表面改質剤、細胞親和性材料、細胞親和性材料の製造方法並びに、骨様移植物及び骨様移植物の製造方法。
【課題】 生体での骨組織に近い生体機能と機械的性質の双方を確保した細胞親和性材料及びこれを用いた骨様移植物を簡便に提供する。
【解決手段】 一般式Ａ−（Ｓｐ）−Ｂ又はＢ−（Ｓｐ）−Ａ−（Ｓｐ）−Ｂで表されるアミド誘導体であって、Ａは、上記Ｓｐ又はＢと結合可能な環を形成していてもよい特定のＮＲ1ＣＯ構造を有するアミド結合含有部であり、Ｓｐは、あってもなくてもよいスペーサ部であり、Ｂは、上記Ｓｐ又はＡと結合可能であると共に極性基を有する基材に対して結合可能な特定構造のシリル基並びに、特定構造のリン酸エステル及びリン酸エステル塩からなる群より選択された少なくとも１つの基材結合部を表す当該アミド誘導体、これからなる表面改質剤と、極性基を有する基材をこの表面改質剤によって表面処理することによる細胞親和性材料。
【解決手段】 一般式Ａ−（Ｓｐ）−Ｂ又はＢ−（Ｓｐ）−Ａ−（Ｓｐ）−Ｂで表されるアミド誘導体であって、Ａは、上記Ｓｐ又はＢと結合可能な環を形成していてもよい特定のＮＲ1ＣＯ構造を有するアミド結合含有部であり、Ｓｐは、あってもなくてもよいスペーサ部であり、Ｂは、上記Ｓｐ又はＡと結合可能であると共に極性基を有する基材に対して結合可能な特定構造のシリル基並びに、特定構造のリン酸エステル及びリン酸エステル塩からなる群より選択された少なくとも１つの基材結合部を表す当該アミド誘導体、これからなる表面改質剤と、極性基を有する基材をこの表面改質剤によって表面処理することによる細胞親和性材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面改質剤、細胞親和性材料及び細胞親和性材料の製造方法並びに、骨様移植物及び骨様移植物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、生体補修用材料等として、金属、プラスチック、ガラス、セラミックス等の非生体由来物質が多用されている。例えば、セラミックスには、人工関節用として焼結アルミナ及び焼結ジルコニアを挙げることができ、人工骨用としてバイオガラス、焼結水酸アパタイト、水酸アパタイト／β−リン酸三カルシウム複合体、β−リン酸三カルシウム及び結晶化ガラスＡ−Ｗ等を挙げることができる。
一方、骨や歯といった硬組織の形成や再生を可能とするような生体活性を有する部材は、硬組織の損傷を受けた際に自己修復の可能性を有するため、実用価値が高い。このような組織の再生能が付与された部材として、生体吸収性部材及び骨形成因子等が担持された部材が開発されている（例えば、特許文献１及び２）
【特許文献１】特開２００３−３２５６５７号公報
【特許文献２】特開２００３−３４２０１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、これまで使用されている人工材料はいずれも、生体骨に近い生体機能と機械的性質の双方を満足できるレベルで確保できるものではない。また、生物活性因子等を結合した部材では、複雑な工程を経て生物活性因子を部材に結合させる必要がある。
従って、本発明の目的は、生体での骨組織に近い生体機能と機械的性質の双方を確保した細胞親和性材料及びこれを用いた骨様移植物を簡便に提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明のアミド誘導体又はその縮合物は、一般式Ａ−（Ｓｐ）−Ｂ又はＢ−（Ｓｐ）−Ａ−（Ｓｐ）−Ｂで表されるアミド誘導体である。
ここでＡは、上記Ｓｐ又はＢと結合可能な環を形成していてもよい下記一般式（Ｉ）で表されるＮＲ1ＣＯ構造を有するアミド結合含有部であり、
【０００５】
【化１】
【０００６】
（式中Ｒ1は、Ｈ又は炭素数１〜１０アルキル基又はアルケニル基、フェニル基、アルキルフェニル基、ピリジル基を表し、ｎ1は、１〜２０の整数を表す。）
ここでＳｐは、あってもなくてもよいスペーサ部であり、存在する場合には、炭素数１〜１０のアルキレン基、アルケニレン基、フェニレン基、炭素数１〜５のアルキル基若しくはアルケニル基又はハロゲンを置換基として有するフェニレン基を表し、
ここでＢは、上記Ｓｐ又はＡと結合可能であると共に極性基を有する基材に対して結合可能な下記一般式（II）で表されるシリル基並びに、一般式（III）で表されるリン酸エステル及びリン酸エステル塩からなる群より選択された少なくとも１つの基材結合部を表し、Ｂが複数存在する場合には互いに同一でも異なってもよい。
【０００７】
【化２】
【０００８】
（式中、Ｙ1、Ｙ2及びＹ3はそれぞれ独立に、−Ｒ2、−ＯＲ3、−ＯＣＯＲ4、−ＮＣＯ及びハロゲンからなる群から選択されたものを表し、互いに同一であっても異なってもよく、ここでＲ2は、炭素数１〜３のアルキル基若しくはアルケニル基、フェニル基を表し、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ、炭素数１〜５のアルキル基若しくはアルケニル基を表す。）
【０００９】
【化３】
【００１０】
（式中、Ｚ1及びＺ2はそれぞれ独立に、ＯＨ、ＯＱ、フェニル基又はフェノキシ基を表し、互いに同一であっても異なってもよく、ここでＱは、アルカリ金属若しくはＮＨ4を表す。）
【００１１】
また、本発明の表面改質剤は、上記アミド誘導体又はその縮合物を含むものである。
本発明の生体親和性材料は、上記アミド誘導体又はその縮合物で表面処理された有機又は無機基材を含むものである。
ここで、前記有機又は無機基材が、ハイドロキシアパタイト、ガラス、金属、プラスチック及びセラミックスからなる群より選択された少なくとも１つであることが好ましい。
【００１２】
本発明の細胞親和性材料の製造方法は、表面に極性基を有する基材を、上記表面改質剤によって表面処理することを含むものである。
更に本発明の細胞親和性材料の製造方法は、表面に極性基を有する基材を、上記表面改質剤によって表面処理して、細胞親和性材料を得ること、細胞親和性材料を、骨形成能を有する細胞と共に培養すること、を含むものである。
本発明の骨様移植物は、上記細胞親和性材料と、骨形成能を有する細胞と、を含むものである。
更に本発明の骨様移植物の製造方法は、表面に極性基を有する基材を、上記表面改質剤によって表面処理して、細胞親和性材料を得ること、細胞親和性材料を、骨形成能を有する細胞と共に培養すること、を含むものである。
【００１３】
本発明にかかる新規なアミド誘導体及びその縮合物並びに、表面改質剤では、タンパク質に対して弱く水素結合可能なＮＲ1ＣＯ構造を有するアミド結合含有部と、極性基を有する基材に対して結合可能な基材結合部とを有している。このＮＲ1ＣＯ構造は、細胞産生物質や、場合によっては細胞表面のタンパク質表面に対しても、弱く結合することができる。この結果、細胞に対しては強く結合することがなく、また、細胞産生因子等のタンパク質を周囲に集めることができる。このことは、本アミド誘導体で処理した表面に対して細胞親和性を付与できることを意味している。一方、基材結合部は、基材に対して強固に結合することができる。この結果、本新規化合物を表面改質剤として用いて基材を処理することによって、容易に、基材表面を細胞親和性にすることができる。
また、このような基材と骨形成能を有する細胞とを同時に培養することによって、基材の表面や内部に細胞を誘導することができるので、高い細胞親和性を有する骨様移植物とすることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、生体での骨組織に近い生体機能と機械的性質の双方を確保した細胞親和性材料及びこれを用いた骨様移植物を簡便に提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明にかかる新規なアミド誘導体は、一般式Ａ−（Ｓｐ）−Ｂ又はＢ−（Ｓｐ）−Ａ−（Ｓｐ）−Ｂで表されるアミド誘導体又はその縮合物である。ここで、Ａは、後述するＮＲ1ＣＯ構造を有するアミド結合含有部であり、Ｓｐは後述するスペーサ部であり、Ｂは、後述する基材結合部である。
本アミド誘導体では、タンパク質に対して弱く水素結合するアミド結合含有部と、基材に対して強固に結合する基材結合部とを有しているので、アミド誘導体及びその縮合物に対して細胞産生物質や細胞自身を弱く結合することができ、本化合物で表面処理した場合には、その表面に対して細胞親和性を付与することができる。
