薬物融合体および複合体
本発明は、血清半減期が改良された薬物融合体に関する。これらの融合体および複合体はポリペプチド、免疫グロブリン（抗体）単一可変ドメインならびにＧＬＰおよび／またはエキセンディン分子を含む。本発明はさらに、このような薬物融合体および複合体を含む使用、製剤、組成物およびデバイスに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清半減期が改良された薬物融合体および複合体に関する。これらの融合体および複合体は免疫グロブリン（抗体）単一可変ドメインとＧＬＰ分子および／またはエキセンディン分子を含む。本発明はさらに、このような薬物融合体および複合体を含む使用、製剤、組成物およびデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
治療および／または診断目的に有用であり得る、活性を有する多くの薬物は、投与されると急速に身体から排出されるので、有用性が限定されている。例えば、治療上有用な活性を有する多くのポリペプチドは、腎臓を介して循環から速やかに除去される。従って、望ましい治療効果を得るためには、大量を投与しなければならない。改良された薬物動態特性を有する改良された治療薬および診断薬の必要がある。
【０００３】
このような、体内もしくは全身循環中の半減期が短い薬物種の一つが、グルカゴン様ペプチド１などのインクレチンホルモン、またはペプチドＹＹ、ならびにエキセンディン、例えばエキセンディン−４である。
【０００４】
グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）−１は、グルコース依存性インスリン分泌促進およびグルカゴン分泌抑制作用、膵臓β細胞に対する栄養作用、ならびに消化管の分泌および運動性に対する抑制作用を有するインクレチンホルモンであるが、それらの作用が相まって血漿グルコースを低下させ、血糖の変動幅を小さくする。さらにＧＬＰ−１は、その満腹感を高める能力によって、食物摂取を減らし、それによって体重増加を抑え、体重減少を引き起こすことさえある。以上を考え合わせると、これらの作用はＧＬＰ−１に独特な特徴を与え、特に、血糖降下作用のグルコース依存性は重症高血糖のリスクを最小限にするはずであるので、抗糖尿病薬として極めて望ましいと考えられる。しかしながら、その薬物動態／薬力学的特性は、天然ＧＬＰ−１が治療上有用ではないというものである。従って、ＧＬＰ−１は連続投与すれば最も効果的であるが、１回の皮下注射での持続時間は短い。ＧＬＰ−１はin vivoで酵素分解を極めて受けやすく、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断の関連がおそらく最も高いと思われるが、それはこれが急速に起こって、非インスリン分泌性の代謝産物を生じるためである。従って、その代謝安定性および薬物動態／薬力学的特性に影響を及ぼす要因に関する理解に基づいた、ＧＬＰ−１の治療上の可能性を活用するための方策が、集中的な研究の焦点となっている。
【０００５】
生物活性をなお維持しながらその分解を遅くするように、ペプチダーゼを阻害するか、またはＧＬＰ−１を修飾することを試みて鋭意研究が行われてきた。国際公開第ＷＯ０５／０２７９７８号は、持続性の作用特性を有するＧＬＰ−１誘導体を開示している。国際公開第ＷＯ０２／４６２２７号は、ＧＬＰ−１または類似体と融合したポリペプチド（例えば、アルブミン）を含む異種融合タンパク質を開示している（これらの類似体の開示は、本発明で使用することができるＧＬＰ−１類似体の例として、引用することにより本明細書の一部とされる）。国際公開第ＷＯ０５／００３２９６号、同第ＷＯ０３／０６００７１号、同第ＷＯ０３／０５９９３４号は、ＧＬＰ−１がこのホルモンの半減期を延長するためにアルブミンと融合されている、アミノ融合タンパク質を開示している。
【０００６】
しかしながら、これらの努力にもかかわらず、長時間持続する活性ＧＬＰ−１は作製されていない。
【０００７】
従って、特に糖尿病および肥満の分野において、糖尿病および肥満の治療に特に可能性のあるインスリン分泌促進作用を同様に有する、改良されたＧＬＰ−１ペプチド、またはエキセンディン−４もしくはＰＹＹなどの他の薬剤の必要性が大いにある。従って、それらの低い毒性および治療上の利点を維持しながらin vivoでより長い作用時間をもたらすようにＧＬＰ−１、エキセンディン−４および他のインスリン分泌促進ペプチドを修飾する必要がある。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、（ａ）（ｂ）との融合体または複合体として存在する、例えばエキセンディン−４、ＰＹＹ（例えば、３−２６ＰＹＹ）またはＧＬＰ−１（例えば、ＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ突然変異体）であり得るインスリン分泌促進薬もしくは分子、またはインクレチン薬もしくは分子と、（ｂ）（ｉ）ＤＯＭ ７ｈ−１４ドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ ７ｈ−１４のアミノ酸配列は図１（ｈ）：配列番号８に示される）、（ｉｉ）ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０のアミノ酸配列は図１（ｏ）：配列番号２６に示される）またはＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ ｄＡｂの配列から４個までのアミノ酸変異を有するｄＡｂ、および（ｉｉｉ）ＤＯＭ ７ｈ−１１−１５ ｄＡｂ（ＤＯＭ ７ｈ−１１−１５のアミノ酸配列は図１（ｐ）：配列番号２７に示される）または（ｉｖ）ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ Ｒ１０８Ｃドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０のアミノ酸配列は図１（ｒ）に示される）から選択される、血清アルブミンと特異的に結合するｄＡｂ（ＡｌｂｕｄＡｂ ＴＭ）とを含む、またはそれらからなる融合体または複合体である組成物を提供する。
【０００９】
また、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬、例えば、エキセンディン−４および／またはＧＬＰ−１、またはＰＹＹと、ｄＡｂ、例えば、ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ、ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ ｄＡｂ、ＤＯＭ ７ｈ−１１−１５ ｄＡｂとを連結するアミノ酸リンカーまたは化学リンカーが場合により存在してもよい。リンカーは例えば、ヘリカルリンカー、例えば、図１（ｋ）：配列番号１１に示される配列のヘリカルリンカーであってよく、または例えば図１（ｌ）：配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するｇｌｙ−ｓｅｒリンカーであってもよい。
【００１０】
ある実施形態では、本発明の融合体（または複合体）は、さらなる分子、例えばさらなるペプチドまたはポリペプチドを含むことができる。
【００１１】
インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬（例えば、エキセンディンおよび／またはＧＬＰ−１）は、ｄＡｂのＮ末端またはＣ末端のいずれかとの融合体（または複合体）として存在することができる。
【００１２】
ある実施形態では、本発明は、以下のもの：
（ａ）２ｘＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１４、アミノ酸配列は図１（ａ）：配列番号１に示される）、
（ｂ）エキセンディン４（Ｇ４Ｓリンカー）３ ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１５、アミノ酸配列は図１（ｂ）：配列番号２に示される）、
（ｃ）エキセンディン４−ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１６、アミノ酸配列は図１（ｃ）：配列番号３に示される）、
（ｄ）エキセンディン４，ヘリカルリンカー，ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１７、アミノ酸配列は図１（ｄ）：配列番号４に示される）、
（ｅ）ＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ（Ｇ４Ｓリンカー）３ ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１８、アミノ酸配列は図１（ｅ）：配列番号５に示される）、
（ｆ）ＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１９、アミノ酸配列は図１（ｆ）：配列番号６に示される）、
（ｇ）ＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ，ヘリカルリンカー，ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１２０、アミノ酸配列は図１（ｇ）：配列番号７に示される）、
（ｈ）エキセンディン４，（Ｇ４Ｓ）３，リンカーＤＯＭ７ｈ−１４−１０融合体（ＤＭＳ７１３９、アミノ酸配列は図１（ｍ）：配列番号２４に示される）、
（ｉ）エキセンディン４，（Ｇ４Ｓ）３，リンカーＤＯＭ７ｈ−１１−１５融合体（ＤＭＳ７１４３、アミノ酸配列は図１（ｎ）：配列番号２５に示される）
から選択される融合体分子を含む、またはそれらからなるポリペプチドを提供する。
【００１３】
本発明はまた、上記のアミノ酸配列、すなわち、配列番号１〜７および配列番号２４〜２５で示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、またはそれからなる複合体分子を提供する。
【００１４】
ある実施形態では、本発明は、リシン（ＰＹＹの１０番の位置に導入）および４リピートＰＥＧリンカーを介して、Ｃ末端でアミド化されたＰＹＹ３−３６と複合体化されたＤＯＭ ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ＡｌｂｕｄＡｂである複合体分子を含む、またはそれからなるポリペプチドを提供する。このペプチド複合体のアミノ酸配列および構造は図１４に示される。
【００１５】
本発明はまた、エキセンディン４，（Ｇ４Ｓ）３，リンカーＤＯＭ７ｈ−１４−１０融合体（ＤＭＳ７１３９、アミノ酸配列は図１（ｍ）：配列番号２４に示される）のアミノ酸配列、またはＤＭＳ７１３９のアミノ酸配列（アミノ酸配列は図１（ｍ）に示される）から４個までのアミノ酸変化を有する融合体もしくは複合体分子を含む、またはそれからなるポリペプチドを提供する。
【００１６】
ＤＯＭ ７ｈ−１４は、血清アルブミンと結合するヒト免疫グロブリン単一可変ドメインすなわちｄＡｂ（Ｖｋ）であり、そのアミノ酸配列は図１（ｈ）：配列番号８に示される。図１（ｈ）：配列番号８に示されるアミノ酸配列では、ＤＯＭ ７ｈ−１４ ｄＡｂのＣＤＲ領域が下線で示されている。
【００１７】
ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０は、血清アルブミンと結合するヒト免疫グロブリン単一可変ドメインすなわちｄＡｂであり、そのアミノ酸配列は図１（ｏ）：配列番号２６に示される。図１（ｏ）：配列番号２６に示されるアミノ酸配列では、ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ ｄＡｂのＣＤＲ領域が下線で示されている。
【００１８】
ＤＯＭ ７ｈ−１１−１５は、血清アルブミンと結合するヒト免疫グロブリン単一可変ドメインすなわちｄＡｂであり、そのアミノ酸配列は図１（ｐ）：配列番号２７に示される。図１（ｐ）：配列番号２７に示されるアミノ酸配列では、ＤＯＭ ７ｈ−１１−１５ ｄＡｂのＣＤＲ領域が下線で示されている。
【００１９】
本明細書において「融合体」とは、第１の部分としての、血清アルブミンと結合するＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂまたはＤＯＭ７ｈ−１４−１０ ｄＡｂまたはＤＯＭ ７ｈ−１１−１５ ｄＡｂと、第２の部分としての、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬とを含む融合タンパク質を表す。血清アルブミンと結合するｄＡｂおよび薬物または薬剤は単一の連続するペプチド鎖の別個の部分として存在する。第１の部分（ｄＡｂ）と第２の部分（インクレチン薬もまたはインスリン分泌促進薬）は、ペプチド結合を介して互いに直接結合させることもできるが、適当なアミノ酸リンカー、またはペプチドもしくはポリペプチドリンカーを介して結合させることもできる。適当であれば、別の部分（付加的部分）、例えば、ペプチドもしくはポリペプチド（例えば、第３、第４の部分）、および／またはリンカー配列が存在してもよい。第１の部分は、第１の部分のＮ末端、Ｃ末端の位置、または内部に存在することができる。ある実施形態では、融合タンパク質は、１つまたは２以上（例えば、１〜約２０）のｄＡｂ部分を含む。
【００２０】
本明細書において「複合体」とは、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬、例えば、ＧＬＰ−１、エキセンディン−４、ＰＹＹ、例えば、ＰＹＹ３−３６が共有結合または非共有結合されている、血清アルブミンと結合するｄＡｂを含む組成物を表す。インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬は、ｄＡｂに直接、または適当なリンカー部分、例えば、ＰＥＧリンカー部分を介して間接的に共有結合させることができる。この薬物または薬剤は、任意の適当な位置で、例えば、アミノ末端、カルボキシ末端または適当なアミノ酸側鎖（例えば、リジンのεアミノ基、またはシステインのチオール基）を介してｄＡｂに結合させることができる。あるいはまた、該薬物または薬剤はｄＡｂに直接的（例えば、静電相互作用、疎水性相互作用）、または間接的に（例えば、相補的結合相手の非共有結合によって（例えば、ビオチンとアビジン）、この場合、結合相手の一方が薬物または薬剤に共有結合され、その相補的結合相手がｄＡｂと共有結合されている）非共有結合させることもできる。
【００２１】
本発明はさらに、本発明の複合体または融合体、例えば、ＤＡＴ０１１４、ＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６、ＤＡＴ０１１７、ＤＡＴ０１１８、ＤＡＴ０１１９およびＤＡＴ１２０、ＤＭＳ７１３９またはＤＭＳ７１４３またはＤＭＳ７１４３のうちいずれかの（実質的に）純粋なモノマーを提供する。ある実施形態では、それは少なくとも純度９８、９９、９９．５％または１００％のモノマーである。
【００２２】
本発明はまた、本明細書に記載の融合体をコードする核酸、例えば、ＤＡＴ０１１４、ＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６、ＤＡＴ０１１７、ＤＡＴ０１１８、ＤＡＴ０１１９およびＤＡＴ１２０、ＤＭＳ７１３９またはＤＭＳ７１４３をコードする核酸を提供し、ここで、その核酸配列は図２（配列番号１３〜３２）に示される。また、これらの核酸を含む宿主細胞も提供される。
【００２３】
本発明はまた、ＤＯＭ７ｈ−１４（配列番号８）、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（配列番号２６）、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５（配列番号２７）およびＤＯＭ ７ｈ−１４−１０Ｒ１０８Ｃ（配列番号４２）から選択される、血清アルブミンと結合するｄＡｂ（ＡｌｂｕｄＡｂ(商標））をコードするアミノ酸も提供する。
【００２４】
本発明はまた、ＤＯＭ７ｈ−１４（配列番号２３）、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（配列番号３１）、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５（配列番号３２）およびＤＯＭ ７ｈ−１４−１０Ｒ１０８Ｃ（配列番号４４）から選択される、血清アルブミンと結合するｄＡｂをコードする核酸を提供する。
【００２５】
本発明はさらに、本発明の融合体を作製する方法を提供し、その方法は、本発明の融合体をコードする組換え核酸および／または構築物を含む宿主細胞を、該組換え核酸の発現に適した条件下で維持し、それによって融合体が産生されることを含む。
【００２６】
本発明はまた、本発明の融合体または複合体を含む組成物（例えば、医薬組成物）も提供する。
【００２７】
本発明はまた、本明細書に記載されているものなどの疾患または障害、例えば、高血糖症、耐糖能異常、β細胞不全、糖尿病（例えば、１型または２型糖尿病または妊娠糖尿病）もしくは肥満などの代謝性疾患、または過食を特徴とする疾患を有する個体を処置する方法を提供し、例えば、本発明は、例えばプラダーウィリィ症候群において食欲を抑制するために使用することができ、その方法は、該個体に治療上有効な量の本発明の融合体または複合体を投与することを含む。
【００２８】
他の代謝障害には、限定されるものではないが、インスリン抵抗性、インスリン欠乏、高インスリン血症、高血糖症、異脂肪血症、高脂血症、高ケトン血症、高血圧症、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、腎不全、神経障害（例えば、自律神経障害、副交感神経神経障害および多発性神経障害）、網膜症、白内障、代謝障害（例えば、インスリンおよび／またはグルコース代謝障害）、内分泌障害、肥満、体重減少、肝臓障害（例えば、肝疾患、肝硬変、および肝臓移植関連障害）、およびこれらの疾患または障害と関連した症状が含まれる。
【００２９】
さらに、本発明の化合物を用いて予防または治療することができる、糖尿病関連症状には、限定されるものではないが、高血糖症、肥満、糖尿病性網膜症、単神経障害、多発性神経障害、アテローム性動脈硬化、潰瘍、心疾患、脳卒中、貧血、壊疽（例えば、足および手の壊疽）、性的不全、感染症、白内障、腎機能低下、自律神経系の不調、白血球機能不全、手根管症候群、デュピュイトラン拘縮、および糖尿病性ケトアシドーシスが含まれる。
【００３０】
本発明はまた、高血糖に関連する疾患を治療または予防する方法を提供し、その方法は、本発明の複合体もしくは融合体および／または医薬組成物の少なくとも一用量を患者または対象に投与することを含む。
【００３１】
本発明はさらに、本発明の複合体もしくは融合体を用いて、患者のインスリン応答性を調節する方法、ならびに細胞によるグルコース取り込みを増加させる方法、および細胞のインスリン感受性を調節する方法に関する。また、患者において、インスリンの合成および放出を刺激する方法、インスリン取り込みに対する脂肪、筋肉または肝組織の感受性を高める方法、グルコース取り込みを刺激する方法、消化過程を遅くする方法、またはグルカゴン分泌を遮断する方法も提供され、その方法は、該患者に本発明の融合体もしくは複合体を投与することを含み、例えば、少なくとも一用量の本発明の薬物複合体もしくは融合体および／または医薬組成物を投与することを含む。
【００３２】
本発明の融合体もしくは複合体および／または医薬組成物は、単独で投与することもできるし、あるいは他の分子または部分、例えば、ポリペプチド、治療用タンパク質および／または分子（例えば、インスリン、ならびに／または患者のインスリン感受性、体重、心疾患、高血圧症、神経障害、細胞代謝および／もしくはグルコース、インスリンもしくは他のホルモンレベルを調節する他のタンパク質（抗体を含む）、ペプチドまたは小分子）と併用投与することもできる。特定の実施形態では、本発明の複合体もしくは融合体は、インスリン（またはインスリン誘導体、類似体、融合タンパク質または分泌促進薬）と併用投与される。
【００３３】
本発明はまた、上記の、例えば、高血糖症、糖尿病（１型もしくは２型または妊娠糖尿病）または肥満などの代謝性疾患のうちいずれかのような疾患または障害の処置用薬剤の製造のための、本発明の複合体または融合体の使用も提供する。
【００３４】
本発明はまた、治療、診断または予防に用いる、本明細書に記載の融合体または複合体の使用に関する。
【００３５】
本発明の融合体または複合体、例えば、融合体のｄＡｂ成分は、例えば、ＰＥＧ基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体または少なくともそのトランスフェリン結合部分、抗体Ｆｃ領域を付加することによって、または抗体ドメインと複合体化することによって、より大きな流体力学的サイズを持たせて半減期をさらに延長するように、さらに構成することができる。例えば、血清アルブミンと結合するｄＡｂは、抗体の、より大きい抗原結合フラグメントとして構成することができる（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ＩｇＧ、ｓｃＦｖとして構成することができる）。
【００３６】
本開示を通じて記載される本発明の他の実施形態において、本発明の融合体に「ｄＡｂ」を使用する代わりに、当業者は、血清アルブミンと結合する、ｄＡｂのＣＤＲ、例えば、ＤＯＭ ７ｈ−１４、ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０またはＤＯＭ ７ｈ−１１−１５のＣＤＲ（例えば、適当なタンパク質スキャフォールドまたは骨格（例えば、アフィボディー、ＳｐＡスキャフォールド、ＬＤＬ受容体クラスＡドメインまたはＥＧＦドメイン）上にグラフトされたＣＤＲ）を含むドメインを使用可能であることも意図される。従って、本開示は全体として、ｄＡｂの代わりにこのようなドメインの開示を与えると解釈されるべきである。
【００３７】
ある実施形態では、本発明は、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬と、二重特異性リガンドまたは多重特異性リガンド（該リガンドは、血清アルブミンと結合する本発明の第１のｄＡｂ、例えば、ＤＯＭ ７ｈ−１４、ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０またはＤＯＭ ７ｈ−１１−１５と、第１のｄＡｂと同じまたは異なる結合特異性を有する第２のｄＡｂとを含み、さらに多重特異性リガンドの場合には、場合によりさらなるｄＡｂを含んでもよい）とを含む本発明の融合体または複合体を提供する。第２のｄＡｂ（またはさらなるｄＡｂ）は、場合により、例えば、ＦｇＦｒ １ｃまたはＣＤ５標的などの異なる標的と結合し得る。
【００３８】
よって、一態様において、本発明は、非経口投与、例えば、皮下注射、筋肉注射もしくは静脈注射による送達、吸入、鼻腔送達、経粘膜送達、経口送達、患者の消化管への送達、直腸送達または眼内送達のための、本発明の融合体または複合体を提供する。一態様において、本発明は、皮下注射による送達、吸入、静脈送達、鼻腔送達、経粘膜送達、経口送達、患者の消化管への送達、直腸送達または眼内送達用の薬剤の製造における、本発明の融合体または複合体の使用を提供する。
【００３９】
一態様において、本発明は、皮下注射、肺送達、静脈送達、鼻腔送達、経粘膜送達、経口送達、患者の消化管への送達、直腸送達または眼内送達による、患者への送達方法を提供し、該方法は、薬学上有効な量の本発明の融合体または複合体を患者に投与することを含む。
【００４０】
一態様において、本発明は、本発明の融合体または複合体を含む、経口製剤、注射製剤、吸入製剤、ネブライザー製剤または眼用製剤を提供する。該製剤は、錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤またはシロップ剤であり得る。一態様において、該組成物は、例えば、肥満治療用の減量飲料として市販される飲料として、経口投与することができる。一態様において、本発明は、患者に対する直腸送達用の製剤を提供し、該製剤は、例えば、坐剤として提供することができる。
【００４１】
ＧＬＰ−１化合物の非経口投与用組成物は、例えば、国際公開第ＷＯ０３／００２１３６（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように調製することができる。
【００４２】
ある種のペプチドの鼻腔投与用組成物は、例えば、欧州特許第２７２０９７号(Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ/ｓ)、または国際公開第ＷＯ９３／１８７８５号（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように調製することができる。
【００４３】
「対象」または「個体」とは、本明細書では、限定されるものではないが、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ，ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のウシ科、ヒツジ科、ウマ科、イヌ科、ネコ科、齧歯類またはネズミ種を含む哺乳類などの動物を含むと定義される。
【００４４】
本発明はまた、本発明の組成物（例えば、本発明の複合体もしくは融合体）を対象（例えば、患者）に投与する際に用いるための、組成物（例えば、本発明の複合体または融合体）、薬物送達デバイスおよび場合により使用説明書を含むキットを提供する。組成物（例えば、複合体または融合体）は、凍結乾燥製剤などの製剤として提供することができる。ある実施形態において、薬物送達デバイスは、注射器、吸入器、鼻腔内または眼用投与デバイス（例えば、噴霧器、点眼器または点鼻器）、および無針注射器からなる群から選択される。
【００４５】
本発明の組成物（例えば、複合体または融合体）は、保存のために凍結乾燥し、使用前に適当な担体で再構成することができる。任意の適当な凍結乾燥法（例えば、噴霧乾燥、固形物乾燥）および／または再構成法を使用することができる。当業者ならば、凍結乾燥および再構成が様々な程度の抗体活性の損失につながる可能性があること、そして使用レベルはそれを補うように調整しなければならないことが分かるであろう。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される凍結乾燥組成物（例えば、薬物複合体、薬物融合体）を含む組成物を提供する。好ましくは、凍結乾燥組成物（例えば、薬物複合体、薬物融合体）は、再び水和し際にその活性（例えば、血清アルブミンに対する結合活性）の損失は、約２０％以下、または約２５％以下、または約３０％以下、または約３５％以下、または約４０％以下、または約４５％以下、または約５０％以下である。活性は、凍結乾燥前にその組成物の効果をもたらすのに必要とされる組成物（例えば、薬物複合体、薬物融合体）の量である。例えば、望ましい血清濃度を達成し、望ましい期間それを維持するのに必要とされる複合体または融合体の量である。組成物（例えば、薬物複合体、薬物融合体）の活性は、凍結乾燥前に任意の適当な方法を用いて測定することができ、活性の損失量を測定するためには、再水和後に同じ方法を用いて活性を測定することができる。
【００４６】
本発明はまた、本発明の融合体または複合体を含む徐放性製剤を提供し、このような徐放性製剤は、本発明の融合体または複合体を、例えば、ヒアルロン酸、マイクロスフェアまたはリポソーム、および他の薬学医上または薬理学上許容される担体、賦形剤および／または希釈剤と組み合わせて含むことができる。このような徐放性製剤は、例えば、坐剤の形であり得る。
【００４７】
一態様において、本発明は、本発明の融合体または複合体と、薬学上または薬理学上許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００４８】
本発明はまた、Ｃ末端にアミノ酸配列ＡＭＡまたはＡＷＡを有する改変されたリーダー配列（このリーダー配列は野生型配列ではない）を提供する。この改変されたリーダー配列は、ＯｍｐＡ−ＡＭＡもしくは−ＡＷＡ；またはＯｍｐＴ−ＡＭＡもしくは−ＡＷＡ；またはＧＡＳ−ＡＭＡもしくは−ＡＷＡであり得る。
【００４９】
改変されたリーダー配列は宿主細胞における異種ポリペプチドの発現のために使用することができる。異種ポリペプチドはインスリン分泌促進薬またはインクレチン薬を含む、またはそれからなり得る。異種ポリペプチドは、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、例えば血清アルブミンと結合するｄＡｂを含む、またはそれからなり得る。
【００５０】
改変されたリーダーによる発現のための異種ポリペプチドは、（ａ）（ｂ）との融合体または複合体として存在する、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬と、（ｂ）ｄＡｂとを含むかまたはそれらからなる融合体または複合体組成物であって、(ａ)は、（ｂ）ｄＡｂ、例えば、血清アルブミンと結合し、図１（ｈ）（配列番号８）に示されるアミノ酸配列を有するＤＯＭ ７ｈ−１４ Ｖｋドメイン抗体（ｄＡｂ）、図１（ｏ）（配列番号２６）に示されるアミノ酸配列を有するＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ ｄＡｂ、および図１（ｐ）（配列番号２７）に示されるアミノ酸配列を有するＤＯＭ ７ｈ−１１−１５ ｄＡｂから選択されるｄＡｂとの融合体または複合体として存在する、融合体または複合体組成物であり得る。
【００５１】
また、改変されたリーダー配列は、
（ａ）２ｘＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１４、アミノ酸配列は図１（ａ）：配列番号１に示される）、
（ｂ）エキセンディン４（Ｇ４Ｓリンカー）３ ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１５、アミノ酸配列は図１（ｂ）：配列番号２に示される）、
（ｃ）エキセンディン４−ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１６、アミノ酸配列は図１（ｃ）：配列番号３に示される）、
（ｄ）エキセンディン４，ヘリカルリンカー，ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１７、アミノ酸配列は図１（ｄ）：配列番号４に示される）、
（ｅ）ＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ（Ｇ４Ｓリンカー）３ ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１８、アミノ酸配列は図１（ｅ）：配列番号５に示される）、
（ｆ）ＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１９、アミノ酸配列は図１（ｆ）：配列番号６に示される）、
（ｇ）ＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ，ヘリカルリンカー，ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１２０、アミノ酸配列は図１（ｇ）：配列番号７に示される）、
（ｈ）エキセンディン４，（Ｇ４Ｓ）３，リンカーＤＯＭ７ｈ−１４−１０融合体（ＤＭＳ７１３９、アミノ酸配列は図１（ｍ）：配列番号２４に示される）、
（ｉ）エキセンディン４，（Ｇ４Ｓ）３，リンカーＤＯＭ７ｈ−１１−１５融合体（ＤＭＳ７１４３、アミノ酸配列は図１（ｎ）：配列番号２５に示される）
から選択される融合体を含む、またはそれからなる異種ポリペプチドの発現のために使用可能である。
【００５２】
また、改変されたリーダーにより発現される異種ポリペプチドは、上記のアミノ酸配列、すなわち、配列番号１〜７および配列番号２４〜２５で示されるアミノ酸配列との複合体分子を含む、またはそれからなることもできる。
【００５３】
また、改変されたリーダーにより発現される異種ポリペプチドは、エキセンディン４，（Ｇ４Ｓ）３，リンカーＤＯＭ７ｈ−１４−１０融合体（ＤＭＳ７１３９、アミノ酸配列は図１（ｍ）：配列番号２４に示される）のアミノ酸配列、またはＤＭＳ７１３９のアミノ酸配列（アミノ酸配列は図１（ｍ）に示される）から４個までのアミノ酸変化を有する融合体もしくは複合体分子を含む、またはそれからなることもできる。
【００５４】
発現のための宿主細胞は、微生物宿主細胞、原核生物宿主細胞、グラム陰性菌宿主細胞または大腸菌宿主細胞であり得る。
【００５５】
また、（ｉ）インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬と、（ｉｉ）インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬からインスリン分泌促進薬またはインクレチン薬のＮ末端のアミノ酸が２個少ないものとの混合物を作製する方法（プロセス）も提供され、該方法は、宿主細胞において該インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬の１番の位置の前での切断と３番の位置の前での切断を生じるリーダー配列を用いて（ｉ）を発現させるステップを含む。該インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬は、例えば、上記で定義されたような血清アルブミンと結合するｄＡｂとの融合体または複合体の形態であり得る。本発明はまた、上記の方法によって得られた、または得ることができる混合物も提供する。
【００５６】
リーダー配列はｏｍｐＡ、ｏｍｐＴ、ＧＡＳ、または上記の改変された配列のいずれか１つであり得る。該方法は、異種発現によって宿主細胞で該混合物を産生するステップを含み得る。該宿主細胞は微生物宿主細胞、原核生物宿主細胞、グラム陰性菌宿主細胞または大腸菌宿主細胞であり得る。
【００５７】
インスリン分泌促進薬およびインクレチン薬、例えば、ＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１Ｒによって媒介され得る多様な治療効果（例えば、膵臓からのグルコース依存性インスリン分泌を刺激するものなど）を有する。また、ＤＰＰＩＶ切断産物であるＧＬＰ−１ ９−３６アミド（またはＧＬＰ−１ ９−３７）によって媒介され得る、ある種の効果が存在することもすでに提案されている。ＧＬＰ−１ ９−３７は膵臓からのグルコース感受性インスリン分泌の刺激には活性が無いが、おそらくはＧＬＰ−１Ｒにより駆動されるものではない機構を介する他の生物学的効果を有することがすでに提案されている。ＧＬＰ−１種の分子に関するこれまでのほとんどの臨床応用は膵臓のＧＬＰ−１Ｒを介して糖尿病を標的としていたので、エキセンディン−４のような非ヒトＧＬＰ−１類似体を使用するか、またはアルビグルチド(Ａｌｂｉｇｌｕｔｉｄｅ)(Ｓｙｎｃｒｉａ)で用いられているようなＧＬＰ−１の８もしくは９個のアミノ酸を突然変異させることによって、あるいは該ペプチドのアミノ末端における化学的修飾または合成的修飾によって、ペプチドにおいてＤＰＰＩＶに対する安定性が操作されている。さらなるアプローチとしては、いずれの内因性分泌ＧＬＰ−１の半減期も延長する、ビルダグリプチン(Ｇａｌｖｕｓ)およびシタグリプチン(Ｊａｎｕｖｉａ)などの小分子ＤＰＰＩＶ阻害剤を用いたＤＰＰＩＶ活性の全面的遮断であった。これらのアプローチは双方とも、ＤＰＰＩＶ代謝産物であるＧＬＰ−１ ９−３６アミドまたはＧＬＰ−１ ９−３７のレベルを効果的に低下させる。
【００５８】
しかしながら、ＤＰＰＩＶ代謝産物であるＧＬＰ−１ ９−３６アミドまたはＧＬＰ−１ ９−３７は、望ましい生物学的効果を有することもすでに提案されている。いくつかの研究は、ＧＬＰ−１ ７−３６の分泌後すぐに生成され、通常の条件下でＧＬＰ−１ ７−３７よりも豊富なＧＬＰ−１ ７−３６アミドのＤＰＰＩＶ切断産物、すなわち、ＧＬＰ−１ ９−３６アミドが生物学的効果を有し得ることを示した。この機構に関しては、以下に挙げるような、経路の異なるいくつかの作用が提案されている。
【００５９】
ＧＬＰ−１（９−３７）はＧＬＰ−１Ｒにおけるアンタゴニストである（例えば、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ. １９９６ Ｄｅｃ ３０；３１８（２−３）：４２９−３５参照）。
グルカゴン様ペプチド−１−（９−３６）アミドは、イヌにin vivo投与した後のグルカゴン様ペプチド−１−（７−３６）アミドの主要代謝産物であり、膵臓受容体に対してアンタゴニストとして働き(Ｋｎｕｄｓｅｎ ＬＢ， Ｐｒｉｄａｌ Ｌ. Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ. １９９７ Ａｕｇ ２２； ２７２（３４）： ２１２０１−６)、膵臓グルカゴン様ペプチド−１受容体の強力なアンタゴニストである(Ｍｏｎｔｒｏｓｅ−Ｒａｆｉｚａｄｅｈ Ｃ, Ｙａｎｇ Ｈ, Ｒｏｄｇｅｒｓ ＢＤ, Ｂｅｄａｙ Ａ, Ｐｒｉｔｃｈｅｔｔｅ ＬＡ, Ｅｎｇ Ｊ. Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ. １９９７ Ａｕｇ ２２;２７２（３４）:２１２０１−６)。
【００６０】
ＧＬＰ−１（９−３７）は、非インスリン依存性機構によって、異なる機構を介してＧＬＰ−１（７−３７）にシグナルを伝達する(Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ. ２００２ Ａｐｒ;２８２（４）:Ｅ８７３−９.)。
ＧＬＰ−１−（９−３６）アミドは、麻酔状態のブタにおいて、インスリン分泌に関わりのない機構によって血糖を低下させる(Ｄｅａｃｏｎ ＣＦ, Ｐｌａｍｂｏｅｃｋ Ａ, Ｍｏｌｌｅｒ Ｓ, Ｈｏｌｓｔ ＪＪ.)。
【００６１】
あるいは、肥満個体においてインスリン感受性を高める働きをすることによる(Ｏｂｅｓｉｔｙ (Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ). ２００８ Ｊｕｌ; １６（７）:１５０１−９. Ｅｐｕｂ ２００８ Ａｐｒ １７)。
【００６２】
ＧＬＰ−１（７−３６）アミドの切断産物であるＧＬＰ−１（９−３６）アミドは血糖調節ペプチドである(Ｅｌａｈｉ Ｄ, Ｅｇａｎ ＪＭ, Ｓｈａｎｎｏｎ ＲＰ, Ｍｅｎｅｉｌｌｙ ＧＳ, Ｋｈａｔｒｉ Ａ, Ｈａｂｅｎｅｒ ＪＦ, Ａｎｄｅｒｓｅｎ ＤＫ)。
【００６３】
エキセンディンのアミノ酸が２個少ない種に関しては、ＤＰＰＩＶ切断の結果としてこれが生じないことからこの活性は示されなかったが、これはエキセンディン−４のアミノ酸が２個少ない種の場合である可能性もある。エキセンディン−４はまた、心臓作用およびその他の作用に関して、ＧＬＰ−１Ｒ依存性および非依存性の経路を介して働くことも示されている(Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ. ２００８;１１７:２３４０‐２３５０: Ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｖａｓｏｄｉｌａｔｏｒｙ Ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ １ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｒｅ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｂｏｔｈ Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ １ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ‐Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ‐Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐａｔｈｗａｙｓ Ｋｉｗｏｎ Ｂａｎ, ＭＳｃ; Ｍ. Ｈｏｓｓｅｉｎ Ｎｏｙａｎ−Ａｓｈｒａｆ, ＰｈＤ; Ｊｕｄｉｔｈ Ｈｏｅｆｅｒ, ＭＤ; Ｓｔｅｆｆｅｎ−Ｓｅｂａｓｔｉａｎ Ｂｏｌｚ, ＭＤ, ＰｈＤ; Ｄａｎｉｅｌ Ｊ. Ｄｒｕｃｋｅｒ, ＭＤ; Ｍａｎｓｏｏｒ Ｈｕｓａｉｎ, ＭＤ)。このことにより、エキセンディンの全長型とアミノ酸が２個少ない形態の双方に対して同等または並行した活性が実際に存在する可能性が浮上する。
【００６４】
少なくとも２つのプロセス経路が、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬とアミノ酸が２個少ない形態の混合物を作製するために利用可能である。例えば、全長ＧＬＰ−１ ７−３６アミド（ＡｌｂｕｄＡｂなどの所望の半減期延長形式における）とＧＬＰ−１ ９−３６アミド（または所望の融合タンパク質）の個別生産があり得る。その後、これらを混合して、ＧＬＰ−１ ７−３６分子とＧＬＰ−１ ９−３６分子の所望の比率で生成物を得ることができる。２つの並行ＧＭＰプロセスを用いて薬剤混合物を得てもよい。
【００６５】
もう１つの方法は、シグナル配列の除去を担うシグナルペプチダーゼ酵素が単一の切断部位を持たず、むしろ２つの切断部位を有する分泌シグナルを選択することである。これらは用いる分泌シグナルによって定義される比率で切断される。従って、選択された分泌シグナルによって、生産比率は、
１番の位置の前で１００％の切断となって、ＧＬＰ−１ ７−３６（もしくは他のインスリン分泌促進薬またはインクレチン薬全長分子）が得られるか；または３番の位置の前で１００％の切断となって、ＧＬＰ−１ ９−３６（もしくはアミノ酸配列が２個少ない他のインスリン分泌促進薬またはインクレチン薬）が得られるか；または全長もしくは２個少ない形態のそれぞれについて０〜１００％の間のいずれかであり得る。例えば、比率は、
全長型９０％：アミノ酸が２個少ない形態１０％、
全長型８０％：アミノ酸が２個少ない形態２０％、
全長型７５％：アミノ酸が２個少ない形態２５％、
全長型５０％：アミノ酸が２個少ない形態５０％、
全長型２５％：アミノ酸が２個少ない形態７５％、
全長型２０％：アミノ酸が２個少ない形態８０％、または
全長型１０％：アミノ酸が２個少ない形態９０％
であり得る。
【００６６】
所望の比率を得るのに適当なリーダー配列を選択することで、ある単一の宿主細胞からの生産が可能となる。これはＧＭＰプロセスに関して主要な利点である。これにより、内因性酵素の安定性を保持しながら、両種の潜在的治療効果の活用が可能となる。
【００６７】
他の内因性ペプチドおよび類似体の全範囲もアミノ末端ジペプチダーゼで処理することにより、元の全長分子および／またはジペプチダーゼ感受性種が生じる。従って、このアプローチは、１回の製造工程で、アミノ酸数個分だけ長さの異なる（このアミノ酸の違いは、シグナルペプチダーゼの認識部位の一部を含む）２種の所定の混合物を得ることができる、いずれのペプチドおよびタンパク質の生産にも有用であり得る。このプロセスの利用は、哺乳類、真核生物または原核生物宿主細胞、例えば、大腸菌で可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１−１】（ａ）ＤＡＴ０１１４（配列番号１）、（ｂ）ＤＡＴ０１１５（配列番号２）、（ｃ）ＤＡＴ０１１６（配列番号３）、（ｄ）ＤＡＴ０１１７（配列番号４）、（ｅ）ＤＡＴ０１１８（配列番号５）、（ｆ）ＤＡＴ０１１９（配列番号６）、（ｇ）ＤＡＴ０１２０（配列番号７）、（ｈ）ＤＯＭ ７ｈ−１４（配列番号８）（ｄＡｂ）（ＣＤＲが下線で示される）、（ｉ）ＧＬＰ−１ ７−３７ Ａ（８）Ｇ（配列番号９）、（ｊ）エキセンディン−４（配列番号１０）、（ｋ）ヘリカルリンカー（配列番号１１）、（ｌ）Ｇｌｙ−ｓｅｒリンカー（配列番号１２）、（ｍ）ＤＭＳ ７１３９（配列番号２４）、（ｎ）ＤＭＳ ７１４３（配列番号２５）、（ｏ）ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０（配列番号２６）（ｄＡｂ）（ＣＤＲが下線で示される）、（ｐ）ＤＯＭ ７ｈ−１１−１５（配列番号２７）（ｄＡｂ）（ＣＤＲが下線で示される）、（ｑ）ＯｍｐＴ ＡＷＡシグナルペプチド（リーダー）（配列番号２８）、（ｒ）ＤＯＭ７ｈ−１４−１０Ｒ１０８Ｃ（配列番号４２）、（ｓ）ＰＹＹ ３−３６（１０番の位置にリシンを有する）（配列番号４３）のアミノ酸配列を示す。
【図１−２】図１−１の続き。
【図１−３】図１−１の続き。
【図２−１】（ａ）ＤＡＴ０１１４（哺乳類構築物）（配列番号１３）、（ｂ）ＤＡＴ０１１５（哺乳類構築物）（配列番号１４）、（ｃ）ＤＡＴ０１１５（大腸菌構築物用に至適化されたもの）（配列番号１５）、（ｄ）ＤＡＴ０１１６（哺乳類構築物）（配列番号１６）、（ｅ）ＤＡＴ０１１６（大腸菌構築物用に至適化されたもの）（配列番号１７）、（ｆ）ＤＡＴ０１１７（哺乳類構築物）（配列番号１８）、（ｇ）ＤＡＴ０１１７（大腸菌構築物用に至適化されたもの）（配列番号１９）、（ｈ）ＤＡＴ０１１８（哺乳類構築物）（配列番号２０）、（ｉ）ＤＡＴ０１１９（哺乳類構築物）（配列番号２１）、（ｊ）ＤＡＴ０１２０（哺乳類構築物）（配列番号２２）、（ｋ）Ｄｏｍ７ｈ−１４（配列番号２３）、（ｌ）ＤＭＳ ７１３９（配列番号２９）、（ｍ）ＤＭＳ ７１４３（配列番号３０）、（ｎ）Ｄｏｍ７ｈ−１４−１０（配列番号３１）（ｄＡｂ）、（ｏ）ＤＯＭ７ｈ−１１−１５（配列番号３２）（ｄＡｂ）、（ｐ）Ｏｍｐ ＡＷＡシグナルペプチド（配列番号３３）、（ｑ）ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ Ｒ１０８Ｃ（ｄＡｂ）（配列番号４４）、（ｒ）カニクイザル(ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｍｏｎｋｅｙ)のｃＤＮＡ（配列番号４５）、（ｓ）オリゴヌクレオチド１（配列番号４７）、（ｔ）オリゴヌクレオチド２（配列番号４８）、（ｕ）大腸菌での発現のためのＤＭ７１３９の核酸配列（配列番号５０）の核酸配列を示す。
【図２−２】図２−１の続き。
【図２−３】図２−１の続き。
【図２−４】図２−１の続き。
【図２−５】図２−１の続き。
【図３ａ】（ａ）は、マウス肥満モデルにおけるＤＡＴ０１１５投与による用量依存的体重減少を示す。
【図３ｂ】（ｂ）は、マウス肥満モデルにおけるＤＡＴ０１１５投与による毎日の摂食量を示す。
【図４】ＤＡＴ０１１５のＤＳＣを示す。実線はＤＡＴ０１１５のトレース、点線は非２状態モデルへの当てはめ。
【図５】リゾチームのＤＳＣを示す。実線はリゾチームのトレース、点線は非２状態モデルへの当てはめ（トレースが重複しているために点線は見えない）。
【図６】ＤＡＴ０１１５のＳＥＣ ＭＡＬＬＳを示す。
【図７】ＤＡＴ０１１７のＳＥＣ ＭＡＬＬＳを示す。
【図８】ＤＡＴ０１２０のＳＥＣ ＭＡＬＬＳを示す。
【図９】リーダー：（ａ）ｏｍｐＡ（大腸菌由来）（配列番号３４）、（ｂ）ｏｍｐＡ−ＡＭＡ（人工配列）（配列番号３５）、（ｃ）ｏｍｐＡ−ＡＷＡ（人工配列）（配列番号３６）、（ｄ）ｏｍｐＴ（大腸菌由来）（配列番号３７）、（ｅ）ｏｍｐＴ−ＡＭＡ（人工配列）（配列番号３８）、（ｆ）ＧＡＳ（Ｓ．セレビシエ(Ｓ. ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)由来）（配列番号３９）、（ｇ）ＧＡＳ−ＡＭＡ（人工配列）（配列番号４０）、（ｈ）ＧＡＳ−ＡＷＡ（人工配列）（配列番号４１）、（ｉ）Ｐｅｌ Ｂ（エルウィニア・カロトボーラ(Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ)）（配列番号４６）、（ｊ）Ｍａｌ Ｅ（人工配列）（配列番号４９）のアミノ酸配列を示す。
【図１０】質量分析によって分析した精製ＤＭＳ７１３９を示す。
【図１１】ＤＡＴ０１１５と対照、ＤＭＳ７１３９と対照、およびＤＭＳ７１３９とＤＡＴ０１１５の間の比較を含む、血糖低下の統計的有意性を示す。（ａ）は実験計画を示し、（ｂ）はグルコースＡＵＣのグラフを示す。水平線が重ならない信頼区間は有意である。
【図１２】ＤＭＳ７１３９の反復投与は、ＤＯＭ７ｈ−１４対照に比べて、ＨｂＡ１ｃの用量依存的減少を示すことを示す。
【図１３】ＤＩＯマウス肥満モデルにおいて、ＤＡＴ０１１５およびＤＭＳ７１３９は、ＤＯＭ７ｈ−１４対照に比べて、摂食量および体重の用量依存的減少を示すことを示す。グラフでは、ｍｃｇ＝マイクログラム。
【図１４】リシン（ＰＹＹの１０番の位置に導入）および４リピートＰＥＧリンカーを介して、Ｃ末端でアミド化されたＰＹＹ３−３６と複合体化されたＤＯＭ ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ＡｌｂｕｄＡｂであるペプチド複合体を示す。直線は、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ＡｌｂｕｄＡｂの遊離のＣ末端システインおよびＰＹＹ配列の１０番の位置のリシンと共有結合しているリンカーを表す。このペプチド複合体のアミノ酸配列および構造は下記の通りである。
【図１５】ＤＭＳ７６０５はビヒクル対照に比べて用量依存的体重減少を示したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
