薬学的リポソーム組成物
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリペプチド断片またはそのアナログまたは対応するＤＮＡ断片に会合したリポソームを含む医薬組成物を用いて、ナイセリア感染を予防し、診断し、および／または治療することができる。１つの態様によると、本発明は、配列番号２を含むポリペプチドまたはその断片またはアナログと会合したリポソームを含む医薬組成物に関する。他の態様において、本発明の医薬組成物の製法、本発明の医薬組成物を宿主に送達する方法、本発明の医薬組成物の使用方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００５年３月７日に出願された米国仮特許出願第６０／５８，８１５号の出願日の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／５８，８１５号は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ナイセリア感染を予防し、診断し、および／または治療するのに用いることができる、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリペプチドまたは対応するＤＮＡ断片に会合したリポソームを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは世界中で死亡および病的状態の主な原因である。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、風土病および流行病、特に髄膜炎および髄膜炎菌血症双方を引き起こす［Ｔｚｅｎｇ，Ｙ−Ｌ ａｎｄ Ｄ．Ｓ．Ｓｔｉｐｈｅｎｓ，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，２，ｐ．６８７（２０００）；Ｐｏｌｌａｒｄ，Ａ．Ｊ．ａｎｄ Ｃ．Ｆｒａｓｃｈ，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９，ｐ．１３２７（２００１）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｓ．Ｌ，ａｎｄ Ａ．Ｊ．Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０，ｐ．６６６（２００２）］。血清殺菌活性はＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する主な防御メカニズムであり、細菌による侵入に対する保護は抗−髄膜炎菌抗体の血清中での存在に相関することはよく記載されている［Ｇｏｌｄｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２９，ｐ．１３０７（１９６９）；Ｇｏｌｄｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２９，ｐ．１３２７（１９６９）］。
【０００４】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、被膜抗原の存在に従って血清学的群に細分化される。現在、１２の血清群が認められているが、血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、ＹおよびＷ１３５は最も普通に見出される。血清群の中で、異なる血清型、サブタイプおよび免疫型は外膜蛋白質およびリポ多糖に基づいて同定することができる［Ｆｒａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，７，ｐ．５０４（１９８５）］。
【０００５】
現在入手可能な被膜多糖ワクチンは全てのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ単離体に対して効果的ではなく、若い幼児において保護抗体の生産を効果的には誘導しない［Ｔｚｅｎｇ，Ｙ−Ｌ ａｎｄ Ｄ．Ｓ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｍｉｃｒｏｄｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，２，ｐ．６８７（２０００）；Ｐｏｌｌａｒｄ，Ａ．Ｊ． ａｎｄ Ｃ．Ｆｒａｓｃｈ，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９，ｐ．１３２７（２００１）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ Ａ．Ｊ．Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０，ｐ．６６６（２００２）］。血清群Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ１３５の被膜多糖はこの生物に対するワクチンにおいて現在用いられている。これらの多糖ワクチンは短い期間では効果的であるが、ワクチン接種した対象は免疫学的記憶を発生せず、従って、彼らは３年以内に再度ワクチン接種をして、それらのレベルの抵抗性を維持しなければならない。
【０００６】
さらに、これらのワクチンは十分なレベルの殺菌抗体を誘導して、この病気の犠牲となる非常に若い子供において所望の保護を与えない。血清群Ｂ単離体に対する効果的なワクチンは現在入手可能でないが、これらの生物は開発国における髄膜炎菌病の主な原因の１つである。さらに、新生ヒト脳組織の糖蛋白質におけるかなり類似の交差−反応性構造の存在は血清群Ｂ多糖の免疫原性を改良する試みを落胆させるかもしれない［Ｆｉｎｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ，ｐ．３５５（１９８３）］。
【０００７】
より効果的なワクチンを得るためには、リポ多糖、ピリ線毛、蛋白質のような他のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ表面抗原が調査されている。免疫化されたボランティアおよび回復期患者の血清中のある種のこれらの蛋白質性表面抗原に対するヒト免疫応答および細菌抗体の存在が示された［Ｍａｎｄｒｅｌｌ ａｎｄ Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ，５７，ｐ．１５９０（１９８９）；Ｐｏｏｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，４０，ｐ．３９８（１９８３）；Ｒｏｓｅｎｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２６，ｐ．１５４３（１９８８）；Ｗｅｄｅｇｅ ａｎｄ Ｆｒｏｈｏｌｍ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５１，ｐ．５７１（１９８６）；Ｗｅｄｅｇｅ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌｓｅｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２５，ｐ．１３４９（１９８７）］。
【０００８】
既に記載された髄膜炎菌表面蛋白質のほとんどに伴う主な問題の１つはそれらの抗原性の不均一性である。事実、主な外膜蛋白質の株間変動は、それらの保護的有効性を抗原的に関連する髄膜炎菌株の限定された数に制限する。主な表面蛋白質のほとんど、あるいは精製された外膜蛋白質を含有するいずれかの外膜小胞に基づくいくつかの戦略は、蛋白質−ベースの髄膜炎菌ワクチンの保護能力を拡大するために現在開発されつつある［Ｔｚｅｎｇ，Ｙ−Ｌ ａｎｄ Ｄ．Ｓ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｍｉｃｒｏｄｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，２，ｐ．６８７（２０００）；Ｐｏｌｌａｒｄ，Ａ．Ｊ．ａｎｃ Ｃ．Ｆｒａｓｃｈ，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９，ｐ．１３２７（２００１）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｓ．Ｌ．，ａｎｄ Ａ．Ｊ．Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０，ｐ．６６６（２００２）］。抗原的に保存された表面−露出領域を持つ普遍的なあるいは少なくとも広く分布した蛋白質の同定は、主な髄膜炎菌外膜蛋白質の大きな負均一性に対して解決を与えるであろう。ナイセリア属表面蛋白質ＡについてのＮｓｐＡと命名された１つのそのような抗原はＰＣＴ／ＷＯ／９６／２９４１２に開示されており、ここに引用して援用する。
【０００９】
ＮｓｐＡ蛋白質に対して向けられたモノクローナル抗体（Ｍａｂ）はテストした髄膜炎菌株の９９％を超えて反応し、これは、高度に保存された抗原性領域がこの蛋白質に存在することを明瞭に示す［Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５，ｐ．１１７３（１９９７）；Ｃａｄｉｅｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６７，ｐ．４９５５，（１９９９）］。免疫電子顕微鏡観察およびフローサイトフルオロメトリーデータは、ＮｓｐＡ蛋白質が無傷髄膜炎菌細胞の表面に存在し、この蛋白質は細胞表面に均一に分布することを明瞭に示した［Ｃａｄｉｅｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６７，ｐ．４９５５，（１９９９）］。この蛋白質をコードする遺伝子はクローン化され、配列決定された［Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５，ｐ．１１７３（１９９７）］。この配列と入試可能なデータベースにコンパイルされた配列との比較は、ｎｓｐＡ遺伝子が、やはり髄膜炎菌外膜に見出されるナイセリア属不透明性蛋白質ファミリー（Ｏｐａ）のメンバーと相同性を共有することを示した。ＤＮＡハイブリダイゼーションは、ｎｓｐＡ遺伝子がテストした全ての髄膜炎菌株のゲノムに存在することを明瞭に確立したが、それは、高度に保存されたホモログが密接に関連する種Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａおよびＮ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａにやはり存在したことも示した。淋菌ＮｓｐＡ蛋白質の特徴付けは従前に示されている［Ｐｌａｎｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ，Ｉｍｍｕｎ．，６７，ｐ．２８５５（１９９９）］。この蛋白質の高レベルの分子保存（＞９６％同一性）についての決定的な証拠は、発散した血清群Ａ、ＢおよびＣ髄膜炎菌株からのさらなるｎｓｐＡ遺伝子のクローニングおよび配列決定に従って得られた［Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５，ｐ．１１７３（１９９７）；Ｃａｄｉｅｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７，ｐ．４９５５，（１９９９）；Ｍｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ，６７，ｐ．２８５５（１９９９）］。十分な量の精製された蛋白質を得て、感染のマウスモデルにおいてその保護能力を評価するために、ｎｓｐＡ遺伝子は発現ベクターｐＷＫＳ３０にクローン化された［Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５，ｐ．１１７３（１９９７）］。ＢＡＬＢ／ｃマウスを２０μｇの免疫アフィニティ−精製組換えＮｓｐＡ蛋白質で３回免疫化し、次いで、致死用量の血清群Ｂ株で攻撃した。ＮｓｐＡ−免疫化マウスの８０％は、対照群における２０％未満と比較して細菌攻撃で生き残った。致死髄膜炎菌攻撃で生き残ったマウスから収集した血清の分析により、テストした４つの血清群Ｂ株に付着され、該株を殺した交差−反応性抗体の存在が明らかとされた。加えて、ＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂでのマウスの受動免疫化により、蛋白質の保護能力が確認された。事実、攻撃１８時間前のＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂ１８の投与は、テストした１１の髄膜炎菌株のうち１０で攻撃したマウスについて記録された細菌血症のレベルを７５％を超えて低下させた［非特許文献１］。これらの結果は、この高度に保存された蛋白質が髄膜炎菌感染に対して保護免疫を誘導できることを示した。
【００１０】
組換え髄膜炎菌表面−露出ＰｏｒＡ、ＰｏｒＢおよびＯｐｃ蛋白質での実験は、殺菌抗体の効果的な生産は、しばしば、天然立体配座を生じさせるための組換え蛋白質の再折り畳みに依存することを示した［非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８］。組換え表面蛋白質の再折り畳みを好都合とするのに用いられる１つの方法は、リポソームへのその取り込みである。
【００１１】
しかしながら、ナイセリア感染の予防、診断および／または治療で用いることができる医薬組成物に対する継続する要求が存在する。
【非特許文献１】Ｃａｄｉｅｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６７，ｐ．４９５５，（１９９９）
【非特許文献２】Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４４，ｐ．３０２７，（１９９８）
【非特許文献３】Ｉｄａｎｐａａｎ−Ｈｅｉｋｋｉｌａ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，１３，ｐ．１５０１（１９９５）
【非特許文献４】Ｍｕｔｔｉｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．，１８，ｐ．３６５（１９９５）
【非特許文献５】Ｍｕｔｔｉｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．，１８，ｐ．４２３（１９９５）
【非特許文献６】Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．，２１，ｐ．４９９，（１９９６）
【非特許文献７】Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，７０，ｐ．４０２８（２００２）
【非特許文献８】Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１５，ｐ．７５１（１９９６）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１つの態様によると、本発明は、配列番号２を含むポリペプチドまたはその断片またはアナログと会合したリポソームを含む医薬組成物に関する。
【００１３】
他の態様において、本発明の医薬組成物の製法、本発明の医薬組成物を宿主に送達する方法、本発明の医薬組成物の使用方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、ナイセリア属感染を予防し、診断し、および／または治療するのに用いることができる、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリペプチドに会合したリポソームを含む医薬組成物を提供する。
【００１５】
１つの態様によると、本発明は、配列番号２またはその断片またはアナログを含むポリペプチドに会合したリポソームを含む医薬組成物に関する。
【００１６】
もう１つの態様によると、本発明は、配列番号２を含むポリペプチドと会合したリポソームを含む医薬組成物に関する。
【００１７】
１つの態様によると、本発明は、配列番号２からなるポリペプチド、またはその断片もしくはアナログと会合したリポソームを含む医薬組成物に関する。
【００１８】
１つの態様によると、本発明は、配列番号２からなるポリペプチドと会合したリポソームを含む医薬組成物に関する。
【００１９】
１つの態様によると、本発明は、配列番号２を含むポリペプチドのエピトープ保持部分、またはその断片もしくはアナログに会合したリポソームを含む医薬組成物に関する。
【００２０】
１つの態様によると、本発明は、配列番号２を含むポリペプチドのエピトープ保持部分に会合したリポソームを含む医薬組成物に関する。
【００２１】
１つの態様によると、本発明は：
（ａ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一性を有するポリペプチドまたはその断片またはアナログ；
（ｂ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも８０％同一性を有するポリペプチドまたはその断片またはアナログ；
（ｃ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも９５％同一性を有するポリペプチドまたはその断片またはアナログ；
（ｄ）配列番号２を含むポリペプチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｅ）配列番号２を含むポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体を惹起させることができるポリペプチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｆ）配列番号２を含むポリペプチドのエピトープ保持部分、またはその断片もしくはアナログ；
（ｇ）Ｎ−末端Ｍｅｔ残基が欠失した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）ポリペプチド；
（ｈ）分泌アミノ酸配列が欠失した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）のポリペプチド；
から選択された単離されたポリペプチドと会合したリポソームを含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
１つの態様によると、本発明は：
（ａ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも８０％同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも９５％同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号２を含むポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体を惹起させることができるポリペプチド；
（ｆ）配列番号２を含むポリペプチドのエピトープ保持部分；
（ｇ）Ｎ−末端Ｍｅｔ残基が欠失した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）ポリペプチド；
（ｈ）分泌アミノ酸配列が欠失した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）のポリペプチド；
から選択された単離されたポリペプチドと会合したリポソームを含む医薬組成物を提供する。
【００２３】
１つの態様によると、本発明は：
（ａ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも７０％相同性を有するポリペプチド、またはその断片もしくはアナログをコードするポリヌクレオチド：
（ｂ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも８０％相同性を有するポリペプチド、またはその断片もしくはアナログをコードするポリヌクレオチド：
（ｃ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも９５％相同性を有するポリペプチド、またはその断片もしくはアナログをコードするポリヌクレオチド：
（ｄ）配列番号２を含むポリペプチド、またはその断片もしくはアナログをコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２を含むポリペプチド、またはその断片もしくはアナログに対して結合特異性を有する抗体を惹起させることができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２を含むポリペプチドのエピトープ保持部分、またはその断片もしくはアナログをコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１を含むポリヌクレオチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）におけるポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチド；
から選択される単離されたポリヌクレオチドと会合したリポソームを含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
１つの態様において、本発明は：
（ａ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも８０％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも９５％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２を含むポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体を惹起させることができるポリペプチドをーコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２を含むポリペプチドのエピトープ保持部分をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）におけるポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチド；
から選択されるポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドと会合したリポソームを含む医薬組成物を提供する。
【００２５】
当業者であれば、本発明は、リポソーム、およびＤＮＡ分子、すなわち、本特許出願においてここに記載した、そのようなポリペプチドの突然変異体、変種、ホモログおよび誘導体のようなアナログをコードするポリヌクレオチドおよびそれらの相補的配列を含む医薬組成物を含むことを認識するであろう。本発明は、本発明のＤＮＡ分子に対応するＲＮＡ分子も含む。ＤＮＡおよびＲＮＡ分子に加えて、本発明は、対応するポリペプチド、およびそのようなポリペプチドに特異的に結合する一特異的抗体を含む。
【００２６】
本明細書中で用いるように、「に会合した」は、本発明のポリペプチドはリポソーム膜に少なくとも部分的に包埋された、好ましくは脂質に非共有結合されたことを意味する。該ポリペプチドは、それ自体が膜に包埋された脂質の脂肪酸「テイル」にも結合することができる。
【００２７】
さらなる実施形態において、本発明によるポリペプチドと会合したリポソームを含む医薬組成物は抗原性である。
【００２８】
さらなる実施形態において、本発明によるポリペプチドと会合したリポソームを含む医薬組成物は免疫原性である。
【００２９】
さらなる実施形態において、本発明によるポリペプチドと会合したリポソームを含む医薬組成物は宿主において免疫応答を誘導することができる。
【００３０】
さらなる実施形態において、本発明は、前記定義の本発明のポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を惹起させることができるポリペプチドと会合したリポソームを含む医薬組成物にも関する。
【００３１】
「結合特異性を有する」抗体は、選択されたポリペプチドを認識し、それに結合するが、試料、例えば、選択されたペプチドを天然では含む生物学的試料中の他の分子を実質的に認識し、それに結合しない抗体である。特異的結合は、選択されたポリペプチドが抗原として用いられるＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定することができる。
【００３２】
本発明によると、生物学的実験における「保護」は、細菌抗体の生産における有意な増加、または殺菌活性の有意な増加によって定義される。
【００３３】
本発明のさらなる態様において、本発明のポリペプチド、またはそのアナログの免疫原性および／または抗原性断片に会合したリポソームを含む医薬組成物が提供される。
【００３４】
本発明の断片は１以上のそのようなエピトープ領域を含むべきであり、あるいはそれらの免疫原性および／または抗原性特性を保有するのに十分にそのような領域に対して同様であるべきである。かくして、本発明による断片では、同一性の程度はおそらくは無関係である。というのは、それらは本明細書中に記載されたポリペプチドまたはそのアナログの特定の部分に１００％同一であり得るからである。本発明は、さらに、本発明のポリペプチドの免疫原性断片を提供し、該断片は本発明のポリペプチドの連続部分である。本発明は、さらに、本発明のポリペプチド配列からの少なくとも１０の連続アミノ酸残基を有する断片を提供する。１つの実施形態において、少なくとも１５連続アミノ酸残基。１つの実施形態において、少なくとも２０連続アミノ酸残基。１つの実施形態において、少なくとも３０連続アミノ酸残基。１つの実施形態において、少なくとも４０連続アミノ酸残基。１つの実施形態において、少なくとも５０連続アミノ酸残基。１つの実施形態において、少なくとも１００連続アミノ酸残基。１つの実施形態において、少なくとも１５０連続アミノ酸残基。
【００３５】
本発明は、さらに、配列番号２を含むポリペプチドと同一または実質的に同一の免疫原性活性を有する断片を提供する。該断片は、（もし必要であれば、担体にカップリングさせた場合）、ＮｓｐＡポリペプチドを認識する免疫応答を惹起させることができる。
【００３６】
そのような免疫原性断片は、例えば、Ｎ−末端リーダーペプチド、および／または膜貫通ドメインおよび／または該部ループおよび／またはターンを欠如するＮｓｐＡポリペプチドを含むことができる。本発明は、さらに、当該配列の全長にわたって、配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一性、好ましくは８０％同一性、より好ましくは９５％同一性を有するポリペプチドの過剰細胞ドメインの実質的に全てを含むＮｓｐＡの断片を提供する。
【００３７】
本発明は、さらに、Ｂ−細胞またはＴ−ヘルパーエピトープを含む断片に会合したリポソームを含む医薬組成物を提供する。
【００３８】
本発明は、さらに、より長いポリペプチドの一部であってよい断片と会合したリポソームを含む医薬組成物を提供する。分泌またはリーダー配列、または多重ヒスチジン残基のような精製を助ける配列、または組換え生産の間に安定性を増大させるさらなる配列、または最終ポリペプチドの免疫原性能力を増大させるさらなるポリペプチドまたは脂質テイル配列を含有するさらなるアミノ酸配列を含むのが有利であり得る。
【００３９】
当業者であれば、本発明のポリペプチドのアナログに会合したリポソームを含む医薬組成物もまた、本発明と関連した、すなわち、抗原性／免疫原性物質としての用途を見出すであろうことを認識するであろう。かくして、例えば、１以上の付加、欠失、置換等を含む蛋白質またはポリペプチドは本発明に含まれる。
【００４０】
本明細書中で用いるように、本発明のポリペプチドの「断片」、「アナログ」または「誘導体」は、アミノ酸残基の１以上が保存されたまたは保存されていないアミノ酸残基（好ましくは保存された）で置き換えられ、かつ天然または非天然であってよいポリペプチドを含む。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドの誘導体およびアナログは、図面に示される配列またはその断片に対して約８０％の同一性を有するであろう。すなわち、残基の８０％は同一である。さらなる実施形態において、ポリペプチドは８０％を超える同一性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは８５％よりも大きな同一性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは９０％よりも大きな同一性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは９５％よりも大きな同一性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは９９％よりも大きな同一性を有するであろう。さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドのアナログは約２０アミノ酸残基未満、より好ましくは１０未満の置換、修飾または欠失を有するであろう。
【００４１】
これらの置換はポリペプチドの二次構造およびヒドロパシック性質に対して最小の影響を有するものである。好ましい置換は保存されたとして当該分野で知られたものであり、すなわち、置換された残基は疎水性、サイズ、電荷または官能基のような物理的または化学的特性を共有する。これらは、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５，１９７８においてＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．によって、およびＥＭＢＯ Ｊ．８，７７９−７８５，１９８９においてＡｒｇｏｓ，Ｐ．によって記載されたもののような置換を含む。例えば、以下の群の１つに属する天然または非天然いずれかのアミノ酸は保存された変化を表す：
ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ｖａｌ；
ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；
ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；
ｌｙｓ、ａｒｇ、ｏｒｎ、ｈｉｓ；
およびｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。
好ましい置換は、対応するＬ−アミノ酸に代えてのＤ−エナンチオマーの置換も含む。
【００４２】
相同性のパーセンテージは、同一性のパーセンテージ＋アミノ酸タイプの同様性または保存のパーセンテージの和と定義される。
【００４３】
１つの実施形態において、本発明のポリペプチドのアナログは、図面に示した配列またはその断片に対して約７０％同一性を有するであろう。すなわち、残基の７０％は同一である。さらなる実施形態において、ポリペプチドは８０％よりも大きな同一性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは８５％よりも大きな同一性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは９０％よりも大きな同一性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは９５％よりも大きな同一性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは９９％よりも大きな同一性を有するであろう。さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドのアナログは約２０アミノ酸残基未満の、より好ましくは約１０アミノ酸残基未満の置換、修飾または欠失を有するであろう。
【００４４】
１つの実施形態において、本発明のポリペプチドのアナログは図面に示した配列またはその断片に対して約７０％相同性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは８０％よりも大きな相同性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは８５％よりも大きな相同性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは９０％よりも大きな相同性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは９５％よりも大きな相同性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは９９％よりも大きな相同性を有するであろう。さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドのアナログは、約２０アミノ酸残基未満、より好ましくは約１０アミノ酸残基未満の置換、修飾または欠失を有するであろう。
【００４５】
アミノ酸配列を比較するのにＣＬＵＳＴＡＬプログラムのようなプログラムを用いることができる。このプログラムはアミノ酸配列を比較し、適切であればスペースをいずれかの配列に挿入することによって最適な整列を見出す。最適な配列についてのアミノ酸同一性または相同性を計算するのが可能である。ＢＬＡＳＴｘのようなプログラムは、同様な配列の最も長いストレッチを整列させ、フィットに対して値を割り当てる。かくして、同様性のいくつかの領域が見出され、各々が異なるスコアを有する比較を得ることが可能である。同一性分析の双方のタイプが本発明で考えられる。
【００４６】
抗原性ポリペプチドをスクリーニングして、エピトープ領域、すなわち、ポリペプチドの抗原性または免疫原性を担う領域を同定するのが可能であることはよく知られている。そのようなスクリーニングを行うための方法は当該分野でよく知られている。かくして、本発明の断片は１以上のそのようなエピトープ領域を含み、あるいはそれらの抗原性／免疫原性特性を保有するのにそのような領域に対して十分に同様であるべきである。
【００４７】
かくして、アナログ、誘導体および断片で重要なものは、それらは、それらが由来する蛋白質またはポリペプチドの少なくともある程度の抗原性／免疫原性を保有することである。
【００４８】
さらに、アミノ酸領域が多形であることが見出される状況においては、異なるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株の異なるエピトープをより有効に模倣するために１以上の特定のアミノ酸を変化させるのが望ましいであろう。
【００４９】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明の１以上のポリペプチド、またはその断片もしくはアナログを含むキメラポリペプチドと会合したリポソームを含む医薬組成物にも関する。
【００５０】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号２を含む２以上のポリペプチド、またその断片またはアナログを含むキメラポリペプチドに会合したリポソームを含む医薬組成物にも関し、ただし、該ポリペプチドはキメラポリペプチドを形成するように連結されているものとする。
【００５１】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号２を含む２以上のポリペプチドを含むキメラポリペプチドに会合したリポソームを含む医薬組成物にも関し、但し、ポリペプチドがキメラポリペプチドを形成するように連結されているものとする。
【００５２】
好ましくは、本発明の医薬組成物のポリペプチドの断片、アナログまたは誘導体は少なくとも１つの抗原性領域、すなわち、少なくとも１つのエピトープを含むであろう。
【００５３】
特別な実施形態において、本発明の医薬組成物に含まれるポリペプチド断片およびアナログは、メチオニン（Ｍｅｔ）またはバリン（Ｖａｌ）のような出発残基は含有しない。好ましくは、ポリペプチドはリーダーまたは分泌配列（シグナル配列）を取り込まない。本発明のポリペプチドのシグナル部分は確立された分子生物学技術に従って決定することができる。一般に、注目するポリペプチドはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ培養から単離し、引き続いて、配列決定して、成熟蛋白質の初期残基、従って、天然ポリペプチドの配列を決定することができる。
【００５４】
本発明の医薬組成物についてのポリペプチドは、それらの開始コドン（メチオニンまたはバリン）なくして、および／または組換えポリペプチドの生産および精製に好都合なようにするそれらのリーダーペプチドなくして、生産しおよび／または用いることができるのが理解される。リーダーペプチドをコードする配列を含まないクローニング遺伝子はポリペプチドをＥ．ｃｏｌｉの細胞質に制限し、それらの回収を容易とするであろう（Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．ａｎｄ Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，Ｊ．Ｊ．（１９９８） Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ． Ｉｎ．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，ｐ．１０９−１４３）。
【００５５】
ＮｓｐＡ蛋白質は抗原性的に高度に保存されており、それが特異的抗体に接近可能なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜に存在することが示されている。
【００５６】
ＮｓｐＡのイン・ビトロ折り畳みは殺菌抗体の生産を完全することができる。この膜たんぱく質の折り畳みを改良するのに用いることができる方法の１つは、リポソームへのその取り込みである。
【００５７】
リポソームは、閉じた同心二層膜を形成するリン脂質および他の極性両性体から形成される［Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｅｓ，Ｇ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，１１，３，８９（１９９０）；Ｌａｓｉｃ，Ｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，８０，ｐ．２０（１９９２）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．，１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ．，ｐ．１６９１にまとめられている］。リポソームの主な成分は脂質であり、それは、長い非極性疎水性「テイル」に結合した極性親水性「ヘッド」を有する。該親水性ヘッドは、典型的には、リン酸基よりなり、他方、親水性テイルは２つの長い炭水化物鎖から形成される。脂質分子は水溶性である１つの部分およびそうではないもう１つの部分を有するため、それらは、疎水性テイルを水分子から隔離する秩序だった構造に凝集する傾向がある。該プロセスにおいて、リポソームは水および溶質をそれらの内部に捕獲することができ、あるいは疎水性領域を持つ分子もまたリポソーム膜に直接的に一体化させることもできる。多くのリン脂質は単独で、または他の脂質と組み合わされて、リポソームを形成する。約束により、リポソームはサイズによってカテゴリー分けされ、３−文字頭字語を用いて、議論すべきリポソームのタイプを指定する。マルチラメラ小胞は「ＭＬＶ」と命名され、大きなユニラメラ小胞は「ＬＵＶ」と命名され、小さなユニラメラ小胞は「ＳＵＶ」と命名される。これらの命名には、時々、リポソームの化学的組成が続く。公知のリポソームの命名法およびまとめはＳｔｏｒｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＰＳＩＴ，１：１９−３１に記載されている。リポソームは膜蛋白質再折り畳みを助けるのに有効であり、また、抗原に対する液性並びに細胞性免疫応答の効果的なアジュバントブースティングである。
【００５８】
本発明は、約１ないし５０、ないし約１ないし１５００の間の脂質に対する蛋白質の比率を有するリポソームを含む医薬組成物を提供する。
【００５９】
本発明は、リン脂質から構成されたリポソームを含む医薬組成物を提供する。これらのリン脂質は合成し、または細菌細胞、大豆、卵から抽出することができる。
【００６０】
本発明は、組換えＮｓｐＡポリペプチドを異なるリポソーム処方に取り込む方法を提供する。
【００６１】
リポソームは、異なる比率で合わせることができる、種々の合成リン脂質（リスト１）または細菌リン脂質および／またはコレステロールで調製することができる。
【００６２】
本発明は、細菌起源からリポソーム処方を作成するために細菌細胞から脂質を抽出する方法を提供する。複合脂質混合物はいくつかの細菌種から抽出することができる。これらの種は限定されるものではないが、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐｐ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｓｐｐ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐｐ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐｐ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐｐ、およびＹｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐを含む。他の種はＢｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９７４）（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）に見出すことができる。好ましい実施形態において、複合脂質混合物はＥ．ｃｏｌｉ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｂｉｓ、またはＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａから抽出される。
【００６３】
本発明のリポソームは、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）のようなホスファチジルエーテルおよびエステルを含めた種々の小胞−形成脂質から、また、ジオレオイルグリセロスクシネートのようなグリセリド；セレブロシド；ガングリオシド、スフィンゴミエリン；コレステロールのようなステロイド；および他の脂質、ならびにビタミンＥまたはビタミンＣパルミテートのような賦形剤からの調製することができる。
【００６４】
リスト１は、ＮｓｐＡ−リポソーム調製物を調製するのに用いることができる合成脂質の部分的リストを評する。他の脂質を用いることができ、それはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．，１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ｐ．３９０に記載されている。
