被験物質のスクリーニング方法
【課題】 リガンドと相互作用する被験物質のスクリーニング方法であって、多数の被験物質の中から結合速度及び解離速度の両方が大きい物質を簡便にスクリーニングできる方法を提供すること。
【解決手段】 リガンドと被験物質との相互作用に基づき一群の被験物質から特定の被験物質を選別するスクリーニング方法において、該リガンドが固相化されており、該リガンドの固相化を行うユニットと、固相化したリガンドと被験物質との相互作用の測定を行うユニットとが分離されており、1x10-2(S-1)以上の任意の解離速度定数（kd）、および1x105(M-1S-1)以上の任意の結合速度定数（ka）を選別の基準値として、測定した解離速度定数および結合速度定数の双方が、上記の基準値以上である被験物質を選別する、上記のスクリーニング方法。
【解決手段】 リガンドと被験物質との相互作用に基づき一群の被験物質から特定の被験物質を選別するスクリーニング方法において、該リガンドが固相化されており、該リガンドの固相化を行うユニットと、固相化したリガンドと被験物質との相互作用の測定を行うユニットとが分離されており、1x10-2(S-1)以上の任意の解離速度定数（kd）、および1x105(M-1S-1)以上の任意の結合速度定数（ka）を選別の基準値として、測定した解離速度定数および結合速度定数の双方が、上記の基準値以上である被験物質を選別する、上記のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンドと相互作用する被験物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品は生体内において蛋白質と相互作用し機能することが多い。例えば、阻害剤は酵素に結合し酵素反応を阻害することで生体内の生化学反応を変化させ、薬理作用を発現する。このため、医薬品探索において蛋白質と医薬品候補化合物の結合の強さを知ることが重要となる。
【０００３】
近年、蛋白と化学物質の相互作用を手法として表面プラズモン共鳴法が注目されている。この手法では金などの金属表面に蛋白を固相化し、化学物質をここに供与したときの共鳴の変化を用いて相互作用を定量する。化学物質である被解析分子は金属表面に固定化された蛋白質などの被解析分子と相互作用する分子へ時間とともに吸着する。このときの吸着量すなわちSPR信号の変化は下式に従って変化する。
dR/dt = ka・Cs・(Rmax - R) - kd・R 式(1)
（式中、RはSPR信号であり、Rmaxは最大SPR信号である。また、kaは結合速度定数、kdは解離速度定数、Csは金属表面近傍の被解析分子の濃度を表す。）
【０００４】
ここで、金属表面を定常的に新鮮な液に置換しつづけられる理想的な条件ではCsは一定となり、簡素な微分方程式を解くことで測定結果からka、kdを求めることが可能である。結合定数(KD)は結合と解離の比を示すものであり、kd/kaで表される。
【０００５】
低分子医薬の探索においては、通常、ひとつのターゲット蛋白質に対して、少なくとも１００００個以上の低分子化合物のスクリーニングを行う。その結果得られたヒット化合物群について、さらに詳細な評価を実施し、ひとつのリード化合物に絞り込んでいく。
【０００６】
表面プラズモン共鳴法による蛋白質と被験化合物との相互作用の測定は、非特許文献１に記載されているように、医薬探索のプロセスに用いられているが、１日あたりの測定数は100サンプル程度であり、その処理能力の低さから前述のような大規模なスクリーニングに使われることはなかった。
【０００７】
大規模スクリーニングは、ELISA法、RI標識法が主に用いられているが、これらの方法は、蛋白と化合物を一定時間反応させた後、バッファーによる洗浄操作を経て、化合物の結合量を測定するため、結合はするものの解離速度の速い化合物を選別するには困難であった。一方で、医薬化合物としては、副作用の観点から、一定の化合物濃度下では速やかに結合し、服用を止めた場合には速やかに解離するような化合物が望まれる場合がある。従って、大規模スクリーニングで、結合速度、解離速度ともに大きい化合物を選別する手法が望まれていた。
【０００８】
【非特許文献１】BUNSEKI KAGAKU vol.51, No.6, pp.461-468 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、リガンドと相互作用する被験物質のスクリーニング方法であって、多数の被験物質の中から結合速度及び解離速度の両方が大きい物質を簡便にスクリーニングできる方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、1x10-2(S-1)以上の任意の解離速度定数（kd）、および1x105(M-1S-1)以上の任意の結合速度定数（ka）を選別の基準値として、測定した解離速度定数および結合速度定数の双方が、上記の基準値以上である被験物質を選別することによって、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明によれば、リガンドと被験物質との相互作用に基づき一群の被験物質から特定の被験物質を選別するスクリーニング方法において、該リガンドが固相化されており、該リガンドの固相化を行うユニットと、固相化したリガンドと被験物質との相互作用の測定を行うユニットとが分離されており、1x10-2(S-1)以上の任意の解離速度定数（kd）、および1x105(M-1S-1)以上の任意の結合速度定数（ka）を選別の基準値として、測定した解離速度定数および結合速度定数の双方が、上記の基準値以上である被験物質を選別する、上記のスクリーニング方法が提供される。
【００１２】
本発明の別の側面によれば、リガンドと被験物質との相互作用に基づき一群の被験化合物から特定の化合物を選別するスクリーニング方法において、該リガンドが固相化されており、固相化された該リガンドに該被験物質の溶液を接触させた時に変化する信号量から、該リガンドと該被験物質との解離速度定数（kd）および結合速度定数（ka）を求め、1x10-2(S-1)以上の任意の解離速度定数（kd）、および1x105(M-1S-1)以上の任意の結合速度定数（ka）を選別の基準値として、測定した解離速度定数および結合速度定数の双方が、上記の基準値以上である被験物質を選別する、上記のスクリーニング方法が提供される。当該方法において、好ましくは、リガンドの固相化を行うユニットと、固相化したリガンドと被験物質との相互作用の測定を行うユニットとが分離されている。
