血管形成の阻害のためのＲＴＥＦ−１変異体およびその使用
転写エンハンサー因子１−関連（ＲＴＥＦ−１）のドミナントネガティブ（ＤＮ）変異体について記載される。ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドは、細胞の転写を変化させるため細胞を直接標的にしてもよいし、核酸発現ベクターで送達してもよい。ＶＥＧＦの産生の阻害方法と、それによる癌などの血管形成障害の処置方法とについて記載する。たとえば、ある態様では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１を用いて加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）などの眼の血管形成障害を処置してもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００７年６月６日に出願された米国出願第６０／９４２，２４９号（この全体の開示は、放棄せずにその全体において参考として本明細書に具体的に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は分子生物学の分野に関し、特に、血管形成（ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（血管形成）に関わるプロセスに関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
ＴＥＡ ＤＮＡ結合ドメイン遺伝子ファミリーのメンバーに転写エンハンサー因子１−関連（ＲＴＥＦ−１：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｆａｃｔｏｒ １−ｒｅｌａｔｅｄ）遺伝子がある。ＴＥＡ ＤＮＡ結合ドメイン遺伝子ファミリーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、マウスからヒトに至るまでよく保存されている。ＴＥＡ ＤＮＡ結合ファミリーのタンパク質は様々な遺伝子の活性化と抑制との両方に関与し、他のタンパク質と一緒になってその個々の機能を改変する場合がある（非特許文献１）。心臓、骨格筋、膵臓、胎盤、脳および肺など、様々な哺乳動物組織で、こうした遺伝子の特定のメンバーの発現が確認されている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。単一遺伝子からｍＲＮＡの選択的スプライシングにより転写エンハンサー因子−１（ＴＥＦ−１）のアイソフォームが膵臓などの単一組織内で同定されてきた（Ｚｕｚａｒｔｅら、２０００；Ｊｉａｎｇら、２０００）。哺乳動物の眼内のこうした遺伝子の発現プロファイルは報告されていない。
【０００４】
ＲＴＥＦ−１遺伝子の転写物はニワトリ組織で最初に同定され、心筋および骨格筋に集中していることが明らかになった（非特許文献４）。ニワトリＲＴＥＦ−１は筋細胞特異的ＣＡＴ（Ｍ−ＣＡＴ）シスＤＮＡエレメントに結合し、筋肉特異的遺伝子の発現を調節し、十分な転写活性化のため筋肉特異的補助因子を要求する。２１６６ヒト結腸直腸癌ｃＤＮＡライブラリーのランダムスクリーニングにより、部分的ｃＤＮＡ ＲＴＥＦ−１配列が同定されたため、心臓ｃＤＮＡライブラリーから、トリＲＴＥＦ−１の全長ヒトホモログが単離されるようになっている（非特許文献２；Ｆｒｉｇｅｒｉｏら、１９９５）。ヒト組織のノーザンブロット解析では、骨格筋および膵臓で最も高レベルの発現が、心臓、腎臓および胎盤では低レベルの発現が示されたのに対し、肝臓、肺または脳ではメッセージが検出されなかった（非特許文献２）。ＲＴＥＦ−１のマウスホモログのノーザンブロット解析からは、ヒトと異なる組織発現パターンが示唆される。成体マウスでは肺組織で発現が最も高レベルで、腎臓、心臓および骨格筋では極めて低レベルで、肝臓、胸腺、脾臓および脳では検出不可能な量であったのに対し、マウス胚骨格筋はＲＴＥＦ−１メッセージに富んでいた（Ｙｏｃｋｅｙら、１９９６）。マウス骨格筋細胞では、全長遺伝子と比較してエクソン５を欠いている、ＲＴＥＦ−１の選択的スプライシングによるマウスアイソフォームが同定されている（Ｙｏｃｋｅｙら、１９９６）。
【０００５】
低酸素状態下の網膜組織中で上方制御されることが知られているプロ血管新生因子の１つに血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ：ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）がある（Ｙｏｕｎｇら、１９９７；Ｐｉｅｒｃｅら、１９９６；Ｄｏｎａｈｕｅら、１９９６；Ｐｅ’ｅｒら、１９９５）。近年、全長ＲＴＥＦ−１タンパク質がＶＥＧＦプロモーターに結合するだけでなく、たとえば、ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ：ｂｏｖｉｎｅ ａｏｒｔｉｃ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）中の低酸素状態下でＶＥＧＦの発現を上方制御することも確認された（Ｓｈｉｅら、２００４）。マイクロアレイ解析からは、低酸素状態下のＢＡＥＣ中でＲＴＥＦ−１の発現が３倍上方制御されることが明らかになった。驚いたことに、ＲＴＥＦ−１は、Ｍ−ＣＡＴモチーフではなく、ＶＥＧＦプロモーター内のＳｐ１エレメントとの相互作用を介してＶＥＧＦ遺伝子活性化に関与している。さらに、ＲＴＥＦによるＶＥＧＦの発現は、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）および低酸素応答エレメント（ＨＲＥ：ｈｙｐｏｘｉａ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）活性化経路と無関係に行われる（Ｓｈｉｅら、２００４）。
【０００６】
腫瘍の血管形成および異常な血管新生など、種々の血管形成障害にはＶＥＧＦの過剰発現が関係していると考えられてきた。たとえば、ＶＥＧＦが、未熟児網膜症（ＲＯＰ：ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）および他の眼の血管新生疾患（Ｌａｓｈｋａｒｉら、２０００；Ｍｉｌｌｅｒ，１９９７；Ｖａｎｎａｙら、２００５；Ｙｏｕｎｇら、１９９７）の発症および重症度に重要な役割を果たしていることは十分に確認されている。こうした障害におけるＶＥＧＦの顕著な役割を踏まえて、ＶＥＧＦ活性を阻害する多くの治療戦略が開発されてきた。しかしながら、現在のＶＥＧＦ遮断療法は一般に、細胞外ＶＥＧＦと同族の細胞表面受容体との相互作用を阻害する。したがって、ＶＥＧＦの産生を阻害する方法など、ＶＥＧＦ遮断に代わる戦略が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＫａｎｅｋｏおよびＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ、Ｄｅｖ Ｇｅｎｅｔ，（１９９８）２２：４３−５５
【非特許文献２】Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，（１９９６）３７：６８−７６
【非特許文献３】Ｙａｓｕｎａｍｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９６）２２８：３６５−７０
【非特許文献４】Ｆａｒｒａｎｃｅら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１：８２６６−７４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の実施形態では、本発明は、１つまたは複数の内部欠失を含むＲＴＥＦ−１アミノ酸配列を含む単離されたドミナントネガティブ（ＤＮ：ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ）ＲＴＥＦ−１ポリペプチドを提供する。本明細書で使用する場合、ドミナントネガティブという語は、配列番号１で例示されるようなインタクトなＲＴＥＦ−１ポリペプチドの活性をＲＴＥＦ−１変異体が抑制または低下させることを意味する。たとえば、ある態様では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１変異体は、細胞に発現すると、ＶＥＧＦプロモーター活性を阻害または低下させるポリペプチドと定義することができる。さらに、場合によっては、ＤＮ ＲＴＥＦ−１は、低酸素またはＲＴＥＦ−１（たとえば、配列番号１、配列番号２または配列番号４）によるＶＥＧＦプロモーター活性を低下または阻害するポリペプチドと定義することもできる。ある態様では、ＲＴＥＦ−１アミノ酸配列は、哺乳動物のＲＴＥＦ−１アミノ酸配列であってもよく、好ましくはヒトＲＴＥＦ−１アミノ酸配列である。
【０００９】
したがって、ある態様では、アミノ酸の内部欠失を１つまたは複数を含むＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドを提供する。たとえば、場合によっては、ＤＮ ＲＴＥＦ−１は、エクソン３、４、５、６、７、８、９または１０によってコードされるアミノ酸の欠失を含んでもよい。たとえば、ある特定の実施形態では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１は、エクソン４、５、６、７、８および／または９によってコードされるアミノ酸配列の全部の欠失を含んでも構わない。さらに、ある特定の場合には、ＤＮ ＲＴＥＦ−１は、エクソン３によってコードされる最後の約５アミノ酸の欠失またはエクソン１０によってコードされる最初の約１１アミノ酸の欠失など、エクソン３および／またはエクソン１０にアミノ酸の部分欠失を含んでもよい。さらに、ＤＮ ＲＴＥＦ−１は、ヒトＲＴＥＦ−１配列などの野生型ＲＴＥＦ−１配列に対するアミノ酸置換を含んでも構わないことを当業者であれば理解するであろう。したがって、場合によっては、ＤＮ ＲＴＥＦ−１は、欠失していないアミノ酸領域の野生型ＲＴＥＦ−１配列（たとえば、配列番号１、配列番号２または配列番号４）と約または少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９パーセント同一である、アミノ酸の内部欠失を１つまたは複数含むＲＴＥＦ−１ポリペプチドと定義することができる。いくつかの非常に特定の態様では、ＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチドは、配列番号３（６５１ｂｐ ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列）と約または少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９パーセント同一であるＲＴＥＦ−１アミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの非常に特定の態様では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドは、配列番号３が示す配列を含んでもよい。本発明が意図するＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドのさらなる実施形態は、発明を実施するための形態に記載する。
【００１０】
いくつかのさらなる態様では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドは、細胞内部移行（ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）部分を含んでもよい。場合によって、細胞内部移行部分をＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドと連結しても、コンジュゲートしてもよい。たとえば、ＤＮ ＲＴＥＦ−１はリポソーム小胞との複合体として提供してもよく、したがって、このポリペプチドは細胞膜を通過することができる。さらに、いくつかの特定の実施形態では、細胞内部移行部分は、ペプチド、ポリペプチド、アプタマーまたはアビマー（ａｖｉｍｅｒ）（たとえば、米国特許出願公開第２００６／０２３４２９９号および同第２００６／０２２３１１４号を参照されたい）配列であってもよい。たとえば、細胞内部移行部分は、ＨＩＶ ｔａｔ、ＨＳＶ−１外皮タンパク質ＶＰ２２またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）由来のアミノ酸を含んでもよい。ある種のさらなる態様では、細胞内部移行部分は、Ｗｒｉｇｈｔら（２００３） ａｎｄ Ｒｏｔｈｂａｒｄら（２０００）に記載されたポリ−アルギニン、メチオニンおよびグリシンペプチドなどの操作された内部移行部分であってもよい。たとえば、細胞内部移行部分は、本明細書に例示するＲＭＲＲＭＲＲＭＲＲ（配列番号２３）であってもよい。したがって、場合によっては、ポリペプチド細胞内部移行部分およびＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドは、融合タンパク質を含んでもよい。
【００１１】
したがって、場合によっては、細胞内部移行部分およびＤＮ ＲＴＥＦ−１配列を含むＤＮ ＲＴＥＦ−１融合タンパク質を提供する。こうした融合タンパク質は、細胞内移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ）部分とＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチド配列とを隔てる（ｓｅｐｅｒａｔｉｎｇ）１つまたは複数のアミノ酸配列をさらに含んでもよいことを当業者であれば理解するであろう。たとえば、場合によっては、リンカー配列がこうした２つのドメインを隔ててもよい。たとえば、リンカー配列は、ポリグリシンリンカーなど、多くの立体構造の自由または自由度を持つ「柔軟な」アミノ酸を含んでもよい。場合によっては、リンカー配列は、プロテイナーゼ切断部位を含んでもよい。たとえば、ある態様では、リンカー配列は、細胞内プロテイナーゼにより認識され、切断される切断部位を含んでもよく、このため、この融合タンパク質が細胞内に移行したならば、ＤＮ ＲＴＥＦ−１配列が細胞内内部移行配列から遊離する。
【００１２】
本発明のさらなる態様では、細胞内部移行部分は細胞標的化部分とさらに定義することができる。この標的化部分は、特定の細胞受容体を発現する細胞など、選択した細胞の集団だけに結合したり、それに取り込まれたりする部分である。こうした細胞標的化は、たとえば、細胞表面タンパク質に結合する抗体、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、アプタマーまたはアビマーを含んでもよい。本明細書で使用する場合、抗体という語は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体またはパラトープペプチドをいう場合がある。場合によっては、本発明の細胞標的化部分は、網膜細胞、内皮細胞、虹彩細胞または神経細胞などの特定のタイプの細胞を標的にしてもよい。なおさらなる態様では、本発明の細胞標的化部分は、癌細胞結合部分と定義することができる。たとえば、いくつかの非常に特異的な場合には、本発明の細胞標的化部分は、ｇｐ２４０またはＨｅｒ−２／ｎｅｕなどの（ｓｕｃｈ ａ）癌細胞関連抗原を標的にしてもよい。
【００１３】
なお本発明のさらなる態様では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドは、細胞輸送シグナル（たとえば、細胞分泌シグナル、核移行シグナルまたは核外移行シグナル）または酵素もしくは蛍光タンパク質などのレポーターポリペプチドのようなアミノ酸配列をさらに含んでもよい。好ましい態様では、たとえば、ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドは、細胞分泌シグナルを含む。たとえば、ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドは、本明細書に例示するように、ＩＬ−２分泌シグナル配列（ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ、配列番号２２）などのヒト遺伝子由来の分泌配列を含んでもよい。したがって、場合によっては、ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドは、細胞内部移行部分および細胞分泌シグナルを含んでもよく、したがって、このポリペプチドはある細胞から分泌され、周囲の細胞に取り込まれることができる。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態では、上記のようなＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドをコードする配列を含む単離された核酸配列を提供する。したがって、本明細書に記載のＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドまたはポリペプチド融合タンパク質のいずれかをコードする核酸配列も、本発明の一部に含まれる。遺伝コードの縮重により、種々の核酸配列を用いて同一のポリペプチドをコードできることを当業者であれば理解するであろう。場合によっては、たとえば、任意の特定のアミノ酸をコードするコドンを変化させて、細胞の発現を促進したり、ゲノムＲＴＥＦ−１遺伝子座で核酸が組み換わる可能性を低下させたりしてもよい。
【００１５】
好ましい態様では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドをコードする核酸配列は発現カセットに組み込まれる。本明細書で使用する場合、「発現カセット」という語は、細胞、より詳細には真核細胞中でＤＮ ＲＴＥＦ−１の発現を可能にする追加の核酸配列を組み込んだものを意味する。こうした追加配列は、たとえば、プロモーター、エンハンサー、イントロン配列（たとえば、ＤＮ ＲＴＥＦ−１コード領域の前後またはその中）またはポリアデニル化シグナル配列を含んでもよい。当業者であれば、発現カセットに組み込まれる配列を用いて、ＤＮ ＲＴＥＦ−１の発現特性を変化させてもよいことを認識するであろう。たとえば、細胞型特異的な条件プロモーター配列または誘導性プロモーター配列を用いて、ＤＮ ＲＴＥＦ−１を選択した細胞型または増殖条件に限定してもよい。たとえば、場合によっては、本発明のＲＴＥＦ−１発現カセットに低酸素誘導性プロモーターを用いてもよい。さらに、場合によっては、癌細胞または眼の細胞において増強活性を持つプロモーターを用いても構わない。さらに、ＲＴＥＦ−１ポリペプチド配列に対してある種の改変を行い、たとえば、本明細書に例示するようにＤＮ ＲＴＥＦ−１の開始コドンをＡＴＧに変更して効率的な翻訳を促進するなど、発現カセットからの発現を増強することも意図している。
【００１６】
なお本発明のさらなる態様では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１コード配列をウイルス発現ベクターなどの発現ベクターに組み込んでもよい。本発明に従って使用するウイルス発現ベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ−４０、レトロウイルスおよびワクシニアウイルスのベクター系があるが、これに限定されるものではない。ある種の好ましい態様では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターとさらに定義できる。場合によっては、こうしたレンチウイルスベクターは、参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第２００３／０００８３７４号および同第２００３／００８２７８９号に記載されたような自己不活性化（ＳＩＮ：ｓｅｌｆ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）レンチウイルスベクターであってもよい。
【００１７】
なおさらなる実施形態では、本発明は、ＲＴＥＦ−１依存性転写活性を低下させたり、阻害したりする方法に関する。本明細書で使用する場合、ＲＴＥＦ−１依存性転写活性という語は、配列番号１、配列番号２または配列番号４などの全長または十分に活性なＲＴＥＦ−１ポリペプチドの発現が関係する転写、またはそれにより増強される転写をいう。したがって、いくつかの点で、本発明は、ＶＥＧＦプロモーター活性（およびその活性によるＶＥＧＦ発現）を阻害したり、低下させたりする方法であって、細胞中にＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドを発現させることを含む、方法を提供する。このため、特定の実施形態では、血管形成障害を有する患者を処置するための方法であって、上述のようなＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチドをコードするＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチドまたは核酸発現ベクターを含有する治療用組成物を有効量で患者に投与することを含む、方法を提供する。好ましい態様では、本明細書に記載の方法を用いてヒト患者を処置することができる。
【００１８】
本明細書で使用する場合、血管形成障害という語は、眼血管新生、動静脈奇形、冠動脈再狭窄（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）、末梢血管再狭窄、糸球体腎炎、関節リウマチまたは癌（腫瘍血管新生反応など）などの好ましからぬ血管新生反応に関連する障害をいう。したがって、場合によっては、本発明の方法を用いて、黄斑変性症（加齢黄斑変性症（ＡＭＤ：ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）など）、角膜移植片拒絶反応、角膜血管新生、未熟児網膜症（ＲＯＰ：ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）および糖尿病性網膜症などの眼障害を処置してもよい。たとえば、本発明の方法を用いて、滲出型またはドライ型ＡＭＤを処置してもよい。したがって、場合によっては、本発明の方法を用いてｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｃｌａｓｓｉｃ病変、ｍｉｎｉｍａｌｌｙ ｃｌａｓｓｉｃ病変およびｏｃｃｕｌｔ ｗｉｔｈ ｎｏ ｃｌａｓｓｉｃ病変などの多くのＡＭＤ関連の眼病変を処置しても構わない（Ｇｒａｇｏｕｄａｓら、２００４）。
【００１９】
当業者であれば、本発明の方法と組み合わせて、または併用して追加の血管形成阻害療法を用いてもよいことを理解するであろう。こうした追加の療法については、本明細書に記載した方法の前後またはほぼ同時に施してもよい。たとえば、追加の血管形成阻害療法は、ＶＥＧＦおよび／またはＦＧＦシグナル経路を拮抗することができる。したがって、場合によってはおよび追加の療法は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦまたはＦＧＦ受容体に結合する抗体を投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）ことを含んでもよい。ある種の特異的態様では、本発明の方法および組成物を、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）、ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）（ペガプタニブナトリウム）または抗炎症剤と併用して使用しても構わない。したがって、ある特定の場合には、薬学的に許容されるキャリア中にＤＮ−ＲＴＥＦ−１組成物およびベバシズマブまたはペガプタニブナトリウムを含む治療用組成物を提供する。なおさらなる態様では、血管形成を調節する遺伝子を本発明の方法と併用して送達してもよい。たとえば、いくつかの態様では、血管形成を調節する遺伝子は、組織メタロプロテアーゼ阻害物質、エンドスタチン、アンジオスタチン、エンドスタチンＸＶＩＩＩ、エンドスタチンＸＶ、クリングル１〜５、ＰＥＸ、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２のＣ末端ヘモペキシンドメイン、ヒトプラスミノーゲンのクリングル５ドメイン、エンドスタチンとアンジオスタチンとの融合タンパク質、エンドスタチンとヒトプラスミノーゲンのクリングル５ドメインとの融合タンパク質、インターフェロンγ誘導モノカイン（Ｍｉｇ）、インターフェロン−α誘導タンパク質１０（ＩＰ１０）、ＭｉｇとＩＰ１０との融合タンパク質、可溶性ＦＬＴ−１（ｆｉｎｓ様チロシンキナーゼ１受容体）およびキナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ：ｋｉｎａｓｅ ｉｎｓｅｒｔ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子であってもよい。ある種の特異的態様では、こうした血管新生レギュレーター遺伝子を、参照によって本明細書に援用する米国特許第７，１２２，１８１号に記載されたレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて送達してもよい。
【００２０】
上記のように、ある態様では、本発明は、癌を処置するための方法を提供する。したがって、場合によっては、記載の方法を用いて腫瘍への血流を制限ないし減少させることで、腫瘍増殖または転移を抑制することができる。ある場合には、本明細書の方法を用いて転移性癌を阻害または処置してもよい。本発明の方法により、種々の癌のタイプを処置することができ、たとえば、処置対象の癌は、膀胱癌、血液癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、結腸癌、食道癌、眼癌、胃腸癌、歯肉癌、頭部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、鼻咽頭癌、頸部癌、卵巣癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、舌癌または子宮癌であってもよい。さらに、本発明の方法と組み合わせて、または併用して追加の抗癌療法剤を用いてもよい。こうした追加の療法については、本発明の方法の前後または同時に施すことができる。たとえば、追加の抗癌療法は、化学療法、外科的療法、免疫療法または放射線療法であってもよい。
【００２１】
本発明のＤＮ ＲＴＥＦ−１組成物については、患者に局所投与しても、全身投与してもよいことを意図している。たとえば、本発明の方法は、ＤＮ ＲＴＥＦ−１組成物の局部投与、静脈内投与、皮内投与、動脈内投与、腹腔内投与、病巣内投与、頭蓋内投与、関節内投与、前立腺内投与、胸膜内投与、気管内投与、眼内投与、鼻腔内投与、硝子体内投与、膣内投与、直腸内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、結膜下投与、膀胱内投与、粘膜投与、心膜内投与、臍帯内投与、眼球内投与、経口投与、吸入投与、注射投与、注入投与、持続注入投与、標的細胞を直接浸す局部灌流による投与、カテーテルを介した投与または洗浄による投与を含んでもよい。上述のように、場合によっては、ＤＮ ＲＴＥＦ−１組成物を眼に送達し、投与は、たとえば、局部投与でも、結膜下投与でも、眼周囲投与でも、眼球後投与でも、テノン嚢下投与でも、前房内投与でも、硝子体内投与でも、眼内投与でも、網膜下投与でも、後強膜近傍投与でも、上脈絡叢投与でもよい。ある態様では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１組成物を眼内注射、局部投与（たとえば、点眼製剤で）により眼に局所投与してもよい。
【００２２】
いくつかのさらなる実施形態では、組成物を滴下投与できる出口を備えたビンに入れられた本発明の医薬組成物を提供する。ある場合には、ビンに入れられた医薬組成物は反復投与量を含み、ある態様では、ビンは片目または両目に投与する単回投与単位を含み、好ましくは、単回投与単位は製剤の１〜２滴である。本明細書で使用する場合、「ビン」という語は、アンプル、点眼器またはシリンジなどの任意の液体用容器をいう。
【００２３】
本発明の方法および／または組成物の文脈で考察される実施形態は、本明細書に記載の任意の他の方法または組成物に関して用いてもよい。したがって、ある方法または組成物に関する実施形態を他の方法および本発明の組成物に用いても構わない。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「１つの（ａ）または（ａｎ）」は、１つを意味することもあれば、複数を意味することもある。特許請求の範囲（単数または複数）で使用するとき、「１つの（ａ）または（ａｎ）」は、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語と併用して使用する場合、１つを意味することもあれば、複数を意味することもある。
【００２５】
特許請求の範囲で「または（ｏｒ）」という語を使用する場合、代替物のみ、あるいは、代替物が相互に排他的であると明示的な記載がない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味するが、本開示では、代替物のみおよび「および／または」に言及する定義が妥当と考える。本明細書で使用する場合、「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとももう１つ、あるいはそれ以上を意味することができる。
【００２６】
本出願において「約（ａｂｏｕｔ）」という語を使用する場合、ある値に、その値の判定に用いる装置、方法に固有の誤差変動または研究対象間に存在する変動が含まれることを示す。
【００２７】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明により明らかになるであろう。ただし、詳細な説明および個々の例は本発明の好ましい実施形態を示すものとはいえ、例示のみを目的としていることを理解すべきである。このため、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、この詳細な説明により様々な変更および変形が当業者に明らかになるであろう。
【００２８】
以下の図面は本明細書の一部であり、本発明のある種の態様をさらに説明するために記載されている。図面と共に本明細書に示す具体的な実施形態の詳細な説明を参照すれば、本発明の理解が深まるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１Ａ〜Ｂ：低酸素ではＲＴＥＦ−１のｍＲＮＡスプライシングが変化する。網膜および虹彩内皮細胞を低酸素状態に置き、ＲＴＥＦ−１スプライシングをＲＴ−ＰＣＲにより解析した。図１Ａ、ＲＴ−ＰＣＲにより同定されたＲＴＥＦ−１スプライスバリアントの配列図である。各スプライスバリアントの非翻訳領域のエクソン配列（斜め線の網掛け）およびアミノ酸コード領域（無地の枠）を示す。さらに、推定ＲＴＥＦ−１機能ドメインも図示しており、格子枠はＴＥＡ ＤＮＡ結合ドメイン（アスタリスクは予想されるαへリックスの位置を示す）を、黒地の枠は核移行シグナル（エクソン４）を、縦線網掛けは活性化ドメイン（プロリンリッチドメイン（ＰＲＤ：Ｐｒｏｌｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｄｏｍａｉｎ））を、横線網掛けはエクソン９および１０の２個のＳＴＹドメインを示す。図１Ｂ、ヒト網膜血管内皮細胞（ＲＶＥＣ：ｒｅｔｉｎａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）の初代培養から調製したＲＴＥＦ−１特異的ＲＴ−ＰＣＲ産物を示すアガロースゲル電気泳動像である。レーン１および４：ＤＮＡラダー；レーン２：正常酸素圧条件下でＲＶＥＣから調製したｃＤＮＡにより得られた２個の産物（大きさは１３０５ｂｐおよび９３６ｂｐ）；レーン３：低酸素状態下でＲＶＥＣから調製されたｃＤＮＡにより得られた３個の産物（大きさは１３０５ｂｐ、９３６ｂｐおよび４４７ｂｐ）。
【図２】図２：ＲＴＥＦ−１変異体は、ＶＥＧＦプロモーターを活性化または抑制する。表記のＲＴＥＦ−１変異体を含む発現ベクターと共にＶＥＧＦプロモーターレポーターコンストラクト（分泌アルカリホスホターゼを誘導するＶＥＧＦプロモーター）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。結果は、ｐＳＥＡＰ−ＶＥＧＦプロモーターと、１３０５ｂｐ（レーン１）、９３６ｂｐ（レーン２）、６５１ｂｐ（レーン３）、ｓｓ−６５１−ＲＭＲ ｂｐ（レーン６）または４４７ｂｐ（レーン４）ＲＴＥＦ−１変異体を含むｐｃＤＮＡ発現コンストラクトとのトランスフェクションから６時間後の培地中のＡＰ活性を示す。レーン５は、インサートのないｐｃＤＮＡ対照プラスミドをコトランスフェクトしたときの対照ＶＥＧＦプロモーター活性を示す。
【図３】図３：ＲＴＥＦ−１によるＶＥＧＦプロモーター活性の調節は、４つのＳＰ１結合部位を含むＶＥＧＦプロモーター部分に左右される。細胞に、１３０５ｂｐ（レーン１）、９３６ｂｐ（レーン２）、６５１ｂｐ（レーン３）、ｓｓ−６５１ｂｐ（レーン６）または４４７ｂｐ（レーン４）ＲＴＥＦ−１変異体を含むｐｃＤＮＡ発現コンストラクトと、インタクトなＶＥＧＦプロモーター（黒地の枠）またはヌクレオチド−１１３〜−５７が欠失したＶＥＧＦプロモーター（白地の枠）を含むレポーターベクターとを上記のようにトランスフェクトした。レーン５は、インサートのないｐｃＤＮＡ対照プラスミドをコトランスフェクトしたときの対照ＶＥＧＦプロモーター活性を示す。
【図４】図４：６５１ｂｐのＲＴＥＦ−１はドミナントネガティブとして働く。細胞に、ｐＳＥＡＰ−ＶＥＧＦおよび１３０５ｂｐ（レーン１、２）、９３６ｂｐ（レーン３、４）または４４７ｂｐ（レーン５、６）ＲＴＥＦ−１変異体を単独で（レーン１、３および５）、あるいはｓｓ−６５１−ＲＭＲ ｂｐ ＲＴＥＦ−１変異体を加えて（レーン２、４および６）上記のようにトランスフェクトした。
【図５】図５Ａ〜Ｃ：ＲＴＥＦ−１ポリペプチドの検出。ＲＴＥＦ−１に特有ではあるが、天然の変異体がそれぞれ共有するアミノ酸配列に対して抗体を作製した。図５Ａは、ＲＴＥＦ−１から関連転写因子までの領域のアミノ酸アライメントである。抗体作製に使用したアミノ酸配列を下線で示す。図５Ｂ：抗ＲＴＥＦ−１抗体によるイムノブロット像。解析に使用した細胞ライセートは、ｐｃＤＮＡ空ベクター（レーン２および８）または１３０５ｂｐ（レーン３、９）、９３６ｂｐ（レーン４、１０）、６５１ｂｐ（レーン５、１１）もしくは４４７ｂｐ（レーン６、１１）ＲＴＥＦ−１変異体のｐｃＤＮＡ発現ベクターをトランスフェクトした細胞から得た。各ＲＴＥＦ−１変異体の検出を楕円で示す。レーン１および７は分子量マーカーである。レーン１〜６は、レーン７〜１２の像の過剰曝露を示す。図５Ｃ：抗ＲＴＥＦ−１抗体を用いて、ｐｃＤＮＡ ６５１ｂｐのＲＴＥＦ−１発現ベクターをトランスフェクトした細胞のＲＴＥＦ−１変異体を検出したイムノブロット像。予想される約２４ｋＤａポリペプチドを矢印で示す。
【図６】図６Ａ〜Ｂ：眼におけるＲＴＥＦ−１変異体の発現。図６Ａ：正常な霊長類眼組織中のＲＴＥＦ−１発現を示すイムノブロット像。網膜（レーン１）、脈絡膜（レーン２）および虹彩（レーン３）の組織ライセートのタンパク質についてイムノブロット解析を行った。Ｍは分子量マーカーを示す。図６Ｂ：ＲＴＥＦ−１特異的プライマーを用いて生成された半定量的ＲＴ−ＰＣＲ産物を可視化するため、エチジウムプロミドで染色したアガロースゲル像。レーン１はＣＲＡＯ網膜ＲＮＡの結果、レーン２は対照網膜ＲＮＡの結果を示す。
【図７】図７Ａ〜Ｄ：霊長類眼組織中のＲＴＥＦ−１発現の免疫組織化学解析。図７Ａ〜Ｂ：ＲＴＥＦ−１の強い染色が虹彩（Ｉ）、毛様体（ＣＢ）、視神経（ＯＮ）および網膜（Ｒ）に局在しているように見える。角膜（Ｃ）および水晶体（Ｌ）は、ＲＴＥＦ−１抗体ハイブリダイゼーションで陰性であった。図７Ｃ〜Ｄ：ＲＴＥＦ−１の最も強い染色が神経節細胞層（ＧＣＬ：ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌ ｌａｙｅｒ）および内顆粒層（ＩＮＬ：ｉｎｎｅｒ ｎｕｃｌｅａｒ ｌａｙｅｒ）に認められる。染色は、細胞質と核との両方に局在しているように見える。外層では染色があまり認められない。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
近年、癌およびＡＭＤなどの血管形成障害の処置を目的として、血管新生のシグナル伝達を阻害するための多くの戦略が開発されているところである。特に、ＶＥＧＦと細胞表面受容体の１つまたは両方との結合の阻害によるＶＥＧＦのシグナル伝達の遮断に着目した戦略が多い。しかしながら、こうした戦略は、異常な血管形成を惹起するＶＥＧＦの初期産生に対処できない。したがって、ＶＥＧＦの産生を阻害する新規な方法および組成物は、ＶＥＧＦ遮断と、それによる血管形成の処置との新しい方法になる可能性がある。このため、ある態様では、本発明は、ＶＥＧＦの活性化に不可欠なドミナントネガティブ転写因子を提供する。さらに、本発明は細胞内プロセスの標的化にも関するため、本発明の治療剤は、特定の細胞型を標的にし、それにより、好ましからぬ全身性副作用を低下させることができる。したがって、本発明は、血管形成障害を処置する新規な方法および／または現在のＶＥＧＦ遮断戦略の有効性を高める方式を提供する。
【００３１】
ＲＴＥＦ−１は多機能性転写因子ファミリーのメンバーであり、低酸素によるＶＥＧＦの転写など、ＶＥＧＦの転写の活性化因子であることが明らかになっている。しかしながら、本明細書に示すように、細胞ではＲＴＥＦ−１の複数のスプライスバリアントが産生され、ＲＮＡの選択的スプライシングバリアントから産生されるＲＴＥＦ−１ポリペプチドでは、転写機能が変化している（図１Ａ、Ｂ）。特に（Ｉｔ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ）、約６５１塩基対のＲＴＥＦ−１転写物は、ＶＥＧＦプロモーター活性を阻害するポリペプチドを産生する（図２、レーン３および５を比較）。さらに、このＲＴＥＦ−１変異体は、分泌シグナルおよび細胞内移行ポリペプチドとの融合タンパク質として形成される場合、より効果的なＶＥＧＦプロモーターの阻害剤となることも明らかになった図２のレーン６）。重要な点として、図４に示すように、６５１ｂｐのＲＴＥＦ−１転写物由来のポリペプチドは、ドミナントネガティブに作用する。つまり、このポリペプチドは、ＶＥＧＦプロモーター活性を低下させるばかりでなく、他の（ａ ｏｔｈｅｒ）ＲＴＥＦ−１タンパク質アイソフォームによるＶＥＧＦプロモーターの増強作用も遮断する。さらに、図６および７に示すように、ＲＴＥＦは眼の組織に発現するため、眼の血管新生障害の発症において重要であることが示唆される。今回の研究では、ＶＥＧＦの産生におけるＲＴＥＦ−１の活性化が、血管新生障害の発症に関与する一要因である可能性が示される。したがって、本発明の方法および組成物は、血管新生を早い段階で予防する手段になる可能性がある。
【００３２】
本発明は、新規なＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドの根拠および血管形成障害を予防ないし阻害するための、その使用を提供する。ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドについては、ＶＥＧＦの産生を遮断するため細胞内環境に直接送達しても、標的細胞に発現させてもよい。こうしたドミネートネガティブポリペプチドは、ＶＥＧＦの新たな産生のみならず、通常、低酸素状態などにおいてＲＴＥＦ−１により刺激を受けるＶＥＧＦの産生も下方制御する。したがって、本発明の組成物を用いて、新たな血管形成（ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を増加させる標的細胞および標的組織の能力を低下させることができる。これは、たとえば、血管の浸潤が直接の病因であるＡＭＤなどの眼の血管新生障害に非常に有益である。さらに、ＤＮ ＲＴＥＦ−１を用いて、新たな血管形成（ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により栄養素を獲得する腫瘍の能力を低下させることで、腫瘍または腫瘍転移を処置することもできる。したがって、腫瘍増殖を遅延させる、および／または腫瘍退縮を誘導する方法も提供する。さらに、発明の組成物は細胞内の早期の転写を標的にしているため、本発明の組成物を用いれば、特異的な細胞標的化／細胞内部移行部分を使用して効果があった組織を標的にして、それにより、標的以外の他の組織の副作用を抑えることもできる。
【００３３】
Ｉ．ドミネートネガティブＲＴＥＦ−１ポリペプチド
本明細書では、多くのＲＴＥＦ−１変異体が記載され、機能的特徴付けが行われている。たとえば、本明細書で具体的に研究した４つの配列は、以下のアミノ酸配列を含む。
【００３４】
１３０５ｂｐのヒトＲＴＥＦ−１のｃＤＮＡによってコードされる配列番号１は、以下の配列を持つ４３４アミノ酸タンパク質である：
【００３５】
【化１】
９３６ｂｐのヒトｃＤＮＡによってコードされる配列番号２は、以下の配列を持つ３１１アミノ酸タンパク質である：
【００３６】
【化２】
６５１ｂｐのヒトｃＤＮＡによってコードされる配列番号３は、以下の配列を持つ２１６アミノ酸タンパク質である：
【００３７】
【化３】
４４７ｂｐのヒトｃＤＮＡによってコードされる配列番号４は、以下の配列を持つ１４８アミノ酸タンパク質である：
【００３８】
【化４】
上述のように本発明のある態様では、ドミナントネガティブ（ＤＮ）ＲＴＥＦ−１ポリペプチドは、アミノ酸の内部欠失を１つまたは複数含んでもよい。たとえば、場合によっては、ＤＮ ＲＴＥＦ−１は、エクソン３、４、５、６、７、８、９または１０によってコードされるアミノ酸の欠失を含んでもよい。たとえば、ある態様では、ＤＮ−ＲＴＥＦ１は、配列番号３のアミノ酸配列またはその誘導体を含む。
【００３９】
【化５】
