血管新生抑制用の薬剤学的組成物
【課題】薬剤学的血管新生抑制用の組成物を提供する。
【解決手段】本発明は、下記化学式１の化合物の薬剤学的有効量を含む薬剤学的血管新生抑制用の組成物に関する：
【化１】
本発明の薬剤学的組成物で有効成分として利用される化合物は、ＱＰ−Ｃに結合して血管新生を効果的に抑制し、血管新生−関連疾病または疾患の予防または治療に効果的に利用される。また、本発明の薬剤学的組成物で有効成分として利用される化合物は、ＱＰ−Ｃの生物学的機能を抑制するために、細胞死滅を誘導せずに血管新生反応を抑制し、これは薬物の安全性を大きく改善する。
【解決手段】本発明は、下記化学式１の化合物の薬剤学的有効量を含む薬剤学的血管新生抑制用の組成物に関する：
【化１】
本発明の薬剤学的組成物で有効成分として利用される化合物は、ＱＰ−Ｃに結合して血管新生を効果的に抑制し、血管新生−関連疾病または疾患の予防または治療に効果的に利用される。また、本発明の薬剤学的組成物で有効成分として利用される化合物は、ＱＰ−Ｃの生物学的機能を抑制するために、細胞死滅を誘導せずに血管新生反応を抑制し、これは薬物の安全性を大きく改善する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生抑制用の薬剤学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
固形癌の発展は、血管新生を要求する。ミトコンドリア機能は、血管新生と連結されており、これはミトコンドリアが酸素消費の主な位置であり、血管新生は酸素濃度−敏感性過程であるためである（Ａｎｄｒｅｙｅｖ，Ａ．Ｙ．，Ｋｕｓｈｎａｒｅｖａ，Ｙ．Ｅ．，ａｎｄ Ｓｔａｒｋｏｖ，Ａ．Ａ．（２００５）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ．）７０，２００−２１４；Ｍａｕｌｉｋ，Ｎ．，ａｎｄ Ｄａｓ，Ｄ．Ｋ．（２００２）．Ｒｅｄｏｘ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３３，１０４７−１０６０）。
【０００３】
また、ミトコンドリア酸化還元状態の変化は、低酸素状態（ｈｙｐｏｘｉａ）の間に活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を刺激し、これは親−血管新生タンパク質の転写を活性化させるものと知られている（Ｃｈａｎｄｅｌ，Ｎ．Ｓ．，Ｍａｌｔｅｐｅ，Ｅ．，Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ，Ｅ．，Ｍａｔｈｉｅｕ，Ｃ．Ｅ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｃ．，ａｎｄ Ｓｃｈｕｍａｃｋｅｒ，Ｐ．Ｔ．（１９９８）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｔｒｉｇｇｅｒ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，１１７１５−１１７２０）。
【０００４】
論文によれば、ミトコンドリア複合体IIIでのＲＯＳ生成は、低酸素状態の間にＨＩＦ−１α安定化の触発に必要十分条件であり（Ｂｒｕｎｅｌｌｅ，Ｊ．Ｋ．，Ｂｅｌｌ，Ｅ．Ｌ．，Ｑｕｅｓａｄａ，Ｎ．Ｍ．，Ｖｅｒｃａｕｔｅｒｅｎ，Ｋ．，Ｔｉｒａｎｔｉ，Ｖ．，Ｚｅｖｉａｎｉ，Ｍ．，Ｓｃａｒｐｕｌｌａ，Ｒ．Ｃ．，ａｎｄ Ｃｈａｎｄｅｌ，Ｎ．Ｓ．（２００５）．Ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＲＯＳ ｂｕｔ ｎｏｔ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１，４０９−４１４；Ｃｈａｎｄｅｌ，Ｎ．Ｓ．，ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ，Ｄ．Ｓ．，Ｆｅｌｉｃｉａｎｏ，Ｃ．Ｅ．，Ｗｏｏｄ，Ｔ．Ｍ．，Ｍｅｌｅｎｄｅｚ，Ｊ．Ａ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄＳｃｈｕｍａｃｋｅｒ，Ｐ．Ｔ．（２０００）．Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ａｔ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｃｏｍｐｌｅｘ ＩＩＩ ｓｔａｂｉｌｉｚｅ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−１ ｄｕｒｉｎｇ ｈｙｐｏｘｉａ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，２５１３０−２５１３８；Ｇｕｚｙ，Ｒ．Ｄ．，Ｈｏｙｏｓ，Ｂ．，Ｒｏｂｉｎ，Ｅ．，Ｃｈｅｎ，Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｌ．，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｋ．Ｄ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，Ｕ．，ａｎｄ Ｓｃｈｕｍａｃｋｅｒ，Ｐ．Ｔ．（２００５）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｃｏｍｐｌｅｘ ＩＩＩ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＲＯＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１，４０１−４０８；Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｋ．Ｄ．，Ｇｕｚｙ，Ｒ．Ｄ．，Ｐａｎ，Ｙ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ｍ．，Ｃａｓｈ，Ｔ．Ｐ．，Ｓｃｈｕｍａｃｋｅｒ，Ｐ．Ｔ．，ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｃ．（２００５）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｆｒｏｍ ｌｏｓｓ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｉｍｐａｉｒｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ ｈｙｐｏｘｉｃ ＨＩＦ−ａｌｐｈａ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１，３９３−３９９）、ミトコンドリアＤＮＡ及び電子運搬活性（ρｏ細胞）が欠けた細胞の場合、低酸素状態の間にＲＯＳの増加またはＨＩＦ−１αターゲット遺伝子の上向き調節ができない。複合体IIIの抑制剤は、低酸素状態の間にミトコンドリアＲＯＳ生成を抑制し、ＨＩＦ−１αの安定化及び転写活性を抑制する。このような発見は、ミトコンドリア複合体IIIからのＲＯＳ生成は、細胞低酸素症のシグナリングで主なイベントということを示す。ミトコンドリア複合体IIIでの構成成分が細胞酸素感知に関与するという事実から、このような過程を抑制する低分子化合物は、低酸素症−誘導血管新生を抑制する有用な手段であると判断される。
【０００５】
一方、生物学的スクリーニング道具は、ある特定の表現形質の変化を誘導することができる天然化合物の同定に有用である（Ｋｗｏｎ，Ｈ．Ｊ．（２００３）．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ｂａｓｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔｓ．Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１０，７１７−７２６；Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｆａｒｍｅｒ，Ｊ．Ｄ．Ｊｒ．，Ｌａｎｅ，Ｗ．Ｓ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．，ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．（１９９１）．Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ｉｓ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ−ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ ａｎｄ ＦＫＢＰ−ＦＫ５０６ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｃｅｌｌ ６６，８０７−８１５）。
【０００６】
本発明者は、内皮細胞で低酸素症のような親−血管新生刺激に対する血管新生性反応を抑制することができる化合物を探し出すために、微生物抽出物の大規模スクリーニングを実施した。その結果、本発明者は、ビシクロセスタテルペン、すなわち、テルぺスタシンを同定し、これは毒性閾値以下の濃度で血管新生反応を抑制することができる候補物質であることを糾明した（Ｊｕｎｇ，Ｈ．Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｈ．Ｂ．，Ｋｉｍ，Ｃ．Ｊ．，Ｒｈｏ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｈｉｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｋｗｏｎ，Ｈ．Ｊ．（２００３）．Ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｅｒｐｅｓｔａｃｉｎ，ａ ｂｉｃｙｃｌｏ ｓｅｓｔｅｒｔｅｒｐｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｅｍｂｅｌｌｉｓｉａ ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ５６，４９２−４９６）。
【０００７】
テルぺスタシンは、インビトロでＨＵＶＥＣ（Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）の血管新生反応を強く抑制し、インビボで胚芽ＣＡＭ（ｃｈｉｃｋ ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）の血管新生を強く抑制した。また、テルペスタシンは、ＨＩＶ感染の間に多核細胞質体（ｓｙｎｃｙｔｉｕｍ）形成を抑制すると知られており、化学的に合成が可能である（Ｃｈａｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｊａｍｉｓｏｎ，Ｔ．Ｆ．（２００４）．Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ（−）−ｔｅｒｐｅｓｔａｃｉｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｓｉｃｃａｎｏｌ ｕｓｉｎｇ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６，１０６８２−１０６９１；Ｍｙｅｒｓ，Ａ．Ｇ．，Ｓｉｕ，Ｍ．，ａｎｄ Ｒｅｎ，Ｆ．（２００２）．Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ（−）−ｔｅｒｐｅｓｔａｃｉｎ ａｎｄ（−）−ｆｕｓａｐｒｏｌｉｆｅｒｉｎ：ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎａｌ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｓ ａ ｈｏｍｏｃｈｉｒａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｅｒｉｅｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４，４２３０−４２３２；Ｏｋａ，Ｍ．，Ｉｉｍｕｒａ，Ｓ．， Ｔｅｎｍｙｏ，Ｏ．，Ｓａｗａｄａ，Ｙ．，Ｓｕｇａｗａｒａ，Ｍ．，Ｏｈｋｕｓａ，Ｎ．， Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｋａｗａｎｏ，Ｋ．，Ｈｕ，Ｓ．Ｌ．，Ｆｕｋａｇａｗａ，Ｙ．， ａｎｄ Ｏｋｉ，Ｔ．（１９９３）．Ｔｅｒｐｅｓｔａｃｉｎ，ａ ｎｅｗ ｓｙｎｃｙｔｉｕｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｒｏｍ Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４６，３６７−３７３）。
【０００８】
ミトコンドリア複合体IIIは、１１個のタンパク質サブユニットで構成されている。複合体の必須な成分、例えば、サイトクロームｂ、サイトクロームｃ１、Ｒｉｅｓｋｅ鉄−硫黄タンパク質及びユビキノンは、機能的によく研究されている（Ｃｒｏｆｔｓ，Ａ．Ｒ．，ａｎｄ Ｂｅｒｒｙ，Ｅ．Ａ．（１９９８）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂｃ１ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ａｎｄ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．８，５０１−５０９；Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｌ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｙａｎ，Ｊ．，Ｋｕｒｉｓｕ，Ｇ．，ａｎｄ Ｃｒａｍｅｒ，Ｗ．Ａ．（２００４）．Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂｃ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ：ａ ｃｏｍｍｏｎ ｃｏｒｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｕｒｒｏｕｎｄｅｄ ｂｙ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｏｕｔｌｙｉｎｇ ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１４，４３２−４３９）。
【０００９】
また、特異的抑制剤、例えば、アンチマイシンＡ、スティグマテリン及びミソチアゾールは、複合体IIIの機能研究に広く利用されている（Ｘｉａ，Ｄ．，Ｙｕ，Ｃ．Ａ．，Ｋｉｍ，Ｈ．，Ｘｉａ，Ｊ．Ｚ．，Ｋａｃｈｕｒｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｙｕ，Ｌ．，ａｎｄ Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．（１９９７）．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂｃ１ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｈｅａｒｔ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７，６０−６６；Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｓｈｕｌｍｅｉｓｔｅｒ，Ｖ．Ｍ．，Ｃｈｉ，Ｙ．Ｉ．，Ｋｉｍ，Ｋ．Ｋ．，Ｈｕｎｇ，Ｌ．Ｗ．，Ｃｒｏｆｔｓ，Ａ．Ｒ．，Ｂｅｒｒｙ，Ｅ．Ａ．，ａｎｄ Ｋｉｍ，Ｓ．Ｈ．（１９９８）．Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｙ ｄｏｍａｉｎ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂｃ１．Ｎａｔｕｒｅ ３９２，６７７−６８４）。
【００１０】
しかし、前記化合物は、電子運搬を抑制し、酸化性燐酸化を無くし、細胞死滅を誘導するために、腫瘍血管新生の抑制剤として適していない。したがって、ＡＴＰ生成を破砕せずとも、複合体IIIの酸素感知機能を無くす新規の化合物に対する要求が台頭され、これは低酸素症に対する適応性反応（例えば、血管成長因子の発現）の抑制に関心を置いている癌生物学者に特に関心があるものである。
【００１１】
本明細書全体に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照に挿入されて本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ａｎｄｒｅｙｅｖ，Ａ．Ｙ．，Ｋｕｓｈｎａｒｅｖａ，Ｙ．Ｅ．，ａｎｄ Ｓｔａｒｋｏｖ，Ａ．Ａ．（２００５）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ．）７０，２００−２１４
【非特許文献２】Ｍａｕｌｉｋ，Ｎ．，ａｎｄ Ｄａｓ，Ｄ．Ｋ．（２００２）．Ｒｅｄｏｘ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３３，１０４７−１０６０
【非特許文献３】Ｃｈａｎｄｅｌ，Ｎ．Ｓ．，Ｍａｌｔｅｐｅ，Ｅ．，Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ，Ｅ．，Ｍａｔｈｉｅｕ，Ｃ．Ｅ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｃ．，ａｎｄ Ｓｃｈｕｍａｃｋｅｒ，Ｐ．Ｔ．（１９９８）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｔｒｉｇｇｅｒ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，１１７１５−１１７２０
【非特許文献４】Ｂｒｕｎｅｌｌｅ，Ｊ．Ｋ．，Ｂｅｌｌ，Ｅ．Ｌ．，Ｑｕｅｓａｄａ，Ｎ．Ｍ．，Ｖｅｒｃａｕｔｅｒｅｎ，Ｋ．，Ｔｉｒａｎｔｉ，Ｖ．，Ｚｅｖｉａｎｉ，Ｍ．，Ｓｃａｒｐｕｌｌａ，Ｒ．Ｃ．，ａｎｄ Ｃｈａｎｄｅｌ，Ｎ．Ｓ．（２００５）．Ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＲＯＳ ｂｕｔ ｎｏｔ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１，４０９−４１４
【非特許文献５】Ｃｈａｎｄｅｌ，Ｎ．Ｓ．，ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ，Ｄ．Ｓ．，Ｆｅｌｉｃｉａｎｏ，Ｃ．Ｅ．，Ｗｏｏｄ，Ｔ．Ｍ．，Ｍｅｌｅｎｄｅｚ，Ｊ．Ａ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄＳｃｈｕｍａｃｋｅｒ，Ｐ．Ｔ．（２０００）．Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ａｔ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｃｏｍｐｌｅｘ ＩＩＩ ｓｔａｂｉｌｉｚｅ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−１ ｄｕｒｉｎｇ ｈｙｐｏｘｉａ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，２５１３０−２５１３８
