蛍光分析方法および装置
【課題】
本発明の目的は、ＤＮＡやタンパク質等の標的物質を標識する蛍光色素へは影響を与えずに、標的物質のごく近傍の基板表面に付着したノイズ原因物質由来のバックグラウンドノイズを低減することに関する。
【解決手段】
本発明は、標的物質と相互作用できるプローブを備えた基板に対し、基材表面にエバネッセント場が発生する様に、ノイズ除去光を照射することに関する。基板表面に非特異吸着した標的物質やゴミは、ノイズ除去光のエバネッセン場により分解されるが、到達距離の短いエバネッセン場は、プローブへはほとんど影響を与えない。本発明によれば、プローブ近傍の基板表面に付着したノイズ原因物質由来のバックグラウンドノイズを低減しつつ、プローブや、プローブと相互作用している標的物質への影響を抑えることができる。
本発明の目的は、ＤＮＡやタンパク質等の標的物質を標識する蛍光色素へは影響を与えずに、標的物質のごく近傍の基板表面に付着したノイズ原因物質由来のバックグラウンドノイズを低減することに関する。
【解決手段】
本発明は、標的物質と相互作用できるプローブを備えた基板に対し、基材表面にエバネッセント場が発生する様に、ノイズ除去光を照射することに関する。基板表面に非特異吸着した標的物質やゴミは、ノイズ除去光のエバネッセン場により分解されるが、到達距離の短いエバネッセン場は、プローブへはほとんど影響を与えない。本発明によれば、プローブ近傍の基板表面に付着したノイズ原因物質由来のバックグラウンドノイズを低減しつつ、プローブや、プローブと相互作用している標的物質への影響を抑えることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光分析技術に関する。例えば、単分子または小数分子の微弱な蛍光を検出する際のＳＮ比を向上するための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡやタンパク質等の標的物質を検出する手段として、標的物質に蛍光標識を施し、レーザ等所定の励起光を照射して発生する蛍光を検出する方法が広く用いられている。例えば、核酸分析デバイスとして、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が開発されてきている。
【０００３】
現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、予め配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。
【０００４】
これに対し、近年、P.N.A.S. 2003, Vol. 100, pp. 3960-3964.（非特許文献１）にあるように、基板にＤＮＡなどを固定してその塩基配列を決定する方法が提案されている。この方法は一般にSequencing by synthesisと呼ばれ、基板表面にランダムに分析すべき試料ＤＮＡ断片を１分子ずつ捕捉し、ほぼ１塩基ずつ伸長させて、その結果を蛍光計測より検出することにより塩基配列を決定するものである。本方式では、単一ＤＮＡ分子毎に塩基配列が決定できる可能性があるため、従来技術の問題であったクローニングやＰＣＲ等での試料ＤＮＡの精製，増幅が不要にできる可能性があり、ゲノム解析や遺伝子診断の迅速化が期待できる。非特許文献１では、バックグラウンドノイズを低減しＳＮ比を向上させるため、溶液の交換による洗浄することが開示されている。
【０００５】
PNAS 2005、Vol. 102、pp. 5932-5937（非特許文献２）では、段階的伸長反応を用いたＤＮＡの配列決定法が開示されている。
【０００６】
『光応用技術・材料事典』２章１節８項「光洗浄」産業技術サービスセンター（２００６）（非特許文献３）では、他分野で行われている洗浄の方法として、液晶製造プロセスにおける基板表面に付着した有機物のエキシマＵＶ洗浄が開示されている。エキシマランプによって生じる波長１７２ｎｍ程度の光は、有機物中の多くの共有結合の結合エネルギーを上回るフォトンエネルギーを持っているため、有機物を分解・気化し、基板表面を洗浄できる。
【０００７】
また、特開２００６−１５３６３９号公報（特許文献１）では、基板上のプローブの存在しない領域のみに向けて光を照射することで、プローブに捕捉されていない蛍光色素の蛍光を消去する方法が開示されている。
【０００８】
また、ＵＳＰ７３２９４９２（特許文献２）では、基板上に酵素を固定し、エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用したＤＮＡの配列決定法が開示されている。
【０００９】
エバネッセント光については、現代光化学Ｉpp.48-49 朝倉書店 大津元一 （１９９４）（非特許文献４）に開示されている。入射側媒質の屈折率ｎ１、出射側媒質の屈折率ｎ２である界面に対し、入射角θで波長λの電磁波（光）を入射する際、θｃ＝sin-1（ｎ２／ｎ１）で与えられるθｃを臨界角と呼ぶ（ただし、sin-1はsinの逆関数）。入射角がθ≧θｃであるときに電磁波は全反射し、このとき界面の出射側近傍には界面からの距離に従い指数関数的に減衰する電磁場が生じる。この電磁場はエバネッセント場（光）と呼ばれる。エバネッセント場相対強度（Ｅ）は界面からの距離（ｚ）の関数で、界面上（ｚ＝０）の時に１で最大となり、波長，入射角，屈折率で決まる値ｄを用いて、Ｅ＝exp（−ｚ／ｄ）と表される。この値ｄを染み出し距離と呼ぶ。ｄは、屈折率ｎ１，出射側媒質の屈折率ｎ２，入射角θ，波長λを用いて、ｄ＝λ／（４π（ｎ１２・sin２θ−ｎ２２）１／２）で与えられることが知られている。
【００１０】
【特許文献１】特開２００６−１５３６３９号公報
【特許文献２】ＵＳＰ７３２９４９２
【非特許文献１】P.N.A.S. 2003, Vol. 100, pp. 3960-3964.
【非特許文献２】PNAS 2005、Vol. 102、pp. 5932-5937
【非特許文献３】『光応用技術・材料事典』２章１節８項「光洗浄」産業技術サービスセンター（２００６）
【非特許文献４】現代光化学Ｉpp.48-49 朝倉書店 大津元一 （１９９４）
【非特許文献５】J. Appl. Phys. 2008、Vol. 103、034301
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本願発明者が、単分子または小数分子の微弱蛍光検出について鋭意検討した結果、次の知見を得るに至った。
【００１２】
一般に、多くのゴミ（有機物）は微弱な蛍光を発している。単分子または少数分子の蛍光分析では、このような極微量のゴミでさえ、致命的なノイズとなる。
【００１３】
単分子または少数分子の蛍光分析では蛍光シグナルが非常に微弱であるため、ノイズ原因物質によるバックグラウンドノイズの影響が非常に大きくなり、従来の多分子の蛍光分析では問題とならなかった単分子または少数分子レベルのノイズ原因物質が致命的となる。例え、ただ１つのノイズ原因物質であっても、プローブに捕捉された標的物質の光と、プローブのごく近傍の基板表面に付着したノイズ原因物質の光と、を識別することはできない。
【００１４】
ここで、バックグラウンドノイズとは、測定対象となるプローブに捕捉された標的物質以外に由来する信号を指す。ノイズ原因物質とは、発光（蛍光）や散乱によってバックグラウンドノイズとなる光を発生する原因となる物質である。このような物質には、各種の有機物が含まれる。特に、蛍光の強いものでは、各種生体物質（チロシンやトリプトファン等のアミノ酸，ＮＡＤＨ，ＦＡＤ，コラーゲンやエラスチン等各種の蛋白質など）や、ちりや埃の類が含まれる。さらには、分析に用いる標的物質そのものも、プローブに捕捉されていなければノイズ原因物質に含まれる。これらのノイズ原因物質は、空気中や水の中を多数浮遊しており、測定デバイスの製造，サンプル調製，測定時などあらゆる工程で混入する危険性がある。各種フィルタを通過してしまうほど小さいものもあるため、これらの混入を単分子の蛍光分析に影響ないレベルに抑えることは不可能に近い。また、標的物質は分析に必要な要素であるため、これの混入を回避することは不可能である。
【００１５】
よって、バックグラウンドノイズを低減するために基板表面に存在するこれらのノイズ原因物質を除去する操作が必要となるが、従来は蛍光分析に用いることのできる技術はなかった。溶液の交換による洗浄では、プローブに捕捉されている標的物質がはがれてしまう可能性がある。単一または少数分子の解析において、これは致命的である。さらに、溶液の交換によりトータルの解析必要な試薬や時間が増大するデメリットもある。
【００１６】
エキシマＵＶ洗浄では、バックグラウンドノイズの原因物質だけでなくプローブＤＮＡまで分解してしまう危険があるため、使用できない。
【００１７】
また、特許文献１に示されているようなプローブＤＮＡの存在する領域を避けてＵＶ光を照射する方法では、プローブＤＮＡ近傍のノイズ原因物質を除去できないため、バックグラウンドノイズの低減には寄与しない。
【００１８】
本発明の目的は、ＤＮＡやタンパク質等の標的物質を標識する蛍光色素へは影響を与えずに、標的物質のごく近傍の基板表面に付着したノイズ原因物質由来のバックグラウンドノイズを低減することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、標的物質と相互作用できるプローブを備えた基板に対し、基材表面にエバネッセント場が発生する様に、ノイズ除去光を照射することに関する。基板表面に非特異吸着した標的物質やゴミは、ノイズ除去光のエバネッセン場により分解されるが、到達距離の短いエバネッセン場は、プローブへはほとんど影響を与えない。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、プローブ近傍の基板表面に付着したノイズ原因物質由来のバックグラウンドノイズを低減しつつ、プローブや、プローブと相互作用している標的物質への影響を抑えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下の実施例では、標的物質と相互作用できるプローブが配置されている基板と、前記標的物質又は前記プローブに向けて励起光を照射する励起光照射光学系と、前記励起光により生じた蛍光を検出する蛍光検出光学系と、前記基板表面に非特異吸着した前記標的物質やゴミを分解できるノイズ除去光を、前記基材表面にエバネッセント場が発生する条件で、前記基板に照射するノイズ除去用光学系を備え、前記エバネッセント場の範囲外に、前記プローブが配置されていることを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００２２】
また、前記励起光照射光学系が、前記基材表面にエバネッセント場が発生する条件で、前記基板に励起光を照射することを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００２３】
また、励起光のエバネッセント場の染み出し距離が、ノイズ除去光のエバネッセント場の染み出し距離よりも長いことを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００２４】
また、前記励起光が可視光であり、前記ノイズ除去光がＵＶ光であることを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００２５】
また、前記基板表面にスペーサが存在し、当該スペーサに前記プローブが配置されていることを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００２６】
また、前記基板表面にスペーサが存在し、当該スペーサに前記プローブが配置されていることを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００２７】
また、前記基板表面に対向する位置に支持体が存在し、当該支持体に前記プローブが配置されていることを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００２８】
また、前記ノイズ除去用光学系が、前記基板の界面にて全反射するようにノイズ除去光を照射し、前記基材表面にエバネッセント場を発生させることを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００２９】
また、前記基板が、ナノ開口を備え、前記ノイズ除去用光学系が、前記ナノ開口にノイズ除去光を照射し、前記基材表面にエバネッセント場を発生させることを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００３０】
また、前記プローブが、ＤＮＡ，ＲＮＡ，アプタマー，遺伝子，ヌクレオソーム，クロマチン，染色体，核様体，細胞膜，細胞壁，ウイルス，抗原，抗体，レクチン，ハプテン，レセプター，酵素，ペプチド，スフィンゴ糖、又はスフィンゴ脂質であることを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００３１】