なお本発明のアミド誘導体は、通常、水添などによって容易に縮合するため、特に断らない限り、本発明において「アミド誘導体」との表現には縮合物も含まれる。
【００１６】
アミド結合含有部、即ち、式中Ａは、下記一般式（Ｉ）で表されるＮＲ1ＣＯ構造を有するアミド結合含有部である。
【００１７】
【化４】
【００１８】
式中Ｒ1は、Ｈ又は炭素数１〜１０アルキル基又はアルケニル基、フェニル基、アルキルフェニル基、ピリジル基を表し、水素結合形成容易性の観点から、Ｒ1は水素であることが好ましい。ｎ1は、１〜２０の整数を表し、好ましくは１〜３の整数である。
このアミド結合含有部は、上記ＮＲ1ＣＯ構造を構造の一部として有していればよく、Ｎ原子やＣ原子を含む任意の連結基を介して、Ｓｐ又はＢと結合可能な環を形成していてもよい。
アミド結合含有部としては、分子全体に占める割合を考慮して、下記の（Ｉａ）〜（Ｉｃ）のいずれかであることが好ましい。
【００１９】
【化５】
【００２０】
式中、Ｒ1は前述したものと同一であり、ｎ2は２〜２０の整数を表し、ｎ3は１〜２０の整数を表し、ｎ2及びｎ3は、好ましくはそれぞれ１〜３の整数である。（Ｉｂ）では、任意の連結基を介した環の一部を構成していてもよい。
このようなアミド結合含有部としては、以下のものを例示することができる。なお下記において＊は、スペーサ部又は基材結合部との連結部分を示す。
【００２１】
【化６】
【００２２】
【化７】
【００２３】
このうち、特に下記のものが細胞親和性の観点及び合成容易性の観点から特に好ましい。
【００２４】
【化８】
【００２５】
スペーサ部、即ち上記式中Ｓｐは、あってもなくてもよいスペーサ部であり、存在する場合には、炭素数１〜１０のアルキレン基、アルケニレン基、フェニレン基、炭素数１〜５のアルキレン基若しくはアルケニレン基又はハロゲンを置換基として有するフェニレン基を表し、好ましくは、炭素数１〜３のアルキレン基、アルケニレン基、フェニレン基、炭素数１〜３のアルキル若しくはアルケニレン置換フェニレン基である。炭素数が多いと、分子の柔軟性が高くなり過ぎ、基材最表面からアミド結合含有部が基材側に潜り込んで、細胞親和性が減少する場合があるので、好ましくない。
【００２６】
基材結合部、即ち式中Ｂは、上記Ｓｐ又はＡと結合可能であると共に極性基を有する基材に対して結合可能な下記一般式（II）で表されるシリル基並びに、一般式（III）で表されるリン酸エステル及びリン酸エステル塩からなる群より選択された少なくとも１つである。ここで、Ｂが複数存在する場合には互いに同一でも異なってもよい。
【００２７】
【化９】
【００２８】
上記式（II）中、Ｙ1、Ｙ2及びＹ3はそれぞれ独立に、−Ｒ2、−ＯＲ3、−ＯＣＯＲ4、−ＮＣＯ及び、塩素又は臭素などのハロゲンからなる群から選択されたものを表し、互いに同一であっても異なってもよい。ここでＲ2は、炭素数１〜３のアルキル基若しくはアルケニル基、フェニル基を表し、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ、炭素数１〜５のアルキル基若しくはアルケニル基を表す。
【００２９】
【化１０】
【００３０】
上記式（III）中、Ｚ1及びＺ2はそれぞれ独立に、ＯＨ、ＯＱ、フェニル基又はフェノキシ基を表し、互いに同一であっても異なってもよく、ここでＱは、ナトリウムなどのアルカリ金属若しくはＮＨ4を表す。
【００３１】
このような基材結合部としては、以下のものを例示することができる。
【００３２】
【化１１】
【００３３】
これらのうち、特に細胞親和性及び合成容易性の観点から、（II−１）、（II−２）、（II−３）、（III−１）、（III−２）及び（III−６）が好ましく、基材との結合部位が３カ所になる（II−１）が特に好ましい。
【００３４】
このようなアミド誘導体としては、下記のものを好ましく挙げることができる。中でも、基板との結合部位の数が多い下記（１）、（２）及び（４）の化合物が特に好ましい。
【００３５】
【化１２】
【００３６】
【化１３】
【００３７】
本発明の上記アミド誘導体は、アミド結合含有部及び基材結合部を有するので、極性基を有する基材に対する表面改質剤として好ましく用いることができる。
即ち、本発明の細胞親和性材料の製造方法は、本発明の表面改質剤によって、表面に極性基を有する有機又は無機基材を表面処理することを含むものである。
【００３８】
表面処理されることができる基材としては、極性基を有する有機又は無機の基材であればよい。ここで極性基とは、水酸基、アミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、エステル結合、エーテル結合をいい、これらを単独で又は組み合わせて有するものであってもよい。
【００３９】
基材としては、ハイドロキシアパタイト、ガラス、金属、プラスチック、セラミックスを挙げることができ、使用対象、例えば生体内の部位や使用目的から適宜選択される。
ハイドロキシアパタイトとしては、一般組成をＣａ5（ＰＯ4）3ＯＨ、とする化合物であり、その反応の非化学量論性によって、ＣａＨＰＯ4、Ｃａ3（ＰＯ4）2、Ｃａ4Ｏ（ＰＯ4）2、Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2、ＣａＰ4Ｏ11、Ｃａ（ＰＯ3）2、Ｃａ2Ｐ2Ｏ7、Ｃａ（Ｈ2ＰＯ4）2・Ｈ2Ｏなどリン酸カルシウムと称される１群の化合物を挙げることができる。また、ハイドロキシアパタイトは、Ｃａ5（ＰＯ4）3ＯＨ、またはＣａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2の組成式で示される化合物を基本成分とするもので、Ｃａ成分の一部分は、Ｓｒ、Ｂａ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ａｌ、Ｙ、Ｌａ、Ｎａ、Ｋ、Ｈなどから選ばれる１種以上で置換されてもよい。また、（ＰＯ4）成分の一部分が、ＶＯ4、ＢＯ3、ＳＯ4、ＣＯ3、ＳｉＯ4等から選ばれる１種以上で置換されてもよい。更に、（ＯＨ）成分の一部分が、Ｆ、Ｃｌ、Ｏ、ＣＯ3等から選ばれる１種以上で置換されてもよい。また、これらの各成分の一部が欠陥となっていてもよい。生体骨中のアパタイトのＰＯ4およびＯＨ成分の一部は通常ＣＯ3に置換されているため、本複合生体材料の製造中、大気中からのＣＯ3の混入と各成分への一部置換（０〜１０質量％程度）があってもよい。
【００４０】
ガラスとしては、生体材料としての用途に一般的に用いられている材質及び形状のものを挙げることができ、例えばガラス繊維やガラス粉体などをあげることができる。
金属としては、表面吸着水を有するものであればよく、銀、金、チタン、コバルト、ニッケル、パラジウムを例示することができ、これらの合金であってもよい。合金としては、歯科等で一般に用いられているものをそのまま適用することができ、例えば、Ｃｏ−Ｃｒ合金、Ａｕ−Ａｇ−Ｐｄ合金等を挙げることができる。
プラスチックとしては、極性基を有するポリマーであればよく、例えば、ポリアミド、ポリエステル、ポリウレタン等を挙げることができる。
【００４１】
基材に対して本発明の表面改質剤で表面処理をする場合には、通常、上記表面改質剤を適当な溶剤や分散剤、例えばエタノール等に溶解して溶液を調製し、基材の表面に塗布又は、基材を処理溶液に浸せばよい。これにより、基材の極性基と本発明の表面改質剤の基材結合部とが結合し、基材の表面に細胞親和性部が配置され、基材が細胞親和性に改質される。
なお表面処理液を調製する際には、このような用途に一般に使用されている少量の酢酸や硫酸などの縮合促進剤を使用してもよい。
【００４２】
また、表面処理工程の後には、表面改質剤と基材との結合を強固にするために、加熱工程を設けてもよい。例えばアルキルシリル基を基材結合部として含む表面改質剤を用いた場合には、基材の表面に所謂シロキサンネットワークが構築されて、基材と強固に結合することができるため、特に好ましい。
【００４３】
本発明の細胞親和性材料は、上記表面改質剤によって表面にアミド構造含有部を有するので、細胞産生物質等のタンパク質と弱く水素結合することができる。このため、細胞親和性が高く、生体内に移植・埋設した場合には、周囲組織との適合性に優れている。
