自己免疫および炎症性障害の処置に使用するための可溶性ポリペプチド
本発明は、特に、自己免疫および炎症性障害の、たとえば、アレルギー性喘息、および炎症性腸疾患の予防または処置のための薬剤として使用するための可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチドに関する。本発明は、より具体的には、ＳＩＲＰαの細胞外ドメイン（ＣＤ１７２ａ）、またはヒトＣＤ４７に結合する機能的な誘導体を含む薬剤として使用するための可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチドに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤として使用するための、特に、たとえば、アレルギー性喘息、および炎症性腸疾患などの自己免疫および炎症性障害の予防または治療のための、可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチドに関する。本発明は、より具体的には、ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）の細胞外ドメイン、またはヒトＣＤ４７に結合する機能的な誘導体を含む薬剤として使用するための可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ４７は、反対細胞上のＳＩＲＰα（別名ＳＨＰＳ−１）およびＳＩＲＰγに結合する細胞表面糖タンパク質である。この相互作用は、免疫細胞機能の負の調節につながり、あるいは、細胞の接着および遊走を媒介するのに役立つことができる。ＣＤ４７を、自己免疫障害の処置において生物学的製剤として使用することが示唆されている（特許文献１）。対照的に、同様の治療目的のため、ＳＩＲＰαなどのＣＤ４７リガンドを使用できる可能性を示す証拠は、非常に少ない。一つの説明は、ＣＤ４７の普遍的な発現が、潜在的な薬物としてのＣＤ４７結合ポリペプチドの使用を妨げるであろうことである。非特許文献１によって示されるデータは、免疫グロブリンＦｃドメインと融合したＳＩＲＰαの細胞外ドメインでできた融合タンパク質が、マウスにおいて、皮膚由来の樹状細胞（ＤＣ）から流入領域リンパ節への遊走を抑えることができ、それにより、マウスにおける接触過敏性反応を（少なくとも部分的に）減衰させることができることを示唆している。ＤＣの遊走および機能は、免疫または炎症反応に不可欠である。疾患の条件の下において、樹状細胞（ＤＣ）のこれらの悪化した応答は、病気の永続化につながりうる。組織からリンパ器官へ病原性樹状細胞（ＤＣ）が遊走することを妨げることは、自己免疫または炎症性疾患を駆動する悪循環を止める魅力的な好機となるであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第１９９９／０４０９４０号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｙｕら、２００６年、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１２６，７９７−８０７
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ＳＩＲＰα−Ｆｃコンストラクトが、疾患の動物モデルにおけるＴｈ１／Ｔｈ１７−およびＴｈ２−駆動疾患を予防または停止するのに適していることを示す最初のインビボでの証拠を提供する。これらのデータは、本発明の基礎を提供し、ＳＩＲＰα由来タンパク質治療の薬物能を裏付ける。本発明は、部分的には、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα経路を操作することが、免疫原性ＣＤ１０３−樹状細胞により駆動されるＴｈ１／Ｔｈ１７−駆動疾患（関節炎および大腸炎）、およびＴｈ２駆動疾患（喘息）の発症を抑制するという発見に基づく。これらの新しい研究結果は、疾患の根本原因における未知の共通の機構を提供し、複数の自己免疫および炎症性障害の処置の見込みを表している。なお、公表された報告における最近の証拠は、ＣＤ４７のライゲーションが、いくつかの癌の治療のために有益であることを示す（Ｍａｊｅｔｉ ｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ ２００９）。この報告は、ＣＤ４７抗体の使用を示すが、他方、本発明は、ＳＩＲＰα由来ポリペプチドをこれらの疾患の処置のために使用することに関する。
【０００６】
したがって、１つの実施態様において、本発明は、ａ）ＳＩＲＰαの細胞外ドメイン（配列番号３）、ｂ）配列番号１の断片、および、ｃ）配列番号３と少なくとも７５％の同一性を有する配列番号１の変異体ポリペプチドからなる群から選ばれるＳＩＲＰα由来のポリペプチドを含む、薬剤として使用するための可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチドを提供し、ここに、前記ＳＩＲＰα由来ポリペプチドは、ヒトＣＤ４７（配列番号２４）に結合する。特定の実施態様において、配列番号３の変異体ポリペプチドは、配列番号３と少なくとも、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一である。
【０００７】
読みやすさのため、本発明の可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチドは、以下、「本発明の可溶性ポリペプチド」と呼ぶ。
【０００８】
１つの実施形態では、前記ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、ＣＤ４７の拮抗剤、すなわち、ＣＤ４７リガンドのＣＤ４７への結合を競合的に阻害するポリペプチドの中から選ばれる。ＣＤ４７リガンドは、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰγまたはＴＳＰ１を含み、これらに限定されない。
【０００９】
別の実施形態では、ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、ＣＤ４７アゴニスト、すなわち、ＣＤ４７シグナル伝達活性を誘導することができるポリペプチドから選ばれる。
【００１０】
１つの実施形態では、前記可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチドは、２μＭまたはそれ未満のＫＤでヒトＣＤ４７に結合するもの、および／または、免疫複合体刺激樹状細胞サイトカイン放出アッセイにおいて測定した場合に、誘導されたサイトカイン分泌を阻害するものから選ばれる。
【００１１】
別の実施形態では、前記ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、少なくともＳＩＲＰαのＶ領域（配列番号２）を含むＳＩＲＰαの細胞外ドメインである。
【００１２】
特定の実施態様において、本発明の可溶性ポリペプチドは、第二の異種ポリペプチドに融合したＳＩＲＰα由来ポリペプチドからなる第一のコンポーネントを含む融合ポリペプチドである。１つの実施形態において、可溶性ポリペプチドは、さらに、第二の異種ポリペプチドとＳＩＲＰα由来ポリペプチドの間にスペーサーを含む。１つの特定の実施態様において、ＳＩＲＰα由来ポリペプチドは、ＩｇＧ Ｆｃドメインに融合している。好ましい実施形態において、前記Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのサイレントＦｃ断片である。１つの実施形態において、前記Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１アイソタイプの非グリコシル化突然変異体である。
【００１３】
別の関連する態様において、本発明の可溶性ポリペプチドは、自己免疫および炎症性障害の処置における薬物として使用される。好ましい適応症は、Ｔｈ２媒介性気道炎症、アレルギー性障害、喘息、炎症性腸疾患、虚血性障害からなる群から選ばれる。加えて、本発明の可溶性ポリペプチドは、白血病または癌の処置における薬物として使用してもよい。
【００１４】
本発明を、より容易に理解することができるようにするため、特定の用語が最初に定義される。さらなる定義は、詳細な説明を通して記載される。
【００１５】
用語ＣＤ４７は、ヒトＣＤ４７を意味する。ヒトＣＤ４７は、配列番号２４を含み、また、たとえば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む任意の自然多型、またはヒトＣＤ４７のスプライス変異体を含む。ヒトに見出されるＣＤ４７塩基配列中のスプライス変異体またはＳＮＰの例は、表１に記載される。
【００１６】
【表１】
【００１７】
用語ＳＩＲＰαは、ＣＤ４７インテグリン関連タンパク質との接着を示すシグナル伝達調節タンパク質アルファ（ＣＤ１７２ａまたはＳＨＰＳ−１とも呼ばれる）を意味する。いくつかの実施形態において、用語ＳＩＲＰαは、配列番号２３において定義されるヒトＳＩＲＰαを意味する。ヒトＳＩＲＰαは、１つのＶ型ドメイン（配列番号２）、および２つのＣ１型のＩｇドメインを有するアミノ酸細胞外ドメイン（配列番号３）、ならびに３つの潜在的Ｎ−グリコシル化部位を含む。これは、リン酸化した場合に、チロシンホスファターゼＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２を動員するＩＴＩＭモチーフを有する１１０個のアミノ酸細胞質配列を持つ。用語ヒトＳＩＲＰαは、さらに、たとえば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む任意の天然多型、またはヒトＳＩＲＰαのスプライス変異体を含むが、これらに限定されない。ヒトに見出されるＳＩＲＰα塩基配列におけるスプライス変異体またはＳＮＰの例は、表２に記載される。
【００１８】
【表２】
【００１９】
本明細書において、任意の膜貫通ドメインが欠けている場合には、または、ポリペプチドを発現する細胞の膜にポリペプチドを固定する若しくは組込むタンパク質ドメインが欠けている場合には、そのようなポリペプチドは、「可溶性」である。特に、本発明の可溶性ポリペプチドは、同様に、ＳＩＲＰαの膜貫通および細胞内ドメインを除いてもよい。
【００２０】
本明細書において、「ＣＤ４７に結合する」ポリペプチドは、２０μＭまたはそれ未満、２μＭまたはそれ未満、０．２μＭまたはそれ未満のＫＤでヒトＣＤ４７に結合するポリペプチドを意味することが意図されている。いくつかの実施態様において、ＣＤ４７に結合するポリペプチドは、さらに、サーファクタントプロテインＡ（ＳＰ−Ａ）および／またはサーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）に結合する。
【００２１】
本明細書において、免疫複合体刺激樹状細胞サイトカイン放出アッセイにおいて測定した場合に誘導されたサイトカイン分泌を阻害するポリペプチドとは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ）Ｃｏｗａｎ１（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ）、または可溶性ＣＤ４０Ｌ、およびＩＦＮ−γで刺激した末梢血単球、コンベンショナル樹状細胞（ＤＣ）、および単球由来樹状細胞からのサイトカイン（たとえば、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２３、ＩＬ−８および／またはＴＮＦ−α）放出を阻害するポリペプチドである。免疫複合体刺激樹状細胞サイトカイン放出アッセイの一例は、以下の実施例で詳細に記載する。いくつかの態様において、本発明の可溶性ポリペプチドは、免疫複合体刺激樹状細胞サイトカイン放出アッセイで測定した場合に、１μＭもしくはそれ未満、１００ｎＭもしくはそれ未満、または１０ｎＭもしくはそれ未満のＩＣ５０でサイトカイン分泌を阻害する。
【００２２】
本明細書においては、Ｔ細胞増殖を阻害するポリペプチドは、実施例で説明するように、混合リンパ球反応アッセイにおいて測定してもよい。
【００２３】
本明細書において、用語「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」は、特定のタンパク質−タンパク質相互作用の会合速度を意味することが意図されており、他方、本明細書において、用語「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」は、特定のタンパク質−タンパク質相互作用の解離速度を意味することが意図されている。本明細書において、用語「ＫＤ」は、解離定数を意味することが意図されており、Ｋａに対するＫｄの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。タンパク質−タンパク質相互作用のためのＫＤ値は、当技術分野でよく確立された方法を用いて測定することができる。タンパク質−タンパク質相互作用のＫＤを測定するための方法は、表面プラズモン共鳴を使用することによるか、あるいは、ビアコア（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによる。
【００２４】
本明細書において、用語「親和性」は、単一の部位におけるポリペプチドおよびその標的との間の相互作用の強さを意味する。各部位内において、ポリペプチドの結合領域は、弱い非共有結合力を介して数多くの部位におけるその標的と相互作用する。相互作用がより多ければ、親和性は、より強力になる。
【００２５】
本明細書において、結合ポリペプチドについての用語「高親和性」は、その標的に対し、１０ｎＭまたはそれ未満、たとえば、１ｎＭまたはそれ未満のＫＤを有するポリペプチドを意味する。
【００２６】
本明細書において、用語「対象」は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。
【００２７】
用語「非ヒト動物」は、すべての脊椎動物、たとえば、非ヒト霊長類、ヒツジ、犬、猫、馬、牛、鶏、両生類、爬虫類などの哺乳類および非哺乳類を含む。
【００２８】
本明細書において、用語「最適化」は、産生細胞または生命体において好まれるコドン、真核細胞、たとえば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）またはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の細胞、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の細胞、チャイニーズハムスター（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ）卵巣細胞（ＣＨＯ）、またはヒト細胞か、あるいは、原核細胞、たとえば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の菌株のいずれかにおいて好まれるコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように、塩基配列が改変されたことを意味する。
【００２９】
最適化された塩基配列は、完全に、または可能な限り多く、開始ヌクレオチド配列によって当初コードされるアミノ酸配列を保持するように設計され、「親」配列としても知られる。ここで最適化された配列は、対応する産生細胞や生命体、たとえば、哺乳動物細胞において好まれるコドンを持つように設計されてきたが、他の原核または真核細胞におけるこれらの配列の最適化した発現も、ここで想定される。最適化された塩基配列によってコードされるアミノ酸配列も、また、最適化と呼ばれる。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の様々な側面は、以下のサブセクションでさらに詳細に説明される。
【００３１】
ＣＤ４７の機能特性に対する本発明の可溶性ポリペプチドの効果を評価するアッセイは、実施例においてさらに詳細に記載されている。
【００３２】
ＳＩＲＰα由来のポリペプチド
本発明の可溶性ポリペプチドは、ａ）ＳＩＲＰαの細胞外ドメイン（配列番号３）、ｂ）配列番号３の断片、およびｃ）配列番号３の変異体ポリペプチドからなる群から選ばれるＳＩＲＰα由来のポリペプチドを含み、ここに、前記ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、ヒトＣＤ４７（配列番号２４）に結合する。
【００３３】
本発明の可溶性ポリペプチド、およびそのＳＩＲＰα由来の断片は、ＣＤ４７に結合する能力を保持するべきである。したがって、配列番号３の断片は、ＳＩＲＰαのＣＤ４７結合ドメインを含むそれらの断片から選択することができる。これらの断片は、一般的には、ＳＩＲＰαの膜貫通および細胞内ドメインを含まない。非制限的で例示的な実施形態において、ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、本質的に配列番号３または配列番号２で構成される。ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、さらに、配列番号３の変異体ポリペプチドを含むが、これに制限されず、ここに、アミノ酸残基は、アミノ酸の欠失、挿入または置換により変異されたが、ネイティブの配列の変更が、分子の生物学的活性に、特にＣＤ４７に対する結合に実質的に影響しない限り、配列番号３に対して少なくとも６０、７０、８０、９０または９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、これは、配列番号２と比較して、ＳＩＲＰα由来のポリペプチドにおけるわずか１、２、３、４または５のアミノ酸が、アミノ酸の欠失、挿入または置換によって変異されているにすぎない変異アミノ酸配列を含む。変異アミノ酸配列の例としては、単一ヌクレオチド多型（表２参照）に由来する配列が挙げられる。
【００３４】
本明細書において、２つの配列間の％同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れて、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性 ＝ 同一の位置の＃／合計の同一の位置の＃ × １００）。配列の比較、および２つの配列間の％同一性の決定は、以下に述べるように、数学的なアルゴリズムを使用して実行することができる。
【００３５】
２つのアミノ酸配列の間の％同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれ、ＰＡＭ１２０重み残基テーブル、１２のギャップ長のペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用するＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７，１９８８）のアルゴリズムを使用して決定することができる。また、２つのアミノ酸配列の間の％同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムに組み込まれ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）、ブロッサム６２マトリックス、またはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用するＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３，１９７０）のアルゴリズムを使用して決定することができる。
【００３６】
特定の実施態様において、ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、保存的なアミノ酸置換を含む配列番号２または配列番号３への変更を含む。
【００３７】
保存的なアミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されてきた。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分岐側鎖を有するアミノ酸（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、ＳＩＲＰα由来ポリペプチドのＣＤ４７結合領域内の１または複数のアミノ酸残基は、同一の側鎖ファミリーから他のアミノ酸残基に置換することができ、新たなポリペプチド変異体は、本明細書に記載した結合または機能アッセイを使用して、保持された機能について試験することができる。
【００３８】
いくつかの実施態様において、ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、免疫複合体刺激樹状細胞サイトカイン放出アッセイで測定して、ヒトＳＩＲＰαの細胞外ドメインを含む配列番号３のポリペプチドと少なくとも同程度にサイトカイン分泌を阻害する能力を保持するものの間から選択される。
【００３９】
いくつかの態様において、ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、混合リンパ球反応アッセイで測定してＴ細胞の増殖を阻害する能力を保持するものの間から選択される。
【００４０】
別の実施形態において、ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、非ヒト霊長類ＣＤ４７とクロス反応するものの中から選ばれる。
【００４１】
融合ポリペプチド
１つの側面において、本発明の可溶性ポリペプチドは、ＳＩＲＰα由来のポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。
【００４２】
好ましい実施形態において、本発明の可溶性ポリペプチドは、ＳＩＲＰα由来のポリペプチド、および第２の異種アミノ酸配列、たとえば、ＳＩＲＰα由来のポリペプチドのＮ−および／またはＣ−末端においてＳＩＲＰα由来のポリペプチドに共有結合し、必要に応じて、さらに、リンカーを含む、ＳＩＲＰα以外の１または複数のタンパク質の部分を含む融合ポリペプチドである。
【００４３】
非ＳＩＲＰα由来のタンパク質は、好ましくは、他の異種タンパク質と融合したときに、血液中の得られる融合タンパク質の半減期を増加させることができる可溶性単鎖ポリペプチドである。これに代えて、またはそれに加えて、非ＳＩＲＰα由来のタンパク質は、融合ポリペプチドの多量体化のためのドメインを含む。
【００４４】
非ＳＩＲＰα由来のタンパク質は、たとえば、免疫グロブリンは、血清アルブミンおよびそれらの断片であることができる。非ＳＩＲＰα由来のタンパク質は、また、対象において投与した場合に分子の半減期を増大させるために、血清アルブミンタンパク質に結合することができるポリペプチドであることができる。このようなアプローチは、たとえば、ＮｙｇｒｅｎらによるＥＰ０４８６５２５に説明されている。
【００４５】
１つの特定の実施態様において、非ＳＩＲＰα由来のタンパク質は、Ｆｃドメインである。ヒトにおける増大したインビボでの半減期を有する可溶性コンストラクトを作製するためのＦｃ部分の使用は、当技術分野でよく知られており、たとえば、Ｃａｐｏｎら（ＵＳ５，４２８，１３０）に記載されている。
【００４６】
本明細書において、用語「Ｆｃドメイン」は、免疫グロブリンの定常領域を意味する。Ｆｃドメインは、少なくとも、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、必要に応じて、重鎖ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２の間に位置するヒンジ領域を含む。Ｆｃ断片は、たとえば、免疫グロブリンのパパイン分解などにより得ることができた。本明細書において、用語Ｆｃドメインは、さらに、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失、または挿入が導入されたＦｃ変異体を含む。
【００４７】
１つの実施形態において、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が、改変されるように、たとえば、増大または減少するように、ＣＨ１のヒンジ領域は、修飾される。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒらの米国特許第５６７７４２５に、さらに記載されている。たとえば、軽鎖および重鎖の集合を促進するように、または、融合ポリペプチドの安定性を増大させ、または減少させるように、ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、改変される。
【００４８】
別の実施形態において、Ｆｃ領域は、その生物学的半減期を増大させるために修飾される。様々なアプローチが可能である。Ｗａｒｄによる米国特許第６２７７３７５に記載されるように、たとえば、１または複数の次の変異が導入されうる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。
【００４９】
他の実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸残基を、異なるアミノ酸残基に置換し、Ｆｃ部分のエフェクター機能を改変することによって、Ｆｃ領域は、改変される。Ｆｃ部分が、エフェクターリガンドへの親和性を改変するように、たとえば、１または複数のアミノ酸が、異なるアミノ酸残基に置換されることができる。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、たとえば、Ｆｃレセプター、または補体のＣ１コンポーネントであることができる。このアプローチは、いずれもＷｉｎｔｅｒらによる米国特許第５６２４８２１および５６４８２６０に詳細に記載されている。
【００５０】
別の実施形態において、得られたＦｃ部分が、改変したＣ１ｑ結合、および／または、減少したまたは消失した補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を有しているように、アミノ酸残基から選択された１または複数のアミノ酸は、異なるアミノ酸残基に置換することができる。このアプローチは、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらの米国特許第６１９４５５１に詳細に記載されている。
【００５１】
別の実施形態において、１または複数のアミノ酸残基は、補体を固定するＦｃ領域の能力を改変するように改変される。このアプローチは、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１にさらに記載されている。
【００５２】
さらに別の態様において、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する融合ポリペプチドの能力を増大させるために、および／またはＦｃγレセプターに対するＦｃ領域の親和性を増大させるまたは減少させるために、Ｆｃ領域は、１または複数のアミノ酸の修飾によって修飾される。このアプローチは、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公報ＷＯ００／４２０７２に詳しく記載されている。また、ＦｃγＲｌ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１における結合部位は、マップされており、改善した結合を有する変異体が、記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４を参照）。
【００５３】