本発明のさらなる態様では、転写機能を維持したまま、ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドを１つまたは複数のアミノ置換でさらに修飾してもよい。たとえば、同等の親水性を持つアミノ酸との置換であれば、１つまたは複数の位置でアミノ酸置換を行ってもよい。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を与えるにはアミノ酸のハイドロパシックインデックスの重要性が、当該技術分野において一般に理解されている（Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。アミノ酸の相対的なハイドロパシック特性は得られるタンパク質の二次構造に関与し、さらにタンパク質と、他の分子、たとえば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原および同種のものとの相互作用を規定していることが認められている。したがって、ＲＥＴＦ−１配列においてそうした保存的置換を行ってもよく、置換を行ってもＶＥＧＦプロモーター活性を抑えるＲＥＴＦ−１配列の活性および能力に対する作用は軽微にとどまるであろう。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、アミノ酸残基には以下の親水性値が付与されている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパルタート（＋３．０±１）；グルタマート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（０．５）；ヒスチジン−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。こうした値を指標として用いてもよく、その場合、親水性値が±２以内にあるアミノ酸の置換は好ましいものであり、±１以内であれば特に好ましく、±０．５以内であれば、特に一層好ましい。したがって、本明細書に記載のＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドのいずれかを、あるアミノ酸と、異なってはいるものの同等の親水性値を持つ同種のアミノ酸との置換により修飾してもよい。親水性が＋／−１．０または＋／−０．５ポイント以内のアミノ酸を同種と見なす。
【００４０】
ＩＩ．細胞内部移行部分および標的化部分
本明細書で使用する細胞内部移行部分は、細胞膜を通ってＤＮ ＲＴＥＦ−１の輸送を仲介する、ＤＮ ＲＴＥＦ−１との（共有結合または非共有結合による）複合体であれば、どのような分子でも構わない。こうした内部移行部分は、ペプチドでも、ポリペプチドでも、ホルモンでも、増殖因子でも、サイトカインでも、アプタマーでも、アビマーでもよい。さらに、細胞内部移行部分は、非特異的な細胞内移行を仲介してもよいし、標的細胞の亜集団内に取り込まれる細胞標的化部分であっても構わない。
【００４１】
たとえば、ある実施形態では、本発明に使用する細胞標的化部分は抗体である。原則として、抗体という語は、以下に限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、ミニボディー、ジボディー、トリボディーのほか、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体およびその任意の混合物などの抗体フラグメントを含む。場合によっては、細胞標的化部分は、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であることが好ましい。関連する実施形態では、細胞標的化ドメインは、アビマーポリペプチドであってもよい。したがって、場合によっては、本発明の細胞標的化コンストラクトは、ＤＮ ＲＴＥＦ−１およびｓｃＦｖまたはアビマーを含む融合タンパク質である。いくつかの非常に特定の実施形態では、細胞標的化コンストラクトは、一本鎖抗体に融合されたＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドを含む融合タンパク質である。
【００４２】
本発明のある態様では、細胞標的化部分は、増殖因子であってもよい。たとえば、本発明による細胞標的化部分として、トランスフォーミング増殖因子、上皮増殖因子、インスリン様成長因子、線維芽細胞増殖因子、Ｂリンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ：Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）、ヘレグリン、血小板由来増殖因子、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）または低酸素誘導因子を用いてもよい。こうした増殖因子を用いれば、同族の増殖因子受容体を発現する細胞にコンストラクトを到達させることができる。たとえば、ＶＥＧＦを用いてＦＬＫ−１および／またはＦｌｔ−１を発現する細胞を標的にしてもよい。なおさらなる態様では、細胞標的化部分は、ポリペプチドＢｌｙＳであっても構わない（米国特許出願公開第第２００６／０１７１９１９号を参照されたい）。
【００４３】
本発明のさらなる態様では、細胞標的化部分は、ホルモンであってもよい。本発明に使用するホルモンの一部の例として、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ゴナドトロピン放出ホルモン、アンドロゲン、エストロゲン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体ホルモン、プロラクチン、成長ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、オキシトシン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、コルチコトロピン放出ホルモン、ソマトスタチン、ドーパミン、メラトニン、チロキシン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、糖質コルチコイド、ミネラルコルチコイド、アドレナリン、ノルアドレナリン、プロゲステロン、インスリン、グルカゴン、アミリン、エリトロポイチン、カルシトリオール、カルシフェロール、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ニューロペプチドＹ、グレリン、ＰＹＹ３−３６、インスリン様成長因子−１、レプチン、トロンボポエチン、アンジオテンシノーゲン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５またはＩＬ−３６があるが、これに限定されるものではない。上記で論じたように、ホルモンを含む標的化コンストラクトにより、表記のホルモンの細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ）受容体を含む細胞集団を標的にする方法が可能になる。
【００４４】
本発明のなおさらなる実施形態では、細胞標的化部分はサイトカインであってもよい。たとえば、本発明による標的化部分として、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、白血病抑制因子、エリスロポエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、オンコスタチンＭ、白血病抑制因子、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＬＴ−β、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢＬ、ＴＧＦ−β、ＩＬ１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡ、ＭＩＦおよびＩＧＩＦのどれを用いてもよい。
【００４５】
本発明のある態様では、本発明の細胞標的化部分は、癌細胞標的化部分であってもよい。表面分子を異常発現するある種の癌細胞は周囲の組織に比べて特有であることがよく知られている。したがって、こうした表面分子に結合する細胞標的化部分を用いれば、ＤＮ ＲＴＥＦ−１を癌細胞に特異的に標的化送達することができる。たとえば、細胞標的化部分を肺癌細胞、乳癌細胞、脳癌細胞、前立腺癌細胞、脾臓癌細胞、膵臓癌細胞、頸部癌細胞、卵巣癌細胞、頭頸部癌細胞、食道癌細胞、肝臓癌細胞、皮膚癌細胞、腎臓癌細胞、白血病癌細胞、骨癌細胞、精巣癌細胞、結腸癌細胞または膀胱癌細胞に結合させ、それに取り込ませてもよい。癌細胞の個々の癌マーカーの発現または発現レベルによって癌細胞標的化ＤＮ ＲＴＥＦ−１の有効性が異なる場合があることを当業者であれば理解するであろう。したがって、ある態様では、標的ＤＮ ＲＴＥＦ−１で癌を処置するための方法であって、癌が特定の細胞表面マーカーを発現するかどうか（あるいはその程度）を判定することと、マーカー遺伝子またはポリペプチドの発現レベルに応じて、ＤＮ ＲＴＥＦ−１標的療法剤（ｔｈｅｒａｐｙ）（または別の抗癌療法剤（ｔｈｅｒａｐｙ））を癌細胞に投与することとを含む方法を提供する。
【００４６】
上記で論じたように、本発明による細胞標的化部分は、たとえば、抗体であってもよい。たとえば、本発明による細胞標的化部分は、メラノーマ細胞などの皮膚癌細胞に結合することができる。ｇｐ２４０抗原は様々なメラノーマで発現するが、正常組織では発現しないことが明らかになっている。このため、本発明のある態様では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１およびｇｐ２４０に結合する細胞標的化部分を含む細胞標的化コンストラクトを提供する。場合によっては、ｇｐ２４０結合分子は、ＺＭＥ−０１８（２２５．２８Ｓ）抗体または９．２．２７抗体などの抗体であってもよい。より一層好ましい実施形態では、ｇｐ２４０結合分子は、ｓｃＦｖＭＥＬ抗体などの一本鎖抗体であってもよい。
【００４７】
本発明のなおさらなる特定の実施形態では、細胞標的化コンストラクトを乳癌細胞に誘導してもよい。たとえば、抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体など、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに結合する細胞標的化部分をＤＮ ＲＴＥＦ−１にコンジュゲートしてもよい。こうした細胞標的化コンストラクトの一例として、一本鎖抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体ｓｃＦｖ２３およびＤＮ ＲＴＥＦ−１を含む融合タンパク質がある。また、本発明の組成物および方法には、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに結合するｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）などの他のｓｃＦｖ抗体を用いてもよい（ｖｏｎ Ｍｉｎｃｋｗｉｔｚら、２００５）。
【００４８】
本発明のある追加の実施形態では、発明による癌細胞標的化部分が、複数のタイプの癌細胞に対して結合能を持つことを想定している。たとえば、８Ｈ９モノクローナル抗体およびこれに由来する一本鎖抗体は、乳癌、肉腫および神経芽細胞腫に発現する糖タンパク質に結合する（Ｏｎｄａら、２００４）。別の例として、様々なタイプの癌に発現するＭＵＣ−１抗原に結合する、米国特許出願公開第２００４／００５６４７号およびＷｉｎｔｈｒｏｐら、２００３に記載の細胞標的化薬がある。したがって、ある実施形態では、本発明の細胞標的化コンストラクトが、複数のタイプの癌または腫瘍を標的にできることが理解されるであろう。
【００４９】
ＩＩＩ．抗体の作製方法
以下の方法は、最も一般的な抗体作製法のいくつかの代表例である。
【００５０】
Ａ．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体については、動物を用いて抗原の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射を複数回行って産生させるのが一般的である。本明細書で使用する場合、「抗原」という語は、抗体の作製に使用する任意のポリペプチドをいう。本発明に従って使用する抗原は、癌の細胞表面マーカーポリペプチドおよび眼特異的細胞表面マーカーを含む。
【００５１】
抗原または標的アミノ酸配列を含むフラグメントを、免疫対象の種に免疫原性を持つタンパク質、たとえば、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシチログロブリンまたは大豆トリプシン阻害剤に、二官能性物質または誘導体化剤、たとえば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基によるコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基による）、グリタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ２、またはＲおよびＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いてコンジュゲートすると有用である場合がある。
【００５２】
免疫原性コンジュゲートまたは誘導体で動物を免疫するには、コンジュゲートの１μｇの１ｍｇ（それぞれウサギまたはマウス）と３容のフロイント完全アジュバントとを組み合わせ、この溶液を複数の部位に皮内注射する。１ヶ月後、フロイント完全アジュバントに加えたコンジュゲートの当初量の１／５〜１／１０で、皮下注射により複数の部位で動物を追加免疫する。７〜１４日後、動物を脱血し、その血清の特異的な抗体価をアッセイする。力価がプラトーになるまで動物を追加免疫する。好ましくは、抗原は同じだが、別のタンパク質との、および／または別の架橋結合試薬によるコンジュゲートで動物を追加免疫する。また、コンジュゲートについては、組換え細胞培養を用いてタンパク質の融合体として作製してもよい。さらに、ミョウバンなどの凝集剤を用いて免疫応答を高める。
【００５３】
Ｂ．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られる。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかながら存在するかもしれない、自然発生する可能性がある突然変異を除いて同一である。したがって、修飾語句「モノクローナル」は、多種類の抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。
【００５４】
たとえば、本発明のモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）が最初に記載したハイブリドーマ法を用いて作製してもよいし、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）を用いて作製してもよい。
【００５５】
ハイブリドーマ法では、マウス、あるいはハムスターなど他の適当な宿主動物を上述のように免疫し、免疫に使用するタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するリンパ球、または産生する能力があるリンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫してもよい。その後、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を用いて、リンパ球を骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ １９８６）。
【００５６】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖および生存を阻害する１つまたは複数の物質を含む好適な培養基に播種し、増殖させる。たとえば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠損している場合、ハイブリドーマの培養基は一般に、ＨＧＰＲＴ−欠損細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む（ＨＡＴ培地）。
【００５７】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、かつ選択した抗体産生細胞からの安定かつ高レベルの抗体発現を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性がある細胞である。中でも好ましい骨髄腫細胞株は、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、およびアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡから入手できるＳＰ−２細胞由来の株など、マウスの骨髄腫株である。
【００５８】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養基を、標的抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降か、あるいはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ：ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）などのインビトロ結合アッセイにより判定する。
【００５９】
モノクローナル抗体の結合親和性は、たとえば、Ｍｕｎｓｏｎ ＆ Ｐｏｌｌａｒｄ（１９８０）のスキャッチャード解析により判定できる。
【００６０】
所望の特異性、親和性および／または活性を持つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定したら、クローンを限界希釈法でサブクローニングし、標準的な方法で増殖させる、Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）。このための好適な培養基として、たとえば、ダルベッコ変法イーグル培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地がある。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖させてもよい。
【００６１】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体については、たとえば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順で培養基、腹水または血清から好適に分離する。
【００６２】
本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（たとえば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブにより）容易に単離し、配列決定できる。本発明のハイブリドーマ細胞は、こうしたＤＮＡの好ましい供給源となる。単離したならば、ＤＮＡを発現ベクターに組み込み、次いで、本来ならば免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトし、この組換え宿主細胞でモノクローナル抗体を合成する。また、たとえば、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列で相同的なマウスの配列を置換したり、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合的に結合したりしてＤＮＡを修飾してもよい。このようにして、本明細書に記載した任意の個々の抗原に対して結合特異性を持つ「キメラ」または「ハイブリッド」抗体を調製する。
【００６３】
一般に、こうした非免疫グロブリンポリペプチドにより、本発明の抗体の定常ドメインを置換したり、本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインを置換したりして、標的抗原に対する特異性を持つ１つの抗原結合部位および別の抗原に対する特異性を持つもう１つ抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作製する。
【００６４】
また、キメラ抗体またはハイブリッド抗体は、架橋剤を含む方法など、タンパク質合成化学における既知の方法を用いてインビトロで調製してもよい。たとえば、ジスルフィド交換反応を用いるか、チオエーテル結合の形成により、免疫毒素を構築することができる。このための好適な試薬の例として、イミノチオラートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミダートが挙げられる。
【００６５】
診断用途では、一般に本発明の抗体を検出可能な部分で標識する。検出可能な部分は、直接的あるいは間接的に、検出可能なシグナルを発生できる任意のものでよい。たとえば、検出可能な部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉなどの放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミンまたはルシフェリンなどの蛍光または化学発光化合物；ビオチン；３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓもしくは１２５Ｉなどの放射性同位体標識またはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくは西洋わさびペルオキシダーゼなどの酵素であってもよい。
【００６６】
抗体を検出可能な部分に別々にコジュゲートするには、Ｈｕｎｔｅｒら（１９６２）；Ｄａｖｉｄら（１９７４）；Ｐａｉｎら（１９８１）；ａｎｄ Ｎｙｇｒｅｎ（１９８２）が記載した方法など、当該技術分野において任意の公知の方法を用いればよい。
【００６７】
本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイおよび免疫沈降アッセイ（Ｚｏｌａ，１９８７）など、任意の既知のアッセイ方法に用いてもよい。
【００６８】
競合結合アッセイは、限られた量の抗体との結合に際して、標識標準物質（精製した標的抗原またはその免疫学的に反応する部分であってもよい）が被検サンプルアナライトと競合する能力を利用する。被検サンプルの抗原の量は、抗体に結合する標準物質の量に反比例する。結合する標準物質の量を判定しやすくするため、通常、競合の前後に抗体を不溶化して、抗体に結合している標準物質およびアナライトを、非結合のままである標準物質およびアナライトと簡便に分離できるようにする。
【００６９】
サンドイッチアッセイでは、検出対象のタンパク質の異なる免疫原性部分またはエピトープに各々結合できる、２種の抗体を使用する。サンドイッチアッセイの場合、固体支持体に固定化した第１の抗体が被検サンプルアナライトに結合し、次いでアナライトに第２の抗体が結合するため、不溶性の３者の複合体が形成される。Ｄａｖｉｄ ＆ Ｇｒｅｅｎｅ、米国特許第４，３７６，１１０号。第２の抗体自体については、検出可能な部分で標識してもよいし（直接的サンドイッチアッセイ）、検出可能な部分で標識した抗免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい（間接的サンドイッチアッセイ）。たとえば、サンドイッチアッセイの１つのタイプとしてＥＬＩＳＡアッセイがあり、この場合、検出可能な部分は酵素である。
【００７０】
Ｃ．ヒト化抗体
既に論じたように、本発明の方法に使用する抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体でも、そのフラグメントでもよい。ただし、いくつかの態様では、処置対象の被検体に免疫応答（ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｓｅ）を引き起こさないように、抗体をヒト化した方が好ましい。非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において周知である。通常、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から１つまたは複数のアミノ酸残基が導入されている。こうした非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「インポート」残基と呼ばれ、一般に「インポート」可変ドメインから取り出す。ヒト化は本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者（Ｊｏｎｅｓら、１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８）に従って、齧歯動物のＣＤＲまたはＣＤＲ配列で、対応するヒト抗体の配列を置換することにより行うことできる。したがって、こうした「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（Ｃａｂｉｌｌｙ， ｓｕｐｒａ）、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に小さなドメインが、対応する非ヒト種由来の配列により置換されている。実際のヒト化抗体は一般に、いくつかのＣＤＲ残基、場合によってはいくつかのＦＲ残基も、齧歯動物抗体の類似部位由来の残基で置換されているヒト抗体である。
【００７１】
たとえば、標的細胞に結合し、細胞内に取り込まれる能力など、抗原に対する高親和性および他の好ましい生物学的特性を保持しつつ抗体をヒト化することが重要である。この目的を実現するには、好ましい方法に従い、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列および様々な概念的ヒト化産物を解析するプロセスによりヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択した候補免疫グロブリン配列の予想される三次元立体構造を図解で表示するコンピュータープログラムが有用である。そうした表示を調べれば、候補免疫グロブリン配列の機能において想定される残基の役割の解析、すなわち、候補免疫グロブリンの抗原への結合能に影響を与える残基の解析が可能になる。このようにして、コンセンサス配列およびインポート配列からＦＲ残基を選択し、組み合わせると、標的抗原（単数または複数）に対する親和性の向上など、所望の抗体特性を実現できる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合の作用に直接的に非常に大きく関与している。詳細については、１９９１年６月１４日に出願された米国特許出願第０７／７１５，２７２号の一部継続出願である１９９２年８月２１日に出願された米国特許出願第０７／９３４，３７３号を参照されたい。
【００７２】
Ｄ．ヒト抗体
ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法で作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を作製するためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株については、たとえば、Ｋｏｚｂｏｒ（１９８４） ａｎｄ Ｂｒｏｄｅｕｒら（１９８７）により記載されている。
【００７３】
現在では、内在性免疫グロブリンが産生されなくても、免疫によりヒト抗体のレパートリーを創出できるトランスジェニック動物（たとえば、マウス）を作製することができる。たとえば、生殖系列変異のキメラマウスを用いて抗体重鎖の結合領域（ＪＨ）遺伝子を同型接合的に欠損させると、内在性抗体の産生が完全に阻害されることが記載されている。こうした生殖系列変異マウスにヒト生殖系列免疫グロブリンの遺伝子アレイを移行すれば、抗原の攻撃によりヒト抗体が産生される。たとえば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）を参照されたい。
【００７４】
あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０）を用いて、非免疫ドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからインビトロでヒト抗体および抗体フラグメントを作製することもできる。この手法に従い、Ｍ１３またはｆｄなどの糸状バクテリオファージのメジャーコートタンパク質またはマイナーコートタンパク質の遺伝子のどちらかに、抗体Ｖドメイン遺伝子をインフレームでクローニングし、ファージ粒子の表面に機能的抗体フラグメントとして提示させる。
【００７５】
この糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡのコピーを含むため、抗体の機能特性に応じて選択を行えば、同時にその特性を示す抗体をコードする遺伝子を選択することにもなる。こうした点で、このファージは、Ｂ細胞の特性の一部と類似している。ファージディスプレイは、様々なフォーマットで行うことができる。総説として、たとえば、Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９３）を参照されたい。ファージディスプレイには、Ｖ遺伝子セグメントの複数の供給源を用いてもよい。Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）は、免疫したマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリーから、多様な抗オキサゾロン抗体を単離した。感作されていないヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーを作成してもよく、Ｍａｒｋｓら（１９９１）またはＧｒｉｆｆｉｔｈら（１９９３）が記載した技法に本質的に従って、多様な抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を単離することができる。自然免疫応答の場合、抗体遺伝子は、高い頻度で突然変異を積み重ねる（体細胞突然変異）。変化がある程度導入されると親和性が高まり、高親和性の表面免疫グロブリンを提示しているＢ細胞は、優先的に複製され、その後の抗原の攻撃の際に分化する。「鎖シャフリング」と呼ばれる手法を用いれば、この自然のプロセスを模倣できる（Ｍａｒｋｓら、１９９２）。この方法では、非免疫ドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然変異体（レパートリー）のレパートリーで重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を順次置換して、ファージディスプレイにより得られた「一次」ヒト抗体の親和性を向上させることができる。この技法を用いれば、ｎＭ範囲の親和性を持つ抗体および抗体フラグメントを作製できる。非常に大きなファージ抗体レパートリー（「マザーオブオールライブラリー」とも呼ばれる）を作成する戦略がＷａｔｅｒｈｏｕｓｅら（１９９３）により記載されており、こうした大きなファージライブラリーからの高親和性のヒト抗体の直接的な単離が報告されている。また、遺伝子シャフリングを用いても、出発齧歯動物抗体と同等の親和性および特異性を持つヒト抗体を齧歯動物抗体から得ることができる。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法によれば、ファージディスプレイ手法で得られた齧歯動物抗体の重鎖または軽鎖Ｖドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換して、齧歯動物−ヒトキメラを作製する。抗原の選択が、機能的抗原結合部位を回復できるヒト可変領域の単離につながる。すなわち、エピトープがパートナーの選択を支配する（インプリントする）。このプロセスを繰り返して残りの齧歯動物Ｖドメインを置換すると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日公開の国際公開第９３／０６２１３号を参照されたい）。この手法は、齧歯動物抗体のＣＤＲグラフティングによる従来のヒト化と異なり、齧歯動物由来のフレームワークまたはＣＤＲ残基を含まない完全なヒト抗体を提供する。
【００７６】
ＩＶ．核酸分子
ある態様では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドをコードする本発明は、核酸分子に関する。ある態様では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１核酸配列を核酸ベクターに組み込む。「ベクター」という語を使用する場合、核酸配列を挿入して核酸配列の複製が可能な細胞に導入できる、キャリア核酸分子をいう。核酸配列は「外来」であってもよい。外来とは、ベクターを導入する細胞にとって異質であるか、あるいは、その配列は細胞内の配列と同種であるが、宿主細胞の核酸内でその配列が通常確認されない位置にあることを意味する。ベクターとして、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス）および人工染色体（ＹＡＣなど）が挙げられる。当業者であれば、標準的な組換え技法によりベクターを構築することができるであろう（たとえば、どちらも参照によって本明細書に援用するＭａｎｉａｔｉｓら、１９８８ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９４を参照されたい）。
【００７７】
「発現ベクター」という語は、転写され得るＲＮＡをコードする核酸を含む遺伝子コンストラクトをいう。場合によっては、ＲＮＡ分子はその後タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳されるが、たとえば、アンチセンス分子またはリボザイムの生成においては、翻訳されない場合もある。発現ベクターは、様々な「制御配列」を含んでもよい。制御配列とは、個々の宿主細胞において、作動可能に連結されたコード配列の転写、場合によっては翻訳に必要な核酸配列をいう。ベクターおよび発現ベクターは、転写および翻訳を決定する制御配列に加えて、以下に記載する他の機能に役立つ核酸配列も含んでもよい。
【００７８】
Ａ．プロモーターおよびエンハンサー
「プロモーター」は、転写の開始および速度を制御する核酸配列の一領域である制御配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および分子が結合して、特異的転写核酸配列を開始する遺伝子エレメントを含んでもよい。「作動的に配置された」、「作動的に連結された」、「制御下」および「転写制御下」という語句は、プロモーターが、核酸配列の転写の開始および／または発現を制御するため、その配列に関して適切な機能的位置および／または方向にあることを意味する。
【００７９】
プロモーターは通常、ＲＮＡ合成の開始部位の位置を決める働きをする配列を含む。その最もよく知られた例としてＴＡＴＡボックスがあるが、たとえば、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターのようにＴＡＴＡボックスを欠損したプロモーターの中には、開始部位に重なる別のエレメントがそれ自体で開始場所を決める働きをするものもある。さらに、転写開始の頻度を調節するプロモーターエレメントもある。一般に、こうしたエレメントは開始部位から上流３０ １１０ｂｐ領域に位置するが、多くのプロモーターが、開始部位の下流にも機能エレメントを含むことが明らかになっている。コード配列をプロモーター「の制御下」に置くには、転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端を、選択したプロモーターの「下流」（すなわち、３’）に配置する。「上流の」プロモーターがＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促進する。
【００８０】
プロモーターエレメント間のスペースは融通が利く場合が多いため、各エレメントが相互に逆になったり、移動したりしてもプロモーター機能は保持される。ｔｋプロモーターの場合、活性を低下させずに、プロモーターエレメント間のスペースを５０ｂｐまで拡大することができる。個々のエレメントは、プロモーターに応じて、協同的にも、あるいは独立的にも機能して転写を活性化できると考えられる。プロモーターは、「エンハンサー」と併用する場合もあれば、そうでない場合もある。エンハンサーとは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性制御配列をいう。
【００８１】
プロモーターは、コードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離して得られるような、核酸配列に天然に関連するものであってもよい。こうしたプロモーターは、「内在性」という場合がある。同様に、エンハンサーも、核酸配列の下流あるいは上流に位置する、その配列に天然に関連するものであってもよい。あるいは、核酸コードセグメントを組換えまたは異種プロモーターの制御下に置いても、いくつかの利点が得られるであろう。組換えまたは異種プロモーターとは、天然環境において核酸配列に通常関連しないプロモーターである。また、組換えまたは異種エンハンサーとは、天然環境において核酸配列に通常関連しないエンハンサーである。こうしたプロモーターまたはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、任意の他のウイルスまたは原核生物細胞もしくは真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および非「天然の」、すなわち、様々な転写調節領域の様々なエレメントおよび／または発現を変化させる突然変異を含むプロモーターまたはエンハンサーを含めてもよい。たとえば、組換えＤＮＡの構築に最も多く使われているプロモーターとして、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースおよびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が挙げられる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列については合成的に生成する以外にも、本明細書に開示した組成物と共に組換えクローニングおよび／またはＰＣＲ（商標）などの核酸増幅技術を用いて生成してもよい（各々参照によって本明細書に援用する米国特許第４，６８３，２０２号および同第５，９２８，９０６号を参照されたい）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体および同種のものなど、非核性オルガネラ内の配列の転写および／または発現を指令する制御配列を用い得ることも意図している。
【００８２】
当然ながら、発現のために選択したオルガネラ、細胞型、組織、器官または生体においてＤＮＡセグメントの発現を効果的に指令するプロモーターおよび／またはエンハンサーを用いることが重要である。分子生物学の当業者であれば、通常、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサーおよび細胞型の組み合わせの使用について知っている（たとえば、参照によって本明細書に援用するＳａｍｂｒｏｏｋら１９８９を参照されたい）。使用するプロモーターは、構成的であっても、組織特異的であっても、誘導性であっても、および／または、組換えタンパク質および／またはペプチドの大規模な作製に都合がよいなど、適当な条件下で、導入したＤＮＡセグメントの高レベルの発現を指令するのに有用であってもよい。プロモーターは、異種性でも、内在性でも構わない。
【００８３】
さらに、（たとえば、真核生物プロモーターデータベースＥＰＤＢ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐｄ．ｉｓｂ−ｓｉｂ．ｃｈ／のように）任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせを用いて発現を誘導してもよい。もう１つの可能な実施形態として、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６細胞質発現系の使用がある。真核細胞では、送達複合体の一部としてまたは他の遺伝子発現コンストラクトとして適当な細菌ポリメラーゼを供給すれば、ある種の細菌プロモーターからの細胞質転写が可能である。
【００８４】
組織特異的プロモーターまたはエレメントの種類およびその活性の特徴付けを行うアッセイは、当業者によく知られている。こうした領域の非限定的な例には、ヒトＬＩＭＫ２遺伝子（Ｎｏｍｏｔｏら１９９９）、ソマトスタチン受容体２遺伝子（Ｋｒａｕｓ ｅｔ．ａｌ．，１９９８）、マウス精巣上体レチノイン酸結合遺伝子（Ｌａｒｅｙｒｅ ｅｔ．ａｌ．，１９９９）、ヒトＣＤ４（Ｚｈａｏ−Ｅｍｏｎｅｔ ｅｔ．ａｌ．，１９９８）、マウスα２（ＸＩ）コラーゲン（Ｔｓｕｍａｋｉ，ｅｔ．ａｌ．，１９９８）、Ｄ１Ａドーパミン受容体遺伝子（Ｌｅｅ，ｅｔ．ａｌ．，１９９７）、インスリン様成長因子ＩＩ（Ｗｕ ｅｔ．ａｌ．，１９９７）およびヒト血小板内皮細胞接着分子−１（Ａｌｍｅｎｄｒｏ ｅｔ．ａｌ．，１９９６）がある。
【００８５】
Ｂ．開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位
また、コード配列の効率的な翻訳には、特異的開始シグナルが必要な場合もある。こうしたシグナルには、ＡＴＧ開始コドンまたはそれに隣接する配列がある。ＡＴＧ開始コドンを含む外来性転写制御シグナルの供給が必要な場合もある。当業者であれば、こうしたことを容易に判定し、必要なシグナルを供給できるであろう。インサート全体の翻訳を確保するには、所望のコード配列のリーディンフレームと開始コドンが「インフレーム」でなければならないことはよく知られている。外来性の転写制御シグナルおよび開始コドンは、天然であっても、あるいは合成であってもよい。適切な転写エンハンサーエレメントを加えることで、発現の効率が高まる場合がある。
