血管内皮機能改善組成物
【課題】血管内皮細胞のＮＯ産生を促進し、血管内皮機能を改善する組成物を提供すること。
【解決手段】大豆に、麹菌培養物を添加、混合し、２５〜５５℃で、１２〜１６８時間反応させることにより、血管内皮機能を改善する組成物を得る。さらに、前記組成物を、分画分子量３０００の限外濾過膜、逆相系のＣ１８カラムクロマトグラフィーや陽イオン交換クロマトグラフィーなどで分離・精製することにより、有効成分が濃縮され、組成物の血管内皮機能改善効果が高まった血管内皮機能を改善する組成物を得る。
【解決手段】大豆に、麹菌培養物を添加、混合し、２５〜５５℃で、１２〜１６８時間反応させることにより、血管内皮機能を改善する組成物を得る。さらに、前記組成物を、分画分子量３０００の限外濾過膜、逆相系のＣ１８カラムクロマトグラフィーや陽イオン交換クロマトグラフィーなどで分離・精製することにより、有効成分が濃縮され、組成物の血管内皮機能改善効果が高まった血管内皮機能を改善する組成物を得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大豆に麹菌培養物を添加、混合して一定条件で得られる血管内皮機能改善組成物に関する。詳しくは、血管内皮細胞の一酸化窒素（以下、ＮＯという）産生を促進して血管内皮機能を改善する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮細胞由来のＮＯは、血管弛緩作用、血小板凝集抑制作用、抗血栓形成作用、抗増殖作用、抗炎症作用、抗酸化ストレス作用などの血管のホメオスタシス維持に関わる様々な生理活性作用を有している。高脂血症、高血圧、糖尿病、喫煙、老化などの危険因子により、血管内皮機能障害が生じ、それに伴うＮＯ産生低下による血管のリモデリング（動脈硬化）が進展し、虚血性心疾患（狭心症、心筋梗塞）や脳卒中などの原因となる（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
多くの心血管疾患では、血管内皮細胞機能不全の状態となるＮＯ産生異常が深く関わっており、その治療には血管内皮細胞におけるＮＯ産生を改善する方法が考えられている。その方法としては、硝酸薬（ＮＯドナー）投与、L-Arginine（ＮＯ合成酵素の基質）投与、ＮＯ合成酵素遺伝子の導入などが挙げられる。しかしながら、硝酸薬の長期投与に関しては、心筋梗塞（主な原因が動脈硬化）を対象とした臨床試験において、予防効果は立証されていない（例えば、非特許文献２参照）。また、L-Arginine投与は、高脂血症患者の血管内皮依存性弛緩反応を改善することが知られているが、成長ホルモン分泌刺激作用など目的と異なる生体反応を引き起こすことが問題となる（例えば、非特許文献３参照）。さらに、ＮＯ合成酵素遺伝子の導入については、標的細胞への特異的な導入方法や遺伝子の発現の調節など多くの課題がある。そのため、このような医薬品の形態ではなく、日常的、継続的に摂取でき、さらに副作用の少ない血管内皮機能改善効果を有する食品素材が求められている。
【０００４】
従来、血管内皮機能改善効果を有する食品素材として、クロロゲン酸、カフェ酸、フェルラ酸が知られている（例えば、特許文献１参照）。血管内皮機能を改善するには、血管内皮細胞に依存したＮＯ産生を促進することが重要であるが、これらの物質については、血管内皮細胞依存性についての解析がされていない。また、前腕部を外部から加圧した後、圧負荷を解除することで反応性充血を起こし、動脈血流の増加を測定しているが（血流依存性血管弛緩反応測定法）、血液中のＮＯ産生の動向については確認がされていない。
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−２６１４４４号公報
【非特許文献１】下川宏明（Ｓｈｉｍｏｋａｗａ Ｈ）著、「Ｐｒｉｍａｒｙ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ:ａｔｈｅｒｏｓｉｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ、 （オランダ）、エルゼビア(Ｅｌｓｅｖｉｅｒ)、１９９９年１月, ３１(１)、ｐ．２３−３７
【非特許文献２】「ＧＩＳＳＩ−３: ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｉｓｉｎｏｐｒｉｌ ａｎｄ ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｔｒｉｎｉｔｒａｔｅ ｓｉｎｇｌｙ ａｎｄ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｏｎ ６−ｗｅｅｋ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ａｎｄ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ. Ｇｒｕｐｐｏ Ｉｔａｌｉａｎｏ ｐｅｒ ｌｏ Ｓｔｕｄｉｏ ｄｅｌｌａ Ｓｏｐｒａｖｖｉｖｅｎｚａ ｎｅｌｌ’ｉｎｆａｒｔｏ Ｍｉｏｃａｒｄｉｃｏ」, ＴＨＥ Ｌａｎｃｅｔ, （オランダ）、エルゼビア(Ｅｌｓｅｖｉｅｒ)、１９９４年、３４３、ｐ．１１１５−１１２２
【非特許文献３】マーク・エー・クレガ−ら（Ｃｒｅａｇｅｒ Ｍ Ａ ｅｔ ａｌ.）著、「Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｖａｓｏｄｉｌａｔｉｏｎ Ｉｎ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ ｈｕｍａｎｓ」、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、（米国）、臨床試験米国協会（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）１９９２年、９０、 ｐ．１２４８−１２５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、血管内皮細胞のＮＯ産生を促進し、血管内皮機能を改善する組成物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題解決のため、鋭意検討を重ねた結果、大豆に麹菌培養物を添加、混合し、２５〜５５℃で１２〜１６８時間反応させて得られる組成物に、血管内皮細胞由来のＮＯ産生を促進する作用があることを見出し、これらの知見に基づき本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、