【００１３】
好ましくは、予め装置に入力された結合速度定数および解離速度定数の範囲内に入る被験物質が自動選別される。
好ましくは、結合速度定数および解離速度定数を表面プラズモン共鳴装置により求める。
好ましくは、選別された被験物質が表示装置上で視覚的に区別される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、多数の被験物質の中から、結合速度及び解離速度の両方が大きい物質を簡便にスクリーニングすることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のスクリーニング方法は、リガンドと被験物質との相互作用に基づき一群の被験物質から特定の被験物質を選別するスクリーニング方法であって、1x10-2(S-1)以上の任意の解離速度定数（kd）、および1x105(M-1S-1)以上の任意の結合速度定数（ka）を選別の基準値として、測定した解離速度定数および結合速度定数の双方が、上記の基準値以上である被験物質を選別することを特徴とする。
【００１６】
本発明において、解離速度定数（kd）および結合速度定数（ka）は、固相化したセンサチップを用いて表面プラズモン共鳴測定装置により求めることが好ましい。表面プラズモン共鳴法では、リガンド及び被験物質の両方が無標識の状態で、両者の結合、解離といった相互作用をリアルタイムで測定することができる。従って、解離速度が極端に速い被験物質であっても、結合性の識別が可能である。
【００１７】
本発明においては、1x10-2(S-1)以上の任意の解離速度定数（kd）、および1x105(M-1S-1)以上の任意の結合速度定数（ka）を選別の基準値として、測定した解離速度定数、および結合速度定数の双方が、それら基準値以上である被験物質を選別する。より好ましくは、1x10-1(S-1)以上の任意の解離速度定数（kd）、および1x106(M-1S-1)以上の任意の結合速度定数（ka）を選別の基準値として、測定した解離速度定数、および結合速度定数の双方が、それら基準値以上である被験物質を選別する。
【００１８】
本発明においては、相互作用の測定は全ての化合物について同一の時間で行うことが好ましい。時間は、結合反応、解離反応ともに10分未満であることが好ましく、3分未満であることがより好ましく、1分未満であることがさらに好ましい。
【００１９】
本発明においては、固相化されたリガンドに被験物質溶液を接触させた時に変化する信号量から、該リガンドと該被験物質の解離速度定数、および結合速度定数を求めることが好ましい。
【００２０】
本発明においては、スクリーニングにかける全被験物質の分子量が予めスクリーニング装置に入力されていることが好ましい。各被験物質の結合量は、結合量／分子量で表されるように、各々の分子量で規格化して表示されることが好ましい。
【００２１】
本発明においては、スクリーニング装置に予め、選択したい範囲の結合速度定数、解離速度定数を入力しておき、その範囲に入る被験物質が自動選別されることが好ましい。選別された被験物質は、表示装置に視覚的に区別されるように表示されることが好ましい。視覚的な区別の方法は特に限定されないが、例えば、文字の大きさ、色、文字の点滅、文字の色、アンダーライン、枠で囲む、などの方法が挙げられる。
【００２２】
本発明においては、リガンド（蛋白質など）が固相化されていることが好ましい。固相化の方法としては、公知の方法が用いられる。また、リガンドの固相化を行うユニットと、固相化したリガンドと被験物質との相互作用測定を行うユニットが分離されていることが好ましい。装置構成の一例を図１に示す。リガンドの固相化を行うユニットと、相互作用測定を行うユニットを分離することにより、測定処理能力が大幅に向上する。
【００２３】
本発明において、一群の被験物質の数は、１０００個以上であることが好ましく、１００００個以上であることがより好ましく、１０００００個以上であることがさらに好ましい。
【００２４】
被験物質は、単一の物質でもよいし、複数の物質の混合物でもよい。本発明で用いる被験物質としては例えば、本明細書中以下に記載するような生理活性物質（リガンド）と相互作用する物質であれば特に限定されないが、低分子有機化合物、高分子化合物、ＤＮＡ等の核酸、蛋白質（抗体などを含む）、ペプチド又はその断片、糖、アミノ酸などが挙げられる。
【００２５】
本発明では、リガンドと該被験物質との解離速度定数（kd）および結合速度定数（ka）は、非標識検出法で測定することが好ましい。非標識検出法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられ、中でも表面プラズモン共鳴装置を用いて表面プラズモン共鳴測定を行うことが特に好ましい。
【００２６】
次に、表面プラズモン共鳴装置で用いるバイオセンサーについて説明する。バイオセンサーの基板は、金属表面又は金属膜であることが好ましい。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００２７】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、１オングストローム以上５０００オングストローム以下であるのが好ましく、特に１０オングストローム以上２０００オングストローム以下であるのが好ましい。５０００オングストロームを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、１オングストローム以上、１００オングストローム以下であるのが好ましい。
【００２８】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００２９】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００３０】
基板は、基板の最表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「基板の最表面」とは、「基板から最も遠い側」という意味である。
【００３１】
好ましい官能基としては−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ3ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基などが挙げられる。ここで、低級アルキル基における炭素数は特に限定されないが、一般的にはＣ１〜Ｃ１０程度であり、好ましくはＣ１〜Ｃ６である。