【００８６】
本発明のある実施形態では、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）エレメントを用いて多重遺伝子またはポリシストロニックメッセージを生成する。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化キャップ依存的翻訳のリボソームスキャニングモデルを介さずに、内部部位で翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメント（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）、および哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳ（Ｍａｃｅｊａｋ ａｎｄ Ｓａｒｎｏｗ，１９９１）が記載されている。ＩＲＥＳエレメントは、異種のオープンリーディングフレームに結合できる。ＩＲＥＳにより分断された複数のオープンリーディングフレームがそれぞれ一緒に転写され、ポリシストロニックメッセージが生成され得る。ＩＲＥＳエレメントにより、各オープンリーディングフレームはリボソームに到達し、効率的に翻訳を行うことができる。同義遺伝子については、単一のメッセージを転写する単一のプロモーター／エンハンサーを用いて効率的に発現させることができる（参照によって本明細書に援用する米国特許第５，９２５，５６５号および同第５，９３５，８１９号を参照されたい）。
【００８７】
Ｃ．マルチプルクローニングサイト
ベクターは、複数の制限酵素部位を含む核酸領域であるマルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）を含んでもよく、ベクターを消化するには、標準的な組換え技法と共にどのマルチプルクローニングサイトを用いてもよい（たとえば、参照によって本明細書に援用するＣａｒｂｏｎｅｌｌｉ ｅｔ．ａｌ．，１９９９，Ｌｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，１９９８，ａｎｄ Ｃｏｃｅａ，１９９７を参照されたい）。「制限酵素消化」とは、核酸分子の特異的場所でのみ機能する酵素による核酸分子の触媒的切断をいう。こうした制限酵素の多くが市販されている。こうした酵素の使用は、当業者により広く理解されている。頻繁には、ＭＣＳ内で切断する制限酵素を用いてベクターを直線化または断片化して、外来性の配列をベクターにライゲートできるようにする。「ライゲーション」とは、相互に近接していても、していなくてもよい２つの核酸フラグメント間にホスホジエステル結合を形成するプロセスをいう。制限酵素およびライゲーション反応に関する技法は、組換え技術の当業者によく知られている。
【００８８】
Ｄ．スプライシング部位
転写された真核生物ＲＮＡ分子の大部分ではＲＮＡスプライシングが行われ、イントロンが一次転写物から除去される。真核生物のゲノム配列を含むベクターで、タンパク質発現のため転写物のプロセシングが適切に行われるには、ドナーおよび／またはアクセプタースプライシング部位が必要な場合がある（たとえば、参照によって本明細書に援用するＣｈａｎｄｌｅｒ ｅｔ．ａｌ．，１９９７を参照されたい）。
【００８９】
Ｅ．終結シグナル
本発明のベクターまたはコンストラクトは通常、少なくとも１つの終結シグナルを含む。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写物の特異的終結に関与するＤＮＡ配列からなる。したがって、ある実施形態では、ＲＮＡ転写物の産生を終了させる終結シグナルを意図している。インビボで望ましいメッセージレベルを得るにはターミネーターが必要な場合もある。
【００９０】
真核生物系では、ターミネーター領域は、新しい転写物が部位特異的に切断され、ポリアデニル化部位が露出されるようにする特異的なＤＮＡ配列をさらに含む。この配列は、特殊な内在性ポリメラーゼにシグナルを送り、転写物の３’末端に約２００Ａ残基の配列（ポリＡ）を付加する。このポリＡテールでＲＮＡ分子が修飾されると安定性が高まり、翻訳の効率が高まると考えられる。したがって、真核生物を含む他の実施形態では、ターミネーターはＲＮＡ切断のためのシグナルを含むことが好ましく、ターミネーターシグナルは、メッセージのポリアデニル化を促進することが一層好ましい。ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位エレメントはメッセージレベルを増強し、そのカセットが他の配列に読み取られるのを最小限に抑える役目を果たすことができる。ある特定の場合には、ポリアデニル化シグナルは、米国特許出願公開第２００５／０１７５５９１号に記載されているようなニューロピリン１からのシグナルであってもよい。
【００９１】
本発明での使用を意図しているターミネーターは、本明細書に記載した、または当業者に公知の任意の転写ターミネーターを含み、たとえば、ウシ成長ホルモンターミネーターなどの遺伝子の終結配列またはＳＶ４０ターミネーターなどのウイルス終結配列があるが、これに限定されるものではない。ある実施形態では、終結シグナルは、配列切断などにより、転写可能または翻訳可能な配列がなくてもよい。
【００９２】
Ｆ．複製起点
ベクターは、宿主細胞中でベクターを増殖させるため、複製を開始する特異的核酸配列である１つまたは複数の複製起点部位（「ｏｒｉ」と呼ばれる場合もある）を含んでもよい。あるいは、宿主細胞が酵母の場合、自己複製配列（ＡＲＳ：ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を用いてもよい。
【００９３】
Ｇ．選択可能なマーカーおよびスクリーニング可能なマーカー
本発明のある実施形態では、発現ベクターにマーカーを組み込むことで、本発明の核酸コンストラクトを含む細胞をインビトロまたはインビボで同定することができる。こうしたマーカーが細胞に同定可能な変化を与えれば、発現ベクターを含む細胞を容易に同定できるであろう。通常、選択可能なマーカーは、選択を可能にする特性を与えるマーカーである。マーカーが存在すると選択が可能になるのがポジティブ選択可能マーカーであり、マーカーが存在すると選択ができなくなるのがネガティブ選択可能マーカーである。ポジティブ選択可能マーカーの例として、薬剤耐性マーカーがある。
【００９４】
薬剤選択マーカーを組み込むと、ほとんどの場合、形質転換体のクローニングおよび同定の助けになり、たとえば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を与える遺伝子は、有用な選択可能なマーカーである。各条件が実施されると形質転換体の識別が可能になる表現型を与えるマーカー以外にも、比色分析に基礎を置くＧＦＰのようなスクリーニング可能なマーカーなどの他のタイプのマーカーも意図している。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ：ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ：ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）などのスクリーニング可能な酵素を用いてもよい。さらに、当業者であれば、ＦＡＣＳ分析との併用が可能な免疫学的マーカーの使用方法も知っているであろう。使用するマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現するのあれば、重要でないと考えられる。別の選択可能およびスクリーニング可能なマーカーも当業者によく知られている。
【００９５】
Ｈ．プラスミドベクター
ある実施形態では、宿主細胞の形質転換に使用するプラスミドベクターを意図している。一般に、そうした宿主には、宿主細胞に適合する種に由来するレプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターを用いる。ベクターは通常、複製部位のほか、表現型による形質転換細胞の選抜を可能にするマーキング配列を含む。非限定的な例では、大腸菌種由来のプラスミドｐＢＲ３２２の誘導体を用いて大腸菌を形質転換することが多い。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含んでおり、したがって、形質転換細胞の同定を容易にする手段となる。ｐＢＲプラスミドまたは他の微生物プラスミドもしくはファージは、たとえば、微生物体がそれ自身のタンパク質発現のために使用できるプロモーターをさらに含むか、あるいは含むように改変する必要がある。
【００９６】
さらに、こうした宿主に関しては、宿主微生物に適合性があるレプリコンおよび制御配列を含むファージベクターを形質転換ベクターとして用いてもよい。たとえば、ファージλＧＥＭＴＭ１１を、宿主細胞、たとえば、大腸菌ＬＥ３９２の形質転換に使用できる組換えファージベクターの作製に用いても構わない。
【００９７】
さらに、有用なプラスミドベクターとして、ｐＩＮ ベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ｅｔ．ａｌ．，１９８５）；およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ：ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）可溶性融合タンパク質の作製に使用し、後に精製および分離されるか、切断されるｐＧＥＸベクターが挙げられる。他の好適な融合タンパク質には、βガラクトシダーゼ、ユビキチンおよび同種のものとの融合タンパク質がある。
【００９８】
好適な培地は多くあり、ＬＢのような任意の好適な培地を用いて、発現ベクターを含む細菌の宿主細胞、たとえば、大腸菌を増殖させる。ある種のベクターを用いて組換えタンパク質の発現を誘導するには、当業者には明らかなように、あるプロモーターに特異的な薬と宿主細胞とを接触させて、たとえば、ＩＰＴＧを培地に加えたり、あるいは、インキュベーション温度を高温に切り替えたりする。通常２〜２４時間かけてさらに細菌を培養した後、遠心分離により細胞を集め、洗浄して残った培地を取り除く。
【００９９】
Ｉ．ウイルスベクター
個々のウイルスについては、細胞に感染したり、受容体を介したエンドサイトーシスにより細胞に進入したりする能力、および宿主細胞ゲノムに統合され、安定かつ効率的にウイルス遺伝子を発現する能力があれば、外来核酸を細胞（たとえば、哺乳動物細胞）に導入する魅力的な候補物質となる。本発明のＤＮ ＲＴＥＦ−１成分は、ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチド（ｐｏｌｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするウイルスベクターであってもよい。本発明の核酸の送達に用いてもよいウイルスベクターの非限定的な例を以下に記載する。
【０１００】
１．アデノウイルスベクター
特定の核酸の送達方法では、アデノウイルス発現ベクターを使用する。アデノウイルスベクターはゲノムＤＮＡに組み込まれる能力が低いことが知られている。しかし、こうした特徴はあるものの、その代わりにこのベクターでは高効率の遺伝子導入が得られる。「アデノウイルス発現ベクター」とは、（ａ）コンストラクトのパッケージングを支持し、（ｂ）その中にクローニングされている、組織または細胞特異的コンストラクトを最終的に発現する、十分なアデノウイルス配列を含有するコンストラクトを含むことを意味する。遺伝子構造またはアデノウイルスが３６ｋｂの直鎖状二本鎖ＤＮＡウイルスであることが分かっており、大きなアデノウイルスＤＮＡ断片を７ｋｂまで外来配列で置換できる（Ｇｒｕｎｈａｕｓ ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２）。
【０１０１】
２．ＡＡＶ（ａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）ベクター
アデノウイルスを使用したトランスフェクションにより、核酸を細胞に導入してもよい。アデノウイルス結合系を用いると、細胞系のトランスフェクション効率が高まることが報告されている（Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ａｎｄ Ｖｏｓ，１９９４；Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ．ａｌ．，１９９２；Ｃｕｒｉｅｌ，１９９４）。本発明のＤＮ ＲＴＥＦ−１発現カセットの送達に使用するベクター系として、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が注目される。その理由として、アデノ随伴ウイルスは組み込まれる頻度が高いうえ、非分裂細胞に感染できるため、たとえば、組織培養（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２）またはインビボで遺伝子を哺乳動物細胞に送達するのに有用である。ＡＡＶは、感染できる宿主域も広い（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ．ａｌ．，１９８４；Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ．ａｌ．，１９８６；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ．ａｌ．，１９８８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ．ａｌ．，１９８８）。ｒＡＡＶベクターの作製および使用に関する詳細は、それぞれ参照によって本明細書に援用する米国特許第５，１３９，９４１号および同第４，７９７，３６８号に記載されている。
【０１０２】
３．レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、遺伝子を宿主ゲノムに組み込み能力、大量の外来遺伝子材料を導入する能力、幅広い種および細胞型に感染する能力ならびに特殊な細胞株にパッケージングされる能力により、治療用のＤＮ ＲＴＥＦ−１送達ベクターとして有望である（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２）。
【０１０３】
ＤＮ ＲＴＥＦ−１レトロウイルスベクターを構築するには、特定のウイルス配列の代わりに（たとえば、ＤＮ ＲＴＥＦ−１をコードする）核酸をウイルスゲノムに挿入して、複製欠損のウイルスを作製する。ビリオンを作製するため、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎ ｅｔ．ａｌ．，１９８３）。ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを、レトロウイルスのＬＴＲおよびパッケージング配列と共に特殊な細胞株に（たとえば、リン酸カルシウム沈殿により）導入すると、パッケージング配列により組換えプラスミドのＲＮＡ転写物がウイルス粒子にパッケージングされ、その後、培養基に分泌される（Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６；Ｍａｎｎ ｅｔ．ａｌ．，１９８３）。次いで、組換えレトロウイルスを含む培地を回収し、任意に濃縮し、遺伝子導入に使用する。レトロウイルスベクターは、多様な細胞型に感染することができる。しかしながら、組み込みおよび安定発現には、宿主細胞の分裂が不可欠である（Ｐａｓｋｉｎｄ ｅｔ．ａｌ．，１９７５）。
【０１０４】
レンチウイルスは、一般的なレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに加えて、制御または構造機能を持つ他の遺伝子を含む複雑なレトロウイルスである。レンチウイルスベクターを用いた血管形成阻害分子の送達方法は、以前に記載されており、たとえば、参照によって本明細書に援用する米国特許第７，１２２，１８１号を参照されたい。レンチウイルスベクターは、当該技術分野において周知である（たとえば、Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ．ａｌ．，１９９６；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ．ａｌ．，１９９７；Ｂｌｏｍｅｒ ｅｔ．ａｌ．，１９９７；米国特許第６，０１３，５１６号および同第５，９９４，１３６号を参照されたい）。レンチウイルスのいくつかの例として、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびサル免疫不全ウイルス：ＳＩＶが挙げられる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ病原性遺伝子を多重弱毒化して作製されており、たとえば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆが欠失しているため、生物学的に安全である。
【０１０５】
組換えレンチウイルスベクターは非分裂細胞への感染が可能で、インビボとエキソビボとで遺伝子導入および核酸配列の発現に用いることができる。たとえば、好適な宿主細胞に、パッケージング機能、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖならびにｒｅｖおよびｔａｔを有する２つ以上のベクターをトランスフェクトする、非分裂細胞への感染が可能な組換えレンチウイルスが、参照によって本明細書に援用する米国特許第５，９９４，１３６号に記載されている。エンベロープタンパク質を、抗体または特定の細胞型の受容体を標的化した特定のリガンドと連結して、組換えウイルスを標的化してもよい。ウイルスベクターは、たとえば、ベクターに目的の配列（制御領域など）を、特異的な標的細胞の受容体リガンドをコードする別の遺伝子と一緒に挿入した時点で、標的特異的となる。
【０１０６】
４．他のウイルスベクター
本発明では、他のウイルスベクターをワクチンコンストラクトとして用いてもよい。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｃｏｕｐａｒ ｅｔ．ａｌ．，１９８８）、シンドビスウイルス、サイトメガロウイルスおよび単純ヘルペスウイルスなどのウイルス由来のベクターを用いても構わない。こうしたベクターは、様々な哺乳動物細胞にとっていくつかの魅力的な特徴を備えている（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｃｏｕｐａｒ ｅｔ．ａｌ．，１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈ ｅｔ．ａｌ．，１９９０）。
【０１０７】
５．改変ウイルスによる送達
送達対象の核酸は、特異的な結合リガンドを発現するように設計してある感染性ウイルスに組み込んでもよい。この場合、このウイルス粒子は、標的細胞の同族の受容体に特異的に結合し、その内容を細胞に送達する。ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾を利用して、レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能にするように設計された新しいアプローチが開発された。この修飾により、シアロ糖タンパク質受容体を介した肝実質細胞の特異的感染が可能になり得る。
【０１０８】
レトロウイルスのエンベロープタンパク質および特異的細胞受容体に対するビオチン化抗体を用いた、組換えレトロウイルスを標的化する別のアプローチも設計された。この抗体を、ビオチン成分を介してストレプトアビジンに結合させた（Ｒｏｕｘ ｅｔ．ａｌ．，１９８９）。主要組織適合性複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を用いて、この表面抗原を持った様々なヒト細胞がインビトロでエコトロピックウイルスに感染することが明らかになった（Ｒｏｕｘ ｅｔ．ａｌ．，１９８９）。
【０１０９】
Ｊ．ベクターによる送達および細胞の形質転換
本発明に使用されるオルガネラ、細胞、組織または生体を形質転換するために核酸を送達する好適な方法は実質的に、核酸（たとえば、ＤＮＡ）をオルガネラ、細胞、組織または生体に導入できるのであれば、本明細書に記載の、あるいは当業者に知られているどのような方法でもよいと考えられる。こうした方法として、エキソビボでのトランスフェクション（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，１９８９，Ｎａｂｅｌら、１９８９）、マイクロインジェクション（Ｈａｒｌａｎｄ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５；参照によって本明細書に援用する米国特許第５，７８９，２１５号）などの注射（それぞれ参照によって本明細書に援用する米国特許第５，９９４，６２４号、同第５，９８１，２７４号、同第５，９４５，１００号、同第５，７８０，４４８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，７０２，９３２号、同第５，６５６，６１０号、同第５，５８９，４６６号および同第５，５８０，８５９号）などによるＤＮＡの直接送達；エレクトロポレーション（参照によって本明細書に援用する米国特許第５，３８４，２５３号；Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ ｅｔ．ａｌ．，１９８６；Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ．ａｌ．，１９８４）；リン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ，１９７３；Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，１９８７；Ｒｉｐｐｅ ｅｔ．ａｌ．，１９９０）；ＤＥＡＥデキストランに続くポリエチレングリコールの使用（Ｇｏｐａｌ．，１９８５）；直接音波負荷（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ ｅｔ．ａｌ．，１９８７）；リポソームによるトランスフェクション（Ｎｉｃｏｌａｕ ａｎｄ Ｓｅｎｅ，１９８２；Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ．ａｌ．，１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕ ｅｔ．ａｌ．，１９８７；Ｗｏｎｇ ｅｔ．ａｌ．，１９８０；Ｋａｎｅｄａ ｅｔ．ａｌ．，１９８９；Ｋａｔｏ ｅｔ．ａｌ．，１９９１）および受容体を介したトランスフェクション（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８７；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８８）；微粒子銃（それぞれ参照によって本明細書に援用する国際公開第９４／０９６９９号および同第９５／０６１２８号；米国特許第５，６１０，０４２号；同第５，３２２，７８３号 同第５，５６３，０５５号、同第５，５５０，３１８号、同第５，５３８，８７７号および同第５，５３８，８８０号）；炭化ケイ素繊維による撹拌（Ｋａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ．ａｌ．，１９９０；それぞれ参照によって本明細書に援用する米国特許第５，３０２，５２３号および同第５，４６４，７６５号）；アグロバクテリウムによる形質転換（それぞれ参照によって本明細書に援用する米国特許第５，５９１，６１６号および同第５，５６３，０５５号）；ＰＥＧによるプロトプラストの形質転換（Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈ ｅｔ．ａｌ．，１９９３；それぞれ参照によって本明細書に援用する米国特許第４，６８４，６１１号および同第４，９５２，５００号）；乾燥／阻害によるＤＮＡの取り込み（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ｅｔ．ａｌ．，１９８５）およびこうした方法の任意の組み合わせがあるが、これに限定されるものではない。こうした技法を用いて、オルガネラ（単数または複数）、細胞（単数または複数）、組織（単数または複数）または生体（単数または複数）を安定に形質転換しても、一過性に形質転換してもよい。
【０１１０】
Ｖ．治療方法
Ａ．医薬調製物
本発明の方法に使用する治療用組成物については、薬理学的に許容される形に製剤化してもよい。「薬学的または薬理学的に許容される」という語句は、必要に応じてヒトなどの動物に投与したとき、有害反応、アレルギー反応または他の有害な反応を引き起こさない分子的実体および組成物をいう。少なくとも１種のＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドまたは核酸活性成分を含む医薬組成物の調製については、参照によって本明細書に援用するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０に例示されているように、本開示によって当業者に知られることになる。さらに、動物（ヒトなど）への投与では、調節物は、ＦＤＡの生物学的基準（ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）が求めるような無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度基準に適合する必要があることは言うまでもない。
【０１１１】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容されるキャリア」には、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（たとえば、抗菌薬、抗真菌薬）、等張剤、吸収遅延剤、塩類、防腐剤、薬剤、薬剤安定剤、ゲル、バインダー、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、着香剤、色素、当業者に知られているような同様の材料およびそれらの組み合わせが含まれる（たとえば、参照によって本明細書に援用するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，１９９０を参照されたい）。薬学的に許容されるキャリアは、好ましくはヒトへの投与用に製剤化されている。一方、ある実施形態では、イヌなどの非ヒト動物への投与用に製剤化されているが、（たとえば、政府規制により）ヒトへの投与が認められない薬学的に許容されるキャリアの使用が望ましい場合がある。キャリアが活性成分と不適合でない限り、従来のどのようなキャリアも治療用組成物または医薬組成物での使用を意図している。
【０１１２】
被検体に投与される本発明の組成物の実際の投薬量については、患者の体重、状態の重症度、処置対象の病型、過去または現在の治療介入、特発性および投与経路など、身体的および生理的要因から判定することができる。いずれにしろ、投与に責任を負う開業医が、組成物中の活性成分（単数または複数）の濃度および個々の被検体に対する適切な用量（単数または複数）を判定することになる。
【０１１３】
ある実施形態では、医薬組成物は、たとえば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含んでもよい。他の実施形態では、活性化合物は、１単位の重量の約２％〜約７５％または約２５％〜約６０％、さらに、たとえば、そこから導き出せる任意の範囲を含んでもよい。他の非限定的な例では、用量はまた、１回の投与につき約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重またはそれ以上、さらにそこから導き出せる任意の範囲を含んでもよい。本明細書に記載した数字から導き出せる範囲の非限定的な例では、上述の数字に基づき、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲を投与することができる。
【０１１４】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、哺乳動物の眼への使用に好適である。たとえば、この製剤は、溶液、懸濁液またはゲルであってもよい。いくつかの実施形態では、この組成物を、硝子体内埋め込み製剤のような生分解性埋め込み製剤または結膜表面に添加するように設計された眼内挿入物などの眼内挿入物により投与する。いくつかの実施形態では、治療薬は、医療装置または埋め込み型装置をコーティングしている。
【０１１５】
好ましい態様では、滴剤形態の水溶液を用いて本発明の製剤を眼に使用する。こうした滴剤については、単回投与アンプルから送達してもよい。単回投与アンプルは、好ましくは無菌であり、したがって、製剤には静菌成分が不要な場合がある。あるいは、好ましくは送達の際に製剤から防腐剤を抽出する装置を含んでいてもよい反復投与ビンから、滴剤を送達しても構わない。そうした装置は、当該技術分野において公知である。
【０１１６】
他の態様では、目蓋の下に添加する溶解可能な挿入物になっている濃縮ゲルまたは類似のビヒクルとして本発明の成分を眼に送達してもよい。
【０１１７】
さらに、本発明の治療用組成物は、液体溶液あるいは懸濁液として注射用組成物の形で投与してもよい；注射前の液体中の溶液または懸濁液に好適な固形を調製してもよい。こうした調製物は、さらに乳化しても構わない。こうした目的のための典型的な組成物は、薬学的に許容されるキャリアを含む。たとえば、この組成物は、リン酸塩緩衝生理食塩水１ミリリットル当たりヒト血清アルブミンを１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇまたは最大約１００ｍｇ含んでもよい。他の薬学的に許容されるキャリアとしては、水溶液、塩類、防腐剤、緩衝液および同種のものなどの無毒性の賦形剤が挙げられる。
【０１１８】
非水性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油およびエチルオレアートなどの注射用有機エステルがある。水性キャリアには、水、アルコール／水溶液、食塩水溶液、塩化ナトリウム、リンゲルデキストロースなどの非経口ビヒクルがある。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補液がある。防腐剤としては、抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤および不活性ガスが挙げられる。様々な成分医薬組成物のｐＨおよび厳密な濃度は、周知のパラメーターによって調整する。
【０１１９】
さらなる製剤は、経口投与に好適である。経口製剤は、たとえば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムおよび同種のものなどの典型的な賦形剤を含む。この組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤または散剤の形態をとる。経路が局部の場合、形態は、クリームでも、軟膏剤でも、軟膏でも、噴霧剤でもよい。
【０１２０】
治療用組成物の有効量については、初期の目的に基づき判定する。「単位用量」または「投薬量」という語は、被検体に使用するのに好適な物理的に分離した単位をいい、各単位は、その投与、言い換えれば、適切な経路および処置レジメンに伴い、上記で論じた所望の応答が得られるように計算された所定量の治療用組成物を含む。処置剤の数と単位用量とに従って投与される量は、所望の保護作用によって異なる。したがって、場合によっては、たとえば、被検体の血清中インスリンまたはグルコースのレベルの変化を測定して投薬量を決定してもよい。
【０１２１】
また、治療用組成物の正確な量は開業医の判断によっても左右される場合があり、１人１人異なる。用量に影響する要因として、患者の身体的および臨床的状態、投与経路、処置の初期の目的（特定の血清中インスリンまたはグルコース濃度の達成と症状の軽減との対比など）ならびに個々の治療物質の効力、安定性および毒性が挙げられる。
【０１２２】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、哺乳動物の眼に使用するのに好適である。たとえば、この製剤は、溶液でも、懸濁液でも、ゲルでもよい。いくつかの実施形態では、この組成物を、硝子体内埋め込み製剤のような生分解性埋め込み製剤または結膜表面に添加するように設計された眼内挿入物などの眼内挿入物により投与する。いくつかの実施形態では、治療薬は、医療装置または埋め込み型装置をコーティングしている。
【０１２３】
好ましい態様では、滴剤形態の水溶液を用いて本発明の製剤を眼に使用する。こうした滴剤については、単回投与アンプルから送達してもよい。単回投与アンプルは、好ましくは無菌であり、したがって、製剤には静菌成分が不要な場合がある。あるいは、好ましくは送達の際に製剤から防腐剤を抽出する装置を含んでいてもよい反復投与ビンから、滴剤を送達しても構わない。そうした装置は、当該技術分野において公知である。
【０１２４】
他の態様では、目蓋の下に添加する溶解可能な挿入物になっている濃縮ゲルまたは類似のビヒクルとして本発明の成分を眼に送達してもよい。
【０１２５】
Ｂ．追加の療法
上記のように、ある態様では、他の血管形成阻害療法または抗癌療法と組み合わせて、あるいはそれと併用して本発明の治療方法を用いてもよい。
【０１２６】
１．化学療法
本発明のある実施形態では、化学療法剤と併用してＤＮ ＲＴＥＦ−１を投与する。本発明による方法には、たとえば、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロースウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、パクリタキセル、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファルネシル−タンパク質タンスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ベルケイド、ビンブラスチンおよびメトトレキサートまたは前記の任意のアナログまたは誘導変異体を用いてもよい。
【０１２７】
２．放射線治療
本発明のある種のさらなる実施形態では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１組成物を用いて放射線療法に対する細胞の感受性を高める。放射線治療として、たとえば、γ線、Ｘ線および／または腫瘍細胞への放射性同位元素の直接送達が挙げられる。本発明の方法によれば、場合によっては、マイクロ波および／またはＵＶ照射を用いても構わない。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３〜４週間）の場合、１日５０〜２００レントゲン、単回照射では２０００〜６５１０レントゲンである。放射性同位元素の投与量は種々様々であり、同位元素の半減期、放射される放射線の強度およびタイプならびに新生細胞による取り込みによって異なる。
【０１２８】
「接触させる」および「曝露する」という語は、本明細書で細胞に用いる場合、治療用コンストラクトと化学療法剤または放射線治療剤とを標的細胞に送達したり、標的細胞の近位に直接導入したりするプロセスをいう。細胞の殺傷または増殖停止を実現するには、細胞を殺傷する、あるいは細胞分裂を阻止するのに効果的な量を組み合わせて、２つの薬を細胞に送達する。
【０１２９】
３．免疫療法
免疫療法は通常、癌細胞を標的として破壊する免疫エフェクター細胞および分子の力を借りる。免疫エフェクターは、たとえば、腫瘍細胞の表面上の何らかのマーカーに対して特異的な抗体であってもよい。抗体は単独で治療のエフェクターとしての役割を果たしてもよいし、実際に細胞の殺傷を行う他の細胞をリクルートしてもよい。また、抗体については、薬剤またはトキシン（化学療法薬、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）にコンジュゲートし、単に標的化剤の機能を果たすだけでもよい。あるいは、エフェクターは、直接的あるいは間接的に腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を含むリンパ球であってもよい。細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞など、様々なエフェクター細胞がある。
【０１３０】
したがって、免疫療法を遺伝子治療と併用して併用療法の一部として用いてもよい。併用療法の一般的なアプローチを以下で考察する。通常、腫瘍細胞は、標的化に適した、すなわち、他の大部分の細胞には存在しない何らかのマーカーを持っているはずである。多くの腫瘍マーカーが存在しており、本発明においては、そのどれも標的化に好適である。一般的な腫瘍マーカーとして、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂ Ｂ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ｇｐ２４０およびｐ１５５が挙げられる。
【０１３１】
４．遺伝子
なお別の実施形態では、本発明の細胞標的化コンストラクトの前、後または同時に治療用ポリヌクレオチドを投与する遺伝子治療。ＤＮ ＲＴＥＦ−１を、１つまたは複数の他の遺伝子産物をコードするベクターと併用して送達すれば、標的組織に対する過剰増殖抑制作用が総合される場合がある。本発明には種々の遺伝子が包含され、たとえば、ＤＮ ＲＴＥＦ−１組成物と併用してｐ５３をコードする遺伝子を送達してもよい。
【０１３２】
５．手術
癌患者の約６０％が、予防的手術、診断的手術または病期分類的手術、治療的手術および対症的手術など、ある種の手術を受ける。治療的手術とは癌の処置であり、本発明の処置、化学療法、放射線治療、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法および／または代替療法など、他の療法と併用して行ってもよい。本発明のＤＮ ＲＴＥＦ−１療法剤（ｔｈｅｒａｐｙ）は、単独で用いても、切除前に腫瘍の大きさを縮小させるようなネオアジュバント療法として細傷害性療法と組み合わせて用いてもよいし、あるいは、腫瘍の一部または全部の摘出後に手術台を滅菌するなど、術後アジュバント療法として用いてもよい。
【０１３３】
治療的手術は、癌性組織の全部または一部を物理的に除去、切除および／または破壊する切除を含む。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することをいう。手術による処置には、腫瘍切除以外にも、レーザー手術、冷凍手術、電気手術および顕微手術（Ｍｏｈｓ手術）がある。さらに、本発明を、表在性癌、前癌または周辺の正常組織の除去と併用して用いてもよいことも意図している。
【０１３４】
癌性の細胞、組織または腫瘍全体の一部を切除する際、体内に空洞が形成されることある。この領域については、追加の抗癌療法剤（ｔｈｅｒａｐｙ）を用いて、灌流、直接注射または局所投与により処置を行ってもよい。こうした処置を、たとえば、１、２、３、４、５、６または７日間ごとに、あるいは１、２、３、４および５週間ごとに、あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヶ月間ごとに繰り返してもよい。この処置剤の投薬量も様々であって構わない。
【０１３５】
６．他の薬
さらに、本発明と併用して、あるいは前述した任意の他の癌療法と組み合わせて、ホルモン療法を用いてもよい。乳癌、前立腺癌、卵巣癌または子宮頸癌など、ある種の癌の処置にホルモンを用いれば、テストステロンまたはエストロゲンなどの一定のホルモンのレベルを低下させたり、その作用を遮断させたりできる。この処置は、処置の選択肢として、または転移のリスクを低下させるため、少なくとも１つの他の癌療法と組み合わせて用いられることが多い。
【実施例】
【０１３６】
以下に、本発明の種々の態様をさらに説明するため、実施例を記載する。以下の実施例に開示される技法は、本発明の実施に際してよく機能する、本発明者が発見した技法および／または組成物であり、したがって、本発明の実施に好ましい方法を構成すると考えられるものと当業者は理解すべきである。しかしながら、本開示に照らして、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、開示した個々の実施形態において多くの変更が可能であり、やはり類似または同様の結果が得られることも当業者は理解すべきである。
【０１３７】
（実施例１）
実験方法
初代眼血管内皮細胞の単離および培養
ヒト細胞および組織の使用についてはすべて、承認された施設内審査委員会のプロトコルに準じて行われた。確立したプロトコルを用いて、ヒト網膜から単離した内皮細胞の初代培養を樹立し、ｍＲＮＡの供給源として使用した（Ｋａｎｄａら、１９９８；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２００５）。死後２４時間以内の匿名のドナー（Ｌｉｏｎ’ｓ Ｅｙｅ Ｂａｎｋ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）からヒト死体眼を得た。ドナーは、循環器疾患または眼疾患の既往がなく、年齢は１６〜４２歳であった。簡単に説明すると、こうした網膜および虹彩組織を無菌的に切開し、ドナーの眼から分離し、０．２％コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ，，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で消化し、マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ３１抗体でコートした磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）を用いて、内皮細胞（ＥＣ：ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）を他の細胞型から単離した。ＥＣを、１０％ウシ胎仔血清および抗生物質を補充した完全ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ／ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で培養した。２〜５回継代細胞を使用した。磁性ビーズによる分離を２回実施後、ＥＣ培養を形態学的基準、ＣＤ３１およびｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の発現ならびにアセチル化低密度リポタンパク質の取り込みで評価したところ、９９．５％以上純粋であった（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２００５）。