【００６５】
リスト１ ＮｓｐＡ−リポソーム調製物を調製するのに用いられる合成脂質のリスト
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＬＰＡ）、
ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＭＰＡ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＰＰＡ）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＳＰＡ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＯＰＡ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＰＯＰＡ）、
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、
１，２−ジトリデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、
１，２−ジペンタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、
１，２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、
１，２−ジミリストレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、
１−ミリストイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１−パルミトイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、
１−パルミトイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、
１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＬＰＧ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＭＰＧ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＰＰＧ）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＳＰＧ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＯＰＧ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＰＯＰＧ）、
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＬＰＳ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＭＰＳ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＰＰＳ）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＳＰＳ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＰＯＰＳ）。
【００６６】
好ましい実施形態において、脂質は：
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＭＰＳ）、および
１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＭＴＡＰ）
から選択させる。
【００６７】
リポソーム膜の流動性および安定性はリン脂質の転移温度（炭化水素領域が準結晶からより流体状態に変化する温度）に依存するであろう。
【００６８】
膜流動性、ラメラの数、小胞サイズ、表面電荷、抗原に対する脂質の比率、および抗原のリポソーム内への局所化の修飾は、リポソーム調製物のアジュバント性を変調することができる。
【００６９】
リポソームの調製はエタノール注入；エーテル注入；洗剤除去；溶媒蒸発；水エマルジョン中のクロロホルムからの有機溶媒の蒸発；核ポアポリカルボネート膜を通じるマルチラメラ小胞の押出し；リン脂質混合物の凍結および解凍、ならびに音波処理およびホムリナイゼーションを含めた多数の異なる技術によって作成することができる。
【００７０】
脂質は、丸底ガラスフラスコ中のクロロホルム：メタノール溶液のような適当な有機溶媒または有機溶媒混合物に溶解させ、ロータリーエバポレーターを用いて乾燥して、容器上の均一なフィルムを達することができる。
【００７１】
次いで、ＮｓｐＡ蛋白質およびＳＤＳを含有する蛋白質−洗剤溶液を脂質フィルムに加え、フィルムが溶解するまで軽く混合することができる。次いで、溶液をＰＢＳ緩衝液に対して透析して、洗剤を除去し、リポソームの形成を誘導する。
【００７２】
ゲル濾過を別法として用いて、ＮｓｐＡ−ＯＧ−ＳＰＳ−脂質混合ミセル溶液からのＮｓｐＡリポソームの形成を誘導し、洗剤を除去することができる。
【００７３】
いくつかのリポソーム処方は、リピドＡ、モノホフホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）のような親油性分子、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ２１、ミョウバン、ＭＦ５９、ｐ３ＣＳＳ、ＭＴＰ−ＰＥのようなリポ多糖のようなアジュバント、ならびにインターフェロンのようなサイトカインを含めた水溶性分子で調製することもできる。好ましい実施形態において、リポソーム組成物は約１ないし１０％アジュバントを含む。より好ましい実施形態において、アジュバントは約５％未満で存在させる。値はアジュバントに応じてｖｏｌ／ｖｏｌまたはｗｔ／ｗｔであってよい。
【００７４】
本発明によると、リポソームは抗原送達において臨界的な役割を演じる。というのは、ポリペプチド−リポソーム組成物は免疫系の細胞による循環からの除去に続いて免疫系に直接的に提示されるからである。加えて、免疫刺激経路の選択は、リポソームの脂質組成に変化を施すことによって改変することができる。例えば、リピドＡ、ムラミルジ−およびトリペプチド−ＰＥおよびカチオン性脂質のような異なる刺激分子をリポソームに処方することができる。
【００７５】
膜蛋白質の再折り畳みに加えて、リポソームもまた抗原に対する液性ならびに細胞性免疫応答をブースティングする有効なアジュバントである。膜流動性、ラメラの数、小胞サイズ、表面電荷、抗原に対する脂質比率、および抗原のリポソーム内の局所化の修飾は、リポソーム調製物のアジュバント性を変調することができる。
【００７６】
好ましい実施形態において、脂質処方は０および２５モル％の間のコレステロールを含有する。
【００７７】
本発明のもう１つの態様によると、（ｉ）リポソーム、担体、希釈剤またはアジュバントと共に本発明のポリペプチドを含有する組成物；（ｉｉ）本発明のポリペプチドおよびリポソーム、希釈剤またはアジュバントを含む医薬組成物；（ｉｉｉ）本発明のポリペプチドおよびリポソーム、単体、希釈剤またはアジュバントを含むワクチン；（ｉｖ）免疫応答、例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する保護免疫応答を誘導するのに免疫原性的に有効な量の本発明の医薬組成物を宿主に投与することによって宿主においてＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する免疫応答を誘導する方法；特に、（ｖ）予防または治療有効量の本発明の医薬組成物をそれを必要とする宿主に投与することによって、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染を予防および／または治療する方法も提供される。
【００７８】
本発明のもう１つの態様によると、（ｉ）リポソーム、担体、希釈剤またはアジュバントと共に本発明のポリヌクレオチドを含有する組成物；（ｉｉ）本発明のポリヌクレオチド、およびリポソーム、担体、希釈剤またはアジュバントを含む医薬組成物；（ｉｉｉ）免疫応答、例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する保護免疫応答を誘導するのに免疫原性的に有効量の本発明の医薬組成物を宿主に投与することによって宿主においてＮ．ｍｅｍｏｍｇｏｅｔｄｏｓに対する免疫応答を誘導する方法；特に、（ｉｖ）予防または治療量の本発明の医薬組成物をそれを必要とする宿主に投与することによって、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染を予防および／または治療する方法も提供される。
【００７９】
もう１つの態様によると、医薬上許容されるアジュバントを含む混合物中のリポソーム、１以上の本発明のＮ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリペプチドを含む医薬組成物が提供される。適当なアジュバントは（１）ＭＦ５９ＴＭ、ＳＡＦＴＭ、ＲｉｂｉＴＭのような水中油型エマルジョン処方；（２）フロイントの完全または不完全アジュバント；（３）塩、すなわち、ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）２、Ａｌ（ＯＨ）３、ＡｌＰＯ４、シリカ、カオリン；（４）ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）のようなそれから精製するＳｔｉｍｕｌｏｍＴＭまたは粒子のようなサポニン誘導体；（５）インターロイキン、インターフェロン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなサイトカイン；（６）炭素ポリヌクレオチド、すなわち、粘膜免疫性の誘導のための、ポリＩＣおよびポリＡＵ、解毒されたコレラトキシンン（ＣＴＢ）およびＥ．ｃｏｌｉ熱不安定トキシンのような他の物質を含む。アジュバントのより詳細な記載は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．１（１９９４） ｐｐ２−１１においてＭ．Ｚ．Ｉ Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．によるレビューにおいて、また、Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．１４，ｐｐ１２６３−１２７６（１９９５）およびＷＯ ９９／２４５７８においてＧｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．によるもう１つのレビューにおいて利用可能である。好ましいアジュバントはＱｕｉｌＡＴＭ、ＱＳ２１ＴＭ、ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌＴＭおよびＡｄｊｕｐｈｏｓＴＭを含む。
【００８０】
本発明の医薬組成物は注射、迅速注入、鼻咽頭吸収、皮膚吸収によって非経口的に、またはバッカル傾向または経口投与することができる。
【００８１】
用語医薬組成物は抗体を含むことも意味する。本発明によると、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染および／またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染によって媒介される病気および兆候の治療または予防用の、本発明のポリペプチドに対する結合特異性を有する１以上の抗体の使用が提供される。
【００８２】
本発明の医薬組成物は、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐ．Ｒ．Ｍｕｒｒａｙ（Ｅｄ，ｉｎ Ｃｈｉｅｆ），Ｅ．Ｊ．Ｂａｒｏｎ，Ｍ．Ａ．Ｐｆａｌｌｅｒ，Ｆ．Ｃ．Ｔｅｎｏｖｅｒ ａｎｄ Ｒ．Ｈ．Ｙｏｌｋｅｎ． ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．ｓｅｖｅｎｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９９，１７７３ｐに記載されたナイセリア感染および／またはナイセリア感染によって媒介される病気および兆候の予防で用いられる。
【００８３】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、髄膜炎および髄膜炎菌血症のような風土病および流行病の治療または予防で用いられる。１つの実施形態において、本発明のワクチン組成物は、ナイセリア感染および／またはナイセリア感染によって媒介される病気および兆候の治療または予防で用いられる。さらなる実施形態において、ナイセリア感染はＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａまたはＮ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａである。
【００８４】
さらなる実施形態において、本発明は、予防または治療量の本発明の組成物を宿主に投与することを含む、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染に罹患性の宿主においてＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染の予防または治療方法を提供する。
【００８５】
本発明で用いるように、用語「宿主」は哺乳動物を含む。さらなる実施形態において、該哺乳動物はヒトである。
【００８６】
特別な実施形態において、医薬組成物は、新生児、幼児、子供、老人および免疫寛容宿主のようなＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染の危険性がある宿主に投与される。
【００８７】
特別な実施形態において、医薬組成物は、成人のようなＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染の危険性がある宿主に投与される。
【００８８】
医薬組成物は、好ましくは、免疫化の間が約１ないし６週間間隔の間隔であり、１ないし３回の、約０．００１ないし１００μｇ／ｋｇ（抗原／体重）、より好ましくは０．０１ないし１０μｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．１ないし１μｇ／ｋｇの単位投与形態である。
【００８９】
医薬組成物は、好ましくは、免疫化の間が約１ないし６週間間隔の間隔である、１ないし３回の、約０．１μｇないし１０ｍｇ、より好ましくは１μｇないし１ｍｇ、最も好ましくは１０ないし１００μｇの単位投与形態である。
【００９０】
もう１つの態様において、配列番号２を含むアミノ酸配列によって特徴付けられるポリペプチド、またはその断片もしくはアナログをコードするポリヌクレオチドに関連するリポソームを含む医薬組成物が提供される。
【００９１】
図１に示したポリヌクレオチド配列は縮重コドンで改変することができるが、依然として、本発明のポリペプチドをコードすることは認識されよう。従って、本発明は、さらに９０％の配列間同一性を有するここに前記したポリヌクレオチド配列（またはその相補体配列）にハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびリポソームを含む医薬組成物を提供する。さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能であり、すなわち、少なくとも９５％同一性を有する。さらなる実施形態において、９７％を超える同一性。
【００９２】
ハイブリダイゼーションに適したストリンジェントな条件は当業者によって容易に決定することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１９９９） ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．参照）。
【００９３】
さらなる実施形態において、配列番号１に示されたポリヌクレオチド、または本発明のポリペプチドをコードするその断片またはアナログと会合したリポソームを含む医薬組成物。
【００９４】
もう１つの態様によると、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させ、発現させたポリペプチド産物を回収することにより、組換え技術によって本発明のポリペプチドを生産する方法が提供される。
【００９５】
別法として、ポリヌクレオチドは確立された合成化学技術、すなわち、十分なポリペプチドを生産するように連結された（ブロック連結）オリゴペプチドの液相または固相合成に従って生産することができる。
【００９６】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを得て、評価する一般的方法は以下の文献に記載されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｗｈｉｔｅ Ｂ．Ａ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９７，４９０ ｐａｇｅｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ，Ｓｃｏｐｅｓ Ｒ．Ｋ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９３，３８０ ｐａｇｅｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
【００９７】
本発明は、ポリペプチドの発現に適した条件下で、本発明の宿主細胞を培養することを含むポリペプチドの製法を提供する。
【００９８】
組換え生産では、宿主細胞を、本発明のポリペプチドをコードするベクターでトランスフェクトし、次いで、適切には、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、または遺伝子を増幅するための修飾された栄養培地中で培養する。適当なベクターは選択された宿主中で生きており、複製可能であるものであり、染色体、非−染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せから由来するベクターを含む。ポリペプチド配列は、それが、プロモーター、リボソーム結合部位（コンセンサス領域またはシャイン−ダルガルノ配列）および所望によりオペレーター（制御エレメント）を含む発現制御領域に操作可能に連結されるように、制限酵素を用いて適当な部位にてベクターに組み込むことができる。与えられた宿主およびベクターに適切である発現制御領域の個々の成分を、確立された分子生物学の原理に従って選択することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。適当なプロモーターは、限定されるものではないが、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔａｃまたはｔｒｐプロモーターおよびファージラムダＰＬプロモーターを含む。ベクターは、好ましくは、複製起点ならびに選択マーカー、すなわち、アンピシリン抵抗性遺伝子を取り込む。適当な細菌ベクターはｐＥＴ、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐＤ１０ ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５および真核生物ベクターｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬを含む。宿主細胞は細菌、すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ；真菌、すなわち、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌｉｎｓ；酵母、すなわち、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたは真核生物、すなわち、ＣＨＯ、ＣＯＳであってよい。
【００９９】
培養におけるポリペプチドの発現に際して、細胞は典型的には遠心によって収穫し、次いで、（もし発現されたポリペプチドが培地に分泌されないならば）物理的化学的手段によって破壊し、得られた粗製調節物を維持して、注目するポリペプチドを単離する。培養基または溶解物からのペプチドの精製は、ポリペプチドの特性に依存して、確立された技術によって、すなわち、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクトマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびべクチンクロマトグラフィーを用いて達成することができる。最終の精製はＨＰＬＣを用いて達成することができる。
【０１００】
ポリペプチドはリーダーまたは分泌配列の有りまたは無しにて発現させることができる。前者の場合には、リーダーは、翻訳後プロセッシングを用いて除去することができ（米国特許第４，４３１，７３９号；米国特許第４，４２５，４３７号；および米国特許第４，３３８，３９７号参照）、あるいは発現されたポリペプチドの精製に従い化学的に除去することができる。
【０１０１】
さらなる態様によると、本発明の医薬組成物はナイセリア感染、特に、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染についての診断テストで用いることができる。
【０１０２】
いくつかの診断方法、例えば、生物学的試料中のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ生物の検出が可能である。以下の手法に従うことができる；
ａ）宿主から生物学的試料を入手し、
ｂ）本発明の医薬組成物と反応性である抗体または抗体断片を、生物学的試料と共にインキュベートして、混合物を形成し；次いで、
ｃ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの存在を示す混合物中の特異的に結合した抗体または結合した断片を検出する。
【０１０３】
別法として、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原に特異的な抗体を含有する、または含有することが疑われる生物学的試料中の該抗体を検出する抗体は以下のように行うことができる。
【０１０４】
ａ）宿主から生物学的試料を入手し、
ｂ）本発明の医薬組成物を生物学的試料と共にインキュベートして、混合物を形成し；ついで、
ｃ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに特異的な抗体の存在を示す混合物中の特異的に結合した抗原または結合した断片を検出する。
【０１０５】
当業者であれば、この診断テストは、本質的に、蛋白質の特異的な抗体が生物に存在するか否かを判断するための、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイまたはラテックス凝集アッセイのような免疫学的テストを含めたいくつかの形態を採ることができるのを認識するであろう。
【０１０６】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を用いて、そのような細菌を含有することが疑われる生物学的試料中のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの存在を検出するのに用いられるＤＮＡプローブを設計することもできる。本発明の検出方法は；
ａ）宿主から生物学的試料を入手し、
ｂ）本発明のポリペプチドまたはその断片をコードするＤＮＡ配列を有する１以上のＤＮＡプローブを生物学的試料と共にインキュベートして、混合物を形成し；次いで、
ｃ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ細菌の存在を示す混合物中の特異的に結合したＤＮＡプローブを検出することを含む。
【０１０７】
本発明のＤＮＡプローブは、例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染を診断する方法として、例えば、ポリメラーゼ鎖反応を用いて試料中の循環Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、すなわち、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ核酸を検出するのに用いることもできる。該プローブは慣用的技術を用いて合成することができ、固相に固定化し、あるいは検出可能な標識で標識することができる。この適用のための好ましいＤＮＡプローブは、本発明のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリペプチドの少なくとも約６連続ヌクレオチドに対して相補的な配列を有するオリゴマーである。さらなる実施形態において、好ましいＤＮＡプローブは、本発明のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリペプチドの少なくとも約１５連続ヌクレオチドに対して相補的な配列を有するオリゴマーであろう。さらなる実施形態において、好ましいＤＮＡプローブは、本発明のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリペプチドの少なくとも約３０連続ヌクレオチドに対して相補的な配列を有するオリゴマーであろう。さらなる実施形態において、好ましいＤＮＡプローブは、本発明のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリペプチドの少なくとも約５０連続ヌクレオチドに対して相補的な配列を有するオリゴマーであろう。
【０１０８】
宿主においてＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの検出のためのもう１つの診断方法は；
ａ）本発明の医薬組成物に対して反応性である抗体を検出可能な標識で標識し；
ｂ）標識された抗体を宿主に投与し、次いで、；
ｃ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの存在を示す宿主における特異的に結合した標識抗体または標識断片を検出する；
ことを含む。
【０１０９】
本発明のさらなる態様は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染の診断および、特に、治療用の特異的抗体の生産のための免疫原としての本発明の医薬組成物の使用である。適当な抗体は、例えば、テストモデルにおいてＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染に対して受動的に保護する特定の抗体の能力を測定することによって、適当なスクリーニング方法を用いて測定することができる。抗体は全抗体またはその抗原−結合断片であってよく、いずれの免疫ブロブリンクラスに属することもできる。抗体または断片は動物起源、特に哺乳動物起源、さらに詳しくはネズミ、ラットまたはヒト起源であってよい。それは天然抗体またはその断片、あるいは所望であれば、組換え抗体または抗体断片であってよい。擁護組み換え抗体または抗体断片は、分子生物学技術を用いて生産された抗体または抗体断片を意味する。抗体または抗体断片はポリクローナル、または好ましくはモノクローナルであってよい。それは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリペプチドと会合した多数のエピトープに対して特異的であるが、好ましくは１つに対して特異的であろう。
【０１１０】
１つの態様において、本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染の予防および／または治療のための抗体の使用を提供する。
【０１１１】
本発明のさらなる態様は、受動免疫化のための、本発明の医薬組成物に向けられた抗体の使用である。本出願に記載された抗体を使用することができよう。
【０１１２】
本発明のさらなる態様は免疫化の方法であり、それにより、本発明の医薬組成物に惹起された抗体は、受動免疫化を供するのに十分な量で宿主に投与される。
【０１１３】
さらなる実施形態において、本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染の予防または治療処置用の医薬の製造における本発明の医薬組成物の使用を提供する。
【０１１４】
さらなる実施形態において、本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染の検出または診断用の本発明の医薬組成物を含むキットを提供する。
【０１１５】
他に定義されなければ、本明細書中で用いるすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野における当業者によって通常理解されるのと同一の意味を有する。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の文献がここに引用してその全体を援用する。コンプリクトする場合、定義を含めた本出願が支配するであろう。加えて、材料、方法および例は説明のためであり、限定的であることを意図しない。
【実施例】
【０１１６】
実施例１
本実施例は、ＮｓｐＡ蛋白質を表す３−Ｄモデルを説明する。
【０１１７】
髄膜炎菌ＮｓｐＡ蛋白質を３−Ｄモデルは、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｄｂ Ｖｉｅｗｅｒ［Ｇｕｅｘ，Ｎ．ａｎｄ ＭＣ Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｅｌｅｃｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１８，ｐ．２７１４（１９９７）］および図１に示されたＮｓｐＡアミノ酸配列を用い、再度折り畳まれたＥ．ｃｏｌｉ ＯｍｐＡ（ＰＤＢ：１ＱＪＰ）の結晶構造［Ｐａｕｔｓｃｈ，Ａ ａｎｄ ＧＥ Ｓｃｈｕｌｚ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２９８，ｐ．２７３（２０００）］に基づいて開発された。この配列ならびに他のＮｓｐＡは、元来、ＰＣＴ／ＷＯ／９６／２９４１２で示された。３−Ｄ ＮｓｐＡモデルは図２に示す。予測される標的（ＮｓｐＡ配列）および鋳型（１ＱＪＰ，ＯＭＰＡ配列）の間の整列は、二次構造を予測（ＰＳＩＰＲＥＤ）、プロフィールライブラリーサーチ（ＦＵＧＵＥ）、位置特異的反復ＢＬＡＳＴ（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ）およびベータ−ストランド両親媒性測定を用いて達成された［Ｓｈｉ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３１０，ｐ．２４３（２００１）；ＭｃＧｕｆｆｉｎ Ｌ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１６，ｐ．４０４（２０００）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５，ｐ．３３８９（１９９７）］。このモデルから、蛋白質の各領域を突き止め、それらを、ペリプラズムターン（Ｔ）、膜包埋領域（Ｍ）および表面−露出ループ（Ｌ）として分類することができた。従前に報告されているように、最初の１８アミノ酸残基は分泌シグナルを表し、これは切断されて成熟ポリペプチドとなる［Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５，ｐ．１１７３（１９９７）］。細菌のペリプラズム領域に面する膜の外側まで延びる３つの鋭いターンは、残基５５ないし５８（Ｔ１）、９２ないし９６（Ｔ２）および１３７ないし１４０（Ｔ３）の間に突き止められた。髄膜炎基膜に包埋されたＮｓｐＡ蛋白質の内部コアは、β−バレルを形成する８つの反平行膜貫通β−ストランドから構成される。これらの膜貫通β−ストランドは、各々、アミノ酸残基２４ないし３３（Ｍ１）、４５ないし５４（Ｍ２）、５９ないし６７（Ｍ３）、８１ないし９１（Ｍ４）、９７ないし１０７（Ｍ５）、１２６ないし１３６（Ｍ６）、１４１ないし１５０（Ｍ７）、および１６４ないし１７３（Ｍ８）の間に位置すると決定された。最後に、髄膜炎基細胞の表面に露出していると判断された４つの領域は、各々、アミノ酸残基３４ないし４４（Ｌ１）、６８ないし８０（Ｌ２）、１０８ないし１２５（Ｌ３）、および１５１ないし１６３（Ｌ４）の間に位置した。このモデルの免疫学的確認は実施例５に示す。
【０１１８】
実施例２
本実施例は、ΔＮｓｐＡ Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ突然変異体株の創製を説明する。
【０１１９】
ＮｓｐＡ蛋白質を発現しない髄膜炎菌突然変異体株を創製するために、ファージベクターλ１１０５に挿入されたトランスポゾンミニ−Ｔｎ１０（Ｋａｎｒ）を用いて遺伝子を
不活化した［Ｗａｙ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ，３２，ｐ．３６９（１９８４）；Ｋｌｅｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０４，ｐ．１３９（１９９１）］。ｎｓｐＡ遺伝子［Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５，ｐ．１１７３（１９９７）］を含有するプラスミドｐＮ２２０２を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０［Ｆ−、ｈｓｄＲ−、ｈｓｄＭ＋、ｔｈｙ−、ＩＮ（ｒｒｎＤ−ｒｒｎＥ）１λ−、ｍｃｒＡ＋、ｍｃｒＢ＋、（ｒｋ＋、ｍｋ＋）、ＭＲＲ＋、ｓｕｏ］を形質転換した。次いで、組換えＥ．ｃｏｌｉ株をファージベクターλ１１０５で感染させ、培養を、２５μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上で平板培養し、３７℃で一晩インキュベートした。染色体またはｐＮ２２０２プラスミドいずれか上にミニ−Ｔｎ１０トランスポゾンを含有する細菌のみが選択培地で増殖するであろう。ＱＩＡｇｅｎプラスミド精製キットを用い、組換えｐＮ２２０２プラスミドを選択されたコロニーから精製した。次いで、これらの精製されたプラスミドを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９（ｅ１４−（ｍｃｒＡ） ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｇｙｒＡ９６ ｔｈｉ−１ ｈｓｄＲ１７（ｒｋ− ｍｋ＋） ｓｕｐＥ４４ ｒｅｌＡ１ Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）（Ｆ’ ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡＢ ｌａｃＩｑＺΔＭ１５））を形質転換し、細菌懸濁液を再度選択培地で平板培養した。ミニ−Ｔｎ１０トランスポゾンを持つ、ｐＮ２２０２ΔｎｓｐＡとして同定された組換えｐＮ２２０２プラスミドを含有する細菌のみが、この第２ラウンドの選択後に増殖することができた。イムノブロットにより、これらの組換えＥ．ｃｏｌｉはＮｓｐＡ蛋白質を生産しなかったことが確認された。プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ組換え株の１つから精製し、ｎｓｐＡ遺伝子中のミニ−Ｔｎ１０トランスポゾンの存在は配列決定によって確認した。１．８ｋｂミニ−Ｔｎ１０は、プラスミドｐＮ２２０２ΔｎｓｐＡに含有されたｎｓｐＡ遺伝子中のヌクレオチド２２１直後に挿入さたれと判断された。次いで、プラスミドｐＮ２２０２ΔｎｓｐＡを用いて、以下のプロトコルに従って、髄膜炎菌株６０８Ｂを形質転換した。１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むハートヒュージョンブロス中で増殖した髄膜炎菌株６０８Ｂの細菌懸濁液の光学密度（λ＝６２０ｎｍ）を〜０．２５に調整した。１０μｌの一定容量の精製されたプラスミドｐＮ２２０２ΔｎｓｐＡを１ｍｌの調整された髄膜炎菌細胞懸濁液に加え、５％ＣＯ２の存在下で３７℃にて３時間インキュベートした。このインキュベーション時間の後、髄膜炎菌細胞を、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するチョコレート寒天プレート上で平板培養した。ＮｓｐＡ蛋白質の発現の欠如は、イムノブロッティングおよびフローサイロフルオロメトリーアッセイによって確認された。予測されるように、ＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂ Ｍｅ−７ならびにウサギおよびマウス過剰免疫結成は６０８ＢΔｎｓｐＡ突然変異体株と反応せず、他方、それらは野生型髄膜炎菌６０８Ｂ株を認識した。
【０１２０】
実施例３
本実施例は、ＮｓｐＡ−特異的モノクローナル抗体の創製を説明する。
【０１２１】
天然ＮｓｐＡに対して向けられたＭＡｂを創製するために、血清型ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株６０８Ｂ［Ｂ：２ａ：Ｐ１．２：Ｌ３］から抽出された外膜調製物で雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫化した［Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５，ｐ．１１７３（１９９７）］。この外膜調製物を得るのに用いた塩化リチウム抽出は、本発明者らによって従前に記載されたように行った［Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５０，ｐ．２６５（１９８５）］。マウスに、ＱｕｉｌＡアジュバント（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｒｎｂｙ，Ｏｎｔ．Ｃａｎａｄａ）の存在下で、３週間間隔で、２０μｇの外膜調製物を３回筋肉内（ＩＭ）注射した。ハイブリドーマ細胞系を創製するのに用いた融合プロトコルは、発明者らによって従前に記載されている［Ｈａｍｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２５，ｐ．２４３４（１９８７）］。ＭＡｂのクラスおよびサブクラスは従前に報告されているようにＥＬＩＳＡによって決定した［Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５，ｐ．１１７３（１９９７）］。
【０１２２】
ＭＡｂの特異性は、精製された組換えＮｓｐＡ蛋白質、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ野生型株６０８Ｂおよび６０８ＢΔｎｓｐＡ突然変異体株から抽出された外膜調製物を用い、ＥＬＩＳＡによって測定し、データを表１に示す。ＥＬＩＳＡは従前に記載されているように行った［Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５，ｐ．１１７３（１９９７）］。ＰＣＴ／ＷＯ／９６／２９４１２に従前に記載されたＭＡｂ Ｍｅ−７を陽性対照として用い、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｐ２外膜蛋白質からの特異的なＭＡｂ ｐ２−４を陰性対照として用いた［Ｃａｄｉｅｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．，６７，ｐ．４９５５，（１９９９）］。全てのＭＡｂは精製された組換えＮｓｐＡと、および髄膜炎菌野生型６０８Ｂ株から抽出された外膜調製物と強く反応したが、それらが髄膜炎菌６０８ＢΔｎｓｐＡ突然変異体株を認識しなかった。
【０１２３】
表１：ＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂの反応性
【０１２４】
【表１−１】
【０１２５】
【表１−２】
１ＭＡｂの反応性は、０．５μｇ／ｍｌの精製された組換えＮｓｐＡ蛋白質、野生型６０８Ｂ髄膜炎菌株からの、またはコーディング抗原としての６０８ＢΔｎｓｐＡ株からのＯＭＰの２．５μｇ／ｍｌを用い、ＥＬＩＳＡによって評価した。
【０１２６】
無傷髄膜炎菌細胞の表面でのＮｓｐＡの露出はサイトフルオロメトリーアッセイを用いて調べた。髄膜炎菌は、８％ＣＯ２雰囲気中、３７℃にて、０．２５％デキストロースを含有するブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）ブロス中で、０．５００（〜１０８ＣＦＵ／ｍｌ）の光学密度（λ＝４９０ｎｍ）まで増殖させた。次いで、ＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂまたは対照ＭＡｂを加え、細胞に結合させ、これを回転させつつ４℃にて２時間インキュベートした。試料を、ブロッキング緩衝液［２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸−緩衝化生食塩水（ＰＳＢ）］中で２回洗浄し、次いで、ブロッキング緩衝液中に希釈された１ｍｌのヤギフルオレセイン（ＦＩＴＣ）−コンジュゲーテッド抗−マウス特異的ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を加えた。回転しつつの室温での６０分間のさらなるインキュベーションの後、試料をＰＢＳ緩衝液中で２回洗浄し、ＰＤＢ緩衝液中の０．３％ホルムアルデヒドで４℃にて１８時間固定した。細胞を、フルオサイトメトリー（Ｅｐｉｃｓ（登録商標）ＸＬ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）によって分析するまで、４℃にて暗所で維持した。
【０１２７】
図３は、２つの血清群Ｂ（６０８Ｂ）［Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５，ｐ．１１７３（１９９７）］およびＣｕ３８５［Ｍｏｅ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６７，ｐ．５６６４，（１９９９）］、１つの血清群Ａ（Ｆ８２３８）［Ｍａｓｌａｎｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４，ｐ．１５６（１９９７）］および１つの血清群Ｃ（Ｃ１１）［Ｍａｓｌａｎｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４，ｐ．１５６（１９９７）］髄膜炎菌株の表面における９つの代表的ＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂの結合を示す。各ＭＡｂについて、濃度は１μｇ／ｍｌに調製し、初期対数期髄膜炎菌細胞を用いて、サイトフルオロメトリーアッセイを行った。これらのＭＡｂのいずれも、ｎｓｐＡ遺伝子がトランスポゾンの挿入によって不活化された６０８ＢΔｎｓｐＡ突然変異体株と反応しなかった（突然変異体株の記載については実施例２参照）。この結果は、これらのＭＡｂのいずれも、生きた髄膜炎菌細胞の表面に非特異的に結合しなかったことを示す。
