虚血性および腎毒性障害の軽減および改善用ＮＧＡＬ
患者臓器に対する処置としての好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）の使用および虚血障害、虚血再灌流障害、毒素誘導性障害より選択された障害を処置、軽減または改善する方法における使用を開示する。本発明は、虚血、虚血再灌流または毒による腎臓等の臓器への障害を処置、軽減または改善するのに有効な量のＮＧＡＬを前記患者へ投与することを含む。シデロホアは前記ＮＧＡＬと共投与できる。本発明はまた、虚血または毒による患者臓器への障害に続くＮＧＡＬ分泌への反応を促進するシデロホアの投与に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は臓器における虚血性および腎毒性障害を軽減または改善する方法に関する。本発明はさらに虚血性および毒素誘導性障害または発作に関連する各種疾病を患う患者の処置に関する。本発明はさらに急性または慢性腎臓障害を患う患者の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
臓器への酸素流量が減少することを虚血というが、虚血が生じると、その影響を受ける細胞のうち実質上全ての細胞小器官および細胞内システムの構造と機能に、複雑な一連の現象を招くこととなる。虚血再灌流（血流の再開）障害は活性酸素種（ＲＯＳ）および活性窒素種（ＲＮＳ）の過剰産生を導き、その結果、細胞の機能または完全性の損失につながる、ミトコンドリアの酸化的リン酸化の変化、ＡＴＰの減少、細胞内カルシウムの上昇、およびプロテインキナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、およびヌクレアーゼの活性化等の一連の現象を招く酸化ストレスの原因となる。これまでに再灌流を伴う虚血によって誘導される炎症反応が大きな原因となって組織と臓器が損傷することが示されてきた。
【０００３】
虚血再灌流障害は臓器移植において深刻な問題である。なぜならば用いる臓器は身体から取り出され、血液源から分離され、その結果かなりの時間酸素と栄養が除かれるからである。今日の腎臓移植技術における重要な課題は、術後の急性尿細管壊死（ＡＴＮ）が原因となる比較的高い発症率の移植後機能障害（ＤＧＦ）にある。詳しくは、移植を行っている多くの病院で腎臓移植の約２０〜３５％にＤＧＦの影響が見られ、腎臓移植の手術直後における合併症としては最多である。ＤＧＦの発症率と定義は移植を行う病院によってさまざまであるが、発症した結果として最も多いのが、入院期間の延長、侵襲的医療行為の追加、患者および健康管理システムに対する費用の追加等である。ＤＧＦは個々の患者に影響するだけでなく、利用可能な臓器供給におこる枯渇の結果として、臓器調達および共有のためのインフラにも影響する。ＤＧＦはまた早期急性拒絶反応が発生する危険性を高め慢性拒絶反応による移植片の早期損失を増大させる。
【０００４】
現行の保存方法によると臓器保存が原因となる低温虚血は、移植後にＤＧＦを起こす主要な危険因子としてみなされてきた。腎臓の場合、２４時間を超える低温虚血時間はＤＧＦの危険性の増加と大いに関連する。１９６０年代半ばに、機械による灌流と低温沈降処理血漿に由来する溶液を用いることで腎臓の低温貯蔵が効果なものとなった。その後低温晶質液の使用を含む簡単な低温貯蔵法が導入された。初期の腎臓での成功以来、保存液は細胞膨張の抑制および代謝支援物の提供によって低音虚血障害を防ぐためにデザインされた完全合成の限定培地に発展した。初期の合成液であるウィスコンシン大学のラクトビオン酸をベースとした溶液（ＵＷ）が膵臓および肝臓用に使用されてきた。合成かつ血清無添加で調合された保存液の出現によって、臓器保存が可能となる質と期間が改善された。しかしこれにもかかわらず腎臓におけるＤＧＦの臨床データおよび腎細胞の構造と形態を含む他の問題点は、そのような溶液が虚血障害または発作の予防において完全には成功していないことを明らかに示している。
【０００５】
さらに、虚血性または腎毒性障害に次ぐ急性腎不全（ＡＲＦ）も、対症療法における大きな進歩にもかかわらず依然高い死亡率で、臨床腎臓学においては周知の問題でありながら完治しない恐れが残されたままである。何十年にも渡り多くの研究が行われ、持続性血管収縮、尿細管閉塞、細胞の構造および代謝の変化、および炎症反応のＡＲＦの病因としての役割を解明してきた。ＡＲＦの処理および処置は、ＡＲＦに対する初期マーカーの欠如だけでなく、虚血に対する腎臓の多面的な反応によって妨げられてきた。虚血性および腎毒性の腎臓障害に関する細胞学および分子生物学における最近の進歩は、近位尿細管細胞が、細胞極性の損失、アポトーシスおよび壊死による細胞死、生細胞の脱分化および増殖、および上皮表現型の再構築を含む複雑で一時的な一連の事象を経験することを示してきた。
【０００６】
虚血性または腎毒性による損傷の結果として、細胞は２つの異なった過程を経て死ぬことがある。アポトーシスすなわちプログラム細胞死（「細胞の自殺」）は、個々の細胞に影響する老化した細胞、損傷した細胞、または異常な細胞を取り除くための生理学的機構である。アポトーシスはエンドヌクレアーゼによって開始され、ＤＮＡが１８０〜２００塩基対の倍数で断片化するという特徴がある。アポトーシス細胞はタンパク質分解酵素または毒性酸素種を放出せずにマクロファージまたは近隣の細胞によって消化されるが、この過程に炎症が伴うことはない。これとは対照的に、壊死（「細胞の殺人」）は細胞集団に影響する病理学的過程で、局所的な組織崩壊、炎症、およびしばしば重篤な全身性の結果を導く。アポトーシスによる細胞死は、虚血、虚血性灌流、腎毒性、多嚢胞腎臓疾患、閉塞、および糸球体疾患を含む増加している一連の腎臓疾患において重要な役割を果たすことが現在示されている。そのため、アポトーシスの下方制御はいくつかの急性および慢性腎臓障害を改善する無類かつ強力な処置法を提供する。
【０００７】
血清クレアチニン値が次のいずれかであった場合、その患者は急性腎不全であるとみなされる。（１）血清クレアチニンのベースライン濃度が２．０ｍｇ／ｄＬ未満の場合で、少なくとも０．５ｍｇ／ｄＬの増加がある、（２）血清クレアチニンのベースライン濃度が２．０ｍｇ／ｄＬ以上の場合で、少なくとも１．５ｍｇ／ｄＬの増加がある、または（３）レントゲン撮影剤に曝された結果として、血清クレアチニンのベースライン濃度にかかわらず、少なくとも０．５ｍｇ／ｄＬの増加がある。
【０００８】
ｃＤＮＡマイクロアレイ技術は、虚血性および腎毒性障害直後の腎臓で、転写を強く誘導する好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）の同定を可能にした。腎臓でのＮＧＡＬの役割はまだ解明されていない。非特許文献１に示すとおり、ＮＧＡＬはタンパク質リポカリンファミリーの１つで、ヒト好中球の顆粒に見られる２５ｋＤａの分泌型糖タンパク質として特徴付けられる。リポカリン類は親油性の小物質を結合することが可能で、少なくとも２、３のリポカリンでは、例えば、ステロイド、ビリン、レチノイド、または他の脂質等の親油性リガンドを結合する機能を有した３次元のβバレル構造を共通に持つ。マウスおよびラット由来のマウス型（同族体）ＮＧＡＬは公知である。マウスでは、ＮＧＡＬはＮＧＡＬ，２４ｐ３タンパク質、ＳＩＰ２４、Ｐ２５、リポカリン２、およびウテロカリンとして示されている。ラットでのＮＧＡＬは、ＮＧＡＬまたはα２ミクログロブリンとして公知である。ヒトＮＧＡＬタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡがクローニングされ配列が決定されている。ヒトＮＧＡＬ遺伝子は、７つのエクソンと６つのイントロンを含み、やはりクローニングされ配列も決定されており、各種組織での発現が分析されてきた。ヒトＮＧＡＬ遺伝子は、１９または２０のアミノ酸シグナル配列を伴う１９７のアミノ酸でできたポリペプチドをコードし、成熟ＮＧＡＬポリペプチドには１７８のアミノ酸が含まれる。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｔｒｐモチーフ（成熟ヒトＮＧＡＬでアミノ酸番号４８〜５０）およびＴｈｒ−Ａｓｐ／Ａｓｎ−Ｔｒｙモチーフ（成熟ヒトＮＧＡＬでアミノ酸番号１３２〜１３４）が公知の全リポカリンに存在する。Ｘ線結晶解析を基に、これらのモチーフはリポカリン類に共通した第３βバレル構造において重要であることが示されてきた。ヒトＮＧＡＬ配列番号におけるシステイン残基９５と１９４は保存されており、分子内ジスルフィド結合を形成すると報告されている。ヒトＮＧＡＬは、成熟アミノ酸配列番号６５（ＮＧＡＬポリペプチド前駆体の番号で概ね８４または８５）に、唯一のＮグリコシル化部位（アスパラギン残基）を含む。
【０００９】
急性尿細管壊死（ＡＴＮ）の根底にあるといえるメカニズムは鉄の誤った局在化である。非結合鉄はＨ２Ｏ２のＯＨとＯＨ−への変換を触媒する（ハーバー・ワイス反応）、または活性型フェリル種またはパーフェリル種を形成することが可能だ。これらのイオンは、脂質、核酸、およびＤＮＡ骨格を含む多種類の分子に変異を誘発する。遊離ヘモグロビンおよびミオグロビンから尿または血中に放出された触媒性の鉄と過酸化脂質は、化学療法、虚血再灌流、移植性虚血、およびタンパク尿媒介尿細管損傷を含む多種類の急性腎不全において実証されてきた。動物に鉄を事前投与すると疾病は悪化し、逆に鉄キレート剤または細菌性シデロホアによる鉄のキレートは損傷を緩和する。非特許文献２に示すとおり、鉄触媒による損傷は腎臓機能障害の最も初期の現象の１つと考えられ、心臓および肝臓を含む他の臓器においても恐らく無視できないだろう。
【００１０】
細胞は鉄を担体タンパク質（トランスフェリン等）から細胞表面の鉄トランスポーター（二価金属トランスポーターＩ等）によって獲得する。細胞内の鉄は鉄反応性タンパク質（ＩＲＰ１、ＩＲＰ２等）、フェリチン複合体、およびヘムオキシゲナーゼＩの作用によって制御される。ＩＲＰ類は低酸素、酸化ストレス、およびリン酸化によって調整されるため、それらの活性の変化は、鉄が媒介する損傷から細胞を保護するフェリチン複合体の形成を制御することによって、虚血性疾患において重要な役割を果たしている可能性がある。フェリチンは鉄−リン−タンパク質の複合体で、約２３％鉄を含み、腸の粘膜で形成される。フェリチンは肝臓、脾臓、および骨髄等の組織における貯蔵型の鉄である。血液および筋肉にそれぞれあるヘモグロビンおよびミオグロビン分子は、酸素の細胞への輸送を触媒するために鉄の結合を必要とする。しかし触媒性の鉄は病因論において一番重要であるにかかわらず、虚血細胞または他の種類の組織損傷における鉄の輸送経路、貯蔵または代謝に関する他の側面はほとんど知られていない。
【００１１】
ＡＴＮを起こすには多くの経路があるにもかかわらず、多くの研究者が近位尿細管の細胞損傷全般に見られるメカニズムを発見してきた。これにはサイトカインの放出が含まれる。１つの案は、虚血性細胞と遊離のミオグロビンおよびヘモグロビン等の尿細管の毒がネフロンで局所的に高濃度の鉄を産生するということである。この鉄は触媒として活性があり酸素ラジカルを産生すると考えられている。鉄触媒による細胞損傷は病因となり、近位尿細管の機能不全につながることは、尿細管損傷が鉄キレート剤注入によって緩和されるという知見等によって証明される。鉄がメカニズムの中心となって虚血後の臓器機能障害を引き起こすという考えは、心臓虚血のインビトロモデルにおいて、鉄不含の細菌由来のシデロホアと呼ばれる鉄キレート剤を使用すると、虚血再灌流障害の影響が緩和されたという実験によっても裏付けされている。こうしたメカニズムはＡＴＮのさまざまな段階で見られる原則的な病因現象であると考えられる。鉄が触媒する損傷は腎臓の機能障害における最も初期の現象の１つであると考えられる。
【００１２】
どのように近位尿細管がＮＧＡＬを捕獲するのかは現在知られていない。実際、ほとんどのリポカリン類に対する受容体の明確な同定はなされていない。非特許文献３に示すとおり、おそらくレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）の再利用に必要なメガリンもまたＮＧＡＬ受容体である。非特許文献４に示すとおり、実際メガリンのノックアウトは尿中のＮＧＡＬの出現につながるが、これらの動物ではまた意外なことに、より高濃度のＮＧＡＬメッセージがあることが解っており、尿のＮＧＡＬは濾過負荷量を捉えられなかったのではなく、むしろ局所的な合成に由来するに違いないことを示唆している。このような不明瞭さにかかわらず、非特許文献５に示すとおり、ＮＧＡＬはＲＢＰおよびα−２ｕグロブリンリポカリン等の他のリポカリン類と同様に、メガリン経路によって細胞に侵入し、分解するためにリソソームに運ばれる。非特許文献６に示すとおり、これらのデータはメガリンを発現しない細胞系（胚性腎臓細胞等）およびタンパク質が分解されない場合におけるＮＧＡＬの輸送経路と対照をなす。トランスフェリンは細胞系では通常リサイクルされるが、非特許文献７に示すとおり、これもまた同様に近位尿細管におけるメガリン−クブリンを基にした経路によってリソソームへ運ばれた後分解される。このため、濾過後にＮＧＡＬはメガリンに捕獲され、近位尿細管によって分解され、リサイクルされないことを提示するのはもっともなことである。この仮説は、全長ＮＧＡＬが注入後しばらくしても血中に再び現れることがないという観察によって裏づけされる。
【非特許文献１】ジェルドセン（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ）その他著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー誌（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、１９９３年２６８巻、ｐ．１０４２５−１０４３２
【非特許文献２】モリ（Ｍｏｒｉ）その他著、「リポカリン−シデロホア−鉄複合体の細胞内輸送による腎臓の虚血再灌流障害の回復」、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション誌（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、２００５年１１５巻、ｐ．６１０−６２１
【非特許文献３】クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）その他著、米国腎臓学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．）、１９９９年１０巻（４）、ｐ．６８５−６９５
【非特許文献４】ヒルパート（Ｈｉｌｐｅｒｔ）その他著、キドニー・インターナショナル誌（Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．）、２００２年６２巻（５）、ｐ．１６７２−１６８１
【非特許文献５】ボーゴフ（Ｂｏｒｇｈｏｆｆ）その他著、アニュアル・レビュー・オブ・ファルマコロジー・アンド・トキシコロジー誌（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．）、１９９０年３０巻、ｐ．３４９−３６７
【非特許文献６】ヤン（Ｙａｎｇ）その他著、モレキュラー・セル誌（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ）、２００２年１０巻（５）、ｐ．１０４５−１０５６
【非特許文献７】コジラキー（Ｋｏｚｙｒａｋｉ）その他著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、２００１年９８巻（２２）、ｐ．１２４９１−１２４９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
腎臓等の臓器における例えば低温虚血障害等の虚血障害を予防、軽減、または改善するのに適した組成物および方法が依然求められている。かかる組成物は移植に用いられる臓器ばかりでなく患者自身の臓器処置にも有用だろう。薬剤投与後の患者において、例えば腎毒性等の細胞への毒性損傷を検出するのに使用できる新しいバイオマーカーも必要である。臓器移植によって引き起こされる組織および臓器への虚血再灌流障害と、臓器細胞の構造および代謝の変化とを処置し軽減する新しく改良された方法は、患者と同様に一般開業医にとっても明らかに有用で重要なことである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、および臓器における虚血、虚血再灌流、または毒素誘導性障害より一般的に選択した状態、障害または疾患を処置、軽減、改善、または予防する組成物および方法におけるＮＧＡＬの使用に関する。本発明はまた、前記状態、障害、または疾患を処置、軽減、改善、または予防するのに有効な量でＮＧＡＬを患者または被験者に投与する方法に関する。前記障害には、患者を虚血性腎臓障害、腎尿細管障害、または壊死またはアポトーシスにかかりやすくなる状態、処置、療法、または疾患に関連する腎臓障害が含まれ得る。前記障害には、急性（ショック、脳卒中、敗血症、外傷、感染症、炎症を含むがこれに限定されない）または慢性（高血圧、糖尿病、心疾患、狼瘡、感染症、炎症を含むがこれに限定されない）の腎臓の状態が含まれ得る。
【００１５】
本発明はまた、腎臓機能の衰退を改善するのに有効な量でＮＧＡＬを患者に投与することにより、患者の虚血性灌流障害によって誘導される腎臓のＮＧＡＬ機能の衰退を改善する方法を提供する。本局面によると、ＮＧＡＬ投与は虚血再灌流障害後の血清または血漿の高濃度クレアチニンを減少させる。ＮＧＡＬ投与量は細胞死を予防または改善するのに有効である。
【００１６】
本発明はさらに、腎臓の再上皮形成の促進または尿細管細胞の増殖に影響するのに有効な量で患者にＮＧＡＬを投与することで、急性または慢性の腎疾患における虚血、虚血性灌流、または毒素誘導性障害の後の腎臓の再上皮形成または尿細管細胞の増殖を促進する方法を提供する。
【００１７】
本発明の一実施形態は、急性腎不全（ＡＲＦ）を処置、軽減、予防、または改善する方法におけるＮＧＡＬの使用を含む。ＮＧＡＬは尿細管細胞の増殖を促進し、尿細管細胞のアポトーシスを軽減または改善することが証明されてきた。ここに開示する方法は、虚血再灌流または毒素誘導性障害によって誘導された患者の腎臓機能の衰退を改善し、さらにその患者における虚血障害に次ぐ急性腎疾患を処置、軽減、改善、または予防するために使用できる。
【００１８】
本発明はさらに、患者における移植臓器の移植後機能障害（ＤＧＦ）を軽減および／または処置する方法におけるＮＧＡＬの使用を提供する。いくつかの局面において、ＤＦＧは急性尿細管壊死（ＡＴＮ）によって引き起こされる。
【００１９】
本発明はまた、患者へ臓器を移植するための方法におけるＮＧＡＬの使用を提供する。前記方法を用いると、臓器移植の損失または急性拒絶反応を軽減または改善するのに有効な量でＮＧＡＬを１以上の（ｉ）臓器または（ｉｉ）提供者に投与することによって、臓器移植の損失または急性拒絶反応を軽減または改善できる。さまざまな局面において、前記臓器は腎臓、肝臓、心臓、脳、肺、胃、腸、結腸、膵臓、血管、膀胱、頚部、皮膚、またはこれらの一部もしくは切片より選択される。特定の局面において、前記臓器は死体または生体臓器提供者に属する。かかる状況において、ＮＧＡＬは前記臓器が患者に移植される前、最中、および／または後に患者に投与できる。前記臓器は死体臓器でもよく、かかる例において前記臓器は死体提供者から得られ、移植後の障害、発作、または臓器の損失を防ぐためにＮＧＡＬは死体または取り出した臓器に投与できる。前記臓器は生体臓器提供であってよく、かかる例において移植後の障害、発作、または臓器の損失を防ぐためにＮＧＡＬは取り出した臓器に投与できる。前記臓器は腎臓、肝臓、心臓、脳、肺、胃、膵臓、血管、膀胱、頚部、皮膚、またはこれらの一部もしくは切片であってよく、本発明の特定の局面において、前記臓器は腎臓である。
【００２０】
本発明はまた、オキシダント媒介アポトーシスが尿細管の細胞死の重要な原因である場合における、死体および生体の提供者の腎臓移植に関連したＮＧＡＬの使用を提供する。通常の合併症である急性腎不全（ＡＲＦ）に加えて、移植された腎臓における虚血再灌流障害は移植後機能障害（ＤＧＦ）を導くことが知られており、これは移植片の損失および急性拒絶反応の危険性を有意に増加させる。本明細書において述べるように、ＮＧＡＬは臓器移植に関連した虚血性の有害効果を軽減または改善する方法において採用される。一実施形態において、ＮＧＡＬは移植臓器の低温貯蔵中での使用等、死体腎臓移植の特徴であるＤＧＦを改善するために臓器保存液に添加できる。かかる方法によると、ＮＧＡＬは虚血性発作後に投与された場合にも少なくとも部分的に有効である。前記方法は患者の暗澹たる予後に通常関連する臨床的に関連のある既存の有害現象であるＡＲＦ等の確定した虚血状態に必要とされている新規治療的処置法を有利に提供する。臓器または移植片の移植における患者の虚血障害に関連するＤＧＦを阻止または改善する方法には、（ｉ）移植された臓器または移植片、（ｉｉ）移植された臓器の提供者、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方に対し、ＤＧＦまたは移植された臓器の損失もしくは急性拒絶反応を阻止または改善するのに有効な量でＮＧＡＬを注入、またはＮＧＡＬと接触することが含まれる。非制限に例示すると、移植用の前記臓器または移植片は、腎臓、心臓、脳、肺、胃、腸、結腸、膵臓、血管、膀胱、頚部、皮膚、またはそれらの一部もしくは切片より選択される。特定の局面では、前記臓器は腎臓である。さらに具体的には、移植された腎臓は死体または生体の提供者からの腎臓である。さらに、ＮＧＡＬは臓器保存液の一成分であり、例えば、ＮＧＡＬ含有臓器保存液は臓器移植の低温貯蔵中に使用される。
【００２１】
本発明はさらに、患者を虚血性腎臓障害にかかりやすくする可能性がある状態、処置、療法、または疾患に関連する腎臓障害を軽減、改善、予防、または保護する方法を提供する。前記方法には、患者の状態、処置、療法、または疾患に関連する腎臓障害を軽減、改善、予防、または保護するのに有効な量のＮＧＡＬを患者に投与することが含まれる。状態、処置、または療法を例示すると、造影剤処置、抗体処置、抗生剤処置、臓器移植、腎臓移植、死体腎臓移植、心臓処置、手術後の心臓処置、または中枢神経系処置を含むがこれに限定されない。本局面における疾患を例示すると、感染症、細菌感染症、急性腎疾患、慢性腎疾患、虚血再灌流障害、ショック、外傷、敗血症、脳卒中、心再灌流障害、心肺バイバス、開心術、および腹部手術を含むがこれらに限定されない。
【００２２】
本発明はまた、患者における腎尿細管の障害または壊死もしくはアポトーシスを処置、軽減、または改善する方法を提供し、治療上有効量のＮＧＡＬを患者へ投与することを含む。本局面によると、前記患者は例えば、急性腎疾患、慢性腎疾患、虚血再灌流障害、臓器移植、毒素誘導性障害、虚血、腎臓移植、ショック、外傷、敗血症、脳卒中、心再灌流障害、心肺バイパス後の腎尿細管障害、開心術後の腎尿細管障害、腹部手術後の腎尿細管障害、感染症、抗生剤処置、抗体処置、または造影剤処置等に影響される可能性がある。本方法では、ＮＧＡＬはまた腎臓の近位尿細管細胞を直接標的にしているため、腎尿細管細胞の増殖を促進するように機能し、その結果として腎尿細管障害または壊死もしくはアポトーシスを軽減または改善できる。
【００２３】
本発明はまた、毒による臓器への障害を処置、軽減、または改善するのに有効な量でＮＧＡＬを患者に投与することによって、患者の臓器への腎毒性障害を含む毒素誘導性障害を処置、軽減、または改善する方法を提供する。別の局面において、毒素誘導性障害を軽減または改善する方法には、ＮＧＡＬおよび患者に有害な治療用化合物の両方を共投与することを含み、前記ＮＧＡＬは、前記臓器への処置の有害効果を軽減または改善するのに有効な量で投与する。
【００２４】
本発明はまた、他の急性（ショック、脳卒中、敗血症、外傷、感染症、炎症を含むがこれに限定されない）および慢性（高血圧、糖尿病、心疾患、狼瘡、感染症、炎症を含むがこれに限定されない）腎臓障害を処置、軽減、または改善する方法を提供する。
【００２５】
本明細書において開示される本発明の各種方法において、ＮＧＡＬは、１種類以上の治療薬、例えば血管拡張剤または酸素供給剤と共に投与できる。さらに、ＮＧＡＬは、静脈注射または非経口投与を非制限に含む各種投与法によって担体、希釈剤、または添加剤からなる生理的に受容できる組成物において投与できる。さらに、ＮＧＡＬは、本明細書に記載するとおり虚血または腎毒性、臓器移植、または腎尿細管の発作、損傷、もしくは障害の前後および最中に投与できる。
【００２６】
本発明はまた、試験物質が腎臓障害を引き起こす可能性があるという示唆に従い、（ａ）マウス等の哺乳類モデルに腎毒性障害を引き起こす試験物質の投与、および（ｂ）その試験物質投与後に、前記哺乳類モデルの尿または血漿サンプル中の好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）の有無を決定することによって、腎毒性を誘導する可能性に関して、治療法を評価する方法を提供する。本方法の特定の局面において、ＮＧＡＬは前記試験物質の投与後約３時間以内に尿または血漿中に検出される。
【００２７】
本発明はまた、哺乳類の臓器への障害を処置、軽減、改善、予防するのに使用するための組成物に関係し、治療上有効量のＮＧＡＬまたはその誘導体またはアナログを含む。さらに、前記組成物は一般的に１：１のモル比でのシデロホアを含み、例えば、ＮＧＡＬとシデロホアの複合体である。前記組成物は本明細書に開示する任意の方法において使用が可能である。
【００２８】
本発明はまた、臓器での虚血、虚血再灌流、または毒素誘導性障害を含む虚血性または毒による状態および疾患を処置、軽減、改善、または予防する組成物と方法においてＮＧＡＬに関連したシデロホアの使用に関する。
【００２９】
本発明の一実施の形態において、ＮＧＡＬおよびシデロホアは、臓器での虚血、虚血再灌流、または毒素誘導性障害の処置、軽減、改善、または予防を促進するのに有効は量で、医薬組成物として投与される。
【００３０】
本発明はまた、内因性ＮＧＡＬによる臓器障害の処置、予防、改善、および軽減の促進のために、患者への投与において使用するためのシデロホアを含む医薬組成物に関する。別の一実施の形態において、一般的にＮＧＡＬとシデロホアの複合体化合物として共投与するための方法が提供される。別の一実施の形態において、内因性ＮＧＡＬの分泌によって開始される腎臓の再上皮形成の促進または尿細管細胞の増殖に正の影響があるように有効な量で、シデロホアが患者に投与される。
【００３１】
特に、本発明は、内因性ＮＧＡＬによる患者の移植後機能障害（ＤＧＦ）および臓器または移植片の移植拒絶反応の軽減または改善を促進する方法を提供し、ＤＧＦまたは移植された臓器の損失もしくは急性拒絶反応の軽減または改善を促進するのに有効な量で、（ｉ）移植された臓器または移植片、（ｉｉ）移植臓器の提供者、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方にシデロホアを投与するステップを含む。本方法は前記臓器への障害を処置、軽減、改善、または予防するのに有効な量でシデロホアを投与することを含む。
【００３２】
本発明の一実施の形態において、ＮＧＡＬ：シデロホア複合体は臓器保存液への添加が可能で、死体腎臓移植の特徴であるＤＧＦを改善するための移植臓器の低温貯蔵中に使用される。さらに別の一実施の形態において、緩衝液中に溶かしたシドロホア単独での臓器保存液への添加が可能で、死体腎臓移植の特徴であるＤＧＦを改善するための移植臓器の低温貯蔵中に使用される。
【００３３】
本発明はさらに、ＮＧＡＬまたはその誘導体もしくはアナログの投与によって、虚血または毒による損傷を受けた臓器における細胞内外の鉄を操作するための方法を提供する。本方法はまた、虚血または毒による臓器の損傷を処置、軽減、改善、またはさらに予防するのに有効な量で、鉄結合化合物、鉄結合化合物に対する補因子、またはシデロホアを投与することを含んでもよい。一般的に、前記虚血または毒によって損傷した臓器は腎臓である。
【００３４】
別の一実施の形態において」、本発明は治療上有効量のＮＧＡＬを含むための第一容器からなる治療キットを提供する。前記第一容器には少なくとも1本のバイアルと、少なくとも1本の試験管と、少なくとも１個のフラスコと、少なくとも1本の瓶とを含んでもよい。本キットはまた、少なくとも１組成物が入れられる第２容器と、および市販用にこれらの容器を共に固定する手段とを含んでもよい。本キットはまた、滅菌済みで薬剤として受容できる緩衝液または他の希釈液を含むための第３容器を含んでもよい。前記第一容器はシリンジであってもよい。前記容器を固定する手段は、前記容器が保持される射出または吹込み成形によるプラスチック枠であってもよい。または、前記バイアルは静脈内薬剤輸送システムに前記組成物を直接導入できるような方法で用意されてもよい。
【００３５】
さらに、本発明の局面、特徴、および利点は、添付図面と合わせて本発明の詳細な説明を一読し検討することで、深く理解されるだろう。
【００３６】
図面の簡単な説明
図１は、（図示のとおり）決められた量の組換え精製ＮＧＡＬのクーマシーブルー（ＣＢ）と高感度化学発光（ポリクローナルＮＧＡＬ抗体によるＥＣＬ）分析を示す。
【００３７】
図２は、ポリクローナルＮＧＡＬ抗体を用いた、注入１時間後の非虚血対照動物からの腎臓、または１時間もしくは３時間後の虚血性腎臓の免疫蛍光染色を示す。
【００３８】
図３は、ＮＧＡＬ投与１時間以内の非虚血（ＮＩ）および虚血（Ｉ）動物からの尿サンプル中ＮＧＡＬを検出するためのウェスタンブロットを示す。
【００３９】
図４は、非虚血対照マウス、生理食塩水前処理虚血マウス、または虚血の１時間前、最中、または１時間後にＮＧＡＬで処理した虚血マウスからの腎臓をヘマトキシリンエオシンで染色した切片を示す。
【００４０】
図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃは、生理食塩水で前処理した、または虚血の１時間前、最中、１時間後にＮＧＡＬで処理した虚血マウスからの腎臓の組織切片のスコアを示す。本切片は、任意の０から４のスケールを用いて尿細管拡張（図５Ａ）、尿細管円柱（図５Ｂ）、および尿細管細胞壊死（図５Ｃ）について分析しスコアを付けた。
【００４１】
図６は、非虚血対照マウス、または生理食塩水で前処理した虚血マウスにおいて測定された血清クレアチニン（Ｐｒｅ Ｓａｌ）、または虚血障害の１時間前（Ｐｒｅ ＮＧＡＬ）、最中（Ｄｕｒ ＮＧＡＬ）、１時間後（ＰｏｓｔＮＧＡＬ）にＮＧＡＬ処理した虚血マウスの虚血２４時間後において測定された血清クレアチニンを示す。
【００４２】
図７は、非虚血対照マウスの代表的な切片、または生理食塩水で前処理した虚血マウス、もしくは虚血障害の１時間前、最中、１時間後にＮＧＡＬで処理した虚血マウスの虚血２４時間後の代表的な切片をＴＵＮＥＬ染色した結果を示す。矢印は、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）染色と比べた、低倍率および高倍率でのアポトーシスの特徴である密で断片化した濃い核の染色を指している。
【００４３】
図８は、非虚血対照マウスの腎臓、または生理食塩水で前処理した虚血マウス、もしくは虚血障害の１時間前、最中、１時間後にＮＧＡＬで処理した虚血マウスの虚血２４時間後の腎臓におけるアポトーシスの定量（上）および増殖（中）を示す。
【００４４】
図９は、非虚血対照マウスの、または生理食塩水で前処理した虚血マウス、もしくは虚血障害の１時間前、最中、１時間後にＮＧＡＬで処理した虚血マウスの虚血２４時間後の腎臓において算出された増殖：アポトーシスの比を示す。
【００４５】
図１０は、尿のみ、尿およびＮＧＡＬ混合（尿＋Ｎｇａｌ）、尿およびＮＧＡＬ：シデロホア混合（尿＋Ｎｇａｌ：Ｓｉｄ）、血漿のみ、緩衝液のみ、緩衝液およびＮＧＡＬ混合（緩衝液＋Ｎｇａｌ）、緩衝液およびＮＧＡＬ：シデロホア混合（緩衝液＋Ｎｇａｌ：Ｓｉｄ（１））、第二緩衝液およびＮＧＡＬ：シデロホア混合（緩衝液＋Ｎｇａｌ：Ｓｉｄ（２））、シデロホアが鉄で飽和された第三緩衝液およびＮＧＡＬ：シデロホア混合（緩衝液＋Ｎｇａｌ：Ｓｉｄ：Ｆｅ）において検出される５５Ｆｅの結合を示す。
【００４６】
図１１Ａは、健康な被験者（正常）、または急性腎臓壊死（ＡＴＮ）もしくは慢性腎不全（ＣＦＲ）を患う被験者、または腎臓疾患がないと診断された肝硬変、血色素沈着症、または膵癌を患う被験者（その他）からのヒト尿サンプルにおけるＮＧＡＬタンパク質の免疫ブロットを示す。モノクローナル抗ヒトＮＧＡＬ（Ｍｏ）およびポリクローナル抗マウスＮＧＡＬ（Ｐｏ）抗体は、組換えおよびヒト固有のＮＧＡＬおよびＮＧＡＬ標準物質を認識する。
【００４７】
図１１Ｂは、ＮＧＡＬ標準物質と比較した、健康な被験者（正常）、または急性腎臓壊死（ＡＴＮ）もしくは慢性腎不全（ＣＦＲ）を患う被験者、または腎臓疾患がないと診断された肝硬変、血色素沈着症、または膵癌を患う被験者（その他）からのヒト血清サンプルにおけるＮＧＡＬタンパク質の免疫ブロットを示す。
【００４８】
図１１Ｃは、健康な被験者（正常）、または急性腎臓壊死（ＡＴＮ）もしくは慢性腎不全（ＣＦＲ）を患う被験者からの尿中のＮＧＡＬタンパク質濃度の量的比較を示す。ＡＴＮはさらに非敗血症と敗血症の群に分類した。
【００４９】
図１１Ｄは、健康な被験者（正常）、または急性腎臓壊死（ＡＴＮ）もしくは慢性腎不全（ＣＦＲ）を患う被験者からの血清中のＮＧＡＬタンパク質濃度の量的比較を示す。ＡＴＮはさらに非敗血症と敗血症の群に分類した。
【００５０】
図１１Ｅは、５０、５、および１ｎｇの標準ＮＧＡＬタンパク質と、ＡＴＮ障害マウスおよび偽処理対照マウスの尿ＮＧＡＬの免疫ブロットを示す。
【００５１】
図１２Ａは、健康なヒト腎臓（正常）におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色を示す。
【００５２】
図１２Ｂは、健康なヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色を示す。
【００５３】
図１２Ｃは、健康なヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色を示す。
【００５４】
図１２Ｄは、敗血症による虚血性ＡＴＮ（虚血性ＡＴＮ）のヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【００５５】
図１２Ｅは、嘔吐および下痢が原因の血液量減少による虚血性ＡＴＮのヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【００５６】
図１２Ｆは、心疾患による虚血性ＡＴＮのヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【００５７】