【０１３８】
低酸素の誘導。
【０１３９】
直径６０ｍｍの培養皿で網膜および虹彩内皮細胞を８０％コンフルエンスまで培養し、次いで気密なモジュレーターインキュベーターチャンバー（Ｂｉｌｌｕｐｓ−Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，Ｄｅｌ Ｍａｒ，ＣＡ）に導入した。チャンバーに、１％Ｏ２、５％ＣＯ２および残りがＮ２の混合ガスを正確に５分間流し、次いでチャンバーをシールし、３７℃の加湿インキュベーターに入れた。８時間後、チャンバーに再び低酸素混合ガスを５分間流し、シールし、８時間さらにインキュベートしてから、もう一度流し、さらに８時間インキュベートした時点で、全ＲＮＡを単離した。
【０１４０】
全ＲＮＡの抽出およびＲＴ−ＰＣＲ
製造者のプロトコルに従い、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓキット（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いて全ＲＮＡを単離し、このＲＮＡ５０ｎｇを用いてオリゴｄＴプライマーで第一鎖を合成した（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。第二鎖ＰＣＲ増幅には、標準的な条件を用いて、公開されたＲＴＥＦ−１配列（ＮＣＢＩ受託＃ Ｕ６３８２４）から設計した以下のプライマー、Ｆ１：５’−ｔｔｇｇａｇｇｇｃａｃｇｇｃｃｇｇｃａ−３’（配列番号２０）およびＲ１：５’−ｔｃａｔｔｃｔｔｔｃａｃｃａｇｃｃｔｇｔａ−３’（配列番号２１）を使用した。増幅産物を電気泳動にかけ、１．５％アガロースゲルで可視化し、続いてゲルから精製し（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、Ａｂｉ３１０自動シーケンサーを用いて標準的なジデオキシヌクレオチドシーケンシングを行った。
【０１４１】
レポーター遺伝子解析
全長ＲＴＥＦ−１アイソフォームを、ｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に定方向にクローニングした。予想されるＴＴＧ開始コドンをフォワードプライマー配列内のＡＴＧに変換した。５４ｂｐの５’ＵＴＲおよび転写開始部位の上流１，０８２ｂｐを含む１，１３６ｂｐのヒトＶＥＧＦ５’近位プロモーターフラグメントを、ｐＳＥＡＰレポータープラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）内の分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ：ｓｅｃｒｅｔａｂｌｅ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）遺伝子に５’側からクローニングした。欠失を持つプロモーターフラグメントを、最初にプロモーターの５’末端およびプロモーターの３’末端を増幅し、続いてこの増幅産物をライゲートして構築した。次いで、目的の領域を欠失したライゲートした産物を増幅し、プロモーターを持たないｐＳＥＡＰベクターに定方向にクローニングした。トランスフェクション試験の前に検証のため、すべてのコンストラクトについて両鎖の配列決定を行った。
【０１４２】
トランスフェクションアッセイ。
【０１４３】
Ａｍａｘａヌクレオフェクション装置（Ａｍａｘａ Ｉｎｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、Ａｍａｘａ試薬および標準的な製造者のプロトコルを用いて、トランスフェクションを行った。簡単に説明すると、２９３Ｔ細胞を、１０％ＤＭＥＭ培地で８０％コンフルエントまで培養し、トリプシン処理して回収した。ヌクレオフェクションごとに１００万個の細胞を用いた。１００万個の細胞を１００ｕｌのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔ溶液および全プラスミドＤＮＡ５μｌ（２μｇを含む）に再懸濁し、エレクトロポレーションを行い（ヌクレオフェクション装置ｐｒｏｇｒａｍ ＃Ａ０２３）、その後すぐに予め温めておいた１ｍｌの培地に再懸濁し、６ウェルプレートの単一ウェルに播種した。細胞を１６〜１８時間回復させ、培地を慎重に除去し、ちょうど５００ｍｌの新鮮な培地と交換した。正確にインキュベーションから６時間後、１５０μｌの培地を慎重に取り除き、その２５μｌを直ちにアッセイするか、あるいはその後のＳＥＡＰ解析に備えて−２０℃で保存した。２５μｌの培地アリコート３個を用いて、製造者のプロトコル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に従い、ＳＥＡＰ解析を行い、３つの数値すべてのＳＥＡＰ値を平均して三重反復実験を比較した。
【０１４４】
１回の実験でコトランスフェクションをそれぞれ少なくとも３回繰り返し、別のプラスミド調製物（ｎ＝９〜１２）で各実験を再び独立にさらに２回繰り返した。代表的な実験を図に示す。統計解析はスチューデントのｔ検定（両側）を用いて行い、１回の実験で３または４サンプルを比較した。多重比較はボンフェローニ補正を用い、Ｐ＜０．０１の場合に有意と判定した。
【０１４５】
コトランスフェクションアッセイ（２つのプラスミドを同じチューブで一緒にトランスフェクトした）ごとに、各プラスミドのコピー数を、使用した最大のプラスミドのコピー数と同等になるように調整した。プロモーターを持たないｐＳＥＡＰベクター、およびインサートのないｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミドを陰性対照とした。ヌクレオフェクション実験ごとに、２つの陽性対照プラスミド、ＳＶ４０プロモーターｐＳＥＡＰプラスミドおよびｐＧＦＰｍａｘベクターを同時にトランスフェクトして、効率的かつ同等のトランスフェクション効率を確保した。ＳＶ４０プロモーターを持つｐＳＥＡＰプラスミドをその後のＳＥＡＰタンパク質解析の陽性対照とした。また、ｐＧＦＰｍａｘベクターも、各バッチの細胞のトランスフェクションの陽性対照とし、一貫したトランスフェクション効率を目視により確認できるようにした。２９３Ｔ細胞を用いたすべての実験では、ヌクレオフェクションによるトランスフェクション効率が一貫して８０〜９０％であった。
【０１４６】
（実施例２）
低酸素および正常眼血管内皮細胞内に存在するＲＴＥＦ−１の新規なアイソフォーム
Ｆ１およびＲ１プライマー対を用いて、初代のヒト網膜血管内皮細胞（ＰＲＶＥＣ：ｐｒｉｍａｒｙ ｒｅｔｉｎａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）および虹彩血管内皮細胞（ＰＩＶＥＣ：ｐｒｉｍａｒｙ ｉｒｉｓ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）の培養から調製したｃＤＮＡの増幅を行ったところ、約１３０５ｂｐおよび９３６ｂｐの産物が得られた（図１Ｂ）。同じプライマー対を用いて、ｍＲＮＡを単離する前に２４時間かけて低酸素状態下で培養しておいたＰＲＶＥＣから単離したｃＤＮＡの増幅を行ったところ、さらに約４４７ｂｐの産物が得られた（図１Ｂ）。６５１ｂｐのｃＤＮＡを、ヒト初代網膜血管内皮細胞（ＰＲＶＥＣ）から単離した。
【０１４７】
シーケンシング解析により、最も大きな産物は、開始コドンから終止コドンまで１３０５ｂｐの全長ＲＴＥＦ−１遺伝子（配列番号１）と同一であり、一方、９３６ｂｐ、６５１ｂｐおよび４４７ｂｐの転写物は、１３０５ｂｐの産物の選択的にスプライシングされた転写物であることが確認された。コドンに関する以下の記載は、４３５コドンからなる１３０５ｂｐの転写物の配列に従って番号を付けてある。このタンパク質の開始コドンは１、終止コドンは４３５である。１３０５ｂｐの転写物のタンパク質部分をコードすると予想される１１個のエクソンのうちの４個、エクソン５〜８は、９３６ｂｐ体からスプライシングされる（図１Ａ）。４４７ｂｐアイソフォームではエクソン５が欠落しているばかりでなく、珍しくエクソン７の中央においてインフレームでスプライシング現象が起き、エクソン７のＧｌｎ−８３からエクソン１２内のコドンＧｌｎ−４２５がスプライシングされる（図１Ａ）。６５１ｂｐのアイソフォームの場合、エクソン３の５’部分がエクソン１０内のスプライス受容部位に直接スプライスされ、それにより転写物からエクソン４、５、６、７、８および９が完全に取り除かれる。
【０１４８】
１３０５ｂｐの産物は、ヒトの心臓、骨格筋、膵臓および肺組織で最初に同定された転写エンハンサー因子−１関連（ＲＴＥＦ−１）遺伝子との同一性を示す（Ｓｔｅｗａｒｔら、１９９６）。他の２つのＲＴＥＦアイソフォーム、エクソン５がＡｓｐ−１１９からＧｌｙ−１６１まで欠落している変異体２（受託＃ＮＭ＿２０１４４１）およびＭｅｔ−１３０で下流のタンパク質開始部位を用いる変異体３（受託＃ＮＭ＿２０１４４３）は、以前に報告されている。ヒト眼血管細胞内で同定された９３６ｂｐ、６５１ｂｐおよび４４７ｂｐのアイソフォームは、これまで他のヒト組織からはまったく同定されていない。
【０１４９】
全長１３０５ｂｐの転写物は、４３４アミノ酸を含むポリペプチドをコードし、予想される分子量は約４８．６ｋＤａである。このポリペプチドは、５０個の強塩基性アミノ酸（Ｋ、Ｒ）、４７個の強酸性アミノ酸（Ｄ、Ｅ）、１３３個の疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｖ）および１２４個の極性アミノ酸（Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）を含む。予想される等電点は８．２４８であり、予想される電荷はｐＨ７．０で４．７９９である。同定されたＲＴＥＦ−１アイソフォームはそれぞれ非標準的なＴＴＧ（ＵＵＧ）開始コドンを用いるため、アミノ末端はリジン残基であると思われる。
【０１５０】
９３６ｂｐの転写物は、３１１アミノ酸を含むポリペプチドをコードし、予想される分子量は約３５．６ｋＤａである。このポリペプチドは、４０個の強塩基性アミノ酸（Ｋ、Ｒ）、３８個の強酸性アミノ酸（Ｄ、Ｅ）、９３個の疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｖ）および９２個の極性アミノ酸（Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）を含む。予想される等電点は８．０３７であり、予想される電荷はｐＨ７．０で３．４５８である。
【０１５１】
６５１ｂｐの転写物は、２１６アミノ酸を含むポリペプチドをコードし、予想される分子量は約２４．４ｋＤａである。このポリペプチドは、２２個の強塩基性アミノ酸（Ｋ、Ｒ）、２７個の強酸性アミノ酸（Ｄ、Ｅ）、６０個の疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｖ）および７１個の極性アミノ酸（Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）を含む。予想される等電点は６．０３９であり、予想される電荷はｐＨ７．０で約−４．０４６である。この６５１ｂｐのアイソフォームは、Ｔｈｒ−９２後のエクソン３内からインフレームでエクソン１０の中央のＳｅｒ−３１１までスプライシングされる（番号はすべて、最も大きいＲＴＥＦ−１アイソフォーム（配列番号１）に基づく）。したがって、６５１ｂｐのアイソフォームは、エクソン２の全部、エクソン３の大部分（エクソン３の２２アミノ酸のうち５アミノ酸が欠損）、エクソン１０の大部分（エクソン１０の最初の１１アミノ酸が欠損）および完全なエクソン１１および１２を含む。この結果、ＴＥＡ結合ドメインの大部分は保持されるものの、通常７２アミノ酸ＴＥＡドメイン内に含まれる、予想される３個のαへリックスの１個および推定核移行シグナル（Ｌｅｕ−１０５からＬｙｓ−１０９）が欠損している。６５１ｂｐのアイソフォームではさらに、プロリンリッチドメイン（ＰＲＤ：ｐｒｏｌｉｎｅ ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ）活性化ドメインおよび最初のＳＴＹドメイン（Ｓｅｒ−２５３からＳｅｒ−２７１）も欠損している。興味深いことに、このエクソン１０のスプライシング現象は、このエクソン内のＳｅｒ−１１（すなわち、エクソン１０の１１番目のアミノ酸）から開始され、ちょうどそこから２番目のＳＴＹドメイン（Ｓｅｒ−２５３からＳｅｒ−３３６）が始まる。このスプライシング現象により、推定核移行シグナルが欠損した部分的ＴＥＡドメインが直接ＳＴＹドメインと融合される。
【０１５２】
４４７ｂｐの転写物は１４８アミノ酸を含むポリペプチドをコードし、予想される分子量は約１６．５ｋＤａである。このポリペプチドは、２２個の強塩基性アミノ酸（Ｋ、Ｒ）、１７個の強酸性アミノ酸（Ｄ、Ｅ）、４３個の疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｖ）および４０個の極性アミノ酸（Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）を含む。予想される等電点は９．４４４であり、予想される電荷はｐＨ７．０で５．５６１である。
【０１５３】
９３６ｂｐおよび４４７ｂｐのアイソフォームの予想されるタンパク質配列は共に、予想される３個のαへリックスおよび推定核移行シグナル（Ｌｅｕ−１０５からＬｙｓ−１０９）を含有する７２アミノ酸ＴＥＡドメイン（Ａｓｐ−３８からＬｙｓ−１０９）を含む。しかしながら、Ｃ末端ドメインでは、エクソン７の最後の６アミノ酸からエクソン８の最初の１９残基にまたがるプロリンリッチドメイン（Ｐｒｏ−１８９からＰｒｏ−２１３）が４４７ｂｐのアイソフォームから欠損している（図１Ａ）。さらに、４４７ｂｐのアイソフォームは、１個はエクソン９内に位置し、もう１個がエクソン１０内にある２個のＳＴＹドメイン（Ｓｅｒ−２５３からＳｅｒ−２７１およびＳｅｒ−３１１からＳｅｒ−３３６）も欠損している（図１Ａ）。このＳＴＹドメインはセリン、トレオニンおよびチロシンなどのヒドロキシル基を持つ残基に富んだ領域である。
【０１５４】
（実施例３）
ＶＥＧＦプロモーターからの発現に対する新規なＲＴＥＦ−１アイソフォームの作用
１３０５ｂｐのアイソフォームに由来するポリペプチドは、ウシ大動脈内皮細胞において、Ｓｐ１部位への結合を介してＶＥＧＦの転写の刺激因子として働くことが明らかになっている（Ｓｈｉｅら、２００４）。このため、新しいアイソフォームもヒトＶＥＧＦプロモーターからの発現を刺激できるかどうかを調べる研究を行った。５４ｂｐの５’ＵＴＲおよび転写開始部位の上流１，０８２ｂｐからなる、ヒトＶＥＧＦ遺伝子の５’近位プロモーターをｐＳＥＡＰレポータープラスミドにクローニングし、ＲＴＥＦ−１アイソフォームをｐｃＤＮＡ発現ベクターにクローニングした。眼血管内皮細胞の初代培養へのプラスミドＤＮＡの核トランスフェクトは難しいため、トランスフェクション研究では代わりの細胞株として２９３Ｔ細胞を用いた。ＶＥＧＦプロモーター−レポータープラスミドにＲＴＥＦ−１アイソフォームを１つずつコトランスフェクトしたところ、１３０５ｂｐ、９３６ｂｐおよび４４７ｂｐのアイソフォームは、ＶＥＧＦプロモーターからレポーターの発現を上方制御することが示される（図２のレーン１、２および４）。しかしながら、興味深いことに、６５１ｂｐのアイソフォームは、ＶＥＧＦプロモーターからの発現を下方制御した（図２のレーン３）。全長１３０５ｂｐのＲＴＥＦ−１産物および９３６ｂｐのアイソフォームは、バックグラウンドよりも３〜４倍有意に発現を増強し（Ｐ＝０．００１）、多重検定の補正後に、この２つのアイソフォーム間に差は認められなかった（Ｐ＝０．０１）。４４７ｂｐのアイソフォームは、バックグラウンド発現よりも約１０〜１５倍（平均１２×）発現を刺激した（Ｐ＝０．０００３）。コトランスフェクション実験を３回に分けて３回ずつ繰り返したが、結果は同じであった。
【０１５５】
６５１ｂｐのアイソフォーム（図２のレーン３）は、ＶＥＧＦプロモーターからの発現を対照（図２のレーン５）に対して有意に下方制御した（Ｐ＝０．００２６）。驚いたことに、６５１ｂｐのアイソフォームの改変体である、以下に記載するＳＳ−６５１ｂｐ−ＲＭＲ産物（図２のレーン６）は、対照に対してＶＥＧＦプロモーターからの発現を抑制したばかりでなく（Ｐ＝０．０００９）、６５１ｂｐのアイソフォームよりも発現の阻害作用が一層強力であった（Ｐ＝０．０００８）。６５１ｂｐのアイソフォーム（図２のレーン３）は、対照で認められた発現と比較して約３倍発現を阻害したのに対し、ＳＳ−６５１ｂｐ−ＲＭＲ体（図２のレーン６）は、その時の対照よりも約１０倍発現を阻害した（図２のレーン５に示す）。ＳＳ−６５１ｂｐ−ＲＭＲの効力は、この分子が、産生細胞から分泌されると共に、隣接する細胞に移入する能力があることによる可能性が高い。
【０１５６】
ｓｓ−６５１−ＲＭＲ ｂｐ ＲＴＥＦ−１は、Ｎ末端でヒトＩＬ−２分泌シグナル配列（配列番号２２）に融合し、Ｃ末端で内部移行部分（配列番号２３）に融合したＲＴＥＦ−１の６５１ｂｐのアイソフォームのコード領域を含む。これにより、発現細胞から分泌され得、周囲の細胞への移入が可能な「ｓｓ−６５１−ＲＭＲ」産物が得られた。
【０１５７】
（実施例４）
Ｓｐ１エレメントは、最大ＶＥＧＦプロモーター活性には必要であるが、ＲＴＥＦエンハンサー活性には必須なものではない
従来の研究から、全長ＲＴＥＦ−１アイソフォームはＳｐ１エレメントに結合し、Ｓｐ１エレメントにＶＥＧＦプロモーター活性を増強させることが明らかになった。以前の研究では、このＳｐ１部位の突然変異が−９７〜−８９ｂｐにあると、ＲＴＥＦ−１エンハンサー活性が喪失した（Ｓｈｉｅら、２００４）。同じ研究では、−８６〜−５８ｂｐの同じ領域内の他の３つのＳｐ１部位が、ＲＴＥＦ−１エンハンサー活性に必須ではないことが確認された。新しいＲＴＥＦ−１アイソフォームがエンハンサー活性にＳｐ１部位を必要とするかどうか調べるため、−１１３ｂｐ〜−５８ｂｐの４つのＳｐ１部位をすべて欠失したＶＥＧＦプロモーターをｐＳＥＡＰベクターにクローニングし、各アイソフォームでコトランスフェクトした。全長ＶＥＧＦプロモーターのバックグラウンドレポーター遺伝子の発現とＳｐ１ネガティブＶＥＧＦプロモーターとを比較すると、Ｓｐ１エレメントが欠損する場合、レポーター発現が３０倍と著しく減少する（図３）。このことから、近位プロモーター内の４個のＳｐ１エレメントの少なくとも１個は、全体の発現の増強に必須であると考えられる。Ｓｐ１ネガティブおよび各アイソフォームによるコトランスフェクション実験でも同等レベルの発現の低下が見られた（図３、黒地の棒と白地の棒を比較されたい）。しかしながら、Ｓｐ１ネガティブプロモーターアッセイの各アイソフォームによるコトランスフェクション実験では、やはり同じ増強傾向が認められた（図３）。バックグラウンドに対する１３０５ｂｐ、９３６ｂｐおよび４４７ｂｐのアイソフォームの増強作用はそれぞれ、３倍、４倍および１２倍。したがって、各アイソフォームのバックグラウンドに対する増強レベルは、ＶＥＧＦプロモーター内にＳｐ１エレメントが存在するどうかに関係なく同じである。
【０１５８】
６５１ｂｐのアイソフォームは、ＶＥＧＦプロモーター内のＳｐ１が欠損していても、やはり対照よりも発現を阻害することができる。したがって、各アイソフォームに対するＶＥＧＦプロモーターの制御は同様であり、Ｓｐ１エレメントが存在するか否かに関わらず変わらない。６５１ｂｐのフラグメントは、競合する形でＶＥＧＦプロモーターからの１３０５ｂｐ、９３６ｂｐおよび４４７ｂｐのアイソフォームのエンハンサー作用を阻害することができる。すなわち、通常ＶＥＧＦプロモーターからの発現を上方制御する増強作用のある他のアイソフォームのいずれかと併用して６５１ｂｐを大量に導入すると、一般にそのエンハンサー活性が競合的に阻害される。
【０１５９】
（実施例５）
６５１ｂｐのＲＴＥＦ−１のｃＤＮＡ由来ポリペプチドにおけるドミナントネガティブ転写活性
６５１ｂｐのアイソフォームが他のＲＴＥＦ−１アイソフォームのＶＥＧＦプロモーター増強作用に与える作用を調べるため、２３９Ｔトランスフェクション実験をさらに行った。簡単に説明すると、細胞に、表記のＲＴＥＦ−１エンハンサー発現コンストラクト（すなわち、１３０５ｂｐ、９３６ｂｐまたは４４７ｂｐ）、ＶＥＧＦレポーターベクターおよび６５１ｂｐのＲＴＥＦ−１アイソフォームあるいは空ベクター対照の発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクション後、ＶＥＧＦプロモーター活性を前述のようにレポーター遺伝子アッセイでアクセスした。この研究の結果を図４に示す。いずれの場合も、ＲＴＥＦ−１アイソフォーム（１３０５ｂｐ、９３６ｂｐおよび４４７ｂｐ）のＶＥＧＦプロモーター活性に対する増強活性は、ＲＴＥＦ−１ ６５１ｂｐのアイソフォームの共発現により抑制された。
【０１６０】
（実施例６）
ＲＴＥＦ−１ｃＤＮＡ発現ベクターは、細胞中で予想されたポリペプチドを産生する
細胞中で指定のＲＴＥＦ−１ポリペプチドが発現すること確認するため、２９３Ｔ細胞に、対照（空ベクター）のｐｃＤＮＡ発現ベクターまたは１３０５ｂｐ、９３６ｂｐ、６５１ｂｐまたは４４７ｂｐのｃＤＮＡ配列の発現ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞ライセートを、抗ＲＴＥＦ−１抗血清を用いてウエスタンブロットで解析した。抗ＲＴＥＦ−１抗血清については、全長配列のアミノ酸２〜１４に対応するＲＴＥＦ−１ペプチドに対して作製した。ウエスタンブロット用の抗体を、関連ヒトＴＥＡタンパク質に特有であるが、トランスフェクトされたＲＴＥＦ−１アイソフォームがそれぞれ共有するＲＴＥＦ−１エピトープに誘導した（図５Ａ）。研究の結果（図５Ｂ）から、トランスフェクト細胞では予想されたＲＴＥＦ−１ポリペプチドが発現されたが、６５１ｂｐのｃＤＮＡ由来のポリペプチドの場合、発現レベルが非常に低かったことが明らかになる。
【０１６１】
（実施例７）
眼組織におけるＲＴＥＦ−１のインビボ発現
さらに、正常な霊長類の眼組織を用いてＲＴＥＦ−１アイソフォームの発現を研究した。各タンパク質アイソフォームに結合する抗ＲＴＥＦ−１抗体を用いたウエスタンブロット解析から、ある種の眼の組織でＲＴＥＦ−１が発現することが明らかになった。ＲＴＥＦ−１の発現は脈絡膜で最も高く、網膜で最も低いようであった（図６Ａ）。質量７５ｋＤのマーカーよりも移動が遅かった検出タンパク質産物は、全長ＲＴＥＦ−１（１３０５ｂｐ）アイソフォームであると思われる（図６Ａ、上のパネル）。質量２３ｋＤと２５ｋＤのマーカーの間で移動している産物は、６５１ｂｐのアイソフォームから生じたものと考えられる（図６Ａ、下のパネル）。
【０１６２】
さらなる研究では、ＣＲＡＯモデルを用いてＲＴ−ＰＣＲによりＲＴＥＦ−１アイソフォームの発現を調査した。その結果から、全長（１３０５ｂｐ）ＲＴＥＦ−１ＲＮＡは対照網膜組織に対してＣＲＡＯ網膜で優先的に発現することが明らかにされた（図６Ｂ、レーン１とレーン２を比較されたい）。
【０１６３】
さらに、眼組織におけるＲＴＥＦ−１発現の細胞分布を評価するため、ＲＴＥＦ−１結合抗体を用いて眼組織を免疫組織化学で解析した。その結果から、ＲＴＥＦ−１は虹彩、毛様体、視神経および網膜で発現することが明らかにされた（図７Ａ〜Ｂ）。
【０１６４】
（実施例８）
ＲＴＥＦ−１アイソフォームの局在性
ＲＴＥＦ−１アイソフォーム（１３０５ｂｐ、６５１ｂｐおよび４４７ｂｐ）をそれぞれｐＭＡＸ−ＦＰ−Ｎベクター（Ａｍａｘａ Ｉｎｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）にクローニングし、各アイソフォームのカルボキシル末端にそれぞれ別の蛍光タンパク質を融合した。１３０５ｂｐのアイソフォームは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）と融合したのに対し、６５１ｂｐのアイソフォームは赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ：ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、４４７ｂｐのアイソフォームは黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ：ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）と融合した。さらに、６５１ｂｐのアイソフォームを、ｈＩＬ−２分泌シグナルおよびＲＭＲ輸送モチーフを含むｐＨＲ−ＣＭＶ−ｅＧＦＰベクターにクローニングし、ｓｓ−６５１−ＲＭＲ ＲＴＥＦ−１−ＧＦＰ融合タンパク質を作製した。各コンストラクトをシーケンシング解析で確認した。ヒト２９３Ｔ細胞を、１ウェル当たり３×１０５細胞の密度で６ウェルプレートに蒔いた。細胞を、１０％ＦＢＳおよび１×濃度のペニシリン−ストレプトマイシン−アムホテリシンを補充したＤＭＥＭ培地で８０％コンフルエントまで増殖させた。各コンストラクトを、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｒ ＩＩ器具（Ａｍａｘａ Ｉｎｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いてエレクトロポレーションにより処理した２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。細胞を、５％ＣＯ２、３７℃で２４時間インキュベートした。トランスフェクション反応をすべて蛍光活性用の蛍光顕微鏡で観察し、写真撮影してＲＴＥＦ−１タンパク質アイソフォームの局在パターンを記録した。
【０１６５】
蛍光顕微鏡解析からは、核移行シグナルを含む２つのＶＥＧＦ−エンハンサーＲＴＥＦ−１アイソフォーム（１３０５ｂｐおよび４４７ｂｐ）が細胞の核に局在していたことが確認される。さらに、阻害性アイソフォーム６５１は、細胞質中、核の外側および周囲に集中していることが分かった。しかしながら、ｈｉＬ−２分泌シグナル配列およびＲＭＲ輸送モチーフを含むｓｓ−６５１−ＲＭＲ ＲＴＥＦ−１アイソフォームは細胞核に局在していることが明らかになった。
【０１６６】
ＲＴＥＦ−１アイソフォームの局在パターンを確認するため、ＲＴＥＦ−１アイソフォームをトランスフェクトした細胞を用いて細胞画分ごとにウエスタンイムノブロット分析を行った。この研究では、細胞に２μｇのＲＴＥＦ−１アイソフォームをトランスフェクトし、２４時間増殖させた。次いで、培地を無血清のＤＭＥＭに交換し、さらに４８時間増殖させた。細胞画分を単離し、回収した。培地をＴＣＡで処理して培地中の残留タンパク質を沈殿させた。３つのアイソフォームを識別しないＲＴＥＦ−１特異的抗体を１／５０００の濃度で用いてＲＴＥＦ−１タンパク質の存在を検出した。核画分、細胞質画分および培地を、ｐｃＤＮＡ空ベクター、または１３０５ｂｐ、９３６ｂｐ、６５１ｂｐ、ｓｓ−６５１−ＲＭＲもしくは４４７ｂｐのＲＴＥＦ−１変異体のｐｃＤＮＡ発現ベクターをトランスフェクトした細胞由来のサンプルを用いて解析した。その結果から、ＶＥＧＦエンハンサーアイソフォーム１３０５ｂｐおよび４４７ｂｐが染色体ＤＮＡへの結合を介してＶＥＧＦの発現を増強することが明らかになった。一方、驚くべきことに、６５１ｂｐのＲＴＥＦ−１ネガティブドミナントアイソフォームは細胞質に局在していても、核に局在するエンハンサーＲＴＥＦ−１アイソフォームの作用を競合的に阻害することができる。
【０１６７】
（実施例９）
ＲＴＥＦ−１タンパク質はヒト眼のメラノーマ細胞内に存在する
ＶＥＧＦは、様々な眼の血管新生疾患の発症および眼腫瘍の樹立に関与する重要なタンパク質である。ＶＥＧＦ遺伝子の発現を調節するタンパク質を同定すれば、眼腫瘍の原因および進行の理解に資する。成人に最も好発する眼内癌は眼のメラノーマ（ＯＭ：ｏｃｕｌａｒ ｍｅｌａｎｏｍａ）であり、局部組織の損傷、視力喪失を引き起こす恐れがあり、転位しやすいため、患者の罹患率および死亡率に大きな影響を与える。
【０１６８】
様々なヒトＲＴＥＦ−１アイソフォームは、ＶＥＧＦ５’近位プロモーター領域からの発現を示差的に増強できる。血管形成、炎症および腫瘍進行がＶＥＧＦの上方制御を介して起こるため、本発明者らは、メラノーマなどの血管新生したヒト眼腫瘍、場合によっては眼以外の他の腫瘍の発症および進展にＲＴＥＦ−１が関わっている可能性があると考える。本発明者らは、ヒト眼のメラノーマ細胞内にＲＴＥＦ−１タンパク質が存在するかどうかを免疫組織化学法で調べた。メラノーマ腫瘍を含むヒト眼の切片を、ヒトＲＴＥＦ−１タンパク質を認識する抗体（ただし、３つのアイソフォームを識別しない）で染色した。切片を含むスライドを顕微鏡で調べた。その結果、ヒト眼のメラノーマ細胞内にＲＴＥＦ−１タンパク質（赤色染色として観察）が存在することが明らかになった。このメラノーマ細胞はメラニン色素により褐色をしている。赤色および褐色染色した細胞は、ＲＴＥＦ−１タンパク質を含む腫瘍細胞である。こうした腫瘍細胞に高レベルのＲＴＥＦ−１が認められることから、こうした細胞内でＲＴＥＦ−１がＶＥＧＦ遺伝子を上方制御し、細胞増殖および腫瘍増大を促進する可能性があることが示唆される。
【０１６９】
したがって、こうしたメラノーマ細胞で６５１ｂｐのＲＴＥＦ−１アイソフォームを用いれば、ＶＥＧＦ発現を抑制し、この種の眼腫瘍の増殖を阻害する可能性がある。６５１ｂｐのＲＴＥＦ−１アイソフォームの使用は、ＶＥＧＦ刺激性の腫瘍増大に依存する他の癌の治療にも有益かもしれない。
【０１７０】
本明細書に開示され、特許請求の範囲に記載された組成物および方法はすべて、本開示に照らして過度の実験を行うことなく作製し、実行することができる。好ましい実施形態によって本発明の組成物および方法を記載してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、組成物および方法ならびに本明細書に記載の方法のステップまたはステップの順序に変更を加えてもよいことが当業者には明らかであろう。より詳細には、同一または類似の結果が得られると考えられる場合、本明細書に記載の薬の代わりに化学的および生理学的に関係するある種の薬を用いてもよいことも明らかであろう。こうした当業者に明らかな類似の置換形態および変更形態はすべて、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の精神、範囲および概念内にあると見なす。
【０１７１】
参考文献
以下の参考文献は、例示的な手順の詳細を提供したり、本明細書に記載の例示的な手順の詳細を捕捉する他の詳細を提供したりする範囲で、参照によって個々に本明細書に援用する。
【０１７２】
【化６】
【０１７３】
【化７】
【０１７４】
【化８】
【０１７５】
【化９】
【０１７６】
【化１０】
【０１７７】
【化１１】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００７年６月６日に出願された米国出願第６０／９４２，２４９号（この全体の開示は、放棄せずにその全体において参考として本明細書に具体的に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は分子生物学の分野に関し、特に、血管形成（ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（血管形成）に関わるプロセスに関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
ＴＥＡ ＤＮＡ結合ドメイン遺伝子ファミリーのメンバーに転写エンハンサー因子１−関連（ＲＴＥＦ−１：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｆａｃｔｏｒ １−ｒｅｌａｔｅｄ）遺伝子がある。ＴＥＡ ＤＮＡ結合ドメイン遺伝子ファミリーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、マウスからヒトに至るまでよく保存されている。ＴＥＡ ＤＮＡ結合ファミリーのタンパク質は様々な遺伝子の活性化と抑制との両方に関与し、他のタンパク質と一緒になってその個々の機能を改変する場合がある（非特許文献１）。心臓、骨格筋、膵臓、胎盤、脳および肺など、様々な哺乳動物組織で、こうした遺伝子の特定のメンバーの発現が確認されている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。単一遺伝子からｍＲＮＡの選択的スプライシングにより転写エンハンサー因子−１（ＴＥＦ−１）のアイソフォームが膵臓などの単一組織内で同定されてきた（Ｚｕｚａｒｔｅら、２０００；Ｊｉａｎｇら、２０００）。哺乳動物の眼内のこうした遺伝子の発現プロファイルは報告されていない。
【０００４】
ＲＴＥＦ−１遺伝子の転写物はニワトリ組織で最初に同定され、心筋および骨格筋に集中していることが明らかになった（非特許文献４）。ニワトリＲＴＥＦ−１は筋細胞特異的ＣＡＴ（Ｍ−ＣＡＴ）シスＤＮＡエレメントに結合し、筋肉特異的遺伝子の発現を調節し、十分な転写活性化のため筋肉特異的補助因子を要求する。２１６６ヒト結腸直腸癌ｃＤＮＡライブラリーのランダムスクリーニングにより、部分的ｃＤＮＡ ＲＴＥＦ−１配列が同定されたため、心臓ｃＤＮＡライブラリーから、トリＲＴＥＦ−１の全長ヒトホモログが単離されるようになっている（非特許文献２；Ｆｒｉｇｅｒｉｏら、１９９５）。ヒト組織のノーザンブロット解析では、骨格筋および膵臓で最も高レベルの発現が、心臓、腎臓および胎盤では低レベルの発現が示されたのに対し、肝臓、肺または脳ではメッセージが検出されなかった（非特許文献２）。ＲＴＥＦ−１のマウスホモログのノーザンブロット解析からは、ヒトと異なる組織発現パターンが示唆される。成体マウスでは肺組織で発現が最も高レベルで、腎臓、心臓および骨格筋では極めて低レベルで、肝臓、胸腺、脾臓および脳では検出不可能な量であったのに対し、マウス胚骨格筋はＲＴＥＦ−１メッセージに富んでいた（Ｙｏｃｋｅｙら、１９９６）。マウス骨格筋細胞では、全長遺伝子と比較してエクソン５を欠いている、ＲＴＥＦ−１の選択的スプライシングによるマウスアイソフォームが同定されている（Ｙｏｃｋｅｙら、１９９６）。
【０００５】
低酸素状態下の網膜組織中で上方制御されることが知られているプロ血管新生因子の１つに血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ：ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）がある（Ｙｏｕｎｇら、１９９７；Ｐｉｅｒｃｅら、１９９６；Ｄｏｎａｈｕｅら、１９９６；Ｐｅ’ｅｒら、１９９５）。近年、全長ＲＴＥＦ−１タンパク質がＶＥＧＦプロモーターに結合するだけでなく、たとえば、ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ：ｂｏｖｉｎｅ ａｏｒｔｉｃ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）中の低酸素状態下でＶＥＧＦの発現を上方制御することも確認された（Ｓｈｉｅら、２００４）。マイクロアレイ解析からは、低酸素状態下のＢＡＥＣ中でＲＴＥＦ−１の発現が３倍上方制御されることが明らかになった。驚いたことに、ＲＴＥＦ−１は、Ｍ−ＣＡＴモチーフではなく、ＶＥＧＦプロモーター内のＳｐ１エレメントとの相互作用を介してＶＥＧＦ遺伝子活性化に関与している。さらに、ＲＴＥＦによるＶＥＧＦの発現は、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）および低酸素応答エレメント（ＨＲＥ：ｈｙｐｏｘｉａ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）活性化経路と無関係に行われる（Ｓｈｉｅら、２００４）。
【０００６】
腫瘍の血管形成および異常な血管新生など、種々の血管形成障害にはＶＥＧＦの過剰発現が関係していると考えられてきた。たとえば、ＶＥＧＦが、未熟児網膜症（ＲＯＰ：ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）および他の眼の血管新生疾患（Ｌａｓｈｋａｒｉら、２０００；Ｍｉｌｌｅｒ，１９９７；Ｖａｎｎａｙら、２００５；Ｙｏｕｎｇら、１９９７）の発症および重症度に重要な役割を果たしていることは十分に確認されている。こうした障害におけるＶＥＧＦの顕著な役割を踏まえて、ＶＥＧＦ活性を阻害する多くの治療戦略が開発されてきた。しかしながら、現在のＶＥＧＦ遮断療法は一般に、細胞外ＶＥＧＦと同族の細胞表面受容体との相互作用を阻害する。したがって、ＶＥＧＦの産生を阻害する方法など、ＶＥＧＦ遮断に代わる戦略が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＫａｎｅｋｏおよびＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ、Ｄｅｖ Ｇｅｎｅｔ，（１９９８）２２：４３−５５
【非特許文献２】Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，（１９９６）３７：６８−７６
【非特許文献３】Ｙａｓｕｎａｍｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９６）２２８：３６５−７０
【非特許文献４】Ｆａｒｒａｎｃｅら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１：８２６６−７４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の実施形態では、本発明は、１つまたは複数の内部欠失を含むＲＴＥＦ−１アミノ酸配列を含む単離されたドミナントネガティブ（ＤＮ：ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ）ＲＴＥＦ−１ポリペプチドを提供する。本明細書で使用する場合、ドミナントネガティブという語は、配列番号１で例示されるようなインタクトなＲＴＥＦ−１ポリペプチドの活性をＲＴＥＦ−１変異体が抑制または低下させることを意味する。たとえば、ある態様では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１変異体は、細胞に発現すると、ＶＥＧＦプロモーター活性を阻害または低下させるポリペプチドと定義することができる。さらに、場合によっては、ＤＮ ＲＴＥＦ−１は、低酸素またはＲＴＥＦ−１（たとえば、配列番号１、配列番号２または配列番号４）によるＶＥＧＦプロモーター活性を低下または阻害するポリペプチドと定義することもできる。ある態様では、ＲＴＥＦ−１アミノ酸配列は、哺乳動物のＲＴＥＦ−１アミノ酸配列であってもよく、好ましくはヒトＲＴＥＦ−１アミノ酸配列である。
【０００９】
したがって、ある態様では、アミノ酸の内部欠失を１つまたは複数を含むＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドを提供する。たとえば、場合によっては、ＤＮ ＲＴＥＦ−１は、エクソン３、４、５、６、７、８、９または１０によってコードされるアミノ酸の欠失を含んでもよい。たとえば、ある特定の実施形態では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１は、エクソン４、５、６、７、８および／または９によってコードされるアミノ酸配列の全部の欠失を含んでも構わない。さらに、ある特定の場合には、ＤＮ ＲＴＥＦ−１は、エクソン３によってコードされる最後の約５アミノ酸の欠失またはエクソン１０によってコードされる最初の約１１アミノ酸の欠失など、エクソン３および／またはエクソン１０にアミノ酸の部分欠失を含んでもよい。さらに、ＤＮ ＲＴＥＦ−１は、ヒトＲＴＥＦ−１配列などの野生型ＲＴＥＦ−１配列に対するアミノ酸置換を含んでも構わないことを当業者であれば理解するであろう。したがって、場合によっては、ＤＮ ＲＴＥＦ−１は、欠失していないアミノ酸領域の野生型ＲＴＥＦ−１配列（たとえば、配列番号１、配列番号２または配列番号４）と約または少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９パーセント同一である、アミノ酸の内部欠失を１つまたは複数含むＲＴＥＦ−１ポリペプチドと定義することができる。いくつかの非常に特定の態様では、ＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチドは、配列番号３（６５１ｂｐ ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列）と約または少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９パーセント同一であるＲＴＥＦ−１アミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの非常に特定の態様では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドは、配列番号３が示す配列を含んでもよい。本発明が意図するＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドのさらなる実施形態は、発明を実施するための形態に記載する。
【００１０】
