被覆磁性粒子の調製方法
超常磁性結晶を含む被覆ポリマー粒子の調製方法であって、超常磁性結晶を含む直径０．５〜１．８μｍの多孔性表面官能化ポリマー粒子を、少なくとも１つのポリイソシアネート及び少なくとも１つのジオール又は少なくとも１つのエポキシドと反応させることを含む方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被覆磁性ポリマー粒子の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁性ポリマー粒子は、様々な医療分野および生化学分野において、例えば、医薬製品の運搬のための輸送ビヒクルとして、診断目的において、分離のため、および合成目的のため、一般に有用である。このような粒子は、これらの機能を行うためには、その磁気特性に依存している。診断アッセイ適用において、例えば、磁気ポリマー粒子に結合した分析物を含有するサンプルに磁場を適用することにより、遠心分離またはろ過の使用をすることなく、前記分析物を単離することが可能である；また、治療適用において、例えば、磁場を患者に適用することにより、薬物運搬磁気ポリマー粒子を所望の身体部位へ狙いをつけるのに用いることができる。
【０００３】
磁気によりとは、ここでは、ポリマー粒子が超常磁性（super paramagnetic）結晶を含有することを意味する。したがって、この磁気ポリマー粒子は、磁気的に置き換え可能であるが、永久に磁化可能というものではない。磁気ポリマー粒子の製造方法が多く知られている。その多数は、マグヘマイト含有ポリマー粒子またはマグネタイト含有ポリマー粒子を、予備形成された磁気酸化鉄、例えば、マグネタイトから形成することを含む。それらの幾つかの関連方法は、米国特許出願公開第ＵＳ−Ａ−４，６５４，２６７（Ｕｇｅｌｓｔａｄ）（特許文献１）に記載されており、その内容はここに引例として組み入れる。
【０００４】
すなわち、特許文献１では、前処理に関する幾つかの制限を概説する。磁性材質内に多孔性ポリマー粒子の孔を組み込むことの困難性というより一般的な問題と同様に、同様の大きさ及び／又は同質又は単一の磁性特性の磁性粒子を得る困難性を含む。
【０００５】
基本的に前記表面又は大きく開いた孔に堆積させることで、磁性ポリマー粒子の実用的な寿命を短くし、磁性粒子の浸出が問題となった。
【０００６】
これらの不都合を克服するために特許文献１では以下のような準備方法を提案した。すなわち、もっとも簡単な形状で、多孔性ポリマー粒子を鉄化合物の溶液に含浸させ、その後、例えば、ｐＨの上昇により鉄を沈殿させる。ついで、沈殿した化合物を、加熱により超常磁性鉄酸化物結晶に変換できる。
【０００７】
前記ポリマー孔内に配置した磁性材料を有する多孔性磁性ポリマー粒子を製造するために、特許文献１では、そのポリマー粒子に鉄イオンを引き寄せる表面官能基を有する多孔性ポリマー粒子を主張した。これらの官能基は、前記ポリマーの製造における官能化コモノマーの使用や、官能基を導入するための重合後のポリマー処理、例えば、ポリマー表面に存在する基への共役又は変換により得られる。
【０００８】
特許文献１に開示の発明は、より均一な磁性粒子特性を有する磁性ポリマー粒子の製造方法の問題の一部を解決するが、前記ポリマー粒子から超常磁性結晶が溶出する問題は依然残っている。
【特許文献１】米国特許出願公開第４，６５４，２６７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
我々は、驚くべきことに、ある大きさの粒子とすることでこの問題を解決でき、表面官能化磁性ポリマー粒子を、ポリイソシアネート／ジオールの組合せ又はエポキシドモノマーと反応させることにより、特に適当な表面特性を備えた磁性粒子を製造でき、“被覆”磁性ポリマー粒子を製造できることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、第１の態様から見ると、本発明は、超常磁性結晶を含む被覆ポリマー粒子の調製方法であって、超常磁性結晶を含む直径０．５〜１．８μｍの多孔性表面官能化被覆ポリマー粒子、より好ましくは直径０．７５〜１．２μｍのポリマー粒子、特には約１μｍのポリマー粒子を、少なくとも１つのエポキシド化合物、好ましくは少なくとも２つのエポキシド化合物と反応させることを含む方法である。
【００１１】
第２の態様から見ると、超常磁性結晶を含む多孔性表面官能化被覆ポリマー粒子の調製方法であって、超常磁性結晶を含む直径０．５〜１．８μｍのポリマー粒子、より好ましくは直径０．７５〜１．２μｍのポリマー粒子、特には約１μｍのポリマー粒子を、少なくとも１つのポリイソシアネート（例えばジイソシアネート）及び少なくとも一つ、好ましくは少なくとも２つのジオールと反応させることを含む方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
好ましいジオールは、ポリエチレングリコールであるか、又は、式ＨＯ（（ＣＨ2）mＯ）nＨ（ｎは、１から１５の整数であり、好ましくは２から４の整数であり、ｍは２から６の整数であり、好ましくは２又は３、もっとも好ましくは２である。）のジオールである。ジオールを１つのみ使用する場合、ポリエチレングリコール、例えば、ポリエチレングリコール３００、４００、５００又は６００が好ましい。
【００１３】
本発明の方法で使用する前記多孔性ポリマー粒子は、官能化表面を有する多孔性ポリマーであればよく、例えば、米国特許出願公開第４，６５４，２６７号明細書に記載のものであってもよい。
【００１４】
前記ポリマーの表面官能基は、その表面にポリイソシアネート又はエポキシドを共有的に結合するために、ポリイソシアネート又はエポキシドと反応可能な基、任意で活性化されている基が好ましい。
【００１５】
前記ポリマーは、ビニル系ポリマー（例えば、スチレン）、アクリレート及び／又はメタクリレートの組合せから形成されるものが好ましい。前記ポリマー材料は、任意で、例えば、架橋剤、例えば、コモノマーとして、例えば、ジビニルベンゼン（DVB)、又は、エチレングリコールジメタクリレートの組み込みにより、架橋されていてもよい。ＤＶＢを含む粒子が好ましい。
【００１６】
前記必要な架橋剤（例えば、コモノマー）の適量は当業者に知られているであろう。前記ポリマーは、架橋されたスチレンポリマー(例えば、コモノマーを含むニトロ基、例えば、ニトロ−スチレン使用及び続く還元により表面官能化されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー)、又は、コモノマーを含むエポキシ基（例えば、グリシジルメタクリレート）の使用、及びその後のアミン化（例えば、エチレンジアミンとの反応）により表面官能化された架橋(メタ)アクリル酸ポリマーである。
【００１７】
本発明の方法に使用するポリマー粒子における超常磁性結晶は、多孔性ポリマー粒子中の超常磁性結晶形態中に沈殿されることが可能な材料であればいずれの種類でもよい。磁気酸化鉄、例えばマグネタイトまたはマグヘマイトが好ましい；しかしながら、前記結晶は、所望であれば、混合金属酸化物または他の磁気材料の種類であってもよい。存在する結晶磁気材料の全体量は、通常１％より多く、好ましくは３％より多く、望ましくは５％またはそれより多い（重量比で、例えば４０重量％まで。割合は、被覆粒子の全体の乾燥重量を基にしたＦｅ（または酸化鉄以外の磁気材料の場合、同等の金属）重量基準を基に計算する。
【００１８】
本発明のポリマー粒子の大きさは、通常、０．５〜１．８μｍの範囲であり、好ましくは、０．７５〜１．２μｍであり、好ましくは０．９〜１．１μｍである。
【００１９】
典型的には、使用する多孔性粒子の表面積は、２．７μｍの平均粒子直径に補正すると（すなわち、２．７／ＭＤによる相乗表面積、ＭＤは、マイクロメータでの平均直径である）、一般的には、少なくとも１５ｍ2／ｇ（ＢＥＴ窒素吸収法による測定）であり、より好ましくは少なくとも３０ｍ2／ｇであり、例えば、７００ｍ2／ｇまでである。同様に測定すると、前記粒子孔容積は少なくとも０．１ｍＬ／ｇが好ましい。
【００２０】
前記ポリマー粒子は、それらが被覆される前は、球状でありかつ、実質的には単分散であるのが典型的であり、一旦それら粒子が被覆されても球状のままであり、実質的に単分散であるのが特に好ましい。
【００２１】
実質的に単分散であるとは、複数の粒子（例えば、少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１０００）において、前記粒子が２０％未満の変動係数（ＣＶ）を有することを意味し、例えば、１５％未満であり、好ましくは１２％未満であり、より好ましくは１１％であり、更により好ましくは１０％未満であり、もっとも好ましくは約８％、例えば、２から５％にすぎないことである。ＣＶは、以下の式の割合として算出される。
【００２２】
ＣＶ＝（１００×標準偏差）／平均
【００２３】
前記式中、平均は、平均粒子直径であり、標準偏差は、粒子サイズにおける標準偏差である。ＣＶは、主最頻値を基に、すなわち、単一の分布曲線を検出粒子サイズ分布に適合させることにより、計算されるのが好ましい。したがって、最頻値サイズより小さいかまたは大きい粒子の幾つかは、計算において無視されてもよく、例えば、約９０％（すなわち、検出可能な粒子の）の全粒子数を基にしてもよい。そのようなＣＶの測定は、コールター（Coulter）ＬＳ１３０粒子サイズ分析器で行うことができる。
【００２４】
本発明で特に実用的な点は、ＷＯ０１／７０８２５で開示のアミノスチレンから部分的に作製されるＷＯ９９／１９３７５（Ｄｙｎｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｒ ＡＳＡ）、ＷＯ００／６１６４８（Ｄｙｎｏ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ＡＳ）に開示されているポリマー粒子である。これらの内容は本願に引用して援用する。
【００２５】
あるいは、ＷＯ０１／７０８２５の開示と対照的に、ポリマー粒子の官能化を重合後に行うことができる点である。例えば、ニトロ化、ついで形成したニトロ基をペンダント・アミン基へ還元することにより；または、直接アミノ化、例えば、アミノエタノールで処理することにより、行うことができる。更なる別の選択肢としては、よく知られたUgelstadの２工程膨潤方法、およびＷＯ００／６１６４７（Ｄｙｎｏ）に記載のその改良法により製造されたポリマー系粒子を用いてもよい。また、ＷＯ９９／１９３７５及びＷＯ００／６１６４８に開示の方法により調製したポリマー粒子も使用できる。これらの文献に開示の方法により製造した多孔性ポリマー粒子は、標準的な方法、例えば、前述のような方法によりそれらの孔に磁性粒子が配置されている。更なる可能性としては、多孔性ポリマー粒子は、ニトロスチレン及びＤＶＢや、米国特許出願公開第４，６５４，２６７号明細書のように導入した磁性材料から調製してもよい。これらの方法すべてにおいて、アミノスチレン、特に４−アミノスチレンのモノマー又はコモノマーとしての使用が、アミノ保持ポリマー材料の調製において好ましい。このモノマー又はコモノマーの使用は、重合後のニトロ化および還元反応の必要性を防ぐ。さらには、この方法により得られる被覆のより予想可能な特性（均質性）は、より正確な被覆を可能にする。
【００２６】
多孔性磁性ポリマー粒子と前記エポキシド又はポリイソシアネートとの反応は、前記ポリマー粒子の孔内にポリマーを生じさせる。前記ポリマーは、前記ポリマー粒子内に超常磁性結晶を物理的に封入し、孔を本質的に防ぐ役割を果たす。ついで、ポリマーを“被覆”することにより、多孔性出発原料と比較して気孔率を減らすことができる。驚くべきことに、我々は、前記超常磁性結晶が重合を触媒し、その近傍で被覆が優先的に形成されることを見出した。
【００２７】
必要に応じて、エポキシドポリマー被覆は、例えば、既知の方法でのイソシアネート又はジイソシアネートの使用による架橋であってもよい。必要に応じて更なる材料を、被覆重合反応前又は被覆重合後ではあるが被覆ポリマー架橋前に、前記多孔性粒子に含浸させてもよい。一般的には、このようなさらなる材料は、発光体又は吸収装置、例えば、発色団、蛍光団又は放射能標識材料であってもよい。
【００２８】
前記粒子を１つのエポキシドと反応させて前記被覆を形成してもよい。適当なエポキシドとしては、グリシドール、アリルグリシジルエーテル又はグリシジルメタクリレートがあげられる。特に、塩化鉄（III）を結合したグリシジルメタクリレートを含む被覆反応は、有利な被覆が得られる。
【００２９】
しかしながら、好ましい形態において、前記多孔性ポリマー粒子を、エポキシド、例えば、２−６エポキシド、特に２、３又は４エポキシドの混合物と反応させる。これらのうち、ジエポキシド又はポリエポキシドを少なくとも３０ｍｏｌ％を含むことが好ましく、少なくとも４５ｍｏｌ％を含むことがより好ましい。
【００３０】
本発明において使用するエポキシド化合物は、少なくとも一つのジエポキシド、例えば、２つのエポキシドの組合せ又はモノエポキシド及びジエポキシドの組合せを含むことが好ましい。前記エポキシドは、少なくとも一つのエーテル結合、及び、任意で、疎水性成分、例えば、Ｃ4-10アルキレン鎖又はフェニル若しくはビスフェニル基を含むことが好ましい。通常、前記エポキシドは、３〜５０の炭素原子を含み、好ましくは３〜２５である。
【００３１】
使用可能な典型的なエポキシドは、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、イソプロピルグリシジルエーテル、ブチルグリシジルエーテル、アリルグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４−ビス（２，３−エポキシプロポキシ）ブタン）、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコール ジグリシジルエーテル（例えば、Ｍｗ１５０〜１０００ｇ／ｍｏｌ）、グリセロールジグリシジルエーテル、グリセロールプロポキシレートトリグリシジルエーテル、グリシドール、グリシジルメタクリレート、及びビスフェノールＡ又はビスフェノールＦ系エポキシド、例えば、２，２−ビス（４−（２，３−エポキシプロポキシ）フェニル）−プロパンを含む。
【００３２】
特に好ましいエポキシドとしては、２，２−ビス（４−（２，３−エポキシプロポキシ）フェニル）−プロパン、アリルグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル及びグリシドールを含む。特に、商標Ａｒａｌｄｉｔｅを付したエポキシド固体が好ましく、例えば、商標Ａｒａｌｄｉｔｅ ＬＹ−５６４（２，２−ビス（４−（２，３−エポキシプロポキシ）フェニル）−プロパン及び１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルの混合物）及び商標Ａｒａｌｄｉｔｅ ＬＹ−０２６（純度８０％ １，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）が好ましい。
【００３３】
単一のエポキシドを使用して行う第１の被覆反応、及び、少なくとも二つのエポキシドの混合物を使用して行う第２の被覆反応は本発明の範囲内である。
【００３４】
その他の好ましい形態において、前記被覆粒子は、１以上（例えば、１、２又は３）のポリイソシアネート及び１以上（例えば、２、３又は４）のジオールから形成される。あるいは、ポリイソシアネートに近いものの混合物（例えば、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標））を使用できる。
【００３５】
使用可能な典型的なポリイソシアネートは、メチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、２，４−トルエンジイソシアネート（２，４−ＴＤＩ）（及び異性体又はその混合物）、イソフロンジイソシアネート（ＩＰＤＩ）、４，４’−オキシビス（フェニルイソシアネート）、４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート（ＭＤＩ）、ＭＤＩ及びＭＤＩ系オリゴマーの混合物（例えば、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ）、２，４−ジフェニルジイソシアネート、メチレン−ビスシクロヘキシルジイソシアネート（Ｈ12ＭＤＩ）、フェニレンジイソシアネート（ｐ−ＰＤＩ）、トランス−シクロヘキサン−１，４−ジイソシアネート（ＣＨＤＩ）、１，６−ジイソシアネートヘキサン（ＤＩＣＨ）、１，５−ジイソシアネートナフタレン（ＮＤＩ）、パラテトラメチルキシレンジイソシアネート（ｐ−ＴＭＸＤＩ）又はメタテトラメチルキシレンジイソシアネート（ｍ−ＴＭＸＤＩ）があげられる。
【００３６】
特に好ましいイソシアネートは、ＭＤＩ又はＭＤＩ系ポリイソシアネート（例えば、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標））である。Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標）は、ＭＤＩ、及び、ＣＨ2−フェニルイソシアネート基を備えたＭＤＩを含むそのオリゴマーを含む。すなわち、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標）は、ＭＤＩ由来の種々のポリイソシアネートの混合物である。サンプルの構造は、
４，４−メチレン−ビス（フェニルイソシアネート）：４０〜５０％、
４，４−メチレン−ビス（フェニルイソシアネート）＋ベンジルイソシアネート：２０〜２５％、
４，４−メチレン−ビス（フェニルイソシアネート）＋２ベンジルイソシアネート：１０％、
４，４−メチレン−ビス（フェニルイソシアネート）＋３ベンジルイソシアネート：２％であってもよい。（このような反応において、前記産物は、２−異性体の一部を含む。）
前記化合物は、商標Ｃａｒａｄａｔｅ、及び、Ｈｕｎｔｓｍａｎにより商標Ｈｙｌｅｎｅ及びＲｕｂｉｎａｔｅで販売されている。
【００３７】
２つのジオールを使用することが好ましい。前記ジオールは、（０．５：１）〜（１：０．５）のモル比で使用することが好ましく、より好ましくは（０．８：１）〜（１：０．８）のモル比である。好ましくは、ジオール混合物において９０ｍｏｌ％を超える量でいずれのジオールも使用しないことである。
【００３８】
好ましいジオールは、ジエチレングリコール、テトラエチレングリコール及びポリエチレングリコール、例えば、ＰＥＧ３００、４００又は６００を含む。好ましいジオールの組合せは、ジエチレングリコール及びテトラエチレングリコールである。
【００３９】
ポリイソシアネートを含む被覆反応の間、好ましくは、第１段階において、ポリイソシアネートを（例えば、ジオールに対して）過剰とすることである。被覆操作のこの段階でポリイソシアネートのみを使用することは、本発明の範囲内である。これにより、反応の間に生じるゲル化の可能性を最小限にすると考えられる。大過剰のポリイソシアネートを初期の被覆反応で使用すると、第２段階で、未反応のイソシアネート基と反応させるために更なるジオール（例えば、前記ジオール）と被覆粒子を反応させる必要がある。初期の被覆反応は、ポリイソシアネートのみを使用すると、その後、得られた粒子を少なくとも一つのジオールと反応させる必要がある。
【００４０】
このような形態において、ジオールは、ポリエチレングリコールが好ましい。ＰＥＧジオールの長鎖は、粒子を被覆した表面間での多くのリンカーの形成を可能にし、ストレプトアビジンのような親和性リガンドとの反応を容易にさせる。
【００４１】
すなわち、被覆するために、前記粒子をポリイソシアネートと反応させ、その後ジオールと反応させること、すなわち、段階的な反応は、本発明の範囲である。
【００４２】
そのため、典型的には、前記被覆反応は、多孔性磁性ポリマー粒子を、エポキシド又はポリイソシアネート及びジオールに含浸させること（例えば、これらの溶液（例えば、メタノール又はジグライム等の有機溶媒での溶液）の使用）、又は、有機溶媒での多孔性粒子の懸濁液と液体エポキシド又はジオール/ポリイソシアネート混合物との混合により行うことができる。超音波処理は、含浸を改善するために使用し、前記反応は、温度を、例えば、５０〜１００℃に上昇させることにより促進させてもよい。使用する溶媒は、大気圧下で抽出してもよい。
【００４３】