１つの実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒト起源であり、ＩｇＧまたはＩｇＡのような免疫グロブリンのクラスのいずれかからのものであってよく、また、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４などの任意のサブタイプからのものであってよい。他の実施形態において、Ｆｃドメインは、非ヒト動物からのものであり、たとえば、マウス、ラット、ウサギ、ラクダ、サメ、非ヒト霊長類、またはハムスターなどからのものであるが、これらに限定されない。
【００５４】
特定の実施態様において、ＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインが使用される。いくつかの特定の実施形態において、ＩｇＧ１ Ｆｃ断片の突然変異体が使用され、たとえば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する、および／またはＦｃγレセプターに結合する融合ポリペプチドの能力を減少させるまたは除去するサイレントＩｇＧ１ Ｆｃが使用される。ＩｇＧ１のアイソタイプのサイレント変異の例は、いわゆるＬＡＬＡ変異であり、ここで、ＨｅｚａｒｅｈらによるＪ．Ｖｉｒｏｌ，２００１，Ｄｅｃ；７５（２４）：１２１６１−８に説明されるように、アミノ酸位置２３４および２３５においてロイシン残基は、アラニン残基に置換される。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの位置２９７の残基におけるグリコシル化を妨げる変異である。たとえば、Ｆｃドメインの位置２９７におけるアスパラギン残基のアミノ酸置換が挙げられる。このようなアミノ酸置換の例は、グリシンまたはアラニンによるＮ２９７の交換である。
【００５５】
１つの実施形態において、Ｆｃドメインは、二量体化ドメインを含み、ここで、二量体化ドメインは、好ましくは、このようなＦｃドメインを含む２つの融合ポリペプチドの間の共有ジスルフィド架橋を作ることができるシステインを介する。
【００５６】
ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、非ＳＩＲＰα由来のタンパク質にインフレームで直接に、またはポリペプチドリンカ（スペーサー）を介して融合させることができる。このようなスペーサーは、単一のアミノ酸（たとえば、グリシン残基）、または５００から１００の間のアミノ酸、たとえば、５０から２０の間のアミノ酸であってもよい。リンカーは、ＣＤ４７に対する結合部位を形成するための適切な空間的な配置をとるために、ＳＩＲＰα由来のドメインを許容するべきである。適当なポリペプチドリンカーは、柔軟な配置を採用したものの間で選択してもよい。このようなリンカーの例は、グリシンおよびセリン残基を含むリンカーであり、たとえば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ ここで ｎ＝ １−１２ であるが、これらに限定されない。
【００５７】
グリコシル化修飾
さらに別の態様において、本発明の可溶性ポリペプチドのグリコシル化パターンは、ＣＨＯ、またはヒト細胞株において得られるもののような典型的な哺乳類のグリコシル化パターンと比較して、改変することができる。たとえば、非グリコシル化ポリペプチドは、グリコシル化を欠くように設計された宿主細胞または哺乳動物細胞として、原核細胞株を使用することによって、行うことができる。糖質の修飾は、たとえば、可溶性ポリペプチド内の１または複数のグリコシル化部位を改変することによって達成することもできる。
【００５８】
これに加えて、またはこれに代えて、グリコシル化ポリペプチドは、グリコシル化の改変されたタイプを持つように作製することができる。このような糖質の変更は、たとえば、改変されたグリコシル化機構を有する、すなわち、可溶性ポリペプチドのグリコシル化パターンが、対応する野生型細胞において観察されるグリコシル化パターンと比較して改変される宿主細胞において、可溶性ポリペプチドを発現することによって達成することができる。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、当技術分野で説明されてきており、本発明の組換え可溶性ポリペプチドを発現させることにより、改変されたグリコシル化を有するこのような可溶性ポリペプチドを産生する宿主細胞として使用されうる。たとえば、ＨａｎｇらによるＥＰ１１７６１９５は、機能的に破壊したＦＵＴ８遺伝子、フコース転移酵素をコードする遺伝子を有する細胞株を説明し、このような細胞株において発現された糖タンパク質は、低フコシル化を示す。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５は、Ａｓｎ（２９７）が連結された糖質にフコースを添付する能力が低下し、また、その結果、宿主細胞内で発現した糖タンパク質の低フコシル化が起こっている変異体ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃｌ３細胞について説明している（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０も参照のこと）。また、本発明の可溶性ポリペプチドは、哺乳動物様グリコシル化パターンのために設計された、たとえば、ピキアパトリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母において、または、たとえば、トリコデルマリーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）などの糸状菌において、製造することができる（たとえば、ＥＰ１２９７１７２Ｂ１参照）。これらの糖設計された宿主細胞の利点は、とりわけ、均質なグリコシル化パターン、および／または高収量を有するポリペプチド組成物を提供することである。
【００５９】
可溶性ポリペプチドのＰＥＧ化および他の抱合体
本発明によって企図されている別の実施形態の本明細書における可溶性ポリペプチドは、ＰＥＧ化されている。たとえば、本質的にＳＩＲＰα由来ポリペプチドからなる本発明の可溶性ポリペプチドは、ＰＥＧ化されうる。ＰＥＧ化は、ＰＥＧ化のない同一の生物学的製剤と比較して、得られた生物学的製剤の生物学的（たとえば、血清の）半減期を増大させる、よく知られている技術である。ポリペプチドをＰＥＧ化するには、通常、１または複数のＰＥＧ基がポリペプチドに付着する条件下において、ポリペプチドが、ＰＥＧの反応性エステル、またはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との反応に供される。ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応、またはアルキル化反応により実施することができる。本明細書において、用語「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質を誘導体化するために使用された任意のＰＥＧの形式、たとえば、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを包含することが意図されている。タンパク質をＰＥＧ化する方法は、当技術分野で知られており、本発明の可溶性ポリペプチドに適用することができる。たとえば、ＮｉｓｈｉｍｕｒａらによるＥＰ０１５４３１６、およびＩｓｈｉｋａｗａらによるＥＰ０４０１３８４を参照されたい。
【００６０】
代わりの抱合体または高分子担体は、特に、得られた抱合体の薬物動態的特性を向上させるために使用することができる。高分子担体は、少なくとも１つの天然または合成の分岐、直鎖状または樹枝状ポリマーを含んでもよい。高分子担体は、好ましくは、水や体液に可溶であり、好ましくは薬学的に許容されるポリマーである。水溶性ポリマー部分は、たとえば、ＰＥＧ、ＰＥＧホモポリマー、ｍＰＥＧ、ポリプロピレングリコールホモポリマー、プロピレングリコールとエチレングリコールの共重合体を含む、ポリアルキレングリコール、およびその誘導体、ここに、前記ホモポリマーおよび共重合体は、非置換であり、または、たとえば、アシル基に１の末端において置換されている；ポリグリセリンまたはポリシアル酸；メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含む糖質、多糖類、セルロースおよびセルロース誘導体；澱粉（たとえば、ヒドロキシアルキル澱粉（ＨＡＳ）、特にヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）、およびデキストリン、並びにこれらの誘導体）；デキストラン硫酸、架橋性デキストリン、およびカルボキシメチルデキストリンなどのデキストラン、およびデキストラン誘導体；キトサン（直鎖多糖類）、ヘパリンおよびヘパリンの断片；ポリビニルアルコール、ポリビニルエチルエーテル；ポリビニルピロリドン；α，β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド］；およびポリオキシ−エチル化ポリオールを含むが、これらに限定されない。
【００６１】
可溶性ポリペプチドの薬剤としての使用
本発明の可溶性ポリペプチドは、動物モデルにおいて、アレルギー性喘息、炎症性腸疾患などの炎症性障害から保護することが示された。したがって、本発明の可溶性ポリペプチドは、特に、炎症性および／または自己免疫応答、特に対象におけるＳＩＲＰα＋細胞によって媒介される応答を（統計的または生物学的に有意な態様で）低下し、または抑制する薬剤として使用することができる。
【００６２】
本発明の可溶性ポリペプチドをコードする核酸分子
本発明の別の側面は、本発明の可溶性ポリペプチド、または少なくともＳＩＲＰα由来のポリペプチド（融合ポリペプチドに関連する実施形態を含みこれに限定されない）をコードする核酸分子に関連する。本発明の可溶性ポリペプチドをコードする塩基配列の例は、配列番号２６または２７を含む。
【００６３】
核酸は、全細胞において、細胞溶解物において、存在してもよく、または、部分的に精製され、または実質的に純粋な形である核酸であってもよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、塩化セシウム結合、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野でよく知られている他のものなどの標準的な技術により、他の細胞成分または他の汚染物質、たとえば、他の細胞の核酸やタンパク質を精製したとき、「単離された」または「実質的に純粋にされた」ものである。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集の１９８７年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。本発明の核酸は、たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡであることができ、または、イントロン配列を含まなくてもよい。ある実施態様において、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。核酸は、ファージディスプレイベクターなどのベクターにおいて、または組換えプラスミドベクターにおいて存在することができる。
【００６４】
いったん、本発明の可溶性ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片、たとえば、上で説明したようなＳＩＲＰα由来ポリペプチドを含む融合ポリペプチドが得られれば、これらのＤＮＡ断片は、さらに標準的な組換えＤＮＡ技術によって操作して、たとえば、発現系における適切な分泌のための任意のシグナル配列、さらなる精製工程のための任意の精製タグと切断タグを含めることができる。これらの操作において、ＤＮＡ断片は、別のＤＮＡ分子に、または精製／分泌タグもしくは柔軟性のあるリンカーなどの別のタンパク質をコードする断片に、作動可能なように連結される。この文脈で使用される用語「作動可能なように連結される」は、２つのＤＮＡ断片が、たとえば、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列が、インフレームのままであるように、またはタンパク質が、所望のプロモーターの制御下に発現されるように、機能的な態様で結合されることを意味するものとする。
【００６５】
ＳＩＲＰα由来ポリペプチド、または可溶性ポリペプチドを産生するトランスフェクトーマの生成
本発明の可溶性ポリペプチドは、当技術分野でよく知られているように、たとえば、組換えＤＮＡ技術、および遺伝子導入法を組み合わせて使用して、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて製造することができる。
【００６６】
たとえば、本発明の可溶性ポリペプチド、またはＳＩＲＰα由来ポリペプチドなどのその中間体を発現するため、対応するポリペプチドをコードするＤＮＡは、標準的な分子生物学的技術（たとえば、関心のあるポリペプチドを発現するハイブリドーマを用いたＰＣＲ増幅、またはｃＤＮＡクローニング）によって得ることができ、該ＤＮＡは、対応する遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能なように連結されるように、発現ベクターに挿入されることができる。この文脈において、用語「作動可能なように連結されている」は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が遺伝子の転写および翻訳を制御する目的の機能を果たすように、遺伝子がベクターにライゲーションされることを意味することが意図されている。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞との互換性があるように選択される。可溶性ポリペプチドまたは中間体をコードする遺伝子は、標準的な方法（たとえば、遺伝子断片における相補的制限酵素部位とベクターのライゲーション、または、制限部位が存在しない場合には、平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。これに加えて、またはこれに代えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞からのポリペプチド鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。遺伝子は、シグナルペプチドがポリペプチド鎖のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローニングされうる。シグナルペプチドは、ＳＩＲＰαシグナルペプチド、または異種シグナルペプチド（すなわち、ＳＩＲＰα配列に天然には関連しないシグナルペプチド）であることができる。
【００６７】
ポリペプチドをコードする配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。用語「調節配列」は、ポリペプチド鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー、および他の発現制御要素（たとえば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図されている。このような調節配列は、たとえば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ １９９０）において記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要因に依存しうることは、当業者に理解されるであろう。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列には、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０）（ＳＶ４０）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）（たとえば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、およびポリオーマ（ｐｏｌｙｏｍａ）など由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を方向付けるウイルス要素が含まれる。また、非ウイルス性調節配列は、ユビキチンプロモーターまたはＰ−グロビンプロモーターなどを用いることができる。さらに、調節要素は、ＳＶ４０初期プロモーター、およびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長末端反復配列を含むＳＲａプロモーターシステムなどの異なる出所からの配列で構成された（Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２）。
【００６８】
これに加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（たとえば、複製の起源）および選択マーカー遺伝子などの付加配列を有することができる。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（たとえば、いずれもＡｘｅｌらによる米国特許第４，３９９，２１６、４，６３４，６６５、および ５，１７９，０１７を参照）。たとえば、通常、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。選択マーカー遺伝子は、（メトトレキサート選択／増幅とともにｄｈｆｒ−宿主細胞のために使用される）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、および（Ｇ４１８選択のための）ｎｅｏ遺伝子を含む。
【００６９】
ポリペプチドの発現のため、可溶性ポリペプチドまたはＳＩＲＰα由来のポリペプチドなどの中間体をコードする発現ベクター（複数も可）は、標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。用語「トランスフェクション」の様々な形態は、原核生物または真核生物宿主細胞への外来性ＤＮＡの導入に一般的に使用される広範囲にわたる技術、たとえば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含することが意図されている。原核生物または真核生物宿主細胞のいずれかにおいて本発明の可溶性ポリペプチドを発現することは、理論的に可能である。真核生物、特に、哺乳動物宿主細胞における糖タンパク質の発現は、議論される。このような真核細胞、特に哺乳動物細胞は、原核細胞よりも、適切に折り畳まれ生物学的に活性な本発明の可溶性ポリペプチドのような糖タンパク質を会合させ、分泌しやすいためである。
【００７０】
可溶性ポリペプチド、および本発明のＳＩＲＰα由来ポリペプチドなどの中間体を発現するための哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ）卵巣（ＣＨＯ細胞）（たとえば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ，１９８２，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１などに記載されたＤＨ ＦＲ選択マーカーとともに用い、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６−４２２０に記載されたｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳＰ２細胞を含む）、またはヒト細胞株（ＰＥＲ−Ｃ６細胞株、Ｃｒｕｃｅｌｌを含む）を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞とともに使用するための別の発現システムは、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８，８４１に示されるＧＳ遺伝子発現システムである。ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが、哺乳動物宿主細胞に導入される場合、可溶性ポリペプチド、またはＳＩＲＰα由来のポリペプチドなどの中間体は、宿主細胞における組換えポリペプチドの発現、または宿主細胞を培養する培養培地中への組換えポリペプチドの分泌を可能にするために十分な期間、宿主細胞を培養することにより製造される。ポリペプチドは、標準的なタンパク質精製方法を使用して培養培地から回収することができる。
【００７１】
多価タンパク質
別の局面において、本発明は、ＣＤ４７に結合する２つの同一のまたは異なる本発明の可溶性ポリペプチドを少なくとも含む多価タンパク質を提供する。１つの実施形態において、多価タンパク質は、少なくとも２つ、３つまたは４つの本発明の可溶性ポリペプチドを含む。可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチドは、タンパク質融合または共有もしくは非共有結合を介して互いに連結することができる。本発明の多価タンパク質は、当技術分野で知られている方法を使用して、構成結合特異性を抱合することにより調製することができる。たとえば、多価タンパク質のそれぞれの結合特異性は、別々に生成され、互いに結合されることができる。
【００７２】
様々なカップリングまたは架橋剤が、共有結合のために使用することができる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、およびスルフォスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−ｌ−カルボン酸（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）（たとえば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６；Ｌｉｕ，ＭＡ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：８６４８などを参照されたい）を含む。他の方法には、Ｐａｕｌｕｓ，１９８５，Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．Ｎｏ．７８，１１８−１３２；Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１−８３、およびＧｌｅｎｎｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７−２３７５に記載されているものが含まれる。共有結合は、２つのシステインの間ジスルフィド架橋、たとえば、Ｆｃドメインのシステインからのジスルフィド架橋によって得ることができる。
【００７３】
特定の実施形態において、ＳＩＲＰα由来のポリペプチドに融合したＦｃドメインのヒンジ領域は、奇数の、たとえば１のスルフヒドリル残基を含むように、結合前に修飾される。あるいは、両方の結合特異性は、同じベクターにおいてコードし、同じ宿主細胞において発現し会合することができる。
【００７４】
医薬組成物
別の側面において、本発明は、薬学的に許容される担体と一緒に処方された本発明の可溶性ポリペプチドの１つまたは組み合わせを含む組成物、たとえば医薬組成物を提供する。
【００７５】
本発明の可溶性ポリペプチドを含む医薬製剤は、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０００））と、所望の純度を有するポリペプチドを、水溶液、凍結乾燥、または他の乾燥させた製剤の形態において、混合することにより、保存のために調製することができる。したがって、本発明はさらに、少なくとも本発明の可溶性ポリペプチドを含む凍結乾燥組成物に関する。
【００７６】
また、併用療法において、すなわち、他の薬剤と組み合わせて、本発明の医薬組成物を投与することもできる。たとえば、併用療法は、少なくとも１つの他の抗炎症剤または別の化学療法剤と組み合わせて、本発明の可溶性ポリペプチドを含むことができる。併用療法で使用することができる治療剤の例は、以下の本発明の可溶性ポリペプチドの使用のセクションで、より詳細に説明されている。
【００７７】
本明細書において、「薬学的に許容される担体」は、任意およびすべての溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、ならびに生理学的に互換性がある同等物を含む。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、経口、脊髄、または表皮の投与（すなわち、注射または注入による投与）に適しているべきである。投与経路に応じて、活性化合物は、酸、および該化合物を不活性化する可能性のある他の自然条件の作用から該化合物を保護するための材料で被覆することができる。
【００７８】
本発明の医薬化合物は、１または複数の薬学的に許容される塩を含むことができる。「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、かつ、任意の不要な毒物学的影響を与えない塩を意味する（たとえば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照）。このような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素、リンなどのような無毒性の無機酸に由来するもの、および脂肪族モノ−およびジ−カルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などのような無毒性の有機酸に由来するものを含む。塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのようなアルカリ土類金属に由来するもの、およびＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカミン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどのような無毒性の有機アミンに由来するものを含む。
【００７９】
本発明の医薬組成物は、また、薬学的に許容される抗酸化物質を含むことができる。薬学的に許容される抗酸化物質の例は、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化物質；パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化物質；クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤などを含む。
【００８０】
本発明の医薬組成物に用いることができる適切な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物、オリーブオイルなどの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルを含む。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどの被覆材料の使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。
【００８１】
これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの補助剤を含むことができる。微生物の存在の防止は、上記の滅菌の手順、およびたとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等の様々な抗菌および抗真菌剤を含めることの両方によって、確実にすることができる。また、組成物に、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが望ましい。また、注射可能な医薬品形態の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を含めることによってもたらされうる。
【００８２】
薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射可能溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体と薬剤の使用は、当該技術分野で知られている。任意の従来の媒体または薬剤に、活性化合物との適合性がない場合を除き、本発明の医薬組成物においてそれらを使用することが意図されている。補助的な活性化合物も、また、組成物に組み込むことができる。
【００８３】
治療組成物は、通常、製造および保存の条件下で滅菌であり、安定でなければならない。組成物は、高薬物濃度に適した溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、またはその他の秩序構造として処方することができる。担体は、たとえば、水、エタノール、およびポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒であることができる。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどの被覆剤の使用により、分散媒の場合には所望の粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。多くの場合、組成物には、たとえば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることができる。注射可能な組成物の長期吸収は、組成物に、モノステアリン酸塩およびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を含めることによってもたらされる。
【００８４】
滅菌注射溶液は、適当な溶媒中で、必要な量、活性化合物を、上記に列挙した成分の１または組み合わせとともに、組み込み、続いて、必要に応じて、滅菌精密ろ過を行うことによって、調製することができる。一般的に、分散媒は、基本的な分散媒体、および上記の列挙されたものから必要な他の成分が含まれている滅菌ビヒクルに、活性化合物を組み込むことにより、調製される。滅菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合には、調製の方法は、以前にフィルター滅菌されたそれの溶液から、活性成分、および任意の追加の所望の成分の粉末を得る、真空乾燥、およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【００８５】
単一の投薬形態を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される対象、および投与の特定の様式に依存して変化する。単一の投薬形態を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般的には、治療的効果を生じさせる組成物のその量であろう。一般的には、１００％のうち、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、活性成分の約０．０１％〜約９９％、活性成分の約０．１％〜約７０％、または約１％〜約３０％の範囲である。
【００８６】
投与計画は、最適な所望の応答（たとえば、治療応答）を提供するために調整される。たとえば、単一のボーラスが、投与されることができ、数回に分けられた投与量が、時間をかけて投与されることができ、または投与量が、治療状況の緊急性によって指示されるように、比例的に低減または増大させられることができる。特に投与の容易化および投薬量の均一性のために、投与単位形態で非経口組成物を処方することが有利である。本明細書において、投与単位形態は、処置される対象への単一投薬量として適した物理的に隔離された単位を意味し、各単位は、必要な薬学的な担体と組み合わせて所望の治療的効果を生むために計算された活性化合物のあらかじめ決められた量を含む。本発明の投薬量単位形態のための仕様は、活性化合物の固有の特性、達成されるべき特定の治療効果、および個人における感受性を処置するためのこのような活性化合物を配合する技術に本来的に備わっている限界によって、決定され、および直接に依存する。
【００８７】
本発明の可溶性ポリペプチドの投与のためには、投薬量は、投与を受ける者の体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり、より通常には、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。たとえば、投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重であることができ、または１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であることができる。典型的な治療計画は、１週間に１回の、２週間に１回の、３週間に１回の、４週間に１回の、１ヶ月に１回の、３ヶ月に１回の、または３〜６ヶ月に１回の投与を伴う。本発明の可溶性ポリペプチドの投与計画は、１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重の静脈内投与を行い、次の投与スケジュールの１つを用いてポリペプチドを与えることを含む：４週間ごとに６投与量、次に、３ヶ月ごと；３週間ごと；３ｍｇ／ｋｇ体重を一度、続いて１ｍｇ／ｋｇ体重を３週間ごと。
【００８８】
可溶性ポリペプチドは、通常、複数回投与される。単一投薬量の間の間隔は、たとえば、毎週、毎月、３ヶ月ごと、または年ごとであることができる。間隔は、患者における可溶性ポリペプチドの血中濃度を測定することによって示されるように、不規則であることができる。いくつかの方法において、投与量は、約１〜１０００μｇ／ｍｌ、いくつかの方法において約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿ポリペプチド濃度を達成するために調整される。
【００８９】
また、可溶性ポリペプチドは、徐放性製剤として投与することができ、その場合、必要な投与の頻度は、より低い。投薬量および頻度は、患者における可溶性ポリペプチドの半減期によって異なる。投薬量と頻度は、処置が、予防的であるか、治療的であるかによって異なりうる。予防的な適用においては、比較的低用量が、長期間にわたって、比較的まれな間隔で投与される。一部の患者は、自分たちの人生の残りのための処置を受け続ける。治療的適用においては、疾患の進行が低減されるまで、もしくは終了するまで、または、患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔での比較的高い投薬量が、必要である。その後、患者は予防的投与計画を行うことができる。
【００９０】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量は、患者に毒性であることなく、特定の患者、組成物、および投与様式について所望の治療応答を達成する効果的な活性成分の量が得られるように変化させることができる。選択された投薬量レベルは、採用される本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与時間、採用される特定の化合物の排泄率、処置の期間、採用される特定の組成物と組み合わせて用いられる他の薬物、化合物、および／または材料、処置を受ける患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態、および以前の病歴、ならびに医療分野でよく知られている同様の要因を含む薬物動態的な様々な要因に依存する。
【００９１】
本発明の可溶性ポリペプチドの「治療的に有効な投薬量」の結果、疾患の症状の重症度が低下し、疾患の無症状期間頻度および継続期間が上昇し、あるいは疾患の苦痛による障害または無力を予防することができる。
【００９２】
本発明の組成物は、当技術分野で公知の種々の１または複数の方法を使用して、１または複数の投与経路によって投与することができる。当業者によって理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて異なるであろう。
【００９３】
本発明の可溶性ポリペプチドを投与するための経路は、たとえば、注射または注入による、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、脊髄、または他の非経口投与経路を含む。本明細書において、語句「非経口投与」は、通常、注射による、経腸および局所投与以外の投与の様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節包内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、皮内、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および幹内の注射および注入を含むが、これらに限定されない。
【００９４】
また、本発明の可溶性ポリペプチドは、局所、表皮、または粘膜の投与経路などの経口経路によって、たとえば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下または局所的に、投与することができる。
【００９５】
活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含む放出制御製剤など、迅速な放出に反する化合物を保護するであろう担体とともに調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸など、生分解性、生体適合性ポリマーが、使用されうる。このような製剤の調製のための多くの方法が、特許を受けており、または当業者に広く知られている。たとえば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７８を参照されたい。
【００９６】
治療組成物は、当該技術分野で知られている医療機器を用いて投与することができる。たとえば、１つの実施形態において、本発明の治療組成物は、米国特許第５，３９９，１６３、５，３８３，８５１、５，３１２，３３５、５，０６４，４１３、４，９４１，８８０、４，７９０，８２４または４，５９６，５５６に示される装置などの無針皮下注射装置を用いて投与することができる。本発明において有用な、よく知られているインプラントおよびモジュールの例は、制御された速度で薬物を分配するための埋め込み型マイクロ注入ポンプを示す米国特許第４４８７６０３；皮膚を通して薬剤を投与するための治療装置を示す米国特許第４４８６１９４；正確な注入速度で薬物を輸送するための薬剤注入ポンプを示す米国特許第４４４７２３３；連続薬物輸送のための可変流量埋め込み型注入装置を示す米国特許第４４４７２２４；多チャンバーコンパートメントを有する浸透薬物輸送システムを示す米国特許第４４３９１９６；、および浸透薬物輸送システムを示す米国特許第４４７５１９６を含む。多くの他のこのようなインプラント、輸送システム、およびモジュールが当業者に知られている。
【００９７】
特定の実施態様において、本発明の可溶性ポリペプチドは、生体内で適切な分布を確実にするように処方することができる。たとえば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高親水性の化合物を除外する。本発明の治療化合物が、（必要に応じて）ＢＢＢを越えることを確実にするため、それらは、たとえば、リポソーム中に処方されることができる。リポソームを製造する方法については、たとえば、米国特許第４５２２８１１、５３７４５４８、および５３９９３３１を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送されそれゆえ標的薬物輸送を増進させる１または複数の部分を含んでもよい（たとえば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ，１９８９, Ｊ．Ｃｌｉｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照されたい）。典型的な標的部分は、葉酸またはビオチン（たとえば、Ｌｏｗらによる米国特許５，４１６，０１６を参照されたい）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｒｎｏｔｈｅｒ．３９：１８０）；サーファクタントプロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）；Ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０）を含む。Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ，１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ，１９９４，Ｉｍｒｎｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，４：２７３も参照されたい。
【００９８】
本発明の使用および方法
本発明の可溶性ポリペプチドは、インビトロおよびインビボの診断および治療の有用性を持つ。たとえば、これらの分子は、様々な障害を治療、予防、または診断するために、培養下の細胞に、たとえば、インビトロ、もしくはインビボで、あるいは、対象における細胞に、たとえば、インビボで、投与することができる。
【００９９】
本明細書において、用語「対象」は、ヒト、および非ヒト動物を含むことが意図されている。非ヒト動物は、たとえば、非ヒト霊長類、ヒツジ、犬、猫、牛、馬、鶏、両生類、爬虫類などの哺乳類および非哺乳類などのすべての脊椎動物を含む。
【０１００】
該方法は、たとえば、アレルギー性喘息または潰瘍性大腸炎など、ＳＩＲＰα＋細胞によって媒介される自己免疫および炎症性障害の治療、予防、または診断に、特に適している。これらは、炎症病状、アレルギーおよびアレルギー性病状、自己免疫疾患、虚血性障害、重症感染症、ならびに細胞、組織または臓器の異種移植（すなわち、異なる種から、たとえば、非ヒト種からヒトへの移植）を含む細胞、臓器または組織の移植拒絶反応を含む。
【０１０１】
自己免疫疾患の例は、関節炎（たとえば、関節リウマチ、関節炎慢性進行性関節炎および変形性関節炎）、および骨量減少を伴う炎症病状とリウマチ性疾患を含むリウマチ性疾患、炎症性痛覚、強直性脊椎炎を含む脊椎関節症、ライター症候群、反応性関節炎、乾癬性関節炎、および腸関連関節炎、過敏症（気道過敏症と皮膚過敏症の両方を含む）、ならびにアレルギーを含み、これらに限定されない。自己免疫疾患は、（たとえば、溶血性貧血、再生不良性貧血、純粋な赤血球貧血、または特発性血小板減少症を含む）自己免疫血液学的障害、全身性エリテマトーデス、炎症性筋障害、多発性軟骨炎、皮膚硬化症、ウェゲナー肉芽腫、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スティーブン−ジョンソン症候群、特発性スプルー、内分泌眼症、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿（糖尿病Ｉ型）、ブドウ膜炎（前部および後部）、乾性角結膜炎および春季カタル、間質性肺線維症、（たとえば、特発性ネフローゼ症候群、または微小変化型腎症を含むネフローゼ症候群がある、またはない）乾癬性関節炎および糸球体腎炎、腫瘍、多発性硬化症、皮膚および角膜の炎症性疾患、筋炎、骨のインプラントのゆるみ、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、および脂質異常症などの代謝性障害を含む。
【０１０２】
本発明の可溶性ポリペプチドは、喘息、気管支炎、じん肺、肺気腫、およびその他の気道の閉塞性または炎症性疾患の治療、予防、または改善にも有用である。
【０１０３】
本発明の可溶性ポリペプチドは、また、ＩｇＥ媒介性障害の処置にも有用である。ＩｇＥ媒介性障害は、多くの一般的な自然発生吸入および摂取抗原に対して免疫学的に応答する遺伝的性向、およびＩｇＥ抗体の継続的な産生によって特徴づけられるアトピー性障害を含む。特定のアトピー性障害は、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性胃腸疾患を含む。
【０１０４】
しかし、ＩｇＥレベル上昇に関連する疾患は、遺伝的な（アトピー）病因を伴うものに限定されない。ＩｇＥ媒介性であり、本発明の製剤で処置されるようであり、ＩｇＥレベル上昇に関連するその他の障害は、過敏症（たとえば、アナフィラキシー過敏症）、湿疹、じんま疹、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、寄生虫症、高ＩｇＥ症候群、血管拡張性失調症、ウィスコット−アルドリッチ症候群、胸腺リンパ形成不全症、高ＩｇＥ症、および移植片対宿主反応を含む。
【０１０５】
本発明の可溶性ポリペプチドは、単独の活性成分として、または他の薬物、たとえば免疫抑制、免疫調整剤、もしくは他の抗炎症剤と併用して、たとえば、アジュバントとして、または組み合わせて、たとえば、上記疾患の治療または予防のために、投与することができる。たとえば、本発明の可溶性ポリペプチドは、ＤＭＡＲＤ、たとえば、金塩、スルファサラジン、抗マラリア剤、メトトレキサート、Ｄ−ペニシラミン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ミノサイクリン、レフルノミド、糖性グルココルチコイド群；カルシニューリン阻害剤、たとえば、シクロスポリンＡまたはＦＫ ５０６；リンパ球再循環のモジュレーター、たとえば、ＦＴＹ７２０およびＦＴＹ７２０類似物；ｍＴＯＲ阻害剤、たとえば、ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、ＣＣＩ７７９、ＡＢＴ５７８、ＡＰ２３５７３またはＴＡＦＡ−９３；免疫抑制特性を有するアスコマイシン、たとえば、ＡＢＴ−２８１、ＡＳＭ９８１など；コルチコステロイド；シクロフォスファミド；アザチオプリン；メトトレキサート；レフルノミド；ミゾリビン；ミコフェノール酸；ミコフェノール酸モフェチル；１５−デオキシスペルグアリン、またはその免疫抑制ホモログ、アナログもしくは誘導体；免疫抑制モノクローナル抗体、たとえば、白血球受容体、たとえば、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６またはそれらのリガンドに対するモノクローナル抗体；他の免疫調整化合物、たとえば、ＣＴＬＡ４またはその変異体の細胞外ドメインの少なくとも一部を有する組換え結合分子、たとえば、非ＣＴＬＡ４タンパク質配列に結合したＣＴＬＡ４またはその変異体の少なくとも細胞外部分、たとえば、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（たとえば、ＡＴＣＣ ６８６２９と指定されるもの）またはその変異体、たとえばＬＥＡ２９Ｙ；接着分子阻害剤、たとえば、ＬＦＡ−１アンタゴニスト、ＩＣＡＭ−１または３アンタゴニスト、ＶＣＡＭ−４アンタゴニスト、またはＶＬＡ−４アンタゴニスト；または化学療法剤、たとえば、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル；抗ＴＮＦ剤、たとえば、ＴＮＦに対するモノクローナル抗体、たとえば、インフリキシマブ、アダリムマブ、ＣＤＰ８７０、またはＴＮＦ−ＲＩまたはＴＮＦ−ＲＩＩに対する受容体コンストラクト、たとえば、エタネルセプト、ＰＥＧ−ＴＮＦ−ＲＩ；炎症性サイトカインのブロッカー、ＩＬ−１ブロッカー、たとえば、アナキンラまたはＩＬ−１トラップ、ＡＡＬ１６０、ＡＣＺ ８８５、ＩＬ−６ブロッカー；ケモカインブロッカー、たとえば、プロテアーゼの阻害剤または活性化剤、たとえば、メタロプロテアーゼ、抗ＩＬ１５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＩＬ１７抗体、アスピリン、または抗感染剤などの非ステロイド性抗炎症薬（一覧は、上記の薬剤に限定されない）との組み合わせで使用することができる。
【０１０６】
本発明の可溶性ポリペプチドは、また、特に、上記で言及したものなどの閉塞性または炎症性気道疾患の処置における抗炎症または気管支拡張薬物物質と併用して使用するための共治療剤として、たとえば、そのような薬物の治療活性の増強剤として、またはそのような薬物の必要とする投与量、または起こりうる副作用を減少させる手段として、有用である。本発明の薬剤は、固定医薬組成物において抗炎症や気管支拡張薬物と混合されてもよく、または抗炎症または気管支拡張薬物と別々に、その前に、同時に、またはその後に投与されてもよい。このような抗炎症薬物は、ステロイド、特に、ブデソニド、ベクロメタゾン、フルチカゾンまたはモメタゾンなどのグルココルチコステロイド、およびカベルゴリン、ブロモクリプチンまたはロピニロールなどのドーパミン受容体アゴニストを含む。このような気管支拡張薬物は、抗コリンまたは抗ムスカリン剤、特に、臭化イプラトロピウム、オキシトロピウム、および臭化チオトロピウムを含む。
【０１０７】
本発明の薬剤とステロイドの組み合わせは、たとえば、ＣＯＰＤ、特に、喘息の治療において、使用されてもよい。本発明の薬剤、および抗コリン、もしくは抗ムスカリン剤、またはドーパミン受容体アゴニストの組み合わせは、たとえば、喘息、または、特に、ＣＯＰＤの処置において、使用されてもよい。
【０１０８】
上記によれば、本発明は、また、それを必要とする対象、特にヒト被験者に、前記で説明したように、可溶性ポリペプチドを投与することを含む、閉塞性または炎症性気道疾患の処置の方法を提供する。別の局面において、本発明は、本明細書中で説明するように、閉塞性または炎症性気道疾患を処置するための薬剤の製造における使用のための可溶性ポリペプチドを提供する。
【０１０９】
本発明の可溶性ポリペプチドは、また、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患などの慢性胃腸炎の治療、予防、または改善に、特に有用である。
【０１１０】
「慢性胃腸炎」は、比較的長い期間の発症によって特徴付けられ、（たとえば、数日間、数週間、数ヶ月、あるいは数年から、最大、被検者の最期まで）持続し、および、単核細胞の浸潤または流入に関連付けられ、自然寛解と自然発生の長さとさらに関連付けられることができる消化管の粘膜の炎症を意味する。したがって、慢性胃腸炎を有する被験者は、長期間の監視、観察、または注意を要すると予想されることがある。このような慢性炎症を有する「慢性胃腸炎症性病状」（「慢性胃腸炎症性疾患とも呼ばれる）は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、環境発作によって誘発される大腸炎（化学療法の投与、および放射線療法などの治療計画によって（たとえば、副作用として）引き起こされ、またはこれに関連付けられる、たとえば、消化管炎症（たとえば、大腸炎））、慢性肉芽腫症（Ｓｃｈａｐｐｉ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ Ｄｉｓ Ｃｈｉｌｄ．２００１，Ｆｅｂｒｕａｒｙ；１９８４（２）：１４７−１５１）などの病状における大腸炎、セリアック疾患、セリアック病（グルテンとして知られるタンパク質の摂取に応答して、腸の内層が炎症を起こす遺伝性疾患）、食物アレルギー、胃炎、感染性の胃炎または腸炎（たとえば、ヘリコバクターピロリ感染慢性活動性胃炎）、および他の形態の感染性病原体によって引き起こされる胃腸の炎症、ならびに他の同様の病状を含むが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１１１】
本明細書中において、「炎症性腸疾患」または「ＩＢＤ」は、腸のすべてまたは部分の炎症によって特徴づけられる任意の種々の疾患を意味する。炎症性腸疾患の例は、クローン病、および潰瘍性大腸炎を含むが、これに限定されない。明細書を通してＩＢＤへの言及は、しばしば、明細書において、胃腸炎症病状の例としての言及であり、制限的であることは意図されていない。
【０１１２】
上記によれば、本発明は、前記で説明した可溶性ポリペプチドを必要とする対象、特に、ヒト対象にこれを投与することを含む、瘍性大腸炎などの慢性胃腸炎、または炎症性腸疾患を処置する方法も提供する。別の局面において、本発明は、慢性胃腸炎または炎症性腸疾患の処置のための薬剤の調製における本明細書中で説明した可溶性ポリペプチドの使用を提供する。
【０１１３】
本発明は、白血病、または他の癌障害の治療、予防または改善において有用である。
【０１１４】
治療上有効な量の可溶性ポリペプチド、および少なくとも１つの第二薬物物質を、たとえば、併用して、または順に同時投与することを含む、上記で定義した方法も、また、本発明の範囲内に包含される。ここに、前記第二薬物物質は、たとえば、上に示した免疫抑制／免疫調整、抗炎症治療、または抗感染症薬物である。
【０１１５】
あるいは、治療的組み合わせ、たとえば、治療上有効な量のａ）本発明の可溶性ポリペプチド、およびｂ）たとえば、上に示した免疫抑制／免疫調整、抗炎症治療、または抗感染症薬物から選択される少なくとも１つの第二の物質からなるキット。該キットには、その投与のための指示を含むことができる。
【０１１６】
本発明の可溶性ポリペプチドが、他の免疫抑制／免疫調整、抗炎症治療、または抗感染症治療とともに投与される場合、もちろん、用いられる共薬物の型、処置を受ける病状などに応じて、同時投与の組み合わせの化合物の投与量は、異なるであろう。
【０１１７】
１つの実施形態において、本発明の水溶性ポリペプチドは、ＣＤ４７＋樹状細胞のレベル、またはＣＤ４７を含む細胞のレベルの検出に使用することができる。これは、たとえば、可溶性ポリペプチド、およびＣＤ４７発現細胞の間で複合体の形成を可能にする条件の下で、（インビトロサンプルなどの）サンプル、およびコントロールサンプルを、本発明の可溶性ポリペプチドと接触させることによって達成することができる。形成された任意の複合体は、サンプルおよびコントロールにおいて、検出され、比較される。たとえば、フローサイトメトリーアッセイなどの当技術分野で周知の標準的な検出方法が、本発明の組成物を使用して実行されうる。
【０１１８】
したがって、１つの側面において、本発明は、可溶性ポリペプチドおよびＣＤ４７の間の複合体の形成を可能にする条件下で、サンプル、およびコントロールサンプルを本発明の可溶性ポリペプチドと接触させることを含む、サンプルにおけるＣＤ４７（たとえば、ヒトＣＤ４７）の存在を検出する、またはＣＤ４７の量を測定する方法をさらに提供する。複合体の形成は、次に、検出され、ここに、複合体形成におけるコントロールのサンプルと比較したサンプルとの間の違いが、サンプルにおけるＣＤ４７の存在の指標となる。
【０１１９】
また、本発明の組成物、および使用説明書から構成されるキットも、本発明の範囲内である。キットは、さらに、少なくとも１つの付加的な試薬を含むことができる。典型的には、キットは、キットの内容物の使用目的を示すラベルを含む。ラベルという用語は、キットの上に、もしくはキットとともにある、または他にキットに付属している任意の書き込み、または記録材料を含む。キットは、上記のように定義された処置に応答するであろう群に属する患者であるかどうかを診断するための道具をさらに含んでもよい。