【非特許文献６】Ｇｕｚｙ，Ｒ．Ｄ．，Ｈｏｙｏｓ，Ｂ．，Ｒｏｂｉｎ，Ｅ．，Ｃｈｅｎ，Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｌ．，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｋ．Ｄ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，Ｕ．，ａｎｄ Ｓｃｈｕｍａｃｋｅｒ，Ｐ．Ｔ．（２００５）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｃｏｍｐｌｅｘ ＩＩＩ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＲＯＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１，４０１−４０８
【非特許文献７】Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｋ．Ｄ．，Ｇｕｚｙ，Ｒ．Ｄ．，Ｐａｎ，Ｙ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ｍ．，Ｃａｓｈ，Ｔ．Ｐ．，Ｓｃｈｕｍａｃｋｅｒ，Ｐ．Ｔ．，ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｃ．（２００５）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｆｒｏｍ ｌｏｓｓ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｉｍｐａｉｒｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ ｈｙｐｏｘｉｃ ＨＩＦ−ａｌｐｈａ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１，３９３−３９９
【非特許文献８】Ｋｗｏｎ，Ｈ．Ｊ．（２００３）．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ｂａｓｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔｓ．Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１０，７１７−７２６
【非特許文献９】Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｆａｒｍｅｒ，Ｊ．Ｄ．Ｊｒ．，Ｌａｎｅ，Ｗ．Ｓ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．，ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．（１９９１）．Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ｉｓ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ−ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ ａｎｄ ＦＫＢＰ−ＦＫ５０６ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｃｅｌｌ ６６，８０７−８１５
【非特許文献１０】Ｊｕｎｇ，Ｈ．Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｈ．Ｂ．，Ｋｉｍ，Ｃ．Ｊ．，Ｒｈｏ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｈｉｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｋｗｏｎ，Ｈ．Ｊ．（２００３）．Ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｅｒｐｅｓｔａｃｉｎ，ａ ｂｉｃｙｃｌｏ ｓｅｓｔｅｒｔｅｒｐｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｅｍｂｅｌｌｉｓｉａ ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ５６，４９２−４９６
【非特許文献１１】Ｃｈａｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｊａｍｉｓｏｎ，Ｔ．Ｆ．（２００４）．Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ（−）−ｔｅｒｐｅｓｔａｃｉｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｓｉｃｃａｎｏｌ ｕｓｉｎｇ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６，１０６８２−１０６９１
【非特許文献１２】Ｍｙｅｒｓ，Ａ．Ｇ．，Ｓｉｕ，Ｍ．，ａｎｄ Ｒｅｎ，Ｆ．（２００２）．Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ（−）−ｔｅｒｐｅｓｔａｃｉｎ ａｎｄ（−）−ｆｕｓａｐｒｏｌｉｆｅｒｉｎ：ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎａｌ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｓ ａ ｈｏｍｏｃｈｉｒａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｅｒｉｅｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４，４２３０−４２３２
【非特許文献１３】Ｏｋａ，Ｍ．，Ｉｉｍｕｒａ，Ｓ．， Ｔｅｎｍｙｏ，Ｏ．，Ｓａｗａｄａ，Ｙ．，Ｓｕｇａｗａｒａ，Ｍ．，Ｏｈｋｕｓａ，Ｎ．， Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｋａｗａｎｏ，Ｋ．，Ｈｕ，Ｓ．Ｌ．，Ｆｕｋａｇａｗａ，Ｙ．， ａｎｄ Ｏｋｉ，Ｔ．（１９９３）．Ｔｅｒｐｅｓｔａｃｉｎ，ａ ｎｅｗ ｓｙｎｃｙｔｉｕｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｒｏｍ Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４６，３６７−３７３
【非特許文献１４】Ｃｒｏｆｔｓ，Ａ．Ｒ．，ａｎｄ Ｂｅｒｒｙ，Ｅ．Ａ．（１９９８）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂｃ１ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ａｎｄ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．８，５０１−５０９
【非特許文献１５】Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｌ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｙａｎ，Ｊ．，Ｋｕｒｉｓｕ，Ｇ．，ａｎｄ Ｃｒａｍｅｒ，Ｗ．Ａ．（２００４）．Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂｃ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ：ａ ｃｏｍｍｏｎ ｃｏｒｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｕｒｒｏｕｎｄｅｄ ｂｙ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｏｕｔｌｙｉｎｇ ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１４，４３２−４３９
【非特許文献１６】Ｘｉａ，Ｄ．，Ｙｕ，Ｃ．Ａ．，Ｋｉｍ，Ｈ．，Ｘｉａ，Ｊ．Ｚ．，Ｋａｃｈｕｒｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｙｕ，Ｌ．，ａｎｄ Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．（１９９７）．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂｃ１ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｈｅａｒｔ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７，６０−６６
【非特許文献１７】Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｓｈｕｌｍｅｉｓｔｅｒ，Ｖ．Ｍ．，Ｃｈｉ，Ｙ．Ｉ．，Ｋｉｍ，Ｋ．Ｋ．，Ｈｕｎｇ，Ｌ．Ｗ．，Ｃｒｏｆｔｓ，Ａ．Ｒ．，Ｂｅｒｒｙ，Ｅ．Ａ．，ａｎｄ Ｋｉｍ，Ｓ．Ｈ．（１９９８）．Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｙ ｄｏｍａｉｎ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂｃ１．Ｎａｔｕｒｅ ３９２，６７７−６８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者は、効果的な抗血管新生剤を開発しようと努力した。その結果、血管新生に対する新たな分子ターゲットであるミトコンドリア複合体IIIのユビキノン−結合タンパク質（ＱＰ−Ｃ）をターゲットにする新規の抗血管新生剤を掘り出し、この抗血管新生剤はＱＰ−Ｃに結合して、血管新生を効果的に遮断することを確認することによって、本発明を完成した。
【００１４】
したがって、本発明の目的は、薬剤学的血管新生抑制用の組成物を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の様相によれば、本発明は、（ａ）下記化学式１の化合物の薬剤学的有効量と、（ｂ）薬剤学的に許容される担体と、を含む薬剤学的血管新生抑制用の組成物を提供する：
【００１７】
【化１】
【００１８】
前記化学式で、Ｒ１〜Ｒ１２は、互いに独立的に水素、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、アミノ、ニトロ、ニトロソ、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ７シクロアルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールアルケニルまたはアルキルアリールであり、Ｒ１３は、水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、Ｘは、酸素または硫黄である。
【００１９】
本発明者は、効果的な抗血管新生剤を開発しようと努力した。その結果、血管新生に対する新たな分子ターゲットであるミトコンドリア複合体IIIのユビキノン−結合タンパク質（ＱＰ−Ｃ）をターゲットにする新規の抗血管新生剤を掘り出し、この抗血管新生剤はＱＰ−Ｃに結合して、血管新生を効果的に遮断することを確認した。
【００２０】
本発明の組成物は、“薬剤学的血管新生抑制用の組成物”と表現され、これは“血管新生−関連疾患の予防または治療用の薬剤学的組成物”または“非調節血管新生−関連疾患の予防または治療用の薬剤学的組成物”と表現されることもできる。
【００２１】
本発明の薬剤学的組成物で有効成分として利用される化合物は、化学式１に表示される。本発明の化合物は、基本的にナフタレン及びナフトチオフェン構造を有し、ジオキシスルホニル基を有する。
【００２２】
本発明の化合物を定義する化学式１で、用語“ハロ”は、ハロゲン族元素を表わし、例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを含む。用語“Ｃ１〜Ｃ１２アルキル”は、炭素数１〜１２の直鎖状または分枝鎖状飽和炭化水素基を意味し、望ましくは、“Ｃ１〜Ｃ４直鎖状または分枝鎖状アルキル”であり、これは低価アルキルとしてメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、イソブチル、ｎ−ブチルを及びｔ−ブチルを含む。用語“アルケニル基”は、指定された炭素数を有する直鎖状または分枝鎖状不飽和炭化水素基を表わし、望ましくは、Ｃ２〜Ｃ６直鎖状または分枝鎖状アルケニルであり、これは最小一つの二重結合を有する炭素数２〜６の炭化水素基であって、例えば、エテニル、プロぺニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、ｔ−ブテニル、ｎ−ペンテニル及びｎ−ヘキセニルを含む。
【００２３】
用語“シクロアルキル”は、指定された炭素数を有するサイクリック炭化水素ラジカルを意味し、望ましくは、“Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル”であり、これはシクロプロピル、シクロブチル及びシクロペンチルを含む。用語“シクロアルケニル”は、指定された炭素数を有し、最小一つの二重結合を有するサイクリック炭化水素基を意味し、望ましくは、“Ｃ５〜Ｃ７シクロアルケニル”であり、これはシクロペンテン、シクロヘキセン及びシクロヘキサジエンを含む。用語“アルキルアミノ”は、アミノ置換体を有するアルキル基を意味する。用語“アルコキシ”は、−Ｏアルキル基を意味する。
【００２４】
用語“アリール”は、全体的にまたは部分的に不飽和された置換または非置換のモノサイクリックまたはポリサイクリック炭素環を意味し、望ましくは、モノアリールまたは非アリールである。モノアリールは、炭素数５〜６を有することが望ましく、非アリールは、炭素数９〜１０を有することが望ましい。最も望ましくは、前記アリールは、置換または非置換のフェニルである。モノアリール、例えば、フェニルが置換される場合には、多様な位置から多様な置換体によって置換がなされうるが、望ましくは、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、Ｃ１〜Ｃ４置換または非置換の直鎖状または分枝鎖状アルキル、Ｃ１〜Ｃ４直鎖状または分枝鎖状アルコキシ、アルキル置換スルファニル、フェノキシ、Ｃ３〜Ｃ６シクロヘテロアルキルまたは置換または非置換アミノ基によって置換される。
【００２５】
用語“ヘテロアリール”は、芳香族ヘテロ環基であって、ヘテロ原子としてＮ、ＯまたはＳを含むものである。望ましくは、ヘテロアリールは、ヘテロ原子としてＮを含むヘテロビアリールである。
【００２６】
用語“アリールアルキル（アラルキル）”は、一つまたはそれ以上のアルキル基による構造に結合されたアリール基を意味し、望ましくは、ベンジル基である。用語“アルキルアリール”は、一つまたはそれ以上のアリール基からなる構造に結合されたアルキル基を意味する。用語“アリールアルケニル”は、一つまたはそれ以上のアルキル基による構造に結合されたアリール基を意味し、望ましくは、フェニルエテニル基である。
【００２７】
本発明の望ましい化合物によれば、前記Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、より望ましくは、ヒドロキシまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、最も望ましくは、ヒドロキシである。
【００２８】
本発明の望ましい具現例によれば、前記Ｒ２〜Ｒ１２は、互いに独立的に水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、より望ましくは、互いに独立的に水素、ヒドロキシまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、最も望ましくは、水素である。
【００２９】
本発明の望ましい具現例によれば、前記Ｒ１３は、水素またはヒドロキシであり、より望ましくは、水素である。
【００３０】
前記化学式１で、Ｘ位置には酸素または硫黄原子が位置することができ、最も望ましくは、酸素原子が位置する。
【００３１】
本発明の最も望ましい具現例によれば、化学式１の化合物で、Ｒ１は、ヒドロキシであり、Ｒ２〜Ｒ１２は、水素であり、Ｒ１３は、水素であり、Ｘは、酸素である。前記定義された化合物は、ＨＤＮＴ［６−（（１−ｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｈｔｈａｌｅｎ−４−ｙｌａｍｉｎｏ）ｄｉｏｘｙｓｕｌｆｏｎｅ）−２Ｈ−ｎａｐｈｔｈｏ［１，８−ｂｃ］ｔｈｉｏｐｈｅｎ−２−ｏｎｅ］である。
【００３２】
本発明の薬剤学的組成物によって予防または治療可能な疾病、疾患または状態は、血管新生と関連した多様な疾患を含む。望ましくは、本発明の組成物によって予防または治療可能な疾患は、癌、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性(age related macular degeneration: AMD)、角膜移植拒否、新生血管緑内障、紅色症、増殖性網膜症、乾癬、血友病性関節、アテローム性動脈硬化プラーク内での毛細血管増殖、ケロイド、傷顆粒化、血管接着、リューマチ関節炎、骨関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再発狭窄症、アテローム性動脈硬化、腸管接着、キャットスクラッチ疾患、潰瘍、肝経病症、糸球体腎炎、糖尿病性腎臓病症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症、器官移植拒否、腎糸球体病症、糖尿病、炎症または神経退行性疾患である。
【００３３】