１）大豆に、麹菌培養物を添加、混合し、２５〜５５℃で１２〜１６８時間反応させて得られる血管内皮機能改善組成物。
２）分画分子量が３０００以下であり、逆相系のＣ１８クロマトグラフィーにて水で溶出されることを特徴とする上記１）記載の血管内皮機能改善組成物。
３）分画分子量が３０００以下であり、陽イオン交換樹脂に吸着することを特徴とする上記１）記載の血管内皮機能改善組成物。
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の血管内皮機能改善組成物は、食経験が豊富な原料から得られる旨みの強い組成物であることから、副作用がほとんどない血管内皮機能改善効果を有する食品素材として、日常的、継続的に摂取することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の血管内皮機能改善組成物は、大豆に、麹菌培養物を添加、混合し、反応させることにより得ることができる。
【００１１】
本発明で用いる大豆としては、黄大豆、赤大豆、黒大豆などが挙げられるが、好ましくは黄大豆を原料として使用する。また、大豆の形態は、丸大豆（全脂大豆）、脱脂大豆どちらでもよく、割砕した大豆、粉末状にした大豆なども使用可能である。
これらの大豆を、加圧蒸煮、無圧蒸煮、乾熱加熱などの加熱処理をして変性させる。これらの加熱処理のうち、工業的に応用されている加圧蒸煮が好ましく、１．５〜７ｋｇ／ｃｍ２、１２０〜１８０℃、１０〜６００秒処理して熱変性させた大豆、あるいは４〜８ｋｇ／ｃｍ２、２００〜２８０℃、１〜１０秒処理した後に、大気中に放出して膨化させた熱変性大豆を使用する。
【００１２】
次に、本発明で用いる麹菌培養物は、大豆や小麦、ふすま等を培地とし、麹菌を接種して培養することにより得られるものである。その製造方法の違いにより、液体麹培養物、固体麹培養物に分類されるが、本発明においてはどちらも利用することができる。
例えば、液体麹培養物は、大豆や小麦、ふすま等を１〜５％含む液体培地に麹菌を接種し、２５〜４０℃で、３０〜９６時間培養して得ることができる。また、固体麹培養物は、大豆や小麦等を含む固体培地に麹菌を接種し、２５〜４０℃で、２４〜４８時間培養した後、水を培養物の重量に対して２〜４倍添加して得ることができる。
なお、麹菌は、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・タマリイ（Aspergillus tamarii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii）など食経験があるものなら任意に選択できるが、好ましくはアスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼーを使用する。
【００１３】
本発明の血管内皮機能改善組成物は、前記した大豆に、上記の麹菌培養物を添加、混合し、反応させることにより得ることができる。反応の条件は、麹菌培養物を終濃度１０〜７０％、好ましくは３０〜５０％、大豆を終濃度５〜４０％、好ましくは１５〜３０％、食塩を終濃度１〜２５％、好ましくは６〜１８％、さらに水を終濃度１０〜８５％混合し、大豆と食塩の終濃度が前記の範囲になるように調製した後、２５〜５５℃、好ましくは３０〜５０℃で、攪拌速度１０〜１５０ｒｐｍ にて、１２〜１６８時間、好ましくは２４〜１４４時間反応させる。温度が２５℃未満だと、反応に長時間を要するとともに、酵素反応が不十分で、旨味成分のアミノ酸の溶出が少なく呈味の点で劣り、５５℃を超えると褐変により色が濃くなるとともに酸化臭が生じる。また、反応時間が１２時間未満でも、酵素反応が不十分で呈味が劣り、１６８時間を越えると、コストや生産効率の点から工業的な応用が難しくなる。反応液量は、目的の収量に応じて、数十ｍｌ〜数十ｔにすることが可能である。また、適宜香味向上のために、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ）属等の酵母を添加して（１０４〜１０７個/ｍｌ）、同時に発酵させることも可能である。
【００１４】
本発明の血管内皮機能改善組成物をさらに限外濾過膜、各種クロマトグラフィー（イオン交換、疎水、親水、ゲル濾過等）で分離・精製することにより、有効成分が濃縮され、組成物の血管内皮機能改善効果を高めることが可能となる。
例えば、得られた組成物を、分子量の大きい夾雑物を除くために限外濾過膜の分画分子量３０００〜１００００の膜で処理し、透過した低分子量の画分を得る。分画分子量３０００以上の画分には、血管内皮細胞に依存したＮＯ産生を促進する効果が確認されないので、好ましくは、限外濾過膜の分画分子量３０００の膜で処理をして透過液を回収する。さらに、逆相系のＣ１８クロマトグラフィーにて、水で溶出させる条件下では、得られた組成物の有効成分は樹脂に結合しないので、樹脂に結合した夾雑物質を除く目的で、水溶出の非吸着画分を回収して、血管内皮機能改善効果が高められた組成物が得られる。逆相系のＣ１８樹脂とは、オクタデシル基をシリカゲルあるいはポリマー基材に化学結合した樹脂であり、球型と破砕型のどちらも使用可能であるが、好ましくは、圧力損失の少ない球型を使用する。また、得られた組成物の有効成分は、一定の条件下において、陽イオン交換樹脂に吸着する。限外濾過膜透過画分を陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、非吸着の夾雑物質を除いた後、ギ酸アンモニウムやＮａＣｌなどの塩で溶出させることで、有効成分が濃縮し、血管内皮機能改善効果が高められた組成物を得ることもできる。陽イオン交換クロマトグラフィーの樹脂としては、スルホン酸基を交換基として持つ強酸性陽イオン交換樹脂や、カルボン酸基を交換基として持つ弱酸性陽イオン交換樹脂など、いずれも使用可能である。