通常、磁性ポリマー粒子を、例えば、診断ツールとして使用する場合、カップリング及び生物学的媒体の一般的な水性システムにおけるその他の反応に十分に関与できるために、適当な割合の求電子性を必要とする。
【００４４】
被覆の一般的な極性は、求電子的であることが望ましい一方、求電子基の割合を所望の割合に調整するために、疎水性基を含む被膜を組み込んでもよい。このように、本発明は、幅広い範囲の極性を有する有用な診断及びその他のツールの提供を可能にする。
【００４５】
必要に応じて、本発明の方法において、被覆磁性ポリマー粒子の表面を、例えば、薬剤分子、レポーター標識（例えば、発色団、蛍光、酵素又は放射性同位体）又はリガンド（例えば、抗体又は抗体フラグメント、金属イオン複合剤、特定の結合パートナー対（例えば、ビオチン又はストレプトアビジン）、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド又はオリゴ糖）によりさらに官能化してもよい。
【００４６】
このようなカップリングは、直接又は間接（及び前記粒子と基質との間に結合を形成するためのカップリング剤の使用を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい）、及び、生体分解性又は非生体分解性であってもよい。磁性ポリマー粒子をターゲット活性化合物の放出のために使用する場合、生体分解性カップリングが望ましい。被覆を達成した後、被覆のペンデント基を処理して、かかる基質の接着のための適当な官能基（例えば、エポキシ、ヒドロキシ、アミノ等の官能基）を与えてもよい。
【００４７】
試料中に存在する又は存在しない特定の検体への親和性に基づき、選択的する特性を解明し、前記官能化被覆磁性粒子を親和性リガンドに結合させてもよい。そのため、前記親和性分子は、特定の検体を特異的に認識可能である磁性プローブに結合可能なあらゆる分子を含んでいてもよい。このため親和性リガンドは、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、抗体フラグメント、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、オリゴペプチド、多糖、糖、ペプチド、核酸分子をコードするペプチド、抗原、薬剤及びその他のリガンドを含む。適当な親和性リガンドの例は、刊行物で入手可能であり、公知である。更なる結合パートナーの使用、第２の親和性リガンド及び結合基は、当該分野でありふれており、本願明細書においてさらに議論する必要はなく、必要に応じて本発明の粒子に応じた種類の使用が可能である。
【００４８】
特に好ましい形態において、前記粒子の被覆は、アクリルレートと共重合可能な官能基、例えば、炭素−炭素二重結合を有するエポキシド化合物を使用して準備することである。例えば、２又は３のエポキシドであって、そのうちひとつが不飽和炭素−炭素結合を含むエポキシドを使用する。ついで、官能基、例えば、カルボン酸基を有するビニル又はアクリレートモノマー（例えば、アクリル酸）と前記被覆粒子を反応させることにより官能化してもよい。ついで、更なる官能化は、ペンダントカルボキシル基の反応、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はストレプトアビジンとの反応により容易に行うことができる。この方法及びそれにより形成される粒子は、新規であり、本発明の更なる態様を形成する。
【００４９】
すなわち、本発明の更なる態様は、被覆ポリマー粒子であって、任意で、超常磁性結晶を保持し、少なくとも２つのエポキシドであって、そのうちの少なくとも一つがアクリレートモノマーと共重合可能な不飽和炭素−炭素結合を有するエポキシドにより形成された被覆を有するポリマー粒子である。
【００５０】
本発明の更なる態様は、被覆ポリマー粒子の調製方法であって、前記ポリマー粒子は、任意で超常磁性結晶を含有し、前記方法は、任意で超常磁性結晶を含有する多孔性表面官能化ポリマー粒子と、少なくとも２つのエポキシド化合物との反応させる工程であって、前記エポキシド化合物の少なくとも一つがアクリレートモノマーと共重合可能な不飽和炭素-炭素結合を有する工程、及び、得られた粒子をビニルモノマー（例えば、アリルグリシジルエーテル又はアクリレートモノマー、例えば、アクリル酸又はアクリルアミド）と反応させる工程を含む方法である。ついで、得られた粒子を親和性リガンド、例えば、ストレプトアビジンとさらに反応させてもよい。
【００５１】
本発明の更なる態様は、合成、抽出又はアッセイにおける本発明の粒子の使用であって、特に、核酸検出における本発明の粒子の使用である。
【００５２】
これらの態様において有用なエポキシドには、グリシジルメタクリレート及びアリルグリシジルエーテルを含む。
【００５３】
例えばアクリル酸と重合可能なビニル基の導入は、被覆表面を無水メタクリル酸のような化合物で反応させることにより行うことができる。例えば、２つのエポキシドの反応により形成される被覆を含む被覆粒子を、洗浄して（例えば、ＮａＯＨで）ヒドロキシル官能基を露出させ、メチルアクリル系無水物で直ちに反応させて、ポリマー表面にビニル基を導入させることができる。
【００５４】
前述のように、粒子に結合した外部物質の特性は、その能力に基づき、特定のターゲット材料の結合を選択する。核酸検出は、通常、核酸プローブを用いてターゲットの核酸が含有していると考えられる試料を調査することを含む。前記核酸プローブは、ターゲットの核酸の配列と、例えば、特異的にハイブリダイズする核酸配列、例えば、核酸親和性リガンド及びターゲットの核酸を組み合わせてハイブリダイズ層を形成することを含む。本発明の官能化粒子は、例えば、少なくとも２つのエポキシドで被覆され、後にストレプトアビジンと反応するカルボキシル基を保持する粒子が、核酸検出に観念的に適している。
【００５５】
ビオチン化単一鎖オリゴヌクレオチドプローブを結合させたストレプトアビジンビーズは、ＤＮＡに特異的な配列の単離に使用できる。前記ビオチン化プローブは、過剰なビオチン化プローブと適当量のビーズを混合することにより、前記ビーズに結合される。ついで、ハイブリダイゼーション緩衝液、例えば、ＳＳＰＥ又はＳＳＣ中で、プローブ及びＤＮＡの長さ及び配列に適当な条件下で、前記ビーズ／プローブをＤＮＡ試料とインキュベートする。過剰かつ不要なＤＮＡを、前記ビーズの磁性特性を利用して洗浄する。捕獲したＤＮＡをＰＣＲ等で検出／定量できる。
【００５６】
ビオチン化二重鎖ＤＮＡフラグメントを結合させたストレプトアビジンビーズは、タンパク質に特異的に結合するＤＮＡ配列の単離に利用できる。適当量のビーズと過剰なビオチン化ＤＮＡフラグメントを混合することにより、ビオチン化ＤＮＡを前記ビーズに結合させる。ついで、前記ビーズ／ＤＮＡを前記タンパク質試料とともにハイブリダイゼーション緩衝液中で、調査するタンパク質に適当な条件下で、インキュベートする。過剰かつ不要なタンパク質を、前記ビーズの磁性特性を利用して洗浄する。捕獲したタンパク質は、下流の用途及び検出のために（高塩、低塩、加熱、低ｐＨ等により）前記プローブから抽出できる。
【００５７】
ターゲット材料は、任意で、生物学的又は合成源の材料であってよい。例えば、分子または分子の基であってもよいし、例えば、抗体、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、酵素、酵素基質、ホルモン、リンホカイン、代謝産物、抗原、ハプテン、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、毒素、毒、環境汚染物質、炭水化物、オリゴ糖、多糖、グリコプロテイン、グリコリピッド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸及び誘導核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、天然又は合成薬剤、レセプター、ウイルス粒子、バクテリア粒子、ウイルス成分、細胞、膜成分、天然又は合成脂肪小胞、ポリマー膜、ポリマーサービス（ｓｅｒｖｉｃｅｓ）及び粒子並びにガラス及びプラスチック面を含んでいてもよい。
【００５８】
本発明のビーズは、免疫測定に使用でき、驚くべきことに、被覆後の粒子のトシル化により、免疫測定における改善された能力を示す粒子が得られることを見出した。すなわち、特に好ましい形態において、被覆した粒子をトシル化することであり、例えば、塩基存在下でのトシルクロライドと粒子との反応によりトシル化できる。得られたトシル化被覆粒子は、新規で、本発明の更なる態様を形成する。トシルは、トルエン−４−スルホニル基を意味する。
【００５９】
さらには、このようにトシル化された種は、親和性リガンド、例えば、ストレプトアビジンとの反応を容易にし、さらに新たな粒子を形成できる。
【００６０】
すなわち、更なる態様の観点から、本発明は、被覆ポリマー粒子であって、超常磁性結晶を保持し、少なくとも一つのポリイソシアネート及び少なくとも一つのジオールから形成された被覆を有し、その後、例えば、トシルクロライドとの反応によりトシル化され、任意で、親和性リガンド、例えば、ストレプトアビジンと反応させた粒子を提供する。
【００６１】
その他の態様の観点から、本発明は、被覆ポリマー粒子であって、任意で超常磁性結晶を保持し、少なくとも一つのエポキシドから形成された被覆を有し、その後例えば、トシルクロライドとの反応によりトシル化され、任意で、親和性リガンド、例えば、ストレプトアビジンと反応させた粒子を提供する。
【００６２】
さらには、驚くべきことに、本願でクレームする直径の粒子は、より大きなサイズのビーズ、例えば、３μｍのビーズと比較して、結合能を極めて増加させることを見出した。クレームするビーズの結合能は、より大きなビーズの結合能よりも２００％以上優れており、分析操作において粒子の使用量を大幅に減少できる。
【００６３】
そのため、本発明のビーズは、逆相クロマトグラフィー又は疎水性作用クロマトグラフィーのメカニズムと同様の吸着/脱着処理に利用できる。逆相クロマトグラフィーは、溶質分子（例えば、タンパク質）と固定化した疎水性リガンド（例えば、ビーズ表面）との間の疎水性吸着相互作用を利用する分離技術である。この相互作用は、通常、極めて強く、低イオン強度の溶液により生じさせることができ、有機溶媒（例えば、アセトニトリル）の使用により壊すことができる。逆相クロマトグラフィーは、複合タンパク質試料を分別し、タンパク質試料を脱塩するために使用できる。ＲＰＣは、通常、カラムに充填した固相を用いて行う。本発明のビーズによれば、カラムを用いず、試料が溶出することなく、高速に自動で行う技術を可能にする。
【００６４】
疎水性作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、溶質分子（例えば、タンパク質）と固定化した疎水性リガンド（例えば、ビーズ表面）との間の疎水性吸着相互作用を利用する分離技術である。この相互作用は、ＲＰＣの間に利用する相互作用よりも弱く、高塩濃度による促進を必要とする。したがって、塩濃度の減少をこれらの吸着相互作用の破壊に使用できる。ＨＩＣは、複合タンパク質試料の分別及びタンパク質試料の脱塩に使用できる。ＨＩＣは、通常、カラムに充填した固相を用いて行われる。本発明のビーズによれば、カラムを用いず、試料が溶出することなく、高速に自動で行う技術を可能にする。
【００６５】
以下の実施例を用いて本発明をさらに説明する。これらは本発明の単なる例であって限定するものではない。
【実施例１】
【００６６】
０．３μｍ種粒子の調製
スチレン１６００ｇを１０重量％水酸化ナトリウム２Ｌで抽出し、水で洗浄してｐＨ７とし、ついでアルゴンを１０分流した。１０Ｌの反応容器内で、水８０００ｇとホウ砂３．０７ｇを８０℃で加熱し、水１００ｇを蒸発乾固させ、酸素を除去した。ついで、湯２００ｍＬ中硫酸デシルナトリウム１９．９７ｇを充填し、１０分間攪拌した。ついで、洗浄した後、実質的に酸素フリーのスチレンを充填し、１５分間攪拌した。ついで、湯２００ｍＬ中ペルオキソ２硫酸カリウム４．８０ｇを充填した。前記混合物を８０℃、アルゴン雰囲気下で１３時間保持した。直径０．３μｍの粒子を有するポリマー粒子の単分散懸濁液が形成された。
【実施例２】
【００６７】
１．０μｍポリスチレン粒子の調製
水８８６０ｇ、ＤＯＰ（ジオクタノイル過酸化物）８６６ｇ、アセトン４３３ｇ及びＳＤＳ ５１．９６ｇを、２段階のマントンガウリンホモジナイザーで２５分間均質化した。第１段階では４００ｋｇ／ｃｍ2で、第２段階では１００ｋｇ/ｃｍ2とした。均質化後、乳濁液５１６４ｇを、実施例１で形成した直径０．３μｍの単分散ポリスチレン粒子の種懸濁液で満たした。ポリマー粒子２９７．８ｇ及び水１５９３ｇを含む種懸濁液１８９１ｇを使用した。
【００６８】
２５℃で２４時間攪拌後、活性種粒子懸濁液６４１４ｇを、水１０３４００ｇ、ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム)１３１ｇ、ポリビニルピロリドンＫ−３０ １５５６ｇ、６３．２％ジビニルベンゼン４１５７ｇ、スチレン１０６０ｇおよびトルエン（ポロゲン（ｐｏｒｏｇｅｎ）として）１１６０６ｇを含む乳濁液で満たした。前記乳濁液を、第１段階では４００ｋｇ／ｃｍ2で、第２段階では１００ｋｇ／ｃｍ2で２５分間均質化した。
【００６９】
２５℃で２時間膨張させた後、水４６６７６ｇを前記反応容器に加え、ついで前記分散液を６０℃で１時間及び７０℃で２０時間重合させた。直径１．０μｍの粒子を有する単分散懸濁液が形成された。
【００７０】
前記粒子をメタノール及びブチルアセテートで洗浄し、乾燥させた。ＢＥＴにより前記比表面積を測定したところ５７０ｍ2／ｇ乾燥物質であった。
【実施例３】
【００７１】
ニトロ化
９５％硫酸９９２０ｇ及び６５％硝酸３０２０ｇの混合物を１０℃で冷却し、ついで、実施例２の１．０μｍ乾燥架橋ポリスチレン粒子を４００ｇ加えた。温度を１時間半で３０℃に上昇させた。前記懸濁液を６０Ｌの氷水で満たした。前記粒子を水及びメタノールでろ過により洗浄した。得られた粒子は、９．０重量％窒素を含有した。
【実施例４】
【００７２】
鉄の混和
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２５７９ｇ及びＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ ３．２ｇを、粒子４５０ｇ及び水３６９４ｇを含む実施例３の窒素化多孔性粒子の懸濁液４１４４ｇに加えた。前記懸濁液を室温で３０分間攪拌した。２５％ＮＨ3水を３２８５ｇ加えた。温度を２時間で６０℃に上昇させた。前記懸濁液を冷却し、前記粒子を遠心分離により水で洗浄した。精製後、前記粒子をメタノールに移した。前記粒子の分析により、３３０ｍｇＦｅ／ｇＤＳ（乾燥物質）及び０．９ｍｇＭｎ／ｇＤＳの含有量であった。
【実施例５】
【００７３】
被覆
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子を１３．３ｇ含むメタノール懸濁液１３３ｇを、９３ｇのジグライム（ｄｉｇｌｙｍｅ）で５回洗浄した。ジグライム中の粒子の乾燥物質を１５重量％に調整し、グリシドール（３．０７ｇ）、１，４−ブタンジオールジグリシジルエタノール（Ａｒａｌｄｉｔｅ（商標）ＤＹ−０２６、８．０６ｇ）及びグリシジルメタクリレート（５．６８ｇ）を前記粒子に加えた。前記混合物を７５℃に加熱し、２０時間攪拌した。ついで、前記粒子を７０ｇのメタノールで６回洗浄し、８０ｇのイソプロパノールで４回洗浄した。
【実施例６】
【００７４】
カルボン酸基での官能化
実施例５で調製した粒子（４２５ｇ）のイソプロパノール懸濁液１８０６ｇに、メタノール（７７４ｇ）、アクリル酸（５１４ｇ）及び２，２’−アゾイソブチロニトリル（２３．４ｇ）を加えた。前記混合液を７３〜７５℃に加熱し、２０時間攪拌した。ついで、前記粒子を２３３８ｇのメタノールで６回洗浄し、３０１８ｇの０．１５Ｍ ＮａＯＨで一度洗浄した。粒子含有量（乾燥物質を基準とする）を１２重量％に調節し、前記混合液を７５℃に加熱し、３．５時間攪拌した。前記粒子を３１８８ｇの水で３回洗浄し、３１８８ｇの０．０１Ｍ ＮａＯＨで５回洗浄した。
【００７５】
工程（Ａ）で調製した粒子（１３．３ｇ）のイソプロパノール懸濁液４７ｇに、メタノール（２４ｇ）、アクリル酸（９．６４ｇ）及び２，２’−アゾイソブチロニトリル（０．４１ｇ）を加えた。前記混合液を、７３〜７５℃に加熱し、２０時間攪拌した。ついで、前記粒子を７３ｇのメタノールで６回洗浄し、９４ｇの０．１５Ｍ ＮａＯＨで一度洗浄した。粒子混合液の乾燥物質を１２重量％に０．１５Ｍ ＮａＯＨで調節し、前記混合液を７５℃に加熱し、３．５時間攪拌した。前記粒子を９９ｇの水で３回洗浄し、９９ｇの０．０１Ｍ ＮａＯＨで５回洗浄した。
【実施例７】
【００７６】
カルボン酸基のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルへの官能化
実施例６の粒子を５．０ｇ含む懸濁液５０ｇを、０．１Ｍ酢酸での洗浄により（３×５０ｍＬ）酸性にした。ついで、酸性にした粒子（カルボン酸含有量０．５ｍｍｏｌ／ｇＤＳ）をアセトン（４×５０ｍＬ）で洗浄し、磁石で濃縮した。懸濁液が３５．６ｇとなるまで余分量のアセトンを追加した。ついで、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．９０ｇ、２５ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルカルボジイミド（３．１６ｇ、２５ｍｍｏｌ）を加えた。前記反応混合液を室温で５時間攪拌した。ついで、前記粒子をアセトンで洗浄した（５×５０ｍＬ）。
【実施例８】
【００７７】
ストレプトアビジンの固定化
１．実施例６のカルボン酸官能化ビーズ２０ｍｇを、１ｍＬの０．０１Ｍ ＮａＯＨに分散させた。
２．前記ビーズを磁石で分離し、上清を除去した。
３．前記ビーズを１ｍＬの３０ｍＭ２−モルホリノ−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）ｐＨ６．１で３回洗浄した。
４．３０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．１）９００μＬに、１．８ｍｇのストレプトアビジンを溶解し、前記ビーズに加えた。
５．前記ビーズ及びストレプトアビジンを室温で１５分間、混合装置でインキュベートした。
６．７５μＬの冷蒸留水に溶解した１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（３ｍｇ）を加えた。
７．前記混合液を、室温で１時間、混合装置でインキュベートした。
８．前記ビーズを、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で３回洗浄し、過剰なストレプトアビジン及びＥＤＣを除去した。
９．前記ビーズを０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で再懸濁した。
【００７８】
被覆の間、ストレプトアビジンの量は、Ｉ125−標識ストレプトアビジンの量を追跡することにより測定した。Ｉ125−標識ストレプトアビジンの相対量は、表面を被覆したストレプトアビジンの量を示す。
【００７９】
遊離ビオチン結合能は、過剰なＣ14−標識ビオチンを前記ストレプトアビジン被覆ビーズへ添加することにより測定した。過剰なビオチンを洗浄し、Ｃ14−標識ビオチン量をβ−シンチレーションカウンターを用いて測定した。
【００８０】
ストレプトアビジンの被覆量は、ビーズ１ｍｇあたり６８μｇであり、遊離ビオチン結合能は、３１００ｐｍｏｌ遊離ビオチン／１ｍｇビーズであった。
【実施例９】
【００８１】
工程Ａ
ジグライム２００ｇ中の超常磁性酸化鉄（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４等同様にして作製）４０．０ｇに１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル１００ｇ及びグリシドール１００ｇを加えた。前記反応混合物を２５０ｒｐｍ、９０℃で２０時間攪拌した。ついで、前記粒子を４００ｍＬのメタノールで５回洗浄し、４００ｍＬの脱イオン水で４回洗浄した。
【００８２】
工程Ｂ