本発明の組成物によって予防または治療可能な自己免疫疾患は、アロペシアグリエッタ（ａｌｏｐｅｃｉａ ｇｒｅａｔａ）、強直性脊椎炎、抗リン脂質症侯群、自己免疫アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫卵巣炎及び睾丸炎、自己免疫血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋病症、腹腔スプルー皮膚炎（ｃｅｌｉａｃ ｓｐｒｕｅ−ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、慢性疲労異常症侯群、慢性炎症性脱髄巣多発性神経病症、Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓ症侯群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症侯群、寒冷凝集素疾患、クローン病、円板性狼瘡、本態性複合寒冷グロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、糸球体腎炎、グレイブス疾患、ギランバレー症侯群、ハシモト甲状腺炎、特発性肺線維化症、特發性血小板減少性紫斑症、ＩｇＡ神経炎、若年性関節炎、扁平苔癬、紅斑性ループス、メニエール病、混合性連結組職疾患、多発性硬化症、タイプＩまたは免疫−媒介糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発軟骨炎、自己免疫性多腺症侯群、リューマチ多発性筋痛、多発性筋炎と皮膚筋炎、一次性無ガンマグロブリン血症、一次性痰症性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症侯群、リューマチ関節炎、サルコイド症、鞏皮症、スティッフマン症候群、全身性紅斑性ループス、紅斑性ループス、タカヤス動脈炎、一時的動脈炎、巨大細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、葡萄膜炎、白板症及びウェゲナー肉芽腫症を含むが、これに限定されるものではない。
【００３４】
本発明の組成物によって予防または治療可能な炎症性疾患の例は、喘息、脳炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、炎症性膓炎、慢性閉鎖性肺疾患、アレルギー、肺血病性ショック症、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節病症、関節炎、炎症性骨溶解、及び慢性ウイルスまたはバクテリア感染による慢性炎症を含むが、これに限定されるものではない。
【００３５】
より望ましくは、本発明の薬剤学的組成物によって予防または治療可能な疾患は、癌または糖尿病性網膜症または加齢黄斑変性(age related macular degeneration: AMD)である。
【００３６】
本明細書で、用語“薬剤学的有効量”は、前記化学式１の化合物の効能または活性を果たすのに十分な量を意味する。
【００３７】
本発明の組成物が薬剤学的組成物として製造される場合、本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体を含む。本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、燐酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、珪酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。
【００３８】
本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含みうる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳しく記載している。
【００３９】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口投与することができ、非経口投与である場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与、粘膜投与及び点眼投与などで投与することができる。
【００４０】
本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって多様に処方可能である。望ましくは、本発明の薬剤学的組成物の投与量は、成人基準に０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）である。
【００４１】
本発明の薬剤学的組成物は、当業者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することで単位容量形態に製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造可能である。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液形態であるか、エクストラクト剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であることもでき、分散剤または安定化剤をさらに含みうる。
【００４２】
本発明の薬剤学的組成物は、ＱＰ−Ｃの生物学的機能を遮断することでＡＴＰ生成を破砕せずとも、ミトコンドリア複合体IIIの酸素感知機能を抑制することによって、効果的にそして人体に安全な方式で血管新生を抑制することによって、多様な血管新生−関連疾患または疾病の予防または治療に利用される。
【発明の効果】
【００４３】
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（i）本発明の薬剤学的組成物で有効成分として利用される化合物は、ＱＰ−Ｃに結合して血管新生を効果的に抑制する。
【００４４】
（ii）本発明の薬剤学的組成物は、血管新生−関連疾病または疾患の予防または治療に効果的に利用される。
【００４５】
（iii）本発明の薬剤学的組成物で有効成分として利用される化合物は、ＱＰ−Ｃに特異的に結合してＱＰ−Ｃの生物学的機能を抑制するために、細胞死滅を誘導せずに血管新生反応（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）を抑制し、これは薬物の安全性を大きく改善する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージで、人間ＱＰ−Ｃのファージコーディング配列を表わす。灰色ボックスが人間ＱＰ−Ｃのファージコーディング配列（８２ａａ）である。
【図２】ＱＰ−Ｃタンパク質の発現及び錠剤結果を示すタンパク質電気泳動結果の写真である。最も左側レーンは、サイズマーカーであり、１〜４レーンは、それぞれ錠剤したＱＰ−Ｃタンパク質（１〜２レーン：ＧＳＴ＋ＱＰ−Ｃ、３〜４レーン：ＱＰ−Ｃ）をローディングしたものである。
【図３】ＨＤＮＴに対する血管内皮細胞の管形成分析結果を示す写真である。濃度−依存的にＨＤＮＴは、ＨＵＶＥＣｓの管形成を抑制するということが分かる。
【図４】ＨＤＮＴに対する血管内皮細胞の侵入分析結果を示す写真である。濃度−依存的にＨＤＮＴは、ＨＵＶＥＣｓの侵入を抑制するということが分かる。
【図５】ＨＤＮＴによるミトコンドリア膜電位変化を蛍光顕微鏡で観察した結果である。ＨＤＮＴが、濃度−依存的にミトコンドリア膜電位を破壊するということが分かる。
【図６】ＨＤＮＴに対するファージディスプレイによる競争結合分析結果である。ＱＰ−Ｃ発現バクテリオファージの結合において、ＨＤＮＴがテルペスタシンと競争するか否かを分析した。ＨＤＮＴは、ビオチン−テルペスタシンとＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージとの間の結合を効果的に阻害した。このような結果は、ＨＤＮＴがＱＰ−Ｃタンパク質に結合するということを表わす。
【図７】ＨＤＮＴに対する蛍光染色による競争結合分析結果である。ＨＤＮＴは、クマリン−テルペスタシンとＱＰ−Ｃとの間の結合を効果的に阻害した。
【図８】ＨＤＮＴに対する表面プラズモン共鳴による競争結合分析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者に自明である。
【実施例】
【００４８】
〔実験材料及び実験方法〕
[実験材料]
テルペスタシンは、真菌類、Ｅｍｂｅｌｌｉｓｉａ ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａの抽出物から錠剤した（Ｊｕｎｇ，Ｈ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｅｒｐｅｓｔａｃｉｎ，ａ ｂｉｃｙｃｌｏ ｓｅｓｔｅｒｔｅｒｐｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｅｍｂｅｌｌｉｓｉａ ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ５６：４９２−４９６（２００３））。
ＨＤＮＴ［６−（（１−ｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｈｔｈａｌｅｎ−４−ｙｌａｍｉｎｏ）ｄｉｏｘｙｓｕｌｆｏｎｅ）−２Ｈ−ｎａｐｈｔｈｏ［１，８−ｂｃ］ｔｈｉｏｐｈｅｎ−２−ｏｎｅ］は、Ｓｐｅｃｓで購入した。
【００４９】
＜テルペスタシンに対する分子プローブの合成＞
（１）ビオチン化テルペスタシン。
ＥＤＣ（１−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−３−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、１．５ｍｇ、０．００７８ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＤＭＡＰ（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ、１．０ｍｇ、０．００８２ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をテルペスタシン（３．０ｍｇ、０．００７５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に添加し、Ｎ−（＋）−ビオチニル−６−アミノヘキサン酸（２．７ｍｇ、０．００７６ｍｍｏｌ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）ｉｎ ＤＭＳＯ（３ｍｌ）を０℃で添加した。室温で一晩反応させた後、反応結果物をエタノール（１５ｍｌ）で抽出し、錠剤用ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝１０：１）で錠剤して２種のビオチン化テルペスタシン誘導体（Ｃ−２４位置からのヒドロキシル基［ＢＴ１］及びＣ−１７位置からのヒドロキシル基［ＢＴ２］）を得た。収率は７５％であった。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ ｆｏｒ Ｃ４１Ｈ６３Ｎ３Ｏ７Ｓ ｍ／ｚ ７６４．５［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【００５０】
【化２】
【００５１】
【化３】
【００５２】
（２）クマリン−コンジュゲイトテルペスタシン。
ＥＤＣ（１．０ｍｇ、０．００５２ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．６４ｍｇ、０．００５２ｍｍｏｌ）をテルペスタシン（２．０ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ−６−アミノヘキサン酸（１．２ｍｇ、０．００５２ｍｍｏｌ）ｉｎ ＤＭＦ（２ｍｌ）の撹拌された溶液に０℃で添加した。室温で一晩反応させた後、反応産物をエタノール（４ｍｌｘ３）で抽出し、２０％ ＴＦＡ ｉｎ ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍｌ）で処理した後、室温で２時間撹拌した。ＤＩＰＥＡ（１．３ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）及び６−（（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセチル）アミノ）ヘキサン酸サクシニミジルエステル（２．２ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を０℃で添加した。室温で４時間撹拌した後、反応産物をエタノール（２０ｍｌ）で抽出し、錠剤用ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝１０：１）で錠剤してクマリン−コンジュゲイトテルペスタシンを６１％収率で得た。合成されたクマリン−コンジュゲイトテルペスタシンは、化学式４に記載している。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ ｆｏｒ Ｃ４９Ｈ７１Ｎ３Ｏ９ ｍ／ｚ ８６８．５［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【００５３】
【化４】
【００５４】
＜ＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージの製造＞
５種の他の人間組職（肝癌、正常肝、痴呆脳、正常脳及び正常胃）から得られたｃＤＮＡライブラリーをコーディングしているＴ７バクテリオファージ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を確保した後、宿主細胞である Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬＴ５６１５に感染させて増幅した。ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶解したビオチン化テルペスタシン（５μＭ）をストレプトアビジンがコーティングされた９６−ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上に固定化した後、前記増幅されたＴ７バクテリオファージライブラリー（６ｘ１０９ｐｆｕ／ｍｌ）をテルペスタシン固定ウェルに添加した。室温で１時間撹拌した後、テルペスタシンと結合していないＴ７バクテリオファージ粒子をＴＢＳ緩衝液で洗浄して除去し、テルペスタシンと結合したＴ７バクテリオファージ粒子は、ＴＢＳ緩衝液で溶解したテルペスタシン（１００μＭ）を添加して１時間溶出させた。前記溶出されたＴ７バクテリオファージをＬＢ寒天培地に培養されたＢＬＴ５６１５に感染させ、形成されたＴ７バクテリオファージプラーク（ｐｌａｑｕｅ）をそれぞれ分離してＤＮＡ塩基配列を分析することによって、ミトコンドリア複合体IIIのユビキノン−結合タンパク質（ＱＰ−Ｃ）を発現するＴ７バクテリオファージを獲得した。人間ＱＰ−Ｃのファージコーディング配列は、図１に記載している。
【００５５】
＜人間ＱＰ−Ｃタンパク質のクローニング、発現及び錠剤＞
肝組職ｃＤＮＡライブラリーを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として用いてＱＰ−Ｃ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿００６２９４）を重合酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を通じて増幅した。使われたプライマーの配列は、次の通りである：前方向プライマー５’−ＡＴＧＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＡＡＧＣＡＧＧＣＣ−３’、逆方向プライマー５’−ＡＴＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＣＣＡＴＴＣＴＴＣ−３’。
【００５６】
前記遺伝子をｐＧＥＸ−４Ｔ１ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のマルチクローニングサイト（ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ ｓｉｔｅ）に挿入し、タンパク質発現のために Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１に形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）した。前記形質転換バクテリアのＬＢ培養液（ＯＤ６００＝０．６）にＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加して３７℃で４時間振動培養した後、超音波破砕機を使って細胞内に誘導発現されたＧＳＴ／ＱＰ−Ｃ融合タンパク質を溶出し、グルタチオンアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）を添加して前記融合タンパク質のみを錠剤した。融合タンパク質のＧＳＴ部分を除去するため、トロンビン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を添加して室温で一晩撹拌した後、遠心分離によってＱＰ−Ｃタンパク質が存在する上澄み液のみを回収した（参照：図２）。
【００５７】
＜血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）阻害活性分析＞
（１．血管内皮細胞の管形成（ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）分析）
４８−ウェルプレートに１５０ｕｌのマトリゲル（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）をコーティングし、３７℃で２時間重合させた。引き続き、血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ、１ｘ１０５細胞／ウェル）を前記マトリゲルに接種し、ＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び本発明の化合物であるＨＤＮＴ（２．５、５μＭ）を添加した。恒温で８時間培養しながら細胞の形態学的変化を顕微鏡下で観察した。管形成血管内皮細胞の細胞毒性は、トリパンブルー染色で評価した（参照：図３）。
【００５８】
（２．血管内皮細胞の侵入（ｉｎｖａｓｉｏｎ）分析）
血管内皮細胞の侵入は、ポリカーボネートフィルター（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ ｆｉｌｔｅｒ）があるトランスウェルチャンバ（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）システムを用いてインビトロで測定した。まず、前記フィルターの下部を１０ｕｌゼラチン（１０ｍｇ／ｍｌ）で１時間コーティングし、フィルターの上部を１０ｕｌマトリゲル（３ｍｇ／ｍｌ）で２時間コーティングした。引き続き、トランスウェルに６００ｕｌ ＥＢＭ−２培地を入れた後、ＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）及び本発明の化合物であるＨＤＮＴ（２．５、５μＭ）を添加した。コーティングされたフィルターを前記トランスウェル上に載せ、フィルターの上部に血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ、１ｘ１０５細胞／ウェル）を接種して恒温で１８時間培養した。その後、７０％メタノールで細胞を固定させてヘマトキシリン／エオシンで染色した後、顕微鏡下で一つのフィルター内の全体細胞を係数することで細胞侵入程度を決定した（参照：図４）。
【００５９】
＜ミトコンドリア機能調節活性分析＞
（１．ミトコンドリア膜電位 （ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）の測定）