いくつかのさらなる態様では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドは、細胞内部移行（ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）部分を含んでもよい。場合によって、細胞内部移行部分をＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドと連結しても、コンジュゲートしてもよい。たとえば、ＤＮ ＲＴＥＦ−１はリポソーム小胞との複合体として提供してもよく、したがって、このポリペプチドは細胞膜を通過することができる。さらに、いくつかの特定の実施形態では、細胞内部移行部分は、ペプチド、ポリペプチド、アプタマーまたはアビマー（ａｖｉｍｅｒ）（たとえば、米国特許出願公開第２００６／０２３４２９９号および同第２００６／０２２３１１４号を参照されたい）配列であってもよい。たとえば、細胞内部移行部分は、ＨＩＶ ｔａｔ、ＨＳＶ−１外皮タンパク質ＶＰ２２またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）由来のアミノ酸を含んでもよい。ある種のさらなる態様では、細胞内部移行部分は、Ｗｒｉｇｈｔら（２００３） ａｎｄ Ｒｏｔｈｂａｒｄら（２０００）に記載されたポリ−アルギニン、メチオニンおよびグリシンペプチドなどの操作された内部移行部分であってもよい。たとえば、細胞内部移行部分は、本明細書に例示するＲＭＲＲＭＲＲＭＲＲ（配列番号２３）であってもよい。したがって、場合によっては、ポリペプチド細胞内部移行部分およびＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドは、融合タンパク質を含んでもよい。
【００１１】
したがって、場合によっては、細胞内部移行部分およびＤＮ ＲＴＥＦ−１配列を含むＤＮ ＲＴＥＦ−１融合タンパク質を提供する。こうした融合タンパク質は、細胞内移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ）部分とＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチド配列とを隔てる（ｓｅｐｅｒａｔｉｎｇ）１つまたは複数のアミノ酸配列をさらに含んでもよいことを当業者であれば理解するであろう。たとえば、場合によっては、リンカー配列がこうした２つのドメインを隔ててもよい。たとえば、リンカー配列は、ポリグリシンリンカーなど、多くの立体構造の自由または自由度を持つ「柔軟な」アミノ酸を含んでもよい。場合によっては、リンカー配列は、プロテイナーゼ切断部位を含んでもよい。たとえば、ある態様では、リンカー配列は、細胞内プロテイナーゼにより認識され、切断される切断部位を含んでもよく、このため、この融合タンパク質が細胞内に移行したならば、ＤＮ ＲＴＥＦ−１配列が細胞内内部移行配列から遊離する。
【００１２】
本発明のさらなる態様では、細胞内部移行部分は細胞標的化部分とさらに定義することができる。この標的化部分は、特定の細胞受容体を発現する細胞など、選択した細胞の集団だけに結合したり、それに取り込まれたりする部分である。こうした細胞標的化は、たとえば、細胞表面タンパク質に結合する抗体、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、アプタマーまたはアビマーを含んでもよい。本明細書で使用する場合、抗体という語は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体またはパラトープペプチドをいう場合がある。場合によっては、本発明の細胞標的化部分は、網膜細胞、内皮細胞、虹彩細胞または神経細胞などの特定のタイプの細胞を標的にしてもよい。なおさらなる態様では、本発明の細胞標的化部分は、癌細胞結合部分と定義することができる。たとえば、いくつかの非常に特異的な場合には、本発明の細胞標的化部分は、ｇｐ２４０またはＨｅｒ−２／ｎｅｕなどの（ｓｕｃｈ ａ）癌細胞関連抗原を標的にしてもよい。
【００１３】
なお本発明のさらなる態様では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドは、細胞輸送シグナル（たとえば、細胞分泌シグナル、核移行シグナルまたは核外移行シグナル）または酵素もしくは蛍光タンパク質などのレポーターポリペプチドのようなアミノ酸配列をさらに含んでもよい。好ましい態様では、たとえば、ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドは、細胞分泌シグナルを含む。たとえば、ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドは、本明細書に例示するように、ＩＬ−２分泌シグナル配列（ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ、配列番号２２）などのヒト遺伝子由来の分泌配列を含んでもよい。したがって、場合によっては、ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドは、細胞内部移行部分および細胞分泌シグナルを含んでもよく、したがって、このポリペプチドはある細胞から分泌され、周囲の細胞に取り込まれることができる。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態では、上記のようなＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドをコードする配列を含む単離された核酸配列を提供する。したがって、本明細書に記載のＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドまたはポリペプチド融合タンパク質のいずれかをコードする核酸配列も、本発明の一部に含まれる。遺伝コードの縮重により、種々の核酸配列を用いて同一のポリペプチドをコードできることを当業者であれば理解するであろう。場合によっては、たとえば、任意の特定のアミノ酸をコードするコドンを変化させて、細胞の発現を促進したり、ゲノムＲＴＥＦ−１遺伝子座で核酸が組み換わる可能性を低下させたりしてもよい。
【００１５】
好ましい態様では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドをコードする核酸配列は発現カセットに組み込まれる。本明細書で使用する場合、「発現カセット」という語は、細胞、より詳細には真核細胞中でＤＮ ＲＴＥＦ−１の発現を可能にする追加の核酸配列を組み込んだものを意味する。こうした追加配列は、たとえば、プロモーター、エンハンサー、イントロン配列（たとえば、ＤＮ ＲＴＥＦ−１コード領域の前後またはその中）またはポリアデニル化シグナル配列を含んでもよい。当業者であれば、発現カセットに組み込まれる配列を用いて、ＤＮ ＲＴＥＦ−１の発現特性を変化させてもよいことを認識するであろう。たとえば、細胞型特異的な条件プロモーター配列または誘導性プロモーター配列を用いて、ＤＮ ＲＴＥＦ−１を選択した細胞型または増殖条件に限定してもよい。たとえば、場合によっては、本発明のＲＴＥＦ−１発現カセットに低酸素誘導性プロモーターを用いてもよい。さらに、場合によっては、癌細胞または眼の細胞において増強活性を持つプロモーターを用いても構わない。さらに、ＲＴＥＦ−１ポリペプチド配列に対してある種の改変を行い、たとえば、本明細書に例示するようにＤＮ ＲＴＥＦ−１の開始コドンをＡＴＧに変更して効率的な翻訳を促進するなど、発現カセットからの発現を増強することも意図している。
【００１６】
なお本発明のさらなる態様では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１コード配列をウイルス発現ベクターなどの発現ベクターに組み込んでもよい。本発明に従って使用するウイルス発現ベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ−４０、レトロウイルスおよびワクシニアウイルスのベクター系があるが、これに限定されるものではない。ある種の好ましい態様では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターとさらに定義できる。場合によっては、こうしたレンチウイルスベクターは、参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第２００３／０００８３７４号および同第２００３／００８２７８９号に記載されたような自己不活性化（ＳＩＮ：ｓｅｌｆ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）レンチウイルスベクターであってもよい。
【００１７】
なおさらなる実施形態では、本発明は、ＲＴＥＦ−１依存性転写活性を低下させたり、阻害したりする方法に関する。本明細書で使用する場合、ＲＴＥＦ−１依存性転写活性という語は、配列番号１、配列番号２または配列番号４などの全長または十分に活性なＲＴＥＦ−１ポリペプチドの発現が関係する転写、またはそれにより増強される転写をいう。したがって、いくつかの点で、本発明は、ＶＥＧＦプロモーター活性（およびその活性によるＶＥＧＦ発現）を阻害したり、低下させたりする方法であって、細胞中にＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドを発現させることを含む、方法を提供する。このため、特定の実施形態では、血管形成障害を有する患者を処置するための方法であって、上述のようなＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチドをコードするＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチドまたは核酸発現ベクターを含有する治療用組成物を有効量で患者に投与することを含む、方法を提供する。好ましい態様では、本明細書に記載の方法を用いてヒト患者を処置することができる。
【００１８】
本明細書で使用する場合、血管形成障害という語は、眼血管新生、動静脈奇形、冠動脈再狭窄（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）、末梢血管再狭窄、糸球体腎炎、関節リウマチまたは癌（腫瘍血管新生反応など）などの好ましからぬ血管新生反応に関連する障害をいう。したがって、場合によっては、本発明の方法を用いて、黄斑変性症（加齢黄斑変性症（ＡＭＤ：ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）など）、角膜移植片拒絶反応、角膜血管新生、未熟児網膜症（ＲＯＰ：ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）および糖尿病性網膜症などの眼障害を処置してもよい。たとえば、本発明の方法を用いて、滲出型またはドライ型ＡＭＤを処置してもよい。したがって、場合によっては、本発明の方法を用いてｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｃｌａｓｓｉｃ病変、ｍｉｎｉｍａｌｌｙ ｃｌａｓｓｉｃ病変およびｏｃｃｕｌｔ ｗｉｔｈ ｎｏ ｃｌａｓｓｉｃ病変などの多くのＡＭＤ関連の眼病変を処置しても構わない（Ｇｒａｇｏｕｄａｓら、２００４）。
【００１９】
当業者であれば、本発明の方法と組み合わせて、または併用して追加の血管形成阻害療法を用いてもよいことを理解するであろう。こうした追加の療法については、本明細書に記載した方法の前後またはほぼ同時に施してもよい。たとえば、追加の血管形成阻害療法は、ＶＥＧＦおよび／またはＦＧＦシグナル経路を拮抗することができる。したがって、場合によってはおよび追加の療法は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦまたはＦＧＦ受容体に結合する抗体を投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）ことを含んでもよい。ある種の特異的態様では、本発明の方法および組成物を、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）、ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）（ペガプタニブナトリウム）または抗炎症剤と併用して使用しても構わない。したがって、ある特定の場合には、薬学的に許容されるキャリア中にＤＮ−ＲＴＥＦ−１組成物およびベバシズマブまたはペガプタニブナトリウムを含む治療用組成物を提供する。なおさらなる態様では、血管形成を調節する遺伝子を本発明の方法と併用して送達してもよい。たとえば、いくつかの態様では、血管形成を調節する遺伝子は、組織メタロプロテアーゼ阻害物質、エンドスタチン、アンジオスタチン、エンドスタチンＸＶＩＩＩ、エンドスタチンＸＶ、クリングル１〜５、ＰＥＸ、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２のＣ末端ヘモペキシンドメイン、ヒトプラスミノーゲンのクリングル５ドメイン、エンドスタチンとアンジオスタチンとの融合タンパク質、エンドスタチンとヒトプラスミノーゲンのクリングル５ドメインとの融合タンパク質、インターフェロンγ誘導モノカイン（Ｍｉｇ）、インターフェロン−α誘導タンパク質１０（ＩＰ１０）、ＭｉｇとＩＰ１０との融合タンパク質、可溶性ＦＬＴ−１（ｆｉｎｓ様チロシンキナーゼ１受容体）およびキナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ：ｋｉｎａｓｅ ｉｎｓｅｒｔ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子であってもよい。ある種の特異的態様では、こうした血管新生レギュレーター遺伝子を、参照によって本明細書に援用する米国特許第７，１２２，１８１号に記載されたレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて送達してもよい。
【００２０】
上記のように、ある態様では、本発明は、癌を処置するための方法を提供する。したがって、場合によっては、記載の方法を用いて腫瘍への血流を制限ないし減少させることで、腫瘍増殖または転移を抑制することができる。ある場合には、本明細書の方法を用いて転移性癌を阻害または処置してもよい。本発明の方法により、種々の癌のタイプを処置することができ、たとえば、処置対象の癌は、膀胱癌、血液癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、結腸癌、食道癌、眼癌、胃腸癌、歯肉癌、頭部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、鼻咽頭癌、頸部癌、卵巣癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、舌癌または子宮癌であってもよい。さらに、本発明の方法と組み合わせて、または併用して追加の抗癌療法剤を用いてもよい。こうした追加の療法については、本発明の方法の前後または同時に施すことができる。たとえば、追加の抗癌療法は、化学療法、外科的療法、免疫療法または放射線療法であってもよい。
【００２１】
本発明のＤＮ ＲＴＥＦ−１組成物については、患者に局所投与しても、全身投与してもよいことを意図している。たとえば、本発明の方法は、ＤＮ ＲＴＥＦ−１組成物の局部投与、静脈内投与、皮内投与、動脈内投与、腹腔内投与、病巣内投与、頭蓋内投与、関節内投与、前立腺内投与、胸膜内投与、気管内投与、眼内投与、鼻腔内投与、硝子体内投与、膣内投与、直腸内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、結膜下投与、膀胱内投与、粘膜投与、心膜内投与、臍帯内投与、眼球内投与、経口投与、吸入投与、注射投与、注入投与、持続注入投与、標的細胞を直接浸す局部灌流による投与、カテーテルを介した投与または洗浄による投与を含んでもよい。上述のように、場合によっては、ＤＮ ＲＴＥＦ−１組成物を眼に送達し、投与は、たとえば、局部投与でも、結膜下投与でも、眼周囲投与でも、眼球後投与でも、テノン嚢下投与でも、前房内投与でも、硝子体内投与でも、眼内投与でも、網膜下投与でも、後強膜近傍投与でも、上脈絡叢投与でもよい。ある態様では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１組成物を眼内注射、局部投与（たとえば、点眼製剤で）により眼に局所投与してもよい。
【００２２】
いくつかのさらなる実施形態では、組成物を滴下投与できる出口を備えたビンに入れられた本発明の医薬組成物を提供する。ある場合には、ビンに入れられた医薬組成物は反復投与量を含み、ある態様では、ビンは片目または両目に投与する単回投与単位を含み、好ましくは、単回投与単位は製剤の１〜２滴である。本明細書で使用する場合、「ビン」という語は、アンプル、点眼器またはシリンジなどの任意の液体用容器をいう。
【００２３】
本発明の方法および／または組成物の文脈で考察される実施形態は、本明細書に記載の任意の他の方法または組成物に関して用いてもよい。したがって、ある方法または組成物に関する実施形態を他の方法および本発明の組成物に用いても構わない。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「１つの（ａ）または（ａｎ）」は、１つを意味することもあれば、複数を意味することもある。特許請求の範囲（単数または複数）で使用するとき、「１つの（ａ）または（ａｎ）」は、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語と併用して使用する場合、１つを意味することもあれば、複数を意味することもある。
【００２５】
特許請求の範囲で「または（ｏｒ）」という語を使用する場合、代替物のみ、あるいは、代替物が相互に排他的であると明示的な記載がない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味するが、本開示では、代替物のみおよび「および／または」に言及する定義が妥当と考える。本明細書で使用する場合、「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとももう１つ、あるいはそれ以上を意味することができる。
【００２６】
本出願において「約（ａｂｏｕｔ）」という語を使用する場合、ある値に、その値の判定に用いる装置、方法に固有の誤差変動または研究対象間に存在する変動が含まれることを示す。
【００２７】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明により明らかになるであろう。ただし、詳細な説明および個々の例は本発明の好ましい実施形態を示すものとはいえ、例示のみを目的としていることを理解すべきである。このため、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、この詳細な説明により様々な変更および変形が当業者に明らかになるであろう。
【００２８】
以下の図面は本明細書の一部であり、本発明のある種の態様をさらに説明するために記載されている。図面と共に本明細書に示す具体的な実施形態の詳細な説明を参照すれば、本発明の理解が深まるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１Ａ〜Ｂ：低酸素ではＲＴＥＦ−１のｍＲＮＡスプライシングが変化する。網膜および虹彩内皮細胞を低酸素状態に置き、ＲＴＥＦ−１スプライシングをＲＴ−ＰＣＲにより解析した。図１Ａ、ＲＴ−ＰＣＲにより同定されたＲＴＥＦ−１スプライスバリアントの配列図である。各スプライスバリアントの非翻訳領域のエクソン配列（斜め線の網掛け）およびアミノ酸コード領域（無地の枠）を示す。さらに、推定ＲＴＥＦ−１機能ドメインも図示しており、格子枠はＴＥＡ ＤＮＡ結合ドメイン（アスタリスクは予想されるαへリックスの位置を示す）を、黒地の枠は核移行シグナル（エクソン４）を、縦線網掛けは活性化ドメイン（プロリンリッチドメイン（ＰＲＤ：Ｐｒｏｌｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｄｏｍａｉｎ））を、横線網掛けはエクソン９および１０の２個のＳＴＹドメインを示す。図１Ｂ、ヒト網膜血管内皮細胞（ＲＶＥＣ：ｒｅｔｉｎａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）の初代培養から調製したＲＴＥＦ−１特異的ＲＴ−ＰＣＲ産物を示すアガロースゲル電気泳動像である。レーン１および４：ＤＮＡラダー；レーン２：正常酸素圧条件下でＲＶＥＣから調製したｃＤＮＡにより得られた２個の産物（大きさは１３０５ｂｐおよび９３６ｂｐ）；レーン３：低酸素状態下でＲＶＥＣから調製されたｃＤＮＡにより得られた３個の産物（大きさは１３０５ｂｐ、９３６ｂｐおよび４４７ｂｐ）。
【図２】図２：ＲＴＥＦ−１変異体は、ＶＥＧＦプロモーターを活性化または抑制する。表記のＲＴＥＦ−１変異体を含む発現ベクターと共にＶＥＧＦプロモーターレポーターコンストラクト（分泌アルカリホスホターゼを誘導するＶＥＧＦプロモーター）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。結果は、ｐＳＥＡＰ−ＶＥＧＦプロモーターと、１３０５ｂｐ（レーン１）、９３６ｂｐ（レーン２）、６５１ｂｐ（レーン３）、ｓｓ−６５１−ＲＭＲ ｂｐ（レーン６）または４４７ｂｐ（レーン４）ＲＴＥＦ−１変異体を含むｐｃＤＮＡ発現コンストラクトとのトランスフェクションから６時間後の培地中のＡＰ活性を示す。レーン５は、インサートのないｐｃＤＮＡ対照プラスミドをコトランスフェクトしたときの対照ＶＥＧＦプロモーター活性を示す。
【図３】図３：ＲＴＥＦ−１によるＶＥＧＦプロモーター活性の調節は、４つのＳＰ１結合部位を含むＶＥＧＦプロモーター部分に左右される。細胞に、１３０５ｂｐ（レーン１）、９３６ｂｐ（レーン２）、６５１ｂｐ（レーン３）、ｓｓ−６５１ｂｐ（レーン６）または４４７ｂｐ（レーン４）ＲＴＥＦ−１変異体を含むｐｃＤＮＡ発現コンストラクトと、インタクトなＶＥＧＦプロモーター（黒地の枠）またはヌクレオチド−１１３〜−５７が欠失したＶＥＧＦプロモーター（白地の枠）を含むレポーターベクターとを上記のようにトランスフェクトした。レーン５は、インサートのないｐｃＤＮＡ対照プラスミドをコトランスフェクトしたときの対照ＶＥＧＦプロモーター活性を示す。
【図４】図４：６５１ｂｐのＲＴＥＦ−１はドミナントネガティブとして働く。細胞に、ｐＳＥＡＰ−ＶＥＧＦおよび１３０５ｂｐ（レーン１、２）、９３６ｂｐ（レーン３、４）または４４７ｂｐ（レーン５、６）ＲＴＥＦ−１変異体を単独で（レーン１、３および５）、あるいはｓｓ−６５１−ＲＭＲ ｂｐ ＲＴＥＦ−１変異体を加えて（レーン２、４および６）上記のようにトランスフェクトした。
【図５】図５Ａ〜Ｃ：ＲＴＥＦ−１ポリペプチドの検出。ＲＴＥＦ−１に特有ではあるが、天然の変異体がそれぞれ共有するアミノ酸配列に対して抗体を作製した。図５Ａは、ＲＴＥＦ−１から関連転写因子までの領域のアミノ酸アライメントである。抗体作製に使用したアミノ酸配列を下線で示す。図５Ｂ：抗ＲＴＥＦ−１抗体によるイムノブロット像。解析に使用した細胞ライセートは、ｐｃＤＮＡ空ベクター（レーン２および８）または１３０５ｂｐ（レーン３、９）、９３６ｂｐ（レーン４、１０）、６５１ｂｐ（レーン５、１１）もしくは４４７ｂｐ（レーン６、１１）ＲＴＥＦ−１変異体のｐｃＤＮＡ発現ベクターをトランスフェクトした細胞から得た。各ＲＴＥＦ−１変異体の検出を楕円で示す。レーン１および７は分子量マーカーである。レーン１〜６は、レーン７〜１２の像の過剰曝露を示す。図５Ｃ：抗ＲＴＥＦ−１抗体を用いて、ｐｃＤＮＡ ６５１ｂｐのＲＴＥＦ−１発現ベクターをトランスフェクトした細胞のＲＴＥＦ−１変異体を検出したイムノブロット像。予想される約２４ｋＤａポリペプチドを矢印で示す。
【図６】図６Ａ〜Ｂ：眼におけるＲＴＥＦ−１変異体の発現。図６Ａ：正常な霊長類眼組織中のＲＴＥＦ−１発現を示すイムノブロット像。網膜（レーン１）、脈絡膜（レーン２）および虹彩（レーン３）の組織ライセートのタンパク質についてイムノブロット解析を行った。Ｍは分子量マーカーを示す。図６Ｂ：ＲＴＥＦ−１特異的プライマーを用いて生成された半定量的ＲＴ−ＰＣＲ産物を可視化するため、エチジウムプロミドで染色したアガロースゲル像。レーン１はＣＲＡＯ網膜ＲＮＡの結果、レーン２は対照網膜ＲＮＡの結果を示す。
【図７】図７Ａ〜Ｄ：霊長類眼組織中のＲＴＥＦ−１発現の免疫組織化学解析。図７Ａ〜Ｂ：ＲＴＥＦ−１の強い染色が虹彩（Ｉ）、毛様体（ＣＢ）、視神経（ＯＮ）および網膜（Ｒ）に局在しているように見える。角膜（Ｃ）および水晶体（Ｌ）は、ＲＴＥＦ−１抗体ハイブリダイゼーションで陰性であった。図７Ｃ〜Ｄ：ＲＴＥＦ−１の最も強い染色が神経節細胞層（ＧＣＬ：ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌ ｌａｙｅｒ）および内顆粒層（ＩＮＬ：ｉｎｎｅｒ ｎｕｃｌｅａｒ ｌａｙｅｒ）に認められる。染色は、細胞質と核との両方に局在しているように見える。外層では染色があまり認められない。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
近年、癌およびＡＭＤなどの血管形成障害の処置を目的として、血管新生のシグナル伝達を阻害するための多くの戦略が開発されているところである。特に、ＶＥＧＦと細胞表面受容体の１つまたは両方との結合の阻害によるＶＥＧＦのシグナル伝達の遮断に着目した戦略が多い。しかしながら、こうした戦略は、異常な血管形成を惹起するＶＥＧＦの初期産生に対処できない。したがって、ＶＥＧＦの産生を阻害する新規な方法および組成物は、ＶＥＧＦ遮断と、それによる血管形成の処置との新しい方法になる可能性がある。このため、ある態様では、本発明は、ＶＥＧＦの活性化に不可欠なドミナントネガティブ転写因子を提供する。さらに、本発明は細胞内プロセスの標的化にも関するため、本発明の治療剤は、特定の細胞型を標的にし、それにより、好ましからぬ全身性副作用を低下させることができる。したがって、本発明は、血管形成障害を処置する新規な方法および／または現在のＶＥＧＦ遮断戦略の有効性を高める方式を提供する。
【００３１】
ＲＴＥＦ−１は多機能性転写因子ファミリーのメンバーであり、低酸素によるＶＥＧＦの転写など、ＶＥＧＦの転写の活性化因子であることが明らかになっている。しかしながら、本明細書に示すように、細胞ではＲＴＥＦ−１の複数のスプライスバリアントが産生され、ＲＮＡの選択的スプライシングバリアントから産生されるＲＴＥＦ−１ポリペプチドでは、転写機能が変化している（図１Ａ、Ｂ）。特に（Ｉｔ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ）、約６５１塩基対のＲＴＥＦ−１転写物は、ＶＥＧＦプロモーター活性を阻害するポリペプチドを産生する（図２、レーン３および５を比較）。さらに、このＲＴＥＦ−１変異体は、分泌シグナルおよび細胞内移行ポリペプチドとの融合タンパク質として形成される場合、より効果的なＶＥＧＦプロモーターの阻害剤となることも明らかになった図２のレーン６）。重要な点として、図４に示すように、６５１ｂｐのＲＴＥＦ−１転写物由来のポリペプチドは、ドミナントネガティブに作用する。つまり、このポリペプチドは、ＶＥＧＦプロモーター活性を低下させるばかりでなく、他の（ａ ｏｔｈｅｒ）ＲＴＥＦ−１タンパク質アイソフォームによるＶＥＧＦプロモーターの増強作用も遮断する。さらに、図６および７に示すように、ＲＴＥＦは眼の組織に発現するため、眼の血管新生障害の発症において重要であることが示唆される。今回の研究では、ＶＥＧＦの産生におけるＲＴＥＦ−１の活性化が、血管新生障害の発症に関与する一要因である可能性が示される。したがって、本発明の方法および組成物は、血管新生を早い段階で予防する手段になる可能性がある。
【００３２】
本発明は、新規なＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドの根拠および血管形成障害を予防ないし阻害するための、その使用を提供する。ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドについては、ＶＥＧＦの産生を遮断するため細胞内環境に直接送達しても、標的細胞に発現させてもよい。こうしたドミネートネガティブポリペプチドは、ＶＥＧＦの新たな産生のみならず、通常、低酸素状態などにおいてＲＴＥＦ−１により刺激を受けるＶＥＧＦの産生も下方制御する。したがって、本発明の組成物を用いて、新たな血管形成（ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を増加させる標的細胞および標的組織の能力を低下させることができる。これは、たとえば、血管の浸潤が直接の病因であるＡＭＤなどの眼の血管新生障害に非常に有益である。さらに、ＤＮ ＲＴＥＦ−１を用いて、新たな血管形成（ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により栄養素を獲得する腫瘍の能力を低下させることで、腫瘍または腫瘍転移を処置することもできる。したがって、腫瘍増殖を遅延させる、および／または腫瘍退縮を誘導する方法も提供する。さらに、発明の組成物は細胞内の早期の転写を標的にしているため、本発明の組成物を用いれば、特異的な細胞標的化／細胞内部移行部分を使用して効果があった組織を標的にして、それにより、標的以外の他の組織の副作用を抑えることもできる。
【００３３】
Ｉ．ドミネートネガティブＲＴＥＦ−１ポリペプチド
本明細書では、多くのＲＴＥＦ−１変異体が記載され、機能的特徴付けが行われている。たとえば、本明細書で具体的に研究した４つの配列は、以下のアミノ酸配列を含む。
【００３４】
１３０５ｂｐのヒトＲＴＥＦ−１のｃＤＮＡによってコードされる配列番号１は、以下の配列を持つ４３４アミノ酸タンパク質である：
【００３５】
【化１】
９３６ｂｐのヒトｃＤＮＡによってコードされる配列番号２は、以下の配列を持つ３１１アミノ酸タンパク質である：
【００３６】
【化２】
６５１ｂｐのヒトｃＤＮＡによってコードされる配列番号３は、以下の配列を持つ２１６アミノ酸タンパク質である：
【００３７】
【化３】
４４７ｂｐのヒトｃＤＮＡによってコードされる配列番号４は、以下の配列を持つ１４８アミノ酸タンパク質である：
【００３８】
【化４】
上述のように本発明のある態様では、ドミナントネガティブ（ＤＮ）ＲＴＥＦ−１ポリペプチドは、アミノ酸の内部欠失を１つまたは複数含んでもよい。たとえば、場合によっては、ＤＮ ＲＴＥＦ−１は、エクソン３、４、５、６、７、８、９または１０によってコードされるアミノ酸の欠失を含んでもよい。たとえば、ある態様では、ＤＮ−ＲＴＥＦ１は、配列番号３のアミノ酸配列またはその誘導体を含む。
【００３９】
【化５】
本発明のさらなる態様では、転写機能を維持したまま、ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドを１つまたは複数のアミノ置換でさらに修飾してもよい。たとえば、同等の親水性を持つアミノ酸との置換であれば、１つまたは複数の位置でアミノ酸置換を行ってもよい。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を与えるにはアミノ酸のハイドロパシックインデックスの重要性が、当該技術分野において一般に理解されている（Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。アミノ酸の相対的なハイドロパシック特性は得られるタンパク質の二次構造に関与し、さらにタンパク質と、他の分子、たとえば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原および同種のものとの相互作用を規定していることが認められている。したがって、ＲＥＴＦ−１配列においてそうした保存的置換を行ってもよく、置換を行ってもＶＥＧＦプロモーター活性を抑えるＲＥＴＦ−１配列の活性および能力に対する作用は軽微にとどまるであろう。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、アミノ酸残基には以下の親水性値が付与されている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパルタート（＋３．０±１）；グルタマート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（０．５）；ヒスチジン−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。こうした値を指標として用いてもよく、その場合、親水性値が±２以内にあるアミノ酸の置換は好ましいものであり、±１以内であれば特に好ましく、±０．５以内であれば、特に一層好ましい。したがって、本明細書に記載のＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドのいずれかを、あるアミノ酸と、異なってはいるものの同等の親水性値を持つ同種のアミノ酸との置換により修飾してもよい。親水性が＋／−１．０または＋／−０．５ポイント以内のアミノ酸を同種と見なす。
【００４０】
ＩＩ．細胞内部移行部分および標的化部分
本明細書で使用する細胞内部移行部分は、細胞膜を通ってＤＮ ＲＴＥＦ−１の輸送を仲介する、ＤＮ ＲＴＥＦ−１との（共有結合または非共有結合による）複合体であれば、どのような分子でも構わない。こうした内部移行部分は、ペプチドでも、ポリペプチドでも、ホルモンでも、増殖因子でも、サイトカインでも、アプタマーでも、アビマーでもよい。さらに、細胞内部移行部分は、非特異的な細胞内移行を仲介してもよいし、標的細胞の亜集団内に取り込まれる細胞標的化部分であっても構わない。
【００４１】
たとえば、ある実施形態では、本発明に使用する細胞標的化部分は抗体である。原則として、抗体という語は、以下に限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、ミニボディー、ジボディー、トリボディーのほか、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体およびその任意の混合物などの抗体フラグメントを含む。場合によっては、細胞標的化部分は、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であることが好ましい。関連する実施形態では、細胞標的化ドメインは、アビマーポリペプチドであってもよい。したがって、場合によっては、本発明の細胞標的化コンストラクトは、ＤＮ ＲＴＥＦ−１およびｓｃＦｖまたはアビマーを含む融合タンパク質である。いくつかの非常に特定の実施形態では、細胞標的化コンストラクトは、一本鎖抗体に融合されたＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドを含む融合タンパク質である。
【００４２】
本発明のある態様では、細胞標的化部分は、増殖因子であってもよい。たとえば、本発明による細胞標的化部分として、トランスフォーミング増殖因子、上皮増殖因子、インスリン様成長因子、線維芽細胞増殖因子、Ｂリンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ：Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）、ヘレグリン、血小板由来増殖因子、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）または低酸素誘導因子を用いてもよい。こうした増殖因子を用いれば、同族の増殖因子受容体を発現する細胞にコンストラクトを到達させることができる。たとえば、ＶＥＧＦを用いてＦＬＫ−１および／またはＦｌｔ−１を発現する細胞を標的にしてもよい。なおさらなる態様では、細胞標的化部分は、ポリペプチドＢｌｙＳであっても構わない（米国特許出願公開第第２００６／０１７１９１９号を参照されたい）。
【００４３】
本発明のさらなる態様では、細胞標的化部分は、ホルモンであってもよい。本発明に使用するホルモンの一部の例として、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ゴナドトロピン放出ホルモン、アンドロゲン、エストロゲン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体ホルモン、プロラクチン、成長ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、オキシトシン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、コルチコトロピン放出ホルモン、ソマトスタチン、ドーパミン、メラトニン、チロキシン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、糖質コルチコイド、ミネラルコルチコイド、アドレナリン、ノルアドレナリン、プロゲステロン、インスリン、グルカゴン、アミリン、エリトロポイチン、カルシトリオール、カルシフェロール、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ニューロペプチドＹ、グレリン、ＰＹＹ３−３６、インスリン様成長因子−１、レプチン、トロンボポエチン、アンジオテンシノーゲン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５またはＩＬ−３６があるが、これに限定されるものではない。上記で論じたように、ホルモンを含む標的化コンストラクトにより、表記のホルモンの細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ）受容体を含む細胞集団を標的にする方法が可能になる。
【００４４】
本発明のなおさらなる実施形態では、細胞標的化部分はサイトカインであってもよい。たとえば、本発明による標的化部分として、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、白血病抑制因子、エリスロポエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、オンコスタチンＭ、白血病抑制因子、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＬＴ−β、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢＬ、ＴＧＦ−β、ＩＬ１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡ、ＭＩＦおよびＩＧＩＦのどれを用いてもよい。
【００４５】
本発明のある態様では、本発明の細胞標的化部分は、癌細胞標的化部分であってもよい。表面分子を異常発現するある種の癌細胞は周囲の組織に比べて特有であることがよく知られている。したがって、こうした表面分子に結合する細胞標的化部分を用いれば、ＤＮ ＲＴＥＦ−１を癌細胞に特異的に標的化送達することができる。たとえば、細胞標的化部分を肺癌細胞、乳癌細胞、脳癌細胞、前立腺癌細胞、脾臓癌細胞、膵臓癌細胞、頸部癌細胞、卵巣癌細胞、頭頸部癌細胞、食道癌細胞、肝臓癌細胞、皮膚癌細胞、腎臓癌細胞、白血病癌細胞、骨癌細胞、精巣癌細胞、結腸癌細胞または膀胱癌細胞に結合させ、それに取り込ませてもよい。癌細胞の個々の癌マーカーの発現または発現レベルによって癌細胞標的化ＤＮ ＲＴＥＦ−１の有効性が異なる場合があることを当業者であれば理解するであろう。したがって、ある態様では、標的ＤＮ ＲＴＥＦ−１で癌を処置するための方法であって、癌が特定の細胞表面マーカーを発現するかどうか（あるいはその程度）を判定することと、マーカー遺伝子またはポリペプチドの発現レベルに応じて、ＤＮ ＲＴＥＦ−１標的療法剤（ｔｈｅｒａｐｙ）（または別の抗癌療法剤（ｔｈｅｒａｐｙ））を癌細胞に投与することとを含む方法を提供する。
【００４６】
上記で論じたように、本発明による細胞標的化部分は、たとえば、抗体であってもよい。たとえば、本発明による細胞標的化部分は、メラノーマ細胞などの皮膚癌細胞に結合することができる。ｇｐ２４０抗原は様々なメラノーマで発現するが、正常組織では発現しないことが明らかになっている。このため、本発明のある態様では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１およびｇｐ２４０に結合する細胞標的化部分を含む細胞標的化コンストラクトを提供する。場合によっては、ｇｐ２４０結合分子は、ＺＭＥ−０１８（２２５．２８Ｓ）抗体または９．２．２７抗体などの抗体であってもよい。より一層好ましい実施形態では、ｇｐ２４０結合分子は、ｓｃＦｖＭＥＬ抗体などの一本鎖抗体であってもよい。
【００４７】
本発明のなおさらなる特定の実施形態では、細胞標的化コンストラクトを乳癌細胞に誘導してもよい。たとえば、抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体など、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに結合する細胞標的化部分をＤＮ ＲＴＥＦ−１にコンジュゲートしてもよい。こうした細胞標的化コンストラクトの一例として、一本鎖抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体ｓｃＦｖ２３およびＤＮ ＲＴＥＦ−１を含む融合タンパク質がある。また、本発明の組成物および方法には、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに結合するｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）などの他のｓｃＦｖ抗体を用いてもよい（ｖｏｎ Ｍｉｎｃｋｗｉｔｚら、２００５）。
【００４８】
本発明のある追加の実施形態では、発明による癌細胞標的化部分が、複数のタイプの癌細胞に対して結合能を持つことを想定している。たとえば、８Ｈ９モノクローナル抗体およびこれに由来する一本鎖抗体は、乳癌、肉腫および神経芽細胞腫に発現する糖タンパク質に結合する（Ｏｎｄａら、２００４）。別の例として、様々なタイプの癌に発現するＭＵＣ−１抗原に結合する、米国特許出願公開第２００４／００５６４７号およびＷｉｎｔｈｒｏｐら、２００３に記載の細胞標的化薬がある。したがって、ある実施形態では、本発明の細胞標的化コンストラクトが、複数のタイプの癌または腫瘍を標的にできることが理解されるであろう。