【００１５】
本発明において、血管内皮機能改善とは、血管内皮細胞に依存したＮＯ産生を促進することをいう。その評価は、マグヌス装置を用いて、血管内皮細胞の有無による血管弛緩反応、およびＮＯ合成酵素阻害剤などの各種阻害剤を反応系に加えたときの血管弛緩反応を確認することで行う。つまり、血管内皮機能改善効果を有する組成物を反応させた場合に、血管内皮細胞を有した標本では血管弛緩反応を示すが、血管内皮細胞を剥離した標本や、反応系にＮＯ合成酵素阻害剤を予め添加した場合には、血管弛緩反応を示さない。これらの条件を満たしていれば、血管内皮細胞に依存したＮＯ産生を促進しているということができる。また、実験動物に上記血管内皮機能改善効果を有する組成物を摂取させ、血漿のＮＯ２/ＮＯ３の上昇や血圧上昇抑制を評価することでも確認できる。
本発明の血管内皮機能改善組成物は、上記の評価により血管内皮細胞に依存したＮＯ産生を促進していることが確認されており、血管内皮機能改善効果を有している。
【００１６】
本発明の血管内皮機能改善組成物は、各種飲食品に添加し、機能性飲食品として利用することができる。本発明である血管内皮機能改善組成物を添加する飲食品としては、特に限定されないが、例えば、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液および調整用粉末を含む）、味噌汁等のスープ類、醤油、粉末醤油、中華の素、だしの素、マヨネーズ、ケチャップ、食酢等の調味料、マーガリン等の油脂含有食品、蕎麦、うどん、中華麺、即席麺等の麺類、かまぼこ、天ぷら等の魚介類加工食品、ハム、ソーセージ等の畜肉類加工食品、ゼリー、グミ等の半固形状食品、ピーナツペースト、カレー等のペースト状食品、ガム、豆腐、サプリメントなどの固形状食品等が挙げられる。
【００１７】
本発明の血管内皮機能改善組成物は、血管内皮機能改善剤、動脈硬化、高血圧、血栓症の予防および治療剤として利用することができる。これら各種予防および治療剤は、血管内皮機能改善組成物に、賦形剤、糖類、香料、乳化剤および保存料の一種または二種以上を適宜含むことにより製造することができる。これら各種予防および治療剤の製品形態は特に制限されずに、使用形態に合わせて適宜選択でき、例えば錠剤、粉末、顆粒、カプセル剤、ペースト、乳化液、溶液等が挙げられる。
【００１８】
以下、実施例を示し、本発明を説明するが、本発明の技術的範囲はこれによって何ら限定されることはない。
【実施例１】
【００１９】
＜血管内皮改善組成物の製造例１＞
脱脂大豆２．０％、醤油油０.４％を含む液体培地(１Ｌ)に、麹菌アスペルギルス・オリゼーの胞子を添加して、３０℃で７２時間培養することにより麹菌培養物を得た。次に、脱脂大豆４１１ｇ、麹菌培養物７５５ ｍｌ、水６５５ｍｌ、食塩１５９ｇ、酵母チゴサッカロミセス・ルキシーを１.５×１０６個／ｍｌの割合で混合して（約２Ｌ）、３９℃、１００ｒｐｍで４８時間、さらに４５℃、１００ｒｐｍで７２時間培養して組成物を得た（本発明品１）。また、得られた組成物を電気透析法にて脱塩して食塩約０%の組成物を得た（本発明品２）。
【実施例２】
【００２０】
＜血管内皮改善組成物の製造例２＞
実施例１で得られた組成物（本発明品２）１．８Ｌをさらに限外濾過膜ＵＦ３０００（マイクローザーＵＦ、ＳＥＰ−１０１３型、旭化成株式会社）にて処理し、透過した分画分子量３０００以下の溶液１．５Ｌを得た。続いて、逆相系のＣ１８クロマトグラフィー（ダイソーゲルＯＤＳ−Ｂ、粒子径５０μｍ、ダイソー株式会社）１８Ｌに供して、水を樹脂の３倍量、３０％エタノールをカラムの３倍量、９９％エタノールをカラムの３倍量流して、水で溶出した画分Ａを９Ｌ，画分Ｂを９Ｌ，画分Ｃを３６Ｌ、３０％エタノール画分を５４Ｌ、９９％エタノール画分を５４Ｌ得た。そのうち、水で溶出した画分Ｃ、すなわち逆相系のＣ１８樹脂に非吸着の組成物を、ロータリーエバポレーター（ＭＯＤＥＬ ＲＥ−１０Ｅ−１００、柴田科学株式会社）にて濃縮後、凍結乾燥（ＲＬＥ−１０３型、共和真空技術株式会社）して１.２ｇの組成物を得た（本発明品３）。
【実施例３】
【００２１】
＜血管内皮改善組成物の製造例３＞
実施例２記載の限外濾過膜で透過した分画分子量３０００以下の画分３０ｍｌを、強酸性陽イオン交換クロマトグラフィー（Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ Ｘ８−２００ 、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）５０ｍｌに供し、樹脂の５倍量の水で非吸着画分を溶出させて除いた。次いで、１０％ギ酸アンモニウム３００ｍｌを流して吸着画分を溶出し、得られた吸着画分を凍結乾燥（ＲＬＥ−１０３型、共和真空技術株式会社）して１３０ｍｇ の組成物を得た（本発明品４）。
【実施例４】
【００２２】
＜調味料の製造＞
実施例１で得た本発明品１を凍結乾燥（ＲＬＥ−１０３型、共和真空技術株式会社）して得た粉末４％を、キッコーマン社製減塩醤油（８．５％ ＮａＣｌ）に混合した後、補塩をして１２％ＮａＣｌ、４％本発明品１を含む醤油を得た。
【実施例５】
【００２３】
＜錠剤の製造＞
実施例１で得た本発明品２を凍結乾燥（ＲＬＥ−１０３型、共和真空技術株式会社）した粉末５％、フロストシュガー６５％、デキストリン２２％、ショ糖エステル５％、ヒドロキシプロピルセルロース３％を混和し、打錠して２５０ｍｇの錠剤を得た。１日あたり２〜４錠摂取する血管内皮機能改善作用を有する機能性飲食品（健康食品）を得た。
【実施例６】
【００２４】
＜摘出大動脈による内皮依存性ＮＯ産生の評価＞