血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）を２４−ウェルプレート（２ｘ１０４細胞／ウェル）上に分周し、１０％牛胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれたＥＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ）培地で培養した。引き続き、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を使って細胞を洗浄した後、新鮮な同一培地に交換した。
【００６０】
本発明の化合物であるＨＤＮＴ（１、５、１０μＭ）を添加して４時間恒温培養した後、ミトコンドリア膜電位の変化を測定するために、親油性陽イオンプローブである５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’、３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾール−カルボシアニンヨウ化物（ＪＣ−１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）０．２５ｕｇ／ｍｌで１５分間染色させた。過分極の膜電位（ｔｏ−１４０ｍＶ）で、前記染色剤は赤色蛍光Ｊ−凝集体を形成し、脱分極の膜電位（ｔｏ−１００ｍＶ）で、前記染色剤は緑色蛍光モノ模型を保持する。前記染色された細胞をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。イメージをＩＸ７０蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で１００倍の倍率で得た（参照：図５）。
【００６１】
（２．ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）による競争結合分析）
ＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージを宿主細胞である Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬＴ５６１５に感染させて増幅した。
【００６２】
本発明の化合物であるＨＤＮＴ（２００μＭ）及びＱＰ−Ｃと結合する化合物であるテルペスタシン（２００μＭ）を前記増幅されたＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージ培養液（６ｘ１０９ ｐｆｕ／ｍｌ）にそれぞれ添加した後、室温で１時間撹拌した。ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶解したビオチンとビオチン化テルペスタシン（５μＭ）とをストレプトアビジンがコーティングされた９６−ウェルプレート上にそれぞれ固定化した後、前記ＱＰ−Ｃファージと化合物の反応混合溶液とをビオチン化テルペスタシンが固定されたウェルに添加した。室温で１時間撹拌した後、ビオチン化テルペスタシンと結合していないＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージ粒子とをＴＢＳ緩衝液で３回反復洗浄して除去した。ビオチン化テルペスタシンと結合したＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージ粒子は、ＴＢＳ緩衝液に溶解されたテルペスタシン（１００μＭ）を添加して１時間溶出させた。前記溶出されたＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージ粒子をＬＢ寒天培地に培養された ＢＬＴ５６１５に感染させ、形成されたバクテリオファージプラークの数を数えて処理区と対照区との間を比較分析した（参照：図６）。
【００６３】
（３．蛍光染色（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）による競争結合分析）
血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）を２４−ウェルプレート（２ｘ１０４細胞／ウェル）上に分周し、１０％牛胎児血清が含まれたＥＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ）培地で培養した。引き続き、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を使って細胞を洗浄した後、新鮮な同一培地に交換した。
各ウェルに本発明の化合物であるＨＤＮＴ（１０μＭ）またはＱＰ−Ｃと結合するテルペスタシン（３０μＭ）を添加して２４時間恒温培養し、蛍光誘導体であるクマリン（２０μＭ）とクマリン−コンジュゲイトされたテルペスタシン（２０μＭ）とを対照群及び処理群に添加して２時間さらに培養した。ＰＢＳ緩衝液で細胞を洗浄した後、ＩＸ７０蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）下で蛍光の強さを観察し、写真撮影した（参照：図７）。
【００６４】
（４．表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）による競争結合分析）
ビオチンまたはビオチン化テルペスタシン（１００μＭ）をストレプトアビジンがコーティングされたセンサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ）の各フローセルに順次に固定化した。本発明の化合物であるＨＤＮＴ（２５μＭ）またはＱＰ−Ｃと結合する化合物テルペスタシン（２５μＭ）を錠剤したＱＰ−Ｃタンパク質（２５μＭ）のＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ）にそれぞれ添加した後、前記センサーチップの表面上に１分当たり３０ｕｌの流速で注入した。
【００６５】
結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）及び解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）曲線を含んだ結合センサーグラム（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）は、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００を通じて得られ、センサーチップ表面は、５０ｍＭ ＮａＯＨ（５ｕｌ）を注入して再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）させた。この際、結合センサーグラムは、ビオチン化テルペスタシンとＱＰ−Ｃタンパク質との間の結合曲線からビオチンとＱＰ−Ｃタンパク質との間の結合曲線を差し引いて得た。表面プラズモン共鳴反応曲線は、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓソフトウェア、ｖｅｒｓｉｏｎ３．１を用いて分析した（参照：図８）。
【００６６】
[実験結果]
＜血管新生阻害活性分析結果＞
血管新生は、胚芽の発生、傷治療及び組職または器官の再生のような無数の生理的過程で必須である（Ｒｉｓａｕ，Ｗ．１９９４．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ４４：４１６−４１７）。しかし、持続的な非調節性血管新生は、リューマチ関節炎、糖尿性網膜炎、固形腫瘍、血管腫及び乾癬のような血管新生性疾病を誘発させる（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．ａｎｄ Ｒ．Ｋ．Ｊａｉｎ．２０００．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４０７：２４９−２５７）。したがって、新たな抗血管新生化合物は、血管新生と連関した癌及び他の人間疾病の治療剤として開発されることができる。そして、本発明の化合物であるＨＤＮＴが抗血管新生活性を表わすかを確認するため、代表的なインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）血管新生測定方法である血管内皮細胞の管形成及び侵入分析を実施した。
【００６７】
図３と４とで示すように、ＨＤＮＴは、ＶＥＧＦによって誘導されるＨＵＶＥＣｓの管形成及び侵入を濃度依存的に抑制した。さらに、本発明の化合物によって血管新生が抑制された細胞がトリパンブルーによって染色されないと見て、ＨＤＮＴの抗血管新生活性が細胞毒性から招来されるものではないということを示す。このような結果は、ＨＤＮＴが新たな抗血管新生治療剤として開発されることができるということを表わす。
【００６８】
＜ミトコンドリア膜電位の測定結果＞
最近、ミトコンドリア機能異常が、心血管疾患、糖尿病及び痴呆などの慢性退行性疾患だけではなく、癌の発病に重要な原因を提供すると明かされた（３．Ｓｚｅｗｃｚｙｋ，Ａ．ａｎｄ Ｌ．Ｗｏｊｔｃｚａｋ．２００２．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ａｓ ａ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｔａｒｇｅｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５４：１０１〜１２７）。
【００６９】
事前報告によれば、ミトコンドリアの電子伝達系から発生する活性酸素種が、癌の転移と増殖とに必須な血管新生を誘導するものと知られた（Ｇｕｚｙ，Ｒ．Ｄ．，Ｂ．Ｈｏｙｏｓ，Ｅ．Ｒｏｂｉｎ，Ｈ．Ｃｈｅｎ，Ｌ．Ｌｉｕ，Ｋ．Ｄ．Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｃ．Ｓｉｍｏｎ，Ｕ．Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ａｎｄ Ｐ．Ｔ．Ｓｃｈｕｍａｃｋｅｒ．２００５．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｃｏｍｐｌｅｘ ＩＩＩ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＲＯＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１：４０１−４０８）。
【００７０】
そして、本発明の化合物であるＨＤＮＴの抗血管新生活性がミトコンドリア機能調節によるものであるかを確認するため、ＨＤＮＴが血管内皮細胞であるＨＵＶＥＣｓのミトコンドリア膜電位変化に及ぼす影響を分析した。ミトコンドリア膜電位の変化は、親油性陽イオンの蛍光マーカーであるＪＣ−１を使って測定した。ＪＣ−１は、ミトコンドリア膜電位が正常（−１４０ｍＶ）である時、赤色蛍光の複合体を形成する一方、ミトコンドリア膜電位が破壊（−１００ｍＶ）される時、緑色蛍光の単量体を形成する性質を有しいる。
【００７１】
図５で示すように、本発明の化合物であるＨＤＮＴの処理濃度が増加するほど赤色蛍光の強さが弱くなる一方、緑色蛍光の強さが強まると見て、ＨＤＮＴがミトコンドリア膜電位を破壊するということが分かった。このような結果は、ＨＤＮＴがミトコンドリア機能を調節することができるということを表わしている。
【００７２】
＜ファージディスプレイによる競争結合分析結果＞
抗血管新生活性を有する天然物であるテルペスタシンは、ＱＰ−Ｃと結合してミトコンドリアから発生する活性酸素種を抑制する。本発明の化合物であるＨＤＮＴがＱＰ−Ｃと結合してミトコンドリア機能を調節するかを確認するため、ＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージを利用したファージディスプレイ競争結合分析実験を行った。
【００７３】
図６で示すように、ビオチンは、ＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージと結合しない一方、ＱＰ−Ｃと結合する化合物であるビオチン化テルペスタシンは、ＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージと特異的に結合した。しかし、過量のテルペスタシンをＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージと先に反応させた場合、競争結合（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）によって前記ビオチン化テルペスタシンとＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージとの間の結合を大きく阻害した。次いで、本発明の化合物であるＨＤＮＴをＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージと先に反応させた場合も、テルペスタシンと同様にビオチン化テルペスタシンとＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージとの間の結合を効果的に阻害した。このような結果は、ＨＤＮＴがＱＰ−Ｃタンパク質に結合するということを表わしている。
【００７４】
＜蛍光染色による競争結合分析結果＞
本発明の化合物であるＨＤＮＴがＱＰ−Ｃと結合することを検証するため、ＱＰ−Ｃと結合する公知された化合物であるテルペスタシンの蛍光誘導体を利用した競争結合分析実験を行った。
【００７５】
図７で示すように、クマリン−テルペスタシンをＨＵＶＥＣｓに処理した結果、クマリン処理とは異なって、ミトコンドリアが存在する細胞質部位で強い青色蛍光を表わした。この際、クマリン−テルペスタシンを細胞に処理する前にテルペスタシンを先に細胞に処理した場合、競争結合によって前記クマルリン−テルペスタシンとミトコンドリアタンパク質であるＱＰ−Ｃとの間の結合が阻害されて、細胞質部位の青色蛍光の強さが大きく弱化された。次いで、本発明の化合物であるＨＤＮＴを細胞に先に処理した場合、テルペスタシン処理と同様に青色蛍光の強さが大きく減少すると見て、ＨＤＮＴがＱＰ−Ｃに結合するということを確認できた。
【００７６】
＜表面プラズモン共鳴による競争結合分析結果＞
本発明の化合物であるＨＤＮＴがＱＰ−Ｃと結合することを再び検証するため、屈折率の変化測定によって生体物質間直接結合をリアルタイムで確認することができる表面プラズモン共鳴技術を用いて競争結合分析実験を行った。ビオチンとビオチン−テルペスタシンとをストレプトアビジンがコーティングされたセンサーチップの各フローセルに順次に固定化した後、テルペスタシンとＱＰ−Ｃタンパク質の反応混合液とを前記センサーチップの表面上に注入した結果、競争結合によってビオチン−テルペスタシンとＱＰ−Ｃタンパク質との間の結合を６０％まで阻害した（図８）。次いで、本発明の化合物であるＨＤＮＴとＱＰ−Ｃタンパク質の反応混合液とをセンサーチップの表面上に注入した場合、テルペスタシンと同様にビオチンテルペスタシンとＱＰ−Ｃタンパク質との間の結合を４０％まで阻害した。このような結果は、ＨＤＮＴがＱＰ−Ｃに直接的に結合するということを検証している。
【００７７】
前述した実験結果によれば、本発明の化合物であるＨＤＮＴは、ミトコンドリアタンパク質であるＱＰ−Ｃを選択的に標的してミトコンドリア機能を調節することによって、癌を含めた血管新生性疾患の治療剤として開発されることができるということが分かる。
【００７８】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したが、当業者において、このような具体的な技術は、単に望ましい具現例であり、これに本発明の範囲が制限されるものではない点は明白である。したがって、本発明の実質的な特許請求の範囲は、請求項とその等価物によって定義される。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明は、血管新生抑制用の薬剤学的組成物に関連する分野に適用されうる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生抑制用の薬剤学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
固形癌の発展は、血管新生を要求する。ミトコンドリア機能は、血管新生と連結されており、これはミトコンドリアが酸素消費の主な位置であり、血管新生は酸素濃度−敏感性過程であるためである（Ａｎｄｒｅｙｅｖ，Ａ．Ｙ．，Ｋｕｓｈｎａｒｅｖａ，Ｙ．Ｅ．，ａｎｄ Ｓｔａｒｋｏｖ，Ａ．Ａ．（２００５）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ．）７０，２００−２１４；Ｍａｕｌｉｋ，Ｎ．，ａｎｄ Ｄａｓ，Ｄ．Ｋ．（２００２）．Ｒｅｄｏｘ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３３，１０４７−１０６０）。
【０００３】
また、ミトコンドリア酸化還元状態の変化は、低酸素状態（ｈｙｐｏｘｉａ）の間に活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を刺激し、これは親−血管新生タンパク質の転写を活性化させるものと知られている（Ｃｈａｎｄｅｌ，Ｎ．Ｓ．，Ｍａｌｔｅｐｅ，Ｅ．，Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ，Ｅ．，Ｍａｔｈｉｅｕ，Ｃ．Ｅ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｃ．，ａｎｄ Ｓｃｈｕｍａｃｋｅｒ，Ｐ．Ｔ．（１９９８）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｔｒｉｇｇｅｒ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，１１７１５−１１７２０）。
【０００４】