発明の詳細な説明
本明細書において、本発明を、実施形態を参照して、明瞭かつ簡潔な明細書を記載できるような方法で説明した。実施形態は本発明から逸脱することなく様々に組み合わせたり分割したりできるものと意図され、また、そのように考えるべきである。
【００７０】
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション法および生化学分野の）当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を持つ。分子的、遺伝学的および生化学的方法（一般的には、参照により本明細書に組み入れるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ., Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ: Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, ２ｄ ｅｄ. （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ, Ｎ.Ｙ.およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ., Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９９） ４ｔｈ Ｅｄ, Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ, Ｉｎｃ.参照）および化学的方法に関して標準的な技術を用いる。
【００７１】
本明細書において「インスリン分泌促進薬」とは、ホルモンであるインスリンの合成もしくは発現、または活性を刺激することができる化合物、あるいはその合成もしくは発現または活性の刺激を引き起こすことができる化合物を意味する。インスリン分泌促進薬の既知の例としては、限定されるものではないが、例えば、グルコース、ＧＩＰ、ＧＬＰ、エキセンディン（例えば、エキセンディン−４およびエキセンディン−３）、ＰＹＹおよびＯＸＭが含まれる。
【００７２】
本明細書において「インクレチン」とは、グルコースレベルが正常である場合、または特にグルコースレベルが上昇している場合に、放出されるインスリン量の増加を引き起こす、消化管ホルモンの一種を意味する。例としては、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、ＯＸＭ、ＰＹＹ（例えば、ＰＹＹ３−３６）、ＶＩＰおよびＰＰ（膵臓ポリペプチド）が挙げられる。
【００７３】
本明細書において、ポリペプチドに関して「類似体」とは、ペプチドの１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている、かつ／または１以上のアミノ酸残基がペプチドから欠失されている、かつ／または１以上のアミノ酸残基がペプチドから欠失されている、かつ／または１以上のアミノ酸残基がペプチドに付加されている、修飾されたペプチドを意味する。このようなアミノ酸残基の付加または欠失はペプチドのＮ末端でも、かつ／またはペプチドのＣ末端でも起こる可能性があり、あるいはペプチド内部にある場合もある。簡単な体系を用いてＧＬＰ−１の類似体が表される：例えば、ＧＬＰ−１ Ａ８Ｇ（７−３７アミノ酸）は、天然の８位のアラニンがグリシン残基で置換されたＧＬＰ−１類似体を表す。ペプチド類似体およびその誘導体の式は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ命名法に従って使用されるアミノ酸の標準的な１文字略号を用いて記される。
【００７４】
本明細書において「断片」とは、ペプチドに関して使用される場合、天然の完全なポリペプチドのアミノ酸配列の全てではないが一部が同じアミノ酸配列を有するポリペプチドである。断片は、「独立」であっても、あるいはそれらが一部または一領域をなしている、より大きなポリペプチド内に、単一のより大きなポリペプチド中の単一の連続した領域として含まれる。例としては、天然のＧＬＰ−１の断片は、天然アミノ酸１〜３６のうち、アミノ酸７〜３６を含む。その上、ポリペプチドの断片は、天然の部分配列の変異体であってもよい。例えば、天然ＧＬＰ−１のアミノ酸７〜３６を含むＧＬＰ−１の断片は、その部分配列内にアミノ酸置換を有する変異体であってもよい。
【００７５】
本発明の適当なインスリン分泌促進薬の例としては、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１誘導体、ＧＬＰ−１類似体、またはＧＬＰ−１類似体の誘導体が含まれる。それに加えて、エキセンディン−４、エキセンディン−４類似体およびエキセンディン−４誘導体または断片、ならびにエキセンディン−３、エキセンディン−３誘導体およびエキセンディン−３類似体も含まれる。
【００７６】
本明細書において「ＧＬＰ−１」とは、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１（７−３８）、ＧＬＰ−１（７−３９）、ＧＬＰ−１（７−４０）、ＧＬＰ−１（７−４１）、ＧＬＰ−１類似体、ＧＬＰ−１ペプチド、ＧＬＰ−１誘導体もしくは突然変異体もしくは断片、またはＧＬＰ−１類似体の誘導体を意味する。このようなペプチド、突然変異体、類似体および誘導体はインスリン分泌促進薬である。
【００７７】
例えば、ＧＬＰ−１は、図１（ｉ）：配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ突然変異体であり得る。
【００７８】
さらなるＧＬＰ−１類似体が、ＧＬＰ−１（７−３６）およびその機能的誘導体を含み、かつ、ＧＬＰ−１（１−３６）もしくはＧＬＰ−１（１−３７）のインスリン分泌促進活性を上回るインスリン分泌促進活性を有するペプチド断片、ならびにインスリン分泌促進薬としてのそれらの使用に関する国際特許出願第９０／１１２９６号(Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ)に記載されている（特に、本発明で用いる薬物の例として、参照により本明細書に組み入れる）。
【００７９】
国際特許出願第９１／１１４５７号（Ｂｕｃｋｌｅｙら）は、本発明のＧＬＰ−１薬としても有用であり得る、活性ＧＬＰ−１ペプチド７−３４、７−３５、７−３６および７−３７の類似体を開示している。
【００８０】
本明細書において「エキセンディン−４ペプチド」とは、エキセンディン−４（１−３９）、エキセンディン−４類似体、エキセンディン−４ペプチドの断片、エキセンディン−４誘導体、またはエキセンディン−４類似体の誘導体を意味する。このようなペプチド、断片および誘導体はインスリン分泌促進薬である。エキセンディン−４（１−３９）のアミノ酸配列は図１（ｊ）：配列番号１０に示される。
【００８１】
本発明に有用なさらなるエキセンディン類似体が、ＰＣＴ特許公報第ＷＯ９９／２５７２８号（Ｂｅｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ）、同第ＷＯ９９／２５７２７号（Ｂｅｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ）、同第ＷＯ９８／０５３５１号（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ）、同第ＷＯ９９／４０７８８号（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ）、同第ＷＯ９９／０７４０４号（Ｂｅｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ）および同第ＷＯ９９／４３７０８号（Ｋｎｕｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ）に記載されている（特に、本発明で用いる薬物の例として、参照により全て本明細書に組み入れる）。
【００８２】
本明細書において「ペプチド」とは、ペプチド結合によって互いに連結された約２〜約５０個のアミノ酸を表す。
【００８３】
本明細書において「ポリペプチド」とは、ペプチド結合によって互いに連結された少なくとも約５０個のアミノ酸を表す。ポリペプチドは一般に三次構造を含み、折り畳まれて機能的ドメインとなっている。
【００８４】
本明細書において「ディスプレイ系」とは、ポリペプチドまたはペプチドの集合体が、所望の特性、例えば、物理的、化学的または機能的特性に基づく選択に利用可能な系を表す。ディスプレイ系は、ポリペプチドまたはペプチド（例えば、溶液中、適当な担体上に固定化）の適当なレパートリーであり得る。また、ディスプレイ系は、細胞発現系（例えば、形質転換細胞、感染細胞、トランスフェクト細胞または形質導入細胞などにおける核酸ライブラリーの発現、およびコードされているポリペプチドの細胞表面上でのディスプレイ）または無細胞発現系（例えば、エマルションコンパートメント化およびディスプレイ）を用いる系であってもよい。典型的なディスプレイ系は、核酸のコード機能と、核酸によってコードされるポリペプチドまたはペプチドの物理的、化学的および／または機能的特性とを関連づけるものである。このようなディスプレイ系を用いると、所望の物理的、化学的および／または機能的特性を有するポリペプチドまたはペプチドを選択することができ、選択されたポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸を容易に単離または回収することができる。核酸のコード機能と、ポリペプチドまたはペプチドの物理的、化学的および／または機能的特性とを関連づけるいくつものディスプレイ系が当技術分野で知られており、例えば、バクテリオファージディスプレイ（ファージディスプレイ、例えば、ファージミドディスプレイ）、リボソームディスプレイ、エマルションコンパートメント化およびディスプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上でのディスプレイ、共有結合ディスプレイなどがある（例えば、欧州特許第０４３６５９７号(Ｄｙａｘ)、米国特許第６，１７２，１９７号(ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ)、米国特許第６，４８９，１０３号(Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａl)参照）。
【００８５】
本明細書において「機能的」とは、特異的結合活性などの生物学的活性を有するポリペプチドまたはペプチドを表す。例えば、「機能的ポリペプチド」とは、抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、その抗原結合部位を介して標的抗原と結合する。
【００８６】
本明細書において「標的リガンド」とは、ポリペプチドまたはペプチドが特異的または選択的に結合するリガンドを表す。例えば、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントである場合には、その標的リガンドは任意の望ましい抗原またはエピトープであり得る。標的抗原との結合は、ポリペプチドまたはペプチドが機能的であることによるものである。
【００８７】
本明細書において抗体は、自然に抗体を産生する任意の種に由来するものであれ、組換えＤＮＡ技術によって作製されたものであれ、血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクト体、酵母または細菌から単離されたものであれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＥ、またはフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、閉構造多重特異性抗体、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、ダイアボディー）を表す。
【００８８】
本明細書において「抗体フォーマット」とは、その構造に抗原に対する結合特異性を付与するように１以上の抗体可変ドメインを組み込むことができる、任意の適当なポリペプチド構造を表す。キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、前記のいずれかの抗原結合フラグメント（例えば、Ｆｖフラグメント（例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント）、単一抗体可変ドメイン（例えば、ｄＡｂ、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）、ならびに前記のいずれかの修飾形（例えば、ポリエチレングリコールもしくは他の適当なポリマーまたはヒト化ＶＨＨの共有結合による修飾）など、種々の適当な抗体フォーマットが当技術分野で知られている。
【００８９】
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」とは、他のＶ領域またはドメインとは独立に、抗原またはエピトープと特異的に結合する抗体可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を表す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の可変領域または可変ドメインを有するフォーマット（例えば、ホモまたはヘテロ多量体）で存在することもできるが、この場合、他の領域またはドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合には必要とされない（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の可変ドメインとは独立に抗原と結合する）。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。「単一免疫グロブリン可変ドメイン」は、本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。「単一抗体可変ドメイン」は、本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、ある実施形態では、ヒト抗体可変ドメインであるが、齧歯類（例えば、国際公開第ＷＯ００／２９００４号に開示、その内容は参照によりその全てが本明細書に組み入れられる）、テンジクザメ、およびラクダ科動物のＶＨＨ ｄＡｂなどの他種由来の単一抗体可変ドメインも含まれる。ラクダ科動物ＶＨＨは、もともと軽鎖を欠いた重鎖抗体を産生するラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。ＶＨＨはヒト化することができる。
【００９０】
「ドメイン」は、タンパク質の残りの部分とは独立した三次構造を有する、折り畳まれたタンパク質構造である。一般に、ドメインは、タンパク質の個別の機能的特性に関与しており、多くの場合、タンパク質の残りの部分および／またはそのドメインの機能を失うことなく、他のタンパク質に付加したり、取り除いたり、移したりすることができる。「単一抗体可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む、折り畳まれたポリペプチドドメインである。従って、これには、完全な抗体可変ドメイン、および例えば１以上のループが、抗体可変ドメインに特徴的でない配列で置き換えられているなどの改変された可変ドメイン、あるいは末端切断されているか、またはＮ末端もしくはＣ末端伸長部を含む抗体可変ドメイン、ならびに少なくとも全長ドメインの結合活性および特異性を保有する、折り畳まれた可変ドメインフラグメントが含まれる。
【００９１】
「ライブラリー」とは、異種ポリペプチドまたは核酸の混合物を表す。ライブラリーは、それぞれが単一のポリペプチドまたは核酸配列を有するメンバーから構成される。この点で、「ライブラリー」は、「レパートリー」と同義である。ライブラリーメンバー間の配列の相違が、ライブラリーに存在する多様性を担っている。ライブラリーは、ポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形をとってもよいし、核酸のライブラリーで形質転換された、例えば、細菌、ウイルス、動物または植物細胞などの生物または細胞の形をとってもよい。一実施形態では、個々の生物または細胞は、１つだけまたは限られた数のライブラリーメンバーを含む。一実施形態において、核酸は、その核酸によってコードされるポリペプチドの発現を可能にするために、発現ベクターに組み込まれている。従って、ある態様において、ライブラリーは、宿主生物の集団の形をとってもよく、各生物は、それを発現させればその対応するポリペプチドメンバーを生成することができる核酸形態でライブラリーの単一メンバーを含む、１コピー以上の発現ベクターを含む。従って、宿主生物の集団は、多様なポリペプチドからなる大きなレパートリーをコードする能力を有している。
【００９２】
本明細書において「用量」とは、１回で全量を（単位用量）、または所定の時間間隔で２回以上の投与で、対象に投与される融合体または複合体の量を表す。例えば、用量は、１日（２４時間）（１日量）、２日、１週間、２週間、３週間または１ヶ月以上の間に（例えば、１回投与で、または２回以上の投与で）対象に投与される融合体または複合体の量を表し得る。投与間隔は、任意の望ましい時間とすることができる。
【００９３】
「半減期」とは、融合体または複合体の血清濃度または血漿濃度がin vivoで、例えば、自然のメカニズムによる分解および／または排出または隔離によって５０％だけ減少するのにかかる時間を表す。本発明の融合体または複合体はin vivoで安定化されており、その半減期は、分解および／または排出または隔離に抵抗する血清アルブミン分子、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合することによって長くなる。これらの血清アルブミン分子は、それ自体in vivoで長い半減期を有する天然タンパク質である。分子の半減期は、その機能的活性がin vivoで、半減期延長分子に特異的でない類似の分子よりも長期間持続するならば延長されている。例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に特異的なｄＡｂとインクレチン薬またはインスリン分泌促進薬、例えば、ＧＬＰ−１またはエキセンディンとを含む本発明の融合体または複合体は、ＨＳＡに対する特異性が無く、ＨＳＡとは結合せずに別の分子と結合する、同じリガンドと比較される。例えば、それは細胞上の第３の標的と結合することができる。一般に、半減期は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれを超えて延長される。２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍またはそれを超える範囲での半減期の延長が可能である。その代わりに、またはそれに加えて、最大３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、３００倍、４００倍までの範囲での半減期の延長が可能である。
【００９４】
本明細書において「流体力学的サイズ」とは、水溶液中での分子の拡散に基づいた、分子（例えば、タンパク質分子、リガンド）の見かけの大きさを表す。溶液中でのタンパク質の拡散または運動を分析処理して、タンパク質の見かけの大きさを導き出すことができるが、この大きさはタンパク質粒子の「ストークス半径」または「流体力学的半径」によって示される。タンパク質の「流体力学的半径」は、質量と形状（立体構造）の両方に依存するので、同じ分子質量を有する２つのタンパク質でも、タンパク質の全体的な立体構造に基づいて異なる流体力学的サイズを有することがある。
【００９５】
２つの配列間の「相同性」または「同一性」または「類似性」（これらの用語は本明細書において互換的に用いられる）の計算は以下のように行われる。配列を、最適な比較ができるようにアラインする（例えば、最適なアラインメントのために、第１および第２のアミノ酸もしくは核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、非相同配列は、比較の目的で無視することができる）。一実施形態において、比較のためにアラインされる参照配列の長さは、その参照配列の長さの少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められているならば、その分子はその位置で同一である（本明細書においてアミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と同等である）。２配列間の同一性％は、２配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れ、配列が共有する同一位置の数の関数である。本明細書で定義される、アミノ酸およびヌクレオチド配列アラインメントおよび相同性、類似性もしくは同一性は、アルゴリズムＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓによって、デフォルトパラメーターを用いて作製し、決定することができる(Ｔａｔｕｓｏｖａ， Ｔ． Ａ． ｅｔ ａｌ，， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ， １７４:１８７−１８８ （１９９９）)。
【００９６】
核酸、宿主細胞：
本発明は、本明細書に記載された本発明の融合体（例えば、配列番号１３〜２３によってコードされるもの）をコードする、単離されたおよび／または組換え核酸に関する。
【００９７】
本明細書において「単離された」と称される核酸は、そのもとの環境中（例えば、細胞内、またはライブラリーなどの核酸混合物中）の他の材料（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／またはＲＮＡなどの他の核酸）から分離された核酸である。単離された核酸は、ベクターの一部として単離することもできる（例えば、プラスミド）。
【００９８】
本明細書において「組換え」と称される核酸は、例えば制限酵素、相同組換え、ウイルスなどを用いたベクターまたは染色体へのクローニングといった、人為的組換えによる方法を含む、組換えＤＮＡ法によって作製された核酸、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて調製された核酸である。
【００９９】
本発明はまた、本明細書に記載の本発明の融合体をコードする核酸を含む（１以上の）組換え核酸または発現構築物を含む、組換え宿主細胞、例えば、哺乳動物または微生物に関する。また、本明細書に記載の本発明の融合体を調製する方法も提供され、該方法は、本発明の組換え宿主細胞、例えば、哺乳動物または微生物を、融合ポリペプチドの発現に適当な条件下で維持することを含む。該方法はさらに、必要に応じて、融合体を単離または回収するステップを含むことができる。
【０１００】
例えば、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸分子（すなわち、１以上の核酸分子）、またはこのような核酸分子を含む発現構築物（すなわち、１以上の構築物）を、選択された宿主細胞に適した任意の方法（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染）を用いて、その核酸分子が１以上の発現制御エレメント（例えば、ベクター内のエレメント、細胞内プロセスによって作出される構築物中のエレメント、宿主細胞ゲノムに組み込まれているエレメント）に機能的に連結されるように、適切な宿主細胞に導入して、組換え宿主細胞を作出することができる。得られた組換え宿主細胞は、発現に適した条件下で（例えば、誘導因子の存在下で、適当な動物内で、適当な塩、増殖因子、抗生物質、栄養添加物などを添加した適当な培地中で）維持することができ、それによって、コードされたペプチドまたはポリペプチドが産生される。必要に応じて、コードされたペプチドまたはポリペプチドを（例えば、動物、宿主細胞、培地、乳汁から）単離または回収することができる。このプロセスには、トランスジェニック動物の宿主細胞における発現が含まれる（例えば、国際公開第ＷＯ９２／０３９１８号、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ参照）。
【０１０１】
また、本明細書に記載の本発明の融合ポリペプチドは、適当なｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系で、例えば、化学合成によって、または他のいずれかの適当な方法によって作製することもできる。
【０１０２】
本明細書に記載され、例示されるように、本発明の融合体または複合体は一般に血清アルブミンと、高い親和性で結合する。
【０１０３】
例えば、本発明の融合体または複合体は、約５μＭ〜約１００ｐ、例えば、約１μＭ〜約１００ｐＭ、例えば、約５〜５０ｎｍ、例えば、約１０〜３０ｎｍ、例えば、約２０〜３０ｎｍの親和性（ＫＤ；ＫＤ＝Ｋｏｆｆ（ｋｄ）／Ｋｏｎ（ｋａ）［表面プラズモン共鳴により測定］）でヒト血清アルブミンと結合することができる。
【０１０４】
本発明の融合体または複合体は、大腸菌(Ｅ. ｃｏｌｉ)またはピキア(Ｐｉｃｈｉａ)種（例えば、Ｐ. ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現させることができ、また、酵母または真菌細胞で発現させることもできる。一実施形態において、融合体は、大腸菌またはピキア種（例えば、Ｐ. ｐａｓｔｏｒｉｓ）、または哺乳類細胞培養（例えば、ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞）で発現させた場合、少なくとも約０．５ｍｇ／ｌの量で分泌される。大腸菌またはピキア種または哺乳類細胞で発現させる場合、本明細書に記載の融合体または複合体は分泌可能であるが、それらは化学合成法、または大腸菌もしくはピキア種を使用しない生物生産法などの任意の適当な方法を用いて作製することもできる。
【０１０５】
ある実施形態において、本発明の融合体および複合体は、国際公開第ＷＯ２００６／０５９１０６号（例えば、国際公開第ＷＯ２００６／０５９１０６号の１０４〜１０５ページ）に記載されているような、または本明細書の実施例に記載されているような動物モデルにおいて、有効量を投与した際に、効果がある。一般に、有効量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。疾病モデルは、ヒトでの治療効果を予測するものとして当業者に認識されている。
【０１０６】
一般に、本発明の融合体および複合体は、精製形態で、薬理学的または生理学的に適当な担体とともに使用される。一般に、これらの担体としては、水性もしくはアルコール／水性の溶液、エマルションもしくは懸濁液、生理食塩水および／または緩衝媒体を含む任意のものを含み得る。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖加リンゲル液、ブドウ糖および塩化ナトリウムおよび乳酸加リンゲル液を含み得る。懸濁液中でポリペプチド複合体を維持するために必要であれば、適当な生理学上許容されるアジュバントを、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギン酸塩などの増粘剤から選択することができる。
【０１０７】
静脈ビヒクルは、ブドウ糖加リンゲル液をベースとしたものなどの液体および栄養補給物質および電解質補給物質を含む。また、保存剤および他の添加物、例えば、抗生物質、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガスが存在してもよい(Ｍａｃｋ （１９８２） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ, 第16版)。持続放出製剤を含む、様々な適切な製剤を使用することができる。
【０１０８】
本発明の医薬組成物の投与経路は、当業者に一般に知られているもののいずれであってもよい。治療のために、本発明の薬物融合体または複合体を標準的な技術に従って任意の患者に投与することができる。
【０１０９】
投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経口、経皮、肺経路を含む任意の適当な方法で、または適切ならば、カテーテルを用いた直接注入によっても可能である。用量および投与頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の併用投与、禁忌、ならびに臨床医によって考慮される他のパラメーターによって異なる。投与は、指示に応じて、局所でも全身でも可能である。
【０１１０】
一実施形態において、本発明は、（ａ）本発明の複合体または融合体と（ｂ）薬学上許容されるバッファーを含む肺送達用の肺製剤を提供し、ここで、該組成物は液滴を含み、組成物中に存在する液滴の約４０％以上、例えば５０％以上は、約６μｍ未満、例えば、約１ミクロン〜約６ミクロン、例えば、約５ミクロン未満、例えば、約１〜約５ミクロンの範囲の大きさを有する。このような組成物は、例えば、直接的な局所的肺送達によって対象に投与するのに特に適している。これらの組成物は、例えば、吸入によって、例えば、噴霧器の使用によって、肺に直接投与することができる。肺送達用のこれらの組成物は、生理学上許容されるバッファーを含むことができ、そのｐＨ範囲は約４〜約８、例えば、約７〜約７．５であり、その粘度は１．２％（ｗ／ｖ）スクロース含有５０ｍＭリン酸バッファー中の約２％〜約１０％ＰＥＧ１０００溶液の粘度にほぼ等しい。
【０１１１】
本発明の融合体または複合体は、保存のために凍結乾燥し、使用前に適当な担体で再構成することができる。この方法は、従来の免疫グロブリンで有効であることが示されており、当技術分野で知られている凍結乾燥および再構成法を使用することができる。当業者には当然のことながら、凍結乾燥および再構成は、様々な程度の抗体活性の損失をもたらす可能性がある（例えば、従来の免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも活性の損失が大きい傾向がある）ので、使用レベルは補填のために多めに調整する必要がある。
【０１１２】
予防用途において、例えば、前糖尿病を有するまたはインスリン抵抗性を有する個体に投与する場合、本発明の融合体または複合体を含有する組成物はまた、疾患の発症を予防、抑制または遅延するため（例えば、寛解もしくは静穏期を持続させるため、または急性期を予防するため）に、同等またはやや少ない用量で投与することもできる。熟練の臨床医ならば、疾患を治療、抑制または予防するために、適当な投与間隔を決定することができる。本発明の融合体または複合体が疾病の治療、抑制または予防のために投与される場合、１日４回まで、週２回、週１回、２週間に１回、月１回または２ヶ月に１回、例えば、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇ）の用量で投与することができる。
【０１１３】
本明細書に記載の組成物を用いて行われる処置または治療は、１以上の症状が、処置前に存在するそのような症状に比べて、またはその組成物で処置されない個体（ヒトまたはモデル動物）もしくは他の適当な対照のそのような症状と比べて軽減される（例えば、少なくとも１０％だけ、または臨床評価スケールで少なくとも１ポイントだけ）ならば、「有効」とみなされる。症状は、標的とする疾患または障害の厳密な性質に応じて明らかに多様であるが、熟練の臨床医または技術者ならばそれを評価することができる。
【０１１４】
同様に、本明細書に記載の組成物を用いて行われる予防は、１以上の症状の発症または重症度が、その組成物で処置されない同等の個体（ヒトまたは動物モデル）の症状に比べて遅延される、軽減される、または消失されるならば、「有効」である。
【０１１５】
本発明の融合体または複合体は個別に投与される組成物として使用することもできるし、あるいは他の治療薬または活性剤、例えば、他のポリペプチドまたはペプチドまたは小分子と併用投与してもよい。これらのさらなる薬剤としては、例えば、メトフォルミン、インスリン、グリタゾン（例えば、ロシグリタゾン）、免疫抑制薬、免疫賦活薬などの様々な薬物を挙げることができる。
【０１１６】
本発明の融合体または複合体は、１以上の別の治療薬または活性剤とともに投与および／または調剤することができる。本発明の融合体または複合体が別の治療薬とともに投与される場合、その融合体または複合体は、別の薬剤の投与の前、投与と同時、投与とともに、または投与の後に投与することができる。一般に、本発明の融合体または複合体は、治療効果の重複をもたらすように投与される。
【０１１７】
半減期：
インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬、例えば、ＧＬＰ−１またはエキセンディンリガンドの半減期の延長は、ｉｎ ｖｉｖｏ適用に有用である。本発明はこの課題を、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬、例えば、ＧＬＰおよびエキセンディンのｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を延長し、その結果としてこれらの分子の機能的活性の、体内での持続時間を延長することによって解決する。
【０１１８】
本明細書に記載のように、本発明の組成物（すなわち、本明細書に記載の融合体または複合体を含む組成物）は、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬単独に比べて、著しく延長されたｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期もしくは血漿半減期、および／または増加したＡＵＣ、および／または増加した平均滞留時間（ＭＲＴ）を有し得る。加えて、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬の活性は、本発明の組成物（例えば、複合体または融合体）において、実質的にとは言えないまでも全般的に変化している。しかしながら、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬単独に比べて、本発明の組成物の活性におけるある程度の変化は許容でき、本発明の複合体または融合体の薬物動態特性の改善によって一般に補償される。例えば、本発明の薬物複合体または融合体は、薬物単独より低い親和性で薬物標的と結合するかもしれないが、薬物組成物の薬物動態特性の改善（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期の延長、ＡＵＣの増大）によって、薬物単独に比べてほぼ等しいか優れた有効性を有し得る。さらに、本発明の複合体または融合体の半減期の延長によって、それらはインスリン分泌促進薬またはインクレチン薬単独よりも少ない頻度で投与することができ（例えば、月１回または週１回患者に投与することができる）、また、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬単独の投与よりも、より一定な血中インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬レベルを達成し、従って、望ましい治療または予防効果を達成する。
【０１１９】
薬物動態分析およびリガンド半減期測定の方法は当業者によく知られている。詳細は、Ｋｅｎｎｅｔｈ, Ａ ｅｔ ａｌ: Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ: Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ ＰｈａｒｍａｃｉｓｔｓおよびＰｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ, Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｃ ａｎａｌｙｓｉｓ: Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （１９９６）に見出すことができる。また、薬物動態パラメーター、例えば、tαおよびtβ半減期、ならびに曲線下面積(AUC)を記載している“Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ”, Ｍ Ｇｉｂａｌｄｉ ＆ Ｄ Ｐｅｒｒｏｎ, Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ発行, ２nd Ｒｅｖ. ｅｘ ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８２）も参照。
【０１２０】
半減期（ｔ１／２αおよびｔ１／２β）ならびにＡＵＣおよびＭＲＴは、時間に対するリガンドの血漿濃度または血清濃度の曲線から決定することができる。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ解析パッケージ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ., Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ, ＣＡ９４０４０, ＵＳＡより入手可能）を使用して、例えば、曲線をモデル化することができる。第１相（α相）では、患者においてリガンドは主として、いくらかの消失を伴いながら分布中である。第２相（β相）は、リガンドの分布が終わり、患者からリガンドが排出につれて血清濃度が低下していく終末相である。ｔα半減期は第１相の半減期であり、ｔβ半減期は第２相の半減期である。加えて、当業者によく知られている非コンパートメントフィッティングモデルを用いて半減期を決定することもできる。
【０１２１】
一実施形態において、本発明は、例えば、ヒト対象において、約１２時間以上、例えば、約１２時間〜約２１日、例えば、約２４時間〜約２１日、例えば、約２〜１０日、例えば、約３〜４日の消失半減期を有する本発明の融合体または複合体を提供する。
【０１２２】
また、本発明の融合体または複合体は、例えば、ＰＥＧ基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体もしくは少なくともそのトランスフェリン結合部分、抗体Ｆｃ領域の結合によって、または抗体ドメインとの複合体化合によって、より大きな流体力学的サイズを有するようにさらに構成することができる。
【０１２３】
流体力学的サイズは、当業者によく知られている方法を用いて測定することができる。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、リガンドの流体力学的サイズを決定することができる。リガンドの流体力学的サイズを測定するのに適したゲル濾過担体、例えば、架橋アガロース担体がよく知られており、容易に入手できる。
【０１２４】
本発明の組成物、すなわち、本明細書に記載の融合体および複合体を含む組成物は、さらにいくつかの利点を提供する。ドメイン抗体成分は非常に安定であり、抗体および抗体の他の抗原結合フラグメントに比べて小さく、大腸菌または酵母（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現によって高収率で作製することができ、血清アルブミンと結合する、抗体の抗原結合フラグメントは、ヒト起源のライブラリーまたは任意の所望の種に由来するライブラリーから容易に選択することができる。従って、血清アルブミンと結合するｄＡｂを含む本発明の組成物は、一般に哺乳類細胞で作製される治療薬（例えば、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体）よりも容易に作製することができ、免疫原性のないｄＡｂを使用することができる（例えば、ヒトｄＡｂはヒトの疾患を治療または診断するために使用することができる）。
【０１２５】
インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬が、血清アルブミンと結合するｄＡｂを含有する薬物組成物の一部である場合、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬の免疫原性を低下させることができる。従って、本発明は、血清アルブミンと結合するｄＡｂを含有する薬物組成物に関して、（例えば、インスリン分泌促進薬またはインクレチン単独よりも）免疫原性が低いか、または実質的に免疫原性のない、融合体または複合体組成物を提供する。従って、このような組成物は、対象の免疫系による抗薬物抗体の合成による有効性の損失を最小限にしつつ、対象に長期間にわたって繰り返し投与することができる。
【０１２６】
さらに、本明細書に記載の複合体または融合体組成物は、インスリン分泌促進薬またはインクレチン単独よりも安全性が高く、副作用が少ない可能性がある。例えば、ｄＡｂの血清アルブミン結合活性の結果として、本発明の融合体または複合体は、血液循環における滞留時間が長くなっている。加えて、本発明の融合体または複合体は、実質的に血液脳関門を超えることができず、全身投与（例えば、静脈投与）後に中枢神経系に蓄積することはあり得ない。従って、本発明の融合体または複合体は、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬単独に比べて、高い安全性かつ少ない副作用で投与することができる。同様に、該融合体または複合体は、薬物単独よりも、特定の臓器（例えば、腎臓または肝臓）に対して低い毒性を有し得る。
【実施例】
【０１２７】
実施例１：ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ）またはエキセンディン−４とＤＯＭ７ｈ−１４ ＡｌｂｕｄＡｂとの遺伝子融合体の発現
エキセンディン−４、または８位のアラニンがグリシンで置換されたＧＬＰ−１（７−３７）（［Ｇｌｙ８］ＧＬＰ−１）のいずれかを、ＤＯＭ７ｈ−１４（下記に示すアミノ酸配列を有する、血清アルブミンと結合するドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＡｌｂｕｄＡｂ））との融合体として、ｐＴＴ−５ベクター（ＣＮＲＣ, Ｃａｎａｄａから入手可能）にクローニングした。各場合において、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４は構築物の５’末端にあり、ｄＡｂは３’末端にあった。図１（Ａ〜Ｇ）に示されるアミノ酸配列を有する、合計７個の構築物（ＤＡＴ０１１４、ＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６、ＤＡＴ０１１７、ＤＡＴ０１１８、ＤＡＴ０１１９、ＤＡＴ０１２０）を作製した。リンカーは存在しないか、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカー（Ｇ４Ｓ）またはヘリカルリンカー(Ａｒａｉ, Ｒ., Ｈ. Ｕｅｄａ, ｅｔ ａｌ. （２００１）. “Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｎｋｅｒｓ ｗｈｉｃｈ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｓｅｐａｒａｔｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ａ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ.” Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １４（８）: ５２９−３２.４５６)もしくは第２のＧＬＰ−１部分からなるリンカーが、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４とｄＡｂの間に存在した。リンカーは、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４をｄＡｂから空間的に分離してＧＬＰ−１またはエキセンディン−４とＧＬＰ−１受容体の間の結合の立体障害を防ぐためのスペーサーとして含めた。これらの構築物の配列を図１（Ａ〜Ｇ）に示す。
【０１２８】
エンドトキシン不含ＤＮＡを大腸菌において、アルカリ溶菌法を用いて調製し（Ｑｉａｇｅｎ ＣＡから入手可能なエンドトキシン不含プラスミドＧｉｇａキットを使用）、それを用いてＨＥＫ２９３Ｅ細胞（CNRC, Canadaから入手可能）にトランスフェクトした。トランスフェクションは、フラスコ当たり３３３μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)および２５０μｇのＤＮＡを用いて、２５０ｍｌ／フラスコのＨＥＫ２９３Ｅ細胞１．７５×１０６細胞／ｍｌに対して行い、発現は３０℃にて５日間とした。上清を遠心分離によって回収し、精製はプロテインＬによるアフィニティー精製によった。タンパク質は樹脂にバッチで結合させてカラムに充填し、カラム容積の１０倍のＰＢＳで洗浄した。タンパク質は、５０ｍｌの０．１ＭグリシンｐＨ２で溶出し、Ｔｒｉｓ ｐＨ８で中和した。予想されるサイズのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で同定し、サイズを下記表１に示す。
【表１】
【０１２９】
実施例２：ＧＬＰ−１およびエキセンディン−４ ＡｌｂｕｄＡｂ融合体は血清アルブミンと結合することを示す
ＧＬＰ−１およびエキセンディン−４ ＡｌｂｕｄＡｂ融合体は、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能）によって分析し、親和性に関する情報を得た。分析は、血清アルブミンでコーティングしたＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅチップ（カルボキシメチル化デキストランマトリックス）を用いて行った。各供試血清アルブミン（ヒト、ラットおよびマウス血清アルブミン）約１０００レゾナンスユニット（ＲＵ）を、酢酸バッファーｐＨ５．５中で固定化した。Ｂｉｏｃｏｒｅ ＡＢのフローセル１は、コーティングのない、ブロックされた陰性対照とし、フローセル２はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（８１５ＲＵ）でコーティングし、フローセル３はラット血清アルブミン（ＲＳＡ）（８２６ＲＵ）でコーティングし、フローセル４はマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）（９３８ＲＵ）でコーティングした。各供試融合体分子は、上記実施例に記載のように哺乳類組織培養にて発現された。
【０１３０】
ＢＩＡＣＯＲＥ ＨＢＳ−ＥＰバッファー（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）で希釈することによって、一定の濃度範囲（１６ｎＭ〜２μＭ）の融合体分子を調製し、ＢＩＡＣＯＲＥチップに流した。
【０１３１】
親和性（ＫＤ）は、ＢＩＡＣＯＲＥ出力から、ＫＤ領域内のｄＡｂ濃度によって作成された出力に結合速度および解離速度曲線を当てはめることによって計算した。親和性（ＫＤ）を下記表２にまとめる。
【表２】
【０１３２】
上記の結果は、融合体分子が全種類の血清アルブミンと結合する能力を保持していることを示すが、このことはそれらのｉｎ ｖｉｖｏ半減期が長くなっている可能性があることを示唆している。
【０１３３】
実施例３：ＧＬＰ−１およびエキセンディン−４ ＡｌｂｕｄＡｂ融合体はＧＬＰ−１受容体結合アッセイ（ＧＬＰ−１Ｒ ＢＡ）において活性がある
融合体に１００ｍＭ ＮａＶｌ、２０ｍＭクエン酸 ｐＨ６．２へのバッファー交換を行った。一方で、ＣＨＯ ６ＣＲＥ ＧＬＰ１Ｒ細胞（ルシフェラーゼレポーター遺伝子を駆動する６ ｃＡＭＰ応答エレメントで、そしてヒトＧＬＰ−１受容体でも安定にトランスフェクトされたＣＨＯ Ｋ１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ, ＡＴＣＣから入手可能））を、懸濁培地中２×１０５細胞／ｍＬで播種した。懸濁培養を２４時間維持した。次に、細胞を２ｍＭ Ｌグルタミンを含有する１５ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（Sigmaから入手可能）で希釈し（２．５×１０５細胞／ｍｌ）、１０μｌ／ウェルのアッセイ化合物を含む３８４ウェルプレートに分注した。アッセイ対照を加えた後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに３時間戻した。インキュベーション後、ｓｔｅａｄｙ ｇｌｏシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）を、キットに記載されているようにウェルに添加し、粘着性のプレートシール（Ｗｅｂｅｒ Ｍａｒｋｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ.カタログ番号６０７７８０）でプレートを密閉した。プレートをリーダー(Ｖｉｅｗｌｕｘ, Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ)に入れ、５分間プレインキュベートした後に蛍光を読み取り、結果をプロットした。化合物は１０μＭアルブミンの存在下および不在下、一定の濃度範囲でアッセイしたところ、用量反応曲線をアルブミンの有り無しで当てはめることができた。ＥＣ５０を算出し、下記表３にまとめる。