従って、本細胞親和性材料は、生体内に移植・埋設する移植物として好ましく用いることができ、このような用途としては、人工骨、人工歯、人工関節等を始めとする人工臓器のみならず、ボルト等の部材やその他の補綴材としても好ましく用いることができる。
【００４４】
また、本発明の細胞親和性材料は、特に多孔質の基材を用いた場合には、細胞親和性材料の周囲のみならず内部に細胞を誘導することができる。これにより、基材を足場として細胞親和性材料の内部で細胞を増殖させることができる。基材として骨と同様の機械特性を有する多孔質の基材を選択し、細胞として例えば骨形成能を有する細胞を用いた場合には、基材を足場として効率よく増殖する。
【００４５】
本発明の骨様移植物は、本発明の細胞親和性材料と、骨形成能を有する細胞とを含むものである。上述したように、基材の表面及び内部に骨形成能を有する細胞を容易に配置することができ、このような骨様移植物は、移植部位への生着性に優れている。
このような骨様移植物は、上述したように細胞親和性材料を得ること及び、この細胞親和性材料を、骨形成能を有する細胞と共に培養することによって、容易に製造することができる。
【００４６】
ここで用いられる細胞としては、骨形成能を有するものであればよく、例えば、骨髄間質細胞等をあげることができる。また拒絶反応を回避する観点から、自家の細胞であることが好ましい。
培養条件及び培養期間としては、細胞の種類及び増殖能によって異なるが、それぞれの細胞の状態に合わせて当業者であれば適宜適切な条件及び培養期間を容易に設定することができる。
【００４７】
なお、移植物としては、骨様移植物に限定されず、細胞種を適切に選択することによって、当業者であれば細胞種に応じた培養条件を選択して、所望の移植物を容易に製造することができる。
【実施例】
【００４８】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
【００４９】
［実施例１］
表面改質剤ＤＡＵ６Ｍの合成
（１）試薬及び装置
Ｎ，Ｎ−ジアリル尿素［Ｃ7Ｈ10ＯＮ2］（Ｆ．Ｗ．：１４０．０９、ｍｐ：６４℃、日東紡株式会社製）
マレイミド［Ｃ4Ｈ3Ｏ2Ｎ］（Ｆ．Ｗ．：９７．０７、ｍｐ：９４℃、Ａｌｄｒｉｃｈ株式会社製）
トリメトキシシラン［ＨＳｉ（ＯＣＨ3）3］（Ｆ．Ｗ．：１２２．２、ｂｐ：８１℃、ｄ：０．９６、東京化成工業株式会社製）。市販品をTrop to Trapにより精製したものを使用した。
塩化白金（IV）酸六水和物［Ｈ2ＰｔＣｌ6・６Ｈ2Ｏ］（Ｆ．Ｗ．：５１７．９、小島化学薬品株式会社製）。市販品を窒素下で蒸留ＴＨＦに溶解し、０．１Ｍ溶液に調整したものを使用した。
【００５０】
テトラヒドロフラン［Ｃ4Ｈ8Ｏ］（Ｆ．Ｗ．：７２．１１、ｂｐ：６６℃、ｄ：０．８９、関東化学株式会社製）。市販品を塩化カルシウムによって数日間予備脱水したものに、水素化カルシウム、ベンゾフェノン、金属ナトリウムを加えて青変するまで還流し，十分に水分を除去した後、常圧蒸留して、６６℃の留分を窒素下で保存したものを使用した。
塩化カルシウム（乾燥用）［ＣａＣｌ2］（Ｆ．Ｗ．：１１０．９８、ｍｐ：１６３℃、関東化学株式会社製）
水素化カルシウム（粉末）［ＣａＨ2］（Ｆ．Ｗ．：４２．０９、ナカライテスク株式会社製）
金属ナトリウム［Ｎａ］（Ｆ．Ｗ．：２２．９９、ｍｐ：９７．８℃、ｄ：０．９７、ナカライテスク株式会社）
ベンゾフェノン［（Ｃ6Ｈ5）2ＣＯ］（Ｆ．Ｗ．：１８２、ｍｐ：４７〜４９℃、東京化成工業株式会社製）
以上は市販品をそのまま使用した。
【００５１】
使用装置は以下のとおりである。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
Bruker DPX ４００型ＮＭＲ装置
ＦＴ−ＩＲ スペクトル：
Nicolet AVATAR 360 FT-IR Spectrometer
Ｍａｓｓ スペクトル：
日本電子 ＪＭＳ−ＳＸ １０２Ａ
日立製作所（株） Ｍ−００３ データ処理システム
【００５２】
（２）合成
合成は下記のスキーム１に従った。還流冷却器、滴下ロートを装備した１００ｍｌナスフラスコ内にＮ，Ｎ−ジアリル尿素３．９８ｇ（２８．４１ｍｍｏｌ）、溶媒としてＴＨＦ約２０ｍｌ、触媒として０．１Ｍ塩化白金酸ＴＨＦ溶液０．１ｍｌを加え、トリメトキシシラン７．２６ｇ（５６．８２ｍｍｏｌ）を氷冷下で徐々に攪拌しながら加えた。その後７７℃で１５時間還流し、これを減圧留去した。得られた生成物の同定は1Ｈ−ＮＭＲ、ＦＴ−ＩＲおよびＭａｓｓの各スペクトルにより行った。
【００５３】
【化１４】
【００５４】
反応は定量的に進行し、得られた生成物は粘性の白色液体であった。得られた生成物の同定は1Ｈ−ＮＭＲ、ＦＴ−ＩＲおよびＭａｓｓの各スペクトルにより行った。各チャートは図１〜３にＤＡＵ６Ｍの1Ｈ−ＮＭＲ、ＦＴ−ＩＲおよびＭａｓｓの各スペクトルチャートを示す。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルではアリル基プロトンに由来するピークが消失し、ケイ素が導入されたことに由来する−ＳｉＯＣＨ3のピークが確認され、積分比も目的物と一致した。ＦＴ−ＩＲスペクトルでは、二重結合に由来するＣ＝Ｃ伸縮振動の特性吸収帯が消失し、ケイ素が導入されたことに由来するＳｉ−Ｏ−Ｃ伸縮振動の特性吸収帯が新たに確認された。Ｍａｓｓスペクトルでは、分子イオンピークが確認でき、各フラグメントからも生成物が目的物であることを裏付ける結果が得られた。
これらの解析結果から生成物が目的物であることを確認した。
【００５５】
［実施例２］
表面改質剤ＭＩ３Ｍの合成
合成は下記スキーム２に従った。還流冷却器、滴下ロートを装備した１００ｍｌナスフラスコ内にマレイミド３．３２ｇ（３４．２０ｍｍｏｌ）、溶媒としてＴＨＦ約１０ｍｌ、触媒として０．１Ｍ塩化白金酸ＴＨＦ溶液０．２ｍｌを加え、トリメトキシシラン５．０５ｇ（４１．３３ｍｍｏｌ）を氷冷下で徐々に攪拌しながら加えた。その後、７７℃で５０時間還流した。これを減圧留去した後、ジクロロメタンでろ過を行ない、ろ液を減圧留去した。得られた生成物の同定は1Ｈ−ＮＭＲ、ＦＴ−ＩＲおよびＭａｓｓの各スペクトルにより行った。
【００５６】
【化１５】
【００５７】
反応は定量的に進行し、得られた生成物は白色固体であった。得られた生成物の同定は1Ｈ−ＮＭＲ、ＦＴ−ＩＲおよびＭａｓｓの各スペクトルにより行なった。図４〜６に、ＭＩ３Ｍの1Ｈ−ＮＭＲ、ＦＴ−ＩＲおよびＭａｓｓの各スペクトルチャートを示す。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルではオレフィンのプロトンに由来するピークが消失し、ケイ素が導入されたことに由来する−ＳｉＯＣＨ3のピークが確認され、積分比も目的物と一致した。ＦＴ−ＩＲスペクトルでは、二重結合に由来するＣ＝Ｃ伸縮振動の特性吸収帯が消失し、ケイ素が導入されたことに由来するＳｉ−Ｏ−Ｃ伸縮振動の特性吸収帯が新たに確認された。Ｍａｓｓスペクトルでは、分子イオンピークが確認でき、各フラグメントからも生成物が目的物であることを裏付ける結果が得られた。
これらの解析結果から生成物が目的物であることを確認した。
【００５８】
［実施例３］
表面改質剤によるハイドロキシアパタイトの表面改質
実施例１で得られたシランカップリング剤（ＤＡＵ６Ｍ）を、エタノールに混合して５０ｍｍｏｌ／Ｌ（約２．４質量％）とし、表面改質処理液とした。ハイドロキシアパタイト［β−ＴＣＰ、商品名：オスフェリオン（登録商標）、オリンパス社製］に、表面改質処理液を１ｍｌ加えて、２４時間撹拌し、常法に従って湿式法にて表面改質を行った。処理後、β−ＴＣＰを取り出して大気中にて自然乾燥させ、ガス滅菌して、試料部材とした。
ここで用いたβ−ＴＣＰ（β−リン酸三カルシウム）は、気孔率約７５％、気孔径１００〜４００μｍ、φ５×２．５ｍｍであった。
表面の改質は、ＥＳＣＡのよる表面の元素分析から窒素，炭素，ケイ素の存在を確認した。
【００５９】
［実施例４］
in vivo 分化誘導アッセイ
in vivo 分化誘導アッセイは、基本的にはGrzeskiらの方法（J. Bone Miner. Res., 1998, Vol.13, pp.1547-1554）に従って下記のように行った。