【０１２０】
十分に記述されてきた本発明は、さらに以下の実施例および請求の範囲によって、説明されるが、これは、例示的なものであり、さらに限定的であることを意味するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】ネズミＳＩＲＰα−Ｆｃは、ＣＤ４７＋／＋（ＷＴ）に結合するが、ＣＤ４７−／−（ＫＯ）細胞には結合しない。ＣＤ４７＋／＋（ＷＴ）またはＣＤ４７−／−（ＫＯ）ネズミ脾細胞に結合するネズミＳＩＲＰα−Ｆｃは、説明したようにフローサイトメトリーによって検出された。ＳＩＲＰα−Ｆｃ結合（ＳＩＲＰ）から生じる蛍光は、ＦＬ３対ドットプロットとしてプロットされている。
【図２】ヒトＳＩＲＰα−Ｆｃは、ＣＤ４７＋／＋発現（Ｊｉｎ８ＣＤ４７）に結合するが、ＣＤ４７欠損Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（Ｊｉｎ８）には結合しない。ＳＩＲＰα− Ｆｃ結合は、上記のフローサイトメトリーによって定量化した。ＳＩＲＰα−Ｆｃ結合（ＳＩＲＰ）から生じる蛍光は、太線におけるヒストグラムとしてプロットされている。太線は、１０μｇ／ｍＬ抗ＣＤ４７クローンＢ６Ｈ１２の存在下での結合を示す。
【図３】プライミング時のＣＤ４７／ＳＩＲＰαのブロッキングは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるアレルギー性疾患の進行を妨げる。（３ａ）マウスには、ＳＩＲＰα−Ｆｃ融合分子の存在下、または非存在下において、０日目と５日目に、腹腔内にＯＶＡ感作し、１２日目、１６日目、および２０日目に、ＯＶＡ−エアロゾル感作を受けさせ、そして、２１日目に、安楽死させた（グループあたりＮ＝４〜７匹）。（３ｂ）Ｈ＆ＥおよびＰＡＳで染色された、ナイーブ肺切片（ＰＢＳ）、免疫されたＯＶＡ、ＯＶＡ付加ＳＩＲＰ−α−ＦＣ−処置マウス。データは、３つの別個に分析された肺の代表である。（３ｃ）ディファレンシャルＢＡＬＦ細胞数が、フローサイトメトリーによって、分析された。（３ｄ）２１日目に測定したＯＶＡ特異的ＩｇＥの血清レベル。（３ｅ）インビトロでのＯＶＡでの再刺激の３日後のＭＬＮ細胞培養の上清中のＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３レベル。（３ｆ）２１日目、生体外の単離されたｍＬＮｓにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＩＬ−１３が産生するＣＤ４＋Ｔ細胞の％を、フローサイトメトリーによって評価した。３つのうちの代表的な実験の１つが示されている。（３ｇ）肺外植片におけるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３および（ｈ）エオタキシン放出。データは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４】ＳＩＲＰα−Ｆｃ処理ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける疾患保護の機序。マウスには、０日目および５日目に、ＳＩＲＰα−Ｆｃ融合分子の存在下で、または非存在下でＯＶＡ感作し、１２日目、１６日目、および２０日目にＯＶＡ−エアロゾル感作を受けさせ、２１日目に安楽死させた。（４ａ）ｍＬＮｓにおけるＣＤ１１ｂ低ＣＤ１０３＋、およびＣＤ１１ｂ高ＣＤ１０３−ＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋にゲートされた）の亜集団。データは、％ＤＣサブセットとして表示される（グループごとにｎ＝３〜４匹）。（４ｂ）ＢＡＬＢ／ｃマウスは、腹腔内ＯＶＡ−ａｌｕｍｎの免疫付与の前日に、ＳＩＲＰα−Ｆｃの存在下で、または不存在下で（ＰＢＳ）、ＣＦＳＥ標識ＣＤ４７＋／＋ＣＤ４＋ＴｇＴ細胞を、受動的に移送され、２日後、ＣＦＳＥ細胞希釈が、ｍＬＮｓにおいて検討された。データは、グループごとに４匹のマウスで行われた実験の代表である。（４ｃ）２１日目、好酸球（ＣＣＲ３＋）の絶対数が、生体外の単離されたｍＬＮｓにおいて、フローサイトメトリーによって、評価された。データは平均±ＳＥＭである（グループごとにＮ＝３〜４マウス）。
【図５】ＳＩＲＰα−Ｆｃの投与によるＴＮＢＳ−大腸炎の保護。大腸炎が誘導され、上記のように評価された。１００μｇ／動物 ネズミＳＩＲＰα−Ｆｃが、腹腔内後０日目および２４時間に適用された。またＰＢＳが腹腔内に注入された。動物の体重は、ＴＮＢＳ注射後４日まで評価された。
【実施例】
【０１２２】
１．本発明の可溶性ポリペプチドの例：
以下の表３は、開示されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いて組換え法によって製造することができる本発明の可溶性ポリペプチドの例を提供する。
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
２．親和性測定：
２．１ ＣＤ４７に対する親和性：
単量体ＣＤ４７、または二価のＣＤ４７−Ｆｃタンパク質に対するヒトＳＩＲＰα− Ｆｃの親和性は、ビアコアによって、評価することができる。ＳＩＲＰαとのＣＤ４７ Ｖ−ドメインの一価の相互作用は、約１μＭであると報告されている（Ｈｅａｔｈｅｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ． ２００８）。
【０１２５】
たとえば、ＡＰＰ−タグ付きＣＤ４７ Ｖドメインタンパク質が、ＨＥＫ２９３細胞において発現され、リガンドとしての二価のＣＤ４７−Ｆｃタンパク質と比較される。ＳＩＲＰα−Ｆｃとの一価の相互作用は、０．８μｍＫＤと測定されたが、他方、二価のＣＤ４７−Ｆｃのタンパク質の結合の強さ（結合力）は、ＫＤ＜６０ｎｍへ１０倍も増大した。対照的に、ネズミＣＤ４７−Ｆｃ融合タンパク質の結合は、観察することができなかったが、このことは、評価された相互作用の特異性を示す。
【０１２６】
【表４】
【０１２７】
２．２ マウス細胞ＣＤ４７に対する細胞結合：
野生型からの、またはＣＤ４７ノックアウトネズミからの５ｘ１０５ＣＤ４７＋、およびＣＤ４７−マウス脾細胞を、２００μｇ／ｍｌヒトＩｇＧ、および５μｇ／ｍｌネズミＳＩＲＰα−Ｆｃを含む５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％ＦＣＳ ２ｍＭのＥＤＴＡ）に、４℃で３０分間、再懸濁した。洗浄後、４℃で３０分間、ＦＩＴＣ標識したストレプトアビジン（１／１０００）で細胞を染色する。結果は、ＳＩＲＰα−Ｆｃが、ＣＤ４７＋／＋のリンパ球に結合するが、ＣＤ４７−／−ノックアウトマウスからのリンパ球には結合しないことを示す（図１）。
【０１２８】
２．３ ヒト細胞ＣＤ４５に対する細胞結合：
５ｘ１０５ＣＤ４７＋、およびＣＤ４７−ＪｕｒｋａｔＴ細胞株を、４℃で３０分間、２００μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ、および５μｇ／ｍｌのＳＩＲＰα−Ｆｃを含む５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ ２％ＦＣＳ ２ｍＭＥＤＴＡ）に再懸濁する。洗浄後、４℃で３０分間、細胞を、ＦＩＴＣ標識したストレプトアビジン（１／１０００）で染色する。
【０１２９】
結果は、ＳＩＲＰα−Ｆｃが、ＣＤ４７＋／＋Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｊｉｎ８ＣＤ４７）のリンパ球に結合するが、ＣＤ４７（Ｊｉｎ８）を発現しないＪｕｒｋａｔ細胞には結合しないことを示す（図２）。抗ＣＤ４７抗体Ｂ６Ｈ１２での阻止によって示されるように、細胞への結合は、特異的であった。
【０１３０】
２．４ ＣＨＯ ＣＤ４７細胞株に結合するビオチン化ＳＩＲＰ−αＦｃの阻害／ブロッキング試験：
また、ＣＨＯ ＣＤ４７細胞株に結合するビオチン化ＳＩＲＰα−Ｆｃの阻害／ブロッキング試験は、異なるエピトープ（すなわち、Ｂ６Ｈ１２、２Ｄ３、ＢＲＩＣ１２６、ＩＦ７、および１０Ｇ２クローン、別の抗ヒトＳＩＲＰ−α（ＣＤ１７２ａ）ｍＡｂ、組換えヒトトロンボスポンジン１（ＴＳＰ−１）、またはＴＳＰ−１のＣ末端（４Ｎ１Ｋ）、およびコントロール（４ＮＧＧ）ペプチド）に対する抗ＣＤ４７ｍＡｂを用いて実施することができる。
【０１３１】
２．５ ＣＨＯ ＣＤ４７細胞株に結合する直接標識抗ＣＤ４７ｍＡｂの阻害／ブロッキング試験：
補完的なアプローチとして、ＣＨＯ ＣＤ４７の細胞株に結合する直接標識された抗ＣＤ４７ｍＡｂの阻害／ブロッキング試験は、非ビオチン化ヒトＳＩＲＰ−α−ＦＣを使用して実行することができる。ＳＩＲＰα−ＦＣを使用してヒトＳＩＲＰα−ＦｃでトランスフェクトされたＬ細胞に結合するビオチン化ＣＤ４７−Ｆｃの阻害／ブロッキング試験も、また、評価されうる。
【０１３２】
３． ＳＩＲＰ−α−Ｆｃ機能アッセイ：
３．１ 免疫複合体刺激樹状細胞サイトカイン放出アッセイ：
末梢血単球（ＣＤ１４＋ ＣＤ１６−）、ならびに単球由来樹状細胞（ＤＣ）は、説明されるように調製される（Ｌａｔｏｕｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１：１６７：２５４７）。コンベンショナル（ＤＣｓ）は、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）で標識した抗ＣＤ１１ｃ（Ｂ−ｌｙ６）、系統マーカーに対するＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体の混合物、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、およびＣＤ５６、ならびにＡＰＣ−Ｃｙ７標識ＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４）を使用して、ＦＡＣＳアリア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によって、ＣＤ１１ｃ＋、系譜−として、＞９９％に達する純度で、単離される。ＡＰＣは、ＨＢ１０１無血清培地において、種々の濃度のヒトＳＩＲＰα−Ｆｃ（１〜２０μｇ／ｍｌの）の存在下で、１／４０．０００（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ）の黄色ブドウ球菌Ｃｏｗａｎ１で、または可溶性ＣＤ４０Ｌ（１μｇ ／ｍｌの）、およびＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ）で、刺激される。サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２３、ＩＬ−８およびＴＮＦ−α）放出は、２４時間または４８時間培養上清において、ＥＬＩＳＡ法によって、評価される。
【０１３３】
３．２ 混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ：
マイトマイシンＣ処理した成熟ＤＣ（ＳＡＣまたはＬＰＳ刺激）は、様々な刺激（ＤＣ）／応答因子（Ｔ細胞）率で、本発明の可溶性ポリペプチド（５〜５０μｇ／ｍｌ）の存在下で、または非存在下で、未分画同種ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ高）または記憶（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ低）成人ＣＤ４＋Ｔ細胞（１０６／ｍｌ）と共培養される。Ｔ細胞増殖（３Ｈチミジン取り込み）、およびＩＦＮ−γ放出は、５〜６日初代培養の培養上清において、評価される。
【０１３４】
４．喘息の治療におけるＳＩＲＰα−Ｆｃの使用のためのマウス動物モデルを用いたインビボのデータ：
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、０日目および５日目に、１ｍｇ Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ（Ｐｉｅｒｃｅ）に吸着した１０μｇのＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｇｒａｄｅ Ｖ）の腹腔内の注射によって、感作された。１２、１６、および２０日目に、マウスは、振動メッシュネブライザーシステム（オムロン）によって注入された０．５％ＯＶＡのエアロゾル（Ｓｉｇｍａ、Ｇｒａｄｅ Ｖ）で、３０分間感作された。最後の感作の２４時間後、７５ｍｇ／ｋｇペントバルビタールナトリウムの過剰摂取によって、マウスを屠殺し、採血した。ＢＡＬを、０．５ｍｌ生理食塩水で３回収集し、肺およびＭＬＮを単離した。肺の３分の１を、抗生物質を補ったＰＢＳ中で、すすぎ、小片に切断し、そして、平底２４ウェルプレート中で、２４時間、１０％ウシ胎児血清、５００Ｕ／ｍｌペニシリン、５００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、および１ｍＭ ２−ＭＥを補充した１ｍｌ ＲＰＭＩ１６４０（Ｗｉｓｅｎｔ Ｉｎｃ．）中で、培養した。ＭＬＮ細胞（４ｘ１０６細胞／ｍｌ）を、平底９６ウェルプレートにおいて、培養し、７２時間、ＯＶＡ（１００μ／ｍｌ）で再刺激した。全量ＢＡＬ細胞を、洗浄し、数え、抗ＣＣＲ３ ＰＥ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＣＤ３ ＦＩＴＣ（クローン１４５ −２Ｃ１１）、および抗Ｂ２２０ ＦＩＴＣ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）で、３０分間、染色した。Ｖａｎ Ｒｉｊｔ Ｌ．Ｓ．ら（Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００４年５月；２８８（１−２）：１１１−２１）に説明されるように、顆粒球は、顆粒状であり、非自家蛍光であり、ＣＤ３およびＢ２２０の発現を欠くことがわかった。好酸球は、ＣＣＲ３発現によって、好中球と区別された。リンパ球は、小さく、非顆粒状であり、非自家蛍光であり、ＣＤ３またはＢ２２０を発現し、そして、マクロファージ、および樹状細胞を含む他の単核細胞は、ＣＤ３、Ｂ２２０およびＣＣＲ３を欠いていた。ＤＣサブセットを同定するために、ｍＬＮｓ、および肺が、まず、リベラーゼで処理され、細かく刻まれ、細胞の数が、数えられた。肺の細胞懸濁液は、赤血球の溶解のために、ＮＨ４Ｃｌで処理し、染色の前に、洗浄した。細胞は、抗ＣＤ１１ｃ ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、または抗ＣＤ１１ｃ ＡＰＣ（クローンＮ４１８）、抗ＣＤ１１ｂ ＰＥ（Ｃａｌｔａｇ）、抗Ｉ−Ａｄ／Ｉ−Ｅｄ ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＧＲ１、抗Ｂ２２０ ＦＩＴＣ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、１２０Ｇ８ ＦＩＴＣ、および抗ＣＤ１０３−ビオチン化、続いて、ＳＡ−ＡＰＣ、またはＣＤ１０３ ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗ＣＤ４７、および抗ＳＩＲＰ−αｍＡｂで染色された。肺において、自家肺胞マクロファージは、分析のゲートから除外された。制御性Ｔ細胞を同定するために、抗ＣＤ４ ＦＩＴＣまたはＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ２５ ＰＥ（Ｃａｌｔａｇ）またはＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ４４ ＡＰＣ（クローンＩＭ７ ８．１）が使用された。生体外でのＩＬ−１３産生を測定するため、肥満細胞、および好塩基球が、まず、細胞外抗ＩｇＥ−ビオチン化、および抗ＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で同定され、そして、ＣＤ４ Ｔ細胞を、抗ＣＤ４ ＡＰＣで染色した。細胞は、固定し、透過処理し、そして、抗ＩＬ−１３ ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。細胞は、まず、細胞外マーカー（抗ＣＤ４ ＡＰＣおよび抗ＣＤ２５ ＦＩＴＣ）で染色し、固定し、透過処理し、そして、抗ＦｏｘＰ３ ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのキット）で染色した。肥満細胞、および好塩基球＋細胞質内ＩＬ−１３染色。すべてのデータは、ＦＡＣＳキャリバー、またはＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で得られ、ＣｅｌｌｑｕｅｓｔまたはＤＩＶＡソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析された。
【０１３５】
サイトカイン測定：
ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＥＬＩＳＡによって、ｍＬＮｓの培養上清、および肺外植片において測定される。
【０１３６】
ＯＶＡ感作および感作マウスからの縦隔ＬＮ細胞は、インビトロで、３日間、ＯＶＡタンパク質（１ｍｇ／ｍｌ）で再刺激され、そして、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３産生が、培養上清において、ＥＬＩＳＡ法によって定量化される。肺外植片は、完全培地において、一晩培養され、培養上清は、サイトカイン放出を測定するために収集される。
【０１３７】
結果：
アレルギー性喘息の処置におけるＳＩＲＰα−Ｆｃの使用するためのマウス動物モデルを用いるインビボのデータ：
ＣＤ４７、およびＳＩＲＰαは、ＳＩＲＰ−α＋ ＣＤ１０３− ＤＣ駆動Ｔｈ２免疫の開始および永続化における重要な分子として現れる。このように、それらは、治療的に肺炎症を低減させるために、そして、気道疾患を改善させるために、活かされる可能性がある。ここでは、アレルギー性気道炎症の進行に対するＳＩＲＰ−α、およびヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（ＳＩＲＰα−ＦＣ）の効果を評価した。ＯＶＡ免疫付与（図３ａ）の０および５日目に、ＳＩＲＰα−Ｆｃのいずれかを投与したＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＯＶＡエアロゾルの感作の後において、肺組織の炎症性細胞浸潤が、非常に少なかった、または、なかった（図３ｂ）。ＢＡＬＦにおける好酸球、好中球とリンパ球の強力な低減、または欠如が、起こり（図３ｃ）、これとともに、血清ＯＶＡ特異的ＩｇＥにおける下落（図３ｄ）、リンパ節の細胞数における５０％低減、およびｍＬＮｓにおけるＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３産生の強烈な阻害（図３ｅおよびｆ）が起こった。気道疾患の進行からの保護は、ＩＬ−１０の増加とも、ＩＦＮ−γ放出とも相関せず、これは、実際、処置されたマウスにおいても、抑制された（データは示さず）。次に、ＣＤ４７−およびＳＩＲＰα−ＦＣ−処置マウスの肺外植片の培養上清におけるサイトカイン、およびケモカイン放出を調べ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、およびエオタキシン放出は、阻害されたが、一方、ＩＬ−４発現は、変化しないままであったことを見出した（図３ｇおよびｈ）。
【０１３８】
次に、この阻害を制御し、気道疾患からの保護をもたらした潜在的な機序を探った。ＣＤ４７−Ｆｃを処置したマウスのｍＬＮｓにおけるＳＩＲＰ−α＋ ＣＤ１０３− 樹状細胞の蓄積の減少が見出された（図４ａ）。ＳＩＲＰα−Ｆｃの投与は、また、ＣＤ４７−Ｆｃで処置したＯＶＡ免疫マウスのｍＬＮｓにおけるＣＦＳＥ標識Ｔｇ Ｔ細胞の割合の低減につながった（図４ｂ）。最後に、ＳＩＲＰα−ＦＣ−処置マウスのｍＬｎｓにおける好酸球の割合および蓄積の減少が観察された（図４ｃ）。
【０１３９】
これらのデータは、初期銀感作におけるＣＤ４７／ＳＩＲＰα遮断が、ｍＬＮｓおよび肺における２型応答、ならびにＩｇＥ抗体依存性気道炎症を劇的に低減させたことを実証する。
【０１４０】
５．大腸炎の治療におけるＳＩＲＰα−Ｆｃの使用のためのマウス動物モデルを用いるインビボのデータ：
トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）（２または３ｍｇ）を、５０％のエタノールに溶解し、３．５Ｆカテーテルを介して、雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＷＴおよびＣＤ４７ ＫＯ）の大腸に滴下した。コントロールマウスは、エタノールのみを与えられた。マウスを、２４時間ごとに秤量し、２日目（早い時点）、または４日目に、屠殺した。慢性ＴＮＢＳ大腸炎モデルにおいて、０日目に、そして、７日目にもう一度、１．５ｍｇのＴＮＢＳを直腸内に注入し、１２日目に、マウスを屠殺した。血清、腸間膜リンパ節、および大腸を、さらなる分析のため、回収した。大腸は、下痢、癒着、腸壁の肥厚、および潰瘍の存在を考慮に入れるウォーレスの基準を使用して、肉眼的にスコア化した。それらは、また、アメホ（Ａｍｅｈｏ）の基準、粘膜下組織の肥厚、単核細胞を有する粘膜下層および固有層の浸潤、粘液枯渇、陰窩構造の損失、および浮腫に基づくスコアリングシステムを使用して、炎症の微視的マーカーについて、評価された（示さず）。組換えマウスＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質を、ＴＮＢＳ大腸炎の誘導の直前、およびその２４時間後に、腹腔内（１００μｇ／マウス）投与した。コントロールマウスは、生理食塩水のみを受けた。０日目、ＴＮＢＳ誘導の３０分前、および１日目における１００μｇ／動物のマウスＳＩＲＰα−Ｆｃの注入は、体重の損失として評価される疾患の進行を統計的に有意にブロックした。
【０１４１】
６．関節炎の治療におけるＳＩＲＰα−Ｆｃの使用のためのインビボのネズミ動物モデル：
コラーゲン誘導関節炎モデル：
ヒト結核菌が、フロイント完全アジュバントと混合され、十分に振盪される（＝溶液Ａ）。ウシコラーゲン溶液アリコートが、氷上で滅菌ＰＢＳとよく混合される（＝溶液Ｂ）。溶液Ａおよび溶液Ｂが、ナイーブ雄ＤＢＡ／１マウスに、乳濁液として、注入された。マウスが、ケタミンの滅菌ろ過液のｓ．ｃ．注入によって、麻酔される。昏睡時に、各マウスの尾の根が、剃毛され、続いて、マウスあたり０．１ｍｌのコラーゲン乳濁液（１００μｇのコラーゲンを含む）が、尾の付け根に、皮内注入される。１００μｌのコラーゲン／ＰＢＳ（１：５希釈）の第二の注入が、初回免疫後の２２日目に、腹腔内に与えられる（＝ 追加免疫）。腫れ、および疾患のスコアリングが、ＢｒａｎｄらによるＮａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００７；２（５）：１２６９−７５で説明するように評価される。
【０１４２】
７．本発明を実施に有用なアミノ酸および塩基配列：
【０１４３】
【表５】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤として使用するための、特に、たとえば、アレルギー性喘息、および炎症性腸疾患などの自己免疫および炎症性障害の予防または治療のための、可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチドに関する。本発明は、より具体的には、ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）の細胞外ドメイン、またはヒトＣＤ４７に結合する機能的な誘導体を含む薬剤として使用するための可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ４７は、反対細胞上のＳＩＲＰα（別名ＳＨＰＳ−１）およびＳＩＲＰγに結合する細胞表面糖タンパク質である。この相互作用は、免疫細胞機能の負の調節につながり、あるいは、細胞の接着および遊走を媒介するのに役立つことができる。ＣＤ４７を、自己免疫障害の処置において生物学的製剤として使用することが示唆されている（特許文献１）。対照的に、同様の治療目的のため、ＳＩＲＰαなどのＣＤ４７リガンドを使用できる可能性を示す証拠は、非常に少ない。一つの説明は、ＣＤ４７の普遍的な発現が、潜在的な薬物としてのＣＤ４７結合ポリペプチドの使用を妨げるであろうことである。非特許文献１によって示されるデータは、免疫グロブリンＦｃドメインと融合したＳＩＲＰαの細胞外ドメインでできた融合タンパク質が、マウスにおいて、皮膚由来の樹状細胞（ＤＣ）から流入領域リンパ節への遊走を抑えることができ、それにより、マウスにおける接触過敏性反応を（少なくとも部分的に）減衰させることができることを示唆している。ＤＣの遊走および機能は、免疫または炎症反応に不可欠である。疾患の条件の下において、樹状細胞（ＤＣ）のこれらの悪化した応答は、病気の永続化につながりうる。組織からリンパ器官へ病原性樹状細胞（ＤＣ）が遊走することを妨げることは、自己免疫または炎症性疾患を駆動する悪循環を止める魅力的な好機となるであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第１９９９／０４０９４０号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｙｕら、２００６年、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１２６，７９７−８０７
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ＳＩＲＰα−Ｆｃコンストラクトが、疾患の動物モデルにおけるＴｈ１／Ｔｈ１７−およびＴｈ２−駆動疾患を予防または停止するのに適していることを示す最初のインビボでの証拠を提供する。これらのデータは、本発明の基礎を提供し、ＳＩＲＰα由来タンパク質治療の薬物能を裏付ける。本発明は、部分的には、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα経路を操作することが、免疫原性ＣＤ１０３−樹状細胞により駆動されるＴｈ１／Ｔｈ１７−駆動疾患（関節炎および大腸炎）、およびＴｈ２駆動疾患（喘息）の発症を抑制するという発見に基づく。これらの新しい研究結果は、疾患の根本原因における未知の共通の機構を提供し、複数の自己免疫および炎症性障害の処置の見込みを表している。なお、公表された報告における最近の証拠は、ＣＤ４７のライゲーションが、いくつかの癌の治療のために有益であることを示す（Ｍａｊｅｔｉ ｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ ２００９）。この報告は、ＣＤ４７抗体の使用を示すが、他方、本発明は、ＳＩＲＰα由来ポリペプチドをこれらの疾患の処置のために使用することに関する。
【０００６】
したがって、１つの実施態様において、本発明は、ａ）ＳＩＲＰαの細胞外ドメイン（配列番号３）、ｂ）配列番号１の断片、および、ｃ）配列番号３と少なくとも７５％の同一性を有する配列番号１の変異体ポリペプチドからなる群から選ばれるＳＩＲＰα由来のポリペプチドを含む、薬剤として使用するための可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチドを提供し、ここに、前記ＳＩＲＰα由来ポリペプチドは、ヒトＣＤ４７（配列番号２４）に結合する。特定の実施態様において、配列番号３の変異体ポリペプチドは、配列番号３と少なくとも、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一である。