【表３】
【０１３４】
上記の結果は、全ての供試融合体分子がＧＬＰ−１受容体に結合する能力を保持していることを示す。これらの結果はまた、この能力が血清アルブミンの存在下でも保持されることを示す。従って、これらの融合体分子は、ｉｎ ｖｉｖｏでＧＬＰ−１受容体と結合する能力を保持する可能性が高い。
【０１３５】
実施例４：ＨＥＫ２９３哺乳類組織培養物におけるＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６、ＤＡＴ０１１７およびＤＡＴ０１２０の発現とその後のプロテインＬによるアフィニティー捕捉およびイオン交換クロマトグラフィー
本試験の目的は、in vivoおよびin vitro特性決定のためにタンパク質を作製することであった。タンパク質は、これまでに記載されているように哺乳類組織培養でＨＥＫ２９３Ｅ細胞においてｐＴＴ−５ベクターから発現させた。簡単に述べると、エンドトキシン不含ＤＮＡを調製および精製し、それを用いてＨＥＫ２９３Ｅ細胞をトランスフェクトした。タンパク質発現は振盪培養器で３０℃にて５日間とし、培養物を回転沈降させ、（目的タンパク質を含有する）上清を回収した。その上清から、プロテインＬアガロースＳｔｒｅａｍｌｉｎｅアフィニティー樹脂（樹脂はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製で、プロテインＬは当所で結合させた）によるアフィニティー捕捉によってタンパク質を精製した。次に、樹脂をカラム容積の１０倍のＰＢＳで洗浄した後、カラム容積の５倍の０．１ＭグリシンｐＨ２．０でタンパク質を溶出した。カラム容積と同量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−グリシン ｐＨ８．０で中和した。この場合（前の実施例とは対照的に）、その後さらに精製を行った。タンパク質（Ｔｒｉｓ−グリシン中）を、２０ｍＭ酢酸バッファーｐＨ５．０へのバッファー交換を行った後、２０ｍＭ酢酸バッファーｐＨ５．０で予め平衡化した１本の（または並行した２本の）６ｍｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓカラム(ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)上にＡｋｔａを用いて添加した。同じバッファーで洗浄した後、２０ｍＭ酢酸バッファーｐＨ５．０中０〜０．７５Ｍまたは０〜１Ｍ ＮａＣｌ勾配によってタンパク質を溶出した。次いで、適正なサイズの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動および質量分析により同定した後、それらを合わせて最終のタンパク質サンプルとした。その後、タンパク質を、２０ｍＭクエン酸バッファーｐＨ６．２、１００ｍＭ ＮａＣｌにバッファー交換し、０．５〜５ｍｇ／ｍｌの間に濃縮した。タンパク質を０．２μＭフィルターで濾過して無菌性を確保した。その後、タンパク質を下記の実施例に使用した。
【０１３６】
実施例５：１回、３回および６回の凍結融解サイクルに対するＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６、ＤＡＴ０１１７およびＤＡＴ０１２０の安定性の比較
本試験の目的は、１回、３回および６回の凍結融解サイクルに対するＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６、ＤＡＴ０１１７およびＤＡＴ０１２０の安定性を比較することであった。各タンパク質は、前記のように哺乳類組織培養でＨＥＫ２９３Ｅ細胞においてｐＴＴ−５ベクターから発現させ、プロテインＬアフィニティー樹脂で精製した後、イオン交換クロマトグラフィーを行った。タンパク質は、２０ｍＭクエン酸バッファー、１００ｍＭ ＮａＣｌにバッファー交換し、同バッファーを用いて０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。次に、各タンパク質の０．５ｍｌアリコート（エッペンドルフ管中）に対して０回、１回、３回または６回の凍結融解サイクルを行い、各サイクルはドライアイス上での３分間とその後の３７℃の水浴中での２分間を含んだ。（タンパク質溶液を完全に融解させるには３７℃２分間で十分であることが試験中に認められた）。必要な回数の凍結融解サイクルを終えた後、タンパク質サンプルは次に分析するまで２〜８℃で保存した。その後、タンパク質に対してＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動、ＧＬＰ−１Ｒ結合アッセイ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーおよび質量分析法による分析を行った。４つのタンパク質全てのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析結果、ＧＬＰ−１Ｒ ＢＡによる能力、および質量分析結果は、１回、３回または６回の凍結融解サイクルによって、ベースラインから有意には変化しないことが見出された。ＳＥＣ分析における最大ピークの高さは影響を受け、６回の凍結融解サイクル後、ＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６、ＤＡＴ０１１７およびＤＡＴ０１２０のそれぞれで最大の高さの７８％、８６％、１０４％および５７％が維持された。ＤＡＴ０１２０は、凍結融解サイクルに対して他の３つのタンパク質よりも安定性が低いと結論づけられた。
【表４】
【０１３７】
実施例６：ＩＩ型糖尿病のｄｂ／ｄｂマウスモデルにおけるＤＡＴ０１１５の作用持続時間の実証
本試験の目的は、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて、経口耐糖能に対するＤＡＴ０１１５の作用の持続時間を測定することであった。試験開始の３日前に血糖値の低下で動物を分類し、その後ブロック化した。各ブロック内の動物１個体を、２６の各試験群に割り当てた。これにより、各試験群における平均開始血糖値の類似性を確保した。
【０１３８】
ＤＡＴ０１１５（上記のように、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞で作製し、精製した）を、経口ブドウ糖負荷の５、２４、４８、７２、９６または１２０時間前のいずれかに、１ｍｇ／Ｋｇ、０．３ｍｇ／Ｋｇまたは０．１ｍｇ／Ｋｇで皮下投与した。（全ての用量を全ての時点で投与したわけではなく、詳細については下表を参照）。ＤＡＴ０１１５は、ビヒクルで処置したｄｂ／ｄｂマウスに比べて、０．１ｍｇ／Ｋｇおよび０．３ｍｇ／Ｋｇの用量では２４時間まで（２４時間を含む）、１ｍｇ／Ｋｇの用量では７２時間まで（７２時間を含む）の時点で、２時間の経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）について、グルコースＡＵＣを有意に減少させた。陽性対照として４２μｇ／Ｋｇで投与したエキセンディン−４もやはり、経口ブドウ糖ボーラス投与の５時間前に投与した場合、ＯＧＴＴ後のグルコースＡＵＣを有意に減少させた。下記表５は、ビヒクルと比較した場合のＤＡＴ０１１５の各試験群のＡＵＣ減少パーセンテージを示す。アステリスクは、偽発見率補正(ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ)を用いてＤＡＴ０１１５をビヒクルと比較した場合にＰ＜０．０５であることを示す。
【表５】
【０１３９】
実施例７：食餌性肥満（ＤＩＯ）マウスの肥満モデルにおけるＤＡＴ０１１５の有効性の実証
本試験の目的は、確立されたマウス摂食モデル（食餌性肥満マウス）を用いて、摂食量および、結果としての体重がＤＡＴ０１１５処置によって影響を受けるかどうかを調べることであった。これはヒトに対する予測となり得る。雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Taconicから購入）は、６０％ｋｃａｌ高脂肪の放射線照射済み食餌で１２週間太らせた後、所内施設に移した。到着後、そのマウスを、温度および湿度制御室（７０〜７２°Ｆ、湿度＝４８〜５０％、５ＡＭ／５ＰＭ光周期）のａｌｐｈａ−ｄｒｉ床敷上に個別に収容した。食餌を４５％高脂肪食に変え、動物を１８日間順応させた。供試化合物を投与する前に、３日間１日１回マウスに生理食塩水を皮下注射し、摂餌量をモニタリングした。マウスは、群間または群内で体重および摂餌量に差がないようにブロック化および群分けした。試験当日、８匹のマウスからなる群に５ｍｌ／ｋｇの注射量で下記のように皮下投与を施した：３群にＤＡＴ０１１５を投与し（低用量、中用量および高用量）、１群に陰性対照分子（ＤＯＭ７ｈ−１４ ＡｌｂｕｄＡｂ、エキセンディン−４複合体を含まない）、そして、１群にエキセンディン−４陽性対照を投与した。
【表６】
【０１４０】
１日の摂餌量および体重を１０日間毎日測定した。ＤＡＴ０１１５は、ＤＯＭ７ｈ−１４対照に比べて用量依存的な体重および摂餌量の減少を示した（図３ａおよび３ｂ参照）。従って、このマウス試験から得られたデータは、ＤＡＴ０１１５が良好な臨床候補であるという仮説を支持すると結論づけられた。
【０１４１】
実施例８：マウスＩＩ型糖尿病モデルにおけるＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６およびＤＡＴ０１１７の血漿半減期の測定
本試験の目的は、マウスＩＩ型糖尿病モデル（ｄｂ／ｄｂマウス）においてＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６およびＤＡＴ０１１７の血漿消失特性を決定し、その結果からＰＫパラメーターを算出することであった。ＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６およびＤＡＴ０１１７タンパク質は前記のように調製した。簡単に述べると、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞を用いて哺乳類組織培養でタンパク質を発現させ、プロテインＬ−アガロースアフィニティー樹脂へのバッチ吸着によって精製した後、グリシンｐＨ２．０で溶出し、Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０で中和した。その後、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓカラムで、２０ｍＭ酢酸ｐＨ５．０中０〜１Ｍの塩勾配を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。次に、目的タンパク質を含有する画分を合わせ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭクエン酸ｐＨ６．２にバッファー交換した。タンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏで使用する前に、濾過除菌、バッファー交換およびエンドトキシン除去を行い、試験した。
【０１４２】
絶食させていない雄ｄｂ／ｄｂマウス（レプチン受容体遺伝子（ｌｅｐｒ）に突然変異があり、レプチン受容体を欠いたＬＥＰｒ ｄｂ同系接合性マウス）の群には、１ｍｇ／ＫｇのＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６またはＤＡＴ０１１７の皮下または静脈投与を行った。ｉｖ投与については、投与前、投与の０．２５、０．５、１、４、７、１２、２４、３６、４８および６０時間後、ならびにｓｃ投与については、投与前、投与の０．５、１、４、７、１２、２４、３６、４８および６０時間後に、血液サンプルを末梢採血によって採取し、血漿を調製した。血漿サンプルは凍結し、後に、必要に応じて、固相抽出およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６またはＤＡＴ０１１７レベルを分析するために解凍して、タンパク質断片の存在を検出した（タンパク質のエキセンディン−４部分から）。次に、算出された血漿レベルを用いて、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアを用い、薬物動態パラメーターの当てはめを行った。皮下および静脈投与後の半減期およびバイオアベイラビリティの概要を下表に示す。これらの結果から（下記表７参照）、３つの化合物はいずれも、マウスＩＩ型糖尿病モデルにおいて、望ましい薬物動態パラメーターを示すと結論づけられた。よって、これらの分子は、糖尿病のヒトにおいて、良好なＰＫパラメーターをもたらす可能性があり、この試験はＤＡＴ０１１７よりもＤＡＴ０１１５またはＤＡＴ０１１６の選択に好都合である。
【表７】
【０１４３】
実施例９：ラットにおけるＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６、ＤＡＴ０１１７の血漿半減期の測定
本試験の目的は、ラットにおいてＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６およびＤＡＴ０１１７の血漿消失（排出）特性を決定し、それらの結果からＰＫパラメーターを算出することであった。ＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６およびＤＡＴ０１１７タンパク質は前記のように調製した。簡単に述べると、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞を用いて哺乳類組織培養でタンパク質を発現させ、プロテインＬ−アガロースアフィニティー樹脂へのバッチ吸着によって精製した後、グリシンｐＨ２．０で溶出し、Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０で中和した。その後、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓカラムで、２０ｍＭ酢酸ｐＨ５．０中０〜１Ｍの塩勾配を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。次に、目的タンパク質を含有する画分を合わせ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭクエン酸ｐＨ６．２にバッファー交換した。タンパク質はｉｎ ｖｉｖｏで使用する前に、濾過除菌、バッファー交換し、品質確認を行った。
【０１４４】
血漿半減期を測定するために、３匹のラットからなる群に、１回の静脈（ｉ．ｖ．）または皮下（Ｓ．Ｃ．）注射で０．３ｍｇ／Ｋｇ（ｉｖ）または１ｍｇ／Ｋｇ（ＳＣ）のＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６またはＤＡＴ０１１７を投与した。血漿サンプルは、７２時間にわたって尾静脈から順次出血させることによって得、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析して、融合体の断片の存在を検出した（融合体のエキセンディン−４部分から）。次に、算出された血漿レベルを用いて、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアを用い、薬物動態パラメーターの当てはめを行った。皮下および静脈内投与後の半減期およびバイオアベイラビリティの概要を下記の表８に示す。これらの結果から、３つの化合物はいずれも、ラットにおいて、望ましい薬物動態パラメーターを示すと結論づけられた。よって、これらの分子は全て、ヒトにおいて、良好なＰＫパラメーターをもたらす可能性があり、この試験は、ＤＡＴ０１１６またはＤＡＴ０１１７よりもＤＡＴ０１１５の選択に好都合であった。
【表８】
【０１４５】
実施例１０：カニクイザルにおけるＤＡＴ０１１５の血漿半減期の測定
本試験の目的は、ヒト以外の霊長類（カニクイザル）においてＤＡＴ０１１５に関する薬物動態パラメーターを決定してパラメーターの非比例的尺度化を図ること、およびＤＡＴ０１１５がヒトにおいて良好なＰＫ特性を有する可能性が高いかどうかについてできる限り最良の指標を与えることであった。ＤＡＴ０１１５エキセンディン−４ ＡｌｂｕｄＡｂ融合体は、哺乳類組織培養においてＨＥＫ２９３Ｅ細胞で発現させ、前記のように精製した。簡単に述べると、プロテインＬ−アガロースアフィニティー樹脂へのバッチ吸着によってタンパク質を精製し、グリシンｐＨ２．０で溶出し、Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０で中和した。その後、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓカラムで２０ｍＭ酢酸ｐＨ５．０中０〜１Ｍの勾配を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。その後、目的タンパク質を含有する画分を集め、バッファーを１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭクエン酸ｐＨ６．２に交換した。
【０１４６】
タンパク質に詳細な品質確認を行い（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析、活性アッセイ：ＧＬＰ−１Ｒ−ＢＡ、ｐＨ確認、浸透圧確認を含む）、濾過除菌し、エンドトキシンを除去した。エンドトキシンが低いことが確認されたタンパク質（＜０．０５ＥＵ／ｍｇタンパク質）をその後in vivo試験に使用した。
【０１４７】
この試験では６匹の雌カニクイザル(Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ; Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＢＲＦ, Ｈｏｕｓｔｏｎ, ＴＸ, Ｐｒｉｍａｔｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ, Ｍｉａｍｉ, ＦＬおよび／またはＣｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ, Ｉｎｃ., Ａｌｉｃｅ, ＴＸ)を使用した。サルは投与開始時に約２〜９才（体重範囲は約２〜５キログラム）であった。サルは個別に、環境制御室（華氏６４〜８４度；相対湿度３０〜７０％、１２時間明暗周期）内のステンレスケージに収容した。これらの雌サルに、Ｍｏｎｋｅｙ Ｄｉｅｔ＃５０３８(ＰＭＩ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ, Ｒｉｃｈｍｏｎｄ, ＩＮ)のビスケット約６個を１日２回与え、新鮮な果物を毎日割り当てた。各動物に、投与群（ｓｃ３匹、ｉｖ３匹）に応じて、供試化合物（ＤＡＴ０１１５）を皮下または静脈投与した。用量は０．１ｍｇ／Ｋｇとした。投与当日は、各サルへの投与後約１時間以内に最初の給餌を行った（試験に関係する手順として動物を長時間その個体の飼育ケージから出す必要がる場合には、投与後２．５時間まで延長される）。２回目の給餌は、１回目の給餌の２時間後より早くには行わなかった。環境を豊かにするため、各サルに、追加の果物、豆類および／または野菜（例えば、ブドウ、ベビーキャロット、ピーナッツ）を生存率確認時もしくはその前後に、または順応後もしくは試験関連の手順後の報酬の方法として与えた。濾過した水道水（Ａｑｕａ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ, Ｉｎｃ.提供、定期的に分析）は自由に摂らせた。
【０１４８】
投与前（０時間）、ならびに投与後わずか５分（ｉｖ群のみ）、０．５、４、８、２４、４８、９６、１４４、１９２、２８８、３３６、５０４および６７２時間の時点で、大腿血管から血漿サンプル（約２ｍｌ）を採取した。（ｉｖ投与群の動物のうち１頭から得られたＰＫサンプルは２４時間までしか採取しなかったので、この動物はＰＫの当てはめから除外した）。サンプルの分析は質量分析によって行い、データの当てはめは、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ当てはめソフトウェアによって行った。ＰＫパラメーターは下記のとおり、ｉｖ投与（ｎ＝２）では、Ｔ１／２ ６７時間、ＭＲＴ ４６時間、Ｖｚ ３２７ｍｌ／ＫｇならびにＣｌ ３．３ｍｌ／時／Ｋｇであり、ｓｃ投与（ｎ＝３）では、Ｔ１／２ ６８時間、ＭＲＴ ９８時間、Ｖｚ ３０６ｍｌ／ＫｇならびにＣｌ ３．１ｍｌ／時／Ｋｇであった。バイオアベイラビリティは９９％と計算された。
【０１４９】
この試験（ならびにカニクイザルおよびヒト血清アルブミンのｂｉａｃｏｒｅ結合データ）から、カニクイザルにおけるＤＡＴ０１１５の６８時間という皮下投与の半減期（上記の通り）によって、ヒトでの同分子の半減期が週１回（またはそれより少ない回数）の投与の要件に相関させるに十分長いものである可能性が高いという確信が得られるものと結論づけられた。
【０１５０】
実施例１１：カニクイザルにおけるＤＡＴ０１１５のＰＤの測定
カニクイザルで上記のようにＰＫ試験を行った。本試験の主要な目的は、（前期実施例に記載のように）カニクイザルにおいてＤＡＴ０１１５に関する薬物動態パラメーターを決定することであったが、第二の目的は、そのサルにおけるＤＡＴ０１１５化合物の有効性の指標を得ることであった（本試験には統計的有意性に関する十分な検出力は無い）。この二次的目的を達成するために、サルによるビスケットの消費を本研究の過程でモニタリングした。投与後数日間、全てのサルに摂食量の減少傾向があることが示された。これはおそらく、この分子のエキセンディン−４部分の、十分に立証された、食欲抑制剤としての効果によるものであると結論づけられた。従って、ＤＡＴ０１１５はｉｎ ｖｉｖｏで活性があることが示された。動物の快適な生活を確保するため、果物およびおやつはビスケットの消費に関わらずほとんどの日に与えた。
【表９】
【０１５１】
実施例１２：表面プラズモン共鳴を用いたＤＡＴ０１１５エキセンディン−４ ＡｌｂｕｄＡｂ融合体のラット、カニクイザルおよびヒト血清アルブミンとの結合
ＤＡＴ０１１５を発現させて精製した後、表面プラズモン共鳴(Ｂｉａｃｏｒｅ, ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)によって分析し、親和性に関する情報を得た。分析は、ビオチン化血清アルブミンをコーティングしたストレプトアビジンチップ（ＳＡ）を用いて行った。２００〜１０００レゾナンスユニット（ＲＵ）の各血清アルブミンをチップに固定化した。フローセル１はコーティングせず、フローセル２はＨＳＡでコーティングし、フローセル３はＲＳＡでコーティングし、フローセル４はＣＳＡでコーティングした。一定の濃度範囲の融合体を、ＢＩＡＣＯＲＥ ＨＢＳ−ＥＰバッファー（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）中への希釈によって１５．６ｎＭ〜２μＭの範囲で調製し、ＢＩＡＣＯＲＥチップに流した。
【０１５２】
親和性（ＫＤ）は、ＢＩＡＣＯＲＥ出力から、ＫＤ領域内のｄＡｂ濃度によって作成された出力に結合速度および解離速度曲線を当てはめることによって計算した。親和性（ＫＤ）を下表にまとめる。
【表１０】
【０１５３】
実施例１３：示差走査熱量測定によるＤＡＴ０１１５熱変性の特性評価
本試験の目的は、オートサンプラーを備えたキャピラリーセルマイクロ熱量計ＶＰ−ＤＳＣ(Ｍｉｃｒｏｃａｌ)を用いて、ＤＳＣ（示差走査熱量測定）によってＤＡＴ０１１５の熱変性をモニタリングすることであった。タンパク質は、２０ｍＭクエン酸ｐＨ６．２、１００ｍＭ ＮａＣｌ中で一晩透析し、濾過した後、２８０ｎｍの吸光度により測定した場合に１ｍｇ／ｍｌの濃度となるように調製した。濾過した透析バッファーを全サンプルに対する標準として使用した。ＤＳＣは１８０℃／時間の加熱速度で行った。各サンプルの前に、１％ｄｅｃｏｎ溶液、次いでバッファーを注入してセルを洗浄し、機器のベースラインとした。得られた出力を、Ｏｒｉｇｉｎ ７ Ｍｉｃｒｏｃａｌソフトウェアを用いて分析した。標準バッファーから得られたＤＳＣ出力をサンプル出力から差し引いた。計算にはサンプルの正確なモル濃度を用いた（Ｏｒｉｇｉｎにより自動的に実施）。遷移前後の上および下のベースライン直線領域の両方に対するベースライン設定は、三次ｃｏｎｎｅｃｔ関数を用いて選択し、関連づけを行った。得られたグラフを非２状態モデルに当てはめ、見かけのＴｍおよびΔＨ／ΔＨｖ値を得る。
【０１５４】
ＤＡＴ０１１５から得られた出力を非２状態遷移モデルに当てはめたところ、見かけＴｍは５６．３℃であった。適合度（フィット）は十分であった（図４参照）。同じ装置を用いて実施した対照出力のリゾチームは、予想どおり完全に適合した良好な品質データを示した。（リゾチームについて得られた見かけＴｍは７６．２℃であり、これは文献で報告されたものと一致する（図５参照））。よって、この試験から、ＤＡＴ０１１５が臨床候補として許容される５６．３℃の融点を有する分子であることを示す信頼性のあるデータが得られたものと結論づけられた。
【０１５５】
実施例１４：ＳＥＣ ＭＡＬＬＳによる溶液状態のＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１７およびＤＡＴ０１２０の特性決定
この試験の目的は、ＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１７およびＤＡＴ０１２０の溶液状態をＳＥＣ ＭＡＬＬＳによって測定することであった。サンプルを精製し、適当なバッファー（ＰＢＳ）に対して透析し、透析後に濾過し、濃度を測定し、１ｍｇ／ｍｌに調整した。ＢＳＡおよびＨＳＡはSigmaから購入し、それ以上精製することなく使用した。
【０１５６】
機器の詳細：
オートサンプラー（ＳＩＬ−２０Ａ）およびＳＰＤ−２０Ａ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＵＶ／Ｖｉｓ検出器を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−２０ＡＤ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣシステムを、Ｗｙａｔｔ Ｍｉｎｉ Ｄａｗｎ Ｔｒｅｏｓ（ＭＡＬＬＳ、多角度光散乱検出器）およびＷｙａｔｔ Ｏｐｔｉｌａｂ ｒＥＸ ＤＲＩ（示差屈折計）に接続した。検出器は−ＬＳ−ＵＶ−ＲＩの順序で接続した。ＲＩおよびＬＳ機器はいずれも４８８ｎｍの波長で操作した。５０もしくは２００ｍＭリン酸バッファー（塩を含有するもしくは含有しない）、ｐＨ７．４または１×ＰＢＳの移動相を用いて、ＴＳＫ２０００(Ｔｏｓｏｈ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ)またはＢｉｏＳｅｐ２０００(Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ)カラム（双方とも同じ分離範囲１〜３００ｋＤａのシリカ系ＨＰＬＣカラム）を使用した。使用流速は０．５または１ｍｌ／分とし、作動時間は流速の違いに応じて調整し（４５または２３分）、分子の分離に有意な影響を及ぼさないと予想される。タンパク質はＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、注入量は１００μｌとした。光散乱検出器は、製造業者の説明書に従ってトルエンで較正した。ＵＶ検出器およびＲＩ検出器のアウトプットを光散乱装置と接続し、Ｗｙａｔｔ ＡＳＴＲＡソフトウェアを用いて３つの検出器からのシグナルを全て同時に収集できるようにした。ＰＢＳ移動相中のＢＳＡ（０．５または１ｍｌ／分）をＴｏｓｏｈ ＴＳＫ２０００カラムに数回注入し、ＵＶ、ＬＳおよびＲＩシグナルをＷｙａｔｔソフトウェアによって収集する。次に、その出力を、ＡＳＴＲＡソフトウェアを用いて分析し、製造業者の説明書に従い、シグナルを正規化し、アラインし、バンドの広がりを補正する。その後、較正定数の平均を求め、以降のサンプル測定に使用されるテンプレートにインプットする。
【０１５７】
絶対モル質量の計算：
１ｍｇ／ｍｌのサンプル１００μｌを、予め平衡化した適当なカラムに注入した。ＳＥＣカラムの後、サンプルを３つのオンライン検出器、ＵＶ、ＭＡＬＬＳ（多角度光散乱）およびＤＲＩ（示差屈折率）検出器に通すことで、絶対モル質量の測定が可能となる。カラムで生じる希釈は約１０倍であることから、溶液中の状態を測定している際の濃度は１００μｇ／ｍｌ、すなわち、約８μＭ ｄＡｂとなる。
【０１５８】
ＡＳＴＲＡでの計算およびＺｉｍｍプロット法の原理（多くの場合バッチサンプルモードで実施される）は、Ｚｉｍｍ ［Ｊ. Ｃｈｅｍ. Ｐｈｙｓ. １６, １０９３−１０９９ （１９４８）］の式である：
【数１】
式中、
ｃは、溶媒中の溶質分子の質量濃度（ｇ／ｍｌ）であり、
Ｍは、重量平均モル質量（ｇ／ｍｏｌ）であり、
Ａ２は、第２ビリアル係数（ｍｏｌ ｍＬ／ｇ２）であり、
Ｋ＊＝４ｐ２ｎ０２（ｄｎ／ｄｃ）２ｌ０−４ＮＡ−１は光学定数であり、ここでｎ０は入射光（真空）波長での溶媒の屈折率であり、ｌ０はナノメーター単位で表された入射光（真空）波長であり、ＮＡはアボガドロ数（６．０２２×１０２３ｍｏｌ−１に相当）であり、ｄｎ／ｄｃは溶媒−溶質溶液の、溶質濃度の変化に対する示差屈折率の増加をｍＬ／ｇで表したものである（この因子はｄＲＩ検出器を用いて独立に測定しなければならない）、
Ｐ（ｑ）は、理論的に導き出された形状因子であって、およそ１−２μ２＜ｒ２＞／３！＋・・・に相当し、ここで、μ＝（４π／λ）ｓｉｎ（θ／２）であり、＜ｒ２＞は平均二乗半径である。Ｐ（ｑ）は、分子のｚ平均サイズ、形状および構造の関数であり、
Ｒｑは過剰Ｒａｙｌｅｉｇｈ比である（ｃｍ−１）］。
【０１５９】
この式は、垂直に偏光／入射光を仮定し、ｃ２の次数まで有効である。
【０１６０】
ｓｉｎ２（ｑ／２）に対するＲｑ／Ｋ＊ｃのプロットへの当てはめである、Ｚｉｍｍフィット法によって計算を行うために、ｃについて一次まで式１の逆数を展開する必要がある。
【０１６１】
ｓｉｎ２（ｑ／２）に対するＲｑ／Ｋ＊ｃのプロットへの当てはめである、Ｚｉｍｍフィット法により計算を行うために、ｃについて一次まで式１の逆数を展開する必要がある。
【数２】
【０１６２】
この場合、適切な結果は
【数３】
および
【数４】
であり、式中、
【数５】
である。
【０１６３】
計算は、ＡＳＴＲＡソフトウェアにより自動的に行われ、その結果としてプロットが得られ、各スライスについてモル質量が決定された［ＡＳＴＲＡマニュアル］。
【０１６４】
クロマトグラムで観察された各ピークについてのプロットから得られたモル分子量を、タンパク質の単一ユニットの予測分子量と比較する。これによってタンパク質の溶解状態について結論を下すことができる。
【０１６５】
試験データ：
ＤＡＴ０１１５
２０ｍＭクエン酸、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．２で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムに、１ｍｇ／ｍｌ ＤＡＴ０１１５を１００μｌ注入した。流速は０．５ｍｌ／分に設定した。タンパク質は単一ピークとして溶出し、分子量はピークの全幅にわたって１７．４ｋＤａと測定された（単量体の予測分子量は１６．９ｋＤａ）。溶出効率は１００％である。図６参照。（ＨＳＡ対照は予測通りの挙動を示し、ＤＡＴ０１１５に関する試験結果を実証した。それは分子量６４ｋＤａ（単量体）および１１０ｋＤａ（二量体）の２つのピークとして溶出する。ＨＳＡ二量体の分子量は、このピーク内のタンパク質の量が極めて少ないためにあまり正確でない可能性がある）。
【０１６６】
ＤＡＴ０１１７
５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．４で平衡化したＴＳＫ２０００カラムに、１ｍｇ／ｍｌ ＤＡＴ０１１７を１００μｌ注入した。流速は１ｍｌ／分に設定した。ＤＡＴ０１１７の注入量の約５０％は、３５〜４５ｋＤａ（二量体以上）前後の分子量を有する２つの重複したピークとしてカラムから溶出したが、これは、ここで試験された条件での強い自己会合を示唆する。（ＢＳＡ対照は予測通りの挙動を示し、ＤＡＴ０１１７の試験結果を実証し、分子質量６１ｋＤａおよび１４６ｋＤａ（単量体および二量体）の２つのピークを示す）。ＳＥＣ Ｍａｌの結果については図７参照。
【０１６７】
ＤＡＴ０１２０
５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．４で平衡化したＴＳＫ２０００カラムに、１ｍｇ／ｍｌ ＤＡＴ０１１７を１００μｌ注入した。流速は１ｍｌ／分に設定した。ＤＡＴ０１２０の注入量の約５０％は、２５ｋＤａ前後と測定された分子量を有するやや非対称のピークとしてＧＦカラムから溶出した。これは、ここで試験された条件でのＤＡＴ０１２０の強い自己会合を示唆し、タンパク質は単量体−二量体の迅速な平衡状態にあると思われる。（ＢＳＡ対照は予測通りの挙動を示し、ＤＡＴ０１２０の試験結果を実証し、分子量６１ｋＤａおよび１４６ｋＤａ（単量体および二量体）の２つのピークを示した）。ＳＥＣ Ｍａｌの結果については図８参照。
【０１６８】
上記の試験結果から、ＤＡＴ０１１５は、ここで使用された条件下で、有意な自己会合を示す他の２つの分子に比べて、自己会合が有意に小さい（場合によっては、無い）と結論づけられた。溶液中の単量体状態は、ｉｎ ｖｉｖｏ作用、ならびに製造時の上流および下流プロセスに関して好ましいものであり得るので、ＤＡＴ０１１５は、溶解状態に関して、臨床的進展のために最も理想的な分子であるといえる。
【０１６９】
実施例１５：アフィニティマトリックス・プロテインＬを使用しない哺乳類発現からの精製
ＤＡＴ０１２０およびＤＡＴ０１１５はいずれも、ＨＥＫ２９３上清から精製した。各タンパク質を哺乳類組織培養でＨＥＫ２９３Ｅ細胞においてｐＴＴ−５ベクターから発現させた。ＭＥＰ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ樹脂の１ｍｌカラムをＰＢＳで平衡化し、０．１Ｍ水酸化ナトリウムで洗浄した後、ＰＢＳで再び平衡化した。上清２００ｍｌを２．５ｍｌ／分でカラムに加えた後、カラムをＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２で溶出した。
【０１７０】
溶出後、１／５容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８を加えることでサンプルを中和し、室温で保存した。サンプルは保存後に少量の沈殿が見られたことから、脱塩処理の前にｓｔｅｒｉｆｌｉｐデバイスを用いて濾過した。
【０１７１】
２つの２６／１０ ＨｉＰｒｅｐ脱塩カラムは２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５（実測値ｐＨ５．３）１０ｍｌ／分で平衡化し、０．１Ｍ ＮａＯＨを添加することで洗浄し、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５で再平衡化した。
【０１７２】
ＤＡＴ０１１５は２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５中で脱塩した後、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５（実測値５．２）で平衡化した１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＳＰＦＦに添加した。このカラムを洗浄した後、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５、１Ｍ ＮａＣｌを用いた０〜１００％勾配にかけ、５ｍＡＵｓを越える吸光度を有する溶出画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１７３】
ＳＰ ＦＦ画分を一晩保存した後、そのサンプルを０．２μｍフィルタで濾過し、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、１００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した２本の２６／１０ ＨｉＰｒｅｐ脱塩カラムに加えた。溶出液を２０ｍｌ遠心濃縮器で濃縮し、濾過除菌し、エンドトキシンを１／１０および１／２００希釈で試験した。
【０１７４】
２通りの希釈でエンドトキシンを試験したところ、１／１０希釈はスパイク回収率２５０で３０ＥＵ／ｍｌの値を示した。１／２００試験は、スパイク回収率１２６％で＜１０．８ＥＵ／ｍｌの値を示した。ＩＤ２７８２３を用いてサンプルに質量分析を行った。高負荷量では、８０ｋＤａマーカーより下と１００〜１６０ｋＤａマーカーの間に見られる低レベルの夾雑物がある。サンプルの純度は９５％より高いと思われる。
【０１７５】
実施例１６ エキセンディン−４およびＤＯＭ７ｈ−１４−１０／ＤＯＭ７ｈ−１１−１５ ＡｌｂｕｄＡｂの遺伝子融合体の発現および精製
本試験の目的は、ＤＭＳ７１３９およびＤＭＳ７１４３を効率的に発現させることであった。ＤＭＳ７１３９は、適切にプロセシングされたＮ末端を有する大腸菌における、エキセンディン−４とＤＯＭ７ｈ−１４−１０（血清アルブミンと結合するドメイン抗体（ｄＡｂ）、ＡｌｂｕｄＡｂ（商標）としても知られる）との融合体であり、ＤＭＳ７１４３はエキセンディン−４とＤＯＭ ７ｈ−１１−１５（血清アルブミンと結合するドメイン抗体（ｄＡｂ）、ＡｌｂｕｄＡｂとしても知られる）との融合体である。次に、その後の試験で、この融合体のエキセンディン−４部分とＡｌｂｕｄＡｂ部分の活性を調べることができる。
【０１７６】
エキセンディン−４をＤＯＭ７ｈ−１４−１０またはＤＯＭ７ｈ−１１−１５との融合体としてクローニングしたが、この場合、エキセンディン−４ペプチドは構築物の５’末端にあり、ＡｌｂｕｄＡｂは３’末端にあった。それぞれエキセンディン−４ペプチドとＡｌｂｕｄＡｂの間に（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを含む全部で２つの構築物を作製した。このリンカーは、エキセンディン−４とＧＬＰ−１受容体の間の結合の立体障害を防ぐためにエキセンディン４をｄＡｂから空間的に分離するためのスペーサーとして含まれた。これらの構築物の配列を図１（ｍ）および１（ｎ）に示す。発現ベクターへのクローニングを可能とするために、融合体を５’にＮｄｅＩ制限部位とその後に改変ＯｍｐＴ（ＯｍｐＴ ＡＷＡ、そのアミノ酸配列は図１（ｑ）配列番号２８に示される）シグナルペプチドを有し、３’末端にＢａｍＨＩ部位を有するアセンブリＰＣＲとして作製した。ＯｍｐＴ ＡＷＡシグナルペプチドは、最後の３つのコドンが野生型から、ＳＦＡの代わりにＡＷＡをコードする「ＧＣＴＴＧＧＧＣＣ」に変更されていた（図２（ｐ）：配列番号３３に示される）。その変異は大腸菌のシグナルペプチダーゼによる適切な部位でのプロセシングを向上させる。
【０１７７】
その上、このペプチダーゼ切断部位のすぐ後に融合体の配列が始まる。シグナルペプチドの最後のコドンおよびエキセンディン−４配列の最初の２つのアミノ酸で重複するＮｃｏＩ消化部位が導入されている。この変異は、以後の、エキセンディン−４のフリーのＮ末端を有する融合体のサブクローニングならびに生産誘導を容易にする。上記に挙げた変異を含む改変されたｐＥＴ１２ａ発現ベクター（ｐＥＴベクターはＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した）をｐＤＯＭ３５と呼称した。ベクターおよびアセンブリＰＣＲをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した後、この挿入配列を、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いてベクターに連結した。この連結物２μｌをＭａｃｈＩ細胞の形質転換に用いた。回復増殖期の後、細胞を、カルベニシリンを含有する寒天プレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。コロニーを配列決定し、適切な配列を含むものをプラスミド増殖および単離(Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐキット、Ｑｉａｇｅｎ)に用いた。ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をプラスミドＤＮＡで形質転換し、得られたコロニーを発現培養物の接種に用いた。発現は、ＴＢ Ｏｎｅｘ培地（Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）の４×０．５リットル培養物、消泡剤１滴および１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンの接種によって行った。培養物を、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で３晩インキュベートした後、培養上清を３７００ｘｇで１時間の遠心分離によって清澄化した。その後、発現したタンパク質を清澄上清から、プロテインＬストリームライン（GE Healthcare，カタログ番号２８−４０５８−０３，プロテインＬ結合型）を用いて精製し、プロテインＬから、０．１Ｍグリシン ｐＨ２．０を用いて溶出した後、０．１容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を用いて中和した。次に、タンパク質を濃縮し、バッファーＡ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム−酢酸 ｐＨ５．０）に対して透析し、ＡｋｔａＸｐｒｅｓｓ(ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)でのイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質をバッファーＡ（無塩バッファー）中、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ ６ｍｌカラムに添加した後、バッファーＢ勾配（２０ｍＭ酢酸ナトリウム−酢酸 ｐＨ５．０ １Ｍ ＮａＣｌ）を用い、６５分かけて０〜６８％Ｂにて画分として溶出した（ＤＭＳ７１３９の場合）。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析によって分析し、適切な質量のものをプールした。最終タンパク質を２０ｍＭクエン酸 ０．１Ｍ ＮａＣｌバッファーに対して透析し、属性をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析によって再確認した。
【０１７８】
実施例１７ 表面プラズモン共鳴を用いた、エキセンディン−４ ＡｌｂｕｄＡｂ融合体ＤＭＳ７１３９およびＤＭＳ７１４３の血清アルブミンとの結合
ＤＭＳ７１３９およびＤＭＳ７１４３を発現させ、上記のように精製し、表面プラズモン共鳴(Ｂｉａｃｏｒｅ， ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)によって分析して親和性に関する情報を得た。分析は、血清アルブミンでコーティングされた２つのＣＭ５チップ（カルボキシメチル化デキストランマトリックス）を用いて行った。約５００レゾナンスユニット（ＲＵ）の各血清アルブミンを酢酸バッファーｐＨ４．５中で固定化した。第１のチップはコーティングのない、ブロックされたフローセル１を含み、フローセル２はＭＳＡ（５６０Ｒｕｓ）でコーティングされていた。第２のチップはコーティングのない、ブロックされたフローセル１を備え、フローセル２はＨＳＡでコーティングされ、フローセル３はＣＳＡでコーティングされ、フローセル４はＲＳＡでコーティングされていた。全ての血清アルブミンに関して、目的はチップ上の３５０ＲＵのタンパク質の領域にコーティングを施すことであった。
【０１７９】
ＢＩＡＣＯＲＥ ＨＢＳ−ＥＰバッファー（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）に希釈することで、一定の濃度範囲の融合体を調製し（ＤＭＳ７１３９では５５ｎＭ〜１μＭの範囲、ＤＭＳ７１４３では２４ｎＭ〜４．４μＭの範囲）、ＢＩＡＣＯＲＥチップに流した。親和性（ＫＤ）は、ＢＩＡＣＯＲＥ出力から、ＫＤ領域内のｄＡｂ濃度によって作成された出力に結合速度および解離速度曲線を当てはめることによって計算した。親和性（ＫＤ）を下記表１１にまとめる。
【表１１】
【０１８０】
ＤＭＳ７１３９およびＤＭＳ７１４３は、血清アルブミンに対して１０〜９０ｎＭの範囲の親和性を有する（ＲＳＡに対するＤＭＳ７１４３の親和性を除く）と結論づけられた。これは、これまでの融合体（例えば、これらのアルブミンに対して数百ｎＭ範囲の親和性を有する、グリシンセリンリンカーでＤＯＭ７ｈ−１４ ＡｌｂｕｄＡｂと連結されたエキセンディン−４であるＤＡＴ０１１５）のＳＡに対する親和性よりも有意に高い。これらの新規融合体の（血清アルブミンに対する）より高い親和性は、より長いin vivo血漿半減期に表れる可能性があり、それは該融合体が同じ有効性でより少ない頻度で投与可能であること、および／または時間が経過しても血漿中により一定のレベルの薬剤を維持することができ、望ましくないｃＭａｘ関連の毒性または副作用を軽減する可能性があることを意味する。
【０１８１】
実施例１８
ＤＭＳ７１３９およびＤＭＳ７１４３融合体はＧＬＰ−１受容体結合アッセイで活性がある
ＧＬＰ−１Ｒは、このアッセイの目的で、ＣＨＯ細胞で発現させる７ＴＭ Ｇタンパク質共役受容体である。ＧＬＰ−１または類似体による受容体の活性化によって、この受容体に結合されているアデニル酸シクラーゼによるＡＴＰのｃＡＭＰへの変換がもたらされる。ＣＨＯ細胞に６ＣＲＥ／ｌｕｃリポーター遺伝子を安定的にトランスフェクトする。従って、受容体のＧＬＰ−１活性化の後にｃＡＭＰが生産されると、プロモーター遺伝子（６コピーのｃＡＭＰ応答エレメント−６ＣＲＥを含む）がルシフェラーゼリポーター遺伝子の発現を駆動する。その後、これはルシフェリンとの反応を触媒し、照度計で測定可能な光を生じる。
【０１８２】
方法：
ＣＨＯ ６ＣＲＥ ＧＬＰ１Ｒ細胞を、３７℃の湯浴中にバイアルを半分沈めることによって急速解凍し、バイアルの内容物を５０ｍｌのファルコン試験管に移し、バイアル当たり１０ｍｌのＲＰＭＩ（フェノールレッドフリー）アッセイ媒体（Sigma、カタログ番号Ｒ７５０９）＋２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５０３０）＋１５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ０８８７）を加えた。計数し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、細胞を適当な容量のＲＰＭＩアッセイ媒体に再懸濁させて１×１０６細胞／ｍｌとし、白色９６ウェル平底組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル組織培養プレート、ｗｈｉｔｅ ｓｔｅｒｉｌｅ、カタログ番号３９１７）の各ウェルに５０μｌずつ分注した。細胞を３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、細胞をインキュベーターから取り出し、予め調製した対照／サンプル５０μｌをウェルに加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに３時間戻した。
【０１８３】
エキセンディン−４対照の調製（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｅ７１４４）：
Ｖ底９６ウェルプレートにて、１９８μｌのＲＰＭＩアッセイ媒体に対して１ｍｇ／ｍｌのエキセンディン−４ ２μｌを加え、２．３９μＭ溶液とした。この２．３９μＭ溶液２μｌを２３７μｌ ＲＰＭＩアッセイ媒体に加え、２０ｎＭ溶液とした（１０ｎＭアッセイにおける終濃度）。プレートに対照１：１０の連続希釈を行い（対照１５μｌ＋ＲＰＭＩアッセイ媒体１３５μｌ）、８点曲線を作成した。
【０１８４】
未知のサンプルの調製：
未知のサンプルの調製にも対照の調製と同じ指針を用いる。上限濃度を必要なアッセイ濃度の２倍とし、プレートを１：１０希釈する。
【０１８５】
ルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ２６２０）の調製：
冷凍庫から必要な数のＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアリコートを取り出し、暗所にて室温で解凍させる。アッセイプレート１枚につき、５ｍｌバイアル１本で十分である。
【０１８６】