工程Ａで調製した粒子の水性懸濁液７２ｇ（粒子含有量１０重量％）に、水酸化ナトリウムを１１９ｇゆっくり添加した。ついで、アリルグリシドールエーテルを１６９．２ｇ加えた。２５０ｒｐｍ、６０℃で１８時間攪拌後、前記粒子を１４００ｍＬのメタノールで５回洗浄した。
【実施例１０】
【００８３】
ジグライム４０ｇ中の超常磁性酸化鉄（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４等同様にして作製）１０ｇに、これにアリルグリシジルエーテルを１６．７ｇ、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルを１６．８ｇ及びグリシドールを１６．８ｇ加えた。前記反応混合物を３００ｒｐｍ、９０℃で２０時間攪拌した。ついで、前記粒子を１００ｍＬのメタノールで５回洗浄した。
【実施例１１】
【００８４】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子を１３ｇ含むジグライム懸濁液７８ｇに、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ（３５．８３ｇ）、ジエチレングリコール（２．８２ｇ）、 テトラエチレングリコール（４．８４ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃に加熱し、２１時間攪拌した。
【００８５】
ジエチレングリコール（４７．０４ｇ）、テトラエチレングリコール（８０．４５ｇ）及び１，４−ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン（１．２９ｇ）を、前記粒子懸濁液に加えた。前記混合物を８０℃に加熱し、２時間攪拌した。前記粒子を冷却し、１００ｇのジグライムで３回洗浄し、１００ｇのアセトンで４回洗浄した。
【実施例１２】
【００８６】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により官能化されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）のメタノール懸濁液２２ｇを、１４ｇのジグライムで５回洗浄した。ジグライムにおける粒子の乾燥物質を１６重量％に調節し、Ａｒａｌｄｉｔｅ（商標）ＤＹ−０２６（１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）（２６ｇ）及びグリシドール（２６ｇ）を前記粒子に加えた。前記混合物を９０℃に加熱し、２０時間攪拌した。ついで、前記粒子を８０ｇのメタノールで５回洗浄し、４５ｇのジグライムで４回洗浄した。
【００８７】
前記粒子のジグライム懸濁液１８ｇに、無水メタクリル酸（１５ｇ）及びピリジン（０．４ｇ）を加えた。前記混合物を７５℃に加熱し、２０時間攪拌した。ついで、前記粒子を９０ｇのメタノールで５回洗浄し、６０ｇのイソプロパノールで３回洗浄した。
【実施例１３】
【００８８】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を２０ｇ含むジグライム懸濁液１２４．４５ｇに、２，２−ビス［４−（グリシジルオキシ）フェニル］プロパン（ビスフェノールＡジグリシジルエーテル、Ａｒａｌｄｉｔ ＬＹ５６４）（４２ｇ）を加えた。前記混合物を６０℃に加熱して２時間攪拌し、室温に冷却して一晩攪拌した。前記懸濁液をジグライムで３回洗浄し、乾燥物質を１２％に調節した。
【００８９】
グリシドール（４．５８ｇ）、Ａｒａｌｄｉｔｅ（商標） ＤＹ−０２６（１，４ ブタンジオールジグリシジルエーテル）（１２．１ｇ）及びグリシジルメタクリレート（８．５７ｇ）を加えた。前記混合物を７５℃に加熱し、２１時間攪拌した。前記粒子懸濁液を冷却し、前記粒子を１００ｇのメタノールで６回洗浄し、１００ｇのイソプロパノールで４回洗浄した。
【実施例１４】
【００９０】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子（３７５ｇ）を５１．６ｇ含む水懸濁液５１６ｇに、前記混合物を攪拌しながら温度を４２℃に保持し、固体水酸化ナトリウム（１４４．８９ｇ）を加えた。アリルグリシジルエーテル（２０６．４ｇ）を加え、前記混合物を６０℃に加熱して１８時間攪拌した。前記粒子懸濁液を冷却し、前記粒子を１５００ｇのメタノールで４回洗浄した。
【実施例１５】
【００９１】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を１５ｇ含むメタノール懸濁液９０ｇを、６０ｇのジグライムで３回洗浄し、２，２−ビス［４−（グリシジルオキシ）フェニル］プロパン（ビスフェノール Ａ ジグリシジルエーテル、Ａｒａｌｄｉｔ ＬＹ−５６４）（７０．４０ｇ）及び１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（Ａｒａｌｄｉｔ ＤＹ−０２６）（４．６１ｇ）を加えた。前記混合物を９５℃で２０時間加熱した。前記粒子を冷却し、１００ｇのジグライムで３回洗浄し、１００ｇのメタノールで３回洗浄した。
【実施例１６】
【００９２】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を５ｇ含むジグライム懸濁液２３．４８ｇに、２，２−ビス［４−（グリシジルオキシ）フェニル］プロパン（ビスフェノールＡジグリシジルエーテル、Ａｒａｌｄｉｔ ＬＹ５６４）（２３．４７ｇ）及びポリエチレングリコールジグリシジルエーテル Ｍｗ３００（３．０７ｇ）を加えた。前記混合物を、９５℃で２０時間加熱した。前記粒子を冷却し４０ｇのメタノールで４回洗浄した。
【実施例１７】
【００９３】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を５ｇ含むジグライム懸濁液２４．４６ｇに、２，２−ビス［４−（グリシジルオキシ）フェニル］プロパン（ビスフェノールＡジグリシジルエーテル、Ａｒａｌｄｉｔ ＬＹ５６４）（２３．５４ｇ）及びポリエチレングリコールジグリシジルエーテル Ｍｗ５００（１５．２８ｇ）を加えた。前記混合物を９５℃で２０時間加熱した。前記粒子を冷却し４０ｇのメタノールで４回洗浄した。
【実施例１８】
【００９４】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を５ｇ含むジグライム懸濁液２６．８２ｇに、２，２−ビス［４−（グリシジルオキシ）フェニル］プロパン（ビスフェノールＡジグリシジルエーテル、Ａｒａｌｄｉｔ ＬＹ−５６４）（４６．９３ｇ）及びグリセロールプロポキシレートトリグリシジルエーテル（６９．９８ｇ）を加えた。前記混合物を９５℃で２０時間加熱した。前記粒子を冷却し、４０ｇのメタノールで４回洗浄した。
【実施例１９】
【００９５】
ストレプトアビジンの固定化
実施例１７の被覆ビーズ２０ｍｇを、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍＬに分散させた。ビーズを磁石で分離し、上清を交換した。これを２回繰り返した。０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）９００μＬに、ストレプトアビジン１ｍｇを溶解し、これを前記ビーズに加えた。ビーズ及びストレプトアビジンを混合装置で、室温で２０時間インキュベートした。前記ビーズをＰＢＳ（ｐＨ７．４、０．１％ＢＳＡ）で３回洗浄した。
【００９６】
遊離ビオチン結合能は、実施例２０に記載のようにして測定し、１９００ｐｍｏｌ遊離ビオチン／１ｍｇビーズであった。
【実施例２０】
【００９７】
ビオチン化ＤＮＡ分子の結合能
１．１０９０，５２６，２１７塩基対のプラスミドＤＮＡフラグメントをビオチン化し、ＰＣＲによりユウロピウム標識した。
２．過剰なビオチン及びユウロピウム標識を、市販のＰＣＲ浄化法により除去し、標識されたＤＮＡを、２６０ｎｍの光学密度及び時間分解蛍光で定量した。
３．ストレプトアビジン被覆ビーズ（実施例８）を、２倍に濃縮した結合緩衝液（２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、０．２Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５）で１度洗浄した。
４．洗浄したビーズ５μｇを結合緩衝液１００μＬに９６ウエルプレートの各ウエルで再懸濁した。
５．水１００μＬに希釈された過剰なＤＮＡ（０．５５ｐｍｏｌの１０９０ｂｐ、１．１ｐｍｏｌの５２６ｂｐ及び２．２ｐｍｏｌの２１７ｂｐ）を、前記ビーズに加え、室温で１５〜３０分穏やかに攪拌しながらインキュベートした。
６．前記プレートを磁石上に配置し、上清を除去した。
７．前記ビーズ−ＤＮＡ複合体を洗浄緩衝液（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．８、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０）２００μＬで３回洗浄した。
８．前記ビーズ−ＤＮＡ複合体を、ＤＥＬＦＩＡ増強（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）溶液２００μＬに再懸濁し、遮光し、室温で１０分間攪拌しながらインキュベートした。
９．前記プレートを磁石上に配置し、前記増強溶液をＦｌｕｏｒＮｕｎｃ ９６ウエルプレートに移し、ユウロピウムのシグナルを時間分解蛍光により測定し（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）、ｃｏｕｎｔｓ／ｓｅｃｏｎｄ（ｃｐｓ）を得た。
１０．ビーズに結合したＤＮＡを、ビーズに結合しているＤＮＡが０．５５、１．１及び２．２ｐｍｏｌで添加されたｃｐｓの割合から計算された。
【００９８】
前記ビーズ結合能は、２１７ｂｐフラグメントでは約２００ｐｍｏｌ／ｍｇ、５２６ｂｐフラグメントでは８０〜１００ｐｍｏｌ／ｍｇ及び１０９０ｂｐフラグメントでは３５〜４５ｐｍｏｌ／ｍｇであった。
【実施例２１】
【００９９】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を５ｇ含むジグライム懸濁液２３．８ｇに、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ（１８．３４ｇ）、ジエチレングリコール（１．４５ｇ）、テトラエチレングリコール（２．４８ｇ）及びジグライム（３６．２ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、２０時間攪拌した。
【０１００】
ポリエチレングリコール Ｍｗ３００（６８．２４ｇ）、テトラエチレングリコール（４１．３０ｇ）及び１，４ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン（０．６８ｇ）を、前記粒子懸濁液に加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、１時間攪拌した。前記粒子を冷却し、１００ｇのジグライムで３回洗浄し、１００ｇのアセトンで４回洗浄した。
【実施例２２】
【０１０１】
免疫グロブリンの固定化
実施例２１の被覆ビーズ２０ｍｇを０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１ｍＬに分散させた。ビーズを磁石で分離し、上清を交換した。これを２回繰り返した。マウスＩｇＧ１抗ヒトαフェトプロテイン１ｍｇを、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）９００μＬに溶解し、これを前記ビーズに加えた。ビーズ及び抗体を、混合装置で、室温で２０時間インキュベートした。前記ビーズをＰＢＳ（ｐＨ ７．４、０．１％ ＢＳＡ）で３回洗浄した。
【０１０２】
被覆の間、前記ビーズに結合した抗体量をＩ125−標識抗体の量の追跡を利用して測定した。前記ビーズに結合した標識抗体の相対量は、固定化された抗体の全体量を示す。前記ビーズに固定化されたタンパク質の量は、２２μｇ抗体／ｍｇビーズであった。
【０１０３】
αフェトプロテインの固定化抗体への結合は、臍帯血の希釈液の添加により測定し、Ｅｕ3+で標識した第２のマウスＩｇＧ抗−ヒトαフェトプロテインを用いて検出した。標識した抗体は時間分解蛍光分光法で検出した。前記臍帯血の希釈液の標準曲線は、濃度増加に伴うシグナル増加を示した。
【実施例２３】
【０１０４】
超磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）５ｇ含むジグライム懸濁液２６．８２ｇに、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ（１８．３４ｇ）、ポリエチレングリコール Ｍｗ６００（１５．８４ｇ）及びジグライム（３３．２０ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃に加熱し、２０時間攪拌した。
【０１０５】
ポリエチレングリコール Ｍｗ６００（２６３．８２ｇ）及び１，４−ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン（０．６６ｇ）を前記粒子懸濁液に加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、１時間攪拌した。前記粒子を冷却し、１００ｇのジグライムで３回洗浄し、１００ｇのアセトンで４回洗浄した。
【実施例２４】
【０１０６】
カルボン酸基での官能化
実施例５で調製した粒子（２．５ｇ）のイソプロパノール懸濁液１５．８７ｇに、アクリル酸（１．８４ｇ）、アクリルアミド（１．７９ｇ）、メタノール（５．９５ｇ）及び２，２’−アゾイソブチロニトリル（０．２８ｇ）を加えた。前記混合物を７５℃で加熱し、２０時間攪拌した。ついで、前記粒子を２０ｇのイソプロパノールで４回洗浄し、２５ｇの０．１５Ｍ ＮａＯＨで４回洗浄した。
【実施例２５】
【０１０７】
カルボン酸基での官能化
実施例５で調製した粒子（１ｇ）の水懸濁液８．４４ｇに、アクリル酸（０．３７ｇ）、アリルグリシジルエーテル（１．３４ｇ）、ジメチルスルホキシド（０．９１ｇ）及び２，２’アゾイソブチロニトリル（０．０６ｇ）を加えた。前記混合物を７５℃で加熱し、２０時間攪拌した。ついで、前記粒子を１０ｇのイソプロパノールで４回洗浄し、１０ｇの０．１５Ｍ ＮａＯＨで４回洗浄した。
【実施例２６】
【０１０８】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を２．７ｇ含むジグライム懸濁液３．９ｇに、ヘキサメチレンジイソシアネート（２．５ｇ）、ジエチレングリコール（０．５ｇ）及びテトラエチレングリコール（１．０ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、２０時間攪拌した。
【０１０９】
ジエチレングリコール（２．６５ｇ）、テトラエチレングリコール（４．６６ｇ）及び１，４−ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン（０．０７ｇ）の混合物を、前記粒子懸濁液に追加した。前記混合物を９５℃に加熱し、２〜３時間攪拌した。前記粒子を冷却し、２０ｇのアセトンで４回洗浄した。
【実施例２７】
【０１１０】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を５ｇ含むジグライム懸濁液２３．８ｇに、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ（１８．３４ｇ）、ジエチレングリコール（１．４５ｇ）、テトラエチレングリコール（２，４８ｇ）及びジグライム（３６．２ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、２０時間攪拌した。
【０１１１】
ポリエチレングリコール Ｍｗ４００（９０．０３ｇ）、テトラエチレングリコール（４１．２０ｇ）及び１，４−ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン（０．６８ｇ）の混合物を前記粒子懸濁液に加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、１時間攪拌した。前記粒子を冷却し、１００ｇのジグライムで３回洗浄し、１００ｇのアセトンで４回洗浄した。
【実施例２８】
【０１１２】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を５ｇ含むジグライム懸濁液２３．８ｇに、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ（１８．３４ｇ）、ジエチレングリコール（１．４５ｇ）、テトラエチレングリコール（２，４８ｇ）及びジグライム（３６．２ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、２０時間攪拌した。
【０１１３】
ポリエチレングリコール Ｍｗ６００（１３５ｇ）、テトラエチレングリコール（４１．３０ｇ）及び１，４−ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン（０．６６ｇ）の混合物を前記粒子懸濁液に加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、１時間攪拌した。前記粒子を冷却し、１００ｇのジグライムで３回洗浄し、１００ｇのアセトンで４回洗浄した。
【実施例２９】
【０１１４】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を５ｇ含むジグライム懸濁液２３．８ｇに、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ（１８．３４ｇ）、ジエチレングリコール（１．４５ｇ）、テトラエチレングリコール（２，４８ｇ）及びジグライム（３６．２ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、２０時間攪拌した。
【０１１５】
エチレングリコール（２７．２９ｇ）及び１，４−ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン（０．６６ｇ）の混合物を前記粒子懸濁液に加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、１時間攪拌した。前記粒子を冷却し、１００ｇのジグライムで３回洗浄し、１００ｇのアセトンで４回洗浄した。
【実施例３０】
【０１１６】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を５ｇ含むジグライム懸濁液２６．８２ｇに、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ（１８．３４ｇ）及びエチレングリコール（１．６４ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、２０時間攪拌した。エチレングリコール（２７．２９ｇ）及び１，４−ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン（０．６６ｇ）の混合物を前記粒子懸濁液に加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、１時間攪拌した。前記粒子を冷却し、１００ｇのジグライムで３回洗浄し、１００ｇのアセトンで４回洗浄した。
【実施例３１】
【０１１７】
トシル基での活性化
実施例３０の粒子４ｇのアセトン懸濁液１７．１ｇに、トシルクロライド（１６ｇ）及びピリジン（７．８５ｇ）を加えた。前記混合物を、２５℃で１７時間攪拌した。ついで、前記粒子を５０ｍＬのアセトンで３回洗浄し、水とアセトンの混合液（アセトン８０重量％）５０ｍＬで一度洗浄し、水とアセトンの混合液（アセトン６０重量％）５０ｍＬで一度洗浄し、水とアセトンの混合液（アセトン４０重量％）５０ｍＬで一度洗浄し、５０ｍＬの水で３回洗浄した。
【実施例３２】
【０１１８】
αフェトプロテインの免疫測定
実施例２２の免疫グロブリン被覆ビーズ５０μｇを、臍帯血希釈液１００μＬに加え、１５分間インキュベートしてαフェトプロテインを結合させた。過剰な臍帯血は、洗浄して除去した。この複合体に、Ｅｕ3+で標識した第２の検出マウスＩｇＧ抗ヒトαフェトプロテインを加えた。インキュベーションし、過剰な検出抗体を除去したあと、標識した抗体の量を時間分解蛍光分光法で検出した。既知のαフェトプロテインで臍帯血の希釈標準曲線では、濃度増加に伴いシグナルが増加した。この標準曲線の使用により、試料中のαフェトプロテインの量を測定した。