【００４９】
ＩＩＩ．抗体の作製方法
以下の方法は、最も一般的な抗体作製法のいくつかの代表例である。
【００５０】
Ａ．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体については、動物を用いて抗原の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射を複数回行って産生させるのが一般的である。本明細書で使用する場合、「抗原」という語は、抗体の作製に使用する任意のポリペプチドをいう。本発明に従って使用する抗原は、癌の細胞表面マーカーポリペプチドおよび眼特異的細胞表面マーカーを含む。
【００５１】
抗原または標的アミノ酸配列を含むフラグメントを、免疫対象の種に免疫原性を持つタンパク質、たとえば、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシチログロブリンまたは大豆トリプシン阻害剤に、二官能性物質または誘導体化剤、たとえば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基によるコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基による）、グリタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ２、またはＲおよびＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いてコンジュゲートすると有用である場合がある。
【００５２】
免疫原性コンジュゲートまたは誘導体で動物を免疫するには、コンジュゲートの１μｇの１ｍｇ（それぞれウサギまたはマウス）と３容のフロイント完全アジュバントとを組み合わせ、この溶液を複数の部位に皮内注射する。１ヶ月後、フロイント完全アジュバントに加えたコンジュゲートの当初量の１／５〜１／１０で、皮下注射により複数の部位で動物を追加免疫する。７〜１４日後、動物を脱血し、その血清の特異的な抗体価をアッセイする。力価がプラトーになるまで動物を追加免疫する。好ましくは、抗原は同じだが、別のタンパク質との、および／または別の架橋結合試薬によるコンジュゲートで動物を追加免疫する。また、コンジュゲートについては、組換え細胞培養を用いてタンパク質の融合体として作製してもよい。さらに、ミョウバンなどの凝集剤を用いて免疫応答を高める。
【００５３】
Ｂ．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られる。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかながら存在するかもしれない、自然発生する可能性がある突然変異を除いて同一である。したがって、修飾語句「モノクローナル」は、多種類の抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。
【００５４】
たとえば、本発明のモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）が最初に記載したハイブリドーマ法を用いて作製してもよいし、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）を用いて作製してもよい。
【００５５】
ハイブリドーマ法では、マウス、あるいはハムスターなど他の適当な宿主動物を上述のように免疫し、免疫に使用するタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するリンパ球、または産生する能力があるリンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫してもよい。その後、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を用いて、リンパ球を骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ １９８６）。
【００５６】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖および生存を阻害する１つまたは複数の物質を含む好適な培養基に播種し、増殖させる。たとえば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠損している場合、ハイブリドーマの培養基は一般に、ＨＧＰＲＴ−欠損細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む（ＨＡＴ培地）。
【００５７】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、かつ選択した抗体産生細胞からの安定かつ高レベルの抗体発現を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性がある細胞である。中でも好ましい骨髄腫細胞株は、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、およびアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡから入手できるＳＰ−２細胞由来の株など、マウスの骨髄腫株である。
【００５８】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養基を、標的抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降か、あるいはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ：ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）などのインビトロ結合アッセイにより判定する。
【００５９】
モノクローナル抗体の結合親和性は、たとえば、Ｍｕｎｓｏｎ ＆ Ｐｏｌｌａｒｄ（１９８０）のスキャッチャード解析により判定できる。
【００６０】
所望の特異性、親和性および／または活性を持つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定したら、クローンを限界希釈法でサブクローニングし、標準的な方法で増殖させる、Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）。このための好適な培養基として、たとえば、ダルベッコ変法イーグル培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地がある。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖させてもよい。
【００６１】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体については、たとえば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順で培養基、腹水または血清から好適に分離する。
【００６２】
本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（たとえば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブにより）容易に単離し、配列決定できる。本発明のハイブリドーマ細胞は、こうしたＤＮＡの好ましい供給源となる。単離したならば、ＤＮＡを発現ベクターに組み込み、次いで、本来ならば免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトし、この組換え宿主細胞でモノクローナル抗体を合成する。また、たとえば、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列で相同的なマウスの配列を置換したり、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合的に結合したりしてＤＮＡを修飾してもよい。このようにして、本明細書に記載した任意の個々の抗原に対して結合特異性を持つ「キメラ」または「ハイブリッド」抗体を調製する。
【００６３】
一般に、こうした非免疫グロブリンポリペプチドにより、本発明の抗体の定常ドメインを置換したり、本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインを置換したりして、標的抗原に対する特異性を持つ１つの抗原結合部位および別の抗原に対する特異性を持つもう１つ抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作製する。
【００６４】
また、キメラ抗体またはハイブリッド抗体は、架橋剤を含む方法など、タンパク質合成化学における既知の方法を用いてインビトロで調製してもよい。たとえば、ジスルフィド交換反応を用いるか、チオエーテル結合の形成により、免疫毒素を構築することができる。このための好適な試薬の例として、イミノチオラートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミダートが挙げられる。
【００６５】
診断用途では、一般に本発明の抗体を検出可能な部分で標識する。検出可能な部分は、直接的あるいは間接的に、検出可能なシグナルを発生できる任意のものでよい。たとえば、検出可能な部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉなどの放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミンまたはルシフェリンなどの蛍光または化学発光化合物；ビオチン；３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓもしくは１２５Ｉなどの放射性同位体標識またはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくは西洋わさびペルオキシダーゼなどの酵素であってもよい。
【００６６】
抗体を検出可能な部分に別々にコジュゲートするには、Ｈｕｎｔｅｒら（１９６２）；Ｄａｖｉｄら（１９７４）；Ｐａｉｎら（１９８１）；ａｎｄ Ｎｙｇｒｅｎ（１９８２）が記載した方法など、当該技術分野において任意の公知の方法を用いればよい。
【００６７】
本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイおよび免疫沈降アッセイ（Ｚｏｌａ，１９８７）など、任意の既知のアッセイ方法に用いてもよい。
【００６８】
競合結合アッセイは、限られた量の抗体との結合に際して、標識標準物質（精製した標的抗原またはその免疫学的に反応する部分であってもよい）が被検サンプルアナライトと競合する能力を利用する。被検サンプルの抗原の量は、抗体に結合する標準物質の量に反比例する。結合する標準物質の量を判定しやすくするため、通常、競合の前後に抗体を不溶化して、抗体に結合している標準物質およびアナライトを、非結合のままである標準物質およびアナライトと簡便に分離できるようにする。
【００６９】
サンドイッチアッセイでは、検出対象のタンパク質の異なる免疫原性部分またはエピトープに各々結合できる、２種の抗体を使用する。サンドイッチアッセイの場合、固体支持体に固定化した第１の抗体が被検サンプルアナライトに結合し、次いでアナライトに第２の抗体が結合するため、不溶性の３者の複合体が形成される。Ｄａｖｉｄ ＆ Ｇｒｅｅｎｅ、米国特許第４，３７６，１１０号。第２の抗体自体については、検出可能な部分で標識してもよいし（直接的サンドイッチアッセイ）、検出可能な部分で標識した抗免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい（間接的サンドイッチアッセイ）。たとえば、サンドイッチアッセイの１つのタイプとしてＥＬＩＳＡアッセイがあり、この場合、検出可能な部分は酵素である。
【００７０】
Ｃ．ヒト化抗体
既に論じたように、本発明の方法に使用する抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体でも、そのフラグメントでもよい。ただし、いくつかの態様では、処置対象の被検体に免疫応答（ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｓｅ）を引き起こさないように、抗体をヒト化した方が好ましい。非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において周知である。通常、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から１つまたは複数のアミノ酸残基が導入されている。こうした非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「インポート」残基と呼ばれ、一般に「インポート」可変ドメインから取り出す。ヒト化は本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者（Ｊｏｎｅｓら、１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８）に従って、齧歯動物のＣＤＲまたはＣＤＲ配列で、対応するヒト抗体の配列を置換することにより行うことできる。したがって、こうした「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（Ｃａｂｉｌｌｙ， ｓｕｐｒａ）、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に小さなドメインが、対応する非ヒト種由来の配列により置換されている。実際のヒト化抗体は一般に、いくつかのＣＤＲ残基、場合によってはいくつかのＦＲ残基も、齧歯動物抗体の類似部位由来の残基で置換されているヒト抗体である。
【００７１】
たとえば、標的細胞に結合し、細胞内に取り込まれる能力など、抗原に対する高親和性および他の好ましい生物学的特性を保持しつつ抗体をヒト化することが重要である。この目的を実現するには、好ましい方法に従い、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列および様々な概念的ヒト化産物を解析するプロセスによりヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択した候補免疫グロブリン配列の予想される三次元立体構造を図解で表示するコンピュータープログラムが有用である。そうした表示を調べれば、候補免疫グロブリン配列の機能において想定される残基の役割の解析、すなわち、候補免疫グロブリンの抗原への結合能に影響を与える残基の解析が可能になる。このようにして、コンセンサス配列およびインポート配列からＦＲ残基を選択し、組み合わせると、標的抗原（単数または複数）に対する親和性の向上など、所望の抗体特性を実現できる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合の作用に直接的に非常に大きく関与している。詳細については、１９９１年６月１４日に出願された米国特許出願第０７／７１５，２７２号の一部継続出願である１９９２年８月２１日に出願された米国特許出願第０７／９３４，３７３号を参照されたい。
【００７２】
Ｄ．ヒト抗体
ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法で作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を作製するためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株については、たとえば、Ｋｏｚｂｏｒ（１９８４） ａｎｄ Ｂｒｏｄｅｕｒら（１９８７）により記載されている。
【００７３】
現在では、内在性免疫グロブリンが産生されなくても、免疫によりヒト抗体のレパートリーを創出できるトランスジェニック動物（たとえば、マウス）を作製することができる。たとえば、生殖系列変異のキメラマウスを用いて抗体重鎖の結合領域（ＪＨ）遺伝子を同型接合的に欠損させると、内在性抗体の産生が完全に阻害されることが記載されている。こうした生殖系列変異マウスにヒト生殖系列免疫グロブリンの遺伝子アレイを移行すれば、抗原の攻撃によりヒト抗体が産生される。たとえば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）を参照されたい。
【００７４】
あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０）を用いて、非免疫ドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからインビトロでヒト抗体および抗体フラグメントを作製することもできる。この手法に従い、Ｍ１３またはｆｄなどの糸状バクテリオファージのメジャーコートタンパク質またはマイナーコートタンパク質の遺伝子のどちらかに、抗体Ｖドメイン遺伝子をインフレームでクローニングし、ファージ粒子の表面に機能的抗体フラグメントとして提示させる。
【００７５】
この糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡのコピーを含むため、抗体の機能特性に応じて選択を行えば、同時にその特性を示す抗体をコードする遺伝子を選択することにもなる。こうした点で、このファージは、Ｂ細胞の特性の一部と類似している。ファージディスプレイは、様々なフォーマットで行うことができる。総説として、たとえば、Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９３）を参照されたい。ファージディスプレイには、Ｖ遺伝子セグメントの複数の供給源を用いてもよい。Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）は、免疫したマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリーから、多様な抗オキサゾロン抗体を単離した。感作されていないヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーを作成してもよく、Ｍａｒｋｓら（１９９１）またはＧｒｉｆｆｉｔｈら（１９９３）が記載した技法に本質的に従って、多様な抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を単離することができる。自然免疫応答の場合、抗体遺伝子は、高い頻度で突然変異を積み重ねる（体細胞突然変異）。変化がある程度導入されると親和性が高まり、高親和性の表面免疫グロブリンを提示しているＢ細胞は、優先的に複製され、その後の抗原の攻撃の際に分化する。「鎖シャフリング」と呼ばれる手法を用いれば、この自然のプロセスを模倣できる（Ｍａｒｋｓら、１９９２）。この方法では、非免疫ドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然変異体（レパートリー）のレパートリーで重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を順次置換して、ファージディスプレイにより得られた「一次」ヒト抗体の親和性を向上させることができる。この技法を用いれば、ｎＭ範囲の親和性を持つ抗体および抗体フラグメントを作製できる。非常に大きなファージ抗体レパートリー（「マザーオブオールライブラリー」とも呼ばれる）を作成する戦略がＷａｔｅｒｈｏｕｓｅら（１９９３）により記載されており、こうした大きなファージライブラリーからの高親和性のヒト抗体の直接的な単離が報告されている。また、遺伝子シャフリングを用いても、出発齧歯動物抗体と同等の親和性および特異性を持つヒト抗体を齧歯動物抗体から得ることができる。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法によれば、ファージディスプレイ手法で得られた齧歯動物抗体の重鎖または軽鎖Ｖドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換して、齧歯動物−ヒトキメラを作製する。抗原の選択が、機能的抗原結合部位を回復できるヒト可変領域の単離につながる。すなわち、エピトープがパートナーの選択を支配する（インプリントする）。このプロセスを繰り返して残りの齧歯動物Ｖドメインを置換すると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日公開の国際公開第９３／０６２１３号を参照されたい）。この手法は、齧歯動物抗体のＣＤＲグラフティングによる従来のヒト化と異なり、齧歯動物由来のフレームワークまたはＣＤＲ残基を含まない完全なヒト抗体を提供する。
【００７６】
ＩＶ．核酸分子
ある態様では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドをコードする本発明は、核酸分子に関する。ある態様では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１核酸配列を核酸ベクターに組み込む。「ベクター」という語を使用する場合、核酸配列を挿入して核酸配列の複製が可能な細胞に導入できる、キャリア核酸分子をいう。核酸配列は「外来」であってもよい。外来とは、ベクターを導入する細胞にとって異質であるか、あるいは、その配列は細胞内の配列と同種であるが、宿主細胞の核酸内でその配列が通常確認されない位置にあることを意味する。ベクターとして、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス）および人工染色体（ＹＡＣなど）が挙げられる。当業者であれば、標準的な組換え技法によりベクターを構築することができるであろう（たとえば、どちらも参照によって本明細書に援用するＭａｎｉａｔｉｓら、１９８８ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９４を参照されたい）。
【００７７】
「発現ベクター」という語は、転写され得るＲＮＡをコードする核酸を含む遺伝子コンストラクトをいう。場合によっては、ＲＮＡ分子はその後タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳されるが、たとえば、アンチセンス分子またはリボザイムの生成においては、翻訳されない場合もある。発現ベクターは、様々な「制御配列」を含んでもよい。制御配列とは、個々の宿主細胞において、作動可能に連結されたコード配列の転写、場合によっては翻訳に必要な核酸配列をいう。ベクターおよび発現ベクターは、転写および翻訳を決定する制御配列に加えて、以下に記載する他の機能に役立つ核酸配列も含んでもよい。
【００７８】
Ａ．プロモーターおよびエンハンサー
「プロモーター」は、転写の開始および速度を制御する核酸配列の一領域である制御配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および分子が結合して、特異的転写核酸配列を開始する遺伝子エレメントを含んでもよい。「作動的に配置された」、「作動的に連結された」、「制御下」および「転写制御下」という語句は、プロモーターが、核酸配列の転写の開始および／または発現を制御するため、その配列に関して適切な機能的位置および／または方向にあることを意味する。
【００７９】
プロモーターは通常、ＲＮＡ合成の開始部位の位置を決める働きをする配列を含む。その最もよく知られた例としてＴＡＴＡボックスがあるが、たとえば、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターのようにＴＡＴＡボックスを欠損したプロモーターの中には、開始部位に重なる別のエレメントがそれ自体で開始場所を決める働きをするものもある。さらに、転写開始の頻度を調節するプロモーターエレメントもある。一般に、こうしたエレメントは開始部位から上流３０ １１０ｂｐ領域に位置するが、多くのプロモーターが、開始部位の下流にも機能エレメントを含むことが明らかになっている。コード配列をプロモーター「の制御下」に置くには、転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端を、選択したプロモーターの「下流」（すなわち、３’）に配置する。「上流の」プロモーターがＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促進する。
【００８０】
プロモーターエレメント間のスペースは融通が利く場合が多いため、各エレメントが相互に逆になったり、移動したりしてもプロモーター機能は保持される。ｔｋプロモーターの場合、活性を低下させずに、プロモーターエレメント間のスペースを５０ｂｐまで拡大することができる。個々のエレメントは、プロモーターに応じて、協同的にも、あるいは独立的にも機能して転写を活性化できると考えられる。プロモーターは、「エンハンサー」と併用する場合もあれば、そうでない場合もある。エンハンサーとは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性制御配列をいう。
【００８１】
プロモーターは、コードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離して得られるような、核酸配列に天然に関連するものであってもよい。こうしたプロモーターは、「内在性」という場合がある。同様に、エンハンサーも、核酸配列の下流あるいは上流に位置する、その配列に天然に関連するものであってもよい。あるいは、核酸コードセグメントを組換えまたは異種プロモーターの制御下に置いても、いくつかの利点が得られるであろう。組換えまたは異種プロモーターとは、天然環境において核酸配列に通常関連しないプロモーターである。また、組換えまたは異種エンハンサーとは、天然環境において核酸配列に通常関連しないエンハンサーである。こうしたプロモーターまたはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、任意の他のウイルスまたは原核生物細胞もしくは真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および非「天然の」、すなわち、様々な転写調節領域の様々なエレメントおよび／または発現を変化させる突然変異を含むプロモーターまたはエンハンサーを含めてもよい。たとえば、組換えＤＮＡの構築に最も多く使われているプロモーターとして、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースおよびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が挙げられる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列については合成的に生成する以外にも、本明細書に開示した組成物と共に組換えクローニングおよび／またはＰＣＲ（商標）などの核酸増幅技術を用いて生成してもよい（各々参照によって本明細書に援用する米国特許第４，６８３，２０２号および同第５，９２８，９０６号を参照されたい）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体および同種のものなど、非核性オルガネラ内の配列の転写および／または発現を指令する制御配列を用い得ることも意図している。
【００８２】
当然ながら、発現のために選択したオルガネラ、細胞型、組織、器官または生体においてＤＮＡセグメントの発現を効果的に指令するプロモーターおよび／またはエンハンサーを用いることが重要である。分子生物学の当業者であれば、通常、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサーおよび細胞型の組み合わせの使用について知っている（たとえば、参照によって本明細書に援用するＳａｍｂｒｏｏｋら１９８９を参照されたい）。使用するプロモーターは、構成的であっても、組織特異的であっても、誘導性であっても、および／または、組換えタンパク質および／またはペプチドの大規模な作製に都合がよいなど、適当な条件下で、導入したＤＮＡセグメントの高レベルの発現を指令するのに有用であってもよい。プロモーターは、異種性でも、内在性でも構わない。
【００８３】
さらに、（たとえば、真核生物プロモーターデータベースＥＰＤＢ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐｄ．ｉｓｂ−ｓｉｂ．ｃｈ／のように）任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせを用いて発現を誘導してもよい。もう１つの可能な実施形態として、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６細胞質発現系の使用がある。真核細胞では、送達複合体の一部としてまたは他の遺伝子発現コンストラクトとして適当な細菌ポリメラーゼを供給すれば、ある種の細菌プロモーターからの細胞質転写が可能である。
【００８４】
組織特異的プロモーターまたはエレメントの種類およびその活性の特徴付けを行うアッセイは、当業者によく知られている。こうした領域の非限定的な例には、ヒトＬＩＭＫ２遺伝子（Ｎｏｍｏｔｏら１９９９）、ソマトスタチン受容体２遺伝子（Ｋｒａｕｓ ｅｔ．ａｌ．，１９９８）、マウス精巣上体レチノイン酸結合遺伝子（Ｌａｒｅｙｒｅ ｅｔ．ａｌ．，１９９９）、ヒトＣＤ４（Ｚｈａｏ−Ｅｍｏｎｅｔ ｅｔ．ａｌ．，１９９８）、マウスα２（ＸＩ）コラーゲン（Ｔｓｕｍａｋｉ，ｅｔ．ａｌ．，１９９８）、Ｄ１Ａドーパミン受容体遺伝子（Ｌｅｅ，ｅｔ．ａｌ．，１９９７）、インスリン様成長因子ＩＩ（Ｗｕ ｅｔ．ａｌ．，１９９７）およびヒト血小板内皮細胞接着分子−１（Ａｌｍｅｎｄｒｏ ｅｔ．ａｌ．，１９９６）がある。
【００８５】
Ｂ．開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位
また、コード配列の効率的な翻訳には、特異的開始シグナルが必要な場合もある。こうしたシグナルには、ＡＴＧ開始コドンまたはそれに隣接する配列がある。ＡＴＧ開始コドンを含む外来性転写制御シグナルの供給が必要な場合もある。当業者であれば、こうしたことを容易に判定し、必要なシグナルを供給できるであろう。インサート全体の翻訳を確保するには、所望のコード配列のリーディンフレームと開始コドンが「インフレーム」でなければならないことはよく知られている。外来性の転写制御シグナルおよび開始コドンは、天然であっても、あるいは合成であってもよい。適切な転写エンハンサーエレメントを加えることで、発現の効率が高まる場合がある。
【００８６】
本発明のある実施形態では、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）エレメントを用いて多重遺伝子またはポリシストロニックメッセージを生成する。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化キャップ依存的翻訳のリボソームスキャニングモデルを介さずに、内部部位で翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメント（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）、および哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳ（Ｍａｃｅｊａｋ ａｎｄ Ｓａｒｎｏｗ，１９９１）が記載されている。ＩＲＥＳエレメントは、異種のオープンリーディングフレームに結合できる。ＩＲＥＳにより分断された複数のオープンリーディングフレームがそれぞれ一緒に転写され、ポリシストロニックメッセージが生成され得る。ＩＲＥＳエレメントにより、各オープンリーディングフレームはリボソームに到達し、効率的に翻訳を行うことができる。同義遺伝子については、単一のメッセージを転写する単一のプロモーター／エンハンサーを用いて効率的に発現させることができる（参照によって本明細書に援用する米国特許第５，９２５，５６５号および同第５，９３５，８１９号を参照されたい）。
【００８７】
Ｃ．マルチプルクローニングサイト
ベクターは、複数の制限酵素部位を含む核酸領域であるマルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）を含んでもよく、ベクターを消化するには、標準的な組換え技法と共にどのマルチプルクローニングサイトを用いてもよい（たとえば、参照によって本明細書に援用するＣａｒｂｏｎｅｌｌｉ ｅｔ．ａｌ．，１９９９，Ｌｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，１９９８，ａｎｄ Ｃｏｃｅａ，１９９７を参照されたい）。「制限酵素消化」とは、核酸分子の特異的場所でのみ機能する酵素による核酸分子の触媒的切断をいう。こうした制限酵素の多くが市販されている。こうした酵素の使用は、当業者により広く理解されている。頻繁には、ＭＣＳ内で切断する制限酵素を用いてベクターを直線化または断片化して、外来性の配列をベクターにライゲートできるようにする。「ライゲーション」とは、相互に近接していても、していなくてもよい２つの核酸フラグメント間にホスホジエステル結合を形成するプロセスをいう。制限酵素およびライゲーション反応に関する技法は、組換え技術の当業者によく知られている。
【００８８】
Ｄ．スプライシング部位
転写された真核生物ＲＮＡ分子の大部分ではＲＮＡスプライシングが行われ、イントロンが一次転写物から除去される。真核生物のゲノム配列を含むベクターで、タンパク質発現のため転写物のプロセシングが適切に行われるには、ドナーおよび／またはアクセプタースプライシング部位が必要な場合がある（たとえば、参照によって本明細書に援用するＣｈａｎｄｌｅｒ ｅｔ．ａｌ．，１９９７を参照されたい）。
【００８９】
Ｅ．終結シグナル
本発明のベクターまたはコンストラクトは通常、少なくとも１つの終結シグナルを含む。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写物の特異的終結に関与するＤＮＡ配列からなる。したがって、ある実施形態では、ＲＮＡ転写物の産生を終了させる終結シグナルを意図している。インビボで望ましいメッセージレベルを得るにはターミネーターが必要な場合もある。
【００９０】
真核生物系では、ターミネーター領域は、新しい転写物が部位特異的に切断され、ポリアデニル化部位が露出されるようにする特異的なＤＮＡ配列をさらに含む。この配列は、特殊な内在性ポリメラーゼにシグナルを送り、転写物の３’末端に約２００Ａ残基の配列（ポリＡ）を付加する。このポリＡテールでＲＮＡ分子が修飾されると安定性が高まり、翻訳の効率が高まると考えられる。したがって、真核生物を含む他の実施形態では、ターミネーターはＲＮＡ切断のためのシグナルを含むことが好ましく、ターミネーターシグナルは、メッセージのポリアデニル化を促進することが一層好ましい。ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位エレメントはメッセージレベルを増強し、そのカセットが他の配列に読み取られるのを最小限に抑える役目を果たすことができる。ある特定の場合には、ポリアデニル化シグナルは、米国特許出願公開第２００５／０１７５５９１号に記載されているようなニューロピリン１からのシグナルであってもよい。
【００９１】
本発明での使用を意図しているターミネーターは、本明細書に記載した、または当業者に公知の任意の転写ターミネーターを含み、たとえば、ウシ成長ホルモンターミネーターなどの遺伝子の終結配列またはＳＶ４０ターミネーターなどのウイルス終結配列があるが、これに限定されるものではない。ある実施形態では、終結シグナルは、配列切断などにより、転写可能または翻訳可能な配列がなくてもよい。
【００９２】
Ｆ．複製起点
ベクターは、宿主細胞中でベクターを増殖させるため、複製を開始する特異的核酸配列である１つまたは複数の複製起点部位（「ｏｒｉ」と呼ばれる場合もある）を含んでもよい。あるいは、宿主細胞が酵母の場合、自己複製配列（ＡＲＳ：ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を用いてもよい。
【００９３】
Ｇ．選択可能なマーカーおよびスクリーニング可能なマーカー
本発明のある実施形態では、発現ベクターにマーカーを組み込むことで、本発明の核酸コンストラクトを含む細胞をインビトロまたはインビボで同定することができる。こうしたマーカーが細胞に同定可能な変化を与えれば、発現ベクターを含む細胞を容易に同定できるであろう。通常、選択可能なマーカーは、選択を可能にする特性を与えるマーカーである。マーカーが存在すると選択が可能になるのがポジティブ選択可能マーカーであり、マーカーが存在すると選択ができなくなるのがネガティブ選択可能マーカーである。ポジティブ選択可能マーカーの例として、薬剤耐性マーカーがある。
【００９４】
薬剤選択マーカーを組み込むと、ほとんどの場合、形質転換体のクローニングおよび同定の助けになり、たとえば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を与える遺伝子は、有用な選択可能なマーカーである。各条件が実施されると形質転換体の識別が可能になる表現型を与えるマーカー以外にも、比色分析に基礎を置くＧＦＰのようなスクリーニング可能なマーカーなどの他のタイプのマーカーも意図している。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ：ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ：ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）などのスクリーニング可能な酵素を用いてもよい。さらに、当業者であれば、ＦＡＣＳ分析との併用が可能な免疫学的マーカーの使用方法も知っているであろう。使用するマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現するのあれば、重要でないと考えられる。別の選択可能およびスクリーニング可能なマーカーも当業者によく知られている。
【００９５】
Ｈ．プラスミドベクター
ある実施形態では、宿主細胞の形質転換に使用するプラスミドベクターを意図している。一般に、そうした宿主には、宿主細胞に適合する種に由来するレプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターを用いる。ベクターは通常、複製部位のほか、表現型による形質転換細胞の選抜を可能にするマーキング配列を含む。非限定的な例では、大腸菌種由来のプラスミドｐＢＲ３２２の誘導体を用いて大腸菌を形質転換することが多い。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含んでおり、したがって、形質転換細胞の同定を容易にする手段となる。ｐＢＲプラスミドまたは他の微生物プラスミドもしくはファージは、たとえば、微生物体がそれ自身のタンパク質発現のために使用できるプロモーターをさらに含むか、あるいは含むように改変する必要がある。
【００９６】
さらに、こうした宿主に関しては、宿主微生物に適合性があるレプリコンおよび制御配列を含むファージベクターを形質転換ベクターとして用いてもよい。たとえば、ファージλＧＥＭＴＭ１１を、宿主細胞、たとえば、大腸菌ＬＥ３９２の形質転換に使用できる組換えファージベクターの作製に用いても構わない。
【００９７】
さらに、有用なプラスミドベクターとして、ｐＩＮ ベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ｅｔ．ａｌ．，１９８５）；およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ：ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）可溶性融合タンパク質の作製に使用し、後に精製および分離されるか、切断されるｐＧＥＸベクターが挙げられる。他の好適な融合タンパク質には、βガラクトシダーゼ、ユビキチンおよび同種のものとの融合タンパク質がある。
【００９８】
好適な培地は多くあり、ＬＢのような任意の好適な培地を用いて、発現ベクターを含む細菌の宿主細胞、たとえば、大腸菌を増殖させる。ある種のベクターを用いて組換えタンパク質の発現を誘導するには、当業者には明らかなように、あるプロモーターに特異的な薬と宿主細胞とを接触させて、たとえば、ＩＰＴＧを培地に加えたり、あるいは、インキュベーション温度を高温に切り替えたりする。通常２〜２４時間かけてさらに細菌を培養した後、遠心分離により細胞を集め、洗浄して残った培地を取り除く。
【００９９】
Ｉ．ウイルスベクター
個々のウイルスについては、細胞に感染したり、受容体を介したエンドサイトーシスにより細胞に進入したりする能力、および宿主細胞ゲノムに統合され、安定かつ効率的にウイルス遺伝子を発現する能力があれば、外来核酸を細胞（たとえば、哺乳動物細胞）に導入する魅力的な候補物質となる。本発明のＤＮ ＲＴＥＦ−１成分は、ＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチド（ｐｏｌｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするウイルスベクターであってもよい。本発明の核酸の送達に用いてもよいウイルスベクターの非限定的な例を以下に記載する。
【０１００】
１．アデノウイルスベクター