図１２Ｇは、ビスホスフォネートが原因の腎毒性による毒性ＡＴＮ（毒性ＡＴＮ）のヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【００５８】
図１２Ｈは、セファロスポリンの毒性が原因の腎毒性による毒性ＡＴＮのヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【００５９】
図１２Ｉは、ヘモグロビン尿症が原因の腎毒性による毒性ＡＴＮのヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【００６０】
図１２Ｊは、ＮＧＡＬが半月体に弱く発現する、糸球体疾患のヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色を示す。
【００６１】
図１２Ｋは、ＮＧＡＬがネフローゼの近位尿細管で弱く発現する、糸球体疾患のヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色を示す。
【００６２】
図１３Ａは、偽処理（正常）、虚血（ＡＴＮ）、およびＮＧＡＬ処理ＡＴＮ障害（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）の腎臓の組織切片を示す。尿細管の核の損失がＡＴＮでは見られるが、皮質（中）および髄質（下）の尿細管内円柱と共に、対照またはＡＴＮ＋Ｎｇａｌ切片（上）、では見られない。ＮＧＡＬ前処理は結果的に皮質尿細管を保護するが、残りの皮質髄質円柱には影響しなかった。
【００６３】
図１３Ｂは、管腔円柱およびＮＧＡＬでの前処理による皮質尿細管の回復をＰＡＳ染色で強調した、虚血（ＡＴＮ）、およびＮＧＡＬ処理ＡＴＮ障害（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）腎臓の組織切片を示す。
【００６４】
図１３Ｃは、ＮＧＡＬによる虚血性皮質の回復を示す、偽処理（偽）、虚血（ＡＴＮ）、およびＮＧＡＬ処理ＡＴＮ障害（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）腎臓のジャブロンスキースコアを示す。
【００６５】
図１４Ａは、腎臓切片のＮカドヘリン染色を示す。虚血再灌流（ＡＴＮ）ではほとんど見られないが、ＮＧＡＬが投与された場合（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）は回復し検出される。
【００６６】
図１４Ｂは、虚血再灌流動物および偽処理動物におけるＮカドヘリン断片（矢印）、およびＮＧＡＬ処理動物での断片抑制によって示される、虚血（ＡＴＮ）と比較した、ＮＧＡＬ処理（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）による全長Ｎカドヘリンタンパク質濃度の回復を示す。ＧＡＰＤＨは負荷対照である。
【００６７】
図１４Ｃは、ＮＧＡＬ前処理によって軽減された虚血再灌流マウス（Ｉ／Ｒ）におけるＴＵＮＥＬ陽性アポトーシス細胞（蛍光）の尿細管を示す。トップロールは核対比染色である。
【００６８】
図１４Ｄは、偽処理対照群（偽）、虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）、およびＮＧＡＬ処理虚血再灌流（＋Ｎｇａｌ）マウスにおけるアポトーシス様核を含む尿細管の比率の定量分析を示す。
【００６９】
図１４Ｅは、偽処理（偽）、虚血再灌流（ＡＴＮ）、またはＮＧＡＬ処理の虚血再灌流（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）の腎臓におけるヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）発現の免疫ブロットを示す。組換えＨＯ−１（ＨＯ−１）およびラット皮質は比較用である。ＧＡＰＤＨは負荷対照である。
【００７０】
図１５は、ＮＧＡＬ１００μｇをマウスに腹腔内注射した後の血液および尿中ＮＧＡＬタンパク質のクリアランスの免疫ブロットを示す。
【００７１】
図１６Ａは、近位尿細管（下）で見られるが、糸球体または髄質（上）では見られない、大きな小胞に局在する蛍光標識（Ａｌｅｘａ５６８）ＮＧＡＬを示す。非結合蛍光色素は腎臓を標識しなかった。
【００７２】
図１６Ｂは、近位尿細管のＳ１およびＳ２部位でのＦＩＴＣデキストランと共に局在するＡｌｅｘａ５６８−ＮＧＡＬを示す。
【００７３】
図１６Ｃは、注入後１時間および５時間の腎臓に見られるＮＧＡＬの全長および１４ｋＤａ断片を示す１２５Ｉ−ＮＧＡＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離。
【００７４】
図１６Ｄは、５５Ｆｅ負荷シデロホア−ＮＧＡＬの腹腔内注射１時間後の腎臓のオートラジオグラフを示す。放射活性減衰は皮質で検出され、近位尿細管細胞の腔内付近に関連している。
【００７５】
図１６Ｅは、髄質で放射活性が検出されなかった、５５Ｆｅ負荷シデロホア−ＮＧＡＬの腹腔内注射１時間後の腎臓のオートラジオグラフを示す。
【００７６】
図１７Ａは、３０分間虚血させたマウスでの血漿クレアチニンを示す。最初のグラフは、虚血１５分前または虚血後１時間以内に用いた場合にＸＬ−１細菌（シデロホアを含有）由来のホロＮＧＡＬ（≧１μｇ）が腎機能を回復させることを示す。しかし投与が遅れた場合、ＮＧＡＬは無効である。第二グラフは、ＢＬ２１細菌（シデロホア不含）由来のアポＮＧＡＬが最小限の活性しか持たないが、エンテロチェリンを添加すると保護的に働く。鉄不含（アポＮＧＡＬ：Ｓｉｄ）および鉄含有シデロホア（アポＮＧＡＬ：Ｓｉｄ：Ｆｅ）は共に保護効果を持つ。対照的に、ガリウム含有複合体（アポＮＧＡＬ：Ｓｉｄ：Ｇａ）は、ＤＦＯの単独投与またはシデロホア不含（Ｓｉｄ）と同様に無効であった。近位尿細管によって濾過され再吸収されるリポカリンであるレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）は無効であった。
【００７７】
図１７Ｂは、ＮＧＡＬの免疫沈降製剤を示す。ＮＧＡＬ：Ｓｉｄはエンテロチェリンを含むが鉄は含まない。ＮＧＡＬ：Ｓｉｄ：Ｆｅはシデロホアと鉄を含む。
【００７８】
図１８Ａは、尿中に鉄結合補因子が存在することを示す。緩衝液は５５Ｆｅ（タンパク質不含）、アポＮＧＡＬ、アポＮＧＡＬ＋シデロホア、またはアポＮＧＡＬ＋シデロホア＋非標識鉄と混合する。一連の洗浄の後、５５ＦｅはアポＮＧＡＬ＋シデロホアによって保持されるが、アポＮＧＡＬまたは鉄飽和シデロホアと結合したアポＮＧＡＬによっては保持されない。このことは不飽和シデロホアがＮＧＡＬによる５５Ｆｅの保持に必要なことが示している。
【００７９】
図１８Ｂは、示すように、尿（＜３，０００Ｄａ）が５５ＦｅまたはアポＮＧＡＬと混合され、その後１０ＫＤａ膜上で３回洗浄すると、アポＮＡＧＬ＋尿が５５Ｆｅを保持することを示す。５５Ｆｅ保持は過剰なクエン酸鉄（Ｆｅ）の添加により遮断される。活性は鉄飽和エンテロチェリン（Ｓｉｄ：Ｆｅ）によっても遮断される。
【００８０】
図１９は、生体（図０と１）または死体（図２と３）腎臓移植後１時間以内に得た腎臓生検を示す。切片はＮＧＡＬ抗体で染色した。ＮＧＡＬ発現は長期の虚血期間を経た死体群で有意に増加した。
【００８１】
図２０は、生体（ＬＲＤ、ｎ＝４）または死体（ＣＡＤ，ｎ＝４）腎臓移植の移植後２時間以内に得た尿サンプルのＮＧＡＬ抗体プローブに用いたウェスタンブロットを示す。尿中のＮＧＡＬ発現は手術前にはなかった。ＮＧＡＬ発現はＬＲＤ群よりもＣＡＤ群の方が有意に増加した。
【００８２】
図２１は、ＬＲＤとＣＡＤを比較した尿ＮＧＡＬのウェスタンブロットによる定量分析を示し、ＣＡＤが有意な発現増加を示している。
【００８３】
図２２は、低温虚血の時間に関する、ＣＡＤ移植の２時間後に得られた尿ＮＧＡＬの相関を示す。尿ＮＧＡＬの発現度合いは虚血時間と相関する。
【００８４】
図２３は、手術後２〜４日に測定した最大血清クレアチニンに関する、ＣＡＤ移植の２時間後に得られた尿ＮＧＡＬの相関を示す。尿ＮＧＡＬの発現度合いは最大血清クレアチニンと相関する。
【００８５】
図２４は、独立した１０本の標準曲線から得られた直線関係に関するＮＧＡＬのＥＬＩＳＡの標準曲線を示す。
【００８６】
図２５は、心肺バイパス（ＣＰＢ）後ＡＲＦを術中に発症した患者の経時的血清ＮＧＡＬ測定値を示す（ｎ＝１０）。
【００８７】
図２６は、ＡＲＦ（四角、ｎ＝１０）を発症したＣＰＢ患者と、手術後何もない患者（菱形、ｎ＝３０）を比べた経時的血清ＮＧＡＬ濃度の平均値±ＳＤを示す。
【００８８】
図２７は、ＣＰＢ後にＡＲＦを発症したＣＰＢ患者の経時的尿ＮＧＡＬ測定値を示す（ｎ＝１１）。
【００８９】
図２８は、ＡＲＦ（菱形、ｎ＝１１）を発症したＣＰＢ患者と、術後何もない患者（四角、ｎ＝３０）を比べた経時的尿ＮＧＡＬ濃度の平均値±ＳＤを示す。
【００９０】
図２９は、ＣＰＢ２時間後の尿ＮＧＡＬ濃度とＣＰＢ時間との相関を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９１】
定義
本明細書で使用されるとおり「臓器」という用語は、ヒトを含む哺乳類等の生物におけるある特定の機能または機能群を働かせる細胞および組織から成る生物学的に分化した構造を意味する。代表的な臓器には、腎臓、肝臓、心臓、骨、軟骨、皮膚、肺、血管、膀胱、頚部、胃、腸、膵臓、小腸、結腸、脳、およびそれらの一部または切片を含むがこれに限定されない。
【００９２】
本明細書で使用されるとおり「腎臓障害」または「腎疾患」という用語は、急性（虚血、虚血再灌流、腎毒性、ショック、脳卒中、敗血症、外傷、感染症、炎症を含むがこれに限定されない）または慢性（高血圧、糖尿病、心疾患、狼瘡、感染症、炎症が含むがこれに限定されない）の腎臓の障害または状態を含むものとする。
【００９３】
「薬剤として受容できる」、「薬理学的に受容できる」および「生理学的に受容できる」という文言は、例えばヒト等の動物に投与した場合に、有害現象、アレルギー反応、または他の不適当な反応を起こさない分子要素および組成物を示す。
【００９４】
本明細書で使用されるとおり「薬剤として受容できる担体」という文言は、その生物学的な効果に影響せずに、１つの臓器または体の一部から、別の臓器または体の一部へ、本発明の組成物を輸送または運搬することに関係する、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、添加剤、溶剤、またはカプセル等の物質、組成物または賦形剤を意味する。各担体は、かかる組成物の他の成分と適合し、被験者に対して無害であるという意味で「受容できる」ようにすべきである。薬剤として受容できる担体としての役目を果たすことのできる物質には、例えば、当業者が通常知っていると思われもので、あらゆる全ての溶剤、分散媒、被覆剤、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗細菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬剤、薬剤安定化剤、ゲル、結合剤、賦形剤、壊変剤、滑剤、甘味料、香料、色素、それらの類似物質や組み合わせが含まれるがこれに限定されない。ＮＧＡＬ、シデロホア、またはそれらの複合体もしくは他の選択できる活性剤または有効成分と不適合な場合を除いて、従来のいかなる担体も治療または医薬組成物において、その使用が考えられる。
【００９５】
「治療上有効量」という文言は、動物または患者等の受容者において、本明細書に記載される処置に特に関係して、有益な結果を出すのに有効な、ＮＧＡＬ、シデロホア、またはそれらの複合体もしくは他の選択できる活性剤または有効成分の量を示す。かかる量は公開されている文献を調べたり、インビトロ試験または健康な動物での代謝実験を行ったりすることで、最初に決定できる。臨床で使用する前に、一般的に広く受容されている処置すべき特定疾患の動物モデルでの確認実験を行うことが有効である。ある特定の実施の形態で用いる一般的な動物モデルはげっ歯類すなわちネズミ科である。かかるモデルは使用するのに経済的であり、特に、得られる結果は臨床での予測値として広く受け入れられる。
【００９６】
ＮＧＡＬに関係する「誘導体（類）」という用語は、虚血、腎尿細管壊死、腎毒性、虚血再灌流障害等の特性への望ましい効果をさらに保持する化学的に修飾されたＮＧＡＬ化合物、物質、阻害剤、または刺激剤を示す。かかる誘導体には親分子の１以上の化学的部分の添加、除去、または置換が含まれてもよい。かかる化学的部分には、水素等の元素、ハロゲン化合物、またはメチル基等の分子群が含まれるがこれに限定されない。かかる誘導体は当業者が知るいかなる方法によっても調製できる。かかる誘導体の特性は当業者が知るいかなる方法または記載されたいかなる方法によっても望ましい特性であるかを試験できる。
【００９７】
「アナログ」という用語は、当業者が理解するとおり構造的に等価または類似の物質を含む。
【００９８】
「患者」、「受容者」、または「被験者」は、温血動物等の動物または生物を示す。動物の例には、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ネコ、イヌ、げっ歯類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、および雌ウシ等の哺乳類が含まれるがこれに限定されない。本発明は特にヒトの患者および被験者に適している。
【００９９】
「阻害剤」とは、細胞内または細胞からのタンパク質もしくは生物化合物の活性、機能、産生、もしくは分泌、またはｍＲＮＡの翻訳における測定可能ないかなる減少をも作り出す化合物、物質または薬剤を意味する。
【０１００】
移植された臓器に関して本明細書で使用されるとおり、虚血障害または虚血再灌流障害の「軽減」とは、（ｉ）例えば保存液中もしくは死体にある臓器、または（ｉｉ）患者に移植された臓器の損傷の測定可能ないかなる減少、縮小、または反転をも示す。同様に、「軽減する」とは、保存される臓器、または患者に移植される臓器の損傷、障害、または発作の測定可能ないかなる減少、縮小、または完全な阻害をも示す。
【０１０１】
本明細書で使用されるとおり「ａ」および「ａｎ」は「１またはそれ以上」を示す。さらに具体的には、組み合わせまたは対象物を採用する方法を請求する請求項における「含む」「有す」または他の非制限語句の使用は、「１またはそれ以上の対象物」が、請求された方法または組み合わせにおいて採用できることを示す。
【０１０２】
本発明は、腎臓等の臓器の虚血障害、虚血性灌流障害、および毒素誘導性障害を処置、軽減、または改善する方法において使用する好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンすなわちＮＧＡＬを提供する。本発明はまた、急性腎臓障害（ショック、外傷、脳卒中、敗血症、感染症、炎症、結石、または手術を含むがこれに限定されない）および慢性腎臓障害（高血圧、糖尿病、心疾患、、狼瘡、炎症、糸球体腎炎、および間質性腎炎を含むがこれに限定されない）を処置、軽減、または改善する方法でのＮＧＡＬの使用を含む。理論的拘束力は望まないものの本発明によると、ＮＧＡＬ投与は、尿細管細胞死すなわちアポトーシスを制限し、再上皮形成すなわち虚血再灌流障害後の生細胞の脱分化および増殖ならびに上皮表現型の再樹立を含む腎臓の虚血後の生細胞の回復を促進するよう、尿細管の細胞死に影響することが解っていた。ＮＧＡＬ投与はまた、虚血障害後の血清および血漿のクレアチニン濃度の上昇を減少させることも証明されている。
【０１０３】
ヒトＮＧＡＬは２５ｋＤａのタンパク質で、ヒト好中球由来のゼラチナーゼと共有結合し、腎臓、気管、肺、胃、および結腸を含む数種のヒト組織において非常に低いレベルで発現する。ＮＧＡＬ発現は刺激を受けた上皮によって分泌され強く誘導される。例えば、ＮＧＡＬ濃度は、急性細菌感染患者の血清、喘息または慢性閉塞性肺疾患患者の喀痰、および気腫肺からの気管支液中で上昇する。ＮＧＡＬはまた、虚血障害直後の腎臓において最大に誘導される遺伝子の１つである。かかるデータは遺伝子チップによるｍＲＮＡの解析に由来し、損傷を受けた腎臓がＮＧＡＬを合成していることを示す。他の研究では、炎症疾患を持つ患者の血清において濃度の上昇が検出されている。そのため、我々は慢性状態の腎臓疾患と比較したヒトのＡＴＮにおけるＮＧＡＬの発現率を評価した。ＮＧＡＬは臨床的にＡＴＮと定義された場合に発現が多くなり、ヒト腎臓生検の近位尿細管に出現する。ＮＧＡＬはまた、量は少ないが慢性腎疾患のいくつかの状態においても腎臓で発現する。ＡＴＮを起こす虚血または虚血再灌流のモデルマウスもまたＮＧＡＬを高レベルに発現する。ＮＧＡＬをマイクログラムの量で注入すると、血漿クレアチニンおよび腎臓の組織分析によって測定されるＡＴＮに対して劇的な保護を示した。腎臓の保護は細菌のシデロホアを含むＮＧＡＬタンパク質が近位尿細管に到達するためである。
【０１０４】
ＮＧＡＬを含む薬剤の組成物または成分の調製は、レミントン薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）第１８版、マック印刷社（Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）１９９０年刊に例示されるとおり本発明の観点から当業者に公知である。さらに、動物（例えばヒト）への投与については、調製法が、米国食品医薬局の生物学基準で要求される無菌性、発熱原性、一般的な安全性と純度の基準に適合しなければならないことが理解されるだろう。
【０１０５】
以前はＮＧＡＬの役割は不明だったが、今では腎形成中の鉄輸送タンパク質であると同定されている。シデロホアおよび鉄に対する高い親和性にかかわらず、ＮＧＡＬは細胞質に鉄を運搬できる。ＮＧＡＬから鉄が輸送されるためのメカニズムとして考えられるのは細胞の飲食作用である。蛍光ＮＧＡＬタンパク質は飲食作用を受けるが、この作用は４℃で遮断される。鉄がＮＧＡＬから放出されるにはこれらの小胞の酸性化が必要であるが、これは酸性化を阻害する薬剤が鉄の取り込みを遮断することから解る。さらに、細胞質で蛍光の鉄リポーターを発現する細胞へＮＧＡＬを添加すると、鉄の活性化によるリポーター発現の変化を刺激するが、このことはＮＧＡＬが鉄の提供者であることを明らかに示している。ＮＧＡＬの飲食作用の経路は培養細胞におけるホロトランスフェリンによる取り込み経路とは明らかに異なる。定常状態ではホロトランスフェリンはｒａｂ−５またはｒａｂ−７のリサイクル小胞（ｒａｂ５およびｒａｂ７はそれぞれ初期および後期の核内体マーカー）へ送られるが、ＮＧＡＬは後期の核内体と少量がリソソームに送られる。かかるデータはＮＧＡＬがシデロホアを含む場合に鉄輸送経路において機能できることを示す。
【０１０６】
インビボでのＮＧＡＬの作用はその薬理学的な効果とは異なるかもしれない。なぜならインビトロで重要なシデロホアは細菌産生物だからである。多くの解析が内因性の低分子の鉄輸送補因子である可能性を示している。これらにはクエン酸および関連化合物だけでなく、分子量約１０００Ｄａの鉄輸送活性因子も含まれる。かかる腎臓における補因子の有無を決定するために、我々はＢＬ２１細菌由来のアポＮＧＡＬと尿サンプルを混合した。尿それ自体および塩液で希釈したアポＮＧＡＬは５５Ｆｅを取り込めなかったが、尿中に希釈したＮＧＡＬは５５Ｆｅを取り込めた。かかる知見は、尿中にＮＧＡＬと鉄の相互作用を可能にする補因子が存在することを示している。
【０１０７】
本発明の一実施の形態において、外因性ＮＧＡＬの投与によって、虚血再灌流障害により引き起こされた構造的損傷を改善できる。アポトーシスおよび壊死の両方を有意に遅らせることができる。理論的拘束力は望まないが、虚血状態でのＮＧＡＬのアポトーシスの抑制メカニズムには、ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）に類似した抗アポトーシス効果が含まれ、これが鉄の細胞外への輸送の促進することで、細胞内区画での鉄による酸化ストレスを制限する（ＣＤフェリス（Ｃ．Ｄ．Ｆｅｒｒｉｓ）その他、１９９０年ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）３巻Ｐ．１５２−１５７）。さまざまなシデロホア類の担体として、ＮＧＡＬはまた過剰な細胞内の鉄の除去を促進し、それにより、虚血再灌流障害後の酸化物が媒介する腎尿細管のアポトーシス細胞死を制限する。壊死に関しては、虚血再灌流障害後の腎臓に２段階の過程により反応が起こり得る。つまりアポトーシスの開始と続く壊死細胞死である。鉄媒介の酸化ストレスの制限に加えて、ＮＧＡＬによるアポトーシスの阻害はかかる過程の二段階目にあたる壊死局面を防ぐのに有効になりうる。アポトーシスの抑制過程によって、ＮＧＡＬは、アポトーシスの増加との関連が周知であるさまざまな腎臓疾患において有効になり得る。かかる腎臓疾患は、虚血、虚血再灌流、腎毒性、多嚢胞性腎臓疾患、閉塞、炎症、および糸球体疾患を含むがこれに限定されない。
【０１０８】
ＮＧＡＬタンパク質はβバレルまたはカリックスを形成する８つのβ鎖からなる。カリックスは、尿中で検出および／または細菌によって産生されるシデロホアを含む低分子化合物と結合し輸送する。ＮＧＡＬのリガンド結合特性の最適な証拠は結晶学研究から得られ、細菌のシデロホア（エンテロチェリン（enterochelin））がβバレルであることが証明された。ＮＧＡＬはかかるシデロホアと高い親和性（０．４ｎＭ）で結合し、シデロホアが鉄を高い親和性（１０−４９Ｍ）で取り込む。結合実験とＸ線結晶解析によって証明されたタンパク質：シデロホア：鉄の化学量は１：１：１である。シデロホアに鉄が取り込まれた場合、ＮＧＡＬ複合体はインビトロでの胚性間葉および細胞系に鉄を与え、シデロホアに鉄がない場合は、ＮＧＡＬ複合体は鉄をキレートする。ＮＧＡＬは多くの細胞種で飲食作用によって取り込まれ、トランスフェリン区画とは異なる後期の核内体区画へ送られる。鉄の放出は核内体区画で起こる。ＮＧＡＬは細菌シデロホアと結合する最初の哺乳類タンパク質として発見されたため、シデロカリンとも呼ばれている。
【０１０９】
シデロホアは環境中の鉄を取り込む小分子タンパク質で、分子量約５００から１０００の低分子である。シデロホアは第二鉄をキレートできる。鉄触媒による損傷は、虚血、虚血再灌流、または毒素誘導性障害後の腎臓の機能不全における最初の現象の１つと考えられ、心臓および肝臓を含む他の臓器への初期段階の損傷において重要らしい。シデロホアによってキレートされた鉄はかかる臓器への損傷を遅らせることができる。
【０１１０】
シデロホアは合成または細菌培養から天然物として回収可能で市販されている。シデロホアは、一般に用いられる１０ｍＭトリスまたはリン酸緩衝塩類溶液を含むさまざまな緩衝液の生理学的条件においてＮＧＡＬと混合すると、ＮＧＡＬに急速に取り込まれる。一般的に、シデロホアは既知量のＮＧＡＬタンパク質に過剰に加えることができる。ＮＧＡＬ分子はシデロホア分子と、各複合体に各分子が１つずつ含まれるように結合するだろう。かかる１：１のＮＧＡＬ：シデロホアの複合体は過剰な非結合シデロホア分子を除くため洗浄した後、本発明の実践で使用するためにさらに処理されてもよい。または、等モルのシデロホアとＮＧＡＬ分子を組み合わせてインキュベートして結合させることも可能である。本発明で使用するために考案した外因性シデロホアには、クエン酸および合成アナログおよび部分およびその他の有機化学によって産生できる化合物をはじめ、エンテロチェリン、カルボキシミコバクチン、アミノチェリン、デスフェリオキサミン、エアロバクチン、アースロバクチン、シゾキネン、フォロキシミシン、シュードバクチン、ネオエナクチン、フォトバクチン、フェリクロム、ヘミン、アクロモバクチン、リゾバクチン、および他の細菌産生物が含まれるがこれに限定されない。内因性シデロホアもまたＮＧＡＬとインビボで複合体を形成するが、かかることは使用方法の実施例において説明する。
【０１１１】
本発明に関する方法は患者にある特定の利点を提供する。虚血障害に次ぐ急性腎臓疾患は普遍的問題のままであり、限られた充分ではない治療選択しかない。尿細管の細胞死（壊死またはアポトーシス）の抑制、軽減、もしくは反転する因子、および／または回復段階（腎尿細管の生細胞の脱分化および増殖もしくは上皮表現型の再樹立を含む）を促進する因子の同定は、新しい治療選択となる可能性がある。本発明によると、ＮＧＡＬは、単独またはシデロホアと共に用いて、上記の望ましい細胞保護特性を有利に示す。外因性のＮＧＡＬの投与は、尿細管のアポトーシス細胞死を制限し再上皮形成を促進することでマウスモデルでの虚血再灌流障害の形態的機能的な原因を制限することが証明されてきた。
【０１１２】
毒素誘導性障害を処置、軽減、または改善するための本発明の一実施の形態において、毒および／または毒性がある処置には、抗生剤、抗炎症剤、抗真菌剤、放射性造影剤、薬剤、化学療法剤、試験薬、薬剤、または天然、市販および工業製化合物もしくは無機物を含んでもよい。特定の毒および腎毒には、シスプラチン、マイトマイシン、シクロホスファミド、イソスファミド、およびメソトレキセート等の抗癌剤、ゲンタマイシン、バンコマイシン、およびトブラマイシンを含む抗生剤、アンホテリシン等の抗真菌剤、ＮＳＡＩＤ等の抗炎症剤、シクロスポリンおよびタクロリムス等の免疫抑制剤、ハイドロカーボン類、クロロカーボン類、およびフルオロカーボン類等の市販されている工業製化合物である薬剤、ヒ素、水銀、ビスマス、および鉛等の無機物が含まれるがこれに限定されない。他に腎毒性化合物には、アミノグリコシド、フォスカーネット、ペンタミジン、ネオマイシン、亜酸化窒素、イソフルラン、カナマイシン、およびシクロホスファミドが含まれてもよい。
【０１１３】
本発明の実施の形態によると、ＮＧＡＬは、本明細書に記載するとおり、虚血、虚血再灌流障害、臓器移植、ＡＴＮ、毒物投与等の前後および最中（同時）に投与が可能である。さらに具体的に、ＮＧＡＬは臓器が移植される約３０分から９０分前に患者に投与できる。３０分から９０分の範囲外の時間での投与もまた考えられる。
【０１１４】
本発明はまた、体重１ｋｇあたり約１から２００ｍｇ、より一般的には約１から１００ｍｇのＮＧＡＬを患者に投与する方法を含む。患者に投与するＮＧＡＬの量はさまざまで、上記の範囲外であってもよい。本明細書で論じるとおり、患者へのＮＧＡＬ投与量はさまざまであってよい。
【０１１５】
薬剤または医薬組成等の本発明に関する組成物は、一般的に１００μＬの組成物中少なくとも約１０μｇのＮＧＡＬおよび／またはシデロホア濃度からなり、より一般的には少なくとも１００μｇである。
【０１１６】
本発明に関する組成物には、固体、液体または霧状での投与法、および注射による投与経路のための滅菌の必要性に依存した薬剤として受容できるさまざまな種類の担体を含んでもよい。本発明は、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、ガラス体内、膣腔内、直腸内、腫瘍内、筋肉内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼球内、経口、部分的、局所的、吸入（例えば噴霧吸入）、注射、点滴、連続点滴、標的細胞を直接液に浸ける局所的灌流、カテーテル経由、洗浄経由、クリーム剤中、脂質成分中（例えばリポソーム）、または当業者なら知っているような他の方法または上記の組み合わせによって投与できる。
【０１１７】
本発明に関する組成物を動物の患者に実際に投与する量は、体重、処置時の重篤度、処置対象となっている疾患の種類、処置前および最中の介在物、かかる患者の突発性疾患、および投与経路などの物理的生理的要因によって決定できる。投与担当医師はどのような場合においても、各被験者に対して適切な組成物および投与量において、ＮＧＡＬ、シデロホア、およびこれらの混合物、および他の選択した活性剤の濃度を決定するものである。
【０１１８】
ある特定の実施の形態において、医薬組成物には例えば少なくとも約０．１％の選択した他の活性剤または有効成分が含まれてもよい。他の実施の形態においては、かかる活性剤または有効成分は重さで約２％から７５％含んでもよく、より一般的には、約２５％から６０％で、この範囲であればいかなる範囲であってもよい。他の非制限的な例では、活性剤または有効成分の投与量は体重１ｋｇあたり約１μｇから５００ｍｇまでを含んでよく、より一般的には、約５ｍｇから１００ｍｇである。
【０１１９】
いくつかの実施例において、本組成物は、１以上の成分の酸化を遅らせるさまざまな抗酸化剤を含んでもよい。さらに、微生物作用の予防がさまざまな抗細菌剤および抗真菌剤等の保存剤によって行える。かかる保存剤には、パラベン類（例えばメチルパラベン類、プロピルパラベン類）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはこれらの組み合わせが含まれるがこれに限定されない。
【０１２０】
本組成物は、遊離塩基、中性または塩の形に調製できる。医薬として受容できる塩には、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、または、例えば塩化水素もしくはリン酸等の無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸によって形成された酸添加塩が含まれる。遊離カルボキシル基で形成された塩はまた、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄類等の無機塩基、またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンまたはプロカイン等の有機塩基に由来させることもできる。
【０１２１】
本組成物の形状が液体である実施の形態において、担体は溶媒または分散媒が可能であり、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレン、グリコール、液体ポリエチレングリコール等）、脂質類（例えば、トリグリセリド類、植物油、リポソーム類）、およびこれらの組み合わせを含むがこれに限定されない。適切な流動度は、例えばレシチン等の被覆剤を使用することにより、例えば液体ポリオールまたは脂質等の担体に分散させることで必要な粒子径を維持することにより、例えばヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤を使用することにより、またはかかる方法の組み合わせにより維持できる。たいていの場合、例えば糖、塩化ナトリウムまたはこれらの組み合わせ等の等張剤を含むのが一般的である。
【０１２２】
本発明の他の実施の形態において、点眼剤、点鼻剤または噴霧剤、エアロゾルまたは吸入剤として使用可能である。かかる組成物は一般に標的組織の種類に合わせてデザインされる。一非制限的な実施例において、点鼻剤は通常水溶液で、滴下または噴霧により鼻腔内に投与するようデザインされている。点鼻剤は鼻の分泌物と多くの点で似るように、正常な繊毛動作が維持できるように調製される。そのため、一般的な実施の形態においては、水溶性点鼻剤は通常等張であるかわずかに緩衝され、ｐＨが約５．５から６．５に維持される。さらに、眼科用製剤に使用されているのと同様な抗微生物保存剤、薬剤、または適当な薬物安定剤を適宜本製剤に含むことができる。例えば、さまざまな市販の点鼻剤は抗生剤または抗ヒスタミン剤等の薬剤を含むことが公知である。
【０１２３】
ある特定の実施の形態において、本組成物は経口摂取等の経路によって投与するため調製される。かかる実施の形態においては、固形の組成物は、例えば、溶液、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル錠（例えば硬いまたは柔らかいゼラチンで覆ったカプセル）、徐放性製剤、舌下錠、口内錠、万能薬、シロップ剤、オブラート、またはこれらの組み合わせを含む。経口組成物は食事療法の食物と共に直接摂取できる。経口投与の一般的な担体には、不活性希釈剤、食物として吸収できる担体、またはこれらの組み合わせが含まれる。本発明の他の局面においては、経口組成物はシロップまたは万能薬として調製可能で、例えば、少なくとも１つの選択された活性剤または有効成分、甘味料、保存剤、香料、色素、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。他の実施の形態においては、経口組成物は１以上の結合剤、添加剤、壊変剤、滑剤、香料、またはこれらの組み合わせを含んでいてもよい。
【０１２４】
ある特定の実施の形態において、１組成には次の中から１つ以上を含んでよい。例えば、トラガントゴム、アカシア、コーンスターチ、ゼラチン、またはこれらの組み合わせ等の結合剤、例えば、リン酸ニカルシウム、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、またはこれらの組み合わせ等の添加剤、例えば、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸、またはこれらの組み合わせ等の壊変剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム等の滑剤、例えばショ糖、乳糖、サッカリンまたはこれらの組み合わせ等の甘味料、例えば、ペパーミント、冬緑油、サクランボ香料、オレンジ香料等の香料、またはこれら全ての組み合わせ。投与が一カプセル単位であるなら、上記の種類の他に液体等の担体を含んでもよい。さまざまな他の物質が被覆剤として使用可能で、一投与単位の物理的形状を異なった形に修飾できる。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル錠は、セラック、糖、またはその両方で覆うことができる。
【０１２５】
他の投与方式に適した別の調整法には座薬が含まれる。通常処方される座薬は、直腸、膣、または尿道に挿入するため、さまざまな重量および形態の固体様式である。挿入後、座薬は腔内の体液で軟化、融解、または分解する。一般に従来からある座薬用の担体は、例えばポリアルキレングリコール類、トリグリセリド類、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。ある特定の実施の形態において、座薬は、例えば、約０．５％から１０％の範囲、および一般には約１％から２％の範囲で、活性剤または有効成分を含む混合物より形成できる。
【０１２６】
無菌の注射可能な液体は、フィルター滅菌の後、適宜、先に列記したその他成分の内のいくつかの成分と共に必要な量の活性化合物を適切な溶媒に取り込むことで調製される。一般に分散は、さまざまな滅菌された活性化合物を、基本的な分散媒および／または他の成分を含む無菌の賦形剤に取り込むことで調製される。無菌の注射可能な液体、懸濁液、または乳剤を調製するための無菌の粉の場合、一般的な調製方法は、フィルター滅菌済み溶媒から活性化合物およびいかなる他の望ましい成分をも生じさせる真空乾燥または凍結乾燥技術である。かかる溶媒は、適宜、適切に緩衝され、その希釈剤は注射前に充分な塩またはブドウ糖によってまずは等張にする。溶媒として使用したＤＭＳＯによって結果的に極端に速い浸透性が予想される場合、直接注射用の高濃度の組成物を調製することが考えられ、かかることにより狭い範囲に高濃度の活性化合物を到達させる。