また、前記標的物質が、ＤＮＡ，ＲＮＡ，アプタマー，抗原，抗体，デオキシリボヌクレオシド３リン酸、又はリボヌクレオシド３リン酸であることを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００３２】
また、前記標的物質が、蛍光標識されたヌクレオチドのモノマー又はオリゴマーであり、前記プローブが、核酸合成酵素、又は核酸分子であり、前記標的物質と前記プローブが相互作用することにより生成される核酸鎖中に取り込まれた前記ヌクレオチドの蛍光を検出することにより、核酸の配列情報を取得することを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００３３】
また、前記ノイズ除去用光学系が、励起光が照射されない領域にノイズ除去光を照射できることを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００３４】
また、プローブを配置できるスペーサを有する光透過性基板と、プローブと相互作用できる標的物質を含む溶液を、前記光透過性基板の表面に保持できる反応槽と、前記光透過性基板と直接又は間接的に接触するプリズムと、レーザ光である励起光を生じる光源と、レーザ光であるＵＶ光を生じる光源と、を備え、前記プリズムに入射した励起光が、前記光透過性基板の表面で全反射し、前記プローブを含む領域にエバネッセント場が発生し、前記プリズムに入射したＵＶ光が、前記光透過性基板の表面で全反射し、前記プローブを含まない領域にエバネッセント場が発生することを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００３５】
また、光透過性基板と、光透過性基板の基板表面と対向する位置に存在し、プローブを配置できる支持体と、プローブと相互作用できる標的物質を含む溶液を、前記光透過性基板の表面に保持できる反応槽と、前記光透過性基板と直接又は間接的に接触するプリズムと、レーザ光である励起光を生じる光源と、レーザ光であるＵＶ光を生じる光源と、を備え、前記プリズムに入射した励起光が、前記光透過性基板の表面で全反射し、前記プローブを含む領域にエバネッセント場が発生し、前記プリズムに入射したＵＶ光が、前記光透過性基板の表面で全反射し、前記プローブを含まない領域にエバネッセント場が発生することを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００３６】
また、プローブを配置できるスペーサと、ナノ開口を備えた基板と、プローブと相互作用できる標的物質を含む溶液を、前記基板の表面に保持できる反応槽と、レーザ光である励起光を生じる光源と、レーザ光であるＵＶ光を生じる光源と、を備え、前記ナノ開口に励起光が照射され、前記プローブを含む領域にエバネッセント場が発生し、前記ナノ開口にＵＶ光が照射され、前記プローブを含まない領域にエバネッセント場が発生することを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００３７】
また、光透過性基板と、光透過性基板の基板表面と対向する位置に存在し、プローブを配置できる支持体と、プローブを配置できるスペーサと、ナノ開口を備えた基板と、プローブと相互作用できる標的物質を含む溶液を、前記基板の表面に保持できる反応槽と、レーザ光である励起光を生じる光源と、レーザ光であるＵＶ光を生じる光源と、を備え、前記ナノ開口に励起光が照射され、前記プローブを含む領域にエバネッセント場が発生し、前記ナノ開口にＵＶ光が照射され、前記プローブを含まない領域にエバネッセント場が発生することを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００３８】
また、標的物質と相互作用できるプローブが配置されている基板と、前記基板の表面に溶液を保持できる第１の反応槽と、前記第１の反応槽に配置された前記基板に対し、当該基材表面にエバネッセント場が発生する条件で、ノイズ除去光照射するノイズ除去用光学系と、前記基板の表面に溶液を保持できる第１の反応槽と、プローブと相互作用できる標的物質を含む溶液を、前記光透過性基板の表面に保持できる第２の反応槽と、前記第２の反応槽に配置された前記基板に対し、励起光を照射する励起光照射光学系と、前記励起光により生じた蛍光を検出する蛍光検出光学系と、を備える蛍光分析装置を開示する。
【００３９】
以下、上記及びその他、本発明の新規な特徴と効果について、図面を参酌して説明する。図面は発明の理解のために用いるものであり、権利範囲を限定するものではない。また、各実施例は適宜組併せることができる。
【実施例１】
【００４０】
本実施例では、図１等を参照しながら、蛍光分析におけるノイズ除去方法、及びそれに利用する装置について説明する。
【００４１】
本実施例においては、デバイス基板１０１上にスペーサ１０３を介してプローブ１０４を固定し、デバイス基板１０１に接するよう反応溶液１０２を保持する。反応溶液１０２中には蛍光標識した未反応の標的物質１０６が含まれる。標的物質の一部はプローブ１０４に特異的に捕捉され、一部はデバイス基板１０１表面に非特異的に付着している。プローブ１０４に特異的に捕捉された標的物質１０５に向け、励起光１１３を照射することで蛍光を発生させる。蛍光は広く用いられている標識手法であり、既存の検出方法を広く用いることができる。例えば、適当な光学系で２次元ＣＣＤ上に結像することで検出できる。ノイズ除去光１０９を臨界角より大きな入射角１１１で、デバイス基板１０１と反応溶液１０２の界面１１０へ向けて照射し全反射させることで、界面の反応溶液側にエバネッセント場１１２を発生させる。
【００４２】
一般に、デバイス基板表面にはさまざまな理由により、標的物質以外のノイズ原因物質であるゴミ１０８が付着しており、有機物からなるゴミはしばしば蛍光や散乱によりノイズの原因となる。また、前述のように、デバイス基板１０１表面に非特異的に付着している標的物質も存在し、同じくノイズの原因となる。特異的に捕捉されている標的物質１０５のみを残し、デバイス基板に付着した物質を除去することが望まれる。より好ましくは、プローブ１０４、およびこれから反応し蛍光シグナルの発生に寄与するであろう未反応の標的物質１０６への影響を最低限に抑える必要がある。
【００４３】
本実施例においては、デバイス基板１０１表面に非特異吸着した標的物質物質１０７やゴミ１０８は、ノイズ除去光のエネルギーで分解されるため、これらの物質に由来する蛍光は大幅に低減、または除去される。一方、全反射が生じる界面１１０とプローブ１０４までの距離によって、ノイズ除去光によるエバネッセント場の光強度を大きく低減することができるため、特異的に捕捉された標的物質１０５や溶液中に浮遊する未反応の標的物質１０６はノイズ除去光の影響を受けない。本実施例によれば所望の標的物質に由来する蛍光のみを分析することができる。
【００４４】
デバイス基板１０１としては、少なくともノイズ除去光に対して実質的に透明である物質を用いることができる。この様な物としては、プラスチック，無機高分子，金属，天然高分子及びセラミックから選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。プラスチックとしては、ポリエチレン，ポリスチレン，ポリカーボネート，ポリプロピレン，ポリアミド，フェノール樹脂，エポキシ樹脂，ポリカルボジイミド樹脂，ポリ塩化ビニル，ポリフッ化ビニリデン，ポリフッ化エチレン，ポリイミド及びアクリル樹脂などが例示できる。無機高分子としては、ガラス，水晶，カーボン，シリカゲル、及びグラファイトが例示できる。 金属としては、金，白金，銀，銅，鉄，アルミニウム，磁石等の常温固体金属が例示できる。天然高分子及びセラミックとしては、ダイアモンド，サファイア，アルミナ，シリカ，炭化ケイ素，窒化ケイ素、及び炭化ホウ素等を例示できる。ただし、励起光をデバイス基板側から照射する場合には、励起光に対しても実質的に透明な物質を用いることが望ましい。また、反応溶液１０２との界面１１０での全反射を用いてエバネッセント場を発生させる場合には、ノイズ除去光に対する屈折率が反応溶液１０２よりも大きい物質である必要があり、具体的には合成石英，水晶，サファイア，各種光学ガラス等が望ましい。
【００４５】
ノイズ除去光１０９としては、各種の光を用いることができるが、ＵＶ光はノイズ原因物質を分解する能力が高く、可視光域の光はプローブや標的物質を損傷する危険性が小さい。例えば、波長２００ｎｍ以下のＵＶ光のフォトンエネルギーは比較的高く、Ｃ＝Ｃ二重結合、Ｏ＝Ｏ二重結合，Ｃ−Ｈ結合，Ｏ−Ｈ結合等の結合エネルギーを上回るため、有機物に存在する大半の共有結合を直接切断できる。波長４００ｎｍ以上の光のフォトンエネルギーはこれに比較して低く、前記の各結合の他、Ｃ−Ｃ結合，Ｃ−Ｏ結合等、比較的不安定な結合の結合エネルギーを下回るため、プローブや標的物質を損傷する危険性をより小さくできる。ただし、波長４００ｎｍ以上の光はノイズ原因物質を直接分解する作用は弱いものの、ノイズ原因物質に吸収されてノイズ原因物質を励起し、その反応性を高めることは可能なため、間接的にノイズ原因物質を分解できる。また、より望ましくは、レーザ等のエネルギー量の大きい光を用いることでより、効率的にノイズ原因物質を分解できる。
【００４６】
励起光１１３は、標的物質の蛍光体を励起可能であれば波長や照射方法を問わないが、界面１１０で全反射する条件で照射することで生じるエバネッセント場１１４を用いて蛍光体を励起することもできる。エバネッセント場を用いることで、溶液中の未反応の標的物質１０６の発する蛍光を抑えることができる。
【００４７】
未反応の標的物質１０６は、プローブ１０４と相互作用するものであれば特に制限はない。この様なものとしては、核酸，タンパク質，糖鎖，脂質及びそれらの複合体や化学反応や酵素反応などによりこれらの分子を構成することが可能な化合物が挙げられる。より具体的には、ＤＮＡ，ＲＮＡ，アプタマー，抗原，抗体や、ＤＮＡ合成に用いられるデオキシリボヌクレオシド３リン酸や、ＲＮＡ合成に用いられるリボヌクレオシド３リン酸などを蛍光体で標識したものが挙げられる。標識に用いられる蛍光体についても、蛍光を発光する原子団であれば特に制限はない。
【００４８】
プローブ１０４は、未反応の標的物質１０６と相互作用するものであれば特に制限はない。この様なものとしては、核酸，タンパク質，糖鎖，脂質及びそれらの複合体が挙げられる。より具体的には、ＤＮＡ，ＲＮＡ，アプタマー，遺伝子，ヌクレオソーム，クロマチン，染色体，核様体，細胞膜，細胞壁，ウイルス，抗原，抗体，レクチン，ハプテン，レセプター，酵素，ペプチド，スフィンゴ糖，スフィンゴ脂質などを挙げることができる。
【００４９】
例えば、未反応の標的物質１０６として前記のように蛍光標識したデオキシリボヌクレオシド３リン酸を用いた場合に望ましいプローブは、分析の対象となる一本鎖鋳型ＤＮＡ、またはこの一本鎖ＤＮＡと相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドとの複合体、またはこの一本鎖ＤＮＡと相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドとＤＮＡ合成酵素との複合体である。
【００５０】
また、プローブ１０４にドナーとなる蛍光体を持たせることで、未反応の標的物質１０６をアクセプターとしたＦＲＥＴを発生させることもできる。また、言うまでもなく、ドナーを未反応の標的物質１０６，アクセプターをプローブ１０４としても良い。
【００５１】
また、核酸分析装置で用いるプローブ１０４としては、測定対象である核酸を特異的に認識，補足できるものが望ましい。この様なものとしては、ＤＮＡや酵素が上げられる。例えば、チミンが連続する様な内部配列を持つＤＮＡを用いれば、polyＡ配列を持つＲＮＡを補足できる。核酸を補足，合成できる様な各種のＤＮＡポリメラーゼやＲＮＡポリメラーゼを用いれば、プローブ１０４上で核酸を合成することができ、合成時に取り込まれる基質を蛍光体などでラベル化，検出することで核酸の配列を分析することができる。
【００５２】
スペーサ１０３としては、デバイス基板１０１と、プローブ１０４および補足された標的物質１０５と、の距離を保つことができるものであれば、形状，材質を問わない。材質としては各種の金属，樹脂，光学ガラスや石英等を用いることができる。また、図２に示したように、基材表面以外の支持体２０３を用いてプローブ１０４を固定し、プローブ１０４および補足された標的物質１０５の距離を保ってもよい。支持体２０３としては、基材に相対する面や側面、これらの面に固定された構造体等を用いることができる。また、スペーサ１０３は、図１のように１つのプローブ１０４に１つを用いても、複数のプローブに対して１つ、または全てのプローブに対して１つの一体化したスペーサを用いても良い。
【００５３】
また、図３に示したように、スペーサ−プローブ３０４を一体としてもよい。この場合は、スペーサ−プローブ３０４が、デバイス基板１０１と補足された標的物質１０５の距離を保つ機能と、標的物質１０５と相互作用する機能の両方を担う構造であれば特に制限はない。この場合、スペーサ機能を担う部分を２本鎖とし、先端のプローブ機能を担う部分を一本鎖としたＤＮＡが、スペーサ−プローブ３０４として望ましい。また、金構造体もスペーサ−プローブ３０４として好ましい。この場合、標的物質１０５にＳＨ基を設けることで、固定が容易になる。