また、実施例３の試料部材のin vivo 分化誘導能を確認するために、ヒト下顎骨由来骨髄間質細胞（ｈＭｄＢＭＳＣ）を用いた。この細胞株は、ＬＸＳＮ−Ｂｍｉ−１（Ｂｍｉ−１：ヒトＢｍｉ−１遺伝子）及びＬＸＳＨ−ｈＴＥＲＴ（ｈＴＥＲＴ：ヒトテトメラーゼリバーストランスクリプターゼ）レトロウイルスを用いて不死化した細胞株である（J. Bone Miner. Res., 2005, Vol.20(1), pp.50-56)。この細胞株に骨形成能があることが、前述の文献中で確認されている。
【００６０】
実施例３で表面改質を行った試料部材を、１×１０6個のｈＭｄＢＭＳＣ細胞を含む２００μＬのα−ＭＥＭと共に３７℃１２時間培養した。それから、細胞とβ−ＴＣＰの混合物を回収して、細胞接着β−ＴＣＰ複合材料を得た。
その後、この複合材料を、オス５週齢のＳＣＩＤマウス（日本クレア）の背側皮下に移植して、８週間後に移植片を摘出した。
摘出した移植片を、４％パラフォルムアルデヒドで固定後、１０％ギ酸で２日間脱灰し、パラフィンにて包埋して標本を作製した。その後、３μｍの切片を作製し、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色を行った。
結果を図７に示す。なお図中Ｈはハイドロキシアパタイトを示している。
【００６１】
図７に示されるように、本実施例の表面改質剤で処理した試料部材は、試料部材の内部にｈＭｄＢＭＳＣ由来の骨様構造物の形成が認められた（矢印部）。このことは、本実施例の表面改質剤によってβ−ＴＣＰが改質されて表面の親水性が向上し、細胞の定着が容易となったことを示している。その結果、β−ＴＣＰの内部にまで細胞が遊走され、β−ＴＣＰの深部に骨が形成可能となった。
【００６２】
［比較例］
表面改質剤による処理を行わなかった以外は実施例５と同様にして、β−ＴＣＰをｈＭｄＢＭＳＣと共に培養した。結果を図８に示す。
図８に示されるように、β−ＴＣＰの内部又は表層部に、骨様構造物の形成は認められなかった。
従って、本発明の表面改質剤によって表面処理を行うことが、β−ＴＣＰの内部でのｈＭｄＢＭＳＣ由来の骨様構造物の形成に必要であることが明らかとなった。
【００６３】
このことから、本発明によれば、生体での骨組織に近い生体機能と機械的性質の双方を確保した細胞親和性材料及びこれを用いた骨様移植物を簡便に提供できることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明の実施例１にかかる表面改質剤の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示すチャートである。
【図２】本発明の実施例１にかかる表面改質剤のＦＴ−ＩＲスペクトルを示すチャートである。
【図３】本発明の実施例１にかかる表面改質剤のマススペクトルを示すチャートである。
【図４】本発明の実施例２にかかる表面改質剤の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示すチャートである。
【図５】本発明の実施例２にかかる表面改質剤のＦＴ−ＩＲスペクトルを示すチャートである。
【図６】本発明の実施例２にかかる表面改質剤のマススペクトルを示すチャートである。
【図７】実施例４にかかる試料部材を用いた場合の細胞のＨＥ染色像である（倍率×３００）。
【図８】比較例にかかる試料部材を用いた場合の細胞のＨＥ染色像である（倍率×３００）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面改質剤、細胞親和性材料及び細胞親和性材料の製造方法並びに、骨様移植物及び骨様移植物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、生体補修用材料等として、金属、プラスチック、ガラス、セラミックス等の非生体由来物質が多用されている。例えば、セラミックスには、人工関節用として焼結アルミナ及び焼結ジルコニアを挙げることができ、人工骨用としてバイオガラス、焼結水酸アパタイト、水酸アパタイト／β−リン酸三カルシウム複合体、β−リン酸三カルシウム及び結晶化ガラスＡ−Ｗ等を挙げることができる。
一方、骨や歯といった硬組織の形成や再生を可能とするような生体活性を有する部材は、硬組織の損傷を受けた際に自己修復の可能性を有するため、実用価値が高い。このような組織の再生能が付与された部材として、生体吸収性部材及び骨形成因子等が担持された部材が開発されている（例えば、特許文献１及び２）
【特許文献１】特開２００３−３２５６５７号公報
【特許文献２】特開２００３−３４２０１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、これまで使用されている人工材料はいずれも、生体骨に近い生体機能と機械的性質の双方を満足できるレベルで確保できるものではない。また、生物活性因子等を結合した部材では、複雑な工程を経て生物活性因子を部材に結合させる必要がある。
従って、本発明の目的は、生体での骨組織に近い生体機能と機械的性質の双方を確保した細胞親和性材料及びこれを用いた骨様移植物を簡便に提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明のアミド誘導体又はその縮合物は、一般式Ａ−（Ｓｐ）−Ｂ又はＢ−（Ｓｐ）−Ａ−（Ｓｐ）−Ｂで表されるアミド誘導体である。
ここでＡは、上記Ｓｐ又はＢと結合可能な環を形成していてもよい下記一般式（Ｉ）で表されるＮＲ1ＣＯ構造を有するアミド結合含有部であり、
【０００５】
【化１】
【０００６】
（式中Ｒ1は、Ｈ又は炭素数１〜１０アルキル基又はアルケニル基、フェニル基、アルキルフェニル基、ピリジル基を表し、ｎ1は、１〜２０の整数を表す。）
ここでＳｐは、あってもなくてもよいスペーサ部であり、存在する場合には、炭素数１〜１０のアルキレン基、アルケニレン基、フェニレン基、炭素数１〜５のアルキル基若しくはアルケニル基又はハロゲンを置換基として有するフェニレン基を表し、
ここでＢは、上記Ｓｐ又はＡと結合可能であると共に極性基を有する基材に対して結合可能な下記一般式（II）で表されるシリル基並びに、一般式（III）で表されるリン酸エステル及びリン酸エステル塩からなる群より選択された少なくとも１つの基材結合部を表し、Ｂが複数存在する場合には互いに同一でも異なってもよい。
【０００７】
【化２】
【０００８】
（式中、Ｙ1、Ｙ2及びＹ3はそれぞれ独立に、−Ｒ2、−ＯＲ3、−ＯＣＯＲ4、−ＮＣＯ及びハロゲンからなる群から選択されたものを表し、互いに同一であっても異なってもよく、ここでＲ2は、炭素数１〜３のアルキル基若しくはアルケニル基、フェニル基を表し、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ、炭素数１〜５のアルキル基若しくはアルケニル基を表す。）
【０００９】
【化３】
【００１０】
（式中、Ｚ1及びＺ2はそれぞれ独立に、ＯＨ、ＯＱ、フェニル基又はフェノキシ基を表し、互いに同一であっても異なってもよく、ここでＱは、アルカリ金属若しくはＮＨ4を表す。）
【００１１】
また、本発明の表面改質剤は、上記アミド誘導体又はその縮合物を含むものである。
本発明の生体親和性材料は、上記アミド誘導体又はその縮合物で表面処理された有機又は無機基材を含むものである。
ここで、前記有機又は無機基材が、ハイドロキシアパタイト、ガラス、金属、プラスチック及びセラミックスからなる群より選択された少なくとも１つであることが好ましい。
【００１２】
本発明の細胞親和性材料の製造方法は、表面に極性基を有する基材を、上記表面改質剤によって表面処理することを含むものである。
更に本発明の細胞親和性材料の製造方法は、表面に極性基を有する基材を、上記表面改質剤によって表面処理して、細胞親和性材料を得ること、細胞親和性材料を、骨形成能を有する細胞と共に培養すること、を含むものである。
本発明の骨様移植物は、上記細胞親和性材料と、骨形成能を有する細胞と、を含むものである。
更に本発明の骨様移植物の製造方法は、表面に極性基を有する基材を、上記表面改質剤によって表面処理して、細胞親和性材料を得ること、細胞親和性材料を、骨形成能を有する細胞と共に培養すること、を含むものである。
【００１３】