【０１２７】
本組成物は製造および貯蔵状態で安定しており、細菌および真菌等の微生物による汚染に対して保護されなければならない。外毒素による汚染が、例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満といった安全基準で最小限に抑えられなければならないことが理解されるだろう。
【０１２８】
実験プロトコル
本発明は、その使用および効能を証明する実施例を通して深く理解されるだろう。以下に示す実験方法は、続く実施例において参照されるものである。
【０１２９】
１．組換えヒトおよびマウスＮＧＡＬの発現、精製、および放射性標識
全長マウスＮＧＡＬｃＤＮＡは、ｐＧＥＸ発現ベクターでクローニングし、細菌中でグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合したタンパク質として発現させ、グルタチオン−セファロースカラム（アマシャム社）を用いて精製し、バンドガード(Ｂｕｎｄｇａａｒｄ Ｊ．)その他著、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ誌（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９４年２０２巻、p．１４６８−１４７５）およびヤン（Ｙａｎｇ Ｊ．）その他著、モレキュラー・セル誌（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２００２年１０巻、ｐ．１０４５−１０５６）およびデル・リオ（Ｄｅｌ Ｒｉｏ Ｍ．）その他著、米国腎臓学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．、２００４年１５巻、ｐ．４１−５１）に記載された方法でトロンビン切断を行った。精製ＮＧＡＬはデトックスゲル内毒素除去カラム（ピアース社）を用いて製造者が推奨する方法で内毒素をなくした。タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、クーマシーブルー染色によって、またはミシュラ（Ｍｉｓｈｒａ）その他著、米国腎臓学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．、２００３年１４巻、ｐ．２５３４−２５４３）に記載されているとおり、ＮＧＡＬに対するポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロティングによって分析した。タンパク質濃度はブラッドフォード法を用いて決定した。図１に示すとおり予想されたサイズの単一できれいなポリペプチドが検出された。
【０１３０】
２．組換えヒトおよびマウスＮＧＡＬの発現と精製
組換えヒトおよびマウスＧＳＴ−ＮＧＡＬは、硫酸第二鉄（５０μＭ：シグマ・アルドリッチ社）を添加して大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＢＬ２１株またはＸＬ１−Ｂｌｕｅ株で発現させた。ＮＧＡＬはグルタチオン−セファロース４Ｂビーズ（アマシャム・バイオサイエンス社）で単離し、トロンビン切断（シグマ・アルドリッチ社：ミズリー州セントルイス）によって溶出し、その後ゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５、ＳＭＡＲＴシステム、アマシャム・バイオサイエンス社）によってさらに精製し、クーマシーゲル（バイオラッド社）によって検証した。ＢＬ２１由来のＮＧＡＬは、鉄がないまたは５倍過剰なモル濃度を用いて鉄飽和させたエンテロチェリンであるシデロホア（ＥＭＣマイクロコレクション社）を結合した。非結合シデロホア（０．７ｋＤａ）はＰＢＳで洗浄（ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−１０）し除去した。５５Ｆｅまたはガリウム（Ｇａ）負荷ＮＧＡＬを作製するために、鉄無しエンテロチェリンＮＧＡＬ複合体を、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）Ｈｅｐｅｓ（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）中の等モル濃度の５５Ｆｅ（１８ｍＣｉ）またはＧａとインキュベートした後、この複合体を３回洗浄した（１０Ｋフィルター）。ヨードビーズ（Ｉｏｄｏｂｅａｄｓ：ピアース社）を用いてＮＧＡＬを１２５Ｉで標識し、非吸収１２５Ｉをゲル濾過（ＰＤ−１０カラム）で除去した後、ＰＢＳに対して徹底的に透析した（７ｋＤａ限外濾過膜：ピアース社）。Ａｌｅｘａ―５６８およびフルオレセインイソチオシアネート（モレキュラープローブス社）を製造者の指示に従いＮＧＡＬと結合させ、その後徹底的に透析した。タンパク質濃度は、標準牛血清アルブミンと比較してクーマシーゲルによって決定した。
【０１３１】
３．ＮＧＡＬの注射
精製された内毒素のないＮＧＡＬはマウスの尾の静脈内、皮内、または腹腔内に注射して投与した。予備実験では、ＮＧＡＬは３種類の濃度（２５０μｇ／１００μＬ溶液を５０、１００、または２５０μｇ）で動物に投与し、１時間後に腎動脈の両側を３０分間クランプし、再流の２４時間後に検証した。等量（１００μＬ）の生理食塩水で前処理した動物と比較した場合、２５０μｇのＮＧＡＬを投与した群のみが尿細管損傷および窒素過剰血症の有意な保護を示した。本明細書で報告する以下の全ての実験は２５０μｇのＮＧＡＬ投与量を用いて行った。５種類のさまざまな動物実験群を使い比較した。非虚血対照群（ｎ＝８）、生理食塩水でのみ前処理した虚血対照群（ｎ＝８）、腎動脈クランプの１時間前にＮＧＡＬで前処理した群（ｎ＝６）、腎動脈クランプの最中にＮＧＡＬ処理した群（ｎ＝６）、腎動脈クランプの１時間後にＮＧＡＬ処理した群（ｎ＝６）である。
【０１３２】
４．ヒトによる研究
健康な志願者、および急性または慢性の腎不全と診断された患者の尿および血清中のＮＧＡＬタンパク質濃度が分析された。急性腎不全（ＡＲＦ）は５日未満の血清クレアチニンの倍化によって診断された。ＡＲＦの推定病因には、次の基準のうち少なくとも２つが当てはまった敗血症が含まれる。陽性血液培養、または肺、皮膚もしくは尿管での局所的感染の証拠、および発熱または白血球数の上昇である。これらの患者の中には、血圧の補助が必要なものもいた。他のＡＲＦの病因には、出血または心疾患が原因の低血圧、腎毒性、または移植後虚血が含まれた。慢性腎不全（ＣＲＦ）の定義は、２ｍｇ／ｄＬを超える血清クレアチニンが少なくとも２ヶ月間変化していないことである。ＣＲＦの推定病因には、閉塞性尿路疾患、慢性間質性腎炎、および糖尿病が含まれた。コロンビア大学医療センターおよび京都大学医学部付属病院において、両組織の審査委員会の承認を得て、評価される患者の血液および尿サンプルが回収され、盲検法を用いて分析された。
【０１３３】
５．ＮＧＡＬの測定
抗マウスＮＧＡＬポリクローナル抗体をウサギで作製した後、組換えマウスＮＧＡＬ（下記参照）と結合させたセファロース４ファストフロービーズカラム（アマシャム・バイオサイエンス社）で精製し、ｐＨ２．５で溶出させた。ヒトＮＧＡＬモノクローナル抗体（アンチボディショップ社）もＮＧＡＬの検出に用いた。ヒトＮＧＡＬはこのモノクローナル抗体でより良く認識されたが、マウスＮＧＡＬはアフィニティ精製したポリクローナルによってのみ認識された。
【０１３４】
ヒト血液サンプルは最初にクエン酸、ＥＤＴＡ、またはヘパリン中に回収されたが、これらの調整は全て同様なＮＧＡＬ免疫反応性を示したので、ヒト血清およびマウス血漿は以下に記載する実施例において回収される。これらのサンプルは１００ｋＤａ限外濾過膜（ＹＭ−１００：アミコン社）を用いて遠心分離し、濾液サンプルを免疫ブロット用に用いた。血液透析を受けている患者では、サンプルは透析直前に回収した。新鮮な尿サンプルは低速で遠心分離した後、それ以上濃縮しないで用いた。
【０１３５】
６．病理学標本
病理学標本には、虚血ＡＴＮ（１０例）、毒性ＡＴＮ（１１例：抗生剤５例、ゾレドロネート２例、カルボプラチン１例、非ステロイド抗炎症剤２例、およびヘモグロビン尿症１例）、および糸球体症（１０例：糖尿病、抗ＧＢＭ、免疫染色陰性半月体形成糸球体症、ＩｇＡ腎障害、最小変化、単状分節状糸球体硬化症を含む）、また、正常な腎臓（３例）をも含んだ。ホルマリン固定しパラフィン包埋した組織を切片化し（５μｍ）、３０分間クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中でマイクロ波を用いて抗原回収した。外因性のペルオキシダーゼは３０分間５％のＨ２Ｏ２で遮断し、その後１０％のヤギ血清／１％のＢＳＡでブロッキングした。アフィニティ精製した抗マウスＮＧＡＬ（０．４μｇ／ｍＬ）を４℃で一晩添加し、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：１００：ベクター社）およびアビジンＨＲＰをそれぞれ３０分間添加した。スライドは２．５分間ＤＡＢ／０．３％Ｈ２Ｏ２で現像し、ヘマトキシリンで対比染色した。非免疫ウサギＩｇＧ（０．４μｇ／ｍＬ：ベクター社）を対照として用いた。
【０１３６】
７．ＮＧＡＬ輸送
腎臓へ輸送されるＮＧＡＬを検出するため、ｒＮＧＡＬ（１０または１００μｇ）、Ａｌｅｘａ―５６８ＮＧＡＬ（１００μｇ）、１２５Ｉ−ＮＧＡＬ（１０μｇ、２×１０６ｃｐｍ）、または５５Ｆｅ負荷エンテロチェリン−ＮＧＡＬ（１０μｇ、１×１０６ｃｐｍ）を腹膜内に注射し、血液、尿、腎臓、および肝臓サンプルを得た。ＮＧＡＬは免疫ブロットにより検出された。Ａｌｅｘａ―５６８ＮＧＡＬは共焦点顕微鏡（ＬＳＭメタ検出器）で検出され、ＮＧＡＬ媒介鉄輸送がシンチレーション計測器およびＥｐｏｎ包埋腎臓の光学顕微鏡オートラジオグラフィーによって検出された。スライドは１週間感光乳剤（ポリサイエンス社）に曝した後、マイクロドールで現像し、トルイジンブルーで対比染色した。近位尿細管のリソソームを検出するために、マウスにはＡｌｅｘａ５６８ＮＧＡＬ注射の２４時間前にフルオレセインデキストラン（４６ｋＤａ、０．５ｍｇ：シグマ社）を注射した。ＬＡＭＰ１（サンタクルズ社）が４％パラホルムアルデヒド固定腎臓のクリオスタット切片で検出された。
【０１３７】
８．ＡＴＮまたは虚血／再灌流障害のマウスモデル
Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（２０〜２５ｇ：チャールズリバー社）は腹膜内ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、体芯温度が３７℃に保たれるように暖灯下の温熱パッド上に静置した。腎臓を腹部切開によって露出させ、右の腎臓を取り出すかまたはその血管茎および尿管を結紮した。左腎臓または両腎臓の血管茎は微細動脈瘤用クリップ（ケントサイエンティフィック社）で右腎摘出後３０分間クランプした。この間の虚血によって死亡率が最小限に抑えられた再現性のある腎臓疾患を形成させた。この間、腹膜を湿らすためにＰＢＳ（０．５ｍＬ）を用い、腹部は５−０ナイロンで縫合した。生理食塩水、ＮＧＡＬ、レチノール負荷レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）、エンテロチェリン、またはデスフェロキサミンメシレート（ＤＦＯ）を、虚血１５分前または再灌流１から２時間後に腹膜内または皮下に注射した。
【０１３８】
再灌流の６または２４時間後に、ヘパリン添加血漿、尿、および腎臓サンプルを回収し、免疫ブロットを用いて、ＮＧＡＬ（ポリクローナル１：５００）、ヘムオキシゲナーゼ１（ストレスゲン社、１：２０００）、Ｅカドヘリン（ＢＤトランスダクションラボ社、１：２０００）、Ｎカドヘリン（ＢＤトランスダクションラボ社、１：３０００）、およびＧＡＰＤＨ（ケミコンインターナショナル社、１：３０００）を測定した。血漿はまたクレアチニンおよび血液尿素窒素比色分析にも用いた。腎臓の矢状断面は４％ホルマリンで固定するか、またはｍＲＮＡおよびタンパク質分析用に瞬間凍結させた。パラフィン包埋切片（５μｍ）は、ヘマトキシリン−エオシン、またはアポトーシス核用のインサイチュキット（フルオレセインＴＵＮＥＬ法、ロシュ社）または全ての核用（トップロール法、モレキュラープローブ社）で染色した。細胞増殖分析用には、ＢｒｄＵを解剖１時間前に腹膜内に注射し、クリオスタット切片を製造者の指示に従い抗ＢｒｄＵ（ロシュ社）で染色した。
【０１３９】
いくつかの実験では、前期マウスは暖かいケージで回復させ、時間ごとに尿を回収した。さまざまな再灌流時間の後に、マウスは再び麻酔後開腹され、比色定量分析によって血清クレアチニンを測定するために、下大静脈の穿刺によって血液を得た。マウスは殺され、腎臓は４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳの灌流でインサイチュ固定され、両腎臓が摘出された。各腎臓の半分が液体窒素で瞬間凍結され、次の処理まで−７０℃で保存された。その後サンプルをホルマリンで固定し、パラフィン包埋没後切片にした（４μｍ）。パラフィン切片はヘマトキシリン−エオシン染色し組織学的に検査した。もう半分の腎臓はＯＣＴ化合物（ティッシュ−テック社）で包埋し、免疫組織学的検査用に凍結切片（４μｍ）を作製した。
【０１４０】
９．リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡが、ＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン社）を用い、製造者の指示に従ってカラム上でＤＮａｓｅ消化し、マウス腎臓から抽出された。ｃＤＮＡ鋳型はオムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素とオリゴｄＴプライマー（キアゲン社）を用いて合成した。ＰＣＲ反応はｉＱ ＳＹＢＲグリーンスーパーミックスおよびＭｙｉＱ単色リアルタイムＰＣＲ検出システム（バイオラッド社）を用いて、９５℃で２分インキュベート後、９５℃３０秒および６０℃３０秒を４０回インキュベートして行った。増殖の特異性は融解曲線の分析とアガロースゲル電気泳動によって検証した。マウスＮＧＡＬｍＲＮＡ用のプライマー配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ ００８４９１）は、ＣＴＣＡＧＡＡＣＴＴＧＡＴＣＣＣＴＧＣＣ（フォワードプライマー、配列番号９３−１１２）およびＴＣＣＴＴＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴ（リバース、５７６−５５７）である。マウスβアクチンｍＲＮＡ用の配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｘ０３６７２）は、ＣＴＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＴＧＡＡＡＡＧ（フォワード、４１５−４３４）およびＴＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧ（リバース、６９６−６７７）である。各プレートには連続希釈した標準サンプルが含まれ、ｍＲＮＡ量の決定に用いられた。ＮＧＡＬｍＲＮＡ含有量はβアクチンｍＲＮＡによって補正した。
【０１４１】
１０．鉄結合補因子
補因子依存性のＮＧＡＬへの鉄結合は、アポＮＧＡＬ（１０μＭ）、５５Ｆｅ（１μＭ）、およびマウス尿の低分子分画（＜３ｋＤａ）を用いて、１５０ｍＭＮａＣｌ−２０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）中で７０分間室温でインキュベートして測定した。尿分画は、新鮮な尿を１０ｋＤａおよび３ｋＤａの膜（ＹＭ−１０およびＹＭ−３、アミコン社）に順次濾過させて得た。次に混合液は１０ｋＤａ膜（ＹＭ−１０、アミコン社）上で３回洗浄した。鉄がないエンテロチェリン結合ＮＧＡＬ（シデロホア無しのＮＧＡＬよりもむしろ）を鉄獲得の陽性対照として用いた。クエン酸第二鉄（１ｍＭ）または鉄負荷エンテロチェリン（Ｓｉｄ：Ｆｅ、５０μＭ）が５５Ｆｅ結合の競合物質として用いられた。
【０１４２】
１１．ＮＧＡＬ免疫組織学分析
ＮＧＡＬ検出用に、凍結腎臓切片に０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳを１０分間浸透させ、１時間ヤギ血清でブロッキングした後、１時間ＮＧＡＬに対する第１抗体（希釈比１：５００）を加えてインキュベートした。その後スライドを暗黒下で３０分間Ｃｙ５（アマシャム社、イリノイ州アーリントンハイツ）が結合した第二抗体に曝露し、ローダミンフィルターを搭載した蛍光顕微鏡（ツァイスアキシオフォト）で視覚化した。
【０１４３】
１２．組織病理学分析スコア
４μｍの腎臓切片はヘマトキシリン−エオシン染色し、ヨコタ（Ｙｏｋｏｔａ Ｎ．）その他著、米国生理学会誌腎臓生理学（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００３年２８５巻Ｆ３１９−Ｆ３２５）およびジェルドセン（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ Ｌ．）その他著、バイオキム・バイオフィズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ２０００年１４８２巻ｐ．２７２−２８３）に記載されている方法で、尿細管への組織病理学的な損傷を盲検法によってスコア化した。各指標は、内側の皮質および外側の髄質領域（尿細管損傷が最も明らか）を強拡大（４０倍）で検査し、各切片の平均値を決定した。指標には、尿細管拡張、尿細管円柱形成、および尿細管細胞壊死が含まれた。各指標は０から４のスケールでスコアにした。異常無し（０）、軽度（１）、中度（２）、重度（３）、非常に重度または広範（４）である。
【０１４４】
１３．アポトーシス検査
アポトーシス核を検出するＴＵＮＥＬ法のために、アポアラートＤＮＡ断片化アッセイキット（クローンテック社）を使用した。パラフィン切片はキシレンおよび低級エタノールで脱パラフィン化し、４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳを使い３０分間４℃に固定し、プロテイナーゼＫを室温で１５分、および０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ１００／ＰＢＳを４℃で１５分間浸透させ、ヌクレオチドおよびＴｄＴ酵素の混合液を加え３７℃で６０分間インキュベートした。反応を２×ＳＳＣで停止させ、切片をＰＢＳで洗浄した後、クリスタル／マウント（バイオメダ社、カリフォルニア州フォスターシティ）でマウントした。ＴＵＮＥＬ陽性のアポトーシス核は蛍光顕微鏡で視覚化することで検出した。核の断片化、核の凝縮、およびＴＵＮＥＬ法による密な蛍光核を含んだアポトーシスの特徴的な形態を示した細胞だけをアポトーシスとして計測した。形態的基準を満たさないＴＵＮＥＬ陽性だけ示した細胞はアポトーシスとはみなさなかった。スライドは盲検法で検査し、各切片とも平均５ヶ所を強拡大（４０倍）して計測した１００細胞あたりのＴＵＮＥＬ陽性核の数を計測することによってアポトーシスを定量した。
【０１４５】
１４．増殖検査
増殖細胞を検出するため、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ、希釈比１：５００、アップステイトバイオテクノロジー社）に対するモノクローナル抗体で切片をインキュベートし、免疫ペルオシキダーゼ染色法（イムノクルズ染色システム、サンタクルズバイオテクノロジー社）を製造者が推奨するとおりに用いて検出した。スライドは盲検法で検査し、各切片とも平均５ヶ所を強拡大（４０倍）して計測した１００細胞あたりのＰＣＮＡ陽性細胞の数を計測することによって増殖を定量した。
【０１４６】
１５．統計解析
ＳＰＳＳソフトウェア（Ｖｅｒ．８／０）を採用し、平均、標準偏差、分布、範囲、および歪度を含む各連続変量に対して一変量統計値を求めた。データは正常値と分布の均一性について検証した。一方向ＡＮＯＶＡを採用し、異なった処理群間の連続変量の平均値±ＳＤを比較した。ランク付けクラスカル・ウォリスＡＮＯＶＡを非正規分布データに用いた。群または他と異なる群の同定には、多重比較法（正規分布に応じてチューキー検定またはダン検定）を用いた。０．０５未満のｐ値が統計的に有意であるとみなされた。ヒトのＮＧＡＬ濃度は統計解析用に対数値に変換した。群間の平均値を比較するためにデータをボンフェロニーの事後検定を伴った一方向ＡＮＯＶＡによって解析した。腎臓障害のジャブロンスキースコアはダンの事後検定を伴ったクラスカル・ウォリス検定によって解析した。
【０１４７】
実施例
さまざまな実施の形態における本発明の実践をより完全に記述するため、以下の実施例を提供する。上記の実験プロトコルは実施例に示すとおりに使用する。
【実施例１】
【０１４８】
静脈内に注射したＮＧＡＬはインビボの近位尿細管細胞によって急速に吸収される。精製ＮＧＡＬは推定作用部位、つまり近位尿細管に到達した。図２で示すとおり、ＮＧＡＬ（２５０μｇ／１００μＬ生理食塩水）または等量の生理食塩水のみを静脈注射されたマウスに虚血再灌流障害を起こし、腎臓および尿を時間を変えて検証した。非虚血生理食塩水対照群にはＮＧＡＬがない（上段左）が、非虚血ＮＧＡＬ処理マウスにはＮＧＡＬがある（下段左）。１時間経った時点で生理食塩水注入マウスの腎臓にはＮＧＡＬがない（上段中）。虚血再灌流障害３時間後の生理食塩水処理マウスには内因性ＮＧＡＬが検出された（上段右）。これとは対照的に、ＮＧＡＬ注射後１時間以内に、細胞質点状分布が主に近位尿細管で容易に検出され（下段中）、３時間経っても依然検出された（下段右）。これらの切片における近位尿細管の同定は場所と形態を基になされた。ＮＧＡＬは生理食塩水を注射したマウスでは１時間の再流時には検出されなかったため、上記検出は虚血障害後の注射したＮＧＡＬの吸収を示す。さらにＮＧＡＬは、図３に示すとおり、注射後１時間以内に尿中で検出された。
【実施例２】
【０１４９】
静脈内に注射されたＮＧＡＬは投与および虚血再灌流障害後すぐに尿中に現れる。実施例１記載のマウスから採取した尿を時間を変えて検証した。図３（左）に示すとおり、１時間の再流時に生理食塩水を注射されたマウスの腎臓または尿中にはＮＧＡＬはなく、３時間の再流時に検出されるようになった。この３時間に及ぶデータは虚血障害に対する腎臓の尿細管細胞の内在的な反応を示している。これとは対照的に、図３（右）に示すとおり、ＮＧＡＬを注射し、同時に虚血再灌流障害を起こさせたマウスでは、ＮＧＡＬは１時間の再流時に腎臓および尿で容易に検出された。
【実施例３】
【０１５０】
ＮＧＡＬは虚血再灌流障害によって引き起こされた尿細管への組織病理学的損傷を改善する。虚血の１時間前、最中、または１時間後にＮＧＡＬを投与すると、結果的に尿細管への組織病理学的損傷は有意に減少した。２４時間の再流時に得たヘマトキシリン−エオシン染色した代表的な腎臓切片を図４に示す。非虚血の対照群（非虚血）が正常な組織を示す一方、生理食塩水（１００μＬ希釈液量）のみで前処理したマウス（生食前処理）は尿細管拡張、尿細管円柱形成、および壊死細胞を含む急性尿細管壊死の広範な特徴を示した。これとは対照的に、ＮＧＡＬ処理した腎臓は組織病理学的反応が弱まっていることを示した。このことは、ＮＧＡＬで前処理したマウス（ＮＧＡＬ前処理）で最も顕著だが、ＮＧＡＬを虚血障害の最中（ＮＧＡＬ虚血中）または１時間後（ＮＧＡＬ虚血後）に投与した場合でも顕著であった。こうした反応を定量するため、腎臓切片における尿細管への組織病理学的損傷を盲検法でスコア化した。結果を図５Ａ〜５Ｃに示す。調べた全３つの指標、拡張（図５Ａ）、円柱（図５Ｂ）、および細胞壊死（図５Ｃ）において、全３種のＮＧＡＬ処理法（虚血の前、最中、または後）が結果的に対照群と比べて有意にスコアを改善した。この有意差はＮＧＡＬを前処理したマウスで最も大きく、続いて虚血中にＮＧＡＬ処理したマウス、虚血後に処理したマウスとなった。しかし構造的な保護は完全ではなく、ＮＧＡＬで前処理したマウスでさえ、非虚血対照群では全く見られない組織病理学的損傷をいくぶん示した。
【実施例４】
【０１５１】
ＮＧＡＬは虚血再灌流障害によって引き起こされる腎臓機能の低下を改善する。図６に示すとおり、虚血の１時間前、最中、または１時間後にＮＧＡＬを投与すると、結果的に２４時間の再流時に測定した血清クレアチニンは有意に減少した。非虚血対照群（非虚血）は血清クレアチニン（０．６５±０．１３ｍｇ／ｄＬ）を示すが、生理食塩水（１００μＬ希釈液量）のみで前処理したマウス（生食前処理）では、血清クレアチニンの有意な上昇が示された（２．６±０．２８ｍｇ／ｄＬ）。これとは対照的に、ＮＧＡＬ処理腎臓は機能的反応を弱めたことを示した。このことは、ＧＮＡＬ前処理マウス（１．２５±０．３ｍｇ／ｄＬ）で最も顕著だが、ＮＧＡＬを虚血障害の最中（ＮＧＡＬ虚血中）（１．５±０，２ｍｇ／ｄＬ）、または１時間後（ＮＧＡＬ虚血後）（１．９５±０．２ｍｇ／ｄＬ）に投与した場合でさえ顕著であった。しかし機能の保護は完全ではなく、ＮＧＡＬで前処理したマウスでさえ、非虚血対照群と比較して血清クレアチニンの有意な上昇を示した。
【実施例５】
【０１５２】
ＮＧＡＬは虚血再灌流障害によって引き起こされる尿細管のアポトーシス細胞死を改善する。外因性のＮＧＡＬの投与によって観察される構造的かつ機能的保護は、アポトーシスの減少の結果である。２４時間の再流時に得た代表的な腎臓切片にＴＵＮＥＬ法を施した。図７はそれを低倍率（左）および高倍率（中央）で見たものである。図８（左）に定量的に示すように、非虚血対照群は最小限のアポトーシス率（調べた１００細胞あたり２．２±０．５個）を示すが、生理食塩水（１００μＬ希釈液量）のみで処理したマウスは尿細管上皮細胞のアポトーシスが有意に増加している（１２．６％±２．２）。これとは対照的に、ＮＧＡＬ処理腎臓はアポトーシス反応を弱めていることが示された。このことは、ＮＧＡＬで前処理したマウス（６．７％±１．６）で最も顕著だが、ＮＧＡＬを虚血障害の最中（７．６％±０．８）または１時間後（８．５％±０．８）に投与した場合でさえ顕著であった。しかしアポトーシス細胞死の保護は完全ではなく、ＮＧＡＬで前処理したマウスでさえ、非虚血対照群と比較してアポトーシス障害の有意な上昇を示した。
【実施例６】
【０１５３】
ＮＧＡＬは虚血障害後の尿細管の細胞増殖を促進する。２４時間の再流時に得てＰＣＮＡに対する抗体で染色した代表的腎臓切片を図７（右）に示す。図８（右）に定量的に示すとおり、非虚血対照群は最小の増殖細胞率（調べた１００細胞あたり１．９％±０．４個）を示すが、生理食塩水（１００μＬ希釈液量）のみで処理したマウスは少ないながらも有意なＰＣＮＡ陽性尿細管上皮細胞数の増加を示した（４．４％±１．２）。これとは対照的に、ＮＧＡＬ処理腎臓では増殖細胞の際立った増加が見られた。このことはＮＧＡＬで前処理したマウス（１９．１％±２．１）で最も顕著だが、ＮＧＡＬを虚血障害の最中（１４．９％±１．２）または１時間後（１４．５％±１．２）に投与した場合でさえ明らかだった。
【実施例７】
【０１５４】
ＮＧＡＬは虚血障害後における尿細管細胞の生死バランスを生存に向け変化させる。虚血障害後の尿細管細胞全体の生死を一方向ＡＮＯＶＡを用いて推定し、２４時間の再流時における増殖とアポトーシスの平均値±ＳＤをさまざまな処理群を対象に比較した。図９に示すとおり、静止状態の成熟腎臓で予想されるような生細胞と死細胞が等しい割合を示す均一比であることが仮定できる。非虚血対照腎臓は増殖：アポトーシスの比が０．８６±０．１で、均一に近い値を示した。生理食塩水（１００μＬ希釈液量）のみで処理したマウスは増殖：アポトーシスの比（０．３４％±０．０５）で有意な減少を示し、２４時間の再流時では細胞死が顕著な特徴であることを示した。これとは対照的に、ＮＧＡＬ処理腎臓では尿細管細胞の増殖：アポトーシスの比が大きく増加した。このことはＮＧＡＬで前処理したマウス（２．９％±０．５）で最も顕著だが、ＮＧＡＬを虚血障害の最中（２．０％±０．１）または１時間後（１．７％±０，１）に投与した場合でさえ顕著であった。この分析は、ＮＧＡＬが虚血障害後に、尿細管細胞の死亡対生存の全体的なバランスを生存に向け変化させることを示している。
【実施例８】
【０１５５】
ＮＧＡＬ発現はヒトの急性腎不全（ＡＲＦ）において増加する。図１１に示すとおり、ヒトの急性腎不全は、血清および尿のＮＧＡＬタンパク質の濃度が対数オーダで上昇することを特徴とした。尿のＮＧＡＬタンパク質は正常な被験者では２２ｎｇ／ｍＬ（ｎ＝１０）だが、急性腎不全およびさまざまな重複罹患の被験者では５５７ｎｇ／ｍＬ（２５倍の上昇、ｐ＜０．００１）である。尿のＮＧＡＬ免疫ブロットを図１１Ａに、および定量グラフを図１１Ｃに示す。正常な被験者の血清ＮＧＡＬ２１ｎｇ／ｍＬ（幾何学平均、ｎ＝５）と比較して、急性腎不全およびさまざまな重複罹患の被験者の血清ＮＧＡＬは１４６ｎｇ／ｍＬで７．３倍上昇した（ｐ＜０．０５）。図１１Ｂには免疫ブロットデータを、図１１Ｄには定量グラフを示す。細菌感染と関連のある急性腎不全の患者は、血清（３３１ｎｇ／ｍＬ）および尿（２７８６ｎｇ／ｍＬ）のＮＧＡＬが最も高い傾向を示すが、感染のない急性腎不全と統計的には差がなかった。ＮＧＡＬ発現と急性不全の程度との相関関係を決定するため、ＮＧＡＬ濃度を対数変換した後、単回帰分析を行った。尿のクレアチニンで補正した尿ＮＧＡＬ（ｒ＝０．６７、ｎ＝３６）ばかりでなく、血清（ｒ＝０．６４、ｎ＝３２）および尿（ｒ＝０．６８、ｎ＝３８）のＮＧＡＬ濃度でも、血清クレアチニン濃度と高い相関が見られた（ｐ＜０．０００１）。これとは対照的に、慢性腎不全の患者の場合、血清ＮＧＡＬ（４９ｎｇ／ｍＬ、ｎ＝１０）および尿ＮＧＡＬ（１１９ｎｇ／ｍＬ、ｎ＝９）の上昇は比較的小さく、これらの値は血清クレアチンとの相関関係を明らかにすることができなかった。これらのデータはＮＧＡＬ発現と急性腎不全とを相関させ、腎臓が血清および尿のＮＧＡＬの主な供給源であることを示している。実際、重篤な腎臓疾患の症例の中には、ＮＧＡＬ分解物の排出（ＮＧＡＬクリアランス値、クレアチニンクリアランス値で補正）が１００％を超えることがあり、このことは尿ＮＧＡＬが単に血液からの濾過に由来するというよりむしろ、局所的な合成に由来することを証明している。比較すると、図１１Ｂに示すとおり、マウス尿でもＡＴＮ障害の誘導の後にＮＧＡＬ濃度が大きく上昇した。
【０１５６】
急性腎不全におけるＮＧＡＬの発現部位を視覚化するため、ヒトの腎臓組織切片をＮＧＡＬに対するアフィニティ精製ポリクローナル抗体で染色した（図１２）。図１２Ａに低倍率、１２Ｂおよび１２Ｃに高倍率で示すとおり、正常な腎臓では、遠位尿細管上皮（皮質領域の平均１０％）および髄質の集合管で非常に弱い染色を示した。まれに糸球体嚢外壁上皮細胞に濃い染色があるが、他の糸球体細胞には見られない。しかし近位尿細管は完全に陰性である。これとは対照的に、腎毒性または虚血に曝した腎臓または以下の診断を受けた被験者の腎臓の切片では、５０％近くの尿細管皮質でＮＧＡＬが染色された。診断名は、敗血症による虚血性ＡＴＮ（図１２Ｄ）、血液量減少症（急性の血液量損失：図１２Ｅ）、心疾患（図１２Ｆ）、ビスホスフォネートによる腎毒性（図１２Ｇ）、セフォスポリンによる腎毒性（図１２Ｈ）、およびヘモグロビン尿症（図１２Ｉ）である。図１２Ｊおよび１２Ｋを見ると、ＮＧＡＬはまた増殖性糸球体症の患者の近位尿細管において広く発現したが、虚血障害で見られるものよりは弱い（皮質実質がＮＧＡＬ陽性であるのは最小変化のみの疾患で２０％、糖尿病性腎障害で４０％、ＡＮＣＡで５０％、および抗糸球体基底膜疾患で６５％）。顕著な核小体を持ち単純化拡大化した修復核を含む、細胞損傷の特徴を示す尿細管細胞が最も濃く染まった。損傷があまりない尿細管細胞はほとんど染まらなかった。これらのデータは、さまざまな腎疾患の皮質尿細管における新規および広範なＮＧＡＬの反応性と、ＮＧＡＬ発現がヒト腎臓の損傷上皮に対する共通の反応であることを示している。
【実施例９】
【０１５７】
外因性のＮＧＡＬはＡＴＮのマウスの近位尿細管を回復させる。虚血腎臓におけるＮＧＡＬ発現の機能的な重要性を調べるため、マウスにＡＴＮ障害を誘導した。腎動脈を３０分間クランプし、対側性の腎臓を取り出した。再灌流の２４時間後、血漿クレアチニンは０．４１±０．１ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝４）から３．６１±０．１７ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝８、ｐ＜０．００１）に上昇し、ＮＧＡＬｍＲＮＡとタンパク質の発現が増加した。ＮＧＡＬｍＲＮＡのレベルは約１０００倍増加し、リアルタイムＰＣＲの検出閾値が、偽処理群で１７．７±０．８７回から虚血性腎臓で７．５２±０．４４回（ｐ＜０．０００１、各ｎ＝４）に減少した（βアクチンｍＲＮＡレベルで補正）。ＮＧＡＬタンパク質は尿で１０００倍（図１１Ｅに示すとおり、偽処理および正常マウスが４０ｎｇ／ｍＬであるのに対し、ＡＴＮの場合４０μｇ／ｍＬ）、血液で３００倍（偽処理マウスが１００ｎｇ／ｍＬであるのに対し、ＡＴＮの場合３０μｇ／ｍＬ）上昇し、腎臓抽出物中では１００倍近く上昇した（偽処理腎臓の場合、湿重量１ｇあたり１μｇ未満であるのに対し、ＡＴＮの場合、平均７３μｇ、ｎ＝３、ｐ＜０．０５）。腎臓のＮＧＡＬタンパク質量はクランプ継続時間とよく相関した。
【０１５８】
ＡＴＮの虚血モデルにおいてＮＧＡＬが保護的に機能するかどうかを決定するため、動脈クランプの前または外してから１時間以内に、ＮＧＡＬを全身に投与した。クランプの１５分前にＮＧＡＬを１００μｇ注射すると、再灌流の２４時間後に測定した血漿クレアチニンの上昇が抑制された（１．１８±０．１８ｍｇ／ｄＬ、ｎ＝７、未処理群では３．１６±０．１７ｍｇ／ｄＬ）。同様の結果が、１０〜３００μｇの範囲でＮＧＡＬを投与した場合に得られたが、１μｇのＮＧＡＬでは保護できなかった（クレアチニン濃度３．０９±０．１１ｍｇ／ｄＬ、ｎ＝３）。また再灌流１時間後にＮＧＡＬを投与した場合も窒素過剰血を抑制した（クレアチニン濃度１．６０±０．２８、ｎ＝３、ｐ＜０．００１）が、ＮＧＡＬによる前処理よりは弱かった。これらのデータは血液尿素窒素の測定によって確認された（データ図示せず）。
【０１５９】