【００３２】
最表面にそれらの官能基を導入する方法としては、それらの官能基の前駆体を含有する高分子を金属表面あるいは金属膜上にコーティングした後、化学処理により最表面に位置する前駆体からそれらの官能基を生成させる方法が挙げられる。例えば−ＣＯＯＣＨ3基を含有するポリメチルメタクリレートを金属膜上にコーティングした後、その表面をＮａＯＨ水溶液（１Ｎ）に４０℃１６時間接触させると、最表面に−ＣＯＯＨ基が生成する。
【００３３】
上記のようにして得られたバイオセンサー用表面において、上記の官能基を介して生理活性物質（リガンド）を共有結合させることによって、金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化することができる。
【００３４】
バイオセンサー用表面上に固定される生理活性物質（リガンド）としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００３５】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００３６】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００３７】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００３８】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００３９】
生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質又は核酸である場合、その固定化は、生理活性物質のアミノ基、チオール基等を利用し、金属表面の官能基に共有結合させることで行うことができる。
【００４０】
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【００４１】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００４２】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００４３】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００４４】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００４５】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００４６】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００４７】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００４８】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００４９】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００５０】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【００５１】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【００５２】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【００５３】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰角（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【００５４】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【００５５】
本発明の一実施態様においては、表面プラズモン共鳴測定装置の流路系内の液体を、被験物質を含まない溶液から被験物質を含む溶液へと交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定することができる。このような測定により、測定時間内における参照セルの信号変化のノイズ幅、及びベースライン変動を抑制することができ、これにより信頼性の高い結合検出データを取得することができる。液の流れを停止させる時間は特に限定されないが、例えば、１秒以上３０分以下であり、好ましくは１０秒以上２０分以下であり、さらに好ましくは１分以上２０分以下程度である。
【００５６】
本発明においては好ましくは、被験物質と相互作用する物質を結合していない参照セルと、被験物質と相互作用する物質を結合した検出セルとを直列に連結して流路系内に設置し、該参照セルと該検出セルに液体を流すことにより、表面プラズモン共鳴の変化を測定することができる。
【００５７】
また、本発明においては、測定に用いるセルの体積(Vs ml)（上記した参照セルと検出セルを用いる場合はそれらのセルの合計体積）に対し、1回の測定あたりの液交換量(Ve ml)の比率(Ve/Vs)を、例えば、1以上100以下とすることができる。Ve/Vsは、より好ましくは1以上50以下であり、特に好ましくは1以上20以下である。測定に用いるセルの体積(Vs ml)は特に限定されないが、好ましくは１×１０-6〜１．０ml、特に好ましくは１×１０-5〜１×１０-1ml程度である。また、液体の交換にかける時間としては、0.01秒以上100秒以下が好ましく、0.1秒以上10秒以下がより好ましい。
【００５８】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５９】
実施例１
図１に記載のスクリーニング用SPRシステムを用いて、リガンドの固定、化合物の結合測定を行った。
（１）リガンドの固定
図１に記載のタンパク固定機と下記のセンサチップを用いて、以下の固定条件でセンサチップにリガンドを固定した。
【００６０】
