複合型骨髄移植材、その調製法およびキット
【課題】移植者に多大の負担を与える自己移植に代わる方法に対して有用な、複合型骨髄移植材料、当該移植材料の調製方法及び調製器具を提供する。
【解決手段】本発明は、基質の表面に均一に分布した多数の始原細胞を含む複合型骨髄移植材料に関するものであり、当該移植材料は、好適には、移植の効果を大きく向上させる働きのある、抗凝固処理していない骨髄吸引液から得られる凝固材を含む。本発明はまた、骨髄吸引液を多孔性生物学的適合性移植可能基質を通過させることにより、吸引骨髄の始原細胞を選択的に基質表面に付着させることを含む骨移植材料を調製する方法を提供する。さらに、高濃度の複合型骨髄移植材料の調製に有用な無菌器具を提供する。
【解決手段】本発明は、基質の表面に均一に分布した多数の始原細胞を含む複合型骨髄移植材料に関するものであり、当該移植材料は、好適には、移植の効果を大きく向上させる働きのある、抗凝固処理していない骨髄吸引液から得られる凝固材を含む。本発明はまた、骨髄吸引液を多孔性生物学的適合性移植可能基質を通過させることにより、吸引骨髄の始原細胞を選択的に基質表面に付着させることを含む骨移植材料を調製する方法を提供する。さらに、高濃度の複合型骨髄移植材料の調製に有用な無菌器具を提供する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
骨移植は、骨折や不癒合の治療や、関節固定を促すために広く使用されている。移植者の体の一部から採取して移植者の別の部位に移植される自原性海綿骨は、現在最も有効な骨移植である。自原性海綿骨は骨治癒反応の広がりを支持する足場、および新規軟骨または骨を形成する始原細胞となる。しかしながら、自原性骨の採取にかかる費用は大きく、また、傷、失血、苦痛をもたらす、手術およびリハビリテーションに時間が掛かる、ならびに感染症の危険があるなど、健康に与える悪影響が大きい。さらに、移植部位の容量が可能な自己移植の容量を超える場合がある。
【０００２】
このため自己移植に代わる方法が開発されてきた。セラミック、生体高分子、合成同種異系移植骨、およびコラーゲン基質を含む複数の精製物質または合成物質が研究され、或いは自己移植の代用として利用されている。ＦＤＡは、局所的な骨の欠損への使用に多孔性のサンゴから得られる剛性ヒドロキシアパタイトセラミックを承認した。また、精製したコラーゲン／セラミック複合型材料が急性長骨骨折への使用に承認されている。これらの材料は、自己移植片の採取に伴う健康への悪影響を避け、また入手可能な自己移植片が限られていることに関する問題を排除するものであるが、一般に複合型材料の臨床的有効性は自己移植片に依然として劣る。また、合成移植材料も骨髄細胞の担体として使用されている。上述の複合型材料を骨格の欠損に移植すると、始原細胞が骨格組織に変化する。
【０００３】
複合型移植片は、細胞懸濁液中の合成移植片と、同量またはそれよりも少ない量の骨髄吸引液を混合することによりつくられる場合がある。しかしながら、軟骨に変化する能力を有する始原細胞、骨、筋肉、繊維組織、およびその他結合組織は骨髄中にわずかしか存在しない。骨髄１ｍｌ当たりの始原細胞の数は、約１００から２０，０００までと、患者によって大きく異なる。これは、骨髄吸引液中の有核細胞の平均値が約２０，０００に１つから４０，０００に１つであることを表している。よって、所定の容量の合成移植材をそれに匹敵する容量の新鮮な骨髄中に混合してなる複合型移植片に含まれる始原細胞の数は比較的微量である。
【０００４】
このため、これまでに複合型移植片中の始原細胞の相対濃度を増大させるための技術が開発されている。この技術は、骨髄細胞の懸濁液を組織培養皿に移植する段階と、細胞を選択培地中で１または数日培養し、始原細胞の個体数を増大させる段階と、次いで細胞を組織培養皿から剥離し、個体数が増加した始原細胞を含む細胞懸濁液を調製する段階を含む。次いで合成セラミック担体をこの始原細胞を多く含む懸濁液に含浸することにより複合型移植片を作成する。残念ながら、この複合型移植片調製法には時間が掛かり過ぎる。さらに、移植者から採取した骨髄吸引液から元となる始原細胞を採取する場合、移植者は複数回の外科処置を受けなければならい。すなわち、一度骨髄採取処置を行い、後日また複合型移植片を移植する処置を行わねばならない。その結果移植者に少なくとも２回の麻酔を行うことになる。
【０００５】
複合型骨移植片基質を製造するために開発された別の技術では、培養方法に利点を持ちながら、時間も掛からず複数の外科処理も必要としない。この技術では、所定の容量の基質材料とそれよりも多い骨髄吸引液を接触させることにより始原細胞を多く含む複合型基質を製造する（特許文献１および２参照）。本技術においては、選択的に始原細胞と結合する表面を有する多孔性基質材に始原細胞を含む骨髄吸引液を通過させることにより、基質内に始原細胞を保持し、それ以外の他の細胞（血液細胞および骨髄から得られるその他有核細胞など）を通過させる。こうして始原細胞を多く含む移植片基質を患者に移植する。
【０００６】
しかしながら、始原細胞は非常に強固に、且つ選択的に一部基質の表面（例えば同種異系移植片）に結合するので、基質全体に均一に分布せず、骨髄吸引液と基質材料の最初の接触位置の近傍に集中する始原細胞の高濃度ポケットを複数形成する。その結果、移植された基質内における始原細胞の分布が不均一であることにより、この技術により調製された骨移植片には、移植後の骨治癒が均一に起こらないという欠点がある。加えて、基質移植後の骨治癒の進行が比較的遅い。
【特許文献１】米国特許第５８２４０８４号明細書
【特許文献２】米国特許第６０４９０２６号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、手術中に行うことが可能な、始原細胞を多く含む複合型骨髄移植材の新規調製方法が所望される。つまり、移植者からの骨髄採取と同時に行うことができ、移植材全体に一様に分布する始原細胞が得られ、且つ移植により治癒を促進する方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
多孔性で生物学的適合性の基質と凝固材とを含む複合型骨髄移植材を提供する。本複合型骨髄移植材料は始原細胞を多く含む。また、複合型骨髄移植材料の調製法を提供する。本方法は、骨髄吸引液を用意する段階、多孔性生物学的適合性移植可能基質を用意する段階、骨髄吸引液と基質を接触させて高濃度の基質を用意する段階、および高濃度の基質を機械的に混合し、始原細胞が実質的に一様に分布した複合型骨髄移植材料を生成する段階を含む。