【００５４】
また、スペーサ１０３を、サンドイッチ構造や四角推等の適当な材質と形状を持つ金属構造体とし、ここから生じる局在型表面プラズモンによる蛍光増強を用いることにより、溶液中の未反応の標的物質１０６の発する蛍光に由来するバックグラウンドノイズを低減することができる。金属構造体は、マスクを通した蒸着・スパッタリング、あるいは蒸着・スパッタリングにより薄膜を形成した後、ドライあるいはウエットエッチングにより製造することができる。金属，絶縁物，金属を連続的に蒸着及び／又はスパッタリングで製膜した後、エッチング等で形状を所望のものに作ることもできる。また、マスクを通して、金属，絶縁物，金属を蒸着及び／又はスパッタリングで積層することでも製造できる。あるいは、金属箔を絶縁物で挟んで接着したあと平滑基板に積層物を接着し、エッチング等で成形することで所望の金属積層体を製造することも可能である。金属構造体の適切な大きさは、照射する光の波長によって異なる。すなわち、表面プラズモンの発生に適する共鳴周波数は、金属構造体表面の自由電子群と光との相互作用によるものである。励起光を可視光とすると、金属構造体の大きさは、幅・高さともに、３０から１０００ｎｍ程度が適しているが、この条件に縛られるものではない。金属としては、光がもたらす電場によって金属中により大きな反分極場（光による印加電場とは反対の位相を持つ電場）ができることが強力な局在型表面プラズモン形成につながるため、より大きな負の誘電率を持つ金属が好ましく、金，銀，白金等の貴金属が望ましい。
【００５５】
デバイス基板１０１とプローブ１０４の距離は、前述のように、より長いほうが、プローブ１０４およびプローブに捕捉された標的物質１０５に対するノイズ除去光の影響がより小さくなるため好ましい。ただし、励起光１１３として前記のエバネッセント場１１４を用いる場合は同時に励起光の強度を弱めてしまうため、両者のバランスを取ることが求められる。具体的には、デバイス基板１０１とプローブ１０４の距離は、励起光のエバネッセント場１１４の染み出し距離より短く、ノイズ除去光のエバネッセント場１１２の染み出し距離よりも長いことが望ましい。
【００５６】
前記２つの光によるエバネッセント場の染み出し距離は、前記２つの光の波長と、界面を構成する物質の２つの波長に対する屈折率、および２つの光の入射角によって決まるため、これらの条件（デバイス基板１０１の材質，スペーサ１０３によって保たれる距離，反応溶液１０２の溶媒，ノイズ除去光１０９と励起光１１３それぞれの波長と入射角）は相互の関係に基づいて決定する必要がある。ここで、波長１９３ｎｍ，５３２ｎｍの光に対する合成石英の屈折率を、それぞれ１.５６，１.４６とする。また、同様に、水の屈折率を、それぞれ１.４４，１.３３とする。この合成石英と水の界面に合成石英側から照射した場合を考える。波長１９３ｎｍのＵＶ光をノイズ除去光１０９として、臨界角より大きい７５°の入射角で照射すると、界面の溶液側に生じるノイズ除去光のエバネッセント場１１２の染み出し距離は３４.３ｎｍで、基板表面から１００ｎｍ離れた位置での強度は基板表面の５.４％程度となる。一方、波長５３２ｎｍの光を励起光１１３として、臨界角より大きい６５.７°の入射角で照射すると、界面の溶液側に生じる励起光のエバネッセント場１１４の染み出し距離は１０１９ｎｍで、基板表面から１００ｎｍ離れた位置での強度は基板表面の９１％程度となる。
【００５７】
以上のように、前記２つの光によるエバネッセント場の基板表面から１００ｎｍ離れた位置での強度は前記のように大きくことなるため、本実施例によれば、デバイス基板表面に付着したノイズ原因物質（非特異吸着した標的物質１０７やゴミ１０８）をノイズ除去光で分解しつつ、プローブ１０４やプローブに捕捉された標的物質１０５へのノイズ除去光による影響を最低限に抑え、なおかつプローブに捕捉された標的物質１０５に由来する蛍光強度を十分に得ることが可能となる。プローブ１０４やプローブに捕捉された標的物質１０５へのノイズ除去光による影響を抑えることは、標的物質１０５が、特に、単分子または少数分子（２〜数十個）の場合に重要な課題となる。これは、多分子に由来する蛍光の分析においては、ノイズ除去光の影響によってプローブ１０４やプローブに捕捉された標的物質１０５が分解されたとしても、蛍光強度が弱まるだけで済むが、単分子に由来する蛍光の分析においてこれは単に蛍光強度が弱まるだけでなく蛍光シグナルそのものが消失することを意味するためである。
【００５８】
例えば、ある光強度と蛍光分子種において、蛍光分子の消光の時定数が１秒であるとき、１秒×loge１０＝２.３秒後には平均して９０％の蛍光分子が消光し、もともとの蛍光分子数が１０個程度であれば２.３秒後には多くの場合に全ての蛍光分子が消光してしまう。
【００５９】
また、図４に示したように、反応溶液１０２を取り除いて蛍光色素を含まない媒質４０２で満たされた状態で、ノイズ除去光１０９を照射してもよい。この場合、反応溶液１０２と異なる屈折率をノイズ除去光および励起光に対して持つ物質を媒質４０２として用いることができ、前記の屈折率，波長，入射角の組み合わせの自由度を大きくすることができる。具体的には、媒質４０２として空気等気体を用いても、水等の液体を用いてもよい。例えば、空気の屈折率は水の屈折率より小さいため、媒質４０２として空気を用いるとノイズ除去光１０９に対する臨界角をより小さくできるので、より小さい入射角での照射が可能となる。また、同じ入射角を用いて媒質４０２としてより屈折率の高い物質を用いることで、染み出し距離を短くできる。
【００６０】
また、図５に示したように、未反応の標的物質１０６や反応溶液１０２を導入する前にノイズ除去光を照射してもよい。この場合にも、デバイス基板１０１の表面には、製造，運搬，プローブ１０４の固定等の工程で付着したノイズ原因物質が存在するが、ノイズ除去光によるエバネッセント場１１２によって、これを分解することができる。本実施例によれば、この場合にもプローブ１０４に損傷を与えることなく、目的を達することができる。また、プローブ固定前にノイズ除去光を照射しても、当然、ノイズ原因物質を分解，除去することにより、蛍光分析のノイズを低減することができる。未反応の標的物質１０６や反応溶液１０２を導入する前や、プローブ固定前でノイズ除去光を照射する際も、蛍光検出を行う際に用いる反応溶液１０２と異なる媒質４０２を用いることができる。
【００６１】
また、未反応の標的物質１０６や反応溶液１０２を導入する前や、プローブ固定前でノイズ除去光を照射した後に、図１や図３に示したように反応溶液１０２や溶液３０２を導入した後でのノイズ除去光照射を組み合わせてもよい。また、ノイズ除去光を照射するタイミングと、励起光を照射して蛍光を検出するタイミングは、同時並行でも、ノイズ除去光を照射した後に励起光を照射しても良い。同時並行であればノイズ除去から蛍光検出にかかる工程を削減できるため、装置の簡略化とスループット向上が実現できる。ノイズ除去光を照射した後に励起光を照射する際には、事前に多数のデバイス基板１０１に対して同時にノイズ除去光を照射しておき、蛍光検出のみ１枚ずつ行うことにより、ノイズ除去光を１枚ずつ照射する場合に比較してスループットを向上できる。
【００６２】
図６は、ノイズ除去光のエバネッセント場６１２をナノ開口６１４を用いて発生させる方法を示したものである。デバイス基板６０１の反応溶液との界面６１０と接する側の面に、ノイズ除去光６０９に対して遮光性薄膜６１３を設ける。遮光性薄膜６１３にはノイズ除去光６０９の波長より短い口径をもつナノ開口６１４を設ける。ナノ開口部分はノイズ除去光６０９に対して実質的に透明媒質６１５で満たす。透明媒質６１５は反応溶液１０２またはデバイス基板６０１と同じ材質を用いてよく、望ましくは石英，サファイア，光学ガラス等である。
【００６３】
前記ナノ開口６１４は、以下の工程で作製する。まず、デバイス基板１０１の表面にアルミニウムを２００ｎｍの厚さになるよう蒸着して遮光性薄膜６１３とする。アルミニウム以外の材質として、銀，金，クロム，炭化シリコンなどを用いて遮光性薄膜としても良い。遮光性薄膜６１３上に、Electron beam lithography技術により径５０ｎｍのナノ開口６１４を１μｍの間隔で複数形成する。前記ナノ開口は、貫通穴でも良いし、デバイス基板１０１にわずかな厚さの膜が残った状態であっても良い。ナノ開口の作製方法としては、J. Appl. Phys. 2008、Vol. 103、034301（非特許文献５）に開示されている方法を用いても良い。
【実施例２】
【００６４】
本実施例では、図７等を参照しながら、実施例１のノイズ除去方法を利用するに好適な核酸分析装置について説明する。以下、実施例１との相違点を中心に説明する。
【００６５】
本実施例では、核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、ノイズ除去用光照射手段と、を備える。
【００６６】
より具体的には、核酸分析デバイス７０５として、合成石英（シグマ光機社製、１９３ｎｍのＵＶ光に対する屈折率１.５６１、３５０〜７００ｎｍに対する屈折率１.４５〜１.４８）のデバイス基板１０１の表面に、高さ１００ｎｍの金構造体をスペーサ１０３として配置し、プローブ１０４としてビオチン−アビジン−ビオチン標識一本鎖鋳型ＤＮＡの複合体を形成し、スペーサ１０３上に固定する。プローブの複合体形成と固定方法については後述する。
【００６７】
また、本実施例では、カバープレート７０１と検出窓７０２と溶液交換用口である流路７０３と排出口７０４から構成される反応チャンバーに、前記のデバイス７０５を設置する。なお、カバープレート７０１と検出窓７０２の材質として、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用する。また、検出窓７０２の厚さは０.１７mmとする。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）７０７およびＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）７０８から発振するレーザ光７１０および７０９を、レーザ光７０９のみをλ／４板７１１によって円偏光し、ダイクロイックミラー７１２（４１０ｎｍ以下を反射）によって、前記２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ７１３によって集光し、その後、プリズム７１４を介してデバイス７０５へ臨界角以上で照射する。本実施例によれば、ＹＡＧレーザ照射により、デバイス７０５表面上にＹＡＧレーザ由来のエバネッセント場が発生し、デバイス表面に結合したプローブＤＮＡにより捕捉された標的物質の蛍光体は、ＹＡＧレーザ由来のエバネッセント場内に存在することになる。蛍光体はＹＡＧレーザ光で励起され、その増強された蛍光の一部は検出窓７０２を介して出射される。また、検出窓７０２より出射される蛍光は、対物レンズ７１５（×６０，ＮＡ１.３５，作動距離０.１５mm）により平行光束とされ、光学フィルタ７１６により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ７１７により２次元ＣＣＤカメラ７１８上に結像される。
【００６８】
また、本実施例では、ノイズ除去用光照射手段としてノイズ除去用光学系を備える。ノイズ除去用光学系は図７の７１４および７２１〜７２５から構成される。ＵＶレーザ光源であるＡｒＦエキシマレーザ７２１（波長１９３ｎｍ，出力３０ｍＷ）から発振するノイズ消去用のＵＶレーザ光７２２を、レンズ７２４によって集光し、その後、プリズム７１４を介してデバイス７０５へ入射角７５°で照射し、デバイスとデバイスに接する溶液の界面で全反射させる。なお、前記のＵＶレーザ光用の光学系を含む領域であるＮ2パージエリア７２５は、光学系からＵＶを吸収する酸素を排除するため窒素ガスを導入しているが、Ａｒガスを導入するか、真空にしてもよい。または石英等のＵＶ透過性のよい素材による光ファイバ等を用いてもよく、この場合は光路の自由度が上がるため装置レイアウトがしやすい。また、７１４および７２１〜７２５の配置としてエバネッセント場を発生可能な光学系配置一般を用いることができる。全反射条件で照射可能なレイアウトであればよい。例えば、７０７〜７１４と対向している必要は無く、並行または直行していてもよい。また、ナノ開口によるエバネッセント場を発生可能な光学系配置でもよい。
【００６９】
本実施例によれば、ＵＶレーザ照射により、デバイス７０５表面上にエバネッセント場が発生し、デバイス表面上のノイズ原因物質はＵＶレーザに由来するエバネッセント場内に存在するが、デバイス表面に結合したスペーサ上のプローブＤＮＡ、およびプローブＤＮＡにより捕捉された標的物質の蛍光体は実質的にＵＶレーザに由来するエバネッセント場の外に存在することになる。デバイス表面上のノイズ原因物質をＵＶレーザ光により分解しノイズを除去できるが、スペーサ上のプローブＤＮＡ、およびプローブＤＮＡにより捕捉された標的物質の蛍光体は保護される。よって、高いＳＮ比で蛍光を検出できる。
【００７０】