８週齢の雄性自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）の胸部大動脈を摘出して２〜３ｍｍ幅のリング標本を調製した。この標本を９５％Ｏ２、５％ＣＯ２混合ガスを通気した３７℃のＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液を満たしたオーガンバス中に懸垂し、２ｇの張力を負荷した。ノルエピネフリン（終濃度１０−７Ｍ）を添加して収縮反応が安定化したところに、アセチルコリン（終濃度１０−６Ｍ）を添加して血管弛緩反応が８０％以上を示すことを確認した。また、血管内皮細胞を剥離した標本は、アセチルコリンを添加して血管弛緩反応が起きないことを確認した。Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液を交換してアセチルコリンを充分洗浄した後に、ノルエピネフリン（終濃度１０-７Ｍ）を添加して収縮反応を安定化させ、実施例１〜３記載の本発明品１〜４の凍結乾燥粉末を添加して、トランスデューサーで張力の変位を記録して評価した（ただし、本発明品１には塩が含まれており血管弛緩反応に影響を及ぼしている可能性がある）。表１に摘出大動脈の血管弛緩率（％）を示したが、本発明品１〜４はいずれも血管弛緩反応が確認された。
【００２５】
【表１】
（Ｎ＝６：平均値±標準偏差）
【００２６】
血管内皮細胞に依存した弛緩反応であるかは、血管内皮細胞を剥離した標本を用いて評価した。また、ＮＯ産生による血管弛緩反応であるかは、ＮＯ合成酵素の阻害剤であるＮＧ−Ｎｉｔｒｏ−Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｌ−ＮＡＭＥ（１０−４Ｍ）をノルエピネフリン添加１５分前に添加して評価した。また、血管内皮細胞よりＮＯが産生された後にグアニル酸シクラーゼが活性化され、血管平滑筋でｃＧＭＰが上昇して血管弛緩反応が惹起されるが、そのグアニル酸シクラーゼの阻害剤であるメチレンブルー（５×１０−５Ｍ）を添加して血管弛緩反応が阻害されるかを評価した。さらにＮＯ産生以外の経路による血管弛緩反応ではないことを確認するため、シクロオキシゲナーゼの阻害剤であるインドメタシン（１０−５Ｍ）を添加して、弛緩反応が阻害されないかを評価した。その結果、表２に示すように血管内皮細胞のある標本では、血管弛緩反応を示したのに対し、血管内皮細胞を剥離した標本では完全に阻害された。また、血管内皮細胞のある標本にＮＯ合成酵素阻害剤（Ｌ−ＮＡＭＥ）を添加した場合も、血管弛緩反応が完全に阻害された。さらに血管弛緩反応後にグアニル酸シクラーゼ阻害剤であるメチレンブルーを添加したところ、直ちに血管弛緩反応が阻害を受けたこと、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（インドメタシン）を添加しても血管弛緩反応は変わらないことから、血管内皮細胞に依存したＮＯ産生を促進して血管が弛緩していることが確認された。すなわち、本発明の血管内皮機能改善組成物により血管内皮細胞におけるＮＯ産生が改善され、動脈硬化症、高血圧症、血栓症の予防にも有用であることが示された。
【００２７】
【表２】
（０．５ ｍｇ/ｍｌ、Ｎ＝６：平均値±標準偏差）
【実施例７】
【００２８】
＜自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）の血漿ＮＯ２/ＮＯ３による評価＞
ラットは、室温２５±１℃、湿度５５±１０％ ＲＨ、照明時間は１２時間（午前７時〜午後７時）の条件下で６週間飼育した。対照群（Ｎ＝６）は、１２％ＮａＣｌ醤油をＭＦ粉末飼料（オリエンタルバイオ社製）に混合して、餌１００ｇ中４％ＮａＣｌになるように調製した餌を与えた。本発明群（Ｎ＝６）は、実施例４記載の血管内皮改善組成物含有醤油をＭＦ粉末飼料に混合して、餌１００ｇ中４％ＮａＣｌ、１．３％本発明組成物になるように調製した餌を４２日間与えた。ラットから採血した血液５ｍｌを抗凝固剤入りの採血管（ベノジェクトＩＩ真空採血管、ＶＰ−ＮＡ０５０、テルモ株式会社）に添加した後、遠心分離にて血漿を調製した。次いで、血漿中のＮＯの変動を、ＮＯ２/ＮＯ３ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−Ｆ ＩＩ（同仁化学研究所）にて評価した。血圧の評価は、８週齢のラットに血圧測定用の送信器ＴＡ１１ＰＡ−Ｃ４０(プライムテック社)を腹部大動脈にカニュレーションし、腹腔内に固定して２週間の回復期間を設けた後に、１０分毎に１０秒間連続的に４２日間計測した。投与前、１０、２０、３０、４０日目の収縮期血圧値（２４時間の平均値）を表３に示した。得られた結果の統計学的処理方法は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ ｔｅｓｔで対照との比較を行った。
表３に示すように、本発明群は対照群と比較して有意に血漿ＮＯ２/ＮＯ３値が上昇し、血圧値の上昇が抑制されていることが確認された。本発明の血管内皮改善組成物のＮＯ産生促進作用により血圧上昇が抑制されていることがわかる。本発明品の血管内皮機能改善組成物は、高血圧の予防に有用であることが示された。
【００２９】
【表３】
（Ｎ＝６：平均値±標準偏差、＊ｐ＜０．０５、 ＊＊ｐ＜０．０１ ｖｓ．対照群）
【実施例８】
【００３０】
＜官能評価＞
本発明の血管内皮機能改善組成物（本発明品１の凍結乾燥粉末）、酵母エキス、クロロゲン酸等カフェオイルキナ酸類を含む生コーヒー豆抽出物を評価した。各サンプル５％溶液を、それぞれ７段階の評点法にて絶対評価を実施した。表４に示すように旨味、甘味、酸味のバランスが良く調味料、健康食品に適していることがわかる。
【００３１】
【表４】
（＋３：非常に強い、＋２：かなり強い、＋１：やや強い、０：普通、−１：やや強い、−２：かなり弱い、−３：非常に弱い、Ｎ＝１２の平均値）
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明で得られる血管内皮機能改善組成物は、血管内皮細胞のＮＯ産生を促進し、優れた抗動脈硬化、抗高血圧、抗血栓作用を有するため、摂取することにより様々な生活習慣病の予防を期待することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大豆に麹菌培養物を添加、混合して一定条件で得られる血管内皮機能改善組成物に関する。詳しくは、血管内皮細胞の一酸化窒素（以下、ＮＯという）産生を促進して血管内皮機能を改善する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮細胞由来のＮＯは、血管弛緩作用、血小板凝集抑制作用、抗血栓形成作用、抗増殖作用、抗炎症作用、抗酸化ストレス作用などの血管のホメオスタシス維持に関わる様々な生理活性作用を有している。高脂血症、高血圧、糖尿病、喫煙、老化などの危険因子により、血管内皮機能障害が生じ、それに伴うＮＯ産生低下による血管のリモデリング（動脈硬化）が進展し、虚血性心疾患（狭心症、心筋梗塞）や脳卒中などの原因となる（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