【０００９】
さらに、複合型骨髄移植材料を調製するためのキットを提供する。本キットは、基質容器、第１エンドキャップ、および第１充填用シリンジを含む。第１充填用シリンジを第１エンドキャップに取り付けることにより、第１充填用シリンジと基質容器との間で液体が流れることが可能となる。第１エンドキャップは基質容器に開放可能に取り付けられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書において、５−２５、または５から２５と言った場合、好適には、上と下の限界値としてそれぞれ独立的に、５以上、且つ、２５未満を意味する。本明細書で使用する「始原細胞」という表現は、結合組織始原細胞および／または幹細胞など、いかなる始原細胞も含む。この細胞群は多能性で、様々な組織（例えば、骨、軟骨、脂肪、腱、じん帯、筋肉、神経組織、造血組織、内皮および血管組織、ならびに肝臓）に変化可能な細胞を含む。
【００１１】
本発明による多数の始原細胞を有する複合型骨髄移植材料調製方法は、一般に次に挙げる段階を含む。すなわち、骨髄吸引液を採取する第１段階、（例えば基質内に吸引液を通すことにより）骨髄吸引液を多孔性且つ生物学的適合性で移植が可能な基質に接触させ、始原細胞の個体数を増大させた高濃度基質を得る第２段階、高濃度基質を混合し、始原細胞を全体にほぼ均一に分布させる第３段階、および余分な液体中の基質を排出する第４段階を含む。好適には、当該方法は、高濃度基質に凝固材を追加する段階も含む。このようにして調製された複合型骨髄移植材料は次いで患者または移植者に移植され、骨治癒および／または骨再生を有効に促す。
【００１２】
上述の方法の段階に含まれる複数の機能要素について以下に説明する。このような機能要素には、骨髄吸引液、多孔性生物学的適合性移植可能基質、および好適には凝固材が含まれる。これら機能要素について説明した後、本発明の複合型骨移植片を調製するための好適な方法および装置について説明する。後述の説明は例示のみを目的とし、限定的なものではないことに注意されたい。
【００１３】
骨髄吸引液
骨髄吸引液には、血漿、有核始原細胞（始原細胞）、有核造血細胞、内皮細胞、および赤血球と血小板とを含む抹消血から得られた細胞が含まれている。骨髄吸引液が抹消血を含むため、吸引液は抗凝固薬を含むシリンジに集めることが好ましい。適当な抗凝固薬として、ヘパリン、クエン酸ナトリウム、およびＥＤＴＡを挙げることができる。好適には、本発明の方法に使用する骨髄吸引液は、移植を受ける患者（移植者）から採取する。それ程好適ではないが、骨髄吸引液を免疫学的に適合する別のドナーから採取してもよい。
【００１４】
多孔性生物学的適合性移植可能基質
当該基質は、多孔性で、生物学的に適合性の、移植可能な基質からなる。好適には、基質は生物活性表面を有する。生物活性表面を有する多孔性生物学的適合性の移植可能な移植片基質材料の例としては、ヒドロキシアパタイトまたはリン酸三カルシウムなどのリン酸カルシウムを含むセラミック、ならびに脱塩または鉱化骨基質が挙げられる。その他の適切な基質材料は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリガラクチン酸、ポリカプロラクトン、酸化ポリエチレン、酸化ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリエチレンおよびポリプロピレンなどの生体高分子を含む。また、それ以外の適切な基質材料はヒアルロン酸で、架橋、生体ガラス、およびコラーゲンにより精製してもしなくてもよい。
【００１５】
さらに好適には、細胞接着分子を基質基板の表面に結合させる。「細胞接着分子」という表現には、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、血管細胞接着分子（Ｖ−ＣＡＭ）、細胞間接着分子（Ｉ−ＣＡＭ）、テネイシン、トロンボスポンジン、オステオネクチン、オステオポンチン、骨シャロ蛋白、コラーゲン、または基板表面に対する始原細胞の選択的接着促進効果を有する他のあらゆる分子または成分を含む。
【００１６】
基質は、同一の外形寸法を有する非多孔性の固体と比較して、始原細胞の接着に使用可能な基質表面積が少なくとも２倍、好適には３倍、５倍、７倍、さらには１０倍となるに十分な多孔性を有することが好ましい。粉末、果粒、繊維、それらの組み合わせ、または単一の超多孔性基板塊を使用することにより、そのような総表面積の増大を図ることができる。始原細胞が孔開口部を通って基質材料の空隙容量内へ浸透し、それにより孔内の表面積が利用されるのを促すために、基質中の孔の大きさは好適には２０μｍより大きく、さらに好適には５０μｍ、１００μｍ、さらには５００μｍより大きく、最も好適には１０００μｍより大きい。
【００１７】
特に適当な基質材料には、分離した鉱化海綿骨切片、鉱化骨の粉末または果粒、脱塩海綿骨切片、脱塩骨の粉末または果粒、グアニジンＨＣｌ抽出脱塩骨基質、皮質骨または海綿骨、Ｉｎｔｅｒｐｏｒｅ５００（登録商標）またはＩｎｔｅｒｐｏｒｅ２００（登録商標）という名称でＩｎｔｅｒｐｏｒｅ社より市販されているサンゴ質ヒドロキシアパタイト、Ｚｉｍｍｅｒ社により市販されている骨移植片の代用品Ｃｏｌｌａｇｒａｆｔ（商標）に含まれるような果粒状セラミック、Ｏｒｔｈｏｖｉｔａ社により市販されている移植片の代用品Ｖｉｔｏｓｓ（商標）に含まれるような顆粒状またはブロック状セラミック、およびＯｒｑｕｅｓｔ社によりコラーゲンからつくられているような糸状海綿が含まれる。
【００１８】
好適な基質は、骨基質の微粒子と繊維状の骨材料との組み合わせとして用意される。微粒子状の骨基質は、ヒトの海綿質骨から、好適には海綿骨から（例えばヒト長骨の末端から）採取するのが好ましい。繊維状骨材料は、皮質骨から採取することが好ましい。微粒子状骨材料および繊維状骨材料のどちらも骨バンクから得ることができ、或いは随意で移植者から採取してもよい。移植者から採取した場合、骨材料は、所望の微粒子および繊維特性に適合するように、手術中手術室において周知の骨処理手段により処理される。
【００１９】