インキュベーションの後、５０μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬を全てのウェルに加え、プレートを室温で３分間インキュベートし、細胞溶解を生じさせた。発光（１秒当たりの計数値）を、Ｍ５ｅマイクロプレートリーダーを用いて読み取ったが、読み取りはウェルごとに０．１秒間とした。細胞だけを含むバックグラウンドウェルのＣＰＳを他の全てのウェルから差し引いた。対照ウェル（ＧＬＰ−１（７−３６）またはエキセンディン−４）は最高濃度で最大の刺激を示すはずである。未知のサンプルの濃度効果曲線を当てはめ、その曲線から、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍまたはＥｘｃｅｌＦｉｔソフトウェアを用いてＥＣ５０を算出する。
【０１８７】
２つのエキセンディン−４ ＡｌｂｕｄＡｂ融合体（ＤＭＳ７１３９およびＤＭＳ７１４３）を、エキセンディン−４と並んだＧＬＰ−１Ｒ ＢＡにおける活性に関するアッセイで試験した。結果を下表１２に示す。
【表１２】
【０１８８】
上記の結果から、ＤＭＳ７１３９およびＤＭＳ７１４３はＧＬＰ−１Ｒ ＢＡにおいて予測された活性を示し、従って、それらはin vivoにおいてＧＬＰ−１受容体に対して活性がある可能性があるということが結論づけられた。従って、ＤＭＳ７１３９およびＤＭＳ７１４３はさらなる前臨床研究の良好な候補であり、これが上手く行けば臨床に移行する展望を持っている。
【０１８９】
実施例１９
ＤＡＴ０１１５またはＤＡＴ０１１７を発現するベクターを大腸菌Ｂｌ２１−（ＤＥ３）株(Ｎｏｖａｇｅｎ)に形質転換した。５０ｍｌの改変テリフィックブロス培地（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｔ０９１８）を含む２５０ｍｌフラスコにＯＤ＝０．１で接種した後、５０ｍｇ／ｌカナマイシンを添加して３０℃で増殖させた。Ａ６００＝０．５〜１で、細胞をＩＰＴＧで誘導して終濃度５０μＭとし、同じ温度で一晩増殖を続けた。培養物を回転沈降させ、プロテインＬ樹脂（所内作製）を用い、ＤＡＴ０１１５またはＤＡＴ０１１７を培養上清から捕捉した。８℃で一晩バッチ結合を行い、樹脂をカラム容積の１０倍のＰＢＳで洗浄し、その樹脂からＤＡＴ０１１５またはＤＡＴ０１１７を、カラム容積の３倍の０．１ＭグリシンｐＨ＝２で溶出した。このタンパク質を、１／５容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を加えることで中和した。その後、タンパク質をＳＤＳ−ゲルおよび質量分析（ＭＳ）またはＥｄｍａｎ分解(Ｅｄｍａｎ)によって分析した。
【０１９０】
アステリスク（＊）の付いたＤＡＴ０１１７発現ベクターを、実施例１６に示した条件を用いて、形質転換し、培養し、分析した。
【表１３】
【０１９１】
実施例２０ ＭａｌＥ／ｐＥＴ３０ベクターを用いた、ＤＭＳ７１３９（エキセンディン−４とＤＯＭ７ｈ１４−１０の遺伝子融合体）ＡｌｂｕｄＡｂの発現および精製
ＤＭＳ７１３９遺伝子を、ＤＭＳ７１３９含有プラスミドから、オリゴヌクレオチドｎｏ．１（図２ｓ：配列番号４７）(ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＣＡＡＡＡＣＣＧＧＴＧＣＴＣＧＣＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＴＧＴＣＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＣＴＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴＣＣＧＣＴＴＣＣＧＣＧＣＴＧＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣ)およびオリゴヌクレオチドｎｏ．２（ＧＴＴＣＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＡＣＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧ）（図２ｔ：配列番号４８）を用い、ＰＣＲにより増幅した。増幅産物は、Ｎ末端ＭａｌＥシグナル配列ＭＫＩＫＴＧＡＲＩＬＡＬＳＡＬＴＴＭＭＦＳＡＳＡＬＡ（図９ｊ：配列番号４９）を有するＤＭＳ７１３９構築物を含み、その５’および３’末端にそれぞれＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ認識配列を残している。得られた遺伝子断片をＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩで消化したｐＥＴ３０ベクター(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)に連結した。この挿入配列を確認するため、Ｔ７−フォワードプライマーおよびＴ７−リバースプライマークローンを用いてクローンの配列決定を行った。
【０１９２】
ＤＭＳ７１３９発現ベクターを、ｐＥＣＯ−ｐｇｌベクター（Ａｏｎ ｅｔ ａｌ. ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｆｅｂ. ２００８ ｖｏｌ.７４, Ｎｏ.２, ｐｇ ９５０−９５８参照）を含む大腸菌ＢＬ２１−（ＤＥ３）株(Ｎｏｖａｇｅｎ)に形質転換し、培養物を、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび３７．５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを添加した最小培地（Ｋｏｒｚ Ｄ.Ｊ. ｅｔ ａｌ Ｊ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. １９９５ ３９ ｐｇ ５９−６５参照)にて３０℃で増殖させた。０．２５〜０．５の間のＡ６００で、細胞（得られた実際の値は０．３４７）をＩＰＴＧで誘導して終濃度７０μＭとし、２８℃で一晩増殖を続けた。培養物を回転沈降させ、プロテインＬ樹脂（所内作製）を用い、ＤＭＳ７１３９を培養上清から捕捉した。４℃で一晩バッチ結合を行い、樹脂をカラム容積の１０倍のＰＢＳで洗浄し、その樹脂からＤＭＳ７１３９を、カラム容積の３倍の０．１ＭグリシンｐＨ＝２で溶出した。その後、タンパク質をＳＤＳ−ゲルおよび質量分析によって分析した。図１０に示されるように、質量分析は極めて純粋なＤＭＳ７１３９が存在することを示す。
【０１９３】
また、タンパク質ＤＭＳ７１３９をコードするＤＮＡ配列に対して大腸菌発現向けにコドンの至適化を行うことができ、この配列を図２（ｕ）配列番号５０に示す。
【０１９４】
実施例２１ ＤＭＳ７１３９はマウス、ラット、カニクイザルおよびヒトＧＬＰ−１Ｒと同様の効力で結合する
ヒト、マウス、ラットおよびカニクイザルＧＬＰ−１ＲにおけるＤＭＳ７１３９の相対的効力を決定するために、黒色素胞機能性ＧＬＰ−１Ｒバイオアッセイを用いた（Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ ｅｔ. ａｌ., Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ. ２００５と同様）。７ＴＭの活性化を介したメラノソーム輸送はすでに十分記されており、黒色素胞内に局在するＧタンパク質は哺乳類細胞系と同様の方式でＧＰＣＲと結合することが示されている(Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ., Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００２; １５６:８５５−８６５)。このバイオアッセイでは、メラノソームとして知られるオルガネラを含む暗色の色素（メラニン）を有する、ツメガエル(Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ)の皮膚細胞に由来する黒色素胞細胞系を用いる(Ｌｅｒｎｅｒ, Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ. １９９４; １７:１４２−１４６)。細胞内ｃＡＭＰレベルの変化は、メラノソームが凝集する、または細胞に拡散する程度を制御し、従って、黒色素胞の色の濃さはｃＡＭＰレベルに直接関係する。さらに詳細を以下に示す。
【０１９５】
ラット、マウスおよびヒトＧＬＰ−１受容体をコードする全長オープンリーディングフレームｃＤＮＡを、標準的な分子生物学的技術を用いて、発現ベクターｐＪＧ３．６またはｐｃＤＮＡ３にクローニングした。Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号を下表１４に示す。
【表１４】
【０１９６】
カニクイザルＧＬＰ−１Ｒをコードするクローンを、カニクイザル肺、肝臓および脳から単離された全ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡから増幅し、ｐｃＤＮＡ３．２ＤＧＷにサブクローニングした。全長ｃＤＮＡ配列を確認した。黒色素胞をＴ２２５フラスコ（Costar カタログ番号３０００）にて、Ｌ−１５培地中、２７℃および０％ＣＯ２で維持し、１週間に１回、集密フラスコから０．７倍トリプシンを用いて分割し（１：１０）、その後、１週間に２回栄養分を与えた。カニクイザルのｃＤＮＡを図２（ｒ）（配列番号４５）に示す。
【０１９７】
アッセイの目的で、細胞を洗浄し、トリプシンで処理し、０．７倍ＥＰＧ ＰＢＳに１５×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。８００μｌの細胞を２０〜４０μｇのｃＤＮＡと穏やかに混合し、氷上で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、８００μｌの細胞／ｃＤＮＡ混合物をピペットでキュベットに移し、５００Ｖ、７２５ｕＦおよび９５０オームでエレクトロポレーションを行った。その後、細胞をキュベットからＲＦＭ（標準カエル培地）を含むＴ７５フラスコに直接移し、室温で少なくとも３時間、次いで、インキュベーター（２５℃、０％ＣＯ２）内で一晩インキュベートした。翌日、細胞をトリプシンで処理し、計数し、Ｃｏｓｔａｒ ９６ハーフウェルプレート（カタログ番号３６９７）に３００，０００細胞／ｍｌの密度で加えた。２時間後、それらをインキュベーター（２５℃、０％ＣＯ２）内の密閉容器に一晩入れた。次の日、培地を吸引し、１％ＤＭＳＯと１０ｎＭメラトニンを含有する２５μｌのＭＡＢ（黒色素胞アッセイバッファー）を各ウェルに加えた。細胞を１時間インキュベートし、ＳＬＴ Ｓｐｅｃｔｒａプレートリーダーにて６２０ｎｍで基礎透過率を測定した。次に、２倍濃度のペプチドおよび標品２５μｌを含有する希釈シリーズ（ＭＡＢで３倍間隔の希釈を用いた１２点シリーズ）を各ウェルに直接加えた。標品はメラトニン１０ｎＭ、ＭＳＨ２００ｎＭおよびＭＡＢを含み、それぞれアッセイ系の最小値、最大値および基本応答レベルを設定するために用いた。ペプチドおよび標品を加えた後、プレートを１時間インキュベートし、上記のように透過率を測定した。データは、Ｒｏｂｏｓａｇｅ（バージョン７．３．２）を用い、（１−Ｔｆ／Ｔｉ）（式中、Ｔｉは最初のベースラインの読み取り値であり、Ｔｆは応答の読み取り値である）を計算することによって解析した。
【０１９８】
Ｇｓ共役型７ＴＭ受容体の活性化（すなわち、ＧＬＰ−１Ｒ）は細胞内ｃＡＭＰの増加をもたらし、メラトニンを用いて予め凝集させたメラノソームをより分散性とし、その応答は細胞の光透過率の低下として測定される。あるいは、ｃＡＭＰを低下させる条件下では、メラノソームが凝集し、細胞の光透過率が増大する。従って、ＧＬＰ−１Ｒ ｃＤＮＡ含有プラスミド構築物を黒色素胞にトランスフェクションし、一次的に発現させた後、ＧＬＰ−１Ｒの活性化に対するＤＭＳ７１３９の相対的効力が用量反応曲線から算出可能である。結果を下表１５に示す。
【表１５】
【０１９９】
ヒト、マウス、ラットおよびカニクイザルＧＬＰ−１Ｒでトランスフェクトとした黒色素胞を用い、ＤＭＳ７１３９のアッセイにおける効力を、各種につき少なくとも２回調べた。２回のアッセイのｐＥＣ５０を表１５に示す。カニクイザル、ヒトおよびラット受容体における効力は極めて類似しており、マウス受容体における効力はやや低い可能性がある。全体として、表１５に示されているデータは、この薬物を用いたマウスモデルで見られた有効性が、毒性学的種（ラットおよびカニクイザル）で、またヒトでも再現する可能性があるということとよく一致する。
【０２００】
実施例２２ ＩＩ型糖尿病のｄｂ／ｄｂマウスモデルにおけるＤＡＴ０１１５およびＤＭＳ７１３９の有効性および作用持続時間
本試験の目的は、１０〜１１週齢のｄｂ／ｄｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから入手）における経口糖耐能に対するＤＡＴ０１１５およびＤＭＳ７１３９の作用持続時間を決定および比較することであった。試験開始の３日前に評価した血糖値によって、処理間で動物を無作為化した。これによって、各試験群の平均開始血糖値の類似性を確保した。ＤＡＴ０１１５およびＤＭＳ７１３９は、経口ブドウ糖ボーラスの１２０時間、９６時間、７２時間または４８時間前に１ｍｇ／ｋｇを皮下投与した（図１１Ａに示す）。
【０２０１】
グルコースＡＵＣは、２時間の経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）にわたって、ビヒクルで処置したｄｂ／ｄｂマウスに比べて、ＤＭＳ７１３９の場合には１２０時間までの全ての時点で、ＤＡＴ０１１５の場合には９６時間までの全ての時点で、有意に減少した（図１１Ｂ）。７２時間、９６時間または１２０時間の時点で投与したＤＡＴ０１１５とＤＭＳ７１３９の間で統計的な差は無かったが、ＤＡＴ０１１５は４８時間の時点でＤＭＳ７１３９よりもグルコースＡＵＣを有意に低下させた。
【０２０２】
ＤＭＳ７１３９が示すグルコースＡＵＣの低下が一貫しているほど、このクラスの薬物にとってより望ましい特性を表すと結論づけられた。よって、本試験は明確な優越性を特定するものではなかったが、このデータ、また他のデータに基づいてＤＭＳ７１３９が主要薬剤として選択された。
【０２０３】
実施例２３ ＤＭＳ７１３９の繰り返し投与は、ＤＯＭ７ｈ−１４対照と比べてＨｂＡ１ｃの用量依存的減少を示す
本試験の目的は、１０〜１１週齢のｄｂ／ｄｂマウス(Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ)においてＤＭＳ７１３９の繰り返し投与後のＨｂＡ１ｃ低下を調べることであった。ＨｂＡ１ｃはヘモグロビンの糖化型であり、その濃度は長期間にわたる血漿グルコース濃度の代替指標として用いられる。各試験群で平均開始ＨｂＡ１ｃレベルの類似性を確保するために、試験開始の３日前にＨｂＡ１ｃレベルに基づき、ｄｂ／ｄｂマウスを無作為化した。動物にＤＭＳ７１３９（０．０１、０．０３、０．１、０．３ｍｇ／ｋｇ）、Ｂｙｅｔｔａ（商標）（０．０００１、０．００１、０．０１、０．１ｍｇ／ｋｇ）またはＤＯＭ７ｈ−１４（０．３ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを２週間、１日１回（ＱＤ）皮下投与した。試験中、体重、摂食量およびグルコースの測定を行い、ＨｂＡ１ｃの測定は１４日の終了時に行った。
【０２０４】
与えたグルコースおよびＨｂＡ１ｃは、対照（ＤＯＭ７ｈ−１４）に対して、０．０３、０．１および０．３ｍｇ／ｋｇのＤＭＳ７１３９処置群で有意に低下したが、それらは生理食塩水対照に対しては有意ではなかった（図１２の結果を参照）。生理食塩水対照に関して得られたデータは、最低用量のエキセンディン−４またはＤＭＳ７１３９で得られたデータに基づいて予測されたものよりも低かった。生理食塩水対照に比べ、エキセンディン−４では変化は見られなかった。また、ＤＭＳ７１３９では、体重および摂食量にも有意な低下が見られた。エキセンディン−４は最高用量で摂食量に有意な効果を示した。
【０２０５】
ＤＭＳ７１３９の繰り返し投与はｄｂ／ｄｂマウスにおいてＨｂＡ１ｃ低下をもたらすとともに、摂食量および体重にも効果をもたらすと結論づけられた。これらの変化はＧＬＰ−１Ｒアゴニストに関して予測されたものと一致している。
【０２０６】
実施例２４ 食餌性肥満（ＤＩＯ）マウスの肥満モデルにおいて、ＤＡＴ０１１５およびＤＭＳ７１３９はＤＯＭ７ｈ−１４対照に比べて摂食量および体重の用量依存的減少を示した
ここに記載される試験の目的は、１０日間の摂食量および結果としての体重がＤＡＴ０１１５およびＤＭＳ７１３９処置によって影響を受けるかどうかを判定すること、およびこれらの化合物のあるものが他のものより長い作用期間を有するかどうかを判定することであった。これはヒトに対する予測となり得る。食餌性肥満（ＤＩＯ）マウス給餌モデルにおいて、ＤＡＴ０１１５投与群、Ｂｙｅｔｔａ投与群およびＤＭＳ７１３９投与群を用いて試験を行った。
【０２０７】
雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウス(Taconic)を６０％ｋｃａｌ高脂肪の放射線照射済み食餌（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｄ１２４９２）で１２週間太らせた後、所内施設に移した。到着後、そのマウスを、温度および湿度制御室（７０〜７２°Ｆ、湿度＝４８〜５０％、５ＡＭ／５ＰＭ光周期）のａｌｐｈａ−ｄｒｉ床敷上に個別に収容した。食餌を４５％高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｄ１２４５１）に変え、動物を１８日間順応させた。化合物を投与する前に、３日間マウスに生理食塩水を皮下注射し、摂餌量をモニタリングした。マウスは、群間で体重および摂餌量に差がないように群分けした。３群にそれぞれ０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇのＤＡＴ０１１５またはＤＭＳ７１３９のいずれかを投与し、１群に陰性対照分子（ＤＯＭ７ｈ−１４ ＡｌｂｕｄＡｂ（商標）１ｍｇ／ｋｇ）を、また１群にエキセンディン−４陽性対照（０．０１ｍｇ／ｋｇ）を投与した。１０日間、毎日、摂食量および体重を測定した。
【０２０８】
ＤＡＴ０１１５およびＤＭＳ７１３９は、ＤＯＭ７ｈ−１４対照に比べて、摂食量および体重の用量依存的減少を示した（図１３の結果を参照）。図１３に示されているエキセンディンはＢｙｅｔｔａ（商標）であったことを注記しておく。このマウス試験からのデータは、これらの有効性の間に統計的な違いは無いことを示す。
【０２０９】
実施例２５ マウス、ラットおよびカニクイザルにおけるＤＭＳ７１３９のＰＫ分析
３種のモデル（ｄｂ／ｄｂマウス、ラットおよびカニクイザル）におけるＤＳＭ７１３９でのｓ．ｃ．およびｉ．ｖ．の一連の試験を行った。適切な時点でのアッセイにより検出可能であると推測される血漿濃度を達成する目的で用量を選択した：マウスでは１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．およびｓ．ｃ．、ラットでは１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．および０．３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．、カニクイザルでは０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．およびｓ．ｃ．。
【０２１０】
ＰＫサンプリングの時点は、ｄｂ／ｄｂマウス（０．１７、１、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０および１６８時間）、ラット（０．１７、１、４、８、１２、２４、４８、７２、９６および１２０時間）ならびにカニクイザル（０．０８３（ｉ．ｖ．群のみ）、０．５、４、８、２４、４８、９６、１４４、１９２、２８８、３３６、５０４および６７２時間（４週間））。各時点で１個体の動物を犠牲にしたマウス以外は、一連の血液サンプリングを行った。血漿サンプルを調製し、後のＤＭＳ７１３９レベルの分析のために冷凍保存した。
【０２１１】
様々な試験でＰＫサンプルを分析するのに、分子のエキセンディン−４部分とＡｌｂｕｄＡｂ部分を検出するＥＬＩＳＡ法と、エキセンディン−４からＮ末端ペプチドを検出するＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の、２種類の定量アッセイを用いた。ＥＬＩＳＡに基づく方法からのデータを以下に示す。
【０２１２】
ＥＬＩＳＡ：
カニクイザル血漿中のＤＡＴ０１１５およびＤＭＳ７１３９のレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。簡単に述べると、９６ウェルのｆｌｕｏｒｏｎｕｎｃプレート(Ｎｕｎｃ ＃４３７７９６)を冷蔵庫内で、５０ｍＭ炭酸ナトリウムバッファーｐＨ９．４（１００μＬ／ウェル）中、５μｇ／ｍＬの抗エキセンディン−４抗体（Ａｂｃａｍ カタログ番号ａｂ２６２６３）で一晩コーティングした。翌日、プレートを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５および０．１％ｔｗｅｅｎ−２０（３００μＬ／ウェル）で５回洗浄した後、２００μＬのブロッキングバッファー（ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ, ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃ ３７５３５，ＴＢＳ中）を用い、公称３７℃でおよそ１時間振盪しながらブロックした。ウェルを上記のように洗浄した後、１００μｌ／ウェルのＱＣ、標品またはサンプルとともに公称３７℃でおよそ２時間振盪しながらインキュベートした。再びウェルを洗浄した後、アッセイバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０ ｐＨ７．５）中、１：２０００最終希釈のウサギ抗ヒトκ軽鎖抗体とともに公称３７℃で１時間振盪しながらインキュベートした後、上記のように洗浄した。次に、ウェルを、１００μｌ／ウェルのリポータータグ溶液（アッセイバッファー中１／５００，０００のヤギ抗ウサギＩｇＧ複合体）とともに公称３７℃で振盪しながらインキュベートした後、上記のように洗浄した。結合したＤＡＴ０１１５またはＧＳＫ２３７４６９７Ａは、１００μＬ／ウェルの発光基質(ｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ ｆｅｍｔｏ （ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３７０７５）)を、およそ１分間一定振盪しながら加えることで検出し、その後、化学発光プレートリーダー(Ｗａｌｌａｃ １４２０ Ｖｉｃｔｏｒ Ｍｕｌｙｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅr Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）)を用いて読み取った。
【０２１３】
測定された血漿レベルに対し、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアバージョンＸ ＴＢＣを用いて、コンパートメントおよびノンコンパートメント薬物動態分析を行った（下表１６参照）。ノンコンパートメント結果では、試験間の一貫性のために同日にＤＡＴ０１１５およびＤＭＳ７１３９の全ｐＫデータのコンパイルとフィッティングを行った。従って、示されたデータはＤＡＴ０１１５およびＤＭＳ７１３９のコンパイルされたデータ、ＮＣＡ結果および図である。
【０２１４】
カニクイザルでは、半減期は、コンパートメント法およびノンコンパートメント法によってそれぞれ１０６．４時間または１１２．８時間（ｉｖ）、および１１３．８時間または１１３．１時間（ｓｃ）であると計算された。３つの種全てにおいて、ＤＭＳ７１３９は血清アルブミンそれ自体の半減期に迫る半減期を有し、従って、ＤＭＳ７１３９が（例えばカニクイザル血清アルブミンに比べて）ヒト血清アルブミンに対して有しているものと同等の親和性を示すと結論づけられ、このことにより、ＤＭＳ７１３９がヒトにおいて毎週の投与（すなわち、低頻度）に適合する半減期を有するという強い確信が得られる。
【表１６】
【０２１５】
実施例２６ カニクイザルにおけるＤＭＳ７１３９およびＤＡＴ０１１５のＰＫ分析の比較
ヒトでの使用を目的に開発するために最も望ましい分子を選択するため、カニクイザルにおける薬物動態パラメーターをＤＡＴ０１１５およびＤＭＳ７１３９に関して比較した（表１７参照）。本発明者らは、表のデータが、ＤＭＳ７１３９がＤＡＴ０１１５よりも望ましいＰＫパラメーターを有することを示し、皮下投与または静脈投与された際にカニクイザルにおいてより長い半減期を示すと結論づけた。半減期がより長いと、より後の時点で、ＤＭＳ７１３９はＤＡＴ０１１５よりも一貫して血漿中の濃度が高いという効果を有する（データは示されていない）。
【表１７】
【０２１６】
実施例２７： ＰＹＹ（３−３６）ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ＡｌｂｕｄＡｂ（商標）ペプチド複合体ＤＭＳ７６０５（図１４に示されている構造を有し、リシンおよび４リピートＰＥＧリンカーを介してＰＹＹ３−３６と複合体化されたＤＯＭ ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ＡｌｂｕｄＡｂである）の作出：
ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ａｌｂｕｄａｂを下記のように大腸菌で発現させ、精製した。ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）をコードする遺伝子をベクターｐＥＴ３０にクローニングした。発現ベクターへのクローニングを可能とするために、融合体を、５’にＮｄｅＩ制限部位、その後にＰＥＬ Ｂリーダー配列を有するアセブンリＰＣＲとして作出した（アミノ酸配列は図９（ｉ）配列番号４６に示される）。ベクターおよびアセンブリＰＣＲをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した後、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いて、この挿入配列をベクターに連結した。ＭａｃｈＩ細胞を形質転換するのにこの連結物２μｌを用いた。回復増殖期間の後、細胞を、カルベニシリン含有寒天プレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。コロニーを配列決定し、適切な配列を含むものをプラスミド増殖および単離(Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐキット、Ｑｉａｇｅｎ)に用いた。ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をプラスミドＤＮＡで形質転換し、得られたコロニーを発現培養物の接種に用いた。発現は、５０ｍｌの改変テリフィックブロス培地(Ｓｉｇｍａ)を含む２５０ｍｌフラスコに接種（これはＯＤ＝０．１で接種した）した後、５０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを添加して３０℃で増殖させた。Ａ６００＝０．５〜１で、細胞をＩＰＴＧで誘導して終濃度５０μＭとし、２３℃で一晩増殖を続けた。その後、培養上清を３７００ｘｇで１時間の遠心分離によって清澄化した。その後、発現したタンパク質を清澄上清から、プロテインＬストリームライン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，カタログ番号２８−４０５８−０３，プロテインＬ結合型）を用いて精製し、プロテインＬから、０．１ＭグリシンｐＨ２．０を用いて溶出した後、溶出量の１／５の１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を加えることで中和した。次に、このタンパク質を、０．１Ｍクエン酸を用いてｐＨ５に調整し、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５で平衡化した３０ｍｌ Ｓｏｕｒｃｅ Ｓカラム(ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)に添加した。ＡｋｔａＸｐｒｅｓｓ ＦＰＬＣ(ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)を用い、１５０ｍｌにわたり、５０ｍＭクエン酸ナトリウム ｐＨ５、１Ｍ ＮａＣｌの０〜１００勾配を適用した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、最も純度の高い産物を含有する画分をプールした。最終タンパク質を５０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ６．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ中で脱塩した。
【０２１７】
次に、Ｄｏｍ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ＡｌｂｕｄＡｂを、図１４に示されているＰＥＧリンカーを用い、ＰＹＹ ３−３６アミノ酸分子（ただし、１０番の位置に、ＰＥＧリンカーで誘導体化可能なリシンを含む）に連結した。ＰＹＹおよびＰＥＧは標準的な化学合成によって調製した。次に、ＰＥＧリンカーの末端のマレイミドを用い、上記のように調製したＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ＡｌｂｕｄＡｂの遊離システインにＰＹＹペプチドを結合させた。
【０２１８】
ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）を５０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ６．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ中で脱塩した。その後、マレイミドで活性化したペプチドをこのタンパク質と１：１比で混合し、インキュベートして複合体を生じさせた。
【０２１９】
上記と同様の方法でイオン交換クロマトグラフィーにより、複合体を未反応のＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）から精製した。最後に、複合体が豊富な画分を、上記と同様の方法でプロテインＬアフィニティー精製を用い、遊離ペプチドから精製した。最終的なＤＭＳ７６０５複合体をバッファー交換し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析によって分析した。
【０２２０】
実施例２８： 黒色素胞機能性バイオアッセイにおける、エキセンディン−４ ＡｌｂｕｄＡｂ（上記のように作製したＤＡＴ０１１５）およびＰＹＹ（３−３６）ＡｌｂｕｄＡｂ融合体ペプチド（実施例２７に記載のように作製したＤＭＳ７６０５、図１４に示される構造を有する）の薬理学的特性
【０２２１】
対象の受容体でトランスフェクトした細胞を用いた黒色素胞機能性バイオアッセイにおいて、エキセンディン−４ ＡｌｂｕｄＡｂ（ＤＡＴ０１１５）およびＰＹＹ（３−３６）ＡｌｂｕｄＡｂ（実施例２７に記載のように作製したＤＭＳ７６０５、図１４に示される構造を有する）の薬理学的特性を調べた。バイオアッセイは、ヒトＮＰＹ１Ｒでは８０μｇのｃＤＮＡを用い、マウスＮＰＹ１Ｒでは４０μｇを用い、他のマウスおよびヒトＮＰＹ受容体（ＮＰＹ２Ｒ、ＮＰＹ４ＲおよびＮＰＹ５Ｒ）では４０μｇを用いたこと以外は、本質的に実施例２１に記載のように行った。
【０２２２】
エキセンディン−４およびＰＹＹ（３−３６）ＡｌｂｕｄＡｂ融合体ペプチドの薬理学的特性（データは示されていない）は、該融合体がマウスおよびヒトＮＰＹ受容体の双方と結合し、それらを活性化することを明らかにした。ＤＭＳ７６０５はＮＰＹ１Ｒ、ＮＰＹ２Ｒ、ＮＰＹ４ＲおよびＮＰＹ５Ｒと結合し、ＮＰＹ２Ｒが最も強く活性化される（データは示されていない）。ＮＰＹＲアクセッション番号は次の通りである：ＮＰＹ１Ｒ：ＮＭ００９０９（ヒト）およびＮＭ０１０９３４（マウス）；ＮＰＹ２Ｒ：ＮＭ００９１０（ヒト）およびＮＭ００８７３１（マウス）；ＮＰＹ４Ｒ：ＮＭ００５９７２（ヒト）およびＮＭ００８９１９（マウス）；ＮＰＹ５Ｒ：ＮＭ００６１７４（ヒト）およびＮＭ０１６７０８（マウス）。
【０２２３】
実施例２９： 食餌性肥満（ＤＩＯ）マウスの肥満モデルにおいて、ＤＭＳ７６０５はビヒクル対照に比べて体重の用量依存的減少を示した
本試験はＤＭＳ７６０５（ａｋａ ＤＭＳ７１６７：ＰＹＹ３−３６）の有効性を評価するため、食餌性肥満（ＤＩＯ）マウス肥満モデルで行った。ここに記載される試験の目的は、６日間の摂食量および体重がＤＭＳ７６０５処置によって影響を受けるかどうかを判定することであった。これらの結果はヒトに対する予測となり得る。
【０２２４】
雄Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス(Ｔａｃｏｎｉｃ)を６０％ｋｃａｌ高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｄ１２４９２）で１２週間太らせた後、所内施設に移した。到着後、そのマウスを、温度および湿度制御室（７０〜７２°Ｆ、湿度＝４８〜５０％、５ＡＭ／５ＰＭ光周期）のａｌｐｈａ−ｄｒｉ床敷上に個別に収容した。食餌を４５％高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｄ１２４５１）に変え、動物を５週間順応させた。動物には食餌と水を自由に摂らせた。化合物を投与する前に、１日、マウスにビヒクルを皮下注射し、摂餌量をモニタリングした。マウスは、群間で体重および摂餌量に差がないように群分けした。これらの群に、１日おきに、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇまたは０．１ｍｇ／ｋｇ用量のビヒクルまたはＤＭＳ７６０５のいずれかを投与した。６日間の累積摂食量における統計的に有意な変化（Ｔ検定によりｐ＜０．０５）が、３ｍｇ／ｋｇ（３７．３％の低下）、１ｍｇ／ｋｇ（３１．３％の低下）および０．３ｍｇ／ｋｇ（２１．８％の低下）で見られたが、０．１ｍｇ／ｋｇでは有意な変化が見られなかった（８．７％の低下、Ｔ検定によりｐ＝０．０７）。体重は投与開始後０日目、３日目および６日目に測定した。
【０２２５】
ＤＭＳ７６０５は、ビヒクル対照に比べて体重の用量依存的減少を示した（図１５）。全ての用量で有意な体重減少が見られた（二元配置ＡＮＯＶＡとその後のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ（事後）分析によりｐ＜０．０１）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清半減期が改良された薬物融合体および複合体に関する。これらの融合体および複合体は免疫グロブリン（抗体）単一可変ドメインとＧＬＰ分子および／またはエキセンディン分子を含む。本発明はさらに、このような薬物融合体および複合体を含む使用、製剤、組成物およびデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
治療および／または診断目的に有用であり得る、活性を有する多くの薬物は、投与されると急速に身体から排出されるので、有用性が限定されている。例えば、治療上有用な活性を有する多くのポリペプチドは、腎臓を介して循環から速やかに除去される。従って、望ましい治療効果を得るためには、大量を投与しなければならない。改良された薬物動態特性を有する改良された治療薬および診断薬の必要がある。
【０００３】
このような、体内もしくは全身循環中の半減期が短い薬物種の一つが、グルカゴン様ペプチド１などのインクレチンホルモン、またはペプチドＹＹ、ならびにエキセンディン、例えばエキセンディン−４である。
【０００４】
グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）−１は、グルコース依存性インスリン分泌促進およびグルカゴン分泌抑制作用、膵臓β細胞に対する栄養作用、ならびに消化管の分泌および運動性に対する抑制作用を有するインクレチンホルモンであるが、それらの作用が相まって血漿グルコースを低下させ、血糖の変動幅を小さくする。さらにＧＬＰ−１は、その満腹感を高める能力によって、食物摂取を減らし、それによって体重増加を抑え、体重減少を引き起こすことさえある。以上を考え合わせると、これらの作用はＧＬＰ−１に独特な特徴を与え、特に、血糖降下作用のグルコース依存性は重症高血糖のリスクを最小限にするはずであるので、抗糖尿病薬として極めて望ましいと考えられる。しかしながら、その薬物動態／薬力学的特性は、天然ＧＬＰ−１が治療上有用ではないというものである。従って、ＧＬＰ−１は連続投与すれば最も効果的であるが、１回の皮下注射での持続時間は短い。ＧＬＰ−１はin vivoで酵素分解を極めて受けやすく、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断の関連がおそらく最も高いと思われるが、それはこれが急速に起こって、非インスリン分泌性の代謝産物を生じるためである。従って、その代謝安定性および薬物動態／薬力学的特性に影響を及ぼす要因に関する理解に基づいた、ＧＬＰ−１の治療上の可能性を活用するための方策が、集中的な研究の焦点となっている。
【０００５】
生物活性をなお維持しながらその分解を遅くするように、ペプチダーゼを阻害するか、またはＧＬＰ−１を修飾することを試みて鋭意研究が行われてきた。国際公開第ＷＯ０５／０２７９７８号は、持続性の作用特性を有するＧＬＰ−１誘導体を開示している。国際公開第ＷＯ０２／４６２２７号は、ＧＬＰ−１または類似体と融合したポリペプチド（例えば、アルブミン）を含む異種融合タンパク質を開示している（これらの類似体の開示は、本発明で使用することができるＧＬＰ−１類似体の例として、引用することにより本明細書の一部とされる）。国際公開第ＷＯ０５／００３２９６号、同第ＷＯ０３／０６００７１号、同第ＷＯ０３／０５９９３４号は、ＧＬＰ−１がこのホルモンの半減期を延長するためにアルブミンと融合されている、アミノ融合タンパク質を開示している。
【０００６】
しかしながら、これらの努力にもかかわらず、長時間持続する活性ＧＬＰ−１は作製されていない。
【０００７】
従って、特に糖尿病および肥満の分野において、糖尿病および肥満の治療に特に可能性のあるインスリン分泌促進作用を同様に有する、改良されたＧＬＰ−１ペプチド、またはエキセンディン−４もしくはＰＹＹなどの他の薬剤の必要性が大いにある。従って、それらの低い毒性および治療上の利点を維持しながらin vivoでより長い作用時間をもたらすようにＧＬＰ−１、エキセンディン−４および他のインスリン分泌促進ペプチドを修飾する必要がある。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、（ａ）（ｂ）との融合体または複合体として存在する、例えばエキセンディン−４、ＰＹＹ（例えば、３−２６ＰＹＹ）またはＧＬＰ−１（例えば、ＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ突然変異体）であり得るインスリン分泌促進薬もしくは分子、またはインクレチン薬もしくは分子と、（ｂ）（ｉ）ＤＯＭ ７ｈ−１４ドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ ７ｈ−１４のアミノ酸配列は図１（ｈ）：配列番号８に示される）、（ｉｉ）ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０のアミノ酸配列は図１（ｏ）：配列番号２６に示される）またはＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ ｄＡｂの配列から４個までのアミノ酸変異を有するｄＡｂ、および（ｉｉｉ）ＤＯＭ ７ｈ−１１−１５ ｄＡｂ（ＤＯＭ ７ｈ−１１−１５のアミノ酸配列は図１（ｐ）：配列番号２７に示される）または（ｉｖ）ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ Ｒ１０８Ｃドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０のアミノ酸配列は図１（ｒ）に示される）から選択される、血清アルブミンと特異的に結合するｄＡｂ（ＡｌｂｕｄＡｂ ＴＭ）とを含む、またはそれらからなる融合体または複合体である組成物を提供する。
【０００９】
また、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬、例えば、エキセンディン−４および／またはＧＬＰ−１、またはＰＹＹと、ｄＡｂ、例えば、ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ、ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ ｄＡｂ、ＤＯＭ ７ｈ−１１−１５ ｄＡｂとを連結するアミノ酸リンカーまたは化学リンカーが場合により存在してもよい。リンカーは例えば、ヘリカルリンカー、例えば、図１（ｋ）：配列番号１１に示される配列のヘリカルリンカーであってよく、または例えば図１（ｌ）：配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するｇｌｙ−ｓｅｒリンカーであってもよい。
【００１０】
ある実施形態では、本発明の融合体（または複合体）は、さらなる分子、例えばさらなるペプチドまたはポリペプチドを含むことができる。
【００１１】
インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬（例えば、エキセンディンおよび／またはＧＬＰ−１）は、ｄＡｂのＮ末端またはＣ末端のいずれかとの融合体（または複合体）として存在することができる。
【００１２】
ある実施形態では、本発明は、以下のもの：
（ａ）２ｘＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１４、アミノ酸配列は図１（ａ）：配列番号１に示される）、
（ｂ）エキセンディン４（Ｇ４Ｓリンカー）３ ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１５、アミノ酸配列は図１（ｂ）：配列番号２に示される）、
（ｃ）エキセンディン４−ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１６、アミノ酸配列は図１（ｃ）：配列番号３に示される）、
（ｄ）エキセンディン４，ヘリカルリンカー，ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１７、アミノ酸配列は図１（ｄ）：配列番号４に示される）、
（ｅ）ＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ（Ｇ４Ｓリンカー）３ ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１８、アミノ酸配列は図１（ｅ）：配列番号５に示される）、
（ｆ）ＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１９、アミノ酸配列は図１（ｆ）：配列番号６に示される）、
（ｇ）ＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ，ヘリカルリンカー，ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１２０、アミノ酸配列は図１（ｇ）：配列番号７に示される）、
（ｈ）エキセンディン４，（Ｇ４Ｓ）３，リンカーＤＯＭ７ｈ−１４−１０融合体（ＤＭＳ７１３９、アミノ酸配列は図１（ｍ）：配列番号２４に示される）、
（ｉ）エキセンディン４，（Ｇ４Ｓ）３，リンカーＤＯＭ７ｈ−１１−１５融合体（ＤＭＳ７１４３、アミノ酸配列は図１（ｎ）：配列番号２５に示される）
から選択される融合体分子を含む、またはそれらからなるポリペプチドを提供する。
【００１３】
本発明はまた、上記のアミノ酸配列、すなわち、配列番号１〜７および配列番号２４〜２５で示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、またはそれからなる複合体分子を提供する。
【００１４】
ある実施形態では、本発明は、リシン（ＰＹＹの１０番の位置に導入）および４リピートＰＥＧリンカーを介して、Ｃ末端でアミド化されたＰＹＹ３−３６と複合体化されたＤＯＭ ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ＡｌｂｕｄＡｂである複合体分子を含む、またはそれからなるポリペプチドを提供する。このペプチド複合体のアミノ酸配列および構造は図１４に示される。
【００１５】
本発明はまた、エキセンディン４，（Ｇ４Ｓ）３，リンカーＤＯＭ７ｈ−１４−１０融合体（ＤＭＳ７１３９、アミノ酸配列は図１（ｍ）：配列番号２４に示される）のアミノ酸配列、またはＤＭＳ７１３９のアミノ酸配列（アミノ酸配列は図１（ｍ）に示される）から４個までのアミノ酸変化を有する融合体もしくは複合体分子を含む、またはそれからなるポリペプチドを提供する。
【００１６】
ＤＯＭ ７ｈ−１４は、血清アルブミンと結合するヒト免疫グロブリン単一可変ドメインすなわちｄＡｂ（Ｖｋ）であり、そのアミノ酸配列は図１（ｈ）：配列番号８に示される。図１（ｈ）：配列番号８に示されるアミノ酸配列では、ＤＯＭ ７ｈ−１４ ｄＡｂのＣＤＲ領域が下線で示されている。
【００１７】
ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０は、血清アルブミンと結合するヒト免疫グロブリン単一可変ドメインすなわちｄＡｂであり、そのアミノ酸配列は図１（ｏ）：配列番号２６に示される。図１（ｏ）：配列番号２６に示されるアミノ酸配列では、ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ ｄＡｂのＣＤＲ領域が下線で示されている。
【００１８】
ＤＯＭ ７ｈ−１１−１５は、血清アルブミンと結合するヒト免疫グロブリン単一可変ドメインすなわちｄＡｂであり、そのアミノ酸配列は図１（ｐ）：配列番号２７に示される。図１（ｐ）：配列番号２７に示されるアミノ酸配列では、ＤＯＭ ７ｈ−１１−１５ ｄＡｂのＣＤＲ領域が下線で示されている。
【００１９】
本明細書において「融合体」とは、第１の部分としての、血清アルブミンと結合するＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂまたはＤＯＭ７ｈ−１４−１０ ｄＡｂまたはＤＯＭ ７ｈ−１１−１５ ｄＡｂと、第２の部分としての、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬とを含む融合タンパク質を表す。血清アルブミンと結合するｄＡｂおよび薬物または薬剤は単一の連続するペプチド鎖の別個の部分として存在する。第１の部分（ｄＡｂ）と第２の部分（インクレチン薬もまたはインスリン分泌促進薬）は、ペプチド結合を介して互いに直接結合させることもできるが、適当なアミノ酸リンカー、またはペプチドもしくはポリペプチドリンカーを介して結合させることもできる。適当であれば、別の部分（付加的部分）、例えば、ペプチドもしくはポリペプチド（例えば、第３、第４の部分）、および／またはリンカー配列が存在してもよい。第１の部分は、第１の部分のＮ末端、Ｃ末端の位置、または内部に存在することができる。ある実施形態では、融合タンパク質は、１つまたは２以上（例えば、１〜約２０）のｄＡｂ部分を含む。
【００２０】
本明細書において「複合体」とは、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬、例えば、ＧＬＰ−１、エキセンディン−４、ＰＹＹ、例えば、ＰＹＹ３−３６が共有結合または非共有結合されている、血清アルブミンと結合するｄＡｂを含む組成物を表す。インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬は、ｄＡｂに直接、または適当なリンカー部分、例えば、ＰＥＧリンカー部分を介して間接的に共有結合させることができる。この薬物または薬剤は、任意の適当な位置で、例えば、アミノ末端、カルボキシ末端または適当なアミノ酸側鎖（例えば、リジンのεアミノ基、またはシステインのチオール基）を介してｄＡｂに結合させることができる。あるいはまた、該薬物または薬剤はｄＡｂに直接的（例えば、静電相互作用、疎水性相互作用）、または間接的に（例えば、相補的結合相手の非共有結合によって（例えば、ビオチンとアビジン）、この場合、結合相手の一方が薬物または薬剤に共有結合され、その相補的結合相手がｄＡｂと共有結合されている）非共有結合させることもできる。
【００２１】
本発明はさらに、本発明の複合体または融合体、例えば、ＤＡＴ０１１４、ＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６、ＤＡＴ０１１７、ＤＡＴ０１１８、ＤＡＴ０１１９およびＤＡＴ１２０、ＤＭＳ７１３９またはＤＭＳ７１４３またはＤＭＳ７１４３のうちいずれかの（実質的に）純粋なモノマーを提供する。ある実施形態では、それは少なくとも純度９８、９９、９９．５％または１００％のモノマーである。