本発明にかかる新規なアミド誘導体及びその縮合物並びに、表面改質剤では、タンパク質に対して弱く水素結合可能なＮＲ1ＣＯ構造を有するアミド結合含有部と、極性基を有する基材に対して結合可能な基材結合部とを有している。このＮＲ1ＣＯ構造は、細胞産生物質や、場合によっては細胞表面のタンパク質表面に対しても、弱く結合することができる。この結果、細胞に対しては強く結合することがなく、また、細胞産生因子等のタンパク質を周囲に集めることができる。このことは、本アミド誘導体で処理した表面に対して細胞親和性を付与できることを意味している。一方、基材結合部は、基材に対して強固に結合することができる。この結果、本新規化合物を表面改質剤として用いて基材を処理することによって、容易に、基材表面を細胞親和性にすることができる。
また、このような基材と骨形成能を有する細胞とを同時に培養することによって、基材の表面や内部に細胞を誘導することができるので、高い細胞親和性を有する骨様移植物とすることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、生体での骨組織に近い生体機能と機械的性質の双方を確保した細胞親和性材料及びこれを用いた骨様移植物を簡便に提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明にかかる新規なアミド誘導体は、一般式Ａ−（Ｓｐ）−Ｂ又はＢ−（Ｓｐ）−Ａ−（Ｓｐ）−Ｂで表されるアミド誘導体又はその縮合物である。ここで、Ａは、後述するＮＲ1ＣＯ構造を有するアミド結合含有部であり、Ｓｐは後述するスペーサ部であり、Ｂは、後述する基材結合部である。
本アミド誘導体では、タンパク質に対して弱く水素結合するアミド結合含有部と、基材に対して強固に結合する基材結合部とを有しているので、アミド誘導体及びその縮合物に対して細胞産生物質や細胞自身を弱く結合することができ、本化合物で表面処理した場合には、その表面に対して細胞親和性を付与することができる。
なお本発明のアミド誘導体は、通常、水添などによって容易に縮合するため、特に断らない限り、本発明において「アミド誘導体」との表現には縮合物も含まれる。
【００１６】
アミド結合含有部、即ち、式中Ａは、下記一般式（Ｉ）で表されるＮＲ1ＣＯ構造を有するアミド結合含有部である。
【００１７】
【化４】
【００１８】
式中Ｒ1は、Ｈ又は炭素数１〜１０アルキル基又はアルケニル基、フェニル基、アルキルフェニル基、ピリジル基を表し、水素結合形成容易性の観点から、Ｒ1は水素であることが好ましい。ｎ1は、１〜２０の整数を表し、好ましくは１〜３の整数である。
このアミド結合含有部は、上記ＮＲ1ＣＯ構造を構造の一部として有していればよく、Ｎ原子やＣ原子を含む任意の連結基を介して、Ｓｐ又はＢと結合可能な環を形成していてもよい。
アミド結合含有部としては、分子全体に占める割合を考慮して、下記の（Ｉａ）〜（Ｉｃ）のいずれかであることが好ましい。
【００１９】
【化５】
【００２０】
式中、Ｒ1は前述したものと同一であり、ｎ2は２〜２０の整数を表し、ｎ3は１〜２０の整数を表し、ｎ2及びｎ3は、好ましくはそれぞれ１〜３の整数である。（Ｉｂ）では、任意の連結基を介した環の一部を構成していてもよい。
このようなアミド結合含有部としては、以下のものを例示することができる。なお下記において＊は、スペーサ部又は基材結合部との連結部分を示す。
【００２１】
【化６】
【００２２】
【化７】
【００２３】
このうち、特に下記のものが細胞親和性の観点及び合成容易性の観点から特に好ましい。
【００２４】
【化８】
【００２５】
スペーサ部、即ち上記式中Ｓｐは、あってもなくてもよいスペーサ部であり、存在する場合には、炭素数１〜１０のアルキレン基、アルケニレン基、フェニレン基、炭素数１〜５のアルキレン基若しくはアルケニレン基又はハロゲンを置換基として有するフェニレン基を表し、好ましくは、炭素数１〜３のアルキレン基、アルケニレン基、フェニレン基、炭素数１〜３のアルキル若しくはアルケニレン置換フェニレン基である。炭素数が多いと、分子の柔軟性が高くなり過ぎ、基材最表面からアミド結合含有部が基材側に潜り込んで、細胞親和性が減少する場合があるので、好ましくない。
【００２６】
基材結合部、即ち式中Ｂは、上記Ｓｐ又はＡと結合可能であると共に極性基を有する基材に対して結合可能な下記一般式（II）で表されるシリル基並びに、一般式（III）で表されるリン酸エステル及びリン酸エステル塩からなる群より選択された少なくとも１つである。ここで、Ｂが複数存在する場合には互いに同一でも異なってもよい。
【００２７】
【化９】
【００２８】
上記式（II）中、Ｙ1、Ｙ2及びＹ3はそれぞれ独立に、−Ｒ2、−ＯＲ3、−ＯＣＯＲ4、−ＮＣＯ及び、塩素又は臭素などのハロゲンからなる群から選択されたものを表し、互いに同一であっても異なってもよい。ここでＲ2は、炭素数１〜３のアルキル基若しくはアルケニル基、フェニル基を表し、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ、炭素数１〜５のアルキル基若しくはアルケニル基を表す。
【００２９】
【化１０】
【００３０】
上記式（III）中、Ｚ1及びＺ2はそれぞれ独立に、ＯＨ、ＯＱ、フェニル基又はフェノキシ基を表し、互いに同一であっても異なってもよく、ここでＱは、ナトリウムなどのアルカリ金属若しくはＮＨ4を表す。
【００３１】
このような基材結合部としては、以下のものを例示することができる。
【００３２】
【化１１】
【００３３】
これらのうち、特に細胞親和性及び合成容易性の観点から、（II−１）、（II−２）、（II−３）、（III−１）、（III−２）及び（III−６）が好ましく、基材との結合部位が３カ所になる（II−１）が特に好ましい。
【００３４】
このようなアミド誘導体としては、下記のものを好ましく挙げることができる。中でも、基板との結合部位の数が多い下記（１）、（２）及び（４）の化合物が特に好ましい。
【００３５】
【化１２】
【００３６】
【化１３】
【００３７】
本発明の上記アミド誘導体は、アミド結合含有部及び基材結合部を有するので、極性基を有する基材に対する表面改質剤として好ましく用いることができる。
即ち、本発明の細胞親和性材料の製造方法は、本発明の表面改質剤によって、表面に極性基を有する有機又は無機基材を表面処理することを含むものである。
【００３８】
表面処理されることができる基材としては、極性基を有する有機又は無機の基材であればよい。ここで極性基とは、水酸基、アミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、エステル結合、エーテル結合をいい、これらを単独で又は組み合わせて有するものであってもよい。
【００３９】
基材としては、ハイドロキシアパタイト、ガラス、金属、プラスチック、セラミックスを挙げることができ、使用対象、例えば生体内の部位や使用目的から適宜選択される。
ハイドロキシアパタイトとしては、一般組成をＣａ5（ＰＯ4）3ＯＨ、とする化合物であり、その反応の非化学量論性によって、ＣａＨＰＯ4、Ｃａ3（ＰＯ4）2、Ｃａ4Ｏ（ＰＯ4）2、Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2、ＣａＰ4Ｏ11、Ｃａ（ＰＯ3）2、Ｃａ2Ｐ2Ｏ7、Ｃａ（Ｈ2ＰＯ4）2・Ｈ2Ｏなどリン酸カルシウムと称される１群の化合物を挙げることができる。また、ハイドロキシアパタイトは、Ｃａ5（ＰＯ4）3ＯＨ、またはＣａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2の組成式で示される化合物を基本成分とするもので、Ｃａ成分の一部分は、Ｓｒ、Ｂａ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ａｌ、Ｙ、Ｌａ、Ｎａ、Ｋ、Ｈなどから選ばれる１種以上で置換されてもよい。また、（ＰＯ4）成分の一部分が、ＶＯ4、ＢＯ3、ＳＯ4、ＣＯ3、ＳｉＯ4等から選ばれる１種以上で置換されてもよい。更に、（ＯＨ）成分の一部分が、Ｆ、Ｃｌ、Ｏ、ＣＯ3等から選ばれる１種以上で置換されてもよい。また、これらの各成分の一部が欠陥となっていてもよい。生体骨中のアパタイトのＰＯ4およびＯＨ成分の一部は通常ＣＯ3に置換されているため、本複合生体材料の製造中、大気中からのＣＯ3の混入と各成分への一部置換（０〜１０質量％程度）があってもよい。
