蛍光分析方法，蛍光分析装置及び画像検出方法
【課題】本発明は、基板上に捕捉するＤＮＡ断片の分子からの蛍光像を２次元センサにて蛍光検出する際、少ない画素数で、効率よく検出する方法を提供することにある。また、基板上に捕捉するＤＮＡ断片の分子からの蛍光像を２次元センサにて蛍光検出する際、安価に、または操作性の良い検出方法を提供することにある。
【解決手段】オリゴヌクレオチドが固定される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光・結像し、２次元センサにて蛍光検出する方法であって、該基板のオリゴヌクレオチドが固定される領域が複数設けられ、それらが基板上に、縦横にほぼ等間隔（間隔ｄｓ）で配置され、集光・結像光学系の結像倍率をＭ、２次元センサの画素の間隔をｄｄとしたとき、
ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎ （ｎ＝１，２，３，４，５：整数）
であるようにして蛍光像を検出する。
【解決手段】オリゴヌクレオチドが固定される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光・結像し、２次元センサにて蛍光検出する方法であって、該基板のオリゴヌクレオチドが固定される領域が複数設けられ、それらが基板上に、縦横にほぼ等間隔（間隔ｄｓ）で配置され、集光・結像光学系の結像倍率をＭ、２次元センサの画素の間隔をｄｄとしたとき、
ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎ （ｎ＝１，２，３，４，５：整数）
であるようにして蛍光像を検出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、画像検出方法に関する。例えば、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを平板状の複数の位置に捕捉し、その蛍光パターンを蛍光検出する方法または装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ，ＲＮＡ，蛋白質等の分析技術は遺伝子解析や遺伝子診断を含む医学，生物学などの分野で重要である。特に最近では、ＤＮＡマイクロアレイ（またはオリゴチップ，ＤＮＡチップ，バイオチップなど種々の名称で呼ばれるが、以下では、まとめてＤＮＡマイクロアレイとする）を使い、１つの検体から多種のＤＮＡ配列情報，遺伝子情報を同時に検査分析する方法及び装置が注目されている。ＤＮＡマイクロアレイは、ガラス等の基板を使用し、これを複数（数１００〜数千万個）の領域に分けて、各々に目的の（通常、種類の異なる）ＤＮＡプローブを固定化し、各々を微小な反応領域にしたものである。これと検体とを反応させることで、検体中の目的ＤＮＡが前記固定化されたＤＮＡプローブとハイブリダイズして捕捉され、さらに蛍光プローブなどを結合させることで、結合状態（位置すなわちハイブリダイズした配列）とその量を蛍光強度等で測定する事が可能になり、遺伝子診断，シーケンス等に利用することができる。
【０００３】
このＤＮＡマイクロアレイの蛍光強度の読み取りは、通常スキャナーと呼ばれる顕微鏡（共焦点蛍光顕微鏡）に類似する装置が使用される（たとえば特許文献１，２）。この装置は、アレイ上にレーザ光などの励起光を１個の微小スポットにして照射し、生じる蛍光を干渉フィルタなどの分光素子を使って励起光と分離し、蛍光強度を光電子増倍管などの光検出器にて検出する。その際、ガルバノミラーなどを使ってアレイ上に形成される微小スポットを２次元的に走査したり、または、微小スポットの位置を固定し、アレイを２次元的に走査したりすることで、アレイ全体の蛍光強度分布、つまりは各ＤＮＡプローブに対する結合の度合を知ることができる。ＤＮＡマイクロアレイの蛍光強度の読み取り法として、上記のようなビームスキャン以外に、アレイの領域に励起光を広く照射し、生じる蛍光像を２次元カメラにて検出する方法（たとえば特許文献３，４）もある。これらの方法では、ＤＮＡプローブを固定化した複数の領域を蛍光検出するに当たり、領域を数十分割して計測しており、また領域間もそれ以上に分割して計測している。これにより、複数の反応領域の位置がずれても分離して検出することができる。しかし、測定すべき領域数に比べ、２次元センサの必要な画素数は数１００倍以上要することになる。
【０００４】
また、ＤＮＡ，ＲＮＡの塩基配列決定法も重要な技術である。通常は、予め配列決定用のＤＮＡ断片又は断片群に蛍光標識した試料を調製し、電気泳動した後又は電気泳動中に分子量分離展開パターンを計測し解析する。具体的には、電気泳動分離に先立ち、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行する。分析すべき試料ＤＮＡの既知の塩基配列部分と相補的な約２０塩基長のオリゴヌクレオチドを合成し蛍光体を標識する。このオリゴヌクレオチドをプライマーとし、約１ピコモルの試料ＤＮＡと相補鎖結合させて、ポリメラーゼにより相補鎖伸長反応を実行する。このとき基質として、４種のデオキシヌクレオチド３リン酸、即ち、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ、及びこれらに加えて例えば、ｄｄＡＴＰを加える。ｄｄＡＴＰが相補鎖伸長で取り込まれると、それ以上相補鎖が伸長しないため、アデニン（Ａ）で終結する様々な長さの断片が調製される。上記反応でｄｄＡＴＰの代わりに、ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰ，ｄｄＴＴＰを各々加えた反応を行う。但し、各反応で用いるプライマーは、塩基配列は同じであるが、蛍光を分光して互いに識別できる４種の蛍光体で標識する。以上の４種の反応物を混合すると、試料ＤＮＡに相補的な数１００塩基長までの１塩基ずつ長さが異なる断片が、末端の塩基種に応じて異なる４種の蛍光体で標識されて得られる。これをキャピラリーゲル電気泳動により１塩基の分解能で分離する。試料は分離されながら泳動し、短いものから順にレーザ照射される。発光蛍光を複数のフィルタを用いて分光しながら計測すると、４種の蛍光体の蛍光強度の時間変化から、全ての断片の末端塩基種を短い断片から順に決定できるというものである。
【０００５】
近年、非特許文献１にあるように、基板にＤＮＡなどを固定してその塩基配列を決定することが提案されている。基板表面にランダムに分析すべき試料ＤＮＡ断片を１分子ずつ捕捉し、ほぼ１塩基ずつ伸長させて、その結果を蛍光計測より検出することにより塩基配列を決定するものである。具体的には、ＤＮＡポリメラーゼの基質として鋳型ＤＮＡに取り込まれてＤＮＡ鎖伸長反応を保護基の存在により停止することができかつ検出され得る標識を持つ４種のｄＮＴＰの誘導体（ＭｄＮＴＰ）を用いてＤＮＡポリメラーゼ反応を行わせる工程、次いで取り込まれたＭｄＮＴＰを蛍光等で検出する工程、及びＭｄＮＴＰを伸長可能な状態に戻す工程を１サイクルとし、それを繰り返すことにより試料ＤＮＡの塩基配列を決定する。本技術では、ＤＮＡ断片を１分子ずつ配列決定することができるため、同時に数多くの断片を解析することができ、解析スループットを大きくすることができる。また、本方式では、単一ＤＮＡ分子毎に塩基配列が決定できる可能性があるため、従来技術の問題であったクローニングやＰＣＲ等での試料ＤＮＡを精製，増幅が不要にできる可能性があり、ゲノム解析や遺伝子診断の迅速化が期待できる。なお、本方法では、分析すべき試料ＤＮＡ断片分子が基板面にランダムに固定されるため、捕捉されたＤＮＡ断片分子数に対して数１００倍の画素数を有する高価なカメラが必要となる。つまり、ＤＮＡ断片分子同士の間隔が平均１ミクロンになるように調整した場合、より大きな間隔同士の分子もいれば、より近接した間隔の分子同士も存在し、これらを互いに分離して検出するには、基板面に換算して、より細かな間隔で蛍光像を検出する必要がある。通常、数１０分の１の間隔で計測する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表平９−５０３３０８号公報
【特許文献２】特開２０００−６９９９８号公報
【特許文献３】特開２００２−１８１７０８号公報
【特許文献４】特開２００１−２５５３２８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.100(7), pp3960, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述の光学系においては、基板上に捕捉する領域数つまり、ＤＮＡ断片の分子数に対して、数１００倍以上の画素数が必要であり、検出速度の低下、高価な２次元センサが必要になるという問題点があった。さらに、また、より高解像度で蛍光像を検出しなければならないため、開口数ＮＡの大きな集光レンズを使う必要があり、高価な系になるという問題点があった。