【０１２８】
無傷髄膜炎菌細胞への付着のレベルに従い、ＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂを３つの群に分類した（図３）。第一の群において、Ｍｅ−７、Ｍｅ−９、Ｍｅ−１１、Ｍｅ−１３およびＭｅ−１５のようなＭＡｂはテストした４つの株の細胞表面において効果的に付着し、これは、それらのエピトープが蛋白質の表面−露出領域に位置することを示す。第二の群に分類されたＭｅ−１０、Ｍｅ−１２およびＭｅ−１４のようなＭＡｂの結合はより可変であった。というのは、それらは、テストされた４つのうち１または２の株の表面のその対応するエピトープを認識したからである。最後に、いずれの無傷髄膜炎菌細胞にも結合しなかったＭｅ−１６のようなＭＡｂは第三の群に分類された。イムノブロットは、後者の群におけるＭＡｂは、それを髄膜炎菌外膜に挿入されなかった場合、精製されたＮｓｐＡとよく反応したことを明瞭に示した（データは示さず）。
【０１２９】
全体として、これらの結合データは、ＮｓｐＡに存在するいくつかのエピトープは露出されており、血清学的に区別される髄膜炎菌細胞の細胞表面の特異的抗体に接近可能であり、他方、他のエピトープは制限された数の株上の抗体に接近可能であることを示唆した。ＮｓｐＡ蛋白質は高度に保存されており、今日までにテストされた全ての株によって生産されるため、群ＩＩのＭＡｂのある種の髄膜炎菌株への結合の欠如は、恐らくは、アミノ酸変動、または蛋白質発現の欠如にほとんど関連しない。髄膜炎菌細胞表面に存在する他の抗原は第二の群におけるＭＡｂによって認識されるエピトープをマスクするのではないか、あるいは蛋白質の三次構造はこれらの株において僅かに異なり、かくして、ある種のエピトープへの抗体への結合を妨げると仮定するであろう。多糖被膜はＮｓｐＡエピトープをシールドし、大量の多糖を生産する髄膜炎菌株への抗体の結合を妨げると報告されている［Ｍｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６７，ｐ．５６６４、（１９９９）］。しかしながら、多糖の生産、結合の欠如、およびＮｓｐＡ−特異的抗体の殺菌活性の間の関係は明瞭には確立されなかった。事実、抗−ＮｓｐＡ抗体は表面に結合せず、高い多糖生産者であると決定された髄膜炎菌株を殺すことができず、他方、低−生産者株は表面結合について陰性であって、殺菌活性に対して抵抗性であった。この後者の観察を考慮し、立体配座変化のような他のメカニズムもまたある種のＭＡｂについて観察された結合の欠如および殺菌活性を説明できるであろうと仮定されるかもしれない。
【０１３０】
全ての４つの株の表面のそれらの特異的エピトープを認識した群Ｉに分類されたＭＡｂは、テストした４つの髄膜炎菌株に対して殺菌性であることが判明した（図３）。群ＩのＭＡｂでは、データは、表面結合および殺菌活性の間の相関を示唆した。しかしながら、群ＩＩに分類されたＭＡｂについてのいずれかの関係を確立するのは困難である。その例として、髄膜炎菌株Ｃ１１は、それが表面結合については陽性であるにも拘わらず、ＭＡｂ Ｍｅ−１２およびＭｅ−１４の殺菌活性に対して抵抗性であった。
【０１３１】
実施例４
本実施例は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）による修飾されたｎｓｐＡ遺伝子産物のクローニングおよびＥ．ｃｏｌｉにおけるこれらの遺伝子産物の発現を記載する。
【０１３２】
ＮｓｐＡ表面−露出エピトープを特徴付けるために、７つの修飾されたＮｓｐＡ蛋白質を設計した（表２）。標準的な方法に従い、制限酵素部位（表３および４）の付加のための塩基延長を含有したオリゴヌクレオチドプライマーの対を用い、Ｎｍ１４、Ｎｍ１６、Ｎｍ１７およびＮｍ２０と命名された修飾されたｎｓｐＡ遺伝子に含まれるべき遺伝子断片を、特許ＰＣＴ／ＷＯ／９６／２９４１２に記載されたｐＵＲＶベクターにクローン化されたｎｓｐＡまたは（Ｎｍ２０の代わりの）Ｎｍ１９からＰＣＲ（ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム２４００ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって増幅した。ＰＣＲ産物は、製造業者の指示に従って、ＱＩＡｇｅｎからのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて、アガロースゲルから精製し、制限エンドヌクレアーゼで消化した。ｐＵＲＶベクターをエンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＱＩＡｇｅｎからのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いてアガロースゲルから精製した。与えられた修飾されたｎｓｐＡ遺伝子に対応する消化されたＰＣＲ産物を、修飾されたｎｓｐＡ遺伝子の創製のためにｐＵＲＶ−ＮｄｅＩ−ＮｏｔＩベクターに連結した。連結された産物を、製造業者の推奨に従い、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５α［Ｆ−φ８０ｄｌａｃｚΔＭ１５ Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｅｎｄＡ１ ｒｅｃＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−ｍｋ＋） ｄｅｏＲ ｔｈｉ−１ ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４ λ―ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１］（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に形質転換した。修飾されたｎｓｐＡ遺伝子断片を含有する組換えプラスミドを、ＱＩＡｇｅｎプラスミドキットを用いて精製し、それらのＤＮＡインサートを配列決定した（Ｔａｑ Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ，ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。
【０１３３】
修飾された蛋白質Ｎｍ１４、Ｎｍ１６、Ｎｍ１７、およびＮｍ２０を完成し、蛋白質Ｎｍ３を創製するために、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ部位−特異的突然変異誘発キットおよび表５に記載されたオリゴヌクレオチドを用いる突然変異誘発実験を製造業者の推奨に従って行った。表６は、部位−特異的突然変異誘発によって創製された修飾されたｎｓｐＡ遺伝子に対する修飾を示す。
【０１３４】
蛋白質Ｎｍ１８を創製するために、制限酵素部位（表４）の付加のための塩基延長を含有するオリゴヌクレオチドプライマーＤＭＡＲ８３９およびＤＭＡＲ１１５９を用い、Ｎ−末端断片をＰＣＲによって増幅し、前記したように消化した。標準的な方法に従い、オリゴヌクレオチドプライマーＤＭＡＲ１１５７およびＤＭＡＲ１１５８をアダプターとして用い、これらのプライマーのアニーリングの後に、Ｃ−末端断片を作製した。ｐＵＲＶ−ＮｄｅＩ−ＮｏｔＩベクターへの連結、およびＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αへの形質転換は前記したように行った。修飾されたｎｓｐＡ遺伝子断片を含有する組換えプラスミドは、ＱＩＡｇｅｎプラスミドキットを用いて精製し、そのＤＮＡインサートを配列決定した（Ｔａｑ Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ，ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。
【０１３５】
Ｎｍ１９分子を創製するために、修飾された遺伝子Ｎｍ１６およびＮｍ１８を、各々、エンドンクレアーゼＮｄｅＩ−ＳａｌＩおよびＳａｌＩ−ＮｏｔＩで消化した。ＱＩＡｇｅｎからのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用い、断片をアガロースゲルから精製し、ｐＵＲＶ−ＮｄｅＩ−ＮｏｔＩベクターに連結した。ＱＩＡｇｅｎプラスミドキットを用い、修飾された遺伝子Ｎｍ１９を含有する組換えプラスミドを精製し、そのＤＮＡインサートを配列決定した（Ｔａｑ Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ，ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。
【０１３６】
得られたプラスミド構築体の各々を用いて、エレクトロポレーション（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ装置，ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｌａｂｓ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）によって、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（Ｆ− ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒ−Ｂｍ−Ｂ） ｇａｌ ｄｃｍ）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換した。この組換え株を、４０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢブロス（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）に接種し、まず、攪拌しつつ３７℃にてほぼ１．５時間インキュベートし（ＯＤ６００ｎｍ＝０．６）、その時点の後、温度をさらに１．５時間で３９℃まで上昇させて、組換え蛋白質の生産を誘導した。表面−露出エピトープを特徴付けるために、実施例５に記載したように、インキュベーション時間の後に得られたＥ．ｃｏｌｉ株に対して、サイトフルオロメトリーアッセイを用いてＮｓｐＡ−特異的Ｍａｂをテストした。
【０１３７】
表２ 修飾されたｎｓｐＡ遺伝子のリスト
【０１３８】
【表２】
表３ 表２にリストされた修飾されたｎｓｐＡ遺伝子の創製のために設計されたＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対のリスト
【０１３９】
【表３】
表４ 表２にリストされた修飾されたｎｓｐＡ遺伝子の創製のために設計されたＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーのリスト
【０１４０】
【表４】
表５ 修飾されたｎｓｐＡ遺伝子に対する部位−特異的突然変異誘発で用いたＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー組のリスト
【０１４１】
【表５】
表６ 部位−特異的突然変異誘発によって創製された修飾されたｎｓｐＡ遺伝子産物に対する修飾のリスト
【０１４２】
【表６】
１下線を施したアミノ酸残基はＤＮＡ配列中の修飾を表す。
【０１４３】
実施例５
本実施低はＮｓｐＡ蛋白質上のＭＡｂによって認識されたエピトープの位置決定を説明する。
【０１４４】
ＮｓｐＡ−特異的Ｍａｂによって認識されたエピトープを位置決定し、および実施例１で示されたＮｓｐＡモデルを確認するために、実施例４に記載された修飾されたＮｓｐＡ蛋白質を生産していた組換えＥ．ｃｏｌｉ株を用いるフローサイトメトリーによって、およびＮｓｐＡ蛋白質をカバーする重複合成ペプチドでのＥＬＩＳＡによって、これらのＭＡｂの表面結合を評価した。
【０１４５】
Ｍｅ−１６のような群ＩＩＩ ＭＡｂによって認識されるエピトープは、ＮｓｐＡ蛋白質の全長をカバーする重複する１５−ないし２０−アミノ酸残基合成ペプチドを用いて容易に位置決定された。これらのペプチドは特許ＰＣＴ／ＷＯ／９６／２９４１２に示されている。その例として、ＭＡｂ Ｍｅ−１６は、ＥＬＩＳＡによって、残基４１ないし５５
【０１４６】
【数１】
および１４１ないし１５０
【０１４７】
【数２】
の間に位置する２つの別々のペプチドと反応することが判明した。より綿密な分析は、これらの２つのペプチドは、ペプチド配列中で下線を施したＡＧＹＲ残基を共有したことを明らかにした。ＮｓｐＡモデル（図２）に従うと、これらの２つの領域は髄膜炎菌外膜の内部に包埋され、予測されるように、これらの領域に対して向けられた抗体は無傷髄膜炎菌細胞に付着しなかった（図３）。
【０１４８】
群ＩおよびＩＩに分類されたＭＡｂはこれらのペプチドのいずれとも反応しなかった。これらの結果は、これらのＭＡｂが立体配座的に制限されたエピトープに対して向けられていることを示唆する。これらのエピトープは、ＰｏｒＡ［Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｄｏｌ．，２７，ｐ．２２７（２０００）；Ｐｅｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，１７，ｐ．２７０２（１９９９）：Ｎｉｅｂｌａ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，１９，ｐ．３５６８（２００１）］およびＯｐｃ蛋白質［Ｃａｒｍｉｎａｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３４，ｐ．６３，（２００１）］で観察された髄膜炎菌外膜蛋白質の生産、精製および処方の間に容易に修飾され、または喪失できた。これらの誤って折り畳まれた蛋白質に対して惹起した抗体は制限された用途のものである。というのは、それらは、しばしば、生物学的に活性が低いからである。これらの立体配座エピトープを位置決定するために、表目−露出のループの異なる組合せが欠失または突然変異した一連の修飾されたＮｓｐＡ蛋白質を構築した（実施例４）。これらの修飾されたＮｓｐＡ蛋白質の立体配座を維持するために、それらをＥ．ｃｏｌｉ膜中で生産した。これらの修飾されたＮｓｐＡ蛋白質と選択されたＭＡｂとの反応性をサイトフルオロメトリーアッセイによって評価した。細胞に対するＭＡｂの付着は、細胞をＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂで標識した後に得られたメジアン蛍光値を対照ＭＡｂについて得られた蛍光値で割って計算された結合指標として表７に示す。１の蛍光値は、無傷細胞の表面に抗体の結合がなかったことを示した。組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞の外膜中でのこれらの修飾されたＮｓｐＡ蛋白質の存在は、ＭＡｂ Ｍｅ−１６を用いるイムノブロットによって確認した。前記したようにＭＡｂ Ｍｅ−１６は、立体配座変化に対して感受性でない直線状エピトープを認識した。このエピトープは表面露出ループ上ではなく、蛋白質の膜貫通部分に位置決定される。イムノブロットは、ＭＡｂ Ｍｅ−１６が全ての修飾されたＮｓｐＡ蛋白質と反応することを明らかとし、組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞がそれらの外膜においてこれらの蛋白質を生産していたことが確認された。
【０１４９】
群ＩＩに分類されるＭＡｂは、４つの表面−露出ループに対する欠失または突然変異いずれかによって誘導された立体配座変化に対して高度に感受性であったＮｓｐＡ蛋白質上のエピトープを認識した。それらの膜において修飾されたＮｓｐＡを生産する組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞へのＭＡｂ Ｍｅ−１０の結合は、４つの表面−露出ループのいずれかにおけるいずれかの修飾に対して高度に感受性であった。この結果は、このＭＡｂによって認識されるエピトープが表面−露出された立体配座であり、このＭＡｂの結合はＮｓｐＡ蛋白質に対する些細な構造的修飾によって妨げることができることを示唆する。ＭＡｂ Ｍｅ−１０について観察される結合特性とは対照的に、ループ４（Ｎｍ１８）の欠失は、組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞へのＭＡｂ Ｍｅ−１２およびＭｅ−１４の結合を妨げなかった。
【０１５０】
ＭＡｂ Ｍｅ−７を例外として、群Ｉに分類されたＭＡｂは、細胞表面に正しく提示されるのにループ２および３双方を必要とした立体配座エピトープに対して向けられる。（Ｎｍ３）に対する突然変異、またはこれらの２つのループのうちの１つの欠失（Ｎｍ１４、Ｎｍ１７）は有意に低下し、あるいは組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞へのＭＡｂ Ｍｅ−１１、Ｍｅ−１７およびＭｅ−１９の結合を完全に妨げた。対照的に、ループ１（Ｎｍ１６）、ループ４（Ｎｍ１８）およびループ１および４（Ｎｍ１９）の欠失は、組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞へのこれらのＭＡｂの結合を有意に低下させなかった。これらの結果は、これらのＭＡｂによって認識されるエピトープは、無傷細胞の表面で正しく提示されるのにループ２および３の双方を必要とすることを示唆する。
【０１５１】
これらの修飾されたＮｓｐＡ蛋白質とＭＡｂ Ｍｅ−７との反応性は、その対応するエピトープがループ３のみに位置することを明瞭に示した。事実、突然変異したＮｓｐＡ蛋白質（Ｎｍ３）、または欠失されたループ３（Ｎｍ１７）が無い蛋白質いずれかを生産する組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞へのＭＡｂ Ｍｅ−７の結合は妨げられなかった。Ｎｍ３ ＮｓｐＡ蛋白質では、１１５および１１８の位置におけるグリシン（Ｇ）およびアスパラギン酸（Ｄ）は、各々、アラニン（Ａ）およびアスパラギン（Ｎ）によって置き換えられた。Ｎｍ３を生産した組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞とＭＡｂ Ｍｅ−７との反応性の欠如は、特異的エピトープがループ３の先端に位置することを示した。
【０１５２】
本実施例で示された結果は少なくともループ２、３および４が細菌の表面に露出していることを示し、かくして、実施例１で示された３−Ｄ ＮｓｐＡモデルは適切であることが確認される。ループ１の表面−露出は確認されなかった。というのは、蛋白質のその部分に対して特異的であるＭＡｂが利用できなかったからである。より重要なことにはこれらのデータは、ほとんどの殺菌性ＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂがループ２および／またはループ３に位置する立体配座エピトープに対して向けられていることを明瞭に示す。誤って折り畳まれたＮｓｐＡ蛋白質でのワクチン接種は、これらの立体配座エピトープに対して向けられた抗体の誘導を妨げ、かくして、この蛋白質の保護能力を低下させ得ると推定することができる。
【０１５３】
表７ それらの外膜において異なる修飾されたＮｓｐＡ蛋白質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞へのＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂの結合の評価
【０１５４】
【表７】
１結合指標は、ＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂで細胞を標識した後に得られたメジアン蛍光値を対照ＭＡｂについて得られた蛍光値で割ったものとして計算した。１の蛍光値は、無傷細胞の表面において抗体の結合がなかったことを示した。低い指標を持つボックスは陰影を付けた。
２それらの外膜において野生型ＮｓｐＡ蛋白質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞
３修飾されたＮｓｐＡ蛋白質（欠失）の免疫
４ＤＭ；ループ３での二重突然変異
＊ｎｄ：測定せず。
【０１５５】
実施例６
本実施例は、細菌細胞から脂質を抽出するのに用いた方法を説明する。
【０１５６】
複合脂質混合物をＥ．ｃｏｌｉ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、およびＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａから抽出して、細菌起源からのリポソーム処方を作製した。
【０１５７】
以下の方法を用いて、実施例７に示したリポソーム処方を作製するのに用いた複合脂質混合物を作製した。
【０１５８】
８％ＣＯ２の存在下で、細菌を３７℃のＢＨＩブロス中で一晩増殖させた（１７５ｒｐｍ）。細胞を遠心によって収集し、ペレットを細胞１グラム当たり６．７ｍｌのメタノールに懸濁させた（湿潤重量）。この細菌懸濁液を、８に調整されたマイクロチッププローブを備えたＳｏｎｉｃ ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ ５００（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて氷浴中で２回音波処理した。次いで、この懸濁液を６５℃にて３０分間加熱した。このインキュベーション時間の後、２容量のクロロホルムを懸濁液に加え、室温にて１時間攪拌した。懸濁液をＷｈａｔｍａｎ Ｎｏ．４フィルターを通して濾過した。濾液をテフロン（登録商標）チューブに移し、０．２容量の生理食塩水（ＮａＣｌ ０．６％（Ｗ／Ｖ））を次いで加えた。遠心の後、上相および界面の沈殿を捨てた。下相下を１容量のクロロホルム：メタノール：生理食塩水（３：４８：４７）で少なくとも４回、あるいは界面にもはや沈殿がなくなるまで抽出した。最終抽出の後、有機下相下のロータリーエバポレーター（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ，Ｂｕｃｈｉ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で乾燥した。乾燥したリン脂質を−８０℃で貯蔵するか、あるいはクロロホルム：メタノール（２：１）の溶液に再懸濁させた。
【０１５９】
実施例７
本実施例は、組換えＮｓｐＡの異なるリポソーム処方への取り込みを説明する。
【０１６０】
リポソームは透析方法を用いて調製した。リポソームは、異なる比率で合わせた、コレステロールを含むまたは含まない、異なる合成（本実施例におけるリスト１参照）または細菌リン脂質で調製した。また、いくつかのリポソーム処方は、６００μｇ／ｍｌのアジュバントモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ，Ａｖａｎｔｉ極性脂質，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）で調製した。ＮｓｐＡ蛋白質をまず９９％エタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）中で沈殿させ、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含有する１ｍｌのＰＢＳ緩衝液中で変性し、１００℃にて１０分間加熱した。溶液を、１５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＮ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧ，Ｓｉｇｍａ）を含有する１ｍｌのＰＢＳ緩衝液で希釈し、室温にて３時間インキュベートした。脂質を丸底ガラスフラスコ中のクロロホルム：メタノール溶液（２：１）に溶解させ、ロータリーエバポレーター（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ，Ｂｕｃｈｉ，Ｓｗｉｚｅｒｌａｎｄ）を用いて乾燥して、容器上の均一なフィルムを達成した。次いで、前記蛋白質−洗剤溶液を脂質フィルムに加え、フィルムが溶解するまで温和に混合した。溶液は、混合後に、外観が僅かに不透明とであった。次いで、溶液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して徹底的に透析して、洗剤を除去し、リポソーム形成を誘導した。透析の後、ステンレス鋼押出しデバイス（Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用い、得られたミルク状溶液を１０００、４００、２００、および１００ｎｍポリカルボネートフィルターを通して順次押し出した。リポソームに取り込まれなかった組換えＮｓｐＡは、４５℃における１５分間の２００００ｇでの遠心によって除去した。リポソーム溶液を４℃にて１時間２５００００ｇで遠心し、ペレット、０．３Ｍスクロースを含有するＰＢＳで懸濁させた。小胞サイズおよび均一性は、サブミクロン粒子アナライザー（モデルＮ４ Ｐｌｕｓ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）での準弾性光散乱によって評価した。この装置を用い、異なる調製物におけるリポソームのサイズはほぼ１００ｎｍであると見積もられた。リポソーム調製物を０．２２μｍ膜を通す濾過によって滅菌し、用いるまで−８０℃で貯蔵した。リポソームに取り込まれた組換え蛋白質の量は、Ｗｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｆｌｕｇｇｅ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８４，１３８：１４１−１４３）によって記載されているように、クロロホルム：メタノール溶液（２：１）でのＮｓｐＡ−リポソーム調製物の蛋白質抽出後にＭｉｃｒｏＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）によって見積もった。
【０１６１】
ゲル濾過および迅速な希釈を、ＮｓｐＡリポソームの形成を誘導するための代替法として用いた。ゲル濾過方法では、ＮｓｐＡ−ＯＧ−ＳＤＳ−脂質溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（カラムサイズ：２×２０ｃｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の頂部に直接的に、またはＰ−６（カラムサイズ；２×２０ｃｍ，Ｂｉｏ Ｒａｄ）サイズ排除クロマトグラフィー／脱塩カラムに適用し、２．５ｍｌ／分の流速にてＰＢＳ緩衝液にて溶出させた。蛋白質および脂質双方を含有する画分をプールし、押出し、遠心し、小胞のサイズを前記したように見積もった。全ての調製物を０．２２μｍ膜を通して滅菌し、用いるまで−８０℃で貯蔵した。
【０１６２】
迅速希釈方法では、脂質フィルムを前記したように丸底ガラスフラスコ中で調製した。この脂質フィルムを、１％トリトンＸ−１００および７５０μｇ／ｍｌのＮｓｐＡ蛋白質を含有するリン酸緩衝化溶液（１０ｍＭ，７０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で溶解させた。次いで、脂質−洗剤−蛋白質溶液を、１１容量のリン酸緩衝液の添加によって、一定攪拌しつつ、滴下（１滴／秒）希釈した。希釈の後、攪拌しつつ、溶液を室温にて３０分間維持した。リポソームに取り込まれなかった組換えＮｓｐＡは遠心によって除去し、リポソーム溶液を前記したように超遠心した。最後に、リポソームペレットを、０．３Ｍスクロースを含有するＰＢＳ緩衝液で懸濁させた。小胞サイズおよび均一性は前記したように見積もった。全ての調製物を０．２２μｍ膜を通して滅菌し、用いるまで−８０℃で貯蔵した。
【０１６３】
リスト１ ＮｓｐＡ−リポソーム調製物を調製するのに用いた合成脂質の部分的リスト
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＬＰＡ）、ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＭＰＡ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＰＰＡ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＳＰＡ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＯＰＡ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＰＯＰＡ）、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジトリデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジペンタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジミリストレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１−ミリストイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−パルミトイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＬＰＧ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＭＰＧ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＰＰＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＳＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＯＰＧ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＰＯＰＧ）、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＬＰＳ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＭＰＳ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＰＰＳ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＳＰＳ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＰＯＰＳ）。
【０１６４】
実施例８
本実施例は、マウスおよびウサギのＮｓｐＡ−リポソーム処方での免疫化を説明する。
【０１６５】
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）の群を、異なるリポソーム調製物に取り込まれた２０μｇの組換えＮｓｐＡまたは、対照としての、蛋白質−フリーリポソーム調製物と共に、１０％水酸化アルミニウムアジュバント（ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌＴＭ ２％：Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に吸着された２０μｇの組換えＮｓｐＡ蛋白質で２週間間隔で３ないし４回筋肉内（ＩＭ）免疫化した。各免疫化に先立って、および最後の注射から２週間後に血液試料を眼窩洞から収集した。血清試料を−２０℃で貯蔵した。
【０１６６】
Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ雌ウサギ（２．５Ｋｇ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、異なるリポソーム処方に取り込まれた１００μｇの組換えＮｓｐＡ蛋白質または、対照としての、蛋白質−フリーリポソーム処方と共に、１０％水酸化アルミニウムアジュバント（ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌＴＭ ２％：Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に吸着された１００μｇの組換えＮｓｐＡ蛋白質で数個の部位にて３週間間隔で３ないし４回ＩＭ免疫化した。血清試料を各免疫化の前および最後の注射から３週間後に収集した。血清試料を−２０℃で貯蔵した。
【０１６７】
実施例９
本実施例は、マウスおよびウサギ血清のＥＬＩＳＡによる分析を説明する。
【０１６８】
免疫化動物の抗体応答を酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。マイクロタイタープレートを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ４．３）中の０．５μｇ／ｍｌの濃度の精製された組換えＮｓｐＡ、または炭酸緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３；３５ｍＭ ＮａＨＣＯ３，ｐＨ９．６）中のｍｌ中のｍｌ当たり０．２５μｇの蛋白質の濃度の髄膜炎菌株６０８Ｂから抽出されたＯＭ調製物いずれかの０．１ｍｌ／ウエルで室温にて一晩コートした。プレートを、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸−緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３７℃にて１時間ブロックし、次いで、ウサギおよびマウス血清の系列希釈と共に１時間インキュベートした。インキュベーション時間後に、プレートを洗浄緩衝液（０．０２％ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。アルカリ性ホスファターゼ−コンジュゲーテッドＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗−マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）または抗−ウサギＩｇＧを３％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に希釈し、この溶液の０．１ｍｌを各ウエルに加えた。３７℃での６０分間のさらなるインキュベーションの後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。１０％ジエタノールアミン（ｐＨ９．６）中のｐ−ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム溶液の１００μｌを各ウエルに加えた。室温での１時間のインキュベーションに続き、ＯＤ４０５ｎｍをＳｐｅｃｔｒａ Ｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読んだ。０．１の読み（λ＝４１０／６３０ｎｍ）がバックグラウンドを差し引いた後に記録された血清希釈は、この血清の力価であると考えられる。組換えＮｓｐＡ蛋白質を含有する処方での免疫化によって惹起された抗血清の全ては、組換えＮｓｐＡに対して強く反応した。加えて、表８に示されるように、全ての免疫化後血清は株６０８Ｂから抽出された髄膜炎菌ＯＭＰに対して反応した。これらの結果は、免疫化によって誘導された抗体の有意な割合が、髄膜炎菌膜に挿入された場合に、天然ＮｓｐＡ蛋白質と反応することを示唆する。２００未満の力価を、蛋白質−フリーリポソーム調製物で免疫化したマウスおよびウサギから収集された血清から記録した（データは示さず）。
【０１６９】
表８ 異なるＮｓｐＡ−リポソーム処方での免疫化後に収集したマウスおよびウサギ抗血清の分析
【０１７０】
【表８】
１マウスおよびウサギを、組換えＮｓｐＡ蛋白質、あるいは実施例８に記載したように、異なるリポソーム処方に取り込んだ組換えＮｓｐＡ蛋白質で免疫化した。
２血清は組換えＮｓｐＡに対し、およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株６０８ＢからのＯＭＰに対して、ＥＬＩＳＡによってテストした。プレ免疫血清は、ＥＬＩＳＡにおいて、組換えＮｓｐＡに対して、およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株６０８ＢからのＯＭＰに対して反応性を示さなかった。ｎｄ、測定せず。
３括弧の間の数字はウサギ識別番号を示す。
４１０％水酸化アルミニウムアジュバントに吸着された組換えＮｓｐＡ蛋白質。
【０１７１】
実施例１０
本実施例は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株の表面のＮｓｐＡ−リポソーム調製物に対して惹起された抗体の接近性を説明する。
【０１７２】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株を、８％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて、０．２５％デキストロースを含有するミューラー−ヒントン（ＭＨ）ブロス中で増殖させて、０．５００（〜１０８ＣＦＵ／ｍｌ）のＯＤ４９０ｎｍを得た。次いで、抗−ＮｓｐＡまたは対照血清の希釈を調整された細菌培養に加え、攪拌しつつ、４℃にて２時間インキュベートした。試料をブロッキング緩衝液［２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸−緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）］中で２回洗浄し、次いで、ブロッキング緩衝液中に希釈された１ｍｌのヤギフルオレセイン（ＦＩＴＣ）−コンジュゲーテッド抗−マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）特異的または抗−ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を加えた。攪拌しつつの室温での６０分間のさらなるインキュベーション時間の後、試料をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液中の０．３％ホルムアルデヒドで４℃にて１８時間固定した。フローサイトメトリー（Ｅｐｉｃｓ（登録商標）ＸＬ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）によって分析するまで、細胞を４℃にて暗所で維持した。フローサイトメトリー分析は、ＮｓｐＡ−リポソーム処方で免疫化したマウスおよびウサギからのＮｓｐＡ−特異的血清に存在する抗体が、１０％水酸化アルミニウムに吸着された組換えＮｓｐＡ蛋白質で免疫化したウサギからの血清に存在するものよりも効率的に髄膜炎菌株６０８Ｂ上のそれらの対応する表面露出エピトープを認識したことを明らかとした（表９）。事実、２５よりも高い結合指標を、１０％水酸化アルミニウムに吸着された組換えＮｓｐＡで免疫化したウサギで記録された１６の結合指標と比較して組換えＮｓｐＡ−リポソーム処方で免疫化したウサギについて記録した。分析した１０，０００髄膜炎菌細胞の８０％を超えたものが、異なるＮｓｐＡ−リポソーム処方で免疫化したマウスからのＮｓｐＡ−特異的血清に存在する抗体で標識されたと判断された。加えて、分析した髄膜炎菌細胞の９０％を超えるものが、異なるリポソーム処方で免疫化したウサギからのＮｓｐＡ−特異的血清に存在する抗体で標識されたと判断された。図４は、２つの異なるＮｓｐＡ−リポソーム処方（Ｅ．ｃｏｌｉ：Ｃｈｏｌ（７：２）＋ＭＰＬＡ；Ｅ．ｃｏｌｉ １００％）での免疫化後に惹起されたＮｓｐＡ−特異的ウサギ抗体が、異なる血清群Ｂ髄膜炎菌株の表面におけるそれらの特異的エピトープを認識できることを示す。これらの観察は、ＮｓｐＡ−リポソーム処方で免疫化したマウスおよびウサギからの血清に存在するＮｓｐＡ−特異的抗体が、無傷髄膜炎菌細胞の表面における接近可能エピトープを認識することを明らかに示す。蛋白質−フリーリポソーム調製物で免疫化したマウスおよびウサギから収集された血清に存在する抗体は髄膜炎菌細胞に付着しなかった（データは示さず）。
【０１７３】
表９ 無傷Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株６０８Ｂ細胞の表面におけるＮｓｐＡ−特異的抗体の付着の評価
【０１７４】
【表９】
１マウスおよびウサギは実施例８に記載されたように組換えＮｓｐＡ−リポソーム処方で免疫化した。
２プールされた血清を１／２０希釈して、サイトフルオロメトリーアッセイを行った。
３分析した１０，０００細胞のうち標識された細胞の％
４結合指標（ＢＩ）は、免疫血清で細胞を標識した後に得られたメジアン蛍光値を、血清なしの対照で得られた蛍光値で割ったものとして計算した。１の蛍光値は、無傷髄膜炎菌細胞の表面において抗体の結合がなかったことを示した。ｎｄ、測定せず。
５１０％水酸化アルミニウムアジュバントに吸着された組換えＮｓｐ蛋白質。
【０１７５】
実施例１１
本実施例は、マウスおよびウサギ血清に存在する抗−ＮｓｐＡ抗体の殺菌活性を説明する。
【０１７６】
細菌をチョコレート寒天プレート上で平板培養し、８％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて１６時間インキュベートし、あるいは８％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて、０．２５％デキストロースを含有するミューラー−ヒントン（ＭＨ）ブロス中で増殖させて、０．６００のＯＤ６２０ｎｍを得た。インキュベーション時間の後、細菌を溶菌緩衝液［ハンクスの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）および１％加水分解カゼイン、ｐＨ７．３］に０．３００のＯＤ４９０ｎｍまで懸濁させ、８×１０４ＣＦＵ／ｍｌまで希釈した。殺菌アッセイは、２５μｌの細菌懸濁液を５０μｌの希釈した加熱−不活化テスト血清と混合することによって行った。この懸濁液を攪拌しつつ（２２５ｒｐｍ）３７℃、８％ＣＯ２にて１５分間インキュベートした。次いで、補体の源としてのウサギまたはヒト血清を２５％の最終濃度まで加え、混合物を攪拌しつつ（２２５ｒｐｍ）３７℃、８％ＣＯ２にてさらに６０分間インキュベートした。インキュベーション時間の最後に、１０μｌのアッセイ混合物をチョコレート寒天プレート上で平板培養することによって、生きた細菌の数を測定した。プレートを８％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて１８ないし２４時間インキュベートした。対照は、免疫化前のマウスから収集した加熱−不活化血清およびウサギ補体と共にインキュベートした細菌からなるものであった。溶解の％は、以下の数学式を用いて決定した：
【０１７７】
【数３】