【００４０】
ガラスとしては、生体材料としての用途に一般的に用いられている材質及び形状のものを挙げることができ、例えばガラス繊維やガラス粉体などをあげることができる。
金属としては、表面吸着水を有するものであればよく、銀、金、チタン、コバルト、ニッケル、パラジウムを例示することができ、これらの合金であってもよい。合金としては、歯科等で一般に用いられているものをそのまま適用することができ、例えば、Ｃｏ−Ｃｒ合金、Ａｕ−Ａｇ−Ｐｄ合金等を挙げることができる。
プラスチックとしては、極性基を有するポリマーであればよく、例えば、ポリアミド、ポリエステル、ポリウレタン等を挙げることができる。
【００４１】
基材に対して本発明の表面改質剤で表面処理をする場合には、通常、上記表面改質剤を適当な溶剤や分散剤、例えばエタノール等に溶解して溶液を調製し、基材の表面に塗布又は、基材を処理溶液に浸せばよい。これにより、基材の極性基と本発明の表面改質剤の基材結合部とが結合し、基材の表面に細胞親和性部が配置され、基材が細胞親和性に改質される。
なお表面処理液を調製する際には、このような用途に一般に使用されている少量の酢酸や硫酸などの縮合促進剤を使用してもよい。
【００４２】
また、表面処理工程の後には、表面改質剤と基材との結合を強固にするために、加熱工程を設けてもよい。例えばアルキルシリル基を基材結合部として含む表面改質剤を用いた場合には、基材の表面に所謂シロキサンネットワークが構築されて、基材と強固に結合することができるため、特に好ましい。
【００４３】
本発明の細胞親和性材料は、上記表面改質剤によって表面にアミド構造含有部を有するので、細胞産生物質等のタンパク質と弱く水素結合することができる。このため、細胞親和性が高く、生体内に移植・埋設した場合には、周囲組織との適合性に優れている。
従って、本細胞親和性材料は、生体内に移植・埋設する移植物として好ましく用いることができ、このような用途としては、人工骨、人工歯、人工関節等を始めとする人工臓器のみならず、ボルト等の部材やその他の補綴材としても好ましく用いることができる。
【００４４】
また、本発明の細胞親和性材料は、特に多孔質の基材を用いた場合には、細胞親和性材料の周囲のみならず内部に細胞を誘導することができる。これにより、基材を足場として細胞親和性材料の内部で細胞を増殖させることができる。基材として骨と同様の機械特性を有する多孔質の基材を選択し、細胞として例えば骨形成能を有する細胞を用いた場合には、基材を足場として効率よく増殖する。
【００４５】
本発明の骨様移植物は、本発明の細胞親和性材料と、骨形成能を有する細胞とを含むものである。上述したように、基材の表面及び内部に骨形成能を有する細胞を容易に配置することができ、このような骨様移植物は、移植部位への生着性に優れている。
このような骨様移植物は、上述したように細胞親和性材料を得ること及び、この細胞親和性材料を、骨形成能を有する細胞と共に培養することによって、容易に製造することができる。
【００４６】
ここで用いられる細胞としては、骨形成能を有するものであればよく、例えば、骨髄間質細胞等をあげることができる。また拒絶反応を回避する観点から、自家の細胞であることが好ましい。
培養条件及び培養期間としては、細胞の種類及び増殖能によって異なるが、それぞれの細胞の状態に合わせて当業者であれば適宜適切な条件及び培養期間を容易に設定することができる。
【００４７】
なお、移植物としては、骨様移植物に限定されず、細胞種を適切に選択することによって、当業者であれば細胞種に応じた培養条件を選択して、所望の移植物を容易に製造することができる。
【実施例】
【００４８】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
【００４９】
［実施例１］
表面改質剤ＤＡＵ６Ｍの合成
（１）試薬及び装置
Ｎ，Ｎ−ジアリル尿素［Ｃ7Ｈ10ＯＮ2］（Ｆ．Ｗ．：１４０．０９、ｍｐ：６４℃、日東紡株式会社製）
マレイミド［Ｃ4Ｈ3Ｏ2Ｎ］（Ｆ．Ｗ．：９７．０７、ｍｐ：９４℃、Ａｌｄｒｉｃｈ株式会社製）
トリメトキシシラン［ＨＳｉ（ＯＣＨ3）3］（Ｆ．Ｗ．：１２２．２、ｂｐ：８１℃、ｄ：０．９６、東京化成工業株式会社製）。市販品をTrop to Trapにより精製したものを使用した。
塩化白金（IV）酸六水和物［Ｈ2ＰｔＣｌ6・６Ｈ2Ｏ］（Ｆ．Ｗ．：５１７．９、小島化学薬品株式会社製）。市販品を窒素下で蒸留ＴＨＦに溶解し、０．１Ｍ溶液に調整したものを使用した。
【００５０】
テトラヒドロフラン［Ｃ4Ｈ8Ｏ］（Ｆ．Ｗ．：７２．１１、ｂｐ：６６℃、ｄ：０．８９、関東化学株式会社製）。市販品を塩化カルシウムによって数日間予備脱水したものに、水素化カルシウム、ベンゾフェノン、金属ナトリウムを加えて青変するまで還流し，十分に水分を除去した後、常圧蒸留して、６６℃の留分を窒素下で保存したものを使用した。
塩化カルシウム（乾燥用）［ＣａＣｌ2］（Ｆ．Ｗ．：１１０．９８、ｍｐ：１６３℃、関東化学株式会社製）
水素化カルシウム（粉末）［ＣａＨ2］（Ｆ．Ｗ．：４２．０９、ナカライテスク株式会社製）
金属ナトリウム［Ｎａ］（Ｆ．Ｗ．：２２．９９、ｍｐ：９７．８℃、ｄ：０．９７、ナカライテスク株式会社）
ベンゾフェノン［（Ｃ6Ｈ5）2ＣＯ］（Ｆ．Ｗ．：１８２、ｍｐ：４７〜４９℃、東京化成工業株式会社製）
以上は市販品をそのまま使用した。
【００５１】
使用装置は以下のとおりである。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
Bruker DPX ４００型ＮＭＲ装置
ＦＴ−ＩＲ スペクトル：
Nicolet AVATAR 360 FT-IR Spectrometer
Ｍａｓｓ スペクトル：
日本電子 ＪＭＳ−ＳＸ １０２Ａ
日立製作所（株） Ｍ−００３ データ処理システム
【００５２】
（２）合成
合成は下記のスキーム１に従った。還流冷却器、滴下ロートを装備した１００ｍｌナスフラスコ内にＮ，Ｎ−ジアリル尿素３．９８ｇ（２８．４１ｍｍｏｌ）、溶媒としてＴＨＦ約２０ｍｌ、触媒として０．１Ｍ塩化白金酸ＴＨＦ溶液０．１ｍｌを加え、トリメトキシシラン７．２６ｇ（５６．８２ｍｍｏｌ）を氷冷下で徐々に攪拌しながら加えた。その後７７℃で１５時間還流し、これを減圧留去した。得られた生成物の同定は1Ｈ−ＮＭＲ、ＦＴ−ＩＲおよびＭａｓｓの各スペクトルにより行った。
【００５３】
【化１４】
【００５４】
反応は定量的に進行し、得られた生成物は粘性の白色液体であった。得られた生成物の同定は1Ｈ−ＮＭＲ、ＦＴ−ＩＲおよびＭａｓｓの各スペクトルにより行った。各チャートは図１〜３にＤＡＵ６Ｍの1Ｈ−ＮＭＲ、ＦＴ−ＩＲおよびＭａｓｓの各スペクトルチャートを示す。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルではアリル基プロトンに由来するピークが消失し、ケイ素が導入されたことに由来する−ＳｉＯＣＨ3のピークが確認され、積分比も目的物と一致した。ＦＴ−ＩＲスペクトルでは、二重結合に由来するＣ＝Ｃ伸縮振動の特性吸収帯が消失し、ケイ素が導入されたことに由来するＳｉ−Ｏ−Ｃ伸縮振動の特性吸収帯が新たに確認された。Ｍａｓｓスペクトルでは、分子イオンピークが確認でき、各フラグメントからも生成物が目的物であることを裏付ける結果が得られた。
これらの解析結果から生成物が目的物であることを確認した。
【００５５】
［実施例２］
表面改質剤ＭＩ３Ｍの合成
合成は下記スキーム２に従った。還流冷却器、滴下ロートを装備した１００ｍｌナスフラスコ内にマレイミド３．３２ｇ（３４．２０ｍｍｏｌ）、溶媒としてＴＨＦ約１０ｍｌ、触媒として０．１Ｍ塩化白金酸ＴＨＦ溶液０．２ｍｌを加え、トリメトキシシラン５．０５ｇ（４１．３３ｍｍｏｌ）を氷冷下で徐々に攪拌しながら加えた。その後、７７℃で５０時間還流した。これを減圧留去した後、ジクロロメタンでろ過を行ない、ろ液を減圧留去した。得られた生成物の同定は1Ｈ−ＮＭＲ、ＦＴ−ＩＲおよびＭａｓｓの各スペクトルにより行った。
【００５６】
【化１５】
【００５７】