【０００９】
本発明の目的は、少ない画素数で効率よく画像を検出する方法に関する。例えば、基板上に捕捉するＤＮＡ断片の分子からの蛍光像を２次元センサにて蛍光検出する際、少ない画素数で、効率よく検出する方法を提供することに関する。また、例えば基板上に捕捉するＤＮＡ断片の分子からの蛍光像を２次元センサにて蛍光検出する際、安価に、または操作性の良い検出方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、例えば本発明は、複数の測定対象物を精密配置し、複数の検出画素を備えた検出器の特定画素に各測定対象物をそれぞれ結像させることに関する。オリゴヌクレオチドが固定される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光・結像し、２次元センサにて蛍光検出する方法であって、該基板のオリゴヌクレオチドが固定される領域が複数設けられ、それらが基板上に、縦横にほぼ等間隔（間隔ｄｓ）で配置され、集光・結像光学系の結像倍率をＭ、２次元センサの画素の間隔をｄｄとしたとき、
ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎ （ｎ＝１，２，３，４，５：整数）
であるようにして蛍光像を検出することに関する。
【００１１】
または、例えばオリゴヌクレオチドが固定される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光・結像し、２次元センサにて蛍光検出する方法であって、該基板のオリゴヌクレオチドが固定される領域は複数設けられ、それらが基板上に、縦横にほぼ等間隔(間隔ｄｓ)で配置され、該領域には単一分子のオリゴヌクレオチドが固定され、集光・結像光学系の結像倍率がＭ、２次元センサの画素の間隔がｄｄとしたとき、
ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎ （ｎ＝１，２，３，４，５：整数）
であるようにして蛍光像を検出する。
【００１２】
より好ましくは、上記関係式で、
ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎ （ｎ＝２，３）
であるように調整して蛍光像を検出することに関する。
【００１３】
好ましくは、オリゴヌクレオチドが固定される領域の間隔ｄｓは、１００ｎｍから１００００ｎｍであり、より好ましくは、５００ｎｍから１５００ｎｍにする。
【００１４】
好ましくは、オリゴヌクレオチドが固定される領域の大きさは１００ｎｍ径以下にする。
【００１５】
また、好ましくは、上記基板の表面は、複数設けられるオリゴヌクレオチドが固定される領域を除く基板上の反応領域には、光学的な遮光機能を有する膜状物質を施すことがより有効であり、金属膜などを蒸着などによって形成させる。
【００１６】
また、好ましくは、ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎとなるように、結像倍率Ｍを調整する機構部を有し、また該基板には、位置決め用のマーカが少なくとも２箇所にあり、位置決め用のマーカを検出し、結像倍率Ｍを自動で調整する機能部を有する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、例えば、測定すべきオリゴヌクレオチドが固定される領域に対して、必要な２次元センサの画素数は、測定精度を損なわずに、従来の数１００倍から、３０倍以下、さらには、１０倍以下と少なくすることができ、効率よく検出することができる。そのため、同じ２次元センサを使う場合、一時により多くの領域からの蛍光像を得ることができ、高スループットが達成できる。また、少ない画素数のカメラを使う場合には、より、安価に測定できることになる。
【００１８】
また、本発明により、例えば、測定対象分子数が同じ場合、少ない画素数で、効率よく検出でき、２次元センサの価格を安価することができるようになる。また、光学分解能をオリゴヌクレオチドが固定される領域同士の間隔程度にすることができるため、大きな開口数の集光レンズを使う必要が無くなり、安価なレンズを使用することができ、液浸レンズも使う必要が無いので、操作性が向上できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１における、蛍光分析方法を使ったＤＮＡ検査装置の構成図である。
【図２】実施例１における、基板の構造説明図である。
【図３】実施例１における、基板と２次元センサの結像対応説明図である。
【図４】実施例１における、効果の説明図である。
【図５】実施例２における、基板の構造説明図である。
【図６】実施例３における、基板の構造説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を実施の形態例により説明するが、本発明は本例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
基板表面に分析すべき試料ＤＮＡ断片を１分子ずつ均等間隔で捕捉し、ほぼ１塩基ずつ伸長させて、取り込まれた蛍光標識を１分子ごと検出して塩基配列を決定する装置、方法について説明する。具体的には、ＤＮＡポリメラーゼの基質として鋳型ＤＮＡに取り込まれてＤＮＡ鎖伸長反応を保護基の存在により停止することができかつ検出され得る標識を持つ４種のｄＮＴＰの誘導体を用いてＤＮＡポリメラーゼ反応を行わせる工程、次いで取り込まれたｄＮＴＰ誘導体を蛍光等で検出する工程、及びｄＮＴＰ誘導体を伸長可能な状態に戻す工程を１サイクルとし、それを繰り返すことにより試料ＤＮＡの塩基配列を決定する。なお、本操作は単分子蛍光検出法に基づくため、測定はＨＥＰＡフィルタを介したクリーンルーム様の環境にて行う。
【００２２】
図１は、本発明の蛍光分析方法を使ったＤＮＡ検査装置の構成図である。装置は正立型の顕微鏡に類似する装置の構成であり、基板８に捕捉するＤＮＡ分子の伸長状態を蛍光検出にて測定する。なお倒立型の顕微鏡に類似する装置の構成にすることも可能である。
【００２３】
基板８は、図２に示すような構造をしている。基板８は透明材質でできており、材質としては合成石英などが使用できる。基板８には反応領域８ａがあり、この部分に試薬などが接触する。反応領域８ａ内にＤＮＡが固定される領域８ｉｊが複数形成されている。領域８ｉｊの個々の大きさは直径１００ｎｍ以下である。この領域にはＤＮＡを捕捉するための表面処理を施す。その表面処理は、例えば、ストレプトアビジンを結合させておき、ビオチンしたＤＮＡ断片を反応させることで、捕捉する。また、ポリＴのオリゴヌクレオチドを固定化しておき、ＤＮＡ断片の一端をポリＡ化処理して、ハイブリ反応にて捕捉することもできる。この際、ＤＮＡ断片濃度を適当に調製することで、個々の領域８ｉｊに単一分子のＤＮＡのみが入るようにすることができる。なお、領域８ｉｊをより小さくしていくことで、領域内に捕捉できる分子が１個になるようにすることも可能である。以後このような状態の基板を計測する。なお、領域８ｉｊ同士の間隔ｄｓは１ミクロンとした。このような、均等間隔の基板の作成法は、例えば、特開２００２−２１４１４２号公報に記載の手法などで、作成する。なお、ｄｓは領域８ｉｊの個々の大きさより大きく、１５００ｎｍ程度以下が好ましい。基板の反応領域８ａは１mm×１mmの大きさで、領域８ｉｊの位置は１０００×１０００＝１００００００個である。
【００２４】
ｄＮＴＰの蛍光標識としてＣｙ３を用いる。蛍光体はＣｙ３にかぎるものではなく、ほかの種々の蛍光体を使用することが可能である。また、異なる蛍光体で標識された４種のｄＮＴＰを使うことも可能であるが、本例では１蛍光体での測定を行う。蛍光励起用のレーザ装置１（ＹＡＧレーザ，５３２ｎｍ）からのレーザ光１ａをλ／４波長板３を通して円偏光とし、ミラー５，ダイクロイックミラー６，ミラー５を介して全反射照明用の石英製プリズム７に入射し、ＤＮＡ分子を均等間隔に捕捉した基板８の裏側から照射する。石英製プリズム７と基板８は無蛍光グリセリンを介して接触させており、レーザ光はその界面で反射することなく、基板８に導入される。基板内でのレーザ光の入射角は約６６度〜６８度で基板８表面で全反射し、エバネッセント照明となる。これにより、高いＳ／Ｎで蛍光測定が可能になる。レーザの照射領域は約２mm径とした。
【００２５】
なお、基板の近傍には、温調器が配置されているが、図では省略した。また、通常観察のため、プリズム下部よりハロゲン照明ができる構造としているが、図ではこれを省略している。
【００２６】
また、レーザ１とは別にレーザ装置２（ＹＡＧレーザ，３５５ｎｍ）を配置し、レーザ光１ａと同軸にして照射できるようにした。本レーザは、取り込まれたｄＮＴＰ誘導体の蛍光検出後、ｄＮＴＰ誘導体を伸長可能な状態に戻す工程に使用するものである。