殺菌抗体は、リポソームに取り込まれた精製された組換えＮｓｐＡ蛋白質で免疫化されたマウスおよびウサギから収集された血清に存在することが判明した（表１０）。重要なことには、殺菌抗体は、１０％水酸化アルミニウムに吸着された組換えＮｓｐＡ蛋白質で免疫化したウサギから収集された血清には存在しなかった。加えて、２つの異なるリポソーム処方（Ｅ．ｃｏｌｉ：Ｃｈｏｌ（７：２）＋ＭＰＬＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ １００％）で免疫化したウサギから収集した血清もまた、３つの異なる血清群Ｂ株に対して殺菌性であることが判明した（表１１）。後者の結果は、ＮｓｐＡ−リポソーム処方での免疫化が交差−殺菌抗体の生産を誘導できることを示す。これらのデータは、リポソームへの精製された組換えＮｓｐＡ蛋白質の取り込みが、天然蛋白質に対する免疫応答をかなり増強したことを示す。
【０１７８】
表１０ 髄膜炎菌株６０８Ｂに対するＮｓｐＡ−リポソーム処方に対して惹起した抗血清の殺菌活性
【０１７９】
【表１０】
１マウスおよびウサギは実施例８に記載されているように組換えＮｓｐＡ−リポソーム処方で免疫化した。
２組換えＮｓｐＡ調製物に対して惹起した抗血清を、髄膜炎菌株６０８Ｂの補体−媒介殺傷を誘導するそれらの能力につきテストした。血清を１／１０希釈した。ｎｄ、測定せず。
３括弧の間の数字はウサギの数を示す。
５１０％水酸化アルミニウムアジュバントに吸着された組換えＮｓｐＡ蛋白質
表１１ 異なるＮｓｐＡ−リポソーム処方での免疫化の後に収集したウサギ抗血清の殺菌活性
【０１８０】
【表１１】
１組換えＮｓｐＡ調製物に対して惹起させたウサギ血清を、４つの髄膜炎菌株の補体−媒介殺傷を誘導するそれらの能力についてテストした。血清は１／１０希釈した。
【０１８１】
実施例１２
本実施例は、異なるリポソーム処方への組換えＮｓｐＡの取り込みを説明する。
【０１８２】
精製された組換えＮｓｐＡ蛋白質（ｒＮｓｐＡ）を無水エタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の添加によってまず沈殿させた。沈殿したｒＮｓｐＡを、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ；Ｓｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含有する１ｍｌのＰＢＳ緩衝液に可溶化させ、１００℃にて１０分間加熱した。ｒＮｓｐＡ溶液を、１５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧ，Ｓｉｇｍａ）を含有する１ｍｌのＰＢＳ緩衝液で希釈し、室温にて３時間インキュベートした。
【０１８３】
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ；Ａｖａｎｔｉ極性脂質，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）、１，２−ジミリストリル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＭＰＳ，Ａｖａｎｔｉ）、およびコレステロール（Ｃｈｏｌ；Ａｖａｎｔｉ）から形成されたリポソーム、およびＤＭＰＣ、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＭＴＡＰ，Ａｖａｎｔｉ）、およびコレステロールから作成されたリポソームは、透析方法（Ｍｕｔｔｉｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｍｉｃｒｏｂ Ｐａｔｈｏｇ．，１８：４２３−３６）を用いて調製した。簡単に述べれば、脂質を丸底ガラスフラスコ中のクロロホルム：メタノール溶液（２：１）に溶解させ、ロータリーエバポレーター（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ，Ｂｕｃｈｉ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて乾燥して、容器上の均一なフィルムを達成した。ｒＮｓｐＡ蛋白質−洗剤溶液を脂質フィルムに加え、フィルムが懸濁するまで軽く混合した。混合物は外観がわずかに不透明になった。次いで、混合物をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して徹底的に透析して、洗剤を除去し、リポソーム形成を誘導した。透析の後、ステンレス鋼押出しデバイス（Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、得られたミルク状懸濁液を１０００、４００、２００および１００ｎｍポリカルボネートフィルターを通して順次押出した。リポソームに取り込まれなかったｒＮｓｐＡは４℃にて２００００×ｇにおける１５分間の遠心によって除去した。リポソーム溶液を４℃にて２５００００×ｇにおいて１時間遠心し、ペレットを０．３Ｍのスクロースを含有するＰＢＳ緩衝液に懸濁させた。小胞サイズおよび均一性は、サブミクロン粒子アナライザー（モデルＮ４ Ｐｌｕｓ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）での準弾性光散乱によって評価した。この装置を用い、異なる調製物におけるリポソームサイズはほぼ１５０ｎｍであると見積もられた。全てのリポソーム調製物は０．２２μｍ膜を通す濾過によって滅菌し、用いるまで＋４℃または−８０℃で貯蔵した。リポソームに取り込まれた組換え蛋白質の量は、Ｗｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｆｌｕｇｇｅ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８４，１３８：１４１−１４３）によって記載されているように、クロロホルム：メタノール溶液（２：１）でのｒＮｓｐＡ−リポソーム調製物の蛋白質抽出後にＭｉｃｒｏＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉ１１．）によって見積もった。
【０１８４】
透析濾過に基づく方法は、ｒＮｓｐＡ−リポソーム処方を作成するための代替方法として用いた。この方法では、脂質を５０℃にて８％ＯＧに懸濁させた。前記したように調製した１容量のｒＮｓｐＡ蛋白質を異なる容量の脂質懸濁液と合わせ、３７℃にて１５分間インキュベートした。脂質／蛋白質混合物をＨＥＰＥＳ緩衝液セーライン（ＨＢＳ）に希釈して、リポソーム小胞の形成を誘導した。ステンレス鋼押出しデバイス（Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用い、得られた懸濁液を２つの重ねた１００ｎｍポリカルボネートフィルターを通した。リポソーム処方は所望の最終容量まで超濾過し、次いで、１０容量のＨＢＳに対して透析濾過して、Ａ／Ｇ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．からの５００，０００公証分子量カットオフカートリッジを用い、遊離蛋白質および洗剤を除去した。最後に、調製物を０．２２μｍ膜を通して滅菌し、小胞サイズおよび均一性は前記したように評価した。全ての調製物は用いるまで＋４℃で貯蔵した。
【０１８５】
実施例１３
本実施例は、ｒＮｓｐＡ−リポソーム処方でのマウスの免疫化を説明する。
【０１８６】
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（４ないし６週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）の群を、１０％水酸化アルミニウムアジュバント（ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌＴＭ ２％：Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に吸着された２０μｇのｒＮｓｐＡ蛋白質で、あるいは異なるリポソーム調製物に取り込まれた２０μｇのｒＮｓｐＡで、３週間間隔で４回筋肉内（ＩＭ）免疫化した。血液試料を各免疫化に先立って、および最後の注射から３週間後に、眼窩洞から収集した。血液試料を−２０℃で貯蔵した。
【０１８７】
実施例１４
本実施例は、ウサギのｒＮｓｐＡ−リポソーム処方での免疫化を説明する。
【０１８８】
Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ雌ウサギ（２．５Ｋｇ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、１０％水酸化アルミニウムアジュバント（ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌＴＭ ２％：Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に吸着させた１００μｇのｒＮｓｐＡ蛋白質で、または異なるリポソーム処方に取り込ませた１００μｇのｒＮｓｐＡ蛋白質で数箇所の部位にて３週間間隔で４回ＩＭ免疫化した。血清試料は、各免疫化の前に、および最後の注射から３週間後に収集した。血清試料は−２０℃で貯蔵した。
【０１８９】
実施例１５
本実施例は、ｒＮｓｐＡ−リポソーム処方で免疫化したウサギからの血清のＥＬＩＳＡによる分析を説明する。
【０１９０】
免疫化した動物の抗体応答を酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。マイクロタイタープレートを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ４．２）中の０．５μｇ／ｍｌの濃度のｒＮｓｐＡ、あるいは炭酸緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３；３５ｍＭ ＮａＨＣＯ３，ｐＨ９．６）中のｍｌ当たり２．５μｇの蛋白質の濃度の髄膜炎菌株６０８Ｂから抽出したＯＭ調製物いずれかの０．１ｍｌ／ウエルで室温にて一晩コートした。プレートを、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸−緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液で３７℃にて３０分間ブロックし、次いで、ウサギ血清の系列希釈と共に１時間インキュベートした。インキュベーション時間の後に、プレートを洗浄緩衝液（０．０２％ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。アルカリ性ホスファターゼ−コンジュゲーテッドＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗−ウサギＩｇＧを、３％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で希釈し、０．１ｍｌのこの溶液を各ウエルに加えた。３７℃における６０分間のさらなるインキュベーションの後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。１０％ジエタノールアミン（ｐＨ９．６）中の１００μｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム溶液を各ウエルに加えた。室温での１時間のインキュベーションに続き、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてＯＤ４０５ｎｍを評価した。ＯＤ値の２倍に対応する吸光度読みがプレ免疫血清につき得られた（λ＝４０５／６３０ｎｍ）血清希釈は、この血清の力価であると考えた。ｒＮｓｐＡ蛋白質を含有する処方で免疫化したウサギから収集した全ての血清は、ＥＬＩＳＡによって評価して、ｒＮｓｐＡと強く反応した（データは示さず）。表１に示すように、髄膜炎菌ＯＭＰに対するより強い力価が、ミョウバンアジュバントに吸着されたｒＮｓｐＡで免疫化したウサギで得られた力価（２１３３３±７３９０）と比較してｒＮｓｐＡ−リポソームで免疫化したウサギから収集した血清で測定された（３１７９７９±１３３７０３；平均±標準偏差）。これらの結果は、免疫化によって誘導された抗体の有意な割合が、髄膜炎菌膜に挿入された場合に、天然ＮｓｐＡ蛋白質と反応することを示唆する。
【０１９１】
表１２ ＥＬＩＳＡ、サイトフルオロメトリーおよび殺菌アッセイ（ＳＢＡ）による異なるｒＮｓｐＡ−リポソーム処方で免疫化したウサギからの血清の分析
【０１９２】
【表１２−１】
【０１９３】
【表１２−２】
１ウサギを、１０％水酸化アルミニウムアジュバントに吸着された１００μｇのｒＮｓｐＡ蛋白質で、あるいは実施例１２に記載したように異なるリポソーム調製物に取り込まれた１００μｇのｒＮｓｐＡで４回筋肉内免疫化した。
２血清は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株６０８Ｂから抽出されたＯＭＰに対してＥＬＩＳＡによってテストした。プレ免疫血清は、ＥＬＩＳＡによって評価して、髄膜炎菌ＯＭＰ調製物に対して反応性を示さなかった。
３血清を１／２０希釈して、実施例１６によって記載したようにサイトフルオロメトリーアッセイを行った。
４結合指標（ＢＩ）は、免疫血清で細胞を標識した後に得られたメジアン蛍光値を、血清無しの対照で得られた蛍光値で割ったものとして計算した。１の蛍光値は、無傷髄膜炎菌細胞の表面で抗体の結合はなかったことを示した。
５分析した１０，０００細胞のうちの標識された細胞の％
６ｒＮｓｐＡ調製物に対して惹起された抗血清を、実施例１７に記載したように、髄膜炎菌株６０８ｂの補体−媒介殺傷を誘導するそれらの能力についてテストした。血清は１／４０希釈した。
７ｒＮｓｐＡ蛋白質を１０％水酸化アルミニウムアジュバントに吸着させた。
【０１９４】
実施例１６
本実施例は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ細胞の表面のＮｓｐＡ−リポソーム処方に対して惹起された抗体の接近性を説明する。
【０１９５】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株は、８％ＣＯ２雰囲気中、攪拌しつつ（２２５ｒｐｍ）にて、０．２５％デキストロースを含有するミューラー−ヒントン（ＭＨ）ブロス中で増殖させて、０．５００（〜１０８ＣＦＵ／ｍｌ）のＣＤ４９０ｎｍを得た。次いで、抗−ＮｓｐＡまたは対照血清の希釈物を調整された細菌培養に加え、攪拌しつつ４℃にて２時間インキュベートした。試料をブロッキング緩衝液［２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸−緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）］で２回洗浄し、次いで、ブロッキング緩衝液中に希釈した１ｍｌのヤギフルオレセイン（ＦＩＴＣ）−コンジュゲーテッド抗−ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を加えた。攪拌しつつの室温での６０分間のさらなるインキュベーション期間の後、試料をＰＢＳ緩衝液中で２回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液中の０．３％ホルムアルデヒドで４℃にて１８時間固定した。フローサイトメトリー（Ｅｐｉｃｓ（登録商標）ＸＬ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）によるそれらの分析まで、細胞を４℃にて暗所に保持した。結合指標（ＢＩ）は、免疫血清で細胞を標識した後に得られたメジアン蛍光値を、血清無しの対照で得られた蛍光値で割ったものとして計算した。１の蛍光値は、無傷髄膜炎菌細胞の表面に抗体の結合がなかったのを示した。フローサイトメトリー分析は、ｒＮｓｐＡ−リポソーム処方で免疫化されたウサギからの血清に存在する抗体は、１０％水酸化アルミニウムに吸着されたｒＮｓｐＡ蛋白質で免疫化されたウサギからの血清に存在するものよりも効果的に髄膜炎菌細胞上のそれらの対応する表面露出エピトープを認識したことを明らかにした（表１２）。事実、ｒＮｓｐＡ−リポソーム処方で免疫化したウサギについて記録された結合指標は、１０％水酸化アルミニウムに吸着されたｒＮｓｐＡで免疫化したウサギについて記録された結合指標（ＢＩ≦２９）よりも一般的に高かった（１１≦ＢＩ≦２６９）。これらの観察は、ｒＮｓｐＡ−リポソーム処方で免疫化されたウサギからの血清に存在するＮｓｐＡ−特異的抗体が、無傷髄膜炎菌細胞の表面の接近可能のエピトープを認識することを明瞭に示す。
【０１９６】
実施例１７
本実施例は、ウサギ血清に存在する抗−ＮｓｐＡ抗体の殺菌活性を説明する。
【０１９７】
細菌を、１％ウマ血清（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含有するＢＨＩ寒天プレート上で平板培養し、８％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて１６時間インキュベートした。０．２５％デキストロースを含有するミューラー−ヒントン（ＭＨ）ブロスを、ＢＨＩ寒天プレートからの細菌で接種し、０．６００のＯＤ６２０ｎｍが得られるまで、８％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて攪拌しつつ（２２５ｒｐｍ）インキュベートした。インキュベーション期間の後、細菌を溶菌緩衝液［ハンクスの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）および０．１％ゼラチン、ｐＨ７．２］に０．３００のＯＤ４９０ｎｍまで懸濁させ、８×１０４ＣＦＵ／ｍｌまで希釈した。殺菌アッセイは、２５μｌの調整された細菌懸濁液を５０μｌの希釈された加熱−不活化ウサギ血清と混合することによって行った。補体の源として、髄膜炎菌細胞についてのその弱い特異的な殺傷活性につき選択された一定容量の２５μｌ（２５％ｖ／ｖ）の正常なヒト血清を加え、混合物を、３７℃、８％ＣＯ２にて、攪拌しつつ（２２５ｒｐｍ）６０分間インキュベートした。インキュベーション期間の最後に、１０μｌのアッセイ混合物をチョコレート寒天プレート上で平板培養することによって、生きた細菌の数を測定した。プレートを８％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて１８ないし２４時間インキュベートした。対照は、免疫化前にウサギから収集した加熱−不活化血清およびヒト補体と共にインキュベートした細菌からなるものであった。溶解の％は以下の数式を用いて決定した：
【０１９８】
【数４】
殺菌抗体は、リポソームに取り込んだｒＮｓｐＡ蛋白質で免疫化されたウサギから収集されたほとんどの血清に存在することが判明した（表１２）。重要なことには、殺菌抗体は、１０％水酸化アルミニウムに吸着させたｒＮｓｐＡ蛋白質で免疫化したウサギから収集した血清には存在しなかった。加えて、２つの異なるリポソーム処方（ＤＭＰＣ：ＤＭＰＳ：Ｃｈｏｌ，ＤＭＰＣ：ＤＭＴＡＰ：Ｃｈｏｌ；７５ｍＭ）で免疫化したウサギから収集した血清もまた、３つの区別される血清群Ｂ株および１つの血清群Ａ株（Ｚ４０６３）に対して殺菌性であることが判明した（表１３）。この後者の結果は、ｒＮｓｐＡ−リポソーム処方での免疫化が、交差−殺菌性抗体の生産を誘導できることを示す。これらのデータは、ｒＮｓｐＡ蛋白質のリポソームへの取り込みが、天然蛋白質に対する機能的免疫応答をかなり増強したことを示す。
【０１９９】
表１３ 異なるｒＮｓｐＡ−リポソーム処方での免疫化の後に収集されたウサギ抗血清の殺菌性活性
【０２００】
【表１３】
１ｒＮｓｐＡ調製物に対して惹起されたウサギ血清を、４つの髄膜炎菌株の補体−媒介殺傷を誘導するそれらの能力についてテストした。血清を１／２０まで希釈した。
【０２０１】
さらに技巧を凝らすことなく、当業者であれば、これまでの記載を用い、本発明を最高限に利用できると考えられる。以下の好ましい特異的な実施形態は、従って、単に説明するものであり、開示の残りを断じて限定するものではないと解釈されるべきである。
【０２０２】
前記および以下の例において、全ての温度は摂氏度で修正されることなく記載され、全ての部および％は特に断りの無い限り重量によるものである。本明細書中で引用された全ての刊行物、特許および出願の、および２００５年３月７日に出願された対応する米国仮出願第６０／６５８，８１５号の全開示はここに引用して援用する。
【０２０３】
これまでの実施例は、これまでの実施例で用いたものに代えて本発明の一般的にまたは具体的に記載された反応体および／または操作条件を置き換えることによって同様な成功をもって反復することができる。
【０２０４】
これまでの記載から、当業者であれば、本発明の必須の特徴を容易に確認することができ、かつその精神および範囲を逸脱することなく、本発明の種々の変形および修飾をなして、それを種々の用法および条件に適合させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０２０５】
【図１】図１は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株６０８Ｂ ＮｓｐＡ蛋白質をコードする遺伝子のヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）配列を表す。
【図２】図２は、髄膜炎菌ＮｓｐＡ蛋白質の３−Ｄモデルを表す。このモデルは、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｄｂ Ｖｉｅｗｅｒ［Ｇｕｅｘ，Ｎ．ａｎｄ ＭＣ Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１８，ｐ．２７１４（１９９７）］を用い、再度折り畳まれたＥ．ｃｏｌｉ ＯｍｐＡ（ＰＤＢ：１ＱＪＰ）の結晶構造から開発された［Ｐａｕｔｓｃｈ，Ａ．ａｎｄ ＧＥ Ｓｃｈｕｌｚ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８，ｐ．２７３（２０００）］。８つの膜貫通β−ストランドは、ペリプラズム側では３つの密なターン（Ｔ）、および細菌の外側表面では４つの表面−露出ループ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４）に連結されている。膜相間と相互作用するアミノ酸残基はボールおよびスティックとして表される。この図は、ベクターＮＴＩスイート７．０（ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．）からの３Ｄ−Ｍｏｌ Ｖｉｅｗｅｒを用いて作成された。
【図３】図３は、２つの血清群Ｂ髄膜炎菌株６０８Ｂ（Ｂ：２ａ：Ｐ１．２：Ｌ３）、ＣＵ３８５（Ｂ：４：Ｐ１．１５：Ｌ３、７、９）、１つの血清群Ａ株Ｆ８２３８（Ａ：４、２１）および１つの血清群Ｃ株Ｃ１１（ＮＴ：Ｐ１．１：Ｌ３、７、９）の表面におけるＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂの接近性のフローサイトメトリーによる評価を表す。指数関数的に増殖する髄膜炎菌細胞を、順次、ＮｓｐＡ−特異的または対照ＭＡｂ、続いて、ＦＩＴＣ−コンジュゲーテッド抗−マウス免疫グロブリン二次抗体と共にインキュベートした。各ＭＡｂの殺菌活性は、対照ＣＦＵと比較した、６０分のインキュベーションの後にｍＬ当たりＣＦＵの５０％減少をもたらす抗体の濃度として表される：＋＋、０．５ないし４９μｇの間の抗体／ｍＬ；＋、５０ないし９９μｇの間の抗体／ｍＬ；−＞１００μｇの抗体／ｍＬにおいて殺菌活性なし。
【図４】図４は、間接蛍光フローサイトメトリーによって測定した、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株６０８Ｂ（Ｂ：２ａ：Ｐ１．２）、ＢＳ１９８（Ｂ：ＮＴ：Ｐ−）、Ｓ３４４６（Ｂ．１４：Ｐ１．２３、１４）およびＨ３５５（Ｂ：１５：Ｐ１．１５）に対するポリクローナル抗−ＮｓｐＡウサギ抗血清の結合の評価を示す。ウサギを、異なるリポソーム処方に取り込まれた１００μｇのｒＮｓｐＡで免疫化した。指数関数的に増殖する髄膜炎菌細胞を、順次、予め採血したまたは過剰免疫血清、続いて、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−コンジュゲーテッド抗−ウサギ免疫グロブリン二次抗体と共にインキュベートした。全ての血清は１：２０の希釈でテストした。各グラフにおいて、左側ピークは予め採血したウサギ血清の結合を表し、他方、右側ピークは無傷髄膜炎菌細胞に対する対応する過剰免疫血清の結合を表す。
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００５年３月７日に出願された米国仮特許出願第６０／５８，８１５号の出願日の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／５８，８１５号は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ナイセリア感染を予防し、診断し、および／または治療するのに用いることができる、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリペプチドまたは対応するＤＮＡ断片に会合したリポソームを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは世界中で死亡および病的状態の主な原因である。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、風土病および流行病、特に髄膜炎および髄膜炎菌血症双方を引き起こす［Ｔｚｅｎｇ，Ｙ−Ｌ ａｎｄ Ｄ．Ｓ．Ｓｔｉｐｈｅｎｓ，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，２，ｐ．６８７（２０００）；Ｐｏｌｌａｒｄ，Ａ．Ｊ．ａｎｄ Ｃ．Ｆｒａｓｃｈ，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９，ｐ．１３２７（２００１）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｓ．Ｌ，ａｎｄ Ａ．Ｊ．Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０，ｐ．６６６（２００２）］。血清殺菌活性はＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する主な防御メカニズムであり、細菌による侵入に対する保護は抗−髄膜炎菌抗体の血清中での存在に相関することはよく記載されている［Ｇｏｌｄｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２９，ｐ．１３０７（１９６９）；Ｇｏｌｄｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２９，ｐ．１３２７（１９６９）］。
【０００４】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、被膜抗原の存在に従って血清学的群に細分化される。現在、１２の血清群が認められているが、血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、ＹおよびＷ１３５は最も普通に見出される。血清群の中で、異なる血清型、サブタイプおよび免疫型は外膜蛋白質およびリポ多糖に基づいて同定することができる［Ｆｒａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，７，ｐ．５０４（１９８５）］。
【０００５】
現在入手可能な被膜多糖ワクチンは全てのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ単離体に対して効果的ではなく、若い幼児において保護抗体の生産を効果的には誘導しない［Ｔｚｅｎｇ，Ｙ−Ｌ ａｎｄ Ｄ．Ｓ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｍｉｃｒｏｄｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，２，ｐ．６８７（２０００）；Ｐｏｌｌａｒｄ，Ａ．Ｊ． ａｎｄ Ｃ．Ｆｒａｓｃｈ，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９，ｐ．１３２７（２００１）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ Ａ．Ｊ．Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０，ｐ．６６６（２００２）］。血清群Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ１３５の被膜多糖はこの生物に対するワクチンにおいて現在用いられている。これらの多糖ワクチンは短い期間では効果的であるが、ワクチン接種した対象は免疫学的記憶を発生せず、従って、彼らは３年以内に再度ワクチン接種をして、それらのレベルの抵抗性を維持しなければならない。
【０００６】
さらに、これらのワクチンは十分なレベルの殺菌抗体を誘導して、この病気の犠牲となる非常に若い子供において所望の保護を与えない。血清群Ｂ単離体に対する効果的なワクチンは現在入手可能でないが、これらの生物は開発国における髄膜炎菌病の主な原因の１つである。さらに、新生ヒト脳組織の糖蛋白質におけるかなり類似の交差−反応性構造の存在は血清群Ｂ多糖の免疫原性を改良する試みを落胆させるかもしれない［Ｆｉｎｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ，ｐ．３５５（１９８３）］。
【０００７】
より効果的なワクチンを得るためには、リポ多糖、ピリ線毛、蛋白質のような他のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ表面抗原が調査されている。免疫化されたボランティアおよび回復期患者の血清中のある種のこれらの蛋白質性表面抗原に対するヒト免疫応答および細菌抗体の存在が示された［Ｍａｎｄｒｅｌｌ ａｎｄ Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ，５７，ｐ．１５９０（１９８９）；Ｐｏｏｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，４０，ｐ．３９８（１９８３）；Ｒｏｓｅｎｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２６，ｐ．１５４３（１９８８）；Ｗｅｄｅｇｅ ａｎｄ Ｆｒｏｈｏｌｍ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５１，ｐ．５７１（１９８６）；Ｗｅｄｅｇｅ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌｓｅｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２５，ｐ．１３４９（１９８７）］。
【０００８】
既に記載された髄膜炎菌表面蛋白質のほとんどに伴う主な問題の１つはそれらの抗原性の不均一性である。事実、主な外膜蛋白質の株間変動は、それらの保護的有効性を抗原的に関連する髄膜炎菌株の限定された数に制限する。主な表面蛋白質のほとんど、あるいは精製された外膜蛋白質を含有するいずれかの外膜小胞に基づくいくつかの戦略は、蛋白質−ベースの髄膜炎菌ワクチンの保護能力を拡大するために現在開発されつつある［Ｔｚｅｎｇ，Ｙ−Ｌ ａｎｄ Ｄ．Ｓ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｍｉｃｒｏｄｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，２，ｐ．６８７（２０００）；Ｐｏｌｌａｒｄ，Ａ．Ｊ．ａｎｃ Ｃ．Ｆｒａｓｃｈ，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９，ｐ．１３２７（２００１）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｓ．Ｌ．，ａｎｄ Ａ．Ｊ．Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０，ｐ．６６６（２００２）］。抗原的に保存された表面−露出領域を持つ普遍的なあるいは少なくとも広く分布した蛋白質の同定は、主な髄膜炎菌外膜蛋白質の大きな負均一性に対して解決を与えるであろう。ナイセリア属表面蛋白質ＡについてのＮｓｐＡと命名された１つのそのような抗原はＰＣＴ／ＷＯ／９６／２９４１２に開示されており、ここに引用して援用する。
【０００９】
ＮｓｐＡ蛋白質に対して向けられたモノクローナル抗体（Ｍａｂ）はテストした髄膜炎菌株の９９％を超えて反応し、これは、高度に保存された抗原性領域がこの蛋白質に存在することを明瞭に示す［Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５，ｐ．１１７３（１９９７）；Ｃａｄｉｅｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６７，ｐ．４９５５，（１９９９）］。免疫電子顕微鏡観察およびフローサイトフルオロメトリーデータは、ＮｓｐＡ蛋白質が無傷髄膜炎菌細胞の表面に存在し、この蛋白質は細胞表面に均一に分布することを明瞭に示した［Ｃａｄｉｅｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６７，ｐ．４９５５，（１９９９）］。この蛋白質をコードする遺伝子はクローン化され、配列決定された［Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５，ｐ．１１７３（１９９７）］。この配列と入試可能なデータベースにコンパイルされた配列との比較は、ｎｓｐＡ遺伝子が、やはり髄膜炎菌外膜に見出されるナイセリア属不透明性蛋白質ファミリー（Ｏｐａ）のメンバーと相同性を共有することを示した。ＤＮＡハイブリダイゼーションは、ｎｓｐＡ遺伝子がテストした全ての髄膜炎菌株のゲノムに存在することを明瞭に確立したが、それは、高度に保存されたホモログが密接に関連する種Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａおよびＮ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａにやはり存在したことも示した。淋菌ＮｓｐＡ蛋白質の特徴付けは従前に示されている［Ｐｌａｎｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ，Ｉｍｍｕｎ．，６７，ｐ．２８５５（１９９９）］。この蛋白質の高レベルの分子保存（＞９６％同一性）についての決定的な証拠は、発散した血清群Ａ、ＢおよびＣ髄膜炎菌株からのさらなるｎｓｐＡ遺伝子のクローニングおよび配列決定に従って得られた［Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５，ｐ．１１７３（１９９７）；Ｃａｄｉｅｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７，ｐ．４９５５，（１９９９）；Ｍｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ，６７，ｐ．２８５５（１９９９）］。十分な量の精製された蛋白質を得て、感染のマウスモデルにおいてその保護能力を評価するために、ｎｓｐＡ遺伝子は発現ベクターｐＷＫＳ３０にクローン化された［Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５，ｐ．１１７３（１９９７）］。ＢＡＬＢ／ｃマウスを２０μｇの免疫アフィニティ−精製組換えＮｓｐＡ蛋白質で３回免疫化し、次いで、致死用量の血清群Ｂ株で攻撃した。ＮｓｐＡ−免疫化マウスの８０％は、対照群における２０％未満と比較して細菌攻撃で生き残った。致死髄膜炎菌攻撃で生き残ったマウスから収集した血清の分析により、テストした４つの血清群Ｂ株に付着され、該株を殺した交差−反応性抗体の存在が明らかとされた。加えて、ＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂでのマウスの受動免疫化により、蛋白質の保護能力が確認された。事実、攻撃１８時間前のＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂ１８の投与は、テストした１１の髄膜炎菌株のうち１０で攻撃したマウスについて記録された細菌血症のレベルを７５％を超えて低下させた［非特許文献１］。これらの結果は、この高度に保存された蛋白質が髄膜炎菌感染に対して保護免疫を誘導できることを示した。
【００１０】
組換え髄膜炎菌表面−露出ＰｏｒＡ、ＰｏｒＢおよびＯｐｃ蛋白質での実験は、殺菌抗体の効果的な生産は、しばしば、天然立体配座を生じさせるための組換え蛋白質の再折り畳みに依存することを示した［非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８］。組換え表面蛋白質の再折り畳みを好都合とするのに用いられる１つの方法は、リポソームへのその取り込みである。
【００１１】
しかしながら、ナイセリア感染の予防、診断および／または治療で用いることができる医薬組成物に対する継続する要求が存在する。
【非特許文献１】Ｃａｄｉｅｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６７，ｐ．４９５５，（１９９９）
【非特許文献２】Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４４，ｐ．３０２７，（１９９８）
【非特許文献３】Ｉｄａｎｐａａｎ−Ｈｅｉｋｋｉｌａ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，１３，ｐ．１５０１（１９９５）
【非特許文献４】Ｍｕｔｔｉｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．，１８，ｐ．３６５（１９９５）
【非特許文献５】Ｍｕｔｔｉｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．，１８，ｐ．４２３（１９９５）
【非特許文献６】Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．，２１，ｐ．４９９，（１９９６）
【非特許文献７】Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，７０，ｐ．４０２８（２００２）
【非特許文献８】Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１５，ｐ．７５１（１９９６）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１つの態様によると、本発明は、配列番号２を含むポリペプチドまたはその断片またはアナログと会合したリポソームを含む医薬組成物に関する。
【００１３】
他の態様において、本発明の医薬組成物の製法、本発明の医薬組成物を宿主に送達する方法、本発明の医薬組成物の使用方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、ナイセリア属感染を予防し、診断し、および／または治療するのに用いることができる、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリペプチドに会合したリポソームを含む医薬組成物を提供する。
【００１５】
１つの態様によると、本発明は、配列番号２またはその断片またはアナログを含むポリペプチドに会合したリポソームを含む医薬組成物に関する。
【００１６】
もう１つの態様によると、本発明は、配列番号２を含むポリペプチドと会合したリポソームを含む医薬組成物に関する。
【００１７】
１つの態様によると、本発明は、配列番号２からなるポリペプチド、またはその断片もしくはアナログと会合したリポソームを含む医薬組成物に関する。
【００１８】
１つの態様によると、本発明は、配列番号２からなるポリペプチドと会合したリポソームを含む医薬組成物に関する。
【００１９】
１つの態様によると、本発明は、配列番号２を含むポリペプチドのエピトープ保持部分、またはその断片もしくはアナログに会合したリポソームを含む医薬組成物に関する。
【００２０】
１つの態様によると、本発明は、配列番号２を含むポリペプチドのエピトープ保持部分に会合したリポソームを含む医薬組成物に関する。
【００２１】
１つの態様によると、本発明は：
（ａ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一性を有するポリペプチドまたはその断片またはアナログ；
（ｂ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも８０％同一性を有するポリペプチドまたはその断片またはアナログ；
（ｃ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも９５％同一性を有するポリペプチドまたはその断片またはアナログ；
（ｄ）配列番号２を含むポリペプチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｅ）配列番号２を含むポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体を惹起させることができるポリペプチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｆ）配列番号２を含むポリペプチドのエピトープ保持部分、またはその断片もしくはアナログ；
（ｇ）Ｎ−末端Ｍｅｔ残基が欠失した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）ポリペプチド；
（ｈ）分泌アミノ酸配列が欠失した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）のポリペプチド；
から選択された単離されたポリペプチドと会合したリポソームを含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
１つの態様によると、本発明は：
（ａ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも８０％同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも９５％同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号２を含むポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体を惹起させることができるポリペプチド；
（ｆ）配列番号２を含むポリペプチドのエピトープ保持部分；
（ｇ）Ｎ−末端Ｍｅｔ残基が欠失した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）ポリペプチド；
（ｈ）分泌アミノ酸配列が欠失した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）のポリペプチド；
から選択された単離されたポリペプチドと会合したリポソームを含む医薬組成物を提供する。
【００２３】
１つの態様によると、本発明は：
（ａ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも７０％相同性を有するポリペプチド、またはその断片もしくはアナログをコードするポリヌクレオチド：