論文によれば、ミトコンドリア複合体IIIでのＲＯＳ生成は、低酸素状態の間にＨＩＦ−１α安定化の触発に必要十分条件であり（Ｂｒｕｎｅｌｌｅ，Ｊ．Ｋ．，Ｂｅｌｌ，Ｅ．Ｌ．，Ｑｕｅｓａｄａ，Ｎ．Ｍ．，Ｖｅｒｃａｕｔｅｒｅｎ，Ｋ．，Ｔｉｒａｎｔｉ，Ｖ．，Ｚｅｖｉａｎｉ，Ｍ．，Ｓｃａｒｐｕｌｌａ，Ｒ．Ｃ．，ａｎｄ Ｃｈａｎｄｅｌ，Ｎ．Ｓ．（２００５）．Ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＲＯＳ ｂｕｔ ｎｏｔ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１，４０９−４１４；Ｃｈａｎｄｅｌ，Ｎ．Ｓ．，ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ，Ｄ．Ｓ．，Ｆｅｌｉｃｉａｎｏ，Ｃ．Ｅ．，Ｗｏｏｄ，Ｔ．Ｍ．，Ｍｅｌｅｎｄｅｚ，Ｊ．Ａ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄＳｃｈｕｍａｃｋｅｒ，Ｐ．Ｔ．（２０００）．Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ａｔ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｃｏｍｐｌｅｘ ＩＩＩ ｓｔａｂｉｌｉｚｅ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−１ ｄｕｒｉｎｇ ｈｙｐｏｘｉａ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，２５１３０−２５１３８；Ｇｕｚｙ，Ｒ．Ｄ．，Ｈｏｙｏｓ，Ｂ．，Ｒｏｂｉｎ，Ｅ．，Ｃｈｅｎ，Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｌ．，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｋ．Ｄ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，Ｕ．，ａｎｄ Ｓｃｈｕｍａｃｋｅｒ，Ｐ．Ｔ．（２００５）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｃｏｍｐｌｅｘ ＩＩＩ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＲＯＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１，４０１−４０８；Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｋ．Ｄ．，Ｇｕｚｙ，Ｒ．Ｄ．，Ｐａｎ，Ｙ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ｍ．，Ｃａｓｈ，Ｔ．Ｐ．，Ｓｃｈｕｍａｃｋｅｒ，Ｐ．Ｔ．，ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｃ．（２００５）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｆｒｏｍ ｌｏｓｓ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｉｍｐａｉｒｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ ｈｙｐｏｘｉｃ ＨＩＦ−ａｌｐｈａ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１，３９３−３９９）、ミトコンドリアＤＮＡ及び電子運搬活性（ρｏ細胞）が欠けた細胞の場合、低酸素状態の間にＲＯＳの増加またはＨＩＦ−１αターゲット遺伝子の上向き調節ができない。複合体IIIの抑制剤は、低酸素状態の間にミトコンドリアＲＯＳ生成を抑制し、ＨＩＦ−１αの安定化及び転写活性を抑制する。このような発見は、ミトコンドリア複合体IIIからのＲＯＳ生成は、細胞低酸素症のシグナリングで主なイベントということを示す。ミトコンドリア複合体IIIでの構成成分が細胞酸素感知に関与するという事実から、このような過程を抑制する低分子化合物は、低酸素症−誘導血管新生を抑制する有用な手段であると判断される。
【０００５】
一方、生物学的スクリーニング道具は、ある特定の表現形質の変化を誘導することができる天然化合物の同定に有用である（Ｋｗｏｎ，Ｈ．Ｊ．（２００３）．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ｂａｓｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔｓ．Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１０，７１７−７２６；Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｆａｒｍｅｒ，Ｊ．Ｄ．Ｊｒ．，Ｌａｎｅ，Ｗ．Ｓ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．，ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．（１９９１）．Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ｉｓ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ−ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ ａｎｄ ＦＫＢＰ−ＦＫ５０６ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｃｅｌｌ ６６，８０７−８１５）。
【０００６】
本発明者は、内皮細胞で低酸素症のような親−血管新生刺激に対する血管新生性反応を抑制することができる化合物を探し出すために、微生物抽出物の大規模スクリーニングを実施した。その結果、本発明者は、ビシクロセスタテルペン、すなわち、テルぺスタシンを同定し、これは毒性閾値以下の濃度で血管新生反応を抑制することができる候補物質であることを糾明した（Ｊｕｎｇ，Ｈ．Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｈ．Ｂ．，Ｋｉｍ，Ｃ．Ｊ．，Ｒｈｏ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｈｉｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｋｗｏｎ，Ｈ．Ｊ．（２００３）．Ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｅｒｐｅｓｔａｃｉｎ，ａ ｂｉｃｙｃｌｏ ｓｅｓｔｅｒｔｅｒｐｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｅｍｂｅｌｌｉｓｉａ ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ５６，４９２−４９６）。
【０００７】
テルぺスタシンは、インビトロでＨＵＶＥＣ（Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）の血管新生反応を強く抑制し、インビボで胚芽ＣＡＭ（ｃｈｉｃｋ ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）の血管新生を強く抑制した。また、テルペスタシンは、ＨＩＶ感染の間に多核細胞質体（ｓｙｎｃｙｔｉｕｍ）形成を抑制すると知られており、化学的に合成が可能である（Ｃｈａｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｊａｍｉｓｏｎ，Ｔ．Ｆ．（２００４）．Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ（−）−ｔｅｒｐｅｓｔａｃｉｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｓｉｃｃａｎｏｌ ｕｓｉｎｇ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６，１０６８２−１０６９１；Ｍｙｅｒｓ，Ａ．Ｇ．，Ｓｉｕ，Ｍ．，ａｎｄ Ｒｅｎ，Ｆ．（２００２）．Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ（−）−ｔｅｒｐｅｓｔａｃｉｎ ａｎｄ（−）−ｆｕｓａｐｒｏｌｉｆｅｒｉｎ：ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎａｌ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｓ ａ ｈｏｍｏｃｈｉｒａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｅｒｉｅｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４，４２３０−４２３２；Ｏｋａ，Ｍ．，Ｉｉｍｕｒａ，Ｓ．， Ｔｅｎｍｙｏ，Ｏ．，Ｓａｗａｄａ，Ｙ．，Ｓｕｇａｗａｒａ，Ｍ．，Ｏｈｋｕｓａ，Ｎ．， Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｋａｗａｎｏ，Ｋ．，Ｈｕ，Ｓ．Ｌ．，Ｆｕｋａｇａｗａ，Ｙ．， ａｎｄ Ｏｋｉ，Ｔ．（１９９３）．Ｔｅｒｐｅｓｔａｃｉｎ，ａ ｎｅｗ ｓｙｎｃｙｔｉｕｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｒｏｍ Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４６，３６７−３７３）。
【０００８】
ミトコンドリア複合体IIIは、１１個のタンパク質サブユニットで構成されている。複合体の必須な成分、例えば、サイトクロームｂ、サイトクロームｃ１、Ｒｉｅｓｋｅ鉄−硫黄タンパク質及びユビキノンは、機能的によく研究されている（Ｃｒｏｆｔｓ，Ａ．Ｒ．，ａｎｄ Ｂｅｒｒｙ，Ｅ．Ａ．（１９９８）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂｃ１ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ａｎｄ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．８，５０１−５０９；Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｌ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｙａｎ，Ｊ．，Ｋｕｒｉｓｕ，Ｇ．，ａｎｄ Ｃｒａｍｅｒ，Ｗ．Ａ．（２００４）．Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂｃ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ：ａ ｃｏｍｍｏｎ ｃｏｒｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｕｒｒｏｕｎｄｅｄ ｂｙ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｏｕｔｌｙｉｎｇ ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１４，４３２−４３９）。
【０００９】
また、特異的抑制剤、例えば、アンチマイシンＡ、スティグマテリン及びミソチアゾールは、複合体IIIの機能研究に広く利用されている（Ｘｉａ，Ｄ．，Ｙｕ，Ｃ．Ａ．，Ｋｉｍ，Ｈ．，Ｘｉａ，Ｊ．Ｚ．，Ｋａｃｈｕｒｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｙｕ，Ｌ．，ａｎｄ Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．（１９９７）．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂｃ１ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｈｅａｒｔ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７，６０−６６；Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｓｈｕｌｍｅｉｓｔｅｒ，Ｖ．Ｍ．，Ｃｈｉ，Ｙ．Ｉ．，Ｋｉｍ，Ｋ．Ｋ．，Ｈｕｎｇ，Ｌ．Ｗ．，Ｃｒｏｆｔｓ，Ａ．Ｒ．，Ｂｅｒｒｙ，Ｅ．Ａ．，ａｎｄ Ｋｉｍ，Ｓ．Ｈ．（１９９８）．Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｙ ｄｏｍａｉｎ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂｃ１．Ｎａｔｕｒｅ ３９２，６７７−６８４）。
【００１０】
しかし、前記化合物は、電子運搬を抑制し、酸化性燐酸化を無くし、細胞死滅を誘導するために、腫瘍血管新生の抑制剤として適していない。したがって、ＡＴＰ生成を破砕せずとも、複合体IIIの酸素感知機能を無くす新規の化合物に対する要求が台頭され、これは低酸素症に対する適応性反応（例えば、血管成長因子の発現）の抑制に関心を置いている癌生物学者に特に関心があるものである。
【００１１】
本明細書全体に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照に挿入されて本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ａｎｄｒｅｙｅｖ，Ａ．Ｙ．，Ｋｕｓｈｎａｒｅｖａ，Ｙ．Ｅ．，ａｎｄ Ｓｔａｒｋｏｖ，Ａ．Ａ．（２００５）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ．）７０，２００−２１４
【非特許文献２】Ｍａｕｌｉｋ，Ｎ．，ａｎｄ Ｄａｓ，Ｄ．Ｋ．（２００２）．Ｒｅｄｏｘ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３３，１０４７−１０６０
【非特許文献３】Ｃｈａｎｄｅｌ，Ｎ．Ｓ．，Ｍａｌｔｅｐｅ，Ｅ．，Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ，Ｅ．，Ｍａｔｈｉｅｕ，Ｃ．Ｅ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｃ．，ａｎｄ Ｓｃｈｕｍａｃｋｅｒ，Ｐ．Ｔ．（１９９８）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｔｒｉｇｇｅｒ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，１１７１５−１１７２０
【非特許文献４】Ｂｒｕｎｅｌｌｅ，Ｊ．Ｋ．，Ｂｅｌｌ，Ｅ．Ｌ．，Ｑｕｅｓａｄａ，Ｎ．Ｍ．，Ｖｅｒｃａｕｔｅｒｅｎ，Ｋ．，Ｔｉｒａｎｔｉ，Ｖ．，Ｚｅｖｉａｎｉ，Ｍ．，Ｓｃａｒｐｕｌｌａ，Ｒ．Ｃ．，ａｎｄ Ｃｈａｎｄｅｌ，Ｎ．Ｓ．（２００５）．Ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＲＯＳ ｂｕｔ ｎｏｔ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１，４０９−４１４
【非特許文献５】Ｃｈａｎｄｅｌ，Ｎ．Ｓ．，ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ，Ｄ．Ｓ．，Ｆｅｌｉｃｉａｎｏ，Ｃ．Ｅ．，Ｗｏｏｄ，Ｔ．Ｍ．，Ｍｅｌｅｎｄｅｚ，Ｊ．Ａ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄＳｃｈｕｍａｃｋｅｒ，Ｐ．Ｔ．（２０００）．Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ａｔ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｃｏｍｐｌｅｘ ＩＩＩ ｓｔａｂｉｌｉｚｅ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−１ ｄｕｒｉｎｇ ｈｙｐｏｘｉａ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，２５１３０−２５１３８
【非特許文献６】Ｇｕｚｙ，Ｒ．Ｄ．，Ｈｏｙｏｓ，Ｂ．，Ｒｏｂｉｎ，Ｅ．，Ｃｈｅｎ，Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｌ．，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｋ．Ｄ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，Ｕ．，ａｎｄ Ｓｃｈｕｍａｃｋｅｒ，Ｐ．Ｔ．（２００５）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｃｏｍｐｌｅｘ ＩＩＩ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＲＯＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１，４０１−４０８
【非特許文献７】Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｋ．Ｄ．，Ｇｕｚｙ，Ｒ．Ｄ．，Ｐａｎ，Ｙ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ｍ．，Ｃａｓｈ，Ｔ．Ｐ．，Ｓｃｈｕｍａｃｋｅｒ，Ｐ．Ｔ．，ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｃ．（２００５）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｆｒｏｍ ｌｏｓｓ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｉｍｐａｉｒｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ ｈｙｐｏｘｉｃ ＨＩＦ−ａｌｐｈａ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１，３９３−３９９
【非特許文献８】Ｋｗｏｎ，Ｈ．Ｊ．（２００３）．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ｂａｓｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔｓ．Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１０，７１７−７２６
【非特許文献９】Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｆａｒｍｅｒ，Ｊ．Ｄ．Ｊｒ．，Ｌａｎｅ，Ｗ．Ｓ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．，ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．（１９９１）．Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ｉｓ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ−ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ ａｎｄ ＦＫＢＰ−ＦＫ５０６ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｃｅｌｌ ６６，８０７−８１５
【非特許文献１０】Ｊｕｎｇ，Ｈ．Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｈ．Ｂ．，Ｋｉｍ，Ｃ．Ｊ．，Ｒｈｏ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｈｉｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｋｗｏｎ，Ｈ．Ｊ．（２００３）．Ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｅｒｐｅｓｔａｃｉｎ，ａ ｂｉｃｙｃｌｏ ｓｅｓｔｅｒｔｅｒｐｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｅｍｂｅｌｌｉｓｉａ ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ５６，４９２−４９６