以下、図８を用いて段階的伸長反応の工程を説明する。反応工程は非特許文献２および非特許文献１に則って行う。ストレプトアビジンを加えたバッファを流路７０３より反応槽７０６に導入し、ストレプトアビジン８０１をデバイス７０５の金構造体８１０上のビオチン８１１に結合させ、ビオチン−アビジン複合体を形成させる（図８（ａ））。ビオチン修飾したターゲットである一本鎖鋳型ＤＮＡ８０２にプライマ８０３をハイブリさせ、前記鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体と大過剰のビオチン８０４を加えたバッファを注入口である流路７０３へ導入し、ビオチン−アビジン結合を介して、単分子の前記鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体を固定する（図８（ｂ））。固定反応後に、余剰な鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体およびビオチンを洗浄用バッファにて洗い流す。次に、蛍光体Ｒ６Ｇで標識された３′末端がアリル基で修飾されたｄＡＴＰ（３′−Ｏ−allyl−ｄＡＴＰ−ＰＣ−Ｒ６Ｇ）８０５およびThermo Sequenaseポリメラーゼ８０６を加えたThermo Sequenase Reactionバッファを流路７０３より反応槽７０６へ導入し、伸長反応を行う。この時、プライマ８０３の３′末端の塩基の次に位置するところの相補的な位置にある一本鎖鋳型ＤＮＡ８０２の配列上の塩基がＴであった場合、前記ｄＡＴＰ８０５はポリメラーゼ伸長反応によって前記鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に取り込まれる。また、ｄＡＴＰ８０５の３′末端はアリル基で修飾されているため、前記鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に１塩基以上取り込まれることはない。伸長反応後、未反応のｄＡＴＰ８０５とポリメラーゼ８０６を洗浄用バッファで反応槽７０６から洗い流し、ＹＡＧレーザ光源７０７より発振するレーザ光７０９をチップへ照射し、蛍光検出を行う（図８（ｄ））。この時、所定の位置における蛍光の有無によりｄＡＴＰが鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に取り込まれたかを判断する。次に、ＹＡＧレーザ光源７０８より発振するレーザ光７１０をチップへ照射し、前記複合体に取り込まれたｄＡＴＰ８０５に標識された蛍光体８０７を光切断により取り除く（図８（ｅ））。次いで、パラジウムを含んだ溶液８０８を反応槽７０６内に導入し、パラジウム触媒反応により、前記複合体に取り込まれたｄＡＴＰの３′末端のアリル基を水酸基に変える（図８（ｆ））。前記３′末端のアリル基を水酸基に変えることにより、前記鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体の伸長反応が再開可能となる。前記触媒反応後に、洗浄用バッファにて反応槽７０６を洗浄する。図８（ｃ）から前記洗浄までのプロセスを各ｄＮＴＰ、つまり、Ａ→Ｃ→Ｇ→Ｔ→Ａ→と繰返すことにより、固定された一本鎖鋳型ＤＮＡ８０２の配列を決定する。
【００７１】
本装置では、複数の金構造体８１０上での蛍光を同時計測できるため、複数の異なる鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に取り込まれたｄＮＴＰの塩基種を、つまり複数の鋳型ＤＮＡの配列を同時に決定できる。また、本実施例のデバイスを用いれば、デバイス基板８０９上に非特異的に吸着している標的物質１０７からのノイズを低減することができる。以上より、本実施例によれば、一度に数多くの標的物質を高いコントラストで検出することができる。
【００７２】
また、本実施例のノイズ除去用光学系を用いて、デバイス７０５以外の部位にノイズ除去光を照射しても良く、流路７０３や、バッファ等反応に必要な溶液を保持するタンクにおいて照射することで、バッファ等に含まれるノイズ原因物質によるノイズを除去することができる。デバイス７０５表面でノイズ除去光を照射する構成では溶液中に浮遊するノイズ原因物質を除去することはできないが、前記流路７０３やタンクにおいて照射することで前記溶液中に浮遊するノイズ原因物質を除去することが可能である。また、この際、ノイズ原因物質に分解されると後に続く反応または蛍光検出に影響を及ぼす物質（例えば未反応の標的物質１０６や鋳型ＤＮＡ等）を含まない溶液のみにノイズ除去光をあててよく、これによって蛍光検出への影響を避けることができる。
【実施例３】
【００７３】
本実施例では、図９を参照しながら、核酸分析装置の装置構成の好ましい構成の別の一例について説明する。以下、実施例１及び２との相違点を中心に説明する。
【００７４】
本実施例は、ノイズ除去装置（図９（ａ））と、蛍光検出装置（図９（ｂ））からなる。まず、図９（ａ）を参照して、本実施例を構成するノイズ除去装置について説明する。
【００７５】
標的物質を含む溶液を低屈折率層側に保持できるチャンバーであるノイズ除去チャンバーに前記デバイス７０５を設置する。ノイズ除去チャンバーは、カバープレート９０１と溶液交換用口である注入口９０３と排出口９０４から構成される。図９（ａ）に示したノイズ除去装置の構成のうち、ノイズ除去用光学系の７２１〜７２５は図７と実質的に同等であり、ＵＶレーザ光７２２は、プリズム９１４を介してデバイス７０５へ入射角７５°で照射し、デバイスとデバイスに接する溶液の界面で全反射し、デバイス表面にノイズ除去光のエバネッセント場１１２を発生させる。また、図９（ｂ）に示した蛍光検出装置は、ノイズ除去用光学系を除いた図７の蛍光分析装置の構成と同等である。
【００７６】
また、本実施例ではチャンバーはノイズ除去装置と蛍光検出装置のそれぞれに含まれているが、チャンバーとデバイス７０５とを一体とし、図９（ａ）のノイズ除去チャンバーと図９（ｂ）の反応チャンバーを共通のものとしてもよい。
【００７７】
本実施例では、ノイズ除去用光学系を蛍光検出装置と分離することで、ノイズ除去用光照射と蛍光検出の工程を並行して行うことが可能となる。実施例２において複数のデバイス７０５を処理する際には、「ノイズ除去用光照射→蛍光検出」の工程をデバイスの個数だけ繰返す必要があるが、一般に蛍光検出にかかる時間のほうが長い。本実施例ではノイズ除去用光照射を予め済ませておくことで、連続して蛍光検出を行うことが可能となり、解析全体のスループットが向上する。また、ノイズ除去装置に複数デバイスを保持するよう構成することで、事前に多数のデバイス基板１０１に対して同時にノイズ除去光を照射しておき、蛍光検出のみ１枚ずつ行うことで、ノイズ除去光を１枚ずつ照射する場合に比較してスループットを向上できる。また、反応槽９０６中の媒質を反応槽７０６中の媒質と異なる屈折率を持つ、異なる物質にすることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】核酸分析デバイスの概要。
【図２】核酸分析デバイスの変形例１。
【図３】核酸分析デバイスの変形例２。
【図４】核酸分析方法の概要。
【図５】核酸分析方法デバイスの変形例。
【図６】核酸分析デバイスの変形例３。
【図７】核酸分析装置の概要。
【図８】段階的伸長反応の概要。
【図９】（ａ）ノイズ除去装置の概要、（ｂ）蛍光検出装置の概要。
【符号の説明】
【００７９】
１０１，６０１，８０９ デバイス基板
１０２，６０２ 反応溶液
１０３，６０３ スペーサ
１０４，６０４ プローブ
１０５ 捕捉された標的物質
１０６ 未反応の標的物質
１０７ 非特異吸着した標的物質
１０８ ゴミ
１０９，６０９ ノイズ除去光
１１０ デバイスと反応溶液の界面
１１１ ノイズ除去光の入射角
１１２，６１２ ノイズ除去光のエバネッセント場
１１３ 励起光
１１４ 励起光のエバネッセント場
２０３ 支持体
３０４ スペーサ−プローブ
４０２ 媒質
６０５ プローブに捕捉された標的物質
６０６ 反応溶液中に浮遊する標的物質
６０７ デバイス基板表面に非特異吸着した標的物質
６０８ ゴミ等の標的物質以外のノイズ原因物質
６１３ 非導光性媒質
６１４ ナノ開口
６１５ 導光性媒質
７０１，９０１ カバープレート
７０２ 検出窓
７０３，９０３ 注入口
７０４，９０４ 排出口
７０５ デバイス
７０６，９０６ 反応槽
７０７，７０８ ＹＡＧレーザ光源
７０９，７１０ レーザ光
７１１ λ／４板
７１２ ダイクロイックミラー
７１３，７２４ レンズ
７１４ プリズム
７１５ 対物レンズ
７１６ 光学フィルタ
７１７ 結像レンズ
７１８ ２次元ＣＣＤカメラ
７２１ ＵＶレーザ光源
７２２ ＵＶレーザ光
７２５ Ｎ2パージエリア
８０１ ストレプトアビジン
８０２ 一本鎖鋳型ＤＮＡ
８０３ プライマ
８０４，８１１ ビオチン
８０５ ｄＡＴＰ（３′−Ｏ−allyl−ｄＡＴＰ−ＰＣ−Ｒ６Ｇ）
８０６ Thermo Sequenaseポリメラーゼ
８０７ 蛍光体
８０８ パラジウムを含んだ溶液
８１０ 金構造体
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光分析技術に関する。例えば、単分子または小数分子の微弱な蛍光を検出する際のＳＮ比を向上するための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡやタンパク質等の標的物質を検出する手段として、標的物質に蛍光標識を施し、レーザ等所定の励起光を照射して発生する蛍光を検出する方法が広く用いられている。例えば、核酸分析デバイスとして、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が開発されてきている。
【０００３】
現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、予め配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。
【０００４】
これに対し、近年、P.N.A.S. 2003, Vol. 100, pp. 3960-3964.（非特許文献１）にあるように、基板にＤＮＡなどを固定してその塩基配列を決定する方法が提案されている。この方法は一般にSequencing by synthesisと呼ばれ、基板表面にランダムに分析すべき試料ＤＮＡ断片を１分子ずつ捕捉し、ほぼ１塩基ずつ伸長させて、その結果を蛍光計測より検出することにより塩基配列を決定するものである。本方式では、単一ＤＮＡ分子毎に塩基配列が決定できる可能性があるため、従来技術の問題であったクローニングやＰＣＲ等での試料ＤＮＡの精製，増幅が不要にできる可能性があり、ゲノム解析や遺伝子診断の迅速化が期待できる。非特許文献１では、バックグラウンドノイズを低減しＳＮ比を向上させるため、溶液の交換による洗浄することが開示されている。
【０００５】
PNAS 2005、Vol. 102、pp. 5932-5937（非特許文献２）では、段階的伸長反応を用いたＤＮＡの配列決定法が開示されている。
【０００６】
『光応用技術・材料事典』２章１節８項「光洗浄」産業技術サービスセンター（２００６）（非特許文献３）では、他分野で行われている洗浄の方法として、液晶製造プロセスにおける基板表面に付着した有機物のエキシマＵＶ洗浄が開示されている。エキシマランプによって生じる波長１７２ｎｍ程度の光は、有機物中の多くの共有結合の結合エネルギーを上回るフォトンエネルギーを持っているため、有機物を分解・気化し、基板表面を洗浄できる。
【０００７】
また、特開２００６−１５３６３９号公報（特許文献１）では、基板上のプローブの存在しない領域のみに向けて光を照射することで、プローブに捕捉されていない蛍光色素の蛍光を消去する方法が開示されている。
【０００８】
また、ＵＳＰ７３２９４９２（特許文献２）では、基板上に酵素を固定し、エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用したＤＮＡの配列決定法が開示されている。
【０００９】
エバネッセント光については、現代光化学Ｉpp.48-49 朝倉書店 大津元一 （１９９４）（非特許文献４）に開示されている。入射側媒質の屈折率ｎ１、出射側媒質の屈折率ｎ２である界面に対し、入射角θで波長λの電磁波（光）を入射する際、θｃ＝sin-1（ｎ２／ｎ１）で与えられるθｃを臨界角と呼ぶ（ただし、sin-1はsinの逆関数）。入射角がθ≧θｃであるときに電磁波は全反射し、このとき界面の出射側近傍には界面からの距離に従い指数関数的に減衰する電磁場が生じる。この電磁場はエバネッセント場（光）と呼ばれる。エバネッセント場相対強度（Ｅ）は界面からの距離（ｚ）の関数で、界面上（ｚ＝０）の時に１で最大となり、波長，入射角，屈折率で決まる値ｄを用いて、Ｅ＝exp（−ｚ／ｄ）と表される。この値ｄを染み出し距離と呼ぶ。ｄは、屈折率ｎ１，出射側媒質の屈折率ｎ２，入射角θ，波長λを用いて、ｄ＝λ／（４π（ｎ１２・sin２θ−ｎ２２）１／２）で与えられることが知られている。
【００１０】
【特許文献１】特開２００６−１５３６３９号公報
【特許文献２】ＵＳＰ７３２９４９２
【非特許文献１】P.N.A.S. 2003, Vol. 100, pp. 3960-3964.