【０００７】
読みやすさのため、本発明の可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチドは、以下、「本発明の可溶性ポリペプチド」と呼ぶ。
【０００８】
１つの実施形態では、前記ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、ＣＤ４７の拮抗剤、すなわち、ＣＤ４７リガンドのＣＤ４７への結合を競合的に阻害するポリペプチドの中から選ばれる。ＣＤ４７リガンドは、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰγまたはＴＳＰ１を含み、これらに限定されない。
【０００９】
別の実施形態では、ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、ＣＤ４７アゴニスト、すなわち、ＣＤ４７シグナル伝達活性を誘導することができるポリペプチドから選ばれる。
【００１０】
１つの実施形態では、前記可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチドは、２μＭまたはそれ未満のＫＤでヒトＣＤ４７に結合するもの、および／または、免疫複合体刺激樹状細胞サイトカイン放出アッセイにおいて測定した場合に、誘導されたサイトカイン分泌を阻害するものから選ばれる。
【００１１】
別の実施形態では、前記ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、少なくともＳＩＲＰαのＶ領域（配列番号２）を含むＳＩＲＰαの細胞外ドメインである。
【００１２】
特定の実施態様において、本発明の可溶性ポリペプチドは、第二の異種ポリペプチドに融合したＳＩＲＰα由来ポリペプチドからなる第一のコンポーネントを含む融合ポリペプチドである。１つの実施形態において、可溶性ポリペプチドは、さらに、第二の異種ポリペプチドとＳＩＲＰα由来ポリペプチドの間にスペーサーを含む。１つの特定の実施態様において、ＳＩＲＰα由来ポリペプチドは、ＩｇＧ Ｆｃドメインに融合している。好ましい実施形態において、前記Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのサイレントＦｃ断片である。１つの実施形態において、前記Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１アイソタイプの非グリコシル化突然変異体である。
【００１３】
別の関連する態様において、本発明の可溶性ポリペプチドは、自己免疫および炎症性障害の処置における薬物として使用される。好ましい適応症は、Ｔｈ２媒介性気道炎症、アレルギー性障害、喘息、炎症性腸疾患、虚血性障害からなる群から選ばれる。加えて、本発明の可溶性ポリペプチドは、白血病または癌の処置における薬物として使用してもよい。
【００１４】
本発明を、より容易に理解することができるようにするため、特定の用語が最初に定義される。さらなる定義は、詳細な説明を通して記載される。
【００１５】
用語ＣＤ４７は、ヒトＣＤ４７を意味する。ヒトＣＤ４７は、配列番号２４を含み、また、たとえば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む任意の自然多型、またはヒトＣＤ４７のスプライス変異体を含む。ヒトに見出されるＣＤ４７塩基配列中のスプライス変異体またはＳＮＰの例は、表１に記載される。
【００１６】
【表１】
【００１７】
用語ＳＩＲＰαは、ＣＤ４７インテグリン関連タンパク質との接着を示すシグナル伝達調節タンパク質アルファ（ＣＤ１７２ａまたはＳＨＰＳ−１とも呼ばれる）を意味する。いくつかの実施形態において、用語ＳＩＲＰαは、配列番号２３において定義されるヒトＳＩＲＰαを意味する。ヒトＳＩＲＰαは、１つのＶ型ドメイン（配列番号２）、および２つのＣ１型のＩｇドメインを有するアミノ酸細胞外ドメイン（配列番号３）、ならびに３つの潜在的Ｎ−グリコシル化部位を含む。これは、リン酸化した場合に、チロシンホスファターゼＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２を動員するＩＴＩＭモチーフを有する１１０個のアミノ酸細胞質配列を持つ。用語ヒトＳＩＲＰαは、さらに、たとえば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む任意の天然多型、またはヒトＳＩＲＰαのスプライス変異体を含むが、これらに限定されない。ヒトに見出されるＳＩＲＰα塩基配列におけるスプライス変異体またはＳＮＰの例は、表２に記載される。
【００１８】
【表２】
【００１９】
本明細書において、任意の膜貫通ドメインが欠けている場合には、または、ポリペプチドを発現する細胞の膜にポリペプチドを固定する若しくは組込むタンパク質ドメインが欠けている場合には、そのようなポリペプチドは、「可溶性」である。特に、本発明の可溶性ポリペプチドは、同様に、ＳＩＲＰαの膜貫通および細胞内ドメインを除いてもよい。
【００２０】
本明細書において、「ＣＤ４７に結合する」ポリペプチドは、２０μＭまたはそれ未満、２μＭまたはそれ未満、０．２μＭまたはそれ未満のＫＤでヒトＣＤ４７に結合するポリペプチドを意味することが意図されている。いくつかの実施態様において、ＣＤ４７に結合するポリペプチドは、さらに、サーファクタントプロテインＡ（ＳＰ−Ａ）および／またはサーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）に結合する。
【００２１】
本明細書において、免疫複合体刺激樹状細胞サイトカイン放出アッセイにおいて測定した場合に誘導されたサイトカイン分泌を阻害するポリペプチドとは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ）Ｃｏｗａｎ１（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ）、または可溶性ＣＤ４０Ｌ、およびＩＦＮ−γで刺激した末梢血単球、コンベンショナル樹状細胞（ＤＣ）、および単球由来樹状細胞からのサイトカイン（たとえば、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２３、ＩＬ−８および／またはＴＮＦ−α）放出を阻害するポリペプチドである。免疫複合体刺激樹状細胞サイトカイン放出アッセイの一例は、以下の実施例で詳細に記載する。いくつかの態様において、本発明の可溶性ポリペプチドは、免疫複合体刺激樹状細胞サイトカイン放出アッセイで測定した場合に、１μＭもしくはそれ未満、１００ｎＭもしくはそれ未満、または１０ｎＭもしくはそれ未満のＩＣ５０でサイトカイン分泌を阻害する。
【００２２】
本明細書においては、Ｔ細胞増殖を阻害するポリペプチドは、実施例で説明するように、混合リンパ球反応アッセイにおいて測定してもよい。
【００２３】
本明細書において、用語「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」は、特定のタンパク質−タンパク質相互作用の会合速度を意味することが意図されており、他方、本明細書において、用語「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」は、特定のタンパク質−タンパク質相互作用の解離速度を意味することが意図されている。本明細書において、用語「ＫＤ」は、解離定数を意味することが意図されており、Ｋａに対するＫｄの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。タンパク質−タンパク質相互作用のためのＫＤ値は、当技術分野でよく確立された方法を用いて測定することができる。タンパク質−タンパク質相互作用のＫＤを測定するための方法は、表面プラズモン共鳴を使用することによるか、あるいは、ビアコア（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによる。
【００２４】
本明細書において、用語「親和性」は、単一の部位におけるポリペプチドおよびその標的との間の相互作用の強さを意味する。各部位内において、ポリペプチドの結合領域は、弱い非共有結合力を介して数多くの部位におけるその標的と相互作用する。相互作用がより多ければ、親和性は、より強力になる。
【００２５】
本明細書において、結合ポリペプチドについての用語「高親和性」は、その標的に対し、１０ｎＭまたはそれ未満、たとえば、１ｎＭまたはそれ未満のＫＤを有するポリペプチドを意味する。
【００２６】
本明細書において、用語「対象」は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。
【００２７】
用語「非ヒト動物」は、すべての脊椎動物、たとえば、非ヒト霊長類、ヒツジ、犬、猫、馬、牛、鶏、両生類、爬虫類などの哺乳類および非哺乳類を含む。
【００２８】
本明細書において、用語「最適化」は、産生細胞または生命体において好まれるコドン、真核細胞、たとえば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）またはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の細胞、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の細胞、チャイニーズハムスター（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ）卵巣細胞（ＣＨＯ）、またはヒト細胞か、あるいは、原核細胞、たとえば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の菌株のいずれかにおいて好まれるコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように、塩基配列が改変されたことを意味する。
【００２９】
最適化された塩基配列は、完全に、または可能な限り多く、開始ヌクレオチド配列によって当初コードされるアミノ酸配列を保持するように設計され、「親」配列としても知られる。ここで最適化された配列は、対応する産生細胞や生命体、たとえば、哺乳動物細胞において好まれるコドンを持つように設計されてきたが、他の原核または真核細胞におけるこれらの配列の最適化した発現も、ここで想定される。最適化された塩基配列によってコードされるアミノ酸配列も、また、最適化と呼ばれる。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の様々な側面は、以下のサブセクションでさらに詳細に説明される。
【００３１】
ＣＤ４７の機能特性に対する本発明の可溶性ポリペプチドの効果を評価するアッセイは、実施例においてさらに詳細に記載されている。
【００３２】
ＳＩＲＰα由来のポリペプチド
本発明の可溶性ポリペプチドは、ａ）ＳＩＲＰαの細胞外ドメイン（配列番号３）、ｂ）配列番号３の断片、およびｃ）配列番号３の変異体ポリペプチドからなる群から選ばれるＳＩＲＰα由来のポリペプチドを含み、ここに、前記ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、ヒトＣＤ４７（配列番号２４）に結合する。
【００３３】
本発明の可溶性ポリペプチド、およびそのＳＩＲＰα由来の断片は、ＣＤ４７に結合する能力を保持するべきである。したがって、配列番号３の断片は、ＳＩＲＰαのＣＤ４７結合ドメインを含むそれらの断片から選択することができる。これらの断片は、一般的には、ＳＩＲＰαの膜貫通および細胞内ドメインを含まない。非制限的で例示的な実施形態において、ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、本質的に配列番号３または配列番号２で構成される。ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、さらに、配列番号３の変異体ポリペプチドを含むが、これに制限されず、ここに、アミノ酸残基は、アミノ酸の欠失、挿入または置換により変異されたが、ネイティブの配列の変更が、分子の生物学的活性に、特にＣＤ４７に対する結合に実質的に影響しない限り、配列番号３に対して少なくとも６０、７０、８０、９０または９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、これは、配列番号２と比較して、ＳＩＲＰα由来のポリペプチドにおけるわずか１、２、３、４または５のアミノ酸が、アミノ酸の欠失、挿入または置換によって変異されているにすぎない変異アミノ酸配列を含む。変異アミノ酸配列の例としては、単一ヌクレオチド多型（表２参照）に由来する配列が挙げられる。
【００３４】
本明細書において、２つの配列間の％同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れて、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性 ＝ 同一の位置の＃／合計の同一の位置の＃ × １００）。配列の比較、および２つの配列間の％同一性の決定は、以下に述べるように、数学的なアルゴリズムを使用して実行することができる。
【００３５】
２つのアミノ酸配列の間の％同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれ、ＰＡＭ１２０重み残基テーブル、１２のギャップ長のペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用するＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７，１９８８）のアルゴリズムを使用して決定することができる。また、２つのアミノ酸配列の間の％同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムに組み込まれ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）、ブロッサム６２マトリックス、またはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用するＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３，１９７０）のアルゴリズムを使用して決定することができる。
【００３６】
特定の実施態様において、ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、保存的なアミノ酸置換を含む配列番号２または配列番号３への変更を含む。
【００３７】
保存的なアミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されてきた。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分岐側鎖を有するアミノ酸（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、ＳＩＲＰα由来ポリペプチドのＣＤ４７結合領域内の１または複数のアミノ酸残基は、同一の側鎖ファミリーから他のアミノ酸残基に置換することができ、新たなポリペプチド変異体は、本明細書に記載した結合または機能アッセイを使用して、保持された機能について試験することができる。
【００３８】
いくつかの実施態様において、ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、免疫複合体刺激樹状細胞サイトカイン放出アッセイで測定して、ヒトＳＩＲＰαの細胞外ドメインを含む配列番号３のポリペプチドと少なくとも同程度にサイトカイン分泌を阻害する能力を保持するものの間から選択される。
【００３９】
いくつかの態様において、ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、混合リンパ球反応アッセイで測定してＴ細胞の増殖を阻害する能力を保持するものの間から選択される。
【００４０】
別の実施形態において、ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、非ヒト霊長類ＣＤ４７とクロス反応するものの中から選ばれる。
【００４１】
融合ポリペプチド
１つの側面において、本発明の可溶性ポリペプチドは、ＳＩＲＰα由来のポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。
【００４２】
好ましい実施形態において、本発明の可溶性ポリペプチドは、ＳＩＲＰα由来のポリペプチド、および第２の異種アミノ酸配列、たとえば、ＳＩＲＰα由来のポリペプチドのＮ−および／またはＣ−末端においてＳＩＲＰα由来のポリペプチドに共有結合し、必要に応じて、さらに、リンカーを含む、ＳＩＲＰα以外の１または複数のタンパク質の部分を含む融合ポリペプチドである。
【００４３】
非ＳＩＲＰα由来のタンパク質は、好ましくは、他の異種タンパク質と融合したときに、血液中の得られる融合タンパク質の半減期を増加させることができる可溶性単鎖ポリペプチドである。これに代えて、またはそれに加えて、非ＳＩＲＰα由来のタンパク質は、融合ポリペプチドの多量体化のためのドメインを含む。
【００４４】
非ＳＩＲＰα由来のタンパク質は、たとえば、免疫グロブリンは、血清アルブミンおよびそれらの断片であることができる。非ＳＩＲＰα由来のタンパク質は、また、対象において投与した場合に分子の半減期を増大させるために、血清アルブミンタンパク質に結合することができるポリペプチドであることができる。このようなアプローチは、たとえば、ＮｙｇｒｅｎらによるＥＰ０４８６５２５に説明されている。
【００４５】
１つの特定の実施態様において、非ＳＩＲＰα由来のタンパク質は、Ｆｃドメインである。ヒトにおける増大したインビボでの半減期を有する可溶性コンストラクトを作製するためのＦｃ部分の使用は、当技術分野でよく知られており、たとえば、Ｃａｐｏｎら（ＵＳ５，４２８，１３０）に記載されている。
【００４６】
本明細書において、用語「Ｆｃドメイン」は、免疫グロブリンの定常領域を意味する。Ｆｃドメインは、少なくとも、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、必要に応じて、重鎖ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２の間に位置するヒンジ領域を含む。Ｆｃ断片は、たとえば、免疫グロブリンのパパイン分解などにより得ることができた。本明細書において、用語Ｆｃドメインは、さらに、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失、または挿入が導入されたＦｃ変異体を含む。
【００４７】
１つの実施形態において、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が、改変されるように、たとえば、増大または減少するように、ＣＨ１のヒンジ領域は、修飾される。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒらの米国特許第５６７７４２５に、さらに記載されている。たとえば、軽鎖および重鎖の集合を促進するように、または、融合ポリペプチドの安定性を増大させ、または減少させるように、ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、改変される。
【００４８】
別の実施形態において、Ｆｃ領域は、その生物学的半減期を増大させるために修飾される。様々なアプローチが可能である。Ｗａｒｄによる米国特許第６２７７３７５に記載されるように、たとえば、１または複数の次の変異が導入されうる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。
【００４９】
他の実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸残基を、異なるアミノ酸残基に置換し、Ｆｃ部分のエフェクター機能を改変することによって、Ｆｃ領域は、改変される。Ｆｃ部分が、エフェクターリガンドへの親和性を改変するように、たとえば、１または複数のアミノ酸が、異なるアミノ酸残基に置換されることができる。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、たとえば、Ｆｃレセプター、または補体のＣ１コンポーネントであることができる。このアプローチは、いずれもＷｉｎｔｅｒらによる米国特許第５６２４８２１および５６４８２６０に詳細に記載されている。
【００５０】
別の実施形態において、得られたＦｃ部分が、改変したＣ１ｑ結合、および／または、減少したまたは消失した補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を有しているように、アミノ酸残基から選択された１または複数のアミノ酸は、異なるアミノ酸残基に置換することができる。このアプローチは、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらの米国特許第６１９４５５１に詳細に記載されている。
【００５１】
別の実施形態において、１または複数のアミノ酸残基は、補体を固定するＦｃ領域の能力を改変するように改変される。このアプローチは、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１にさらに記載されている。
【００５２】
さらに別の態様において、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する融合ポリペプチドの能力を増大させるために、および／またはＦｃγレセプターに対するＦｃ領域の親和性を増大させるまたは減少させるために、Ｆｃ領域は、１または複数のアミノ酸の修飾によって修飾される。このアプローチは、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公報ＷＯ００／４２０７２に詳しく記載されている。また、ＦｃγＲｌ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１における結合部位は、マップされており、改善した結合を有する変異体が、記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４を参照）。
【００５３】
１つの実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒト起源であり、ＩｇＧまたはＩｇＡのような免疫グロブリンのクラスのいずれかからのものであってよく、また、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４などの任意のサブタイプからのものであってよい。他の実施形態において、Ｆｃドメインは、非ヒト動物からのものであり、たとえば、マウス、ラット、ウサギ、ラクダ、サメ、非ヒト霊長類、またはハムスターなどからのものであるが、これらに限定されない。
【００５４】
特定の実施態様において、ＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインが使用される。いくつかの特定の実施形態において、ＩｇＧ１ Ｆｃ断片の突然変異体が使用され、たとえば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する、および／またはＦｃγレセプターに結合する融合ポリペプチドの能力を減少させるまたは除去するサイレントＩｇＧ１ Ｆｃが使用される。ＩｇＧ１のアイソタイプのサイレント変異の例は、いわゆるＬＡＬＡ変異であり、ここで、ＨｅｚａｒｅｈらによるＪ．Ｖｉｒｏｌ，２００１，Ｄｅｃ；７５（２４）：１２１６１−８に説明されるように、アミノ酸位置２３４および２３５においてロイシン残基は、アラニン残基に置換される。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの位置２９７の残基におけるグリコシル化を妨げる変異である。たとえば、Ｆｃドメインの位置２９７におけるアスパラギン残基のアミノ酸置換が挙げられる。このようなアミノ酸置換の例は、グリシンまたはアラニンによるＮ２９７の交換である。
【００５５】
１つの実施形態において、Ｆｃドメインは、二量体化ドメインを含み、ここで、二量体化ドメインは、好ましくは、このようなＦｃドメインを含む２つの融合ポリペプチドの間の共有ジスルフィド架橋を作ることができるシステインを介する。
【００５６】
ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、非ＳＩＲＰα由来のタンパク質にインフレームで直接に、またはポリペプチドリンカ（スペーサー）を介して融合させることができる。このようなスペーサーは、単一のアミノ酸（たとえば、グリシン残基）、または５００から１００の間のアミノ酸、たとえば、５０から２０の間のアミノ酸であってもよい。リンカーは、ＣＤ４７に対する結合部位を形成するための適切な空間的な配置をとるために、ＳＩＲＰα由来のドメインを許容するべきである。適当なポリペプチドリンカーは、柔軟な配置を採用したものの間で選択してもよい。このようなリンカーの例は、グリシンおよびセリン残基を含むリンカーであり、たとえば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ ここで ｎ＝ １−１２ であるが、これらに限定されない。
【００５７】
グリコシル化修飾
さらに別の態様において、本発明の可溶性ポリペプチドのグリコシル化パターンは、ＣＨＯ、またはヒト細胞株において得られるもののような典型的な哺乳類のグリコシル化パターンと比較して、改変することができる。たとえば、非グリコシル化ポリペプチドは、グリコシル化を欠くように設計された宿主細胞または哺乳動物細胞として、原核細胞株を使用することによって、行うことができる。糖質の修飾は、たとえば、可溶性ポリペプチド内の１または複数のグリコシル化部位を改変することによって達成することもできる。
【００５８】
これに加えて、またはこれに代えて、グリコシル化ポリペプチドは、グリコシル化の改変されたタイプを持つように作製することができる。このような糖質の変更は、たとえば、改変されたグリコシル化機構を有する、すなわち、可溶性ポリペプチドのグリコシル化パターンが、対応する野生型細胞において観察されるグリコシル化パターンと比較して改変される宿主細胞において、可溶性ポリペプチドを発現することによって達成することができる。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、当技術分野で説明されてきており、本発明の組換え可溶性ポリペプチドを発現させることにより、改変されたグリコシル化を有するこのような可溶性ポリペプチドを産生する宿主細胞として使用されうる。たとえば、ＨａｎｇらによるＥＰ１１７６１９５は、機能的に破壊したＦＵＴ８遺伝子、フコース転移酵素をコードする遺伝子を有する細胞株を説明し、このような細胞株において発現された糖タンパク質は、低フコシル化を示す。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５は、Ａｓｎ（２９７）が連結された糖質にフコースを添付する能力が低下し、また、その結果、宿主細胞内で発現した糖タンパク質の低フコシル化が起こっている変異体ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃｌ３細胞について説明している（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０も参照のこと）。また、本発明の可溶性ポリペプチドは、哺乳動物様グリコシル化パターンのために設計された、たとえば、ピキアパトリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母において、または、たとえば、トリコデルマリーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）などの糸状菌において、製造することができる（たとえば、ＥＰ１２９７１７２Ｂ１参照）。これらの糖設計された宿主細胞の利点は、とりわけ、均質なグリコシル化パターン、および／または高収量を有するポリペプチド組成物を提供することである。