【実施例３３】
【０１１９】
実施例２２と同様ではあるが、マウスＩｇＧ抗−ヒトミオグロブリンを付した被覆ビーズを使用し、ヒト保存プラズマ試料中のミオグロブリンの量をＬｉａｉｓｏｎ免疫測定装置で分析した。ビーズ及び試料（１０μＬ）を１０分間インキュベートし、過剰な試料は洗浄して除去した。アクリジニウム（Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ）オレンジエステルを共役させた検出抗体を加えた。１０分間のインキュベーション後過剰な検出抗体を洗浄し、前記化学発光シグナルを生じさせ、Ｌｉａｉｓｏｎ装置の発光リーダーで検出した。
【実施例３４】
【０１２０】
Ｄ−Ｄｉｍｅｒの免疫測定
実施例２２と同様に被覆したビーズではあるが、マウスＩｇＧ抗−ヒトＤ−ｄｉｍｅｒを付した被覆ビーズを使用し、ヒト保存プラズマ試料中のミオグロブリンの量をＬｉａｉｓｏｎ免疫測定装置で分析した。ビーズ及び試料（１０μＬ）を１０分間インキュベートし、過剰な試料は洗浄して除去した。アクリジニウムオレンジエステルを共役させた検出抗体を加えた。１０分間のインキュベーション後過剰な検出抗体を洗浄して除去し、前記化学発光シグナルを生じさせ、Ｌｉａｉｓｏｎ装置の発光リーダーで検出した。
【実施例３５】
【０１２１】
無傷ＰＴＨの免疫測定
実施例１９と同様にストレプトアビジンで被覆したビーズを使用し、ヒトＥＤＴＡプラズマ試料に於ける無傷ＰＴＨの含量をＬｉａｉｓｏｎ免疫測定装置で分析した。１５０μＬのＥＤＴＡプラズマを、無傷ＰＴＨに対するビオチン化ポリクロナールヤギ抗体、及び、同様に得られる免疫複合体に対するアクリジニウムエステル接合ポリクロナールヤギ抗体とインキュベーションした。ストレプトアビジンで被覆したビーズを、前記免疫複合体に加えてインキュベーションし、前記ビオチンを固定化ストレプトアビジンに結合させた。前記ビーズを洗浄し、化学発光シグナルを生じさせ、Ｌｉａｉｓｏｎ装置の発光リーダーで検出した。
【実施例３６】
【０１２２】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）のメタノール懸濁液２２ｇを、１４ｇのジグライムで４回洗浄した。ジグライム中の粒子の乾燥物質を１６重量％に調節し、グリシジルメタクリレート（５０ｇ）及び塩化鉄（III）（０．６２ｇ）を前記粒子に加えた。前記混合物を７５℃に加熱し、２０時間攪拌した。ついで、前記粒子を１４ｇのメタノールで６回洗浄し、１３ｇのイソプロパノールで４回洗浄した。
【実施例３７】
【０１２３】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を５ｇ含むジグライム懸濁液２６．８２ｇに、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ（１８．３４ｇ）及びジグライム（３３．２０ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、２０時間攪拌した。ポリエチレングリコールＭｗ６００（２３６．８２ｇ）及び１，４−ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン（０．６６ｇ）の混合物を前記粒子懸濁液に加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、１時間攪拌した。前記粒子を冷却し、１００ｇのジグライムで３回洗浄し、１００ｇのアセトンで４回洗浄した。
【実施例３８】
【０１２４】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を２．５０ｇ含むジグライム懸濁液１４．５２ｇに、２，２−ビス［４−（グリシジルオキシ）フェニル］プロパン（ビスフェノールＡジグリシジルエーテル、Ａｒａｌｄｉｔ ＬＹ−５６４）（１３．０３ｇ）を加えた。前記混合物を９５℃で加熱し、２０時間攪拌した。前記粒子を冷却し、１７ｇのジグライムで３回洗浄し、１７ｇのメタノールで５回洗浄した。
【実施例３９】
【０１２５】
ビオチン化タンパク質分子のための結合能
１．ストレプトアビジンビーズ（実施例１９）５μｇを、ＤＥＬＦＩＡアッセイ緩衝液で一度洗浄し、ユウロピウム3+で標識した過剰のビオチン抗体と、９６ウエルプレート中で混合した。
２．室温で混合物のインキュベーションを２０分間行い、前記抗体を前記ビーズに結合させた。
３．前記プレートを磁石上に配置し、上清を除去した。
４．前記ビーズ−抗体複合体を、２００μＬのＤＥＬＦＩＡ洗浄緩衝液で３回洗浄した。
５．前記ビーズ−抗体複合体をＤＥＬＦＩＡ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ溶液２００μＬに再懸濁し、遮光し、室温で１０分間攪拌しながらインキュベートした。
６．前記プレートを磁石上に配置し、前記増強溶液をＦｌｕｏｒＮｕｎｃ９６ウエルプレートに移し、前記ユウロピウムシグナルを時間分解蛍光（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）により測定し、一秒あたりの総数（ｃｐｓ）を得た。
７．前記ビーズに結合する抗体量を、前記ビーズに結合するｃｐｓの割合から計算した。
ビーズの結合能は、約８．０μｇビオチン抗体／ｍｇビーズであった。
【実施例４０】
【０１２６】
ニトロ化及び還元により表面官能化し、超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子を５ｇ含むジグライム懸濁液３０．１ｇに、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ（１３．８ｇ）、ジエチレングリコール（２．０８ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、２０時間攪拌した。ジエチレングリコール（３５ｇ）及び１，４−ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン（０．５ｇ）の混合物を前記粒子懸濁液に加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、１時間攪拌した。前記粒子を冷却し、８０ｍＬのジグライムで３回洗浄し、８０ｍＬのアセトンで５回洗浄した。
【実施例４１】
【０１２７】
ニトロ化及び還元により表面官能化し、超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子を５ｇ含むジグライム懸濁液３０．８ｇに、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ（１３．８ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、２０時間攪拌した。ジエチレングリコール（３５ｇ）及び１，４−ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン（０．５ｇ）の混合物を前記粒子懸濁液に加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、１時間攪拌した。前記粒子を冷却し、８０ｍＬのジグライムで３回洗浄し、８０ｍＬのアセトンで５回洗浄した。
【実施例４２】
【０１２８】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子７．０ｇを、ジエチレングリコールジメチルエーテルで乾燥物質あたり２０重量％に調節した。Ａｒａｌｄｉｔ Ｄｙ−０２６ １７．５ｇ及びグリシドール１７．５ｇを前記懸濁液に加え、前記混合物を９０℃で２時間加熱した。前記ビーズをメタノール（２００ｍＬ）で５回洗浄し、水（２００ｍＬ）で５回洗浄した。
【実施例４３】
【０１２９】
実施例４３のビーズ８．０ｇの懸濁液８０ｇに、水酸化ナトリウム２２．５ｇ及びアリルグリシジルエーテル３２ｇを加えた。前記ビーズを攪拌し、６０℃で１８時間加熱し、２４０ｍＬのメタノールで４回洗浄した。
【実施例４４】
【０１３０】
逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）
実施例４１、４２、１１、１５及び３０のビーズを使用し、コンアルブミン、大豆トリプシンインヒビター、アルコールデヒドロゲナーゼ、シトクロムＣ及びジアミン・オキシダーゼ又はＳＷ４８０細胞からの細胞溶解物を含むタンパク質を分別した。１ｍｇのビーズを予め洗浄し、ＲＰＣ吸着緩衝液（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ又は別の選択肢として５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１Ｍリン酸アンモニウム塩、０．１％トリフルオロ酢酸）１０μＬに再懸濁し、２５μｇのタンパク質混合物又は細胞溶解物と１分間インキュベーションした。吸着後、前記ビーズを洗浄緩衝液（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓから得るか、又は５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１Ｍリン酸アンモニウム塩、０．１％トリフルオロ酢酸）で３回洗浄し、ついで、アセトニトリルの増加濃度勾配（０、１５、３０、４０及び５０％）の脱着緩衝液を使用し、画分中のタンパク質を脱着した。
【実施例４５】
【０１３１】
疎水性作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
実施例４４のビーズを使用し、コンアルブミン、大豆トリプシンインヒビター、アルコールデヒドロゲナーゼ、シトクロムＣ及びジアミン・オキシダーゼを含むタンパク質混合物を分別した。１ｍｇのビーズを予め洗浄し、吸着緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．８、１Ｍリン酸アンモニウム塩）に再懸濁し、２５μｇのタンパク質混合物と１分間インキュベーションした。吸着後、前記ビーズを適当な洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１Ｍリン酸アンモニウム塩）で３回洗浄し、ついで、硫酸アンモニウムの減少濃度勾配（０．８、０．６、０．４、０．２及び０．０Ｍ）の脱着緩衝液を使用し、画分中のタンパク質を脱着した。
【実施例４６】
【０１３２】
超常磁性鉄酸化物（４６重量％Ｆｅ）（３７５ｇ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子を５ｇ含むジグライム懸濁液２６．８１ｇに、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ（１８．３９ｇ）及びジグライム（３３．５０ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、２０時間攪拌した。前記粒子を冷却し、１００ｇのジメチルホルムアミドで４回洗浄した。
【０１３３】
ジメチルホルムアミド懸濁液６．６６ｇに、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（Ａｒａｌｄｉｔ ＬＹ−０２６）（３．０３ｇ）を加えた。前記混合物を７０℃で加熱し、２０時間攪拌した。前記粒子を冷却し、１７ｇのジメチルホルムアミドで３回洗浄した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被覆磁性ポリマー粒子の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁性ポリマー粒子は、様々な医療分野および生化学分野において、例えば、医薬製品の運搬のための輸送ビヒクルとして、診断目的において、分離のため、および合成目的のため、一般に有用である。このような粒子は、これらの機能を行うためには、その磁気特性に依存している。診断アッセイ適用において、例えば、磁気ポリマー粒子に結合した分析物を含有するサンプルに磁場を適用することにより、遠心分離またはろ過の使用をすることなく、前記分析物を単離することが可能である；また、治療適用において、例えば、磁場を患者に適用することにより、薬物運搬磁気ポリマー粒子を所望の身体部位へ狙いをつけるのに用いることができる。
【０００３】
磁気によりとは、ここでは、ポリマー粒子が超常磁性（super paramagnetic）結晶を含有することを意味する。したがって、この磁気ポリマー粒子は、磁気的に置き換え可能であるが、永久に磁化可能というものではない。磁気ポリマー粒子の製造方法が多く知られている。その多数は、マグヘマイト含有ポリマー粒子またはマグネタイト含有ポリマー粒子を、予備形成された磁気酸化鉄、例えば、マグネタイトから形成することを含む。それらの幾つかの関連方法は、米国特許出願公開第ＵＳ−Ａ−４，６５４，２６７（Ｕｇｅｌｓｔａｄ）（特許文献１）に記載されており、その内容はここに引例として組み入れる。
【０００４】
すなわち、特許文献１では、前処理に関する幾つかの制限を概説する。磁性材質内に多孔性ポリマー粒子の孔を組み込むことの困難性というより一般的な問題と同様に、同様の大きさ及び／又は同質又は単一の磁性特性の磁性粒子を得る困難性を含む。
【０００５】
基本的に前記表面又は大きく開いた孔に堆積させることで、磁性ポリマー粒子の実用的な寿命を短くし、磁性粒子の浸出が問題となった。
【０００６】
これらの不都合を克服するために特許文献１では以下のような準備方法を提案した。すなわち、もっとも簡単な形状で、多孔性ポリマー粒子を鉄化合物の溶液に含浸させ、その後、例えば、ｐＨの上昇により鉄を沈殿させる。ついで、沈殿した化合物を、加熱により超常磁性鉄酸化物結晶に変換できる。
【０００７】
前記ポリマー孔内に配置した磁性材料を有する多孔性磁性ポリマー粒子を製造するために、特許文献１では、そのポリマー粒子に鉄イオンを引き寄せる表面官能基を有する多孔性ポリマー粒子を主張した。これらの官能基は、前記ポリマーの製造における官能化コモノマーの使用や、官能基を導入するための重合後のポリマー処理、例えば、ポリマー表面に存在する基への共役又は変換により得られる。
【０００８】
特許文献１に開示の発明は、より均一な磁性粒子特性を有する磁性ポリマー粒子の製造方法の問題の一部を解決するが、前記ポリマー粒子から超常磁性結晶が溶出する問題は依然残っている。
【特許文献１】米国特許出願公開第４，６５４，２６７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
我々は、驚くべきことに、ある大きさの粒子とすることでこの問題を解決でき、表面官能化磁性ポリマー粒子を、ポリイソシアネート／ジオールの組合せ又はエポキシドモノマーと反応させることにより、特に適当な表面特性を備えた磁性粒子を製造でき、“被覆”磁性ポリマー粒子を製造できることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、第１の態様から見ると、本発明は、超常磁性結晶を含む被覆ポリマー粒子の調製方法であって、超常磁性結晶を含む直径０．５〜１．８μｍの多孔性表面官能化被覆ポリマー粒子、より好ましくは直径０．７５〜１．２μｍのポリマー粒子、特には約１μｍのポリマー粒子を、少なくとも１つのエポキシド化合物、好ましくは少なくとも２つのエポキシド化合物と反応させることを含む方法である。
【００１１】
第２の態様から見ると、超常磁性結晶を含む多孔性表面官能化被覆ポリマー粒子の調製方法であって、超常磁性結晶を含む直径０．５〜１．８μｍのポリマー粒子、より好ましくは直径０．７５〜１．２μｍのポリマー粒子、特には約１μｍのポリマー粒子を、少なくとも１つのポリイソシアネート（例えばジイソシアネート）及び少なくとも一つ、好ましくは少なくとも２つのジオールと反応させることを含む方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
好ましいジオールは、ポリエチレングリコールであるか、又は、式ＨＯ（（ＣＨ2）mＯ）nＨ（ｎは、１から１５の整数であり、好ましくは２から４の整数であり、ｍは２から６の整数であり、好ましくは２又は３、もっとも好ましくは２である。）のジオールである。ジオールを１つのみ使用する場合、ポリエチレングリコール、例えば、ポリエチレングリコール３００、４００、５００又は６００が好ましい。
【００１３】
本発明の方法で使用する前記多孔性ポリマー粒子は、官能化表面を有する多孔性ポリマーであればよく、例えば、米国特許出願公開第４，６５４，２６７号明細書に記載のものであってもよい。
【００１４】
前記ポリマーの表面官能基は、その表面にポリイソシアネート又はエポキシドを共有的に結合するために、ポリイソシアネート又はエポキシドと反応可能な基、任意で活性化されている基が好ましい。
【００１５】
前記ポリマーは、ビニル系ポリマー（例えば、スチレン）、アクリレート及び／又はメタクリレートの組合せから形成されるものが好ましい。前記ポリマー材料は、任意で、例えば、架橋剤、例えば、コモノマーとして、例えば、ジビニルベンゼン（DVB)、又は、エチレングリコールジメタクリレートの組み込みにより、架橋されていてもよい。ＤＶＢを含む粒子が好ましい。
【００１６】
前記必要な架橋剤（例えば、コモノマー）の適量は当業者に知られているであろう。前記ポリマーは、架橋されたスチレンポリマー(例えば、コモノマーを含むニトロ基、例えば、ニトロ−スチレン使用及び続く還元により表面官能化されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー)、又は、コモノマーを含むエポキシ基（例えば、グリシジルメタクリレート）の使用、及びその後のアミン化（例えば、エチレンジアミンとの反応）により表面官能化された架橋(メタ)アクリル酸ポリマーである。
【００１７】
本発明の方法に使用するポリマー粒子における超常磁性結晶は、多孔性ポリマー粒子中の超常磁性結晶形態中に沈殿されることが可能な材料であればいずれの種類でもよい。磁気酸化鉄、例えばマグネタイトまたはマグヘマイトが好ましい；しかしながら、前記結晶は、所望であれば、混合金属酸化物または他の磁気材料の種類であってもよい。存在する結晶磁気材料の全体量は、通常１％より多く、好ましくは３％より多く、望ましくは５％またはそれより多い（重量比で、例えば４０重量％まで。割合は、被覆粒子の全体の乾燥重量を基にしたＦｅ（または酸化鉄以外の磁気材料の場合、同等の金属）重量基準を基に計算する。
【００１８】
本発明のポリマー粒子の大きさは、通常、０．５〜１．８μｍの範囲であり、好ましくは、０．７５〜１．２μｍであり、好ましくは０．９〜１．１μｍである。
【００１９】
典型的には、使用する多孔性粒子の表面積は、２．７μｍの平均粒子直径に補正すると（すなわち、２．７／ＭＤによる相乗表面積、ＭＤは、マイクロメータでの平均直径である）、一般的には、少なくとも１５ｍ2／ｇ（ＢＥＴ窒素吸収法による測定）であり、より好ましくは少なくとも３０ｍ2／ｇであり、例えば、７００ｍ2／ｇまでである。同様に測定すると、前記粒子孔容積は少なくとも０．１ｍＬ／ｇが好ましい。
【００２０】
前記ポリマー粒子は、それらが被覆される前は、球状でありかつ、実質的には単分散であるのが典型的であり、一旦それら粒子が被覆されても球状のままであり、実質的に単分散であるのが特に好ましい。
【００２１】
実質的に単分散であるとは、複数の粒子（例えば、少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１０００）において、前記粒子が２０％未満の変動係数（ＣＶ）を有することを意味し、例えば、１５％未満であり、好ましくは１２％未満であり、より好ましくは１１％であり、更により好ましくは１０％未満であり、もっとも好ましくは約８％、例えば、２から５％にすぎないことである。ＣＶは、以下の式の割合として算出される。
【００２２】
ＣＶ＝（１００×標準偏差）／平均
【００２３】