センサチップ：金膜の厚さが500オングストロームになるように金を蒸着した1cm(1cmのカバーガラスをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分処理した後、スピンコート機（MODEL ASS-303、ABLE製）にセットし1000rpmにて回転させ、金蒸着カバーガラス中央にポリメチルメタクリレート（PMMA）のメチルエチルケトン溶液（2mg/ml）を50μｌ滴下し、2分後に回転を止めた。エリプソメトリー法（In-Situ Ellipsometer MAUS-101、Five Lab製）により膜厚を測定したところ、ポリメタクリル酸メチル膜の厚さは200オングストロームであった。このサンプルをPMMA表面チップと呼ぶ。このPMMA表面チップをNaOH水溶液（１Ｎ）に４０℃１６時間浸漬した後、水で3回洗浄した。このサンプルをPMMA/COOH表面チップと呼ぶ。このPMMA/COOH表面チップを１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液２ｍｌに６０分浸漬した後、α-アミノ-ポリエチレンオキシ-ω-カルボン酸（平均分子量5000）水溶液（１0mM）２ｍｌに１６時間浸漬した。最後に水で５回洗浄した。
【００６１】
リガンドの固定は以下の手順で行う。
リガンド溶液の調製： 炭酸脱水素酵素を0.1mg/mlになるように酢酸バッファー（pH5.0）で溶解。
センサチップ表面の活性化： NHS(0.1M)/EDC(0.4M)=1/1、25℃、30分
リガンドの固定： 上記のリガンド溶液、25℃、30分
ブロッキング： 1Mエタノールアミン溶液(pH8.5)、25℃、30分
【００６２】
（２）化合物の結合測定
測定化合物： Indapamide
温度： 25℃
ランニングバッファー： リン酸バッファー(pH7.4、DMSO5%含有)
化合物濃度： 0.5μM
測定時間： 30秒
【００６３】
（３）ka、kd、KDの計算
表面プラズモン共鳴の信号変化の測定結果から、下記式（１）、（２）及び（３）を用いることによって吸着速度係数（ka）及び離脱速度係数（kd）を求め、求めた吸着速度係数（ka）及び離脱速度係数（kd）から、KD＝kd／ka表される式により解離定数（KD）を算出した。
【００６４】
ｄθ／ｄｔ＝ka×ｃs×（１−θ）−kd×θ （１）
（式中、θは吸着率（＝吸着量／飽和吸着量）、kaは吸着速度係数、kdは離脱速度係数、ｃsは金属表面近傍の被解析分子の濃度を表す。）
∂ｃ／∂ｔ＝Ｄ×∂2ｃ／∂ｘ2 （２）
（式中、ｘは金属表面からの距離、Ｄは被解析分子の拡散係数、ｃは被解析分子の濃度を表し、ｘ＝０のときｃ＝ｃsとなる。）
θ＝Ｒ／Ｒｍａｘ （３）
（式中、θは吸着率（＝吸着量／飽和吸着量）を示し、Ｒは表面プラズモン信号を示し、Ｒｍａｘは被解析分子が飽和吸着したときの信号を表す。）
【００６５】
その結果を以下に示す。
ka = 4.0×105(M-1s-1)
kd = 2.2×10-1(s-1)
KD = 5.5×10-7(M)
【００６６】
実施例２
PMMAの代わりに下記化合物F-1を用いること以外は実施例１と同様に作製したセンサチップを用いて、実施例１と同様に実験を行った。その結果、実施例１と同様の結果が得られた。
【００６７】
【化１】
【００６８】
実施例３
図１に記載のスクリーニング用SPRシステムと実施例２で作成したセンサチップを用いて、リガンドの固定、多数の化合物のスクリーニングを自動的に行う。
（１）リガンド固定
リガンドの固定は以下の手順で行う。
リガンド溶液の調製： 炭酸脱水素酵素0.1mgを酢酸バッファー(pH5.0) 1mlに溶解。
センサチップ表面の活性化： NHS(0.1M)/EDC(0.4M)=1/1、25℃、30分
リガンドの固定： 上記のリガンド溶液、25℃、30分
ブロッキング： 1Mエタノールアミン溶液(pH8.5)、25℃、30分
【００６９】
（２）結合測定、および化合物の選別
測定化合物： 任意の一群の化合物5000個
温度： 25℃
ランニングバッファー： リン酸バッファー(pH7.4、DMSO5%含有)
化合物濃度： 0.1、1、10μM(DMSO 5% PBSバッファー)
測定時間： 30秒
【００７０】
ka、kdの計算：実施例１の（３）と同様の方法により計算する。計算に使用する結合曲線は、上記3点の化合物濃度で得られた曲線の中から適宜選択する。
化合物の選別： kaが1.0×106(M-1s-1)以上、かつkdが1.0×10-1(s-1)以上の化合物を自動選別する。
表示： 上記で選別された化合物の番号が、表示装置上に点滅して表示される。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、本発明のスクリーニング方法を行うためのＳＰＲシステムの一例を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンドと相互作用する被験物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品は生体内において蛋白質と相互作用し機能することが多い。例えば、阻害剤は酵素に結合し酵素反応を阻害することで生体内の生化学反応を変化させ、薬理作用を発現する。このため、医薬品探索において蛋白質と医薬品候補化合物の結合の強さを知ることが重要となる。
【０００３】
近年、蛋白と化学物質の相互作用を手法として表面プラズモン共鳴法が注目されている。この手法では金などの金属表面に蛋白を固相化し、化学物質をここに供与したときの共鳴の変化を用いて相互作用を定量する。化学物質である被解析分子は金属表面に固定化された蛋白質などの被解析分子と相互作用する分子へ時間とともに吸着する。このときの吸着量すなわちSPR信号の変化は下式に従って変化する。
dR/dt = ka・Cs・(Rmax - R) - kd・R 式(1)
（式中、RはSPR信号であり、Rmaxは最大SPR信号である。また、kaは結合速度定数、kdは解離速度定数、Csは金属表面近傍の被解析分子の濃度を表す。）
【０００４】
ここで、金属表面を定常的に新鮮な液に置換しつづけられる理想的な条件ではCsは一定となり、簡素な微分方程式を解くことで測定結果からka、kdを求めることが可能である。結合定数(KD)は結合と解離の比を示すものであり、kd/kaで表される。
【０００５】
低分子医薬の探索においては、通常、ひとつのターゲット蛋白質に対して、少なくとも１００００個以上の低分子化合物のスクリーニングを行う。その結果得られたヒット化合物群について、さらに詳細な評価を実施し、ひとつのリード化合物に絞り込んでいく。
【０００６】