特定の核酸の送達方法では、アデノウイルス発現ベクターを使用する。アデノウイルスベクターはゲノムＤＮＡに組み込まれる能力が低いことが知られている。しかし、こうした特徴はあるものの、その代わりにこのベクターでは高効率の遺伝子導入が得られる。「アデノウイルス発現ベクター」とは、（ａ）コンストラクトのパッケージングを支持し、（ｂ）その中にクローニングされている、組織または細胞特異的コンストラクトを最終的に発現する、十分なアデノウイルス配列を含有するコンストラクトを含むことを意味する。遺伝子構造またはアデノウイルスが３６ｋｂの直鎖状二本鎖ＤＮＡウイルスであることが分かっており、大きなアデノウイルスＤＮＡ断片を７ｋｂまで外来配列で置換できる（Ｇｒｕｎｈａｕｓ ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２）。
【０１０１】
２．ＡＡＶ（ａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）ベクター
アデノウイルスを使用したトランスフェクションにより、核酸を細胞に導入してもよい。アデノウイルス結合系を用いると、細胞系のトランスフェクション効率が高まることが報告されている（Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ａｎｄ Ｖｏｓ，１９９４；Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ．ａｌ．，１９９２；Ｃｕｒｉｅｌ，１９９４）。本発明のＤＮ ＲＴＥＦ−１発現カセットの送達に使用するベクター系として、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が注目される。その理由として、アデノ随伴ウイルスは組み込まれる頻度が高いうえ、非分裂細胞に感染できるため、たとえば、組織培養（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２）またはインビボで遺伝子を哺乳動物細胞に送達するのに有用である。ＡＡＶは、感染できる宿主域も広い（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ．ａｌ．，１９８４；Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ．ａｌ．，１９８６；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ．ａｌ．，１９８８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ．ａｌ．，１９８８）。ｒＡＡＶベクターの作製および使用に関する詳細は、それぞれ参照によって本明細書に援用する米国特許第５，１３９，９４１号および同第４，７９７，３６８号に記載されている。
【０１０２】
３．レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、遺伝子を宿主ゲノムに組み込み能力、大量の外来遺伝子材料を導入する能力、幅広い種および細胞型に感染する能力ならびに特殊な細胞株にパッケージングされる能力により、治療用のＤＮ ＲＴＥＦ−１送達ベクターとして有望である（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２）。
【０１０３】
ＤＮ ＲＴＥＦ−１レトロウイルスベクターを構築するには、特定のウイルス配列の代わりに（たとえば、ＤＮ ＲＴＥＦ−１をコードする）核酸をウイルスゲノムに挿入して、複製欠損のウイルスを作製する。ビリオンを作製するため、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎ ｅｔ．ａｌ．，１９８３）。ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを、レトロウイルスのＬＴＲおよびパッケージング配列と共に特殊な細胞株に（たとえば、リン酸カルシウム沈殿により）導入すると、パッケージング配列により組換えプラスミドのＲＮＡ転写物がウイルス粒子にパッケージングされ、その後、培養基に分泌される（Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６；Ｍａｎｎ ｅｔ．ａｌ．，１９８３）。次いで、組換えレトロウイルスを含む培地を回収し、任意に濃縮し、遺伝子導入に使用する。レトロウイルスベクターは、多様な細胞型に感染することができる。しかしながら、組み込みおよび安定発現には、宿主細胞の分裂が不可欠である（Ｐａｓｋｉｎｄ ｅｔ．ａｌ．，１９７５）。
【０１０４】
レンチウイルスは、一般的なレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに加えて、制御または構造機能を持つ他の遺伝子を含む複雑なレトロウイルスである。レンチウイルスベクターを用いた血管形成阻害分子の送達方法は、以前に記載されており、たとえば、参照によって本明細書に援用する米国特許第７，１２２，１８１号を参照されたい。レンチウイルスベクターは、当該技術分野において周知である（たとえば、Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ．ａｌ．，１９９６；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ．ａｌ．，１９９７；Ｂｌｏｍｅｒ ｅｔ．ａｌ．，１９９７；米国特許第６，０１３，５１６号および同第５，９９４，１３６号を参照されたい）。レンチウイルスのいくつかの例として、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびサル免疫不全ウイルス：ＳＩＶが挙げられる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ病原性遺伝子を多重弱毒化して作製されており、たとえば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆが欠失しているため、生物学的に安全である。
【０１０５】
組換えレンチウイルスベクターは非分裂細胞への感染が可能で、インビボとエキソビボとで遺伝子導入および核酸配列の発現に用いることができる。たとえば、好適な宿主細胞に、パッケージング機能、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖならびにｒｅｖおよびｔａｔを有する２つ以上のベクターをトランスフェクトする、非分裂細胞への感染が可能な組換えレンチウイルスが、参照によって本明細書に援用する米国特許第５，９９４，１３６号に記載されている。エンベロープタンパク質を、抗体または特定の細胞型の受容体を標的化した特定のリガンドと連結して、組換えウイルスを標的化してもよい。ウイルスベクターは、たとえば、ベクターに目的の配列（制御領域など）を、特異的な標的細胞の受容体リガンドをコードする別の遺伝子と一緒に挿入した時点で、標的特異的となる。
【０１０６】
４．他のウイルスベクター
本発明では、他のウイルスベクターをワクチンコンストラクトとして用いてもよい。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｃｏｕｐａｒ ｅｔ．ａｌ．，１９８８）、シンドビスウイルス、サイトメガロウイルスおよび単純ヘルペスウイルスなどのウイルス由来のベクターを用いても構わない。こうしたベクターは、様々な哺乳動物細胞にとっていくつかの魅力的な特徴を備えている（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｃｏｕｐａｒ ｅｔ．ａｌ．，１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈ ｅｔ．ａｌ．，１９９０）。
【０１０７】
５．改変ウイルスによる送達
送達対象の核酸は、特異的な結合リガンドを発現するように設計してある感染性ウイルスに組み込んでもよい。この場合、このウイルス粒子は、標的細胞の同族の受容体に特異的に結合し、その内容を細胞に送達する。ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾を利用して、レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能にするように設計された新しいアプローチが開発された。この修飾により、シアロ糖タンパク質受容体を介した肝実質細胞の特異的感染が可能になり得る。
【０１０８】
レトロウイルスのエンベロープタンパク質および特異的細胞受容体に対するビオチン化抗体を用いた、組換えレトロウイルスを標的化する別のアプローチも設計された。この抗体を、ビオチン成分を介してストレプトアビジンに結合させた（Ｒｏｕｘ ｅｔ．ａｌ．，１９８９）。主要組織適合性複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を用いて、この表面抗原を持った様々なヒト細胞がインビトロでエコトロピックウイルスに感染することが明らかになった（Ｒｏｕｘ ｅｔ．ａｌ．，１９８９）。
【０１０９】
Ｊ．ベクターによる送達および細胞の形質転換
本発明に使用されるオルガネラ、細胞、組織または生体を形質転換するために核酸を送達する好適な方法は実質的に、核酸（たとえば、ＤＮＡ）をオルガネラ、細胞、組織または生体に導入できるのであれば、本明細書に記載の、あるいは当業者に知られているどのような方法でもよいと考えられる。こうした方法として、エキソビボでのトランスフェクション（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，１９８９，Ｎａｂｅｌら、１９８９）、マイクロインジェクション（Ｈａｒｌａｎｄ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５；参照によって本明細書に援用する米国特許第５，７８９，２１５号）などの注射（それぞれ参照によって本明細書に援用する米国特許第５，９９４，６２４号、同第５，９８１，２７４号、同第５，９４５，１００号、同第５，７８０，４４８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，７０２，９３２号、同第５，６５６，６１０号、同第５，５８９，４６６号および同第５，５８０，８５９号）などによるＤＮＡの直接送達；エレクトロポレーション（参照によって本明細書に援用する米国特許第５，３８４，２５３号；Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ ｅｔ．ａｌ．，１９８６；Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ．ａｌ．，１９８４）；リン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ，１９７３；Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，１９８７；Ｒｉｐｐｅ ｅｔ．ａｌ．，１９９０）；ＤＥＡＥデキストランに続くポリエチレングリコールの使用（Ｇｏｐａｌ．，１９８５）；直接音波負荷（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ ｅｔ．ａｌ．，１９８７）；リポソームによるトランスフェクション（Ｎｉｃｏｌａｕ ａｎｄ Ｓｅｎｅ，１９８２；Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ．ａｌ．，１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕ ｅｔ．ａｌ．，１９８７；Ｗｏｎｇ ｅｔ．ａｌ．，１９８０；Ｋａｎｅｄａ ｅｔ．ａｌ．，１９８９；Ｋａｔｏ ｅｔ．ａｌ．，１９９１）および受容体を介したトランスフェクション（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８７；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８８）；微粒子銃（それぞれ参照によって本明細書に援用する国際公開第９４／０９６９９号および同第９５／０６１２８号；米国特許第５，６１０，０４２号；同第５，３２２，７８３号 同第５，５６３，０５５号、同第５，５５０，３１８号、同第５，５３８，８７７号および同第５，５３８，８８０号）；炭化ケイ素繊維による撹拌（Ｋａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ．ａｌ．，１９９０；それぞれ参照によって本明細書に援用する米国特許第５，３０２，５２３号および同第５，４６４，７６５号）；アグロバクテリウムによる形質転換（それぞれ参照によって本明細書に援用する米国特許第５，５９１，６１６号および同第５，５６３，０５５号）；ＰＥＧによるプロトプラストの形質転換（Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈ ｅｔ．ａｌ．，１９９３；それぞれ参照によって本明細書に援用する米国特許第４，６８４，６１１号および同第４，９５２，５００号）；乾燥／阻害によるＤＮＡの取り込み（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ｅｔ．ａｌ．，１９８５）およびこうした方法の任意の組み合わせがあるが、これに限定されるものではない。こうした技法を用いて、オルガネラ（単数または複数）、細胞（単数または複数）、組織（単数または複数）または生体（単数または複数）を安定に形質転換しても、一過性に形質転換してもよい。
【０１１０】
Ｖ．治療方法
Ａ．医薬調製物
本発明の方法に使用する治療用組成物については、薬理学的に許容される形に製剤化してもよい。「薬学的または薬理学的に許容される」という語句は、必要に応じてヒトなどの動物に投与したとき、有害反応、アレルギー反応または他の有害な反応を引き起こさない分子的実体および組成物をいう。少なくとも１種のＤＮ ＲＴＥＦ−１ポリペプチドまたは核酸活性成分を含む医薬組成物の調製については、参照によって本明細書に援用するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０に例示されているように、本開示によって当業者に知られることになる。さらに、動物（ヒトなど）への投与では、調節物は、ＦＤＡの生物学的基準（ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）が求めるような無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度基準に適合する必要があることは言うまでもない。
【０１１１】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容されるキャリア」には、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（たとえば、抗菌薬、抗真菌薬）、等張剤、吸収遅延剤、塩類、防腐剤、薬剤、薬剤安定剤、ゲル、バインダー、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、着香剤、色素、当業者に知られているような同様の材料およびそれらの組み合わせが含まれる（たとえば、参照によって本明細書に援用するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，１９９０を参照されたい）。薬学的に許容されるキャリアは、好ましくはヒトへの投与用に製剤化されている。一方、ある実施形態では、イヌなどの非ヒト動物への投与用に製剤化されているが、（たとえば、政府規制により）ヒトへの投与が認められない薬学的に許容されるキャリアの使用が望ましい場合がある。キャリアが活性成分と不適合でない限り、従来のどのようなキャリアも治療用組成物または医薬組成物での使用を意図している。
【０１１２】
被検体に投与される本発明の組成物の実際の投薬量については、患者の体重、状態の重症度、処置対象の病型、過去または現在の治療介入、特発性および投与経路など、身体的および生理的要因から判定することができる。いずれにしろ、投与に責任を負う開業医が、組成物中の活性成分（単数または複数）の濃度および個々の被検体に対する適切な用量（単数または複数）を判定することになる。
【０１１３】
ある実施形態では、医薬組成物は、たとえば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含んでもよい。他の実施形態では、活性化合物は、１単位の重量の約２％〜約７５％または約２５％〜約６０％、さらに、たとえば、そこから導き出せる任意の範囲を含んでもよい。他の非限定的な例では、用量はまた、１回の投与につき約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重またはそれ以上、さらにそこから導き出せる任意の範囲を含んでもよい。本明細書に記載した数字から導き出せる範囲の非限定的な例では、上述の数字に基づき、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲を投与することができる。
【０１１４】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、哺乳動物の眼への使用に好適である。たとえば、この製剤は、溶液、懸濁液またはゲルであってもよい。いくつかの実施形態では、この組成物を、硝子体内埋め込み製剤のような生分解性埋め込み製剤または結膜表面に添加するように設計された眼内挿入物などの眼内挿入物により投与する。いくつかの実施形態では、治療薬は、医療装置または埋め込み型装置をコーティングしている。
【０１１５】
好ましい態様では、滴剤形態の水溶液を用いて本発明の製剤を眼に使用する。こうした滴剤については、単回投与アンプルから送達してもよい。単回投与アンプルは、好ましくは無菌であり、したがって、製剤には静菌成分が不要な場合がある。あるいは、好ましくは送達の際に製剤から防腐剤を抽出する装置を含んでいてもよい反復投与ビンから、滴剤を送達しても構わない。そうした装置は、当該技術分野において公知である。
【０１１６】
他の態様では、目蓋の下に添加する溶解可能な挿入物になっている濃縮ゲルまたは類似のビヒクルとして本発明の成分を眼に送達してもよい。
【０１１７】
さらに、本発明の治療用組成物は、液体溶液あるいは懸濁液として注射用組成物の形で投与してもよい；注射前の液体中の溶液または懸濁液に好適な固形を調製してもよい。こうした調製物は、さらに乳化しても構わない。こうした目的のための典型的な組成物は、薬学的に許容されるキャリアを含む。たとえば、この組成物は、リン酸塩緩衝生理食塩水１ミリリットル当たりヒト血清アルブミンを１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇまたは最大約１００ｍｇ含んでもよい。他の薬学的に許容されるキャリアとしては、水溶液、塩類、防腐剤、緩衝液および同種のものなどの無毒性の賦形剤が挙げられる。
【０１１８】
非水性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油およびエチルオレアートなどの注射用有機エステルがある。水性キャリアには、水、アルコール／水溶液、食塩水溶液、塩化ナトリウム、リンゲルデキストロースなどの非経口ビヒクルがある。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補液がある。防腐剤としては、抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤および不活性ガスが挙げられる。様々な成分医薬組成物のｐＨおよび厳密な濃度は、周知のパラメーターによって調整する。
【０１１９】
さらなる製剤は、経口投与に好適である。経口製剤は、たとえば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムおよび同種のものなどの典型的な賦形剤を含む。この組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤または散剤の形態をとる。経路が局部の場合、形態は、クリームでも、軟膏剤でも、軟膏でも、噴霧剤でもよい。
【０１２０】
治療用組成物の有効量については、初期の目的に基づき判定する。「単位用量」または「投薬量」という語は、被検体に使用するのに好適な物理的に分離した単位をいい、各単位は、その投与、言い換えれば、適切な経路および処置レジメンに伴い、上記で論じた所望の応答が得られるように計算された所定量の治療用組成物を含む。処置剤の数と単位用量とに従って投与される量は、所望の保護作用によって異なる。したがって、場合によっては、たとえば、被検体の血清中インスリンまたはグルコースのレベルの変化を測定して投薬量を決定してもよい。
【０１２１】
また、治療用組成物の正確な量は開業医の判断によっても左右される場合があり、１人１人異なる。用量に影響する要因として、患者の身体的および臨床的状態、投与経路、処置の初期の目的（特定の血清中インスリンまたはグルコース濃度の達成と症状の軽減との対比など）ならびに個々の治療物質の効力、安定性および毒性が挙げられる。
【０１２２】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、哺乳動物の眼に使用するのに好適である。たとえば、この製剤は、溶液でも、懸濁液でも、ゲルでもよい。いくつかの実施形態では、この組成物を、硝子体内埋め込み製剤のような生分解性埋め込み製剤または結膜表面に添加するように設計された眼内挿入物などの眼内挿入物により投与する。いくつかの実施形態では、治療薬は、医療装置または埋め込み型装置をコーティングしている。
【０１２３】
好ましい態様では、滴剤形態の水溶液を用いて本発明の製剤を眼に使用する。こうした滴剤については、単回投与アンプルから送達してもよい。単回投与アンプルは、好ましくは無菌であり、したがって、製剤には静菌成分が不要な場合がある。あるいは、好ましくは送達の際に製剤から防腐剤を抽出する装置を含んでいてもよい反復投与ビンから、滴剤を送達しても構わない。そうした装置は、当該技術分野において公知である。
【０１２４】
他の態様では、目蓋の下に添加する溶解可能な挿入物になっている濃縮ゲルまたは類似のビヒクルとして本発明の成分を眼に送達してもよい。
【０１２５】
Ｂ．追加の療法
上記のように、ある態様では、他の血管形成阻害療法または抗癌療法と組み合わせて、あるいはそれと併用して本発明の治療方法を用いてもよい。
【０１２６】
１．化学療法
本発明のある実施形態では、化学療法剤と併用してＤＮ ＲＴＥＦ−１を投与する。本発明による方法には、たとえば、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロースウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、パクリタキセル、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファルネシル−タンパク質タンスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ベルケイド、ビンブラスチンおよびメトトレキサートまたは前記の任意のアナログまたは誘導変異体を用いてもよい。
【０１２７】
２．放射線治療
本発明のある種のさらなる実施形態では、ＤＮ ＲＴＥＦ−１組成物を用いて放射線療法に対する細胞の感受性を高める。放射線治療として、たとえば、γ線、Ｘ線および／または腫瘍細胞への放射性同位元素の直接送達が挙げられる。本発明の方法によれば、場合によっては、マイクロ波および／またはＵＶ照射を用いても構わない。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３〜４週間）の場合、１日５０〜２００レントゲン、単回照射では２０００〜６５１０レントゲンである。放射性同位元素の投与量は種々様々であり、同位元素の半減期、放射される放射線の強度およびタイプならびに新生細胞による取り込みによって異なる。
【０１２８】
「接触させる」および「曝露する」という語は、本明細書で細胞に用いる場合、治療用コンストラクトと化学療法剤または放射線治療剤とを標的細胞に送達したり、標的細胞の近位に直接導入したりするプロセスをいう。細胞の殺傷または増殖停止を実現するには、細胞を殺傷する、あるいは細胞分裂を阻止するのに効果的な量を組み合わせて、２つの薬を細胞に送達する。
【０１２９】
３．免疫療法
免疫療法は通常、癌細胞を標的として破壊する免疫エフェクター細胞および分子の力を借りる。免疫エフェクターは、たとえば、腫瘍細胞の表面上の何らかのマーカーに対して特異的な抗体であってもよい。抗体は単独で治療のエフェクターとしての役割を果たしてもよいし、実際に細胞の殺傷を行う他の細胞をリクルートしてもよい。また、抗体については、薬剤またはトキシン（化学療法薬、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）にコンジュゲートし、単に標的化剤の機能を果たすだけでもよい。あるいは、エフェクターは、直接的あるいは間接的に腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を含むリンパ球であってもよい。細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞など、様々なエフェクター細胞がある。
【０１３０】
したがって、免疫療法を遺伝子治療と併用して併用療法の一部として用いてもよい。併用療法の一般的なアプローチを以下で考察する。通常、腫瘍細胞は、標的化に適した、すなわち、他の大部分の細胞には存在しない何らかのマーカーを持っているはずである。多くの腫瘍マーカーが存在しており、本発明においては、そのどれも標的化に好適である。一般的な腫瘍マーカーとして、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂ Ｂ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ｇｐ２４０およびｐ１５５が挙げられる。
【０１３１】
４．遺伝子
なお別の実施形態では、本発明の細胞標的化コンストラクトの前、後または同時に治療用ポリヌクレオチドを投与する遺伝子治療。ＤＮ ＲＴＥＦ−１を、１つまたは複数の他の遺伝子産物をコードするベクターと併用して送達すれば、標的組織に対する過剰増殖抑制作用が総合される場合がある。本発明には種々の遺伝子が包含され、たとえば、ＤＮ ＲＴＥＦ−１組成物と併用してｐ５３をコードする遺伝子を送達してもよい。
【０１３２】
５．手術
癌患者の約６０％が、予防的手術、診断的手術または病期分類的手術、治療的手術および対症的手術など、ある種の手術を受ける。治療的手術とは癌の処置であり、本発明の処置、化学療法、放射線治療、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法および／または代替療法など、他の療法と併用して行ってもよい。本発明のＤＮ ＲＴＥＦ−１療法剤（ｔｈｅｒａｐｙ）は、単独で用いても、切除前に腫瘍の大きさを縮小させるようなネオアジュバント療法として細傷害性療法と組み合わせて用いてもよいし、あるいは、腫瘍の一部または全部の摘出後に手術台を滅菌するなど、術後アジュバント療法として用いてもよい。
【０１３３】
治療的手術は、癌性組織の全部または一部を物理的に除去、切除および／または破壊する切除を含む。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することをいう。手術による処置には、腫瘍切除以外にも、レーザー手術、冷凍手術、電気手術および顕微手術（Ｍｏｈｓ手術）がある。さらに、本発明を、表在性癌、前癌または周辺の正常組織の除去と併用して用いてもよいことも意図している。
【０１３４】
癌性の細胞、組織または腫瘍全体の一部を切除する際、体内に空洞が形成されることある。この領域については、追加の抗癌療法剤（ｔｈｅｒａｐｙ）を用いて、灌流、直接注射または局所投与により処置を行ってもよい。こうした処置を、たとえば、１、２、３、４、５、６または７日間ごとに、あるいは１、２、３、４および５週間ごとに、あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヶ月間ごとに繰り返してもよい。この処置剤の投薬量も様々であって構わない。
【０１３５】
６．他の薬
さらに、本発明と併用して、あるいは前述した任意の他の癌療法と組み合わせて、ホルモン療法を用いてもよい。乳癌、前立腺癌、卵巣癌または子宮頸癌など、ある種の癌の処置にホルモンを用いれば、テストステロンまたはエストロゲンなどの一定のホルモンのレベルを低下させたり、その作用を遮断させたりできる。この処置は、処置の選択肢として、または転移のリスクを低下させるため、少なくとも１つの他の癌療法と組み合わせて用いられることが多い。
【実施例】
【０１３６】
以下に、本発明の種々の態様をさらに説明するため、実施例を記載する。以下の実施例に開示される技法は、本発明の実施に際してよく機能する、本発明者が発見した技法および／または組成物であり、したがって、本発明の実施に好ましい方法を構成すると考えられるものと当業者は理解すべきである。しかしながら、本開示に照らして、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、開示した個々の実施形態において多くの変更が可能であり、やはり類似または同様の結果が得られることも当業者は理解すべきである。
【０１３７】
（実施例１）
実験方法
初代眼血管内皮細胞の単離および培養
ヒト細胞および組織の使用についてはすべて、承認された施設内審査委員会のプロトコルに準じて行われた。確立したプロトコルを用いて、ヒト網膜から単離した内皮細胞の初代培養を樹立し、ｍＲＮＡの供給源として使用した（Ｋａｎｄａら、１９９８；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２００５）。死後２４時間以内の匿名のドナー（Ｌｉｏｎ’ｓ Ｅｙｅ Ｂａｎｋ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）からヒト死体眼を得た。ドナーは、循環器疾患または眼疾患の既往がなく、年齢は１６〜４２歳であった。簡単に説明すると、こうした網膜および虹彩組織を無菌的に切開し、ドナーの眼から分離し、０．２％コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ，，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で消化し、マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ３１抗体でコートした磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）を用いて、内皮細胞（ＥＣ：ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）を他の細胞型から単離した。ＥＣを、１０％ウシ胎仔血清および抗生物質を補充した完全ＭＣＤＢ−１３１培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ／ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で培養した。２〜５回継代細胞を使用した。磁性ビーズによる分離を２回実施後、ＥＣ培養を形態学的基準、ＣＤ３１およびｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の発現ならびにアセチル化低密度リポタンパク質の取り込みで評価したところ、９９．５％以上純粋であった（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２００５）。
【０１３８】
低酸素の誘導。
【０１３９】
直径６０ｍｍの培養皿で網膜および虹彩内皮細胞を８０％コンフルエンスまで培養し、次いで気密なモジュレーターインキュベーターチャンバー（Ｂｉｌｌｕｐｓ−Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，Ｄｅｌ Ｍａｒ，ＣＡ）に導入した。チャンバーに、１％Ｏ２、５％ＣＯ２および残りがＮ２の混合ガスを正確に５分間流し、次いでチャンバーをシールし、３７℃の加湿インキュベーターに入れた。８時間後、チャンバーに再び低酸素混合ガスを５分間流し、シールし、８時間さらにインキュベートしてから、もう一度流し、さらに８時間インキュベートした時点で、全ＲＮＡを単離した。
【０１４０】
全ＲＮＡの抽出およびＲＴ−ＰＣＲ
製造者のプロトコルに従い、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓキット（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いて全ＲＮＡを単離し、このＲＮＡ５０ｎｇを用いてオリゴｄＴプライマーで第一鎖を合成した（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。第二鎖ＰＣＲ増幅には、標準的な条件を用いて、公開されたＲＴＥＦ−１配列（ＮＣＢＩ受託＃ Ｕ６３８２４）から設計した以下のプライマー、Ｆ１：５’−ｔｔｇｇａｇｇｇｃａｃｇｇｃｃｇｇｃａ−３’（配列番号２０）およびＲ１：５’−ｔｃａｔｔｃｔｔｔｃａｃｃａｇｃｃｔｇｔａ−３’（配列番号２１）を使用した。増幅産物を電気泳動にかけ、１．５％アガロースゲルで可視化し、続いてゲルから精製し（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、Ａｂｉ３１０自動シーケンサーを用いて標準的なジデオキシヌクレオチドシーケンシングを行った。
【０１４１】
レポーター遺伝子解析
全長ＲＴＥＦ−１アイソフォームを、ｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に定方向にクローニングした。予想されるＴＴＧ開始コドンをフォワードプライマー配列内のＡＴＧに変換した。５４ｂｐの５’ＵＴＲおよび転写開始部位の上流１，０８２ｂｐを含む１，１３６ｂｐのヒトＶＥＧＦ５’近位プロモーターフラグメントを、ｐＳＥＡＰレポータープラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）内の分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ：ｓｅｃｒｅｔａｂｌｅ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）遺伝子に５’側からクローニングした。欠失を持つプロモーターフラグメントを、最初にプロモーターの５’末端およびプロモーターの３’末端を増幅し、続いてこの増幅産物をライゲートして構築した。次いで、目的の領域を欠失したライゲートした産物を増幅し、プロモーターを持たないｐＳＥＡＰベクターに定方向にクローニングした。トランスフェクション試験の前に検証のため、すべてのコンストラクトについて両鎖の配列決定を行った。
【０１４２】
トランスフェクションアッセイ。
【０１４３】
Ａｍａｘａヌクレオフェクション装置（Ａｍａｘａ Ｉｎｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、Ａｍａｘａ試薬および標準的な製造者のプロトコルを用いて、トランスフェクションを行った。簡単に説明すると、２９３Ｔ細胞を、１０％ＤＭＥＭ培地で８０％コンフルエントまで培養し、トリプシン処理して回収した。ヌクレオフェクションごとに１００万個の細胞を用いた。１００万個の細胞を１００ｕｌのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔ溶液および全プラスミドＤＮＡ５μｌ（２μｇを含む）に再懸濁し、エレクトロポレーションを行い（ヌクレオフェクション装置ｐｒｏｇｒａｍ ＃Ａ０２３）、その後すぐに予め温めておいた１ｍｌの培地に再懸濁し、６ウェルプレートの単一ウェルに播種した。細胞を１６〜１８時間回復させ、培地を慎重に除去し、ちょうど５００ｍｌの新鮮な培地と交換した。正確にインキュベーションから６時間後、１５０μｌの培地を慎重に取り除き、その２５μｌを直ちにアッセイするか、あるいはその後のＳＥＡＰ解析に備えて−２０℃で保存した。２５μｌの培地アリコート３個を用いて、製造者のプロトコル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に従い、ＳＥＡＰ解析を行い、３つの数値すべてのＳＥＡＰ値を平均して三重反復実験を比較した。
【０１４４】
１回の実験でコトランスフェクションをそれぞれ少なくとも３回繰り返し、別のプラスミド調製物（ｎ＝９〜１２）で各実験を再び独立にさらに２回繰り返した。代表的な実験を図に示す。統計解析はスチューデントのｔ検定（両側）を用いて行い、１回の実験で３または４サンプルを比較した。多重比較はボンフェローニ補正を用い、Ｐ＜０．０１の場合に有意と判定した。
【０１４５】
コトランスフェクションアッセイ（２つのプラスミドを同じチューブで一緒にトランスフェクトした）ごとに、各プラスミドのコピー数を、使用した最大のプラスミドのコピー数と同等になるように調整した。プロモーターを持たないｐＳＥＡＰベクター、およびインサートのないｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミドを陰性対照とした。ヌクレオフェクション実験ごとに、２つの陽性対照プラスミド、ＳＶ４０プロモーターｐＳＥＡＰプラスミドおよびｐＧＦＰｍａｘベクターを同時にトランスフェクトして、効率的かつ同等のトランスフェクション効率を確保した。ＳＶ４０プロモーターを持つｐＳＥＡＰプラスミドをその後のＳＥＡＰタンパク質解析の陽性対照とした。また、ｐＧＦＰｍａｘベクターも、各バッチの細胞のトランスフェクションの陽性対照とし、一貫したトランスフェクション効率を目視により確認できるようにした。２９３Ｔ細胞を用いたすべての実験では、ヌクレオフェクションによるトランスフェクション効率が一貫して８０〜９０％であった。
【０１４６】
（実施例２）
低酸素および正常眼血管内皮細胞内に存在するＲＴＥＦ−１の新規なアイソフォーム
Ｆ１およびＲ１プライマー対を用いて、初代のヒト網膜血管内皮細胞（ＰＲＶＥＣ：ｐｒｉｍａｒｙ ｒｅｔｉｎａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）および虹彩血管内皮細胞（ＰＩＶＥＣ：ｐｒｉｍａｒｙ ｉｒｉｓ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）の培養から調製したｃＤＮＡの増幅を行ったところ、約１３０５ｂｐおよび９３６ｂｐの産物が得られた（図１Ｂ）。同じプライマー対を用いて、ｍＲＮＡを単離する前に２４時間かけて低酸素状態下で培養しておいたＰＲＶＥＣから単離したｃＤＮＡの増幅を行ったところ、さらに約４４７ｂｐの産物が得られた（図１Ｂ）。６５１ｂｐのｃＤＮＡを、ヒト初代網膜血管内皮細胞（ＰＲＶＥＣ）から単離した。
【０１４７】
シーケンシング解析により、最も大きな産物は、開始コドンから終止コドンまで１３０５ｂｐの全長ＲＴＥＦ−１遺伝子（配列番号１）と同一であり、一方、９３６ｂｐ、６５１ｂｐおよび４４７ｂｐの転写物は、１３０５ｂｐの産物の選択的にスプライシングされた転写物であることが確認された。コドンに関する以下の記載は、４３５コドンからなる１３０５ｂｐの転写物の配列に従って番号を付けてある。このタンパク質の開始コドンは１、終止コドンは４３５である。１３０５ｂｐの転写物のタンパク質部分をコードすると予想される１１個のエクソンのうちの４個、エクソン５〜８は、９３６ｂｐ体からスプライシングされる（図１Ａ）。４４７ｂｐアイソフォームではエクソン５が欠落しているばかりでなく、珍しくエクソン７の中央においてインフレームでスプライシング現象が起き、エクソン７のＧｌｎ−８３からエクソン１２内のコドンＧｌｎ−４２５がスプライシングされる（図１Ａ）。６５１ｂｐのアイソフォームの場合、エクソン３の５’部分がエクソン１０内のスプライス受容部位に直接スプライスされ、それにより転写物からエクソン４、５、６、７、８および９が完全に取り除かれる。
【０１４８】
１３０５ｂｐの産物は、ヒトの心臓、骨格筋、膵臓および肺組織で最初に同定された転写エンハンサー因子−１関連（ＲＴＥＦ−１）遺伝子との同一性を示す（Ｓｔｅｗａｒｔら、１９９６）。他の２つのＲＴＥＦアイソフォーム、エクソン５がＡｓｐ−１１９からＧｌｙ−１６１まで欠落している変異体２（受託＃ＮＭ＿２０１４４１）およびＭｅｔ−１３０で下流のタンパク質開始部位を用いる変異体３（受託＃ＮＭ＿２０１４４３）は、以前に報告されている。ヒト眼血管細胞内で同定された９３６ｂｐ、６５１ｂｐおよび４４７ｂｐのアイソフォームは、これまで他のヒト組織からはまったく同定されていない。
【０１４９】
全長１３０５ｂｐの転写物は、４３４アミノ酸を含むポリペプチドをコードし、予想される分子量は約４８．６ｋＤａである。このポリペプチドは、５０個の強塩基性アミノ酸（Ｋ、Ｒ）、４７個の強酸性アミノ酸（Ｄ、Ｅ）、１３３個の疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｖ）および１２４個の極性アミノ酸（Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）を含む。予想される等電点は８．２４８であり、予想される電荷はｐＨ７．０で４．７９９である。同定されたＲＴＥＦ−１アイソフォームはそれぞれ非標準的なＴＴＧ（ＵＵＧ）開始コドンを用いるため、アミノ末端はリジン残基であると思われる。
【０１５０】
９３６ｂｐの転写物は、３１１アミノ酸を含むポリペプチドをコードし、予想される分子量は約３５．６ｋＤａである。このポリペプチドは、４０個の強塩基性アミノ酸（Ｋ、Ｒ）、３８個の強酸性アミノ酸（Ｄ、Ｅ）、９３個の疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｖ）および９２個の極性アミノ酸（Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）を含む。予想される等電点は８．０３７であり、予想される電荷はｐＨ７．０で３．４５８である。
【０１５１】