前記式中、平均は、平均粒子直径であり、標準偏差は、粒子サイズにおける標準偏差である。ＣＶは、主最頻値を基に、すなわち、単一の分布曲線を検出粒子サイズ分布に適合させることにより、計算されるのが好ましい。したがって、最頻値サイズより小さいかまたは大きい粒子の幾つかは、計算において無視されてもよく、例えば、約９０％（すなわち、検出可能な粒子の）の全粒子数を基にしてもよい。そのようなＣＶの測定は、コールター（Coulter）ＬＳ１３０粒子サイズ分析器で行うことができる。
【００２４】
本発明で特に実用的な点は、ＷＯ０１／７０８２５で開示のアミノスチレンから部分的に作製されるＷＯ９９／１９３７５（Ｄｙｎｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｒ ＡＳＡ）、ＷＯ００／６１６４８（Ｄｙｎｏ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ＡＳ）に開示されているポリマー粒子である。これらの内容は本願に引用して援用する。
【００２５】
あるいは、ＷＯ０１／７０８２５の開示と対照的に、ポリマー粒子の官能化を重合後に行うことができる点である。例えば、ニトロ化、ついで形成したニトロ基をペンダント・アミン基へ還元することにより；または、直接アミノ化、例えば、アミノエタノールで処理することにより、行うことができる。更なる別の選択肢としては、よく知られたUgelstadの２工程膨潤方法、およびＷＯ００／６１６４７（Ｄｙｎｏ）に記載のその改良法により製造されたポリマー系粒子を用いてもよい。また、ＷＯ９９／１９３７５及びＷＯ００／６１６４８に開示の方法により調製したポリマー粒子も使用できる。これらの文献に開示の方法により製造した多孔性ポリマー粒子は、標準的な方法、例えば、前述のような方法によりそれらの孔に磁性粒子が配置されている。更なる可能性としては、多孔性ポリマー粒子は、ニトロスチレン及びＤＶＢや、米国特許出願公開第４，６５４，２６７号明細書のように導入した磁性材料から調製してもよい。これらの方法すべてにおいて、アミノスチレン、特に４−アミノスチレンのモノマー又はコモノマーとしての使用が、アミノ保持ポリマー材料の調製において好ましい。このモノマー又はコモノマーの使用は、重合後のニトロ化および還元反応の必要性を防ぐ。さらには、この方法により得られる被覆のより予想可能な特性（均質性）は、より正確な被覆を可能にする。
【００２６】
多孔性磁性ポリマー粒子と前記エポキシド又はポリイソシアネートとの反応は、前記ポリマー粒子の孔内にポリマーを生じさせる。前記ポリマーは、前記ポリマー粒子内に超常磁性結晶を物理的に封入し、孔を本質的に防ぐ役割を果たす。ついで、ポリマーを“被覆”することにより、多孔性出発原料と比較して気孔率を減らすことができる。驚くべきことに、我々は、前記超常磁性結晶が重合を触媒し、その近傍で被覆が優先的に形成されることを見出した。
【００２７】
必要に応じて、エポキシドポリマー被覆は、例えば、既知の方法でのイソシアネート又はジイソシアネートの使用による架橋であってもよい。必要に応じて更なる材料を、被覆重合反応前又は被覆重合後ではあるが被覆ポリマー架橋前に、前記多孔性粒子に含浸させてもよい。一般的には、このようなさらなる材料は、発光体又は吸収装置、例えば、発色団、蛍光団又は放射能標識材料であってもよい。
【００２８】
前記粒子を１つのエポキシドと反応させて前記被覆を形成してもよい。適当なエポキシドとしては、グリシドール、アリルグリシジルエーテル又はグリシジルメタクリレートがあげられる。特に、塩化鉄（III）を結合したグリシジルメタクリレートを含む被覆反応は、有利な被覆が得られる。
【００２９】
しかしながら、好ましい形態において、前記多孔性ポリマー粒子を、エポキシド、例えば、２−６エポキシド、特に２、３又は４エポキシドの混合物と反応させる。これらのうち、ジエポキシド又はポリエポキシドを少なくとも３０ｍｏｌ％を含むことが好ましく、少なくとも４５ｍｏｌ％を含むことがより好ましい。
【００３０】
本発明において使用するエポキシド化合物は、少なくとも一つのジエポキシド、例えば、２つのエポキシドの組合せ又はモノエポキシド及びジエポキシドの組合せを含むことが好ましい。前記エポキシドは、少なくとも一つのエーテル結合、及び、任意で、疎水性成分、例えば、Ｃ4-10アルキレン鎖又はフェニル若しくはビスフェニル基を含むことが好ましい。通常、前記エポキシドは、３〜５０の炭素原子を含み、好ましくは３〜２５である。
【００３１】
使用可能な典型的なエポキシドは、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、イソプロピルグリシジルエーテル、ブチルグリシジルエーテル、アリルグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４−ビス（２，３−エポキシプロポキシ）ブタン）、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコール ジグリシジルエーテル（例えば、Ｍｗ１５０〜１０００ｇ／ｍｏｌ）、グリセロールジグリシジルエーテル、グリセロールプロポキシレートトリグリシジルエーテル、グリシドール、グリシジルメタクリレート、及びビスフェノールＡ又はビスフェノールＦ系エポキシド、例えば、２，２−ビス（４−（２，３−エポキシプロポキシ）フェニル）−プロパンを含む。
【００３２】
特に好ましいエポキシドとしては、２，２−ビス（４−（２，３−エポキシプロポキシ）フェニル）−プロパン、アリルグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル及びグリシドールを含む。特に、商標Ａｒａｌｄｉｔｅを付したエポキシド固体が好ましく、例えば、商標Ａｒａｌｄｉｔｅ ＬＹ−５６４（２，２−ビス（４−（２，３−エポキシプロポキシ）フェニル）−プロパン及び１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルの混合物）及び商標Ａｒａｌｄｉｔｅ ＬＹ−０２６（純度８０％ １，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）が好ましい。
【００３３】
単一のエポキシドを使用して行う第１の被覆反応、及び、少なくとも二つのエポキシドの混合物を使用して行う第２の被覆反応は本発明の範囲内である。
【００３４】
その他の好ましい形態において、前記被覆粒子は、１以上（例えば、１、２又は３）のポリイソシアネート及び１以上（例えば、２、３又は４）のジオールから形成される。あるいは、ポリイソシアネートに近いものの混合物（例えば、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標））を使用できる。
【００３５】
使用可能な典型的なポリイソシアネートは、メチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、２，４−トルエンジイソシアネート（２，４−ＴＤＩ）（及び異性体又はその混合物）、イソフロンジイソシアネート（ＩＰＤＩ）、４，４’−オキシビス（フェニルイソシアネート）、４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート（ＭＤＩ）、ＭＤＩ及びＭＤＩ系オリゴマーの混合物（例えば、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ）、２，４−ジフェニルジイソシアネート、メチレン−ビスシクロヘキシルジイソシアネート（Ｈ12ＭＤＩ）、フェニレンジイソシアネート（ｐ−ＰＤＩ）、トランス−シクロヘキサン−１，４−ジイソシアネート（ＣＨＤＩ）、１，６−ジイソシアネートヘキサン（ＤＩＣＨ）、１，５−ジイソシアネートナフタレン（ＮＤＩ）、パラテトラメチルキシレンジイソシアネート（ｐ−ＴＭＸＤＩ）又はメタテトラメチルキシレンジイソシアネート（ｍ−ＴＭＸＤＩ）があげられる。
【００３６】
特に好ましいイソシアネートは、ＭＤＩ又はＭＤＩ系ポリイソシアネート（例えば、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標））である。Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標）は、ＭＤＩ、及び、ＣＨ2−フェニルイソシアネート基を備えたＭＤＩを含むそのオリゴマーを含む。すなわち、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標）は、ＭＤＩ由来の種々のポリイソシアネートの混合物である。サンプルの構造は、
４，４−メチレン−ビス（フェニルイソシアネート）：４０〜５０％、
４，４−メチレン−ビス（フェニルイソシアネート）＋ベンジルイソシアネート：２０〜２５％、
４，４−メチレン−ビス（フェニルイソシアネート）＋２ベンジルイソシアネート：１０％、
４，４−メチレン−ビス（フェニルイソシアネート）＋３ベンジルイソシアネート：２％であってもよい。（このような反応において、前記産物は、２−異性体の一部を含む。）
前記化合物は、商標Ｃａｒａｄａｔｅ、及び、Ｈｕｎｔｓｍａｎにより商標Ｈｙｌｅｎｅ及びＲｕｂｉｎａｔｅで販売されている。
【００３７】
２つのジオールを使用することが好ましい。前記ジオールは、（０．５：１）〜（１：０．５）のモル比で使用することが好ましく、より好ましくは（０．８：１）〜（１：０．８）のモル比である。好ましくは、ジオール混合物において９０ｍｏｌ％を超える量でいずれのジオールも使用しないことである。
【００３８】
好ましいジオールは、ジエチレングリコール、テトラエチレングリコール及びポリエチレングリコール、例えば、ＰＥＧ３００、４００又は６００を含む。好ましいジオールの組合せは、ジエチレングリコール及びテトラエチレングリコールである。
【００３９】
ポリイソシアネートを含む被覆反応の間、好ましくは、第１段階において、ポリイソシアネートを（例えば、ジオールに対して）過剰とすることである。被覆操作のこの段階でポリイソシアネートのみを使用することは、本発明の範囲内である。これにより、反応の間に生じるゲル化の可能性を最小限にすると考えられる。大過剰のポリイソシアネートを初期の被覆反応で使用すると、第２段階で、未反応のイソシアネート基と反応させるために更なるジオール（例えば、前記ジオール）と被覆粒子を反応させる必要がある。初期の被覆反応は、ポリイソシアネートのみを使用すると、その後、得られた粒子を少なくとも一つのジオールと反応させる必要がある。
【００４０】
このような形態において、ジオールは、ポリエチレングリコールが好ましい。ＰＥＧジオールの長鎖は、粒子を被覆した表面間での多くのリンカーの形成を可能にし、ストレプトアビジンのような親和性リガンドとの反応を容易にさせる。
【００４１】
すなわち、被覆するために、前記粒子をポリイソシアネートと反応させ、その後ジオールと反応させること、すなわち、段階的な反応は、本発明の範囲である。
【００４２】
そのため、典型的には、前記被覆反応は、多孔性磁性ポリマー粒子を、エポキシド又はポリイソシアネート及びジオールに含浸させること（例えば、これらの溶液（例えば、メタノール又はジグライム等の有機溶媒での溶液）の使用）、又は、有機溶媒での多孔性粒子の懸濁液と液体エポキシド又はジオール/ポリイソシアネート混合物との混合により行うことができる。超音波処理は、含浸を改善するために使用し、前記反応は、温度を、例えば、５０〜１００℃に上昇させることにより促進させてもよい。使用する溶媒は、大気圧下で抽出してもよい。
【００４３】
通常、磁性ポリマー粒子を、例えば、診断ツールとして使用する場合、カップリング及び生物学的媒体の一般的な水性システムにおけるその他の反応に十分に関与できるために、適当な割合の求電子性を必要とする。
【００４４】
被覆の一般的な極性は、求電子的であることが望ましい一方、求電子基の割合を所望の割合に調整するために、疎水性基を含む被膜を組み込んでもよい。このように、本発明は、幅広い範囲の極性を有する有用な診断及びその他のツールの提供を可能にする。
【００４５】
必要に応じて、本発明の方法において、被覆磁性ポリマー粒子の表面を、例えば、薬剤分子、レポーター標識（例えば、発色団、蛍光、酵素又は放射性同位体）又はリガンド（例えば、抗体又は抗体フラグメント、金属イオン複合剤、特定の結合パートナー対（例えば、ビオチン又はストレプトアビジン）、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド又はオリゴ糖）によりさらに官能化してもよい。
【００４６】
このようなカップリングは、直接又は間接（及び前記粒子と基質との間に結合を形成するためのカップリング剤の使用を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい）、及び、生体分解性又は非生体分解性であってもよい。磁性ポリマー粒子をターゲット活性化合物の放出のために使用する場合、生体分解性カップリングが望ましい。被覆を達成した後、被覆のペンデント基を処理して、かかる基質の接着のための適当な官能基（例えば、エポキシ、ヒドロキシ、アミノ等の官能基）を与えてもよい。
【００４７】
試料中に存在する又は存在しない特定の検体への親和性に基づき、選択的する特性を解明し、前記官能化被覆磁性粒子を親和性リガンドに結合させてもよい。そのため、前記親和性分子は、特定の検体を特異的に認識可能である磁性プローブに結合可能なあらゆる分子を含んでいてもよい。このため親和性リガンドは、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、抗体フラグメント、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、オリゴペプチド、多糖、糖、ペプチド、核酸分子をコードするペプチド、抗原、薬剤及びその他のリガンドを含む。適当な親和性リガンドの例は、刊行物で入手可能であり、公知である。更なる結合パートナーの使用、第２の親和性リガンド及び結合基は、当該分野でありふれており、本願明細書においてさらに議論する必要はなく、必要に応じて本発明の粒子に応じた種類の使用が可能である。
【００４８】
特に好ましい形態において、前記粒子の被覆は、アクリルレートと共重合可能な官能基、例えば、炭素−炭素二重結合を有するエポキシド化合物を使用して準備することである。例えば、２又は３のエポキシドであって、そのうちひとつが不飽和炭素−炭素結合を含むエポキシドを使用する。ついで、官能基、例えば、カルボン酸基を有するビニル又はアクリレートモノマー（例えば、アクリル酸）と前記被覆粒子を反応させることにより官能化してもよい。ついで、更なる官能化は、ペンダントカルボキシル基の反応、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はストレプトアビジンとの反応により容易に行うことができる。この方法及びそれにより形成される粒子は、新規であり、本発明の更なる態様を形成する。
【００４９】
すなわち、本発明の更なる態様は、被覆ポリマー粒子であって、任意で、超常磁性結晶を保持し、少なくとも２つのエポキシドであって、そのうちの少なくとも一つがアクリレートモノマーと共重合可能な不飽和炭素−炭素結合を有するエポキシドにより形成された被覆を有するポリマー粒子である。
【００５０】
本発明の更なる態様は、被覆ポリマー粒子の調製方法であって、前記ポリマー粒子は、任意で超常磁性結晶を含有し、前記方法は、任意で超常磁性結晶を含有する多孔性表面官能化ポリマー粒子と、少なくとも２つのエポキシド化合物との反応させる工程であって、前記エポキシド化合物の少なくとも一つがアクリレートモノマーと共重合可能な不飽和炭素-炭素結合を有する工程、及び、得られた粒子をビニルモノマー（例えば、アリルグリシジルエーテル又はアクリレートモノマー、例えば、アクリル酸又はアクリルアミド）と反応させる工程を含む方法である。ついで、得られた粒子を親和性リガンド、例えば、ストレプトアビジンとさらに反応させてもよい。
【００５１】
本発明の更なる態様は、合成、抽出又はアッセイにおける本発明の粒子の使用であって、特に、核酸検出における本発明の粒子の使用である。
【００５２】
これらの態様において有用なエポキシドには、グリシジルメタクリレート及びアリルグリシジルエーテルを含む。
【００５３】
例えばアクリル酸と重合可能なビニル基の導入は、被覆表面を無水メタクリル酸のような化合物で反応させることにより行うことができる。例えば、２つのエポキシドの反応により形成される被覆を含む被覆粒子を、洗浄して（例えば、ＮａＯＨで）ヒドロキシル官能基を露出させ、メチルアクリル系無水物で直ちに反応させて、ポリマー表面にビニル基を導入させることができる。
【００５４】
前述のように、粒子に結合した外部物質の特性は、その能力に基づき、特定のターゲット材料の結合を選択する。核酸検出は、通常、核酸プローブを用いてターゲットの核酸が含有していると考えられる試料を調査することを含む。前記核酸プローブは、ターゲットの核酸の配列と、例えば、特異的にハイブリダイズする核酸配列、例えば、核酸親和性リガンド及びターゲットの核酸を組み合わせてハイブリダイズ層を形成することを含む。本発明の官能化粒子は、例えば、少なくとも２つのエポキシドで被覆され、後にストレプトアビジンと反応するカルボキシル基を保持する粒子が、核酸検出に観念的に適している。
【００５５】
ビオチン化単一鎖オリゴヌクレオチドプローブを結合させたストレプトアビジンビーズは、ＤＮＡに特異的な配列の単離に使用できる。前記ビオチン化プローブは、過剰なビオチン化プローブと適当量のビーズを混合することにより、前記ビーズに結合される。ついで、ハイブリダイゼーション緩衝液、例えば、ＳＳＰＥ又はＳＳＣ中で、プローブ及びＤＮＡの長さ及び配列に適当な条件下で、前記ビーズ／プローブをＤＮＡ試料とインキュベートする。過剰かつ不要なＤＮＡを、前記ビーズの磁性特性を利用して洗浄する。捕獲したＤＮＡをＰＣＲ等で検出／定量できる。
【００５６】
ビオチン化二重鎖ＤＮＡフラグメントを結合させたストレプトアビジンビーズは、タンパク質に特異的に結合するＤＮＡ配列の単離に利用できる。適当量のビーズと過剰なビオチン化ＤＮＡフラグメントを混合することにより、ビオチン化ＤＮＡを前記ビーズに結合させる。ついで、前記ビーズ／ＤＮＡを前記タンパク質試料とともにハイブリダイゼーション緩衝液中で、調査するタンパク質に適当な条件下で、インキュベートする。過剰かつ不要なタンパク質を、前記ビーズの磁性特性を利用して洗浄する。捕獲したタンパク質は、下流の用途及び検出のために（高塩、低塩、加熱、低ｐＨ等により）前記プローブから抽出できる。
【００５７】
ターゲット材料は、任意で、生物学的又は合成源の材料であってよい。例えば、分子または分子の基であってもよいし、例えば、抗体、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、酵素、酵素基質、ホルモン、リンホカイン、代謝産物、抗原、ハプテン、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、毒素、毒、環境汚染物質、炭水化物、オリゴ糖、多糖、グリコプロテイン、グリコリピッド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸及び誘導核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、天然又は合成薬剤、レセプター、ウイルス粒子、バクテリア粒子、ウイルス成分、細胞、膜成分、天然又は合成脂肪小胞、ポリマー膜、ポリマーサービス（ｓｅｒｖｉｃｅｓ）及び粒子並びにガラス及びプラスチック面を含んでいてもよい。
【００５８】
本発明のビーズは、免疫測定に使用でき、驚くべきことに、被覆後の粒子のトシル化により、免疫測定における改善された能力を示す粒子が得られることを見出した。すなわち、特に好ましい形態において、被覆した粒子をトシル化することであり、例えば、塩基存在下でのトシルクロライドと粒子との反応によりトシル化できる。得られたトシル化被覆粒子は、新規で、本発明の更なる態様を形成する。トシルは、トルエン−４−スルホニル基を意味する。
【００５９】
さらには、このようにトシル化された種は、親和性リガンド、例えば、ストレプトアビジンとの反応を容易にし、さらに新たな粒子を形成できる。
【００６０】
すなわち、更なる態様の観点から、本発明は、被覆ポリマー粒子であって、超常磁性結晶を保持し、少なくとも一つのポリイソシアネート及び少なくとも一つのジオールから形成された被覆を有し、その後、例えば、トシルクロライドとの反応によりトシル化され、任意で、親和性リガンド、例えば、ストレプトアビジンと反応させた粒子を提供する。