【００２２】
本発明はまた、本明細書に記載の融合体をコードする核酸、例えば、ＤＡＴ０１１４、ＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６、ＤＡＴ０１１７、ＤＡＴ０１１８、ＤＡＴ０１１９およびＤＡＴ１２０、ＤＭＳ７１３９またはＤＭＳ７１４３をコードする核酸を提供し、ここで、その核酸配列は図２（配列番号１３〜３２）に示される。また、これらの核酸を含む宿主細胞も提供される。
【００２３】
本発明はまた、ＤＯＭ７ｈ−１４（配列番号８）、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（配列番号２６）、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５（配列番号２７）およびＤＯＭ ７ｈ−１４−１０Ｒ１０８Ｃ（配列番号４２）から選択される、血清アルブミンと結合するｄＡｂ（ＡｌｂｕｄＡｂ(商標））をコードするアミノ酸も提供する。
【００２４】
本発明はまた、ＤＯＭ７ｈ−１４（配列番号２３）、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（配列番号３１）、ＤＯＭ７ｈ−１１−１５（配列番号３２）およびＤＯＭ ７ｈ−１４−１０Ｒ１０８Ｃ（配列番号４４）から選択される、血清アルブミンと結合するｄＡｂをコードする核酸を提供する。
【００２５】
本発明はさらに、本発明の融合体を作製する方法を提供し、その方法は、本発明の融合体をコードする組換え核酸および／または構築物を含む宿主細胞を、該組換え核酸の発現に適した条件下で維持し、それによって融合体が産生されることを含む。
【００２６】
本発明はまた、本発明の融合体または複合体を含む組成物（例えば、医薬組成物）も提供する。
【００２７】
本発明はまた、本明細書に記載されているものなどの疾患または障害、例えば、高血糖症、耐糖能異常、β細胞不全、糖尿病（例えば、１型または２型糖尿病または妊娠糖尿病）もしくは肥満などの代謝性疾患、または過食を特徴とする疾患を有する個体を処置する方法を提供し、例えば、本発明は、例えばプラダーウィリィ症候群において食欲を抑制するために使用することができ、その方法は、該個体に治療上有効な量の本発明の融合体または複合体を投与することを含む。
【００２８】
他の代謝障害には、限定されるものではないが、インスリン抵抗性、インスリン欠乏、高インスリン血症、高血糖症、異脂肪血症、高脂血症、高ケトン血症、高血圧症、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、腎不全、神経障害（例えば、自律神経障害、副交感神経神経障害および多発性神経障害）、網膜症、白内障、代謝障害（例えば、インスリンおよび／またはグルコース代謝障害）、内分泌障害、肥満、体重減少、肝臓障害（例えば、肝疾患、肝硬変、および肝臓移植関連障害）、およびこれらの疾患または障害と関連した症状が含まれる。
【００２９】
さらに、本発明の化合物を用いて予防または治療することができる、糖尿病関連症状には、限定されるものではないが、高血糖症、肥満、糖尿病性網膜症、単神経障害、多発性神経障害、アテローム性動脈硬化、潰瘍、心疾患、脳卒中、貧血、壊疽（例えば、足および手の壊疽）、性的不全、感染症、白内障、腎機能低下、自律神経系の不調、白血球機能不全、手根管症候群、デュピュイトラン拘縮、および糖尿病性ケトアシドーシスが含まれる。
【００３０】
本発明はまた、高血糖に関連する疾患を治療または予防する方法を提供し、その方法は、本発明の複合体もしくは融合体および／または医薬組成物の少なくとも一用量を患者または対象に投与することを含む。
【００３１】
本発明はさらに、本発明の複合体もしくは融合体を用いて、患者のインスリン応答性を調節する方法、ならびに細胞によるグルコース取り込みを増加させる方法、および細胞のインスリン感受性を調節する方法に関する。また、患者において、インスリンの合成および放出を刺激する方法、インスリン取り込みに対する脂肪、筋肉または肝組織の感受性を高める方法、グルコース取り込みを刺激する方法、消化過程を遅くする方法、またはグルカゴン分泌を遮断する方法も提供され、その方法は、該患者に本発明の融合体もしくは複合体を投与することを含み、例えば、少なくとも一用量の本発明の薬物複合体もしくは融合体および／または医薬組成物を投与することを含む。
【００３２】
本発明の融合体もしくは複合体および／または医薬組成物は、単独で投与することもできるし、あるいは他の分子または部分、例えば、ポリペプチド、治療用タンパク質および／または分子（例えば、インスリン、ならびに／または患者のインスリン感受性、体重、心疾患、高血圧症、神経障害、細胞代謝および／もしくはグルコース、インスリンもしくは他のホルモンレベルを調節する他のタンパク質（抗体を含む）、ペプチドまたは小分子）と併用投与することもできる。特定の実施形態では、本発明の複合体もしくは融合体は、インスリン（またはインスリン誘導体、類似体、融合タンパク質または分泌促進薬）と併用投与される。
【００３３】
本発明はまた、上記の、例えば、高血糖症、糖尿病（１型もしくは２型または妊娠糖尿病）または肥満などの代謝性疾患のうちいずれかのような疾患または障害の処置用薬剤の製造のための、本発明の複合体または融合体の使用も提供する。
【００３４】
本発明はまた、治療、診断または予防に用いる、本明細書に記載の融合体または複合体の使用に関する。
【００３５】
本発明の融合体または複合体、例えば、融合体のｄＡｂ成分は、例えば、ＰＥＧ基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体または少なくともそのトランスフェリン結合部分、抗体Ｆｃ領域を付加することによって、または抗体ドメインと複合体化することによって、より大きな流体力学的サイズを持たせて半減期をさらに延長するように、さらに構成することができる。例えば、血清アルブミンと結合するｄＡｂは、抗体の、より大きい抗原結合フラグメントとして構成することができる（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ＩｇＧ、ｓｃＦｖとして構成することができる）。
【００３６】
本開示を通じて記載される本発明の他の実施形態において、本発明の融合体に「ｄＡｂ」を使用する代わりに、当業者は、血清アルブミンと結合する、ｄＡｂのＣＤＲ、例えば、ＤＯＭ ７ｈ−１４、ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０またはＤＯＭ ７ｈ−１１−１５のＣＤＲ（例えば、適当なタンパク質スキャフォールドまたは骨格（例えば、アフィボディー、ＳｐＡスキャフォールド、ＬＤＬ受容体クラスＡドメインまたはＥＧＦドメイン）上にグラフトされたＣＤＲ）を含むドメインを使用可能であることも意図される。従って、本開示は全体として、ｄＡｂの代わりにこのようなドメインの開示を与えると解釈されるべきである。
【００３７】
ある実施形態では、本発明は、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬と、二重特異性リガンドまたは多重特異性リガンド（該リガンドは、血清アルブミンと結合する本発明の第１のｄＡｂ、例えば、ＤＯＭ ７ｈ−１４、ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０またはＤＯＭ ７ｈ−１１−１５と、第１のｄＡｂと同じまたは異なる結合特異性を有する第２のｄＡｂとを含み、さらに多重特異性リガンドの場合には、場合によりさらなるｄＡｂを含んでもよい）とを含む本発明の融合体または複合体を提供する。第２のｄＡｂ（またはさらなるｄＡｂ）は、場合により、例えば、ＦｇＦｒ １ｃまたはＣＤ５標的などの異なる標的と結合し得る。
【００３８】
よって、一態様において、本発明は、非経口投与、例えば、皮下注射、筋肉注射もしくは静脈注射による送達、吸入、鼻腔送達、経粘膜送達、経口送達、患者の消化管への送達、直腸送達または眼内送達のための、本発明の融合体または複合体を提供する。一態様において、本発明は、皮下注射による送達、吸入、静脈送達、鼻腔送達、経粘膜送達、経口送達、患者の消化管への送達、直腸送達または眼内送達用の薬剤の製造における、本発明の融合体または複合体の使用を提供する。
【００３９】
一態様において、本発明は、皮下注射、肺送達、静脈送達、鼻腔送達、経粘膜送達、経口送達、患者の消化管への送達、直腸送達または眼内送達による、患者への送達方法を提供し、該方法は、薬学上有効な量の本発明の融合体または複合体を患者に投与することを含む。
【００４０】
一態様において、本発明は、本発明の融合体または複合体を含む、経口製剤、注射製剤、吸入製剤、ネブライザー製剤または眼用製剤を提供する。該製剤は、錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤またはシロップ剤であり得る。一態様において、該組成物は、例えば、肥満治療用の減量飲料として市販される飲料として、経口投与することができる。一態様において、本発明は、患者に対する直腸送達用の製剤を提供し、該製剤は、例えば、坐剤として提供することができる。
【００４１】
ＧＬＰ−１化合物の非経口投与用組成物は、例えば、国際公開第ＷＯ０３／００２１３６（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように調製することができる。
【００４２】
ある種のペプチドの鼻腔投与用組成物は、例えば、欧州特許第２７２０９７号(Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ/ｓ)、または国際公開第ＷＯ９３／１８７８５号（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように調製することができる。
【００４３】
「対象」または「個体」とは、本明細書では、限定されるものではないが、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ，ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のウシ科、ヒツジ科、ウマ科、イヌ科、ネコ科、齧歯類またはネズミ種を含む哺乳類などの動物を含むと定義される。
【００４４】
本発明はまた、本発明の組成物（例えば、本発明の複合体もしくは融合体）を対象（例えば、患者）に投与する際に用いるための、組成物（例えば、本発明の複合体または融合体）、薬物送達デバイスおよび場合により使用説明書を含むキットを提供する。組成物（例えば、複合体または融合体）は、凍結乾燥製剤などの製剤として提供することができる。ある実施形態において、薬物送達デバイスは、注射器、吸入器、鼻腔内または眼用投与デバイス（例えば、噴霧器、点眼器または点鼻器）、および無針注射器からなる群から選択される。
【００４５】
本発明の組成物（例えば、複合体または融合体）は、保存のために凍結乾燥し、使用前に適当な担体で再構成することができる。任意の適当な凍結乾燥法（例えば、噴霧乾燥、固形物乾燥）および／または再構成法を使用することができる。当業者ならば、凍結乾燥および再構成が様々な程度の抗体活性の損失につながる可能性があること、そして使用レベルはそれを補うように調整しなければならないことが分かるであろう。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される凍結乾燥組成物（例えば、薬物複合体、薬物融合体）を含む組成物を提供する。好ましくは、凍結乾燥組成物（例えば、薬物複合体、薬物融合体）は、再び水和し際にその活性（例えば、血清アルブミンに対する結合活性）の損失は、約２０％以下、または約２５％以下、または約３０％以下、または約３５％以下、または約４０％以下、または約４５％以下、または約５０％以下である。活性は、凍結乾燥前にその組成物の効果をもたらすのに必要とされる組成物（例えば、薬物複合体、薬物融合体）の量である。例えば、望ましい血清濃度を達成し、望ましい期間それを維持するのに必要とされる複合体または融合体の量である。組成物（例えば、薬物複合体、薬物融合体）の活性は、凍結乾燥前に任意の適当な方法を用いて測定することができ、活性の損失量を測定するためには、再水和後に同じ方法を用いて活性を測定することができる。
【００４６】
本発明はまた、本発明の融合体または複合体を含む徐放性製剤を提供し、このような徐放性製剤は、本発明の融合体または複合体を、例えば、ヒアルロン酸、マイクロスフェアまたはリポソーム、および他の薬学医上または薬理学上許容される担体、賦形剤および／または希釈剤と組み合わせて含むことができる。このような徐放性製剤は、例えば、坐剤の形であり得る。
【００４７】
一態様において、本発明は、本発明の融合体または複合体と、薬学上または薬理学上許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００４８】
本発明はまた、Ｃ末端にアミノ酸配列ＡＭＡまたはＡＷＡを有する改変されたリーダー配列（このリーダー配列は野生型配列ではない）を提供する。この改変されたリーダー配列は、ＯｍｐＡ−ＡＭＡもしくは−ＡＷＡ；またはＯｍｐＴ−ＡＭＡもしくは−ＡＷＡ；またはＧＡＳ−ＡＭＡもしくは−ＡＷＡであり得る。
【００４９】
改変されたリーダー配列は宿主細胞における異種ポリペプチドの発現のために使用することができる。異種ポリペプチドはインスリン分泌促進薬またはインクレチン薬を含む、またはそれからなり得る。異種ポリペプチドは、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、例えば血清アルブミンと結合するｄＡｂを含む、またはそれからなり得る。
【００５０】
改変されたリーダーによる発現のための異種ポリペプチドは、（ａ）（ｂ）との融合体または複合体として存在する、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬と、（ｂ）ｄＡｂとを含むかまたはそれらからなる融合体または複合体組成物であって、(ａ)は、（ｂ）ｄＡｂ、例えば、血清アルブミンと結合し、図１（ｈ）（配列番号８）に示されるアミノ酸配列を有するＤＯＭ ７ｈ−１４ Ｖｋドメイン抗体（ｄＡｂ）、図１（ｏ）（配列番号２６）に示されるアミノ酸配列を有するＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ ｄＡｂ、および図１（ｐ）（配列番号２７）に示されるアミノ酸配列を有するＤＯＭ ７ｈ−１１−１５ ｄＡｂから選択されるｄＡｂとの融合体または複合体として存在する、融合体または複合体組成物であり得る。
【００５１】
また、改変されたリーダー配列は、
（ａ）２ｘＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１４、アミノ酸配列は図１（ａ）：配列番号１に示される）、
（ｂ）エキセンディン４（Ｇ４Ｓリンカー）３ ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１５、アミノ酸配列は図１（ｂ）：配列番号２に示される）、
（ｃ）エキセンディン４−ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１６、アミノ酸配列は図１（ｃ）：配列番号３に示される）、
（ｄ）エキセンディン４，ヘリカルリンカー，ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１７、アミノ酸配列は図１（ｄ）：配列番号４に示される）、
（ｅ）ＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ（Ｇ４Ｓリンカー）３ ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１８、アミノ酸配列は図１（ｅ）：配列番号５に示される）、
（ｆ）ＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１１９、アミノ酸配列は図１（ｆ）：配列番号６に示される）、
（ｇ）ＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ，ヘリカルリンカー，ＤＯＭ７ｈ−１４ ｄＡｂ融合体（ＤＡＴ０１２０、アミノ酸配列は図１（ｇ）：配列番号７に示される）、
（ｈ）エキセンディン４，（Ｇ４Ｓ）３，リンカーＤＯＭ７ｈ−１４−１０融合体（ＤＭＳ７１３９、アミノ酸配列は図１（ｍ）：配列番号２４に示される）、
（ｉ）エキセンディン４，（Ｇ４Ｓ）３，リンカーＤＯＭ７ｈ−１１−１５融合体（ＤＭＳ７１４３、アミノ酸配列は図１（ｎ）：配列番号２５に示される）
から選択される融合体を含む、またはそれからなる異種ポリペプチドの発現のために使用可能である。
【００５２】
また、改変されたリーダーにより発現される異種ポリペプチドは、上記のアミノ酸配列、すなわち、配列番号１〜７および配列番号２４〜２５で示されるアミノ酸配列との複合体分子を含む、またはそれからなることもできる。
【００５３】
また、改変されたリーダーにより発現される異種ポリペプチドは、エキセンディン４，（Ｇ４Ｓ）３，リンカーＤＯＭ７ｈ−１４−１０融合体（ＤＭＳ７１３９、アミノ酸配列は図１（ｍ）：配列番号２４に示される）のアミノ酸配列、またはＤＭＳ７１３９のアミノ酸配列（アミノ酸配列は図１（ｍ）に示される）から４個までのアミノ酸変化を有する融合体もしくは複合体分子を含む、またはそれからなることもできる。
【００５４】
発現のための宿主細胞は、微生物宿主細胞、原核生物宿主細胞、グラム陰性菌宿主細胞または大腸菌宿主細胞であり得る。
【００５５】
また、（ｉ）インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬と、（ｉｉ）インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬からインスリン分泌促進薬またはインクレチン薬のＮ末端のアミノ酸が２個少ないものとの混合物を作製する方法（プロセス）も提供され、該方法は、宿主細胞において該インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬の１番の位置の前での切断と３番の位置の前での切断を生じるリーダー配列を用いて（ｉ）を発現させるステップを含む。該インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬は、例えば、上記で定義されたような血清アルブミンと結合するｄＡｂとの融合体または複合体の形態であり得る。本発明はまた、上記の方法によって得られた、または得ることができる混合物も提供する。
【００５６】
リーダー配列はｏｍｐＡ、ｏｍｐＴ、ＧＡＳ、または上記の改変された配列のいずれか１つであり得る。該方法は、異種発現によって宿主細胞で該混合物を産生するステップを含み得る。該宿主細胞は微生物宿主細胞、原核生物宿主細胞、グラム陰性菌宿主細胞または大腸菌宿主細胞であり得る。
【００５７】
インスリン分泌促進薬およびインクレチン薬、例えば、ＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１Ｒによって媒介され得る多様な治療効果（例えば、膵臓からのグルコース依存性インスリン分泌を刺激するものなど）を有する。また、ＤＰＰＩＶ切断産物であるＧＬＰ−１ ９−３６アミド（またはＧＬＰ−１ ９−３７）によって媒介され得る、ある種の効果が存在することもすでに提案されている。ＧＬＰ−１ ９−３７は膵臓からのグルコース感受性インスリン分泌の刺激には活性が無いが、おそらくはＧＬＰ−１Ｒにより駆動されるものではない機構を介する他の生物学的効果を有することがすでに提案されている。ＧＬＰ−１種の分子に関するこれまでのほとんどの臨床応用は膵臓のＧＬＰ−１Ｒを介して糖尿病を標的としていたので、エキセンディン−４のような非ヒトＧＬＰ−１類似体を使用するか、またはアルビグルチド(Ａｌｂｉｇｌｕｔｉｄｅ)(Ｓｙｎｃｒｉａ)で用いられているようなＧＬＰ−１の８もしくは９個のアミノ酸を突然変異させることによって、あるいは該ペプチドのアミノ末端における化学的修飾または合成的修飾によって、ペプチドにおいてＤＰＰＩＶに対する安定性が操作されている。さらなるアプローチとしては、いずれの内因性分泌ＧＬＰ−１の半減期も延長する、ビルダグリプチン(Ｇａｌｖｕｓ)およびシタグリプチン(Ｊａｎｕｖｉａ)などの小分子ＤＰＰＩＶ阻害剤を用いたＤＰＰＩＶ活性の全面的遮断であった。これらのアプローチは双方とも、ＤＰＰＩＶ代謝産物であるＧＬＰ−１ ９−３６アミドまたはＧＬＰ−１ ９−３７のレベルを効果的に低下させる。
【００５８】
しかしながら、ＤＰＰＩＶ代謝産物であるＧＬＰ−１ ９−３６アミドまたはＧＬＰ−１ ９−３７は、望ましい生物学的効果を有することもすでに提案されている。いくつかの研究は、ＧＬＰ−１ ７−３６の分泌後すぐに生成され、通常の条件下でＧＬＰ−１ ７−３７よりも豊富なＧＬＰ−１ ７−３６アミドのＤＰＰＩＶ切断産物、すなわち、ＧＬＰ−１ ９−３６アミドが生物学的効果を有し得ることを示した。この機構に関しては、以下に挙げるような、経路の異なるいくつかの作用が提案されている。
【００５９】
ＧＬＰ−１（９−３７）はＧＬＰ−１Ｒにおけるアンタゴニストである（例えば、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ. １９９６ Ｄｅｃ ３０；３１８（２−３）：４２９−３５参照）。
グルカゴン様ペプチド−１−（９−３６）アミドは、イヌにin vivo投与した後のグルカゴン様ペプチド−１−（７−３６）アミドの主要代謝産物であり、膵臓受容体に対してアンタゴニストとして働き(Ｋｎｕｄｓｅｎ ＬＢ， Ｐｒｉｄａｌ Ｌ. Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ. １９９７ Ａｕｇ ２２； ２７２（３４）： ２１２０１−６)、膵臓グルカゴン様ペプチド−１受容体の強力なアンタゴニストである(Ｍｏｎｔｒｏｓｅ−Ｒａｆｉｚａｄｅｈ Ｃ, Ｙａｎｇ Ｈ, Ｒｏｄｇｅｒｓ ＢＤ, Ｂｅｄａｙ Ａ, Ｐｒｉｔｃｈｅｔｔｅ ＬＡ, Ｅｎｇ Ｊ. Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ. １９９７ Ａｕｇ ２２;２７２（３４）:２１２０１−６)。
【００６０】
ＧＬＰ−１（９−３７）は、非インスリン依存性機構によって、異なる機構を介してＧＬＰ−１（７−３７）にシグナルを伝達する(Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ. ２００２ Ａｐｒ;２８２（４）:Ｅ８７３−９.)。
ＧＬＰ−１−（９−３６）アミドは、麻酔状態のブタにおいて、インスリン分泌に関わりのない機構によって血糖を低下させる(Ｄｅａｃｏｎ ＣＦ, Ｐｌａｍｂｏｅｃｋ Ａ, Ｍｏｌｌｅｒ Ｓ, Ｈｏｌｓｔ ＪＪ.)。
【００６１】
あるいは、肥満個体においてインスリン感受性を高める働きをすることによる(Ｏｂｅｓｉｔｙ (Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ). ２００８ Ｊｕｌ; １６（７）:１５０１−９. Ｅｐｕｂ ２００８ Ａｐｒ １７)。
【００６２】
ＧＬＰ−１（７−３６）アミドの切断産物であるＧＬＰ−１（９−３６）アミドは血糖調節ペプチドである(Ｅｌａｈｉ Ｄ, Ｅｇａｎ ＪＭ, Ｓｈａｎｎｏｎ ＲＰ, Ｍｅｎｅｉｌｌｙ ＧＳ, Ｋｈａｔｒｉ Ａ, Ｈａｂｅｎｅｒ ＪＦ, Ａｎｄｅｒｓｅｎ ＤＫ)。
【００６３】
エキセンディンのアミノ酸が２個少ない種に関しては、ＤＰＰＩＶ切断の結果としてこれが生じないことからこの活性は示されなかったが、これはエキセンディン−４のアミノ酸が２個少ない種の場合である可能性もある。エキセンディン−４はまた、心臓作用およびその他の作用に関して、ＧＬＰ−１Ｒ依存性および非依存性の経路を介して働くことも示されている(Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ. ２００８;１１７:２３４０‐２３５０: Ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｖａｓｏｄｉｌａｔｏｒｙ Ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ １ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｒｅ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｂｏｔｈ Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ １ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ‐Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ‐Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐａｔｈｗａｙｓ Ｋｉｗｏｎ Ｂａｎ, ＭＳｃ; Ｍ. Ｈｏｓｓｅｉｎ Ｎｏｙａｎ−Ａｓｈｒａｆ, ＰｈＤ; Ｊｕｄｉｔｈ Ｈｏｅｆｅｒ, ＭＤ; Ｓｔｅｆｆｅｎ−Ｓｅｂａｓｔｉａｎ Ｂｏｌｚ, ＭＤ, ＰｈＤ; Ｄａｎｉｅｌ Ｊ. Ｄｒｕｃｋｅｒ, ＭＤ; Ｍａｎｓｏｏｒ Ｈｕｓａｉｎ, ＭＤ)。このことにより、エキセンディンの全長型とアミノ酸が２個少ない形態の双方に対して同等または並行した活性が実際に存在する可能性が浮上する。
【００６４】
少なくとも２つのプロセス経路が、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬とアミノ酸が２個少ない形態の混合物を作製するために利用可能である。例えば、全長ＧＬＰ−１ ７−３６アミド（ＡｌｂｕｄＡｂなどの所望の半減期延長形式における）とＧＬＰ−１ ９−３６アミド（または所望の融合タンパク質）の個別生産があり得る。その後、これらを混合して、ＧＬＰ−１ ７−３６分子とＧＬＰ−１ ９−３６分子の所望の比率で生成物を得ることができる。２つの並行ＧＭＰプロセスを用いて薬剤混合物を得てもよい。
【００６５】
もう１つの方法は、シグナル配列の除去を担うシグナルペプチダーゼ酵素が単一の切断部位を持たず、むしろ２つの切断部位を有する分泌シグナルを選択することである。これらは用いる分泌シグナルによって定義される比率で切断される。従って、選択された分泌シグナルによって、生産比率は、
１番の位置の前で１００％の切断となって、ＧＬＰ−１ ７−３６（もしくは他のインスリン分泌促進薬またはインクレチン薬全長分子）が得られるか；または３番の位置の前で１００％の切断となって、ＧＬＰ−１ ９−３６（もしくはアミノ酸配列が２個少ない他のインスリン分泌促進薬またはインクレチン薬）が得られるか；または全長もしくは２個少ない形態のそれぞれについて０〜１００％の間のいずれかであり得る。例えば、比率は、
全長型９０％：アミノ酸が２個少ない形態１０％、
全長型８０％：アミノ酸が２個少ない形態２０％、
全長型７５％：アミノ酸が２個少ない形態２５％、
全長型５０％：アミノ酸が２個少ない形態５０％、
全長型２５％：アミノ酸が２個少ない形態７５％、
全長型２０％：アミノ酸が２個少ない形態８０％、または
全長型１０％：アミノ酸が２個少ない形態９０％
であり得る。
【００６６】
所望の比率を得るのに適当なリーダー配列を選択することで、ある単一の宿主細胞からの生産が可能となる。これはＧＭＰプロセスに関して主要な利点である。これにより、内因性酵素の安定性を保持しながら、両種の潜在的治療効果の活用が可能となる。
【００６７】
他の内因性ペプチドおよび類似体の全範囲もアミノ末端ジペプチダーゼで処理することにより、元の全長分子および／またはジペプチダーゼ感受性種が生じる。従って、このアプローチは、１回の製造工程で、アミノ酸数個分だけ長さの異なる（このアミノ酸の違いは、シグナルペプチダーゼの認識部位の一部を含む）２種の所定の混合物を得ることができる、いずれのペプチドおよびタンパク質の生産にも有用であり得る。このプロセスの利用は、哺乳類、真核生物または原核生物宿主細胞、例えば、大腸菌で可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１−１】（ａ）ＤＡＴ０１１４（配列番号１）、（ｂ）ＤＡＴ０１１５（配列番号２）、（ｃ）ＤＡＴ０１１６（配列番号３）、（ｄ）ＤＡＴ０１１７（配列番号４）、（ｅ）ＤＡＴ０１１８（配列番号５）、（ｆ）ＤＡＴ０１１９（配列番号６）、（ｇ）ＤＡＴ０１２０（配列番号７）、（ｈ）ＤＯＭ ７ｈ−１４（配列番号８）（ｄＡｂ）（ＣＤＲが下線で示される）、（ｉ）ＧＬＰ−１ ７−３７ Ａ（８）Ｇ（配列番号９）、（ｊ）エキセンディン−４（配列番号１０）、（ｋ）ヘリカルリンカー（配列番号１１）、（ｌ）Ｇｌｙ−ｓｅｒリンカー（配列番号１２）、（ｍ）ＤＭＳ ７１３９（配列番号２４）、（ｎ）ＤＭＳ ７１４３（配列番号２５）、（ｏ）ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０（配列番号２６）（ｄＡｂ）（ＣＤＲが下線で示される）、（ｐ）ＤＯＭ ７ｈ−１１−１５（配列番号２７）（ｄＡｂ）（ＣＤＲが下線で示される）、（ｑ）ＯｍｐＴ ＡＷＡシグナルペプチド（リーダー）（配列番号２８）、（ｒ）ＤＯＭ７ｈ−１４−１０Ｒ１０８Ｃ（配列番号４２）、（ｓ）ＰＹＹ ３−３６（１０番の位置にリシンを有する）（配列番号４３）のアミノ酸配列を示す。
【図１−２】図１−１の続き。
【図１−３】図１−１の続き。
【図２−１】（ａ）ＤＡＴ０１１４（哺乳類構築物）（配列番号１３）、（ｂ）ＤＡＴ０１１５（哺乳類構築物）（配列番号１４）、（ｃ）ＤＡＴ０１１５（大腸菌構築物用に至適化されたもの）（配列番号１５）、（ｄ）ＤＡＴ０１１６（哺乳類構築物）（配列番号１６）、（ｅ）ＤＡＴ０１１６（大腸菌構築物用に至適化されたもの）（配列番号１７）、（ｆ）ＤＡＴ０１１７（哺乳類構築物）（配列番号１８）、（ｇ）ＤＡＴ０１１７（大腸菌構築物用に至適化されたもの）（配列番号１９）、（ｈ）ＤＡＴ０１１８（哺乳類構築物）（配列番号２０）、（ｉ）ＤＡＴ０１１９（哺乳類構築物）（配列番号２１）、（ｊ）ＤＡＴ０１２０（哺乳類構築物）（配列番号２２）、（ｋ）Ｄｏｍ７ｈ−１４（配列番号２３）、（ｌ）ＤＭＳ ７１３９（配列番号２９）、（ｍ）ＤＭＳ ７１４３（配列番号３０）、（ｎ）Ｄｏｍ７ｈ−１４−１０（配列番号３１）（ｄＡｂ）、（ｏ）ＤＯＭ７ｈ−１１−１５（配列番号３２）（ｄＡｂ）、（ｐ）Ｏｍｐ ＡＷＡシグナルペプチド（配列番号３３）、（ｑ）ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ Ｒ１０８Ｃ（ｄＡｂ）（配列番号４４）、（ｒ）カニクイザル(ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｍｏｎｋｅｙ)のｃＤＮＡ（配列番号４５）、（ｓ）オリゴヌクレオチド１（配列番号４７）、（ｔ）オリゴヌクレオチド２（配列番号４８）、（ｕ）大腸菌での発現のためのＤＭ７１３９の核酸配列（配列番号５０）の核酸配列を示す。
【図２−２】図２−１の続き。
【図２−３】図２−１の続き。
【図２−４】図２−１の続き。
【図２−５】図２−１の続き。
【図３ａ】（ａ）は、マウス肥満モデルにおけるＤＡＴ０１１５投与による用量依存的体重減少を示す。
【図３ｂ】（ｂ）は、マウス肥満モデルにおけるＤＡＴ０１１５投与による毎日の摂食量を示す。
【図４】ＤＡＴ０１１５のＤＳＣを示す。実線はＤＡＴ０１１５のトレース、点線は非２状態モデルへの当てはめ。
【図５】リゾチームのＤＳＣを示す。実線はリゾチームのトレース、点線は非２状態モデルへの当てはめ（トレースが重複しているために点線は見えない）。
【図６】ＤＡＴ０１１５のＳＥＣ ＭＡＬＬＳを示す。
【図７】ＤＡＴ０１１７のＳＥＣ ＭＡＬＬＳを示す。
【図８】ＤＡＴ０１２０のＳＥＣ ＭＡＬＬＳを示す。
【図９】リーダー：（ａ）ｏｍｐＡ（大腸菌由来）（配列番号３４）、（ｂ）ｏｍｐＡ−ＡＭＡ（人工配列）（配列番号３５）、（ｃ）ｏｍｐＡ−ＡＷＡ（人工配列）（配列番号３６）、（ｄ）ｏｍｐＴ（大腸菌由来）（配列番号３７）、（ｅ）ｏｍｐＴ−ＡＭＡ（人工配列）（配列番号３８）、（ｆ）ＧＡＳ（Ｓ．セレビシエ(Ｓ. ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)由来）（配列番号３９）、（ｇ）ＧＡＳ−ＡＭＡ（人工配列）（配列番号４０）、（ｈ）ＧＡＳ−ＡＷＡ（人工配列）（配列番号４１）、（ｉ）Ｐｅｌ Ｂ（エルウィニア・カロトボーラ(Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ)）（配列番号４６）、（ｊ）Ｍａｌ Ｅ（人工配列）（配列番号４９）のアミノ酸配列を示す。
【図１０】質量分析によって分析した精製ＤＭＳ７１３９を示す。
【図１１】ＤＡＴ０１１５と対照、ＤＭＳ７１３９と対照、およびＤＭＳ７１３９とＤＡＴ０１１５の間の比較を含む、血糖低下の統計的有意性を示す。（ａ）は実験計画を示し、（ｂ）はグルコースＡＵＣのグラフを示す。水平線が重ならない信頼区間は有意である。
【図１２】ＤＭＳ７１３９の反復投与は、ＤＯＭ７ｈ−１４対照に比べて、ＨｂＡ１ｃの用量依存的減少を示すことを示す。
【図１３】ＤＩＯマウス肥満モデルにおいて、ＤＡＴ０１１５およびＤＭＳ７１３９は、ＤＯＭ７ｈ−１４対照に比べて、摂食量および体重の用量依存的減少を示すことを示す。グラフでは、ｍｃｇ＝マイクログラム。
【図１４】リシン（ＰＹＹの１０番の位置に導入）および４リピートＰＥＧリンカーを介して、Ｃ末端でアミド化されたＰＹＹ３−３６と複合体化されたＤＯＭ ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ＡｌｂｕｄＡｂであるペプチド複合体を示す。直線は、ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ＡｌｂｕｄＡｂの遊離のＣ末端システインおよびＰＹＹ配列の１０番の位置のリシンと共有結合しているリンカーを表す。このペプチド複合体のアミノ酸配列および構造は下記の通りである。
【図１５】ＤＭＳ７６０５はビヒクル対照に比べて用量依存的体重減少を示したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
発明の詳細な説明
本明細書において、本発明を、実施形態を参照して、明瞭かつ簡潔な明細書を記載できるような方法で説明した。実施形態は本発明から逸脱することなく様々に組み合わせたり分割したりできるものと意図され、また、そのように考えるべきである。
【００７０】
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション法および生化学分野の）当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を持つ。分子的、遺伝学的および生化学的方法（一般的には、参照により本明細書に組み入れるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ., Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ: Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, ２ｄ ｅｄ. （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ, Ｎ.Ｙ.およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ., Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９９） ４ｔｈ Ｅｄ, Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ, Ｉｎｃ.参照）および化学的方法に関して標準的な技術を用いる。
【００７１】
本明細書において「インスリン分泌促進薬」とは、ホルモンであるインスリンの合成もしくは発現、または活性を刺激することができる化合物、あるいはその合成もしくは発現または活性の刺激を引き起こすことができる化合物を意味する。インスリン分泌促進薬の既知の例としては、限定されるものではないが、例えば、グルコース、ＧＩＰ、ＧＬＰ、エキセンディン（例えば、エキセンディン−４およびエキセンディン−３）、ＰＹＹおよびＯＸＭが含まれる。
【００７２】
本明細書において「インクレチン」とは、グルコースレベルが正常である場合、または特にグルコースレベルが上昇している場合に、放出されるインスリン量の増加を引き起こす、消化管ホルモンの一種を意味する。例としては、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、ＯＸＭ、ＰＹＹ（例えば、ＰＹＹ３−３６）、ＶＩＰおよびＰＰ（膵臓ポリペプチド）が挙げられる。
【００７３】
本明細書において、ポリペプチドに関して「類似体」とは、ペプチドの１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている、かつ／または１以上のアミノ酸残基がペプチドから欠失されている、かつ／または１以上のアミノ酸残基がペプチドから欠失されている、かつ／または１以上のアミノ酸残基がペプチドに付加されている、修飾されたペプチドを意味する。このようなアミノ酸残基の付加または欠失はペプチドのＮ末端でも、かつ／またはペプチドのＣ末端でも起こる可能性があり、あるいはペプチド内部にある場合もある。簡単な体系を用いてＧＬＰ−１の類似体が表される：例えば、ＧＬＰ−１ Ａ８Ｇ（７−３７アミノ酸）は、天然の８位のアラニンがグリシン残基で置換されたＧＬＰ−１類似体を表す。ペプチド類似体およびその誘導体の式は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ命名法に従って使用されるアミノ酸の標準的な１文字略号を用いて記される。
【００７４】
本明細書において「断片」とは、ペプチドに関して使用される場合、天然の完全なポリペプチドのアミノ酸配列の全てではないが一部が同じアミノ酸配列を有するポリペプチドである。断片は、「独立」であっても、あるいはそれらが一部または一領域をなしている、より大きなポリペプチド内に、単一のより大きなポリペプチド中の単一の連続した領域として含まれる。例としては、天然のＧＬＰ−１の断片は、天然アミノ酸１〜３６のうち、アミノ酸７〜３６を含む。その上、ポリペプチドの断片は、天然の部分配列の変異体であってもよい。例えば、天然ＧＬＰ−１のアミノ酸７〜３６を含むＧＬＰ−１の断片は、その部分配列内にアミノ酸置換を有する変異体であってもよい。
【００７５】
本発明の適当なインスリン分泌促進薬の例としては、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１誘導体、ＧＬＰ−１類似体、またはＧＬＰ−１類似体の誘導体が含まれる。それに加えて、エキセンディン−４、エキセンディン−４類似体およびエキセンディン−４誘導体または断片、ならびにエキセンディン−３、エキセンディン−３誘導体およびエキセンディン−３類似体も含まれる。
【００７６】
本明細書において「ＧＬＰ−１」とは、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１（７−３８）、ＧＬＰ−１（７−３９）、ＧＬＰ−１（７−４０）、ＧＬＰ−１（７−４１）、ＧＬＰ−１類似体、ＧＬＰ−１ペプチド、ＧＬＰ−１誘導体もしくは突然変異体もしくは断片、またはＧＬＰ−１類似体の誘導体を意味する。このようなペプチド、突然変異体、類似体および誘導体はインスリン分泌促進薬である。
【００７７】
例えば、ＧＬＰ−１は、図１（ｉ）：配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ突然変異体であり得る。
【００７８】
さらなるＧＬＰ−１類似体が、ＧＬＰ−１（７−３６）およびその機能的誘導体を含み、かつ、ＧＬＰ−１（１−３６）もしくはＧＬＰ−１（１−３７）のインスリン分泌促進活性を上回るインスリン分泌促進活性を有するペプチド断片、ならびにインスリン分泌促進薬としてのそれらの使用に関する国際特許出願第９０／１１２９６号(Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ)に記載されている（特に、本発明で用いる薬物の例として、参照により本明細書に組み入れる）。
【００７９】
国際特許出願第９１／１１４５７号（Ｂｕｃｋｌｅｙら）は、本発明のＧＬＰ−１薬としても有用であり得る、活性ＧＬＰ−１ペプチド７−３４、７−３５、７−３６および７−３７の類似体を開示している。
【００８０】
本明細書において「エキセンディン−４ペプチド」とは、エキセンディン−４（１−３９）、エキセンディン−４類似体、エキセンディン−４ペプチドの断片、エキセンディン−４誘導体、またはエキセンディン−４類似体の誘導体を意味する。このようなペプチド、断片および誘導体はインスリン分泌促進薬である。エキセンディン−４（１−３９）のアミノ酸配列は図１（ｊ）：配列番号１０に示される。
【００８１】
本発明に有用なさらなるエキセンディン類似体が、ＰＣＴ特許公報第ＷＯ９９／２５７２８号（Ｂｅｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ）、同第ＷＯ９９／２５７２７号（Ｂｅｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ）、同第ＷＯ９８／０５３５１号（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ）、同第ＷＯ９９／４０７８８号（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ）、同第ＷＯ９９／０７４０４号（Ｂｅｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ）および同第ＷＯ９９／４３７０８号（Ｋｎｕｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ）に記載されている（特に、本発明で用いる薬物の例として、参照により全て本明細書に組み入れる）。
【００８２】
本明細書において「ペプチド」とは、ペプチド結合によって互いに連結された約２〜約５０個のアミノ酸を表す。
【００８３】
本明細書において「ポリペプチド」とは、ペプチド結合によって互いに連結された少なくとも約５０個のアミノ酸を表す。ポリペプチドは一般に三次構造を含み、折り畳まれて機能的ドメインとなっている。
【００８４】
本明細書において「ディスプレイ系」とは、ポリペプチドまたはペプチドの集合体が、所望の特性、例えば、物理的、化学的または機能的特性に基づく選択に利用可能な系を表す。ディスプレイ系は、ポリペプチドまたはペプチド（例えば、溶液中、適当な担体上に固定化）の適当なレパートリーであり得る。また、ディスプレイ系は、細胞発現系（例えば、形質転換細胞、感染細胞、トランスフェクト細胞または形質導入細胞などにおける核酸ライブラリーの発現、およびコードされているポリペプチドの細胞表面上でのディスプレイ）または無細胞発現系（例えば、エマルションコンパートメント化およびディスプレイ）を用いる系であってもよい。典型的なディスプレイ系は、核酸のコード機能と、核酸によってコードされるポリペプチドまたはペプチドの物理的、化学的および／または機能的特性とを関連づけるものである。このようなディスプレイ系を用いると、所望の物理的、化学的および／または機能的特性を有するポリペプチドまたはペプチドを選択することができ、選択されたポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸を容易に単離または回収することができる。核酸のコード機能と、ポリペプチドまたはペプチドの物理的、化学的および／または機能的特性とを関連づけるいくつものディスプレイ系が当技術分野で知られており、例えば、バクテリオファージディスプレイ（ファージディスプレイ、例えば、ファージミドディスプレイ）、リボソームディスプレイ、エマルションコンパートメント化およびディスプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上でのディスプレイ、共有結合ディスプレイなどがある（例えば、欧州特許第０４３６５９７号(Ｄｙａｘ)、米国特許第６，１７２，１９７号(ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ)、米国特許第６，４８９，１０３号(Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａl)参照）。
【００８５】
本明細書において「機能的」とは、特異的結合活性などの生物学的活性を有するポリペプチドまたはペプチドを表す。例えば、「機能的ポリペプチド」とは、抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、その抗原結合部位を介して標的抗原と結合する。
【００８６】
本明細書において「標的リガンド」とは、ポリペプチドまたはペプチドが特異的または選択的に結合するリガンドを表す。例えば、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントである場合には、その標的リガンドは任意の望ましい抗原またはエピトープであり得る。標的抗原との結合は、ポリペプチドまたはペプチドが機能的であることによるものである。
【００８７】
本明細書において抗体は、自然に抗体を産生する任意の種に由来するものであれ、組換えＤＮＡ技術によって作製されたものであれ、血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクト体、酵母または細菌から単離されたものであれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＥ、またはフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、閉構造多重特異性抗体、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、ダイアボディー）を表す。
【００８８】
本明細書において「抗体フォーマット」とは、その構造に抗原に対する結合特異性を付与するように１以上の抗体可変ドメインを組み込むことができる、任意の適当なポリペプチド構造を表す。キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、前記のいずれかの抗原結合フラグメント（例えば、Ｆｖフラグメント（例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント）、単一抗体可変ドメイン（例えば、ｄＡｂ、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）、ならびに前記のいずれかの修飾形（例えば、ポリエチレングリコールもしくは他の適当なポリマーまたはヒト化ＶＨＨの共有結合による修飾）など、種々の適当な抗体フォーマットが当技術分野で知られている。
【００８９】
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」とは、他のＶ領域またはドメインとは独立に、抗原またはエピトープと特異的に結合する抗体可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を表す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の可変領域または可変ドメインを有するフォーマット（例えば、ホモまたはヘテロ多量体）で存在することもできるが、この場合、他の領域またはドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合には必要とされない（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の可変ドメインとは独立に抗原と結合する）。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。「単一免疫グロブリン可変ドメイン」は、本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。「単一抗体可変ドメイン」は、本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、ある実施形態では、ヒト抗体可変ドメインであるが、齧歯類（例えば、国際公開第ＷＯ００／２９００４号に開示、その内容は参照によりその全てが本明細書に組み入れられる）、テンジクザメ、およびラクダ科動物のＶＨＨ ｄＡｂなどの他種由来の単一抗体可変ドメインも含まれる。ラクダ科動物ＶＨＨは、もともと軽鎖を欠いた重鎖抗体を産生するラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。ＶＨＨはヒト化することができる。
【００９０】