多くの心血管疾患では、血管内皮細胞機能不全の状態となるＮＯ産生異常が深く関わっており、その治療には血管内皮細胞におけるＮＯ産生を改善する方法が考えられている。その方法としては、硝酸薬（ＮＯドナー）投与、L-Arginine（ＮＯ合成酵素の基質）投与、ＮＯ合成酵素遺伝子の導入などが挙げられる。しかしながら、硝酸薬の長期投与に関しては、心筋梗塞（主な原因が動脈硬化）を対象とした臨床試験において、予防効果は立証されていない（例えば、非特許文献２参照）。また、L-Arginine投与は、高脂血症患者の血管内皮依存性弛緩反応を改善することが知られているが、成長ホルモン分泌刺激作用など目的と異なる生体反応を引き起こすことが問題となる（例えば、非特許文献３参照）。さらに、ＮＯ合成酵素遺伝子の導入については、標的細胞への特異的な導入方法や遺伝子の発現の調節など多くの課題がある。そのため、このような医薬品の形態ではなく、日常的、継続的に摂取でき、さらに副作用の少ない血管内皮機能改善効果を有する食品素材が求められている。
【０００４】
従来、血管内皮機能改善効果を有する食品素材として、クロロゲン酸、カフェ酸、フェルラ酸が知られている（例えば、特許文献１参照）。血管内皮機能を改善するには、血管内皮細胞に依存したＮＯ産生を促進することが重要であるが、これらの物質については、血管内皮細胞依存性についての解析がされていない。また、前腕部を外部から加圧した後、圧負荷を解除することで反応性充血を起こし、動脈血流の増加を測定しているが（血流依存性血管弛緩反応測定法）、血液中のＮＯ産生の動向については確認がされていない。
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−２６１４４４号公報
【非特許文献１】下川宏明（Ｓｈｉｍｏｋａｗａ Ｈ）著、「Ｐｒｉｍａｒｙ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ:ａｔｈｅｒｏｓｉｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ、 （オランダ）、エルゼビア(Ｅｌｓｅｖｉｅｒ)、１９９９年１月, ３１(１)、ｐ．２３−３７
【非特許文献２】「ＧＩＳＳＩ−３: ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｉｓｉｎｏｐｒｉｌ ａｎｄ ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｔｒｉｎｉｔｒａｔｅ ｓｉｎｇｌｙ ａｎｄ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｏｎ ６−ｗｅｅｋ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ａｎｄ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ. Ｇｒｕｐｐｏ Ｉｔａｌｉａｎｏ ｐｅｒ ｌｏ Ｓｔｕｄｉｏ ｄｅｌｌａ Ｓｏｐｒａｖｖｉｖｅｎｚａ ｎｅｌｌ’ｉｎｆａｒｔｏ Ｍｉｏｃａｒｄｉｃｏ」, ＴＨＥ Ｌａｎｃｅｔ, （オランダ）、エルゼビア(Ｅｌｓｅｖｉｅｒ)、１９９４年、３４３、ｐ．１１１５−１１２２
【非特許文献３】マーク・エー・クレガ−ら（Ｃｒｅａｇｅｒ Ｍ Ａ ｅｔ ａｌ.）著、「Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｖａｓｏｄｉｌａｔｉｏｎ Ｉｎ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ ｈｕｍａｎｓ」、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、（米国）、臨床試験米国協会（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）１９９２年、９０、 ｐ．１２４８−１２５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、血管内皮細胞のＮＯ産生を促進し、血管内皮機能を改善する組成物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題解決のため、鋭意検討を重ねた結果、大豆に麹菌培養物を添加、混合し、２５〜５５℃で１２〜１６８時間反応させて得られる組成物に、血管内皮細胞由来のＮＯ産生を促進する作用があることを見出し、これらの知見に基づき本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、
１）大豆に、麹菌培養物を添加、混合し、２５〜５５℃で１２〜１６８時間反応させて得られる血管内皮機能改善組成物。
２）分画分子量が３０００以下であり、逆相系のＣ１８クロマトグラフィーにて水で溶出されることを特徴とする上記１）記載の血管内皮機能改善組成物。
３）分画分子量が３０００以下であり、陽イオン交換樹脂に吸着することを特徴とする上記１）記載の血管内皮機能改善組成物。
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の血管内皮機能改善組成物は、食経験が豊富な原料から得られる旨みの強い組成物であることから、副作用がほとんどない血管内皮機能改善効果を有する食品素材として、日常的、継続的に摂取することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の血管内皮機能改善組成物は、大豆に、麹菌培養物を添加、混合し、反応させることにより得ることができる。