【非特許文献２】PNAS 2005、Vol. 102、pp. 5932-5937
【非特許文献３】『光応用技術・材料事典』２章１節８項「光洗浄」産業技術サービスセンター（２００６）
【非特許文献４】現代光化学Ｉpp.48-49 朝倉書店 大津元一 （１９９４）
【非特許文献５】J. Appl. Phys. 2008、Vol. 103、034301
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本願発明者が、単分子または小数分子の微弱蛍光検出について鋭意検討した結果、次の知見を得るに至った。
【００１２】
一般に、多くのゴミ（有機物）は微弱な蛍光を発している。単分子または少数分子の蛍光分析では、このような極微量のゴミでさえ、致命的なノイズとなる。
【００１３】
単分子または少数分子の蛍光分析では蛍光シグナルが非常に微弱であるため、ノイズ原因物質によるバックグラウンドノイズの影響が非常に大きくなり、従来の多分子の蛍光分析では問題とならなかった単分子または少数分子レベルのノイズ原因物質が致命的となる。例え、ただ１つのノイズ原因物質であっても、プローブに捕捉された標的物質の光と、プローブのごく近傍の基板表面に付着したノイズ原因物質の光と、を識別することはできない。
【００１４】
ここで、バックグラウンドノイズとは、測定対象となるプローブに捕捉された標的物質以外に由来する信号を指す。ノイズ原因物質とは、発光（蛍光）や散乱によってバックグラウンドノイズとなる光を発生する原因となる物質である。このような物質には、各種の有機物が含まれる。特に、蛍光の強いものでは、各種生体物質（チロシンやトリプトファン等のアミノ酸，ＮＡＤＨ，ＦＡＤ，コラーゲンやエラスチン等各種の蛋白質など）や、ちりや埃の類が含まれる。さらには、分析に用いる標的物質そのものも、プローブに捕捉されていなければノイズ原因物質に含まれる。これらのノイズ原因物質は、空気中や水の中を多数浮遊しており、測定デバイスの製造，サンプル調製，測定時などあらゆる工程で混入する危険性がある。各種フィルタを通過してしまうほど小さいものもあるため、これらの混入を単分子の蛍光分析に影響ないレベルに抑えることは不可能に近い。また、標的物質は分析に必要な要素であるため、これの混入を回避することは不可能である。
【００１５】
よって、バックグラウンドノイズを低減するために基板表面に存在するこれらのノイズ原因物質を除去する操作が必要となるが、従来は蛍光分析に用いることのできる技術はなかった。溶液の交換による洗浄では、プローブに捕捉されている標的物質がはがれてしまう可能性がある。単一または少数分子の解析において、これは致命的である。さらに、溶液の交換によりトータルの解析必要な試薬や時間が増大するデメリットもある。
【００１６】
エキシマＵＶ洗浄では、バックグラウンドノイズの原因物質だけでなくプローブＤＮＡまで分解してしまう危険があるため、使用できない。
【００１７】
また、特許文献１に示されているようなプローブＤＮＡの存在する領域を避けてＵＶ光を照射する方法では、プローブＤＮＡ近傍のノイズ原因物質を除去できないため、バックグラウンドノイズの低減には寄与しない。
【００１８】
本発明の目的は、ＤＮＡやタンパク質等の標的物質を標識する蛍光色素へは影響を与えずに、標的物質のごく近傍の基板表面に付着したノイズ原因物質由来のバックグラウンドノイズを低減することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、標的物質と相互作用できるプローブを備えた基板に対し、基材表面にエバネッセント場が発生する様に、ノイズ除去光を照射することに関する。基板表面に非特異吸着した標的物質やゴミは、ノイズ除去光のエバネッセン場により分解されるが、到達距離の短いエバネッセン場は、プローブへはほとんど影響を与えない。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、プローブ近傍の基板表面に付着したノイズ原因物質由来のバックグラウンドノイズを低減しつつ、プローブや、プローブと相互作用している標的物質への影響を抑えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下の実施例では、標的物質と相互作用できるプローブが配置されている基板と、前記標的物質又は前記プローブに向けて励起光を照射する励起光照射光学系と、前記励起光により生じた蛍光を検出する蛍光検出光学系と、前記基板表面に非特異吸着した前記標的物質やゴミを分解できるノイズ除去光を、前記基材表面にエバネッセント場が発生する条件で、前記基板に照射するノイズ除去用光学系を備え、前記エバネッセント場の範囲外に、前記プローブが配置されていることを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００２２】
また、前記励起光照射光学系が、前記基材表面にエバネッセント場が発生する条件で、前記基板に励起光を照射することを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００２３】
また、励起光のエバネッセント場の染み出し距離が、ノイズ除去光のエバネッセント場の染み出し距離よりも長いことを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００２４】
また、前記励起光が可視光であり、前記ノイズ除去光がＵＶ光であることを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００２５】
また、前記基板表面にスペーサが存在し、当該スペーサに前記プローブが配置されていることを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００２６】
また、前記基板表面にスペーサが存在し、当該スペーサに前記プローブが配置されていることを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００２７】
また、前記基板表面に対向する位置に支持体が存在し、当該支持体に前記プローブが配置されていることを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００２８】
また、前記ノイズ除去用光学系が、前記基板の界面にて全反射するようにノイズ除去光を照射し、前記基材表面にエバネッセント場を発生させることを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００２９】
また、前記基板が、ナノ開口を備え、前記ノイズ除去用光学系が、前記ナノ開口にノイズ除去光を照射し、前記基材表面にエバネッセント場を発生させることを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００３０】
また、前記プローブが、ＤＮＡ，ＲＮＡ，アプタマー，遺伝子，ヌクレオソーム，クロマチン，染色体，核様体，細胞膜，細胞壁，ウイルス，抗原，抗体，レクチン，ハプテン，レセプター，酵素，ペプチド，スフィンゴ糖、又はスフィンゴ脂質であることを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００３１】
また、前記標的物質が、ＤＮＡ，ＲＮＡ，アプタマー，抗原，抗体，デオキシリボヌクレオシド３リン酸、又はリボヌクレオシド３リン酸であることを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００３２】
また、前記標的物質が、蛍光標識されたヌクレオチドのモノマー又はオリゴマーであり、前記プローブが、核酸合成酵素、又は核酸分子であり、前記標的物質と前記プローブが相互作用することにより生成される核酸鎖中に取り込まれた前記ヌクレオチドの蛍光を検出することにより、核酸の配列情報を取得することを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００３３】
また、前記ノイズ除去用光学系が、励起光が照射されない領域にノイズ除去光を照射できることを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００３４】
また、プローブを配置できるスペーサを有する光透過性基板と、プローブと相互作用できる標的物質を含む溶液を、前記光透過性基板の表面に保持できる反応槽と、前記光透過性基板と直接又は間接的に接触するプリズムと、レーザ光である励起光を生じる光源と、レーザ光であるＵＶ光を生じる光源と、を備え、前記プリズムに入射した励起光が、前記光透過性基板の表面で全反射し、前記プローブを含む領域にエバネッセント場が発生し、前記プリズムに入射したＵＶ光が、前記光透過性基板の表面で全反射し、前記プローブを含まない領域にエバネッセント場が発生することを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００３５】
また、光透過性基板と、光透過性基板の基板表面と対向する位置に存在し、プローブを配置できる支持体と、プローブと相互作用できる標的物質を含む溶液を、前記光透過性基板の表面に保持できる反応槽と、前記光透過性基板と直接又は間接的に接触するプリズムと、レーザ光である励起光を生じる光源と、レーザ光であるＵＶ光を生じる光源と、を備え、前記プリズムに入射した励起光が、前記光透過性基板の表面で全反射し、前記プローブを含む領域にエバネッセント場が発生し、前記プリズムに入射したＵＶ光が、前記光透過性基板の表面で全反射し、前記プローブを含まない領域にエバネッセント場が発生することを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００３６】
また、プローブを配置できるスペーサと、ナノ開口を備えた基板と、プローブと相互作用できる標的物質を含む溶液を、前記基板の表面に保持できる反応槽と、レーザ光である励起光を生じる光源と、レーザ光であるＵＶ光を生じる光源と、を備え、前記ナノ開口に励起光が照射され、前記プローブを含む領域にエバネッセント場が発生し、前記ナノ開口にＵＶ光が照射され、前記プローブを含まない領域にエバネッセント場が発生することを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００３７】
また、光透過性基板と、光透過性基板の基板表面と対向する位置に存在し、プローブを配置できる支持体と、プローブを配置できるスペーサと、ナノ開口を備えた基板と、プローブと相互作用できる標的物質を含む溶液を、前記基板の表面に保持できる反応槽と、レーザ光である励起光を生じる光源と、レーザ光であるＵＶ光を生じる光源と、を備え、前記ナノ開口に励起光が照射され、前記プローブを含む領域にエバネッセント場が発生し、前記ナノ開口にＵＶ光が照射され、前記プローブを含まない領域にエバネッセント場が発生することを特徴とする蛍光分析装置を開示する。
【００３８】
また、標的物質と相互作用できるプローブが配置されている基板と、前記基板の表面に溶液を保持できる第１の反応槽と、前記第１の反応槽に配置された前記基板に対し、当該基材表面にエバネッセント場が発生する条件で、ノイズ除去光照射するノイズ除去用光学系と、前記基板の表面に溶液を保持できる第１の反応槽と、プローブと相互作用できる標的物質を含む溶液を、前記光透過性基板の表面に保持できる第２の反応槽と、前記第２の反応槽に配置された前記基板に対し、励起光を照射する励起光照射光学系と、前記励起光により生じた蛍光を検出する蛍光検出光学系と、を備える蛍光分析装置を開示する。
【００３９】
以下、上記及びその他、本発明の新規な特徴と効果について、図面を参酌して説明する。図面は発明の理解のために用いるものであり、権利範囲を限定するものではない。また、各実施例は適宜組併せることができる。
【実施例１】
【００４０】
本実施例では、図１等を参照しながら、蛍光分析におけるノイズ除去方法、及びそれに利用する装置について説明する。
【００４１】
本実施例においては、デバイス基板１０１上にスペーサ１０３を介してプローブ１０４を固定し、デバイス基板１０１に接するよう反応溶液１０２を保持する。反応溶液１０２中には蛍光標識した未反応の標的物質１０６が含まれる。標的物質の一部はプローブ１０４に特異的に捕捉され、一部はデバイス基板１０１表面に非特異的に付着している。プローブ１０４に特異的に捕捉された標的物質１０５に向け、励起光１１３を照射することで蛍光を発生させる。蛍光は広く用いられている標識手法であり、既存の検出方法を広く用いることができる。例えば、適当な光学系で２次元ＣＣＤ上に結像することで検出できる。ノイズ除去光１０９を臨界角より大きな入射角１１１で、デバイス基板１０１と反応溶液１０２の界面１１０へ向けて照射し全反射させることで、界面の反応溶液側にエバネッセント場１１２を発生させる。
【００４２】
一般に、デバイス基板表面にはさまざまな理由により、標的物質以外のノイズ原因物質であるゴミ１０８が付着しており、有機物からなるゴミはしばしば蛍光や散乱によりノイズの原因となる。また、前述のように、デバイス基板１０１表面に非特異的に付着している標的物質も存在し、同じくノイズの原因となる。特異的に捕捉されている標的物質１０５のみを残し、デバイス基板に付着した物質を除去することが望まれる。より好ましくは、プローブ１０４、およびこれから反応し蛍光シグナルの発生に寄与するであろう未反応の標的物質１０６への影響を最低限に抑える必要がある。
【００４３】
本実施例においては、デバイス基板１０１表面に非特異吸着した標的物質物質１０７やゴミ１０８は、ノイズ除去光のエネルギーで分解されるため、これらの物質に由来する蛍光は大幅に低減、または除去される。一方、全反射が生じる界面１１０とプローブ１０４までの距離によって、ノイズ除去光によるエバネッセント場の光強度を大きく低減することができるため、特異的に捕捉された標的物質１０５や溶液中に浮遊する未反応の標的物質１０６はノイズ除去光の影響を受けない。本実施例によれば所望の標的物質に由来する蛍光のみを分析することができる。
【００４４】
デバイス基板１０１としては、少なくともノイズ除去光に対して実質的に透明である物質を用いることができる。この様な物としては、プラスチック，無機高分子，金属，天然高分子及びセラミックから選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。プラスチックとしては、ポリエチレン，ポリスチレン，ポリカーボネート，ポリプロピレン，ポリアミド，フェノール樹脂，エポキシ樹脂，ポリカルボジイミド樹脂，ポリ塩化ビニル，ポリフッ化ビニリデン，ポリフッ化エチレン，ポリイミド及びアクリル樹脂などが例示できる。無機高分子としては、ガラス，水晶，カーボン，シリカゲル、及びグラファイトが例示できる。 金属としては、金，白金，銀，銅，鉄，アルミニウム，磁石等の常温固体金属が例示できる。天然高分子及びセラミックとしては、ダイアモンド，サファイア，アルミナ，シリカ，炭化ケイ素，窒化ケイ素、及び炭化ホウ素等を例示できる。ただし、励起光をデバイス基板側から照射する場合には、励起光に対しても実質的に透明な物質を用いることが望ましい。また、反応溶液１０２との界面１１０での全反射を用いてエバネッセント場を発生させる場合には、ノイズ除去光に対する屈折率が反応溶液１０２よりも大きい物質である必要があり、具体的には合成石英，水晶，サファイア，各種光学ガラス等が望ましい。