表面プラズモン共鳴法による蛋白質と被験化合物との相互作用の測定は、非特許文献１に記載されているように、医薬探索のプロセスに用いられているが、１日あたりの測定数は100サンプル程度であり、その処理能力の低さから前述のような大規模なスクリーニングに使われることはなかった。
【０００７】
大規模スクリーニングは、ELISA法、RI標識法が主に用いられているが、これらの方法は、蛋白と化合物を一定時間反応させた後、バッファーによる洗浄操作を経て、化合物の結合量を測定するため、結合はするものの解離速度の速い化合物を選別するには困難であった。一方で、医薬化合物としては、副作用の観点から、一定の化合物濃度下では速やかに結合し、服用を止めた場合には速やかに解離するような化合物が望まれる場合がある。従って、大規模スクリーニングで、結合速度、解離速度ともに大きい化合物を選別する手法が望まれていた。
【０００８】
【非特許文献１】BUNSEKI KAGAKU vol.51, No.6, pp.461-468 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、リガンドと相互作用する被験物質のスクリーニング方法であって、多数の被験物質の中から結合速度及び解離速度の両方が大きい物質を簡便にスクリーニングできる方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、1x10-2(S-1)以上の任意の解離速度定数（kd）、および1x105(M-1S-1)以上の任意の結合速度定数（ka）を選別の基準値として、測定した解離速度定数および結合速度定数の双方が、上記の基準値以上である被験物質を選別することによって、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明によれば、リガンドと被験物質との相互作用に基づき一群の被験物質から特定の被験物質を選別するスクリーニング方法において、該リガンドが固相化されており、該リガンドの固相化を行うユニットと、固相化したリガンドと被験物質との相互作用の測定を行うユニットとが分離されており、1x10-2(S-1)以上の任意の解離速度定数（kd）、および1x105(M-1S-1)以上の任意の結合速度定数（ka）を選別の基準値として、測定した解離速度定数および結合速度定数の双方が、上記の基準値以上である被験物質を選別する、上記のスクリーニング方法が提供される。
【００１２】
本発明の別の側面によれば、リガンドと被験物質との相互作用に基づき一群の被験化合物から特定の化合物を選別するスクリーニング方法において、該リガンドが固相化されており、固相化された該リガンドに該被験物質の溶液を接触させた時に変化する信号量から、該リガンドと該被験物質との解離速度定数（kd）および結合速度定数（ka）を求め、1x10-2(S-1)以上の任意の解離速度定数（kd）、および1x105(M-1S-1)以上の任意の結合速度定数（ka）を選別の基準値として、測定した解離速度定数および結合速度定数の双方が、上記の基準値以上である被験物質を選別する、上記のスクリーニング方法が提供される。当該方法において、好ましくは、リガンドの固相化を行うユニットと、固相化したリガンドと被験物質との相互作用の測定を行うユニットとが分離されている。
【００１３】
好ましくは、予め装置に入力された結合速度定数および解離速度定数の範囲内に入る被験物質が自動選別される。
好ましくは、結合速度定数および解離速度定数を表面プラズモン共鳴装置により求める。
好ましくは、選別された被験物質が表示装置上で視覚的に区別される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、多数の被験物質の中から、結合速度及び解離速度の両方が大きい物質を簡便にスクリーニングすることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のスクリーニング方法は、リガンドと被験物質との相互作用に基づき一群の被験物質から特定の被験物質を選別するスクリーニング方法であって、1x10-2(S-1)以上の任意の解離速度定数（kd）、および1x105(M-1S-1)以上の任意の結合速度定数（ka）を選別の基準値として、測定した解離速度定数および結合速度定数の双方が、上記の基準値以上である被験物質を選別することを特徴とする。
【００１６】
本発明において、解離速度定数（kd）および結合速度定数（ka）は、固相化したセンサチップを用いて表面プラズモン共鳴測定装置により求めることが好ましい。表面プラズモン共鳴法では、リガンド及び被験物質の両方が無標識の状態で、両者の結合、解離といった相互作用をリアルタイムで測定することができる。従って、解離速度が極端に速い被験物質であっても、結合性の識別が可能である。
【００１７】
本発明においては、1x10-2(S-1)以上の任意の解離速度定数（kd）、および1x105(M-1S-1)以上の任意の結合速度定数（ka）を選別の基準値として、測定した解離速度定数、および結合速度定数の双方が、それら基準値以上である被験物質を選別する。より好ましくは、1x10-1(S-1)以上の任意の解離速度定数（kd）、および1x106(M-1S-1)以上の任意の結合速度定数（ka）を選別の基準値として、測定した解離速度定数、および結合速度定数の双方が、それら基準値以上である被験物質を選別する。
【００１８】
本発明においては、相互作用の測定は全ての化合物について同一の時間で行うことが好ましい。時間は、結合反応、解離反応ともに10分未満であることが好ましく、3分未満であることがより好ましく、1分未満であることがさらに好ましい。
【００１９】
本発明においては、固相化されたリガンドに被験物質溶液を接触させた時に変化する信号量から、該リガンドと該被験物質の解離速度定数、および結合速度定数を求めることが好ましい。
【００２０】
本発明においては、スクリーニングにかける全被験物質の分子量が予めスクリーニング装置に入力されていることが好ましい。各被験物質の結合量は、結合量／分子量で表されるように、各々の分子量で規格化して表示されることが好ましい。
【００２１】
本発明においては、スクリーニング装置に予め、選択したい範囲の結合速度定数、解離速度定数を入力しておき、その範囲に入る被験物質が自動選別されることが好ましい。選別された被験物質は、表示装置に視覚的に区別されるように表示されることが好ましい。視覚的な区別の方法は特に限定されないが、例えば、文字の大きさ、色、文字の点滅、文字の色、アンダーライン、枠で囲む、などの方法が挙げられる。