【００５９】
可溶性ポリペプチドのＰＥＧ化および他の抱合体
本発明によって企図されている別の実施形態の本明細書における可溶性ポリペプチドは、ＰＥＧ化されている。たとえば、本質的にＳＩＲＰα由来ポリペプチドからなる本発明の可溶性ポリペプチドは、ＰＥＧ化されうる。ＰＥＧ化は、ＰＥＧ化のない同一の生物学的製剤と比較して、得られた生物学的製剤の生物学的（たとえば、血清の）半減期を増大させる、よく知られている技術である。ポリペプチドをＰＥＧ化するには、通常、１または複数のＰＥＧ基がポリペプチドに付着する条件下において、ポリペプチドが、ＰＥＧの反応性エステル、またはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との反応に供される。ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応、またはアルキル化反応により実施することができる。本明細書において、用語「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質を誘導体化するために使用された任意のＰＥＧの形式、たとえば、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを包含することが意図されている。タンパク質をＰＥＧ化する方法は、当技術分野で知られており、本発明の可溶性ポリペプチドに適用することができる。たとえば、ＮｉｓｈｉｍｕｒａらによるＥＰ０１５４３１６、およびＩｓｈｉｋａｗａらによるＥＰ０４０１３８４を参照されたい。
【００６０】
代わりの抱合体または高分子担体は、特に、得られた抱合体の薬物動態的特性を向上させるために使用することができる。高分子担体は、少なくとも１つの天然または合成の分岐、直鎖状または樹枝状ポリマーを含んでもよい。高分子担体は、好ましくは、水や体液に可溶であり、好ましくは薬学的に許容されるポリマーである。水溶性ポリマー部分は、たとえば、ＰＥＧ、ＰＥＧホモポリマー、ｍＰＥＧ、ポリプロピレングリコールホモポリマー、プロピレングリコールとエチレングリコールの共重合体を含む、ポリアルキレングリコール、およびその誘導体、ここに、前記ホモポリマーおよび共重合体は、非置換であり、または、たとえば、アシル基に１の末端において置換されている；ポリグリセリンまたはポリシアル酸；メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含む糖質、多糖類、セルロースおよびセルロース誘導体；澱粉（たとえば、ヒドロキシアルキル澱粉（ＨＡＳ）、特にヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）、およびデキストリン、並びにこれらの誘導体）；デキストラン硫酸、架橋性デキストリン、およびカルボキシメチルデキストリンなどのデキストラン、およびデキストラン誘導体；キトサン（直鎖多糖類）、ヘパリンおよびヘパリンの断片；ポリビニルアルコール、ポリビニルエチルエーテル；ポリビニルピロリドン；α，β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド］；およびポリオキシ−エチル化ポリオールを含むが、これらに限定されない。
【００６１】
可溶性ポリペプチドの薬剤としての使用
本発明の可溶性ポリペプチドは、動物モデルにおいて、アレルギー性喘息、炎症性腸疾患などの炎症性障害から保護することが示された。したがって、本発明の可溶性ポリペプチドは、特に、炎症性および／または自己免疫応答、特に対象におけるＳＩＲＰα＋細胞によって媒介される応答を（統計的または生物学的に有意な態様で）低下し、または抑制する薬剤として使用することができる。
【００６２】
本発明の可溶性ポリペプチドをコードする核酸分子
本発明の別の側面は、本発明の可溶性ポリペプチド、または少なくともＳＩＲＰα由来のポリペプチド（融合ポリペプチドに関連する実施形態を含みこれに限定されない）をコードする核酸分子に関連する。本発明の可溶性ポリペプチドをコードする塩基配列の例は、配列番号２６または２７を含む。
【００６３】
核酸は、全細胞において、細胞溶解物において、存在してもよく、または、部分的に精製され、または実質的に純粋な形である核酸であってもよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、塩化セシウム結合、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野でよく知られている他のものなどの標準的な技術により、他の細胞成分または他の汚染物質、たとえば、他の細胞の核酸やタンパク質を精製したとき、「単離された」または「実質的に純粋にされた」ものである。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集の１９８７年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。本発明の核酸は、たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡであることができ、または、イントロン配列を含まなくてもよい。ある実施態様において、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。核酸は、ファージディスプレイベクターなどのベクターにおいて、または組換えプラスミドベクターにおいて存在することができる。
【００６４】
いったん、本発明の可溶性ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片、たとえば、上で説明したようなＳＩＲＰα由来ポリペプチドを含む融合ポリペプチドが得られれば、これらのＤＮＡ断片は、さらに標準的な組換えＤＮＡ技術によって操作して、たとえば、発現系における適切な分泌のための任意のシグナル配列、さらなる精製工程のための任意の精製タグと切断タグを含めることができる。これらの操作において、ＤＮＡ断片は、別のＤＮＡ分子に、または精製／分泌タグもしくは柔軟性のあるリンカーなどの別のタンパク質をコードする断片に、作動可能なように連結される。この文脈で使用される用語「作動可能なように連結される」は、２つのＤＮＡ断片が、たとえば、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列が、インフレームのままであるように、またはタンパク質が、所望のプロモーターの制御下に発現されるように、機能的な態様で結合されることを意味するものとする。
【００６５】
ＳＩＲＰα由来ポリペプチド、または可溶性ポリペプチドを産生するトランスフェクトーマの生成
本発明の可溶性ポリペプチドは、当技術分野でよく知られているように、たとえば、組換えＤＮＡ技術、および遺伝子導入法を組み合わせて使用して、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて製造することができる。
【００６６】
たとえば、本発明の可溶性ポリペプチド、またはＳＩＲＰα由来ポリペプチドなどのその中間体を発現するため、対応するポリペプチドをコードするＤＮＡは、標準的な分子生物学的技術（たとえば、関心のあるポリペプチドを発現するハイブリドーマを用いたＰＣＲ増幅、またはｃＤＮＡクローニング）によって得ることができ、該ＤＮＡは、対応する遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能なように連結されるように、発現ベクターに挿入されることができる。この文脈において、用語「作動可能なように連結されている」は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が遺伝子の転写および翻訳を制御する目的の機能を果たすように、遺伝子がベクターにライゲーションされることを意味することが意図されている。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞との互換性があるように選択される。可溶性ポリペプチドまたは中間体をコードする遺伝子は、標準的な方法（たとえば、遺伝子断片における相補的制限酵素部位とベクターのライゲーション、または、制限部位が存在しない場合には、平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。これに加えて、またはこれに代えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞からのポリペプチド鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。遺伝子は、シグナルペプチドがポリペプチド鎖のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローニングされうる。シグナルペプチドは、ＳＩＲＰαシグナルペプチド、または異種シグナルペプチド（すなわち、ＳＩＲＰα配列に天然には関連しないシグナルペプチド）であることができる。
【００６７】
ポリペプチドをコードする配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。用語「調節配列」は、ポリペプチド鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー、および他の発現制御要素（たとえば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図されている。このような調節配列は、たとえば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ １９９０）において記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要因に依存しうることは、当業者に理解されるであろう。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列には、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０）（ＳＶ４０）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）（たとえば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、およびポリオーマ（ｐｏｌｙｏｍａ）など由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を方向付けるウイルス要素が含まれる。また、非ウイルス性調節配列は、ユビキチンプロモーターまたはＰ−グロビンプロモーターなどを用いることができる。さらに、調節要素は、ＳＶ４０初期プロモーター、およびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長末端反復配列を含むＳＲａプロモーターシステムなどの異なる出所からの配列で構成された（Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２）。
【００６８】
これに加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（たとえば、複製の起源）および選択マーカー遺伝子などの付加配列を有することができる。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（たとえば、いずれもＡｘｅｌらによる米国特許第４，３９９，２１６、４，６３４，６６５、および ５，１７９，０１７を参照）。たとえば、通常、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。選択マーカー遺伝子は、（メトトレキサート選択／増幅とともにｄｈｆｒ−宿主細胞のために使用される）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、および（Ｇ４１８選択のための）ｎｅｏ遺伝子を含む。
【００６９】
ポリペプチドの発現のため、可溶性ポリペプチドまたはＳＩＲＰα由来のポリペプチドなどの中間体をコードする発現ベクター（複数も可）は、標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。用語「トランスフェクション」の様々な形態は、原核生物または真核生物宿主細胞への外来性ＤＮＡの導入に一般的に使用される広範囲にわたる技術、たとえば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含することが意図されている。原核生物または真核生物宿主細胞のいずれかにおいて本発明の可溶性ポリペプチドを発現することは、理論的に可能である。真核生物、特に、哺乳動物宿主細胞における糖タンパク質の発現は、議論される。このような真核細胞、特に哺乳動物細胞は、原核細胞よりも、適切に折り畳まれ生物学的に活性な本発明の可溶性ポリペプチドのような糖タンパク質を会合させ、分泌しやすいためである。
【００７０】
可溶性ポリペプチド、および本発明のＳＩＲＰα由来ポリペプチドなどの中間体を発現するための哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ）卵巣（ＣＨＯ細胞）（たとえば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ，１９８２，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１などに記載されたＤＨ ＦＲ選択マーカーとともに用い、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６−４２２０に記載されたｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳＰ２細胞を含む）、またはヒト細胞株（ＰＥＲ−Ｃ６細胞株、Ｃｒｕｃｅｌｌを含む）を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞とともに使用するための別の発現システムは、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８，８４１に示されるＧＳ遺伝子発現システムである。ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが、哺乳動物宿主細胞に導入される場合、可溶性ポリペプチド、またはＳＩＲＰα由来のポリペプチドなどの中間体は、宿主細胞における組換えポリペプチドの発現、または宿主細胞を培養する培養培地中への組換えポリペプチドの分泌を可能にするために十分な期間、宿主細胞を培養することにより製造される。ポリペプチドは、標準的なタンパク質精製方法を使用して培養培地から回収することができる。
【００７１】
多価タンパク質
別の局面において、本発明は、ＣＤ４７に結合する２つの同一のまたは異なる本発明の可溶性ポリペプチドを少なくとも含む多価タンパク質を提供する。１つの実施形態において、多価タンパク質は、少なくとも２つ、３つまたは４つの本発明の可溶性ポリペプチドを含む。可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチドは、タンパク質融合または共有もしくは非共有結合を介して互いに連結することができる。本発明の多価タンパク質は、当技術分野で知られている方法を使用して、構成結合特異性を抱合することにより調製することができる。たとえば、多価タンパク質のそれぞれの結合特異性は、別々に生成され、互いに結合されることができる。
【００７２】
様々なカップリングまたは架橋剤が、共有結合のために使用することができる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、およびスルフォスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−ｌ−カルボン酸（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）（たとえば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６；Ｌｉｕ，ＭＡ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：８６４８などを参照されたい）を含む。他の方法には、Ｐａｕｌｕｓ，１９８５，Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．Ｎｏ．７８，１１８−１３２；Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１−８３、およびＧｌｅｎｎｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７−２３７５に記載されているものが含まれる。共有結合は、２つのシステインの間ジスルフィド架橋、たとえば、Ｆｃドメインのシステインからのジスルフィド架橋によって得ることができる。
【００７３】
特定の実施形態において、ＳＩＲＰα由来のポリペプチドに融合したＦｃドメインのヒンジ領域は、奇数の、たとえば１のスルフヒドリル残基を含むように、結合前に修飾される。あるいは、両方の結合特異性は、同じベクターにおいてコードし、同じ宿主細胞において発現し会合することができる。
【００７４】
医薬組成物
別の側面において、本発明は、薬学的に許容される担体と一緒に処方された本発明の可溶性ポリペプチドの１つまたは組み合わせを含む組成物、たとえば医薬組成物を提供する。
【００７５】
本発明の可溶性ポリペプチドを含む医薬製剤は、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０００））と、所望の純度を有するポリペプチドを、水溶液、凍結乾燥、または他の乾燥させた製剤の形態において、混合することにより、保存のために調製することができる。したがって、本発明はさらに、少なくとも本発明の可溶性ポリペプチドを含む凍結乾燥組成物に関する。
【００７６】
また、併用療法において、すなわち、他の薬剤と組み合わせて、本発明の医薬組成物を投与することもできる。たとえば、併用療法は、少なくとも１つの他の抗炎症剤または別の化学療法剤と組み合わせて、本発明の可溶性ポリペプチドを含むことができる。併用療法で使用することができる治療剤の例は、以下の本発明の可溶性ポリペプチドの使用のセクションで、より詳細に説明されている。
【００７７】
本明細書において、「薬学的に許容される担体」は、任意およびすべての溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、ならびに生理学的に互換性がある同等物を含む。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、経口、脊髄、または表皮の投与（すなわち、注射または注入による投与）に適しているべきである。投与経路に応じて、活性化合物は、酸、および該化合物を不活性化する可能性のある他の自然条件の作用から該化合物を保護するための材料で被覆することができる。
【００７８】
本発明の医薬化合物は、１または複数の薬学的に許容される塩を含むことができる。「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、かつ、任意の不要な毒物学的影響を与えない塩を意味する（たとえば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照）。このような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素、リンなどのような無毒性の無機酸に由来するもの、および脂肪族モノ−およびジ−カルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などのような無毒性の有機酸に由来するものを含む。塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのようなアルカリ土類金属に由来するもの、およびＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカミン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどのような無毒性の有機アミンに由来するものを含む。
【００７９】
本発明の医薬組成物は、また、薬学的に許容される抗酸化物質を含むことができる。薬学的に許容される抗酸化物質の例は、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化物質；パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化物質；クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤などを含む。
【００８０】
本発明の医薬組成物に用いることができる適切な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物、オリーブオイルなどの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルを含む。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどの被覆材料の使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。
【００８１】
これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの補助剤を含むことができる。微生物の存在の防止は、上記の滅菌の手順、およびたとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等の様々な抗菌および抗真菌剤を含めることの両方によって、確実にすることができる。また、組成物に、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが望ましい。また、注射可能な医薬品形態の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を含めることによってもたらされうる。
【００８２】
薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射可能溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体と薬剤の使用は、当該技術分野で知られている。任意の従来の媒体または薬剤に、活性化合物との適合性がない場合を除き、本発明の医薬組成物においてそれらを使用することが意図されている。補助的な活性化合物も、また、組成物に組み込むことができる。
【００８３】
治療組成物は、通常、製造および保存の条件下で滅菌であり、安定でなければならない。組成物は、高薬物濃度に適した溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、またはその他の秩序構造として処方することができる。担体は、たとえば、水、エタノール、およびポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒であることができる。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどの被覆剤の使用により、分散媒の場合には所望の粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。多くの場合、組成物には、たとえば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることができる。注射可能な組成物の長期吸収は、組成物に、モノステアリン酸塩およびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を含めることによってもたらされる。
【００８４】
滅菌注射溶液は、適当な溶媒中で、必要な量、活性化合物を、上記に列挙した成分の１または組み合わせとともに、組み込み、続いて、必要に応じて、滅菌精密ろ過を行うことによって、調製することができる。一般的に、分散媒は、基本的な分散媒体、および上記の列挙されたものから必要な他の成分が含まれている滅菌ビヒクルに、活性化合物を組み込むことにより、調製される。滅菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合には、調製の方法は、以前にフィルター滅菌されたそれの溶液から、活性成分、および任意の追加の所望の成分の粉末を得る、真空乾燥、およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【００８５】
単一の投薬形態を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される対象、および投与の特定の様式に依存して変化する。単一の投薬形態を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般的には、治療的効果を生じさせる組成物のその量であろう。一般的には、１００％のうち、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、活性成分の約０．０１％〜約９９％、活性成分の約０．１％〜約７０％、または約１％〜約３０％の範囲である。
【００８６】
投与計画は、最適な所望の応答（たとえば、治療応答）を提供するために調整される。たとえば、単一のボーラスが、投与されることができ、数回に分けられた投与量が、時間をかけて投与されることができ、または投与量が、治療状況の緊急性によって指示されるように、比例的に低減または増大させられることができる。特に投与の容易化および投薬量の均一性のために、投与単位形態で非経口組成物を処方することが有利である。本明細書において、投与単位形態は、処置される対象への単一投薬量として適した物理的に隔離された単位を意味し、各単位は、必要な薬学的な担体と組み合わせて所望の治療的効果を生むために計算された活性化合物のあらかじめ決められた量を含む。本発明の投薬量単位形態のための仕様は、活性化合物の固有の特性、達成されるべき特定の治療効果、および個人における感受性を処置するためのこのような活性化合物を配合する技術に本来的に備わっている限界によって、決定され、および直接に依存する。
【００８７】