図１３Ａを見ると、ＡＴＮ腎臓に比べ、対照群およびＮＧＡＬ処理腎臓（ＡＴＮ＋ＮＧＡＬ）において、尿細管の壊死および管腔壊死細胞片よりむしろ、近位尿細管Ｓ１およびＳ２部位の上皮細胞が正常形態のまま保護されているという組織学的知見によっても、ＮＧＡＬ活性は証明された。図１３Ｂを見ると、髄質外層の外帯にあるＳ３部位はＮＧＡＬ注射ではほとんど保護されないが、尿細管円柱もあまり顕著ではなかった。こうした観察は、図１３Ｃに見られる切片のジャブロンスキースコアによって支持された。これとは対照的に、虚血２時間後に処理した場合、保護効果はなかった（クレアチニン濃度３．１２±０．３５ｍｇ／ｄＬ、ｎ＝３）。
【実施例１０】
【０１６０】
虚血性灌流障害との相関。カドヘリンの輸送と代謝は虚血の影響を直ちに受けるため、また、ＮＧＡＬはラットの胚性後腎間葉においてＥカドヘリンの誘導体として機能するため、ＮＧＡＬは虚血腎臓においてカドヘリン発現を回復させる。この仮説を検証するため、免疫蛍光法によってマウスの近位尿細管においてＥカドヘリンの検出が可能になった一方、図１４Ａを見ると近位尿細管の全部位でＮカドヘリンが存在し、これが主要なカドヘリンらしいことをまず確認した。Ｎカドヘリンはカスペース類、βセクレターゼ、およびＣＲＥＢシグナリングを調節する重要なシグナル分子の可能性がある細胞質で３０〜４０Ｋｄ断片を生成する基質メタロプロテイナーゼによって処理されることが知られている。Ｎカドヘリンは虚血再灌流後に３０Ｋｄの断片に分解されることが、図１４Ｂの免疫ブロットで証明された。このことはこれらの経路の内１以上の経路が活性化されたことを示している。マウスによっては、Ｎカドヘリンの分解は再灌流後の６時間以内に検出され、２４時間までに、Ｎカドヘリンの免疫蛍光および全長Ｎカドヘリンの両者がほとんどなくなった。これと対照的に、ＮＧＡＬで前処理すると、Ｎカドヘリンの免疫蛍光は保存され、全長Ｎカドヘリンの発現が促進し、再灌流の６時間後に（数個体で）測定した断片、または２４時間後に測定した断片の出現が減少した。そのため、近位尿細管のマーカーであるＮカドヘリンの保護はＮＧＡＬ活性と相関し、ＮＧＡＬ活性の高感度なマーカーとなる。Ｅカドヘリンは遠位尿細管および集合管で高度に発現するのだが、虚血およびＮＧＡＬ処理にほとんど影響されなかった。同様に、金属誘導による腎毒性ＡＴＮはＮカドヘリンの分解を導くが、Ｅカドヘリンには影響しなかった。そこでＮＧＡＬの一効果は、Ｎカドヘリン断片がシグナリングを阻害することにある。
【０１６１】
近位尿細管細胞の破壊は結果的にアポトーシス細胞死になるため、アポトーシス誘導のＴＵＮＥＬ検査を用いて細胞の生存率へのＮＧＡＬが細胞の生存率に与える効果を決定した。再灌流の２４時間後に、図１４Ｃに見るＴＵＮＥＬ陽性尿細管細胞を少なくとも１個有する尿細管の割合を計測した。虚血性腎臓（Ｉ／Ｒ）は、１１．５％±０．６（ＳＥＭ、ｎ＝４個体）の皮質尿細管がＴＵＮＥＬ陽性細胞を含んでいることを示したが、ＮＧＡＬ処理後（Ｉ／Ｒ＋Ｎｇａｌ）では陽性率は２．９％±０．９（ＳＥＭ、ｎ＝７、ｐ＜０．００１）に下がった。比較すると、図１４Ｄの定量グラフに示すとおり、偽処理腎臓の陽性率は０．５％±０．３である。
【０１６２】
ＢｒｄＵ取り込みが細胞増殖の測定手段として決定された。このとき腎臓の組織切片において、少なくとも１個のＢｒｄＵ陽性尿細管細胞がある皮質尿細管の割合を決定した（図示せず）。虚血性の皮質尿細管はほとんどＢｒｄＵ陽性細胞を含んでいなかった（１．９％±０．３、ｎ＝３）が、ＮＧＡＬで前処理した虚血性腎臓の虚血２４時間後では陽性細胞が少しではあるが有意に増加した（３．９％±０．５、ｎ＝４、ｐ＜０．０５）。比較すと、偽処理腎臓のＢｒｄＵ陽性細胞率は３．７％±０．７であった。そこでＮＧＡＬによる回復は、皮質細胞のアポトーシスを減少させ、尿細管細胞の補償的な増殖を刺激するか、または損傷から細胞を回復させるかのどちらかであった。
【０１６３】
ＮＧＡＬ発現は虚血性損傷と相関するため、外因性ＮＧＡＬタンパク質で処理した後の内因性ＮＧＡＬの発現を測定した。虚血マウスを１００ｍｇのＮＧＡＬで処理すると、リアルタイムＰＣＲで測定したとおり再灌流の２４時間後に内因性のＮＧＡＬのＲＮＡの増加は７２％±１６（ｐ＜０．０１、ｎ＝５）まで減少した。１００ｍｇのＮＧＡＬで処理すると、免疫ブロットで測定したとおり腎臓では内因性ＮＧＡＬタンパク質の産生が２．５倍（虚血７３±７μｇ／ｇ、ＮＧＡＬ処理虚血２９±７μｇ／ｇ、各ｎ＝３、ｐ＜０．０１）まで減少し、尿細管細胞の増殖能が保護された。
【実施例１１】
【０１６４】
ＮＧＡＬはＡＴＮにおいてヘムオキシゲナーゼ１を上方制御する。多くの研究で、ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）が虚血腎臓の近位尿細管の重要な制御因子として同定されている。ＨＯ−１はＡＴＮの回復に必要であり、その発現レベルは組織損傷の回復と直接相関する。図１４Ｅに示すとおり、虚血再灌流（ＡＴＮレーン）はＨＯ−１の発現を促進するが、ＡＴＮ損傷マウスに１０〜１００μｇのＮＧＡＬで処理した場合（ＡＴＮ Ｎｇａｌレーン）、再灌流後２４時間以内にＨＯ−１は５〜１０倍さらに上方制御された。ＮＧＡＬ単独でＨＯ−１を誘導するのかを決定するため、ＮＧＡＬの量を変えて健康なマウス（偽レーン）に投与し、ＨＯ−１タンパク質レベルを測定した。しかしＮＧＡＬ注射後のＨＯ−１の発現はＮＧＡＬ処理ＡＴＮ損傷腎臓に比べずっと少ないく、ＮＧＡＬは虚血再灌流の間に他の活性因子と協同してＨＯ−１を上方制御し、鉄媒介の損傷から腎臓を保護することを示している。
【実施例１２】
【０１６５】
ＡＴＮの回復機構。ＮＧＡＬは近位尿細管を標的にする。ＮＧＡＬが虚血障害から近位尿細管を保護するメカニズムを確証するため、ＮＧＡＬを腹膜内または皮下に注射した後の外因性ＮＧＡＬの分布を決定した。図１５を見ると、１００μｇの外因性ＮＧＡＬを注射して１０分以内にＮＧＡＬは尿で検出された。このことはタンパク質が速やかに腎臓で処理されたことを示している。ＮＧＡＬを１０μｇ投与した場合にも同じ時間経過が観察ｓらえた（図示せず）。しかし最初の1時間で尿中に検出されたのは、注射したＮＧＡＬの内わずか０．１〜０．２％のみだった。輸送経路をより明確に追跡するため、蛍光結合のＮＧＡＬを投与した。1時間が経過するまでに、図１６Ａに見るフルオレセインとＡｌｅｘａ標識ＮＧＡＬの両方が皮質近位尿細管の腔側に近い領域（ネフロンのＳ１およびＳ２部位）にある大きな小胞に局在したが、尿細管の他の部位には見られなかった。尚、近位尿細管によって取り込まれリソソームで分解される第二のリポカリンであるレチノイド負荷ＲＢＰは無効だったため、タンパク質の輸送経路それ自体が腎臓保護機構である可能性はほとんどない（図１６Ａ）。これらの細胞内小器官がリソソームであるかを確かめるため、Ａｌｅｘａ―５６８ＮＧＡＬ投与の前日に、フルオレセイン−デキストラン（４３ｋＤａ）で近位尿細管のリソソームを標識した。ＮＧＡＬ注射の１時間後、ＮＧＡＬ小胞の３３％に図１６Ｂに見るデキストランが含まれていた。さらに、これら小胞の多くはリソソームのマーカーであるＬＡＭＰ１で共染色した（図示せず）。同様の結果が１２５Ｉ−ＮＧＡＬを注射した後でも観察され、図１６Ｃを見ると、１時間が経過するまでに全長タンパク質が急速に血中から除去され、腎臓に集まることを示している。実際、腎臓は、１ｍｇタンパク質あたり肝臓の１３倍の１２５Ｉ−ＮＧＡＬを有していた。同様のデータを、ヒトＮＧＡＬに関してすでに報告しており、ヒトＮＧＡＬの場合、急速に循環血液中から回収され（ｔ１／２＝１０分）、１ｍｇタンパク質あたり肝臓の１２倍の量が腎臓に集まっていた。腎臓に局在したタンパク質はＴＣＡで沈降させると（７０％）、全長ＮＧＡＬと特定の１４ｋＤａ分解産物とからなっていた。これらの分子種は注射の５時間後まで残存し、その後ゆっくりと消失した。これとは対照的に、血漿および特に尿は、ほとんどが分子量の低いＴＣＡ可溶性の１２５Ｉ断片を含んでいた（ＴＣＡ沈降は血漿３５％、尿２０％）。
【０１６６】
これらのデータによると、全長ＮＧＡＬは急速に近位尿細管で回収され、そこでリソソームに輸送され１４ｋＤａの断片に分解されることが分かった。循環血液から自由に濾過される事実にもかかわらず正常なマウスまたはヒトの尿では非常に低濃度のＮＧＡＬしかないので（ヒトでは尿ＮＧＡＬ＝２２ｎｇ／ｍＬであるが濾過負荷量＝２０ｎｇ／ｍＬ×ＧＦＲ、マウスでは尿ＮＧＡＬ＝４０ｎｇ／ｍＬであるが濾過負荷量＝１００ｎｇ／ｍＬ×ＧＦＲ）、内因性タンパク質（低濃度の血清ＮＧＡＬ）は同様な経路で輸送されている可能性がある。
【実施例１３】
【０１６７】
近位尿細管のＡＴＮからの回復にはＦｅ：シデロホアが必要。ＮＧＡＬが鉄を近位尿細管に輸送できるかを確かめるため、鉄のないエンテロチェリン−ＮＧＡＬ（Ｓｉｄ：ＮＧＡＬ）と５５Ｆｅとを１：１の化学量（５５Ｆｅ：Ｓｉｄ：ＮＧＡＬ）でインキュベートして、放射性鉄５５ＦｅでＮＧＡＬを飽和状態にした。この放射性標識５５Ｆｅ：Ｓｉｄ：ＮＧＡＬ複合体を注射（腹腔内に１０μｇ）した。その１時間後、５５Ｆｅのほとんどが腎臓で回収（５５％）されたが、血漿（４．３％）、尿（０．６％）、肝臓（２．４％）、および脾臓（０．２％）ではわずかしか検出されなかった。腎臓における５５Ｆｅの場所を特定するため、組織切片のオートラジオグラフィーを行った。図１６Ｅおよび表１（Ｘ２＝２１．２、ｐ＝０．００１７）に示すとおり、５５Ｆｅは近位尿細管に局在し、具体的には刷子縁の下部の腔側表面に沿っていた。
【表１】
注：ａ全銀粒子数＝２６０１ ｂ全点数＝９９９ ｃ粒子（％）／点数（％）
【０１６８】
対照的に、５５Ｆｅは図１６Ｄに示す髄質では見られなかった。これらのデータは、外因性５５Ｆｅ：Ｓｉｄ：ＮＧＡＬ複合体を注射した場合、近位尿細管がＮＧＡＬタンパク質とそのリガンドである鉄の両方を獲得できるようになることを証明している。尚、５５Ｆｅ：Ｓｉｄ：ＮＧＡＬの分布はタンパク質非結合のクエン酸５５Ｆｅの分布と全く異なり、後者では鉄のわずか１．５％のみが腎臓に回収された（図示せず）。
【実施例１４】
【０１６９】
腎臓保護において鉄輸送が果たす役割を明らかにするため、２種類の大腸菌株（Ｅ．Ｃｏｌｉ）でクローニングしたＮＧＡＬを比較した。ＸＬ−１Ｂｌｕｅ株でクローニングしたＮＧＡＬはエンテロチェリンを含み、鉄が負荷されている。一方、ＢＬ２１株でクローニングしたＮＧＡＬはエンテロチェリンを含まない。図１７Ａを見ると、ＸＬ−１ＢｌｕｅクローンＮＧＡＬ１０μｇ（ホロＮｇａｌ１０μｇ：左）は、偽処理（偽）および未処理ＡＴＮ損傷腎臓（ＡＴＮ）に比べて腎臓を保護した。しかしエンテロチェリンがないＢＬ２１クローンＮＧＡＬ１０μｇ（アポＮｇａｌ１０μｇ：中）では保護が低かった。そのためＢＬ２１クローンＮＧＡＬを、鉄無し（アポＮｇａｌ：Ｓｉｄ）および鉄飽和エンテロチェリン（アポＮｇａｌ：Ｓｉｄ：Ｆｅ）で再構成した。エンテロチェリンの負荷（鉄の有無にかかわらず）は腎臓の保護を促進し、血清クレアチンの上昇を弱めた。鉄飽和シデロホアは腎臓での鉄キレートの許容量を減少させるため、鉄があるとわずかに保護が低下した。鉄負荷と鉄無しＮＧＡＬ：Ｓｉｄのどちらも保護的であるため、鉄よりもむしろシデロホア自体が活性を示していた可能性がある。鉄の役割をさらに調べるため、ガリウム：Ｓｉｄ：ＮＧＡＬ：Ｓｉｄ：ガリウム（アポＮｇａｌ：ｓｉｄ：Ｇａ）複合体も検証した。ガリウムは、エンテロチェリンシデロホアを含む鉄結合部位を高い親和性で占有する（ガリウムは非標識鉄と同程度にエンテロチェリンへの５５Ｆｅの結合を阻害する）。また鉄のように酸化還元反応を受けないため、ガリウムはシデロホアへ結合するため鉄と競合する。鉄複合体と比べて、虚血１５分前にガリウム複合体で処理したマウスは保護されなかった（クレアチニン濃度３．１７±０．１、ｎ＝４）。さらに、遊離シデロホアの単独投与、デスフェリオキサミンメシレート（ＤＦＯ）、またはレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）もまた対ＡＴＮ保護に失敗した。これらのデータは、ＮＧＡＬ：シデロホア複合体がＮＧＡＬの保護活性を提供し、シデロホアによる鉄の輸送がＮＧＡＬに依存していることを証明している。鉄がある場合とない場合のＮＧＡＬ：シデロホア複合体の免疫ブロットを図１７Ｂに示す。
【実施例１５】
【０１７０】
尿シデロホアの証明。外因性ＮＧＡＬに関連して重要なシデロホアは細菌の産物であるため、インビボでの内因性ＮＧＡＬの作用は外因性ＮＧＡＬの薬理学的効果とは異なるだろう。しかしさまざまな研究によって、鉄を輸送する内因性の低分子量因子の存在が示唆されてきた。これらの分子には、クエン酸、および関連化合物、また、分子量１Ｋｄ程度の鉄輸送活性が含まれてもよい。ＮＧＡＬの補因子の尿に存在するかを確認するため、ＢＬ２１株由来のアポＮＧＡＬを健康なマウスの尿サンプルと混合した。図１８Ａを示ると、尿の低分子量化合物（＜３Ｋｄ）が、１０Ｋｄ限外濾過膜上の５５Ｆｅを取り込めず、またＴｒｉｓまたはリン酸緩衝液に希釈したアポＮＧＡＬが５５Ｆｅを取り込めていなかった。ところがＮＧＡＬと尿（＜３Ｄａ）をインキュベートすると、５５Ｆｅが取り込めるようになった。ＮＧＡＬによって取り込まれた鉄は、１０００倍の非標識クエン酸鉄、およびより強力には５０倍濃度の鉄飽和エンテロチェリンの存在によって阻害された。これを図１８Ｂに示す。鉄の取り込みは飽和できる。また３０μＬのマウス尿を用いた場合、約２０％のＮＧＡＬ分子が鉄と結合する。これらの知見は、マウス尿がＮＧＡＬ−鉄と相互作用する低分子量の補因子を含むことを示唆している。この内因性の因子は、ＮＧＡＬのカリックスと高い親和性（０．４ｎＭ）で結合する細菌のシデロホアと競合的なので、細菌と哺乳類因子の両方が同じリポカリンの結合ポケットを占有すると思われる。
【実施例１６】
【０１７１】
腎臓移植を受けた患者におけるＮＧＡＬ発現。腎臓移植を受けたヒトの回復期におけるＮＧＡＬ発現を評価した。生体腎移植（ＬＲＤ、ｎ＝１０）または死体腎移植（ＣＡＤ、ｎ＝１２）を対象に腎臓移植後１時間以内に腎臓生検を得た。生検標本は切片化し、ＮＧＡＬ抗体で免疫組織学的に染色した。図１９に示すとおり、ＮＧＡＬ発現はＣＡＤ群で有意に増加した。死体腎は、生体提供者からの腎臓よりも長時間体外で保持されているので、虚血の程度が概して大きく、ＮＧＡＬ発現と正の相関を示した。
【０１７２】
ＬＲＤ（ｎ＝４）またはＣＡＤ（ｎ＝４）腎臓移植を対象に、移植前および移植２時間後に得た尿サンプルのウェスタンブロットを図２０に示す。尿中のＮＧＡＬ発現は手術前にはない。ＮＧＡＬ発現は、ＣＡＤ群の方がＬＲＤ群よりも有意に増加した。図２１を見ると、ウェスタンブロットで定量した尿ＮＧＡＬをＬＲＤとＣＡＤとで比較した場合、ＣＡＤの方が有意な発現増加を示した。ＥＬＩＳＡによる定量でも同様の結果を示した（図示せず）。この知見はまたＣＡＤ腎臓移植に関連する虚血時間の長さに相関した。ＣＡＤ移植の２時間後に得た尿と低温虚血時間との相関を図２２に示す。
【０１７３】
血清クレアチニン濃度は、移植手術後２〜４日で最大になる。これもまた尿ＮＧＡＬと相関した。ＣＡＤ移植の２時間後に得た尿と最大血清クレアチニンとの相関を図２３に示す。
【実施例１７】
【０１７４】
急性腎不全の診断ツールとしてのＮＧＡＬ測定の利用。心肺バイパス開心術中に起きる不幸の１つに急性腎不全（ＡＲＦ）の発症がある。血清ＮＧＡＬ測定はＡＲＦを発症する危険性がある患者を高率に予測できる。図２４は、ＮＧＡＬのＥＬＩＳＡによる標準曲線で、１０の独立した標準曲線から得られた直線関係を示す。ＣＰＢ後にＡＲＦを発症した患者（ｎ＝１０）を対象に経時的にサンプルを採取し血清ＮＧＡＬを測定した。これを図２５に示す。ＮＧＡＬの上昇は術後に回収したサンプルで著しく、上昇は少なくとも４日間継続した。これとは対照的に、ＡＲＦを発症しなかった患者では、術後４日間血清ＮＧＡＬの上昇はなかった。図２６は、時間経過で見たＡＲＦを発症した患者（ｎ＝１０）対術後何も起こらなかった患者（ｎ＝３０）の血清ＮＧＡＬの平均値±ＳＤを示す。図２７に示すとおり、ＣＰＢ後にＡＲＦを発症した患者（ｎ＝１１）の経時的尿ＮＧＡＬ測定でも上昇が見られたが、血清ＮＧＡＬと比べるとばらつきが大きかった。しかし図２８で示すとおり、ＡＲＦを発症した患者（ｎ＝１１）と術後何も起こらなかった患者（ｎ＝３０）を対象に経時的に尿ＮＧＡＬの平均値±ＳＤの比較分析を行った結果、尿ＮＧＡＬ濃度によってＡＲＦの予測が可能になることが分かった。図２９を見ると、手術２時間後の尿ＮＧＡＬ濃度は手術中のＣＰＢ時間の長さに相関した。
【０１７５】
以上、実施の形態および実施例を挙げて本発明を説明し、また、実施の形態および実施例を詳細に記述したが、付記する請求の範囲をかかる詳細事項に制限または限定することを意図しない。当業者であれば、本明細書に記載した以外のさらなる利点および変更が容易に理解されるだろう。そのため、より広い局面において本発明は、示され記述された前記特定の詳細事項、代表的な方法および構造、および例証した実施例に限定されない。よって、本発明の範囲または精神から離脱せずに、かかる詳細事項から離脱できるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】（図示のとおり）決められた量の組換え精製ＮＧＡＬのクーマシーブルー（ＣＢ）と高感度化学発光（ポリクローナルＮＧＡＬ抗体によるＥＣＬ）分析を示す。
【図２】ポリクローナルＮＧＡＬ抗体を用いた、注入１時間後の非虚血対照動物からの腎臓、または１時間もしくは３時間後の虚血性腎臓の免疫蛍光染色を示す。
【図３】ＮＧＡＬ投与１時間以内の非虚血（ＮＩ）および虚血（Ｉ）動物からの尿サンプル中ＮＧＡＬを検出するためのウェスタンブロットを示す。
【図４】非虚血対照マウス、生理食塩水前処理虚血マウス、または虚血の１時間前、最中、または１時間後にＮＧＡＬで処理した虚血マウスからの腎臓をヘマトキシリンエオシンで染色した切片を示す。
【図５】生理食塩水で前処理した、または虚血の１時間前、最中、１時間後にＮＧＡＬで処理した虚血マウスからの腎臓の組織切片のスコアを示す。本切片は、任意の０から４のスケールを用いて尿細管拡張（図５Ａ）、尿細管円柱（図５Ｂ）、および尿細管細胞壊死（図５Ｃ）について分析しスコアを付けた。
【図６】非虚血対照マウス、または生理食塩水で前処理した虚血マウスにおいて測定された血清クレアチニン（Ｐｒｅ Ｓａｌ）、または虚血障害の１時間前（Ｐｒｅ ＮＧＡＬ）、最中（Ｄｕｒ ＮＧＡＬ）、１時間後（ＰｏｓｔＮＧＡＬ）にＮＧＡＬ処理した虚血マウスの虚血２４時間後において測定された血清クレアチニンを示す。
【図７】非虚血対照マウスの代表的な切片、または生理食塩水で前処理した虚血マウス、もしくは虚血障害の１時間前、最中、１時間後にＮＧＡＬで処理した虚血マウスの虚血２４時間後の代表的な切片をＴＵＮＥＬ染色した結果を示す。矢印は、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）染色と比べた、低倍率および高倍率でのアポトーシスの特徴である密で断片化した濃い核の染色を指している。
【図８】非虚血対照マウスの腎臓、または生理食塩水で前処理した虚血マウス、もしくは虚血障害の１時間前、最中、１時間後にＮＧＡＬで処理した虚血マウスの虚血２４時間後の腎臓におけるアポトーシスの定量（上）および増殖（中）を示す。
【０１７７】
【図９】非虚血対照マウスの、または生理食塩水で前処理した虚血マウス、もしくは虚血障害の１時間前、最中、１時間後にＮＧＡＬで処理した虚血マウスの虚血２４時間後の腎臓において算出された増殖：アポトーシスの比を示す。
【図１０】尿のみ、尿およびＮＧＡＬ混合（尿＋Ｎｇａｌ）、尿およびＮＧＡＬ：シデロホア混合（尿＋Ｎｇａｌ：Ｓｉｄ）、血漿のみ、緩衝液のみ、緩衝液およびＮＧＡＬ混合（緩衝液＋Ｎｇａｌ）、緩衝液およびＮＧＡＬ：シデロホア混合（緩衝液＋Ｎｇａｌ：Ｓｉｄ（１））、第二緩衝液およびＮＧＡＬ：シデロホア混合（緩衝液＋Ｎｇａｌ：Ｓｉｄ（２））、シデロホアが鉄で飽和された第三緩衝液およびＮＧＡＬ：シデロホア混合（緩衝液＋Ｎｇａｌ：Ｓｉｄ：Ｆｅ）において検出される５５Ｆｅの結合を示す。
【図１１Ａ】健康な被験者（正常）、または急性腎臓壊死（ＡＴＮ）もしくは慢性腎不全（ＣＦＲ）を患う被験者、または腎臓疾患がないと診断された肝硬変、血色素沈着症、または膵癌を患う被験者（その他）からのヒト尿サンプルにおけるＮＧＡＬタンパク質の免疫ブロットを示す。モノクローナル抗ヒトＮＧＡＬ（Ｍｏ）およびポリクローナル抗マウスＮＧＡＬ（Ｐｏ）抗体は、組換えおよびヒト固有のＮＧＡＬおよびＮＧＡＬ標準物質を認識する。
【図１１Ｂ】ＮＧＡＬ標準物質と比較した、健康な被験者（正常）、または急性腎臓壊死（ＡＴＮ）もしくは慢性腎不全（ＣＦＲ）を患う被験者、または腎臓疾患がないと診断された肝硬変、血色素沈着症、または膵癌を患う被験者（その他）からのヒト血清サンプルにおけるＮＧＡＬタンパク質の免疫ブロットを示す。
【図１１Ｃ】健康な被験者（正常）、または急性腎臓壊死（ＡＴＮ）もしくは慢性腎不全（ＣＦＲ）を患う被験者からの尿中のＮＧＡＬタンパク質濃度の量的比較を示す。ＡＴＮはさらに非敗血症と敗血症の群に分類した。
【図１１Ｄ】健康な被験者（正常）、または急性腎臓壊死（ＡＴＮ）もしくは慢性腎不全（ＣＦＲ）を患う被験者からの血清中のＮＧＡＬタンパク質濃度の量的比較を示す。ＡＴＮはさらに非敗血症と敗血症の群に分類した。
【図１１Ｅ】５０、５、および１ｎｇの標準ＮＧＡＬタンパク質と、ＡＴＮ障害マウスおよび偽処理対照マウスの尿ＮＧＡＬの免疫ブロットを示す。
【０１７８】
【図１２Ａ】健康なヒト腎臓（正常）におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色を示す。
【図１２Ｂ】健康なヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色を示す。
【図１２Ｃ】健康なヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色を示す。
【図１２Ｄ】敗血症による虚血性ＡＴＮ（虚血性ＡＴＮ）のヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【図１２Ｅ】嘔吐および下痢が原因の血液量減少による虚血性ＡＴＮのヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【図１２Ｆ】心疾患による虚血性ＡＴＮのヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【図１２Ｇ】ビスホスフォネートが原因の腎毒性による毒性ＡＴＮ（毒性ＡＴＮ）のヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【図１２Ｈ】セファロスポリンの毒性が原因の腎毒性による毒性ＡＴＮのヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【図１２Ｉ】ヘモグロビン尿症が原因の腎毒性による毒性ＡＴＮのヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【図１２Ｊ】ＮＧＡＬが半月体に弱く発現する、糸球体疾患のヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色を示す。
【図１２Ｋ】ＮＧＡＬがネフローゼの近位尿細管で弱く発現する、糸球体疾患のヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色を示す。
【０１７９】
【図１３Ａ】偽処理（正常）、虚血（ＡＴＮ）、およびＮＧＡＬ処理ＡＴＮ障害（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）の腎臓の組織切片を示す。尿細管の核の損失がＡＴＮでは見られるが、皮質（中）および髄質（下）の尿細管内円柱と共に、対照またはＡＴＮ＋Ｎｇａｌ切片（上）、では見られない。ＮＧＡＬ前処理は結果的に皮質尿細管を保護するが、残りの皮質髄質円柱には影響しなかった。
【図１３Ｂ】管腔円柱およびＮＧＡＬでの前処理による皮質尿細管の回復をＰＡＳ染色で強調した、虚血（ＡＴＮ）、およびＮＧＡＬ処理ＡＴＮ障害（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）腎臓の組織切片を示す。
【図１３Ｃ】ＮＧＡＬによる虚血性皮質の回復を示す、偽処理（偽）、虚血（ＡＴＮ）、およびＮＧＡＬ処理ＡＴＮ障害（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）腎臓のジャブロンスキースコアを示す。
【図１４Ａ】腎臓切片のＮカドヘリン染色を示す。虚血再灌流（ＡＴＮ）ではほとんど見られないが、ＮＧＡＬが投与された場合（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）は回復し検出される。
【図１４Ｂ】虚血再灌流動物および偽処理動物におけるＮカドヘリン断片（矢印）、およびＮＧＡＬ処理動物での断片抑制によって示される、虚血（ＡＴＮ）と比較した、ＮＧＡＬ処理（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）による全長Ｎカドヘリンタンパク質濃度の回復を示す。ＧＡＰＤＨは負荷対照である。
【図１４Ｃ】ＮＧＡＬ前処理によって軽減された虚血再灌流マウス（Ｉ／Ｒ）におけるＴＵＮＥＬ陽性アポトーシス細胞（蛍光）の尿細管を示す。トップロールは核対比染色である。
【図１４Ｄ】偽処理対照群（偽）、虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）、およびＮＧＡＬ処理虚血再灌流（＋Ｎｇａｌ）マウスにおけるアポトーシス様核を含む尿細管の比率の定量分析を示す。
【図１４Ｅ】偽処理（偽）、虚血再灌流（ＡＴＮ）、またはＮＧＡＬ処理の虚血再灌流（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）の腎臓におけるヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）発現の免疫ブロットを示す。組換えＨＯ−１（ＨＯ−１）およびラット皮質は比較用である。ＧＡＰＤＨは負荷対照である。
【０１８０】
【図１５】ＮＧＡＬ１００μｇをマウスに腹腔内注射した後の血液および尿中ＮＧＡＬタンパク質のクリアランスの免疫ブロットを示す。
【図１６Ａ】近位尿細管（下）で見られるが、糸球体または髄質（上）では見られない、大きな小胞に局在する蛍光標識（Ａｌｅｘａ５６８）ＮＧＡＬを示す。非結合蛍光色素は腎臓を標識しなかった。
【図１６Ｂ】近位尿細管のＳ１およびＳ２部位でのＦＩＴＣデキストランと共に局在するＡｌｅｘａ５６８−ＮＧＡＬを示す。
【図１６Ｃ】注入後１時間および５時間の腎臓に見られるＮＧＡＬの全長および１４ｋＤａ断片を示す１２５Ｉ−ＮＧＡＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離。
【図１６Ｄ】５５Ｆｅ負荷シデロホア−ＮＧＡＬの腹腔内注射１時間後の腎臓のオートラジオグラフを示す。放射活性減衰は皮質で検出され、近位尿細管細胞の腔内付近に関連している。
【図１６Ｅ】髄質で放射活性が検出されなかった、５５Ｆｅ負荷シデロホア−ＮＧＡＬの腹腔内注射１時間後の腎臓のオートラジオグラフを示す。
【図１７Ａ】は、３０分間虚血させたマウスでの血漿クレアチニンを示す。最初のグラフは、虚血１５分前または虚血後１時間以内に用いた場合にＸＬ−１細菌（シデロホアを含有）由来のホロＮＧＡＬ（≧１μｇ）が腎機能を回復させることを示す。しかし投与が遅れた場合、ＮＧＡＬは無効である。第二グラフは、ＢＬ２１細菌（シデロホア不含）由来のアポＮＧＡＬが最小限の活性しか持たないが、エンテロチェリンを添加すると保護的に働く。鉄不含（アポＮＧＡＬ：Ｓｉｄ）および鉄含有シデロホア（アポＮＧＡＬ：Ｓｉｄ：Ｆｅ）は共に保護効果を持つ。対照的に、ガリウム含有複合体（アポＮＧＡＬ：Ｓｉｄ：Ｇａ）は、ＤＦＯの単独投与またはシデロホア不含（Ｓｉｄ）と同様に無効であった。近位尿細管によって濾過され再吸収されるリポカリンであるレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）は無効であった。
【図１７Ｂ】ＮＧＡＬの免疫沈降製剤を示す。ＮＧＡＬ：Ｓｉｄはエンテロチェリンを含むが鉄は含まない。ＮＧＡＬ：Ｓｉｄ：Ｆｅはシデロホアと鉄を含む。
【０１８１】
【図１８Ａ】尿中に鉄結合補因子が存在することを示す。緩衝液は５５Ｆｅ（タンパク質不含）、アポＮＧＡＬ、アポＮＧＡＬ＋シデロホア、またはアポＮＧＡＬ＋シデロホア＋非標識鉄と混合する。一連の洗浄の後、５５ＦｅはアポＮＧＡＬ＋シデロホアによって保持されるが、アポＮＧＡＬまたは鉄飽和シデロホアと結合したアポＮＧＡＬによっては保持されない。このことは不飽和シデロホアがＮＧＡＬによる５５Ｆｅの保持に必要なことが示している。
【図１８Ｂ】示すように、尿（＜３，０００Ｄａ）が５５ＦｅまたはアポＮＧＡＬと混合され、その後１０ＫＤａ膜上で３回洗浄すると、アポＮＡＧＬ＋尿が５５Ｆｅを保持することを示す。５５Ｆｅ保持は過剰なクエン酸鉄（Ｆｅ）の添加により遮断される。活性は鉄飽和エンテロチェリン（Ｓｉｄ：Ｆｅ）によっても遮断される。
【図１９】生体（図０と１）または死体（図２と３）腎臓移植後１時間以内に得た腎臓生検を示す。切片はＮＧＡＬ抗体で染色した。ＮＧＡＬ発現は長期の虚血期間を経た死体群で有意に増加した。
【図２０】生体（ＬＲＤ、ｎ＝４）または死体（ＣＡＤ，ｎ＝４）腎臓移植の移植後２時間以内に得た尿サンプルのＮＧＡＬ抗体プローブに用いたウェスタンブロットを示す。尿中のＮＧＡＬ発現は手術前にはなかった。ＮＧＡＬ発現はＬＲＤ群よりもＣＡＤ群の方が有意に増加した。
【図２１】ＬＲＤとＣＡＤを比較した尿ＮＧＡＬのウェスタンブロットによる定量分析を示し、ＣＡＤが有意な発現増加を示している。
【図２２】低温虚血の時間に関する、ＣＡＤ移植の２時間後に得られた尿ＮＧＡＬの相関を示す。尿ＮＧＡＬの発現度合いは虚血時間と相関する。
【図２３】手術後２〜４日に測定した最大血清クレアチニンに関する、ＣＡＤ移植の２時間後に得られた尿ＮＧＡＬの相関を示す。尿ＮＧＡＬの発現度合いは最大血清クレアチニンと相関する。
【０１８２】
【図２４】独立した１０本の標準曲線から得られた直線関係に関するＮＧＡＬのＥＬＩＳＡの標準曲線を示す。
【図２５】心肺バイパス（ＣＰＢ）後ＡＲＦを術中に発症した患者の経時的血清ＮＧＡＬ測定値を示す（ｎ＝１０）。
【図２６】ＡＲＦ（四角、ｎ＝１０）を発症したＣＰＢ患者と、手術後何もない患者（菱形、ｎ＝３０）を比べた経時的血清ＮＧＡＬ濃度の平均値±ＳＤを示す。
【図２７】ＣＰＢ後にＡＲＦを発症したＣＰＢ患者の経時的尿ＮＧＡＬ測定値を示す（ｎ＝１１）。
【図２８】ＡＲＦ（菱形、ｎ＝１１）を発症したＣＰＢ患者と、術後何もない患者（四角、ｎ＝３０）を比べた経時的尿ＮＧＡＬ濃度の平均値±ＳＤを示す。
【図２９】ＣＰＢ２時間後の尿ＮＧＡＬ濃度とＣＰＢ時間との相関を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は臓器における虚血性および腎毒性障害を軽減または改善する方法に関する。本発明はさらに虚血性および毒素誘導性障害または発作に関連する各種疾病を患う患者の処置に関する。本発明はさらに急性または慢性腎臓障害を患う患者の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
臓器への酸素流量が減少することを虚血というが、虚血が生じると、その影響を受ける細胞のうち実質上全ての細胞小器官および細胞内システムの構造と機能に、複雑な一連の現象を招くこととなる。虚血再灌流（血流の再開）障害は活性酸素種（ＲＯＳ）および活性窒素種（ＲＮＳ）の過剰産生を導き、その結果、細胞の機能または完全性の損失につながる、ミトコンドリアの酸化的リン酸化の変化、ＡＴＰの減少、細胞内カルシウムの上昇、およびプロテインキナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、およびヌクレアーゼの活性化等の一連の現象を招く酸化ストレスの原因となる。これまでに再灌流を伴う虚血によって誘導される炎症反応が大きな原因となって組織と臓器が損傷することが示されてきた。
【０００３】
虚血再灌流障害は臓器移植において深刻な問題である。なぜならば用いる臓器は身体から取り出され、血液源から分離され、その結果かなりの時間酸素と栄養が除かれるからである。今日の腎臓移植技術における重要な課題は、術後の急性尿細管壊死（ＡＴＮ）が原因となる比較的高い発症率の移植後機能障害（ＤＧＦ）にある。詳しくは、移植を行っている多くの病院で腎臓移植の約２０〜３５％にＤＧＦの影響が見られ、腎臓移植の手術直後における合併症としては最多である。ＤＧＦの発症率と定義は移植を行う病院によってさまざまであるが、発症した結果として最も多いのが、入院期間の延長、侵襲的医療行為の追加、患者および健康管理システムに対する費用の追加等である。ＤＧＦは個々の患者に影響するだけでなく、利用可能な臓器供給におこる枯渇の結果として、臓器調達および共有のためのインフラにも影響する。ＤＧＦはまた早期急性拒絶反応が発生する危険性を高め慢性拒絶反応による移植片の早期損失を増大させる。
【０００４】
現行の保存方法によると臓器保存が原因となる低温虚血は、移植後にＤＧＦを起こす主要な危険因子としてみなされてきた。腎臓の場合、２４時間を超える低温虚血時間はＤＧＦの危険性の増加と大いに関連する。１９６０年代半ばに、機械による灌流と低温沈降処理血漿に由来する溶液を用いることで腎臓の低温貯蔵が効果なものとなった。その後低温晶質液の使用を含む簡単な低温貯蔵法が導入された。初期の腎臓での成功以来、保存液は細胞膨張の抑制および代謝支援物の提供によって低音虚血障害を防ぐためにデザインされた完全合成の限定培地に発展した。初期の合成液であるウィスコンシン大学のラクトビオン酸をベースとした溶液（ＵＷ）が膵臓および肝臓用に使用されてきた。合成かつ血清無添加で調合された保存液の出現によって、臓器保存が可能となる質と期間が改善された。しかしこれにもかかわらず腎臓におけるＤＧＦの臨床データおよび腎細胞の構造と形態を含む他の問題点は、そのような溶液が虚血障害または発作の予防において完全には成功していないことを明らかに示している。
【０００５】
さらに、虚血性または腎毒性障害に次ぐ急性腎不全（ＡＲＦ）も、対症療法における大きな進歩にもかかわらず依然高い死亡率で、臨床腎臓学においては周知の問題でありながら完治しない恐れが残されたままである。何十年にも渡り多くの研究が行われ、持続性血管収縮、尿細管閉塞、細胞の構造および代謝の変化、および炎症反応のＡＲＦの病因としての役割を解明してきた。ＡＲＦの処理および処置は、ＡＲＦに対する初期マーカーの欠如だけでなく、虚血に対する腎臓の多面的な反応によって妨げられてきた。虚血性および腎毒性の腎臓障害に関する細胞学および分子生物学における最近の進歩は、近位尿細管細胞が、細胞極性の損失、アポトーシスおよび壊死による細胞死、生細胞の脱分化および増殖、および上皮表現型の再構築を含む複雑で一時的な一連の事象を経験することを示してきた。
【０００６】