【００２２】
本発明においては、リガンド（蛋白質など）が固相化されていることが好ましい。固相化の方法としては、公知の方法が用いられる。また、リガンドの固相化を行うユニットと、固相化したリガンドと被験物質との相互作用測定を行うユニットが分離されていることが好ましい。装置構成の一例を図１に示す。リガンドの固相化を行うユニットと、相互作用測定を行うユニットを分離することにより、測定処理能力が大幅に向上する。
【００２３】
本発明において、一群の被験物質の数は、１０００個以上であることが好ましく、１００００個以上であることがより好ましく、１０００００個以上であることがさらに好ましい。
【００２４】
被験物質は、単一の物質でもよいし、複数の物質の混合物でもよい。本発明で用いる被験物質としては例えば、本明細書中以下に記載するような生理活性物質（リガンド）と相互作用する物質であれば特に限定されないが、低分子有機化合物、高分子化合物、ＤＮＡ等の核酸、蛋白質（抗体などを含む）、ペプチド又はその断片、糖、アミノ酸などが挙げられる。
【００２５】
本発明では、リガンドと該被験物質との解離速度定数（kd）および結合速度定数（ka）は、非標識検出法で測定することが好ましい。非標識検出法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられ、中でも表面プラズモン共鳴装置を用いて表面プラズモン共鳴測定を行うことが特に好ましい。
【００２６】
次に、表面プラズモン共鳴装置で用いるバイオセンサーについて説明する。バイオセンサーの基板は、金属表面又は金属膜であることが好ましい。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００２７】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、１オングストローム以上５０００オングストローム以下であるのが好ましく、特に１０オングストローム以上２０００オングストローム以下であるのが好ましい。５０００オングストロームを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、１オングストローム以上、１００オングストローム以下であるのが好ましい。
【００２８】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００２９】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００３０】
基板は、基板の最表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「基板の最表面」とは、「基板から最も遠い側」という意味である。
【００３１】
好ましい官能基としては−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ3ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基などが挙げられる。ここで、低級アルキル基における炭素数は特に限定されないが、一般的にはＣ１〜Ｃ１０程度であり、好ましくはＣ１〜Ｃ６である。
【００３２】
最表面にそれらの官能基を導入する方法としては、それらの官能基の前駆体を含有する高分子を金属表面あるいは金属膜上にコーティングした後、化学処理により最表面に位置する前駆体からそれらの官能基を生成させる方法が挙げられる。例えば−ＣＯＯＣＨ3基を含有するポリメチルメタクリレートを金属膜上にコーティングした後、その表面をＮａＯＨ水溶液（１Ｎ）に４０℃１６時間接触させると、最表面に−ＣＯＯＨ基が生成する。
【００３３】
上記のようにして得られたバイオセンサー用表面において、上記の官能基を介して生理活性物質（リガンド）を共有結合させることによって、金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化することができる。
【００３４】
バイオセンサー用表面上に固定される生理活性物質（リガンド）としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００３５】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００３６】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００３７】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００３８】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００３９】
生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質又は核酸である場合、その固定化は、生理活性物質のアミノ基、チオール基等を利用し、金属表面の官能基に共有結合させることで行うことができる。
【００４０】
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【００４１】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００４２】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００４３】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００４４】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００４５】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００４６】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００４７】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００４８】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００４９】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００５０】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【００５１】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【００５２】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【００５３】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰角（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【００５４】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【００５５】