「ドメイン」は、タンパク質の残りの部分とは独立した三次構造を有する、折り畳まれたタンパク質構造である。一般に、ドメインは、タンパク質の個別の機能的特性に関与しており、多くの場合、タンパク質の残りの部分および／またはそのドメインの機能を失うことなく、他のタンパク質に付加したり、取り除いたり、移したりすることができる。「単一抗体可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む、折り畳まれたポリペプチドドメインである。従って、これには、完全な抗体可変ドメイン、および例えば１以上のループが、抗体可変ドメインに特徴的でない配列で置き換えられているなどの改変された可変ドメイン、あるいは末端切断されているか、またはＮ末端もしくはＣ末端伸長部を含む抗体可変ドメイン、ならびに少なくとも全長ドメインの結合活性および特異性を保有する、折り畳まれた可変ドメインフラグメントが含まれる。
【００９１】
「ライブラリー」とは、異種ポリペプチドまたは核酸の混合物を表す。ライブラリーは、それぞれが単一のポリペプチドまたは核酸配列を有するメンバーから構成される。この点で、「ライブラリー」は、「レパートリー」と同義である。ライブラリーメンバー間の配列の相違が、ライブラリーに存在する多様性を担っている。ライブラリーは、ポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形をとってもよいし、核酸のライブラリーで形質転換された、例えば、細菌、ウイルス、動物または植物細胞などの生物または細胞の形をとってもよい。一実施形態では、個々の生物または細胞は、１つだけまたは限られた数のライブラリーメンバーを含む。一実施形態において、核酸は、その核酸によってコードされるポリペプチドの発現を可能にするために、発現ベクターに組み込まれている。従って、ある態様において、ライブラリーは、宿主生物の集団の形をとってもよく、各生物は、それを発現させればその対応するポリペプチドメンバーを生成することができる核酸形態でライブラリーの単一メンバーを含む、１コピー以上の発現ベクターを含む。従って、宿主生物の集団は、多様なポリペプチドからなる大きなレパートリーをコードする能力を有している。
【００９２】
本明細書において「用量」とは、１回で全量を（単位用量）、または所定の時間間隔で２回以上の投与で、対象に投与される融合体または複合体の量を表す。例えば、用量は、１日（２４時間）（１日量）、２日、１週間、２週間、３週間または１ヶ月以上の間に（例えば、１回投与で、または２回以上の投与で）対象に投与される融合体または複合体の量を表し得る。投与間隔は、任意の望ましい時間とすることができる。
【００９３】
「半減期」とは、融合体または複合体の血清濃度または血漿濃度がin vivoで、例えば、自然のメカニズムによる分解および／または排出または隔離によって５０％だけ減少するのにかかる時間を表す。本発明の融合体または複合体はin vivoで安定化されており、その半減期は、分解および／または排出または隔離に抵抗する血清アルブミン分子、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合することによって長くなる。これらの血清アルブミン分子は、それ自体in vivoで長い半減期を有する天然タンパク質である。分子の半減期は、その機能的活性がin vivoで、半減期延長分子に特異的でない類似の分子よりも長期間持続するならば延長されている。例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に特異的なｄＡｂとインクレチン薬またはインスリン分泌促進薬、例えば、ＧＬＰ−１またはエキセンディンとを含む本発明の融合体または複合体は、ＨＳＡに対する特異性が無く、ＨＳＡとは結合せずに別の分子と結合する、同じリガンドと比較される。例えば、それは細胞上の第３の標的と結合することができる。一般に、半減期は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれを超えて延長される。２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍またはそれを超える範囲での半減期の延長が可能である。その代わりに、またはそれに加えて、最大３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、３００倍、４００倍までの範囲での半減期の延長が可能である。
【００９４】
本明細書において「流体力学的サイズ」とは、水溶液中での分子の拡散に基づいた、分子（例えば、タンパク質分子、リガンド）の見かけの大きさを表す。溶液中でのタンパク質の拡散または運動を分析処理して、タンパク質の見かけの大きさを導き出すことができるが、この大きさはタンパク質粒子の「ストークス半径」または「流体力学的半径」によって示される。タンパク質の「流体力学的半径」は、質量と形状（立体構造）の両方に依存するので、同じ分子質量を有する２つのタンパク質でも、タンパク質の全体的な立体構造に基づいて異なる流体力学的サイズを有することがある。
【００９５】
２つの配列間の「相同性」または「同一性」または「類似性」（これらの用語は本明細書において互換的に用いられる）の計算は以下のように行われる。配列を、最適な比較ができるようにアラインする（例えば、最適なアラインメントのために、第１および第２のアミノ酸もしくは核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、非相同配列は、比較の目的で無視することができる）。一実施形態において、比較のためにアラインされる参照配列の長さは、その参照配列の長さの少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められているならば、その分子はその位置で同一である（本明細書においてアミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と同等である）。２配列間の同一性％は、２配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れ、配列が共有する同一位置の数の関数である。本明細書で定義される、アミノ酸およびヌクレオチド配列アラインメントおよび相同性、類似性もしくは同一性は、アルゴリズムＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓによって、デフォルトパラメーターを用いて作製し、決定することができる(Ｔａｔｕｓｏｖａ， Ｔ． Ａ． ｅｔ ａｌ，， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ， １７４:１８７−１８８ （１９９９）)。
【００９６】
核酸、宿主細胞：
本発明は、本明細書に記載された本発明の融合体（例えば、配列番号１３〜２３によってコードされるもの）をコードする、単離されたおよび／または組換え核酸に関する。
【００９７】
本明細書において「単離された」と称される核酸は、そのもとの環境中（例えば、細胞内、またはライブラリーなどの核酸混合物中）の他の材料（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／またはＲＮＡなどの他の核酸）から分離された核酸である。単離された核酸は、ベクターの一部として単離することもできる（例えば、プラスミド）。
【００９８】
本明細書において「組換え」と称される核酸は、例えば制限酵素、相同組換え、ウイルスなどを用いたベクターまたは染色体へのクローニングといった、人為的組換えによる方法を含む、組換えＤＮＡ法によって作製された核酸、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて調製された核酸である。
【００９９】
本発明はまた、本明細書に記載の本発明の融合体をコードする核酸を含む（１以上の）組換え核酸または発現構築物を含む、組換え宿主細胞、例えば、哺乳動物または微生物に関する。また、本明細書に記載の本発明の融合体を調製する方法も提供され、該方法は、本発明の組換え宿主細胞、例えば、哺乳動物または微生物を、融合ポリペプチドの発現に適当な条件下で維持することを含む。該方法はさらに、必要に応じて、融合体を単離または回収するステップを含むことができる。
【０１００】
例えば、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸分子（すなわち、１以上の核酸分子）、またはこのような核酸分子を含む発現構築物（すなわち、１以上の構築物）を、選択された宿主細胞に適した任意の方法（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染）を用いて、その核酸分子が１以上の発現制御エレメント（例えば、ベクター内のエレメント、細胞内プロセスによって作出される構築物中のエレメント、宿主細胞ゲノムに組み込まれているエレメント）に機能的に連結されるように、適切な宿主細胞に導入して、組換え宿主細胞を作出することができる。得られた組換え宿主細胞は、発現に適した条件下で（例えば、誘導因子の存在下で、適当な動物内で、適当な塩、増殖因子、抗生物質、栄養添加物などを添加した適当な培地中で）維持することができ、それによって、コードされたペプチドまたはポリペプチドが産生される。必要に応じて、コードされたペプチドまたはポリペプチドを（例えば、動物、宿主細胞、培地、乳汁から）単離または回収することができる。このプロセスには、トランスジェニック動物の宿主細胞における発現が含まれる（例えば、国際公開第ＷＯ９２／０３９１８号、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ参照）。
【０１０１】
また、本明細書に記載の本発明の融合ポリペプチドは、適当なｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系で、例えば、化学合成によって、または他のいずれかの適当な方法によって作製することもできる。
【０１０２】
本明細書に記載され、例示されるように、本発明の融合体または複合体は一般に血清アルブミンと、高い親和性で結合する。
【０１０３】
例えば、本発明の融合体または複合体は、約５μＭ〜約１００ｐ、例えば、約１μＭ〜約１００ｐＭ、例えば、約５〜５０ｎｍ、例えば、約１０〜３０ｎｍ、例えば、約２０〜３０ｎｍの親和性（ＫＤ；ＫＤ＝Ｋｏｆｆ（ｋｄ）／Ｋｏｎ（ｋａ）［表面プラズモン共鳴により測定］）でヒト血清アルブミンと結合することができる。
【０１０４】
本発明の融合体または複合体は、大腸菌(Ｅ. ｃｏｌｉ)またはピキア(Ｐｉｃｈｉａ)種（例えば、Ｐ. ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現させることができ、また、酵母または真菌細胞で発現させることもできる。一実施形態において、融合体は、大腸菌またはピキア種（例えば、Ｐ. ｐａｓｔｏｒｉｓ）、または哺乳類細胞培養（例えば、ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞）で発現させた場合、少なくとも約０．５ｍｇ／ｌの量で分泌される。大腸菌またはピキア種または哺乳類細胞で発現させる場合、本明細書に記載の融合体または複合体は分泌可能であるが、それらは化学合成法、または大腸菌もしくはピキア種を使用しない生物生産法などの任意の適当な方法を用いて作製することもできる。
【０１０５】
ある実施形態において、本発明の融合体および複合体は、国際公開第ＷＯ２００６／０５９１０６号（例えば、国際公開第ＷＯ２００６／０５９１０６号の１０４〜１０５ページ）に記載されているような、または本明細書の実施例に記載されているような動物モデルにおいて、有効量を投与した際に、効果がある。一般に、有効量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。疾病モデルは、ヒトでの治療効果を予測するものとして当業者に認識されている。
【０１０６】
一般に、本発明の融合体および複合体は、精製形態で、薬理学的または生理学的に適当な担体とともに使用される。一般に、これらの担体としては、水性もしくはアルコール／水性の溶液、エマルションもしくは懸濁液、生理食塩水および／または緩衝媒体を含む任意のものを含み得る。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖加リンゲル液、ブドウ糖および塩化ナトリウムおよび乳酸加リンゲル液を含み得る。懸濁液中でポリペプチド複合体を維持するために必要であれば、適当な生理学上許容されるアジュバントを、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギン酸塩などの増粘剤から選択することができる。
【０１０７】
静脈ビヒクルは、ブドウ糖加リンゲル液をベースとしたものなどの液体および栄養補給物質および電解質補給物質を含む。また、保存剤および他の添加物、例えば、抗生物質、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガスが存在してもよい(Ｍａｃｋ （１９８２） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ, 第16版)。持続放出製剤を含む、様々な適切な製剤を使用することができる。
【０１０８】
本発明の医薬組成物の投与経路は、当業者に一般に知られているもののいずれであってもよい。治療のために、本発明の薬物融合体または複合体を標準的な技術に従って任意の患者に投与することができる。
【０１０９】
投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経口、経皮、肺経路を含む任意の適当な方法で、または適切ならば、カテーテルを用いた直接注入によっても可能である。用量および投与頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の併用投与、禁忌、ならびに臨床医によって考慮される他のパラメーターによって異なる。投与は、指示に応じて、局所でも全身でも可能である。
【０１１０】
一実施形態において、本発明は、（ａ）本発明の複合体または融合体と（ｂ）薬学上許容されるバッファーを含む肺送達用の肺製剤を提供し、ここで、該組成物は液滴を含み、組成物中に存在する液滴の約４０％以上、例えば５０％以上は、約６μｍ未満、例えば、約１ミクロン〜約６ミクロン、例えば、約５ミクロン未満、例えば、約１〜約５ミクロンの範囲の大きさを有する。このような組成物は、例えば、直接的な局所的肺送達によって対象に投与するのに特に適している。これらの組成物は、例えば、吸入によって、例えば、噴霧器の使用によって、肺に直接投与することができる。肺送達用のこれらの組成物は、生理学上許容されるバッファーを含むことができ、そのｐＨ範囲は約４〜約８、例えば、約７〜約７．５であり、その粘度は１．２％（ｗ／ｖ）スクロース含有５０ｍＭリン酸バッファー中の約２％〜約１０％ＰＥＧ１０００溶液の粘度にほぼ等しい。
【０１１１】
本発明の融合体または複合体は、保存のために凍結乾燥し、使用前に適当な担体で再構成することができる。この方法は、従来の免疫グロブリンで有効であることが示されており、当技術分野で知られている凍結乾燥および再構成法を使用することができる。当業者には当然のことながら、凍結乾燥および再構成は、様々な程度の抗体活性の損失をもたらす可能性がある（例えば、従来の免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも活性の損失が大きい傾向がある）ので、使用レベルは補填のために多めに調整する必要がある。
【０１１２】
予防用途において、例えば、前糖尿病を有するまたはインスリン抵抗性を有する個体に投与する場合、本発明の融合体または複合体を含有する組成物はまた、疾患の発症を予防、抑制または遅延するため（例えば、寛解もしくは静穏期を持続させるため、または急性期を予防するため）に、同等またはやや少ない用量で投与することもできる。熟練の臨床医ならば、疾患を治療、抑制または予防するために、適当な投与間隔を決定することができる。本発明の融合体または複合体が疾病の治療、抑制または予防のために投与される場合、１日４回まで、週２回、週１回、２週間に１回、月１回または２ヶ月に１回、例えば、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇ）の用量で投与することができる。
【０１１３】
本明細書に記載の組成物を用いて行われる処置または治療は、１以上の症状が、処置前に存在するそのような症状に比べて、またはその組成物で処置されない個体（ヒトまたはモデル動物）もしくは他の適当な対照のそのような症状と比べて軽減される（例えば、少なくとも１０％だけ、または臨床評価スケールで少なくとも１ポイントだけ）ならば、「有効」とみなされる。症状は、標的とする疾患または障害の厳密な性質に応じて明らかに多様であるが、熟練の臨床医または技術者ならばそれを評価することができる。
【０１１４】
同様に、本明細書に記載の組成物を用いて行われる予防は、１以上の症状の発症または重症度が、その組成物で処置されない同等の個体（ヒトまたは動物モデル）の症状に比べて遅延される、軽減される、または消失されるならば、「有効」である。
【０１１５】
本発明の融合体または複合体は個別に投与される組成物として使用することもできるし、あるいは他の治療薬または活性剤、例えば、他のポリペプチドまたはペプチドまたは小分子と併用投与してもよい。これらのさらなる薬剤としては、例えば、メトフォルミン、インスリン、グリタゾン（例えば、ロシグリタゾン）、免疫抑制薬、免疫賦活薬などの様々な薬物を挙げることができる。
【０１１６】
本発明の融合体または複合体は、１以上の別の治療薬または活性剤とともに投与および／または調剤することができる。本発明の融合体または複合体が別の治療薬とともに投与される場合、その融合体または複合体は、別の薬剤の投与の前、投与と同時、投与とともに、または投与の後に投与することができる。一般に、本発明の融合体または複合体は、治療効果の重複をもたらすように投与される。
【０１１７】
半減期：
インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬、例えば、ＧＬＰ−１またはエキセンディンリガンドの半減期の延長は、ｉｎ ｖｉｖｏ適用に有用である。本発明はこの課題を、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬、例えば、ＧＬＰおよびエキセンディンのｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を延長し、その結果としてこれらの分子の機能的活性の、体内での持続時間を延長することによって解決する。
【０１１８】
本明細書に記載のように、本発明の組成物（すなわち、本明細書に記載の融合体または複合体を含む組成物）は、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬単独に比べて、著しく延長されたｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期もしくは血漿半減期、および／または増加したＡＵＣ、および／または増加した平均滞留時間（ＭＲＴ）を有し得る。加えて、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬の活性は、本発明の組成物（例えば、複合体または融合体）において、実質的にとは言えないまでも全般的に変化している。しかしながら、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬単独に比べて、本発明の組成物の活性におけるある程度の変化は許容でき、本発明の複合体または融合体の薬物動態特性の改善によって一般に補償される。例えば、本発明の薬物複合体または融合体は、薬物単独より低い親和性で薬物標的と結合するかもしれないが、薬物組成物の薬物動態特性の改善（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期の延長、ＡＵＣの増大）によって、薬物単独に比べてほぼ等しいか優れた有効性を有し得る。さらに、本発明の複合体または融合体の半減期の延長によって、それらはインスリン分泌促進薬またはインクレチン薬単独よりも少ない頻度で投与することができ（例えば、月１回または週１回患者に投与することができる）、また、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬単独の投与よりも、より一定な血中インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬レベルを達成し、従って、望ましい治療または予防効果を達成する。
【０１１９】
薬物動態分析およびリガンド半減期測定の方法は当業者によく知られている。詳細は、Ｋｅｎｎｅｔｈ, Ａ ｅｔ ａｌ: Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ: Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ ＰｈａｒｍａｃｉｓｔｓおよびＰｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ, Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｃ ａｎａｌｙｓｉｓ: Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （１９９６）に見出すことができる。また、薬物動態パラメーター、例えば、tαおよびtβ半減期、ならびに曲線下面積(AUC)を記載している“Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ”, Ｍ Ｇｉｂａｌｄｉ ＆ Ｄ Ｐｅｒｒｏｎ, Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ発行, ２nd Ｒｅｖ. ｅｘ ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８２）も参照。
【０１２０】
半減期（ｔ１／２αおよびｔ１／２β）ならびにＡＵＣおよびＭＲＴは、時間に対するリガンドの血漿濃度または血清濃度の曲線から決定することができる。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ解析パッケージ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ., Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ, ＣＡ９４０４０, ＵＳＡより入手可能）を使用して、例えば、曲線をモデル化することができる。第１相（α相）では、患者においてリガンドは主として、いくらかの消失を伴いながら分布中である。第２相（β相）は、リガンドの分布が終わり、患者からリガンドが排出につれて血清濃度が低下していく終末相である。ｔα半減期は第１相の半減期であり、ｔβ半減期は第２相の半減期である。加えて、当業者によく知られている非コンパートメントフィッティングモデルを用いて半減期を決定することもできる。
【０１２１】
一実施形態において、本発明は、例えば、ヒト対象において、約１２時間以上、例えば、約１２時間〜約２１日、例えば、約２４時間〜約２１日、例えば、約２〜１０日、例えば、約３〜４日の消失半減期を有する本発明の融合体または複合体を提供する。
【０１２２】
また、本発明の融合体または複合体は、例えば、ＰＥＧ基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体もしくは少なくともそのトランスフェリン結合部分、抗体Ｆｃ領域の結合によって、または抗体ドメインとの複合体化合によって、より大きな流体力学的サイズを有するようにさらに構成することができる。
【０１２３】
流体力学的サイズは、当業者によく知られている方法を用いて測定することができる。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、リガンドの流体力学的サイズを決定することができる。リガンドの流体力学的サイズを測定するのに適したゲル濾過担体、例えば、架橋アガロース担体がよく知られており、容易に入手できる。
【０１２４】
本発明の組成物、すなわち、本明細書に記載の融合体および複合体を含む組成物は、さらにいくつかの利点を提供する。ドメイン抗体成分は非常に安定であり、抗体および抗体の他の抗原結合フラグメントに比べて小さく、大腸菌または酵母（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現によって高収率で作製することができ、血清アルブミンと結合する、抗体の抗原結合フラグメントは、ヒト起源のライブラリーまたは任意の所望の種に由来するライブラリーから容易に選択することができる。従って、血清アルブミンと結合するｄＡｂを含む本発明の組成物は、一般に哺乳類細胞で作製される治療薬（例えば、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体）よりも容易に作製することができ、免疫原性のないｄＡｂを使用することができる（例えば、ヒトｄＡｂはヒトの疾患を治療または診断するために使用することができる）。
【０１２５】
インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬が、血清アルブミンと結合するｄＡｂを含有する薬物組成物の一部である場合、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬の免疫原性を低下させることができる。従って、本発明は、血清アルブミンと結合するｄＡｂを含有する薬物組成物に関して、（例えば、インスリン分泌促進薬またはインクレチン単独よりも）免疫原性が低いか、または実質的に免疫原性のない、融合体または複合体組成物を提供する。従って、このような組成物は、対象の免疫系による抗薬物抗体の合成による有効性の損失を最小限にしつつ、対象に長期間にわたって繰り返し投与することができる。
【０１２６】
さらに、本明細書に記載の複合体または融合体組成物は、インスリン分泌促進薬またはインクレチン単独よりも安全性が高く、副作用が少ない可能性がある。例えば、ｄＡｂの血清アルブミン結合活性の結果として、本発明の融合体または複合体は、血液循環における滞留時間が長くなっている。加えて、本発明の融合体または複合体は、実質的に血液脳関門を超えることができず、全身投与（例えば、静脈投与）後に中枢神経系に蓄積することはあり得ない。従って、本発明の融合体または複合体は、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬単独に比べて、高い安全性かつ少ない副作用で投与することができる。同様に、該融合体または複合体は、薬物単独よりも、特定の臓器（例えば、腎臓または肝臓）に対して低い毒性を有し得る。
【実施例】
【０１２７】
実施例１：ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ）またはエキセンディン−４とＤＯＭ７ｈ−１４ ＡｌｂｕｄＡｂとの遺伝子融合体の発現
エキセンディン−４、または８位のアラニンがグリシンで置換されたＧＬＰ−１（７−３７）（［Ｇｌｙ８］ＧＬＰ−１）のいずれかを、ＤＯＭ７ｈ−１４（下記に示すアミノ酸配列を有する、血清アルブミンと結合するドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＡｌｂｕｄＡｂ））との融合体として、ｐＴＴ−５ベクター（ＣＮＲＣ, Ｃａｎａｄａから入手可能）にクローニングした。各場合において、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４は構築物の５’末端にあり、ｄＡｂは３’末端にあった。図１（Ａ〜Ｇ）に示されるアミノ酸配列を有する、合計７個の構築物（ＤＡＴ０１１４、ＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６、ＤＡＴ０１１７、ＤＡＴ０１１８、ＤＡＴ０１１９、ＤＡＴ０１２０）を作製した。リンカーは存在しないか、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカー（Ｇ４Ｓ）またはヘリカルリンカー(Ａｒａｉ, Ｒ., Ｈ. Ｕｅｄａ, ｅｔ ａｌ. （２００１）. “Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｎｋｅｒｓ ｗｈｉｃｈ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｓｅｐａｒａｔｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ａ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ.” Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １４（８）: ５２９−３２.４５６)もしくは第２のＧＬＰ−１部分からなるリンカーが、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４とｄＡｂの間に存在した。リンカーは、ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４をｄＡｂから空間的に分離してＧＬＰ−１またはエキセンディン−４とＧＬＰ−１受容体の間の結合の立体障害を防ぐためのスペーサーとして含めた。これらの構築物の配列を図１（Ａ〜Ｇ）に示す。
【０１２８】
エンドトキシン不含ＤＮＡを大腸菌において、アルカリ溶菌法を用いて調製し（Ｑｉａｇｅｎ ＣＡから入手可能なエンドトキシン不含プラスミドＧｉｇａキットを使用）、それを用いてＨＥＫ２９３Ｅ細胞（CNRC, Canadaから入手可能）にトランスフェクトした。トランスフェクションは、フラスコ当たり３３３μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)および２５０μｇのＤＮＡを用いて、２５０ｍｌ／フラスコのＨＥＫ２９３Ｅ細胞１．７５×１０６細胞／ｍｌに対して行い、発現は３０℃にて５日間とした。上清を遠心分離によって回収し、精製はプロテインＬによるアフィニティー精製によった。タンパク質は樹脂にバッチで結合させてカラムに充填し、カラム容積の１０倍のＰＢＳで洗浄した。タンパク質は、５０ｍｌの０．１ＭグリシンｐＨ２で溶出し、Ｔｒｉｓ ｐＨ８で中和した。予想されるサイズのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で同定し、サイズを下記表１に示す。
【表１】
【０１２９】
実施例２：ＧＬＰ−１およびエキセンディン−４ ＡｌｂｕｄＡｂ融合体は血清アルブミンと結合することを示す
ＧＬＰ−１およびエキセンディン−４ ＡｌｂｕｄＡｂ融合体は、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能）によって分析し、親和性に関する情報を得た。分析は、血清アルブミンでコーティングしたＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅチップ（カルボキシメチル化デキストランマトリックス）を用いて行った。各供試血清アルブミン（ヒト、ラットおよびマウス血清アルブミン）約１０００レゾナンスユニット（ＲＵ）を、酢酸バッファーｐＨ５．５中で固定化した。Ｂｉｏｃｏｒｅ ＡＢのフローセル１は、コーティングのない、ブロックされた陰性対照とし、フローセル２はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（８１５ＲＵ）でコーティングし、フローセル３はラット血清アルブミン（ＲＳＡ）（８２６ＲＵ）でコーティングし、フローセル４はマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）（９３８ＲＵ）でコーティングした。各供試融合体分子は、上記実施例に記載のように哺乳類組織培養にて発現された。
【０１３０】
ＢＩＡＣＯＲＥ ＨＢＳ−ＥＰバッファー（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）で希釈することによって、一定の濃度範囲（１６ｎＭ〜２μＭ）の融合体分子を調製し、ＢＩＡＣＯＲＥチップに流した。
【０１３１】
親和性（ＫＤ）は、ＢＩＡＣＯＲＥ出力から、ＫＤ領域内のｄＡｂ濃度によって作成された出力に結合速度および解離速度曲線を当てはめることによって計算した。親和性（ＫＤ）を下記表２にまとめる。
【表２】
【０１３２】
上記の結果は、融合体分子が全種類の血清アルブミンと結合する能力を保持していることを示すが、このことはそれらのｉｎ ｖｉｖｏ半減期が長くなっている可能性があることを示唆している。
【０１３３】
実施例３：ＧＬＰ−１およびエキセンディン−４ ＡｌｂｕｄＡｂ融合体はＧＬＰ−１受容体結合アッセイ（ＧＬＰ−１Ｒ ＢＡ）において活性がある
融合体に１００ｍＭ ＮａＶｌ、２０ｍＭクエン酸 ｐＨ６．２へのバッファー交換を行った。一方で、ＣＨＯ ６ＣＲＥ ＧＬＰ１Ｒ細胞（ルシフェラーゼレポーター遺伝子を駆動する６ ｃＡＭＰ応答エレメントで、そしてヒトＧＬＰ−１受容体でも安定にトランスフェクトされたＣＨＯ Ｋ１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ, ＡＴＣＣから入手可能））を、懸濁培地中２×１０５細胞／ｍＬで播種した。懸濁培養を２４時間維持した。次に、細胞を２ｍＭ Ｌグルタミンを含有する１５ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（Sigmaから入手可能）で希釈し（２．５×１０５細胞／ｍｌ）、１０μｌ／ウェルのアッセイ化合物を含む３８４ウェルプレートに分注した。アッセイ対照を加えた後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに３時間戻した。インキュベーション後、ｓｔｅａｄｙ ｇｌｏシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）を、キットに記載されているようにウェルに添加し、粘着性のプレートシール（Ｗｅｂｅｒ Ｍａｒｋｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ.カタログ番号６０７７８０）でプレートを密閉した。プレートをリーダー(Ｖｉｅｗｌｕｘ, Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ)に入れ、５分間プレインキュベートした後に蛍光を読み取り、結果をプロットした。化合物は１０μＭアルブミンの存在下および不在下、一定の濃度範囲でアッセイしたところ、用量反応曲線をアルブミンの有り無しで当てはめることができた。ＥＣ５０を算出し、下記表３にまとめる。
【表３】
【０１３４】
上記の結果は、全ての供試融合体分子がＧＬＰ−１受容体に結合する能力を保持していることを示す。これらの結果はまた、この能力が血清アルブミンの存在下でも保持されることを示す。従って、これらの融合体分子は、ｉｎ ｖｉｖｏでＧＬＰ−１受容体と結合する能力を保持する可能性が高い。
【０１３５】
実施例４：ＨＥＫ２９３哺乳類組織培養物におけるＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６、ＤＡＴ０１１７およびＤＡＴ０１２０の発現とその後のプロテインＬによるアフィニティー捕捉およびイオン交換クロマトグラフィー
本試験の目的は、in vivoおよびin vitro特性決定のためにタンパク質を作製することであった。タンパク質は、これまでに記載されているように哺乳類組織培養でＨＥＫ２９３Ｅ細胞においてｐＴＴ−５ベクターから発現させた。簡単に述べると、エンドトキシン不含ＤＮＡを調製および精製し、それを用いてＨＥＫ２９３Ｅ細胞をトランスフェクトした。タンパク質発現は振盪培養器で３０℃にて５日間とし、培養物を回転沈降させ、（目的タンパク質を含有する）上清を回収した。その上清から、プロテインＬアガロースＳｔｒｅａｍｌｉｎｅアフィニティー樹脂（樹脂はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製で、プロテインＬは当所で結合させた）によるアフィニティー捕捉によってタンパク質を精製した。次に、樹脂をカラム容積の１０倍のＰＢＳで洗浄した後、カラム容積の５倍の０．１ＭグリシンｐＨ２．０でタンパク質を溶出した。カラム容積と同量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−グリシン ｐＨ８．０で中和した。この場合（前の実施例とは対照的に）、その後さらに精製を行った。タンパク質（Ｔｒｉｓ−グリシン中）を、２０ｍＭ酢酸バッファーｐＨ５．０へのバッファー交換を行った後、２０ｍＭ酢酸バッファーｐＨ５．０で予め平衡化した１本の（または並行した２本の）６ｍｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓカラム(ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)上にＡｋｔａを用いて添加した。同じバッファーで洗浄した後、２０ｍＭ酢酸バッファーｐＨ５．０中０〜０．７５Ｍまたは０〜１Ｍ ＮａＣｌ勾配によってタンパク質を溶出した。次いで、適正なサイズの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動および質量分析により同定した後、それらを合わせて最終のタンパク質サンプルとした。その後、タンパク質を、２０ｍＭクエン酸バッファーｐＨ６．２、１００ｍＭ ＮａＣｌにバッファー交換し、０．５〜５ｍｇ／ｍｌの間に濃縮した。タンパク質を０．２μＭフィルターで濾過して無菌性を確保した。その後、タンパク質を下記の実施例に使用した。
【０１３６】
実施例５：１回、３回および６回の凍結融解サイクルに対するＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６、ＤＡＴ０１１７およびＤＡＴ０１２０の安定性の比較
本試験の目的は、１回、３回および６回の凍結融解サイクルに対するＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６、ＤＡＴ０１１７およびＤＡＴ０１２０の安定性を比較することであった。各タンパク質は、前記のように哺乳類組織培養でＨＥＫ２９３Ｅ細胞においてｐＴＴ−５ベクターから発現させ、プロテインＬアフィニティー樹脂で精製した後、イオン交換クロマトグラフィーを行った。タンパク質は、２０ｍＭクエン酸バッファー、１００ｍＭ ＮａＣｌにバッファー交換し、同バッファーを用いて０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。次に、各タンパク質の０．５ｍｌアリコート（エッペンドルフ管中）に対して０回、１回、３回または６回の凍結融解サイクルを行い、各サイクルはドライアイス上での３分間とその後の３７℃の水浴中での２分間を含んだ。（タンパク質溶液を完全に融解させるには３７℃２分間で十分であることが試験中に認められた）。必要な回数の凍結融解サイクルを終えた後、タンパク質サンプルは次に分析するまで２〜８℃で保存した。その後、タンパク質に対してＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動、ＧＬＰ−１Ｒ結合アッセイ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーおよび質量分析法による分析を行った。４つのタンパク質全てのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析結果、ＧＬＰ−１Ｒ ＢＡによる能力、および質量分析結果は、１回、３回または６回の凍結融解サイクルによって、ベースラインから有意には変化しないことが見出された。ＳＥＣ分析における最大ピークの高さは影響を受け、６回の凍結融解サイクル後、ＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６、ＤＡＴ０１１７およびＤＡＴ０１２０のそれぞれで最大の高さの７８％、８６％、１０４％および５７％が維持された。ＤＡＴ０１２０は、凍結融解サイクルに対して他の３つのタンパク質よりも安定性が低いと結論づけられた。
【表４】
【０１３７】
実施例６：ＩＩ型糖尿病のｄｂ／ｄｂマウスモデルにおけるＤＡＴ０１１５の作用持続時間の実証
本試験の目的は、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて、経口耐糖能に対するＤＡＴ０１１５の作用の持続時間を測定することであった。試験開始の３日前に血糖値の低下で動物を分類し、その後ブロック化した。各ブロック内の動物１個体を、２６の各試験群に割り当てた。これにより、各試験群における平均開始血糖値の類似性を確保した。
【０１３８】
ＤＡＴ０１１５（上記のように、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞で作製し、精製した）を、経口ブドウ糖負荷の５、２４、４８、７２、９６または１２０時間前のいずれかに、１ｍｇ／Ｋｇ、０．３ｍｇ／Ｋｇまたは０．１ｍｇ／Ｋｇで皮下投与した。（全ての用量を全ての時点で投与したわけではなく、詳細については下表を参照）。ＤＡＴ０１１５は、ビヒクルで処置したｄｂ／ｄｂマウスに比べて、０．１ｍｇ／Ｋｇおよび０．３ｍｇ／Ｋｇの用量では２４時間まで（２４時間を含む）、１ｍｇ／Ｋｇの用量では７２時間まで（７２時間を含む）の時点で、２時間の経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）について、グルコースＡＵＣを有意に減少させた。陽性対照として４２μｇ／Ｋｇで投与したエキセンディン−４もやはり、経口ブドウ糖ボーラス投与の５時間前に投与した場合、ＯＧＴＴ後のグルコースＡＵＣを有意に減少させた。下記表５は、ビヒクルと比較した場合のＤＡＴ０１１５の各試験群のＡＵＣ減少パーセンテージを示す。アステリスクは、偽発見率補正(ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ)を用いてＤＡＴ０１１５をビヒクルと比較した場合にＰ＜０．０５であることを示す。
【表５】
【０１３９】
実施例７：食餌性肥満（ＤＩＯ）マウスの肥満モデルにおけるＤＡＴ０１１５の有効性の実証
本試験の目的は、確立されたマウス摂食モデル（食餌性肥満マウス）を用いて、摂食量および、結果としての体重がＤＡＴ０１１５処置によって影響を受けるかどうかを調べることであった。これはヒトに対する予測となり得る。雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Taconicから購入）は、６０％ｋｃａｌ高脂肪の放射線照射済み食餌で１２週間太らせた後、所内施設に移した。到着後、そのマウスを、温度および湿度制御室（７０〜７２°Ｆ、湿度＝４８〜５０％、５ＡＭ／５ＰＭ光周期）のａｌｐｈａ−ｄｒｉ床敷上に個別に収容した。食餌を４５％高脂肪食に変え、動物を１８日間順応させた。供試化合物を投与する前に、３日間１日１回マウスに生理食塩水を皮下注射し、摂餌量をモニタリングした。マウスは、群間または群内で体重および摂餌量に差がないようにブロック化および群分けした。試験当日、８匹のマウスからなる群に５ｍｌ／ｋｇの注射量で下記のように皮下投与を施した：３群にＤＡＴ０１１５を投与し（低用量、中用量および高用量）、１群に陰性対照分子（ＤＯＭ７ｈ−１４ ＡｌｂｕｄＡｂ、エキセンディン−４複合体を含まない）、そして、１群にエキセンディン−４陽性対照を投与した。
【表６】
【０１４０】
１日の摂餌量および体重を１０日間毎日測定した。ＤＡＴ０１１５は、ＤＯＭ７ｈ−１４対照に比べて用量依存的な体重および摂餌量の減少を示した（図３ａおよび３ｂ参照）。従って、このマウス試験から得られたデータは、ＤＡＴ０１１５が良好な臨床候補であるという仮説を支持すると結論づけられた。
【０１４１】
実施例８：マウスＩＩ型糖尿病モデルにおけるＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６およびＤＡＴ０１１７の血漿半減期の測定
本試験の目的は、マウスＩＩ型糖尿病モデル（ｄｂ／ｄｂマウス）においてＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６およびＤＡＴ０１１７の血漿消失特性を決定し、その結果からＰＫパラメーターを算出することであった。ＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６およびＤＡＴ０１１７タンパク質は前記のように調製した。簡単に述べると、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞を用いて哺乳類組織培養でタンパク質を発現させ、プロテインＬ−アガロースアフィニティー樹脂へのバッチ吸着によって精製した後、グリシンｐＨ２．０で溶出し、Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０で中和した。その後、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓカラムで、２０ｍＭ酢酸ｐＨ５．０中０〜１Ｍの塩勾配を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。次に、目的タンパク質を含有する画分を合わせ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭクエン酸ｐＨ６．２にバッファー交換した。タンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏで使用する前に、濾過除菌、バッファー交換およびエンドトキシン除去を行い、試験した。
【０１４２】
絶食させていない雄ｄｂ／ｄｂマウス（レプチン受容体遺伝子（ｌｅｐｒ）に突然変異があり、レプチン受容体を欠いたＬＥＰｒ ｄｂ同系接合性マウス）の群には、１ｍｇ／ＫｇのＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６またはＤＡＴ０１１７の皮下または静脈投与を行った。ｉｖ投与については、投与前、投与の０．２５、０．５、１、４、７、１２、２４、３６、４８および６０時間後、ならびにｓｃ投与については、投与前、投与の０．５、１、４、７、１２、２４、３６、４８および６０時間後に、血液サンプルを末梢採血によって採取し、血漿を調製した。血漿サンプルは凍結し、後に、必要に応じて、固相抽出およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６またはＤＡＴ０１１７レベルを分析するために解凍して、タンパク質断片の存在を検出した（タンパク質のエキセンディン−４部分から）。次に、算出された血漿レベルを用いて、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアを用い、薬物動態パラメーターの当てはめを行った。皮下および静脈投与後の半減期およびバイオアベイラビリティの概要を下表に示す。これらの結果から（下記表７参照）、３つの化合物はいずれも、マウスＩＩ型糖尿病モデルにおいて、望ましい薬物動態パラメーターを示すと結論づけられた。よって、これらの分子は、糖尿病のヒトにおいて、良好なＰＫパラメーターをもたらす可能性があり、この試験はＤＡＴ０１１７よりもＤＡＴ０１１５またはＤＡＴ０１１６の選択に好都合である。
【表７】
【０１４３】
実施例９：ラットにおけるＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６、ＤＡＴ０１１７の血漿半減期の測定
本試験の目的は、ラットにおいてＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６およびＤＡＴ０１１７の血漿消失（排出）特性を決定し、それらの結果からＰＫパラメーターを算出することであった。ＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６およびＤＡＴ０１１７タンパク質は前記のように調製した。簡単に述べると、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞を用いて哺乳類組織培養でタンパク質を発現させ、プロテインＬ−アガロースアフィニティー樹脂へのバッチ吸着によって精製した後、グリシンｐＨ２．０で溶出し、Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０で中和した。その後、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓカラムで、２０ｍＭ酢酸ｐＨ５．０中０〜１Ｍの塩勾配を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。次に、目的タンパク質を含有する画分を合わせ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭクエン酸ｐＨ６．２にバッファー交換した。タンパク質はｉｎ ｖｉｖｏで使用する前に、濾過除菌、バッファー交換し、品質確認を行った。
【０１４４】