【００２７】
基板８の上部には、試薬などをながし、反応させるためのフローチャンバ９が構成されている。チャンバには試薬導入口１２があり、分注ノズル２６を有する分注ユニット２５，試薬保管ユニット２７，チップボックス２８により、目的の試薬液の注入などを行う。
試薬保管ユニット２７には、試料液容器２７ａ，４種のｄＮＴＰ誘導体溶液容器２７ｂ，２７ｃ，２７ｄ，２７ｅ及び洗浄液容器２７ｆ等が用意される。チップボックス２８内の分注チップを分注ノズル２６に取り付け、適当な試薬液を吸引し、チャンバ導入口から基板の反応領域に導入し、反応させる。廃液は廃液チューブ１０を介して廃液容器１１に排出される。これらは制御ＰＣ２１により自動的に行われる。
【００２８】
フローチャンバは光軸方向に透明材で形成され、蛍光検出される。蛍光１３は、自動ピントあわせ装置２９で制御される集光レンズ（対物レンズ）１４で集められ、フィルタユニット１５で必要な波長の蛍光を取り出し、自動ズーム機構部１７，結像レンズ１８で、２次元センサカメラ１９（高感度冷却ＣＣＤカメラ）で蛍光像を検出する。カメラの露光時間の設定，蛍光画像の取り込みのタイミングなどの制御は、２次元センサカメラコントローラ２０を介して制御ＰＣ２１が行う。４種のｄＮＴＰを使う場合は、フィルタユニット１５で該当する４種の蛍光体用のフィルタを時分割で切り替えて蛍光像を検出することなどで対応できる。
【００２９】
なお、装置は、調整などのため、透過光観察用鏡筒１６とＴＶカメラ２３とモニタ２４を備えており、ハロゲン照明などで基板８の状態をリアルタイムで観察できるようになっている。
【００３０】
図２にあるように、基板８には位置きめマーカ３０，３１が刻印されている。マーカ３０，３１は領域８ｉｊの並びと平行に配置され、その間隔が規定されている。そこで、透過照明での観測でマーカを検出することで、領域８ｉｊの位置を計算することができ、自動ズーム機構部１７を制御して指定の倍率になるようにする。本例の場合は、画素間隔（画素サイズ）ｄｄが７.４ミクロンの２次元センサカメラ１９（高感度冷却ＣＣＤカメラ）を使用している。結像系の倍率Ｍを１４.８倍に設定することで、基板８上の領域８ｉｊ同士の間隔を２分割して計測する。
【００３１】
本実施例で使用する２次元センサカメラとして、ＣＣＤエリアセンサを使用した。画素サイズが７.４×７.４ミクロンで、画素数２０４８×２０４８画素の冷却ＣＣＤカメラを使用する。基板の反応領域８ａの大きさが１mm×１mmの大きさで、その中に１ミクロン間
隔で１０００×１０００個の領域８ｉｊがあり、上記２０４８×２０４８画素の冷却ＣＣＤカメラで計測するため、結像系の倍率Ｍを１４.８倍に設定し、反応領域換算でカメラ１画素は０.５×０.５ミクロンに対応させる。なお、２次元センサカメラとしては、ＣＣＤエリアセンサの他、Ｃ−ＭＯＳエリアセンサなどの撮像カメラなどを一般に使うことができる。ＣＣＤエリアセンサにも、構造によって、背面照射型，正面照射型があり、どちらも使用できる。また、素子内部に信号の増倍機能を有する電子増倍型ＣＣＤカメラなども高感度化を図る上で有効である。また、センサは冷却型が望ましく、−２０℃程度以下にすることで、センサの持つダークノイズを低減出来、測定の精度を高めることができる。
【００３２】
本例では、反応領域８ａからの蛍光像を一度に検出するが、分割することもできる。反応領域８ａの大きさをより広くして、例えば５mm×５mmにすると、一度の画像計測ではすべての領域をカバーできないので、１mm×１mm毎に分割して計測して複数の画像を再構成して全体の蛍光像を測定することになる。この場合、基板の位置を移動させるためのＸ−Ｙ移動機構部をステージ下部に配置し、制御ＰＣで照射位置への移動，光照射，蛍光像検出を制御する。本例ではＸ−Ｙ移動機構部は図示していない。
【００３３】
種々のカメラが使用できるが、画素サイズが６.４５×６.４５ミクロンで画素数１３９２×１０４０画素の冷却ＣＣＤカメラなら結像系の倍率は１２.９倍を、画素サイズが９×９ミクロンで画素数４００８×２６７２画素のカメラなら結像系の倍率は１８倍を、画素サイズが１６×１６ミクロンで画素数５１２×５１２画素のカメラなら結像系の倍率は３２倍に調整して測定する。
【００３４】
図３に本例での基板と２次元センサの結像対応説明図を示す。基板８上にＤＮＡ一分子４０（４０ａ，４０ｂ，４０ｃ）が間隔１ミクロンで碁盤の目状に捕捉されるものと考える。実際は必ずしもすべての位置にＤＮＡ分子が捕捉されるとは限らないが、その場合でも同じ効果が得られるので、本状態で説明する。レンズ４１を介して２次元センサカメラ（高感度冷却ＣＣＤカメラ）の画素４２上に結像させる。図では簡単のため、結像倍率を１倍、２次元センサカメラの画素間隔を１／１４.８倍にして表示した（基板上の寸法で規格化した）。ＤＮＡ一分子４０ａ，４０ｂ，４０ｃが画素４２ｆ，４２ｄ，４２ｂに対応し、１画素おきに蛍光検出できることになる。この結果、レンズ収差，結像ボケなどによるＤＮＡ一分子４０ａ，４０ｂ，４０ｃ同士の蛍光の重なりの影響が少なく、また、ＤＮＡ一分子の捕捉される位置が＋−１０％程度ずれても蛍光測定への影響が少なく、安定な計測を行うことができる。
【００３５】
図６に、効果の説明図を示した。従来のようにＤＮＡ分子をランダムに捕捉する場合、捕捉間隔の平均が１ミクロンであっても、確率的に極近傍に捕捉される分子もあれば、離れている分子もある。これらすべてを互いに分離して検出するにはより細かな分解能で蛍光像を検出する必要があるが、光の回折限界による制約、有限な画素数などのため、通常０.１ミクロン相当が普通である。この場合でも捕捉されるＤＮＡ１分子を個別に１００％検出することはできず１０％程度は別のＤＮＡ分子と重なりを持ってしまう可能性がある。また１ＤＮＡ分子を検出するのに、カメラ上で平均１００画素必要であり、無駄がおおい。それに対して、ＤＮＡ１分子を均等間隔で配置する場合、本例のように２分割つまり０.５ミクロンの解像度で計測すると、１ＤＮＡ分子を検出するのに、カメラ上で平均４画素で十分であり、効率よい測定ができる。これは同時計測分子数を２５倍多くできることを意味し、測定の高スループット化が実現できる。または、同じ反応領域を測定する場合、画素数を少なくすることができ、ＣＣＤのコストを少なくすることができる。
【００３６】
また、本実施例の場合、集光レンズに必要なＮＡは０.６７程度となり、ドライ系のレンズの使用が可能になり、操作性がよくなるという効果もある。
【００３７】
上記では、ＤＮＡ１分子の配置間隔を２分割で測定した場合について説明したが、３分割でも同様の効果を得ることができる。さらには、１から５分割程度でほぼ同様の効果を得ることができる。
【００３８】
以下、実際の計測手順に従って配列決定法を説明する。モデル試料としてＭ１３−ＤＮＡ断片を使用した。末端を定法に従い、Ｍ１３−ＤＮＡ断片の末端をビオチン化する。ビオチン化ＤＮＡ溶液を図１の試料液容器２７ａに、Ｃｙ３で標識されたケージドｄＡＴＰ，ケージドｄＣＴＰ，ケージドｄＧＴＰ，ケージドｄＴＴＰ溶液（ポリメラーゼ含む）を容器２７ｂ，２７ｃ，２７ｄ，２７ｅに保持する。なお、Ｃｙ３で標識されたケージドｄＮＴＰはヌクレオチドに２−ニトロベンジル基を結合したケージド化合物であり、ポリメラーゼにより、相補鎖として取り込まれるが、相補鎖合成反応で連続的に取り込まれる活性が抑えられている。そのため、１塩基分伸長して反応がとまるが、ついで、３６０ｎｍ以下の紫外線を照射すると、ケージド物質（２−ニトロベンジル基）が遊離し、ヌクレオチド本来の活性が生じ、次のｄＮＴＰの合成を起こすことができる。
【００３９】
分注ユニット２５により、フローチャンバ内にテンプレートとなるビオチン化ＤＮＡを導入し、基板と反応させる。洗浄後、オリゴプライマーを導入してビオチン化ＤＮＡにプライマーをハイブリさせる。これにより相補鎖伸長反応を行う。まず洗浄後、Ｃｙ３標識ケージドｄＡＴＰ溶液を導入する。プライマー結合位置の次のテンプレートの塩基がＴのときにＣｙ３標識ケージドｄＡＴＰが取り込まれる。洗浄した後、レーザ光１ａ（ＹＡＧレーザ，５３２ｎｍ）を照射し、２次元センサカメラにて、蛍光測定を行う。蛍光の有無により、Ｃｙ３標識ケージドｄＡＴＰの取り込みが判断できる。ついで、洗浄の後、レーザ光２ａ（ＹＡＧレーザ，３５５ｎｍ）を照射し、ｄＡＴＰの活性を戻す。この手順をＣｙ３標識ケージドｄＣＴＰ，ケージドｄＧＴＰ，ケージドｄＴＴＰ溶液について行い、これを１サイクルとして、複数サイクル行うことで、塩基配列が決定できる。
【００４０】