【００４５】
ノイズ除去光１０９としては、各種の光を用いることができるが、ＵＶ光はノイズ原因物質を分解する能力が高く、可視光域の光はプローブや標的物質を損傷する危険性が小さい。例えば、波長２００ｎｍ以下のＵＶ光のフォトンエネルギーは比較的高く、Ｃ＝Ｃ二重結合、Ｏ＝Ｏ二重結合，Ｃ−Ｈ結合，Ｏ−Ｈ結合等の結合エネルギーを上回るため、有機物に存在する大半の共有結合を直接切断できる。波長４００ｎｍ以上の光のフォトンエネルギーはこれに比較して低く、前記の各結合の他、Ｃ−Ｃ結合，Ｃ−Ｏ結合等、比較的不安定な結合の結合エネルギーを下回るため、プローブや標的物質を損傷する危険性をより小さくできる。ただし、波長４００ｎｍ以上の光はノイズ原因物質を直接分解する作用は弱いものの、ノイズ原因物質に吸収されてノイズ原因物質を励起し、その反応性を高めることは可能なため、間接的にノイズ原因物質を分解できる。また、より望ましくは、レーザ等のエネルギー量の大きい光を用いることでより、効率的にノイズ原因物質を分解できる。
【００４６】
励起光１１３は、標的物質の蛍光体を励起可能であれば波長や照射方法を問わないが、界面１１０で全反射する条件で照射することで生じるエバネッセント場１１４を用いて蛍光体を励起することもできる。エバネッセント場を用いることで、溶液中の未反応の標的物質１０６の発する蛍光を抑えることができる。
【００４７】
未反応の標的物質１０６は、プローブ１０４と相互作用するものであれば特に制限はない。この様なものとしては、核酸，タンパク質，糖鎖，脂質及びそれらの複合体や化学反応や酵素反応などによりこれらの分子を構成することが可能な化合物が挙げられる。より具体的には、ＤＮＡ，ＲＮＡ，アプタマー，抗原，抗体や、ＤＮＡ合成に用いられるデオキシリボヌクレオシド３リン酸や、ＲＮＡ合成に用いられるリボヌクレオシド３リン酸などを蛍光体で標識したものが挙げられる。標識に用いられる蛍光体についても、蛍光を発光する原子団であれば特に制限はない。
【００４８】
プローブ１０４は、未反応の標的物質１０６と相互作用するものであれば特に制限はない。この様なものとしては、核酸，タンパク質，糖鎖，脂質及びそれらの複合体が挙げられる。より具体的には、ＤＮＡ，ＲＮＡ，アプタマー，遺伝子，ヌクレオソーム，クロマチン，染色体，核様体，細胞膜，細胞壁，ウイルス，抗原，抗体，レクチン，ハプテン，レセプター，酵素，ペプチド，スフィンゴ糖，スフィンゴ脂質などを挙げることができる。
【００４９】
例えば、未反応の標的物質１０６として前記のように蛍光標識したデオキシリボヌクレオシド３リン酸を用いた場合に望ましいプローブは、分析の対象となる一本鎖鋳型ＤＮＡ、またはこの一本鎖ＤＮＡと相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドとの複合体、またはこの一本鎖ＤＮＡと相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドとＤＮＡ合成酵素との複合体である。
【００５０】
また、プローブ１０４にドナーとなる蛍光体を持たせることで、未反応の標的物質１０６をアクセプターとしたＦＲＥＴを発生させることもできる。また、言うまでもなく、ドナーを未反応の標的物質１０６，アクセプターをプローブ１０４としても良い。
【００５１】
また、核酸分析装置で用いるプローブ１０４としては、測定対象である核酸を特異的に認識，補足できるものが望ましい。この様なものとしては、ＤＮＡや酵素が上げられる。例えば、チミンが連続する様な内部配列を持つＤＮＡを用いれば、polyＡ配列を持つＲＮＡを補足できる。核酸を補足，合成できる様な各種のＤＮＡポリメラーゼやＲＮＡポリメラーゼを用いれば、プローブ１０４上で核酸を合成することができ、合成時に取り込まれる基質を蛍光体などでラベル化，検出することで核酸の配列を分析することができる。
【００５２】
スペーサ１０３としては、デバイス基板１０１と、プローブ１０４および補足された標的物質１０５と、の距離を保つことができるものであれば、形状，材質を問わない。材質としては各種の金属，樹脂，光学ガラスや石英等を用いることができる。また、図２に示したように、基材表面以外の支持体２０３を用いてプローブ１０４を固定し、プローブ１０４および補足された標的物質１０５の距離を保ってもよい。支持体２０３としては、基材に相対する面や側面、これらの面に固定された構造体等を用いることができる。また、スペーサ１０３は、図１のように１つのプローブ１０４に１つを用いても、複数のプローブに対して１つ、または全てのプローブに対して１つの一体化したスペーサを用いても良い。
【００５３】
また、図３に示したように、スペーサ−プローブ３０４を一体としてもよい。この場合は、スペーサ−プローブ３０４が、デバイス基板１０１と補足された標的物質１０５の距離を保つ機能と、標的物質１０５と相互作用する機能の両方を担う構造であれば特に制限はない。この場合、スペーサ機能を担う部分を２本鎖とし、先端のプローブ機能を担う部分を一本鎖としたＤＮＡが、スペーサ−プローブ３０４として望ましい。また、金構造体もスペーサ−プローブ３０４として好ましい。この場合、標的物質１０５にＳＨ基を設けることで、固定が容易になる。
【００５４】
また、スペーサ１０３を、サンドイッチ構造や四角推等の適当な材質と形状を持つ金属構造体とし、ここから生じる局在型表面プラズモンによる蛍光増強を用いることにより、溶液中の未反応の標的物質１０６の発する蛍光に由来するバックグラウンドノイズを低減することができる。金属構造体は、マスクを通した蒸着・スパッタリング、あるいは蒸着・スパッタリングにより薄膜を形成した後、ドライあるいはウエットエッチングにより製造することができる。金属，絶縁物，金属を連続的に蒸着及び／又はスパッタリングで製膜した後、エッチング等で形状を所望のものに作ることもできる。また、マスクを通して、金属，絶縁物，金属を蒸着及び／又はスパッタリングで積層することでも製造できる。あるいは、金属箔を絶縁物で挟んで接着したあと平滑基板に積層物を接着し、エッチング等で成形することで所望の金属積層体を製造することも可能である。金属構造体の適切な大きさは、照射する光の波長によって異なる。すなわち、表面プラズモンの発生に適する共鳴周波数は、金属構造体表面の自由電子群と光との相互作用によるものである。励起光を可視光とすると、金属構造体の大きさは、幅・高さともに、３０から１０００ｎｍ程度が適しているが、この条件に縛られるものではない。金属としては、光がもたらす電場によって金属中により大きな反分極場（光による印加電場とは反対の位相を持つ電場）ができることが強力な局在型表面プラズモン形成につながるため、より大きな負の誘電率を持つ金属が好ましく、金，銀，白金等の貴金属が望ましい。
【００５５】
デバイス基板１０１とプローブ１０４の距離は、前述のように、より長いほうが、プローブ１０４およびプローブに捕捉された標的物質１０５に対するノイズ除去光の影響がより小さくなるため好ましい。ただし、励起光１１３として前記のエバネッセント場１１４を用いる場合は同時に励起光の強度を弱めてしまうため、両者のバランスを取ることが求められる。具体的には、デバイス基板１０１とプローブ１０４の距離は、励起光のエバネッセント場１１４の染み出し距離より短く、ノイズ除去光のエバネッセント場１１２の染み出し距離よりも長いことが望ましい。
【００５６】
前記２つの光によるエバネッセント場の染み出し距離は、前記２つの光の波長と、界面を構成する物質の２つの波長に対する屈折率、および２つの光の入射角によって決まるため、これらの条件（デバイス基板１０１の材質，スペーサ１０３によって保たれる距離，反応溶液１０２の溶媒，ノイズ除去光１０９と励起光１１３それぞれの波長と入射角）は相互の関係に基づいて決定する必要がある。ここで、波長１９３ｎｍ，５３２ｎｍの光に対する合成石英の屈折率を、それぞれ１.５６，１.４６とする。また、同様に、水の屈折率を、それぞれ１.４４，１.３３とする。この合成石英と水の界面に合成石英側から照射した場合を考える。波長１９３ｎｍのＵＶ光をノイズ除去光１０９として、臨界角より大きい７５°の入射角で照射すると、界面の溶液側に生じるノイズ除去光のエバネッセント場１１２の染み出し距離は３４.３ｎｍで、基板表面から１００ｎｍ離れた位置での強度は基板表面の５.４％程度となる。一方、波長５３２ｎｍの光を励起光１１３として、臨界角より大きい６５.７°の入射角で照射すると、界面の溶液側に生じる励起光のエバネッセント場１１４の染み出し距離は１０１９ｎｍで、基板表面から１００ｎｍ離れた位置での強度は基板表面の９１％程度となる。
【００５７】
以上のように、前記２つの光によるエバネッセント場の基板表面から１００ｎｍ離れた位置での強度は前記のように大きくことなるため、本実施例によれば、デバイス基板表面に付着したノイズ原因物質（非特異吸着した標的物質１０７やゴミ１０８）をノイズ除去光で分解しつつ、プローブ１０４やプローブに捕捉された標的物質１０５へのノイズ除去光による影響を最低限に抑え、なおかつプローブに捕捉された標的物質１０５に由来する蛍光強度を十分に得ることが可能となる。プローブ１０４やプローブに捕捉された標的物質１０５へのノイズ除去光による影響を抑えることは、標的物質１０５が、特に、単分子または少数分子（２〜数十個）の場合に重要な課題となる。これは、多分子に由来する蛍光の分析においては、ノイズ除去光の影響によってプローブ１０４やプローブに捕捉された標的物質１０５が分解されたとしても、蛍光強度が弱まるだけで済むが、単分子に由来する蛍光の分析においてこれは単に蛍光強度が弱まるだけでなく蛍光シグナルそのものが消失することを意味するためである。
【００５８】
例えば、ある光強度と蛍光分子種において、蛍光分子の消光の時定数が１秒であるとき、１秒×loge１０＝２.３秒後には平均して９０％の蛍光分子が消光し、もともとの蛍光分子数が１０個程度であれば２.３秒後には多くの場合に全ての蛍光分子が消光してしまう。
【００５９】
また、図４に示したように、反応溶液１０２を取り除いて蛍光色素を含まない媒質４０２で満たされた状態で、ノイズ除去光１０９を照射してもよい。この場合、反応溶液１０２と異なる屈折率をノイズ除去光および励起光に対して持つ物質を媒質４０２として用いることができ、前記の屈折率，波長，入射角の組み合わせの自由度を大きくすることができる。具体的には、媒質４０２として空気等気体を用いても、水等の液体を用いてもよい。例えば、空気の屈折率は水の屈折率より小さいため、媒質４０２として空気を用いるとノイズ除去光１０９に対する臨界角をより小さくできるので、より小さい入射角での照射が可能となる。また、同じ入射角を用いて媒質４０２としてより屈折率の高い物質を用いることで、染み出し距離を短くできる。
【００６０】
また、図５に示したように、未反応の標的物質１０６や反応溶液１０２を導入する前にノイズ除去光を照射してもよい。この場合にも、デバイス基板１０１の表面には、製造，運搬，プローブ１０４の固定等の工程で付着したノイズ原因物質が存在するが、ノイズ除去光によるエバネッセント場１１２によって、これを分解することができる。本実施例によれば、この場合にもプローブ１０４に損傷を与えることなく、目的を達することができる。また、プローブ固定前にノイズ除去光を照射しても、当然、ノイズ原因物質を分解，除去することにより、蛍光分析のノイズを低減することができる。未反応の標的物質１０６や反応溶液１０２を導入する前や、プローブ固定前でノイズ除去光を照射する際も、蛍光検出を行う際に用いる反応溶液１０２と異なる媒質４０２を用いることができる。
【００６１】
また、未反応の標的物質１０６や反応溶液１０２を導入する前や、プローブ固定前でノイズ除去光を照射した後に、図１や図３に示したように反応溶液１０２や溶液３０２を導入した後でのノイズ除去光照射を組み合わせてもよい。また、ノイズ除去光を照射するタイミングと、励起光を照射して蛍光を検出するタイミングは、同時並行でも、ノイズ除去光を照射した後に励起光を照射しても良い。同時並行であればノイズ除去から蛍光検出にかかる工程を削減できるため、装置の簡略化とスループット向上が実現できる。ノイズ除去光を照射した後に励起光を照射する際には、事前に多数のデバイス基板１０１に対して同時にノイズ除去光を照射しておき、蛍光検出のみ１枚ずつ行うことにより、ノイズ除去光を１枚ずつ照射する場合に比較してスループットを向上できる。
【００６２】
図６は、ノイズ除去光のエバネッセント場６１２をナノ開口６１４を用いて発生させる方法を示したものである。デバイス基板６０１の反応溶液との界面６１０と接する側の面に、ノイズ除去光６０９に対して遮光性薄膜６１３を設ける。遮光性薄膜６１３にはノイズ除去光６０９の波長より短い口径をもつナノ開口６１４を設ける。ナノ開口部分はノイズ除去光６０９に対して実質的に透明媒質６１５で満たす。透明媒質６１５は反応溶液１０２またはデバイス基板６０１と同じ材質を用いてよく、望ましくは石英，サファイア，光学ガラス等である。
【００６３】
前記ナノ開口６１４は、以下の工程で作製する。まず、デバイス基板１０１の表面にアルミニウムを２００ｎｍの厚さになるよう蒸着して遮光性薄膜６１３とする。アルミニウム以外の材質として、銀，金，クロム，炭化シリコンなどを用いて遮光性薄膜としても良い。遮光性薄膜６１３上に、Electron beam lithography技術により径５０ｎｍのナノ開口６１４を１μｍの間隔で複数形成する。前記ナノ開口は、貫通穴でも良いし、デバイス基板１０１にわずかな厚さの膜が残った状態であっても良い。ナノ開口の作製方法としては、J. Appl. Phys. 2008、Vol. 103、034301（非特許文献５）に開示されている方法を用いても良い。
【実施例２】
【００６４】
本実施例では、図７等を参照しながら、実施例１のノイズ除去方法を利用するに好適な核酸分析装置について説明する。以下、実施例１との相違点を中心に説明する。
【００６５】
本実施例では、核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、ノイズ除去用光照射手段と、を備える。
【００６６】