【００１１】
本発明で用いる大豆としては、黄大豆、赤大豆、黒大豆などが挙げられるが、好ましくは黄大豆を原料として使用する。また、大豆の形態は、丸大豆（全脂大豆）、脱脂大豆どちらでもよく、割砕した大豆、粉末状にした大豆なども使用可能である。
これらの大豆を、加圧蒸煮、無圧蒸煮、乾熱加熱などの加熱処理をして変性させる。これらの加熱処理のうち、工業的に応用されている加圧蒸煮が好ましく、１．５〜７ｋｇ／ｃｍ２、１２０〜１８０℃、１０〜６００秒処理して熱変性させた大豆、あるいは４〜８ｋｇ／ｃｍ２、２００〜２８０℃、１〜１０秒処理した後に、大気中に放出して膨化させた熱変性大豆を使用する。
【００１２】
次に、本発明で用いる麹菌培養物は、大豆や小麦、ふすま等を培地とし、麹菌を接種して培養することにより得られるものである。その製造方法の違いにより、液体麹培養物、固体麹培養物に分類されるが、本発明においてはどちらも利用することができる。
例えば、液体麹培養物は、大豆や小麦、ふすま等を１〜５％含む液体培地に麹菌を接種し、２５〜４０℃で、３０〜９６時間培養して得ることができる。また、固体麹培養物は、大豆や小麦等を含む固体培地に麹菌を接種し、２５〜４０℃で、２４〜４８時間培養した後、水を培養物の重量に対して２〜４倍添加して得ることができる。
なお、麹菌は、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・タマリイ（Aspergillus tamarii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii）など食経験があるものなら任意に選択できるが、好ましくはアスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼーを使用する。
【００１３】
本発明の血管内皮機能改善組成物は、前記した大豆に、上記の麹菌培養物を添加、混合し、反応させることにより得ることができる。反応の条件は、麹菌培養物を終濃度１０〜７０％、好ましくは３０〜５０％、大豆を終濃度５〜４０％、好ましくは１５〜３０％、食塩を終濃度１〜２５％、好ましくは６〜１８％、さらに水を終濃度１０〜８５％混合し、大豆と食塩の終濃度が前記の範囲になるように調製した後、２５〜５５℃、好ましくは３０〜５０℃で、攪拌速度１０〜１５０ｒｐｍ にて、１２〜１６８時間、好ましくは２４〜１４４時間反応させる。温度が２５℃未満だと、反応に長時間を要するとともに、酵素反応が不十分で、旨味成分のアミノ酸の溶出が少なく呈味の点で劣り、５５℃を超えると褐変により色が濃くなるとともに酸化臭が生じる。また、反応時間が１２時間未満でも、酵素反応が不十分で呈味が劣り、１６８時間を越えると、コストや生産効率の点から工業的な応用が難しくなる。反応液量は、目的の収量に応じて、数十ｍｌ〜数十ｔにすることが可能である。また、適宜香味向上のために、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ）属等の酵母を添加して（１０４〜１０７個/ｍｌ）、同時に発酵させることも可能である。
【００１４】
本発明の血管内皮機能改善組成物をさらに限外濾過膜、各種クロマトグラフィー（イオン交換、疎水、親水、ゲル濾過等）で分離・精製することにより、有効成分が濃縮され、組成物の血管内皮機能改善効果を高めることが可能となる。
例えば、得られた組成物を、分子量の大きい夾雑物を除くために限外濾過膜の分画分子量３０００〜１００００の膜で処理し、透過した低分子量の画分を得る。分画分子量３０００以上の画分には、血管内皮細胞に依存したＮＯ産生を促進する効果が確認されないので、好ましくは、限外濾過膜の分画分子量３０００の膜で処理をして透過液を回収する。さらに、逆相系のＣ１８クロマトグラフィーにて、水で溶出させる条件下では、得られた組成物の有効成分は樹脂に結合しないので、樹脂に結合した夾雑物質を除く目的で、水溶出の非吸着画分を回収して、血管内皮機能改善効果が高められた組成物が得られる。逆相系のＣ１８樹脂とは、オクタデシル基をシリカゲルあるいはポリマー基材に化学結合した樹脂であり、球型と破砕型のどちらも使用可能であるが、好ましくは、圧力損失の少ない球型を使用する。また、得られた組成物の有効成分は、一定の条件下において、陽イオン交換樹脂に吸着する。限外濾過膜透過画分を陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、非吸着の夾雑物質を除いた後、ギ酸アンモニウムやＮａＣｌなどの塩で溶出させることで、有効成分が濃縮し、血管内皮機能改善効果が高められた組成物を得ることもできる。陽イオン交換クロマトグラフィーの樹脂としては、スルホン酸基を交換基として持つ強酸性陽イオン交換樹脂や、カルボン酸基を交換基として持つ弱酸性陽イオン交換樹脂など、いずれも使用可能である。
【００１５】
本発明において、血管内皮機能改善とは、血管内皮細胞に依存したＮＯ産生を促進することをいう。その評価は、マグヌス装置を用いて、血管内皮細胞の有無による血管弛緩反応、およびＮＯ合成酵素阻害剤などの各種阻害剤を反応系に加えたときの血管弛緩反応を確認することで行う。つまり、血管内皮機能改善効果を有する組成物を反応させた場合に、血管内皮細胞を有した標本では血管弛緩反応を示すが、血管内皮細胞を剥離した標本や、反応系にＮＯ合成酵素阻害剤を予め添加した場合には、血管弛緩反応を示さない。これらの条件を満たしていれば、血管内皮細胞に依存したＮＯ産生を促進しているということができる。また、実験動物に上記血管内皮機能改善効果を有する組成物を摂取させ、血漿のＮＯ２/ＮＯ３の上昇や血圧上昇抑制を評価することでも確認できる。
本発明の血管内皮機能改善組成物は、上記の評価により血管内皮細胞に依存したＮＯ産生を促進していることが確認されており、血管内皮機能改善効果を有している。
【００１６】