虚血性または腎毒性による損傷の結果として、細胞は２つの異なった過程を経て死ぬことがある。アポトーシスすなわちプログラム細胞死（「細胞の自殺」）は、個々の細胞に影響する老化した細胞、損傷した細胞、または異常な細胞を取り除くための生理学的機構である。アポトーシスはエンドヌクレアーゼによって開始され、ＤＮＡが１８０〜２００塩基対の倍数で断片化するという特徴がある。アポトーシス細胞はタンパク質分解酵素または毒性酸素種を放出せずにマクロファージまたは近隣の細胞によって消化されるが、この過程に炎症が伴うことはない。これとは対照的に、壊死（「細胞の殺人」）は細胞集団に影響する病理学的過程で、局所的な組織崩壊、炎症、およびしばしば重篤な全身性の結果を導く。アポトーシスによる細胞死は、虚血、虚血性灌流、腎毒性、多嚢胞腎臓疾患、閉塞、および糸球体疾患を含む増加している一連の腎臓疾患において重要な役割を果たすことが現在示されている。そのため、アポトーシスの下方制御はいくつかの急性および慢性腎臓障害を改善する無類かつ強力な処置法を提供する。
【０００７】
血清クレアチニン値が次のいずれかであった場合、その患者は急性腎不全であるとみなされる。（１）血清クレアチニンのベースライン濃度が２．０ｍｇ／ｄＬ未満の場合で、少なくとも０．５ｍｇ／ｄＬの増加がある、（２）血清クレアチニンのベースライン濃度が２．０ｍｇ／ｄＬ以上の場合で、少なくとも１．５ｍｇ／ｄＬの増加がある、または（３）レントゲン撮影剤に曝された結果として、血清クレアチニンのベースライン濃度にかかわらず、少なくとも０．５ｍｇ／ｄＬの増加がある。
【０００８】
ｃＤＮＡマイクロアレイ技術は、虚血性および腎毒性障害直後の腎臓で、転写を強く誘導する好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）の同定を可能にした。腎臓でのＮＧＡＬの役割はまだ解明されていない。非特許文献１に示すとおり、ＮＧＡＬはタンパク質リポカリンファミリーの１つで、ヒト好中球の顆粒に見られる２５ｋＤａの分泌型糖タンパク質として特徴付けられる。リポカリン類は親油性の小物質を結合することが可能で、少なくとも２、３のリポカリンでは、例えば、ステロイド、ビリン、レチノイド、または他の脂質等の親油性リガンドを結合する機能を有した３次元のβバレル構造を共通に持つ。マウスおよびラット由来のマウス型（同族体）ＮＧＡＬは公知である。マウスでは、ＮＧＡＬはＮＧＡＬ，２４ｐ３タンパク質、ＳＩＰ２４、Ｐ２５、リポカリン２、およびウテロカリンとして示されている。ラットでのＮＧＡＬは、ＮＧＡＬまたはα２ミクログロブリンとして公知である。ヒトＮＧＡＬタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡがクローニングされ配列が決定されている。ヒトＮＧＡＬ遺伝子は、７つのエクソンと６つのイントロンを含み、やはりクローニングされ配列も決定されており、各種組織での発現が分析されてきた。ヒトＮＧＡＬ遺伝子は、１９または２０のアミノ酸シグナル配列を伴う１９７のアミノ酸でできたポリペプチドをコードし、成熟ＮＧＡＬポリペプチドには１７８のアミノ酸が含まれる。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｔｒｐモチーフ（成熟ヒトＮＧＡＬでアミノ酸番号４８〜５０）およびＴｈｒ−Ａｓｐ／Ａｓｎ−Ｔｒｙモチーフ（成熟ヒトＮＧＡＬでアミノ酸番号１３２〜１３４）が公知の全リポカリンに存在する。Ｘ線結晶解析を基に、これらのモチーフはリポカリン類に共通した第３βバレル構造において重要であることが示されてきた。ヒトＮＧＡＬ配列番号におけるシステイン残基９５と１９４は保存されており、分子内ジスルフィド結合を形成すると報告されている。ヒトＮＧＡＬは、成熟アミノ酸配列番号６５（ＮＧＡＬポリペプチド前駆体の番号で概ね８４または８５）に、唯一のＮグリコシル化部位（アスパラギン残基）を含む。
【０００９】
急性尿細管壊死（ＡＴＮ）の根底にあるといえるメカニズムは鉄の誤った局在化である。非結合鉄はＨ２Ｏ２のＯＨとＯＨ−への変換を触媒する（ハーバー・ワイス反応）、または活性型フェリル種またはパーフェリル種を形成することが可能だ。これらのイオンは、脂質、核酸、およびＤＮＡ骨格を含む多種類の分子に変異を誘発する。遊離ヘモグロビンおよびミオグロビンから尿または血中に放出された触媒性の鉄と過酸化脂質は、化学療法、虚血再灌流、移植性虚血、およびタンパク尿媒介尿細管損傷を含む多種類の急性腎不全において実証されてきた。動物に鉄を事前投与すると疾病は悪化し、逆に鉄キレート剤または細菌性シデロホアによる鉄のキレートは損傷を緩和する。非特許文献２に示すとおり、鉄触媒による損傷は腎臓機能障害の最も初期の現象の１つと考えられ、心臓および肝臓を含む他の臓器においても恐らく無視できないだろう。
【００１０】
細胞は鉄を担体タンパク質（トランスフェリン等）から細胞表面の鉄トランスポーター（二価金属トランスポーターＩ等）によって獲得する。細胞内の鉄は鉄反応性タンパク質（ＩＲＰ１、ＩＲＰ２等）、フェリチン複合体、およびヘムオキシゲナーゼＩの作用によって制御される。ＩＲＰ類は低酸素、酸化ストレス、およびリン酸化によって調整されるため、それらの活性の変化は、鉄が媒介する損傷から細胞を保護するフェリチン複合体の形成を制御することによって、虚血性疾患において重要な役割を果たしている可能性がある。フェリチンは鉄−リン−タンパク質の複合体で、約２３％鉄を含み、腸の粘膜で形成される。フェリチンは肝臓、脾臓、および骨髄等の組織における貯蔵型の鉄である。血液および筋肉にそれぞれあるヘモグロビンおよびミオグロビン分子は、酸素の細胞への輸送を触媒するために鉄の結合を必要とする。しかし触媒性の鉄は病因論において一番重要であるにかかわらず、虚血細胞または他の種類の組織損傷における鉄の輸送経路、貯蔵または代謝に関する他の側面はほとんど知られていない。
【００１１】
ＡＴＮを起こすには多くの経路があるにもかかわらず、多くの研究者が近位尿細管の細胞損傷全般に見られるメカニズムを発見してきた。これにはサイトカインの放出が含まれる。１つの案は、虚血性細胞と遊離のミオグロビンおよびヘモグロビン等の尿細管の毒がネフロンで局所的に高濃度の鉄を産生するということである。この鉄は触媒として活性があり酸素ラジカルを産生すると考えられている。鉄触媒による細胞損傷は病因となり、近位尿細管の機能不全につながることは、尿細管損傷が鉄キレート剤注入によって緩和されるという知見等によって証明される。鉄がメカニズムの中心となって虚血後の臓器機能障害を引き起こすという考えは、心臓虚血のインビトロモデルにおいて、鉄不含の細菌由来のシデロホアと呼ばれる鉄キレート剤を使用すると、虚血再灌流障害の影響が緩和されたという実験によっても裏付けされている。こうしたメカニズムはＡＴＮのさまざまな段階で見られる原則的な病因現象であると考えられる。鉄が触媒する損傷は腎臓の機能障害における最も初期の現象の１つであると考えられる。
【００１２】
どのように近位尿細管がＮＧＡＬを捕獲するのかは現在知られていない。実際、ほとんどのリポカリン類に対する受容体の明確な同定はなされていない。非特許文献３に示すとおり、おそらくレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）の再利用に必要なメガリンもまたＮＧＡＬ受容体である。非特許文献４に示すとおり、実際メガリンのノックアウトは尿中のＮＧＡＬの出現につながるが、これらの動物ではまた意外なことに、より高濃度のＮＧＡＬメッセージがあることが解っており、尿のＮＧＡＬは濾過負荷量を捉えられなかったのではなく、むしろ局所的な合成に由来するに違いないことを示唆している。このような不明瞭さにかかわらず、非特許文献５に示すとおり、ＮＧＡＬはＲＢＰおよびα−２ｕグロブリンリポカリン等の他のリポカリン類と同様に、メガリン経路によって細胞に侵入し、分解するためにリソソームに運ばれる。非特許文献６に示すとおり、これらのデータはメガリンを発現しない細胞系（胚性腎臓細胞等）およびタンパク質が分解されない場合におけるＮＧＡＬの輸送経路と対照をなす。トランスフェリンは細胞系では通常リサイクルされるが、非特許文献７に示すとおり、これもまた同様に近位尿細管におけるメガリン−クブリンを基にした経路によってリソソームへ運ばれた後分解される。このため、濾過後にＮＧＡＬはメガリンに捕獲され、近位尿細管によって分解され、リサイクルされないことを提示するのはもっともなことである。この仮説は、全長ＮＧＡＬが注入後しばらくしても血中に再び現れることがないという観察によって裏づけされる。
【非特許文献１】ジェルドセン（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ）その他著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー誌（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、１９９３年２６８巻、ｐ．１０４２５−１０４３２
【非特許文献２】モリ（Ｍｏｒｉ）その他著、「リポカリン−シデロホア−鉄複合体の細胞内輸送による腎臓の虚血再灌流障害の回復」、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション誌（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、２００５年１１５巻、ｐ．６１０−６２１
【非特許文献３】クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）その他著、米国腎臓学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．）、１９９９年１０巻（４）、ｐ．６８５−６９５
【非特許文献４】ヒルパート（Ｈｉｌｐｅｒｔ）その他著、キドニー・インターナショナル誌（Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．）、２００２年６２巻（５）、ｐ．１６７２−１６８１
【非特許文献５】ボーゴフ（Ｂｏｒｇｈｏｆｆ）その他著、アニュアル・レビュー・オブ・ファルマコロジー・アンド・トキシコロジー誌（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．）、１９９０年３０巻、ｐ．３４９−３６７
【非特許文献６】ヤン（Ｙａｎｇ）その他著、モレキュラー・セル誌（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ）、２００２年１０巻（５）、ｐ．１０４５−１０５６
【非特許文献７】コジラキー（Ｋｏｚｙｒａｋｉ）その他著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、２００１年９８巻（２２）、ｐ．１２４９１−１２４９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
腎臓等の臓器における例えば低温虚血障害等の虚血障害を予防、軽減、または改善するのに適した組成物および方法が依然求められている。かかる組成物は移植に用いられる臓器ばかりでなく患者自身の臓器処置にも有用だろう。薬剤投与後の患者において、例えば腎毒性等の細胞への毒性損傷を検出するのに使用できる新しいバイオマーカーも必要である。臓器移植によって引き起こされる組織および臓器への虚血再灌流障害と、臓器細胞の構造および代謝の変化とを処置し軽減する新しく改良された方法は、患者と同様に一般開業医にとっても明らかに有用で重要なことである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、および臓器における虚血、虚血再灌流、または毒素誘導性障害より一般的に選択した状態、障害または疾患を処置、軽減、改善、または予防する組成物および方法におけるＮＧＡＬの使用に関する。本発明はまた、前記状態、障害、または疾患を処置、軽減、改善、または予防するのに有効な量でＮＧＡＬを患者または被験者に投与する方法に関する。前記障害には、患者を虚血性腎臓障害、腎尿細管障害、または壊死またはアポトーシスにかかりやすくなる状態、処置、療法、または疾患に関連する腎臓障害が含まれ得る。前記障害には、急性（ショック、脳卒中、敗血症、外傷、感染症、炎症を含むがこれに限定されない）または慢性（高血圧、糖尿病、心疾患、狼瘡、感染症、炎症を含むがこれに限定されない）の腎臓の状態が含まれ得る。
【００１５】
本発明はまた、腎臓機能の衰退を改善するのに有効な量でＮＧＡＬを患者に投与することにより、患者の虚血性灌流障害によって誘導される腎臓のＮＧＡＬ機能の衰退を改善する方法を提供する。本局面によると、ＮＧＡＬ投与は虚血再灌流障害後の血清または血漿の高濃度クレアチニンを減少させる。ＮＧＡＬ投与量は細胞死を予防または改善するのに有効である。
【００１６】
本発明はさらに、腎臓の再上皮形成の促進または尿細管細胞の増殖に影響するのに有効な量で患者にＮＧＡＬを投与することで、急性または慢性の腎疾患における虚血、虚血性灌流、または毒素誘導性障害の後の腎臓の再上皮形成または尿細管細胞の増殖を促進する方法を提供する。
【００１７】
本発明の一実施形態は、急性腎不全（ＡＲＦ）を処置、軽減、予防、または改善する方法におけるＮＧＡＬの使用を含む。ＮＧＡＬは尿細管細胞の増殖を促進し、尿細管細胞のアポトーシスを軽減または改善することが証明されてきた。ここに開示する方法は、虚血再灌流または毒素誘導性障害によって誘導された患者の腎臓機能の衰退を改善し、さらにその患者における虚血障害に次ぐ急性腎疾患を処置、軽減、改善、または予防するために使用できる。
【００１８】
本発明はさらに、患者における移植臓器の移植後機能障害（ＤＧＦ）を軽減および／または処置する方法におけるＮＧＡＬの使用を提供する。いくつかの局面において、ＤＦＧは急性尿細管壊死（ＡＴＮ）によって引き起こされる。
【００１９】
本発明はまた、患者へ臓器を移植するための方法におけるＮＧＡＬの使用を提供する。前記方法を用いると、臓器移植の損失または急性拒絶反応を軽減または改善するのに有効な量でＮＧＡＬを１以上の（ｉ）臓器または（ｉｉ）提供者に投与することによって、臓器移植の損失または急性拒絶反応を軽減または改善できる。さまざまな局面において、前記臓器は腎臓、肝臓、心臓、脳、肺、胃、腸、結腸、膵臓、血管、膀胱、頚部、皮膚、またはこれらの一部もしくは切片より選択される。特定の局面において、前記臓器は死体または生体臓器提供者に属する。かかる状況において、ＮＧＡＬは前記臓器が患者に移植される前、最中、および／または後に患者に投与できる。前記臓器は死体臓器でもよく、かかる例において前記臓器は死体提供者から得られ、移植後の障害、発作、または臓器の損失を防ぐためにＮＧＡＬは死体または取り出した臓器に投与できる。前記臓器は生体臓器提供であってよく、かかる例において移植後の障害、発作、または臓器の損失を防ぐためにＮＧＡＬは取り出した臓器に投与できる。前記臓器は腎臓、肝臓、心臓、脳、肺、胃、膵臓、血管、膀胱、頚部、皮膚、またはこれらの一部もしくは切片であってよく、本発明の特定の局面において、前記臓器は腎臓である。
【００２０】
本発明はまた、オキシダント媒介アポトーシスが尿細管の細胞死の重要な原因である場合における、死体および生体の提供者の腎臓移植に関連したＮＧＡＬの使用を提供する。通常の合併症である急性腎不全（ＡＲＦ）に加えて、移植された腎臓における虚血再灌流障害は移植後機能障害（ＤＧＦ）を導くことが知られており、これは移植片の損失および急性拒絶反応の危険性を有意に増加させる。本明細書において述べるように、ＮＧＡＬは臓器移植に関連した虚血性の有害効果を軽減または改善する方法において採用される。一実施形態において、ＮＧＡＬは移植臓器の低温貯蔵中での使用等、死体腎臓移植の特徴であるＤＧＦを改善するために臓器保存液に添加できる。かかる方法によると、ＮＧＡＬは虚血性発作後に投与された場合にも少なくとも部分的に有効である。前記方法は患者の暗澹たる予後に通常関連する臨床的に関連のある既存の有害現象であるＡＲＦ等の確定した虚血状態に必要とされている新規治療的処置法を有利に提供する。臓器または移植片の移植における患者の虚血障害に関連するＤＧＦを阻止または改善する方法には、（ｉ）移植された臓器または移植片、（ｉｉ）移植された臓器の提供者、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方に対し、ＤＧＦまたは移植された臓器の損失もしくは急性拒絶反応を阻止または改善するのに有効な量でＮＧＡＬを注入、またはＮＧＡＬと接触することが含まれる。非制限に例示すると、移植用の前記臓器または移植片は、腎臓、心臓、脳、肺、胃、腸、結腸、膵臓、血管、膀胱、頚部、皮膚、またはそれらの一部もしくは切片より選択される。特定の局面では、前記臓器は腎臓である。さらに具体的には、移植された腎臓は死体または生体の提供者からの腎臓である。さらに、ＮＧＡＬは臓器保存液の一成分であり、例えば、ＮＧＡＬ含有臓器保存液は臓器移植の低温貯蔵中に使用される。
【００２１】
本発明はさらに、患者を虚血性腎臓障害にかかりやすくする可能性がある状態、処置、療法、または疾患に関連する腎臓障害を軽減、改善、予防、または保護する方法を提供する。前記方法には、患者の状態、処置、療法、または疾患に関連する腎臓障害を軽減、改善、予防、または保護するのに有効な量のＮＧＡＬを患者に投与することが含まれる。状態、処置、または療法を例示すると、造影剤処置、抗体処置、抗生剤処置、臓器移植、腎臓移植、死体腎臓移植、心臓処置、手術後の心臓処置、または中枢神経系処置を含むがこれに限定されない。本局面における疾患を例示すると、感染症、細菌感染症、急性腎疾患、慢性腎疾患、虚血再灌流障害、ショック、外傷、敗血症、脳卒中、心再灌流障害、心肺バイバス、開心術、および腹部手術を含むがこれらに限定されない。
【００２２】
本発明はまた、患者における腎尿細管の障害または壊死もしくはアポトーシスを処置、軽減、または改善する方法を提供し、治療上有効量のＮＧＡＬを患者へ投与することを含む。本局面によると、前記患者は例えば、急性腎疾患、慢性腎疾患、虚血再灌流障害、臓器移植、毒素誘導性障害、虚血、腎臓移植、ショック、外傷、敗血症、脳卒中、心再灌流障害、心肺バイパス後の腎尿細管障害、開心術後の腎尿細管障害、腹部手術後の腎尿細管障害、感染症、抗生剤処置、抗体処置、または造影剤処置等に影響される可能性がある。本方法では、ＮＧＡＬはまた腎臓の近位尿細管細胞を直接標的にしているため、腎尿細管細胞の増殖を促進するように機能し、その結果として腎尿細管障害または壊死もしくはアポトーシスを軽減または改善できる。
【００２３】
本発明はまた、毒による臓器への障害を処置、軽減、または改善するのに有効な量でＮＧＡＬを患者に投与することによって、患者の臓器への腎毒性障害を含む毒素誘導性障害を処置、軽減、または改善する方法を提供する。別の局面において、毒素誘導性障害を軽減または改善する方法には、ＮＧＡＬおよび患者に有害な治療用化合物の両方を共投与することを含み、前記ＮＧＡＬは、前記臓器への処置の有害効果を軽減または改善するのに有効な量で投与する。
【００２４】
本発明はまた、他の急性（ショック、脳卒中、敗血症、外傷、感染症、炎症を含むがこれに限定されない）および慢性（高血圧、糖尿病、心疾患、狼瘡、感染症、炎症を含むがこれに限定されない）腎臓障害を処置、軽減、または改善する方法を提供する。
【００２５】
本明細書において開示される本発明の各種方法において、ＮＧＡＬは、１種類以上の治療薬、例えば血管拡張剤または酸素供給剤と共に投与できる。さらに、ＮＧＡＬは、静脈注射または非経口投与を非制限に含む各種投与法によって担体、希釈剤、または添加剤からなる生理的に受容できる組成物において投与できる。さらに、ＮＧＡＬは、本明細書に記載するとおり虚血または腎毒性、臓器移植、または腎尿細管の発作、損傷、もしくは障害の前後および最中に投与できる。
【００２６】
本発明はまた、試験物質が腎臓障害を引き起こす可能性があるという示唆に従い、（ａ）マウス等の哺乳類モデルに腎毒性障害を引き起こす試験物質の投与、および（ｂ）その試験物質投与後に、前記哺乳類モデルの尿または血漿サンプル中の好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）の有無を決定することによって、腎毒性を誘導する可能性に関して、治療法を評価する方法を提供する。本方法の特定の局面において、ＮＧＡＬは前記試験物質の投与後約３時間以内に尿または血漿中に検出される。
【００２７】
本発明はまた、哺乳類の臓器への障害を処置、軽減、改善、予防するのに使用するための組成物に関係し、治療上有効量のＮＧＡＬまたはその誘導体またはアナログを含む。さらに、前記組成物は一般的に１：１のモル比でのシデロホアを含み、例えば、ＮＧＡＬとシデロホアの複合体である。前記組成物は本明細書に開示する任意の方法において使用が可能である。
【００２８】
本発明はまた、臓器での虚血、虚血再灌流、または毒素誘導性障害を含む虚血性または毒による状態および疾患を処置、軽減、改善、または予防する組成物と方法においてＮＧＡＬに関連したシデロホアの使用に関する。
【００２９】
本発明の一実施の形態において、ＮＧＡＬおよびシデロホアは、臓器での虚血、虚血再灌流、または毒素誘導性障害の処置、軽減、改善、または予防を促進するのに有効は量で、医薬組成物として投与される。
【００３０】
本発明はまた、内因性ＮＧＡＬによる臓器障害の処置、予防、改善、および軽減の促進のために、患者への投与において使用するためのシデロホアを含む医薬組成物に関する。別の一実施の形態において、一般的にＮＧＡＬとシデロホアの複合体化合物として共投与するための方法が提供される。別の一実施の形態において、内因性ＮＧＡＬの分泌によって開始される腎臓の再上皮形成の促進または尿細管細胞の増殖に正の影響があるように有効な量で、シデロホアが患者に投与される。
【００３１】
特に、本発明は、内因性ＮＧＡＬによる患者の移植後機能障害（ＤＧＦ）および臓器または移植片の移植拒絶反応の軽減または改善を促進する方法を提供し、ＤＧＦまたは移植された臓器の損失もしくは急性拒絶反応の軽減または改善を促進するのに有効な量で、（ｉ）移植された臓器または移植片、（ｉｉ）移植臓器の提供者、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方にシデロホアを投与するステップを含む。本方法は前記臓器への障害を処置、軽減、改善、または予防するのに有効な量でシデロホアを投与することを含む。
【００３２】
本発明の一実施の形態において、ＮＧＡＬ：シデロホア複合体は臓器保存液への添加が可能で、死体腎臓移植の特徴であるＤＧＦを改善するための移植臓器の低温貯蔵中に使用される。さらに別の一実施の形態において、緩衝液中に溶かしたシドロホア単独での臓器保存液への添加が可能で、死体腎臓移植の特徴であるＤＧＦを改善するための移植臓器の低温貯蔵中に使用される。
【００３３】
本発明はさらに、ＮＧＡＬまたはその誘導体もしくはアナログの投与によって、虚血または毒による損傷を受けた臓器における細胞内外の鉄を操作するための方法を提供する。本方法はまた、虚血または毒による臓器の損傷を処置、軽減、改善、またはさらに予防するのに有効な量で、鉄結合化合物、鉄結合化合物に対する補因子、またはシデロホアを投与することを含んでもよい。一般的に、前記虚血または毒によって損傷した臓器は腎臓である。
【００３４】
別の一実施の形態において」、本発明は治療上有効量のＮＧＡＬを含むための第一容器からなる治療キットを提供する。前記第一容器には少なくとも1本のバイアルと、少なくとも1本の試験管と、少なくとも１個のフラスコと、少なくとも1本の瓶とを含んでもよい。本キットはまた、少なくとも１組成物が入れられる第２容器と、および市販用にこれらの容器を共に固定する手段とを含んでもよい。本キットはまた、滅菌済みで薬剤として受容できる緩衝液または他の希釈液を含むための第３容器を含んでもよい。前記第一容器はシリンジであってもよい。前記容器を固定する手段は、前記容器が保持される射出または吹込み成形によるプラスチック枠であってもよい。または、前記バイアルは静脈内薬剤輸送システムに前記組成物を直接導入できるような方法で用意されてもよい。
【００３５】
さらに、本発明の局面、特徴、および利点は、添付図面と合わせて本発明の詳細な説明を一読し検討することで、深く理解されるだろう。
【００３６】
図面の簡単な説明
図１は、（図示のとおり）決められた量の組換え精製ＮＧＡＬのクーマシーブルー（ＣＢ）と高感度化学発光（ポリクローナルＮＧＡＬ抗体によるＥＣＬ）分析を示す。
【００３７】
図２は、ポリクローナルＮＧＡＬ抗体を用いた、注入１時間後の非虚血対照動物からの腎臓、または１時間もしくは３時間後の虚血性腎臓の免疫蛍光染色を示す。
【００３８】
図３は、ＮＧＡＬ投与１時間以内の非虚血（ＮＩ）および虚血（Ｉ）動物からの尿サンプル中ＮＧＡＬを検出するためのウェスタンブロットを示す。
【００３９】
図４は、非虚血対照マウス、生理食塩水前処理虚血マウス、または虚血の１時間前、最中、または１時間後にＮＧＡＬで処理した虚血マウスからの腎臓をヘマトキシリンエオシンで染色した切片を示す。
【００４０】
図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃは、生理食塩水で前処理した、または虚血の１時間前、最中、１時間後にＮＧＡＬで処理した虚血マウスからの腎臓の組織切片のスコアを示す。本切片は、任意の０から４のスケールを用いて尿細管拡張（図５Ａ）、尿細管円柱（図５Ｂ）、および尿細管細胞壊死（図５Ｃ）について分析しスコアを付けた。
【００４１】
図６は、非虚血対照マウス、または生理食塩水で前処理した虚血マウスにおいて測定された血清クレアチニン（Ｐｒｅ Ｓａｌ）、または虚血障害の１時間前（Ｐｒｅ ＮＧＡＬ）、最中（Ｄｕｒ ＮＧＡＬ）、１時間後（ＰｏｓｔＮＧＡＬ）にＮＧＡＬ処理した虚血マウスの虚血２４時間後において測定された血清クレアチニンを示す。
【００４２】
図７は、非虚血対照マウスの代表的な切片、または生理食塩水で前処理した虚血マウス、もしくは虚血障害の１時間前、最中、１時間後にＮＧＡＬで処理した虚血マウスの虚血２４時間後の代表的な切片をＴＵＮＥＬ染色した結果を示す。矢印は、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）染色と比べた、低倍率および高倍率でのアポトーシスの特徴である密で断片化した濃い核の染色を指している。
【００４３】
図８は、非虚血対照マウスの腎臓、または生理食塩水で前処理した虚血マウス、もしくは虚血障害の１時間前、最中、１時間後にＮＧＡＬで処理した虚血マウスの虚血２４時間後の腎臓におけるアポトーシスの定量（上）および増殖（中）を示す。
【００４４】
図９は、非虚血対照マウスの、または生理食塩水で前処理した虚血マウス、もしくは虚血障害の１時間前、最中、１時間後にＮＧＡＬで処理した虚血マウスの虚血２４時間後の腎臓において算出された増殖：アポトーシスの比を示す。
【００４５】
図１０は、尿のみ、尿およびＮＧＡＬ混合（尿＋Ｎｇａｌ）、尿およびＮＧＡＬ：シデロホア混合（尿＋Ｎｇａｌ：Ｓｉｄ）、血漿のみ、緩衝液のみ、緩衝液およびＮＧＡＬ混合（緩衝液＋Ｎｇａｌ）、緩衝液およびＮＧＡＬ：シデロホア混合（緩衝液＋Ｎｇａｌ：Ｓｉｄ（１））、第二緩衝液およびＮＧＡＬ：シデロホア混合（緩衝液＋Ｎｇａｌ：Ｓｉｄ（２））、シデロホアが鉄で飽和された第三緩衝液およびＮＧＡＬ：シデロホア混合（緩衝液＋Ｎｇａｌ：Ｓｉｄ：Ｆｅ）において検出される５５Ｆｅの結合を示す。
【００４６】
図１１Ａは、健康な被験者（正常）、または急性腎臓壊死（ＡＴＮ）もしくは慢性腎不全（ＣＦＲ）を患う被験者、または腎臓疾患がないと診断された肝硬変、血色素沈着症、または膵癌を患う被験者（その他）からのヒト尿サンプルにおけるＮＧＡＬタンパク質の免疫ブロットを示す。モノクローナル抗ヒトＮＧＡＬ（Ｍｏ）およびポリクローナル抗マウスＮＧＡＬ（Ｐｏ）抗体は、組換えおよびヒト固有のＮＧＡＬおよびＮＧＡＬ標準物質を認識する。
【００４７】
図１１Ｂは、ＮＧＡＬ標準物質と比較した、健康な被験者（正常）、または急性腎臓壊死（ＡＴＮ）もしくは慢性腎不全（ＣＦＲ）を患う被験者、または腎臓疾患がないと診断された肝硬変、血色素沈着症、または膵癌を患う被験者（その他）からのヒト血清サンプルにおけるＮＧＡＬタンパク質の免疫ブロットを示す。
【００４８】
図１１Ｃは、健康な被験者（正常）、または急性腎臓壊死（ＡＴＮ）もしくは慢性腎不全（ＣＦＲ）を患う被験者からの尿中のＮＧＡＬタンパク質濃度の量的比較を示す。ＡＴＮはさらに非敗血症と敗血症の群に分類した。
【００４９】
図１１Ｄは、健康な被験者（正常）、または急性腎臓壊死（ＡＴＮ）もしくは慢性腎不全（ＣＦＲ）を患う被験者からの血清中のＮＧＡＬタンパク質濃度の量的比較を示す。ＡＴＮはさらに非敗血症と敗血症の群に分類した。
【００５０】
図１１Ｅは、５０、５、および１ｎｇの標準ＮＧＡＬタンパク質と、ＡＴＮ障害マウスおよび偽処理対照マウスの尿ＮＧＡＬの免疫ブロットを示す。
【００５１】
図１２Ａは、健康なヒト腎臓（正常）におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色を示す。
【００５２】
図１２Ｂは、健康なヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色を示す。
【００５３】
図１２Ｃは、健康なヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色を示す。
【００５４】
図１２Ｄは、敗血症による虚血性ＡＴＮ（虚血性ＡＴＮ）のヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【００５５】
図１２Ｅは、嘔吐および下痢が原因の血液量減少による虚血性ＡＴＮのヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【００５６】
図１２Ｆは、心疾患による虚血性ＡＴＮのヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【００５７】
図１２Ｇは、ビスホスフォネートが原因の腎毒性による毒性ＡＴＮ（毒性ＡＴＮ）のヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【００５８】
図１２Ｈは、セファロスポリンの毒性が原因の腎毒性による毒性ＡＴＮのヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【００５９】
図１２Ｉは、ヘモグロビン尿症が原因の腎毒性による毒性ＡＴＮのヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【００６０】
図１２Ｊは、ＮＧＡＬが半月体に弱く発現する、糸球体疾患のヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色を示す。
【００６１】
図１２Ｋは、ＮＧＡＬがネフローゼの近位尿細管で弱く発現する、糸球体疾患のヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色を示す。
【００６２】
図１３Ａは、偽処理（正常）、虚血（ＡＴＮ）、およびＮＧＡＬ処理ＡＴＮ障害（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）の腎臓の組織切片を示す。尿細管の核の損失がＡＴＮでは見られるが、皮質（中）および髄質（下）の尿細管内円柱と共に、対照またはＡＴＮ＋Ｎｇａｌ切片（上）、では見られない。ＮＧＡＬ前処理は結果的に皮質尿細管を保護するが、残りの皮質髄質円柱には影響しなかった。
【００６３】
図１３Ｂは、管腔円柱およびＮＧＡＬでの前処理による皮質尿細管の回復をＰＡＳ染色で強調した、虚血（ＡＴＮ）、およびＮＧＡＬ処理ＡＴＮ障害（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）腎臓の組織切片を示す。
【００６４】
図１３Ｃは、ＮＧＡＬによる虚血性皮質の回復を示す、偽処理（偽）、虚血（ＡＴＮ）、およびＮＧＡＬ処理ＡＴＮ障害（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）腎臓のジャブロンスキースコアを示す。
【００６５】
図１４Ａは、腎臓切片のＮカドヘリン染色を示す。虚血再灌流（ＡＴＮ）ではほとんど見られないが、ＮＧＡＬが投与された場合（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）は回復し検出される。
【００６６】
図１４Ｂは、虚血再灌流動物および偽処理動物におけるＮカドヘリン断片（矢印）、およびＮＧＡＬ処理動物での断片抑制によって示される、虚血（ＡＴＮ）と比較した、ＮＧＡＬ処理（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）による全長Ｎカドヘリンタンパク質濃度の回復を示す。ＧＡＰＤＨは負荷対照である。
【００６７】
図１４Ｃは、ＮＧＡＬ前処理によって軽減された虚血再灌流マウス（Ｉ／Ｒ）におけるＴＵＮＥＬ陽性アポトーシス細胞（蛍光）の尿細管を示す。トップロールは核対比染色である。
【００６８】
図１４Ｄは、偽処理対照群（偽）、虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）、およびＮＧＡＬ処理虚血再灌流（＋Ｎｇａｌ）マウスにおけるアポトーシス様核を含む尿細管の比率の定量分析を示す。
【００６９】
図１４Ｅは、偽処理（偽）、虚血再灌流（ＡＴＮ）、またはＮＧＡＬ処理の虚血再灌流（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）の腎臓におけるヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）発現の免疫ブロットを示す。組換えＨＯ−１（ＨＯ−１）およびラット皮質は比較用である。ＧＡＰＤＨは負荷対照である。
【００７０】
図１５は、ＮＧＡＬ１００μｇをマウスに腹腔内注射した後の血液および尿中ＮＧＡＬタンパク質のクリアランスの免疫ブロットを示す。
【００７１】
図１６Ａは、近位尿細管（下）で見られるが、糸球体または髄質（上）では見られない、大きな小胞に局在する蛍光標識（Ａｌｅｘａ５６８）ＮＧＡＬを示す。非結合蛍光色素は腎臓を標識しなかった。
【００７２】
図１６Ｂは、近位尿細管のＳ１およびＳ２部位でのＦＩＴＣデキストランと共に局在するＡｌｅｘａ５６８−ＮＧＡＬを示す。
【００７３】
図１６Ｃは、注入後１時間および５時間の腎臓に見られるＮＧＡＬの全長および１４ｋＤａ断片を示す１２５Ｉ−ＮＧＡＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離。
【００７４】
図１６Ｄは、５５Ｆｅ負荷シデロホア−ＮＧＡＬの腹腔内注射１時間後の腎臓のオートラジオグラフを示す。放射活性減衰は皮質で検出され、近位尿細管細胞の腔内付近に関連している。