本発明の可溶性ポリペプチドの投与のためには、投薬量は、投与を受ける者の体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり、より通常には、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。たとえば、投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重であることができ、または１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であることができる。典型的な治療計画は、１週間に１回の、２週間に１回の、３週間に１回の、４週間に１回の、１ヶ月に１回の、３ヶ月に１回の、または３〜６ヶ月に１回の投与を伴う。本発明の可溶性ポリペプチドの投与計画は、１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重の静脈内投与を行い、次の投与スケジュールの１つを用いてポリペプチドを与えることを含む：４週間ごとに６投与量、次に、３ヶ月ごと；３週間ごと；３ｍｇ／ｋｇ体重を一度、続いて１ｍｇ／ｋｇ体重を３週間ごと。
【００８８】
可溶性ポリペプチドは、通常、複数回投与される。単一投薬量の間の間隔は、たとえば、毎週、毎月、３ヶ月ごと、または年ごとであることができる。間隔は、患者における可溶性ポリペプチドの血中濃度を測定することによって示されるように、不規則であることができる。いくつかの方法において、投与量は、約１〜１０００μｇ／ｍｌ、いくつかの方法において約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿ポリペプチド濃度を達成するために調整される。
【００８９】
また、可溶性ポリペプチドは、徐放性製剤として投与することができ、その場合、必要な投与の頻度は、より低い。投薬量および頻度は、患者における可溶性ポリペプチドの半減期によって異なる。投薬量と頻度は、処置が、予防的であるか、治療的であるかによって異なりうる。予防的な適用においては、比較的低用量が、長期間にわたって、比較的まれな間隔で投与される。一部の患者は、自分たちの人生の残りのための処置を受け続ける。治療的適用においては、疾患の進行が低減されるまで、もしくは終了するまで、または、患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔での比較的高い投薬量が、必要である。その後、患者は予防的投与計画を行うことができる。
【００９０】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量は、患者に毒性であることなく、特定の患者、組成物、および投与様式について所望の治療応答を達成する効果的な活性成分の量が得られるように変化させることができる。選択された投薬量レベルは、採用される本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与時間、採用される特定の化合物の排泄率、処置の期間、採用される特定の組成物と組み合わせて用いられる他の薬物、化合物、および／または材料、処置を受ける患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態、および以前の病歴、ならびに医療分野でよく知られている同様の要因を含む薬物動態的な様々な要因に依存する。
【００９１】
本発明の可溶性ポリペプチドの「治療的に有効な投薬量」の結果、疾患の症状の重症度が低下し、疾患の無症状期間頻度および継続期間が上昇し、あるいは疾患の苦痛による障害または無力を予防することができる。
【００９２】
本発明の組成物は、当技術分野で公知の種々の１または複数の方法を使用して、１または複数の投与経路によって投与することができる。当業者によって理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて異なるであろう。
【００９３】
本発明の可溶性ポリペプチドを投与するための経路は、たとえば、注射または注入による、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、脊髄、または他の非経口投与経路を含む。本明細書において、語句「非経口投与」は、通常、注射による、経腸および局所投与以外の投与の様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節包内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、皮内、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および幹内の注射および注入を含むが、これらに限定されない。
【００９４】
また、本発明の可溶性ポリペプチドは、局所、表皮、または粘膜の投与経路などの経口経路によって、たとえば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下または局所的に、投与することができる。
【００９５】
活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含む放出制御製剤など、迅速な放出に反する化合物を保護するであろう担体とともに調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸など、生分解性、生体適合性ポリマーが、使用されうる。このような製剤の調製のための多くの方法が、特許を受けており、または当業者に広く知られている。たとえば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７８を参照されたい。
【００９６】
治療組成物は、当該技術分野で知られている医療機器を用いて投与することができる。たとえば、１つの実施形態において、本発明の治療組成物は、米国特許第５，３９９，１６３、５，３８３，８５１、５，３１２，３３５、５，０６４，４１３、４，９４１，８８０、４，７９０，８２４または４，５９６，５５６に示される装置などの無針皮下注射装置を用いて投与することができる。本発明において有用な、よく知られているインプラントおよびモジュールの例は、制御された速度で薬物を分配するための埋め込み型マイクロ注入ポンプを示す米国特許第４４８７６０３；皮膚を通して薬剤を投与するための治療装置を示す米国特許第４４８６１９４；正確な注入速度で薬物を輸送するための薬剤注入ポンプを示す米国特許第４４４７２３３；連続薬物輸送のための可変流量埋め込み型注入装置を示す米国特許第４４４７２２４；多チャンバーコンパートメントを有する浸透薬物輸送システムを示す米国特許第４４３９１９６；、および浸透薬物輸送システムを示す米国特許第４４７５１９６を含む。多くの他のこのようなインプラント、輸送システム、およびモジュールが当業者に知られている。
【００９７】
特定の実施態様において、本発明の可溶性ポリペプチドは、生体内で適切な分布を確実にするように処方することができる。たとえば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高親水性の化合物を除外する。本発明の治療化合物が、（必要に応じて）ＢＢＢを越えることを確実にするため、それらは、たとえば、リポソーム中に処方されることができる。リポソームを製造する方法については、たとえば、米国特許第４５２２８１１、５３７４５４８、および５３９９３３１を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送されそれゆえ標的薬物輸送を増進させる１または複数の部分を含んでもよい（たとえば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ，１９８９, Ｊ．Ｃｌｉｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照されたい）。典型的な標的部分は、葉酸またはビオチン（たとえば、Ｌｏｗらによる米国特許５，４１６，０１６を参照されたい）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｒｎｏｔｈｅｒ．３９：１８０）；サーファクタントプロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）；Ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０）を含む。Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ，１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ，１９９４，Ｉｍｒｎｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，４：２７３も参照されたい。
【００９８】
本発明の使用および方法
本発明の可溶性ポリペプチドは、インビトロおよびインビボの診断および治療の有用性を持つ。たとえば、これらの分子は、様々な障害を治療、予防、または診断するために、培養下の細胞に、たとえば、インビトロ、もしくはインビボで、あるいは、対象における細胞に、たとえば、インビボで、投与することができる。
【００９９】
本明細書において、用語「対象」は、ヒト、および非ヒト動物を含むことが意図されている。非ヒト動物は、たとえば、非ヒト霊長類、ヒツジ、犬、猫、牛、馬、鶏、両生類、爬虫類などの哺乳類および非哺乳類などのすべての脊椎動物を含む。
【０１００】
該方法は、たとえば、アレルギー性喘息または潰瘍性大腸炎など、ＳＩＲＰα＋細胞によって媒介される自己免疫および炎症性障害の治療、予防、または診断に、特に適している。これらは、炎症病状、アレルギーおよびアレルギー性病状、自己免疫疾患、虚血性障害、重症感染症、ならびに細胞、組織または臓器の異種移植（すなわち、異なる種から、たとえば、非ヒト種からヒトへの移植）を含む細胞、臓器または組織の移植拒絶反応を含む。
【０１０１】
自己免疫疾患の例は、関節炎（たとえば、関節リウマチ、関節炎慢性進行性関節炎および変形性関節炎）、および骨量減少を伴う炎症病状とリウマチ性疾患を含むリウマチ性疾患、炎症性痛覚、強直性脊椎炎を含む脊椎関節症、ライター症候群、反応性関節炎、乾癬性関節炎、および腸関連関節炎、過敏症（気道過敏症と皮膚過敏症の両方を含む）、ならびにアレルギーを含み、これらに限定されない。自己免疫疾患は、（たとえば、溶血性貧血、再生不良性貧血、純粋な赤血球貧血、または特発性血小板減少症を含む）自己免疫血液学的障害、全身性エリテマトーデス、炎症性筋障害、多発性軟骨炎、皮膚硬化症、ウェゲナー肉芽腫、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スティーブン−ジョンソン症候群、特発性スプルー、内分泌眼症、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿（糖尿病Ｉ型）、ブドウ膜炎（前部および後部）、乾性角結膜炎および春季カタル、間質性肺線維症、（たとえば、特発性ネフローゼ症候群、または微小変化型腎症を含むネフローゼ症候群がある、またはない）乾癬性関節炎および糸球体腎炎、腫瘍、多発性硬化症、皮膚および角膜の炎症性疾患、筋炎、骨のインプラントのゆるみ、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、および脂質異常症などの代謝性障害を含む。
【０１０２】
本発明の可溶性ポリペプチドは、喘息、気管支炎、じん肺、肺気腫、およびその他の気道の閉塞性または炎症性疾患の治療、予防、または改善にも有用である。
【０１０３】
本発明の可溶性ポリペプチドは、また、ＩｇＥ媒介性障害の処置にも有用である。ＩｇＥ媒介性障害は、多くの一般的な自然発生吸入および摂取抗原に対して免疫学的に応答する遺伝的性向、およびＩｇＥ抗体の継続的な産生によって特徴づけられるアトピー性障害を含む。特定のアトピー性障害は、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性胃腸疾患を含む。
【０１０４】
しかし、ＩｇＥレベル上昇に関連する疾患は、遺伝的な（アトピー）病因を伴うものに限定されない。ＩｇＥ媒介性であり、本発明の製剤で処置されるようであり、ＩｇＥレベル上昇に関連するその他の障害は、過敏症（たとえば、アナフィラキシー過敏症）、湿疹、じんま疹、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、寄生虫症、高ＩｇＥ症候群、血管拡張性失調症、ウィスコット−アルドリッチ症候群、胸腺リンパ形成不全症、高ＩｇＥ症、および移植片対宿主反応を含む。
【０１０５】
本発明の可溶性ポリペプチドは、単独の活性成分として、または他の薬物、たとえば免疫抑制、免疫調整剤、もしくは他の抗炎症剤と併用して、たとえば、アジュバントとして、または組み合わせて、たとえば、上記疾患の治療または予防のために、投与することができる。たとえば、本発明の可溶性ポリペプチドは、ＤＭＡＲＤ、たとえば、金塩、スルファサラジン、抗マラリア剤、メトトレキサート、Ｄ−ペニシラミン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ミノサイクリン、レフルノミド、糖性グルココルチコイド群；カルシニューリン阻害剤、たとえば、シクロスポリンＡまたはＦＫ ５０６；リンパ球再循環のモジュレーター、たとえば、ＦＴＹ７２０およびＦＴＹ７２０類似物；ｍＴＯＲ阻害剤、たとえば、ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、ＣＣＩ７７９、ＡＢＴ５７８、ＡＰ２３５７３またはＴＡＦＡ−９３；免疫抑制特性を有するアスコマイシン、たとえば、ＡＢＴ−２８１、ＡＳＭ９８１など；コルチコステロイド；シクロフォスファミド；アザチオプリン；メトトレキサート；レフルノミド；ミゾリビン；ミコフェノール酸；ミコフェノール酸モフェチル；１５−デオキシスペルグアリン、またはその免疫抑制ホモログ、アナログもしくは誘導体；免疫抑制モノクローナル抗体、たとえば、白血球受容体、たとえば、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６またはそれらのリガンドに対するモノクローナル抗体；他の免疫調整化合物、たとえば、ＣＴＬＡ４またはその変異体の細胞外ドメインの少なくとも一部を有する組換え結合分子、たとえば、非ＣＴＬＡ４タンパク質配列に結合したＣＴＬＡ４またはその変異体の少なくとも細胞外部分、たとえば、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（たとえば、ＡＴＣＣ ６８６２９と指定されるもの）またはその変異体、たとえばＬＥＡ２９Ｙ；接着分子阻害剤、たとえば、ＬＦＡ−１アンタゴニスト、ＩＣＡＭ−１または３アンタゴニスト、ＶＣＡＭ−４アンタゴニスト、またはＶＬＡ−４アンタゴニスト；または化学療法剤、たとえば、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル；抗ＴＮＦ剤、たとえば、ＴＮＦに対するモノクローナル抗体、たとえば、インフリキシマブ、アダリムマブ、ＣＤＰ８７０、またはＴＮＦ−ＲＩまたはＴＮＦ−ＲＩＩに対する受容体コンストラクト、たとえば、エタネルセプト、ＰＥＧ−ＴＮＦ−ＲＩ；炎症性サイトカインのブロッカー、ＩＬ−１ブロッカー、たとえば、アナキンラまたはＩＬ−１トラップ、ＡＡＬ１６０、ＡＣＺ ８８５、ＩＬ−６ブロッカー；ケモカインブロッカー、たとえば、プロテアーゼの阻害剤または活性化剤、たとえば、メタロプロテアーゼ、抗ＩＬ１５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＩＬ１７抗体、アスピリン、または抗感染剤などの非ステロイド性抗炎症薬（一覧は、上記の薬剤に限定されない）との組み合わせで使用することができる。
【０１０６】
本発明の可溶性ポリペプチドは、また、特に、上記で言及したものなどの閉塞性または炎症性気道疾患の処置における抗炎症または気管支拡張薬物物質と併用して使用するための共治療剤として、たとえば、そのような薬物の治療活性の増強剤として、またはそのような薬物の必要とする投与量、または起こりうる副作用を減少させる手段として、有用である。本発明の薬剤は、固定医薬組成物において抗炎症や気管支拡張薬物と混合されてもよく、または抗炎症または気管支拡張薬物と別々に、その前に、同時に、またはその後に投与されてもよい。このような抗炎症薬物は、ステロイド、特に、ブデソニド、ベクロメタゾン、フルチカゾンまたはモメタゾンなどのグルココルチコステロイド、およびカベルゴリン、ブロモクリプチンまたはロピニロールなどのドーパミン受容体アゴニストを含む。このような気管支拡張薬物は、抗コリンまたは抗ムスカリン剤、特に、臭化イプラトロピウム、オキシトロピウム、および臭化チオトロピウムを含む。
【０１０７】
本発明の薬剤とステロイドの組み合わせは、たとえば、ＣＯＰＤ、特に、喘息の治療において、使用されてもよい。本発明の薬剤、および抗コリン、もしくは抗ムスカリン剤、またはドーパミン受容体アゴニストの組み合わせは、たとえば、喘息、または、特に、ＣＯＰＤの処置において、使用されてもよい。
【０１０８】
上記によれば、本発明は、また、それを必要とする対象、特にヒト被験者に、前記で説明したように、可溶性ポリペプチドを投与することを含む、閉塞性または炎症性気道疾患の処置の方法を提供する。別の局面において、本発明は、本明細書中で説明するように、閉塞性または炎症性気道疾患を処置するための薬剤の製造における使用のための可溶性ポリペプチドを提供する。
【０１０９】
本発明の可溶性ポリペプチドは、また、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患などの慢性胃腸炎の治療、予防、または改善に、特に有用である。
【０１１０】
「慢性胃腸炎」は、比較的長い期間の発症によって特徴付けられ、（たとえば、数日間、数週間、数ヶ月、あるいは数年から、最大、被検者の最期まで）持続し、および、単核細胞の浸潤または流入に関連付けられ、自然寛解と自然発生の長さとさらに関連付けられることができる消化管の粘膜の炎症を意味する。したがって、慢性胃腸炎を有する被験者は、長期間の監視、観察、または注意を要すると予想されることがある。このような慢性炎症を有する「慢性胃腸炎症性病状」（「慢性胃腸炎症性疾患とも呼ばれる）は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、環境発作によって誘発される大腸炎（化学療法の投与、および放射線療法などの治療計画によって（たとえば、副作用として）引き起こされ、またはこれに関連付けられる、たとえば、消化管炎症（たとえば、大腸炎））、慢性肉芽腫症（Ｓｃｈａｐｐｉ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ Ｄｉｓ Ｃｈｉｌｄ．２００１，Ｆｅｂｒｕａｒｙ；１９８４（２）：１４７−１５１）などの病状における大腸炎、セリアック疾患、セリアック病（グルテンとして知られるタンパク質の摂取に応答して、腸の内層が炎症を起こす遺伝性疾患）、食物アレルギー、胃炎、感染性の胃炎または腸炎（たとえば、ヘリコバクターピロリ感染慢性活動性胃炎）、および他の形態の感染性病原体によって引き起こされる胃腸の炎症、ならびに他の同様の病状を含むが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１１１】
本明細書中において、「炎症性腸疾患」または「ＩＢＤ」は、腸のすべてまたは部分の炎症によって特徴づけられる任意の種々の疾患を意味する。炎症性腸疾患の例は、クローン病、および潰瘍性大腸炎を含むが、これに限定されない。明細書を通してＩＢＤへの言及は、しばしば、明細書において、胃腸炎症病状の例としての言及であり、制限的であることは意図されていない。
【０１１２】
上記によれば、本発明は、前記で説明した可溶性ポリペプチドを必要とする対象、特に、ヒト対象にこれを投与することを含む、瘍性大腸炎などの慢性胃腸炎、または炎症性腸疾患を処置する方法も提供する。別の局面において、本発明は、慢性胃腸炎または炎症性腸疾患の処置のための薬剤の調製における本明細書中で説明した可溶性ポリペプチドの使用を提供する。
【０１１３】
本発明は、白血病、または他の癌障害の治療、予防または改善において有用である。
【０１１４】
治療上有効な量の可溶性ポリペプチド、および少なくとも１つの第二薬物物質を、たとえば、併用して、または順に同時投与することを含む、上記で定義した方法も、また、本発明の範囲内に包含される。ここに、前記第二薬物物質は、たとえば、上に示した免疫抑制／免疫調整、抗炎症治療、または抗感染症薬物である。
【０１１５】
あるいは、治療的組み合わせ、たとえば、治療上有効な量のａ）本発明の可溶性ポリペプチド、およびｂ）たとえば、上に示した免疫抑制／免疫調整、抗炎症治療、または抗感染症薬物から選択される少なくとも１つの第二の物質からなるキット。該キットには、その投与のための指示を含むことができる。
【０１１６】
本発明の可溶性ポリペプチドが、他の免疫抑制／免疫調整、抗炎症治療、または抗感染症治療とともに投与される場合、もちろん、用いられる共薬物の型、処置を受ける病状などに応じて、同時投与の組み合わせの化合物の投与量は、異なるであろう。
【０１１７】
１つの実施形態において、本発明の水溶性ポリペプチドは、ＣＤ４７＋樹状細胞のレベル、またはＣＤ４７を含む細胞のレベルの検出に使用することができる。これは、たとえば、可溶性ポリペプチド、およびＣＤ４７発現細胞の間で複合体の形成を可能にする条件の下で、（インビトロサンプルなどの）サンプル、およびコントロールサンプルを、本発明の可溶性ポリペプチドと接触させることによって達成することができる。形成された任意の複合体は、サンプルおよびコントロールにおいて、検出され、比較される。たとえば、フローサイトメトリーアッセイなどの当技術分野で周知の標準的な検出方法が、本発明の組成物を使用して実行されうる。
【０１１８】
したがって、１つの側面において、本発明は、可溶性ポリペプチドおよびＣＤ４７の間の複合体の形成を可能にする条件下で、サンプル、およびコントロールサンプルを本発明の可溶性ポリペプチドと接触させることを含む、サンプルにおけるＣＤ４７（たとえば、ヒトＣＤ４７）の存在を検出する、またはＣＤ４７の量を測定する方法をさらに提供する。複合体の形成は、次に、検出され、ここに、複合体形成におけるコントロールのサンプルと比較したサンプルとの間の違いが、サンプルにおけるＣＤ４７の存在の指標となる。
【０１１９】
また、本発明の組成物、および使用説明書から構成されるキットも、本発明の範囲内である。キットは、さらに、少なくとも１つの付加的な試薬を含むことができる。典型的には、キットは、キットの内容物の使用目的を示すラベルを含む。ラベルという用語は、キットの上に、もしくはキットとともにある、または他にキットに付属している任意の書き込み、または記録材料を含む。キットは、上記のように定義された処置に応答するであろう群に属する患者であるかどうかを診断するための道具をさらに含んでもよい。
【０１２０】
十分に記述されてきた本発明は、さらに以下の実施例および請求の範囲によって、説明されるが、これは、例示的なものであり、さらに限定的であることを意味するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】ネズミＳＩＲＰα−Ｆｃは、ＣＤ４７＋／＋（ＷＴ）に結合するが、ＣＤ４７−／−（ＫＯ）細胞には結合しない。ＣＤ４７＋／＋（ＷＴ）またはＣＤ４７−／−（ＫＯ）ネズミ脾細胞に結合するネズミＳＩＲＰα−Ｆｃは、説明したようにフローサイトメトリーによって検出された。ＳＩＲＰα−Ｆｃ結合（ＳＩＲＰ）から生じる蛍光は、ＦＬ３対ドットプロットとしてプロットされている。
【図２】ヒトＳＩＲＰα−Ｆｃは、ＣＤ４７＋／＋発現（Ｊｉｎ８ＣＤ４７）に結合するが、ＣＤ４７欠損Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（Ｊｉｎ８）には結合しない。ＳＩＲＰα− Ｆｃ結合は、上記のフローサイトメトリーによって定量化した。ＳＩＲＰα−Ｆｃ結合（ＳＩＲＰ）から生じる蛍光は、太線におけるヒストグラムとしてプロットされている。太線は、１０μｇ／ｍＬ抗ＣＤ４７クローンＢ６Ｈ１２の存在下での結合を示す。
【図３】プライミング時のＣＤ４７／ＳＩＲＰαのブロッキングは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるアレルギー性疾患の進行を妨げる。（３ａ）マウスには、ＳＩＲＰα−Ｆｃ融合分子の存在下、または非存在下において、０日目と５日目に、腹腔内にＯＶＡ感作し、１２日目、１６日目、および２０日目に、ＯＶＡ−エアロゾル感作を受けさせ、そして、２１日目に、安楽死させた（グループあたりＮ＝４〜７匹）。（３ｂ）Ｈ＆ＥおよびＰＡＳで染色された、ナイーブ肺切片（ＰＢＳ）、免疫されたＯＶＡ、ＯＶＡ付加ＳＩＲＰ−α−ＦＣ−処置マウス。データは、３つの別個に分析された肺の代表である。（３ｃ）ディファレンシャルＢＡＬＦ細胞数が、フローサイトメトリーによって、分析された。（３ｄ）２１日目に測定したＯＶＡ特異的ＩｇＥの血清レベル。（３ｅ）インビトロでのＯＶＡでの再刺激の３日後のＭＬＮ細胞培養の上清中のＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３レベル。（３ｆ）２１日目、生体外の単離されたｍＬＮｓにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＩＬ−１３が産生するＣＤ４＋Ｔ細胞の％を、フローサイトメトリーによって評価した。３つのうちの代表的な実験の１つが示されている。（３ｇ）肺外植片におけるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３および（ｈ）エオタキシン放出。データは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４】ＳＩＲＰα−Ｆｃ処理ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける疾患保護の機序。マウスには、０日目および５日目に、ＳＩＲＰα−Ｆｃ融合分子の存在下で、または非存在下でＯＶＡ感作し、１２日目、１６日目、および２０日目にＯＶＡ−エアロゾル感作を受けさせ、２１日目に安楽死させた。（４ａ）ｍＬＮｓにおけるＣＤ１１ｂ低ＣＤ１０３＋、およびＣＤ１１ｂ高ＣＤ１０３−ＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋にゲートされた）の亜集団。データは、％ＤＣサブセットとして表示される（グループごとにｎ＝３〜４匹）。（４ｂ）ＢＡＬＢ／ｃマウスは、腹腔内ＯＶＡ−ａｌｕｍｎの免疫付与の前日に、ＳＩＲＰα−Ｆｃの存在下で、または不存在下で（ＰＢＳ）、ＣＦＳＥ標識ＣＤ４７＋／＋ＣＤ４＋ＴｇＴ細胞を、受動的に移送され、２日後、ＣＦＳＥ細胞希釈が、ｍＬＮｓにおいて検討された。データは、グループごとに４匹のマウスで行われた実験の代表である。（４ｃ）２１日目、好酸球（ＣＣＲ３＋）の絶対数が、生体外の単離されたｍＬＮｓにおいて、フローサイトメトリーによって、評価された。データは平均±ＳＥＭである（グループごとにＮ＝３〜４マウス）。
【図５】ＳＩＲＰα−Ｆｃの投与によるＴＮＢＳ−大腸炎の保護。大腸炎が誘導され、上記のように評価された。１００μｇ／動物 ネズミＳＩＲＰα−Ｆｃが、腹腔内後０日目および２４時間に適用された。またＰＢＳが腹腔内に注入された。動物の体重は、ＴＮＢＳ注射後４日まで評価された。
【実施例】
【０１２２】
１．本発明の可溶性ポリペプチドの例：
以下の表３は、開示されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いて組換え法によって製造することができる本発明の可溶性ポリペプチドの例を提供する。