本発明の一実施態様においては、表面プラズモン共鳴測定装置の流路系内の液体を、被験物質を含まない溶液から被験物質を含む溶液へと交換後、液の流れを停止させた状態で表面プラズモン共鳴の変化を測定することができる。このような測定により、測定時間内における参照セルの信号変化のノイズ幅、及びベースライン変動を抑制することができ、これにより信頼性の高い結合検出データを取得することができる。液の流れを停止させる時間は特に限定されないが、例えば、１秒以上３０分以下であり、好ましくは１０秒以上２０分以下であり、さらに好ましくは１分以上２０分以下程度である。
【００５６】
本発明においては好ましくは、被験物質と相互作用する物質を結合していない参照セルと、被験物質と相互作用する物質を結合した検出セルとを直列に連結して流路系内に設置し、該参照セルと該検出セルに液体を流すことにより、表面プラズモン共鳴の変化を測定することができる。
【００５７】
また、本発明においては、測定に用いるセルの体積(Vs ml)（上記した参照セルと検出セルを用いる場合はそれらのセルの合計体積）に対し、1回の測定あたりの液交換量(Ve ml)の比率(Ve/Vs)を、例えば、1以上100以下とすることができる。Ve/Vsは、より好ましくは1以上50以下であり、特に好ましくは1以上20以下である。測定に用いるセルの体積(Vs ml)は特に限定されないが、好ましくは１×１０-6〜１．０ml、特に好ましくは１×１０-5〜１×１０-1ml程度である。また、液体の交換にかける時間としては、0.01秒以上100秒以下が好ましく、0.1秒以上10秒以下がより好ましい。
【００５８】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５９】
実施例１
図１に記載のスクリーニング用SPRシステムを用いて、リガンドの固定、化合物の結合測定を行った。
（１）リガンドの固定
図１に記載のタンパク固定機と下記のセンサチップを用いて、以下の固定条件でセンサチップにリガンドを固定した。
【００６０】
センサチップ：金膜の厚さが500オングストロームになるように金を蒸着した1cm(1cmのカバーガラスをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分処理した後、スピンコート機（MODEL ASS-303、ABLE製）にセットし1000rpmにて回転させ、金蒸着カバーガラス中央にポリメチルメタクリレート（PMMA）のメチルエチルケトン溶液（2mg/ml）を50μｌ滴下し、2分後に回転を止めた。エリプソメトリー法（In-Situ Ellipsometer MAUS-101、Five Lab製）により膜厚を測定したところ、ポリメタクリル酸メチル膜の厚さは200オングストロームであった。このサンプルをPMMA表面チップと呼ぶ。このPMMA表面チップをNaOH水溶液（１Ｎ）に４０℃１６時間浸漬した後、水で3回洗浄した。このサンプルをPMMA/COOH表面チップと呼ぶ。このPMMA/COOH表面チップを１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液２ｍｌに６０分浸漬した後、α-アミノ-ポリエチレンオキシ-ω-カルボン酸（平均分子量5000）水溶液（１0mM）２ｍｌに１６時間浸漬した。最後に水で５回洗浄した。
【００６１】
リガンドの固定は以下の手順で行う。
リガンド溶液の調製： 炭酸脱水素酵素を0.1mg/mlになるように酢酸バッファー（pH5.0）で溶解。
センサチップ表面の活性化： NHS(0.1M)/EDC(0.4M)=1/1、25℃、30分
リガンドの固定： 上記のリガンド溶液、25℃、30分
ブロッキング： 1Mエタノールアミン溶液(pH8.5)、25℃、30分
【００６２】
（２）化合物の結合測定
測定化合物： Indapamide
温度： 25℃
ランニングバッファー： リン酸バッファー(pH7.4、DMSO5%含有)
化合物濃度： 0.5μM
測定時間： 30秒
【００６３】
（３）ka、kd、KDの計算
表面プラズモン共鳴の信号変化の測定結果から、下記式（１）、（２）及び（３）を用いることによって吸着速度係数（ka）及び離脱速度係数（kd）を求め、求めた吸着速度係数（ka）及び離脱速度係数（kd）から、KD＝kd／ka表される式により解離定数（KD）を算出した。
【００６４】
ｄθ／ｄｔ＝ka×ｃs×（１−θ）−kd×θ （１）
（式中、θは吸着率（＝吸着量／飽和吸着量）、kaは吸着速度係数、kdは離脱速度係数、ｃsは金属表面近傍の被解析分子の濃度を表す。）
∂ｃ／∂ｔ＝Ｄ×∂2ｃ／∂ｘ2 （２）
（式中、ｘは金属表面からの距離、Ｄは被解析分子の拡散係数、ｃは被解析分子の濃度を表し、ｘ＝０のときｃ＝ｃsとなる。）
θ＝Ｒ／Ｒｍａｘ （３）
（式中、θは吸着率（＝吸着量／飽和吸着量）を示し、Ｒは表面プラズモン信号を示し、Ｒｍａｘは被解析分子が飽和吸着したときの信号を表す。）
【００６５】
その結果を以下に示す。
ka = 4.0×105(M-1s-1)
kd = 2.2×10-1(s-1)
KD = 5.5×10-7(M)
【００６６】
実施例２
PMMAの代わりに下記化合物F-1を用いること以外は実施例１と同様に作製したセンサチップを用いて、実施例１と同様に実験を行った。その結果、実施例１と同様の結果が得られた。
【００６７】
【化１】
【００６８】
実施例３
図１に記載のスクリーニング用SPRシステムと実施例２で作成したセンサチップを用いて、リガンドの固定、多数の化合物のスクリーニングを自動的に行う。
（１）リガンド固定
リガンドの固定は以下の手順で行う。