【００７５】
図１６Ｅは、髄質で放射活性が検出されなかった、５５Ｆｅ負荷シデロホア−ＮＧＡＬの腹腔内注射１時間後の腎臓のオートラジオグラフを示す。
【００７６】
図１７Ａは、３０分間虚血させたマウスでの血漿クレアチニンを示す。最初のグラフは、虚血１５分前または虚血後１時間以内に用いた場合にＸＬ−１細菌（シデロホアを含有）由来のホロＮＧＡＬ（≧１μｇ）が腎機能を回復させることを示す。しかし投与が遅れた場合、ＮＧＡＬは無効である。第二グラフは、ＢＬ２１細菌（シデロホア不含）由来のアポＮＧＡＬが最小限の活性しか持たないが、エンテロチェリンを添加すると保護的に働く。鉄不含（アポＮＧＡＬ：Ｓｉｄ）および鉄含有シデロホア（アポＮＧＡＬ：Ｓｉｄ：Ｆｅ）は共に保護効果を持つ。対照的に、ガリウム含有複合体（アポＮＧＡＬ：Ｓｉｄ：Ｇａ）は、ＤＦＯの単独投与またはシデロホア不含（Ｓｉｄ）と同様に無効であった。近位尿細管によって濾過され再吸収されるリポカリンであるレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）は無効であった。
【００７７】
図１７Ｂは、ＮＧＡＬの免疫沈降製剤を示す。ＮＧＡＬ：Ｓｉｄはエンテロチェリンを含むが鉄は含まない。ＮＧＡＬ：Ｓｉｄ：Ｆｅはシデロホアと鉄を含む。
【００７８】
図１８Ａは、尿中に鉄結合補因子が存在することを示す。緩衝液は５５Ｆｅ（タンパク質不含）、アポＮＧＡＬ、アポＮＧＡＬ＋シデロホア、またはアポＮＧＡＬ＋シデロホア＋非標識鉄と混合する。一連の洗浄の後、５５ＦｅはアポＮＧＡＬ＋シデロホアによって保持されるが、アポＮＧＡＬまたは鉄飽和シデロホアと結合したアポＮＧＡＬによっては保持されない。このことは不飽和シデロホアがＮＧＡＬによる５５Ｆｅの保持に必要なことが示している。
【００７９】
図１８Ｂは、示すように、尿（＜３，０００Ｄａ）が５５ＦｅまたはアポＮＧＡＬと混合され、その後１０ＫＤａ膜上で３回洗浄すると、アポＮＡＧＬ＋尿が５５Ｆｅを保持することを示す。５５Ｆｅ保持は過剰なクエン酸鉄（Ｆｅ）の添加により遮断される。活性は鉄飽和エンテロチェリン（Ｓｉｄ：Ｆｅ）によっても遮断される。
【００８０】
図１９は、生体（図０と１）または死体（図２と３）腎臓移植後１時間以内に得た腎臓生検を示す。切片はＮＧＡＬ抗体で染色した。ＮＧＡＬ発現は長期の虚血期間を経た死体群で有意に増加した。
【００８１】
図２０は、生体（ＬＲＤ、ｎ＝４）または死体（ＣＡＤ，ｎ＝４）腎臓移植の移植後２時間以内に得た尿サンプルのＮＧＡＬ抗体プローブに用いたウェスタンブロットを示す。尿中のＮＧＡＬ発現は手術前にはなかった。ＮＧＡＬ発現はＬＲＤ群よりもＣＡＤ群の方が有意に増加した。
【００８２】
図２１は、ＬＲＤとＣＡＤを比較した尿ＮＧＡＬのウェスタンブロットによる定量分析を示し、ＣＡＤが有意な発現増加を示している。
【００８３】
図２２は、低温虚血の時間に関する、ＣＡＤ移植の２時間後に得られた尿ＮＧＡＬの相関を示す。尿ＮＧＡＬの発現度合いは虚血時間と相関する。
【００８４】
図２３は、手術後２〜４日に測定した最大血清クレアチニンに関する、ＣＡＤ移植の２時間後に得られた尿ＮＧＡＬの相関を示す。尿ＮＧＡＬの発現度合いは最大血清クレアチニンと相関する。
【００８５】
図２４は、独立した１０本の標準曲線から得られた直線関係に関するＮＧＡＬのＥＬＩＳＡの標準曲線を示す。
【００８６】
図２５は、心肺バイパス（ＣＰＢ）後ＡＲＦを術中に発症した患者の経時的血清ＮＧＡＬ測定値を示す（ｎ＝１０）。
【００８７】
図２６は、ＡＲＦ（四角、ｎ＝１０）を発症したＣＰＢ患者と、手術後何もない患者（菱形、ｎ＝３０）を比べた経時的血清ＮＧＡＬ濃度の平均値±ＳＤを示す。
【００８８】
図２７は、ＣＰＢ後にＡＲＦを発症したＣＰＢ患者の経時的尿ＮＧＡＬ測定値を示す（ｎ＝１１）。
【００８９】
図２８は、ＡＲＦ（菱形、ｎ＝１１）を発症したＣＰＢ患者と、術後何もない患者（四角、ｎ＝３０）を比べた経時的尿ＮＧＡＬ濃度の平均値±ＳＤを示す。
【００９０】
図２９は、ＣＰＢ２時間後の尿ＮＧＡＬ濃度とＣＰＢ時間との相関を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９１】
定義
本明細書で使用されるとおり「臓器」という用語は、ヒトを含む哺乳類等の生物におけるある特定の機能または機能群を働かせる細胞および組織から成る生物学的に分化した構造を意味する。代表的な臓器には、腎臓、肝臓、心臓、骨、軟骨、皮膚、肺、血管、膀胱、頚部、胃、腸、膵臓、小腸、結腸、脳、およびそれらの一部または切片を含むがこれに限定されない。
【００９２】
本明細書で使用されるとおり「腎臓障害」または「腎疾患」という用語は、急性（虚血、虚血再灌流、腎毒性、ショック、脳卒中、敗血症、外傷、感染症、炎症を含むがこれに限定されない）または慢性（高血圧、糖尿病、心疾患、狼瘡、感染症、炎症が含むがこれに限定されない）の腎臓の障害または状態を含むものとする。
【００９３】
「薬剤として受容できる」、「薬理学的に受容できる」および「生理学的に受容できる」という文言は、例えばヒト等の動物に投与した場合に、有害現象、アレルギー反応、または他の不適当な反応を起こさない分子要素および組成物を示す。
【００９４】
本明細書で使用されるとおり「薬剤として受容できる担体」という文言は、その生物学的な効果に影響せずに、１つの臓器または体の一部から、別の臓器または体の一部へ、本発明の組成物を輸送または運搬することに関係する、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、添加剤、溶剤、またはカプセル等の物質、組成物または賦形剤を意味する。各担体は、かかる組成物の他の成分と適合し、被験者に対して無害であるという意味で「受容できる」ようにすべきである。薬剤として受容できる担体としての役目を果たすことのできる物質には、例えば、当業者が通常知っていると思われもので、あらゆる全ての溶剤、分散媒、被覆剤、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗細菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬剤、薬剤安定化剤、ゲル、結合剤、賦形剤、壊変剤、滑剤、甘味料、香料、色素、それらの類似物質や組み合わせが含まれるがこれに限定されない。ＮＧＡＬ、シデロホア、またはそれらの複合体もしくは他の選択できる活性剤または有効成分と不適合な場合を除いて、従来のいかなる担体も治療または医薬組成物において、その使用が考えられる。
【００９５】
「治療上有効量」という文言は、動物または患者等の受容者において、本明細書に記載される処置に特に関係して、有益な結果を出すのに有効な、ＮＧＡＬ、シデロホア、またはそれらの複合体もしくは他の選択できる活性剤または有効成分の量を示す。かかる量は公開されている文献を調べたり、インビトロ試験または健康な動物での代謝実験を行ったりすることで、最初に決定できる。臨床で使用する前に、一般的に広く受容されている処置すべき特定疾患の動物モデルでの確認実験を行うことが有効である。ある特定の実施の形態で用いる一般的な動物モデルはげっ歯類すなわちネズミ科である。かかるモデルは使用するのに経済的であり、特に、得られる結果は臨床での予測値として広く受け入れられる。
【００９６】
ＮＧＡＬに関係する「誘導体（類）」という用語は、虚血、腎尿細管壊死、腎毒性、虚血再灌流障害等の特性への望ましい効果をさらに保持する化学的に修飾されたＮＧＡＬ化合物、物質、阻害剤、または刺激剤を示す。かかる誘導体には親分子の１以上の化学的部分の添加、除去、または置換が含まれてもよい。かかる化学的部分には、水素等の元素、ハロゲン化合物、またはメチル基等の分子群が含まれるがこれに限定されない。かかる誘導体は当業者が知るいかなる方法によっても調製できる。かかる誘導体の特性は当業者が知るいかなる方法または記載されたいかなる方法によっても望ましい特性であるかを試験できる。
【００９７】
「アナログ」という用語は、当業者が理解するとおり構造的に等価または類似の物質を含む。
【００９８】
「患者」、「受容者」、または「被験者」は、温血動物等の動物または生物を示す。動物の例には、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ネコ、イヌ、げっ歯類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、および雌ウシ等の哺乳類が含まれるがこれに限定されない。本発明は特にヒトの患者および被験者に適している。
【００９９】
「阻害剤」とは、細胞内または細胞からのタンパク質もしくは生物化合物の活性、機能、産生、もしくは分泌、またはｍＲＮＡの翻訳における測定可能ないかなる減少をも作り出す化合物、物質または薬剤を意味する。
【０１００】
移植された臓器に関して本明細書で使用されるとおり、虚血障害または虚血再灌流障害の「軽減」とは、（ｉ）例えば保存液中もしくは死体にある臓器、または（ｉｉ）患者に移植された臓器の損傷の測定可能ないかなる減少、縮小、または反転をも示す。同様に、「軽減する」とは、保存される臓器、または患者に移植される臓器の損傷、障害、または発作の測定可能ないかなる減少、縮小、または完全な阻害をも示す。
【０１０１】
本明細書で使用されるとおり「ａ」および「ａｎ」は「１またはそれ以上」を示す。さらに具体的には、組み合わせまたは対象物を採用する方法を請求する請求項における「含む」「有す」または他の非制限語句の使用は、「１またはそれ以上の対象物」が、請求された方法または組み合わせにおいて採用できることを示す。
【０１０２】
本発明は、腎臓等の臓器の虚血障害、虚血性灌流障害、および毒素誘導性障害を処置、軽減、または改善する方法において使用する好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンすなわちＮＧＡＬを提供する。本発明はまた、急性腎臓障害（ショック、外傷、脳卒中、敗血症、感染症、炎症、結石、または手術を含むがこれに限定されない）および慢性腎臓障害（高血圧、糖尿病、心疾患、、狼瘡、炎症、糸球体腎炎、および間質性腎炎を含むがこれに限定されない）を処置、軽減、または改善する方法でのＮＧＡＬの使用を含む。理論的拘束力は望まないものの本発明によると、ＮＧＡＬ投与は、尿細管細胞死すなわちアポトーシスを制限し、再上皮形成すなわち虚血再灌流障害後の生細胞の脱分化および増殖ならびに上皮表現型の再樹立を含む腎臓の虚血後の生細胞の回復を促進するよう、尿細管の細胞死に影響することが解っていた。ＮＧＡＬ投与はまた、虚血障害後の血清および血漿のクレアチニン濃度の上昇を減少させることも証明されている。
【０１０３】
ヒトＮＧＡＬは２５ｋＤａのタンパク質で、ヒト好中球由来のゼラチナーゼと共有結合し、腎臓、気管、肺、胃、および結腸を含む数種のヒト組織において非常に低いレベルで発現する。ＮＧＡＬ発現は刺激を受けた上皮によって分泌され強く誘導される。例えば、ＮＧＡＬ濃度は、急性細菌感染患者の血清、喘息または慢性閉塞性肺疾患患者の喀痰、および気腫肺からの気管支液中で上昇する。ＮＧＡＬはまた、虚血障害直後の腎臓において最大に誘導される遺伝子の１つである。かかるデータは遺伝子チップによるｍＲＮＡの解析に由来し、損傷を受けた腎臓がＮＧＡＬを合成していることを示す。他の研究では、炎症疾患を持つ患者の血清において濃度の上昇が検出されている。そのため、我々は慢性状態の腎臓疾患と比較したヒトのＡＴＮにおけるＮＧＡＬの発現率を評価した。ＮＧＡＬは臨床的にＡＴＮと定義された場合に発現が多くなり、ヒト腎臓生検の近位尿細管に出現する。ＮＧＡＬはまた、量は少ないが慢性腎疾患のいくつかの状態においても腎臓で発現する。ＡＴＮを起こす虚血または虚血再灌流のモデルマウスもまたＮＧＡＬを高レベルに発現する。ＮＧＡＬをマイクログラムの量で注入すると、血漿クレアチニンおよび腎臓の組織分析によって測定されるＡＴＮに対して劇的な保護を示した。腎臓の保護は細菌のシデロホアを含むＮＧＡＬタンパク質が近位尿細管に到達するためである。
【０１０４】
ＮＧＡＬを含む薬剤の組成物または成分の調製は、レミントン薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）第１８版、マック印刷社（Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）１９９０年刊に例示されるとおり本発明の観点から当業者に公知である。さらに、動物（例えばヒト）への投与については、調製法が、米国食品医薬局の生物学基準で要求される無菌性、発熱原性、一般的な安全性と純度の基準に適合しなければならないことが理解されるだろう。
【０１０５】
以前はＮＧＡＬの役割は不明だったが、今では腎形成中の鉄輸送タンパク質であると同定されている。シデロホアおよび鉄に対する高い親和性にかかわらず、ＮＧＡＬは細胞質に鉄を運搬できる。ＮＧＡＬから鉄が輸送されるためのメカニズムとして考えられるのは細胞の飲食作用である。蛍光ＮＧＡＬタンパク質は飲食作用を受けるが、この作用は４℃で遮断される。鉄がＮＧＡＬから放出されるにはこれらの小胞の酸性化が必要であるが、これは酸性化を阻害する薬剤が鉄の取り込みを遮断することから解る。さらに、細胞質で蛍光の鉄リポーターを発現する細胞へＮＧＡＬを添加すると、鉄の活性化によるリポーター発現の変化を刺激するが、このことはＮＧＡＬが鉄の提供者であることを明らかに示している。ＮＧＡＬの飲食作用の経路は培養細胞におけるホロトランスフェリンによる取り込み経路とは明らかに異なる。定常状態ではホロトランスフェリンはｒａｂ−５またはｒａｂ−７のリサイクル小胞（ｒａｂ５およびｒａｂ７はそれぞれ初期および後期の核内体マーカー）へ送られるが、ＮＧＡＬは後期の核内体と少量がリソソームに送られる。かかるデータはＮＧＡＬがシデロホアを含む場合に鉄輸送経路において機能できることを示す。
【０１０６】
インビボでのＮＧＡＬの作用はその薬理学的な効果とは異なるかもしれない。なぜならインビトロで重要なシデロホアは細菌産生物だからである。多くの解析が内因性の低分子の鉄輸送補因子である可能性を示している。これらにはクエン酸および関連化合物だけでなく、分子量約１０００Ｄａの鉄輸送活性因子も含まれる。かかる腎臓における補因子の有無を決定するために、我々はＢＬ２１細菌由来のアポＮＧＡＬと尿サンプルを混合した。尿それ自体および塩液で希釈したアポＮＧＡＬは５５Ｆｅを取り込めなかったが、尿中に希釈したＮＧＡＬは５５Ｆｅを取り込めた。かかる知見は、尿中にＮＧＡＬと鉄の相互作用を可能にする補因子が存在することを示している。
【０１０７】
本発明の一実施の形態において、外因性ＮＧＡＬの投与によって、虚血再灌流障害により引き起こされた構造的損傷を改善できる。アポトーシスおよび壊死の両方を有意に遅らせることができる。理論的拘束力は望まないが、虚血状態でのＮＧＡＬのアポトーシスの抑制メカニズムには、ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）に類似した抗アポトーシス効果が含まれ、これが鉄の細胞外への輸送の促進することで、細胞内区画での鉄による酸化ストレスを制限する（ＣＤフェリス（Ｃ．Ｄ．Ｆｅｒｒｉｓ）その他、１９９０年ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）３巻Ｐ．１５２−１５７）。さまざまなシデロホア類の担体として、ＮＧＡＬはまた過剰な細胞内の鉄の除去を促進し、それにより、虚血再灌流障害後の酸化物が媒介する腎尿細管のアポトーシス細胞死を制限する。壊死に関しては、虚血再灌流障害後の腎臓に２段階の過程により反応が起こり得る。つまりアポトーシスの開始と続く壊死細胞死である。鉄媒介の酸化ストレスの制限に加えて、ＮＧＡＬによるアポトーシスの阻害はかかる過程の二段階目にあたる壊死局面を防ぐのに有効になりうる。アポトーシスの抑制過程によって、ＮＧＡＬは、アポトーシスの増加との関連が周知であるさまざまな腎臓疾患において有効になり得る。かかる腎臓疾患は、虚血、虚血再灌流、腎毒性、多嚢胞性腎臓疾患、閉塞、炎症、および糸球体疾患を含むがこれに限定されない。
【０１０８】
ＮＧＡＬタンパク質はβバレルまたはカリックスを形成する８つのβ鎖からなる。カリックスは、尿中で検出および／または細菌によって産生されるシデロホアを含む低分子化合物と結合し輸送する。ＮＧＡＬのリガンド結合特性の最適な証拠は結晶学研究から得られ、細菌のシデロホア（エンテロチェリン（enterochelin））がβバレルであることが証明された。ＮＧＡＬはかかるシデロホアと高い親和性（０．４ｎＭ）で結合し、シデロホアが鉄を高い親和性（１０−４９Ｍ）で取り込む。結合実験とＸ線結晶解析によって証明されたタンパク質：シデロホア：鉄の化学量は１：１：１である。シデロホアに鉄が取り込まれた場合、ＮＧＡＬ複合体はインビトロでの胚性間葉および細胞系に鉄を与え、シデロホアに鉄がない場合は、ＮＧＡＬ複合体は鉄をキレートする。ＮＧＡＬは多くの細胞種で飲食作用によって取り込まれ、トランスフェリン区画とは異なる後期の核内体区画へ送られる。鉄の放出は核内体区画で起こる。ＮＧＡＬは細菌シデロホアと結合する最初の哺乳類タンパク質として発見されたため、シデロカリンとも呼ばれている。
【０１０９】
シデロホアは環境中の鉄を取り込む小分子タンパク質で、分子量約５００から１０００の低分子である。シデロホアは第二鉄をキレートできる。鉄触媒による損傷は、虚血、虚血再灌流、または毒素誘導性障害後の腎臓の機能不全における最初の現象の１つと考えられ、心臓および肝臓を含む他の臓器への初期段階の損傷において重要らしい。シデロホアによってキレートされた鉄はかかる臓器への損傷を遅らせることができる。
【０１１０】
シデロホアは合成または細菌培養から天然物として回収可能で市販されている。シデロホアは、一般に用いられる１０ｍＭトリスまたはリン酸緩衝塩類溶液を含むさまざまな緩衝液の生理学的条件においてＮＧＡＬと混合すると、ＮＧＡＬに急速に取り込まれる。一般的に、シデロホアは既知量のＮＧＡＬタンパク質に過剰に加えることができる。ＮＧＡＬ分子はシデロホア分子と、各複合体に各分子が１つずつ含まれるように結合するだろう。かかる１：１のＮＧＡＬ：シデロホアの複合体は過剰な非結合シデロホア分子を除くため洗浄した後、本発明の実践で使用するためにさらに処理されてもよい。または、等モルのシデロホアとＮＧＡＬ分子を組み合わせてインキュベートして結合させることも可能である。本発明で使用するために考案した外因性シデロホアには、クエン酸および合成アナログおよび部分およびその他の有機化学によって産生できる化合物をはじめ、エンテロチェリン、カルボキシミコバクチン、アミノチェリン、デスフェリオキサミン、エアロバクチン、アースロバクチン、シゾキネン、フォロキシミシン、シュードバクチン、ネオエナクチン、フォトバクチン、フェリクロム、ヘミン、アクロモバクチン、リゾバクチン、および他の細菌産生物が含まれるがこれに限定されない。内因性シデロホアもまたＮＧＡＬとインビボで複合体を形成するが、かかることは使用方法の実施例において説明する。
【０１１１】
本発明に関する方法は患者にある特定の利点を提供する。虚血障害に次ぐ急性腎臓疾患は普遍的問題のままであり、限られた充分ではない治療選択しかない。尿細管の細胞死（壊死またはアポトーシス）の抑制、軽減、もしくは反転する因子、および／または回復段階（腎尿細管の生細胞の脱分化および増殖もしくは上皮表現型の再樹立を含む）を促進する因子の同定は、新しい治療選択となる可能性がある。本発明によると、ＮＧＡＬは、単独またはシデロホアと共に用いて、上記の望ましい細胞保護特性を有利に示す。外因性のＮＧＡＬの投与は、尿細管のアポトーシス細胞死を制限し再上皮形成を促進することでマウスモデルでの虚血再灌流障害の形態的機能的な原因を制限することが証明されてきた。
【０１１２】
毒素誘導性障害を処置、軽減、または改善するための本発明の一実施の形態において、毒および／または毒性がある処置には、抗生剤、抗炎症剤、抗真菌剤、放射性造影剤、薬剤、化学療法剤、試験薬、薬剤、または天然、市販および工業製化合物もしくは無機物を含んでもよい。特定の毒および腎毒には、シスプラチン、マイトマイシン、シクロホスファミド、イソスファミド、およびメソトレキセート等の抗癌剤、ゲンタマイシン、バンコマイシン、およびトブラマイシンを含む抗生剤、アンホテリシン等の抗真菌剤、ＮＳＡＩＤ等の抗炎症剤、シクロスポリンおよびタクロリムス等の免疫抑制剤、ハイドロカーボン類、クロロカーボン類、およびフルオロカーボン類等の市販されている工業製化合物である薬剤、ヒ素、水銀、ビスマス、および鉛等の無機物が含まれるがこれに限定されない。他に腎毒性化合物には、アミノグリコシド、フォスカーネット、ペンタミジン、ネオマイシン、亜酸化窒素、イソフルラン、カナマイシン、およびシクロホスファミドが含まれてもよい。
【０１１３】
本発明の実施の形態によると、ＮＧＡＬは、本明細書に記載するとおり、虚血、虚血再灌流障害、臓器移植、ＡＴＮ、毒物投与等の前後および最中（同時）に投与が可能である。さらに具体的に、ＮＧＡＬは臓器が移植される約３０分から９０分前に患者に投与できる。３０分から９０分の範囲外の時間での投与もまた考えられる。
【０１１４】
本発明はまた、体重１ｋｇあたり約１から２００ｍｇ、より一般的には約１から１００ｍｇのＮＧＡＬを患者に投与する方法を含む。患者に投与するＮＧＡＬの量はさまざまで、上記の範囲外であってもよい。本明細書で論じるとおり、患者へのＮＧＡＬ投与量はさまざまであってよい。
【０１１５】
薬剤または医薬組成等の本発明に関する組成物は、一般的に１００μＬの組成物中少なくとも約１０μｇのＮＧＡＬおよび／またはシデロホア濃度からなり、より一般的には少なくとも１００μｇである。
【０１１６】
本発明に関する組成物には、固体、液体または霧状での投与法、および注射による投与経路のための滅菌の必要性に依存した薬剤として受容できるさまざまな種類の担体を含んでもよい。本発明は、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、ガラス体内、膣腔内、直腸内、腫瘍内、筋肉内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼球内、経口、部分的、局所的、吸入（例えば噴霧吸入）、注射、点滴、連続点滴、標的細胞を直接液に浸ける局所的灌流、カテーテル経由、洗浄経由、クリーム剤中、脂質成分中（例えばリポソーム）、または当業者なら知っているような他の方法または上記の組み合わせによって投与できる。
【０１１７】
本発明に関する組成物を動物の患者に実際に投与する量は、体重、処置時の重篤度、処置対象となっている疾患の種類、処置前および最中の介在物、かかる患者の突発性疾患、および投与経路などの物理的生理的要因によって決定できる。投与担当医師はどのような場合においても、各被験者に対して適切な組成物および投与量において、ＮＧＡＬ、シデロホア、およびこれらの混合物、および他の選択した活性剤の濃度を決定するものである。
【０１１８】
ある特定の実施の形態において、医薬組成物には例えば少なくとも約０．１％の選択した他の活性剤または有効成分が含まれてもよい。他の実施の形態においては、かかる活性剤または有効成分は重さで約２％から７５％含んでもよく、より一般的には、約２５％から６０％で、この範囲であればいかなる範囲であってもよい。他の非制限的な例では、活性剤または有効成分の投与量は体重１ｋｇあたり約１μｇから５００ｍｇまでを含んでよく、より一般的には、約５ｍｇから１００ｍｇである。
【０１１９】
いくつかの実施例において、本組成物は、１以上の成分の酸化を遅らせるさまざまな抗酸化剤を含んでもよい。さらに、微生物作用の予防がさまざまな抗細菌剤および抗真菌剤等の保存剤によって行える。かかる保存剤には、パラベン類（例えばメチルパラベン類、プロピルパラベン類）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはこれらの組み合わせが含まれるがこれに限定されない。
【０１２０】
本組成物は、遊離塩基、中性または塩の形に調製できる。医薬として受容できる塩には、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、または、例えば塩化水素もしくはリン酸等の無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸によって形成された酸添加塩が含まれる。遊離カルボキシル基で形成された塩はまた、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄類等の無機塩基、またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンまたはプロカイン等の有機塩基に由来させることもできる。
【０１２１】
本組成物の形状が液体である実施の形態において、担体は溶媒または分散媒が可能であり、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレン、グリコール、液体ポリエチレングリコール等）、脂質類（例えば、トリグリセリド類、植物油、リポソーム類）、およびこれらの組み合わせを含むがこれに限定されない。適切な流動度は、例えばレシチン等の被覆剤を使用することにより、例えば液体ポリオールまたは脂質等の担体に分散させることで必要な粒子径を維持することにより、例えばヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤を使用することにより、またはかかる方法の組み合わせにより維持できる。たいていの場合、例えば糖、塩化ナトリウムまたはこれらの組み合わせ等の等張剤を含むのが一般的である。
【０１２２】
本発明の他の実施の形態において、点眼剤、点鼻剤または噴霧剤、エアロゾルまたは吸入剤として使用可能である。かかる組成物は一般に標的組織の種類に合わせてデザインされる。一非制限的な実施例において、点鼻剤は通常水溶液で、滴下または噴霧により鼻腔内に投与するようデザインされている。点鼻剤は鼻の分泌物と多くの点で似るように、正常な繊毛動作が維持できるように調製される。そのため、一般的な実施の形態においては、水溶性点鼻剤は通常等張であるかわずかに緩衝され、ｐＨが約５．５から６．５に維持される。さらに、眼科用製剤に使用されているのと同様な抗微生物保存剤、薬剤、または適当な薬物安定剤を適宜本製剤に含むことができる。例えば、さまざまな市販の点鼻剤は抗生剤または抗ヒスタミン剤等の薬剤を含むことが公知である。
【０１２３】
ある特定の実施の形態において、本組成物は経口摂取等の経路によって投与するため調製される。かかる実施の形態においては、固形の組成物は、例えば、溶液、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル錠（例えば硬いまたは柔らかいゼラチンで覆ったカプセル）、徐放性製剤、舌下錠、口内錠、万能薬、シロップ剤、オブラート、またはこれらの組み合わせを含む。経口組成物は食事療法の食物と共に直接摂取できる。経口投与の一般的な担体には、不活性希釈剤、食物として吸収できる担体、またはこれらの組み合わせが含まれる。本発明の他の局面においては、経口組成物はシロップまたは万能薬として調製可能で、例えば、少なくとも１つの選択された活性剤または有効成分、甘味料、保存剤、香料、色素、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。他の実施の形態においては、経口組成物は１以上の結合剤、添加剤、壊変剤、滑剤、香料、またはこれらの組み合わせを含んでいてもよい。
【０１２４】
ある特定の実施の形態において、１組成には次の中から１つ以上を含んでよい。例えば、トラガントゴム、アカシア、コーンスターチ、ゼラチン、またはこれらの組み合わせ等の結合剤、例えば、リン酸ニカルシウム、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、またはこれらの組み合わせ等の添加剤、例えば、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸、またはこれらの組み合わせ等の壊変剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム等の滑剤、例えばショ糖、乳糖、サッカリンまたはこれらの組み合わせ等の甘味料、例えば、ペパーミント、冬緑油、サクランボ香料、オレンジ香料等の香料、またはこれら全ての組み合わせ。投与が一カプセル単位であるなら、上記の種類の他に液体等の担体を含んでもよい。さまざまな他の物質が被覆剤として使用可能で、一投与単位の物理的形状を異なった形に修飾できる。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル錠は、セラック、糖、またはその両方で覆うことができる。
【０１２５】
他の投与方式に適した別の調整法には座薬が含まれる。通常処方される座薬は、直腸、膣、または尿道に挿入するため、さまざまな重量および形態の固体様式である。挿入後、座薬は腔内の体液で軟化、融解、または分解する。一般に従来からある座薬用の担体は、例えばポリアルキレングリコール類、トリグリセリド類、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。ある特定の実施の形態において、座薬は、例えば、約０．５％から１０％の範囲、および一般には約１％から２％の範囲で、活性剤または有効成分を含む混合物より形成できる。
【０１２６】
無菌の注射可能な液体は、フィルター滅菌の後、適宜、先に列記したその他成分の内のいくつかの成分と共に必要な量の活性化合物を適切な溶媒に取り込むことで調製される。一般に分散は、さまざまな滅菌された活性化合物を、基本的な分散媒および／または他の成分を含む無菌の賦形剤に取り込むことで調製される。無菌の注射可能な液体、懸濁液、または乳剤を調製するための無菌の粉の場合、一般的な調製方法は、フィルター滅菌済み溶媒から活性化合物およびいかなる他の望ましい成分をも生じさせる真空乾燥または凍結乾燥技術である。かかる溶媒は、適宜、適切に緩衝され、その希釈剤は注射前に充分な塩またはブドウ糖によってまずは等張にする。溶媒として使用したＤＭＳＯによって結果的に極端に速い浸透性が予想される場合、直接注射用の高濃度の組成物を調製することが考えられ、かかることにより狭い範囲に高濃度の活性化合物を到達させる。
【０１２７】
本組成物は製造および貯蔵状態で安定しており、細菌および真菌等の微生物による汚染に対して保護されなければならない。外毒素による汚染が、例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満といった安全基準で最小限に抑えられなければならないことが理解されるだろう。
【０１２８】
実験プロトコル
本発明は、その使用および効能を証明する実施例を通して深く理解されるだろう。以下に示す実験方法は、続く実施例において参照されるものである。
【０１２９】
１．組換えヒトおよびマウスＮＧＡＬの発現、精製、および放射性標識
全長マウスＮＧＡＬｃＤＮＡは、ｐＧＥＸ発現ベクターでクローニングし、細菌中でグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合したタンパク質として発現させ、グルタチオン−セファロースカラム（アマシャム社）を用いて精製し、バンドガード(Ｂｕｎｄｇａａｒｄ Ｊ．)その他著、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ誌（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９４年２０２巻、p．１４６８−１４７５）およびヤン（Ｙａｎｇ Ｊ．）その他著、モレキュラー・セル誌（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２００２年１０巻、ｐ．１０４５−１０５６）およびデル・リオ（Ｄｅｌ Ｒｉｏ Ｍ．）その他著、米国腎臓学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．、２００４年１５巻、ｐ．４１−５１）に記載された方法でトロンビン切断を行った。精製ＮＧＡＬはデトックスゲル内毒素除去カラム（ピアース社）を用いて製造者が推奨する方法で内毒素をなくした。タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、クーマシーブルー染色によって、またはミシュラ（Ｍｉｓｈｒａ）その他著、米国腎臓学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．、２００３年１４巻、ｐ．２５３４−２５４３）に記載されているとおり、ＮＧＡＬに対するポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロティングによって分析した。タンパク質濃度はブラッドフォード法を用いて決定した。図１に示すとおり予想されたサイズの単一できれいなポリペプチドが検出された。
【０１３０】
２．組換えヒトおよびマウスＮＧＡＬの発現と精製
組換えヒトおよびマウスＧＳＴ−ＮＧＡＬは、硫酸第二鉄（５０μＭ：シグマ・アルドリッチ社）を添加して大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＢＬ２１株またはＸＬ１−Ｂｌｕｅ株で発現させた。ＮＧＡＬはグルタチオン−セファロース４Ｂビーズ（アマシャム・バイオサイエンス社）で単離し、トロンビン切断（シグマ・アルドリッチ社：ミズリー州セントルイス）によって溶出し、その後ゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５、ＳＭＡＲＴシステム、アマシャム・バイオサイエンス社）によってさらに精製し、クーマシーゲル（バイオラッド社）によって検証した。ＢＬ２１由来のＮＧＡＬは、鉄がないまたは５倍過剰なモル濃度を用いて鉄飽和させたエンテロチェリンであるシデロホア（ＥＭＣマイクロコレクション社）を結合した。非結合シデロホア（０．７ｋＤａ）はＰＢＳで洗浄（ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−１０）し除去した。５５Ｆｅまたはガリウム（Ｇａ）負荷ＮＧＡＬを作製するために、鉄無しエンテロチェリンＮＧＡＬ複合体を、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）Ｈｅｐｅｓ（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）中の等モル濃度の５５Ｆｅ（１８ｍＣｉ）またはＧａとインキュベートした後、この複合体を３回洗浄した（１０Ｋフィルター）。ヨードビーズ（Ｉｏｄｏｂｅａｄｓ：ピアース社）を用いてＮＧＡＬを１２５Ｉで標識し、非吸収１２５Ｉをゲル濾過（ＰＤ−１０カラム）で除去した後、ＰＢＳに対して徹底的に透析した（７ｋＤａ限外濾過膜：ピアース社）。Ａｌｅｘａ―５６８およびフルオレセインイソチオシアネート（モレキュラープローブス社）を製造者の指示に従いＮＧＡＬと結合させ、その後徹底的に透析した。タンパク質濃度は、標準牛血清アルブミンと比較してクーマシーゲルによって決定した。