ＤＮＡポリメラーゼの基質として鋳型ＤＮＡに取り込まれてＤＮＡ鎖伸長反応を保護基の存在により停止することができかつ検出され得る標識を持つ４種のｄＮＴＰの誘導体であり、なんらかの手段により該ｄＮＴＰ誘導体を伸長可能な状態に戻すことのできる試薬として本例では、蛍光標識ケージドｄＮＴＰを使用したが、蛍光体とヌクレオチドをジスルフィド結合により結合したｄＮＴＰの誘導体などでも同様に実施できる。この場合、蛍光体の存在で、伸長が停止し、Ｔｒｉｓ［2−carboxyethyl］phosphine試薬などでジスルフィド結合を化学的に解離させて伸長可能な状態に戻すことが可能である。
【実施例２】
【００４１】
実施例１では、領域８ｉｊの個々に単一分子のＤＮＡが入る構成であるが、図５のように、基板５０にＤＮＡ分子群５１同士が均一の間隔を有して配置する場合も同様に実現できる。
【実施例３】
【００４２】
反応基板の別の実施例を示す。本実施例での基板６０の構造を図６に示す。基板６０は、反応領域６０ａを有し、その内部にＤＮＡが固定される領域６０ｉｊが複数形成されており、さらに複数の６０ｉｊの周りを光学的に不透明なマスク６０ｂで覆う構造とする。
マスク材料としては、アルミニウム，クロムなどの金属，炭化シリコンなどが適用でき、蒸着などで、薄膜化する。領域６０ｉｊの個々の大きさは直径１００ｎｍ以下であり、この開口をマスク６０ｂのなかに作成する方法としては、プロジェクション法での蒸着（蒸着源と基板との間に適当なマスクを配置して蒸着する），電子ビームリソグラフィー，フォトリソグラフィーによる直接描画によって作成できる。
【００４３】
本例によっても、上記実施例１と同様の効果が得られる。また、反応領域６０ｉｊ以外はマスクされているため、不要な迷光，蛍光が低減でき、より高感度に測定することができるようになる。
【符号の説明】
【００４４】
１…レーザ装置（ＹＡＧレーザ，５３２ｎｍ）、１ａ…レーザ光１、２…レーザ装置（ＹＡＧレーザ，３５５ｎｍ）、２ａ…レーザ光、３，４…λ／４波長板、５…ミラー、６…ダイクロイックミラー、７…石英製プリズム、８，５０，６０…基板、８ａ…反応領域、８ｉｊ…ＤＮＡが固定される領域、９…フローチャンバ、１０…廃液チューブ、１１…廃液容器、１２…試薬導入口、１３…蛍光、１４…集光レンズ（対物レンズ）、１５…フィルタユニット、１６…透過光観察用鏡筒、１７…自動ズーム機構部、１８…結像レンズ、１９…２次元センサカメラ（高感度冷却ＣＣＤカメラ）、２０…２次元センサカメラコントローラ、２１…制御ＰＣ、２２，２４…モニタ、２３…ＴＶカメラ、２５…分注ユニット、２６…分注ノズル、２７…試薬保管ユニット、２７ａ…試料液容器、２７ｂ，２７ｃ，２７ｄ，２７ｅ…４種のｄＮＴＰ誘導体溶液容器、２７ｆ…洗浄液容器、２８…チップボックス、２９…自動ピントあわせ装置、３０，３１…位置きめマーカ、４０，４０ａ，４０ｂ，４０ｃ…ＤＮＡ一分子、４１…レンズ、４２…２次元センサカメラの画素、５１…ＤＮＡ分子群、６０ａ…反応領域、６０ｂ…マスク、６０ｉｊ…ＤＮＡが固定される領域、６１，６２，６３…位置きめマーカ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、画像検出方法に関する。例えば、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを平板状の複数の位置に捕捉し、その蛍光パターンを蛍光検出する方法または装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ，ＲＮＡ，蛋白質等の分析技術は遺伝子解析や遺伝子診断を含む医学，生物学などの分野で重要である。特に最近では、ＤＮＡマイクロアレイ（またはオリゴチップ，ＤＮＡチップ，バイオチップなど種々の名称で呼ばれるが、以下では、まとめてＤＮＡマイクロアレイとする）を使い、１つの検体から多種のＤＮＡ配列情報，遺伝子情報を同時に検査分析する方法及び装置が注目されている。ＤＮＡマイクロアレイは、ガラス等の基板を使用し、これを複数（数１００〜数千万個）の領域に分けて、各々に目的の（通常、種類の異なる）ＤＮＡプローブを固定化し、各々を微小な反応領域にしたものである。これと検体とを反応させることで、検体中の目的ＤＮＡが前記固定化されたＤＮＡプローブとハイブリダイズして捕捉され、さらに蛍光プローブなどを結合させることで、結合状態（位置すなわちハイブリダイズした配列）とその量を蛍光強度等で測定する事が可能になり、遺伝子診断，シーケンス等に利用することができる。
【０００３】
このＤＮＡマイクロアレイの蛍光強度の読み取りは、通常スキャナーと呼ばれる顕微鏡（共焦点蛍光顕微鏡）に類似する装置が使用される（たとえば特許文献１，２）。この装置は、アレイ上にレーザ光などの励起光を１個の微小スポットにして照射し、生じる蛍光を干渉フィルタなどの分光素子を使って励起光と分離し、蛍光強度を光電子増倍管などの光検出器にて検出する。その際、ガルバノミラーなどを使ってアレイ上に形成される微小スポットを２次元的に走査したり、または、微小スポットの位置を固定し、アレイを２次元的に走査したりすることで、アレイ全体の蛍光強度分布、つまりは各ＤＮＡプローブに対する結合の度合を知ることができる。ＤＮＡマイクロアレイの蛍光強度の読み取り法として、上記のようなビームスキャン以外に、アレイの領域に励起光を広く照射し、生じる蛍光像を２次元カメラにて検出する方法（たとえば特許文献３，４）もある。これらの方法では、ＤＮＡプローブを固定化した複数の領域を蛍光検出するに当たり、領域を数十分割して計測しており、また領域間もそれ以上に分割して計測している。これにより、複数の反応領域の位置がずれても分離して検出することができる。しかし、測定すべき領域数に比べ、２次元センサの必要な画素数は数１００倍以上要することになる。
【０００４】
また、ＤＮＡ，ＲＮＡの塩基配列決定法も重要な技術である。通常は、予め配列決定用のＤＮＡ断片又は断片群に蛍光標識した試料を調製し、電気泳動した後又は電気泳動中に分子量分離展開パターンを計測し解析する。具体的には、電気泳動分離に先立ち、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行する。分析すべき試料ＤＮＡの既知の塩基配列部分と相補的な約２０塩基長のオリゴヌクレオチドを合成し蛍光体を標識する。このオリゴヌクレオチドをプライマーとし、約１ピコモルの試料ＤＮＡと相補鎖結合させて、ポリメラーゼにより相補鎖伸長反応を実行する。このとき基質として、４種のデオキシヌクレオチド３リン酸、即ち、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ、及びこれらに加えて例えば、ｄｄＡＴＰを加える。ｄｄＡＴＰが相補鎖伸長で取り込まれると、それ以上相補鎖が伸長しないため、アデニン（Ａ）で終結する様々な長さの断片が調製される。上記反応でｄｄＡＴＰの代わりに、ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰ，ｄｄＴＴＰを各々加えた反応を行う。但し、各反応で用いるプライマーは、塩基配列は同じであるが、蛍光を分光して互いに識別できる４種の蛍光体で標識する。以上の４種の反応物を混合すると、試料ＤＮＡに相補的な数１００塩基長までの１塩基ずつ長さが異なる断片が、末端の塩基種に応じて異なる４種の蛍光体で標識されて得られる。これをキャピラリーゲル電気泳動により１塩基の分解能で分離する。試料は分離されながら泳動し、短いものから順にレーザ照射される。発光蛍光を複数のフィルタを用いて分光しながら計測すると、４種の蛍光体の蛍光強度の時間変化から、全ての断片の末端塩基種を短い断片から順に決定できるというものである。
【０００５】
近年、非特許文献１にあるように、基板にＤＮＡなどを固定してその塩基配列を決定することが提案されている。基板表面にランダムに分析すべき試料ＤＮＡ断片を１分子ずつ捕捉し、ほぼ１塩基ずつ伸長させて、その結果を蛍光計測より検出することにより塩基配列を決定するものである。具体的には、ＤＮＡポリメラーゼの基質として鋳型ＤＮＡに取り込まれてＤＮＡ鎖伸長反応を保護基の存在により停止することができかつ検出され得る標識を持つ４種のｄＮＴＰの誘導体（ＭｄＮＴＰ）を用いてＤＮＡポリメラーゼ反応を行わせる工程、次いで取り込まれたＭｄＮＴＰを蛍光等で検出する工程、及びＭｄＮＴＰを伸長可能な状態に戻す工程を１サイクルとし、それを繰り返すことにより試料ＤＮＡの塩基配列を決定する。本技術では、ＤＮＡ断片を１分子ずつ配列決定することができるため、同時に数多くの断片を解析することができ、解析スループットを大きくすることができる。また、本方式では、単一ＤＮＡ分子毎に塩基配列が決定できる可能性があるため、従来技術の問題であったクローニングやＰＣＲ等での試料ＤＮＡを精製，増幅が不要にできる可能性があり、ゲノム解析や遺伝子診断の迅速化が期待できる。なお、本方法では、分析すべき試料ＤＮＡ断片分子が基板面にランダムに固定されるため、捕捉されたＤＮＡ断片分子数に対して数１００倍の画素数を有する高価なカメラが必要となる。つまり、ＤＮＡ断片分子同士の間隔が平均１ミクロンになるように調整した場合、より大きな間隔同士の分子もいれば、より近接した間隔の分子同士も存在し、これらを互いに分離して検出するには、基板面に換算して、より細かな間隔で蛍光像を検出する必要がある。通常、数１０分の１の間隔で計測する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表平９−５０３３０８号公報