より具体的には、核酸分析デバイス７０５として、合成石英（シグマ光機社製、１９３ｎｍのＵＶ光に対する屈折率１.５６１、３５０〜７００ｎｍに対する屈折率１.４５〜１.４８）のデバイス基板１０１の表面に、高さ１００ｎｍの金構造体をスペーサ１０３として配置し、プローブ１０４としてビオチン−アビジン−ビオチン標識一本鎖鋳型ＤＮＡの複合体を形成し、スペーサ１０３上に固定する。プローブの複合体形成と固定方法については後述する。
【００６７】
また、本実施例では、カバープレート７０１と検出窓７０２と溶液交換用口である流路７０３と排出口７０４から構成される反応チャンバーに、前記のデバイス７０５を設置する。なお、カバープレート７０１と検出窓７０２の材質として、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用する。また、検出窓７０２の厚さは０.１７mmとする。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）７０７およびＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）７０８から発振するレーザ光７１０および７０９を、レーザ光７０９のみをλ／４板７１１によって円偏光し、ダイクロイックミラー７１２（４１０ｎｍ以下を反射）によって、前記２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ７１３によって集光し、その後、プリズム７１４を介してデバイス７０５へ臨界角以上で照射する。本実施例によれば、ＹＡＧレーザ照射により、デバイス７０５表面上にＹＡＧレーザ由来のエバネッセント場が発生し、デバイス表面に結合したプローブＤＮＡにより捕捉された標的物質の蛍光体は、ＹＡＧレーザ由来のエバネッセント場内に存在することになる。蛍光体はＹＡＧレーザ光で励起され、その増強された蛍光の一部は検出窓７０２を介して出射される。また、検出窓７０２より出射される蛍光は、対物レンズ７１５（×６０，ＮＡ１.３５，作動距離０.１５mm）により平行光束とされ、光学フィルタ７１６により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ７１７により２次元ＣＣＤカメラ７１８上に結像される。
【００６８】
また、本実施例では、ノイズ除去用光照射手段としてノイズ除去用光学系を備える。ノイズ除去用光学系は図７の７１４および７２１〜７２５から構成される。ＵＶレーザ光源であるＡｒＦエキシマレーザ７２１（波長１９３ｎｍ，出力３０ｍＷ）から発振するノイズ消去用のＵＶレーザ光７２２を、レンズ７２４によって集光し、その後、プリズム７１４を介してデバイス７０５へ入射角７５°で照射し、デバイスとデバイスに接する溶液の界面で全反射させる。なお、前記のＵＶレーザ光用の光学系を含む領域であるＮ2パージエリア７２５は、光学系からＵＶを吸収する酸素を排除するため窒素ガスを導入しているが、Ａｒガスを導入するか、真空にしてもよい。または石英等のＵＶ透過性のよい素材による光ファイバ等を用いてもよく、この場合は光路の自由度が上がるため装置レイアウトがしやすい。また、７１４および７２１〜７２５の配置としてエバネッセント場を発生可能な光学系配置一般を用いることができる。全反射条件で照射可能なレイアウトであればよい。例えば、７０７〜７１４と対向している必要は無く、並行または直行していてもよい。また、ナノ開口によるエバネッセント場を発生可能な光学系配置でもよい。
【００６９】
本実施例によれば、ＵＶレーザ照射により、デバイス７０５表面上にエバネッセント場が発生し、デバイス表面上のノイズ原因物質はＵＶレーザに由来するエバネッセント場内に存在するが、デバイス表面に結合したスペーサ上のプローブＤＮＡ、およびプローブＤＮＡにより捕捉された標的物質の蛍光体は実質的にＵＶレーザに由来するエバネッセント場の外に存在することになる。デバイス表面上のノイズ原因物質をＵＶレーザ光により分解しノイズを除去できるが、スペーサ上のプローブＤＮＡ、およびプローブＤＮＡにより捕捉された標的物質の蛍光体は保護される。よって、高いＳＮ比で蛍光を検出できる。
【００７０】
以下、図８を用いて段階的伸長反応の工程を説明する。反応工程は非特許文献２および非特許文献１に則って行う。ストレプトアビジンを加えたバッファを流路７０３より反応槽７０６に導入し、ストレプトアビジン８０１をデバイス７０５の金構造体８１０上のビオチン８１１に結合させ、ビオチン−アビジン複合体を形成させる（図８（ａ））。ビオチン修飾したターゲットである一本鎖鋳型ＤＮＡ８０２にプライマ８０３をハイブリさせ、前記鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体と大過剰のビオチン８０４を加えたバッファを注入口である流路７０３へ導入し、ビオチン−アビジン結合を介して、単分子の前記鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体を固定する（図８（ｂ））。固定反応後に、余剰な鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体およびビオチンを洗浄用バッファにて洗い流す。次に、蛍光体Ｒ６Ｇで標識された３′末端がアリル基で修飾されたｄＡＴＰ（３′−Ｏ−allyl−ｄＡＴＰ−ＰＣ−Ｒ６Ｇ）８０５およびThermo Sequenaseポリメラーゼ８０６を加えたThermo Sequenase Reactionバッファを流路７０３より反応槽７０６へ導入し、伸長反応を行う。この時、プライマ８０３の３′末端の塩基の次に位置するところの相補的な位置にある一本鎖鋳型ＤＮＡ８０２の配列上の塩基がＴであった場合、前記ｄＡＴＰ８０５はポリメラーゼ伸長反応によって前記鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に取り込まれる。また、ｄＡＴＰ８０５の３′末端はアリル基で修飾されているため、前記鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に１塩基以上取り込まれることはない。伸長反応後、未反応のｄＡＴＰ８０５とポリメラーゼ８０６を洗浄用バッファで反応槽７０６から洗い流し、ＹＡＧレーザ光源７０７より発振するレーザ光７０９をチップへ照射し、蛍光検出を行う（図８（ｄ））。この時、所定の位置における蛍光の有無によりｄＡＴＰが鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に取り込まれたかを判断する。次に、ＹＡＧレーザ光源７０８より発振するレーザ光７１０をチップへ照射し、前記複合体に取り込まれたｄＡＴＰ８０５に標識された蛍光体８０７を光切断により取り除く（図８（ｅ））。次いで、パラジウムを含んだ溶液８０８を反応槽７０６内に導入し、パラジウム触媒反応により、前記複合体に取り込まれたｄＡＴＰの３′末端のアリル基を水酸基に変える（図８（ｆ））。前記３′末端のアリル基を水酸基に変えることにより、前記鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体の伸長反応が再開可能となる。前記触媒反応後に、洗浄用バッファにて反応槽７０６を洗浄する。図８（ｃ）から前記洗浄までのプロセスを各ｄＮＴＰ、つまり、Ａ→Ｃ→Ｇ→Ｔ→Ａ→と繰返すことにより、固定された一本鎖鋳型ＤＮＡ８０２の配列を決定する。
【００７１】
本装置では、複数の金構造体８１０上での蛍光を同時計測できるため、複数の異なる鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に取り込まれたｄＮＴＰの塩基種を、つまり複数の鋳型ＤＮＡの配列を同時に決定できる。また、本実施例のデバイスを用いれば、デバイス基板８０９上に非特異的に吸着している標的物質１０７からのノイズを低減することができる。以上より、本実施例によれば、一度に数多くの標的物質を高いコントラストで検出することができる。
【００７２】
また、本実施例のノイズ除去用光学系を用いて、デバイス７０５以外の部位にノイズ除去光を照射しても良く、流路７０３や、バッファ等反応に必要な溶液を保持するタンクにおいて照射することで、バッファ等に含まれるノイズ原因物質によるノイズを除去することができる。デバイス７０５表面でノイズ除去光を照射する構成では溶液中に浮遊するノイズ原因物質を除去することはできないが、前記流路７０３やタンクにおいて照射することで前記溶液中に浮遊するノイズ原因物質を除去することが可能である。また、この際、ノイズ原因物質に分解されると後に続く反応または蛍光検出に影響を及ぼす物質（例えば未反応の標的物質１０６や鋳型ＤＮＡ等）を含まない溶液のみにノイズ除去光をあててよく、これによって蛍光検出への影響を避けることができる。
【実施例３】
【００７３】
本実施例では、図９を参照しながら、核酸分析装置の装置構成の好ましい構成の別の一例について説明する。以下、実施例１及び２との相違点を中心に説明する。
【００７４】
本実施例は、ノイズ除去装置（図９（ａ））と、蛍光検出装置（図９（ｂ））からなる。まず、図９（ａ）を参照して、本実施例を構成するノイズ除去装置について説明する。
【００７５】
標的物質を含む溶液を低屈折率層側に保持できるチャンバーであるノイズ除去チャンバーに前記デバイス７０５を設置する。ノイズ除去チャンバーは、カバープレート９０１と溶液交換用口である注入口９０３と排出口９０４から構成される。図９（ａ）に示したノイズ除去装置の構成のうち、ノイズ除去用光学系の７２１〜７２５は図７と実質的に同等であり、ＵＶレーザ光７２２は、プリズム９１４を介してデバイス７０５へ入射角７５°で照射し、デバイスとデバイスに接する溶液の界面で全反射し、デバイス表面にノイズ除去光のエバネッセント場１１２を発生させる。また、図９（ｂ）に示した蛍光検出装置は、ノイズ除去用光学系を除いた図７の蛍光分析装置の構成と同等である。
【００７６】
また、本実施例ではチャンバーはノイズ除去装置と蛍光検出装置のそれぞれに含まれているが、チャンバーとデバイス７０５とを一体とし、図９（ａ）のノイズ除去チャンバーと図９（ｂ）の反応チャンバーを共通のものとしてもよい。
【００７７】
本実施例では、ノイズ除去用光学系を蛍光検出装置と分離することで、ノイズ除去用光照射と蛍光検出の工程を並行して行うことが可能となる。実施例２において複数のデバイス７０５を処理する際には、「ノイズ除去用光照射→蛍光検出」の工程をデバイスの個数だけ繰返す必要があるが、一般に蛍光検出にかかる時間のほうが長い。本実施例ではノイズ除去用光照射を予め済ませておくことで、連続して蛍光検出を行うことが可能となり、解析全体のスループットが向上する。また、ノイズ除去装置に複数デバイスを保持するよう構成することで、事前に多数のデバイス基板１０１に対して同時にノイズ除去光を照射しておき、蛍光検出のみ１枚ずつ行うことで、ノイズ除去光を１枚ずつ照射する場合に比較してスループットを向上できる。また、反応槽９０６中の媒質を反応槽７０６中の媒質と異なる屈折率を持つ、異なる物質にすることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】核酸分析デバイスの概要。
【図２】核酸分析デバイスの変形例１。
【図３】核酸分析デバイスの変形例２。
【図４】核酸分析方法の概要。
【図５】核酸分析方法デバイスの変形例。
【図６】核酸分析デバイスの変形例３。
【図７】核酸分析装置の概要。
【図８】段階的伸長反応の概要。
【図９】（ａ）ノイズ除去装置の概要、（ｂ）蛍光検出装置の概要。
【符号の説明】
【００７９】
１０１，６０１，８０９ デバイス基板
１０２，６０２ 反応溶液
１０３，６０３ スペーサ
１０４，６０４ プローブ
１０５ 捕捉された標的物質
１０６ 未反応の標的物質
１０７ 非特異吸着した標的物質
１０８ ゴミ
１０９，６０９ ノイズ除去光
１１０ デバイスと反応溶液の界面
１１１ ノイズ除去光の入射角
１１２，６１２ ノイズ除去光のエバネッセント場
１１３ 励起光
１１４ 励起光のエバネッセント場
２０３ 支持体
３０４ スペーサ−プローブ
４０２ 媒質
６０５ プローブに捕捉された標的物質
６０６ 反応溶液中に浮遊する標的物質
６０７ デバイス基板表面に非特異吸着した標的物質
６０８ ゴミ等の標的物質以外のノイズ原因物質
６１３ 非導光性媒質
６１４ ナノ開口
６１５ 導光性媒質
７０１，９０１ カバープレート
７０２ 検出窓
７０３，９０３ 注入口
７０４，９０４ 排出口
７０５ デバイス
７０６，９０６ 反応槽
７０７，７０８ ＹＡＧレーザ光源
７０９，７１０ レーザ光
７１１ λ／４板
７１２ ダイクロイックミラー
７１３，７２４ レンズ
７１４ プリズム
７１５ 対物レンズ
７１６ 光学フィルタ
７１７ 結像レンズ
７１８ ２次元ＣＣＤカメラ
７２１ ＵＶレーザ光源
７２２ ＵＶレーザ光
７２５ Ｎ2パージエリア
８０１ ストレプトアビジン
８０２ 一本鎖鋳型ＤＮＡ
８０３ プライマ
８０４，８１１ ビオチン
８０５ ｄＡＴＰ（３′−Ｏ−allyl−ｄＡＴＰ−ＰＣ−Ｒ６Ｇ）
８０６ Thermo Sequenaseポリメラーゼ
８０７ 蛍光体
８０８ パラジウムを含んだ溶液
８１０ 金構造体
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質と相互作用できるプローブが配置されている基板と、
前記標的物質又は前記プローブに向けて励起光を照射する励起光照射光学系と、
前記励起光により生じた蛍光を検出する蛍光検出光学系と、
前記基板表面に非特異吸着した前記標的物質やゴミを分解できるノイズ除去光を、前記基材表面にエバネッセント場が発生する条件で、前記基板に照射するノイズ除去用光学系を備え、
前記エバネッセント場の範囲外に、前記プローブが配置されていることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項２】
請求項１記載の蛍光分析装置において、
前記励起光照射光学系が、前記基材表面にエバネッセント場が発生する条件で、前記基板に励起光を照射することを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項３】
請求項２記載の蛍光分析装置において、
励起光のエバネッセント場の染み出し距離が、ノイズ除去光のエバネッセント場の染み出し距離よりも長いことを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項４】
請求項２記載の蛍光分析装置において、
前記励起光が可視光であり、前記ノイズ除去光がＵＶ光であることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項５】
請求項１記載の蛍光分析装置において、
前記基板表面にスペーサが存在し、当該スペーサに前記プローブが配置されていることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項６】