血漿半減期を測定するために、３匹のラットからなる群に、１回の静脈（ｉ．ｖ．）または皮下（Ｓ．Ｃ．）注射で０．３ｍｇ／Ｋｇ（ｉｖ）または１ｍｇ／Ｋｇ（ＳＣ）のＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１６またはＤＡＴ０１１７を投与した。血漿サンプルは、７２時間にわたって尾静脈から順次出血させることによって得、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析して、融合体の断片の存在を検出した（融合体のエキセンディン−４部分から）。次に、算出された血漿レベルを用いて、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアを用い、薬物動態パラメーターの当てはめを行った。皮下および静脈内投与後の半減期およびバイオアベイラビリティの概要を下記の表８に示す。これらの結果から、３つの化合物はいずれも、ラットにおいて、望ましい薬物動態パラメーターを示すと結論づけられた。よって、これらの分子は全て、ヒトにおいて、良好なＰＫパラメーターをもたらす可能性があり、この試験は、ＤＡＴ０１１６またはＤＡＴ０１１７よりもＤＡＴ０１１５の選択に好都合であった。
【表８】
【０１４５】
実施例１０：カニクイザルにおけるＤＡＴ０１１５の血漿半減期の測定
本試験の目的は、ヒト以外の霊長類（カニクイザル）においてＤＡＴ０１１５に関する薬物動態パラメーターを決定してパラメーターの非比例的尺度化を図ること、およびＤＡＴ０１１５がヒトにおいて良好なＰＫ特性を有する可能性が高いかどうかについてできる限り最良の指標を与えることであった。ＤＡＴ０１１５エキセンディン−４ ＡｌｂｕｄＡｂ融合体は、哺乳類組織培養においてＨＥＫ２９３Ｅ細胞で発現させ、前記のように精製した。簡単に述べると、プロテインＬ−アガロースアフィニティー樹脂へのバッチ吸着によってタンパク質を精製し、グリシンｐＨ２．０で溶出し、Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０で中和した。その後、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓカラムで２０ｍＭ酢酸ｐＨ５．０中０〜１Ｍの勾配を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。その後、目的タンパク質を含有する画分を集め、バッファーを１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭクエン酸ｐＨ６．２に交換した。
【０１４６】
タンパク質に詳細な品質確認を行い（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析、活性アッセイ：ＧＬＰ−１Ｒ−ＢＡ、ｐＨ確認、浸透圧確認を含む）、濾過除菌し、エンドトキシンを除去した。エンドトキシンが低いことが確認されたタンパク質（＜０．０５ＥＵ／ｍｇタンパク質）をその後in vivo試験に使用した。
【０１４７】
この試験では６匹の雌カニクイザル(Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ; Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＢＲＦ, Ｈｏｕｓｔｏｎ, ＴＸ, Ｐｒｉｍａｔｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ, Ｍｉａｍｉ, ＦＬおよび／またはＣｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ, Ｉｎｃ., Ａｌｉｃｅ, ＴＸ)を使用した。サルは投与開始時に約２〜９才（体重範囲は約２〜５キログラム）であった。サルは個別に、環境制御室（華氏６４〜８４度；相対湿度３０〜７０％、１２時間明暗周期）内のステンレスケージに収容した。これらの雌サルに、Ｍｏｎｋｅｙ Ｄｉｅｔ＃５０３８(ＰＭＩ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ, Ｒｉｃｈｍｏｎｄ, ＩＮ)のビスケット約６個を１日２回与え、新鮮な果物を毎日割り当てた。各動物に、投与群（ｓｃ３匹、ｉｖ３匹）に応じて、供試化合物（ＤＡＴ０１１５）を皮下または静脈投与した。用量は０．１ｍｇ／Ｋｇとした。投与当日は、各サルへの投与後約１時間以内に最初の給餌を行った（試験に関係する手順として動物を長時間その個体の飼育ケージから出す必要がる場合には、投与後２．５時間まで延長される）。２回目の給餌は、１回目の給餌の２時間後より早くには行わなかった。環境を豊かにするため、各サルに、追加の果物、豆類および／または野菜（例えば、ブドウ、ベビーキャロット、ピーナッツ）を生存率確認時もしくはその前後に、または順応後もしくは試験関連の手順後の報酬の方法として与えた。濾過した水道水（Ａｑｕａ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ, Ｉｎｃ.提供、定期的に分析）は自由に摂らせた。
【０１４８】
投与前（０時間）、ならびに投与後わずか５分（ｉｖ群のみ）、０．５、４、８、２４、４８、９６、１４４、１９２、２８８、３３６、５０４および６７２時間の時点で、大腿血管から血漿サンプル（約２ｍｌ）を採取した。（ｉｖ投与群の動物のうち１頭から得られたＰＫサンプルは２４時間までしか採取しなかったので、この動物はＰＫの当てはめから除外した）。サンプルの分析は質量分析によって行い、データの当てはめは、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ当てはめソフトウェアによって行った。ＰＫパラメーターは下記のとおり、ｉｖ投与（ｎ＝２）では、Ｔ１／２ ６７時間、ＭＲＴ ４６時間、Ｖｚ ３２７ｍｌ／ＫｇならびにＣｌ ３．３ｍｌ／時／Ｋｇであり、ｓｃ投与（ｎ＝３）では、Ｔ１／２ ６８時間、ＭＲＴ ９８時間、Ｖｚ ３０６ｍｌ／ＫｇならびにＣｌ ３．１ｍｌ／時／Ｋｇであった。バイオアベイラビリティは９９％と計算された。
【０１４９】
この試験（ならびにカニクイザルおよびヒト血清アルブミンのｂｉａｃｏｒｅ結合データ）から、カニクイザルにおけるＤＡＴ０１１５の６８時間という皮下投与の半減期（上記の通り）によって、ヒトでの同分子の半減期が週１回（またはそれより少ない回数）の投与の要件に相関させるに十分長いものである可能性が高いという確信が得られるものと結論づけられた。
【０１５０】
実施例１１：カニクイザルにおけるＤＡＴ０１１５のＰＤの測定
カニクイザルで上記のようにＰＫ試験を行った。本試験の主要な目的は、（前期実施例に記載のように）カニクイザルにおいてＤＡＴ０１１５に関する薬物動態パラメーターを決定することであったが、第二の目的は、そのサルにおけるＤＡＴ０１１５化合物の有効性の指標を得ることであった（本試験には統計的有意性に関する十分な検出力は無い）。この二次的目的を達成するために、サルによるビスケットの消費を本研究の過程でモニタリングした。投与後数日間、全てのサルに摂食量の減少傾向があることが示された。これはおそらく、この分子のエキセンディン−４部分の、十分に立証された、食欲抑制剤としての効果によるものであると結論づけられた。従って、ＤＡＴ０１１５はｉｎ ｖｉｖｏで活性があることが示された。動物の快適な生活を確保するため、果物およびおやつはビスケットの消費に関わらずほとんどの日に与えた。
【表９】
【０１５１】
実施例１２：表面プラズモン共鳴を用いたＤＡＴ０１１５エキセンディン−４ ＡｌｂｕｄＡｂ融合体のラット、カニクイザルおよびヒト血清アルブミンとの結合
ＤＡＴ０１１５を発現させて精製した後、表面プラズモン共鳴(Ｂｉａｃｏｒｅ, ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)によって分析し、親和性に関する情報を得た。分析は、ビオチン化血清アルブミンをコーティングしたストレプトアビジンチップ（ＳＡ）を用いて行った。２００〜１０００レゾナンスユニット（ＲＵ）の各血清アルブミンをチップに固定化した。フローセル１はコーティングせず、フローセル２はＨＳＡでコーティングし、フローセル３はＲＳＡでコーティングし、フローセル４はＣＳＡでコーティングした。一定の濃度範囲の融合体を、ＢＩＡＣＯＲＥ ＨＢＳ−ＥＰバッファー（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）中への希釈によって１５．６ｎＭ〜２μＭの範囲で調製し、ＢＩＡＣＯＲＥチップに流した。
【０１５２】
親和性（ＫＤ）は、ＢＩＡＣＯＲＥ出力から、ＫＤ領域内のｄＡｂ濃度によって作成された出力に結合速度および解離速度曲線を当てはめることによって計算した。親和性（ＫＤ）を下表にまとめる。
【表１０】
【０１５３】
実施例１３：示差走査熱量測定によるＤＡＴ０１１５熱変性の特性評価
本試験の目的は、オートサンプラーを備えたキャピラリーセルマイクロ熱量計ＶＰ−ＤＳＣ(Ｍｉｃｒｏｃａｌ)を用いて、ＤＳＣ（示差走査熱量測定）によってＤＡＴ０１１５の熱変性をモニタリングすることであった。タンパク質は、２０ｍＭクエン酸ｐＨ６．２、１００ｍＭ ＮａＣｌ中で一晩透析し、濾過した後、２８０ｎｍの吸光度により測定した場合に１ｍｇ／ｍｌの濃度となるように調製した。濾過した透析バッファーを全サンプルに対する標準として使用した。ＤＳＣは１８０℃／時間の加熱速度で行った。各サンプルの前に、１％ｄｅｃｏｎ溶液、次いでバッファーを注入してセルを洗浄し、機器のベースラインとした。得られた出力を、Ｏｒｉｇｉｎ ７ Ｍｉｃｒｏｃａｌソフトウェアを用いて分析した。標準バッファーから得られたＤＳＣ出力をサンプル出力から差し引いた。計算にはサンプルの正確なモル濃度を用いた（Ｏｒｉｇｉｎにより自動的に実施）。遷移前後の上および下のベースライン直線領域の両方に対するベースライン設定は、三次ｃｏｎｎｅｃｔ関数を用いて選択し、関連づけを行った。得られたグラフを非２状態モデルに当てはめ、見かけのＴｍおよびΔＨ／ΔＨｖ値を得る。
【０１５４】
ＤＡＴ０１１５から得られた出力を非２状態遷移モデルに当てはめたところ、見かけＴｍは５６．３℃であった。適合度（フィット）は十分であった（図４参照）。同じ装置を用いて実施した対照出力のリゾチームは、予想どおり完全に適合した良好な品質データを示した。（リゾチームについて得られた見かけＴｍは７６．２℃であり、これは文献で報告されたものと一致する（図５参照））。よって、この試験から、ＤＡＴ０１１５が臨床候補として許容される５６．３℃の融点を有する分子であることを示す信頼性のあるデータが得られたものと結論づけられた。
【０１５５】
実施例１４：ＳＥＣ ＭＡＬＬＳによる溶液状態のＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１７およびＤＡＴ０１２０の特性決定
この試験の目的は、ＤＡＴ０１１５、ＤＡＴ０１１７およびＤＡＴ０１２０の溶液状態をＳＥＣ ＭＡＬＬＳによって測定することであった。サンプルを精製し、適当なバッファー（ＰＢＳ）に対して透析し、透析後に濾過し、濃度を測定し、１ｍｇ／ｍｌに調整した。ＢＳＡおよびＨＳＡはSigmaから購入し、それ以上精製することなく使用した。
【０１５６】
機器の詳細：
オートサンプラー（ＳＩＬ−２０Ａ）およびＳＰＤ−２０Ａ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＵＶ／Ｖｉｓ検出器を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−２０ＡＤ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣシステムを、Ｗｙａｔｔ Ｍｉｎｉ Ｄａｗｎ Ｔｒｅｏｓ（ＭＡＬＬＳ、多角度光散乱検出器）およびＷｙａｔｔ Ｏｐｔｉｌａｂ ｒＥＸ ＤＲＩ（示差屈折計）に接続した。検出器は−ＬＳ−ＵＶ−ＲＩの順序で接続した。ＲＩおよびＬＳ機器はいずれも４８８ｎｍの波長で操作した。５０もしくは２００ｍＭリン酸バッファー（塩を含有するもしくは含有しない）、ｐＨ７．４または１×ＰＢＳの移動相を用いて、ＴＳＫ２０００(Ｔｏｓｏｈ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ)またはＢｉｏＳｅｐ２０００(Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ)カラム（双方とも同じ分離範囲１〜３００ｋＤａのシリカ系ＨＰＬＣカラム）を使用した。使用流速は０．５または１ｍｌ／分とし、作動時間は流速の違いに応じて調整し（４５または２３分）、分子の分離に有意な影響を及ぼさないと予想される。タンパク質はＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、注入量は１００μｌとした。光散乱検出器は、製造業者の説明書に従ってトルエンで較正した。ＵＶ検出器およびＲＩ検出器のアウトプットを光散乱装置と接続し、Ｗｙａｔｔ ＡＳＴＲＡソフトウェアを用いて３つの検出器からのシグナルを全て同時に収集できるようにした。ＰＢＳ移動相中のＢＳＡ（０．５または１ｍｌ／分）をＴｏｓｏｈ ＴＳＫ２０００カラムに数回注入し、ＵＶ、ＬＳおよびＲＩシグナルをＷｙａｔｔソフトウェアによって収集する。次に、その出力を、ＡＳＴＲＡソフトウェアを用いて分析し、製造業者の説明書に従い、シグナルを正規化し、アラインし、バンドの広がりを補正する。その後、較正定数の平均を求め、以降のサンプル測定に使用されるテンプレートにインプットする。
【０１５７】
絶対モル質量の計算：
１ｍｇ／ｍｌのサンプル１００μｌを、予め平衡化した適当なカラムに注入した。ＳＥＣカラムの後、サンプルを３つのオンライン検出器、ＵＶ、ＭＡＬＬＳ（多角度光散乱）およびＤＲＩ（示差屈折率）検出器に通すことで、絶対モル質量の測定が可能となる。カラムで生じる希釈は約１０倍であることから、溶液中の状態を測定している際の濃度は１００μｇ／ｍｌ、すなわち、約８μＭ ｄＡｂとなる。
【０１５８】
ＡＳＴＲＡでの計算およびＺｉｍｍプロット法の原理（多くの場合バッチサンプルモードで実施される）は、Ｚｉｍｍ ［Ｊ. Ｃｈｅｍ. Ｐｈｙｓ. １６, １０９３−１０９９ （１９４８）］の式である：
【数１】
式中、
ｃは、溶媒中の溶質分子の質量濃度（ｇ／ｍｌ）であり、
Ｍは、重量平均モル質量（ｇ／ｍｏｌ）であり、
Ａ２は、第２ビリアル係数（ｍｏｌ ｍＬ／ｇ２）であり、
Ｋ＊＝４ｐ２ｎ０２（ｄｎ／ｄｃ）２ｌ０−４ＮＡ−１は光学定数であり、ここでｎ０は入射光（真空）波長での溶媒の屈折率であり、ｌ０はナノメーター単位で表された入射光（真空）波長であり、ＮＡはアボガドロ数（６．０２２×１０２３ｍｏｌ−１に相当）であり、ｄｎ／ｄｃは溶媒−溶質溶液の、溶質濃度の変化に対する示差屈折率の増加をｍＬ／ｇで表したものである（この因子はｄＲＩ検出器を用いて独立に測定しなければならない）、
Ｐ（ｑ）は、理論的に導き出された形状因子であって、およそ１−２μ２＜ｒ２＞／３！＋・・・に相当し、ここで、μ＝（４π／λ）ｓｉｎ（θ／２）であり、＜ｒ２＞は平均二乗半径である。Ｐ（ｑ）は、分子のｚ平均サイズ、形状および構造の関数であり、
Ｒｑは過剰Ｒａｙｌｅｉｇｈ比である（ｃｍ−１）］。
【０１５９】
この式は、垂直に偏光／入射光を仮定し、ｃ２の次数まで有効である。
【０１６０】
ｓｉｎ２（ｑ／２）に対するＲｑ／Ｋ＊ｃのプロットへの当てはめである、Ｚｉｍｍフィット法によって計算を行うために、ｃについて一次まで式１の逆数を展開する必要がある。
【０１６１】
ｓｉｎ２（ｑ／２）に対するＲｑ／Ｋ＊ｃのプロットへの当てはめである、Ｚｉｍｍフィット法により計算を行うために、ｃについて一次まで式１の逆数を展開する必要がある。
【数２】
【０１６２】
この場合、適切な結果は
【数３】
および
【数４】
であり、式中、
【数５】
である。
【０１６３】
計算は、ＡＳＴＲＡソフトウェアにより自動的に行われ、その結果としてプロットが得られ、各スライスについてモル質量が決定された［ＡＳＴＲＡマニュアル］。
【０１６４】
クロマトグラムで観察された各ピークについてのプロットから得られたモル分子量を、タンパク質の単一ユニットの予測分子量と比較する。これによってタンパク質の溶解状態について結論を下すことができる。
【０１６５】
試験データ：
ＤＡＴ０１１５
２０ｍＭクエン酸、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．２で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムに、１ｍｇ／ｍｌ ＤＡＴ０１１５を１００μｌ注入した。流速は０．５ｍｌ／分に設定した。タンパク質は単一ピークとして溶出し、分子量はピークの全幅にわたって１７．４ｋＤａと測定された（単量体の予測分子量は１６．９ｋＤａ）。溶出効率は１００％である。図６参照。（ＨＳＡ対照は予測通りの挙動を示し、ＤＡＴ０１１５に関する試験結果を実証した。それは分子量６４ｋＤａ（単量体）および１１０ｋＤａ（二量体）の２つのピークとして溶出する。ＨＳＡ二量体の分子量は、このピーク内のタンパク質の量が極めて少ないためにあまり正確でない可能性がある）。
【０１６６】
ＤＡＴ０１１７
５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．４で平衡化したＴＳＫ２０００カラムに、１ｍｇ／ｍｌ ＤＡＴ０１１７を１００μｌ注入した。流速は１ｍｌ／分に設定した。ＤＡＴ０１１７の注入量の約５０％は、３５〜４５ｋＤａ（二量体以上）前後の分子量を有する２つの重複したピークとしてカラムから溶出したが、これは、ここで試験された条件での強い自己会合を示唆する。（ＢＳＡ対照は予測通りの挙動を示し、ＤＡＴ０１１７の試験結果を実証し、分子質量６１ｋＤａおよび１４６ｋＤａ（単量体および二量体）の２つのピークを示す）。ＳＥＣ Ｍａｌの結果については図７参照。
【０１６７】
ＤＡＴ０１２０
５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．４で平衡化したＴＳＫ２０００カラムに、１ｍｇ／ｍｌ ＤＡＴ０１１７を１００μｌ注入した。流速は１ｍｌ／分に設定した。ＤＡＴ０１２０の注入量の約５０％は、２５ｋＤａ前後と測定された分子量を有するやや非対称のピークとしてＧＦカラムから溶出した。これは、ここで試験された条件でのＤＡＴ０１２０の強い自己会合を示唆し、タンパク質は単量体−二量体の迅速な平衡状態にあると思われる。（ＢＳＡ対照は予測通りの挙動を示し、ＤＡＴ０１２０の試験結果を実証し、分子量６１ｋＤａおよび１４６ｋＤａ（単量体および二量体）の２つのピークを示した）。ＳＥＣ Ｍａｌの結果については図８参照。
【０１６８】
上記の試験結果から、ＤＡＴ０１１５は、ここで使用された条件下で、有意な自己会合を示す他の２つの分子に比べて、自己会合が有意に小さい（場合によっては、無い）と結論づけられた。溶液中の単量体状態は、ｉｎ ｖｉｖｏ作用、ならびに製造時の上流および下流プロセスに関して好ましいものであり得るので、ＤＡＴ０１１５は、溶解状態に関して、臨床的進展のために最も理想的な分子であるといえる。
【０１６９】
実施例１５：アフィニティマトリックス・プロテインＬを使用しない哺乳類発現からの精製
ＤＡＴ０１２０およびＤＡＴ０１１５はいずれも、ＨＥＫ２９３上清から精製した。各タンパク質を哺乳類組織培養でＨＥＫ２９３Ｅ細胞においてｐＴＴ−５ベクターから発現させた。ＭＥＰ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ樹脂の１ｍｌカラムをＰＢＳで平衡化し、０．１Ｍ水酸化ナトリウムで洗浄した後、ＰＢＳで再び平衡化した。上清２００ｍｌを２．５ｍｌ／分でカラムに加えた後、カラムをＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２で溶出した。
【０１７０】
溶出後、１／５容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８を加えることでサンプルを中和し、室温で保存した。サンプルは保存後に少量の沈殿が見られたことから、脱塩処理の前にｓｔｅｒｉｆｌｉｐデバイスを用いて濾過した。
【０１７１】
２つの２６／１０ ＨｉＰｒｅｐ脱塩カラムは２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５（実測値ｐＨ５．３）１０ｍｌ／分で平衡化し、０．１Ｍ ＮａＯＨを添加することで洗浄し、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５で再平衡化した。
【０１７２】
ＤＡＴ０１１５は２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５中で脱塩した後、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５（実測値５．２）で平衡化した１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＳＰＦＦに添加した。このカラムを洗浄した後、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５、１Ｍ ＮａＣｌを用いた０〜１００％勾配にかけ、５ｍＡＵｓを越える吸光度を有する溶出画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１７３】
ＳＰ ＦＦ画分を一晩保存した後、そのサンプルを０．２μｍフィルタで濾過し、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、１００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した２本の２６／１０ ＨｉＰｒｅｐ脱塩カラムに加えた。溶出液を２０ｍｌ遠心濃縮器で濃縮し、濾過除菌し、エンドトキシンを１／１０および１／２００希釈で試験した。
【０１７４】
２通りの希釈でエンドトキシンを試験したところ、１／１０希釈はスパイク回収率２５０で３０ＥＵ／ｍｌの値を示した。１／２００試験は、スパイク回収率１２６％で＜１０．８ＥＵ／ｍｌの値を示した。ＩＤ２７８２３を用いてサンプルに質量分析を行った。高負荷量では、８０ｋＤａマーカーより下と１００〜１６０ｋＤａマーカーの間に見られる低レベルの夾雑物がある。サンプルの純度は９５％より高いと思われる。
【０１７５】
実施例１６ エキセンディン−４およびＤＯＭ７ｈ−１４−１０／ＤＯＭ７ｈ−１１−１５ ＡｌｂｕｄＡｂの遺伝子融合体の発現および精製
本試験の目的は、ＤＭＳ７１３９およびＤＭＳ７１４３を効率的に発現させることであった。ＤＭＳ７１３９は、適切にプロセシングされたＮ末端を有する大腸菌における、エキセンディン−４とＤＯＭ７ｈ−１４−１０（血清アルブミンと結合するドメイン抗体（ｄＡｂ）、ＡｌｂｕｄＡｂ（商標）としても知られる）との融合体であり、ＤＭＳ７１４３はエキセンディン−４とＤＯＭ ７ｈ−１１−１５（血清アルブミンと結合するドメイン抗体（ｄＡｂ）、ＡｌｂｕｄＡｂとしても知られる）との融合体である。次に、その後の試験で、この融合体のエキセンディン−４部分とＡｌｂｕｄＡｂ部分の活性を調べることができる。
【０１７６】
エキセンディン−４をＤＯＭ７ｈ−１４−１０またはＤＯＭ７ｈ−１１−１５との融合体としてクローニングしたが、この場合、エキセンディン−４ペプチドは構築物の５’末端にあり、ＡｌｂｕｄＡｂは３’末端にあった。それぞれエキセンディン−４ペプチドとＡｌｂｕｄＡｂの間に（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを含む全部で２つの構築物を作製した。このリンカーは、エキセンディン−４とＧＬＰ−１受容体の間の結合の立体障害を防ぐためにエキセンディン４をｄＡｂから空間的に分離するためのスペーサーとして含まれた。これらの構築物の配列を図１（ｍ）および１（ｎ）に示す。発現ベクターへのクローニングを可能とするために、融合体を５’にＮｄｅＩ制限部位とその後に改変ＯｍｐＴ（ＯｍｐＴ ＡＷＡ、そのアミノ酸配列は図１（ｑ）配列番号２８に示される）シグナルペプチドを有し、３’末端にＢａｍＨＩ部位を有するアセンブリＰＣＲとして作製した。ＯｍｐＴ ＡＷＡシグナルペプチドは、最後の３つのコドンが野生型から、ＳＦＡの代わりにＡＷＡをコードする「ＧＣＴＴＧＧＧＣＣ」に変更されていた（図２（ｐ）：配列番号３３に示される）。その変異は大腸菌のシグナルペプチダーゼによる適切な部位でのプロセシングを向上させる。
【０１７７】
その上、このペプチダーゼ切断部位のすぐ後に融合体の配列が始まる。シグナルペプチドの最後のコドンおよびエキセンディン−４配列の最初の２つのアミノ酸で重複するＮｃｏＩ消化部位が導入されている。この変異は、以後の、エキセンディン−４のフリーのＮ末端を有する融合体のサブクローニングならびに生産誘導を容易にする。上記に挙げた変異を含む改変されたｐＥＴ１２ａ発現ベクター（ｐＥＴベクターはＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した）をｐＤＯＭ３５と呼称した。ベクターおよびアセンブリＰＣＲをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した後、この挿入配列を、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いてベクターに連結した。この連結物２μｌをＭａｃｈＩ細胞の形質転換に用いた。回復増殖期の後、細胞を、カルベニシリンを含有する寒天プレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。コロニーを配列決定し、適切な配列を含むものをプラスミド増殖および単離(Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐキット、Ｑｉａｇｅｎ)に用いた。ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をプラスミドＤＮＡで形質転換し、得られたコロニーを発現培養物の接種に用いた。発現は、ＴＢ Ｏｎｅｘ培地（Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）の４×０．５リットル培養物、消泡剤１滴および１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンの接種によって行った。培養物を、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で３晩インキュベートした後、培養上清を３７００ｘｇで１時間の遠心分離によって清澄化した。その後、発現したタンパク質を清澄上清から、プロテインＬストリームライン（GE Healthcare，カタログ番号２８−４０５８−０３，プロテインＬ結合型）を用いて精製し、プロテインＬから、０．１Ｍグリシン ｐＨ２．０を用いて溶出した後、０．１容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を用いて中和した。次に、タンパク質を濃縮し、バッファーＡ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム−酢酸 ｐＨ５．０）に対して透析し、ＡｋｔａＸｐｒｅｓｓ(ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)でのイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質をバッファーＡ（無塩バッファー）中、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ ６ｍｌカラムに添加した後、バッファーＢ勾配（２０ｍＭ酢酸ナトリウム−酢酸 ｐＨ５．０ １Ｍ ＮａＣｌ）を用い、６５分かけて０〜６８％Ｂにて画分として溶出した（ＤＭＳ７１３９の場合）。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析によって分析し、適切な質量のものをプールした。最終タンパク質を２０ｍＭクエン酸 ０．１Ｍ ＮａＣｌバッファーに対して透析し、属性をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析によって再確認した。
【０１７８】
実施例１７ 表面プラズモン共鳴を用いた、エキセンディン−４ ＡｌｂｕｄＡｂ融合体ＤＭＳ７１３９およびＤＭＳ７１４３の血清アルブミンとの結合
ＤＭＳ７１３９およびＤＭＳ７１４３を発現させ、上記のように精製し、表面プラズモン共鳴(Ｂｉａｃｏｒｅ， ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)によって分析して親和性に関する情報を得た。分析は、血清アルブミンでコーティングされた２つのＣＭ５チップ（カルボキシメチル化デキストランマトリックス）を用いて行った。約５００レゾナンスユニット（ＲＵ）の各血清アルブミンを酢酸バッファーｐＨ４．５中で固定化した。第１のチップはコーティングのない、ブロックされたフローセル１を含み、フローセル２はＭＳＡ（５６０Ｒｕｓ）でコーティングされていた。第２のチップはコーティングのない、ブロックされたフローセル１を備え、フローセル２はＨＳＡでコーティングされ、フローセル３はＣＳＡでコーティングされ、フローセル４はＲＳＡでコーティングされていた。全ての血清アルブミンに関して、目的はチップ上の３５０ＲＵのタンパク質の領域にコーティングを施すことであった。
【０１７９】
ＢＩＡＣＯＲＥ ＨＢＳ−ＥＰバッファー（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）に希釈することで、一定の濃度範囲の融合体を調製し（ＤＭＳ７１３９では５５ｎＭ〜１μＭの範囲、ＤＭＳ７１４３では２４ｎＭ〜４．４μＭの範囲）、ＢＩＡＣＯＲＥチップに流した。親和性（ＫＤ）は、ＢＩＡＣＯＲＥ出力から、ＫＤ領域内のｄＡｂ濃度によって作成された出力に結合速度および解離速度曲線を当てはめることによって計算した。親和性（ＫＤ）を下記表１１にまとめる。
【表１１】
【０１８０】
ＤＭＳ７１３９およびＤＭＳ７１４３は、血清アルブミンに対して１０〜９０ｎＭの範囲の親和性を有する（ＲＳＡに対するＤＭＳ７１４３の親和性を除く）と結論づけられた。これは、これまでの融合体（例えば、これらのアルブミンに対して数百ｎＭ範囲の親和性を有する、グリシンセリンリンカーでＤＯＭ７ｈ−１４ ＡｌｂｕｄＡｂと連結されたエキセンディン−４であるＤＡＴ０１１５）のＳＡに対する親和性よりも有意に高い。これらの新規融合体の（血清アルブミンに対する）より高い親和性は、より長いin vivo血漿半減期に表れる可能性があり、それは該融合体が同じ有効性でより少ない頻度で投与可能であること、および／または時間が経過しても血漿中により一定のレベルの薬剤を維持することができ、望ましくないｃＭａｘ関連の毒性または副作用を軽減する可能性があることを意味する。
【０１８１】
実施例１８
ＤＭＳ７１３９およびＤＭＳ７１４３融合体はＧＬＰ−１受容体結合アッセイで活性がある
ＧＬＰ−１Ｒは、このアッセイの目的で、ＣＨＯ細胞で発現させる７ＴＭ Ｇタンパク質共役受容体である。ＧＬＰ−１または類似体による受容体の活性化によって、この受容体に結合されているアデニル酸シクラーゼによるＡＴＰのｃＡＭＰへの変換がもたらされる。ＣＨＯ細胞に６ＣＲＥ／ｌｕｃリポーター遺伝子を安定的にトランスフェクトする。従って、受容体のＧＬＰ−１活性化の後にｃＡＭＰが生産されると、プロモーター遺伝子（６コピーのｃＡＭＰ応答エレメント−６ＣＲＥを含む）がルシフェラーゼリポーター遺伝子の発現を駆動する。その後、これはルシフェリンとの反応を触媒し、照度計で測定可能な光を生じる。
【０１８２】
方法：
ＣＨＯ ６ＣＲＥ ＧＬＰ１Ｒ細胞を、３７℃の湯浴中にバイアルを半分沈めることによって急速解凍し、バイアルの内容物を５０ｍｌのファルコン試験管に移し、バイアル当たり１０ｍｌのＲＰＭＩ（フェノールレッドフリー）アッセイ媒体（Sigma、カタログ番号Ｒ７５０９）＋２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５０３０）＋１５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ０８８７）を加えた。計数し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、細胞を適当な容量のＲＰＭＩアッセイ媒体に再懸濁させて１×１０６細胞／ｍｌとし、白色９６ウェル平底組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル組織培養プレート、ｗｈｉｔｅ ｓｔｅｒｉｌｅ、カタログ番号３９１７）の各ウェルに５０μｌずつ分注した。細胞を３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、細胞をインキュベーターから取り出し、予め調製した対照／サンプル５０μｌをウェルに加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに３時間戻した。
【０１８３】
エキセンディン−４対照の調製（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｅ７１４４）：
Ｖ底９６ウェルプレートにて、１９８μｌのＲＰＭＩアッセイ媒体に対して１ｍｇ／ｍｌのエキセンディン−４ ２μｌを加え、２．３９μＭ溶液とした。この２．３９μＭ溶液２μｌを２３７μｌ ＲＰＭＩアッセイ媒体に加え、２０ｎＭ溶液とした（１０ｎＭアッセイにおける終濃度）。プレートに対照１：１０の連続希釈を行い（対照１５μｌ＋ＲＰＭＩアッセイ媒体１３５μｌ）、８点曲線を作成した。
【０１８４】
未知のサンプルの調製：
未知のサンプルの調製にも対照の調製と同じ指針を用いる。上限濃度を必要なアッセイ濃度の２倍とし、プレートを１：１０希釈する。
【０１８５】
ルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ２６２０）の調製：
冷凍庫から必要な数のＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアリコートを取り出し、暗所にて室温で解凍させる。アッセイプレート１枚につき、５ｍｌバイアル１本で十分である。
【０１８６】
インキュベーションの後、５０μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬を全てのウェルに加え、プレートを室温で３分間インキュベートし、細胞溶解を生じさせた。発光（１秒当たりの計数値）を、Ｍ５ｅマイクロプレートリーダーを用いて読み取ったが、読み取りはウェルごとに０．１秒間とした。細胞だけを含むバックグラウンドウェルのＣＰＳを他の全てのウェルから差し引いた。対照ウェル（ＧＬＰ−１（７−３６）またはエキセンディン−４）は最高濃度で最大の刺激を示すはずである。未知のサンプルの濃度効果曲線を当てはめ、その曲線から、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍまたはＥｘｃｅｌＦｉｔソフトウェアを用いてＥＣ５０を算出する。
【０１８７】
２つのエキセンディン−４ ＡｌｂｕｄＡｂ融合体（ＤＭＳ７１３９およびＤＭＳ７１４３）を、エキセンディン−４と並んだＧＬＰ−１Ｒ ＢＡにおける活性に関するアッセイで試験した。結果を下表１２に示す。
【表１２】
【０１８８】
上記の結果から、ＤＭＳ７１３９およびＤＭＳ７１４３はＧＬＰ−１Ｒ ＢＡにおいて予測された活性を示し、従って、それらはin vivoにおいてＧＬＰ−１受容体に対して活性がある可能性があるということが結論づけられた。従って、ＤＭＳ７１３９およびＤＭＳ７１４３はさらなる前臨床研究の良好な候補であり、これが上手く行けば臨床に移行する展望を持っている。
【０１８９】
実施例１９
ＤＡＴ０１１５またはＤＡＴ０１１７を発現するベクターを大腸菌Ｂｌ２１−（ＤＥ３）株(Ｎｏｖａｇｅｎ)に形質転換した。５０ｍｌの改変テリフィックブロス培地（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｔ０９１８）を含む２５０ｍｌフラスコにＯＤ＝０．１で接種した後、５０ｍｇ／ｌカナマイシンを添加して３０℃で増殖させた。Ａ６００＝０．５〜１で、細胞をＩＰＴＧで誘導して終濃度５０μＭとし、同じ温度で一晩増殖を続けた。培養物を回転沈降させ、プロテインＬ樹脂（所内作製）を用い、ＤＡＴ０１１５またはＤＡＴ０１１７を培養上清から捕捉した。８℃で一晩バッチ結合を行い、樹脂をカラム容積の１０倍のＰＢＳで洗浄し、その樹脂からＤＡＴ０１１５またはＤＡＴ０１１７を、カラム容積の３倍の０．１ＭグリシンｐＨ＝２で溶出した。このタンパク質を、１／５容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を加えることで中和した。その後、タンパク質をＳＤＳ−ゲルおよび質量分析（ＭＳ）またはＥｄｍａｎ分解(Ｅｄｍａｎ)によって分析した。
【０１９０】
アステリスク（＊）の付いたＤＡＴ０１１７発現ベクターを、実施例１６に示した条件を用いて、形質転換し、培養し、分析した。
【表１３】
【０１９１】
実施例２０ ＭａｌＥ／ｐＥＴ３０ベクターを用いた、ＤＭＳ７１３９（エキセンディン−４とＤＯＭ７ｈ１４−１０の遺伝子融合体）ＡｌｂｕｄＡｂの発現および精製
ＤＭＳ７１３９遺伝子を、ＤＭＳ７１３９含有プラスミドから、オリゴヌクレオチドｎｏ．１（図２ｓ：配列番号４７）(ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＣＡＡＡＡＣＣＧＧＴＧＣＴＣＧＣＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＴＧＴＣＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＣＴＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴＣＣＧＣＴＴＣＣＧＣＧＣＴＧＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣ)およびオリゴヌクレオチドｎｏ．２（ＧＴＴＣＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＡＣＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧ）（図２ｔ：配列番号４８）を用い、ＰＣＲにより増幅した。増幅産物は、Ｎ末端ＭａｌＥシグナル配列ＭＫＩＫＴＧＡＲＩＬＡＬＳＡＬＴＴＭＭＦＳＡＳＡＬＡ（図９ｊ：配列番号４９）を有するＤＭＳ７１３９構築物を含み、その５’および３’末端にそれぞれＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ認識配列を残している。得られた遺伝子断片をＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩで消化したｐＥＴ３０ベクター(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)に連結した。この挿入配列を確認するため、Ｔ７−フォワードプライマーおよびＴ７−リバースプライマークローンを用いてクローンの配列決定を行った。
【０１９２】
ＤＭＳ７１３９発現ベクターを、ｐＥＣＯ−ｐｇｌベクター（Ａｏｎ ｅｔ ａｌ. ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｆｅｂ. ２００８ ｖｏｌ.７４, Ｎｏ.２, ｐｇ ９５０−９５８参照）を含む大腸菌ＢＬ２１−（ＤＥ３）株(Ｎｏｖａｇｅｎ)に形質転換し、培養物を、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび３７．５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを添加した最小培地（Ｋｏｒｚ Ｄ.Ｊ. ｅｔ ａｌ Ｊ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. １９９５ ３９ ｐｇ ５９−６５参照)にて３０℃で増殖させた。０．２５〜０．５の間のＡ６００で、細胞（得られた実際の値は０．３４７）をＩＰＴＧで誘導して終濃度７０μＭとし、２８℃で一晩増殖を続けた。培養物を回転沈降させ、プロテインＬ樹脂（所内作製）を用い、ＤＭＳ７１３９を培養上清から捕捉した。４℃で一晩バッチ結合を行い、樹脂をカラム容積の１０倍のＰＢＳで洗浄し、その樹脂からＤＭＳ７１３９を、カラム容積の３倍の０．１ＭグリシンｐＨ＝２で溶出した。その後、タンパク質をＳＤＳ−ゲルおよび質量分析によって分析した。図１０に示されるように、質量分析は極めて純粋なＤＭＳ７１３９が存在することを示す。
【０１９３】
また、タンパク質ＤＭＳ７１３９をコードするＤＮＡ配列に対して大腸菌発現向けにコドンの至適化を行うことができ、この配列を図２（ｕ）配列番号５０に示す。
【０１９４】
実施例２１ ＤＭＳ７１３９はマウス、ラット、カニクイザルおよびヒトＧＬＰ−１Ｒと同様の効力で結合する
ヒト、マウス、ラットおよびカニクイザルＧＬＰ−１ＲにおけるＤＭＳ７１３９の相対的効力を決定するために、黒色素胞機能性ＧＬＰ−１Ｒバイオアッセイを用いた（Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ ｅｔ. ａｌ., Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ. ２００５と同様）。７ＴＭの活性化を介したメラノソーム輸送はすでに十分記されており、黒色素胞内に局在するＧタンパク質は哺乳類細胞系と同様の方式でＧＰＣＲと結合することが示されている(Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ., Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００２; １５６:８５５−８６５)。このバイオアッセイでは、メラノソームとして知られるオルガネラを含む暗色の色素（メラニン）を有する、ツメガエル(Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ)の皮膚細胞に由来する黒色素胞細胞系を用いる(Ｌｅｒｎｅｒ, Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ. １９９４; １７:１４２−１４６)。細胞内ｃＡＭＰレベルの変化は、メラノソームが凝集する、または細胞に拡散する程度を制御し、従って、黒色素胞の色の濃さはｃＡＭＰレベルに直接関係する。さらに詳細を以下に示す。
【０１９５】
ラット、マウスおよびヒトＧＬＰ−１受容体をコードする全長オープンリーディングフレームｃＤＮＡを、標準的な分子生物学的技術を用いて、発現ベクターｐＪＧ３．６またはｐｃＤＮＡ３にクローニングした。Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号を下表１４に示す。
【表１４】
【０１９６】
カニクイザルＧＬＰ−１Ｒをコードするクローンを、カニクイザル肺、肝臓および脳から単離された全ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡから増幅し、ｐｃＤＮＡ３．２ＤＧＷにサブクローニングした。全長ｃＤＮＡ配列を確認した。黒色素胞をＴ２２５フラスコ（Costar カタログ番号３０００）にて、Ｌ−１５培地中、２７℃および０％ＣＯ２で維持し、１週間に１回、集密フラスコから０．７倍トリプシンを用いて分割し（１：１０）、その後、１週間に２回栄養分を与えた。カニクイザルのｃＤＮＡを図２（ｒ）（配列番号４５）に示す。
【０１９７】
アッセイの目的で、細胞を洗浄し、トリプシンで処理し、０．７倍ＥＰＧ ＰＢＳに１５×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。８００μｌの細胞を２０〜４０μｇのｃＤＮＡと穏やかに混合し、氷上で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、８００μｌの細胞／ｃＤＮＡ混合物をピペットでキュベットに移し、５００Ｖ、７２５ｕＦおよび９５０オームでエレクトロポレーションを行った。その後、細胞をキュベットからＲＦＭ（標準カエル培地）を含むＴ７５フラスコに直接移し、室温で少なくとも３時間、次いで、インキュベーター（２５℃、０％ＣＯ２）内で一晩インキュベートした。翌日、細胞をトリプシンで処理し、計数し、Ｃｏｓｔａｒ ９６ハーフウェルプレート（カタログ番号３６９７）に３００，０００細胞／ｍｌの密度で加えた。２時間後、それらをインキュベーター（２５℃、０％ＣＯ２）内の密閉容器に一晩入れた。次の日、培地を吸引し、１％ＤＭＳＯと１０ｎＭメラトニンを含有する２５μｌのＭＡＢ（黒色素胞アッセイバッファー）を各ウェルに加えた。細胞を１時間インキュベートし、ＳＬＴ Ｓｐｅｃｔｒａプレートリーダーにて６２０ｎｍで基礎透過率を測定した。次に、２倍濃度のペプチドおよび標品２５μｌを含有する希釈シリーズ（ＭＡＢで３倍間隔の希釈を用いた１２点シリーズ）を各ウェルに直接加えた。標品はメラトニン１０ｎＭ、ＭＳＨ２００ｎＭおよびＭＡＢを含み、それぞれアッセイ系の最小値、最大値および基本応答レベルを設定するために用いた。ペプチドおよび標品を加えた後、プレートを１時間インキュベートし、上記のように透過率を測定した。データは、Ｒｏｂｏｓａｇｅ（バージョン７．３．２）を用い、（１−Ｔｆ／Ｔｉ）（式中、Ｔｉは最初のベースラインの読み取り値であり、Ｔｆは応答の読み取り値である）を計算することによって解析した。
【０１９８】
Ｇｓ共役型７ＴＭ受容体の活性化（すなわち、ＧＬＰ−１Ｒ）は細胞内ｃＡＭＰの増加をもたらし、メラトニンを用いて予め凝集させたメラノソームをより分散性とし、その応答は細胞の光透過率の低下として測定される。あるいは、ｃＡＭＰを低下させる条件下では、メラノソームが凝集し、細胞の光透過率が増大する。従って、ＧＬＰ−１Ｒ ｃＤＮＡ含有プラスミド構築物を黒色素胞にトランスフェクションし、一次的に発現させた後、ＧＬＰ−１Ｒの活性化に対するＤＭＳ７１３９の相対的効力が用量反応曲線から算出可能である。結果を下表１５に示す。
【表１５】
【０１９９】
ヒト、マウス、ラットおよびカニクイザルＧＬＰ−１Ｒでトランスフェクトとした黒色素胞を用い、ＤＭＳ７１３９のアッセイにおける効力を、各種につき少なくとも２回調べた。２回のアッセイのｐＥＣ５０を表１５に示す。カニクイザル、ヒトおよびラット受容体における効力は極めて類似しており、マウス受容体における効力はやや低い可能性がある。全体として、表１５に示されているデータは、この薬物を用いたマウスモデルで見られた有効性が、毒性学的種（ラットおよびカニクイザル）で、またヒトでも再現する可能性があるということとよく一致する。
【０２００】
実施例２２ ＩＩ型糖尿病のｄｂ／ｄｂマウスモデルにおけるＤＡＴ０１１５およびＤＭＳ７１３９の有効性および作用持続時間
本試験の目的は、１０〜１１週齢のｄｂ／ｄｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから入手）における経口糖耐能に対するＤＡＴ０１１５およびＤＭＳ７１３９の作用持続時間を決定および比較することであった。試験開始の３日前に評価した血糖値によって、処理間で動物を無作為化した。これによって、各試験群の平均開始血糖値の類似性を確保した。ＤＡＴ０１１５およびＤＭＳ７１３９は、経口ブドウ糖ボーラスの１２０時間、９６時間、７２時間または４８時間前に１ｍｇ／ｋｇを皮下投与した（図１１Ａに示す）。
【０２０１】
グルコースＡＵＣは、２時間の経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）にわたって、ビヒクルで処置したｄｂ／ｄｂマウスに比べて、ＤＭＳ７１３９の場合には１２０時間までの全ての時点で、ＤＡＴ０１１５の場合には９６時間までの全ての時点で、有意に減少した（図１１Ｂ）。７２時間、９６時間または１２０時間の時点で投与したＤＡＴ０１１５とＤＭＳ７１３９の間で統計的な差は無かったが、ＤＡＴ０１１５は４８時間の時点でＤＭＳ７１３９よりもグルコースＡＵＣを有意に低下させた。
【０２０２】
ＤＭＳ７１３９が示すグルコースＡＵＣの低下が一貫しているほど、このクラスの薬物にとってより望ましい特性を表すと結論づけられた。よって、本試験は明確な優越性を特定するものではなかったが、このデータ、また他のデータに基づいてＤＭＳ７１３９が主要薬剤として選択された。
【０２０３】
実施例２３ ＤＭＳ７１３９の繰り返し投与は、ＤＯＭ７ｈ−１４対照と比べてＨｂＡ１ｃの用量依存的減少を示す
本試験の目的は、１０〜１１週齢のｄｂ／ｄｂマウス(Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ)においてＤＭＳ７１３９の繰り返し投与後のＨｂＡ１ｃ低下を調べることであった。ＨｂＡ１ｃはヘモグロビンの糖化型であり、その濃度は長期間にわたる血漿グルコース濃度の代替指標として用いられる。各試験群で平均開始ＨｂＡ１ｃレベルの類似性を確保するために、試験開始の３日前にＨｂＡ１ｃレベルに基づき、ｄｂ／ｄｂマウスを無作為化した。動物にＤＭＳ７１３９（０．０１、０．０３、０．１、０．３ｍｇ／ｋｇ）、Ｂｙｅｔｔａ（商標）（０．０００１、０．００１、０．０１、０．１ｍｇ／ｋｇ）またはＤＯＭ７ｈ−１４（０．３ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを２週間、１日１回（ＱＤ）皮下投与した。試験中、体重、摂食量およびグルコースの測定を行い、ＨｂＡ１ｃの測定は１４日の終了時に行った。