【非特許文献１１】Ｃｈａｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｊａｍｉｓｏｎ，Ｔ．Ｆ．（２００４）．Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ（−）−ｔｅｒｐｅｓｔａｃｉｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｓｉｃｃａｎｏｌ ｕｓｉｎｇ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６，１０６８２−１０６９１
【非特許文献１２】Ｍｙｅｒｓ，Ａ．Ｇ．，Ｓｉｕ，Ｍ．，ａｎｄ Ｒｅｎ，Ｆ．（２００２）．Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ（−）−ｔｅｒｐｅｓｔａｃｉｎ ａｎｄ（−）−ｆｕｓａｐｒｏｌｉｆｅｒｉｎ：ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎａｌ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｓ ａ ｈｏｍｏｃｈｉｒａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｅｒｉｅｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４，４２３０−４２３２
【非特許文献１３】Ｏｋａ，Ｍ．，Ｉｉｍｕｒａ，Ｓ．， Ｔｅｎｍｙｏ，Ｏ．，Ｓａｗａｄａ，Ｙ．，Ｓｕｇａｗａｒａ，Ｍ．，Ｏｈｋｕｓａ，Ｎ．， Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｋａｗａｎｏ，Ｋ．，Ｈｕ，Ｓ．Ｌ．，Ｆｕｋａｇａｗａ，Ｙ．， ａｎｄ Ｏｋｉ，Ｔ．（１９９３）．Ｔｅｒｐｅｓｔａｃｉｎ，ａ ｎｅｗ ｓｙｎｃｙｔｉｕｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｒｏｍ Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４６，３６７−３７３
【非特許文献１４】Ｃｒｏｆｔｓ，Ａ．Ｒ．，ａｎｄ Ｂｅｒｒｙ，Ｅ．Ａ．（１９９８）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂｃ１ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ａｎｄ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．８，５０１−５０９
【非特許文献１５】Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｌ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｙａｎ，Ｊ．，Ｋｕｒｉｓｕ，Ｇ．，ａｎｄ Ｃｒａｍｅｒ，Ｗ．Ａ．（２００４）．Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂｃ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ：ａ ｃｏｍｍｏｎ ｃｏｒｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｕｒｒｏｕｎｄｅｄ ｂｙ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｏｕｔｌｙｉｎｇ ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１４，４３２−４３９
【非特許文献１６】Ｘｉａ，Ｄ．，Ｙｕ，Ｃ．Ａ．，Ｋｉｍ，Ｈ．，Ｘｉａ，Ｊ．Ｚ．，Ｋａｃｈｕｒｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｙｕ，Ｌ．，ａｎｄ Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．（１９９７）．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂｃ１ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｈｅａｒｔ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７，６０−６６
【非特許文献１７】Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｓｈｕｌｍｅｉｓｔｅｒ，Ｖ．Ｍ．，Ｃｈｉ，Ｙ．Ｉ．，Ｋｉｍ，Ｋ．Ｋ．，Ｈｕｎｇ，Ｌ．Ｗ．，Ｃｒｏｆｔｓ，Ａ．Ｒ．，Ｂｅｒｒｙ，Ｅ．Ａ．，ａｎｄ Ｋｉｍ，Ｓ．Ｈ．（１９９８）．Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｙ ｄｏｍａｉｎ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂｃ１．Ｎａｔｕｒｅ ３９２，６７７−６８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者は、効果的な抗血管新生剤を開発しようと努力した。その結果、血管新生に対する新たな分子ターゲットであるミトコンドリア複合体IIIのユビキノン−結合タンパク質（ＱＰ−Ｃ）をターゲットにする新規の抗血管新生剤を掘り出し、この抗血管新生剤はＱＰ−Ｃに結合して、血管新生を効果的に遮断することを確認することによって、本発明を完成した。
【００１４】
したがって、本発明の目的は、薬剤学的血管新生抑制用の組成物を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の様相によれば、本発明は、（ａ）下記化学式１の化合物の薬剤学的有効量と、（ｂ）薬剤学的に許容される担体と、を含む薬剤学的血管新生抑制用の組成物を提供する：
【００１７】
【化１】
【００１８】
前記化学式で、Ｒ１〜Ｒ１２は、互いに独立的に水素、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、アミノ、ニトロ、ニトロソ、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ７シクロアルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールアルケニルまたはアルキルアリールであり、Ｒ１３は、水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、Ｘは、酸素または硫黄である。
【００１９】
本発明者は、効果的な抗血管新生剤を開発しようと努力した。その結果、血管新生に対する新たな分子ターゲットであるミトコンドリア複合体IIIのユビキノン−結合タンパク質（ＱＰ−Ｃ）をターゲットにする新規の抗血管新生剤を掘り出し、この抗血管新生剤はＱＰ−Ｃに結合して、血管新生を効果的に遮断することを確認した。
【００２０】
本発明の組成物は、“薬剤学的血管新生抑制用の組成物”と表現され、これは“血管新生−関連疾患の予防または治療用の薬剤学的組成物”または“非調節血管新生−関連疾患の予防または治療用の薬剤学的組成物”と表現されることもできる。
【００２１】
本発明の薬剤学的組成物で有効成分として利用される化合物は、化学式１に表示される。本発明の化合物は、基本的にナフタレン及びナフトチオフェン構造を有し、ジオキシスルホニル基を有する。
【００２２】
本発明の化合物を定義する化学式１で、用語“ハロ”は、ハロゲン族元素を表わし、例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを含む。用語“Ｃ１〜Ｃ１２アルキル”は、炭素数１〜１２の直鎖状または分枝鎖状飽和炭化水素基を意味し、望ましくは、“Ｃ１〜Ｃ４直鎖状または分枝鎖状アルキル”であり、これは低価アルキルとしてメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、イソブチル、ｎ−ブチルを及びｔ−ブチルを含む。用語“アルケニル基”は、指定された炭素数を有する直鎖状または分枝鎖状不飽和炭化水素基を表わし、望ましくは、Ｃ２〜Ｃ６直鎖状または分枝鎖状アルケニルであり、これは最小一つの二重結合を有する炭素数２〜６の炭化水素基であって、例えば、エテニル、プロぺニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、ｔ−ブテニル、ｎ−ペンテニル及びｎ−ヘキセニルを含む。
【００２３】
用語“シクロアルキル”は、指定された炭素数を有するサイクリック炭化水素ラジカルを意味し、望ましくは、“Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル”であり、これはシクロプロピル、シクロブチル及びシクロペンチルを含む。用語“シクロアルケニル”は、指定された炭素数を有し、最小一つの二重結合を有するサイクリック炭化水素基を意味し、望ましくは、“Ｃ５〜Ｃ７シクロアルケニル”であり、これはシクロペンテン、シクロヘキセン及びシクロヘキサジエンを含む。用語“アルキルアミノ”は、アミノ置換体を有するアルキル基を意味する。用語“アルコキシ”は、−Ｏアルキル基を意味する。
【００２４】
用語“アリール”は、全体的にまたは部分的に不飽和された置換または非置換のモノサイクリックまたはポリサイクリック炭素環を意味し、望ましくは、モノアリールまたは非アリールである。モノアリールは、炭素数５〜６を有することが望ましく、非アリールは、炭素数９〜１０を有することが望ましい。最も望ましくは、前記アリールは、置換または非置換のフェニルである。モノアリール、例えば、フェニルが置換される場合には、多様な位置から多様な置換体によって置換がなされうるが、望ましくは、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、Ｃ１〜Ｃ４置換または非置換の直鎖状または分枝鎖状アルキル、Ｃ１〜Ｃ４直鎖状または分枝鎖状アルコキシ、アルキル置換スルファニル、フェノキシ、Ｃ３〜Ｃ６シクロヘテロアルキルまたは置換または非置換アミノ基によって置換される。
【００２５】
用語“ヘテロアリール”は、芳香族ヘテロ環基であって、ヘテロ原子としてＮ、ＯまたはＳを含むものである。望ましくは、ヘテロアリールは、ヘテロ原子としてＮを含むヘテロビアリールである。
【００２６】
用語“アリールアルキル（アラルキル）”は、一つまたはそれ以上のアルキル基による構造に結合されたアリール基を意味し、望ましくは、ベンジル基である。用語“アルキルアリール”は、一つまたはそれ以上のアリール基からなる構造に結合されたアルキル基を意味する。用語“アリールアルケニル”は、一つまたはそれ以上のアルキル基による構造に結合されたアリール基を意味し、望ましくは、フェニルエテニル基である。
【００２７】
本発明の望ましい化合物によれば、前記Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、より望ましくは、ヒドロキシまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、最も望ましくは、ヒドロキシである。
【００２８】
本発明の望ましい具現例によれば、前記Ｒ２〜Ｒ１２は、互いに独立的に水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、より望ましくは、互いに独立的に水素、ヒドロキシまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、最も望ましくは、水素である。
【００２９】
本発明の望ましい具現例によれば、前記Ｒ１３は、水素またはヒドロキシであり、より望ましくは、水素である。
【００３０】
前記化学式１で、Ｘ位置には酸素または硫黄原子が位置することができ、最も望ましくは、酸素原子が位置する。
【００３１】
本発明の最も望ましい具現例によれば、化学式１の化合物で、Ｒ１は、ヒドロキシであり、Ｒ２〜Ｒ１２は、水素であり、Ｒ１３は、水素であり、Ｘは、酸素である。前記定義された化合物は、ＨＤＮＴ［６−（（１−ｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｈｔｈａｌｅｎ−４−ｙｌａｍｉｎｏ）ｄｉｏｘｙｓｕｌｆｏｎｅ）−２Ｈ−ｎａｐｈｔｈｏ［１，８−ｂｃ］ｔｈｉｏｐｈｅｎ−２−ｏｎｅ］である。
【００３２】
本発明の薬剤学的組成物によって予防または治療可能な疾病、疾患または状態は、血管新生と関連した多様な疾患を含む。望ましくは、本発明の組成物によって予防または治療可能な疾患は、癌、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性(age related macular degeneration: AMD)、角膜移植拒否、新生血管緑内障、紅色症、増殖性網膜症、乾癬、血友病性関節、アテローム性動脈硬化プラーク内での毛細血管増殖、ケロイド、傷顆粒化、血管接着、リューマチ関節炎、骨関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再発狭窄症、アテローム性動脈硬化、腸管接着、キャットスクラッチ疾患、潰瘍、肝経病症、糸球体腎炎、糖尿病性腎臓病症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症、器官移植拒否、腎糸球体病症、糖尿病、炎症または神経退行性疾患である。
【００３３】
本発明の組成物によって予防または治療可能な自己免疫疾患は、アロペシアグリエッタ（ａｌｏｐｅｃｉａ ｇｒｅａｔａ）、強直性脊椎炎、抗リン脂質症侯群、自己免疫アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫卵巣炎及び睾丸炎、自己免疫血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋病症、腹腔スプルー皮膚炎（ｃｅｌｉａｃ ｓｐｒｕｅ−ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、慢性疲労異常症侯群、慢性炎症性脱髄巣多発性神経病症、Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓ症侯群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症侯群、寒冷凝集素疾患、クローン病、円板性狼瘡、本態性複合寒冷グロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、糸球体腎炎、グレイブス疾患、ギランバレー症侯群、ハシモト甲状腺炎、特発性肺線維化症、特發性血小板減少性紫斑症、ＩｇＡ神経炎、若年性関節炎、扁平苔癬、紅斑性ループス、メニエール病、混合性連結組職疾患、多発性硬化症、タイプＩまたは免疫−媒介糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発軟骨炎、自己免疫性多腺症侯群、リューマチ多発性筋痛、多発性筋炎と皮膚筋炎、一次性無ガンマグロブリン血症、一次性痰症性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症侯群、リューマチ関節炎、サルコイド症、鞏皮症、スティッフマン症候群、全身性紅斑性ループス、紅斑性ループス、タカヤス動脈炎、一時的動脈炎、巨大細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、葡萄膜炎、白板症及びウェゲナー肉芽腫症を含むが、これに限定されるものではない。
【００３４】
本発明の組成物によって予防または治療可能な炎症性疾患の例は、喘息、脳炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、炎症性膓炎、慢性閉鎖性肺疾患、アレルギー、肺血病性ショック症、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節病症、関節炎、炎症性骨溶解、及び慢性ウイルスまたはバクテリア感染による慢性炎症を含むが、これに限定されるものではない。
【００３５】
より望ましくは、本発明の薬剤学的組成物によって予防または治療可能な疾患は、癌または糖尿病性網膜症または加齢黄斑変性(age related macular degeneration: AMD)である。
【００３６】
本明細書で、用語“薬剤学的有効量”は、前記化学式１の化合物の効能または活性を果たすのに十分な量を意味する。
【００３７】
本発明の組成物が薬剤学的組成物として製造される場合、本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体を含む。本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、燐酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、珪酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。
【００３８】
本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含みうる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳しく記載している。
【００３９】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口投与することができ、非経口投与である場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与、粘膜投与及び点眼投与などで投与することができる。
【００４０】
本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって多様に処方可能である。望ましくは、本発明の薬剤学的組成物の投与量は、成人基準に０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）である。
【００４１】
本発明の薬剤学的組成物は、当業者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することで単位容量形態に製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造可能である。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液形態であるか、エクストラクト剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であることもでき、分散剤または安定化剤をさらに含みうる。
【００４２】
本発明の薬剤学的組成物は、ＱＰ−Ｃの生物学的機能を遮断することでＡＴＰ生成を破砕せずとも、ミトコンドリア複合体IIIの酸素感知機能を抑制することによって、効果的にそして人体に安全な方式で血管新生を抑制することによって、多様な血管新生−関連疾患または疾病の予防または治療に利用される。
【発明の効果】
【００４３】