【特許文献２】特開２０００−６９９９８号公報
【特許文献３】特開２００２−１８１７０８号公報
【特許文献４】特開２００１−２５５３２８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.100(7), pp3960, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述の光学系においては、基板上に捕捉する領域数つまり、ＤＮＡ断片の分子数に対して、数１００倍以上の画素数が必要であり、検出速度の低下、高価な２次元センサが必要になるという問題点があった。さらに、また、より高解像度で蛍光像を検出しなければならないため、開口数ＮＡの大きな集光レンズを使う必要があり、高価な系になるという問題点があった。
【０００９】
本発明の目的は、少ない画素数で効率よく画像を検出する方法に関する。例えば、基板上に捕捉するＤＮＡ断片の分子からの蛍光像を２次元センサにて蛍光検出する際、少ない画素数で、効率よく検出する方法を提供することに関する。また、例えば基板上に捕捉するＤＮＡ断片の分子からの蛍光像を２次元センサにて蛍光検出する際、安価に、または操作性の良い検出方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、例えば本発明は、複数の測定対象物を精密配置し、複数の検出画素を備えた検出器の特定画素に各測定対象物をそれぞれ結像させることに関する。オリゴヌクレオチドが固定される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光・結像し、２次元センサにて蛍光検出する方法であって、該基板のオリゴヌクレオチドが固定される領域が複数設けられ、それらが基板上に、縦横にほぼ等間隔（間隔ｄｓ）で配置され、集光・結像光学系の結像倍率をＭ、２次元センサの画素の間隔をｄｄとしたとき、
ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎ （ｎ＝１，２，３，４，５：整数）
であるようにして蛍光像を検出することに関する。
【００１１】
または、例えばオリゴヌクレオチドが固定される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光・結像し、２次元センサにて蛍光検出する方法であって、該基板のオリゴヌクレオチドが固定される領域は複数設けられ、それらが基板上に、縦横にほぼ等間隔(間隔ｄｓ)で配置され、該領域には単一分子のオリゴヌクレオチドが固定され、集光・結像光学系の結像倍率がＭ、２次元センサの画素の間隔がｄｄとしたとき、
ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎ （ｎ＝１，２，３，４，５：整数）
であるようにして蛍光像を検出する。
【００１２】
より好ましくは、上記関係式で、
ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎ （ｎ＝２，３）
であるように調整して蛍光像を検出することに関する。
【００１３】
好ましくは、オリゴヌクレオチドが固定される領域の間隔ｄｓは、１００ｎｍから１００００ｎｍであり、より好ましくは、５００ｎｍから１５００ｎｍにする。
【００１４】
好ましくは、オリゴヌクレオチドが固定される領域の大きさは１００ｎｍ径以下にする。
【００１５】
また、好ましくは、上記基板の表面は、複数設けられるオリゴヌクレオチドが固定される領域を除く基板上の反応領域には、光学的な遮光機能を有する膜状物質を施すことがより有効であり、金属膜などを蒸着などによって形成させる。
【００１６】
また、好ましくは、ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎとなるように、結像倍率Ｍを調整する機構部を有し、また該基板には、位置決め用のマーカが少なくとも２箇所にあり、位置決め用のマーカを検出し、結像倍率Ｍを自動で調整する機能部を有する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、例えば、測定すべきオリゴヌクレオチドが固定される領域に対して、必要な２次元センサの画素数は、測定精度を損なわずに、従来の数１００倍から、３０倍以下、さらには、１０倍以下と少なくすることができ、効率よく検出することができる。そのため、同じ２次元センサを使う場合、一時により多くの領域からの蛍光像を得ることができ、高スループットが達成できる。また、少ない画素数のカメラを使う場合には、より、安価に測定できることになる。
【００１８】
また、本発明により、例えば、測定対象分子数が同じ場合、少ない画素数で、効率よく検出でき、２次元センサの価格を安価することができるようになる。また、光学分解能をオリゴヌクレオチドが固定される領域同士の間隔程度にすることができるため、大きな開口数の集光レンズを使う必要が無くなり、安価なレンズを使用することができ、液浸レンズも使う必要が無いので、操作性が向上できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１における、蛍光分析方法を使ったＤＮＡ検査装置の構成図である。
【図２】実施例１における、基板の構造説明図である。
【図３】実施例１における、基板と２次元センサの結像対応説明図である。
【図４】実施例１における、効果の説明図である。
【図５】実施例２における、基板の構造説明図である。
【図６】実施例３における、基板の構造説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を実施の形態例により説明するが、本発明は本例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
基板表面に分析すべき試料ＤＮＡ断片を１分子ずつ均等間隔で捕捉し、ほぼ１塩基ずつ伸長させて、取り込まれた蛍光標識を１分子ごと検出して塩基配列を決定する装置、方法について説明する。具体的には、ＤＮＡポリメラーゼの基質として鋳型ＤＮＡに取り込まれてＤＮＡ鎖伸長反応を保護基の存在により停止することができかつ検出され得る標識を持つ４種のｄＮＴＰの誘導体を用いてＤＮＡポリメラーゼ反応を行わせる工程、次いで取り込まれたｄＮＴＰ誘導体を蛍光等で検出する工程、及びｄＮＴＰ誘導体を伸長可能な状態に戻す工程を１サイクルとし、それを繰り返すことにより試料ＤＮＡの塩基配列を決定する。なお、本操作は単分子蛍光検出法に基づくため、測定はＨＥＰＡフィルタを介したクリーンルーム様の環境にて行う。
【００２２】
図１は、本発明の蛍光分析方法を使ったＤＮＡ検査装置の構成図である。装置は正立型の顕微鏡に類似する装置の構成であり、基板８に捕捉するＤＮＡ分子の伸長状態を蛍光検出にて測定する。なお倒立型の顕微鏡に類似する装置の構成にすることも可能である。
【００２３】
基板８は、図２に示すような構造をしている。基板８は透明材質でできており、材質としては合成石英などが使用できる。基板８には反応領域８ａがあり、この部分に試薬などが接触する。反応領域８ａ内にＤＮＡが固定される領域８ｉｊが複数形成されている。領域８ｉｊの個々の大きさは直径１００ｎｍ以下である。この領域にはＤＮＡを捕捉するための表面処理を施す。その表面処理は、例えば、ストレプトアビジンを結合させておき、ビオチンしたＤＮＡ断片を反応させることで、捕捉する。また、ポリＴのオリゴヌクレオチドを固定化しておき、ＤＮＡ断片の一端をポリＡ化処理して、ハイブリ反応にて捕捉することもできる。この際、ＤＮＡ断片濃度を適当に調製することで、個々の領域８ｉｊに単一分子のＤＮＡのみが入るようにすることができる。なお、領域８ｉｊをより小さくしていくことで、領域内に捕捉できる分子が１個になるようにすることも可能である。以後このような状態の基板を計測する。なお、領域８ｉｊ同士の間隔ｄｓは１ミクロンとした。このような、均等間隔の基板の作成法は、例えば、特開２００２−２１４１４２号公報に記載の手法などで、作成する。なお、ｄｓは領域８ｉｊの個々の大きさより大きく、１５００ｎｍ程度以下が好ましい。基板の反応領域８ａは１mm×１mmの大きさで、領域８ｉｊの位置は１０００×１０００＝１００００００個である。
【００２４】