（ｂ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも８０％相同性を有するポリペプチド、またはその断片もしくはアナログをコードするポリヌクレオチド：
（ｃ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも９５％相同性を有するポリペプチド、またはその断片もしくはアナログをコードするポリヌクレオチド：
（ｄ）配列番号２を含むポリペプチド、またはその断片もしくはアナログをコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２を含むポリペプチド、またはその断片もしくはアナログに対して結合特異性を有する抗体を惹起させることができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２を含むポリペプチドのエピトープ保持部分、またはその断片もしくはアナログをコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１を含むポリヌクレオチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）におけるポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチド；
から選択される単離されたポリヌクレオチドと会合したリポソームを含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
１つの態様において、本発明は：
（ａ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも８０％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも９５％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２を含むポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体を惹起させることができるポリペプチドをーコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２を含むポリペプチドのエピトープ保持部分をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）におけるポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチド；
から選択されるポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドと会合したリポソームを含む医薬組成物を提供する。
【００２５】
当業者であれば、本発明は、リポソーム、およびＤＮＡ分子、すなわち、本特許出願においてここに記載した、そのようなポリペプチドの突然変異体、変種、ホモログおよび誘導体のようなアナログをコードするポリヌクレオチドおよびそれらの相補的配列を含む医薬組成物を含むことを認識するであろう。本発明は、本発明のＤＮＡ分子に対応するＲＮＡ分子も含む。ＤＮＡおよびＲＮＡ分子に加えて、本発明は、対応するポリペプチド、およびそのようなポリペプチドに特異的に結合する一特異的抗体を含む。
【００２６】
本明細書中で用いるように、「に会合した」は、本発明のポリペプチドはリポソーム膜に少なくとも部分的に包埋された、好ましくは脂質に非共有結合されたことを意味する。該ポリペプチドは、それ自体が膜に包埋された脂質の脂肪酸「テイル」にも結合することができる。
【００２７】
さらなる実施形態において、本発明によるポリペプチドと会合したリポソームを含む医薬組成物は抗原性である。
【００２８】
さらなる実施形態において、本発明によるポリペプチドと会合したリポソームを含む医薬組成物は免疫原性である。
【００２９】
さらなる実施形態において、本発明によるポリペプチドと会合したリポソームを含む医薬組成物は宿主において免疫応答を誘導することができる。
【００３０】
さらなる実施形態において、本発明は、前記定義の本発明のポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を惹起させることができるポリペプチドと会合したリポソームを含む医薬組成物にも関する。
【００３１】
「結合特異性を有する」抗体は、選択されたポリペプチドを認識し、それに結合するが、試料、例えば、選択されたペプチドを天然では含む生物学的試料中の他の分子を実質的に認識し、それに結合しない抗体である。特異的結合は、選択されたポリペプチドが抗原として用いられるＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定することができる。
【００３２】
本発明によると、生物学的実験における「保護」は、細菌抗体の生産における有意な増加、または殺菌活性の有意な増加によって定義される。
【００３３】
本発明のさらなる態様において、本発明のポリペプチド、またはそのアナログの免疫原性および／または抗原性断片に会合したリポソームを含む医薬組成物が提供される。
【００３４】
本発明の断片は１以上のそのようなエピトープ領域を含むべきであり、あるいはそれらの免疫原性および／または抗原性特性を保有するのに十分にそのような領域に対して同様であるべきである。かくして、本発明による断片では、同一性の程度はおそらくは無関係である。というのは、それらは本明細書中に記載されたポリペプチドまたはそのアナログの特定の部分に１００％同一であり得るからである。本発明は、さらに、本発明のポリペプチドの免疫原性断片を提供し、該断片は本発明のポリペプチドの連続部分である。本発明は、さらに、本発明のポリペプチド配列からの少なくとも１０の連続アミノ酸残基を有する断片を提供する。１つの実施形態において、少なくとも１５連続アミノ酸残基。１つの実施形態において、少なくとも２０連続アミノ酸残基。１つの実施形態において、少なくとも３０連続アミノ酸残基。１つの実施形態において、少なくとも４０連続アミノ酸残基。１つの実施形態において、少なくとも５０連続アミノ酸残基。１つの実施形態において、少なくとも１００連続アミノ酸残基。１つの実施形態において、少なくとも１５０連続アミノ酸残基。
【００３５】
本発明は、さらに、配列番号２を含むポリペプチドと同一または実質的に同一の免疫原性活性を有する断片を提供する。該断片は、（もし必要であれば、担体にカップリングさせた場合）、ＮｓｐＡポリペプチドを認識する免疫応答を惹起させることができる。
【００３６】
そのような免疫原性断片は、例えば、Ｎ−末端リーダーペプチド、および／または膜貫通ドメインおよび／または該部ループおよび／またはターンを欠如するＮｓｐＡポリペプチドを含むことができる。本発明は、さらに、当該配列の全長にわたって、配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一性、好ましくは８０％同一性、より好ましくは９５％同一性を有するポリペプチドの過剰細胞ドメインの実質的に全てを含むＮｓｐＡの断片を提供する。
【００３７】
本発明は、さらに、Ｂ−細胞またはＴ−ヘルパーエピトープを含む断片に会合したリポソームを含む医薬組成物を提供する。
【００３８】
本発明は、さらに、より長いポリペプチドの一部であってよい断片と会合したリポソームを含む医薬組成物を提供する。分泌またはリーダー配列、または多重ヒスチジン残基のような精製を助ける配列、または組換え生産の間に安定性を増大させるさらなる配列、または最終ポリペプチドの免疫原性能力を増大させるさらなるポリペプチドまたは脂質テイル配列を含有するさらなるアミノ酸配列を含むのが有利であり得る。
【００３９】
当業者であれば、本発明のポリペプチドのアナログに会合したリポソームを含む医薬組成物もまた、本発明と関連した、すなわち、抗原性／免疫原性物質としての用途を見出すであろうことを認識するであろう。かくして、例えば、１以上の付加、欠失、置換等を含む蛋白質またはポリペプチドは本発明に含まれる。
【００４０】
本明細書中で用いるように、本発明のポリペプチドの「断片」、「アナログ」または「誘導体」は、アミノ酸残基の１以上が保存されたまたは保存されていないアミノ酸残基（好ましくは保存された）で置き換えられ、かつ天然または非天然であってよいポリペプチドを含む。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドの誘導体およびアナログは、図面に示される配列またはその断片に対して約８０％の同一性を有するであろう。すなわち、残基の８０％は同一である。さらなる実施形態において、ポリペプチドは８０％を超える同一性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは８５％よりも大きな同一性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは９０％よりも大きな同一性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは９５％よりも大きな同一性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは９９％よりも大きな同一性を有するであろう。さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドのアナログは約２０アミノ酸残基未満、より好ましくは１０未満の置換、修飾または欠失を有するであろう。
【００４１】
これらの置換はポリペプチドの二次構造およびヒドロパシック性質に対して最小の影響を有するものである。好ましい置換は保存されたとして当該分野で知られたものであり、すなわち、置換された残基は疎水性、サイズ、電荷または官能基のような物理的または化学的特性を共有する。これらは、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５，１９７８においてＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．によって、およびＥＭＢＯ Ｊ．８，７７９−７８５，１９８９においてＡｒｇｏｓ，Ｐ．によって記載されたもののような置換を含む。例えば、以下の群の１つに属する天然または非天然いずれかのアミノ酸は保存された変化を表す：
ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ｖａｌ；
ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；
ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；
ｌｙｓ、ａｒｇ、ｏｒｎ、ｈｉｓ；
およびｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。
好ましい置換は、対応するＬ−アミノ酸に代えてのＤ−エナンチオマーの置換も含む。
【００４２】
相同性のパーセンテージは、同一性のパーセンテージ＋アミノ酸タイプの同様性または保存のパーセンテージの和と定義される。
【００４３】
１つの実施形態において、本発明のポリペプチドのアナログは、図面に示した配列またはその断片に対して約７０％同一性を有するであろう。すなわち、残基の７０％は同一である。さらなる実施形態において、ポリペプチドは８０％よりも大きな同一性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは８５％よりも大きな同一性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは９０％よりも大きな同一性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは９５％よりも大きな同一性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは９９％よりも大きな同一性を有するであろう。さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドのアナログは約２０アミノ酸残基未満の、より好ましくは約１０アミノ酸残基未満の置換、修飾または欠失を有するであろう。
【００４４】
１つの実施形態において、本発明のポリペプチドのアナログは図面に示した配列またはその断片に対して約７０％相同性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは８０％よりも大きな相同性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは８５％よりも大きな相同性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは９０％よりも大きな相同性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは９５％よりも大きな相同性を有するであろう。さらなる実施形態において、ポリペプチドは９９％よりも大きな相同性を有するであろう。さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドのアナログは、約２０アミノ酸残基未満、より好ましくは約１０アミノ酸残基未満の置換、修飾または欠失を有するであろう。
【００４５】
アミノ酸配列を比較するのにＣＬＵＳＴＡＬプログラムのようなプログラムを用いることができる。このプログラムはアミノ酸配列を比較し、適切であればスペースをいずれかの配列に挿入することによって最適な整列を見出す。最適な配列についてのアミノ酸同一性または相同性を計算するのが可能である。ＢＬＡＳＴｘのようなプログラムは、同様な配列の最も長いストレッチを整列させ、フィットに対して値を割り当てる。かくして、同様性のいくつかの領域が見出され、各々が異なるスコアを有する比較を得ることが可能である。同一性分析の双方のタイプが本発明で考えられる。
【００４６】
抗原性ポリペプチドをスクリーニングして、エピトープ領域、すなわち、ポリペプチドの抗原性または免疫原性を担う領域を同定するのが可能であることはよく知られている。そのようなスクリーニングを行うための方法は当該分野でよく知られている。かくして、本発明の断片は１以上のそのようなエピトープ領域を含み、あるいはそれらの抗原性／免疫原性特性を保有するのにそのような領域に対して十分に同様であるべきである。
【００４７】
かくして、アナログ、誘導体および断片で重要なものは、それらは、それらが由来する蛋白質またはポリペプチドの少なくともある程度の抗原性／免疫原性を保有することである。
【００４８】
さらに、アミノ酸領域が多形であることが見出される状況においては、異なるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株の異なるエピトープをより有効に模倣するために１以上の特定のアミノ酸を変化させるのが望ましいであろう。
【００４９】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明の１以上のポリペプチド、またはその断片もしくはアナログを含むキメラポリペプチドと会合したリポソームを含む医薬組成物にも関する。
【００５０】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号２を含む２以上のポリペプチド、またその断片またはアナログを含むキメラポリペプチドに会合したリポソームを含む医薬組成物にも関し、ただし、該ポリペプチドはキメラポリペプチドを形成するように連結されているものとする。
【００５１】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号２を含む２以上のポリペプチドを含むキメラポリペプチドに会合したリポソームを含む医薬組成物にも関し、但し、ポリペプチドがキメラポリペプチドを形成するように連結されているものとする。
【００５２】
好ましくは、本発明の医薬組成物のポリペプチドの断片、アナログまたは誘導体は少なくとも１つの抗原性領域、すなわち、少なくとも１つのエピトープを含むであろう。
【００５３】
特別な実施形態において、本発明の医薬組成物に含まれるポリペプチド断片およびアナログは、メチオニン（Ｍｅｔ）またはバリン（Ｖａｌ）のような出発残基は含有しない。好ましくは、ポリペプチドはリーダーまたは分泌配列（シグナル配列）を取り込まない。本発明のポリペプチドのシグナル部分は確立された分子生物学技術に従って決定することができる。一般に、注目するポリペプチドはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ培養から単離し、引き続いて、配列決定して、成熟蛋白質の初期残基、従って、天然ポリペプチドの配列を決定することができる。
【００５４】
本発明の医薬組成物についてのポリペプチドは、それらの開始コドン（メチオニンまたはバリン）なくして、および／または組換えポリペプチドの生産および精製に好都合なようにするそれらのリーダーペプチドなくして、生産しおよび／または用いることができるのが理解される。リーダーペプチドをコードする配列を含まないクローニング遺伝子はポリペプチドをＥ．ｃｏｌｉの細胞質に制限し、それらの回収を容易とするであろう（Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．ａｎｄ Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，Ｊ．Ｊ．（１９９８） Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ． Ｉｎ．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，ｐ．１０９−１４３）。
【００５５】
ＮｓｐＡ蛋白質は抗原性的に高度に保存されており、それが特異的抗体に接近可能なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜に存在することが示されている。
【００５６】
ＮｓｐＡのイン・ビトロ折り畳みは殺菌抗体の生産を完全することができる。この膜たんぱく質の折り畳みを改良するのに用いることができる方法の１つは、リポソームへのその取り込みである。
【００５７】
リポソームは、閉じた同心二層膜を形成するリン脂質および他の極性両性体から形成される［Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｅｓ，Ｇ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，１１，３，８９（１９９０）；Ｌａｓｉｃ，Ｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，８０，ｐ．２０（１９９２）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．，１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ．，ｐ．１６９１にまとめられている］。リポソームの主な成分は脂質であり、それは、長い非極性疎水性「テイル」に結合した極性親水性「ヘッド」を有する。該親水性ヘッドは、典型的には、リン酸基よりなり、他方、親水性テイルは２つの長い炭水化物鎖から形成される。脂質分子は水溶性である１つの部分およびそうではないもう１つの部分を有するため、それらは、疎水性テイルを水分子から隔離する秩序だった構造に凝集する傾向がある。該プロセスにおいて、リポソームは水および溶質をそれらの内部に捕獲することができ、あるいは疎水性領域を持つ分子もまたリポソーム膜に直接的に一体化させることもできる。多くのリン脂質は単独で、または他の脂質と組み合わされて、リポソームを形成する。約束により、リポソームはサイズによってカテゴリー分けされ、３−文字頭字語を用いて、議論すべきリポソームのタイプを指定する。マルチラメラ小胞は「ＭＬＶ」と命名され、大きなユニラメラ小胞は「ＬＵＶ」と命名され、小さなユニラメラ小胞は「ＳＵＶ」と命名される。これらの命名には、時々、リポソームの化学的組成が続く。公知のリポソームの命名法およびまとめはＳｔｏｒｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＰＳＩＴ，１：１９−３１に記載されている。リポソームは膜蛋白質再折り畳みを助けるのに有効であり、また、抗原に対する液性並びに細胞性免疫応答の効果的なアジュバントブースティングである。
【００５８】
本発明は、約１ないし５０、ないし約１ないし１５００の間の脂質に対する蛋白質の比率を有するリポソームを含む医薬組成物を提供する。
【００５９】
本発明は、リン脂質から構成されたリポソームを含む医薬組成物を提供する。これらのリン脂質は合成し、または細菌細胞、大豆、卵から抽出することができる。
【００６０】
本発明は、組換えＮｓｐＡポリペプチドを異なるリポソーム処方に取り込む方法を提供する。
【００６１】
リポソームは、異なる比率で合わせることができる、種々の合成リン脂質（リスト１）または細菌リン脂質および／またはコレステロールで調製することができる。
【００６２】
本発明は、細菌起源からリポソーム処方を作成するために細菌細胞から脂質を抽出する方法を提供する。複合脂質混合物はいくつかの細菌種から抽出することができる。これらの種は限定されるものではないが、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐｐ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｓｐｐ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐｐ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐｐ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐｐ、およびＹｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐを含む。他の種はＢｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９７４）（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）に見出すことができる。好ましい実施形態において、複合脂質混合物はＥ．ｃｏｌｉ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｂｉｓ、またはＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａから抽出される。
【００６３】
本発明のリポソームは、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）のようなホスファチジルエーテルおよびエステルを含めた種々の小胞−形成脂質から、また、ジオレオイルグリセロスクシネートのようなグリセリド；セレブロシド；ガングリオシド、スフィンゴミエリン；コレステロールのようなステロイド；および他の脂質、ならびにビタミンＥまたはビタミンＣパルミテートのような賦形剤からの調製することができる。
【００６４】
リスト１は、ＮｓｐＡ−リポソーム調製物を調製するのに用いることができる合成脂質の部分的リストを評する。他の脂質を用いることができ、それはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．，１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ｐ．３９０に記載されている。
【００６５】
リスト１ ＮｓｐＡ−リポソーム調製物を調製するのに用いられる合成脂質のリスト
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＬＰＡ）、
ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＭＰＡ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＰＰＡ）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＳＰＡ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＯＰＡ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＰＯＰＡ）、
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、
１，２−ジトリデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、
１，２−ジペンタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、
１，２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、
１，２−ジミリストレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、
１−ミリストイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１−パルミトイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、
１−パルミトイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、
１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＬＰＧ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＭＰＧ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＰＰＧ）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＳＰＧ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＯＰＧ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＰＯＰＧ）、
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＬＰＳ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＭＰＳ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＰＰＳ）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＳＰＳ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＰＯＰＳ）。
【００６６】
好ましい実施形態において、脂質は：
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＭＰＳ）、および
１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＭＴＡＰ）
から選択させる。
【００６７】
リポソーム膜の流動性および安定性はリン脂質の転移温度（炭化水素領域が準結晶からより流体状態に変化する温度）に依存するであろう。
【００６８】
膜流動性、ラメラの数、小胞サイズ、表面電荷、抗原に対する脂質の比率、および抗原のリポソーム内への局所化の修飾は、リポソーム調製物のアジュバント性を変調することができる。
【００６９】
リポソームの調製はエタノール注入；エーテル注入；洗剤除去；溶媒蒸発；水エマルジョン中のクロロホルムからの有機溶媒の蒸発；核ポアポリカルボネート膜を通じるマルチラメラ小胞の押出し；リン脂質混合物の凍結および解凍、ならびに音波処理およびホムリナイゼーションを含めた多数の異なる技術によって作成することができる。
【００７０】
脂質は、丸底ガラスフラスコ中のクロロホルム：メタノール溶液のような適当な有機溶媒または有機溶媒混合物に溶解させ、ロータリーエバポレーターを用いて乾燥して、容器上の均一なフィルムを達することができる。
【００７１】
次いで、ＮｓｐＡ蛋白質およびＳＤＳを含有する蛋白質−洗剤溶液を脂質フィルムに加え、フィルムが溶解するまで軽く混合することができる。次いで、溶液をＰＢＳ緩衝液に対して透析して、洗剤を除去し、リポソームの形成を誘導する。
【００７２】
ゲル濾過を別法として用いて、ＮｓｐＡ−ＯＧ−ＳＰＳ−脂質混合ミセル溶液からのＮｓｐＡリポソームの形成を誘導し、洗剤を除去することができる。
【００７３】
いくつかのリポソーム処方は、リピドＡ、モノホフホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）のような親油性分子、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ２１、ミョウバン、ＭＦ５９、ｐ３ＣＳＳ、ＭＴＰ−ＰＥのようなリポ多糖のようなアジュバント、ならびにインターフェロンのようなサイトカインを含めた水溶性分子で調製することもできる。好ましい実施形態において、リポソーム組成物は約１ないし１０％アジュバントを含む。より好ましい実施形態において、アジュバントは約５％未満で存在させる。値はアジュバントに応じてｖｏｌ／ｖｏｌまたはｗｔ／ｗｔであってよい。
【００７４】
本発明によると、リポソームは抗原送達において臨界的な役割を演じる。というのは、ポリペプチド−リポソーム組成物は免疫系の細胞による循環からの除去に続いて免疫系に直接的に提示されるからである。加えて、免疫刺激経路の選択は、リポソームの脂質組成に変化を施すことによって改変することができる。例えば、リピドＡ、ムラミルジ−およびトリペプチド−ＰＥおよびカチオン性脂質のような異なる刺激分子をリポソームに処方することができる。
【００７５】
膜蛋白質の再折り畳みに加えて、リポソームもまた抗原に対する液性ならびに細胞性免疫応答をブースティングする有効なアジュバントである。膜流動性、ラメラの数、小胞サイズ、表面電荷、抗原に対する脂質比率、および抗原のリポソーム内の局所化の修飾は、リポソーム調製物のアジュバント性を変調することができる。
【００７６】
好ましい実施形態において、脂質処方は０および２５モル％の間のコレステロールを含有する。
【００７７】
本発明のもう１つの態様によると、（ｉ）リポソーム、担体、希釈剤またはアジュバントと共に本発明のポリペプチドを含有する組成物；（ｉｉ）本発明のポリペプチドおよびリポソーム、希釈剤またはアジュバントを含む医薬組成物；（ｉｉｉ）本発明のポリペプチドおよびリポソーム、単体、希釈剤またはアジュバントを含むワクチン；（ｉｖ）免疫応答、例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する保護免疫応答を誘導するのに免疫原性的に有効な量の本発明の医薬組成物を宿主に投与することによって宿主においてＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する免疫応答を誘導する方法；特に、（ｖ）予防または治療有効量の本発明の医薬組成物をそれを必要とする宿主に投与することによって、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染を予防および／または治療する方法も提供される。
【００７８】
本発明のもう１つの態様によると、（ｉ）リポソーム、担体、希釈剤またはアジュバントと共に本発明のポリヌクレオチドを含有する組成物；（ｉｉ）本発明のポリヌクレオチド、およびリポソーム、担体、希釈剤またはアジュバントを含む医薬組成物；（ｉｉｉ）免疫応答、例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する保護免疫応答を誘導するのに免疫原性的に有効量の本発明の医薬組成物を宿主に投与することによって宿主においてＮ．ｍｅｍｏｍｇｏｅｔｄｏｓに対する免疫応答を誘導する方法；特に、（ｉｖ）予防または治療量の本発明の医薬組成物をそれを必要とする宿主に投与することによって、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染を予防および／または治療する方法も提供される。
【００７９】
もう１つの態様によると、医薬上許容されるアジュバントを含む混合物中のリポソーム、１以上の本発明のＮ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリペプチドを含む医薬組成物が提供される。適当なアジュバントは（１）ＭＦ５９ＴＭ、ＳＡＦＴＭ、ＲｉｂｉＴＭのような水中油型エマルジョン処方；（２）フロイントの完全または不完全アジュバント；（３）塩、すなわち、ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）２、Ａｌ（ＯＨ）３、ＡｌＰＯ４、シリカ、カオリン；（４）ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）のようなそれから精製するＳｔｉｍｕｌｏｍＴＭまたは粒子のようなサポニン誘導体；（５）インターロイキン、インターフェロン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなサイトカイン；（６）炭素ポリヌクレオチド、すなわち、粘膜免疫性の誘導のための、ポリＩＣおよびポリＡＵ、解毒されたコレラトキシンン（ＣＴＢ）およびＥ．ｃｏｌｉ熱不安定トキシンのような他の物質を含む。アジュバントのより詳細な記載は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．１（１９９４） ｐｐ２−１１においてＭ．Ｚ．Ｉ Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．によるレビューにおいて、また、Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．１４，ｐｐ１２６３−１２７６（１９９５）およびＷＯ ９９／２４５７８においてＧｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．によるもう１つのレビューにおいて利用可能である。好ましいアジュバントはＱｕｉｌＡＴＭ、ＱＳ２１ＴＭ、ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌＴＭおよびＡｄｊｕｐｈｏｓＴＭを含む。
【００８０】
本発明の医薬組成物は注射、迅速注入、鼻咽頭吸収、皮膚吸収によって非経口的に、またはバッカル傾向または経口投与することができる。
【００８１】
用語医薬組成物は抗体を含むことも意味する。本発明によると、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染および／またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染によって媒介される病気および兆候の治療または予防用の、本発明のポリペプチドに対する結合特異性を有する１以上の抗体の使用が提供される。
【００８２】
本発明の医薬組成物は、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐ．Ｒ．Ｍｕｒｒａｙ（Ｅｄ，ｉｎ Ｃｈｉｅｆ），Ｅ．Ｊ．Ｂａｒｏｎ，Ｍ．Ａ．Ｐｆａｌｌｅｒ，Ｆ．Ｃ．Ｔｅｎｏｖｅｒ ａｎｄ Ｒ．Ｈ．Ｙｏｌｋｅｎ． ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．ｓｅｖｅｎｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９９，１７７３ｐに記載されたナイセリア感染および／またはナイセリア感染によって媒介される病気および兆候の予防で用いられる。
【００８３】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、髄膜炎および髄膜炎菌血症のような風土病および流行病の治療または予防で用いられる。１つの実施形態において、本発明のワクチン組成物は、ナイセリア感染および／またはナイセリア感染によって媒介される病気および兆候の治療または予防で用いられる。さらなる実施形態において、ナイセリア感染はＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａまたはＮ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａである。
【００８４】
さらなる実施形態において、本発明は、予防または治療量の本発明の組成物を宿主に投与することを含む、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染に罹患性の宿主においてＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染の予防または治療方法を提供する。
【００８５】
本発明で用いるように、用語「宿主」は哺乳動物を含む。さらなる実施形態において、該哺乳動物はヒトである。
【００８６】
特別な実施形態において、医薬組成物は、新生児、幼児、子供、老人および免疫寛容宿主のようなＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染の危険性がある宿主に投与される。
【００８７】
特別な実施形態において、医薬組成物は、成人のようなＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染の危険性がある宿主に投与される。
【００８８】
医薬組成物は、好ましくは、免疫化の間が約１ないし６週間間隔の間隔であり、１ないし３回の、約０．００１ないし１００μｇ／ｋｇ（抗原／体重）、より好ましくは０．０１ないし１０μｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．１ないし１μｇ／ｋｇの単位投与形態である。
【００８９】
医薬組成物は、好ましくは、免疫化の間が約１ないし６週間間隔の間隔である、１ないし３回の、約０．１μｇないし１０ｍｇ、より好ましくは１μｇないし１ｍｇ、最も好ましくは１０ないし１００μｇの単位投与形態である。
【００９０】
もう１つの態様において、配列番号２を含むアミノ酸配列によって特徴付けられるポリペプチド、またはその断片もしくはアナログをコードするポリヌクレオチドに関連するリポソームを含む医薬組成物が提供される。
【００９１】
図１に示したポリヌクレオチド配列は縮重コドンで改変することができるが、依然として、本発明のポリペプチドをコードすることは認識されよう。従って、本発明は、さらに９０％の配列間同一性を有するここに前記したポリヌクレオチド配列（またはその相補体配列）にハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびリポソームを含む医薬組成物を提供する。さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能であり、すなわち、少なくとも９５％同一性を有する。さらなる実施形態において、９７％を超える同一性。
【００９２】
ハイブリダイゼーションに適したストリンジェントな条件は当業者によって容易に決定することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１９９９） ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．参照）。
【００９３】
さらなる実施形態において、配列番号１に示されたポリヌクレオチド、または本発明のポリペプチドをコードするその断片またはアナログと会合したリポソームを含む医薬組成物。
【００９４】
もう１つの態様によると、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させ、発現させたポリペプチド産物を回収することにより、組換え技術によって本発明のポリペプチドを生産する方法が提供される。
【００９５】
別法として、ポリヌクレオチドは確立された合成化学技術、すなわち、十分なポリペプチドを生産するように連結された（ブロック連結）オリゴペプチドの液相または固相合成に従って生産することができる。
【００９６】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを得て、評価する一般的方法は以下の文献に記載されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｗｈｉｔｅ Ｂ．Ａ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９７，４９０ ｐａｇｅｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ，Ｓｃｏｐｅｓ Ｒ．Ｋ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９３，３８０ ｐａｇｅｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
【００９７】
本発明は、ポリペプチドの発現に適した条件下で、本発明の宿主細胞を培養することを含むポリペプチドの製法を提供する。
【００９８】
組換え生産では、宿主細胞を、本発明のポリペプチドをコードするベクターでトランスフェクトし、次いで、適切には、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、または遺伝子を増幅するための修飾された栄養培地中で培養する。適当なベクターは選択された宿主中で生きており、複製可能であるものであり、染色体、非−染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せから由来するベクターを含む。ポリペプチド配列は、それが、プロモーター、リボソーム結合部位（コンセンサス領域またはシャイン−ダルガルノ配列）および所望によりオペレーター（制御エレメント）を含む発現制御領域に操作可能に連結されるように、制限酵素を用いて適当な部位にてベクターに組み込むことができる。与えられた宿主およびベクターに適切である発現制御領域の個々の成分を、確立された分子生物学の原理に従って選択することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。適当なプロモーターは、限定されるものではないが、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔａｃまたはｔｒｐプロモーターおよびファージラムダＰＬプロモーターを含む。ベクターは、好ましくは、複製起点ならびに選択マーカー、すなわち、アンピシリン抵抗性遺伝子を取り込む。適当な細菌ベクターはｐＥＴ、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐＤ１０ ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５および真核生物ベクターｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬを含む。宿主細胞は細菌、すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ；真菌、すなわち、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌｉｎｓ；酵母、すなわち、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたは真核生物、すなわち、ＣＨＯ、ＣＯＳであってよい。