本発明の血管内皮機能改善組成物は、各種飲食品に添加し、機能性飲食品として利用することができる。本発明である血管内皮機能改善組成物を添加する飲食品としては、特に限定されないが、例えば、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液および調整用粉末を含む）、味噌汁等のスープ類、醤油、粉末醤油、中華の素、だしの素、マヨネーズ、ケチャップ、食酢等の調味料、マーガリン等の油脂含有食品、蕎麦、うどん、中華麺、即席麺等の麺類、かまぼこ、天ぷら等の魚介類加工食品、ハム、ソーセージ等の畜肉類加工食品、ゼリー、グミ等の半固形状食品、ピーナツペースト、カレー等のペースト状食品、ガム、豆腐、サプリメントなどの固形状食品等が挙げられる。
【００１７】
本発明の血管内皮機能改善組成物は、血管内皮機能改善剤、動脈硬化、高血圧、血栓症の予防および治療剤として利用することができる。これら各種予防および治療剤は、血管内皮機能改善組成物に、賦形剤、糖類、香料、乳化剤および保存料の一種または二種以上を適宜含むことにより製造することができる。これら各種予防および治療剤の製品形態は特に制限されずに、使用形態に合わせて適宜選択でき、例えば錠剤、粉末、顆粒、カプセル剤、ペースト、乳化液、溶液等が挙げられる。
【００１８】
以下、実施例を示し、本発明を説明するが、本発明の技術的範囲はこれによって何ら限定されることはない。
【実施例１】
【００１９】
＜血管内皮改善組成物の製造例１＞
脱脂大豆２．０％、醤油油０.４％を含む液体培地(１Ｌ)に、麹菌アスペルギルス・オリゼーの胞子を添加して、３０℃で７２時間培養することにより麹菌培養物を得た。次に、脱脂大豆４１１ｇ、麹菌培養物７５５ ｍｌ、水６５５ｍｌ、食塩１５９ｇ、酵母チゴサッカロミセス・ルキシーを１.５×１０６個／ｍｌの割合で混合して（約２Ｌ）、３９℃、１００ｒｐｍで４８時間、さらに４５℃、１００ｒｐｍで７２時間培養して組成物を得た（本発明品１）。また、得られた組成物を電気透析法にて脱塩して食塩約０%の組成物を得た（本発明品２）。
【実施例２】
【００２０】
＜血管内皮改善組成物の製造例２＞
実施例１で得られた組成物（本発明品２）１．８Ｌをさらに限外濾過膜ＵＦ３０００（マイクローザーＵＦ、ＳＥＰ−１０１３型、旭化成株式会社）にて処理し、透過した分画分子量３０００以下の溶液１．５Ｌを得た。続いて、逆相系のＣ１８クロマトグラフィー（ダイソーゲルＯＤＳ−Ｂ、粒子径５０μｍ、ダイソー株式会社）１８Ｌに供して、水を樹脂の３倍量、３０％エタノールをカラムの３倍量、９９％エタノールをカラムの３倍量流して、水で溶出した画分Ａを９Ｌ，画分Ｂを９Ｌ，画分Ｃを３６Ｌ、３０％エタノール画分を５４Ｌ、９９％エタノール画分を５４Ｌ得た。そのうち、水で溶出した画分Ｃ、すなわち逆相系のＣ１８樹脂に非吸着の組成物を、ロータリーエバポレーター（ＭＯＤＥＬ ＲＥ−１０Ｅ−１００、柴田科学株式会社）にて濃縮後、凍結乾燥（ＲＬＥ−１０３型、共和真空技術株式会社）して１.２ｇの組成物を得た（本発明品３）。
【実施例３】
【００２１】
＜血管内皮改善組成物の製造例３＞
実施例２記載の限外濾過膜で透過した分画分子量３０００以下の画分３０ｍｌを、強酸性陽イオン交換クロマトグラフィー（Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ Ｘ８−２００ 、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）５０ｍｌに供し、樹脂の５倍量の水で非吸着画分を溶出させて除いた。次いで、１０％ギ酸アンモニウム３００ｍｌを流して吸着画分を溶出し、得られた吸着画分を凍結乾燥（ＲＬＥ−１０３型、共和真空技術株式会社）して１３０ｍｇ の組成物を得た（本発明品４）。
【実施例４】
【００２２】
＜調味料の製造＞
実施例１で得た本発明品１を凍結乾燥（ＲＬＥ−１０３型、共和真空技術株式会社）して得た粉末４％を、キッコーマン社製減塩醤油（８．５％ ＮａＣｌ）に混合した後、補塩をして１２％ＮａＣｌ、４％本発明品１を含む醤油を得た。
【実施例５】
【００２３】
＜錠剤の製造＞
実施例１で得た本発明品２を凍結乾燥（ＲＬＥ−１０３型、共和真空技術株式会社）した粉末５％、フロストシュガー６５％、デキストリン２２％、ショ糖エステル５％、ヒドロキシプロピルセルロース３％を混和し、打錠して２５０ｍｇの錠剤を得た。１日あたり２〜４錠摂取する血管内皮機能改善作用を有する機能性飲食品（健康食品）を得た。
【実施例６】
【００２４】
＜摘出大動脈による内皮依存性ＮＯ産生の評価＞
８週齢の雄性自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）の胸部大動脈を摘出して２〜３ｍｍ幅のリング標本を調製した。この標本を９５％Ｏ２、５％ＣＯ２混合ガスを通気した３７℃のＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液を満たしたオーガンバス中に懸垂し、２ｇの張力を負荷した。ノルエピネフリン（終濃度１０−７Ｍ）を添加して収縮反応が安定化したところに、アセチルコリン（終濃度１０−６Ｍ）を添加して血管弛緩反応が８０％以上を示すことを確認した。また、血管内皮細胞を剥離した標本は、アセチルコリンを添加して血管弛緩反応が起きないことを確認した。Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液を交換してアセチルコリンを充分洗浄した後に、ノルエピネフリン（終濃度１０-７Ｍ）を添加して収縮反応を安定化させ、実施例１〜３記載の本発明品１〜４の凍結乾燥粉末を添加して、トランスデューサーで張力の変位を記録して評価した（ただし、本発明品１には塩が含まれており血管弛緩反応に影響を及ぼしている可能性がある）。表１に摘出大動脈の血管弛緩率（％）を示したが、本発明品１〜４はいずれも血管弛緩反応が確認された。
【００２５】
【表１】
（Ｎ＝６：平均値±標準偏差）
【００２６】