【０１３１】
３．ＮＧＡＬの注射
精製された内毒素のないＮＧＡＬはマウスの尾の静脈内、皮内、または腹腔内に注射して投与した。予備実験では、ＮＧＡＬは３種類の濃度（２５０μｇ／１００μＬ溶液を５０、１００、または２５０μｇ）で動物に投与し、１時間後に腎動脈の両側を３０分間クランプし、再流の２４時間後に検証した。等量（１００μＬ）の生理食塩水で前処理した動物と比較した場合、２５０μｇのＮＧＡＬを投与した群のみが尿細管損傷および窒素過剰血症の有意な保護を示した。本明細書で報告する以下の全ての実験は２５０μｇのＮＧＡＬ投与量を用いて行った。５種類のさまざまな動物実験群を使い比較した。非虚血対照群（ｎ＝８）、生理食塩水でのみ前処理した虚血対照群（ｎ＝８）、腎動脈クランプの１時間前にＮＧＡＬで前処理した群（ｎ＝６）、腎動脈クランプの最中にＮＧＡＬ処理した群（ｎ＝６）、腎動脈クランプの１時間後にＮＧＡＬ処理した群（ｎ＝６）である。
【０１３２】
４．ヒトによる研究
健康な志願者、および急性または慢性の腎不全と診断された患者の尿および血清中のＮＧＡＬタンパク質濃度が分析された。急性腎不全（ＡＲＦ）は５日未満の血清クレアチニンの倍化によって診断された。ＡＲＦの推定病因には、次の基準のうち少なくとも２つが当てはまった敗血症が含まれる。陽性血液培養、または肺、皮膚もしくは尿管での局所的感染の証拠、および発熱または白血球数の上昇である。これらの患者の中には、血圧の補助が必要なものもいた。他のＡＲＦの病因には、出血または心疾患が原因の低血圧、腎毒性、または移植後虚血が含まれた。慢性腎不全（ＣＲＦ）の定義は、２ｍｇ／ｄＬを超える血清クレアチニンが少なくとも２ヶ月間変化していないことである。ＣＲＦの推定病因には、閉塞性尿路疾患、慢性間質性腎炎、および糖尿病が含まれた。コロンビア大学医療センターおよび京都大学医学部付属病院において、両組織の審査委員会の承認を得て、評価される患者の血液および尿サンプルが回収され、盲検法を用いて分析された。
【０１３３】
５．ＮＧＡＬの測定
抗マウスＮＧＡＬポリクローナル抗体をウサギで作製した後、組換えマウスＮＧＡＬ（下記参照）と結合させたセファロース４ファストフロービーズカラム（アマシャム・バイオサイエンス社）で精製し、ｐＨ２．５で溶出させた。ヒトＮＧＡＬモノクローナル抗体（アンチボディショップ社）もＮＧＡＬの検出に用いた。ヒトＮＧＡＬはこのモノクローナル抗体でより良く認識されたが、マウスＮＧＡＬはアフィニティ精製したポリクローナルによってのみ認識された。
【０１３４】
ヒト血液サンプルは最初にクエン酸、ＥＤＴＡ、またはヘパリン中に回収されたが、これらの調整は全て同様なＮＧＡＬ免疫反応性を示したので、ヒト血清およびマウス血漿は以下に記載する実施例において回収される。これらのサンプルは１００ｋＤａ限外濾過膜（ＹＭ−１００：アミコン社）を用いて遠心分離し、濾液サンプルを免疫ブロット用に用いた。血液透析を受けている患者では、サンプルは透析直前に回収した。新鮮な尿サンプルは低速で遠心分離した後、それ以上濃縮しないで用いた。
【０１３５】
６．病理学標本
病理学標本には、虚血ＡＴＮ（１０例）、毒性ＡＴＮ（１１例：抗生剤５例、ゾレドロネート２例、カルボプラチン１例、非ステロイド抗炎症剤２例、およびヘモグロビン尿症１例）、および糸球体症（１０例：糖尿病、抗ＧＢＭ、免疫染色陰性半月体形成糸球体症、ＩｇＡ腎障害、最小変化、単状分節状糸球体硬化症を含む）、また、正常な腎臓（３例）をも含んだ。ホルマリン固定しパラフィン包埋した組織を切片化し（５μｍ）、３０分間クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中でマイクロ波を用いて抗原回収した。外因性のペルオキシダーゼは３０分間５％のＨ２Ｏ２で遮断し、その後１０％のヤギ血清／１％のＢＳＡでブロッキングした。アフィニティ精製した抗マウスＮＧＡＬ（０．４μｇ／ｍＬ）を４℃で一晩添加し、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：１００：ベクター社）およびアビジンＨＲＰをそれぞれ３０分間添加した。スライドは２．５分間ＤＡＢ／０．３％Ｈ２Ｏ２で現像し、ヘマトキシリンで対比染色した。非免疫ウサギＩｇＧ（０．４μｇ／ｍＬ：ベクター社）を対照として用いた。
【０１３６】
７．ＮＧＡＬ輸送
腎臓へ輸送されるＮＧＡＬを検出するため、ｒＮＧＡＬ（１０または１００μｇ）、Ａｌｅｘａ―５６８ＮＧＡＬ（１００μｇ）、１２５Ｉ−ＮＧＡＬ（１０μｇ、２×１０６ｃｐｍ）、または５５Ｆｅ負荷エンテロチェリン−ＮＧＡＬ（１０μｇ、１×１０６ｃｐｍ）を腹膜内に注射し、血液、尿、腎臓、および肝臓サンプルを得た。ＮＧＡＬは免疫ブロットにより検出された。Ａｌｅｘａ―５６８ＮＧＡＬは共焦点顕微鏡（ＬＳＭメタ検出器）で検出され、ＮＧＡＬ媒介鉄輸送がシンチレーション計測器およびＥｐｏｎ包埋腎臓の光学顕微鏡オートラジオグラフィーによって検出された。スライドは１週間感光乳剤（ポリサイエンス社）に曝した後、マイクロドールで現像し、トルイジンブルーで対比染色した。近位尿細管のリソソームを検出するために、マウスにはＡｌｅｘａ５６８ＮＧＡＬ注射の２４時間前にフルオレセインデキストラン（４６ｋＤａ、０．５ｍｇ：シグマ社）を注射した。ＬＡＭＰ１（サンタクルズ社）が４％パラホルムアルデヒド固定腎臓のクリオスタット切片で検出された。
【０１３７】
８．ＡＴＮまたは虚血／再灌流障害のマウスモデル
Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（２０〜２５ｇ：チャールズリバー社）は腹膜内ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、体芯温度が３７℃に保たれるように暖灯下の温熱パッド上に静置した。腎臓を腹部切開によって露出させ、右の腎臓を取り出すかまたはその血管茎および尿管を結紮した。左腎臓または両腎臓の血管茎は微細動脈瘤用クリップ（ケントサイエンティフィック社）で右腎摘出後３０分間クランプした。この間の虚血によって死亡率が最小限に抑えられた再現性のある腎臓疾患を形成させた。この間、腹膜を湿らすためにＰＢＳ（０．５ｍＬ）を用い、腹部は５−０ナイロンで縫合した。生理食塩水、ＮＧＡＬ、レチノール負荷レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）、エンテロチェリン、またはデスフェロキサミンメシレート（ＤＦＯ）を、虚血１５分前または再灌流１から２時間後に腹膜内または皮下に注射した。
【０１３８】
再灌流の６または２４時間後に、ヘパリン添加血漿、尿、および腎臓サンプルを回収し、免疫ブロットを用いて、ＮＧＡＬ（ポリクローナル１：５００）、ヘムオキシゲナーゼ１（ストレスゲン社、１：２０００）、Ｅカドヘリン（ＢＤトランスダクションラボ社、１：２０００）、Ｎカドヘリン（ＢＤトランスダクションラボ社、１：３０００）、およびＧＡＰＤＨ（ケミコンインターナショナル社、１：３０００）を測定した。血漿はまたクレアチニンおよび血液尿素窒素比色分析にも用いた。腎臓の矢状断面は４％ホルマリンで固定するか、またはｍＲＮＡおよびタンパク質分析用に瞬間凍結させた。パラフィン包埋切片（５μｍ）は、ヘマトキシリン−エオシン、またはアポトーシス核用のインサイチュキット（フルオレセインＴＵＮＥＬ法、ロシュ社）または全ての核用（トップロール法、モレキュラープローブ社）で染色した。細胞増殖分析用には、ＢｒｄＵを解剖１時間前に腹膜内に注射し、クリオスタット切片を製造者の指示に従い抗ＢｒｄＵ（ロシュ社）で染色した。
【０１３９】
いくつかの実験では、前期マウスは暖かいケージで回復させ、時間ごとに尿を回収した。さまざまな再灌流時間の後に、マウスは再び麻酔後開腹され、比色定量分析によって血清クレアチニンを測定するために、下大静脈の穿刺によって血液を得た。マウスは殺され、腎臓は４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳの灌流でインサイチュ固定され、両腎臓が摘出された。各腎臓の半分が液体窒素で瞬間凍結され、次の処理まで−７０℃で保存された。その後サンプルをホルマリンで固定し、パラフィン包埋没後切片にした（４μｍ）。パラフィン切片はヘマトキシリン−エオシン染色し組織学的に検査した。もう半分の腎臓はＯＣＴ化合物（ティッシュ−テック社）で包埋し、免疫組織学的検査用に凍結切片（４μｍ）を作製した。
【０１４０】
９．リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡが、ＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン社）を用い、製造者の指示に従ってカラム上でＤＮａｓｅ消化し、マウス腎臓から抽出された。ｃＤＮＡ鋳型はオムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素とオリゴｄＴプライマー（キアゲン社）を用いて合成した。ＰＣＲ反応はｉＱ ＳＹＢＲグリーンスーパーミックスおよびＭｙｉＱ単色リアルタイムＰＣＲ検出システム（バイオラッド社）を用いて、９５℃で２分インキュベート後、９５℃３０秒および６０℃３０秒を４０回インキュベートして行った。増殖の特異性は融解曲線の分析とアガロースゲル電気泳動によって検証した。マウスＮＧＡＬｍＲＮＡ用のプライマー配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ ００８４９１）は、ＣＴＣＡＧＡＡＣＴＴＧＡＴＣＣＣＴＧＣＣ（フォワードプライマー、配列番号９３−１１２）およびＴＣＣＴＴＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴ（リバース、５７６−５５７）である。マウスβアクチンｍＲＮＡ用の配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｘ０３６７２）は、ＣＴＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＴＧＡＡＡＡＧ（フォワード、４１５−４３４）およびＴＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧ（リバース、６９６−６７７）である。各プレートには連続希釈した標準サンプルが含まれ、ｍＲＮＡ量の決定に用いられた。ＮＧＡＬｍＲＮＡ含有量はβアクチンｍＲＮＡによって補正した。
【０１４１】
１０．鉄結合補因子
補因子依存性のＮＧＡＬへの鉄結合は、アポＮＧＡＬ（１０μＭ）、５５Ｆｅ（１μＭ）、およびマウス尿の低分子分画（＜３ｋＤａ）を用いて、１５０ｍＭＮａＣｌ−２０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）中で７０分間室温でインキュベートして測定した。尿分画は、新鮮な尿を１０ｋＤａおよび３ｋＤａの膜（ＹＭ−１０およびＹＭ−３、アミコン社）に順次濾過させて得た。次に混合液は１０ｋＤａ膜（ＹＭ−１０、アミコン社）上で３回洗浄した。鉄がないエンテロチェリン結合ＮＧＡＬ（シデロホア無しのＮＧＡＬよりもむしろ）を鉄獲得の陽性対照として用いた。クエン酸第二鉄（１ｍＭ）または鉄負荷エンテロチェリン（Ｓｉｄ：Ｆｅ、５０μＭ）が５５Ｆｅ結合の競合物質として用いられた。
【０１４２】
１１．ＮＧＡＬ免疫組織学分析
ＮＧＡＬ検出用に、凍結腎臓切片に０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳを１０分間浸透させ、１時間ヤギ血清でブロッキングした後、１時間ＮＧＡＬに対する第１抗体（希釈比１：５００）を加えてインキュベートした。その後スライドを暗黒下で３０分間Ｃｙ５（アマシャム社、イリノイ州アーリントンハイツ）が結合した第二抗体に曝露し、ローダミンフィルターを搭載した蛍光顕微鏡（ツァイスアキシオフォト）で視覚化した。
【０１４３】
１２．組織病理学分析スコア
４μｍの腎臓切片はヘマトキシリン−エオシン染色し、ヨコタ（Ｙｏｋｏｔａ Ｎ．）その他著、米国生理学会誌腎臓生理学（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００３年２８５巻Ｆ３１９−Ｆ３２５）およびジェルドセン（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ Ｌ．）その他著、バイオキム・バイオフィズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ２０００年１４８２巻ｐ．２７２−２８３）に記載されている方法で、尿細管への組織病理学的な損傷を盲検法によってスコア化した。各指標は、内側の皮質および外側の髄質領域（尿細管損傷が最も明らか）を強拡大（４０倍）で検査し、各切片の平均値を決定した。指標には、尿細管拡張、尿細管円柱形成、および尿細管細胞壊死が含まれた。各指標は０から４のスケールでスコアにした。異常無し（０）、軽度（１）、中度（２）、重度（３）、非常に重度または広範（４）である。
【０１４４】
１３．アポトーシス検査
アポトーシス核を検出するＴＵＮＥＬ法のために、アポアラートＤＮＡ断片化アッセイキット（クローンテック社）を使用した。パラフィン切片はキシレンおよび低級エタノールで脱パラフィン化し、４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳを使い３０分間４℃に固定し、プロテイナーゼＫを室温で１５分、および０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ１００／ＰＢＳを４℃で１５分間浸透させ、ヌクレオチドおよびＴｄＴ酵素の混合液を加え３７℃で６０分間インキュベートした。反応を２×ＳＳＣで停止させ、切片をＰＢＳで洗浄した後、クリスタル／マウント（バイオメダ社、カリフォルニア州フォスターシティ）でマウントした。ＴＵＮＥＬ陽性のアポトーシス核は蛍光顕微鏡で視覚化することで検出した。核の断片化、核の凝縮、およびＴＵＮＥＬ法による密な蛍光核を含んだアポトーシスの特徴的な形態を示した細胞だけをアポトーシスとして計測した。形態的基準を満たさないＴＵＮＥＬ陽性だけ示した細胞はアポトーシスとはみなさなかった。スライドは盲検法で検査し、各切片とも平均５ヶ所を強拡大（４０倍）して計測した１００細胞あたりのＴＵＮＥＬ陽性核の数を計測することによってアポトーシスを定量した。
【０１４５】
１４．増殖検査
増殖細胞を検出するため、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ、希釈比１：５００、アップステイトバイオテクノロジー社）に対するモノクローナル抗体で切片をインキュベートし、免疫ペルオシキダーゼ染色法（イムノクルズ染色システム、サンタクルズバイオテクノロジー社）を製造者が推奨するとおりに用いて検出した。スライドは盲検法で検査し、各切片とも平均５ヶ所を強拡大（４０倍）して計測した１００細胞あたりのＰＣＮＡ陽性細胞の数を計測することによって増殖を定量した。
【０１４６】
１５．統計解析
ＳＰＳＳソフトウェア（Ｖｅｒ．８／０）を採用し、平均、標準偏差、分布、範囲、および歪度を含む各連続変量に対して一変量統計値を求めた。データは正常値と分布の均一性について検証した。一方向ＡＮＯＶＡを採用し、異なった処理群間の連続変量の平均値±ＳＤを比較した。ランク付けクラスカル・ウォリスＡＮＯＶＡを非正規分布データに用いた。群または他と異なる群の同定には、多重比較法（正規分布に応じてチューキー検定またはダン検定）を用いた。０．０５未満のｐ値が統計的に有意であるとみなされた。ヒトのＮＧＡＬ濃度は統計解析用に対数値に変換した。群間の平均値を比較するためにデータをボンフェロニーの事後検定を伴った一方向ＡＮＯＶＡによって解析した。腎臓障害のジャブロンスキースコアはダンの事後検定を伴ったクラスカル・ウォリス検定によって解析した。
【０１４７】
実施例
さまざまな実施の形態における本発明の実践をより完全に記述するため、以下の実施例を提供する。上記の実験プロトコルは実施例に示すとおりに使用する。
【実施例１】
【０１４８】
静脈内に注射したＮＧＡＬはインビボの近位尿細管細胞によって急速に吸収される。精製ＮＧＡＬは推定作用部位、つまり近位尿細管に到達した。図２で示すとおり、ＮＧＡＬ（２５０μｇ／１００μＬ生理食塩水）または等量の生理食塩水のみを静脈注射されたマウスに虚血再灌流障害を起こし、腎臓および尿を時間を変えて検証した。非虚血生理食塩水対照群にはＮＧＡＬがない（上段左）が、非虚血ＮＧＡＬ処理マウスにはＮＧＡＬがある（下段左）。１時間経った時点で生理食塩水注入マウスの腎臓にはＮＧＡＬがない（上段中）。虚血再灌流障害３時間後の生理食塩水処理マウスには内因性ＮＧＡＬが検出された（上段右）。これとは対照的に、ＮＧＡＬ注射後１時間以内に、細胞質点状分布が主に近位尿細管で容易に検出され（下段中）、３時間経っても依然検出された（下段右）。これらの切片における近位尿細管の同定は場所と形態を基になされた。ＮＧＡＬは生理食塩水を注射したマウスでは１時間の再流時には検出されなかったため、上記検出は虚血障害後の注射したＮＧＡＬの吸収を示す。さらにＮＧＡＬは、図３に示すとおり、注射後１時間以内に尿中で検出された。
【実施例２】
【０１４９】
静脈内に注射されたＮＧＡＬは投与および虚血再灌流障害後すぐに尿中に現れる。実施例１記載のマウスから採取した尿を時間を変えて検証した。図３（左）に示すとおり、１時間の再流時に生理食塩水を注射されたマウスの腎臓または尿中にはＮＧＡＬはなく、３時間の再流時に検出されるようになった。この３時間に及ぶデータは虚血障害に対する腎臓の尿細管細胞の内在的な反応を示している。これとは対照的に、図３（右）に示すとおり、ＮＧＡＬを注射し、同時に虚血再灌流障害を起こさせたマウスでは、ＮＧＡＬは１時間の再流時に腎臓および尿で容易に検出された。
【実施例３】
【０１５０】
ＮＧＡＬは虚血再灌流障害によって引き起こされた尿細管への組織病理学的損傷を改善する。虚血の１時間前、最中、または１時間後にＮＧＡＬを投与すると、結果的に尿細管への組織病理学的損傷は有意に減少した。２４時間の再流時に得たヘマトキシリン−エオシン染色した代表的な腎臓切片を図４に示す。非虚血の対照群（非虚血）が正常な組織を示す一方、生理食塩水（１００μＬ希釈液量）のみで前処理したマウス（生食前処理）は尿細管拡張、尿細管円柱形成、および壊死細胞を含む急性尿細管壊死の広範な特徴を示した。これとは対照的に、ＮＧＡＬ処理した腎臓は組織病理学的反応が弱まっていることを示した。このことは、ＮＧＡＬで前処理したマウス（ＮＧＡＬ前処理）で最も顕著だが、ＮＧＡＬを虚血障害の最中（ＮＧＡＬ虚血中）または１時間後（ＮＧＡＬ虚血後）に投与した場合でも顕著であった。こうした反応を定量するため、腎臓切片における尿細管への組織病理学的損傷を盲検法でスコア化した。結果を図５Ａ〜５Ｃに示す。調べた全３つの指標、拡張（図５Ａ）、円柱（図５Ｂ）、および細胞壊死（図５Ｃ）において、全３種のＮＧＡＬ処理法（虚血の前、最中、または後）が結果的に対照群と比べて有意にスコアを改善した。この有意差はＮＧＡＬを前処理したマウスで最も大きく、続いて虚血中にＮＧＡＬ処理したマウス、虚血後に処理したマウスとなった。しかし構造的な保護は完全ではなく、ＮＧＡＬで前処理したマウスでさえ、非虚血対照群では全く見られない組織病理学的損傷をいくぶん示した。
【実施例４】
【０１５１】
ＮＧＡＬは虚血再灌流障害によって引き起こされる腎臓機能の低下を改善する。図６に示すとおり、虚血の１時間前、最中、または１時間後にＮＧＡＬを投与すると、結果的に２４時間の再流時に測定した血清クレアチニンは有意に減少した。非虚血対照群（非虚血）は血清クレアチニン（０．６５±０．１３ｍｇ／ｄＬ）を示すが、生理食塩水（１００μＬ希釈液量）のみで前処理したマウス（生食前処理）では、血清クレアチニンの有意な上昇が示された（２．６±０．２８ｍｇ／ｄＬ）。これとは対照的に、ＮＧＡＬ処理腎臓は機能的反応を弱めたことを示した。このことは、ＧＮＡＬ前処理マウス（１．２５±０．３ｍｇ／ｄＬ）で最も顕著だが、ＮＧＡＬを虚血障害の最中（ＮＧＡＬ虚血中）（１．５±０，２ｍｇ／ｄＬ）、または１時間後（ＮＧＡＬ虚血後）（１．９５±０．２ｍｇ／ｄＬ）に投与した場合でさえ顕著であった。しかし機能の保護は完全ではなく、ＮＧＡＬで前処理したマウスでさえ、非虚血対照群と比較して血清クレアチニンの有意な上昇を示した。
【実施例５】
【０１５２】
ＮＧＡＬは虚血再灌流障害によって引き起こされる尿細管のアポトーシス細胞死を改善する。外因性のＮＧＡＬの投与によって観察される構造的かつ機能的保護は、アポトーシスの減少の結果である。２４時間の再流時に得た代表的な腎臓切片にＴＵＮＥＬ法を施した。図７はそれを低倍率（左）および高倍率（中央）で見たものである。図８（左）に定量的に示すように、非虚血対照群は最小限のアポトーシス率（調べた１００細胞あたり２．２±０．５個）を示すが、生理食塩水（１００μＬ希釈液量）のみで処理したマウスは尿細管上皮細胞のアポトーシスが有意に増加している（１２．６％±２．２）。これとは対照的に、ＮＧＡＬ処理腎臓はアポトーシス反応を弱めていることが示された。このことは、ＮＧＡＬで前処理したマウス（６．７％±１．６）で最も顕著だが、ＮＧＡＬを虚血障害の最中（７．６％±０．８）または１時間後（８．５％±０．８）に投与した場合でさえ顕著であった。しかしアポトーシス細胞死の保護は完全ではなく、ＮＧＡＬで前処理したマウスでさえ、非虚血対照群と比較してアポトーシス障害の有意な上昇を示した。
【実施例６】
【０１５３】
ＮＧＡＬは虚血障害後の尿細管の細胞増殖を促進する。２４時間の再流時に得てＰＣＮＡに対する抗体で染色した代表的腎臓切片を図７（右）に示す。図８（右）に定量的に示すとおり、非虚血対照群は最小の増殖細胞率（調べた１００細胞あたり１．９％±０．４個）を示すが、生理食塩水（１００μＬ希釈液量）のみで処理したマウスは少ないながらも有意なＰＣＮＡ陽性尿細管上皮細胞数の増加を示した（４．４％±１．２）。これとは対照的に、ＮＧＡＬ処理腎臓では増殖細胞の際立った増加が見られた。このことはＮＧＡＬで前処理したマウス（１９．１％±２．１）で最も顕著だが、ＮＧＡＬを虚血障害の最中（１４．９％±１．２）または１時間後（１４．５％±１．２）に投与した場合でさえ明らかだった。
【実施例７】
【０１５４】
ＮＧＡＬは虚血障害後における尿細管細胞の生死バランスを生存に向け変化させる。虚血障害後の尿細管細胞全体の生死を一方向ＡＮＯＶＡを用いて推定し、２４時間の再流時における増殖とアポトーシスの平均値±ＳＤをさまざまな処理群を対象に比較した。図９に示すとおり、静止状態の成熟腎臓で予想されるような生細胞と死細胞が等しい割合を示す均一比であることが仮定できる。非虚血対照腎臓は増殖：アポトーシスの比が０．８６±０．１で、均一に近い値を示した。生理食塩水（１００μＬ希釈液量）のみで処理したマウスは増殖：アポトーシスの比（０．３４％±０．０５）で有意な減少を示し、２４時間の再流時では細胞死が顕著な特徴であることを示した。これとは対照的に、ＮＧＡＬ処理腎臓では尿細管細胞の増殖：アポトーシスの比が大きく増加した。このことはＮＧＡＬで前処理したマウス（２．９％±０．５）で最も顕著だが、ＮＧＡＬを虚血障害の最中（２．０％±０．１）または１時間後（１．７％±０，１）に投与した場合でさえ顕著であった。この分析は、ＮＧＡＬが虚血障害後に、尿細管細胞の死亡対生存の全体的なバランスを生存に向け変化させることを示している。
【実施例８】
【０１５５】
ＮＧＡＬ発現はヒトの急性腎不全（ＡＲＦ）において増加する。図１１に示すとおり、ヒトの急性腎不全は、血清および尿のＮＧＡＬタンパク質の濃度が対数オーダで上昇することを特徴とした。尿のＮＧＡＬタンパク質は正常な被験者では２２ｎｇ／ｍＬ（ｎ＝１０）だが、急性腎不全およびさまざまな重複罹患の被験者では５５７ｎｇ／ｍＬ（２５倍の上昇、ｐ＜０．００１）である。尿のＮＧＡＬ免疫ブロットを図１１Ａに、および定量グラフを図１１Ｃに示す。正常な被験者の血清ＮＧＡＬ２１ｎｇ／ｍＬ（幾何学平均、ｎ＝５）と比較して、急性腎不全およびさまざまな重複罹患の被験者の血清ＮＧＡＬは１４６ｎｇ／ｍＬで７．３倍上昇した（ｐ＜０．０５）。図１１Ｂには免疫ブロットデータを、図１１Ｄには定量グラフを示す。細菌感染と関連のある急性腎不全の患者は、血清（３３１ｎｇ／ｍＬ）および尿（２７８６ｎｇ／ｍＬ）のＮＧＡＬが最も高い傾向を示すが、感染のない急性腎不全と統計的には差がなかった。ＮＧＡＬ発現と急性不全の程度との相関関係を決定するため、ＮＧＡＬ濃度を対数変換した後、単回帰分析を行った。尿のクレアチニンで補正した尿ＮＧＡＬ（ｒ＝０．６７、ｎ＝３６）ばかりでなく、血清（ｒ＝０．６４、ｎ＝３２）および尿（ｒ＝０．６８、ｎ＝３８）のＮＧＡＬ濃度でも、血清クレアチニン濃度と高い相関が見られた（ｐ＜０．０００１）。これとは対照的に、慢性腎不全の患者の場合、血清ＮＧＡＬ（４９ｎｇ／ｍＬ、ｎ＝１０）および尿ＮＧＡＬ（１１９ｎｇ／ｍＬ、ｎ＝９）の上昇は比較的小さく、これらの値は血清クレアチンとの相関関係を明らかにすることができなかった。これらのデータはＮＧＡＬ発現と急性腎不全とを相関させ、腎臓が血清および尿のＮＧＡＬの主な供給源であることを示している。実際、重篤な腎臓疾患の症例の中には、ＮＧＡＬ分解物の排出（ＮＧＡＬクリアランス値、クレアチニンクリアランス値で補正）が１００％を超えることがあり、このことは尿ＮＧＡＬが単に血液からの濾過に由来するというよりむしろ、局所的な合成に由来することを証明している。比較すると、図１１Ｂに示すとおり、マウス尿でもＡＴＮ障害の誘導の後にＮＧＡＬ濃度が大きく上昇した。
【０１５６】
急性腎不全におけるＮＧＡＬの発現部位を視覚化するため、ヒトの腎臓組織切片をＮＧＡＬに対するアフィニティ精製ポリクローナル抗体で染色した（図１２）。図１２Ａに低倍率、１２Ｂおよび１２Ｃに高倍率で示すとおり、正常な腎臓では、遠位尿細管上皮（皮質領域の平均１０％）および髄質の集合管で非常に弱い染色を示した。まれに糸球体嚢外壁上皮細胞に濃い染色があるが、他の糸球体細胞には見られない。しかし近位尿細管は完全に陰性である。これとは対照的に、腎毒性または虚血に曝した腎臓または以下の診断を受けた被験者の腎臓の切片では、５０％近くの尿細管皮質でＮＧＡＬが染色された。診断名は、敗血症による虚血性ＡＴＮ（図１２Ｄ）、血液量減少症（急性の血液量損失：図１２Ｅ）、心疾患（図１２Ｆ）、ビスホスフォネートによる腎毒性（図１２Ｇ）、セフォスポリンによる腎毒性（図１２Ｈ）、およびヘモグロビン尿症（図１２Ｉ）である。図１２Ｊおよび１２Ｋを見ると、ＮＧＡＬはまた増殖性糸球体症の患者の近位尿細管において広く発現したが、虚血障害で見られるものよりは弱い（皮質実質がＮＧＡＬ陽性であるのは最小変化のみの疾患で２０％、糖尿病性腎障害で４０％、ＡＮＣＡで５０％、および抗糸球体基底膜疾患で６５％）。顕著な核小体を持ち単純化拡大化した修復核を含む、細胞損傷の特徴を示す尿細管細胞が最も濃く染まった。損傷があまりない尿細管細胞はほとんど染まらなかった。これらのデータは、さまざまな腎疾患の皮質尿細管における新規および広範なＮＧＡＬの反応性と、ＮＧＡＬ発現がヒト腎臓の損傷上皮に対する共通の反応であることを示している。
【実施例９】
【０１５７】
外因性のＮＧＡＬはＡＴＮのマウスの近位尿細管を回復させる。虚血腎臓におけるＮＧＡＬ発現の機能的な重要性を調べるため、マウスにＡＴＮ障害を誘導した。腎動脈を３０分間クランプし、対側性の腎臓を取り出した。再灌流の２４時間後、血漿クレアチニンは０．４１±０．１ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝４）から３．６１±０．１７ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝８、ｐ＜０．００１）に上昇し、ＮＧＡＬｍＲＮＡとタンパク質の発現が増加した。ＮＧＡＬｍＲＮＡのレベルは約１０００倍増加し、リアルタイムＰＣＲの検出閾値が、偽処理群で１７．７±０．８７回から虚血性腎臓で７．５２±０．４４回（ｐ＜０．０００１、各ｎ＝４）に減少した（βアクチンｍＲＮＡレベルで補正）。ＮＧＡＬタンパク質は尿で１０００倍（図１１Ｅに示すとおり、偽処理および正常マウスが４０ｎｇ／ｍＬであるのに対し、ＡＴＮの場合４０μｇ／ｍＬ）、血液で３００倍（偽処理マウスが１００ｎｇ／ｍＬであるのに対し、ＡＴＮの場合３０μｇ／ｍＬ）上昇し、腎臓抽出物中では１００倍近く上昇した（偽処理腎臓の場合、湿重量１ｇあたり１μｇ未満であるのに対し、ＡＴＮの場合、平均７３μｇ、ｎ＝３、ｐ＜０．０５）。腎臓のＮＧＡＬタンパク質量はクランプ継続時間とよく相関した。
【０１５８】
ＡＴＮの虚血モデルにおいてＮＧＡＬが保護的に機能するかどうかを決定するため、動脈クランプの前または外してから１時間以内に、ＮＧＡＬを全身に投与した。クランプの１５分前にＮＧＡＬを１００μｇ注射すると、再灌流の２４時間後に測定した血漿クレアチニンの上昇が抑制された（１．１８±０．１８ｍｇ／ｄＬ、ｎ＝７、未処理群では３．１６±０．１７ｍｇ／ｄＬ）。同様の結果が、１０〜３００μｇの範囲でＮＧＡＬを投与した場合に得られたが、１μｇのＮＧＡＬでは保護できなかった（クレアチニン濃度３．０９±０．１１ｍｇ／ｄＬ、ｎ＝３）。また再灌流１時間後にＮＧＡＬを投与した場合も窒素過剰血を抑制した（クレアチニン濃度１．６０±０．２８、ｎ＝３、ｐ＜０．００１）が、ＮＧＡＬによる前処理よりは弱かった。これらのデータは血液尿素窒素の測定によって確認された（データ図示せず）。
【０１５９】
図１３Ａを見ると、ＡＴＮ腎臓に比べ、対照群およびＮＧＡＬ処理腎臓（ＡＴＮ＋ＮＧＡＬ）において、尿細管の壊死および管腔壊死細胞片よりむしろ、近位尿細管Ｓ１およびＳ２部位の上皮細胞が正常形態のまま保護されているという組織学的知見によっても、ＮＧＡＬ活性は証明された。図１３Ｂを見ると、髄質外層の外帯にあるＳ３部位はＮＧＡＬ注射ではほとんど保護されないが、尿細管円柱もあまり顕著ではなかった。こうした観察は、図１３Ｃに見られる切片のジャブロンスキースコアによって支持された。これとは対照的に、虚血２時間後に処理した場合、保護効果はなかった（クレアチニン濃度３．１２±０．３５ｍｇ／ｄＬ、ｎ＝３）。
【実施例１０】
【０１６０】
虚血性灌流障害との相関。カドヘリンの輸送と代謝は虚血の影響を直ちに受けるため、また、ＮＧＡＬはラットの胚性後腎間葉においてＥカドヘリンの誘導体として機能するため、ＮＧＡＬは虚血腎臓においてカドヘリン発現を回復させる。この仮説を検証するため、免疫蛍光法によってマウスの近位尿細管においてＥカドヘリンの検出が可能になった一方、図１４Ａを見ると近位尿細管の全部位でＮカドヘリンが存在し、これが主要なカドヘリンらしいことをまず確認した。Ｎカドヘリンはカスペース類、βセクレターゼ、およびＣＲＥＢシグナリングを調節する重要なシグナル分子の可能性がある細胞質で３０〜４０Ｋｄ断片を生成する基質メタロプロテイナーゼによって処理されることが知られている。Ｎカドヘリンは虚血再灌流後に３０Ｋｄの断片に分解されることが、図１４Ｂの免疫ブロットで証明された。このことはこれらの経路の内１以上の経路が活性化されたことを示している。マウスによっては、Ｎカドヘリンの分解は再灌流後の６時間以内に検出され、２４時間までに、Ｎカドヘリンの免疫蛍光および全長Ｎカドヘリンの両者がほとんどなくなった。これと対照的に、ＮＧＡＬで前処理すると、Ｎカドヘリンの免疫蛍光は保存され、全長Ｎカドヘリンの発現が促進し、再灌流の６時間後に（数個体で）測定した断片、または２４時間後に測定した断片の出現が減少した。そのため、近位尿細管のマーカーであるＮカドヘリンの保護はＮＧＡＬ活性と相関し、ＮＧＡＬ活性の高感度なマーカーとなる。Ｅカドヘリンは遠位尿細管および集合管で高度に発現するのだが、虚血およびＮＧＡＬ処理にほとんど影響されなかった。同様に、金属誘導による腎毒性ＡＴＮはＮカドヘリンの分解を導くが、Ｅカドヘリンには影響しなかった。そこでＮＧＡＬの一効果は、Ｎカドヘリン断片がシグナリングを阻害することにある。
【０１６１】
近位尿細管細胞の破壊は結果的にアポトーシス細胞死になるため、アポトーシス誘導のＴＵＮＥＬ検査を用いて細胞の生存率へのＮＧＡＬが細胞の生存率に与える効果を決定した。再灌流の２４時間後に、図１４Ｃに見るＴＵＮＥＬ陽性尿細管細胞を少なくとも１個有する尿細管の割合を計測した。虚血性腎臓（Ｉ／Ｒ）は、１１．５％±０．６（ＳＥＭ、ｎ＝４個体）の皮質尿細管がＴＵＮＥＬ陽性細胞を含んでいることを示したが、ＮＧＡＬ処理後（Ｉ／Ｒ＋Ｎｇａｌ）では陽性率は２．９％±０．９（ＳＥＭ、ｎ＝７、ｐ＜０．００１）に下がった。比較すると、図１４Ｄの定量グラフに示すとおり、偽処理腎臓の陽性率は０．５％±０．３である。
【０１６２】
ＢｒｄＵ取り込みが細胞増殖の測定手段として決定された。このとき腎臓の組織切片において、少なくとも１個のＢｒｄＵ陽性尿細管細胞がある皮質尿細管の割合を決定した（図示せず）。虚血性の皮質尿細管はほとんどＢｒｄＵ陽性細胞を含んでいなかった（１．９％±０．３、ｎ＝３）が、ＮＧＡＬで前処理した虚血性腎臓の虚血２４時間後では陽性細胞が少しではあるが有意に増加した（３．９％±０．５、ｎ＝４、ｐ＜０．０５）。比較すと、偽処理腎臓のＢｒｄＵ陽性細胞率は３．７％±０．７であった。そこでＮＧＡＬによる回復は、皮質細胞のアポトーシスを減少させ、尿細管細胞の補償的な増殖を刺激するか、または損傷から細胞を回復させるかのどちらかであった。
【０１６３】
ＮＧＡＬ発現は虚血性損傷と相関するため、外因性ＮＧＡＬタンパク質で処理した後の内因性ＮＧＡＬの発現を測定した。虚血マウスを１００ｍｇのＮＧＡＬで処理すると、リアルタイムＰＣＲで測定したとおり再灌流の２４時間後に内因性のＮＧＡＬのＲＮＡの増加は７２％±１６（ｐ＜０．０１、ｎ＝５）まで減少した。１００ｍｇのＮＧＡＬで処理すると、免疫ブロットで測定したとおり腎臓では内因性ＮＧＡＬタンパク質の産生が２．５倍（虚血７３±７μｇ／ｇ、ＮＧＡＬ処理虚血２９±７μｇ／ｇ、各ｎ＝３、ｐ＜０．０１）まで減少し、尿細管細胞の増殖能が保護された。
【実施例１１】
【０１６４】
ＮＧＡＬはＡＴＮにおいてヘムオキシゲナーゼ１を上方制御する。多くの研究で、ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）が虚血腎臓の近位尿細管の重要な制御因子として同定されている。ＨＯ−１はＡＴＮの回復に必要であり、その発現レベルは組織損傷の回復と直接相関する。図１４Ｅに示すとおり、虚血再灌流（ＡＴＮレーン）はＨＯ−１の発現を促進するが、ＡＴＮ損傷マウスに１０〜１００μｇのＮＧＡＬで処理した場合（ＡＴＮ Ｎｇａｌレーン）、再灌流後２４時間以内にＨＯ−１は５〜１０倍さらに上方制御された。ＮＧＡＬ単独でＨＯ−１を誘導するのかを決定するため、ＮＧＡＬの量を変えて健康なマウス（偽レーン）に投与し、ＨＯ−１タンパク質レベルを測定した。しかしＮＧＡＬ注射後のＨＯ−１の発現はＮＧＡＬ処理ＡＴＮ損傷腎臓に比べずっと少ないく、ＮＧＡＬは虚血再灌流の間に他の活性因子と協同してＨＯ−１を上方制御し、鉄媒介の損傷から腎臓を保護することを示している。