用意する微粒子状の骨材料は、最適には、塊、小片または切片の形態の同種異系移植片海綿骨の粒子であり、その大きさは平均粒径にして１−１５ｍｍ、好適には２−８ｍｍの範囲である。用意する繊維状の骨材料は、最適には、同種異系移植片脱塩皮質骨繊維であり、その長さは５ｍｍ以上、さらに好適には１ｃｍ以上、２ｃｍ以上、３ｃｍ以上、さらには４ｃｍ以上で、最適には５ｃｍ以上である。繊維状の骨材料は、随意で、５ｍｍ−２ｃｍ、５ｍｍ−３ｃｍ、５ｍｍ−４ｃｍ、５ｍｍ−５ｃｍ、５ｍｍ−１５ｃｍ、またはその他の範囲の、様々な長さの繊維を混合して用意してもよい。或いは、繊維状骨材料に、Ｏｓｔｅｏｔｅｃｈ社により市販されているＧｒａｆｔｏｎ Ｆｌｅｘ（登録商標）などの柔軟なマットを使用してもよい。
【００２０】
微粒子状および繊維状骨材料を混合し、次のようにして好適な複合型基質を形成する。骨繊維、好適には上述の長さを有する脱塩皮質骨繊維を、次のような好適な配合で微粒子状骨粒子と混合する。すなわち、乾燥時重量が約２２５ｍｇ、それより徐々に望ましさは低下するが、２００−３００ｍｇ、１５０−３７５ｍｇ、１００−４５０ｍｇ、７５−５００ｍｇ、或いは２５−１０００ｍｇの脱塩皮質骨繊維と、約１０ｃｃ（かさ容量）、それより徐々に望ましさは低下するが、８−１２ｃｃ、６−１４ｃｃ、４−１６ｃｃ、２−１８ｃｃ、或いは１−２５ｃｃの、平均粒径１−１５ｍｍ、好適には２−８ｍｍの微粒子状骨粒子とを混合する。随意で、脱塩皮質骨繊維は同じような繊維を含む柔軟なマットから取得してもよい。そのようなマットを使用する場合、存在する可能性のある毒性または高浸透圧物質をすべて排除するために、等張液でまず洗浄する。次いでマットを食塩水または他の適当な等張液に浸し、個々の骨繊維の分離を促す。分離した骨繊維を微粒子状骨材料と次のような配合で混合し、好適な複合型基質を形成する。すなわち、当初の大きさが２．５ｃｍ×５ｃｍ×約２．５ｍｍ（当初の容積約３．１ｃｍ３）である１つのマットと、平均粒径１−１５ｍｍ、好適には２−８ｍｍの微粒子状骨粒子約１０ｃｃ（かさ容量）、それより徐々に望ましさは低下するが、８−１２ｃｃ、６−１４ｃｃ、或いは４−１６ｃｃを合わせる。
【００２１】
様々な大きさの移植片が必要な場合、本発明による繊維状骨対微粒子状骨の配合比（上述）に準拠する様々な大きさの複合型基質を用意することができることに注目されたい。例えば、微粒子状骨２０ｃｃ（推定均一かさ密度）を骨繊維４５０ｍｇと混合し、好適な複合型基質をつくることができる。
【００２２】
凝固材
凝固材は、移植者（または免疫学的に適合するドナー）の静脈または動脈から採取した血液から形成される血餅でよい。さらに好適には、凝固材は、最適には移植者から採取した抗凝固処理されていない骨髄吸引液から形成される骨髄クロットである。骨髄クロットが形成される骨髄吸引液は、手術中移植片処理段階において移植者から採取することが好ましい。それができない場合、凝固材は、従来技術に周知のフィブリングルー、フィブリン凝固材、血小板ゲル、および／または血小板濃縮物でもよい。
【００２３】
（抗凝固処理されていない骨髄吸引液から得た）骨髄クロットを始原細胞の濃度を高めた移植片基質に加えることにより得られる複合型骨髄移植片材料の有効性は、凝固材を加えない複合型移植片と比較して驚くほど大きく向上する。骨髄クロットのみに対し、（２倍以上の始原細胞を含み）５０−７０％多い有核細胞を産む同様の高濃度基質に骨髄クロットを加えた場合に得られる移植片は、高濃度基質のみの場合、および非高濃度基質と骨髄クロットを混合した場合のいずれよりも品質が優れていた。したがって、骨髄クロットを始原細胞の濃度を高めた基質に加えることにより、移植片の性能を向上させることができる。
【００２４】
特定の理論のいずれにも縛られることなく、以下の理由のうちの１つまたは複数により、骨髄クロットの添加は複合型骨移植片の有効性を向上させると考えられる。第１に、骨治療が成功するまでの過程に重要な細胞のいくつかが移植片基質に付着せず、したがって移植位置に十分に集中しない（または排除されることさえある）可能性があり、その結果当該位置においては効果を示さないか、または効果が不十分である。凝固カスケード（後述）の結果としてフィブリンにフィブリノーゲンを重合させると、移植位置における治癒反応に重要な細胞の付着および移動を促す貴重な追加的基質を得ることができる。そのような細胞には、増殖して血管形成により血管を形成する重要な前駆物質である環状構造を形成する移動性内皮細胞が含まれる。
【００２５】
第２の可能性は、移植位置での血餅形成の生理学的過程により、該位置に移植された骨形成原細胞の環境が向上することである。特に、抗凝固処理されていない骨髄吸引液が凝固すると、それに含まれる血小板が活性化し、血小板の脱果粒が起こる。次いで血小板の脱果粒により、そうでない場合には移植位置に存在しなくなる場合のある成長因子と骨回帰サイトカインを放出する。この段階において放出されるいくつかの重要な生物活性因子には、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、および形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ｂｅｔａ）が含まれる。また、凝固カスケードの結果であるフィブリノーゲンから形成されるフィブリン基質により、手術直後の期間中移植位置において重要な安定性を得ることができる。さらに、移植片の移植後数日間に亘って起こる線維素溶解活動の過程により、移植片が取り込まれる初期段階において、血管由来因子の追加的供給源（例えば、周知のフィブリン分割生成物）が与えられる。移植後移植位置において得られる血管形成により、該位置での新規血管の形成が促され、それが新しく移植された始原細胞およびその他細胞の栄養源となって骨治癒および成長が起こり、よって治癒反応を促進すると考えられる。
【実施例１】
【００２６】
本発明による複合型骨移植片作成方法の好適な実施例を説明する。本明細書に開示する装置部分は、好適には透明または半透明のプラスチックから作られることが好ましい。本発明の第１の好適な実施例では、図１に示すように、上述のように用意した複合型生物学的適合性移植可能基質１０を基質容器内に配置する。該容器は最適にはカラム１２である。（基質１０は、その材料および構造によって、隙間無く充填しても、ゆるく充填してもよい。）カラム１２は、特定の移植片のために必要な基質の量を収容するのに適した大きな内部容量を有するようにつくることができる。本明細書で使用する基質容量とは、特定の基質と同一の外形寸法を有する非多孔性固体の排除体積を指す。例えば、内部容量が５、１０、１５、２０、２５、３０ｃｃ、またはその他であるカラムを、様々な基質容量を収容するために使用することができる。好適には、カラム１２の内径は０．５−３．０ｃｍ、さらに好適には１−２ｃｍ、さらには１−１．５ｃｍである。カラム１２の好適な長さは、内径の１．５倍以上、さらに好適には２倍以上、最適には３倍以上である。ねじ込み接続、スナップ接続、またはその他任意の接続手段により、エンドキャップ１４が着脱可能にカラム１２に取り付けられる。