血管内皮細胞に依存した弛緩反応であるかは、血管内皮細胞を剥離した標本を用いて評価した。また、ＮＯ産生による血管弛緩反応であるかは、ＮＯ合成酵素の阻害剤であるＮＧ−Ｎｉｔｒｏ−Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｌ−ＮＡＭＥ（１０−４Ｍ）をノルエピネフリン添加１５分前に添加して評価した。また、血管内皮細胞よりＮＯが産生された後にグアニル酸シクラーゼが活性化され、血管平滑筋でｃＧＭＰが上昇して血管弛緩反応が惹起されるが、そのグアニル酸シクラーゼの阻害剤であるメチレンブルー（５×１０−５Ｍ）を添加して血管弛緩反応が阻害されるかを評価した。さらにＮＯ産生以外の経路による血管弛緩反応ではないことを確認するため、シクロオキシゲナーゼの阻害剤であるインドメタシン（１０−５Ｍ）を添加して、弛緩反応が阻害されないかを評価した。その結果、表２に示すように血管内皮細胞のある標本では、血管弛緩反応を示したのに対し、血管内皮細胞を剥離した標本では完全に阻害された。また、血管内皮細胞のある標本にＮＯ合成酵素阻害剤（Ｌ−ＮＡＭＥ）を添加した場合も、血管弛緩反応が完全に阻害された。さらに血管弛緩反応後にグアニル酸シクラーゼ阻害剤であるメチレンブルーを添加したところ、直ちに血管弛緩反応が阻害を受けたこと、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（インドメタシン）を添加しても血管弛緩反応は変わらないことから、血管内皮細胞に依存したＮＯ産生を促進して血管が弛緩していることが確認された。すなわち、本発明の血管内皮機能改善組成物により血管内皮細胞におけるＮＯ産生が改善され、動脈硬化症、高血圧症、血栓症の予防にも有用であることが示された。
【００２７】
【表２】
（０．５ ｍｇ/ｍｌ、Ｎ＝６：平均値±標準偏差）
【実施例７】
【００２８】
＜自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）の血漿ＮＯ２/ＮＯ３による評価＞
ラットは、室温２５±１℃、湿度５５±１０％ ＲＨ、照明時間は１２時間（午前７時〜午後７時）の条件下で６週間飼育した。対照群（Ｎ＝６）は、１２％ＮａＣｌ醤油をＭＦ粉末飼料（オリエンタルバイオ社製）に混合して、餌１００ｇ中４％ＮａＣｌになるように調製した餌を与えた。本発明群（Ｎ＝６）は、実施例４記載の血管内皮改善組成物含有醤油をＭＦ粉末飼料に混合して、餌１００ｇ中４％ＮａＣｌ、１．３％本発明組成物になるように調製した餌を４２日間与えた。ラットから採血した血液５ｍｌを抗凝固剤入りの採血管（ベノジェクトＩＩ真空採血管、ＶＰ−ＮＡ０５０、テルモ株式会社）に添加した後、遠心分離にて血漿を調製した。次いで、血漿中のＮＯの変動を、ＮＯ２/ＮＯ３ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−Ｆ ＩＩ（同仁化学研究所）にて評価した。血圧の評価は、８週齢のラットに血圧測定用の送信器ＴＡ１１ＰＡ−Ｃ４０(プライムテック社)を腹部大動脈にカニュレーションし、腹腔内に固定して２週間の回復期間を設けた後に、１０分毎に１０秒間連続的に４２日間計測した。投与前、１０、２０、３０、４０日目の収縮期血圧値（２４時間の平均値）を表３に示した。得られた結果の統計学的処理方法は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ ｔｅｓｔで対照との比較を行った。
表３に示すように、本発明群は対照群と比較して有意に血漿ＮＯ２/ＮＯ３値が上昇し、血圧値の上昇が抑制されていることが確認された。本発明の血管内皮改善組成物のＮＯ産生促進作用により血圧上昇が抑制されていることがわかる。本発明品の血管内皮機能改善組成物は、高血圧の予防に有用であることが示された。
【００２９】
【表３】
（Ｎ＝６：平均値±標準偏差、＊ｐ＜０．０５、 ＊＊ｐ＜０．０１ ｖｓ．対照群）
【実施例８】
【００３０】
＜官能評価＞
本発明の血管内皮機能改善組成物（本発明品１の凍結乾燥粉末）、酵母エキス、クロロゲン酸等カフェオイルキナ酸類を含む生コーヒー豆抽出物を評価した。各サンプル５％溶液を、それぞれ７段階の評点法にて絶対評価を実施した。表４に示すように旨味、甘味、酸味のバランスが良く調味料、健康食品に適していることがわかる。
【００３１】
【表４】
（＋３：非常に強い、＋２：かなり強い、＋１：やや強い、０：普通、−１：やや強い、−２：かなり弱い、−３：非常に弱い、Ｎ＝１２の平均値）
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明で得られる血管内皮機能改善組成物は、血管内皮細胞のＮＯ産生を促進し、優れた抗動脈硬化、抗高血圧、抗血栓作用を有するため、摂取することにより様々な生活習慣病の予防を期待することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆に、麹菌培養物を添加、混合し、２５〜５５℃で１２〜１６８時間反応させて得られる血管内皮機能改善組成物。
【請求項２】
分画分子量が３０００以下であり、逆相系のＣ１８クロマトグラフィーにて水で溶出されることを特徴とする請求項１記載の血管内皮機能改善組成物。
【請求項３】
分画分子量が３０００以下であり、陽イオン交換樹脂に吸着することを特徴とする請求項１記載の血管内皮機能改善組成物。
【請求項１】
大豆に、麹菌培養物を添加、混合し、２５〜５５℃で１２〜１６８時間反応させて得られる血管内皮機能改善組成物。
【請求項２】
分画分子量が３０００以下であり、逆相系のＣ１８クロマトグラフィーにて水で溶出されることを特徴とする請求項１記載の血管内皮機能改善組成物。
【請求項３】
分画分子量が３０００以下であり、陽イオン交換樹脂に吸着することを特徴とする請求項１記載の血管内皮機能改善組成物。
【公開番号】特開２００７−８８４６（Ｐ２００７−８８４６Ａ）
【公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１９００２４（Ｐ２００５−１９００２４）
【出願日】平成１７年６月２９日（２００５．６．２９）
【出願人】（０００００４４７７）キッコーマン株式会社 (212)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月２９日（２００５．６．２９）
【出願人】（０００００４４７７）キッコーマン株式会社 (212)
【Ｆターム（参考）】
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