【実施例１２】
【０１６５】
ＡＴＮの回復機構。ＮＧＡＬは近位尿細管を標的にする。ＮＧＡＬが虚血障害から近位尿細管を保護するメカニズムを確証するため、ＮＧＡＬを腹膜内または皮下に注射した後の外因性ＮＧＡＬの分布を決定した。図１５を見ると、１００μｇの外因性ＮＧＡＬを注射して１０分以内にＮＧＡＬは尿で検出された。このことはタンパク質が速やかに腎臓で処理されたことを示している。ＮＧＡＬを１０μｇ投与した場合にも同じ時間経過が観察ｓらえた（図示せず）。しかし最初の1時間で尿中に検出されたのは、注射したＮＧＡＬの内わずか０．１〜０．２％のみだった。輸送経路をより明確に追跡するため、蛍光結合のＮＧＡＬを投与した。1時間が経過するまでに、図１６Ａに見るフルオレセインとＡｌｅｘａ標識ＮＧＡＬの両方が皮質近位尿細管の腔側に近い領域（ネフロンのＳ１およびＳ２部位）にある大きな小胞に局在したが、尿細管の他の部位には見られなかった。尚、近位尿細管によって取り込まれリソソームで分解される第二のリポカリンであるレチノイド負荷ＲＢＰは無効だったため、タンパク質の輸送経路それ自体が腎臓保護機構である可能性はほとんどない（図１６Ａ）。これらの細胞内小器官がリソソームであるかを確かめるため、Ａｌｅｘａ―５６８ＮＧＡＬ投与の前日に、フルオレセイン−デキストラン（４３ｋＤａ）で近位尿細管のリソソームを標識した。ＮＧＡＬ注射の１時間後、ＮＧＡＬ小胞の３３％に図１６Ｂに見るデキストランが含まれていた。さらに、これら小胞の多くはリソソームのマーカーであるＬＡＭＰ１で共染色した（図示せず）。同様の結果が１２５Ｉ−ＮＧＡＬを注射した後でも観察され、図１６Ｃを見ると、１時間が経過するまでに全長タンパク質が急速に血中から除去され、腎臓に集まることを示している。実際、腎臓は、１ｍｇタンパク質あたり肝臓の１３倍の１２５Ｉ−ＮＧＡＬを有していた。同様のデータを、ヒトＮＧＡＬに関してすでに報告しており、ヒトＮＧＡＬの場合、急速に循環血液中から回収され（ｔ１／２＝１０分）、１ｍｇタンパク質あたり肝臓の１２倍の量が腎臓に集まっていた。腎臓に局在したタンパク質はＴＣＡで沈降させると（７０％）、全長ＮＧＡＬと特定の１４ｋＤａ分解産物とからなっていた。これらの分子種は注射の５時間後まで残存し、その後ゆっくりと消失した。これとは対照的に、血漿および特に尿は、ほとんどが分子量の低いＴＣＡ可溶性の１２５Ｉ断片を含んでいた（ＴＣＡ沈降は血漿３５％、尿２０％）。
【０１６６】
これらのデータによると、全長ＮＧＡＬは急速に近位尿細管で回収され、そこでリソソームに輸送され１４ｋＤａの断片に分解されることが分かった。循環血液から自由に濾過される事実にもかかわらず正常なマウスまたはヒトの尿では非常に低濃度のＮＧＡＬしかないので（ヒトでは尿ＮＧＡＬ＝２２ｎｇ／ｍＬであるが濾過負荷量＝２０ｎｇ／ｍＬ×ＧＦＲ、マウスでは尿ＮＧＡＬ＝４０ｎｇ／ｍＬであるが濾過負荷量＝１００ｎｇ／ｍＬ×ＧＦＲ）、内因性タンパク質（低濃度の血清ＮＧＡＬ）は同様な経路で輸送されている可能性がある。
【実施例１３】
【０１６７】
近位尿細管のＡＴＮからの回復にはＦｅ：シデロホアが必要。ＮＧＡＬが鉄を近位尿細管に輸送できるかを確かめるため、鉄のないエンテロチェリン−ＮＧＡＬ（Ｓｉｄ：ＮＧＡＬ）と５５Ｆｅとを１：１の化学量（５５Ｆｅ：Ｓｉｄ：ＮＧＡＬ）でインキュベートして、放射性鉄５５ＦｅでＮＧＡＬを飽和状態にした。この放射性標識５５Ｆｅ：Ｓｉｄ：ＮＧＡＬ複合体を注射（腹腔内に１０μｇ）した。その１時間後、５５Ｆｅのほとんどが腎臓で回収（５５％）されたが、血漿（４．３％）、尿（０．６％）、肝臓（２．４％）、および脾臓（０．２％）ではわずかしか検出されなかった。腎臓における５５Ｆｅの場所を特定するため、組織切片のオートラジオグラフィーを行った。図１６Ｅおよび表１（Ｘ２＝２１．２、ｐ＝０．００１７）に示すとおり、５５Ｆｅは近位尿細管に局在し、具体的には刷子縁の下部の腔側表面に沿っていた。
【表１】
注：ａ全銀粒子数＝２６０１ ｂ全点数＝９９９ ｃ粒子（％）／点数（％）
【０１６８】
対照的に、５５Ｆｅは図１６Ｄに示す髄質では見られなかった。これらのデータは、外因性５５Ｆｅ：Ｓｉｄ：ＮＧＡＬ複合体を注射した場合、近位尿細管がＮＧＡＬタンパク質とそのリガンドである鉄の両方を獲得できるようになることを証明している。尚、５５Ｆｅ：Ｓｉｄ：ＮＧＡＬの分布はタンパク質非結合のクエン酸５５Ｆｅの分布と全く異なり、後者では鉄のわずか１．５％のみが腎臓に回収された（図示せず）。
【実施例１４】
【０１６９】
腎臓保護において鉄輸送が果たす役割を明らかにするため、２種類の大腸菌株（Ｅ．Ｃｏｌｉ）でクローニングしたＮＧＡＬを比較した。ＸＬ−１Ｂｌｕｅ株でクローニングしたＮＧＡＬはエンテロチェリンを含み、鉄が負荷されている。一方、ＢＬ２１株でクローニングしたＮＧＡＬはエンテロチェリンを含まない。図１７Ａを見ると、ＸＬ−１ＢｌｕｅクローンＮＧＡＬ１０μｇ（ホロＮｇａｌ１０μｇ：左）は、偽処理（偽）および未処理ＡＴＮ損傷腎臓（ＡＴＮ）に比べて腎臓を保護した。しかしエンテロチェリンがないＢＬ２１クローンＮＧＡＬ１０μｇ（アポＮｇａｌ１０μｇ：中）では保護が低かった。そのためＢＬ２１クローンＮＧＡＬを、鉄無し（アポＮｇａｌ：Ｓｉｄ）および鉄飽和エンテロチェリン（アポＮｇａｌ：Ｓｉｄ：Ｆｅ）で再構成した。エンテロチェリンの負荷（鉄の有無にかかわらず）は腎臓の保護を促進し、血清クレアチンの上昇を弱めた。鉄飽和シデロホアは腎臓での鉄キレートの許容量を減少させるため、鉄があるとわずかに保護が低下した。鉄負荷と鉄無しＮＧＡＬ：Ｓｉｄのどちらも保護的であるため、鉄よりもむしろシデロホア自体が活性を示していた可能性がある。鉄の役割をさらに調べるため、ガリウム：Ｓｉｄ：ＮＧＡＬ：Ｓｉｄ：ガリウム（アポＮｇａｌ：ｓｉｄ：Ｇａ）複合体も検証した。ガリウムは、エンテロチェリンシデロホアを含む鉄結合部位を高い親和性で占有する（ガリウムは非標識鉄と同程度にエンテロチェリンへの５５Ｆｅの結合を阻害する）。また鉄のように酸化還元反応を受けないため、ガリウムはシデロホアへ結合するため鉄と競合する。鉄複合体と比べて、虚血１５分前にガリウム複合体で処理したマウスは保護されなかった（クレアチニン濃度３．１７±０．１、ｎ＝４）。さらに、遊離シデロホアの単独投与、デスフェリオキサミンメシレート（ＤＦＯ）、またはレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）もまた対ＡＴＮ保護に失敗した。これらのデータは、ＮＧＡＬ：シデロホア複合体がＮＧＡＬの保護活性を提供し、シデロホアによる鉄の輸送がＮＧＡＬに依存していることを証明している。鉄がある場合とない場合のＮＧＡＬ：シデロホア複合体の免疫ブロットを図１７Ｂに示す。
【実施例１５】
【０１７０】
尿シデロホアの証明。外因性ＮＧＡＬに関連して重要なシデロホアは細菌の産物であるため、インビボでの内因性ＮＧＡＬの作用は外因性ＮＧＡＬの薬理学的効果とは異なるだろう。しかしさまざまな研究によって、鉄を輸送する内因性の低分子量因子の存在が示唆されてきた。これらの分子には、クエン酸、および関連化合物、また、分子量１Ｋｄ程度の鉄輸送活性が含まれてもよい。ＮＧＡＬの補因子の尿に存在するかを確認するため、ＢＬ２１株由来のアポＮＧＡＬを健康なマウスの尿サンプルと混合した。図１８Ａを示ると、尿の低分子量化合物（＜３Ｋｄ）が、１０Ｋｄ限外濾過膜上の５５Ｆｅを取り込めず、またＴｒｉｓまたはリン酸緩衝液に希釈したアポＮＧＡＬが５５Ｆｅを取り込めていなかった。ところがＮＧＡＬと尿（＜３Ｄａ）をインキュベートすると、５５Ｆｅが取り込めるようになった。ＮＧＡＬによって取り込まれた鉄は、１０００倍の非標識クエン酸鉄、およびより強力には５０倍濃度の鉄飽和エンテロチェリンの存在によって阻害された。これを図１８Ｂに示す。鉄の取り込みは飽和できる。また３０μＬのマウス尿を用いた場合、約２０％のＮＧＡＬ分子が鉄と結合する。これらの知見は、マウス尿がＮＧＡＬ−鉄と相互作用する低分子量の補因子を含むことを示唆している。この内因性の因子は、ＮＧＡＬのカリックスと高い親和性（０．４ｎＭ）で結合する細菌のシデロホアと競合的なので、細菌と哺乳類因子の両方が同じリポカリンの結合ポケットを占有すると思われる。
【実施例１６】
【０１７１】
腎臓移植を受けた患者におけるＮＧＡＬ発現。腎臓移植を受けたヒトの回復期におけるＮＧＡＬ発現を評価した。生体腎移植（ＬＲＤ、ｎ＝１０）または死体腎移植（ＣＡＤ、ｎ＝１２）を対象に腎臓移植後１時間以内に腎臓生検を得た。生検標本は切片化し、ＮＧＡＬ抗体で免疫組織学的に染色した。図１９に示すとおり、ＮＧＡＬ発現はＣＡＤ群で有意に増加した。死体腎は、生体提供者からの腎臓よりも長時間体外で保持されているので、虚血の程度が概して大きく、ＮＧＡＬ発現と正の相関を示した。
【０１７２】
ＬＲＤ（ｎ＝４）またはＣＡＤ（ｎ＝４）腎臓移植を対象に、移植前および移植２時間後に得た尿サンプルのウェスタンブロットを図２０に示す。尿中のＮＧＡＬ発現は手術前にはない。ＮＧＡＬ発現は、ＣＡＤ群の方がＬＲＤ群よりも有意に増加した。図２１を見ると、ウェスタンブロットで定量した尿ＮＧＡＬをＬＲＤとＣＡＤとで比較した場合、ＣＡＤの方が有意な発現増加を示した。ＥＬＩＳＡによる定量でも同様の結果を示した（図示せず）。この知見はまたＣＡＤ腎臓移植に関連する虚血時間の長さに相関した。ＣＡＤ移植の２時間後に得た尿と低温虚血時間との相関を図２２に示す。
【０１７３】
血清クレアチニン濃度は、移植手術後２〜４日で最大になる。これもまた尿ＮＧＡＬと相関した。ＣＡＤ移植の２時間後に得た尿と最大血清クレアチニンとの相関を図２３に示す。
【実施例１７】
【０１７４】
急性腎不全の診断ツールとしてのＮＧＡＬ測定の利用。心肺バイパス開心術中に起きる不幸の１つに急性腎不全（ＡＲＦ）の発症がある。血清ＮＧＡＬ測定はＡＲＦを発症する危険性がある患者を高率に予測できる。図２４は、ＮＧＡＬのＥＬＩＳＡによる標準曲線で、１０の独立した標準曲線から得られた直線関係を示す。ＣＰＢ後にＡＲＦを発症した患者（ｎ＝１０）を対象に経時的にサンプルを採取し血清ＮＧＡＬを測定した。これを図２５に示す。ＮＧＡＬの上昇は術後に回収したサンプルで著しく、上昇は少なくとも４日間継続した。これとは対照的に、ＡＲＦを発症しなかった患者では、術後４日間血清ＮＧＡＬの上昇はなかった。図２６は、時間経過で見たＡＲＦを発症した患者（ｎ＝１０）対術後何も起こらなかった患者（ｎ＝３０）の血清ＮＧＡＬの平均値±ＳＤを示す。図２７に示すとおり、ＣＰＢ後にＡＲＦを発症した患者（ｎ＝１１）の経時的尿ＮＧＡＬ測定でも上昇が見られたが、血清ＮＧＡＬと比べるとばらつきが大きかった。しかし図２８で示すとおり、ＡＲＦを発症した患者（ｎ＝１１）と術後何も起こらなかった患者（ｎ＝３０）を対象に経時的に尿ＮＧＡＬの平均値±ＳＤの比較分析を行った結果、尿ＮＧＡＬ濃度によってＡＲＦの予測が可能になることが分かった。図２９を見ると、手術２時間後の尿ＮＧＡＬ濃度は手術中のＣＰＢ時間の長さに相関した。
【０１７５】
以上、実施の形態および実施例を挙げて本発明を説明し、また、実施の形態および実施例を詳細に記述したが、付記する請求の範囲をかかる詳細事項に制限または限定することを意図しない。当業者であれば、本明細書に記載した以外のさらなる利点および変更が容易に理解されるだろう。そのため、より広い局面において本発明は、示され記述された前記特定の詳細事項、代表的な方法および構造、および例証した実施例に限定されない。よって、本発明の範囲または精神から離脱せずに、かかる詳細事項から離脱できるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】（図示のとおり）決められた量の組換え精製ＮＧＡＬのクーマシーブルー（ＣＢ）と高感度化学発光（ポリクローナルＮＧＡＬ抗体によるＥＣＬ）分析を示す。
【図２】ポリクローナルＮＧＡＬ抗体を用いた、注入１時間後の非虚血対照動物からの腎臓、または１時間もしくは３時間後の虚血性腎臓の免疫蛍光染色を示す。
【図３】ＮＧＡＬ投与１時間以内の非虚血（ＮＩ）および虚血（Ｉ）動物からの尿サンプル中ＮＧＡＬを検出するためのウェスタンブロットを示す。
【図４】非虚血対照マウス、生理食塩水前処理虚血マウス、または虚血の１時間前、最中、または１時間後にＮＧＡＬで処理した虚血マウスからの腎臓をヘマトキシリンエオシンで染色した切片を示す。
【図５】生理食塩水で前処理した、または虚血の１時間前、最中、１時間後にＮＧＡＬで処理した虚血マウスからの腎臓の組織切片のスコアを示す。本切片は、任意の０から４のスケールを用いて尿細管拡張（図５Ａ）、尿細管円柱（図５Ｂ）、および尿細管細胞壊死（図５Ｃ）について分析しスコアを付けた。
【図６】非虚血対照マウス、または生理食塩水で前処理した虚血マウスにおいて測定された血清クレアチニン（Ｐｒｅ Ｓａｌ）、または虚血障害の１時間前（Ｐｒｅ ＮＧＡＬ）、最中（Ｄｕｒ ＮＧＡＬ）、１時間後（ＰｏｓｔＮＧＡＬ）にＮＧＡＬ処理した虚血マウスの虚血２４時間後において測定された血清クレアチニンを示す。
【図７】非虚血対照マウスの代表的な切片、または生理食塩水で前処理した虚血マウス、もしくは虚血障害の１時間前、最中、１時間後にＮＧＡＬで処理した虚血マウスの虚血２４時間後の代表的な切片をＴＵＮＥＬ染色した結果を示す。矢印は、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）染色と比べた、低倍率および高倍率でのアポトーシスの特徴である密で断片化した濃い核の染色を指している。
【図８】非虚血対照マウスの腎臓、または生理食塩水で前処理した虚血マウス、もしくは虚血障害の１時間前、最中、１時間後にＮＧＡＬで処理した虚血マウスの虚血２４時間後の腎臓におけるアポトーシスの定量（上）および増殖（中）を示す。
【０１７７】
【図９】非虚血対照マウスの、または生理食塩水で前処理した虚血マウス、もしくは虚血障害の１時間前、最中、１時間後にＮＧＡＬで処理した虚血マウスの虚血２４時間後の腎臓において算出された増殖：アポトーシスの比を示す。
【図１０】尿のみ、尿およびＮＧＡＬ混合（尿＋Ｎｇａｌ）、尿およびＮＧＡＬ：シデロホア混合（尿＋Ｎｇａｌ：Ｓｉｄ）、血漿のみ、緩衝液のみ、緩衝液およびＮＧＡＬ混合（緩衝液＋Ｎｇａｌ）、緩衝液およびＮＧＡＬ：シデロホア混合（緩衝液＋Ｎｇａｌ：Ｓｉｄ（１））、第二緩衝液およびＮＧＡＬ：シデロホア混合（緩衝液＋Ｎｇａｌ：Ｓｉｄ（２））、シデロホアが鉄で飽和された第三緩衝液およびＮＧＡＬ：シデロホア混合（緩衝液＋Ｎｇａｌ：Ｓｉｄ：Ｆｅ）において検出される５５Ｆｅの結合を示す。
【図１１Ａ】健康な被験者（正常）、または急性腎臓壊死（ＡＴＮ）もしくは慢性腎不全（ＣＦＲ）を患う被験者、または腎臓疾患がないと診断された肝硬変、血色素沈着症、または膵癌を患う被験者（その他）からのヒト尿サンプルにおけるＮＧＡＬタンパク質の免疫ブロットを示す。モノクローナル抗ヒトＮＧＡＬ（Ｍｏ）およびポリクローナル抗マウスＮＧＡＬ（Ｐｏ）抗体は、組換えおよびヒト固有のＮＧＡＬおよびＮＧＡＬ標準物質を認識する。
【図１１Ｂ】ＮＧＡＬ標準物質と比較した、健康な被験者（正常）、または急性腎臓壊死（ＡＴＮ）もしくは慢性腎不全（ＣＦＲ）を患う被験者、または腎臓疾患がないと診断された肝硬変、血色素沈着症、または膵癌を患う被験者（その他）からのヒト血清サンプルにおけるＮＧＡＬタンパク質の免疫ブロットを示す。
【図１１Ｃ】健康な被験者（正常）、または急性腎臓壊死（ＡＴＮ）もしくは慢性腎不全（ＣＦＲ）を患う被験者からの尿中のＮＧＡＬタンパク質濃度の量的比較を示す。ＡＴＮはさらに非敗血症と敗血症の群に分類した。
【図１１Ｄ】健康な被験者（正常）、または急性腎臓壊死（ＡＴＮ）もしくは慢性腎不全（ＣＦＲ）を患う被験者からの血清中のＮＧＡＬタンパク質濃度の量的比較を示す。ＡＴＮはさらに非敗血症と敗血症の群に分類した。
【図１１Ｅ】５０、５、および１ｎｇの標準ＮＧＡＬタンパク質と、ＡＴＮ障害マウスおよび偽処理対照マウスの尿ＮＧＡＬの免疫ブロットを示す。
【０１７８】
【図１２Ａ】健康なヒト腎臓（正常）におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色を示す。
【図１２Ｂ】健康なヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色を示す。
【図１２Ｃ】健康なヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色を示す。
【図１２Ｄ】敗血症による虚血性ＡＴＮ（虚血性ＡＴＮ）のヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【図１２Ｅ】嘔吐および下痢が原因の血液量減少による虚血性ＡＴＮのヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【図１２Ｆ】心疾患による虚血性ＡＴＮのヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【図１２Ｇ】ビスホスフォネートが原因の腎毒性による毒性ＡＴＮ（毒性ＡＴＮ）のヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【図１２Ｈ】セファロスポリンの毒性が原因の腎毒性による毒性ＡＴＮのヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【図１２Ｉ】ヘモグロビン尿症が原因の腎毒性による毒性ＡＴＮのヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色の増加を示す。
【図１２Ｊ】ＮＧＡＬが半月体に弱く発現する、糸球体疾患のヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色を示す。
【図１２Ｋ】ＮＧＡＬがネフローゼの近位尿細管で弱く発現する、糸球体疾患のヒト腎臓におけるＮＧＡＬの免疫組織学染色を示す。
【０１７９】
【図１３Ａ】偽処理（正常）、虚血（ＡＴＮ）、およびＮＧＡＬ処理ＡＴＮ障害（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）の腎臓の組織切片を示す。尿細管の核の損失がＡＴＮでは見られるが、皮質（中）および髄質（下）の尿細管内円柱と共に、対照またはＡＴＮ＋Ｎｇａｌ切片（上）、では見られない。ＮＧＡＬ前処理は結果的に皮質尿細管を保護するが、残りの皮質髄質円柱には影響しなかった。
【図１３Ｂ】管腔円柱およびＮＧＡＬでの前処理による皮質尿細管の回復をＰＡＳ染色で強調した、虚血（ＡＴＮ）、およびＮＧＡＬ処理ＡＴＮ障害（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）腎臓の組織切片を示す。
【図１３Ｃ】ＮＧＡＬによる虚血性皮質の回復を示す、偽処理（偽）、虚血（ＡＴＮ）、およびＮＧＡＬ処理ＡＴＮ障害（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）腎臓のジャブロンスキースコアを示す。
【図１４Ａ】腎臓切片のＮカドヘリン染色を示す。虚血再灌流（ＡＴＮ）ではほとんど見られないが、ＮＧＡＬが投与された場合（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）は回復し検出される。
【図１４Ｂ】虚血再灌流動物および偽処理動物におけるＮカドヘリン断片（矢印）、およびＮＧＡＬ処理動物での断片抑制によって示される、虚血（ＡＴＮ）と比較した、ＮＧＡＬ処理（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）による全長Ｎカドヘリンタンパク質濃度の回復を示す。ＧＡＰＤＨは負荷対照である。
【図１４Ｃ】ＮＧＡＬ前処理によって軽減された虚血再灌流マウス（Ｉ／Ｒ）におけるＴＵＮＥＬ陽性アポトーシス細胞（蛍光）の尿細管を示す。トップロールは核対比染色である。
【図１４Ｄ】偽処理対照群（偽）、虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）、およびＮＧＡＬ処理虚血再灌流（＋Ｎｇａｌ）マウスにおけるアポトーシス様核を含む尿細管の比率の定量分析を示す。
【図１４Ｅ】偽処理（偽）、虚血再灌流（ＡＴＮ）、またはＮＧＡＬ処理の虚血再灌流（ＡＴＮ＋Ｎｇａｌ）の腎臓におけるヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）発現の免疫ブロットを示す。組換えＨＯ−１（ＨＯ−１）およびラット皮質は比較用である。ＧＡＰＤＨは負荷対照である。
【０１８０】
【図１５】ＮＧＡＬ１００μｇをマウスに腹腔内注射した後の血液および尿中ＮＧＡＬタンパク質のクリアランスの免疫ブロットを示す。
【図１６Ａ】近位尿細管（下）で見られるが、糸球体または髄質（上）では見られない、大きな小胞に局在する蛍光標識（Ａｌｅｘａ５６８）ＮＧＡＬを示す。非結合蛍光色素は腎臓を標識しなかった。
【図１６Ｂ】近位尿細管のＳ１およびＳ２部位でのＦＩＴＣデキストランと共に局在するＡｌｅｘａ５６８−ＮＧＡＬを示す。
【図１６Ｃ】注入後１時間および５時間の腎臓に見られるＮＧＡＬの全長および１４ｋＤａ断片を示す１２５Ｉ−ＮＧＡＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離。
【図１６Ｄ】５５Ｆｅ負荷シデロホア−ＮＧＡＬの腹腔内注射１時間後の腎臓のオートラジオグラフを示す。放射活性減衰は皮質で検出され、近位尿細管細胞の腔内付近に関連している。
【図１６Ｅ】髄質で放射活性が検出されなかった、５５Ｆｅ負荷シデロホア−ＮＧＡＬの腹腔内注射１時間後の腎臓のオートラジオグラフを示す。
【図１７Ａ】は、３０分間虚血させたマウスでの血漿クレアチニンを示す。最初のグラフは、虚血１５分前または虚血後１時間以内に用いた場合にＸＬ−１細菌（シデロホアを含有）由来のホロＮＧＡＬ（≧１μｇ）が腎機能を回復させることを示す。しかし投与が遅れた場合、ＮＧＡＬは無効である。第二グラフは、ＢＬ２１細菌（シデロホア不含）由来のアポＮＧＡＬが最小限の活性しか持たないが、エンテロチェリンを添加すると保護的に働く。鉄不含（アポＮＧＡＬ：Ｓｉｄ）および鉄含有シデロホア（アポＮＧＡＬ：Ｓｉｄ：Ｆｅ）は共に保護効果を持つ。対照的に、ガリウム含有複合体（アポＮＧＡＬ：Ｓｉｄ：Ｇａ）は、ＤＦＯの単独投与またはシデロホア不含（Ｓｉｄ）と同様に無効であった。近位尿細管によって濾過され再吸収されるリポカリンであるレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）は無効であった。
【図１７Ｂ】ＮＧＡＬの免疫沈降製剤を示す。ＮＧＡＬ：Ｓｉｄはエンテロチェリンを含むが鉄は含まない。ＮＧＡＬ：Ｓｉｄ：Ｆｅはシデロホアと鉄を含む。
【０１８１】
【図１８Ａ】尿中に鉄結合補因子が存在することを示す。緩衝液は５５Ｆｅ（タンパク質不含）、アポＮＧＡＬ、アポＮＧＡＬ＋シデロホア、またはアポＮＧＡＬ＋シデロホア＋非標識鉄と混合する。一連の洗浄の後、５５ＦｅはアポＮＧＡＬ＋シデロホアによって保持されるが、アポＮＧＡＬまたは鉄飽和シデロホアと結合したアポＮＧＡＬによっては保持されない。このことは不飽和シデロホアがＮＧＡＬによる５５Ｆｅの保持に必要なことが示している。
【図１８Ｂ】示すように、尿（＜３，０００Ｄａ）が５５ＦｅまたはアポＮＧＡＬと混合され、その後１０ＫＤａ膜上で３回洗浄すると、アポＮＡＧＬ＋尿が５５Ｆｅを保持することを示す。５５Ｆｅ保持は過剰なクエン酸鉄（Ｆｅ）の添加により遮断される。活性は鉄飽和エンテロチェリン（Ｓｉｄ：Ｆｅ）によっても遮断される。
【図１９】生体（図０と１）または死体（図２と３）腎臓移植後１時間以内に得た腎臓生検を示す。切片はＮＧＡＬ抗体で染色した。ＮＧＡＬ発現は長期の虚血期間を経た死体群で有意に増加した。
【図２０】生体（ＬＲＤ、ｎ＝４）または死体（ＣＡＤ，ｎ＝４）腎臓移植の移植後２時間以内に得た尿サンプルのＮＧＡＬ抗体プローブに用いたウェスタンブロットを示す。尿中のＮＧＡＬ発現は手術前にはなかった。ＮＧＡＬ発現はＬＲＤ群よりもＣＡＤ群の方が有意に増加した。
【図２１】ＬＲＤとＣＡＤを比較した尿ＮＧＡＬのウェスタンブロットによる定量分析を示し、ＣＡＤが有意な発現増加を示している。
【図２２】低温虚血の時間に関する、ＣＡＤ移植の２時間後に得られた尿ＮＧＡＬの相関を示す。尿ＮＧＡＬの発現度合いは虚血時間と相関する。
【図２３】手術後２〜４日に測定した最大血清クレアチニンに関する、ＣＡＤ移植の２時間後に得られた尿ＮＧＡＬの相関を示す。尿ＮＧＡＬの発現度合いは最大血清クレアチニンと相関する。
【０１８２】
【図２４】独立した１０本の標準曲線から得られた直線関係に関するＮＧＡＬのＥＬＩＳＡの標準曲線を示す。
【図２５】心肺バイパス（ＣＰＢ）後ＡＲＦを術中に発症した患者の経時的血清ＮＧＡＬ測定値を示す（ｎ＝１０）。
【図２６】ＡＲＦ（四角、ｎ＝１０）を発症したＣＰＢ患者と、手術後何もない患者（菱形、ｎ＝３０）を比べた経時的血清ＮＧＡＬ濃度の平均値±ＳＤを示す。
【図２７】ＣＰＢ後にＡＲＦを発症したＣＰＢ患者の経時的尿ＮＧＡＬ測定値を示す（ｎ＝１１）。
【図２８】ＡＲＦ（菱形、ｎ＝１１）を発症したＣＰＢ患者と、術後何もない患者（四角、ｎ＝３０）を比べた経時的尿ＮＧＡＬ濃度の平均値±ＳＤを示す。
【図２９】ＣＰＢ２時間後の尿ＮＧＡＬ濃度とＣＰＢ時間との相関を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者臓器への虚血障害、虚血再灌流障害、および毒素誘導性障害より選択された障害を処置、軽減、改善、または予防するための薬剤の製造における好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）の使用。
【請求項２】
臓器が、腎臓、肝臓、心臓、脳、肺、胃、腸、結腸、膵臓、血管、膀胱、頚部、皮膚、およびそれらの一部からなる群より選択され、好ましくは、前記臓器が患者に移植され、患者への臓器移植の前にＮＧＡＬが死体または生体の臓器提供者へ投与されることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
障害が、患者を虚血性腎臓障害に導く状態、処置、療法、または疾患に関連する腎臓障害を含み、好ましくは、前記腎臓障害が、造影剤処置、抗体処置、抗生物質処置、臓器移植、腎臓移植、死体腎臓移植、心臓処置、手術後の心臓処置、および中枢神経系処置からなる群より選択された状態、処置、もしくは療法の結果である、または感染、細菌感染、腎疾患、虚血再灌流障害、心再灌流障害、心肺バイバス、開心術、および腹部手術からなる群より選択した疾患の結果であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項４】
薬剤がさらにシデロホアを含み、好ましくはシデロホアを前記ＮＧＡＬとの複合化合物として含むことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項５】
患者または臓器もしくは移植片の提供者における臓器または移植片の移植後機能障害（ＤＧＦ）または拒絶反応を軽減または改善するための薬剤の製造における好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）の使用。
【請求項６】
臓器または移植片が、腎臓、肝臓、心臓、脳、肺、胃、腸、結腸、膵臓、血管、膀胱、頚部、皮膚、およびそれらの一部からなる群から選択され、好ましくは、前記臓器または移植片が死体または生体提供者の腎臓であることを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項７】
薬剤がさらにシデロホアを含み、好ましくはシデロホアをＮＧＡＬとの複合化合物として含むことを特徴とする請求項６に記載の使用。
【請求項８】
哺乳類の臓器への障害の処置、軽減、改善、または予防に使用するための組成物であって、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、またはその誘導体もしくはアナログを含む組成物。
【請求項９】
組成物１００μＬあたり少なくとも１０μｇのＮＧＡＬを含むことを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
シデロホアをさらに含み、好ましくはシデロホアを前記ＮＧＡＬとの複合化合物として含むことを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１】
患者臓器への虚血障害、虚血再灌流障害、および毒素誘導性障害より選択された障害を処置、軽減、改善、または予防するための薬剤の製造における好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）の使用。
【請求項２】
臓器が、腎臓、肝臓、心臓、脳、肺、胃、腸、結腸、膵臓、血管、膀胱、頚部、皮膚、およびそれらの一部からなる群より選択され、好ましくは、前記臓器が患者に移植され、患者への臓器移植の前にＮＧＡＬが死体または生体の臓器提供者へ投与されることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
障害が、患者を虚血性腎臓障害に導く状態、処置、療法、または疾患に関連する腎臓障害を含み、好ましくは、前記腎臓障害が、造影剤処置、抗体処置、抗生物質処置、臓器移植、腎臓移植、死体腎臓移植、心臓処置、手術後の心臓処置、および中枢神経系処置からなる群より選択された状態、処置、もしくは療法の結果である、または感染、細菌感染、腎疾患、虚血再灌流障害、心再灌流障害、心肺バイバス、開心術、および腹部手術からなる群より選択した疾患の結果であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項４】
薬剤がさらにシデロホアを含み、好ましくはシデロホアを前記ＮＧＡＬとの複合化合物として含むことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項５】
患者または臓器もしくは移植片の提供者における臓器または移植片の移植後機能障害（ＤＧＦ）または拒絶反応を軽減または改善するための薬剤の製造における好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）の使用。
【請求項６】
臓器または移植片が、腎臓、肝臓、心臓、脳、肺、胃、腸、結腸、膵臓、血管、膀胱、頚部、皮膚、およびそれらの一部からなる群から選択され、好ましくは、前記臓器または移植片が死体または生体提供者の腎臓であることを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項７】
薬剤がさらにシデロホアを含み、好ましくはシデロホアをＮＧＡＬとの複合化合物として含むことを特徴とする請求項６に記載の使用。
【請求項８】
哺乳類の臓器への障害の処置、軽減、改善、または予防に使用するための組成物であって、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、またはその誘導体もしくはアナログを含む組成物。
【請求項９】
組成物１００μＬあたり少なくとも１０μｇのＮＧＡＬを含むことを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
シデロホアをさらに含み、好ましくはシデロホアを前記ＮＧＡＬとの複合化合物として含むことを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１２Ａ−１２Ｉ】
【図１２Ｊ−１２Ｋ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１４Ｅ】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ】
【図１６Ｅ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１２Ａ−１２Ｉ】
【図１２Ｊ−１２Ｋ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１４Ｅ】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ】
【図１６Ｅ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【公表番号】特表２００７−５３６２６０（Ｐ２００７−５３６２６０Ａ）
【公表日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１１６２３（Ｐ２００７−５１１６２３）
【出願日】平成１７年５月６日（２００５．５．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１５７９９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０７７９３
【国際公開日】平成１７年１１月１７日（２００５．１１．１７）
【出願人】（５０５３６１６０２）ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク (4)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｔｒｕｓｔｅｅｓ ｏｆ Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
【出願人】（５００４６９２３５）チルドレンズ ホスピタル メディカル センター (40)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月６日（２００５．５．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１５７９９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０７７９３
【国際公開日】平成１７年１１月１７日（２００５．１１．１７）
【出願人】（５０５３６１６０２）ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク (4)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｔｒｕｓｔｅｅｓ ｏｆ Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
【出願人】（５００４６９２３５）チルドレンズ ホスピタル メディカル センター (40)
【Ｆターム（参考）】
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