リガンド溶液の調製： 炭酸脱水素酵素0.1mgを酢酸バッファー(pH5.0) 1mlに溶解。
センサチップ表面の活性化： NHS(0.1M)/EDC(0.4M)=1/1、25℃、30分
リガンドの固定： 上記のリガンド溶液、25℃、30分
ブロッキング： 1Mエタノールアミン溶液(pH8.5)、25℃、30分
【００６９】
（２）結合測定、および化合物の選別
測定化合物： 任意の一群の化合物5000個
温度： 25℃
ランニングバッファー： リン酸バッファー(pH7.4、DMSO5%含有)
化合物濃度： 0.1、1、10μM(DMSO 5% PBSバッファー)
測定時間： 30秒
【００７０】
ka、kdの計算：実施例１の（３）と同様の方法により計算する。計算に使用する結合曲線は、上記3点の化合物濃度で得られた曲線の中から適宜選択する。
化合物の選別： kaが1.0×106(M-1s-1)以上、かつkdが1.0×10-1(s-1)以上の化合物を自動選別する。
表示： 上記で選別された化合物の番号が、表示装置上に点滅して表示される。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、本発明のスクリーニング方法を行うためのＳＰＲシステムの一例を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドと被験物質との相互作用に基づき一群の被験物質から特定の被験物質を選別するスクリーニング方法において、該リガンドが固相化されており、該リガンドの固相化を行うユニットと、固相化したリガンドと被験物質との相互作用の測定を行うユニットとが分離されており、1x10-2(S-1)以上の任意の解離速度定数（kd）、および1x105(M-1S-1)以上の任意の結合速度定数（ka）を選別の基準値として、測定した解離速度定数および結合速度定数の双方が、上記の基準値以上である被験物質を選別する、上記のスクリーニング方法。
【請求項２】
リガンドと被験物質との相互作用に基づき一群の被験化合物から特定の化合物を選別するスクリーニング方法において、該リガンドが固相化されており、固相化された該リガンドに該被験物質の溶液を接触させた時に変化する信号量から、該リガンドと該被験物質との解離速度定数（kd）および結合速度定数（ka）を求め、1x10-2(S-1)以上の任意の解離速度定数（kd）、および1x105(M-1S-1)以上の任意の結合速度定数（ka）を選別の基準値として、測定した解離速度定数および結合速度定数の双方が、上記の基準値以上である被験物質を選別する、上記のスクリーニング方法。
【請求項３】
リガンドの固相化を行うユニットと、固相化したリガンドと被験物質との相互作用の測定を行うユニットとが分離されている、請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
予め装置に入力された結合速度定数および解離速度定数の範囲内に入る被験物質が自動選別される、請求項１から３の何れかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
結合速度定数および解離速度定数を表面プラズモン共鳴装置により求める、請求項１から４の何れかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
選別された被験物質が表示装置上で視覚的に区別される、請求項１から５の何れかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１】
リガンドと被験物質との相互作用に基づき一群の被験物質から特定の被験物質を選別するスクリーニング方法において、該リガンドが固相化されており、該リガンドの固相化を行うユニットと、固相化したリガンドと被験物質との相互作用の測定を行うユニットとが分離されており、1x10-2(S-1)以上の任意の解離速度定数（kd）、および1x105(M-1S-1)以上の任意の結合速度定数（ka）を選別の基準値として、測定した解離速度定数および結合速度定数の双方が、上記の基準値以上である被験物質を選別する、上記のスクリーニング方法。
【請求項２】
リガンドと被験物質との相互作用に基づき一群の被験化合物から特定の化合物を選別するスクリーニング方法において、該リガンドが固相化されており、固相化された該リガンドに該被験物質の溶液を接触させた時に変化する信号量から、該リガンドと該被験物質との解離速度定数（kd）および結合速度定数（ka）を求め、1x10-2(S-1)以上の任意の解離速度定数（kd）、および1x105(M-1S-1)以上の任意の結合速度定数（ka）を選別の基準値として、測定した解離速度定数および結合速度定数の双方が、上記の基準値以上である被験物質を選別する、上記のスクリーニング方法。
【請求項３】
リガンドの固相化を行うユニットと、固相化したリガンドと被験物質との相互作用の測定を行うユニットとが分離されている、請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
予め装置に入力された結合速度定数および解離速度定数の範囲内に入る被験物質が自動選別される、請求項１から３の何れかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
結合速度定数および解離速度定数を表面プラズモン共鳴装置により求める、請求項１から４の何れかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
選別された被験物質が表示装置上で視覚的に区別される、請求項１から５の何れかに記載のスクリーニング方法。
【図１】
【公開番号】特開２００６−７８２１０（Ｐ２００６−７８２１０Ａ）
【公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２５９６６１（Ｐ２００４−２５９６６１）
【出願日】平成１６年９月７日（２００４．９．７）
【出願人】（０００００５２０１）富士写真フイルム株式会社 (7,609)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月７日（２００４．９．７）
【出願人】（０００００５２０１）富士写真フイルム株式会社 (7,609)
【Ｆターム（参考）】
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