【００６１】
その他の態様の観点から、本発明は、被覆ポリマー粒子であって、任意で超常磁性結晶を保持し、少なくとも一つのエポキシドから形成された被覆を有し、その後例えば、トシルクロライドとの反応によりトシル化され、任意で、親和性リガンド、例えば、ストレプトアビジンと反応させた粒子を提供する。
【００６２】
さらには、驚くべきことに、本願でクレームする直径の粒子は、より大きなサイズのビーズ、例えば、３μｍのビーズと比較して、結合能を極めて増加させることを見出した。クレームするビーズの結合能は、より大きなビーズの結合能よりも２００％以上優れており、分析操作において粒子の使用量を大幅に減少できる。
【００６３】
そのため、本発明のビーズは、逆相クロマトグラフィー又は疎水性作用クロマトグラフィーのメカニズムと同様の吸着/脱着処理に利用できる。逆相クロマトグラフィーは、溶質分子（例えば、タンパク質）と固定化した疎水性リガンド（例えば、ビーズ表面）との間の疎水性吸着相互作用を利用する分離技術である。この相互作用は、通常、極めて強く、低イオン強度の溶液により生じさせることができ、有機溶媒（例えば、アセトニトリル）の使用により壊すことができる。逆相クロマトグラフィーは、複合タンパク質試料を分別し、タンパク質試料を脱塩するために使用できる。ＲＰＣは、通常、カラムに充填した固相を用いて行う。本発明のビーズによれば、カラムを用いず、試料が溶出することなく、高速に自動で行う技術を可能にする。
【００６４】
疎水性作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、溶質分子（例えば、タンパク質）と固定化した疎水性リガンド（例えば、ビーズ表面）との間の疎水性吸着相互作用を利用する分離技術である。この相互作用は、ＲＰＣの間に利用する相互作用よりも弱く、高塩濃度による促進を必要とする。したがって、塩濃度の減少をこれらの吸着相互作用の破壊に使用できる。ＨＩＣは、複合タンパク質試料の分別及びタンパク質試料の脱塩に使用できる。ＨＩＣは、通常、カラムに充填した固相を用いて行われる。本発明のビーズによれば、カラムを用いず、試料が溶出することなく、高速に自動で行う技術を可能にする。
【００６５】
以下の実施例を用いて本発明をさらに説明する。これらは本発明の単なる例であって限定するものではない。
【実施例１】
【００６６】
０．３μｍ種粒子の調製
スチレン１６００ｇを１０重量％水酸化ナトリウム２Ｌで抽出し、水で洗浄してｐＨ７とし、ついでアルゴンを１０分流した。１０Ｌの反応容器内で、水８０００ｇとホウ砂３．０７ｇを８０℃で加熱し、水１００ｇを蒸発乾固させ、酸素を除去した。ついで、湯２００ｍＬ中硫酸デシルナトリウム１９．９７ｇを充填し、１０分間攪拌した。ついで、洗浄した後、実質的に酸素フリーのスチレンを充填し、１５分間攪拌した。ついで、湯２００ｍＬ中ペルオキソ２硫酸カリウム４．８０ｇを充填した。前記混合物を８０℃、アルゴン雰囲気下で１３時間保持した。直径０．３μｍの粒子を有するポリマー粒子の単分散懸濁液が形成された。
【実施例２】
【００６７】
１．０μｍポリスチレン粒子の調製
水８８６０ｇ、ＤＯＰ（ジオクタノイル過酸化物）８６６ｇ、アセトン４３３ｇ及びＳＤＳ ５１．９６ｇを、２段階のマントンガウリンホモジナイザーで２５分間均質化した。第１段階では４００ｋｇ／ｃｍ2で、第２段階では１００ｋｇ/ｃｍ2とした。均質化後、乳濁液５１６４ｇを、実施例１で形成した直径０．３μｍの単分散ポリスチレン粒子の種懸濁液で満たした。ポリマー粒子２９７．８ｇ及び水１５９３ｇを含む種懸濁液１８９１ｇを使用した。
【００６８】
２５℃で２４時間攪拌後、活性種粒子懸濁液６４１４ｇを、水１０３４００ｇ、ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム)１３１ｇ、ポリビニルピロリドンＫ−３０ １５５６ｇ、６３．２％ジビニルベンゼン４１５７ｇ、スチレン１０６０ｇおよびトルエン（ポロゲン（ｐｏｒｏｇｅｎ）として）１１６０６ｇを含む乳濁液で満たした。前記乳濁液を、第１段階では４００ｋｇ／ｃｍ2で、第２段階では１００ｋｇ／ｃｍ2で２５分間均質化した。
【００６９】
２５℃で２時間膨張させた後、水４６６７６ｇを前記反応容器に加え、ついで前記分散液を６０℃で１時間及び７０℃で２０時間重合させた。直径１．０μｍの粒子を有する単分散懸濁液が形成された。
【００７０】
前記粒子をメタノール及びブチルアセテートで洗浄し、乾燥させた。ＢＥＴにより前記比表面積を測定したところ５７０ｍ2／ｇ乾燥物質であった。
【実施例３】
【００７１】
ニトロ化
９５％硫酸９９２０ｇ及び６５％硝酸３０２０ｇの混合物を１０℃で冷却し、ついで、実施例２の１．０μｍ乾燥架橋ポリスチレン粒子を４００ｇ加えた。温度を１時間半で３０℃に上昇させた。前記懸濁液を６０Ｌの氷水で満たした。前記粒子を水及びメタノールでろ過により洗浄した。得られた粒子は、９．０重量％窒素を含有した。
【実施例４】
【００７２】
鉄の混和
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２５７９ｇ及びＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ ３．２ｇを、粒子４５０ｇ及び水３６９４ｇを含む実施例３の窒素化多孔性粒子の懸濁液４１４４ｇに加えた。前記懸濁液を室温で３０分間攪拌した。２５％ＮＨ3水を３２８５ｇ加えた。温度を２時間で６０℃に上昇させた。前記懸濁液を冷却し、前記粒子を遠心分離により水で洗浄した。精製後、前記粒子をメタノールに移した。前記粒子の分析により、３３０ｍｇＦｅ／ｇＤＳ（乾燥物質）及び０．９ｍｇＭｎ／ｇＤＳの含有量であった。
【実施例５】
【００７３】
被覆
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子を１３．３ｇ含むメタノール懸濁液１３３ｇを、９３ｇのジグライム（ｄｉｇｌｙｍｅ）で５回洗浄した。ジグライム中の粒子の乾燥物質を１５重量％に調整し、グリシドール（３．０７ｇ）、１，４−ブタンジオールジグリシジルエタノール（Ａｒａｌｄｉｔｅ（商標）ＤＹ−０２６、８．０６ｇ）及びグリシジルメタクリレート（５．６８ｇ）を前記粒子に加えた。前記混合物を７５℃に加熱し、２０時間攪拌した。ついで、前記粒子を７０ｇのメタノールで６回洗浄し、８０ｇのイソプロパノールで４回洗浄した。
【実施例６】
【００７４】
カルボン酸基での官能化
実施例５で調製した粒子（４２５ｇ）のイソプロパノール懸濁液１８０６ｇに、メタノール（７７４ｇ）、アクリル酸（５１４ｇ）及び２，２’−アゾイソブチロニトリル（２３．４ｇ）を加えた。前記混合液を７３〜７５℃に加熱し、２０時間攪拌した。ついで、前記粒子を２３３８ｇのメタノールで６回洗浄し、３０１８ｇの０．１５Ｍ ＮａＯＨで一度洗浄した。粒子含有量（乾燥物質を基準とする）を１２重量％に調節し、前記混合液を７５℃に加熱し、３．５時間攪拌した。前記粒子を３１８８ｇの水で３回洗浄し、３１８８ｇの０．０１Ｍ ＮａＯＨで５回洗浄した。
【００７５】
工程（Ａ）で調製した粒子（１３．３ｇ）のイソプロパノール懸濁液４７ｇに、メタノール（２４ｇ）、アクリル酸（９．６４ｇ）及び２，２’−アゾイソブチロニトリル（０．４１ｇ）を加えた。前記混合液を、７３〜７５℃に加熱し、２０時間攪拌した。ついで、前記粒子を７３ｇのメタノールで６回洗浄し、９４ｇの０．１５Ｍ ＮａＯＨで一度洗浄した。粒子混合液の乾燥物質を１２重量％に０．１５Ｍ ＮａＯＨで調節し、前記混合液を７５℃に加熱し、３．５時間攪拌した。前記粒子を９９ｇの水で３回洗浄し、９９ｇの０．０１Ｍ ＮａＯＨで５回洗浄した。
【実施例７】
【００７６】
カルボン酸基のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルへの官能化
実施例６の粒子を５．０ｇ含む懸濁液５０ｇを、０．１Ｍ酢酸での洗浄により（３×５０ｍＬ）酸性にした。ついで、酸性にした粒子（カルボン酸含有量０．５ｍｍｏｌ／ｇＤＳ）をアセトン（４×５０ｍＬ）で洗浄し、磁石で濃縮した。懸濁液が３５．６ｇとなるまで余分量のアセトンを追加した。ついで、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．９０ｇ、２５ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルカルボジイミド（３．１６ｇ、２５ｍｍｏｌ）を加えた。前記反応混合液を室温で５時間攪拌した。ついで、前記粒子をアセトンで洗浄した（５×５０ｍＬ）。
【実施例８】
【００７７】
ストレプトアビジンの固定化
１．実施例６のカルボン酸官能化ビーズ２０ｍｇを、１ｍＬの０．０１Ｍ ＮａＯＨに分散させた。
２．前記ビーズを磁石で分離し、上清を除去した。
３．前記ビーズを１ｍＬの３０ｍＭ２−モルホリノ−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）ｐＨ６．１で３回洗浄した。
４．３０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．１）９００μＬに、１．８ｍｇのストレプトアビジンを溶解し、前記ビーズに加えた。
５．前記ビーズ及びストレプトアビジンを室温で１５分間、混合装置でインキュベートした。
６．７５μＬの冷蒸留水に溶解した１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（３ｍｇ）を加えた。
７．前記混合液を、室温で１時間、混合装置でインキュベートした。
８．前記ビーズを、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で３回洗浄し、過剰なストレプトアビジン及びＥＤＣを除去した。
９．前記ビーズを０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で再懸濁した。
【００７８】
被覆の間、ストレプトアビジンの量は、Ｉ125−標識ストレプトアビジンの量を追跡することにより測定した。Ｉ125−標識ストレプトアビジンの相対量は、表面を被覆したストレプトアビジンの量を示す。
【００７９】
遊離ビオチン結合能は、過剰なＣ14−標識ビオチンを前記ストレプトアビジン被覆ビーズへ添加することにより測定した。過剰なビオチンを洗浄し、Ｃ14−標識ビオチン量をβ−シンチレーションカウンターを用いて測定した。
【００８０】
ストレプトアビジンの被覆量は、ビーズ１ｍｇあたり６８μｇであり、遊離ビオチン結合能は、３１００ｐｍｏｌ遊離ビオチン／１ｍｇビーズであった。
【実施例９】
【００８１】
工程Ａ
ジグライム２００ｇ中の超常磁性酸化鉄（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４等同様にして作製）４０．０ｇに１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル１００ｇ及びグリシドール１００ｇを加えた。前記反応混合物を２５０ｒｐｍ、９０℃で２０時間攪拌した。ついで、前記粒子を４００ｍＬのメタノールで５回洗浄し、４００ｍＬの脱イオン水で４回洗浄した。
【００８２】
工程Ｂ
工程Ａで調製した粒子の水性懸濁液７２ｇ（粒子含有量１０重量％）に、水酸化ナトリウムを１１９ｇゆっくり添加した。ついで、アリルグリシドールエーテルを１６９．２ｇ加えた。２５０ｒｐｍ、６０℃で１８時間攪拌後、前記粒子を１４００ｍＬのメタノールで５回洗浄した。
【実施例１０】
【００８３】
ジグライム４０ｇ中の超常磁性酸化鉄（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４等同様にして作製）１０ｇに、これにアリルグリシジルエーテルを１６．７ｇ、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルを１６．８ｇ及びグリシドールを１６．８ｇ加えた。前記反応混合物を３００ｒｐｍ、９０℃で２０時間攪拌した。ついで、前記粒子を１００ｍＬのメタノールで５回洗浄した。
【実施例１１】
【００８４】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子を１３ｇ含むジグライム懸濁液７８ｇに、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ（３５．８３ｇ）、ジエチレングリコール（２．８２ｇ）、 テトラエチレングリコール（４．８４ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃に加熱し、２１時間攪拌した。
【００８５】
ジエチレングリコール（４７．０４ｇ）、テトラエチレングリコール（８０．４５ｇ）及び１，４−ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン（１．２９ｇ）を、前記粒子懸濁液に加えた。前記混合物を８０℃に加熱し、２時間攪拌した。前記粒子を冷却し、１００ｇのジグライムで３回洗浄し、１００ｇのアセトンで４回洗浄した。
【実施例１２】
【００８６】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により官能化されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）のメタノール懸濁液２２ｇを、１４ｇのジグライムで５回洗浄した。ジグライムにおける粒子の乾燥物質を１６重量％に調節し、Ａｒａｌｄｉｔｅ（商標）ＤＹ−０２６（１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）（２６ｇ）及びグリシドール（２６ｇ）を前記粒子に加えた。前記混合物を９０℃に加熱し、２０時間攪拌した。ついで、前記粒子を８０ｇのメタノールで５回洗浄し、４５ｇのジグライムで４回洗浄した。
【００８７】
前記粒子のジグライム懸濁液１８ｇに、無水メタクリル酸（１５ｇ）及びピリジン（０．４ｇ）を加えた。前記混合物を７５℃に加熱し、２０時間攪拌した。ついで、前記粒子を９０ｇのメタノールで５回洗浄し、６０ｇのイソプロパノールで３回洗浄した。
【実施例１３】
【００８８】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を２０ｇ含むジグライム懸濁液１２４．４５ｇに、２，２−ビス［４−（グリシジルオキシ）フェニル］プロパン（ビスフェノールＡジグリシジルエーテル、Ａｒａｌｄｉｔ ＬＹ５６４）（４２ｇ）を加えた。前記混合物を６０℃に加熱して２時間攪拌し、室温に冷却して一晩攪拌した。前記懸濁液をジグライムで３回洗浄し、乾燥物質を１２％に調節した。
【００８９】
グリシドール（４．５８ｇ）、Ａｒａｌｄｉｔｅ（商標） ＤＹ−０２６（１，４ ブタンジオールジグリシジルエーテル）（１２．１ｇ）及びグリシジルメタクリレート（８．５７ｇ）を加えた。前記混合物を７５℃に加熱し、２１時間攪拌した。前記粒子懸濁液を冷却し、前記粒子を１００ｇのメタノールで６回洗浄し、１００ｇのイソプロパノールで４回洗浄した。
【実施例１４】
【００９０】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子（３７５ｇ）を５１．６ｇ含む水懸濁液５１６ｇに、前記混合物を攪拌しながら温度を４２℃に保持し、固体水酸化ナトリウム（１４４．８９ｇ）を加えた。アリルグリシジルエーテル（２０６．４ｇ）を加え、前記混合物を６０℃に加熱して１８時間攪拌した。前記粒子懸濁液を冷却し、前記粒子を１５００ｇのメタノールで４回洗浄した。
【実施例１５】
【００９１】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を１５ｇ含むメタノール懸濁液９０ｇを、６０ｇのジグライムで３回洗浄し、２，２−ビス［４−（グリシジルオキシ）フェニル］プロパン（ビスフェノール Ａ ジグリシジルエーテル、Ａｒａｌｄｉｔ ＬＹ−５６４）（７０．４０ｇ）及び１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（Ａｒａｌｄｉｔ ＤＹ−０２６）（４．６１ｇ）を加えた。前記混合物を９５℃で２０時間加熱した。前記粒子を冷却し、１００ｇのジグライムで３回洗浄し、１００ｇのメタノールで３回洗浄した。
【実施例１６】
【００９２】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を５ｇ含むジグライム懸濁液２３．４８ｇに、２，２−ビス［４−（グリシジルオキシ）フェニル］プロパン（ビスフェノールＡジグリシジルエーテル、Ａｒａｌｄｉｔ ＬＹ５６４）（２３．４７ｇ）及びポリエチレングリコールジグリシジルエーテル Ｍｗ３００（３．０７ｇ）を加えた。前記混合物を、９５℃で２０時間加熱した。前記粒子を冷却し４０ｇのメタノールで４回洗浄した。
【実施例１７】
【００９３】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を５ｇ含むジグライム懸濁液２４．４６ｇに、２，２−ビス［４−（グリシジルオキシ）フェニル］プロパン（ビスフェノールＡジグリシジルエーテル、Ａｒａｌｄｉｔ ＬＹ５６４）（２３．５４ｇ）及びポリエチレングリコールジグリシジルエーテル Ｍｗ５００（１５．２８ｇ）を加えた。前記混合物を９５℃で２０時間加熱した。前記粒子を冷却し４０ｇのメタノールで４回洗浄した。
【実施例１８】
【００９４】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を５ｇ含むジグライム懸濁液２６．８２ｇに、２，２−ビス［４−（グリシジルオキシ）フェニル］プロパン（ビスフェノールＡジグリシジルエーテル、Ａｒａｌｄｉｔ ＬＹ−５６４）（４６．９３ｇ）及びグリセロールプロポキシレートトリグリシジルエーテル（６９．９８ｇ）を加えた。前記混合物を９５℃で２０時間加熱した。前記粒子を冷却し、４０ｇのメタノールで４回洗浄した。
【実施例１９】
【００９５】
ストレプトアビジンの固定化
実施例１７の被覆ビーズ２０ｍｇを、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍＬに分散させた。ビーズを磁石で分離し、上清を交換した。これを２回繰り返した。０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）９００μＬに、ストレプトアビジン１ｍｇを溶解し、これを前記ビーズに加えた。ビーズ及びストレプトアビジンを混合装置で、室温で２０時間インキュベートした。前記ビーズをＰＢＳ（ｐＨ７．４、０．１％ＢＳＡ）で３回洗浄した。
【００９６】
遊離ビオチン結合能は、実施例２０に記載のようにして測定し、１９００ｐｍｏｌ遊離ビオチン／１ｍｇビーズであった。
【実施例２０】
【００９７】
ビオチン化ＤＮＡ分子の結合能
１．１０９０，５２６，２１７塩基対のプラスミドＤＮＡフラグメントをビオチン化し、ＰＣＲによりユウロピウム標識した。
２．過剰なビオチン及びユウロピウム標識を、市販のＰＣＲ浄化法により除去し、標識されたＤＮＡを、２６０ｎｍの光学密度及び時間分解蛍光で定量した。
３．ストレプトアビジン被覆ビーズ（実施例８）を、２倍に濃縮した結合緩衝液（２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、０．２Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５）で１度洗浄した。
４．洗浄したビーズ５μｇを結合緩衝液１００μＬに９６ウエルプレートの各ウエルで再懸濁した。
５．水１００μＬに希釈された過剰なＤＮＡ（０．５５ｐｍｏｌの１０９０ｂｐ、１．１ｐｍｏｌの５２６ｂｐ及び２．２ｐｍｏｌの２１７ｂｐ）を、前記ビーズに加え、室温で１５〜３０分穏やかに攪拌しながらインキュベートした。
６．前記プレートを磁石上に配置し、上清を除去した。
７．前記ビーズ−ＤＮＡ複合体を洗浄緩衝液（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．８、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０）２００μＬで３回洗浄した。
８．前記ビーズ−ＤＮＡ複合体を、ＤＥＬＦＩＡ増強（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）溶液２００μＬに再懸濁し、遮光し、室温で１０分間攪拌しながらインキュベートした。