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（i）本発明の薬剤学的組成物で有効成分として利用される化合物は、ＱＰ−Ｃに結合して血管新生を効果的に抑制する。
【００４４】
（ii）本発明の薬剤学的組成物は、血管新生−関連疾病または疾患の予防または治療に効果的に利用される。
【００４５】
（iii）本発明の薬剤学的組成物で有効成分として利用される化合物は、ＱＰ−Ｃに特異的に結合してＱＰ−Ｃの生物学的機能を抑制するために、細胞死滅を誘導せずに血管新生反応（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）を抑制し、これは薬物の安全性を大きく改善する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージで、人間ＱＰ−Ｃのファージコーディング配列を表わす。灰色ボックスが人間ＱＰ−Ｃのファージコーディング配列（８２ａａ）である。
【図２】ＱＰ−Ｃタンパク質の発現及び錠剤結果を示すタンパク質電気泳動結果の写真である。最も左側レーンは、サイズマーカーであり、１〜４レーンは、それぞれ錠剤したＱＰ−Ｃタンパク質（１〜２レーン：ＧＳＴ＋ＱＰ−Ｃ、３〜４レーン：ＱＰ−Ｃ）をローディングしたものである。
【図３】ＨＤＮＴに対する血管内皮細胞の管形成分析結果を示す写真である。濃度−依存的にＨＤＮＴは、ＨＵＶＥＣｓの管形成を抑制するということが分かる。
【図４】ＨＤＮＴに対する血管内皮細胞の侵入分析結果を示す写真である。濃度−依存的にＨＤＮＴは、ＨＵＶＥＣｓの侵入を抑制するということが分かる。
【図５】ＨＤＮＴによるミトコンドリア膜電位変化を蛍光顕微鏡で観察した結果である。ＨＤＮＴが、濃度−依存的にミトコンドリア膜電位を破壊するということが分かる。
【図６】ＨＤＮＴに対するファージディスプレイによる競争結合分析結果である。ＱＰ−Ｃ発現バクテリオファージの結合において、ＨＤＮＴがテルペスタシンと競争するか否かを分析した。ＨＤＮＴは、ビオチン−テルペスタシンとＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージとの間の結合を効果的に阻害した。このような結果は、ＨＤＮＴがＱＰ−Ｃタンパク質に結合するということを表わす。
【図７】ＨＤＮＴに対する蛍光染色による競争結合分析結果である。ＨＤＮＴは、クマリン−テルペスタシンとＱＰ−Ｃとの間の結合を効果的に阻害した。
【図８】ＨＤＮＴに対する表面プラズモン共鳴による競争結合分析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者に自明である。
【実施例】
【００４８】
〔実験材料及び実験方法〕
[実験材料]
テルペスタシンは、真菌類、Ｅｍｂｅｌｌｉｓｉａ ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａの抽出物から錠剤した（Ｊｕｎｇ，Ｈ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｅｒｐｅｓｔａｃｉｎ，ａ ｂｉｃｙｃｌｏ ｓｅｓｔｅｒｔｅｒｐｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｅｍｂｅｌｌｉｓｉａ ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ５６：４９２−４９６（２００３））。
ＨＤＮＴ［６−（（１−ｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｈｔｈａｌｅｎ−４−ｙｌａｍｉｎｏ）ｄｉｏｘｙｓｕｌｆｏｎｅ）−２Ｈ−ｎａｐｈｔｈｏ［１，８−ｂｃ］ｔｈｉｏｐｈｅｎ−２−ｏｎｅ］は、Ｓｐｅｃｓで購入した。
【００４９】
＜テルペスタシンに対する分子プローブの合成＞
（１）ビオチン化テルペスタシン。
ＥＤＣ（１−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−３−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、１．５ｍｇ、０．００７８ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＤＭＡＰ（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ、１．０ｍｇ、０．００８２ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をテルペスタシン（３．０ｍｇ、０．００７５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に添加し、Ｎ−（＋）−ビオチニル−６−アミノヘキサン酸（２．７ｍｇ、０．００７６ｍｍｏｌ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）ｉｎ ＤＭＳＯ（３ｍｌ）を０℃で添加した。室温で一晩反応させた後、反応結果物をエタノール（１５ｍｌ）で抽出し、錠剤用ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝１０：１）で錠剤して２種のビオチン化テルペスタシン誘導体（Ｃ−２４位置からのヒドロキシル基［ＢＴ１］及びＣ−１７位置からのヒドロキシル基［ＢＴ２］）を得た。収率は７５％であった。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ ｆｏｒ Ｃ４１Ｈ６３Ｎ３Ｏ７Ｓ ｍ／ｚ ７６４．５［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【００５０】
【化２】
【００５１】
【化３】
【００５２】
（２）クマリン−コンジュゲイトテルペスタシン。
ＥＤＣ（１．０ｍｇ、０．００５２ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．６４ｍｇ、０．００５２ｍｍｏｌ）をテルペスタシン（２．０ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ−６−アミノヘキサン酸（１．２ｍｇ、０．００５２ｍｍｏｌ）ｉｎ ＤＭＦ（２ｍｌ）の撹拌された溶液に０℃で添加した。室温で一晩反応させた後、反応産物をエタノール（４ｍｌｘ３）で抽出し、２０％ ＴＦＡ ｉｎ ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍｌ）で処理した後、室温で２時間撹拌した。ＤＩＰＥＡ（１．３ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）及び６−（（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセチル）アミノ）ヘキサン酸サクシニミジルエステル（２．２ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を０℃で添加した。室温で４時間撹拌した後、反応産物をエタノール（２０ｍｌ）で抽出し、錠剤用ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝１０：１）で錠剤してクマリン−コンジュゲイトテルペスタシンを６１％収率で得た。合成されたクマリン−コンジュゲイトテルペスタシンは、化学式４に記載している。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ ｆｏｒ Ｃ４９Ｈ７１Ｎ３Ｏ９ ｍ／ｚ ８６８．５［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【００５３】
【化４】
【００５４】
＜ＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージの製造＞
５種の他の人間組職（肝癌、正常肝、痴呆脳、正常脳及び正常胃）から得られたｃＤＮＡライブラリーをコーディングしているＴ７バクテリオファージ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を確保した後、宿主細胞である Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬＴ５６１５に感染させて増幅した。ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶解したビオチン化テルペスタシン（５μＭ）をストレプトアビジンがコーティングされた９６−ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上に固定化した後、前記増幅されたＴ７バクテリオファージライブラリー（６ｘ１０９ｐｆｕ／ｍｌ）をテルペスタシン固定ウェルに添加した。室温で１時間撹拌した後、テルペスタシンと結合していないＴ７バクテリオファージ粒子をＴＢＳ緩衝液で洗浄して除去し、テルペスタシンと結合したＴ７バクテリオファージ粒子は、ＴＢＳ緩衝液で溶解したテルペスタシン（１００μＭ）を添加して１時間溶出させた。前記溶出されたＴ７バクテリオファージをＬＢ寒天培地に培養されたＢＬＴ５６１５に感染させ、形成されたＴ７バクテリオファージプラーク（ｐｌａｑｕｅ）をそれぞれ分離してＤＮＡ塩基配列を分析することによって、ミトコンドリア複合体IIIのユビキノン−結合タンパク質（ＱＰ−Ｃ）を発現するＴ７バクテリオファージを獲得した。人間ＱＰ−Ｃのファージコーディング配列は、図１に記載している。
【００５５】
＜人間ＱＰ−Ｃタンパク質のクローニング、発現及び錠剤＞
肝組職ｃＤＮＡライブラリーを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として用いてＱＰ−Ｃ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿００６２９４）を重合酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を通じて増幅した。使われたプライマーの配列は、次の通りである：前方向プライマー５’−ＡＴＧＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＡＡＧＣＡＧＧＣＣ−３’、逆方向プライマー５’−ＡＴＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＣＣＡＴＴＣＴＴＣ−３’。
【００５６】
前記遺伝子をｐＧＥＸ−４Ｔ１ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のマルチクローニングサイト（ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ ｓｉｔｅ）に挿入し、タンパク質発現のために Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１に形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）した。前記形質転換バクテリアのＬＢ培養液（ＯＤ６００＝０．６）にＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加して３７℃で４時間振動培養した後、超音波破砕機を使って細胞内に誘導発現されたＧＳＴ／ＱＰ−Ｃ融合タンパク質を溶出し、グルタチオンアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）を添加して前記融合タンパク質のみを錠剤した。融合タンパク質のＧＳＴ部分を除去するため、トロンビン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を添加して室温で一晩撹拌した後、遠心分離によってＱＰ−Ｃタンパク質が存在する上澄み液のみを回収した（参照：図２）。
【００５７】
＜血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）阻害活性分析＞
（１．血管内皮細胞の管形成（ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）分析）
４８−ウェルプレートに１５０ｕｌのマトリゲル（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）をコーティングし、３７℃で２時間重合させた。引き続き、血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ、１ｘ１０５細胞／ウェル）を前記マトリゲルに接種し、ＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び本発明の化合物であるＨＤＮＴ（２．５、５μＭ）を添加した。恒温で８時間培養しながら細胞の形態学的変化を顕微鏡下で観察した。管形成血管内皮細胞の細胞毒性は、トリパンブルー染色で評価した（参照：図３）。
【００５８】
（２．血管内皮細胞の侵入（ｉｎｖａｓｉｏｎ）分析）
血管内皮細胞の侵入は、ポリカーボネートフィルター（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ ｆｉｌｔｅｒ）があるトランスウェルチャンバ（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）システムを用いてインビトロで測定した。まず、前記フィルターの下部を１０ｕｌゼラチン（１０ｍｇ／ｍｌ）で１時間コーティングし、フィルターの上部を１０ｕｌマトリゲル（３ｍｇ／ｍｌ）で２時間コーティングした。引き続き、トランスウェルに６００ｕｌ ＥＢＭ−２培地を入れた後、ＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）及び本発明の化合物であるＨＤＮＴ（２．５、５μＭ）を添加した。コーティングされたフィルターを前記トランスウェル上に載せ、フィルターの上部に血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ、１ｘ１０５細胞／ウェル）を接種して恒温で１８時間培養した。その後、７０％メタノールで細胞を固定させてヘマトキシリン／エオシンで染色した後、顕微鏡下で一つのフィルター内の全体細胞を係数することで細胞侵入程度を決定した（参照：図４）。
【００５９】
＜ミトコンドリア機能調節活性分析＞
（１．ミトコンドリア膜電位 （ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）の測定）
血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）を２４−ウェルプレート（２ｘ１０４細胞／ウェル）上に分周し、１０％牛胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれたＥＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ）培地で培養した。引き続き、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を使って細胞を洗浄した後、新鮮な同一培地に交換した。
【００６０】
本発明の化合物であるＨＤＮＴ（１、５、１０μＭ）を添加して４時間恒温培養した後、ミトコンドリア膜電位の変化を測定するために、親油性陽イオンプローブである５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’、３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾール−カルボシアニンヨウ化物（ＪＣ−１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）０．２５ｕｇ／ｍｌで１５分間染色させた。過分極の膜電位（ｔｏ−１４０ｍＶ）で、前記染色剤は赤色蛍光Ｊ−凝集体を形成し、脱分極の膜電位（ｔｏ−１００ｍＶ）で、前記染色剤は緑色蛍光モノ模型を保持する。前記染色された細胞をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。イメージをＩＸ７０蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で１００倍の倍率で得た（参照：図５）。
【００６１】
（２．ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）による競争結合分析）
ＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージを宿主細胞である Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬＴ５６１５に感染させて増幅した。
【００６２】
本発明の化合物であるＨＤＮＴ（２００μＭ）及びＱＰ−Ｃと結合する化合物であるテルペスタシン（２００μＭ）を前記増幅されたＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージ培養液（６ｘ１０９ ｐｆｕ／ｍｌ）にそれぞれ添加した後、室温で１時間撹拌した。ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶解したビオチンとビオチン化テルペスタシン（５μＭ）とをストレプトアビジンがコーティングされた９６−ウェルプレート上にそれぞれ固定化した後、前記ＱＰ−Ｃファージと化合物の反応混合溶液とをビオチン化テルペスタシンが固定されたウェルに添加した。室温で１時間撹拌した後、ビオチン化テルペスタシンと結合していないＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージ粒子とをＴＢＳ緩衝液で３回反復洗浄して除去した。ビオチン化テルペスタシンと結合したＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージ粒子は、ＴＢＳ緩衝液に溶解されたテルペスタシン（１００μＭ）を添加して１時間溶出させた。前記溶出されたＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージ粒子をＬＢ寒天培地に培養された ＢＬＴ５６１５に感染させ、形成されたバクテリオファージプラークの数を数えて処理区と対照区との間を比較分析した（参照：図６）。
【００６３】
（３．蛍光染色（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）による競争結合分析）
血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）を２４−ウェルプレート（２ｘ１０４細胞／ウェル）上に分周し、１０％牛胎児血清が含まれたＥＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ）培地で培養した。引き続き、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を使って細胞を洗浄した後、新鮮な同一培地に交換した。
各ウェルに本発明の化合物であるＨＤＮＴ（１０μＭ）またはＱＰ−Ｃと結合するテルペスタシン（３０μＭ）を添加して２４時間恒温培養し、蛍光誘導体であるクマリン（２０μＭ）とクマリン−コンジュゲイトされたテルペスタシン（２０μＭ）とを対照群及び処理群に添加して２時間さらに培養した。ＰＢＳ緩衝液で細胞を洗浄した後、ＩＸ７０蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）下で蛍光の強さを観察し、写真撮影した（参照：図７）。