【００９９】
培養におけるポリペプチドの発現に際して、細胞は典型的には遠心によって収穫し、次いで、（もし発現されたポリペプチドが培地に分泌されないならば）物理的化学的手段によって破壊し、得られた粗製調節物を維持して、注目するポリペプチドを単離する。培養基または溶解物からのペプチドの精製は、ポリペプチドの特性に依存して、確立された技術によって、すなわち、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクトマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびべクチンクロマトグラフィーを用いて達成することができる。最終の精製はＨＰＬＣを用いて達成することができる。
【０１００】
ポリペプチドはリーダーまたは分泌配列の有りまたは無しにて発現させることができる。前者の場合には、リーダーは、翻訳後プロセッシングを用いて除去することができ（米国特許第４，４３１，７３９号；米国特許第４，４２５，４３７号；および米国特許第４，３３８，３９７号参照）、あるいは発現されたポリペプチドの精製に従い化学的に除去することができる。
【０１０１】
さらなる態様によると、本発明の医薬組成物はナイセリア感染、特に、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染についての診断テストで用いることができる。
【０１０２】
いくつかの診断方法、例えば、生物学的試料中のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ生物の検出が可能である。以下の手法に従うことができる；
ａ）宿主から生物学的試料を入手し、
ｂ）本発明の医薬組成物と反応性である抗体または抗体断片を、生物学的試料と共にインキュベートして、混合物を形成し；次いで、
ｃ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの存在を示す混合物中の特異的に結合した抗体または結合した断片を検出する。
【０１０３】
別法として、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原に特異的な抗体を含有する、または含有することが疑われる生物学的試料中の該抗体を検出する抗体は以下のように行うことができる。
【０１０４】
ａ）宿主から生物学的試料を入手し、
ｂ）本発明の医薬組成物を生物学的試料と共にインキュベートして、混合物を形成し；ついで、
ｃ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに特異的な抗体の存在を示す混合物中の特異的に結合した抗原または結合した断片を検出する。
【０１０５】
当業者であれば、この診断テストは、本質的に、蛋白質の特異的な抗体が生物に存在するか否かを判断するための、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイまたはラテックス凝集アッセイのような免疫学的テストを含めたいくつかの形態を採ることができるのを認識するであろう。
【０１０６】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を用いて、そのような細菌を含有することが疑われる生物学的試料中のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの存在を検出するのに用いられるＤＮＡプローブを設計することもできる。本発明の検出方法は；
ａ）宿主から生物学的試料を入手し、
ｂ）本発明のポリペプチドまたはその断片をコードするＤＮＡ配列を有する１以上のＤＮＡプローブを生物学的試料と共にインキュベートして、混合物を形成し；次いで、
ｃ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ細菌の存在を示す混合物中の特異的に結合したＤＮＡプローブを検出することを含む。
【０１０７】
本発明のＤＮＡプローブは、例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染を診断する方法として、例えば、ポリメラーゼ鎖反応を用いて試料中の循環Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、すなわち、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ核酸を検出するのに用いることもできる。該プローブは慣用的技術を用いて合成することができ、固相に固定化し、あるいは検出可能な標識で標識することができる。この適用のための好ましいＤＮＡプローブは、本発明のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリペプチドの少なくとも約６連続ヌクレオチドに対して相補的な配列を有するオリゴマーである。さらなる実施形態において、好ましいＤＮＡプローブは、本発明のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリペプチドの少なくとも約１５連続ヌクレオチドに対して相補的な配列を有するオリゴマーであろう。さらなる実施形態において、好ましいＤＮＡプローブは、本発明のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリペプチドの少なくとも約３０連続ヌクレオチドに対して相補的な配列を有するオリゴマーであろう。さらなる実施形態において、好ましいＤＮＡプローブは、本発明のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリペプチドの少なくとも約５０連続ヌクレオチドに対して相補的な配列を有するオリゴマーであろう。
【０１０８】
宿主においてＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの検出のためのもう１つの診断方法は；
ａ）本発明の医薬組成物に対して反応性である抗体を検出可能な標識で標識し；
ｂ）標識された抗体を宿主に投与し、次いで、；
ｃ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの存在を示す宿主における特異的に結合した標識抗体または標識断片を検出する；
ことを含む。
【０１０９】
本発明のさらなる態様は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染の診断および、特に、治療用の特異的抗体の生産のための免疫原としての本発明の医薬組成物の使用である。適当な抗体は、例えば、テストモデルにおいてＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染に対して受動的に保護する特定の抗体の能力を測定することによって、適当なスクリーニング方法を用いて測定することができる。抗体は全抗体またはその抗原−結合断片であってよく、いずれの免疫ブロブリンクラスに属することもできる。抗体または断片は動物起源、特に哺乳動物起源、さらに詳しくはネズミ、ラットまたはヒト起源であってよい。それは天然抗体またはその断片、あるいは所望であれば、組換え抗体または抗体断片であってよい。擁護組み換え抗体または抗体断片は、分子生物学技術を用いて生産された抗体または抗体断片を意味する。抗体または抗体断片はポリクローナル、または好ましくはモノクローナルであってよい。それは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリペプチドと会合した多数のエピトープに対して特異的であるが、好ましくは１つに対して特異的であろう。
【０１１０】
１つの態様において、本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染の予防および／または治療のための抗体の使用を提供する。
【０１１１】
本発明のさらなる態様は、受動免疫化のための、本発明の医薬組成物に向けられた抗体の使用である。本出願に記載された抗体を使用することができよう。
【０１１２】
本発明のさらなる態様は免疫化の方法であり、それにより、本発明の医薬組成物に惹起された抗体は、受動免疫化を供するのに十分な量で宿主に投与される。
【０１１３】
さらなる実施形態において、本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染の予防または治療処置用の医薬の製造における本発明の医薬組成物の使用を提供する。
【０１１４】
さらなる実施形態において、本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染の検出または診断用の本発明の医薬組成物を含むキットを提供する。
【０１１５】
他に定義されなければ、本明細書中で用いるすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野における当業者によって通常理解されるのと同一の意味を有する。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の文献がここに引用してその全体を援用する。コンプリクトする場合、定義を含めた本出願が支配するであろう。加えて、材料、方法および例は説明のためであり、限定的であることを意図しない。
【実施例】
【０１１６】
実施例１
本実施例は、ＮｓｐＡ蛋白質を表す３−Ｄモデルを説明する。
【０１１７】
髄膜炎菌ＮｓｐＡ蛋白質を３−Ｄモデルは、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｄｂ Ｖｉｅｗｅｒ［Ｇｕｅｘ，Ｎ．ａｎｄ ＭＣ Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｅｌｅｃｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１８，ｐ．２７１４（１９９７）］および図１に示されたＮｓｐＡアミノ酸配列を用い、再度折り畳まれたＥ．ｃｏｌｉ ＯｍｐＡ（ＰＤＢ：１ＱＪＰ）の結晶構造［Ｐａｕｔｓｃｈ，Ａ ａｎｄ ＧＥ Ｓｃｈｕｌｚ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２９８，ｐ．２７３（２０００）］に基づいて開発された。この配列ならびに他のＮｓｐＡは、元来、ＰＣＴ／ＷＯ／９６／２９４１２で示された。３−Ｄ ＮｓｐＡモデルは図２に示す。予測される標的（ＮｓｐＡ配列）および鋳型（１ＱＪＰ，ＯＭＰＡ配列）の間の整列は、二次構造を予測（ＰＳＩＰＲＥＤ）、プロフィールライブラリーサーチ（ＦＵＧＵＥ）、位置特異的反復ＢＬＡＳＴ（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ）およびベータ−ストランド両親媒性測定を用いて達成された［Ｓｈｉ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３１０，ｐ．２４３（２００１）；ＭｃＧｕｆｆｉｎ Ｌ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１６，ｐ．４０４（２０００）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５，ｐ．３３８９（１９９７）］。このモデルから、蛋白質の各領域を突き止め、それらを、ペリプラズムターン（Ｔ）、膜包埋領域（Ｍ）および表面−露出ループ（Ｌ）として分類することができた。従前に報告されているように、最初の１８アミノ酸残基は分泌シグナルを表し、これは切断されて成熟ポリペプチドとなる［Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５，ｐ．１１７３（１９９７）］。細菌のペリプラズム領域に面する膜の外側まで延びる３つの鋭いターンは、残基５５ないし５８（Ｔ１）、９２ないし９６（Ｔ２）および１３７ないし１４０（Ｔ３）の間に突き止められた。髄膜炎基膜に包埋されたＮｓｐＡ蛋白質の内部コアは、β−バレルを形成する８つの反平行膜貫通β−ストランドから構成される。これらの膜貫通β−ストランドは、各々、アミノ酸残基２４ないし３３（Ｍ１）、４５ないし５４（Ｍ２）、５９ないし６７（Ｍ３）、８１ないし９１（Ｍ４）、９７ないし１０７（Ｍ５）、１２６ないし１３６（Ｍ６）、１４１ないし１５０（Ｍ７）、および１６４ないし１７３（Ｍ８）の間に位置すると決定された。最後に、髄膜炎基細胞の表面に露出していると判断された４つの領域は、各々、アミノ酸残基３４ないし４４（Ｌ１）、６８ないし８０（Ｌ２）、１０８ないし１２５（Ｌ３）、および１５１ないし１６３（Ｌ４）の間に位置した。このモデルの免疫学的確認は実施例５に示す。
【０１１８】
実施例２
本実施例は、ΔＮｓｐＡ Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ突然変異体株の創製を説明する。
【０１１９】
ＮｓｐＡ蛋白質を発現しない髄膜炎菌突然変異体株を創製するために、ファージベクターλ１１０５に挿入されたトランスポゾンミニ−Ｔｎ１０（Ｋａｎｒ）を用いて遺伝子を
不活化した［Ｗａｙ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ，３２，ｐ．３６９（１９８４）；Ｋｌｅｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０４，ｐ．１３９（１９９１）］。ｎｓｐＡ遺伝子［Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５，ｐ．１１７３（１９９７）］を含有するプラスミドｐＮ２２０２を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０［Ｆ−、ｈｓｄＲ−、ｈｓｄＭ＋、ｔｈｙ−、ＩＮ（ｒｒｎＤ−ｒｒｎＥ）１λ−、ｍｃｒＡ＋、ｍｃｒＢ＋、（ｒｋ＋、ｍｋ＋）、ＭＲＲ＋、ｓｕｏ］を形質転換した。次いで、組換えＥ．ｃｏｌｉ株をファージベクターλ１１０５で感染させ、培養を、２５μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上で平板培養し、３７℃で一晩インキュベートした。染色体またはｐＮ２２０２プラスミドいずれか上にミニ−Ｔｎ１０トランスポゾンを含有する細菌のみが選択培地で増殖するであろう。ＱＩＡｇｅｎプラスミド精製キットを用い、組換えｐＮ２２０２プラスミドを選択されたコロニーから精製した。次いで、これらの精製されたプラスミドを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９（ｅ１４−（ｍｃｒＡ） ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｇｙｒＡ９６ ｔｈｉ−１ ｈｓｄＲ１７（ｒｋ− ｍｋ＋） ｓｕｐＥ４４ ｒｅｌＡ１ Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）（Ｆ’ ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡＢ ｌａｃＩｑＺΔＭ１５））を形質転換し、細菌懸濁液を再度選択培地で平板培養した。ミニ−Ｔｎ１０トランスポゾンを持つ、ｐＮ２２０２ΔｎｓｐＡとして同定された組換えｐＮ２２０２プラスミドを含有する細菌のみが、この第２ラウンドの選択後に増殖することができた。イムノブロットにより、これらの組換えＥ．ｃｏｌｉはＮｓｐＡ蛋白質を生産しなかったことが確認された。プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ組換え株の１つから精製し、ｎｓｐＡ遺伝子中のミニ−Ｔｎ１０トランスポゾンの存在は配列決定によって確認した。１．８ｋｂミニ−Ｔｎ１０は、プラスミドｐＮ２２０２ΔｎｓｐＡに含有されたｎｓｐＡ遺伝子中のヌクレオチド２２１直後に挿入さたれと判断された。次いで、プラスミドｐＮ２２０２ΔｎｓｐＡを用いて、以下のプロトコルに従って、髄膜炎菌株６０８Ｂを形質転換した。１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むハートヒュージョンブロス中で増殖した髄膜炎菌株６０８Ｂの細菌懸濁液の光学密度（λ＝６２０ｎｍ）を〜０．２５に調整した。１０μｌの一定容量の精製されたプラスミドｐＮ２２０２ΔｎｓｐＡを１ｍｌの調整された髄膜炎菌細胞懸濁液に加え、５％ＣＯ２の存在下で３７℃にて３時間インキュベートした。このインキュベーション時間の後、髄膜炎菌細胞を、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するチョコレート寒天プレート上で平板培養した。ＮｓｐＡ蛋白質の発現の欠如は、イムノブロッティングおよびフローサイロフルオロメトリーアッセイによって確認された。予測されるように、ＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂ Ｍｅ−７ならびにウサギおよびマウス過剰免疫結成は６０８ＢΔｎｓｐＡ突然変異体株と反応せず、他方、それらは野生型髄膜炎菌６０８Ｂ株を認識した。
【０１２０】
実施例３
本実施例は、ＮｓｐＡ−特異的モノクローナル抗体の創製を説明する。
【０１２１】
天然ＮｓｐＡに対して向けられたＭＡｂを創製するために、血清型ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株６０８Ｂ［Ｂ：２ａ：Ｐ１．２：Ｌ３］から抽出された外膜調製物で雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫化した［Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５，ｐ．１１７３（１９９７）］。この外膜調製物を得るのに用いた塩化リチウム抽出は、本発明者らによって従前に記載されたように行った［Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５０，ｐ．２６５（１９８５）］。マウスに、ＱｕｉｌＡアジュバント（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｒｎｂｙ，Ｏｎｔ．Ｃａｎａｄａ）の存在下で、３週間間隔で、２０μｇの外膜調製物を３回筋肉内（ＩＭ）注射した。ハイブリドーマ細胞系を創製するのに用いた融合プロトコルは、発明者らによって従前に記載されている［Ｈａｍｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２５，ｐ．２４３４（１９８７）］。ＭＡｂのクラスおよびサブクラスは従前に報告されているようにＥＬＩＳＡによって決定した［Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５，ｐ．１１７３（１９９７）］。
【０１２２】
ＭＡｂの特異性は、精製された組換えＮｓｐＡ蛋白質、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ野生型株６０８Ｂおよび６０８ＢΔｎｓｐＡ突然変異体株から抽出された外膜調製物を用い、ＥＬＩＳＡによって測定し、データを表１に示す。ＥＬＩＳＡは従前に記載されているように行った［Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５，ｐ．１１７３（１９９７）］。ＰＣＴ／ＷＯ／９６／２９４１２に従前に記載されたＭＡｂ Ｍｅ−７を陽性対照として用い、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｐ２外膜蛋白質からの特異的なＭＡｂ ｐ２−４を陰性対照として用いた［Ｃａｄｉｅｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．，６７，ｐ．４９５５，（１９９９）］。全てのＭＡｂは精製された組換えＮｓｐＡと、および髄膜炎菌野生型６０８Ｂ株から抽出された外膜調製物と強く反応したが、それらが髄膜炎菌６０８ＢΔｎｓｐＡ突然変異体株を認識しなかった。
【０１２３】
表１：ＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂの反応性
【０１２４】
【表１−１】
【０１２５】
【表１−２】
１ＭＡｂの反応性は、０．５μｇ／ｍｌの精製された組換えＮｓｐＡ蛋白質、野生型６０８Ｂ髄膜炎菌株からの、またはコーディング抗原としての６０８ＢΔｎｓｐＡ株からのＯＭＰの２．５μｇ／ｍｌを用い、ＥＬＩＳＡによって評価した。
【０１２６】
無傷髄膜炎菌細胞の表面でのＮｓｐＡの露出はサイトフルオロメトリーアッセイを用いて調べた。髄膜炎菌は、８％ＣＯ２雰囲気中、３７℃にて、０．２５％デキストロースを含有するブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）ブロス中で、０．５００（〜１０８ＣＦＵ／ｍｌ）の光学密度（λ＝４９０ｎｍ）まで増殖させた。次いで、ＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂまたは対照ＭＡｂを加え、細胞に結合させ、これを回転させつつ４℃にて２時間インキュベートした。試料を、ブロッキング緩衝液［２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸−緩衝化生食塩水（ＰＳＢ）］中で２回洗浄し、次いで、ブロッキング緩衝液中に希釈された１ｍｌのヤギフルオレセイン（ＦＩＴＣ）−コンジュゲーテッド抗−マウス特異的ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を加えた。回転しつつの室温での６０分間のさらなるインキュベーションの後、試料をＰＢＳ緩衝液中で２回洗浄し、ＰＤＢ緩衝液中の０．３％ホルムアルデヒドで４℃にて１８時間固定した。細胞を、フルオサイトメトリー（Ｅｐｉｃｓ（登録商標）ＸＬ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）によって分析するまで、４℃にて暗所で維持した。
【０１２７】
図３は、２つの血清群Ｂ（６０８Ｂ）［Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５，ｐ．１１７３（１９９７）］およびＣｕ３８５［Ｍｏｅ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６７，ｐ．５６６４，（１９９９）］、１つの血清群Ａ（Ｆ８２３８）［Ｍａｓｌａｎｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４，ｐ．１５６（１９９７）］および１つの血清群Ｃ（Ｃ１１）［Ｍａｓｌａｎｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４，ｐ．１５６（１９９７）］髄膜炎菌株の表面における９つの代表的ＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂの結合を示す。各ＭＡｂについて、濃度は１μｇ／ｍｌに調製し、初期対数期髄膜炎菌細胞を用いて、サイトフルオロメトリーアッセイを行った。これらのＭＡｂのいずれも、ｎｓｐＡ遺伝子がトランスポゾンの挿入によって不活化された６０８ＢΔｎｓｐＡ突然変異体株と反応しなかった（突然変異体株の記載については実施例２参照）。この結果は、これらのＭＡｂのいずれも、生きた髄膜炎菌細胞の表面に非特異的に結合しなかったことを示す。
【０１２８】
無傷髄膜炎菌細胞への付着のレベルに従い、ＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂを３つの群に分類した（図３）。第一の群において、Ｍｅ−７、Ｍｅ−９、Ｍｅ−１１、Ｍｅ−１３およびＭｅ−１５のようなＭＡｂはテストした４つの株の細胞表面において効果的に付着し、これは、それらのエピトープが蛋白質の表面−露出領域に位置することを示す。第二の群に分類されたＭｅ−１０、Ｍｅ−１２およびＭｅ−１４のようなＭＡｂの結合はより可変であった。というのは、それらは、テストされた４つのうち１または２の株の表面のその対応するエピトープを認識したからである。最後に、いずれの無傷髄膜炎菌細胞にも結合しなかったＭｅ−１６のようなＭＡｂは第三の群に分類された。イムノブロットは、後者の群におけるＭＡｂは、それを髄膜炎菌外膜に挿入されなかった場合、精製されたＮｓｐＡとよく反応したことを明瞭に示した（データは示さず）。
【０１２９】
全体として、これらの結合データは、ＮｓｐＡに存在するいくつかのエピトープは露出されており、血清学的に区別される髄膜炎菌細胞の細胞表面の特異的抗体に接近可能であり、他方、他のエピトープは制限された数の株上の抗体に接近可能であることを示唆した。ＮｓｐＡ蛋白質は高度に保存されており、今日までにテストされた全ての株によって生産されるため、群ＩＩのＭＡｂのある種の髄膜炎菌株への結合の欠如は、恐らくは、アミノ酸変動、または蛋白質発現の欠如にほとんど関連しない。髄膜炎菌細胞表面に存在する他の抗原は第二の群におけるＭＡｂによって認識されるエピトープをマスクするのではないか、あるいは蛋白質の三次構造はこれらの株において僅かに異なり、かくして、ある種のエピトープへの抗体への結合を妨げると仮定するであろう。多糖被膜はＮｓｐＡエピトープをシールドし、大量の多糖を生産する髄膜炎菌株への抗体の結合を妨げると報告されている［Ｍｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６７，ｐ．５６６４、（１９９９）］。しかしながら、多糖の生産、結合の欠如、およびＮｓｐＡ−特異的抗体の殺菌活性の間の関係は明瞭には確立されなかった。事実、抗−ＮｓｐＡ抗体は表面に結合せず、高い多糖生産者であると決定された髄膜炎菌株を殺すことができず、他方、低−生産者株は表面結合について陰性であって、殺菌活性に対して抵抗性であった。この後者の観察を考慮し、立体配座変化のような他のメカニズムもまたある種のＭＡｂについて観察された結合の欠如および殺菌活性を説明できるであろうと仮定されるかもしれない。
【０１３０】
全ての４つの株の表面のそれらの特異的エピトープを認識した群Ｉに分類されたＭＡｂは、テストした４つの髄膜炎菌株に対して殺菌性であることが判明した（図３）。群ＩのＭＡｂでは、データは、表面結合および殺菌活性の間の相関を示唆した。しかしながら、群ＩＩに分類されたＭＡｂについてのいずれかの関係を確立するのは困難である。その例として、髄膜炎菌株Ｃ１１は、それが表面結合については陽性であるにも拘わらず、ＭＡｂ Ｍｅ−１２およびＭｅ−１４の殺菌活性に対して抵抗性であった。
【０１３１】
実施例４
本実施例は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）による修飾されたｎｓｐＡ遺伝子産物のクローニングおよびＥ．ｃｏｌｉにおけるこれらの遺伝子産物の発現を記載する。
【０１３２】
ＮｓｐＡ表面−露出エピトープを特徴付けるために、７つの修飾されたＮｓｐＡ蛋白質を設計した（表２）。標準的な方法に従い、制限酵素部位（表３および４）の付加のための塩基延長を含有したオリゴヌクレオチドプライマーの対を用い、Ｎｍ１４、Ｎｍ１６、Ｎｍ１７およびＮｍ２０と命名された修飾されたｎｓｐＡ遺伝子に含まれるべき遺伝子断片を、特許ＰＣＴ／ＷＯ／９６／２９４１２に記載されたｐＵＲＶベクターにクローン化されたｎｓｐＡまたは（Ｎｍ２０の代わりの）Ｎｍ１９からＰＣＲ（ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム２４００ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって増幅した。ＰＣＲ産物は、製造業者の指示に従って、ＱＩＡｇｅｎからのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて、アガロースゲルから精製し、制限エンドヌクレアーゼで消化した。ｐＵＲＶベクターをエンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＱＩＡｇｅｎからのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いてアガロースゲルから精製した。与えられた修飾されたｎｓｐＡ遺伝子に対応する消化されたＰＣＲ産物を、修飾されたｎｓｐＡ遺伝子の創製のためにｐＵＲＶ−ＮｄｅＩ−ＮｏｔＩベクターに連結した。連結された産物を、製造業者の推奨に従い、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５α［Ｆ−φ８０ｄｌａｃｚΔＭ１５ Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｅｎｄＡ１ ｒｅｃＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−ｍｋ＋） ｄｅｏＲ ｔｈｉ−１ ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４ λ―ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１］（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に形質転換した。修飾されたｎｓｐＡ遺伝子断片を含有する組換えプラスミドを、ＱＩＡｇｅｎプラスミドキットを用いて精製し、それらのＤＮＡインサートを配列決定した（Ｔａｑ Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ，ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。
【０１３３】
修飾された蛋白質Ｎｍ１４、Ｎｍ１６、Ｎｍ１７、およびＮｍ２０を完成し、蛋白質Ｎｍ３を創製するために、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ部位−特異的突然変異誘発キットおよび表５に記載されたオリゴヌクレオチドを用いる突然変異誘発実験を製造業者の推奨に従って行った。表６は、部位−特異的突然変異誘発によって創製された修飾されたｎｓｐＡ遺伝子に対する修飾を示す。
【０１３４】
蛋白質Ｎｍ１８を創製するために、制限酵素部位（表４）の付加のための塩基延長を含有するオリゴヌクレオチドプライマーＤＭＡＲ８３９およびＤＭＡＲ１１５９を用い、Ｎ−末端断片をＰＣＲによって増幅し、前記したように消化した。標準的な方法に従い、オリゴヌクレオチドプライマーＤＭＡＲ１１５７およびＤＭＡＲ１１５８をアダプターとして用い、これらのプライマーのアニーリングの後に、Ｃ−末端断片を作製した。ｐＵＲＶ−ＮｄｅＩ−ＮｏｔＩベクターへの連結、およびＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αへの形質転換は前記したように行った。修飾されたｎｓｐＡ遺伝子断片を含有する組換えプラスミドは、ＱＩＡｇｅｎプラスミドキットを用いて精製し、そのＤＮＡインサートを配列決定した（Ｔａｑ Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ，ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。
【０１３５】
Ｎｍ１９分子を創製するために、修飾された遺伝子Ｎｍ１６およびＮｍ１８を、各々、エンドンクレアーゼＮｄｅＩ−ＳａｌＩおよびＳａｌＩ−ＮｏｔＩで消化した。ＱＩＡｇｅｎからのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用い、断片をアガロースゲルから精製し、ｐＵＲＶ−ＮｄｅＩ−ＮｏｔＩベクターに連結した。ＱＩＡｇｅｎプラスミドキットを用い、修飾された遺伝子Ｎｍ１９を含有する組換えプラスミドを精製し、そのＤＮＡインサートを配列決定した（Ｔａｑ Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ，ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。
【０１３６】
得られたプラスミド構築体の各々を用いて、エレクトロポレーション（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ装置，ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｌａｂｓ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）によって、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（Ｆ− ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒ−Ｂｍ−Ｂ） ｇａｌ ｄｃｍ）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換した。この組換え株を、４０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢブロス（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）に接種し、まず、攪拌しつつ３７℃にてほぼ１．５時間インキュベートし（ＯＤ６００ｎｍ＝０．６）、その時点の後、温度をさらに１．５時間で３９℃まで上昇させて、組換え蛋白質の生産を誘導した。表面−露出エピトープを特徴付けるために、実施例５に記載したように、インキュベーション時間の後に得られたＥ．ｃｏｌｉ株に対して、サイトフルオロメトリーアッセイを用いてＮｓｐＡ−特異的Ｍａｂをテストした。
【０１３７】
表２ 修飾されたｎｓｐＡ遺伝子のリスト
【０１３８】
【表２】
表３ 表２にリストされた修飾されたｎｓｐＡ遺伝子の創製のために設計されたＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対のリスト
【０１３９】
【表３】
表４ 表２にリストされた修飾されたｎｓｐＡ遺伝子の創製のために設計されたＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーのリスト
【０１４０】
【表４】
表５ 修飾されたｎｓｐＡ遺伝子に対する部位−特異的突然変異誘発で用いたＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー組のリスト
【０１４１】
【表５】
表６ 部位−特異的突然変異誘発によって創製された修飾されたｎｓｐＡ遺伝子産物に対する修飾のリスト
【０１４２】
【表６】
１下線を施したアミノ酸残基はＤＮＡ配列中の修飾を表す。
【０１４３】
実施例５
本実施低はＮｓｐＡ蛋白質上のＭＡｂによって認識されたエピトープの位置決定を説明する。
【０１４４】
ＮｓｐＡ−特異的Ｍａｂによって認識されたエピトープを位置決定し、および実施例１で示されたＮｓｐＡモデルを確認するために、実施例４に記載された修飾されたＮｓｐＡ蛋白質を生産していた組換えＥ．ｃｏｌｉ株を用いるフローサイトメトリーによって、およびＮｓｐＡ蛋白質をカバーする重複合成ペプチドでのＥＬＩＳＡによって、これらのＭＡｂの表面結合を評価した。
【０１４５】
Ｍｅ−１６のような群ＩＩＩ ＭＡｂによって認識されるエピトープは、ＮｓｐＡ蛋白質の全長をカバーする重複する１５−ないし２０−アミノ酸残基合成ペプチドを用いて容易に位置決定された。これらのペプチドは特許ＰＣＴ／ＷＯ／９６／２９４１２に示されている。その例として、ＭＡｂ Ｍｅ−１６は、ＥＬＩＳＡによって、残基４１ないし５５
【０１４６】
【数１】
および１４１ないし１５０
【０１４７】
【数２】
の間に位置する２つの別々のペプチドと反応することが判明した。より綿密な分析は、これらの２つのペプチドは、ペプチド配列中で下線を施したＡＧＹＲ残基を共有したことを明らかにした。ＮｓｐＡモデル（図２）に従うと、これらの２つの領域は髄膜炎菌外膜の内部に包埋され、予測されるように、これらの領域に対して向けられた抗体は無傷髄膜炎菌細胞に付着しなかった（図３）。
【０１４８】
群ＩおよびＩＩに分類されたＭＡｂはこれらのペプチドのいずれとも反応しなかった。これらの結果は、これらのＭＡｂが立体配座的に制限されたエピトープに対して向けられていることを示唆する。これらのエピトープは、ＰｏｒＡ［Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｄｏｌ．，２７，ｐ．２２７（２０００）；Ｐｅｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，１７，ｐ．２７０２（１９９９）：Ｎｉｅｂｌａ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，１９，ｐ．３５６８（２００１）］およびＯｐｃ蛋白質［Ｃａｒｍｉｎａｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３４，ｐ．６３，（２００１）］で観察された髄膜炎菌外膜蛋白質の生産、精製および処方の間に容易に修飾され、または喪失できた。これらの誤って折り畳まれた蛋白質に対して惹起した抗体は制限された用途のものである。というのは、それらは、しばしば、生物学的に活性が低いからである。これらの立体配座エピトープを位置決定するために、表目−露出のループの異なる組合せが欠失または突然変異した一連の修飾されたＮｓｐＡ蛋白質を構築した（実施例４）。これらの修飾されたＮｓｐＡ蛋白質の立体配座を維持するために、それらをＥ．ｃｏｌｉ膜中で生産した。これらの修飾されたＮｓｐＡ蛋白質と選択されたＭＡｂとの反応性をサイトフルオロメトリーアッセイによって評価した。細胞に対するＭＡｂの付着は、細胞をＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂで標識した後に得られたメジアン蛍光値を対照ＭＡｂについて得られた蛍光値で割って計算された結合指標として表７に示す。１の蛍光値は、無傷細胞の表面に抗体の結合がなかったことを示した。組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞の外膜中でのこれらの修飾されたＮｓｐＡ蛋白質の存在は、ＭＡｂ Ｍｅ−１６を用いるイムノブロットによって確認した。前記したようにＭＡｂ Ｍｅ−１６は、立体配座変化に対して感受性でない直線状エピトープを認識した。このエピトープは表面露出ループ上ではなく、蛋白質の膜貫通部分に位置決定される。イムノブロットは、ＭＡｂ Ｍｅ−１６が全ての修飾されたＮｓｐＡ蛋白質と反応することを明らかとし、組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞がそれらの外膜においてこれらの蛋白質を生産していたことが確認された。
【０１４９】
群ＩＩに分類されるＭＡｂは、４つの表面−露出ループに対する欠失または突然変異いずれかによって誘導された立体配座変化に対して高度に感受性であったＮｓｐＡ蛋白質上のエピトープを認識した。それらの膜において修飾されたＮｓｐＡを生産する組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞へのＭＡｂ Ｍｅ−１０の結合は、４つの表面−露出ループのいずれかにおけるいずれかの修飾に対して高度に感受性であった。この結果は、このＭＡｂによって認識されるエピトープが表面−露出された立体配座であり、このＭＡｂの結合はＮｓｐＡ蛋白質に対する些細な構造的修飾によって妨げることができることを示唆する。ＭＡｂ Ｍｅ−１０について観察される結合特性とは対照的に、ループ４（Ｎｍ１８）の欠失は、組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞へのＭＡｂ Ｍｅ−１２およびＭｅ−１４の結合を妨げなかった。
【０１５０】
ＭＡｂ Ｍｅ−７を例外として、群Ｉに分類されたＭＡｂは、細胞表面に正しく提示されるのにループ２および３双方を必要とした立体配座エピトープに対して向けられる。（Ｎｍ３）に対する突然変異、またはこれらの２つのループのうちの１つの欠失（Ｎｍ１４、Ｎｍ１７）は有意に低下し、あるいは組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞へのＭＡｂ Ｍｅ−１１、Ｍｅ−１７およびＭｅ−１９の結合を完全に妨げた。対照的に、ループ１（Ｎｍ１６）、ループ４（Ｎｍ１８）およびループ１および４（Ｎｍ１９）の欠失は、組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞へのこれらのＭＡｂの結合を有意に低下させなかった。これらの結果は、これらのＭＡｂによって認識されるエピトープは、無傷細胞の表面で正しく提示されるのにループ２および３の双方を必要とすることを示唆する。
【０１５１】
これらの修飾されたＮｓｐＡ蛋白質とＭＡｂ Ｍｅ−７との反応性は、その対応するエピトープがループ３のみに位置することを明瞭に示した。事実、突然変異したＮｓｐＡ蛋白質（Ｎｍ３）、または欠失されたループ３（Ｎｍ１７）が無い蛋白質いずれかを生産する組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞へのＭＡｂ Ｍｅ−７の結合は妨げられなかった。Ｎｍ３ ＮｓｐＡ蛋白質では、１１５および１１８の位置におけるグリシン（Ｇ）およびアスパラギン酸（Ｄ）は、各々、アラニン（Ａ）およびアスパラギン（Ｎ）によって置き換えられた。Ｎｍ３を生産した組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞とＭＡｂ Ｍｅ−７との反応性の欠如は、特異的エピトープがループ３の先端に位置することを示した。
【０１５２】
本実施例で示された結果は少なくともループ２、３および４が細菌の表面に露出していることを示し、かくして、実施例１で示された３−Ｄ ＮｓｐＡモデルは適切であることが確認される。ループ１の表面−露出は確認されなかった。というのは、蛋白質のその部分に対して特異的であるＭＡｂが利用できなかったからである。より重要なことにはこれらのデータは、ほとんどの殺菌性ＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂがループ２および／またはループ３に位置する立体配座エピトープに対して向けられていることを明瞭に示す。誤って折り畳まれたＮｓｐＡ蛋白質でのワクチン接種は、これらの立体配座エピトープに対して向けられた抗体の誘導を妨げ、かくして、この蛋白質の保護能力を低下させ得ると推定することができる。
【０１５３】
表７ それらの外膜において異なる修飾されたＮｓｐＡ蛋白質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞へのＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂの結合の評価
【０１５４】
【表７】
１結合指標は、ＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂで細胞を標識した後に得られたメジアン蛍光値を対照ＭＡｂについて得られた蛍光値で割ったものとして計算した。１の蛍光値は、無傷細胞の表面において抗体の結合がなかったことを示した。低い指標を持つボックスは陰影を付けた。