ｄＮＴＰの蛍光標識としてＣｙ３を用いる。蛍光体はＣｙ３にかぎるものではなく、ほかの種々の蛍光体を使用することが可能である。また、異なる蛍光体で標識された４種のｄＮＴＰを使うことも可能であるが、本例では１蛍光体での測定を行う。蛍光励起用のレーザ装置１（ＹＡＧレーザ，５３２ｎｍ）からのレーザ光１ａをλ／４波長板３を通して円偏光とし、ミラー５，ダイクロイックミラー６，ミラー５を介して全反射照明用の石英製プリズム７に入射し、ＤＮＡ分子を均等間隔に捕捉した基板８の裏側から照射する。石英製プリズム７と基板８は無蛍光グリセリンを介して接触させており、レーザ光はその界面で反射することなく、基板８に導入される。基板内でのレーザ光の入射角は約６６度〜６８度で基板８表面で全反射し、エバネッセント照明となる。これにより、高いＳ／Ｎで蛍光測定が可能になる。レーザの照射領域は約２mm径とした。
【００２５】
なお、基板の近傍には、温調器が配置されているが、図では省略した。また、通常観察のため、プリズム下部よりハロゲン照明ができる構造としているが、図ではこれを省略している。
【００２６】
また、レーザ１とは別にレーザ装置２（ＹＡＧレーザ，３５５ｎｍ）を配置し、レーザ光１ａと同軸にして照射できるようにした。本レーザは、取り込まれたｄＮＴＰ誘導体の蛍光検出後、ｄＮＴＰ誘導体を伸長可能な状態に戻す工程に使用するものである。
【００２７】
基板８の上部には、試薬などをながし、反応させるためのフローチャンバ９が構成されている。チャンバには試薬導入口１２があり、分注ノズル２６を有する分注ユニット２５，試薬保管ユニット２７，チップボックス２８により、目的の試薬液の注入などを行う。
試薬保管ユニット２７には、試料液容器２７ａ，４種のｄＮＴＰ誘導体溶液容器２７ｂ，２７ｃ，２７ｄ，２７ｅ及び洗浄液容器２７ｆ等が用意される。チップボックス２８内の分注チップを分注ノズル２６に取り付け、適当な試薬液を吸引し、チャンバ導入口から基板の反応領域に導入し、反応させる。廃液は廃液チューブ１０を介して廃液容器１１に排出される。これらは制御ＰＣ２１により自動的に行われる。
【００２８】
フローチャンバは光軸方向に透明材で形成され、蛍光検出される。蛍光１３は、自動ピントあわせ装置２９で制御される集光レンズ（対物レンズ）１４で集められ、フィルタユニット１５で必要な波長の蛍光を取り出し、自動ズーム機構部１７，結像レンズ１８で、２次元センサカメラ１９（高感度冷却ＣＣＤカメラ）で蛍光像を検出する。カメラの露光時間の設定，蛍光画像の取り込みのタイミングなどの制御は、２次元センサカメラコントローラ２０を介して制御ＰＣ２１が行う。４種のｄＮＴＰを使う場合は、フィルタユニット１５で該当する４種の蛍光体用のフィルタを時分割で切り替えて蛍光像を検出することなどで対応できる。
【００２９】
なお、装置は、調整などのため、透過光観察用鏡筒１６とＴＶカメラ２３とモニタ２４を備えており、ハロゲン照明などで基板８の状態をリアルタイムで観察できるようになっている。
【００３０】
図２にあるように、基板８には位置きめマーカ３０，３１が刻印されている。マーカ３０，３１は領域８ｉｊの並びと平行に配置され、その間隔が規定されている。そこで、透過照明での観測でマーカを検出することで、領域８ｉｊの位置を計算することができ、自動ズーム機構部１７を制御して指定の倍率になるようにする。本例の場合は、画素間隔（画素サイズ）ｄｄが７.４ミクロンの２次元センサカメラ１９（高感度冷却ＣＣＤカメラ）を使用している。結像系の倍率Ｍを１４.８倍に設定することで、基板８上の領域８ｉｊ同士の間隔を２分割して計測する。
【００３１】
本実施例で使用する２次元センサカメラとして、ＣＣＤエリアセンサを使用した。画素サイズが７.４×７.４ミクロンで、画素数２０４８×２０４８画素の冷却ＣＣＤカメラを使用する。基板の反応領域８ａの大きさが１mm×１mmの大きさで、その中に１ミクロン間
隔で１０００×１０００個の領域８ｉｊがあり、上記２０４８×２０４８画素の冷却ＣＣＤカメラで計測するため、結像系の倍率Ｍを１４.８倍に設定し、反応領域換算でカメラ１画素は０.５×０.５ミクロンに対応させる。なお、２次元センサカメラとしては、ＣＣＤエリアセンサの他、Ｃ−ＭＯＳエリアセンサなどの撮像カメラなどを一般に使うことができる。ＣＣＤエリアセンサにも、構造によって、背面照射型，正面照射型があり、どちらも使用できる。また、素子内部に信号の増倍機能を有する電子増倍型ＣＣＤカメラなども高感度化を図る上で有効である。また、センサは冷却型が望ましく、−２０℃程度以下にすることで、センサの持つダークノイズを低減出来、測定の精度を高めることができる。
【００３２】
本例では、反応領域８ａからの蛍光像を一度に検出するが、分割することもできる。反応領域８ａの大きさをより広くして、例えば５mm×５mmにすると、一度の画像計測ではすべての領域をカバーできないので、１mm×１mm毎に分割して計測して複数の画像を再構成して全体の蛍光像を測定することになる。この場合、基板の位置を移動させるためのＸ−Ｙ移動機構部をステージ下部に配置し、制御ＰＣで照射位置への移動，光照射，蛍光像検出を制御する。本例ではＸ−Ｙ移動機構部は図示していない。
【００３３】
種々のカメラが使用できるが、画素サイズが６.４５×６.４５ミクロンで画素数１３９２×１０４０画素の冷却ＣＣＤカメラなら結像系の倍率は１２.９倍を、画素サイズが９×９ミクロンで画素数４００８×２６７２画素のカメラなら結像系の倍率は１８倍を、画素サイズが１６×１６ミクロンで画素数５１２×５１２画素のカメラなら結像系の倍率は３２倍に調整して測定する。
【００３４】
図３に本例での基板と２次元センサの結像対応説明図を示す。基板８上にＤＮＡ一分子４０（４０ａ，４０ｂ，４０ｃ）が間隔１ミクロンで碁盤の目状に捕捉されるものと考える。実際は必ずしもすべての位置にＤＮＡ分子が捕捉されるとは限らないが、その場合でも同じ効果が得られるので、本状態で説明する。レンズ４１を介して２次元センサカメラ（高感度冷却ＣＣＤカメラ）の画素４２上に結像させる。図では簡単のため、結像倍率を１倍、２次元センサカメラの画素間隔を１／１４.８倍にして表示した（基板上の寸法で規格化した）。ＤＮＡ一分子４０ａ，４０ｂ，４０ｃが画素４２ｆ，４２ｄ，４２ｂに対応し、１画素おきに蛍光検出できることになる。この結果、レンズ収差，結像ボケなどによるＤＮＡ一分子４０ａ，４０ｂ，４０ｃ同士の蛍光の重なりの影響が少なく、また、ＤＮＡ一分子の捕捉される位置が＋−１０％程度ずれても蛍光測定への影響が少なく、安定な計測を行うことができる。
【００３５】
図６に、効果の説明図を示した。従来のようにＤＮＡ分子をランダムに捕捉する場合、捕捉間隔の平均が１ミクロンであっても、確率的に極近傍に捕捉される分子もあれば、離れている分子もある。これらすべてを互いに分離して検出するにはより細かな分解能で蛍光像を検出する必要があるが、光の回折限界による制約、有限な画素数などのため、通常０.１ミクロン相当が普通である。この場合でも捕捉されるＤＮＡ１分子を個別に１００％検出することはできず１０％程度は別のＤＮＡ分子と重なりを持ってしまう可能性がある。また１ＤＮＡ分子を検出するのに、カメラ上で平均１００画素必要であり、無駄がおおい。それに対して、ＤＮＡ１分子を均等間隔で配置する場合、本例のように２分割つまり０.５ミクロンの解像度で計測すると、１ＤＮＡ分子を検出するのに、カメラ上で平均４画素で十分であり、効率よい測定ができる。これは同時計測分子数を２５倍多くできることを意味し、測定の高スループット化が実現できる。または、同じ反応領域を測定する場合、画素数を少なくすることができ、ＣＣＤのコストを少なくすることができる。
【００３６】
また、本実施例の場合、集光レンズに必要なＮＡは０.６７程度となり、ドライ系のレンズの使用が可能になり、操作性がよくなるという効果もある。
【００３７】
上記では、ＤＮＡ１分子の配置間隔を２分割で測定した場合について説明したが、３分割でも同様の効果を得ることができる。さらには、１から５分割程度でほぼ同様の効果を得ることができる。
【００３８】
以下、実際の計測手順に従って配列決定法を説明する。モデル試料としてＭ１３−ＤＮＡ断片を使用した。末端を定法に従い、Ｍ１３−ＤＮＡ断片の末端をビオチン化する。ビオチン化ＤＮＡ溶液を図１の試料液容器２７ａに、Ｃｙ３で標識されたケージドｄＡＴＰ，ケージドｄＣＴＰ，ケージドｄＧＴＰ，ケージドｄＴＴＰ溶液（ポリメラーゼ含む）を容器２７ｂ，２７ｃ，２７ｄ，２７ｅに保持する。なお、Ｃｙ３で標識されたケージドｄＮＴＰはヌクレオチドに２−ニトロベンジル基を結合したケージド化合物であり、ポリメラーゼにより、相補鎖として取り込まれるが、相補鎖合成反応で連続的に取り込まれる活性が抑えられている。そのため、１塩基分伸長して反応がとまるが、ついで、３６０ｎｍ以下の紫外線を照射すると、ケージド物質（２−ニトロベンジル基）が遊離し、ヌクレオチド本来の活性が生じ、次のｄＮＴＰの合成を起こすことができる。
【００３９】