請求項１記載の蛍光分析装置において、
前記基板表面にスペーサが存在し、当該スペーサに前記プローブが配置されていることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項７】
請求項１記載の蛍光分析装置において、
前記基板表面に対向する位置に支持体が存在し、当該支持体に前記プローブが配置されていることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項８】
請求項１記載の蛍光分析装置において、
前記ノイズ除去用光学系が、前記基板の界面にて全反射するようにノイズ除去光を照射し、前記基材表面にエバネッセント場を発生させることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項９】
請求項１記載の蛍光分析装置において、
前記基板が、ナノ開口を備え、
前記ノイズ除去用光学系が、前記ナノ開口にノイズ除去光を照射し、前記基材表面にエバネッセント場を発生させることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１０】
請求項１記載の蛍光分析装置において、
前記プローブが、ＤＮＡ，ＲＮＡ，アプタマー，遺伝子，ヌクレオソーム，クロマチン，染色体，核様体、細胞膜，細胞壁、ウイルス，抗原，抗体，レクチン，ハプテン，レセプター，酵素，ペプチド，スフィンゴ糖、又はスフィンゴ脂質であることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１１】
請求項１記載の蛍光分析装置において、
前記標的物質が、ＤＮＡ，ＲＮＡ，アプタマー，抗原，抗体，デオキシリボヌクレオシド３リン酸、又はリボヌクレオシド３リン酸であることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１２】
請求項１記載の蛍光分析装置において、
前記標的物質が、蛍光標識されたヌクレオチドのモノマー又はオリゴマーであり、
前記プローブが、核酸合成酵素、又は核酸分子であり、
前記標的物質と前記プローブが相互作用することにより生成される核酸鎖中に取り込まれた前記ヌクレオチドの蛍光を検出することにより、核酸の配列情報を取得することを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１３】
請求項１記載の蛍光分析装置において、
前記ノイズ除去用光学系が、励起光が照射されない領域にノイズ除去光を照射できることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１４】
プローブを配置できるスペーサを有する光透過性基板と、
プローブと相互作用できる標的物質を含む溶液を、前記光透過性基板の表面に保持できる反応槽と、
前記光透過性基板と直接又は間接的に接触するプリズムと、
レーザ光である励起光を生じる光源と、
レーザ光であるＵＶ光を生じる光源と、を備え、
前記プリズムに入射した励起光が、前記光透過性基板の表面で全反射し、前記プローブを含む領域にエバネッセント場が発生し、
前記プリズムに入射したＵＶ光が、前記光透過性基板の表面で全反射し、前記プローブを含まない領域にエバネッセント場が発生することを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１５】
光透過性基板と、
光透過性基板の基板表面と対向する位置に存在し、プローブを配置できる支持体と、
プローブと相互作用できる標的物質を含む溶液を、前記光透過性基板の表面に保持できる反応槽と、
前記光透過性基板と直接又は間接的に接触するプリズムと、
レーザ光である励起光を生じる光源と、
レーザ光であるＵＶ光を生じる光源と、を備え、
前記プリズムに入射した励起光が、前記光透過性基板の表面で全反射し、前記プローブを含む領域にエバネッセント場が発生し、
前記プリズムに入射したＵＶ光が、前記光透過性基板の表面で全反射し、前記プローブを含まない領域にエバネッセント場が発生することを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１６】
プローブを配置できるスペーサと、ナノ開口を備えた基板と、
プローブと相互作用できる標的物質を含む溶液を、前記基板の表面に保持できる反応槽と、
レーザ光である励起光を生じる光源と、
レーザ光であるＵＶ光を生じる光源と、を備え、
前記ナノ開口に励起光が照射され、前記プローブを含む領域にエバネッセント場が発生し、
前記ナノ開口にＵＶ光が照射され、前記プローブを含まない領域にエバネッセント場が発生することを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１７】
光透過性基板と、
光透過性基板の基板表面と対向する位置に存在し、プローブを配置できる支持体と、
プローブを配置できるスペーサと、ナノ開口を備えた基板と、
プローブと相互作用できる標的物質を含む溶液を、前記基板の表面に保持できる反応槽と、
レーザ光である励起光を生じる光源と、
レーザ光であるＵＶ光を生じる光源と、を備え、
前記ナノ開口に励起光が照射され、前記プローブを含む領域にエバネッセント場が発生し、
前記ナノ開口にＵＶ光が照射され、前記プローブを含まない領域にエバネッセント場が発生することを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１８】
標的物質と相互作用できるプローブが配置されている基板と、
前記基板の表面に溶液を保持できる第１の反応槽と、
前記第１の反応槽に配置された前記基板に対し、当該基材表面にエバネッセント場が発生する条件で、ノイズ除去光照射するノイズ除去用光学系と、
前記基板の表面に溶液を保持できる第１の反応槽と、
プローブと相互作用できる標的物質を含む溶液を、前記光透過性基板の表面に保持できる第２の反応槽と、
前記第２の反応槽に配置された前記基板に対し、励起光を照射する励起光照射光学系と、
前記励起光により生じた蛍光を検出する蛍光検出光学系と、
を備える蛍光分析装置。
【請求項１】
標的物質と相互作用できるプローブが配置されている基板と、
前記標的物質又は前記プローブに向けて励起光を照射する励起光照射光学系と、
前記励起光により生じた蛍光を検出する蛍光検出光学系と、
前記基板表面に非特異吸着した前記標的物質やゴミを分解できるノイズ除去光を、前記基材表面にエバネッセント場が発生する条件で、前記基板に照射するノイズ除去用光学系を備え、
前記エバネッセント場の範囲外に、前記プローブが配置されていることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項２】
請求項１記載の蛍光分析装置において、
前記励起光照射光学系が、前記基材表面にエバネッセント場が発生する条件で、前記基板に励起光を照射することを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項３】
請求項２記載の蛍光分析装置において、
励起光のエバネッセント場の染み出し距離が、ノイズ除去光のエバネッセント場の染み出し距離よりも長いことを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項４】
請求項２記載の蛍光分析装置において、
前記励起光が可視光であり、前記ノイズ除去光がＵＶ光であることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項５】
請求項１記載の蛍光分析装置において、
前記基板表面にスペーサが存在し、当該スペーサに前記プローブが配置されていることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項６】
請求項１記載の蛍光分析装置において、
前記基板表面にスペーサが存在し、当該スペーサに前記プローブが配置されていることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項７】
請求項１記載の蛍光分析装置において、
前記基板表面に対向する位置に支持体が存在し、当該支持体に前記プローブが配置されていることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項８】
請求項１記載の蛍光分析装置において、
前記ノイズ除去用光学系が、前記基板の界面にて全反射するようにノイズ除去光を照射し、前記基材表面にエバネッセント場を発生させることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項９】
請求項１記載の蛍光分析装置において、
前記基板が、ナノ開口を備え、
前記ノイズ除去用光学系が、前記ナノ開口にノイズ除去光を照射し、前記基材表面にエバネッセント場を発生させることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１０】
請求項１記載の蛍光分析装置において、
前記プローブが、ＤＮＡ，ＲＮＡ，アプタマー，遺伝子，ヌクレオソーム，クロマチン，染色体，核様体、細胞膜，細胞壁、ウイルス，抗原，抗体，レクチン，ハプテン，レセプター，酵素，ペプチド，スフィンゴ糖、又はスフィンゴ脂質であることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１１】
請求項１記載の蛍光分析装置において、
前記標的物質が、ＤＮＡ，ＲＮＡ，アプタマー，抗原，抗体，デオキシリボヌクレオシド３リン酸、又はリボヌクレオシド３リン酸であることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１２】
請求項１記載の蛍光分析装置において、
前記標的物質が、蛍光標識されたヌクレオチドのモノマー又はオリゴマーであり、
前記プローブが、核酸合成酵素、又は核酸分子であり、
前記標的物質と前記プローブが相互作用することにより生成される核酸鎖中に取り込まれた前記ヌクレオチドの蛍光を検出することにより、核酸の配列情報を取得することを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１３】
請求項１記載の蛍光分析装置において、
前記ノイズ除去用光学系が、励起光が照射されない領域にノイズ除去光を照射できることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１４】
プローブを配置できるスペーサを有する光透過性基板と、
プローブと相互作用できる標的物質を含む溶液を、前記光透過性基板の表面に保持できる反応槽と、
前記光透過性基板と直接又は間接的に接触するプリズムと、
レーザ光である励起光を生じる光源と、
レーザ光であるＵＶ光を生じる光源と、を備え、
前記プリズムに入射した励起光が、前記光透過性基板の表面で全反射し、前記プローブを含む領域にエバネッセント場が発生し、
前記プリズムに入射したＵＶ光が、前記光透過性基板の表面で全反射し、前記プローブを含まない領域にエバネッセント場が発生することを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１５】
光透過性基板と、
光透過性基板の基板表面と対向する位置に存在し、プローブを配置できる支持体と、
プローブと相互作用できる標的物質を含む溶液を、前記光透過性基板の表面に保持できる反応槽と、
前記光透過性基板と直接又は間接的に接触するプリズムと、
レーザ光である励起光を生じる光源と、
レーザ光であるＵＶ光を生じる光源と、を備え、
前記プリズムに入射した励起光が、前記光透過性基板の表面で全反射し、前記プローブを含む領域にエバネッセント場が発生し、
前記プリズムに入射したＵＶ光が、前記光透過性基板の表面で全反射し、前記プローブを含まない領域にエバネッセント場が発生することを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１６】
プローブを配置できるスペーサと、ナノ開口を備えた基板と、
プローブと相互作用できる標的物質を含む溶液を、前記基板の表面に保持できる反応槽と、
レーザ光である励起光を生じる光源と、
レーザ光であるＵＶ光を生じる光源と、を備え、
前記ナノ開口に励起光が照射され、前記プローブを含む領域にエバネッセント場が発生し、
前記ナノ開口にＵＶ光が照射され、前記プローブを含まない領域にエバネッセント場が発生することを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１７】
光透過性基板と、
光透過性基板の基板表面と対向する位置に存在し、プローブを配置できる支持体と、
プローブを配置できるスペーサと、ナノ開口を備えた基板と、
プローブと相互作用できる標的物質を含む溶液を、前記基板の表面に保持できる反応槽と、
レーザ光である励起光を生じる光源と、
レーザ光であるＵＶ光を生じる光源と、を備え、
前記ナノ開口に励起光が照射され、前記プローブを含む領域にエバネッセント場が発生し、
前記ナノ開口にＵＶ光が照射され、前記プローブを含まない領域にエバネッセント場が発生することを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１８】
標的物質と相互作用できるプローブが配置されている基板と、
前記基板の表面に溶液を保持できる第１の反応槽と、
前記第１の反応槽に配置された前記基板に対し、当該基材表面にエバネッセント場が発生する条件で、ノイズ除去光照射するノイズ除去用光学系と、
前記基板の表面に溶液を保持できる第１の反応槽と、
プローブと相互作用できる標的物質を含む溶液を、前記光透過性基板の表面に保持できる第２の反応槽と、
前記第２の反応槽に配置された前記基板に対し、励起光を照射する励起光照射光学系と、
前記励起光により生じた蛍光を検出する蛍光検出光学系と、
を備える蛍光分析装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００９−２４４０００（Ｐ２００９−２４４０００Ａ）
【公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８９１７４（Ｐ２００８−８９１７４）
【出願日】平成２０年３月３１日（２００８．３．３１）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月３１日（２００８．３．３１）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
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