【００２７】
随意で、吸引液２０を通す一方で基質１０の粒子を保持する効果のあるスクリーンまたは膜１５をエンドキャップ１４に設けることができる（図８参照）。好適には、そのような膜は、直径が少なくとも２０μｍ、好適には３０μｍ、さらに好適には４０μｍの開口を複数有する。
【００２８】
（好適には抗凝固薬を含む）骨髄吸引液２０は、好ましくは移植者から、周知の手段により採取する。次いで吸引液２０を第１充填用シリンジ２８に充填する。最初、吸引液２０は始原細胞３２とそれ以外の有核細胞３３を、１：２０，０００から１：４０，０００の比率で含んでいる（図２Ａ参照）。吸引液はまた、血小板、赤血球、および血清（血清に溶解または懸濁可能な分子を含む）を含んでいる。充填用シリンジ２８には、エンドキャップコネクタ３１と一致するように構成されたシリンジコネクタ３０を取り付け、充填用シリンジ２８の対応する内部容積とカラム１２との間を液体が流れることができるようにする。第２充填用シリンジ２９にも、同様にエンドキャップコネクタ３１と一致するように構成されたシリンジコネクタ３０を取り付ける。図２に示すように、第１および第２充填用シリンジ２８、２９をカラム１２の両側で先述のコネクタを介してエンドキャップ１４に取り付け、よって第１充填用シリンジ２８、カラム１２、および第２充填用シリンジ２９の間で液体が流れることが可能になる。
【００２９】
次いで第１充填用シリンジ２８を押し込むと、吸引液２０はカラム１２内に流入して該カラム内の基質１０を通過するか、または基質１０と接触し、その後カラム１２の反対側で第２充填用シリンジ２９内に回収される。骨髄吸引液と基質とを接触させることで、基質内に吸引液を流すこと、基質を吸引液内で培養すること、または別の周知の手段により、濃度の高い基質を得ることができる。或いは、任意の周知の方法により吸引液２０に基質１０を接触させ、濃度の高い基質を得る。始原細胞は、有利にはおよび選択的に基質１０の表面に付着し、よって基質内に保持される。一方、他の余剰細胞（血球および骨髄由来の有核細胞）は基質内を比較的自由に流れ、第２充填用シリンジ２９に回収される。基質１０内の始原細胞の固体数を増やすために、基質１０内を流れる吸引液２０の容積は基質の容積を超えることが好ましい。このようにして、吸引液容積内に存在する始原細胞は好適に基質容積内で濃縮され、濃度の高い基質を得ることができる。ここで使用する「濃度の高い」という表現は、全有核骨髄細胞に対する始原細胞の比率が、元の骨髄吸引液内よりも基質内で高いことを意味する。好適には、濃度の高い基質内における、全骨髄由来有核細胞に対する始原細胞の比率は、１：２０，０００以上、好適には１：１０，０００以上、さらに好適には１：５，０００以上であり、これは始原細胞の浸透率または濃度が２倍以上、好適には４倍以上になっていることを示す。さらに好適には、濃度の高い基質における始原細胞の濃度は、骨髄クロットを含むが濃度を高めていない基質の５倍以上、好適には６倍以上、さらに好適には８倍以上である。吸引液容積：基質容積の比は、２：１以上であることが好ましく、さらに好適には３：１以上、さらには４：１以上である。例えば、基質容積１５ｃｃを有する基質を使用する場合、基質を通過させる吸引液の総容積は好適には３０ｃｃ以上、さらに好適には４５ｃｃ以上、さらには６０ｃｃ以上とする。随意で、カラム１２から第２充填用シリンジ２９に最初に流入した液を廃棄し、本方法を継続してもよい。
【００３０】
随意で、第１および第２充填用シリンジ２８、２９を交互に押し込むことにより、カラム１２内の基質１０に吸引液２０を両方向に流してもよい。特定の基質への細胞および前駆体の結合率に応じて、吸引液２０を基質１０に通して流すというこの手順を少なくとも１回、好適には２回以上、さらに好適には３回以上、さらには４回以上繰り返す。随意で、元の骨髄吸引液の懸濁液及び何らかの流出液が基質１０を通過した後に洗浄液を基質１０に通してもよい。洗浄液は、ｐＨ範囲が７．３から７．５である、無菌で等張性の緩衝液からなることが好ましい。適当な洗浄液は、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス平行塩類溶液、ヒト血清、および必要最小限の媒体を含む。
【００３１】
上述の手順の後、充填用シリンジ２８、２９をエンドキャップ１４から取り外す。図３に示すように、基質１０に保持された始原細胞３２は、基質１０内で不均一に分布している。特に、基質１０内には始原細胞の濃度勾配が存在し、始原細胞３２は、骨髄吸引液２０がカラム１２内に流入したとき最初に基質材料に接触した地点であるカラム１２の端部近傍の領域に集中している（図３Ｂ参照）。その結果、基質１０の中央の領域においては始原細胞３２の個体数がずっと少ない（図３Ａ参照）。これは、カラム１２に流入した際に始原細胞およびその他細胞が基質表面に急速に付着するためである。したがって、始原細胞がもっと均一に分布した濃度の高い基質を製造するのに、機械的混合段階を設けることが効果的である。
【００３２】
図４に示すように、カラム１２からエンドキャップを取り外し、カラム１２にシリンジアダプタ１３を取り付けてアプリケータシリンジ５０を形成する。シリンジアダプタ１３は、カラム１２を押し込み、そこから基質材料を放出するように構成されたプランジャを備える。このようにして、始原細胞の濃度を高めた基質材料１１をカラム１２から放出し、所定量の凝固材１８とともに混合ボウル４０に移す。凝固材１８は、好適には、上述のように凝固することが可能な、移植者から採取した抗凝固処理されていない骨髄吸引液である。随意で、抗凝固処理されていない骨髄吸引液を高濃度基質と合わせてから凝固させ、混合段階中および後に凝固が起こるようにすることもできる。凝固材の容量：始原細胞の濃度を高めた基質材料容量の比率は約１：１であることが好ましく、それが無理な場合は、約または最低１：５、１：４、１：３、１：２、２：１、３：１、４：１または５：１でもよい。混合ボウル４０内に入れた高濃度基質材料１１と凝固材１８とを機械的に混ぜ合わせ、不均質の移植可能な複合型骨移植片のほぼ一様な組成の混合物８を用意する（図５参照）。ほぼ一様な組成とは、複合型骨移植片混合物８が、繊維状および微粒子状の複合基質からなる骨材料と、個体数が増加した始原細胞と、凝固材とを含み、それらのすべてが混合物全体にほぼ均一に分布しており、よっていずれの構成要素についてもかさ濃度勾配をほとんど示さないことを意味する。このような機械的混合は、例えば、混合ボウル４０内でへら具３８により行うか、或いはその他任意の既知の機械的混合手段により行う。