９．前記プレートを磁石上に配置し、前記増強溶液をＦｌｕｏｒＮｕｎｃ ９６ウエルプレートに移し、ユウロピウムのシグナルを時間分解蛍光により測定し（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）、ｃｏｕｎｔｓ／ｓｅｃｏｎｄ（ｃｐｓ）を得た。
１０．ビーズに結合したＤＮＡを、ビーズに結合しているＤＮＡが０．５５、１．１及び２．２ｐｍｏｌで添加されたｃｐｓの割合から計算された。
【００９８】
前記ビーズ結合能は、２１７ｂｐフラグメントでは約２００ｐｍｏｌ／ｍｇ、５２６ｂｐフラグメントでは８０〜１００ｐｍｏｌ／ｍｇ及び１０９０ｂｐフラグメントでは３５〜４５ｐｍｏｌ／ｍｇであった。
【実施例２１】
【００９９】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を５ｇ含むジグライム懸濁液２３．８ｇに、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ（１８．３４ｇ）、ジエチレングリコール（１．４５ｇ）、テトラエチレングリコール（２．４８ｇ）及びジグライム（３６．２ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、２０時間攪拌した。
【０１００】
ポリエチレングリコール Ｍｗ３００（６８．２４ｇ）、テトラエチレングリコール（４１．３０ｇ）及び１，４ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン（０．６８ｇ）を、前記粒子懸濁液に加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、１時間攪拌した。前記粒子を冷却し、１００ｇのジグライムで３回洗浄し、１００ｇのアセトンで４回洗浄した。
【実施例２２】
【０１０１】
免疫グロブリンの固定化
実施例２１の被覆ビーズ２０ｍｇを０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１ｍＬに分散させた。ビーズを磁石で分離し、上清を交換した。これを２回繰り返した。マウスＩｇＧ１抗ヒトαフェトプロテイン１ｍｇを、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）９００μＬに溶解し、これを前記ビーズに加えた。ビーズ及び抗体を、混合装置で、室温で２０時間インキュベートした。前記ビーズをＰＢＳ（ｐＨ ７．４、０．１％ ＢＳＡ）で３回洗浄した。
【０１０２】
被覆の間、前記ビーズに結合した抗体量をＩ125−標識抗体の量の追跡を利用して測定した。前記ビーズに結合した標識抗体の相対量は、固定化された抗体の全体量を示す。前記ビーズに固定化されたタンパク質の量は、２２μｇ抗体／ｍｇビーズであった。
【０１０３】
αフェトプロテインの固定化抗体への結合は、臍帯血の希釈液の添加により測定し、Ｅｕ3+で標識した第２のマウスＩｇＧ抗−ヒトαフェトプロテインを用いて検出した。標識した抗体は時間分解蛍光分光法で検出した。前記臍帯血の希釈液の標準曲線は、濃度増加に伴うシグナル増加を示した。
【実施例２３】
【０１０４】
超磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）５ｇ含むジグライム懸濁液２６．８２ｇに、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ（１８．３４ｇ）、ポリエチレングリコール Ｍｗ６００（１５．８４ｇ）及びジグライム（３３．２０ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃に加熱し、２０時間攪拌した。
【０１０５】
ポリエチレングリコール Ｍｗ６００（２６３．８２ｇ）及び１，４−ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン（０．６６ｇ）を前記粒子懸濁液に加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、１時間攪拌した。前記粒子を冷却し、１００ｇのジグライムで３回洗浄し、１００ｇのアセトンで４回洗浄した。
【実施例２４】
【０１０６】
カルボン酸基での官能化
実施例５で調製した粒子（２．５ｇ）のイソプロパノール懸濁液１５．８７ｇに、アクリル酸（１．８４ｇ）、アクリルアミド（１．７９ｇ）、メタノール（５．９５ｇ）及び２，２’−アゾイソブチロニトリル（０．２８ｇ）を加えた。前記混合物を７５℃で加熱し、２０時間攪拌した。ついで、前記粒子を２０ｇのイソプロパノールで４回洗浄し、２５ｇの０．１５Ｍ ＮａＯＨで４回洗浄した。
【実施例２５】
【０１０７】
カルボン酸基での官能化
実施例５で調製した粒子（１ｇ）の水懸濁液８．４４ｇに、アクリル酸（０．３７ｇ）、アリルグリシジルエーテル（１．３４ｇ）、ジメチルスルホキシド（０．９１ｇ）及び２，２’アゾイソブチロニトリル（０．０６ｇ）を加えた。前記混合物を７５℃で加熱し、２０時間攪拌した。ついで、前記粒子を１０ｇのイソプロパノールで４回洗浄し、１０ｇの０．１５Ｍ ＮａＯＨで４回洗浄した。
【実施例２６】
【０１０８】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を２．７ｇ含むジグライム懸濁液３．９ｇに、ヘキサメチレンジイソシアネート（２．５ｇ）、ジエチレングリコール（０．５ｇ）及びテトラエチレングリコール（１．０ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、２０時間攪拌した。
【０１０９】
ジエチレングリコール（２．６５ｇ）、テトラエチレングリコール（４．６６ｇ）及び１，４−ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン（０．０７ｇ）の混合物を、前記粒子懸濁液に追加した。前記混合物を９５℃に加熱し、２〜３時間攪拌した。前記粒子を冷却し、２０ｇのアセトンで４回洗浄した。
【実施例２７】
【０１１０】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を５ｇ含むジグライム懸濁液２３．８ｇに、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ（１８．３４ｇ）、ジエチレングリコール（１．４５ｇ）、テトラエチレングリコール（２，４８ｇ）及びジグライム（３６．２ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、２０時間攪拌した。
【０１１１】
ポリエチレングリコール Ｍｗ４００（９０．０３ｇ）、テトラエチレングリコール（４１．２０ｇ）及び１，４−ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン（０．６８ｇ）の混合物を前記粒子懸濁液に加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、１時間攪拌した。前記粒子を冷却し、１００ｇのジグライムで３回洗浄し、１００ｇのアセトンで４回洗浄した。
【実施例２８】
【０１１２】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を５ｇ含むジグライム懸濁液２３．８ｇに、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ（１８．３４ｇ）、ジエチレングリコール（１．４５ｇ）、テトラエチレングリコール（２，４８ｇ）及びジグライム（３６．２ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、２０時間攪拌した。
【０１１３】
ポリエチレングリコール Ｍｗ６００（１３５ｇ）、テトラエチレングリコール（４１．３０ｇ）及び１，４−ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン（０．６６ｇ）の混合物を前記粒子懸濁液に加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、１時間攪拌した。前記粒子を冷却し、１００ｇのジグライムで３回洗浄し、１００ｇのアセトンで４回洗浄した。
【実施例２９】
【０１１４】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を５ｇ含むジグライム懸濁液２３．８ｇに、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ（１８．３４ｇ）、ジエチレングリコール（１．４５ｇ）、テトラエチレングリコール（２，４８ｇ）及びジグライム（３６．２ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、２０時間攪拌した。
【０１１５】
エチレングリコール（２７．２９ｇ）及び１，４−ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン（０．６６ｇ）の混合物を前記粒子懸濁液に加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、１時間攪拌した。前記粒子を冷却し、１００ｇのジグライムで３回洗浄し、１００ｇのアセトンで４回洗浄した。
【実施例３０】
【０１１６】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を５ｇ含むジグライム懸濁液２６．８２ｇに、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ（１８．３４ｇ）及びエチレングリコール（１．６４ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、２０時間攪拌した。エチレングリコール（２７．２９ｇ）及び１，４−ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン（０．６６ｇ）の混合物を前記粒子懸濁液に加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、１時間攪拌した。前記粒子を冷却し、１００ｇのジグライムで３回洗浄し、１００ｇのアセトンで４回洗浄した。
【実施例３１】
【０１１７】
トシル基での活性化
実施例３０の粒子４ｇのアセトン懸濁液１７．１ｇに、トシルクロライド（１６ｇ）及びピリジン（７．８５ｇ）を加えた。前記混合物を、２５℃で１７時間攪拌した。ついで、前記粒子を５０ｍＬのアセトンで３回洗浄し、水とアセトンの混合液（アセトン８０重量％）５０ｍＬで一度洗浄し、水とアセトンの混合液（アセトン６０重量％）５０ｍＬで一度洗浄し、水とアセトンの混合液（アセトン４０重量％）５０ｍＬで一度洗浄し、５０ｍＬの水で３回洗浄した。
【実施例３２】
【０１１８】
αフェトプロテインの免疫測定
実施例２２の免疫グロブリン被覆ビーズ５０μｇを、臍帯血希釈液１００μＬに加え、１５分間インキュベートしてαフェトプロテインを結合させた。過剰な臍帯血は、洗浄して除去した。この複合体に、Ｅｕ3+で標識した第２の検出マウスＩｇＧ抗ヒトαフェトプロテインを加えた。インキュベーションし、過剰な検出抗体を除去したあと、標識した抗体の量を時間分解蛍光分光法で検出した。既知のαフェトプロテインで臍帯血の希釈標準曲線では、濃度増加に伴いシグナルが増加した。この標準曲線の使用により、試料中のαフェトプロテインの量を測定した。
【実施例３３】
【０１１９】
実施例２２と同様ではあるが、マウスＩｇＧ抗−ヒトミオグロブリンを付した被覆ビーズを使用し、ヒト保存プラズマ試料中のミオグロブリンの量をＬｉａｉｓｏｎ免疫測定装置で分析した。ビーズ及び試料（１０μＬ）を１０分間インキュベートし、過剰な試料は洗浄して除去した。アクリジニウム（Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ）オレンジエステルを共役させた検出抗体を加えた。１０分間のインキュベーション後過剰な検出抗体を洗浄し、前記化学発光シグナルを生じさせ、Ｌｉａｉｓｏｎ装置の発光リーダーで検出した。
【実施例３４】
【０１２０】
Ｄ−Ｄｉｍｅｒの免疫測定
実施例２２と同様に被覆したビーズではあるが、マウスＩｇＧ抗−ヒトＤ−ｄｉｍｅｒを付した被覆ビーズを使用し、ヒト保存プラズマ試料中のミオグロブリンの量をＬｉａｉｓｏｎ免疫測定装置で分析した。ビーズ及び試料（１０μＬ）を１０分間インキュベートし、過剰な試料は洗浄して除去した。アクリジニウムオレンジエステルを共役させた検出抗体を加えた。１０分間のインキュベーション後過剰な検出抗体を洗浄して除去し、前記化学発光シグナルを生じさせ、Ｌｉａｉｓｏｎ装置の発光リーダーで検出した。
【実施例３５】
【０１２１】
無傷ＰＴＨの免疫測定
実施例１９と同様にストレプトアビジンで被覆したビーズを使用し、ヒトＥＤＴＡプラズマ試料に於ける無傷ＰＴＨの含量をＬｉａｉｓｏｎ免疫測定装置で分析した。１５０μＬのＥＤＴＡプラズマを、無傷ＰＴＨに対するビオチン化ポリクロナールヤギ抗体、及び、同様に得られる免疫複合体に対するアクリジニウムエステル接合ポリクロナールヤギ抗体とインキュベーションした。ストレプトアビジンで被覆したビーズを、前記免疫複合体に加えてインキュベーションし、前記ビオチンを固定化ストレプトアビジンに結合させた。前記ビーズを洗浄し、化学発光シグナルを生じさせ、Ｌｉａｉｓｏｎ装置の発光リーダーで検出した。
【実施例３６】
【０１２２】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）のメタノール懸濁液２２ｇを、１４ｇのジグライムで４回洗浄した。ジグライム中の粒子の乾燥物質を１６重量％に調節し、グリシジルメタクリレート（５０ｇ）及び塩化鉄（III）（０．６２ｇ）を前記粒子に加えた。前記混合物を７５℃に加熱し、２０時間攪拌した。ついで、前記粒子を１４ｇのメタノールで６回洗浄し、１３ｇのイソプロパノールで４回洗浄した。
【実施例３７】
【０１２３】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を５ｇ含むジグライム懸濁液２６．８２ｇに、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ（１８．３４ｇ）及びジグライム（３３．２０ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、２０時間攪拌した。ポリエチレングリコールＭｗ６００（２３６．８２ｇ）及び１，４−ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン（０．６６ｇ）の混合物を前記粒子懸濁液に加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、１時間攪拌した。前記粒子を冷却し、１００ｇのジグライムで３回洗浄し、１００ｇのアセトンで４回洗浄した。
【実施例３８】
【０１２４】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子（実施例４と同様にして作製）を２．５０ｇ含むジグライム懸濁液１４．５２ｇに、２，２−ビス［４−（グリシジルオキシ）フェニル］プロパン（ビスフェノールＡジグリシジルエーテル、Ａｒａｌｄｉｔ ＬＹ−５６４）（１３．０３ｇ）を加えた。前記混合物を９５℃で加熱し、２０時間攪拌した。前記粒子を冷却し、１７ｇのジグライムで３回洗浄し、１７ｇのメタノールで５回洗浄した。
【実施例３９】
【０１２５】
ビオチン化タンパク質分子のための結合能
１．ストレプトアビジンビーズ（実施例１９）５μｇを、ＤＥＬＦＩＡアッセイ緩衝液で一度洗浄し、ユウロピウム3+で標識した過剰のビオチン抗体と、９６ウエルプレート中で混合した。
２．室温で混合物のインキュベーションを２０分間行い、前記抗体を前記ビーズに結合させた。
３．前記プレートを磁石上に配置し、上清を除去した。
４．前記ビーズ−抗体複合体を、２００μＬのＤＥＬＦＩＡ洗浄緩衝液で３回洗浄した。
５．前記ビーズ−抗体複合体をＤＥＬＦＩＡ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ溶液２００μＬに再懸濁し、遮光し、室温で１０分間攪拌しながらインキュベートした。
６．前記プレートを磁石上に配置し、前記増強溶液をＦｌｕｏｒＮｕｎｃ９６ウエルプレートに移し、前記ユウロピウムシグナルを時間分解蛍光（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）により測定し、一秒あたりの総数（ｃｐｓ）を得た。
７．前記ビーズに結合する抗体量を、前記ビーズに結合するｃｐｓの割合から計算した。
ビーズの結合能は、約８．０μｇビオチン抗体／ｍｇビーズであった。
【実施例４０】
【０１２６】
ニトロ化及び還元により表面官能化し、超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子を５ｇ含むジグライム懸濁液３０．１ｇに、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ（１３．８ｇ）、ジエチレングリコール（２．０８ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、２０時間攪拌した。ジエチレングリコール（３５ｇ）及び１，４−ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン（０．５ｇ）の混合物を前記粒子懸濁液に加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、１時間攪拌した。前記粒子を冷却し、８０ｍＬのジグライムで３回洗浄し、８０ｍＬのアセトンで５回洗浄した。
【実施例４１】
【０１２７】
ニトロ化及び還元により表面官能化し、超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子を５ｇ含むジグライム懸濁液３０．８ｇに、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ（１３．８ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、２０時間攪拌した。ジエチレングリコール（３５ｇ）及び１，４−ジアザビシクロ（２．２．２）オクタン（０．５ｇ）の混合物を前記粒子懸濁液に加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、１時間攪拌した。前記粒子を冷却し、８０ｍＬのジグライムで３回洗浄し、８０ｍＬのアセトンで５回洗浄した。
【実施例４２】
【０１２８】
超常磁性鉄酸化物（３３重量％Ｆｅ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子７．０ｇを、ジエチレングリコールジメチルエーテルで乾燥物質あたり２０重量％に調節した。Ａｒａｌｄｉｔ Ｄｙ−０２６ １７．５ｇ及びグリシドール１７．５ｇを前記懸濁液に加え、前記混合物を９０℃で２時間加熱した。前記ビーズをメタノール（２００ｍＬ）で５回洗浄し、水（２００ｍＬ）で５回洗浄した。
【実施例４３】
【０１２９】
実施例４３のビーズ８．０ｇの懸濁液８０ｇに、水酸化ナトリウム２２．５ｇ及びアリルグリシジルエーテル３２ｇを加えた。前記ビーズを攪拌し、６０℃で１８時間加熱し、２４０ｍＬのメタノールで４回洗浄した。
【実施例４４】
【０１３０】
逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）