２それらの外膜において野生型ＮｓｐＡ蛋白質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞
３修飾されたＮｓｐＡ蛋白質（欠失）の免疫
４ＤＭ；ループ３での二重突然変異
＊ｎｄ：測定せず。
【０１５５】
実施例６
本実施例は、細菌細胞から脂質を抽出するのに用いた方法を説明する。
【０１５６】
複合脂質混合物をＥ．ｃｏｌｉ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、およびＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａから抽出して、細菌起源からのリポソーム処方を作製した。
【０１５７】
以下の方法を用いて、実施例７に示したリポソーム処方を作製するのに用いた複合脂質混合物を作製した。
【０１５８】
８％ＣＯ２の存在下で、細菌を３７℃のＢＨＩブロス中で一晩増殖させた（１７５ｒｐｍ）。細胞を遠心によって収集し、ペレットを細胞１グラム当たり６．７ｍｌのメタノールに懸濁させた（湿潤重量）。この細菌懸濁液を、８に調整されたマイクロチッププローブを備えたＳｏｎｉｃ ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ ５００（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて氷浴中で２回音波処理した。次いで、この懸濁液を６５℃にて３０分間加熱した。このインキュベーション時間の後、２容量のクロロホルムを懸濁液に加え、室温にて１時間攪拌した。懸濁液をＷｈａｔｍａｎ Ｎｏ．４フィルターを通して濾過した。濾液をテフロン（登録商標）チューブに移し、０．２容量の生理食塩水（ＮａＣｌ ０．６％（Ｗ／Ｖ））を次いで加えた。遠心の後、上相および界面の沈殿を捨てた。下相下を１容量のクロロホルム：メタノール：生理食塩水（３：４８：４７）で少なくとも４回、あるいは界面にもはや沈殿がなくなるまで抽出した。最終抽出の後、有機下相下のロータリーエバポレーター（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ，Ｂｕｃｈｉ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で乾燥した。乾燥したリン脂質を−８０℃で貯蔵するか、あるいはクロロホルム：メタノール（２：１）の溶液に再懸濁させた。
【０１５９】
実施例７
本実施例は、組換えＮｓｐＡの異なるリポソーム処方への取り込みを説明する。
【０１６０】
リポソームは透析方法を用いて調製した。リポソームは、異なる比率で合わせた、コレステロールを含むまたは含まない、異なる合成（本実施例におけるリスト１参照）または細菌リン脂質で調製した。また、いくつかのリポソーム処方は、６００μｇ／ｍｌのアジュバントモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ，Ａｖａｎｔｉ極性脂質，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）で調製した。ＮｓｐＡ蛋白質をまず９９％エタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）中で沈殿させ、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含有する１ｍｌのＰＢＳ緩衝液中で変性し、１００℃にて１０分間加熱した。溶液を、１５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＮ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧ，Ｓｉｇｍａ）を含有する１ｍｌのＰＢＳ緩衝液で希釈し、室温にて３時間インキュベートした。脂質を丸底ガラスフラスコ中のクロロホルム：メタノール溶液（２：１）に溶解させ、ロータリーエバポレーター（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ，Ｂｕｃｈｉ，Ｓｗｉｚｅｒｌａｎｄ）を用いて乾燥して、容器上の均一なフィルムを達成した。次いで、前記蛋白質−洗剤溶液を脂質フィルムに加え、フィルムが溶解するまで温和に混合した。溶液は、混合後に、外観が僅かに不透明とであった。次いで、溶液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して徹底的に透析して、洗剤を除去し、リポソーム形成を誘導した。透析の後、ステンレス鋼押出しデバイス（Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用い、得られたミルク状溶液を１０００、４００、２００、および１００ｎｍポリカルボネートフィルターを通して順次押し出した。リポソームに取り込まれなかった組換えＮｓｐＡは、４５℃における１５分間の２００００ｇでの遠心によって除去した。リポソーム溶液を４℃にて１時間２５００００ｇで遠心し、ペレット、０．３Ｍスクロースを含有するＰＢＳで懸濁させた。小胞サイズおよび均一性は、サブミクロン粒子アナライザー（モデルＮ４ Ｐｌｕｓ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）での準弾性光散乱によって評価した。この装置を用い、異なる調製物におけるリポソームのサイズはほぼ１００ｎｍであると見積もられた。リポソーム調製物を０．２２μｍ膜を通す濾過によって滅菌し、用いるまで−８０℃で貯蔵した。リポソームに取り込まれた組換え蛋白質の量は、Ｗｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｆｌｕｇｇｅ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８４，１３８：１４１−１４３）によって記載されているように、クロロホルム：メタノール溶液（２：１）でのＮｓｐＡ−リポソーム調製物の蛋白質抽出後にＭｉｃｒｏＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）によって見積もった。
【０１６１】
ゲル濾過および迅速な希釈を、ＮｓｐＡリポソームの形成を誘導するための代替法として用いた。ゲル濾過方法では、ＮｓｐＡ−ＯＧ−ＳＤＳ−脂質溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（カラムサイズ：２×２０ｃｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の頂部に直接的に、またはＰ−６（カラムサイズ；２×２０ｃｍ，Ｂｉｏ Ｒａｄ）サイズ排除クロマトグラフィー／脱塩カラムに適用し、２．５ｍｌ／分の流速にてＰＢＳ緩衝液にて溶出させた。蛋白質および脂質双方を含有する画分をプールし、押出し、遠心し、小胞のサイズを前記したように見積もった。全ての調製物を０．２２μｍ膜を通して滅菌し、用いるまで−８０℃で貯蔵した。
【０１６２】
迅速希釈方法では、脂質フィルムを前記したように丸底ガラスフラスコ中で調製した。この脂質フィルムを、１％トリトンＸ−１００および７５０μｇ／ｍｌのＮｓｐＡ蛋白質を含有するリン酸緩衝化溶液（１０ｍＭ，７０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で溶解させた。次いで、脂質−洗剤−蛋白質溶液を、１１容量のリン酸緩衝液の添加によって、一定攪拌しつつ、滴下（１滴／秒）希釈した。希釈の後、攪拌しつつ、溶液を室温にて３０分間維持した。リポソームに取り込まれなかった組換えＮｓｐＡは遠心によって除去し、リポソーム溶液を前記したように超遠心した。最後に、リポソームペレットを、０．３Ｍスクロースを含有するＰＢＳ緩衝液で懸濁させた。小胞サイズおよび均一性は前記したように見積もった。全ての調製物を０．２２μｍ膜を通して滅菌し、用いるまで−８０℃で貯蔵した。
【０１６３】
リスト１ ＮｓｐＡ−リポソーム調製物を調製するのに用いた合成脂質の部分的リスト
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＬＰＡ）、ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＭＰＡ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＰＰＡ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＳＰＡ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＯＰＡ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＰＯＰＡ）、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジトリデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジペンタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジミリストレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１−ミリストイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−パルミトイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＬＰＧ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＭＰＧ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＰＰＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＳＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＯＰＧ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＰＯＰＧ）、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＬＰＳ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＭＰＳ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＰＰＳ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＳＰＳ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＰＯＰＳ）。
【０１６４】
実施例８
本実施例は、マウスおよびウサギのＮｓｐＡ−リポソーム処方での免疫化を説明する。
【０１６５】
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）の群を、異なるリポソーム調製物に取り込まれた２０μｇの組換えＮｓｐＡまたは、対照としての、蛋白質−フリーリポソーム調製物と共に、１０％水酸化アルミニウムアジュバント（ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌＴＭ ２％：Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に吸着された２０μｇの組換えＮｓｐＡ蛋白質で２週間間隔で３ないし４回筋肉内（ＩＭ）免疫化した。各免疫化に先立って、および最後の注射から２週間後に血液試料を眼窩洞から収集した。血清試料を−２０℃で貯蔵した。
【０１６６】
Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ雌ウサギ（２．５Ｋｇ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、異なるリポソーム処方に取り込まれた１００μｇの組換えＮｓｐＡ蛋白質または、対照としての、蛋白質−フリーリポソーム処方と共に、１０％水酸化アルミニウムアジュバント（ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌＴＭ ２％：Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に吸着された１００μｇの組換えＮｓｐＡ蛋白質で数個の部位にて３週間間隔で３ないし４回ＩＭ免疫化した。血清試料を各免疫化の前および最後の注射から３週間後に収集した。血清試料を−２０℃で貯蔵した。
【０１６７】
実施例９
本実施例は、マウスおよびウサギ血清のＥＬＩＳＡによる分析を説明する。
【０１６８】
免疫化動物の抗体応答を酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。マイクロタイタープレートを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ４．３）中の０．５μｇ／ｍｌの濃度の精製された組換えＮｓｐＡ、または炭酸緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３；３５ｍＭ ＮａＨＣＯ３，ｐＨ９．６）中のｍｌ中のｍｌ当たり０．２５μｇの蛋白質の濃度の髄膜炎菌株６０８Ｂから抽出されたＯＭ調製物いずれかの０．１ｍｌ／ウエルで室温にて一晩コートした。プレートを、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸−緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３７℃にて１時間ブロックし、次いで、ウサギおよびマウス血清の系列希釈と共に１時間インキュベートした。インキュベーション時間後に、プレートを洗浄緩衝液（０．０２％ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。アルカリ性ホスファターゼ−コンジュゲーテッドＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗−マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）または抗−ウサギＩｇＧを３％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に希釈し、この溶液の０．１ｍｌを各ウエルに加えた。３７℃での６０分間のさらなるインキュベーションの後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。１０％ジエタノールアミン（ｐＨ９．６）中のｐ−ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム溶液の１００μｌを各ウエルに加えた。室温での１時間のインキュベーションに続き、ＯＤ４０５ｎｍをＳｐｅｃｔｒａ Ｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読んだ。０．１の読み（λ＝４１０／６３０ｎｍ）がバックグラウンドを差し引いた後に記録された血清希釈は、この血清の力価であると考えられる。組換えＮｓｐＡ蛋白質を含有する処方での免疫化によって惹起された抗血清の全ては、組換えＮｓｐＡに対して強く反応した。加えて、表８に示されるように、全ての免疫化後血清は株６０８Ｂから抽出された髄膜炎菌ＯＭＰに対して反応した。これらの結果は、免疫化によって誘導された抗体の有意な割合が、髄膜炎菌膜に挿入された場合に、天然ＮｓｐＡ蛋白質と反応することを示唆する。２００未満の力価を、蛋白質−フリーリポソーム調製物で免疫化したマウスおよびウサギから収集された血清から記録した（データは示さず）。
【０１６９】
表８ 異なるＮｓｐＡ−リポソーム処方での免疫化後に収集したマウスおよびウサギ抗血清の分析
【０１７０】
【表８】
１マウスおよびウサギを、組換えＮｓｐＡ蛋白質、あるいは実施例８に記載したように、異なるリポソーム処方に取り込んだ組換えＮｓｐＡ蛋白質で免疫化した。
２血清は組換えＮｓｐＡに対し、およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株６０８ＢからのＯＭＰに対して、ＥＬＩＳＡによってテストした。プレ免疫血清は、ＥＬＩＳＡにおいて、組換えＮｓｐＡに対して、およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株６０８ＢからのＯＭＰに対して反応性を示さなかった。ｎｄ、測定せず。
３括弧の間の数字はウサギ識別番号を示す。
４１０％水酸化アルミニウムアジュバントに吸着された組換えＮｓｐＡ蛋白質。
【０１７１】
実施例１０
本実施例は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株の表面のＮｓｐＡ−リポソーム調製物に対して惹起された抗体の接近性を説明する。
【０１７２】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株を、８％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて、０．２５％デキストロースを含有するミューラー−ヒントン（ＭＨ）ブロス中で増殖させて、０．５００（〜１０８ＣＦＵ／ｍｌ）のＯＤ４９０ｎｍを得た。次いで、抗−ＮｓｐＡまたは対照血清の希釈を調整された細菌培養に加え、攪拌しつつ、４℃にて２時間インキュベートした。試料をブロッキング緩衝液［２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸−緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）］中で２回洗浄し、次いで、ブロッキング緩衝液中に希釈された１ｍｌのヤギフルオレセイン（ＦＩＴＣ）−コンジュゲーテッド抗−マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）特異的または抗−ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を加えた。攪拌しつつの室温での６０分間のさらなるインキュベーション時間の後、試料をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液中の０．３％ホルムアルデヒドで４℃にて１８時間固定した。フローサイトメトリー（Ｅｐｉｃｓ（登録商標）ＸＬ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）によって分析するまで、細胞を４℃にて暗所で維持した。フローサイトメトリー分析は、ＮｓｐＡ−リポソーム処方で免疫化したマウスおよびウサギからのＮｓｐＡ−特異的血清に存在する抗体が、１０％水酸化アルミニウムに吸着された組換えＮｓｐＡ蛋白質で免疫化したウサギからの血清に存在するものよりも効率的に髄膜炎菌株６０８Ｂ上のそれらの対応する表面露出エピトープを認識したことを明らかとした（表９）。事実、２５よりも高い結合指標を、１０％水酸化アルミニウムに吸着された組換えＮｓｐＡで免疫化したウサギで記録された１６の結合指標と比較して組換えＮｓｐＡ−リポソーム処方で免疫化したウサギについて記録した。分析した１０，０００髄膜炎菌細胞の８０％を超えたものが、異なるＮｓｐＡ−リポソーム処方で免疫化したマウスからのＮｓｐＡ−特異的血清に存在する抗体で標識されたと判断された。加えて、分析した髄膜炎菌細胞の９０％を超えるものが、異なるリポソーム処方で免疫化したウサギからのＮｓｐＡ−特異的血清に存在する抗体で標識されたと判断された。図４は、２つの異なるＮｓｐＡ−リポソーム処方（Ｅ．ｃｏｌｉ：Ｃｈｏｌ（７：２）＋ＭＰＬＡ；Ｅ．ｃｏｌｉ １００％）での免疫化後に惹起されたＮｓｐＡ−特異的ウサギ抗体が、異なる血清群Ｂ髄膜炎菌株の表面におけるそれらの特異的エピトープを認識できることを示す。これらの観察は、ＮｓｐＡ−リポソーム処方で免疫化したマウスおよびウサギからの血清に存在するＮｓｐＡ−特異的抗体が、無傷髄膜炎菌細胞の表面における接近可能エピトープを認識することを明らかに示す。蛋白質−フリーリポソーム調製物で免疫化したマウスおよびウサギから収集された血清に存在する抗体は髄膜炎菌細胞に付着しなかった（データは示さず）。
【０１７３】
表９ 無傷Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株６０８Ｂ細胞の表面におけるＮｓｐＡ−特異的抗体の付着の評価
【０１７４】
【表９】
１マウスおよびウサギは実施例８に記載されたように組換えＮｓｐＡ−リポソーム処方で免疫化した。
２プールされた血清を１／２０希釈して、サイトフルオロメトリーアッセイを行った。
３分析した１０，０００細胞のうち標識された細胞の％
４結合指標（ＢＩ）は、免疫血清で細胞を標識した後に得られたメジアン蛍光値を、血清なしの対照で得られた蛍光値で割ったものとして計算した。１の蛍光値は、無傷髄膜炎菌細胞の表面において抗体の結合がなかったことを示した。ｎｄ、測定せず。
５１０％水酸化アルミニウムアジュバントに吸着された組換えＮｓｐ蛋白質。
【０１７５】
実施例１１
本実施例は、マウスおよびウサギ血清に存在する抗−ＮｓｐＡ抗体の殺菌活性を説明する。
【０１７６】
細菌をチョコレート寒天プレート上で平板培養し、８％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて１６時間インキュベートし、あるいは８％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて、０．２５％デキストロースを含有するミューラー−ヒントン（ＭＨ）ブロス中で増殖させて、０．６００のＯＤ６２０ｎｍを得た。インキュベーション時間の後、細菌を溶菌緩衝液［ハンクスの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）および１％加水分解カゼイン、ｐＨ７．３］に０．３００のＯＤ４９０ｎｍまで懸濁させ、８×１０４ＣＦＵ／ｍｌまで希釈した。殺菌アッセイは、２５μｌの細菌懸濁液を５０μｌの希釈した加熱−不活化テスト血清と混合することによって行った。この懸濁液を攪拌しつつ（２２５ｒｐｍ）３７℃、８％ＣＯ２にて１５分間インキュベートした。次いで、補体の源としてのウサギまたはヒト血清を２５％の最終濃度まで加え、混合物を攪拌しつつ（２２５ｒｐｍ）３７℃、８％ＣＯ２にてさらに６０分間インキュベートした。インキュベーション時間の最後に、１０μｌのアッセイ混合物をチョコレート寒天プレート上で平板培養することによって、生きた細菌の数を測定した。プレートを８％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて１８ないし２４時間インキュベートした。対照は、免疫化前のマウスから収集した加熱−不活化血清およびウサギ補体と共にインキュベートした細菌からなるものであった。溶解の％は、以下の数学式を用いて決定した：
【０１７７】
【数３】
殺菌抗体は、リポソームに取り込まれた精製された組換えＮｓｐＡ蛋白質で免疫化されたマウスおよびウサギから収集された血清に存在することが判明した（表１０）。重要なことには、殺菌抗体は、１０％水酸化アルミニウムに吸着された組換えＮｓｐＡ蛋白質で免疫化したウサギから収集された血清には存在しなかった。加えて、２つの異なるリポソーム処方（Ｅ．ｃｏｌｉ：Ｃｈｏｌ（７：２）＋ＭＰＬＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ １００％）で免疫化したウサギから収集した血清もまた、３つの異なる血清群Ｂ株に対して殺菌性であることが判明した（表１１）。後者の結果は、ＮｓｐＡ−リポソーム処方での免疫化が交差−殺菌抗体の生産を誘導できることを示す。これらのデータは、リポソームへの精製された組換えＮｓｐＡ蛋白質の取り込みが、天然蛋白質に対する免疫応答をかなり増強したことを示す。
【０１７８】
表１０ 髄膜炎菌株６０８Ｂに対するＮｓｐＡ−リポソーム処方に対して惹起した抗血清の殺菌活性
【０１７９】
【表１０】
１マウスおよびウサギは実施例８に記載されているように組換えＮｓｐＡ−リポソーム処方で免疫化した。
２組換えＮｓｐＡ調製物に対して惹起した抗血清を、髄膜炎菌株６０８Ｂの補体−媒介殺傷を誘導するそれらの能力につきテストした。血清を１／１０希釈した。ｎｄ、測定せず。
３括弧の間の数字はウサギの数を示す。
５１０％水酸化アルミニウムアジュバントに吸着された組換えＮｓｐＡ蛋白質
表１１ 異なるＮｓｐＡ−リポソーム処方での免疫化の後に収集したウサギ抗血清の殺菌活性
【０１８０】
【表１１】
１組換えＮｓｐＡ調製物に対して惹起させたウサギ血清を、４つの髄膜炎菌株の補体−媒介殺傷を誘導するそれらの能力についてテストした。血清は１／１０希釈した。
【０１８１】
実施例１２
本実施例は、異なるリポソーム処方への組換えＮｓｐＡの取り込みを説明する。
【０１８２】
精製された組換えＮｓｐＡ蛋白質（ｒＮｓｐＡ）を無水エタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の添加によってまず沈殿させた。沈殿したｒＮｓｐＡを、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ；Ｓｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含有する１ｍｌのＰＢＳ緩衝液に可溶化させ、１００℃にて１０分間加熱した。ｒＮｓｐＡ溶液を、１５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧ，Ｓｉｇｍａ）を含有する１ｍｌのＰＢＳ緩衝液で希釈し、室温にて３時間インキュベートした。
【０１８３】
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ；Ａｖａｎｔｉ極性脂質，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）、１，２−ジミリストリル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＭＰＳ，Ａｖａｎｔｉ）、およびコレステロール（Ｃｈｏｌ；Ａｖａｎｔｉ）から形成されたリポソーム、およびＤＭＰＣ、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＭＴＡＰ，Ａｖａｎｔｉ）、およびコレステロールから作成されたリポソームは、透析方法（Ｍｕｔｔｉｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｍｉｃｒｏｂ Ｐａｔｈｏｇ．，１８：４２３−３６）を用いて調製した。簡単に述べれば、脂質を丸底ガラスフラスコ中のクロロホルム：メタノール溶液（２：１）に溶解させ、ロータリーエバポレーター（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ，Ｂｕｃｈｉ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて乾燥して、容器上の均一なフィルムを達成した。ｒＮｓｐＡ蛋白質−洗剤溶液を脂質フィルムに加え、フィルムが懸濁するまで軽く混合した。混合物は外観がわずかに不透明になった。次いで、混合物をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して徹底的に透析して、洗剤を除去し、リポソーム形成を誘導した。透析の後、ステンレス鋼押出しデバイス（Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、得られたミルク状懸濁液を１０００、４００、２００および１００ｎｍポリカルボネートフィルターを通して順次押出した。リポソームに取り込まれなかったｒＮｓｐＡは４℃にて２００００×ｇにおける１５分間の遠心によって除去した。リポソーム溶液を４℃にて２５００００×ｇにおいて１時間遠心し、ペレットを０．３Ｍのスクロースを含有するＰＢＳ緩衝液に懸濁させた。小胞サイズおよび均一性は、サブミクロン粒子アナライザー（モデルＮ４ Ｐｌｕｓ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）での準弾性光散乱によって評価した。この装置を用い、異なる調製物におけるリポソームサイズはほぼ１５０ｎｍであると見積もられた。全てのリポソーム調製物は０．２２μｍ膜を通す濾過によって滅菌し、用いるまで＋４℃または−８０℃で貯蔵した。リポソームに取り込まれた組換え蛋白質の量は、Ｗｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｆｌｕｇｇｅ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８４，１３８：１４１−１４３）によって記載されているように、クロロホルム：メタノール溶液（２：１）でのｒＮｓｐＡ−リポソーム調製物の蛋白質抽出後にＭｉｃｒｏＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉ１１．）によって見積もった。
【０１８４】
透析濾過に基づく方法は、ｒＮｓｐＡ−リポソーム処方を作成するための代替方法として用いた。この方法では、脂質を５０℃にて８％ＯＧに懸濁させた。前記したように調製した１容量のｒＮｓｐＡ蛋白質を異なる容量の脂質懸濁液と合わせ、３７℃にて１５分間インキュベートした。脂質／蛋白質混合物をＨＥＰＥＳ緩衝液セーライン（ＨＢＳ）に希釈して、リポソーム小胞の形成を誘導した。ステンレス鋼押出しデバイス（Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用い、得られた懸濁液を２つの重ねた１００ｎｍポリカルボネートフィルターを通した。リポソーム処方は所望の最終容量まで超濾過し、次いで、１０容量のＨＢＳに対して透析濾過して、Ａ／Ｇ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．からの５００，０００公証分子量カットオフカートリッジを用い、遊離蛋白質および洗剤を除去した。最後に、調製物を０．２２μｍ膜を通して滅菌し、小胞サイズおよび均一性は前記したように評価した。全ての調製物は用いるまで＋４℃で貯蔵した。
【０１８５】
実施例１３
本実施例は、ｒＮｓｐＡ−リポソーム処方でのマウスの免疫化を説明する。
【０１８６】
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（４ないし６週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）の群を、１０％水酸化アルミニウムアジュバント（ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌＴＭ ２％：Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に吸着された２０μｇのｒＮｓｐＡ蛋白質で、あるいは異なるリポソーム調製物に取り込まれた２０μｇのｒＮｓｐＡで、３週間間隔で４回筋肉内（ＩＭ）免疫化した。血液試料を各免疫化に先立って、および最後の注射から３週間後に、眼窩洞から収集した。血液試料を−２０℃で貯蔵した。
【０１８７】
実施例１４
本実施例は、ウサギのｒＮｓｐＡ−リポソーム処方での免疫化を説明する。
【０１８８】
Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ雌ウサギ（２．５Ｋｇ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、１０％水酸化アルミニウムアジュバント（ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌＴＭ ２％：Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に吸着させた１００μｇのｒＮｓｐＡ蛋白質で、または異なるリポソーム処方に取り込ませた１００μｇのｒＮｓｐＡ蛋白質で数箇所の部位にて３週間間隔で４回ＩＭ免疫化した。血清試料は、各免疫化の前に、および最後の注射から３週間後に収集した。血清試料は−２０℃で貯蔵した。
【０１８９】
実施例１５
本実施例は、ｒＮｓｐＡ−リポソーム処方で免疫化したウサギからの血清のＥＬＩＳＡによる分析を説明する。
【０１９０】
免疫化した動物の抗体応答を酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。マイクロタイタープレートを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ４．２）中の０．５μｇ／ｍｌの濃度のｒＮｓｐＡ、あるいは炭酸緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３；３５ｍＭ ＮａＨＣＯ３，ｐＨ９．６）中のｍｌ当たり２．５μｇの蛋白質の濃度の髄膜炎菌株６０８Ｂから抽出したＯＭ調製物いずれかの０．１ｍｌ／ウエルで室温にて一晩コートした。プレートを、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸−緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液で３７℃にて３０分間ブロックし、次いで、ウサギ血清の系列希釈と共に１時間インキュベートした。インキュベーション時間の後に、プレートを洗浄緩衝液（０．０２％ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。アルカリ性ホスファターゼ−コンジュゲーテッドＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗−ウサギＩｇＧを、３％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で希釈し、０．１ｍｌのこの溶液を各ウエルに加えた。３７℃における６０分間のさらなるインキュベーションの後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。１０％ジエタノールアミン（ｐＨ９．６）中の１００μｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム溶液を各ウエルに加えた。室温での１時間のインキュベーションに続き、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてＯＤ４０５ｎｍを評価した。ＯＤ値の２倍に対応する吸光度読みがプレ免疫血清につき得られた（λ＝４０５／６３０ｎｍ）血清希釈は、この血清の力価であると考えた。ｒＮｓｐＡ蛋白質を含有する処方で免疫化したウサギから収集した全ての血清は、ＥＬＩＳＡによって評価して、ｒＮｓｐＡと強く反応した（データは示さず）。表１に示すように、髄膜炎菌ＯＭＰに対するより強い力価が、ミョウバンアジュバントに吸着されたｒＮｓｐＡで免疫化したウサギで得られた力価（２１３３３±７３９０）と比較してｒＮｓｐＡ−リポソームで免疫化したウサギから収集した血清で測定された（３１７９７９±１３３７０３；平均±標準偏差）。これらの結果は、免疫化によって誘導された抗体の有意な割合が、髄膜炎菌膜に挿入された場合に、天然ＮｓｐＡ蛋白質と反応することを示唆する。
【０１９１】
表１２ ＥＬＩＳＡ、サイトフルオロメトリーおよび殺菌アッセイ（ＳＢＡ）による異なるｒＮｓｐＡ−リポソーム処方で免疫化したウサギからの血清の分析
【０１９２】
【表１２−１】
【０１９３】
【表１２−２】
１ウサギを、１０％水酸化アルミニウムアジュバントに吸着された１００μｇのｒＮｓｐＡ蛋白質で、あるいは実施例１２に記載したように異なるリポソーム調製物に取り込まれた１００μｇのｒＮｓｐＡで４回筋肉内免疫化した。
２血清は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株６０８Ｂから抽出されたＯＭＰに対してＥＬＩＳＡによってテストした。プレ免疫血清は、ＥＬＩＳＡによって評価して、髄膜炎菌ＯＭＰ調製物に対して反応性を示さなかった。
３血清を１／２０希釈して、実施例１６によって記載したようにサイトフルオロメトリーアッセイを行った。
４結合指標（ＢＩ）は、免疫血清で細胞を標識した後に得られたメジアン蛍光値を、血清無しの対照で得られた蛍光値で割ったものとして計算した。１の蛍光値は、無傷髄膜炎菌細胞の表面で抗体の結合はなかったことを示した。
５分析した１０，０００細胞のうちの標識された細胞の％
６ｒＮｓｐＡ調製物に対して惹起された抗血清を、実施例１７に記載したように、髄膜炎菌株６０８ｂの補体−媒介殺傷を誘導するそれらの能力についてテストした。血清は１／４０希釈した。
７ｒＮｓｐＡ蛋白質を１０％水酸化アルミニウムアジュバントに吸着させた。
【０１９４】
実施例１６
本実施例は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ細胞の表面のＮｓｐＡ−リポソーム処方に対して惹起された抗体の接近性を説明する。
【０１９５】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株は、８％ＣＯ２雰囲気中、攪拌しつつ（２２５ｒｐｍ）にて、０．２５％デキストロースを含有するミューラー−ヒントン（ＭＨ）ブロス中で増殖させて、０．５００（〜１０８ＣＦＵ／ｍｌ）のＣＤ４９０ｎｍを得た。次いで、抗−ＮｓｐＡまたは対照血清の希釈物を調整された細菌培養に加え、攪拌しつつ４℃にて２時間インキュベートした。試料をブロッキング緩衝液［２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸−緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）］で２回洗浄し、次いで、ブロッキング緩衝液中に希釈した１ｍｌのヤギフルオレセイン（ＦＩＴＣ）−コンジュゲーテッド抗−ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を加えた。攪拌しつつの室温での６０分間のさらなるインキュベーション期間の後、試料をＰＢＳ緩衝液中で２回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液中の０．３％ホルムアルデヒドで４℃にて１８時間固定した。フローサイトメトリー（Ｅｐｉｃｓ（登録商標）ＸＬ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）によるそれらの分析まで、細胞を４℃にて暗所に保持した。結合指標（ＢＩ）は、免疫血清で細胞を標識した後に得られたメジアン蛍光値を、血清無しの対照で得られた蛍光値で割ったものとして計算した。１の蛍光値は、無傷髄膜炎菌細胞の表面に抗体の結合がなかったのを示した。フローサイトメトリー分析は、ｒＮｓｐＡ−リポソーム処方で免疫化されたウサギからの血清に存在する抗体は、１０％水酸化アルミニウムに吸着されたｒＮｓｐＡ蛋白質で免疫化されたウサギからの血清に存在するものよりも効果的に髄膜炎菌細胞上のそれらの対応する表面露出エピトープを認識したことを明らかにした（表１２）。事実、ｒＮｓｐＡ−リポソーム処方で免疫化したウサギについて記録された結合指標は、１０％水酸化アルミニウムに吸着されたｒＮｓｐＡで免疫化したウサギについて記録された結合指標（ＢＩ≦２９）よりも一般的に高かった（１１≦ＢＩ≦２６９）。これらの観察は、ｒＮｓｐＡ−リポソーム処方で免疫化されたウサギからの血清に存在するＮｓｐＡ−特異的抗体が、無傷髄膜炎菌細胞の表面の接近可能のエピトープを認識することを明瞭に示す。
【０１９６】
実施例１７
本実施例は、ウサギ血清に存在する抗−ＮｓｐＡ抗体の殺菌活性を説明する。
【０１９７】
細菌を、１％ウマ血清（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含有するＢＨＩ寒天プレート上で平板培養し、８％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて１６時間インキュベートした。０．２５％デキストロースを含有するミューラー−ヒントン（ＭＨ）ブロスを、ＢＨＩ寒天プレートからの細菌で接種し、０．６００のＯＤ６２０ｎｍが得られるまで、８％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて攪拌しつつ（２２５ｒｐｍ）インキュベートした。インキュベーション期間の後、細菌を溶菌緩衝液［ハンクスの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）および０．１％ゼラチン、ｐＨ７．２］に０．３００のＯＤ４９０ｎｍまで懸濁させ、８×１０４ＣＦＵ／ｍｌまで希釈した。殺菌アッセイは、２５μｌの調整された細菌懸濁液を５０μｌの希釈された加熱−不活化ウサギ血清と混合することによって行った。補体の源として、髄膜炎菌細胞についてのその弱い特異的な殺傷活性につき選択された一定容量の２５μｌ（２５％ｖ／ｖ）の正常なヒト血清を加え、混合物を、３７℃、８％ＣＯ２にて、攪拌しつつ（２２５ｒｐｍ）６０分間インキュベートした。インキュベーション期間の最後に、１０μｌのアッセイ混合物をチョコレート寒天プレート上で平板培養することによって、生きた細菌の数を測定した。プレートを８％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて１８ないし２４時間インキュベートした。対照は、免疫化前にウサギから収集した加熱−不活化血清およびヒト補体と共にインキュベートした細菌からなるものであった。溶解の％は以下の数式を用いて決定した：
【０１９８】
【数４】
殺菌抗体は、リポソームに取り込んだｒＮｓｐＡ蛋白質で免疫化されたウサギから収集されたほとんどの血清に存在することが判明した（表１２）。重要なことには、殺菌抗体は、１０％水酸化アルミニウムに吸着させたｒＮｓｐＡ蛋白質で免疫化したウサギから収集した血清には存在しなかった。加えて、２つの異なるリポソーム処方（ＤＭＰＣ：ＤＭＰＳ：Ｃｈｏｌ，ＤＭＰＣ：ＤＭＴＡＰ：Ｃｈｏｌ；７５ｍＭ）で免疫化したウサギから収集した血清もまた、３つの区別される血清群Ｂ株および１つの血清群Ａ株（Ｚ４０６３）に対して殺菌性であることが判明した（表１３）。この後者の結果は、ｒＮｓｐＡ−リポソーム処方での免疫化が、交差−殺菌性抗体の生産を誘導できることを示す。これらのデータは、ｒＮｓｐＡ蛋白質のリポソームへの取り込みが、天然蛋白質に対する機能的免疫応答をかなり増強したことを示す。
【０１９９】
表１３ 異なるｒＮｓｐＡ−リポソーム処方での免疫化の後に収集されたウサギ抗血清の殺菌性活性
【０２００】
【表１３】
１ｒＮｓｐＡ調製物に対して惹起されたウサギ血清を、４つの髄膜炎菌株の補体−媒介殺傷を誘導するそれらの能力についてテストした。血清を１／２０まで希釈した。
【０２０１】
さらに技巧を凝らすことなく、当業者であれば、これまでの記載を用い、本発明を最高限に利用できると考えられる。以下の好ましい特異的な実施形態は、従って、単に説明するものであり、開示の残りを断じて限定するものではないと解釈されるべきである。
【０２０２】