【００３３】
図５に示すように、漏斗４１を（まだ複合型骨髄移植片材料８を含む）混合ボウル４０に取り付け、アプリケータシリンジ５０を漏斗４１に取り付ける。図５の器具全体を、図６のようにほぼ上下を逆転させ、混合ボウル４０の底蓋４２を取り外す。随意で、ボウルの内容物を、アプリケータシリンジ５０に取り付けた漏斗４１に注ぐか、またはすくい集めてもよい。次いで、移植可能な複合型骨髄移植片材料８をアプリケータシリンジ５０に詰める。該材料を詰めるのを補助するのにへら具３８を使用することができる。随意で、図に示すように、アプリケータシリンジ内に材料を詰めるためのプランジャーの一方の端部にへら具３８を装備してもよい。詰め込み後、アプリケータシリンジ５０を漏斗４１から取り外し、移植可能な複合型骨髄移植片材料８を患者に適用するために使用することができる。移植片材料８は、移植位置に骨治癒または骨再生を引き起こすのに効果がある。随意で、従来技術による他の機械的手段により、複合型骨髄材料を混合ボウルから患者に直接移してもよい。
【実施例２】
【００３４】
本発明による複合型骨髄移植片材料は、第２の好適な実施例にしたがって次のようにして調製することもできる。複合型基質１０および骨髄吸引液２０（好適には抗凝固薬を含む）を別個に用意して上述のように調製し、上述の実施例１で開示したものと同様の割合で混合ボウル４０内に別個に配置する。次いでへら具３８またはその他周知の機械的混合手段を使用して基質と吸引液を機械的に混合し、高濃度の基質を得る。その後高濃度基質１１から液状吸引液２０を以下のようにして排出する。図７に示すように、漏斗４１を混合ボウル４０に取り付け、カラム１２を漏斗４１に取り付けて、カラム１２の反対側の端部に単一のエンドキャップ１４を接続する。またエンドキャップ１４には、吸引液を通過させる一方、高濃度基質１１を保持する開口を複数有する膜またはスクリーン（図示せず）を取り付ける。開口の径は、２０μｍ以上、好適には３０μｍ以上、さらに好適には４０μｍ以上であることが好ましい。排水シリンジ４５を既知の接続手段を介してエンドキャップ１４に取り付け、それにより排水シリンジ４５の対応する内部容積とカラム１２の間を液体が流れるようにする。このような器具の全体図は、図７に示すように逆様になっており、底蓋４２は必要であれば取り外すことができる。混合ボウル４０内の液体を、カラム１２を通して排水シリンジ４５内に引き込む、または排出する。液体をカラム１２に押し戻しても良い。上述したように、この両方向への操作を数回繰り返すことができる。その後使用済みの液体を廃棄する。
【００３５】
或いは、液状吸引液２０は、容器の一方の壁部（例えば混合ボウル４０の底）と多孔性スクリーンまたは膜（図示せず）との間で高濃度基質を圧縮することにより、高濃度基質から排出させてもよい。当該スクリーンまたは膜は、吸引液は通過させるが容器の壁部に対して圧縮された高濃度基質を保持するように構成された開口を複数有する。次いで、膜を透過した液状吸引液を注ぎ出し、容器の壁部と多孔性膜の間で圧縮された高濃度基質を容器に残す。好適には、容器は、その出口の上流に多孔性膜を取り付けたシリンジであり、容器の壁部はシリンジプランジャである。この好適な実施例では、基質をシリンジ内で多孔性膜の方向へ押し出すことによって、吸引液を出口から放出し、一方で高濃度基質をシリンジ内に残すことにより、高濃度基質の圧縮を行う。
【００３６】
こうして濃度が高まった基質１１は、図４に示すように、次に所定量の凝固材１８と合わせ、その後好適な実施例１で説明したものと同様の方法により処理し、移植者の骨治癒および骨再生を引き起こすのに有効な移植可能複合型骨髄移植片材料８をつくる。
【００３７】
随意で、上述の両実施例のそれぞれにもう１つの段階を加えることができる。移植可能骨移植片材料８を移植する前に、一定量の抗凝固処理されていない骨髄吸引液を、凝固する前（例えば移植片材料８がアプリケータシリンジ５０内にある間）の移植片材料８に（放出するなどして）加える。このようにすることで液状吸引液は移植片材料８の空隙容積に浸透し、最終的にそこで凝固する。吸引液は、移植片材料に有効に浸透するのに十分な時間に亘って液状に保持されることを確実にするために、吸引後直ちに当該材料８に注入されなければならない。この段階は、移植可能移植片材料８に、追加的な骨髄由来有核細胞（追加的始原細胞を含む）を与える。
【００３８】
本発明の複合型骨髄移植片材料調製法を完了するのに必要な時間は、典型的に６０分未満である。よって、本方法は骨髄ドナー／移植者が手術室にいる間に行うことができる。したがって、本発明の方法を使用することにより、複合型骨移植片を受けるために移植者が受けなければならない外科処置の回数を減らすことができる。
【実施例３】
【００３９】
本発明により、外科医が本発明の方法を行う際の補助となるキットもまた提供される。図８に示すように、そのようなキットは、好適には上述の好適な実施例のいずれかによる方法を実行することができ、滅菌された、好適にはプラスチックからなる透明または半透明の、少なくとも以下に挙げる器具を備える。該器具とは、１つの基質容器（例えば基質カラム１２）、既知の取り付け手段によって基質容器に開放可能に取り付けることができる少なくとも１つのエンドキャップ１４、エンドキャップ１４に取り付ける、充填用シリンジと液体を連通させるためのエンドキャップコネクタ３１、エンドキャップ１４と液体を連通させるためのシリンジコネクタ３０を有する少なくとも１つの充填用シリンジ２８、取り外し可能な底蓋４２を有する混合ボウル４０、一方の端部が混合ボウル４０の開口端と一致し、他方の端部がカラム１２と一致するように取り付けられる漏斗４１、カラム１２をアプリケータシリンジに変換するシリンジアダプタ１３、およびへら具３８である。最適には、キットは、上述したものと同様に構成される第２充填用シリンジ２９と第２エンドキャップ１４をさらに備える。随意で、キットには、骨移植片基質として使用するための多孔性生物学的適合性移植基板と、基質容器内に基質を保持するための多孔性膜１５を加えてもよい。随意で、本発明のキットは、ヘパリン骨髄吸引液シリンジ、吸引針、追加の充填用シリンジ、または骨移植術に有益な他の器具をさらに備えてもよい。