【００６４】
（４．表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）による競争結合分析）
ビオチンまたはビオチン化テルペスタシン（１００μＭ）をストレプトアビジンがコーティングされたセンサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ）の各フローセルに順次に固定化した。本発明の化合物であるＨＤＮＴ（２５μＭ）またはＱＰ−Ｃと結合する化合物テルペスタシン（２５μＭ）を錠剤したＱＰ−Ｃタンパク質（２５μＭ）のＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ）にそれぞれ添加した後、前記センサーチップの表面上に１分当たり３０ｕｌの流速で注入した。
【００６５】
結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）及び解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）曲線を含んだ結合センサーグラム（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）は、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００を通じて得られ、センサーチップ表面は、５０ｍＭ ＮａＯＨ（５ｕｌ）を注入して再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）させた。この際、結合センサーグラムは、ビオチン化テルペスタシンとＱＰ−Ｃタンパク質との間の結合曲線からビオチンとＱＰ−Ｃタンパク質との間の結合曲線を差し引いて得た。表面プラズモン共鳴反応曲線は、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓソフトウェア、ｖｅｒｓｉｏｎ３．１を用いて分析した（参照：図８）。
【００６６】
[実験結果]
＜血管新生阻害活性分析結果＞
血管新生は、胚芽の発生、傷治療及び組職または器官の再生のような無数の生理的過程で必須である（Ｒｉｓａｕ，Ｗ．１９９４．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ４４：４１６−４１７）。しかし、持続的な非調節性血管新生は、リューマチ関節炎、糖尿性網膜炎、固形腫瘍、血管腫及び乾癬のような血管新生性疾病を誘発させる（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．ａｎｄ Ｒ．Ｋ．Ｊａｉｎ．２０００．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４０７：２４９−２５７）。したがって、新たな抗血管新生化合物は、血管新生と連関した癌及び他の人間疾病の治療剤として開発されることができる。そして、本発明の化合物であるＨＤＮＴが抗血管新生活性を表わすかを確認するため、代表的なインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）血管新生測定方法である血管内皮細胞の管形成及び侵入分析を実施した。
【００６７】
図３と４とで示すように、ＨＤＮＴは、ＶＥＧＦによって誘導されるＨＵＶＥＣｓの管形成及び侵入を濃度依存的に抑制した。さらに、本発明の化合物によって血管新生が抑制された細胞がトリパンブルーによって染色されないと見て、ＨＤＮＴの抗血管新生活性が細胞毒性から招来されるものではないということを示す。このような結果は、ＨＤＮＴが新たな抗血管新生治療剤として開発されることができるということを表わす。
【００６８】
＜ミトコンドリア膜電位の測定結果＞
最近、ミトコンドリア機能異常が、心血管疾患、糖尿病及び痴呆などの慢性退行性疾患だけではなく、癌の発病に重要な原因を提供すると明かされた（３．Ｓｚｅｗｃｚｙｋ，Ａ．ａｎｄ Ｌ．Ｗｏｊｔｃｚａｋ．２００２．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ａｓ ａ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｔａｒｇｅｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５４：１０１〜１２７）。
【００６９】
事前報告によれば、ミトコンドリアの電子伝達系から発生する活性酸素種が、癌の転移と増殖とに必須な血管新生を誘導するものと知られた（Ｇｕｚｙ，Ｒ．Ｄ．，Ｂ．Ｈｏｙｏｓ，Ｅ．Ｒｏｂｉｎ，Ｈ．Ｃｈｅｎ，Ｌ．Ｌｉｕ，Ｋ．Ｄ．Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｃ．Ｓｉｍｏｎ，Ｕ．Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ａｎｄ Ｐ．Ｔ．Ｓｃｈｕｍａｃｋｅｒ．２００５．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｃｏｍｐｌｅｘ ＩＩＩ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＲＯＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１：４０１−４０８）。
【００７０】
そして、本発明の化合物であるＨＤＮＴの抗血管新生活性がミトコンドリア機能調節によるものであるかを確認するため、ＨＤＮＴが血管内皮細胞であるＨＵＶＥＣｓのミトコンドリア膜電位変化に及ぼす影響を分析した。ミトコンドリア膜電位の変化は、親油性陽イオンの蛍光マーカーであるＪＣ−１を使って測定した。ＪＣ−１は、ミトコンドリア膜電位が正常（−１４０ｍＶ）である時、赤色蛍光の複合体を形成する一方、ミトコンドリア膜電位が破壊（−１００ｍＶ）される時、緑色蛍光の単量体を形成する性質を有しいる。
【００７１】
図５で示すように、本発明の化合物であるＨＤＮＴの処理濃度が増加するほど赤色蛍光の強さが弱くなる一方、緑色蛍光の強さが強まると見て、ＨＤＮＴがミトコンドリア膜電位を破壊するということが分かった。このような結果は、ＨＤＮＴがミトコンドリア機能を調節することができるということを表わしている。
【００７２】
＜ファージディスプレイによる競争結合分析結果＞
抗血管新生活性を有する天然物であるテルペスタシンは、ＱＰ−Ｃと結合してミトコンドリアから発生する活性酸素種を抑制する。本発明の化合物であるＨＤＮＴがＱＰ−Ｃと結合してミトコンドリア機能を調節するかを確認するため、ＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージを利用したファージディスプレイ競争結合分析実験を行った。
【００７３】
図６で示すように、ビオチンは、ＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージと結合しない一方、ＱＰ−Ｃと結合する化合物であるビオチン化テルペスタシンは、ＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージと特異的に結合した。しかし、過量のテルペスタシンをＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージと先に反応させた場合、競争結合（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）によって前記ビオチン化テルペスタシンとＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージとの間の結合を大きく阻害した。次いで、本発明の化合物であるＨＤＮＴをＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージと先に反応させた場合も、テルペスタシンと同様にビオチン化テルペスタシンとＱＰ−Ｃ発現Ｔ７バクテリオファージとの間の結合を効果的に阻害した。このような結果は、ＨＤＮＴがＱＰ−Ｃタンパク質に結合するということを表わしている。
【００７４】
＜蛍光染色による競争結合分析結果＞
本発明の化合物であるＨＤＮＴがＱＰ−Ｃと結合することを検証するため、ＱＰ−Ｃと結合する公知された化合物であるテルペスタシンの蛍光誘導体を利用した競争結合分析実験を行った。
【００７５】
図７で示すように、クマリン−テルペスタシンをＨＵＶＥＣｓに処理した結果、クマリン処理とは異なって、ミトコンドリアが存在する細胞質部位で強い青色蛍光を表わした。この際、クマリン−テルペスタシンを細胞に処理する前にテルペスタシンを先に細胞に処理した場合、競争結合によって前記クマルリン−テルペスタシンとミトコンドリアタンパク質であるＱＰ−Ｃとの間の結合が阻害されて、細胞質部位の青色蛍光の強さが大きく弱化された。次いで、本発明の化合物であるＨＤＮＴを細胞に先に処理した場合、テルペスタシン処理と同様に青色蛍光の強さが大きく減少すると見て、ＨＤＮＴがＱＰ−Ｃに結合するということを確認できた。
【００７６】
＜表面プラズモン共鳴による競争結合分析結果＞
本発明の化合物であるＨＤＮＴがＱＰ−Ｃと結合することを再び検証するため、屈折率の変化測定によって生体物質間直接結合をリアルタイムで確認することができる表面プラズモン共鳴技術を用いて競争結合分析実験を行った。ビオチンとビオチン−テルペスタシンとをストレプトアビジンがコーティングされたセンサーチップの各フローセルに順次に固定化した後、テルペスタシンとＱＰ−Ｃタンパク質の反応混合液とを前記センサーチップの表面上に注入した結果、競争結合によってビオチン−テルペスタシンとＱＰ−Ｃタンパク質との間の結合を６０％まで阻害した（図８）。次いで、本発明の化合物であるＨＤＮＴとＱＰ−Ｃタンパク質の反応混合液とをセンサーチップの表面上に注入した場合、テルペスタシンと同様にビオチンテルペスタシンとＱＰ−Ｃタンパク質との間の結合を４０％まで阻害した。このような結果は、ＨＤＮＴがＱＰ−Ｃに直接的に結合するということを検証している。
【００７７】
前述した実験結果によれば、本発明の化合物であるＨＤＮＴは、ミトコンドリアタンパク質であるＱＰ−Ｃを選択的に標的してミトコンドリア機能を調節することによって、癌を含めた血管新生性疾患の治療剤として開発されることができるということが分かる。
【００７８】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したが、当業者において、このような具体的な技術は、単に望ましい具現例であり、これに本発明の範囲が制限されるものではない点は明白である。したがって、本発明の実質的な特許請求の範囲は、請求項とその等価物によって定義される。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明は、血管新生抑制用の薬剤学的組成物に関連する分野に適用されうる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）下記化学式１の化合物の薬剤学的有効量と、
（ｂ）薬剤学的に許容される担体と、を含むことを特徴とする薬剤学的血管新生抑制用の薬剤学的組成物：
【化１】
前記化学式で、
Ｒ１〜Ｒ１２は、互いに独立的に水素、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、アミノ、ニトロ、ニトロソ、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ７シクロアルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールアルケニルまたはアルキルアリールであり、
Ｒ１３は、水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、
Ｘは、酸素または硫黄である。
【請求項２】
前記Ｒ１は、
水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシであることを特徴とする請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３】
前記Ｒ２〜Ｒ１２は、
互いに独立的に水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシであることを特徴とする請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項４】
前記Ｒ１３は、
水素またはヒドロキシであることを特徴とする請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項５】
前記Ｘは、
酸素であることを特徴とする請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項６】
前記Ｒ１は、ヒドロキシであり、
Ｒ２〜Ｒ１２は、水素であり、
Ｒ１３は、水素であり、
Ｘは、酸素であることを特徴とする請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項７】
前記薬剤学的組成物は、癌、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性(age related macular degeneration: AMD)、角膜移植拒否、新生血管緑内障、紅色症、増殖性網膜症、乾癬、血友病性関節、アテローム性動脈硬化プラーク内での毛細血管増殖、ケロイド、傷顆粒化、血管接着、リューマチ関節炎、骨関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再発狭窄症、アテローム性動脈硬化、腸管接着、キャットスクラッチ疾患、潰瘍、肝経病症、糸球体腎炎、糖尿病性腎臓病症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症、器官移植拒否、腎糸球体病症、糖尿病、炎症または神経退行性疾患の非調節性血管新生−関連疾病または疾患の予防または治療に利用されることを特徴とする請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１】
（ａ）下記化学式１の化合物の薬剤学的有効量と、
（ｂ）薬剤学的に許容される担体と、を含むことを特徴とする薬剤学的血管新生抑制用の薬剤学的組成物：
【化１】
前記化学式で、
Ｒ１〜Ｒ１２は、互いに独立的に水素、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、アミノ、ニトロ、ニトロソ、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ７シクロアルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールアルケニルまたはアルキルアリールであり、
Ｒ１３は、水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、
Ｘは、酸素または硫黄である。
【請求項２】
前記Ｒ１は、
水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシであることを特徴とする請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３】
前記Ｒ２〜Ｒ１２は、
互いに独立的に水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシであることを特徴とする請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項４】
前記Ｒ１３は、
水素またはヒドロキシであることを特徴とする請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項５】
前記Ｘは、
酸素であることを特徴とする請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項６】
前記Ｒ１は、ヒドロキシであり、
Ｒ２〜Ｒ１２は、水素であり、
Ｒ１３は、水素であり、
Ｘは、酸素であることを特徴とする請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項７】
前記薬剤学的組成物は、癌、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性(age related macular degeneration: AMD)、角膜移植拒否、新生血管緑内障、紅色症、増殖性網膜症、乾癬、血友病性関節、アテローム性動脈硬化プラーク内での毛細血管増殖、ケロイド、傷顆粒化、血管接着、リューマチ関節炎、骨関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再発狭窄症、アテローム性動脈硬化、腸管接着、キャットスクラッチ疾患、潰瘍、肝経病症、糸球体腎炎、糖尿病性腎臓病症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症、器官移植拒否、腎糸球体病症、糖尿病、炎症または神経退行性疾患の非調節性血管新生−関連疾病または疾患の予防または治療に利用されることを特徴とする請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図８】
【図４】
【図７】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図８】
【図４】
【図７】
【公表番号】特表２０１０−５２２２３２（Ｐ２０１０−５２２２３２Ａ）
【公表日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５００８５３（Ｐ２０１０−５００８５３）
【出願日】平成２１年１月３０日（２００９．１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／０００４５７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１０７９３３
【国際公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【出願人】（５０６２６３４９１）インダストリー−アカデミック コーペレイション ファウンデイション， ヨンセイ ユニバーシティ (18)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月３０日（２００９．１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／０００４５７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１０７９３３
【国際公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【出願人】（５０６２６３４９１）インダストリー−アカデミック コーペレイション ファウンデイション， ヨンセイ ユニバーシティ (18)
【Ｆターム（参考）】
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