反応は定量的に進行し、得られた生成物は白色固体であった。得られた生成物の同定は1Ｈ−ＮＭＲ、ＦＴ−ＩＲおよびＭａｓｓの各スペクトルにより行なった。図４〜６に、ＭＩ３Ｍの1Ｈ−ＮＭＲ、ＦＴ−ＩＲおよびＭａｓｓの各スペクトルチャートを示す。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルではオレフィンのプロトンに由来するピークが消失し、ケイ素が導入されたことに由来する−ＳｉＯＣＨ3のピークが確認され、積分比も目的物と一致した。ＦＴ−ＩＲスペクトルでは、二重結合に由来するＣ＝Ｃ伸縮振動の特性吸収帯が消失し、ケイ素が導入されたことに由来するＳｉ−Ｏ−Ｃ伸縮振動の特性吸収帯が新たに確認された。Ｍａｓｓスペクトルでは、分子イオンピークが確認でき、各フラグメントからも生成物が目的物であることを裏付ける結果が得られた。
これらの解析結果から生成物が目的物であることを確認した。
【００５８】
［実施例３］
表面改質剤によるハイドロキシアパタイトの表面改質
実施例１で得られたシランカップリング剤（ＤＡＵ６Ｍ）を、エタノールに混合して５０ｍｍｏｌ／Ｌ（約２．４質量％）とし、表面改質処理液とした。ハイドロキシアパタイト［β−ＴＣＰ、商品名：オスフェリオン（登録商標）、オリンパス社製］に、表面改質処理液を１ｍｌ加えて、２４時間撹拌し、常法に従って湿式法にて表面改質を行った。処理後、β−ＴＣＰを取り出して大気中にて自然乾燥させ、ガス滅菌して、試料部材とした。
ここで用いたβ−ＴＣＰ（β−リン酸三カルシウム）は、気孔率約７５％、気孔径１００〜４００μｍ、φ５×２．５ｍｍであった。
表面の改質は、ＥＳＣＡのよる表面の元素分析から窒素，炭素，ケイ素の存在を確認した。
【００５９】
［実施例４］
in vivo 分化誘導アッセイ
in vivo 分化誘導アッセイは、基本的にはGrzeskiらの方法（J. Bone Miner. Res., 1998, Vol.13, pp.1547-1554）に従って下記のように行った。
また、実施例３の試料部材のin vivo 分化誘導能を確認するために、ヒト下顎骨由来骨髄間質細胞（ｈＭｄＢＭＳＣ）を用いた。この細胞株は、ＬＸＳＮ−Ｂｍｉ−１（Ｂｍｉ−１：ヒトＢｍｉ−１遺伝子）及びＬＸＳＨ−ｈＴＥＲＴ（ｈＴＥＲＴ：ヒトテトメラーゼリバーストランスクリプターゼ）レトロウイルスを用いて不死化した細胞株である（J. Bone Miner. Res., 2005, Vol.20(1), pp.50-56)。この細胞株に骨形成能があることが、前述の文献中で確認されている。
【００６０】
実施例３で表面改質を行った試料部材を、１×１０6個のｈＭｄＢＭＳＣ細胞を含む２００μＬのα−ＭＥＭと共に３７℃１２時間培養した。それから、細胞とβ−ＴＣＰの混合物を回収して、細胞接着β−ＴＣＰ複合材料を得た。
その後、この複合材料を、オス５週齢のＳＣＩＤマウス（日本クレア）の背側皮下に移植して、８週間後に移植片を摘出した。
摘出した移植片を、４％パラフォルムアルデヒドで固定後、１０％ギ酸で２日間脱灰し、パラフィンにて包埋して標本を作製した。その後、３μｍの切片を作製し、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色を行った。
結果を図７に示す。なお図中Ｈはハイドロキシアパタイトを示している。
【００６１】
図７に示されるように、本実施例の表面改質剤で処理した試料部材は、試料部材の内部にｈＭｄＢＭＳＣ由来の骨様構造物の形成が認められた（矢印部）。このことは、本実施例の表面改質剤によってβ−ＴＣＰが改質されて表面の親水性が向上し、細胞の定着が容易となったことを示している。その結果、β−ＴＣＰの内部にまで細胞が遊走され、β−ＴＣＰの深部に骨が形成可能となった。
【００６２】
［比較例］
表面改質剤による処理を行わなかった以外は実施例５と同様にして、β−ＴＣＰをｈＭｄＢＭＳＣと共に培養した。結果を図８に示す。
図８に示されるように、β−ＴＣＰの内部又は表層部に、骨様構造物の形成は認められなかった。
従って、本発明の表面改質剤によって表面処理を行うことが、β−ＴＣＰの内部でのｈＭｄＢＭＳＣ由来の骨様構造物の形成に必要であることが明らかとなった。
【００６３】
このことから、本発明によれば、生体での骨組織に近い生体機能と機械的性質の双方を確保した細胞親和性材料及びこれを用いた骨様移植物を簡便に提供できることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明の実施例１にかかる表面改質剤の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示すチャートである。
【図２】本発明の実施例１にかかる表面改質剤のＦＴ−ＩＲスペクトルを示すチャートである。
【図３】本発明の実施例１にかかる表面改質剤のマススペクトルを示すチャートである。
【図４】本発明の実施例２にかかる表面改質剤の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示すチャートである。
【図５】本発明の実施例２にかかる表面改質剤のＦＴ−ＩＲスペクトルを示すチャートである。
【図６】本発明の実施例２にかかる表面改質剤のマススペクトルを示すチャートである。
【図７】実施例４にかかる試料部材を用いた場合の細胞のＨＥ染色像である（倍率×３００）。
【図８】比較例にかかる試料部材を用いた場合の細胞のＨＥ染色像である（倍率×３００）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ａ−（Ｓｐ）−Ｂ又はＢ−（Ｓｐ）−Ａ−（Ｓｐ）−Ｂで表されるアミド誘導体であって、
Ａは、上記Ｓｐ又はＢと結合可能な環を形成していてもよい下記一般式（Ｉ）で表されるＮＲ1ＣＯ構造を有するアミド結合含有部であり、
【化１】
（式中Ｒ1は、Ｈ又は炭素数１〜１０アルキル基又はアルケニル基、フェニル基、アルキルフェニル基、ピリジル基を表し、ｎ1は、１〜２０の整数を表す。）
Ｓｐは、あってもなくてもよいスペーサ部であり、存在する場合には、炭素数１〜１０のアルキレン基、アルケニレン基、フェニレン基、炭素数１〜５のアルキル基若しくはアルケニル基又はハロゲンを置換基として有するフェニレン基を表し、
Ｂは、上記Ｓｐ又はＡと結合可能であると共に極性基を有する基材に対して結合可能な下記一般式（II）で表されるシリル基並びに、一般式（III）で表されるリン酸エステル及びリン酸エステル塩からなる群より選択された少なくとも１つの基材結合部を表し、Ｂが複数存在する場合には互いに同一でも異なってもよい、
【化２】
（式中、Ｙ1、Ｙ2及びＹ3はそれぞれ独立に、−Ｒ2、−ＯＲ3、−ＯＣＯＲ4、−ＮＣＯ及びハロゲンからなる群から選択されたものを表し、互いに同一であっても異なってもよく、ここでＲ2は、炭素数１〜３のアルキル基若しくはアルケニル基、フェニル基を表し、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ、炭素数１〜５のアルキル基若しくはアルケニル基を表す。）
【化３】
（式中、Ｚ1及びＺ2はそれぞれ独立に、ＯＨ、ＯＱ、フェニル基又はフェノキシ基を表し、互いに同一であっても異なってもよく、ここでＱは、アルカリ金属若しくはＮＨ4を表す。）
当該アミド誘導体。
【請求項２】
前記アミド結合含有部が、下記式（Ｉａ）、（Ｉｂ）又は（Ｉｃ）であることを特徴とする請求項１記載のアミド誘導体。
【化４】
（式中、Ｒ1は、前述したものと同一である。ｎ2は２〜２０の整数を表し、ｎ3は１〜２０の整数を表し、前記式（Ｉｂ）はスペーサ又は基材結合部との結合可能な環を形成していてもよい。）
【請求項３】
前記アミド結合含有部が、下記のものから選択されたいずれかである請求項１記載のアミド誘導体。
【化５】
【請求項４】
前記基材結合部が、下記のものから選択された少なくとも１つである請求項１アミド誘導体。
【化６】
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項記載のアミド誘導体の縮合物。
【請求項６】
一般式Ａ−（Ｓｐ）−Ｂ又はＢ−（Ｓｐ）−Ａ−（Ｓｐ）−Ｂで表されるアミド誘導体若しくはその縮合物である表面改質剤であって、
Ａは、上記Ｓｐ又はＢと結合可能な環を形成していてもよい下記一般式（Ｉ）で表されるＮＲ1ＣＯ構造を有するアミド結合含有部であり、
【化７】