【００４０】
以下の治験例により本発明の様々な特徴をさらに説明する。
【００４１】
治験例１
高濃度基質を有する骨移植片材料が、濃度を高めていない移植片（特許文献１および２参照）よりも高い性能を示すということは既に示した。以下の実験は、高濃度基質と吸引した骨髄クロット（ＡＢＭＣ）を混合した骨材料のさらなる効果を実証した。
【００４２】
後部脊椎固定術を２２匹のビーグル犬に施した。各個体について、３つの異なる脊椎固定位置において部分固定を行った（Ｌ１−２、Ｌ３−４，およびＬ５−６）。基質材料に海綿骨片を用いて３種類の複合型骨移植片を調製した。犬１１匹に脱塩海綿骨片を使用し、残りの１１匹に鉱化海綿骨片を使用した。３種類の複合型移植片は、高濃度基質のみ、骨髄クロットを含む濃度を高めていない基質、および骨髄クロットを含む高濃度基質であった。濃縮は、上述のように、基質材料にそれよりも多い量の吸引液を合わせることにより行った。
【００４３】
結果を示す主要なパラメータとして癒合点を使用し、固定を比較した。また、ＣＴスキャンの定量分析を使用して各位置の骨容積を評価し、各位置において機械的実験を行った。表１および表２に、それぞれ鉱化基質および脱塩基質について、各個体の移植位置における各複合型移植片の癒合点をまとめた。
【表１】
【表２】
【００４４】
上記のデータは、骨髄クロット材料を骨移植基質に加えることにより、複合型移植片の効力が大きく促進されることを示す。鉱化海綿骨材料を使用したとき、高濃度基質＋ＡＢＭＣのグループで癒合点が最も高かった（ミーン値＝１．９）。さらに、高濃度基質＋ＡＢＭＣのグループの癒合点は、高濃度基質のみのグループの値（ミーン値＝０．６、ｐ＝０．００８）より有意に高かった。高濃度基質＋ＡＢＭＣのグループはまた、ＡＢＭＣのみのグループ（ミーン値１．２、ｐ＝０．０４）よりも統計的に優れていた。この優れた効能の度合いは予期せぬものであり、驚くほど大きかった。３種類の複合型移植材料、すなわち、高濃度基質＋ＡＢＭＣ、ＡＢＭＣのみ、高濃度基質のみの全体癒合率はそれぞれ、１１例のうち９（８１％）、１１例のうち７（６３％）および１１例のうち４（３６％）であった。高い癒合率を有する固定位置は、高濃度基質＋ＡＢＭＣグループに集まっていた。高濃度基質＋ＡＢＭＣグループでは、固定位置１１のうち４（３６％）が３．０以上の評価を受けた。対照的に、高濃度基質のみのグループでは１１のうちわずかに１（８．３％）、ＡＢＭＣのみのグループでは１１例のうち２（１８％）の固定位置が同様の評価を受けただけであった。
【００４５】
脱塩海綿骨基質を使用したときも、癒合点は高濃度基質＋ＡＢＭＣグループで最も高かった。３種類の複合型移植材料、すなわち、高濃度基質＋ＡＢＭＣ、ＡＢＭＣのみ、高濃度基質のみの全体癒合率はそれぞれ、１１例のうち７（６３％）、１１例のうち６（５４％）および１１例のうち５（４５％）であった。ここでも、高い癒合点を有する固定位置は高濃度基質＋ＡＢＭＣグループに集中していた。高濃度基質＋ＡＢＭＣグループでは、１１のうち５つの固定位置（４５％）が３．０以上の評価を受けた。対照的に、高濃度基質のみのグループでは１１のうちわずかに２（１８％）、ＡＢＭＣのみのグループでは１１例のうち３（２７％）の固定位置が同様の評価を受けただけであった。ＡＢＭＣと高濃度骨基質を組み合わせることにより、高濃度骨基質のみの場合と比較して、驚異的で意外な程優れた効能を示す骨移植片が得られた。
【００４６】
全ての標本に対して機械的実験も行った。骨癒合が明確な降伏点を示した標本についてのみ、最大荷重、欠損に至る変形、および欠損に至るエネルギーのデータを計算した。脱塩および鉱化試料それぞれについての機械的実験データを以下の表３および４にまとめる。
【００４７】
各移植片の剛性を測定し、脱塩および鉱化骨基質両方について、３種類の移植片それぞれのミーン値および標準偏差値を示すデータを表にした。鉱化骨基質では、高濃度基質のみ、ＡＢＭＣのみ、および高濃度基質＋ＡＢＭＣの移植片はそれぞれ、６．９±２．４、７．９±２．３、および８．２±４．２を示した。脱塩骨基質では、高濃度基質のみ、ＡＢＭＣのみ、および高濃度基質＋ＡＢＭＣの移植片はそれぞれ、９．１±６．０、９．４±６．２、および９．６±４．８を示した。
【００４８】
癒合容積、癒合面積および癒合塊中の平均骨密度に関し、各複合型移植片についてＣＴ画像分析データを取得した。鉱化および脱塩海綿骨基質それぞれについて、表３および表４に該データをまとめる。表３および４から明らかであるように、癒合容積と癒合面積の両方が、高濃度基質＋ＡＢＭＣグループで最も大きかった。
【表３】
【表４】
【００４９】
上記に説明した本発明の実施例は好適な実施形態を構成するものであるが、添付の請求の範囲に規定される本発明の範囲から逸脱することなく、変形が可能であることは自明である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】エンドキャップを取り付けた移植片基質を含む基質容器の斜視図である。
【図２】図２は充填用シリンジを取り付けた図１の基質容器の斜視図である。図２Ａは始原細胞および骨髄由来有核細胞を示す骨髄吸引液の拡大図である。
【図３】図３は始原細胞が不均一に分布した移植片基質を含む基質容器の斜視図である。図３Ａは骨髄吸引液が通過した後の移植片基質の中央領域の拡大図であり、図３Ｂは同移植片基質の端部領域の拡大図である。
【図４】凝固材および高濃度基質材料を含む混合ボウルの斜視図である。
【図５】混合ボウル、漏斗およびアプリケータシリンジを備えるアセンブリの斜視図である。
【図６】本発明の好適な実施例を行うために上下を反転させた図５のアセンブリの斜視図である。
【図７】本発明の第２の好適な実施例を行うための、混合ボウル、漏斗、基質用容器、および排水シリンジを備えるアセンブリの斜視図である。
【図８】本発明によるキットの斜視図である。
【背景技術】
【０００１】
骨移植は、骨折や不癒合の治療や、関節固定を促すために広く使用されている。移植者の体の一部から採取して移植者の別の部位に移植される自原性海綿骨は、現在最も有効な骨移植である。自原性海綿骨は骨治癒反応の広がりを支持する足場、および新規軟骨または骨を形成する始原細胞となる。しかしながら、自原性骨の採取にかかる費用は大きく、また、傷、失血、苦痛をもたらす、手術およびリハビリテーションに時間が掛かる、ならびに感染症の危険があるなど、健康に与える悪影響が大きい。さらに、移植部位の容量が可能な自己移植の容量を超える場合がある。