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
２．親和性測定：
２．１ ＣＤ４７に対する親和性：
単量体ＣＤ４７、または二価のＣＤ４７−Ｆｃタンパク質に対するヒトＳＩＲＰα− Ｆｃの親和性は、ビアコアによって、評価することができる。ＳＩＲＰαとのＣＤ４７ Ｖ−ドメインの一価の相互作用は、約１μＭであると報告されている（Ｈｅａｔｈｅｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ． ２００８）。
【０１２５】
たとえば、ＡＰＰ−タグ付きＣＤ４７ Ｖドメインタンパク質が、ＨＥＫ２９３細胞において発現され、リガンドとしての二価のＣＤ４７−Ｆｃタンパク質と比較される。ＳＩＲＰα−Ｆｃとの一価の相互作用は、０．８μｍＫＤと測定されたが、他方、二価のＣＤ４７−Ｆｃのタンパク質の結合の強さ（結合力）は、ＫＤ＜６０ｎｍへ１０倍も増大した。対照的に、ネズミＣＤ４７−Ｆｃ融合タンパク質の結合は、観察することができなかったが、このことは、評価された相互作用の特異性を示す。
【０１２６】
【表４】
【０１２７】
２．２ マウス細胞ＣＤ４７に対する細胞結合：
野生型からの、またはＣＤ４７ノックアウトネズミからの５ｘ１０５ＣＤ４７＋、およびＣＤ４７−マウス脾細胞を、２００μｇ／ｍｌヒトＩｇＧ、および５μｇ／ｍｌネズミＳＩＲＰα−Ｆｃを含む５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％ＦＣＳ ２ｍＭのＥＤＴＡ）に、４℃で３０分間、再懸濁した。洗浄後、４℃で３０分間、ＦＩＴＣ標識したストレプトアビジン（１／１０００）で細胞を染色する。結果は、ＳＩＲＰα−Ｆｃが、ＣＤ４７＋／＋のリンパ球に結合するが、ＣＤ４７−／−ノックアウトマウスからのリンパ球には結合しないことを示す（図１）。
【０１２８】
２．３ ヒト細胞ＣＤ４５に対する細胞結合：
５ｘ１０５ＣＤ４７＋、およびＣＤ４７−ＪｕｒｋａｔＴ細胞株を、４℃で３０分間、２００μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ、および５μｇ／ｍｌのＳＩＲＰα−Ｆｃを含む５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ ２％ＦＣＳ ２ｍＭＥＤＴＡ）に再懸濁する。洗浄後、４℃で３０分間、細胞を、ＦＩＴＣ標識したストレプトアビジン（１／１０００）で染色する。
【０１２９】
結果は、ＳＩＲＰα−Ｆｃが、ＣＤ４７＋／＋Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｊｉｎ８ＣＤ４７）のリンパ球に結合するが、ＣＤ４７（Ｊｉｎ８）を発現しないＪｕｒｋａｔ細胞には結合しないことを示す（図２）。抗ＣＤ４７抗体Ｂ６Ｈ１２での阻止によって示されるように、細胞への結合は、特異的であった。
【０１３０】
２．４ ＣＨＯ ＣＤ４７細胞株に結合するビオチン化ＳＩＲＰ−αＦｃの阻害／ブロッキング試験：
また、ＣＨＯ ＣＤ４７細胞株に結合するビオチン化ＳＩＲＰα−Ｆｃの阻害／ブロッキング試験は、異なるエピトープ（すなわち、Ｂ６Ｈ１２、２Ｄ３、ＢＲＩＣ１２６、ＩＦ７、および１０Ｇ２クローン、別の抗ヒトＳＩＲＰ−α（ＣＤ１７２ａ）ｍＡｂ、組換えヒトトロンボスポンジン１（ＴＳＰ−１）、またはＴＳＰ−１のＣ末端（４Ｎ１Ｋ）、およびコントロール（４ＮＧＧ）ペプチド）に対する抗ＣＤ４７ｍＡｂを用いて実施することができる。
【０１３１】
２．５ ＣＨＯ ＣＤ４７細胞株に結合する直接標識抗ＣＤ４７ｍＡｂの阻害／ブロッキング試験：
補完的なアプローチとして、ＣＨＯ ＣＤ４７の細胞株に結合する直接標識された抗ＣＤ４７ｍＡｂの阻害／ブロッキング試験は、非ビオチン化ヒトＳＩＲＰ−α−ＦＣを使用して実行することができる。ＳＩＲＰα−ＦＣを使用してヒトＳＩＲＰα−ＦｃでトランスフェクトされたＬ細胞に結合するビオチン化ＣＤ４７−Ｆｃの阻害／ブロッキング試験も、また、評価されうる。
【０１３２】
３． ＳＩＲＰ−α−Ｆｃ機能アッセイ：
３．１ 免疫複合体刺激樹状細胞サイトカイン放出アッセイ：
末梢血単球（ＣＤ１４＋ ＣＤ１６−）、ならびに単球由来樹状細胞（ＤＣ）は、説明されるように調製される（Ｌａｔｏｕｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１：１６７：２５４７）。コンベンショナル（ＤＣｓ）は、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）で標識した抗ＣＤ１１ｃ（Ｂ−ｌｙ６）、系統マーカーに対するＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体の混合物、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、およびＣＤ５６、ならびにＡＰＣ−Ｃｙ７標識ＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４）を使用して、ＦＡＣＳアリア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によって、ＣＤ１１ｃ＋、系譜−として、＞９９％に達する純度で、単離される。ＡＰＣは、ＨＢ１０１無血清培地において、種々の濃度のヒトＳＩＲＰα−Ｆｃ（１〜２０μｇ／ｍｌの）の存在下で、１／４０．０００（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ）の黄色ブドウ球菌Ｃｏｗａｎ１で、または可溶性ＣＤ４０Ｌ（１μｇ ／ｍｌの）、およびＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ）で、刺激される。サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２３、ＩＬ−８およびＴＮＦ−α）放出は、２４時間または４８時間培養上清において、ＥＬＩＳＡ法によって、評価される。
【０１３３】
３．２ 混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ：
マイトマイシンＣ処理した成熟ＤＣ（ＳＡＣまたはＬＰＳ刺激）は、様々な刺激（ＤＣ）／応答因子（Ｔ細胞）率で、本発明の可溶性ポリペプチド（５〜５０μｇ／ｍｌ）の存在下で、または非存在下で、未分画同種ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ高）または記憶（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ低）成人ＣＤ４＋Ｔ細胞（１０６／ｍｌ）と共培養される。Ｔ細胞増殖（３Ｈチミジン取り込み）、およびＩＦＮ−γ放出は、５〜６日初代培養の培養上清において、評価される。
【０１３４】
４．喘息の治療におけるＳＩＲＰα−Ｆｃの使用のためのマウス動物モデルを用いたインビボのデータ：
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、０日目および５日目に、１ｍｇ Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ（Ｐｉｅｒｃｅ）に吸着した１０μｇのＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｇｒａｄｅ Ｖ）の腹腔内の注射によって、感作された。１２、１６、および２０日目に、マウスは、振動メッシュネブライザーシステム（オムロン）によって注入された０．５％ＯＶＡのエアロゾル（Ｓｉｇｍａ、Ｇｒａｄｅ Ｖ）で、３０分間感作された。最後の感作の２４時間後、７５ｍｇ／ｋｇペントバルビタールナトリウムの過剰摂取によって、マウスを屠殺し、採血した。ＢＡＬを、０．５ｍｌ生理食塩水で３回収集し、肺およびＭＬＮを単離した。肺の３分の１を、抗生物質を補ったＰＢＳ中で、すすぎ、小片に切断し、そして、平底２４ウェルプレート中で、２４時間、１０％ウシ胎児血清、５００Ｕ／ｍｌペニシリン、５００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、および１ｍＭ ２−ＭＥを補充した１ｍｌ ＲＰＭＩ１６４０（Ｗｉｓｅｎｔ Ｉｎｃ．）中で、培養した。ＭＬＮ細胞（４ｘ１０６細胞／ｍｌ）を、平底９６ウェルプレートにおいて、培養し、７２時間、ＯＶＡ（１００μ／ｍｌ）で再刺激した。全量ＢＡＬ細胞を、洗浄し、数え、抗ＣＣＲ３ ＰＥ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＣＤ３ ＦＩＴＣ（クローン１４５ −２Ｃ１１）、および抗Ｂ２２０ ＦＩＴＣ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）で、３０分間、染色した。Ｖａｎ Ｒｉｊｔ Ｌ．Ｓ．ら（Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００４年５月；２８８（１−２）：１１１−２１）に説明されるように、顆粒球は、顆粒状であり、非自家蛍光であり、ＣＤ３およびＢ２２０の発現を欠くことがわかった。好酸球は、ＣＣＲ３発現によって、好中球と区別された。リンパ球は、小さく、非顆粒状であり、非自家蛍光であり、ＣＤ３またはＢ２２０を発現し、そして、マクロファージ、および樹状細胞を含む他の単核細胞は、ＣＤ３、Ｂ２２０およびＣＣＲ３を欠いていた。ＤＣサブセットを同定するために、ｍＬＮｓ、および肺が、まず、リベラーゼで処理され、細かく刻まれ、細胞の数が、数えられた。肺の細胞懸濁液は、赤血球の溶解のために、ＮＨ４Ｃｌで処理し、染色の前に、洗浄した。細胞は、抗ＣＤ１１ｃ ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、または抗ＣＤ１１ｃ ＡＰＣ（クローンＮ４１８）、抗ＣＤ１１ｂ ＰＥ（Ｃａｌｔａｇ）、抗Ｉ−Ａｄ／Ｉ−Ｅｄ ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＧＲ１、抗Ｂ２２０ ＦＩＴＣ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、１２０Ｇ８ ＦＩＴＣ、および抗ＣＤ１０３−ビオチン化、続いて、ＳＡ−ＡＰＣ、またはＣＤ１０３ ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗ＣＤ４７、および抗ＳＩＲＰ−αｍＡｂで染色された。肺において、自家肺胞マクロファージは、分析のゲートから除外された。制御性Ｔ細胞を同定するために、抗ＣＤ４ ＦＩＴＣまたはＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ２５ ＰＥ（Ｃａｌｔａｇ）またはＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ４４ ＡＰＣ（クローンＩＭ７ ８．１）が使用された。生体外でのＩＬ−１３産生を測定するため、肥満細胞、および好塩基球が、まず、細胞外抗ＩｇＥ−ビオチン化、および抗ＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で同定され、そして、ＣＤ４ Ｔ細胞を、抗ＣＤ４ ＡＰＣで染色した。細胞は、固定し、透過処理し、そして、抗ＩＬ−１３ ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。細胞は、まず、細胞外マーカー（抗ＣＤ４ ＡＰＣおよび抗ＣＤ２５ ＦＩＴＣ）で染色し、固定し、透過処理し、そして、抗ＦｏｘＰ３ ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのキット）で染色した。肥満細胞、および好塩基球＋細胞質内ＩＬ−１３染色。すべてのデータは、ＦＡＣＳキャリバー、またはＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で得られ、ＣｅｌｌｑｕｅｓｔまたはＤＩＶＡソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析された。
【０１３５】
サイトカイン測定：
ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＥＬＩＳＡによって、ｍＬＮｓの培養上清、および肺外植片において測定される。
【０１３６】
ＯＶＡ感作および感作マウスからの縦隔ＬＮ細胞は、インビトロで、３日間、ＯＶＡタンパク質（１ｍｇ／ｍｌ）で再刺激され、そして、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３産生が、培養上清において、ＥＬＩＳＡ法によって定量化される。肺外植片は、完全培地において、一晩培養され、培養上清は、サイトカイン放出を測定するために収集される。
【０１３７】
結果：
アレルギー性喘息の処置におけるＳＩＲＰα−Ｆｃの使用するためのマウス動物モデルを用いるインビボのデータ：
ＣＤ４７、およびＳＩＲＰαは、ＳＩＲＰ−α＋ ＣＤ１０３− ＤＣ駆動Ｔｈ２免疫の開始および永続化における重要な分子として現れる。このように、それらは、治療的に肺炎症を低減させるために、そして、気道疾患を改善させるために、活かされる可能性がある。ここでは、アレルギー性気道炎症の進行に対するＳＩＲＰ−α、およびヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（ＳＩＲＰα−ＦＣ）の効果を評価した。ＯＶＡ免疫付与（図３ａ）の０および５日目に、ＳＩＲＰα−Ｆｃのいずれかを投与したＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＯＶＡエアロゾルの感作の後において、肺組織の炎症性細胞浸潤が、非常に少なかった、または、なかった（図３ｂ）。ＢＡＬＦにおける好酸球、好中球とリンパ球の強力な低減、または欠如が、起こり（図３ｃ）、これとともに、血清ＯＶＡ特異的ＩｇＥにおける下落（図３ｄ）、リンパ節の細胞数における５０％低減、およびｍＬＮｓにおけるＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３産生の強烈な阻害（図３ｅおよびｆ）が起こった。気道疾患の進行からの保護は、ＩＬ−１０の増加とも、ＩＦＮ−γ放出とも相関せず、これは、実際、処置されたマウスにおいても、抑制された（データは示さず）。次に、ＣＤ４７−およびＳＩＲＰα−ＦＣ−処置マウスの肺外植片の培養上清におけるサイトカイン、およびケモカイン放出を調べ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、およびエオタキシン放出は、阻害されたが、一方、ＩＬ−４発現は、変化しないままであったことを見出した（図３ｇおよびｈ）。
【０１３８】
次に、この阻害を制御し、気道疾患からの保護をもたらした潜在的な機序を探った。ＣＤ４７−Ｆｃを処置したマウスのｍＬＮｓにおけるＳＩＲＰ−α＋ ＣＤ１０３− 樹状細胞の蓄積の減少が見出された（図４ａ）。ＳＩＲＰα−Ｆｃの投与は、また、ＣＤ４７−Ｆｃで処置したＯＶＡ免疫マウスのｍＬＮｓにおけるＣＦＳＥ標識Ｔｇ Ｔ細胞の割合の低減につながった（図４ｂ）。最後に、ＳＩＲＰα−ＦＣ−処置マウスのｍＬｎｓにおける好酸球の割合および蓄積の減少が観察された（図４ｃ）。
【０１３９】
これらのデータは、初期銀感作におけるＣＤ４７／ＳＩＲＰα遮断が、ｍＬＮｓおよび肺における２型応答、ならびにＩｇＥ抗体依存性気道炎症を劇的に低減させたことを実証する。
【０１４０】
５．大腸炎の治療におけるＳＩＲＰα−Ｆｃの使用のためのマウス動物モデルを用いるインビボのデータ：
トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）（２または３ｍｇ）を、５０％のエタノールに溶解し、３．５Ｆカテーテルを介して、雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＷＴおよびＣＤ４７ ＫＯ）の大腸に滴下した。コントロールマウスは、エタノールのみを与えられた。マウスを、２４時間ごとに秤量し、２日目（早い時点）、または４日目に、屠殺した。慢性ＴＮＢＳ大腸炎モデルにおいて、０日目に、そして、７日目にもう一度、１．５ｍｇのＴＮＢＳを直腸内に注入し、１２日目に、マウスを屠殺した。血清、腸間膜リンパ節、および大腸を、さらなる分析のため、回収した。大腸は、下痢、癒着、腸壁の肥厚、および潰瘍の存在を考慮に入れるウォーレスの基準を使用して、肉眼的にスコア化した。それらは、また、アメホ（Ａｍｅｈｏ）の基準、粘膜下組織の肥厚、単核細胞を有する粘膜下層および固有層の浸潤、粘液枯渇、陰窩構造の損失、および浮腫に基づくスコアリングシステムを使用して、炎症の微視的マーカーについて、評価された（示さず）。組換えマウスＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質を、ＴＮＢＳ大腸炎の誘導の直前、およびその２４時間後に、腹腔内（１００μｇ／マウス）投与した。コントロールマウスは、生理食塩水のみを受けた。０日目、ＴＮＢＳ誘導の３０分前、および１日目における１００μｇ／動物のマウスＳＩＲＰα−Ｆｃの注入は、体重の損失として評価される疾患の進行を統計的に有意にブロックした。
【０１４１】
６．関節炎の治療におけるＳＩＲＰα−Ｆｃの使用のためのインビボのネズミ動物モデル：
コラーゲン誘導関節炎モデル：
ヒト結核菌が、フロイント完全アジュバントと混合され、十分に振盪される（＝溶液Ａ）。ウシコラーゲン溶液アリコートが、氷上で滅菌ＰＢＳとよく混合される（＝溶液Ｂ）。溶液Ａおよび溶液Ｂが、ナイーブ雄ＤＢＡ／１マウスに、乳濁液として、注入された。マウスが、ケタミンの滅菌ろ過液のｓ．ｃ．注入によって、麻酔される。昏睡時に、各マウスの尾の根が、剃毛され、続いて、マウスあたり０．１ｍｌのコラーゲン乳濁液（１００μｇのコラーゲンを含む）が、尾の付け根に、皮内注入される。１００μｌのコラーゲン／ＰＢＳ（１：５希釈）の第二の注入が、初回免疫後の２２日目に、腹腔内に与えられる（＝ 追加免疫）。腫れ、および疾患のスコアリングが、ＢｒａｎｄらによるＮａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００７；２（５）：１２６９−７５で説明するように評価される。
【０１４２】
７．本発明を実施に有用なアミノ酸および塩基配列：
【０１４３】
【表５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ） ＳＩＲＰαの細胞外ドメイン（配列番号３）、
ｂ） 配列番号３の断片：、および、
ｃ） 配列番号２と少なくとも７５％の同一性を有する配列番号３の変異体ポリペプチド
からなる群から選択されるＳＩＲＰα由来ポリペプチドを含む、薬剤として使用するための可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチドであって、
ここに、前記ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、ヒトＣＤ４７（配列番号２４）に結合する、可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチド。
【請求項２】
ヒトＣＤ４７に２μＭまたはそれ未満のＫＤで結合し、および、免疫複合体刺激性樹状細胞サイトカイン放出アッセイにおいて測定された場合に、誘導されるサイトカイン分泌を阻害する、請求項１に記載の可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチド。
【請求項３】
前記ＳＩＲＰα由来ポリペプチドがＩｇＧ Ｆｃ断片に融合している、請求項１または２に記載の可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチド。
【請求項４】
前記ＩｇＧ Ｆｃ断片が変異非グリコシル化Ｆｃ断片である、請求項１、２または３に記載の可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチド。
【請求項５】
前記ＳＩＲＰα細胞外ドメインが、少なくともＳＩＲＰαのＶ領域（配列番号２）を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチド。
【請求項６】
自己免疫および炎症性障害の処置における薬物として使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチド。
【請求項７】
ａ） Ｔｈ２媒介性気道炎症；
ｂ） アレルギー性障害；
ｃ） 喘息；
ｄ） 炎症性腸疾患；
ｅ） 関節炎；
ｆ） 虚血性障害、または、
ｇ） 白血病もしくは癌
の処置における薬物として使用するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチド。
【請求項８】
本質的に、ヒトＩｇＧのＦｃ断片に融合したＳＩＲＰαの細胞外ドメインから構成される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチドの少なくとも２つを含む、タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチド、または請求項９に記載のタンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体の１または複数と組み合わされた、請求項１０の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項記載の可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項１３】
請求項１２記載の核酸の１または複数を含む、クローニングまたは発現ベクター。
【請求項１４】
少なくとも配列番号２５または２６の核酸を含む、請求項１３に記載のクローニングまたは発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の１または複数のクローニングまたは発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
前記宿主細胞が、哺乳類細胞、たとえば、ＣＨＯ細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１】
ａ） ＳＩＲＰαの細胞外ドメイン（配列番号３）、
ｂ） 配列番号３の断片：、および、
ｃ） 配列番号２と少なくとも７５％の同一性を有する配列番号３の変異体ポリペプチド
からなる群から選択されるＳＩＲＰα由来ポリペプチドを含む、薬剤として使用するための可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチドであって、
ここに、前記ＳＩＲＰα由来のポリペプチドは、ヒトＣＤ４７（配列番号２４）に結合する、可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチド。
【請求項２】
ヒトＣＤ４７に２μＭまたはそれ未満のＫＤで結合し、および、免疫複合体刺激性樹状細胞サイトカイン放出アッセイにおいて測定された場合に、誘導されるサイトカイン分泌を阻害する、請求項１に記載の可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチド。
【請求項３】
前記ＳＩＲＰα由来ポリペプチドがＩｇＧ Ｆｃ断片に融合している、請求項１または２に記載の可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチド。
【請求項４】
前記ＩｇＧ Ｆｃ断片が変異非グリコシル化Ｆｃ断片である、請求項１、２または３に記載の可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチド。
【請求項５】
前記ＳＩＲＰα細胞外ドメインが、少なくともＳＩＲＰαのＶ領域（配列番号２）を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチド。
【請求項６】
自己免疫および炎症性障害の処置における薬物として使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチド。
【請求項７】
ａ） Ｔｈ２媒介性気道炎症；
ｂ） アレルギー性障害；
ｃ） 喘息；
ｄ） 炎症性腸疾患；
ｅ） 関節炎；
ｆ） 虚血性障害、または、
ｇ） 白血病もしくは癌
の処置における薬物として使用するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチド。
【請求項８】
本質的に、ヒトＩｇＧのＦｃ断片に融合したＳＩＲＰαの細胞外ドメインから構成される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチドの少なくとも２つを含む、タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチド、または請求項９に記載のタンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体の１または複数と組み合わされた、請求項１０の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項記載の可溶性ＣＤ４７結合ポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項１３】
請求項１２記載の核酸の１または複数を含む、クローニングまたは発現ベクター。
【請求項１４】
少なくとも配列番号２５または２６の核酸を含む、請求項１３に記載のクローニングまたは発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の１または複数のクローニングまたは発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
前記宿主細胞が、哺乳類細胞、たとえば、ＣＨＯ細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【図１】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃｄ】
【図３ｅｆ】
【図３ｇｈ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図５】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃｄ】
【図３ｅｆ】
【図３ｇｈ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図５】
【公表番号】特表２０１２−５１２６４０（Ｐ２０１２−５１２６４０Ａ）
【公表日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４１４４１（Ｐ２０１１−５４１４４１）
【出願日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６７４１１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７００４７
【国際公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６７４１１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７００４７
【国際公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】
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