実施例４１、４２、１１、１５及び３０のビーズを使用し、コンアルブミン、大豆トリプシンインヒビター、アルコールデヒドロゲナーゼ、シトクロムＣ及びジアミン・オキシダーゼ又はＳＷ４８０細胞からの細胞溶解物を含むタンパク質を分別した。１ｍｇのビーズを予め洗浄し、ＲＰＣ吸着緩衝液（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ又は別の選択肢として５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１Ｍリン酸アンモニウム塩、０．１％トリフルオロ酢酸）１０μＬに再懸濁し、２５μｇのタンパク質混合物又は細胞溶解物と１分間インキュベーションした。吸着後、前記ビーズを洗浄緩衝液（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓから得るか、又は５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１Ｍリン酸アンモニウム塩、０．１％トリフルオロ酢酸）で３回洗浄し、ついで、アセトニトリルの増加濃度勾配（０、１５、３０、４０及び５０％）の脱着緩衝液を使用し、画分中のタンパク質を脱着した。
【実施例４５】
【０１３１】
疎水性作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
実施例４４のビーズを使用し、コンアルブミン、大豆トリプシンインヒビター、アルコールデヒドロゲナーゼ、シトクロムＣ及びジアミン・オキシダーゼを含むタンパク質混合物を分別した。１ｍｇのビーズを予め洗浄し、吸着緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．８、１Ｍリン酸アンモニウム塩）に再懸濁し、２５μｇのタンパク質混合物と１分間インキュベーションした。吸着後、前記ビーズを適当な洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１Ｍリン酸アンモニウム塩）で３回洗浄し、ついで、硫酸アンモニウムの減少濃度勾配（０．８、０．６、０．４、０．２及び０．０Ｍ）の脱着緩衝液を使用し、画分中のタンパク質を脱着した。
【実施例４６】
【０１３２】
超常磁性鉄酸化物（４６重量％Ｆｅ）（３７５ｇ）を含む１．０μｍのニトロ化及び還元により表面官能化されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子を５ｇ含むジグライム懸濁液２６．８１ｇに、Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標） ＶＬ（１８．３９ｇ）及びジグライム（３３．５０ｇ）を加えた。前記混合物を８０℃で加熱し、２０時間攪拌した。前記粒子を冷却し、１００ｇのジメチルホルムアミドで４回洗浄した。
【０１３３】
ジメチルホルムアミド懸濁液６．６６ｇに、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（Ａｒａｌｄｉｔ ＬＹ−０２６）（３．０３ｇ）を加えた。前記混合物を７０℃で加熱し、２０時間攪拌した。前記粒子を冷却し、１７ｇのジメチルホルムアミドで３回洗浄した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
超常磁性結晶を含む被覆ポリマー粒子の調製方法であって、超常磁性結晶を含む直径０．５〜１．８μｍの多孔性表面官能化ポリマー粒子を、少なくとも１つのポリイソシアネート及び少なくとも１つのジオールと反応させることを含む方法。
【請求項２】
少なくとも２つのジオールを使用する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ジオールが、ポリエチレングリコール及び式ＨＯ（（ＣＨ2）mＯ）nＨ（ｎは、１から１５の整数であり、ｍは２から６の整数である）のジオールからなる群から選択される請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ジオールが、ジエチレングリコール及びテトラエチレングリコールである請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記ジオールの１つが、ポリエチレングリコールである請求項２又は３記載の方法。
【請求項６】
前記ポリイソシアネートが、４，４−メチレンビス（フェニルイソシアネート）、又は、ＣＨ2−フェニレンイソシアネート残基を備えた４，４−メチレンビス（フェニルイソシアネート）（Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標））を含むポリイソシアネートである請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ポリイソシアネートが、ジイソシアネートである請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記粒子を、第１段階において、ポリイソシアネート及び少なくとも１つのジオールの混合物であって、前記ジオールと比較して前記ポリイソシアネートがモル過剰な混合物と反応させ、その後、第２段階において、少なくとも１つのジオールと反応させる請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記反応の第１段階で２つのジオールを使用し、第２段階で１又は２つのジオールを使用する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ジエチレングリコール及びテトラエチレングリコールを、前記反応の両段階で使用する請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記粒子を、第１段階において、ジオール不存在下でポリイソシアネートと反応させ、第２段階において少なくともひとつのジオールと反応させる請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
１つのジオールを使用し、前記ジオールがポリエチレングリコールである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
超常磁性結晶を含む被覆ポリマー粒子の調製方法であって、超常磁性結晶を含む直径０．５〜１．８μｍの多孔性表面官能化ポリマー粒子を、少なくとも１つのエポキシド化合物と反応させることを含む方法。
【請求項１４】
１つのエポキシドを使用し、前記エポキシドがグリシジルメタクリレートであり、前記反応が塩化鉄(III)の存在下で行われる請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも２つのエポキシドを使用する請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも２つのエポキシド化合物が、少なくとも１つのビスエポキシド化合物を含む請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記エポキシド化合物が、グリシドール及び１，４−ビス−（２，３−エポキシプロポキシ）ブタンを含む請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記エポキシド化合物が、１，４−ビス−（２，３−エポキシプロポキシ）ブタン及び２，２−ビス（４−（２，３−エポキシプロポキシ）フェニル）−プロパンを含む請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記エポキシド化合物が、グリシドール、アリルグリシジルエーテル及び１，４−ビス−（２，３−エポキシプロポキシ）ブタンを含む請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
前記エポキシド化合物の１つが、分子量１５０から１０００ｇ／ｍｏｌのポリエチレングリコールジグリシジルエーテルである請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
超常磁性結晶を含む被覆ポリマー粒子の調製のための請求項１３記載の方法であって、超常磁性結晶を含む多孔性表面官能化ポリマー粒子を、少なくとも２つのエポキシド化合物を反応させる工程であって、少なくとも１つの前記エポキシド化合物がアクリレートモノマーと共重合可能な不飽和炭素-炭素結合を有するエポキシド化合物である工程、及び、形成された粒子とアクリレートモノマーとを反応させる工程を含む方法。
【請求項２２】
前記粒子をポリマー架橋剤でも反応させる前記いずれかの請求項記載の方法。
【請求項２３】
前記架橋剤が、ジビニルベンゼンである請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記粒子が、アミン官能化されている前記いずれかの請求項記載の方法。
【請求項２５】
前記多孔性表面官能化ポリマー粒子が、硝酸で処理され、かつ、還元されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子である前記いずれかの請求項記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリマー粒子の直径が、０．５〜１．２μｍの間である前記いずれかの請求項記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリマー粒子の直径が、約１μｍである請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記被覆粒子を、その後トシル化する請求項１から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記被覆反応後、前記粒子を薬剤粒子、レポーター残基又はリガンドをカップリングさせる前記いずれかの請求項記載の方法。
【請求項３０】
前記リガンドが、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、抗体フラグメント、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、オリゴペプチド、多糖、糖、ペプチド、核酸分子をコードするペプチド、抗原又は薬剤である請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記リガンドが、ストレプトアビジンである請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
被覆ポリマー粒子であって、任意に超常磁性結晶を有し、少なくとも２つのエポキシドから形成された被覆であって、少なくとも一つの前記エポキシドがアクリルレートモノマーと共重合可能な不飽和炭素-炭素結合を有する被覆を有する粒子。
【請求項３３】
請求項２８から３１のいずれかの方法により得られる粒子。
【請求項３４】
請求項１から２０のいずれかに記載の方法により得られる粒子。
【請求項３５】
請求項２２から２７のいずれかに記載の方法により得られる粒子。
【請求項３６】
請求項３２記載の粒子又は請求項１から３１のいずれかに記載の方法の生産物のアッセイにおける使用。
【請求項３７】
前記のアッセイが、核酸の検出又は免疫測定である請求項３６記載の使用。
【請求項３８】
請求項３２記載の粒子又は請求項１から３１のいずれかに記載の方法の生産物の疎水性作用クロマトグラフィー又は逆相クロマトグラフィーにおける使用。
【請求項１】
超常磁性結晶を含む被覆ポリマー粒子の調製方法であって、超常磁性結晶を含む直径０．５〜１．８μｍの多孔性表面官能化ポリマー粒子を、少なくとも１つのポリイソシアネート及び少なくとも１つのジオールと反応させることを含む方法。
【請求項２】
少なくとも２つのジオールを使用する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ジオールが、ポリエチレングリコール及び式ＨＯ（（ＣＨ2）mＯ）nＨ（ｎは、１から１５の整数であり、ｍは２から６の整数である）のジオールからなる群から選択される請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ジオールが、ジエチレングリコール及びテトラエチレングリコールである請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記ジオールの１つが、ポリエチレングリコールである請求項２又は３記載の方法。
【請求項６】
前記ポリイソシアネートが、４，４−メチレンビス（フェニルイソシアネート）、又は、ＣＨ2−フェニレンイソシアネート残基を備えた４，４−メチレンビス（フェニルイソシアネート）（Ｄｅｓｍｏｄｕｒ（商標））を含むポリイソシアネートである請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ポリイソシアネートが、ジイソシアネートである請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記粒子を、第１段階において、ポリイソシアネート及び少なくとも１つのジオールの混合物であって、前記ジオールと比較して前記ポリイソシアネートがモル過剰な混合物と反応させ、その後、第２段階において、少なくとも１つのジオールと反応させる請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記反応の第１段階で２つのジオールを使用し、第２段階で１又は２つのジオールを使用する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ジエチレングリコール及びテトラエチレングリコールを、前記反応の両段階で使用する請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記粒子を、第１段階において、ジオール不存在下でポリイソシアネートと反応させ、第２段階において少なくともひとつのジオールと反応させる請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
１つのジオールを使用し、前記ジオールがポリエチレングリコールである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
超常磁性結晶を含む被覆ポリマー粒子の調製方法であって、超常磁性結晶を含む直径０．５〜１．８μｍの多孔性表面官能化ポリマー粒子を、少なくとも１つのエポキシド化合物と反応させることを含む方法。
【請求項１４】
１つのエポキシドを使用し、前記エポキシドがグリシジルメタクリレートであり、前記反応が塩化鉄(III)の存在下で行われる請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも２つのエポキシドを使用する請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも２つのエポキシド化合物が、少なくとも１つのビスエポキシド化合物を含む請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記エポキシド化合物が、グリシドール及び１，４−ビス−（２，３−エポキシプロポキシ）ブタンを含む請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記エポキシド化合物が、１，４−ビス−（２，３−エポキシプロポキシ）ブタン及び２，２−ビス（４−（２，３−エポキシプロポキシ）フェニル）−プロパンを含む請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記エポキシド化合物が、グリシドール、アリルグリシジルエーテル及び１，４−ビス−（２，３−エポキシプロポキシ）ブタンを含む請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
前記エポキシド化合物の１つが、分子量１５０から１０００ｇ／ｍｏｌのポリエチレングリコールジグリシジルエーテルである請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
超常磁性結晶を含む被覆ポリマー粒子の調製のための請求項１３記載の方法であって、超常磁性結晶を含む多孔性表面官能化ポリマー粒子を、少なくとも２つのエポキシド化合物を反応させる工程であって、少なくとも１つの前記エポキシド化合物がアクリレートモノマーと共重合可能な不飽和炭素-炭素結合を有するエポキシド化合物である工程、及び、形成された粒子とアクリレートモノマーとを反応させる工程を含む方法。
【請求項２２】
前記粒子をポリマー架橋剤でも反応させる前記いずれかの請求項記載の方法。
【請求項２３】
前記架橋剤が、ジビニルベンゼンである請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記粒子が、アミン官能化されている前記いずれかの請求項記載の方法。
【請求項２５】
前記多孔性表面官能化ポリマー粒子が、硝酸で処理され、かつ、還元されたスチレンジビニルベンゼンポリマー粒子である前記いずれかの請求項記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリマー粒子の直径が、０．５〜１．２μｍの間である前記いずれかの請求項記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリマー粒子の直径が、約１μｍである請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記被覆粒子を、その後トシル化する請求項１から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記被覆反応後、前記粒子を薬剤粒子、レポーター残基又はリガンドをカップリングさせる前記いずれかの請求項記載の方法。
【請求項３０】
前記リガンドが、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、抗体フラグメント、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、オリゴペプチド、多糖、糖、ペプチド、核酸分子をコードするペプチド、抗原又は薬剤である請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記リガンドが、ストレプトアビジンである請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
被覆ポリマー粒子であって、任意に超常磁性結晶を有し、少なくとも２つのエポキシドから形成された被覆であって、少なくとも一つの前記エポキシドがアクリルレートモノマーと共重合可能な不飽和炭素-炭素結合を有する被覆を有する粒子。
【請求項３３】
請求項２８から３１のいずれかの方法により得られる粒子。
【請求項３４】
請求項１から２０のいずれかに記載の方法により得られる粒子。
【請求項３５】
請求項２２から２７のいずれかに記載の方法により得られる粒子。
【請求項３６】
請求項３２記載の粒子又は請求項１から３１のいずれかに記載の方法の生産物のアッセイにおける使用。
【請求項３７】
前記のアッセイが、核酸の検出又は免疫測定である請求項３６記載の使用。
【請求項３８】
請求項３２記載の粒子又は請求項１から３１のいずれかに記載の方法の生産物の疎水性作用クロマトグラフィー又は逆相クロマトグラフィーにおける使用。
【公表番号】特表２００７−５２７４５４（Ｐ２００７−５２７４５４Ａ）
【公表日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１９９７９（Ｐ２００６−５１９９７９）
【出願日】平成１６年４月２８日（２００４．４．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００１８０１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１５２１６
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（５０６００１５１６）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月２８日（２００４．４．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００１８０１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１５２１６
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（５０６００１５１６）
【Ｆターム（参考）】
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