【０００２】
このため自己移植に代わる方法が開発されてきた。セラミック、生体高分子、合成同種異系移植骨、およびコラーゲン基質を含む複数の精製物質または合成物質が研究され、或いは自己移植の代用として利用されている。ＦＤＡは、局所的な骨の欠損への使用に多孔性のサンゴから得られる剛性ヒドロキシアパタイトセラミックを承認した。また、精製したコラーゲン／セラミック複合型材料が急性長骨骨折への使用に承認されている。これらの材料は、自己移植片の採取に伴う健康への悪影響を避け、また入手可能な自己移植片が限られていることに関する問題を排除するものであるが、一般に複合型材料の臨床的有効性は自己移植片に依然として劣る。また、合成移植材料も骨髄細胞の担体として使用されている。上述の複合型材料を骨格の欠損に移植すると、始原細胞が骨格組織に変化する。
【０００３】
複合型移植片は、細胞懸濁液中の合成移植片と、同量またはそれよりも少ない量の骨髄吸引液を混合することによりつくられる場合がある。しかしながら、軟骨に変化する能力を有する始原細胞、骨、筋肉、繊維組織、およびその他結合組織は骨髄中にわずかしか存在しない。骨髄１ｍｌ当たりの始原細胞の数は、約１００から２０，０００までと、患者によって大きく異なる。これは、骨髄吸引液中の有核細胞の平均値が約２０，０００に１つから４０，０００に１つであることを表している。よって、所定の容量の合成移植材をそれに匹敵する容量の新鮮な骨髄中に混合してなる複合型移植片に含まれる始原細胞の数は比較的微量である。
【０００４】
このため、これまでに複合型移植片中の始原細胞の相対濃度を増大させるための技術が開発されている。この技術は、骨髄細胞の懸濁液を組織培養皿に移植する段階と、細胞を選択培地中で１または数日培養し、始原細胞の個体数を増大させる段階と、次いで細胞を組織培養皿から剥離し、個体数が増加した始原細胞を含む細胞懸濁液を調製する段階を含む。次いで合成セラミック担体をこの始原細胞を多く含む懸濁液に含浸することにより複合型移植片を作成する。残念ながら、この複合型移植片調製法には時間が掛かり過ぎる。さらに、移植者から採取した骨髄吸引液から元となる始原細胞を採取する場合、移植者は複数回の外科処置を受けなければならい。すなわち、一度骨髄採取処置を行い、後日また複合型移植片を移植する処置を行わねばならない。その結果移植者に少なくとも２回の麻酔を行うことになる。
【０００５】
複合型骨移植片基質を製造するために開発された別の技術では、培養方法に利点を持ちながら、時間も掛からず複数の外科処理も必要としない。この技術では、所定の容量の基質材料とそれよりも多い骨髄吸引液を接触させることにより始原細胞を多く含む複合型基質を製造する（特許文献１および２参照）。本技術においては、選択的に始原細胞と結合する表面を有する多孔性基質材に始原細胞を含む骨髄吸引液を通過させることにより、基質内に始原細胞を保持し、それ以外の他の細胞（血液細胞および骨髄から得られるその他有核細胞など）を通過させる。こうして始原細胞を多く含む移植片基質を患者に移植する。
【０００６】
しかしながら、始原細胞は非常に強固に、且つ選択的に一部基質の表面（例えば同種異系移植片）に結合するので、基質全体に均一に分布せず、骨髄吸引液と基質材料の最初の接触位置の近傍に集中する始原細胞の高濃度ポケットを複数形成する。その結果、移植された基質内における始原細胞の分布が不均一であることにより、この技術により調製された骨移植片には、移植後の骨治癒が均一に起こらないという欠点がある。加えて、基質移植後の骨治癒の進行が比較的遅い。
【特許文献１】米国特許第５８２４０８４号明細書
【特許文献２】米国特許第６０４９０２６号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、手術中に行うことが可能な、始原細胞を多く含む複合型骨髄移植材の新規調製方法が所望される。つまり、移植者からの骨髄採取と同時に行うことができ、移植材全体に一様に分布する始原細胞が得られ、且つ移植により治癒を促進する方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
多孔性で生物学的適合性の基質と凝固材とを含む複合型骨髄移植材を提供する。本複合型骨髄移植材料は始原細胞を多く含む。また、複合型骨髄移植材料の調製法を提供する。本方法は、骨髄吸引液を用意する段階、多孔性生物学的適合性移植可能基質を用意する段階、骨髄吸引液と基質を接触させて高濃度の基質を用意する段階、および高濃度の基質を機械的に混合し、始原細胞が実質的に一様に分布した複合型骨髄移植材料を生成する段階を含む。
【０００９】
さらに、複合型骨髄移植材料を調製するためのキットを提供する。本キットは、基質容器、第１エンドキャップ、および第１充填用シリンジを含む。第１充填用シリンジを第１エンドキャップに取り付けることにより、第１充填用シリンジと基質容器との間で液体が流れることが可能となる。第１エンドキャップは基質容器に開放可能に取り付けられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書において、５−２５、または５から２５と言った場合、好適には、上と下の限界値としてそれぞれ独立的に、５以上、且つ、２５未満を意味する。本明細書で使用する「始原細胞」という表現は、結合組織始原細胞および／または幹細胞など、いかなる始原細胞も含む。この細胞群は多能性で、様々な組織（例えば、骨、軟骨、脂肪、腱、じん帯、筋肉、神経組織、造血組織、内皮および血管組織、ならびに肝臓）に変化可能な細胞を含む。
【００１１】
本発明による多数の始原細胞を有する複合型骨髄移植材料調製方法は、一般に次に挙げる段階を含む。すなわち、骨髄吸引液を採取する第１段階、（例えば基質内に吸引液を通すことにより）骨髄吸引液を多孔性且つ生物学的適合性で移植が可能な基質に接触させ、始原細胞の個体数を増大させた高濃度基質を得る第２段階、高濃度基質を混合し、始原細胞を全体にほぼ均一に分布させる第３段階、および余分な液体中の基質を排出する第４段階を含む。好適には、当該方法は、高濃度基質に凝固材を追加する段階も含む。このようにして調製された複合型骨髄移植材料は次いで患者または移植者に移植され、骨治癒および／または骨再生を有効に促す。
【００１２】