前記および以下の例において、全ての温度は摂氏度で修正されることなく記載され、全ての部および％は特に断りの無い限り重量によるものである。本明細書中で引用された全ての刊行物、特許および出願の、および２００５年３月７日に出願された対応する米国仮出願第６０／６５８，８１５号の全開示はここに引用して援用する。
【０２０３】
これまでの実施例は、これまでの実施例で用いたものに代えて本発明の一般的にまたは具体的に記載された反応体および／または操作条件を置き換えることによって同様な成功をもって反復することができる。
【０２０４】
これまでの記載から、当業者であれば、本発明の必須の特徴を容易に確認することができ、かつその精神および範囲を逸脱することなく、本発明の種々の変形および修飾をなして、それを種々の用法および条件に適合させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０２０５】
【図１】図１は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株６０８Ｂ ＮｓｐＡ蛋白質をコードする遺伝子のヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）配列を表す。
【図２】図２は、髄膜炎菌ＮｓｐＡ蛋白質の３−Ｄモデルを表す。このモデルは、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｄｂ Ｖｉｅｗｅｒ［Ｇｕｅｘ，Ｎ．ａｎｄ ＭＣ Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１８，ｐ．２７１４（１９９７）］を用い、再度折り畳まれたＥ．ｃｏｌｉ ＯｍｐＡ（ＰＤＢ：１ＱＪＰ）の結晶構造から開発された［Ｐａｕｔｓｃｈ，Ａ．ａｎｄ ＧＥ Ｓｃｈｕｌｚ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８，ｐ．２７３（２０００）］。８つの膜貫通β−ストランドは、ペリプラズム側では３つの密なターン（Ｔ）、および細菌の外側表面では４つの表面−露出ループ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４）に連結されている。膜相間と相互作用するアミノ酸残基はボールおよびスティックとして表される。この図は、ベクターＮＴＩスイート７．０（ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．）からの３Ｄ−Ｍｏｌ Ｖｉｅｗｅｒを用いて作成された。
【図３】図３は、２つの血清群Ｂ髄膜炎菌株６０８Ｂ（Ｂ：２ａ：Ｐ１．２：Ｌ３）、ＣＵ３８５（Ｂ：４：Ｐ１．１５：Ｌ３、７、９）、１つの血清群Ａ株Ｆ８２３８（Ａ：４、２１）および１つの血清群Ｃ株Ｃ１１（ＮＴ：Ｐ１．１：Ｌ３、７、９）の表面におけるＮｓｐＡ−特異的ＭＡｂの接近性のフローサイトメトリーによる評価を表す。指数関数的に増殖する髄膜炎菌細胞を、順次、ＮｓｐＡ−特異的または対照ＭＡｂ、続いて、ＦＩＴＣ−コンジュゲーテッド抗−マウス免疫グロブリン二次抗体と共にインキュベートした。各ＭＡｂの殺菌活性は、対照ＣＦＵと比較した、６０分のインキュベーションの後にｍＬ当たりＣＦＵの５０％減少をもたらす抗体の濃度として表される：＋＋、０．５ないし４９μｇの間の抗体／ｍＬ；＋、５０ないし９９μｇの間の抗体／ｍＬ；−＞１００μｇの抗体／ｍＬにおいて殺菌活性なし。
【図４】図４は、間接蛍光フローサイトメトリーによって測定した、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株６０８Ｂ（Ｂ：２ａ：Ｐ１．２）、ＢＳ１９８（Ｂ：ＮＴ：Ｐ−）、Ｓ３４４６（Ｂ．１４：Ｐ１．２３、１４）およびＨ３５５（Ｂ：１５：Ｐ１．１５）に対するポリクローナル抗−ＮｓｐＡウサギ抗血清の結合の評価を示す。ウサギを、異なるリポソーム処方に取り込まれた１００μｇのｒＮｓｐＡで免疫化した。指数関数的に増殖する髄膜炎菌細胞を、順次、予め採血したまたは過剰免疫血清、続いて、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−コンジュゲーテッド抗−ウサギ免疫グロブリン二次抗体と共にインキュベートした。全ての血清は１：２０の希釈でテストした。各グラフにおいて、左側ピークは予め採血したウサギ血清の結合を表し、他方、右側ピークは無傷髄膜炎菌細胞に対する対応する過剰免疫血清の結合を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２を含む少なくとも１つのポリペプチド、またはその断片もしくはアナログと会合したリポソームを含む医薬組成物。
【請求項２】
前記組成物が配列番号２を含む少なくとも１つのポリペプチドと会合したリポソームを含む請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記組成物が、配列番号２からなる少なくとも１つのポリペプチド、またはその断片もしくはアナログと会合したリポソームを含む請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記組成物が、配列番号２からなる少なくとも１つのポリペプチドと会合したリポソームを含む請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
配列番号２を含むポリペプチドの部分、またはその断片もしくはアナログの少なくとも１つのエピトープ保持部分と会合したリポソームを含む医薬組成物。
【請求項６】
前記組成物が、配列番号２を含むポリペプチドの少なくとも１つのエピトープ保持部分と会合したリポソームを含む請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
少なくとも１つの単離されたポリペプチドと会合したリポソームを含む医薬組成物であって、該単離されたポリペプチドが：
（ａ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一性を有するポリペプチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｂ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも８０％同一性を有するポリペプチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｃ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも９５％同一性を有するポリペプチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｄ）配列番号２を含むポリペプチド、または断片またはアナログ；
（ｅ）配列番号２を含むポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を惹起させることができるポリペプチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｆ）配列番号２を含むポリペプチド、またはその断片もしくはアナログのエピトープ保持部分；
（ｇ）Ｎ−末端Ｍｅｔ残基が欠失した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）のポリペプチド；および
（ｈ）分泌アミノ酸配列が欠失した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、または（ｇ）のポリペプチド；
から選択される医薬組成物。
【請求項８】
前記単離されたポリペプチドが：
（ａ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも８０％同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも９５％同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号２を含むポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体を惹起させることができるポリペプチド；
（ｆ）配列番号２を含むポリペプチドのエピトープ保持部分；
（ｇ）Ｎ−末端Ｍｅｔ残基が欠失した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）のポリペプチド；および
（ｈ）分泌アミノ酸配列が欠失した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）のポリペプチド；
から選択される請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
少なくとも１つの単離されたポリヌクレオチドと会合したリポソームを含む医薬組成物であって、該単離されたポリヌクレオチドが：
（ａ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｂ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも８０％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｃ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも９５％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｄ）配列番号２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｅ）配列番号２を含むポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体を惹起させることができるポリヌクレオチドまたはその断片；
（ｆ）配列番号２を含むポリペプチドのエピトープ保持部分をコードするポリヌクレオチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｇ）配列番号１を含むポリヌクレオチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）におけるポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチド；
から選択される医薬組成物。
【請求項１０】
前記単離されたポリヌクレオチドが：
（ａ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも８０％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも９５％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２を含むポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を惹起させることができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２を含むポリペプチドのエピトープ保持部分をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１を含むポリヌクレオチド、またはその断片もしくはアナログ；および
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）に対して相補的であるポリヌクレオチド；
から選択される請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
配列番号２を含む２以上のポリペプチド、またはその断片もしくはアナログを含むキメラポリペプチドと会合したリポソームを含む医薬組成物であって、該ポリペプチドはキメラポリペプチドを形成するように連結されている医薬組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、配列番号２を含む２以上のポリペプチドを含むキメラポリペプチドと会合したリポソームを含み、ここで、該ポリペプチドはキメラポリペプチドを形成するように連結されている請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記リポソームが合成リン脂質、細菌リン脂質および／またはコレステロールから選択される脂質を含む請求項１ないし１２いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記リポソームがＥ．ｃｏｌｉ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａから抽出された細菌脂質を含む請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記リポソームがホスファチジルエーテルおよびエステル、グリセリド、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、およびステロイドから選択される脂質を含む請求項１ないし１２いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記脂質が：
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＬＰＡ）、
ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＭＰＡ）、
１．２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＰＰＡ）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＳＰＡ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＯＰＡ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＰＯＰＡ）、
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、
１，２−ジトリデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、
１，２−ジペンタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、
１，２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、
１，２−ジミリストレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、
１−ミリストイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１−パルミトイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、
１−パルミトイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、
１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＬＰＧ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＭＰＧ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＰＰＧ）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＳＰＧ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＯＰＧ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＰＯＰＧ）、
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＬＰＳ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＭＰＳ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＰＰＳ）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＳＰＳ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）および
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＰＯＰＳ）
から選択される請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記脂質が：
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＭＰＳ）、および
１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＭＴＡＰ）
から選択される請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記リポソームが、さらに、リピドＡ、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、リポ多糖およびサイトカインから選択される少なくとも１つのアジュバントを含む請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記リポソームが０ないし２５モル％のコレステロールを含む請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記組成物が、さらに、医薬上許容されるアジュバントを含む請求項１ないし１８いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
免疫応答を誘導するのに免疫学的に有効量の請求項１ないし１９いずれか１項に記載の医薬組成物を宿主に投与することを含む、該宿主においてＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する免疫応答を誘導する方法。
【請求項２２】
予防または治療量の請求項１ないし１９いずれか１項に記載の医薬組成物をそれを必要とする宿主に投与することを含む、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染を予防および／または治療する方法。
【請求項２３】
予防または治療量の請求項１ないし１９いずれか１項に記載の医薬組成物をそれを必要とする宿主に投与することを含む、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａおよびＮ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａから選択されるナイセリア感染を予防および／または治療する方法。
【請求項２４】
有効量の請求項１ないし１９いずれか１項に記載の医薬組成物を宿主に投与することを含む、宿主において髄膜炎および髄膜炎菌血症を治療または予防する方法。
【請求項２５】
前記宿主が哺乳動物である請求項２０ないし２３いずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記宿主がヒトである請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記宿主が成人のヒトである請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物が免疫化の間の約１ないし６週間隔の間隔で、約０．００１ないし１００μｇ／ｋｇの（抗原／体重）の単位投与形態で投与される請求項２０ないし２６いずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ａ）宿主から生物学的試料を入手し；
ｂ）請求項１ないし１９いずれか１項に記載の医薬組成物に対して反応性である抗体またはその断片を生物学的試料と共にインキュベートして、混合物を形成させ；次いで、
ｃ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの存在を示す混合物中の特異的に結合した抗体または結合した断片を検出する；
ことを含む、生物学的試料中のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ生物を検出する診断方法。
【請求項３０】
ａ）宿主から生物学的試料を入手し；
ｂ）請求項１ないし１９いずれか１項に記載の医薬組成物を生物学的試料と共にインキュベートして、混合物を形成し；次いで、
ｃ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対して特異的な抗体の存在を示す混合物中の特異的に結合した抗原または結合した断片を検出する；
ことを含む、生物学的試料中のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ生物を検出する診断方法。
【請求項３１】
ａ）宿主から生物学的試料を入手し；
ｂ）配列番号２を含むポリペプチドまたはその断片をコードするＤＮＡ配列を有する１以上のＤＮＡプローブを該生物学的試料と共にインキュベートして、混合物を形成し；次いで、
ｃ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ細菌の存在を示す混合物中の特異的に結合したＤＮＡプローブを検出する；
ことを含む、生物学的試料中のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ生物を検出する診断方法。
【請求項３２】
ａ）請求項１ないし１９いずれか１項に記載の医薬組成物に対して反応性である抗体を検出可能な標識で標識し；
ｂ）標識された抗体を宿主に投与し；次いで、
ｃ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの存在を示す宿主中の特異的に結合した標識抗体または標識断片を検出する；
ことを含む、宿主においてＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを検出する診断方法。
【請求項３３】
治療または予防量の前記薬学的組成物を個体に投与することを含む、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染に対して罹患性の個体におけるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの予防または治療措置のための請求項１ないし１９いずれか１項に記載の医薬方法の使用。
【請求項３４】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染の診断の検出用の請求項１ないし１９いずれか１項に記載の薬学的組成物を含むキット。
【請求項１】
配列番号２を含む少なくとも１つのポリペプチド、またはその断片もしくはアナログと会合したリポソームを含む医薬組成物。
【請求項２】
前記組成物が配列番号２を含む少なくとも１つのポリペプチドと会合したリポソームを含む請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記組成物が、配列番号２からなる少なくとも１つのポリペプチド、またはその断片もしくはアナログと会合したリポソームを含む請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記組成物が、配列番号２からなる少なくとも１つのポリペプチドと会合したリポソームを含む請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
配列番号２を含むポリペプチドの部分、またはその断片もしくはアナログの少なくとも１つのエピトープ保持部分と会合したリポソームを含む医薬組成物。
【請求項６】
前記組成物が、配列番号２を含むポリペプチドの少なくとも１つのエピトープ保持部分と会合したリポソームを含む請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
少なくとも１つの単離されたポリペプチドと会合したリポソームを含む医薬組成物であって、該単離されたポリペプチドが：
（ａ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一性を有するポリペプチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｂ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも８０％同一性を有するポリペプチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｃ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも９５％同一性を有するポリペプチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｄ）配列番号２を含むポリペプチド、または断片またはアナログ；
（ｅ）配列番号２を含むポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を惹起させることができるポリペプチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｆ）配列番号２を含むポリペプチド、またはその断片もしくはアナログのエピトープ保持部分；
（ｇ）Ｎ−末端Ｍｅｔ残基が欠失した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）のポリペプチド；および
（ｈ）分泌アミノ酸配列が欠失した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、または（ｇ）のポリペプチド；
から選択される医薬組成物。
【請求項８】
前記単離されたポリペプチドが：
（ａ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも８０％同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも９５％同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号２を含むポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体を惹起させることができるポリペプチド；
（ｆ）配列番号２を含むポリペプチドのエピトープ保持部分；
（ｇ）Ｎ−末端Ｍｅｔ残基が欠失した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）のポリペプチド；および
（ｈ）分泌アミノ酸配列が欠失した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）のポリペプチド；
から選択される請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
少なくとも１つの単離されたポリヌクレオチドと会合したリポソームを含む医薬組成物であって、該単離されたポリヌクレオチドが：
（ａ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｂ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも８０％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｃ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも９５％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｄ）配列番号２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｅ）配列番号２を含むポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体を惹起させることができるポリヌクレオチドまたはその断片；
（ｆ）配列番号２を含むポリペプチドのエピトープ保持部分をコードするポリヌクレオチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｇ）配列番号１を含むポリヌクレオチド、またはその断片もしくはアナログ；
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）におけるポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチド；
から選択される医薬組成物。
【請求項１０】
前記単離されたポリヌクレオチドが：
（ａ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも８０％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２を含む第二のポリペプチドに対して少なくとも９５％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２を含むポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を惹起させることができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２を含むポリペプチドのエピトープ保持部分をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１を含むポリヌクレオチド、またはその断片もしくはアナログ；および
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）に対して相補的であるポリヌクレオチド；
から選択される請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
配列番号２を含む２以上のポリペプチド、またはその断片もしくはアナログを含むキメラポリペプチドと会合したリポソームを含む医薬組成物であって、該ポリペプチドはキメラポリペプチドを形成するように連結されている医薬組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、配列番号２を含む２以上のポリペプチドを含むキメラポリペプチドと会合したリポソームを含み、ここで、該ポリペプチドはキメラポリペプチドを形成するように連結されている請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記リポソームが合成リン脂質、細菌リン脂質および／またはコレステロールから選択される脂質を含む請求項１ないし１２いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記リポソームがＥ．ｃｏｌｉ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａから抽出された細菌脂質を含む請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記リポソームがホスファチジルエーテルおよびエステル、グリセリド、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、およびステロイドから選択される脂質を含む請求項１ないし１２いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記脂質が：
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＬＰＡ）、
ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＭＰＡ）、
１．２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＰＰＡ）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＳＰＡ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＤＯＰＡ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（ＰＯＰＡ）、
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、
１，２−ジトリデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、
１，２−ジペンタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、
１，２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、
１，２−ジミリストレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、
１−ミリストイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１−パルミトイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、
１−パルミトイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、
１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＬＰＧ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＭＰＧ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＰＰＧ）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＳＰＧ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＤＯＰＧ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ＲＡＣ−（１−グリセロール）］（ＰＯＰＧ）、
１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＬＰＳ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＭＰＳ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＰＰＳ）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＳＰＳ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）および
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＰＯＰＳ）
から選択される請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記脂質が：
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＭＰＳ）、および
１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＭＴＡＰ）
から選択される請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記リポソームが、さらに、リピドＡ、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、リポ多糖およびサイトカインから選択される少なくとも１つのアジュバントを含む請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記リポソームが０ないし２５モル％のコレステロールを含む請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記組成物が、さらに、医薬上許容されるアジュバントを含む請求項１ないし１８いずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
免疫応答を誘導するのに免疫学的に有効量の請求項１ないし１９いずれか１項に記載の医薬組成物を宿主に投与することを含む、該宿主においてＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する免疫応答を誘導する方法。
【請求項２２】
予防または治療量の請求項１ないし１９いずれか１項に記載の医薬組成物をそれを必要とする宿主に投与することを含む、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染を予防および／または治療する方法。
【請求項２３】
予防または治療量の請求項１ないし１９いずれか１項に記載の医薬組成物をそれを必要とする宿主に投与することを含む、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａおよびＮ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａから選択されるナイセリア感染を予防および／または治療する方法。
【請求項２４】
有効量の請求項１ないし１９いずれか１項に記載の医薬組成物を宿主に投与することを含む、宿主において髄膜炎および髄膜炎菌血症を治療または予防する方法。
【請求項２５】
前記宿主が哺乳動物である請求項２０ないし２３いずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記宿主がヒトである請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記宿主が成人のヒトである請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物が免疫化の間の約１ないし６週間隔の間隔で、約０．００１ないし１００μｇ／ｋｇの（抗原／体重）の単位投与形態で投与される請求項２０ないし２６いずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ａ）宿主から生物学的試料を入手し；
ｂ）請求項１ないし１９いずれか１項に記載の医薬組成物に対して反応性である抗体またはその断片を生物学的試料と共にインキュベートして、混合物を形成させ；次いで、
ｃ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの存在を示す混合物中の特異的に結合した抗体または結合した断片を検出する；
ことを含む、生物学的試料中のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ生物を検出する診断方法。
【請求項３０】
ａ）宿主から生物学的試料を入手し；
ｂ）請求項１ないし１９いずれか１項に記載の医薬組成物を生物学的試料と共にインキュベートして、混合物を形成し；次いで、
ｃ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対して特異的な抗体の存在を示す混合物中の特異的に結合した抗原または結合した断片を検出する；
ことを含む、生物学的試料中のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ生物を検出する診断方法。
【請求項３１】
ａ）宿主から生物学的試料を入手し；
ｂ）配列番号２を含むポリペプチドまたはその断片をコードするＤＮＡ配列を有する１以上のＤＮＡプローブを該生物学的試料と共にインキュベートして、混合物を形成し；次いで、
ｃ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ細菌の存在を示す混合物中の特異的に結合したＤＮＡプローブを検出する；
ことを含む、生物学的試料中のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ生物を検出する診断方法。
【請求項３２】
ａ）請求項１ないし１９いずれか１項に記載の医薬組成物に対して反応性である抗体を検出可能な標識で標識し；
ｂ）標識された抗体を宿主に投与し；次いで、
ｃ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの存在を示す宿主中の特異的に結合した標識抗体または標識断片を検出する；
ことを含む、宿主においてＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを検出する診断方法。
【請求項３３】
治療または予防量の前記薬学的組成物を個体に投与することを含む、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染に対して罹患性の個体におけるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの予防または治療措置のための請求項１ないし１９いずれか１項に記載の医薬方法の使用。
【請求項３４】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染の診断の検出用の請求項１ないし１９いずれか１項に記載の薬学的組成物を含むキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００８−５３３０１６（Ｐ２００８−５３３０１６Ａ）
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５００８３６（Ｐ２００８−５００８３６）
【出願日】平成１８年３月７日（２００６．３．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００８０５２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９６７０１
【国際公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【出願人】（５０７２６７３１１）アイディー バイオメディカル コーポレイション オブ ケベック シー．オー．ビー． アズ グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ノース アメリカ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月７日（２００６．３．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００８０５２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９６７０１
【国際公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【出願人】（５０７２６７３１１）アイディー バイオメディカル コーポレイション オブ ケベック シー．オー．ビー． アズ グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ノース アメリカ (2)
【Ｆターム（参考）】
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