分注ユニット２５により、フローチャンバ内にテンプレートとなるビオチン化ＤＮＡを導入し、基板と反応させる。洗浄後、オリゴプライマーを導入してビオチン化ＤＮＡにプライマーをハイブリさせる。これにより相補鎖伸長反応を行う。まず洗浄後、Ｃｙ３標識ケージドｄＡＴＰ溶液を導入する。プライマー結合位置の次のテンプレートの塩基がＴのときにＣｙ３標識ケージドｄＡＴＰが取り込まれる。洗浄した後、レーザ光１ａ（ＹＡＧレーザ，５３２ｎｍ）を照射し、２次元センサカメラにて、蛍光測定を行う。蛍光の有無により、Ｃｙ３標識ケージドｄＡＴＰの取り込みが判断できる。ついで、洗浄の後、レーザ光２ａ（ＹＡＧレーザ，３５５ｎｍ）を照射し、ｄＡＴＰの活性を戻す。この手順をＣｙ３標識ケージドｄＣＴＰ，ケージドｄＧＴＰ，ケージドｄＴＴＰ溶液について行い、これを１サイクルとして、複数サイクル行うことで、塩基配列が決定できる。
【００４０】
ＤＮＡポリメラーゼの基質として鋳型ＤＮＡに取り込まれてＤＮＡ鎖伸長反応を保護基の存在により停止することができかつ検出され得る標識を持つ４種のｄＮＴＰの誘導体であり、なんらかの手段により該ｄＮＴＰ誘導体を伸長可能な状態に戻すことのできる試薬として本例では、蛍光標識ケージドｄＮＴＰを使用したが、蛍光体とヌクレオチドをジスルフィド結合により結合したｄＮＴＰの誘導体などでも同様に実施できる。この場合、蛍光体の存在で、伸長が停止し、Ｔｒｉｓ［2−carboxyethyl］phosphine試薬などでジスルフィド結合を化学的に解離させて伸長可能な状態に戻すことが可能である。
【実施例２】
【００４１】
実施例１では、領域８ｉｊの個々に単一分子のＤＮＡが入る構成であるが、図５のように、基板５０にＤＮＡ分子群５１同士が均一の間隔を有して配置する場合も同様に実現できる。
【実施例３】
【００４２】
反応基板の別の実施例を示す。本実施例での基板６０の構造を図６に示す。基板６０は、反応領域６０ａを有し、その内部にＤＮＡが固定される領域６０ｉｊが複数形成されており、さらに複数の６０ｉｊの周りを光学的に不透明なマスク６０ｂで覆う構造とする。
マスク材料としては、アルミニウム，クロムなどの金属，炭化シリコンなどが適用でき、蒸着などで、薄膜化する。領域６０ｉｊの個々の大きさは直径１００ｎｍ以下であり、この開口をマスク６０ｂのなかに作成する方法としては、プロジェクション法での蒸着（蒸着源と基板との間に適当なマスクを配置して蒸着する），電子ビームリソグラフィー，フォトリソグラフィーによる直接描画によって作成できる。
【００４３】
本例によっても、上記実施例１と同様の効果が得られる。また、反応領域６０ｉｊ以外はマスクされているため、不要な迷光，蛍光が低減でき、より高感度に測定することができるようになる。
【符号の説明】
【００４４】
１…レーザ装置（ＹＡＧレーザ，５３２ｎｍ）、１ａ…レーザ光１、２…レーザ装置（ＹＡＧレーザ，３５５ｎｍ）、２ａ…レーザ光、３，４…λ／４波長板、５…ミラー、６…ダイクロイックミラー、７…石英製プリズム、８，５０，６０…基板、８ａ…反応領域、８ｉｊ…ＤＮＡが固定される領域、９…フローチャンバ、１０…廃液チューブ、１１…廃液容器、１２…試薬導入口、１３…蛍光、１４…集光レンズ（対物レンズ）、１５…フィルタユニット、１６…透過光観察用鏡筒、１７…自動ズーム機構部、１８…結像レンズ、１９…２次元センサカメラ（高感度冷却ＣＣＤカメラ）、２０…２次元センサカメラコントローラ、２１…制御ＰＣ、２２，２４…モニタ、２３…ＴＶカメラ、２５…分注ユニット、２６…分注ノズル、２７…試薬保管ユニット、２７ａ…試料液容器、２７ｂ，２７ｃ，２７ｄ，２７ｅ…４種のｄＮＴＰ誘導体溶液容器、２７ｆ…洗浄液容器、２８…チップボックス、２９…自動ピントあわせ装置、３０，３１…位置きめマーカ、４０，４０ａ，４０ｂ，４０ｃ…ＤＮＡ一分子、４１…レンズ、４２…２次元センサカメラの画素、５１…ＤＮＡ分子群、６０ａ…反応領域、６０ｂ…マスク、６０ｉｊ…ＤＮＡが固定される領域、６１，６２，６３…位置きめマーカ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドが固定される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光・結像し、２次元センサにて蛍光検出する方法であって、該基板のオリゴヌクレオチドが固定される領域は複数設けられ、それらが基板上に、縦横にほぼ等間隔（間隔ｄｓ）で配置され、集光・結像光学系の結像倍率がＭ、２次元センサの画素の間隔がｄｄとしたとき、 ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎ （ｎ＝１，２，３，４，５：整数）
であることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドが固定される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光・結像し、２次元センサにて蛍光検出する方法であって、該基板のオリゴヌクレオチドが固定される領域は複数設けられ、それらが基板上に、縦横にほぼ等間隔（間隔ｄｓ）で配置され、該領域には単一分子のオリゴヌクレオチドが固定され、集光・結像光学系の結像倍率がＭ、２次元センサの画素の間隔がｄｄとしたとき、
ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎ （ｎ＝１，２，３，４，５：整数）
であることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項３】
請求項１または２のいずれか記載の蛍光分析方法において、
ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎ （ｎ＝２，３）
であることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか記載の蛍光分析方法において、オリゴヌクレオチドが固定される領域の間隔ｄｓは、１００ｎｍから１００００ｎｍであることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか記載の蛍光分析方法において、オリゴヌクレオチドが固定される領域の大きさは１００ｎｍ径以下であることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項６】
請求項１または２のいずれか記載の蛍光分析方法において、複数設けられるオリゴヌクレオチドが固定される領域を除く基板上の反応領域には、光学的な遮光機能を有する膜状物質が施されていることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項７】
請求項６記載の蛍光分析方法において、膜状物質は金属膜であることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項８】
請求項１または２のいずれか記載の蛍光分析方法において、該基板には、位置決め用のマーカが少なくとも２箇所にあることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項９】
請求項１から５のいずれか記載の蛍光分析方法において、ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎとなるように、結像倍率Ｍを調整する手段を有することを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項１０】
請求項９記載の蛍光分析方法において、該ズーム機能は、位置決め用のマーカの検出に基づき、自動で行う手段を有することを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドが固定される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光・結像し、２次元センサにて蛍光検出する装置であって、オリゴヌクレオチドが固定される複数領域が縦横にほぼ等間隔（間隔ｄｓ）で配置されている基板と、蛍光励起用の照射光源と照射光学系，蛍光集光結像光学系，２次元センサを具備し、集光・結像光学系の結像倍率がＭ、２次元センサの画素の間隔がｄｄとしたとき、
ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎ （ｎ＝１，２，３，４，５：整数）
となるように構成されたことを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドが固定される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光・結像し、２次元センサにて蛍光検出する装置であって、オリゴヌクレオチドが固定される複数領域が縦横にほぼ等間隔（間隔ｄｓ）で配置されている基板と、蛍光励起用の照射光源と照射光学系，蛍光集光結像光学系，２次元センサを具備し、集光・結像光学系の結像倍率がＭ、２次元センサの画素の間隔がｄｄとしたとき、
ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎ （ｎ＝２，３：整数）
となるように構成されたことを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドが固定される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光・結像し、２次元センサにて蛍光検出する装置であって、オリゴヌクレオチドが固定される複数領域が縦横にほぼ等間隔（間隔ｄｓ）で配置されている基板と、蛍光励起用の照射光源と照射光学系，蛍光集光結像光学系，２次元センサを具備し、集光・結像光学系の結像倍率がＭ、２次元センサの画素の間隔がｄｄとしたとき、
ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎ （ｎ＝１，２，３，４，５：整数）
となるように結像倍率を自動調整する機構部を有することを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１４】
所定位置に配置された複数の検出対象物を複数の検出画素を備えた検出器により検出する画像検出方法であって、
検出器の特定画素に各検出対象物をそれぞれ結像させることを特徴とする方法。
【請求項１】
オリゴヌクレオチドが固定される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光・結像し、２次元センサにて蛍光検出する方法であって、該基板のオリゴヌクレオチドが固定される領域は複数設けられ、それらが基板上に、縦横にほぼ等間隔（間隔ｄｓ）で配置され、集光・結像光学系の結像倍率がＭ、２次元センサの画素の間隔がｄｄとしたとき、 ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎ （ｎ＝１，２，３，４，５：整数）
であることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドが固定される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光・結像し、２次元センサにて蛍光検出する方法であって、該基板のオリゴヌクレオチドが固定される領域は複数設けられ、それらが基板上に、縦横にほぼ等間隔（間隔ｄｓ）で配置され、該領域には単一分子のオリゴヌクレオチドが固定され、集光・結像光学系の結像倍率がＭ、２次元センサの画素の間隔がｄｄとしたとき、
ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎ （ｎ＝１，２，３，４，５：整数）
であることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項３】
請求項１または２のいずれか記載の蛍光分析方法において、
ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎ （ｎ＝２，３）
であることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか記載の蛍光分析方法において、オリゴヌクレオチドが固定される領域の間隔ｄｓは、１００ｎｍから１００００ｎｍであることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか記載の蛍光分析方法において、オリゴヌクレオチドが固定される領域の大きさは１００ｎｍ径以下であることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項６】
請求項１または２のいずれか記載の蛍光分析方法において、複数設けられるオリゴヌクレオチドが固定される領域を除く基板上の反応領域には、光学的な遮光機能を有する膜状物質が施されていることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項７】
請求項６記載の蛍光分析方法において、膜状物質は金属膜であることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項８】
請求項１または２のいずれか記載の蛍光分析方法において、該基板には、位置決め用のマーカが少なくとも２箇所にあることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項９】
請求項１から５のいずれか記載の蛍光分析方法において、ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎとなるように、結像倍率Ｍを調整する手段を有することを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項１０】
請求項９記載の蛍光分析方法において、該ズーム機能は、位置決め用のマーカの検出に基づき、自動で行う手段を有することを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドが固定される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光・結像し、２次元センサにて蛍光検出する装置であって、オリゴヌクレオチドが固定される複数領域が縦横にほぼ等間隔（間隔ｄｓ）で配置されている基板と、蛍光励起用の照射光源と照射光学系，蛍光集光結像光学系，２次元センサを具備し、集光・結像光学系の結像倍率がＭ、２次元センサの画素の間隔がｄｄとしたとき、
ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎ （ｎ＝１，２，３，４，５：整数）
となるように構成されたことを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドが固定される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光・結像し、２次元センサにて蛍光検出する装置であって、オリゴヌクレオチドが固定される複数領域が縦横にほぼ等間隔（間隔ｄｓ）で配置されている基板と、蛍光励起用の照射光源と照射光学系，蛍光集光結像光学系，２次元センサを具備し、集光・結像光学系の結像倍率がＭ、２次元センサの画素の間隔がｄｄとしたとき、
ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎ （ｎ＝２，３：整数）
となるように構成されたことを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドが固定される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光・結像し、２次元センサにて蛍光検出する装置であって、オリゴヌクレオチドが固定される複数領域が縦横にほぼ等間隔（間隔ｄｓ）で配置されている基板と、蛍光励起用の照射光源と照射光学系，蛍光集光結像光学系，２次元センサを具備し、集光・結像光学系の結像倍率がＭ、２次元センサの画素の間隔がｄｄとしたとき、
ｄｄ＝ｄｓ×Ｍ／ｎ （ｎ＝１，２，３，４，５：整数）
となるように結像倍率を自動調整する機構部を有することを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１４】
所定位置に配置された複数の検出対象物を複数の検出画素を備えた検出器により検出する画像検出方法であって、
検出器の特定画素に各検出対象物をそれぞれ結像させることを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−１８０７４０（Ｐ２００９−１８０７４０Ａ）
【公開日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１４１１６（Ｐ２００９−１１４１１６）
【出願日】平成２１年５月１１日（２００９．５．１１）
【分割の表示】特願２００６−１５０８８３（Ｐ２００６−１５０８８３）の分割
【原出願日】平成１８年５月３１日（２００６．５．３１）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月１１日（２００９．５．１１）
【分割の表示】特願２００６−１５０８８３（Ｐ２００６−１５０８８３）の分割
【原出願日】平成１８年５月３１日（２００６．５．３１）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
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