（式中Ｒ1は、Ｈ又は炭素数１〜１０アルキル基又はアルケニル基、フェニル基、アルキルフェニル基、ピリジル基を表し、ｎ1は、１〜２０の整数を表す。）
Ｓｐは、あってもなくてもよいスペーサ部であり、存在する場合には、炭素数１〜１０のアルキレン基、アルケニレン基、フェニレン基、炭素数１〜５のアルキル基若しくはアルケニル基又はハロゲンを置換基として有するフェニレン基を表し、
Ｂは、上記Ｓｐ又はＡと結合可能であると共に極性基を有する基材に対して結合可能な下記一般式（II）で表されるシリル基並びに、一般式（III）で表されるリン酸エステル及びリン酸エステル塩からなる群より選択された少なくとも１つの基材結合部を表し、Ｂが複数存在する場合には互いに同一でも異なってもよい、
【化８】
（式中、Ｙ1、Ｙ2及びＹ3はそれぞれ独立に、−Ｒ2、−ＯＲ3、−ＯＣＯＲ4、−ＮＣＯ及びハロゲンからなる群から選択されたものを表し、互いに同一であっても異なってもよく、ここでＲ2は、炭素数１〜３のアルキル基若しくはアルケニル基、フェニル基を表し、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ、炭素数１〜５のアルキル基若しくはアルケニル基を表す。）
【化９】
（式中、Ｚ1及びＺ2はそれぞれ独立に、ＯＨ、ＯＱ、フェニル基又はフェノキシ基を表し、互いに同一であっても異なってもよく、ここでＱは、アルカリ金属若しくはＮＨ4を表す。）
当該表面改質剤。
【請求項７】
請求項６記載の表面改質剤で表面処理された有機又は無機基材を含む細胞親和性材料。
【請求項８】
前記有機又は無機基材が、ハイドロキシアパタイト、ガラス、金属、プラスチック及びセラミックスからなる群より選択された少なくとも１つであることを特徴とする請求項７記載の細胞親和性材料。
【請求項９】
表面に極性基を有する基材を、請求項６記載の表面改質剤によって表面処理することを含む細胞親和性材料の製造方法。
【請求項１０】
請求項７記載の細胞親和性材料と、
骨形成能を有する細胞と、
を含む骨様移植物。
【請求項１１】
表面に極性基を有する基材を、請求項６記載の表面改質剤によって表面処理して、細胞親和性材料を得ること、
細胞親和性材料を、骨形成能を有する細胞と共に培養すること、
を含む骨様移植物の製造方法。
【請求項１】
一般式Ａ−（Ｓｐ）−Ｂ又はＢ−（Ｓｐ）−Ａ−（Ｓｐ）−Ｂで表されるアミド誘導体であって、
Ａは、上記Ｓｐ又はＢと結合可能な環を形成していてもよい下記一般式（Ｉ）で表されるＮＲ1ＣＯ構造を有するアミド結合含有部であり、
【化１】
（式中Ｒ1は、Ｈ又は炭素数１〜１０アルキル基又はアルケニル基、フェニル基、アルキルフェニル基、ピリジル基を表し、ｎ1は、１〜２０の整数を表す。）
Ｓｐは、あってもなくてもよいスペーサ部であり、存在する場合には、炭素数１〜１０のアルキレン基、アルケニレン基、フェニレン基、炭素数１〜５のアルキル基若しくはアルケニル基又はハロゲンを置換基として有するフェニレン基を表し、
Ｂは、上記Ｓｐ又はＡと結合可能であると共に極性基を有する基材に対して結合可能な下記一般式（II）で表されるシリル基並びに、一般式（III）で表されるリン酸エステル及びリン酸エステル塩からなる群より選択された少なくとも１つの基材結合部を表し、Ｂが複数存在する場合には互いに同一でも異なってもよい、
【化２】
（式中、Ｙ1、Ｙ2及びＹ3はそれぞれ独立に、−Ｒ2、−ＯＲ3、−ＯＣＯＲ4、−ＮＣＯ及びハロゲンからなる群から選択されたものを表し、互いに同一であっても異なってもよく、ここでＲ2は、炭素数１〜３のアルキル基若しくはアルケニル基、フェニル基を表し、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ、炭素数１〜５のアルキル基若しくはアルケニル基を表す。）
【化３】
（式中、Ｚ1及びＺ2はそれぞれ独立に、ＯＨ、ＯＱ、フェニル基又はフェノキシ基を表し、互いに同一であっても異なってもよく、ここでＱは、アルカリ金属若しくはＮＨ4を表す。）
当該アミド誘導体。
【請求項２】
前記アミド結合含有部が、下記式（Ｉａ）、（Ｉｂ）又は（Ｉｃ）であることを特徴とする請求項１記載のアミド誘導体。
【化４】
（式中、Ｒ1は、前述したものと同一である。ｎ2は２〜２０の整数を表し、ｎ3は１〜２０の整数を表し、前記式（Ｉｂ）はスペーサ又は基材結合部との結合可能な環を形成していてもよい。）
【請求項３】
前記アミド結合含有部が、下記のものから選択されたいずれかである請求項１記載のアミド誘導体。
【化５】
【請求項４】
前記基材結合部が、下記のものから選択された少なくとも１つである請求項１アミド誘導体。
【化６】
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項記載のアミド誘導体の縮合物。
【請求項６】
一般式Ａ−（Ｓｐ）−Ｂ又はＢ−（Ｓｐ）−Ａ−（Ｓｐ）−Ｂで表されるアミド誘導体若しくはその縮合物である表面改質剤であって、
Ａは、上記Ｓｐ又はＢと結合可能な環を形成していてもよい下記一般式（Ｉ）で表されるＮＲ1ＣＯ構造を有するアミド結合含有部であり、
【化７】
（式中Ｒ1は、Ｈ又は炭素数１〜１０アルキル基又はアルケニル基、フェニル基、アルキルフェニル基、ピリジル基を表し、ｎ1は、１〜２０の整数を表す。）
Ｓｐは、あってもなくてもよいスペーサ部であり、存在する場合には、炭素数１〜１０のアルキレン基、アルケニレン基、フェニレン基、炭素数１〜５のアルキル基若しくはアルケニル基又はハロゲンを置換基として有するフェニレン基を表し、
Ｂは、上記Ｓｐ又はＡと結合可能であると共に極性基を有する基材に対して結合可能な下記一般式（II）で表されるシリル基並びに、一般式（III）で表されるリン酸エステル及びリン酸エステル塩からなる群より選択された少なくとも１つの基材結合部を表し、Ｂが複数存在する場合には互いに同一でも異なってもよい、
【化８】
（式中、Ｙ1、Ｙ2及びＹ3はそれぞれ独立に、−Ｒ2、−ＯＲ3、−ＯＣＯＲ4、−ＮＣＯ及びハロゲンからなる群から選択されたものを表し、互いに同一であっても異なってもよく、ここでＲ2は、炭素数１〜３のアルキル基若しくはアルケニル基、フェニル基を表し、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ、炭素数１〜５のアルキル基若しくはアルケニル基を表す。）
【化９】
（式中、Ｚ1及びＺ2はそれぞれ独立に、ＯＨ、ＯＱ、フェニル基又はフェノキシ基を表し、互いに同一であっても異なってもよく、ここでＱは、アルカリ金属若しくはＮＨ4を表す。）
当該表面改質剤。
【請求項７】
請求項６記載の表面改質剤で表面処理された有機又は無機基材を含む細胞親和性材料。
【請求項８】
前記有機又は無機基材が、ハイドロキシアパタイト、ガラス、金属、プラスチック及びセラミックスからなる群より選択された少なくとも１つであることを特徴とする請求項７記載の細胞親和性材料。
【請求項９】
表面に極性基を有する基材を、請求項６記載の表面改質剤によって表面処理することを含む細胞親和性材料の製造方法。
【請求項１０】
請求項７記載の細胞親和性材料と、
骨形成能を有する細胞と、
を含む骨様移植物。
【請求項１１】
表面に極性基を有する基材を、請求項６記載の表面改質剤によって表面処理して、細胞親和性材料を得ること、
細胞親和性材料を、骨形成能を有する細胞と共に培養すること、
を含む骨様移植物の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００６−２４１０８４（Ｐ２００６−２４１０８４Ａ）
【公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５９７５０（Ｐ２００５−５９７５０）
【出願日】平成１７年３月３日（２００５．３．３）
【出願人】（８０３０００１１５）学校法人東京理科大学 (545)
【出願人】（５０５０７９７８５）学校法人神奈川歯科大学 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月３日（２００５．３．３）
【出願人】（８０３０００１１５）学校法人東京理科大学 (545)
【出願人】（５０５０７９７８５）学校法人神奈川歯科大学 (6)
【Ｆターム（参考）】
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