６５１ｂｐの転写物は、２１６アミノ酸を含むポリペプチドをコードし、予想される分子量は約２４．４ｋＤａである。このポリペプチドは、２２個の強塩基性アミノ酸（Ｋ、Ｒ）、２７個の強酸性アミノ酸（Ｄ、Ｅ）、６０個の疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｖ）および７１個の極性アミノ酸（Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）を含む。予想される等電点は６．０３９であり、予想される電荷はｐＨ７．０で約−４．０４６である。この６５１ｂｐのアイソフォームは、Ｔｈｒ−９２後のエクソン３内からインフレームでエクソン１０の中央のＳｅｒ−３１１までスプライシングされる（番号はすべて、最も大きいＲＴＥＦ−１アイソフォーム（配列番号１）に基づく）。したがって、６５１ｂｐのアイソフォームは、エクソン２の全部、エクソン３の大部分（エクソン３の２２アミノ酸のうち５アミノ酸が欠損）、エクソン１０の大部分（エクソン１０の最初の１１アミノ酸が欠損）および完全なエクソン１１および１２を含む。この結果、ＴＥＡ結合ドメインの大部分は保持されるものの、通常７２アミノ酸ＴＥＡドメイン内に含まれる、予想される３個のαへリックスの１個および推定核移行シグナル（Ｌｅｕ−１０５からＬｙｓ−１０９）が欠損している。６５１ｂｐのアイソフォームではさらに、プロリンリッチドメイン（ＰＲＤ：ｐｒｏｌｉｎｅ ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ）活性化ドメインおよび最初のＳＴＹドメイン（Ｓｅｒ−２５３からＳｅｒ−２７１）も欠損している。興味深いことに、このエクソン１０のスプライシング現象は、このエクソン内のＳｅｒ−１１（すなわち、エクソン１０の１１番目のアミノ酸）から開始され、ちょうどそこから２番目のＳＴＹドメイン（Ｓｅｒ−２５３からＳｅｒ−３３６）が始まる。このスプライシング現象により、推定核移行シグナルが欠損した部分的ＴＥＡドメインが直接ＳＴＹドメインと融合される。
【０１５２】
４４７ｂｐの転写物は１４８アミノ酸を含むポリペプチドをコードし、予想される分子量は約１６．５ｋＤａである。このポリペプチドは、２２個の強塩基性アミノ酸（Ｋ、Ｒ）、１７個の強酸性アミノ酸（Ｄ、Ｅ）、４３個の疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｖ）および４０個の極性アミノ酸（Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）を含む。予想される等電点は９．４４４であり、予想される電荷はｐＨ７．０で５．５６１である。
【０１５３】
９３６ｂｐおよび４４７ｂｐのアイソフォームの予想されるタンパク質配列は共に、予想される３個のαへリックスおよび推定核移行シグナル（Ｌｅｕ−１０５からＬｙｓ−１０９）を含有する７２アミノ酸ＴＥＡドメイン（Ａｓｐ−３８からＬｙｓ−１０９）を含む。しかしながら、Ｃ末端ドメインでは、エクソン７の最後の６アミノ酸からエクソン８の最初の１９残基にまたがるプロリンリッチドメイン（Ｐｒｏ−１８９からＰｒｏ−２１３）が４４７ｂｐのアイソフォームから欠損している（図１Ａ）。さらに、４４７ｂｐのアイソフォームは、１個はエクソン９内に位置し、もう１個がエクソン１０内にある２個のＳＴＹドメイン（Ｓｅｒ−２５３からＳｅｒ−２７１およびＳｅｒ−３１１からＳｅｒ−３３６）も欠損している（図１Ａ）。このＳＴＹドメインはセリン、トレオニンおよびチロシンなどのヒドロキシル基を持つ残基に富んだ領域である。
【０１５４】
（実施例３）
ＶＥＧＦプロモーターからの発現に対する新規なＲＴＥＦ−１アイソフォームの作用
１３０５ｂｐのアイソフォームに由来するポリペプチドは、ウシ大動脈内皮細胞において、Ｓｐ１部位への結合を介してＶＥＧＦの転写の刺激因子として働くことが明らかになっている（Ｓｈｉｅら、２００４）。このため、新しいアイソフォームもヒトＶＥＧＦプロモーターからの発現を刺激できるかどうかを調べる研究を行った。５４ｂｐの５’ＵＴＲおよび転写開始部位の上流１，０８２ｂｐからなる、ヒトＶＥＧＦ遺伝子の５’近位プロモーターをｐＳＥＡＰレポータープラスミドにクローニングし、ＲＴＥＦ−１アイソフォームをｐｃＤＮＡ発現ベクターにクローニングした。眼血管内皮細胞の初代培養へのプラスミドＤＮＡの核トランスフェクトは難しいため、トランスフェクション研究では代わりの細胞株として２９３Ｔ細胞を用いた。ＶＥＧＦプロモーター−レポータープラスミドにＲＴＥＦ−１アイソフォームを１つずつコトランスフェクトしたところ、１３０５ｂｐ、９３６ｂｐおよび４４７ｂｐのアイソフォームは、ＶＥＧＦプロモーターからレポーターの発現を上方制御することが示される（図２のレーン１、２および４）。しかしながら、興味深いことに、６５１ｂｐのアイソフォームは、ＶＥＧＦプロモーターからの発現を下方制御した（図２のレーン３）。全長１３０５ｂｐのＲＴＥＦ−１産物および９３６ｂｐのアイソフォームは、バックグラウンドよりも３〜４倍有意に発現を増強し（Ｐ＝０．００１）、多重検定の補正後に、この２つのアイソフォーム間に差は認められなかった（Ｐ＝０．０１）。４４７ｂｐのアイソフォームは、バックグラウンド発現よりも約１０〜１５倍（平均１２×）発現を刺激した（Ｐ＝０．０００３）。コトランスフェクション実験を３回に分けて３回ずつ繰り返したが、結果は同じであった。
【０１５５】
６５１ｂｐのアイソフォーム（図２のレーン３）は、ＶＥＧＦプロモーターからの発現を対照（図２のレーン５）に対して有意に下方制御した（Ｐ＝０．００２６）。驚いたことに、６５１ｂｐのアイソフォームの改変体である、以下に記載するＳＳ−６５１ｂｐ−ＲＭＲ産物（図２のレーン６）は、対照に対してＶＥＧＦプロモーターからの発現を抑制したばかりでなく（Ｐ＝０．０００９）、６５１ｂｐのアイソフォームよりも発現の阻害作用が一層強力であった（Ｐ＝０．０００８）。６５１ｂｐのアイソフォーム（図２のレーン３）は、対照で認められた発現と比較して約３倍発現を阻害したのに対し、ＳＳ−６５１ｂｐ−ＲＭＲ体（図２のレーン６）は、その時の対照よりも約１０倍発現を阻害した（図２のレーン５に示す）。ＳＳ−６５１ｂｐ−ＲＭＲの効力は、この分子が、産生細胞から分泌されると共に、隣接する細胞に移入する能力があることによる可能性が高い。
【０１５６】
ｓｓ−６５１−ＲＭＲ ｂｐ ＲＴＥＦ−１は、Ｎ末端でヒトＩＬ−２分泌シグナル配列（配列番号２２）に融合し、Ｃ末端で内部移行部分（配列番号２３）に融合したＲＴＥＦ−１の６５１ｂｐのアイソフォームのコード領域を含む。これにより、発現細胞から分泌され得、周囲の細胞への移入が可能な「ｓｓ−６５１−ＲＭＲ」産物が得られた。
【０１５７】
（実施例４）
Ｓｐ１エレメントは、最大ＶＥＧＦプロモーター活性には必要であるが、ＲＴＥＦエンハンサー活性には必須なものではない
従来の研究から、全長ＲＴＥＦ−１アイソフォームはＳｐ１エレメントに結合し、Ｓｐ１エレメントにＶＥＧＦプロモーター活性を増強させることが明らかになった。以前の研究では、このＳｐ１部位の突然変異が−９７〜−８９ｂｐにあると、ＲＴＥＦ−１エンハンサー活性が喪失した（Ｓｈｉｅら、２００４）。同じ研究では、−８６〜−５８ｂｐの同じ領域内の他の３つのＳｐ１部位が、ＲＴＥＦ−１エンハンサー活性に必須ではないことが確認された。新しいＲＴＥＦ−１アイソフォームがエンハンサー活性にＳｐ１部位を必要とするかどうか調べるため、−１１３ｂｐ〜−５８ｂｐの４つのＳｐ１部位をすべて欠失したＶＥＧＦプロモーターをｐＳＥＡＰベクターにクローニングし、各アイソフォームでコトランスフェクトした。全長ＶＥＧＦプロモーターのバックグラウンドレポーター遺伝子の発現とＳｐ１ネガティブＶＥＧＦプロモーターとを比較すると、Ｓｐ１エレメントが欠損する場合、レポーター発現が３０倍と著しく減少する（図３）。このことから、近位プロモーター内の４個のＳｐ１エレメントの少なくとも１個は、全体の発現の増強に必須であると考えられる。Ｓｐ１ネガティブおよび各アイソフォームによるコトランスフェクション実験でも同等レベルの発現の低下が見られた（図３、黒地の棒と白地の棒を比較されたい）。しかしながら、Ｓｐ１ネガティブプロモーターアッセイの各アイソフォームによるコトランスフェクション実験では、やはり同じ増強傾向が認められた（図３）。バックグラウンドに対する１３０５ｂｐ、９３６ｂｐおよび４４７ｂｐのアイソフォームの増強作用はそれぞれ、３倍、４倍および１２倍。したがって、各アイソフォームのバックグラウンドに対する増強レベルは、ＶＥＧＦプロモーター内にＳｐ１エレメントが存在するどうかに関係なく同じである。
【０１５８】
６５１ｂｐのアイソフォームは、ＶＥＧＦプロモーター内のＳｐ１が欠損していても、やはり対照よりも発現を阻害することができる。したがって、各アイソフォームに対するＶＥＧＦプロモーターの制御は同様であり、Ｓｐ１エレメントが存在するか否かに関わらず変わらない。６５１ｂｐのフラグメントは、競合する形でＶＥＧＦプロモーターからの１３０５ｂｐ、９３６ｂｐおよび４４７ｂｐのアイソフォームのエンハンサー作用を阻害することができる。すなわち、通常ＶＥＧＦプロモーターからの発現を上方制御する増強作用のある他のアイソフォームのいずれかと併用して６５１ｂｐを大量に導入すると、一般にそのエンハンサー活性が競合的に阻害される。
【０１５９】
（実施例５）
６５１ｂｐのＲＴＥＦ−１のｃＤＮＡ由来ポリペプチドにおけるドミナントネガティブ転写活性
６５１ｂｐのアイソフォームが他のＲＴＥＦ−１アイソフォームのＶＥＧＦプロモーター増強作用に与える作用を調べるため、２３９Ｔトランスフェクション実験をさらに行った。簡単に説明すると、細胞に、表記のＲＴＥＦ−１エンハンサー発現コンストラクト（すなわち、１３０５ｂｐ、９３６ｂｐまたは４４７ｂｐ）、ＶＥＧＦレポーターベクターおよび６５１ｂｐのＲＴＥＦ−１アイソフォームあるいは空ベクター対照の発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクション後、ＶＥＧＦプロモーター活性を前述のようにレポーター遺伝子アッセイでアクセスした。この研究の結果を図４に示す。いずれの場合も、ＲＴＥＦ−１アイソフォーム（１３０５ｂｐ、９３６ｂｐおよび４４７ｂｐ）のＶＥＧＦプロモーター活性に対する増強活性は、ＲＴＥＦ−１ ６５１ｂｐのアイソフォームの共発現により抑制された。
【０１６０】
（実施例６）
ＲＴＥＦ−１ｃＤＮＡ発現ベクターは、細胞中で予想されたポリペプチドを産生する
細胞中で指定のＲＴＥＦ−１ポリペプチドが発現すること確認するため、２９３Ｔ細胞に、対照（空ベクター）のｐｃＤＮＡ発現ベクターまたは１３０５ｂｐ、９３６ｂｐ、６５１ｂｐまたは４４７ｂｐのｃＤＮＡ配列の発現ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞ライセートを、抗ＲＴＥＦ−１抗血清を用いてウエスタンブロットで解析した。抗ＲＴＥＦ−１抗血清については、全長配列のアミノ酸２〜１４に対応するＲＴＥＦ−１ペプチドに対して作製した。ウエスタンブロット用の抗体を、関連ヒトＴＥＡタンパク質に特有であるが、トランスフェクトされたＲＴＥＦ−１アイソフォームがそれぞれ共有するＲＴＥＦ−１エピトープに誘導した（図５Ａ）。研究の結果（図５Ｂ）から、トランスフェクト細胞では予想されたＲＴＥＦ−１ポリペプチドが発現されたが、６５１ｂｐのｃＤＮＡ由来のポリペプチドの場合、発現レベルが非常に低かったことが明らかになる。
【０１６１】
（実施例７）
眼組織におけるＲＴＥＦ−１のインビボ発現
さらに、正常な霊長類の眼組織を用いてＲＴＥＦ−１アイソフォームの発現を研究した。各タンパク質アイソフォームに結合する抗ＲＴＥＦ−１抗体を用いたウエスタンブロット解析から、ある種の眼の組織でＲＴＥＦ−１が発現することが明らかになった。ＲＴＥＦ−１の発現は脈絡膜で最も高く、網膜で最も低いようであった（図６Ａ）。質量７５ｋＤのマーカーよりも移動が遅かった検出タンパク質産物は、全長ＲＴＥＦ−１（１３０５ｂｐ）アイソフォームであると思われる（図６Ａ、上のパネル）。質量２３ｋＤと２５ｋＤのマーカーの間で移動している産物は、６５１ｂｐのアイソフォームから生じたものと考えられる（図６Ａ、下のパネル）。
【０１６２】
さらなる研究では、ＣＲＡＯモデルを用いてＲＴ−ＰＣＲによりＲＴＥＦ−１アイソフォームの発現を調査した。その結果から、全長（１３０５ｂｐ）ＲＴＥＦ−１ＲＮＡは対照網膜組織に対してＣＲＡＯ網膜で優先的に発現することが明らかにされた（図６Ｂ、レーン１とレーン２を比較されたい）。
【０１６３】
さらに、眼組織におけるＲＴＥＦ−１発現の細胞分布を評価するため、ＲＴＥＦ−１結合抗体を用いて眼組織を免疫組織化学で解析した。その結果から、ＲＴＥＦ−１は虹彩、毛様体、視神経および網膜で発現することが明らかにされた（図７Ａ〜Ｂ）。
【０１６４】
（実施例８）
ＲＴＥＦ−１アイソフォームの局在性
ＲＴＥＦ−１アイソフォーム（１３０５ｂｐ、６５１ｂｐおよび４４７ｂｐ）をそれぞれｐＭＡＸ−ＦＰ−Ｎベクター（Ａｍａｘａ Ｉｎｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）にクローニングし、各アイソフォームのカルボキシル末端にそれぞれ別の蛍光タンパク質を融合した。１３０５ｂｐのアイソフォームは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）と融合したのに対し、６５１ｂｐのアイソフォームは赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ：ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、４４７ｂｐのアイソフォームは黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ：ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）と融合した。さらに、６５１ｂｐのアイソフォームを、ｈＩＬ−２分泌シグナルおよびＲＭＲ輸送モチーフを含むｐＨＲ−ＣＭＶ−ｅＧＦＰベクターにクローニングし、ｓｓ−６５１−ＲＭＲ ＲＴＥＦ−１−ＧＦＰ融合タンパク質を作製した。各コンストラクトをシーケンシング解析で確認した。ヒト２９３Ｔ細胞を、１ウェル当たり３×１０５細胞の密度で６ウェルプレートに蒔いた。細胞を、１０％ＦＢＳおよび１×濃度のペニシリン−ストレプトマイシン−アムホテリシンを補充したＤＭＥＭ培地で８０％コンフルエントまで増殖させた。各コンストラクトを、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｒ ＩＩ器具（Ａｍａｘａ Ｉｎｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いてエレクトロポレーションにより処理した２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。細胞を、５％ＣＯ２、３７℃で２４時間インキュベートした。トランスフェクション反応をすべて蛍光活性用の蛍光顕微鏡で観察し、写真撮影してＲＴＥＦ−１タンパク質アイソフォームの局在パターンを記録した。
【０１６５】
蛍光顕微鏡解析からは、核移行シグナルを含む２つのＶＥＧＦ−エンハンサーＲＴＥＦ−１アイソフォーム（１３０５ｂｐおよび４４７ｂｐ）が細胞の核に局在していたことが確認される。さらに、阻害性アイソフォーム６５１は、細胞質中、核の外側および周囲に集中していることが分かった。しかしながら、ｈｉＬ−２分泌シグナル配列およびＲＭＲ輸送モチーフを含むｓｓ−６５１−ＲＭＲ ＲＴＥＦ−１アイソフォームは細胞核に局在していることが明らかになった。
【０１６６】
ＲＴＥＦ−１アイソフォームの局在パターンを確認するため、ＲＴＥＦ−１アイソフォームをトランスフェクトした細胞を用いて細胞画分ごとにウエスタンイムノブロット分析を行った。この研究では、細胞に２μｇのＲＴＥＦ−１アイソフォームをトランスフェクトし、２４時間増殖させた。次いで、培地を無血清のＤＭＥＭに交換し、さらに４８時間増殖させた。細胞画分を単離し、回収した。培地をＴＣＡで処理して培地中の残留タンパク質を沈殿させた。３つのアイソフォームを識別しないＲＴＥＦ−１特異的抗体を１／５０００の濃度で用いてＲＴＥＦ−１タンパク質の存在を検出した。核画分、細胞質画分および培地を、ｐｃＤＮＡ空ベクター、または１３０５ｂｐ、９３６ｂｐ、６５１ｂｐ、ｓｓ−６５１−ＲＭＲもしくは４４７ｂｐのＲＴＥＦ−１変異体のｐｃＤＮＡ発現ベクターをトランスフェクトした細胞由来のサンプルを用いて解析した。その結果から、ＶＥＧＦエンハンサーアイソフォーム１３０５ｂｐおよび４４７ｂｐが染色体ＤＮＡへの結合を介してＶＥＧＦの発現を増強することが明らかになった。一方、驚くべきことに、６５１ｂｐのＲＴＥＦ−１ネガティブドミナントアイソフォームは細胞質に局在していても、核に局在するエンハンサーＲＴＥＦ−１アイソフォームの作用を競合的に阻害することができる。
【０１６７】
（実施例９）
ＲＴＥＦ−１タンパク質はヒト眼のメラノーマ細胞内に存在する
ＶＥＧＦは、様々な眼の血管新生疾患の発症および眼腫瘍の樹立に関与する重要なタンパク質である。ＶＥＧＦ遺伝子の発現を調節するタンパク質を同定すれば、眼腫瘍の原因および進行の理解に資する。成人に最も好発する眼内癌は眼のメラノーマ（ＯＭ：ｏｃｕｌａｒ ｍｅｌａｎｏｍａ）であり、局部組織の損傷、視力喪失を引き起こす恐れがあり、転位しやすいため、患者の罹患率および死亡率に大きな影響を与える。
【０１６８】
様々なヒトＲＴＥＦ−１アイソフォームは、ＶＥＧＦ５’近位プロモーター領域からの発現を示差的に増強できる。血管形成、炎症および腫瘍進行がＶＥＧＦの上方制御を介して起こるため、本発明者らは、メラノーマなどの血管新生したヒト眼腫瘍、場合によっては眼以外の他の腫瘍の発症および進展にＲＴＥＦ−１が関わっている可能性があると考える。本発明者らは、ヒト眼のメラノーマ細胞内にＲＴＥＦ−１タンパク質が存在するかどうかを免疫組織化学法で調べた。メラノーマ腫瘍を含むヒト眼の切片を、ヒトＲＴＥＦ−１タンパク質を認識する抗体（ただし、３つのアイソフォームを識別しない）で染色した。切片を含むスライドを顕微鏡で調べた。その結果、ヒト眼のメラノーマ細胞内にＲＴＥＦ−１タンパク質（赤色染色として観察）が存在することが明らかになった。このメラノーマ細胞はメラニン色素により褐色をしている。赤色および褐色染色した細胞は、ＲＴＥＦ−１タンパク質を含む腫瘍細胞である。こうした腫瘍細胞に高レベルのＲＴＥＦ−１が認められることから、こうした細胞内でＲＴＥＦ−１がＶＥＧＦ遺伝子を上方制御し、細胞増殖および腫瘍増大を促進する可能性があることが示唆される。
【０１６９】
したがって、こうしたメラノーマ細胞で６５１ｂｐのＲＴＥＦ−１アイソフォームを用いれば、ＶＥＧＦ発現を抑制し、この種の眼腫瘍の増殖を阻害する可能性がある。６５１ｂｐのＲＴＥＦ−１アイソフォームの使用は、ＶＥＧＦ刺激性の腫瘍増大に依存する他の癌の治療にも有益かもしれない。
【０１７０】
本明細書に開示され、特許請求の範囲に記載された組成物および方法はすべて、本開示に照らして過度の実験を行うことなく作製し、実行することができる。好ましい実施形態によって本発明の組成物および方法を記載してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、組成物および方法ならびに本明細書に記載の方法のステップまたはステップの順序に変更を加えてもよいことが当業者には明らかであろう。より詳細には、同一または類似の結果が得られると考えられる場合、本明細書に記載の薬の代わりに化学的および生理学的に関係するある種の薬を用いてもよいことも明らかであろう。こうした当業者に明らかな類似の置換形態および変更形態はすべて、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の精神、範囲および概念内にあると見なす。
【０１７１】
参考文献
以下の参考文献は、例示的な手順の詳細を提供したり、本明細書に記載の例示的な手順の詳細を捕捉する他の詳細を提供したりする範囲で、参照によって個々に本明細書に援用する。
【０１７２】
【化６】
【０１７３】
【化７】
【０１７４】
【化８】
【０１７５】
【化９】
【０１７６】
【化１０】
【０１７７】
【化１１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチドであって、１つまたは複数の内部欠失を含むＲＴＥＦ−１アミノ酸配列を含み、該ポリペプチドはＶＥＧＦプロモーター活性を低下させ、該ＲＴＥＦ−１アミノ酸配列はＲＴＥＦ−１のエクソン２、３、１０、１１および１２によってコードされるアミノ酸、およびＲＴＥＦ−１のエクソン３、４、５、６、７、８、９および１０によってコードされるアミノ酸の欠失を含む、ＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項２】
前記ＲＴＥＦ−１アミノ酸配列はエクソン３によってコードされる少なくとも１６アミノ酸を含む、請求項１に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項３】
前記ＲＴＥＦ−１アミノ酸配列はエクソン１０によってコードされる少なくとも３６アミノ酸を含む、請求項１に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項４】
前記ＲＴＥＦ−１アミノ酸配列は配列番号３と少なくとも約９５パーセント同一である、請求項１に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドは配列番号３に記載の配列を持つ、請求項４に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項６】
分泌シグナル配列をさらに含む、請求項１に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項７】
細胞内部移行部分をさらに含む、請求項１に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項８】
前記内部移行部分はペプチド、ポリペプチド、アプタマーまたはアビマーである、請求項７に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項９】
前記内部移行部分はＨＩＶ ｔａｔ、ＨＳＶ−１外皮タンパク質ＶＰ２２またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａアンテノペディア由来の内部移行配列を含む、請求項８に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項１０】
前記内部移行部分はポリ−アルギニン、ポリ−メチオニンおよび／またはポリ−グリシンペプチドを含む、請求項８に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項１１】
前記内部移行部分はアミノ酸配列ＲＭＲＲＭＲＲＭＲＲ（配列番号２３）を含む、請求項７に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項１２】
前記内部移行部分は抗体である、請求項７に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項１３】
前記抗体内部移行部分は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体またはパラトープペプチドである、請求項１２に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項１４】
細胞分泌シグナルおよび細胞内部移行部分をさらに含む、請求項１に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項１５】
前記分泌シグナル配列はヒトＩＬ−２分泌シグナル配列（配列番号２２）を含む、請求項１４に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号３、配列番号２２および配列番号２３の配列を持つものとしてさらに定義される請求項１５に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載のＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸配列。
【請求項１８】
核酸発現カセットとしてさらに定義される、請求項１７に記載の単離された核酸配列。
【請求項１９】
ウイルス発現ベクターとしてさらに定義される、請求項１８に記載の単離された核酸配列。
【請求項２０】
前記ウイルス発現ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ−４０、レトロウイルスまたはワクシニアウイルスベクターである、請求項１９に記載の単離された核酸配列。
【請求項２１】
前記ウイルス発現ベクターはアデノ随伴ウイルスである、請求項２０に記載の単離された核酸配列。
【請求項２２】
前記ウイルス発現ベクターはレンチウイルス発現ベクターである、請求項２０に記載の単離された核酸配列。
【請求項２３】
前記レンチウイルス発現ベクターはＨＩＶベクターである、請求項２２に記載の単離された核酸配列。
【請求項２４】
前記発現カセットは細胞型特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含む、請求項２３に記載の単離された核酸配列。
【請求項２５】
前記誘導性プロモーターは低酸素誘導性プロモーターである、請求項２４に記載の単離された核酸配列。
【請求項２６】
前記誘導性プロモーターは血管形成誘導性プロモーターである、請求項２４に記載の単離された核酸配列
【請求項２７】
第２の抗血管形成遺伝子をさらに含む、請求項１７に記載の単離された核酸配列。
【請求項２８】
血管形成障害を有する患者を処置するための方法であって、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチドまたは請求項１７〜２７のいずれかに記載のＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸発現ベクターを含有する有効量の治療用組成物を該患者に投与することを含む、方法。
【請求項２９】
前記血管形成障害は眼血管新生、動静脈奇形、冠動脈再狭窄、末梢血管再狭窄、糸球体腎炎または関節リウマチである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記血管形成障害は眼血管新生である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記障害は黄斑変性症、角膜移植片拒絶反応、角膜血管新生、未熟児網膜症（ＲＯＰ）または糖尿病性網膜症である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記障害は加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
第２の抗血管形成治療剤（ｔｈｅｒａｐｙ）を投与することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記第２の抗血管形成治療剤は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ、ＦＧＦ受容体、ベバシズマブ、ラニビズマブまたはペガプタニブナトリウムに結合する抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記血管形成障害は癌である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記癌は転移性癌である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記癌は膀胱癌、血液癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、結腸癌、食道癌、眼癌、胃腸癌、歯肉癌、頭部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、鼻咽頭癌、頸部癌、卵巣癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、舌癌または子宮癌である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記癌は眼のメラノーマである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
第２の抗癌療法を施すことをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記第２の抗癌療法は化学療法、外科的療法、免疫療法または放射線療法である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記患者はヒトである、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
前記治療用組成物は、請求項１〜１７のいずれかに記載のＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチドを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
前記治療用組成物は、請求項１８〜２７のいずれかに記載のＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸発現ベクターを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４４】
前記治療用組成物は全身投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４５】
前記治療用組成物は局所投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４６】
前記治療用組成物は前記眼に投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４７】
前記治療用組成物は前記眼に局部的に、あるいは、眼内注射により投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記治療用組成物は点眼薬として投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項１】
単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチドであって、１つまたは複数の内部欠失を含むＲＴＥＦ−１アミノ酸配列を含み、該ポリペプチドはＶＥＧＦプロモーター活性を低下させ、該ＲＴＥＦ−１アミノ酸配列はＲＴＥＦ−１のエクソン２、３、１０、１１および１２によってコードされるアミノ酸、およびＲＴＥＦ−１のエクソン３、４、５、６、７、８、９および１０によってコードされるアミノ酸の欠失を含む、ＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項２】
前記ＲＴＥＦ−１アミノ酸配列はエクソン３によってコードされる少なくとも１６アミノ酸を含む、請求項１に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項３】
前記ＲＴＥＦ−１アミノ酸配列はエクソン１０によってコードされる少なくとも３６アミノ酸を含む、請求項１に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項４】
前記ＲＴＥＦ−１アミノ酸配列は配列番号３と少なくとも約９５パーセント同一である、請求項１に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドは配列番号３に記載の配列を持つ、請求項４に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項６】
分泌シグナル配列をさらに含む、請求項１に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項７】
細胞内部移行部分をさらに含む、請求項１に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項８】
前記内部移行部分はペプチド、ポリペプチド、アプタマーまたはアビマーである、請求項７に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項９】
前記内部移行部分はＨＩＶ ｔａｔ、ＨＳＶ−１外皮タンパク質ＶＰ２２またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａアンテノペディア由来の内部移行配列を含む、請求項８に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項１０】
前記内部移行部分はポリ−アルギニン、ポリ−メチオニンおよび／またはポリ−グリシンペプチドを含む、請求項８に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項１１】
前記内部移行部分はアミノ酸配列ＲＭＲＲＭＲＲＭＲＲ（配列番号２３）を含む、請求項７に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項１２】
前記内部移行部分は抗体である、請求項７に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項１３】
前記抗体内部移行部分は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体またはパラトープペプチドである、請求項１２に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項１４】
細胞分泌シグナルおよび細胞内部移行部分をさらに含む、請求項１に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項１５】
前記分泌シグナル配列はヒトＩＬ−２分泌シグナル配列（配列番号２２）を含む、請求項１４に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号３、配列番号２２および配列番号２３の配列を持つものとしてさらに定義される請求項１５に記載の単離されたＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載のＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸配列。
【請求項１８】
核酸発現カセットとしてさらに定義される、請求項１７に記載の単離された核酸配列。
【請求項１９】
ウイルス発現ベクターとしてさらに定義される、請求項１８に記載の単離された核酸配列。
【請求項２０】
前記ウイルス発現ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ−４０、レトロウイルスまたはワクシニアウイルスベクターである、請求項１９に記載の単離された核酸配列。
【請求項２１】
前記ウイルス発現ベクターはアデノ随伴ウイルスである、請求項２０に記載の単離された核酸配列。
【請求項２２】
前記ウイルス発現ベクターはレンチウイルス発現ベクターである、請求項２０に記載の単離された核酸配列。
【請求項２３】
前記レンチウイルス発現ベクターはＨＩＶベクターである、請求項２２に記載の単離された核酸配列。
【請求項２４】
前記発現カセットは細胞型特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含む、請求項２３に記載の単離された核酸配列。
【請求項２５】
前記誘導性プロモーターは低酸素誘導性プロモーターである、請求項２４に記載の単離された核酸配列。
【請求項２６】
前記誘導性プロモーターは血管形成誘導性プロモーターである、請求項２４に記載の単離された核酸配列
【請求項２７】
第２の抗血管形成遺伝子をさらに含む、請求項１７に記載の単離された核酸配列。
【請求項２８】
血管形成障害を有する患者を処置するための方法であって、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチドまたは請求項１７〜２７のいずれかに記載のＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸発現ベクターを含有する有効量の治療用組成物を該患者に投与することを含む、方法。
【請求項２９】
前記血管形成障害は眼血管新生、動静脈奇形、冠動脈再狭窄、末梢血管再狭窄、糸球体腎炎または関節リウマチである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記血管形成障害は眼血管新生である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記障害は黄斑変性症、角膜移植片拒絶反応、角膜血管新生、未熟児網膜症（ＲＯＰ）または糖尿病性網膜症である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記障害は加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
第２の抗血管形成治療剤（ｔｈｅｒａｐｙ）を投与することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記第２の抗血管形成治療剤は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ、ＦＧＦ受容体、ベバシズマブ、ラニビズマブまたはペガプタニブナトリウムに結合する抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記血管形成障害は癌である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記癌は転移性癌である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記癌は膀胱癌、血液癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、結腸癌、食道癌、眼癌、胃腸癌、歯肉癌、頭部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、鼻咽頭癌、頸部癌、卵巣癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、舌癌または子宮癌である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記癌は眼のメラノーマである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
第２の抗癌療法を施すことをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記第２の抗癌療法は化学療法、外科的療法、免疫療法または放射線療法である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記患者はヒトである、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
前記治療用組成物は、請求項１〜１７のいずれかに記載のＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチドを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
前記治療用組成物は、請求項１８〜２７のいずれかに記載のＲＴＥＦ−１ドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸発現ベクターを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４４】
前記治療用組成物は全身投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４５】
前記治療用組成物は局所投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４６】
前記治療用組成物は前記眼に投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４７】
前記治療用組成物は前記眼に局部的に、あるいは、眼内注射により投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記治療用組成物は点眼薬として投与される、請求項４７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１０−５２８６６３（Ｐ２０１０−５２８６６３Ａ）
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１１３５４（Ｐ２０１０−５１１３５４）
【出願日】平成２０年６月６日（２００８．６．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６０５８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５４３５１
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５０５０９８９３７）リサーチ ディベロップメント ファウンデーション (16)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月６日（２００８．６．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６０５８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５４３５１
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５０５０９８９３７）リサーチ ディベロップメント ファウンデーション (16)
【Ｆターム（参考）】
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