【０２０４】
与えたグルコースおよびＨｂＡ１ｃは、対照（ＤＯＭ７ｈ−１４）に対して、０．０３、０．１および０．３ｍｇ／ｋｇのＤＭＳ７１３９処置群で有意に低下したが、それらは生理食塩水対照に対しては有意ではなかった（図１２の結果を参照）。生理食塩水対照に関して得られたデータは、最低用量のエキセンディン−４またはＤＭＳ７１３９で得られたデータに基づいて予測されたものよりも低かった。生理食塩水対照に比べ、エキセンディン−４では変化は見られなかった。また、ＤＭＳ７１３９では、体重および摂食量にも有意な低下が見られた。エキセンディン−４は最高用量で摂食量に有意な効果を示した。
【０２０５】
ＤＭＳ７１３９の繰り返し投与はｄｂ／ｄｂマウスにおいてＨｂＡ１ｃ低下をもたらすとともに、摂食量および体重にも効果をもたらすと結論づけられた。これらの変化はＧＬＰ−１Ｒアゴニストに関して予測されたものと一致している。
【０２０６】
実施例２４ 食餌性肥満（ＤＩＯ）マウスの肥満モデルにおいて、ＤＡＴ０１１５およびＤＭＳ７１３９はＤＯＭ７ｈ−１４対照に比べて摂食量および体重の用量依存的減少を示した
ここに記載される試験の目的は、１０日間の摂食量および結果としての体重がＤＡＴ０１１５およびＤＭＳ７１３９処置によって影響を受けるかどうかを判定すること、およびこれらの化合物のあるものが他のものより長い作用期間を有するかどうかを判定することであった。これはヒトに対する予測となり得る。食餌性肥満（ＤＩＯ）マウス給餌モデルにおいて、ＤＡＴ０１１５投与群、Ｂｙｅｔｔａ投与群およびＤＭＳ７１３９投与群を用いて試験を行った。
【０２０７】
雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウス(Taconic)を６０％ｋｃａｌ高脂肪の放射線照射済み食餌（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｄ１２４９２）で１２週間太らせた後、所内施設に移した。到着後、そのマウスを、温度および湿度制御室（７０〜７２°Ｆ、湿度＝４８〜５０％、５ＡＭ／５ＰＭ光周期）のａｌｐｈａ−ｄｒｉ床敷上に個別に収容した。食餌を４５％高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｄ１２４５１）に変え、動物を１８日間順応させた。化合物を投与する前に、３日間マウスに生理食塩水を皮下注射し、摂餌量をモニタリングした。マウスは、群間で体重および摂餌量に差がないように群分けした。３群にそれぞれ０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇのＤＡＴ０１１５またはＤＭＳ７１３９のいずれかを投与し、１群に陰性対照分子（ＤＯＭ７ｈ−１４ ＡｌｂｕｄＡｂ（商標）１ｍｇ／ｋｇ）を、また１群にエキセンディン−４陽性対照（０．０１ｍｇ／ｋｇ）を投与した。１０日間、毎日、摂食量および体重を測定した。
【０２０８】
ＤＡＴ０１１５およびＤＭＳ７１３９は、ＤＯＭ７ｈ−１４対照に比べて、摂食量および体重の用量依存的減少を示した（図１３の結果を参照）。図１３に示されているエキセンディンはＢｙｅｔｔａ（商標）であったことを注記しておく。このマウス試験からのデータは、これらの有効性の間に統計的な違いは無いことを示す。
【０２０９】
実施例２５ マウス、ラットおよびカニクイザルにおけるＤＭＳ７１３９のＰＫ分析
３種のモデル（ｄｂ／ｄｂマウス、ラットおよびカニクイザル）におけるＤＳＭ７１３９でのｓ．ｃ．およびｉ．ｖ．の一連の試験を行った。適切な時点でのアッセイにより検出可能であると推測される血漿濃度を達成する目的で用量を選択した：マウスでは１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．およびｓ．ｃ．、ラットでは１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．および０．３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．、カニクイザルでは０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．およびｓ．ｃ．。
【０２１０】
ＰＫサンプリングの時点は、ｄｂ／ｄｂマウス（０．１７、１、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０および１６８時間）、ラット（０．１７、１、４、８、１２、２４、４８、７２、９６および１２０時間）ならびにカニクイザル（０．０８３（ｉ．ｖ．群のみ）、０．５、４、８、２４、４８、９６、１４４、１９２、２８８、３３６、５０４および６７２時間（４週間））。各時点で１個体の動物を犠牲にしたマウス以外は、一連の血液サンプリングを行った。血漿サンプルを調製し、後のＤＭＳ７１３９レベルの分析のために冷凍保存した。
【０２１１】
様々な試験でＰＫサンプルを分析するのに、分子のエキセンディン−４部分とＡｌｂｕｄＡｂ部分を検出するＥＬＩＳＡ法と、エキセンディン−４からＮ末端ペプチドを検出するＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の、２種類の定量アッセイを用いた。ＥＬＩＳＡに基づく方法からのデータを以下に示す。
【０２１２】
ＥＬＩＳＡ：
カニクイザル血漿中のＤＡＴ０１１５およびＤＭＳ７１３９のレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。簡単に述べると、９６ウェルのｆｌｕｏｒｏｎｕｎｃプレート(Ｎｕｎｃ ＃４３７７９６)を冷蔵庫内で、５０ｍＭ炭酸ナトリウムバッファーｐＨ９．４（１００μＬ／ウェル）中、５μｇ／ｍＬの抗エキセンディン−４抗体（Ａｂｃａｍ カタログ番号ａｂ２６２６３）で一晩コーティングした。翌日、プレートを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５および０．１％ｔｗｅｅｎ−２０（３００μＬ／ウェル）で５回洗浄した後、２００μＬのブロッキングバッファー（ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ, ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃ ３７５３５，ＴＢＳ中）を用い、公称３７℃でおよそ１時間振盪しながらブロックした。ウェルを上記のように洗浄した後、１００μｌ／ウェルのＱＣ、標品またはサンプルとともに公称３７℃でおよそ２時間振盪しながらインキュベートした。再びウェルを洗浄した後、アッセイバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０ ｐＨ７．５）中、１：２０００最終希釈のウサギ抗ヒトκ軽鎖抗体とともに公称３７℃で１時間振盪しながらインキュベートした後、上記のように洗浄した。次に、ウェルを、１００μｌ／ウェルのリポータータグ溶液（アッセイバッファー中１／５００，０００のヤギ抗ウサギＩｇＧ複合体）とともに公称３７℃で振盪しながらインキュベートした後、上記のように洗浄した。結合したＤＡＴ０１１５またはＧＳＫ２３７４６９７Ａは、１００μＬ／ウェルの発光基質(ｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ ｆｅｍｔｏ （ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３７０７５）)を、およそ１分間一定振盪しながら加えることで検出し、その後、化学発光プレートリーダー(Ｗａｌｌａｃ １４２０ Ｖｉｃｔｏｒ Ｍｕｌｙｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅr Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）)を用いて読み取った。
【０２１３】
測定された血漿レベルに対し、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアバージョンＸ ＴＢＣを用いて、コンパートメントおよびノンコンパートメント薬物動態分析を行った（下表１６参照）。ノンコンパートメント結果では、試験間の一貫性のために同日にＤＡＴ０１１５およびＤＭＳ７１３９の全ｐＫデータのコンパイルとフィッティングを行った。従って、示されたデータはＤＡＴ０１１５およびＤＭＳ７１３９のコンパイルされたデータ、ＮＣＡ結果および図である。
【０２１４】
カニクイザルでは、半減期は、コンパートメント法およびノンコンパートメント法によってそれぞれ１０６．４時間または１１２．８時間（ｉｖ）、および１１３．８時間または１１３．１時間（ｓｃ）であると計算された。３つの種全てにおいて、ＤＭＳ７１３９は血清アルブミンそれ自体の半減期に迫る半減期を有し、従って、ＤＭＳ７１３９が（例えばカニクイザル血清アルブミンに比べて）ヒト血清アルブミンに対して有しているものと同等の親和性を示すと結論づけられ、このことにより、ＤＭＳ７１３９がヒトにおいて毎週の投与（すなわち、低頻度）に適合する半減期を有するという強い確信が得られる。
【表１６】
【０２１５】
実施例２６ カニクイザルにおけるＤＭＳ７１３９およびＤＡＴ０１１５のＰＫ分析の比較
ヒトでの使用を目的に開発するために最も望ましい分子を選択するため、カニクイザルにおける薬物動態パラメーターをＤＡＴ０１１５およびＤＭＳ７１３９に関して比較した（表１７参照）。本発明者らは、表のデータが、ＤＭＳ７１３９がＤＡＴ０１１５よりも望ましいＰＫパラメーターを有することを示し、皮下投与または静脈投与された際にカニクイザルにおいてより長い半減期を示すと結論づけた。半減期がより長いと、より後の時点で、ＤＭＳ７１３９はＤＡＴ０１１５よりも一貫して血漿中の濃度が高いという効果を有する（データは示されていない）。
【表１７】
【０２１６】
実施例２７： ＰＹＹ（３−３６）ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ＡｌｂｕｄＡｂ（商標）ペプチド複合体ＤＭＳ７６０５（図１４に示されている構造を有し、リシンおよび４リピートＰＥＧリンカーを介してＰＹＹ３−３６と複合体化されたＤＯＭ ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ＡｌｂｕｄＡｂである）の作出：
ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ａｌｂｕｄａｂを下記のように大腸菌で発現させ、精製した。ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）をコードする遺伝子をベクターｐＥＴ３０にクローニングした。発現ベクターへのクローニングを可能とするために、融合体を、５’にＮｄｅＩ制限部位、その後にＰＥＬ Ｂリーダー配列を有するアセブンリＰＣＲとして作出した（アミノ酸配列は図９（ｉ）配列番号４６に示される）。ベクターおよびアセンブリＰＣＲをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した後、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いて、この挿入配列をベクターに連結した。ＭａｃｈＩ細胞を形質転換するのにこの連結物２μｌを用いた。回復増殖期間の後、細胞を、カルベニシリン含有寒天プレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。コロニーを配列決定し、適切な配列を含むものをプラスミド増殖および単離(Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐキット、Ｑｉａｇｅｎ)に用いた。ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をプラスミドＤＮＡで形質転換し、得られたコロニーを発現培養物の接種に用いた。発現は、５０ｍｌの改変テリフィックブロス培地(Ｓｉｇｍａ)を含む２５０ｍｌフラスコに接種（これはＯＤ＝０．１で接種した）した後、５０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを添加して３０℃で増殖させた。Ａ６００＝０．５〜１で、細胞をＩＰＴＧで誘導して終濃度５０μＭとし、２３℃で一晩増殖を続けた。その後、培養上清を３７００ｘｇで１時間の遠心分離によって清澄化した。その後、発現したタンパク質を清澄上清から、プロテインＬストリームライン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，カタログ番号２８−４０５８−０３，プロテインＬ結合型）を用いて精製し、プロテインＬから、０．１ＭグリシンｐＨ２．０を用いて溶出した後、溶出量の１／５の１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を加えることで中和した。次に、このタンパク質を、０．１Ｍクエン酸を用いてｐＨ５に調整し、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５で平衡化した３０ｍｌ Ｓｏｕｒｃｅ Ｓカラム(ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)に添加した。ＡｋｔａＸｐｒｅｓｓ ＦＰＬＣ(ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)を用い、１５０ｍｌにわたり、５０ｍＭクエン酸ナトリウム ｐＨ５、１Ｍ ＮａＣｌの０〜１００勾配を適用した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、最も純度の高い産物を含有する画分をプールした。最終タンパク質を５０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ６．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ中で脱塩した。
【０２１７】
次に、Ｄｏｍ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ＡｌｂｕｄＡｂを、図１４に示されているＰＥＧリンカーを用い、ＰＹＹ ３−３６アミノ酸分子（ただし、１０番の位置に、ＰＥＧリンカーで誘導体化可能なリシンを含む）に連結した。ＰＹＹおよびＰＥＧは標準的な化学合成によって調製した。次に、ＰＥＧリンカーの末端のマレイミドを用い、上記のように調製したＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ＡｌｂｕｄＡｂの遊離システインにＰＹＹペプチドを結合させた。
【０２１８】
ＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）を５０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ６．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ中で脱塩した。その後、マレイミドで活性化したペプチドをこのタンパク質と１：１比で混合し、インキュベートして複合体を生じさせた。
【０２１９】
上記と同様の方法でイオン交換クロマトグラフィーにより、複合体を未反応のＤＯＭ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）から精製した。最後に、複合体が豊富な画分を、上記と同様の方法でプロテインＬアフィニティー精製を用い、遊離ペプチドから精製した。最終的なＤＭＳ７６０５複合体をバッファー交換し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析によって分析した。
【０２２０】
実施例２８： 黒色素胞機能性バイオアッセイにおける、エキセンディン−４ ＡｌｂｕｄＡｂ（上記のように作製したＤＡＴ０１１５）およびＰＹＹ（３−３６）ＡｌｂｕｄＡｂ融合体ペプチド（実施例２７に記載のように作製したＤＭＳ７６０５、図１４に示される構造を有する）の薬理学的特性
【０２２１】
対象の受容体でトランスフェクトした細胞を用いた黒色素胞機能性バイオアッセイにおいて、エキセンディン−４ ＡｌｂｕｄＡｂ（ＤＡＴ０１１５）およびＰＹＹ（３−３６）ＡｌｂｕｄＡｂ（実施例２７に記載のように作製したＤＭＳ７６０５、図１４に示される構造を有する）の薬理学的特性を調べた。バイオアッセイは、ヒトＮＰＹ１Ｒでは８０μｇのｃＤＮＡを用い、マウスＮＰＹ１Ｒでは４０μｇを用い、他のマウスおよびヒトＮＰＹ受容体（ＮＰＹ２Ｒ、ＮＰＹ４ＲおよびＮＰＹ５Ｒ）では４０μｇを用いたこと以外は、本質的に実施例２１に記載のように行った。
【０２２２】
エキセンディン−４およびＰＹＹ（３−３６）ＡｌｂｕｄＡｂ融合体ペプチドの薬理学的特性（データは示されていない）は、該融合体がマウスおよびヒトＮＰＹ受容体の双方と結合し、それらを活性化することを明らかにした。ＤＭＳ７６０５はＮＰＹ１Ｒ、ＮＰＹ２Ｒ、ＮＰＹ４ＲおよびＮＰＹ５Ｒと結合し、ＮＰＹ２Ｒが最も強く活性化される（データは示されていない）。ＮＰＹＲアクセッション番号は次の通りである：ＮＰＹ１Ｒ：ＮＭ００９０９（ヒト）およびＮＭ０１０９３４（マウス）；ＮＰＹ２Ｒ：ＮＭ００９１０（ヒト）およびＮＭ００８７３１（マウス）；ＮＰＹ４Ｒ：ＮＭ００５９７２（ヒト）およびＮＭ００８９１９（マウス）；ＮＰＹ５Ｒ：ＮＭ００６１７４（ヒト）およびＮＭ０１６７０８（マウス）。
【０２２３】
実施例２９： 食餌性肥満（ＤＩＯ）マウスの肥満モデルにおいて、ＤＭＳ７６０５はビヒクル対照に比べて体重の用量依存的減少を示した
本試験はＤＭＳ７６０５（ａｋａ ＤＭＳ７１６７：ＰＹＹ３−３６）の有効性を評価するため、食餌性肥満（ＤＩＯ）マウス肥満モデルで行った。ここに記載される試験の目的は、６日間の摂食量および体重がＤＭＳ７６０５処置によって影響を受けるかどうかを判定することであった。これらの結果はヒトに対する予測となり得る。
【０２２４】
雄Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス(Ｔａｃｏｎｉｃ)を６０％ｋｃａｌ高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｄ１２４９２）で１２週間太らせた後、所内施設に移した。到着後、そのマウスを、温度および湿度制御室（７０〜７２°Ｆ、湿度＝４８〜５０％、５ＡＭ／５ＰＭ光周期）のａｌｐｈａ−ｄｒｉ床敷上に個別に収容した。食餌を４５％高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｄ１２４５１）に変え、動物を５週間順応させた。動物には食餌と水を自由に摂らせた。化合物を投与する前に、１日、マウスにビヒクルを皮下注射し、摂餌量をモニタリングした。マウスは、群間で体重および摂餌量に差がないように群分けした。これらの群に、１日おきに、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇまたは０．１ｍｇ／ｋｇ用量のビヒクルまたはＤＭＳ７６０５のいずれかを投与した。６日間の累積摂食量における統計的に有意な変化（Ｔ検定によりｐ＜０．０５）が、３ｍｇ／ｋｇ（３７．３％の低下）、１ｍｇ／ｋｇ（３１．３％の低下）および０．３ｍｇ／ｋｇ（２１．８％の低下）で見られたが、０．１ｍｇ／ｋｇでは有意な変化が見られなかった（８．７％の低下、Ｔ検定によりｐ＝０．０７）。体重は投与開始後０日目、３日目および６日目に測定した。
【０２２５】
ＤＭＳ７６０５は、ビヒクル対照に比べて体重の用量依存的減少を示した（図１５）。全ての用量で有意な体重減少が見られた（二元配置ＡＮＯＶＡとその後のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ（事後）分析によりｐ＜０．０１）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｂ）との誘導体または複合体として存在する、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬と、（ｂ）血清アルブミンと結合するｄＡｂとを含むかまたはそれらからなる融合体または複合体組成物であって、前記（ａ）は、（ｂ）血清アルブミンと結合するｄＡｂであって、（ｉ）ＤＯＭ ７ｈ−１４ドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ ７ｈ−１４のアミノ酸配列は図１（ｈ）：配列番号８に示される）、（ｉｉ）ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０のアミノ酸配列は図１（ｏ）：配列番号２６に示される）またはＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ ｄＡｂの配列から４個までのアミノ酸変異を有するｄＡｂ、および（ｉｉｉ）ＤＯＭ ７ｈ−１１−１５ ｄＡｂ（ＤＯＭ ７ｈ−１１−１５のアミノ酸配列は図１（ｐ）：配列番号２７に示される）または（ｉｖ）ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ Ｒ１０８Ｃドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０のアミノ酸配列は図１（ｒ）に示される）から選択されるｄＡｂとの融合体または複合体として存在する、上記融合体または複合体組成物。
【請求項２】
前記薬物がエキセンディン−４、ＧＬＰ−１分子もしくはＰＹＹ分子、または天然分子の結合活性を保持するその突然変異体もしくは誘導体である、請求項１に記載の融合体または複合体。
【請求項３】
前記薬物が（ａ）図１（ｉ）（配列番号９）に示されるアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ突然変異体、または（ｂ）図１（ｊ）（配列番号１０）に示されるアミノ酸配列を有するエキセンディン−４分子、または（ｃ）ＰＹＹ３−３６、もしくは１０番の位置にリシンを有しかつ図１ｓに示されるアミノ酸配列を有するＰＹＹ３−３６から選択される、請求項１または２に記載の融合体または複合体。
【請求項４】
前記薬物と前記ｄＡｂを連結するアミノ酸リンカーまたは化学リンカーを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合体または複合体。
【請求項５】
前記アミノ酸リンカーが図１（ｋ）（配列番号１１）に示されるアミノ酸配列を有するヘリカルリンカー、または図１（ｌ）（配列番号１２）に示されるアミノ酸配列を有するｇｌｙ−ｓｅｒリンカーである、請求項４に記載の融合体または複合体。
【請求項６】
前記インスリン分泌促進薬または前記インクレチン薬が融合体の一部として前記ｄＡｂのＮ末端またはＣ末端のいずれかに存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合体。
【請求項７】
（ａ）エキセンディン４，（Ｇ４Ｓ）３，リンカーＤＯＭ７ｈ−１４−１０融合体（ＤＭＳ７１３９）
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＷＩＧＳＱＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＭＷＲＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＱＧＬＲＨＰＫＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ
（配列番号２４）
（ｂ）エキセンディン４，（Ｇ４Ｓ）３，リンカーＤＯＭ７ｈ−１１−１５融合体（ＤＭＳ７１４３）
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＲＰＩＧＴＭＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＬＡＦＳＲＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＱＡＧＴＨＰＴＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ
（配列番号２５）
（ｃ）リシン（ＰＹＹの１０番の位置に導入）および図１４に示されるような４リピートＰＥＧリンカーを介して、Ｃ末端でアミド化されたＰＹＹ３−３６と複合体化されたＤＯＭ ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ＡｌｂｕｄＡｂである、ペプチド複合体
から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項６に記載の融合体または複合体。
【請求項８】
前記ｄＡｂが、ＰＥＧ基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体もしくは少なくともそのトランスフェリン結合部分、抗体Ｆｃ領域から選択される分子をｄＡｂと結合させることによって、または抗体ドメインと複合体化することによって、流体力学的サイズを大きくするようにさらに構成されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合体または複合体。
【請求項９】
ペプチド部分またはポリペプチド部分をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合体または複合体。
【請求項１０】
ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ ｄＡｂまたはＤＯＭ ７ｈ−１１−１５ ｄＡｂに対して同じまたは異なる結合特異性を有する別のｄＡｂ部分を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合体または複合体。
【請求項１１】
ヒトにおける排出半減期が１２時間以上、例えば１２〜２１日である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合体または複合体。
【請求項１２】
ヒト血清アルブミンと約５マイクロモル〜約１ピコモルの範囲のＫＤで結合する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合体または複合体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合体または複合体を薬学上または生理学上許容される担体、賦形剤または希釈剤と組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項１４】
さらなる治療薬または活性薬を含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
（ａ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合体または複合体、および（ｂ）さらなる治療薬または活性薬を含む組成物であって、対象に個別投与、逐次投与または同時投与するための組成物。
【請求項１６】
代謝性疾患または障害の治療または予防に使用するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記疾患または障害が高血糖症、耐糖能異常、β細胞不全、糖尿病（１型もしくは２型糖尿病または妊娠糖尿病）、肥満、または過食を特徴とする疾患から選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
代謝性疾患または障害を治療または予防するための薬剤の製造における、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１９】
皮下注射、静脈注射または筋肉注射によって対象へ送達するための薬剤の製造における、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２０】
非経口送達、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、眼送達、肺送達または消化管送達のための薬剤の製造における、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２１】
患者に治療上または予防上有効な量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、代謝性疾患を治療または予防する方法。
【請求項２２】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物を含む、経口製剤、注射製剤、吸入製剤またはネブライザー製剤。
【請求項２３】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物を含む、例えば坐剤の形態の、徐放性製剤。
【請求項２４】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物を含む、凍結乾燥製剤。
【請求項２５】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物を含む、送達デバイス。
【請求項２６】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合体をコードする、例えば配列番号５０、３０、２９、１５〜２２から選択される配列の、単離されたまたは組換え核酸。
【請求項２７】
請求項７または８に記載の融合体のいずれか１つをコードする核酸。
【請求項２８】
請求項２７または２８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２９】
請求項２７もしくは２８に記載の核酸または請求項２９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３０】
（ａ）（ｂ）との誘導体または複合体として存在する、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬と、（ｂ）ｄＡｂとを含むかまたはそれからなる融合ポリペプチドを作製する方法であって、前記（ａ）は、（ｂ）ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０、ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ Ｒ１０８ＣまたはＤＯＭ ７ｈ−１１−１５ドメイン抗体（ｄＡｂ）から選択されるｄＡｂとの融合体として存在するものであり、請求項２９に記載の宿主細胞を前記核酸またはベクターの発現に好適な条件下で維持することを含み、それにより融合ポリペプチドが生産される、上記方法。
【請求項３１】
患者、例えばヒト患者において高血糖に関連する疾患または障害を治療または予防する方法であって、治療上または予防上有効な量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物を患者に投与することを含む方法。
【請求項３２】
患者、例えばヒト患者においてインスリン生産を刺激する、かつ／またはインスリン感受性を高める方法であって、前記患者に少なくとも１用量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項３３】
Ｃ末端にアミノ酸配列ＡＭＡまたはＡＷＡを有する改変されたリーダー配列であって、野生型配列ではないリーダー配列。
【請求項３４】
前記配列がＯｍｐＡ−ＡＭＡもしくは−ＡＷＡ；またはＯｍｐＴ−ＡＭＡもしくは−ＡＷＡ；またはＧＡＳ−ＡＭＡもしくは−ＡＷＡから選択される、請求項３３に記載の改変されたリーダー配列。
【請求項３５】
宿主細胞における異種ポリペプチドの発現のための、請求項３３または３４に記載の改変されたリーダー配列の使用。
【請求項３６】
異種ポリペプチドがドメイン抗体（ｄＡｂ）、例えば、血清アルブミンと結合するｄＡｂを含む、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
異種ポリペプチドがインスリン分泌促進薬またはインクレチン薬を含むかまたはそれからなる、請求項３５または３６に記載の使用。
【請求項３８】
（ｉ）インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬と、（ｉｉ）インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬から前記インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬のＮ末端のアミノ酸が２個少なくなったものとの混合物を作製する方法であって、宿主細胞において前記インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬の１番の位置の前での切断と３番の位置の前での切断を生じるリーダー配列を用いて（ｉ）を発現させるステップを含む方法。
【請求項３９】
（ｉ）インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬と、（ｉｉ）インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬から前記インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬のＮ末端のアミノ酸が２個少なくなったものとの混合物であって、請求項３８に記載の方法によって得られるかまたは得ることが可能な、上記混合物。
【請求項１】
（ａ）（ｂ）との誘導体または複合体として存在する、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬と、（ｂ）血清アルブミンと結合するｄＡｂとを含むかまたはそれらからなる融合体または複合体組成物であって、前記（ａ）は、（ｂ）血清アルブミンと結合するｄＡｂであって、（ｉ）ＤＯＭ ７ｈ−１４ドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ ７ｈ−１４のアミノ酸配列は図１（ｈ）：配列番号８に示される）、（ｉｉ）ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０のアミノ酸配列は図１（ｏ）：配列番号２６に示される）またはＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ ｄＡｂの配列から４個までのアミノ酸変異を有するｄＡｂ、および（ｉｉｉ）ＤＯＭ ７ｈ−１１−１５ ｄＡｂ（ＤＯＭ ７ｈ−１１−１５のアミノ酸配列は図１（ｐ）：配列番号２７に示される）または（ｉｖ）ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ Ｒ１０８Ｃドメイン抗体（ｄＡｂ）（ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０のアミノ酸配列は図１（ｒ）に示される）から選択されるｄＡｂとの融合体または複合体として存在する、上記融合体または複合体組成物。
【請求項２】
前記薬物がエキセンディン−４、ＧＬＰ−１分子もしくはＰＹＹ分子、または天然分子の結合活性を保持するその突然変異体もしくは誘導体である、請求項１に記載の融合体または複合体。
【請求項３】
前記薬物が（ａ）図１（ｉ）（配列番号９）に示されるアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１（７−３７）Ａ８Ｇ突然変異体、または（ｂ）図１（ｊ）（配列番号１０）に示されるアミノ酸配列を有するエキセンディン−４分子、または（ｃ）ＰＹＹ３−３６、もしくは１０番の位置にリシンを有しかつ図１ｓに示されるアミノ酸配列を有するＰＹＹ３−３６から選択される、請求項１または２に記載の融合体または複合体。
【請求項４】
前記薬物と前記ｄＡｂを連結するアミノ酸リンカーまたは化学リンカーを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合体または複合体。
【請求項５】
前記アミノ酸リンカーが図１（ｋ）（配列番号１１）に示されるアミノ酸配列を有するヘリカルリンカー、または図１（ｌ）（配列番号１２）に示されるアミノ酸配列を有するｇｌｙ−ｓｅｒリンカーである、請求項４に記載の融合体または複合体。
【請求項６】
前記インスリン分泌促進薬または前記インクレチン薬が融合体の一部として前記ｄＡｂのＮ末端またはＣ末端のいずれかに存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合体。
【請求項７】
（ａ）エキセンディン４，（Ｇ４Ｓ）３，リンカーＤＯＭ７ｈ−１４−１０融合体（ＤＭＳ７１３９）
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＷＩＧＳＱＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＭＷＲＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＱＧＬＲＨＰＫＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ
（配列番号２４）
（ｂ）エキセンディン４，（Ｇ４Ｓ）３，リンカーＤＯＭ７ｈ−１１−１５融合体（ＤＭＳ７１４３）
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＲＰＩＧＴＭＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＬＡＦＳＲＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＱＡＧＴＨＰＴＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ
（配列番号２５）
（ｃ）リシン（ＰＹＹの１０番の位置に導入）および図１４に示されるような４リピートＰＥＧリンカーを介して、Ｃ末端でアミド化されたＰＹＹ３−３６と複合体化されたＤＯＭ ７ｈ−１４−１０（Ｒ１０８Ｃ）ＡｌｂｕｄＡｂである、ペプチド複合体
から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項６に記載の融合体または複合体。
【請求項８】
前記ｄＡｂが、ＰＥＧ基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体もしくは少なくともそのトランスフェリン結合部分、抗体Ｆｃ領域から選択される分子をｄＡｂと結合させることによって、または抗体ドメインと複合体化することによって、流体力学的サイズを大きくするようにさらに構成されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合体または複合体。
【請求項９】
ペプチド部分またはポリペプチド部分をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合体または複合体。
【請求項１０】
ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ ｄＡｂまたはＤＯＭ ７ｈ−１１−１５ ｄＡｂに対して同じまたは異なる結合特異性を有する別のｄＡｂ部分を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合体または複合体。
【請求項１１】
ヒトにおける排出半減期が１２時間以上、例えば１２〜２１日である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合体または複合体。
【請求項１２】
ヒト血清アルブミンと約５マイクロモル〜約１ピコモルの範囲のＫＤで結合する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合体または複合体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合体または複合体を薬学上または生理学上許容される担体、賦形剤または希釈剤と組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項１４】
さらなる治療薬または活性薬を含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
（ａ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合体または複合体、および（ｂ）さらなる治療薬または活性薬を含む組成物であって、対象に個別投与、逐次投与または同時投与するための組成物。
【請求項１６】
代謝性疾患または障害の治療または予防に使用するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記疾患または障害が高血糖症、耐糖能異常、β細胞不全、糖尿病（１型もしくは２型糖尿病または妊娠糖尿病）、肥満、または過食を特徴とする疾患から選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
代謝性疾患または障害を治療または予防するための薬剤の製造における、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１９】
皮下注射、静脈注射または筋肉注射によって対象へ送達するための薬剤の製造における、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２０】
非経口送達、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、眼送達、肺送達または消化管送達のための薬剤の製造における、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２１】
患者に治療上または予防上有効な量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、代謝性疾患を治療または予防する方法。
【請求項２２】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物を含む、経口製剤、注射製剤、吸入製剤またはネブライザー製剤。
【請求項２３】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物を含む、例えば坐剤の形態の、徐放性製剤。
【請求項２４】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物を含む、凍結乾燥製剤。
【請求項２５】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物を含む、送達デバイス。
【請求項２６】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合体をコードする、例えば配列番号５０、３０、２９、１５〜２２から選択される配列の、単離されたまたは組換え核酸。
【請求項２７】
請求項７または８に記載の融合体のいずれか１つをコードする核酸。
【請求項２８】
請求項２７または２８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２９】
請求項２７もしくは２８に記載の核酸または請求項２９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３０】
（ａ）（ｂ）との誘導体または複合体として存在する、インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬と、（ｂ）ｄＡｂとを含むかまたはそれからなる融合ポリペプチドを作製する方法であって、前記（ａ）は、（ｂ）ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０、ＤＯＭ ７ｈ−１４−１０ Ｒ１０８ＣまたはＤＯＭ ７ｈ−１１−１５ドメイン抗体（ｄＡｂ）から選択されるｄＡｂとの融合体として存在するものであり、請求項２９に記載の宿主細胞を前記核酸またはベクターの発現に好適な条件下で維持することを含み、それにより融合ポリペプチドが生産される、上記方法。
【請求項３１】
患者、例えばヒト患者において高血糖に関連する疾患または障害を治療または予防する方法であって、治療上または予防上有効な量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物を患者に投与することを含む方法。
【請求項３２】
患者、例えばヒト患者においてインスリン生産を刺激する、かつ／またはインスリン感受性を高める方法であって、前記患者に少なくとも１用量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項３３】
Ｃ末端にアミノ酸配列ＡＭＡまたはＡＷＡを有する改変されたリーダー配列であって、野生型配列ではないリーダー配列。
【請求項３４】
前記配列がＯｍｐＡ−ＡＭＡもしくは−ＡＷＡ；またはＯｍｐＴ−ＡＭＡもしくは−ＡＷＡ；またはＧＡＳ−ＡＭＡもしくは−ＡＷＡから選択される、請求項３３に記載の改変されたリーダー配列。
【請求項３５】
宿主細胞における異種ポリペプチドの発現のための、請求項３３または３４に記載の改変されたリーダー配列の使用。
【請求項３６】
異種ポリペプチドがドメイン抗体（ｄＡｂ）、例えば、血清アルブミンと結合するｄＡｂを含む、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
異種ポリペプチドがインスリン分泌促進薬またはインクレチン薬を含むかまたはそれからなる、請求項３５または３６に記載の使用。
【請求項３８】
（ｉ）インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬と、（ｉｉ）インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬から前記インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬のＮ末端のアミノ酸が２個少なくなったものとの混合物を作製する方法であって、宿主細胞において前記インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬の１番の位置の前での切断と３番の位置の前での切断を生じるリーダー配列を用いて（ｉ）を発現させるステップを含む方法。
【請求項３９】
（ｉ）インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬と、（ｉｉ）インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬から前記インスリン分泌促進薬またはインクレチン薬のＮ末端のアミノ酸が２個少なくなったものとの混合物であって、請求項３８に記載の方法によって得られるかまたは得ることが可能な、上記混合物。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図２−５】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１−２】
【図１−３】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図２−５】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２０１２−５２１９７１（Ｐ２０１２−５２１９７１Ａ）
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０１２９０（Ｐ２０１２−５０１２９０）
【出願日】平成２２年３月２４日（２０１０．３．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５３８０６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０８９３７
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（３９７００９９３４）グラクソ グループ リミテッド (832)
【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯ ＧＲＯＵＰ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２４日（２０１０．３．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５３８０６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０８９３７
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（３９７００９９３４）グラクソ グループ リミテッド (832)
【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯ ＧＲＯＵＰ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
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