上述の方法の段階に含まれる複数の機能要素について以下に説明する。このような機能要素には、骨髄吸引液、多孔性生物学的適合性移植可能基質、および好適には凝固材が含まれる。これら機能要素について説明した後、本発明の複合型骨移植片を調製するための好適な方法および装置について説明する。後述の説明は例示のみを目的とし、限定的なものではないことに注意されたい。
【００１３】
骨髄吸引液
骨髄吸引液には、血漿、有核始原細胞（始原細胞）、有核造血細胞、内皮細胞、および赤血球と血小板とを含む抹消血から得られた細胞が含まれている。骨髄吸引液が抹消血を含むため、吸引液は抗凝固薬を含むシリンジに集めることが好ましい。適当な抗凝固薬として、ヘパリン、クエン酸ナトリウム、およびＥＤＴＡを挙げることができる。好適には、本発明の方法に使用する骨髄吸引液は、移植を受ける患者（移植者）から採取する。それ程好適ではないが、骨髄吸引液を免疫学的に適合する別のドナーから採取してもよい。
【００１４】
多孔性生物学的適合性移植可能基質
当該基質は、多孔性で、生物学的に適合性の、移植可能な基質からなる。好適には、基質は生物活性表面を有する。生物活性表面を有する多孔性生物学的適合性の移植可能な移植片基質材料の例としては、ヒドロキシアパタイトまたはリン酸三カルシウムなどのリン酸カルシウムを含むセラミック、ならびに脱塩または鉱化骨基質が挙げられる。その他の適切な基質材料は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリガラクチン酸、ポリカプロラクトン、酸化ポリエチレン、酸化ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリエチレンおよびポリプロピレンなどの生体高分子を含む。また、それ以外の適切な基質材料はヒアルロン酸で、架橋、生体ガラス、およびコラーゲンにより精製してもしなくてもよい。
【００１５】
さらに好適には、細胞接着分子を基質基板の表面に結合させる。「細胞接着分子」という表現には、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、血管細胞接着分子（Ｖ−ＣＡＭ）、細胞間接着分子（Ｉ−ＣＡＭ）、テネイシン、トロンボスポンジン、オステオネクチン、オステオポンチン、骨シャロ蛋白、コラーゲン、または基板表面に対する始原細胞の選択的接着促進効果を有する他のあらゆる分子または成分を含む。
【００１６】
基質は、同一の外形寸法を有する非多孔性の固体と比較して、始原細胞の接着に使用可能な基質表面積が少なくとも２倍、好適には３倍、５倍、７倍、さらには１０倍となるに十分な多孔性を有することが好ましい。粉末、果粒、繊維、それらの組み合わせ、または単一の超多孔性基板塊を使用することにより、そのような総表面積の増大を図ることができる。始原細胞が孔開口部を通って基質材料の空隙容量内へ浸透し、それにより孔内の表面積が利用されるのを促すために、基質中の孔の大きさは好適には２０μｍより大きく、さらに好適には５０μｍ、１００μｍ、さらには５００μｍより大きく、最も好適には１０００μｍより大きい。
【００１７】
特に適当な基質材料には、分離した鉱化海綿骨切片、鉱化骨の粉末または果粒、脱塩海綿骨切片、脱塩骨の粉末または果粒、グアニジンＨＣｌ抽出脱塩骨基質、皮質骨または海綿骨、Ｉｎｔｅｒｐｏｒｅ５００（登録商標）またはＩｎｔｅｒｐｏｒｅ２００（登録商標）という名称でＩｎｔｅｒｐｏｒｅ社より市販されているサンゴ質ヒドロキシアパタイト、Ｚｉｍｍｅｒ社により市販されている骨移植片の代用品Ｃｏｌｌａｇｒａｆｔ（商標）に含まれるような果粒状セラミック、Ｏｒｔｈｏｖｉｔａ社により市販されている移植片の代用品Ｖｉｔｏｓｓ（商標）に含まれるような顆粒状またはブロック状セラミック、およびＯｒｑｕｅｓｔ社によりコラーゲンからつくられているような糸状海綿が含まれる。
【００１８】
好適な基質は、骨基質の微粒子と繊維状の骨材料との組み合わせとして用意される。微粒子状の骨基質は、ヒトの海綿質骨から、好適には海綿骨から（例えばヒト長骨の末端から）採取するのが好ましい。繊維状骨材料は、皮質骨から採取することが好ましい。微粒子状骨材料および繊維状骨材料のどちらも骨バンクから得ることができ、或いは随意で移植者から採取してもよい。移植者から採取した場合、骨材料は、所望の微粒子および繊維特性に適合するように、手術中手術室において周知の骨処理手段により処理される。
【００１９】
用意する微粒子状の骨材料は、最適には、塊、小片または切片の形態の同種異系移植片海綿骨の粒子であり、その大きさは平均粒径にして１−１５ｍｍ、好適には２−８ｍｍの範囲である。用意する繊維状の骨材料は、最適には、同種異系移植片脱塩皮質骨繊維であり、その長さは５ｍｍ以上、さらに好適には１ｃｍ以上、２ｃｍ以上、３ｃｍ以上、さらには４ｃｍ以上で、最適には５ｃｍ以上である。繊維状の骨材料は、随意で、５ｍｍ−２ｃｍ、５ｍｍ−３ｃｍ、５ｍｍ−４ｃｍ、５ｍｍ−５ｃｍ、５ｍｍ−１５ｃｍ、またはその他の範囲の、様々な長さの繊維を混合して用意してもよい。或いは、繊維状骨材料に、Ｏｓｔｅｏｔｅｃｈ社により市販されているＧｒａｆｔｏｎ Ｆｌｅｘ（登録商標）などの柔軟なマットを使用してもよい。
【００２０】
微粒子状および繊維状骨材料を混合し、次のようにして好適な複合型基質を形成する。骨繊維、好適には上述の長さを有する脱塩皮質骨繊維を、次のような好適な配合で微粒子状骨粒子と混合する。すなわち、乾燥時重量が約２２５ｍｇ、それより徐々に望ましさは低下するが、２００−３００ｍｇ、１５０−３７５ｍｇ、１００−４５０ｍｇ、７５−５００ｍｇ、或いは２５−１０００ｍｇの脱塩皮質骨繊維と、約１０ｃｃ（かさ容量）、それより徐々に望ましさは低下するが、８−１２ｃｃ、６−１４ｃｃ、４−１６ｃｃ、２−１８ｃｃ、或いは１−２５ｃｃの、平均粒径１−１５ｍｍ、好適には２−８ｍｍの微粒子状骨粒子とを混合する。随意で、脱塩皮質骨繊維は同じような繊維を含む柔軟なマットから取得してもよい。そのようなマットを使用する場合、存在する可能性のある毒性または高浸透圧物質をすべて排除するために、等張液でまず洗浄する。次いでマットを食塩水または他の適当な等張液に浸し、個々の骨繊維の分離を促す。分離した骨繊維を微粒子状骨材料と次のような配合で混合し、好適な複合型基質を形成する。すなわち、当初の大きさが２．５ｃｍ×５ｃｍ×約２．５ｍｍ（当初の容積約３．１ｃｍ３）である１つのマットと、平均粒径１−１５ｍｍ、好適には２−８ｍｍの微粒子状骨粒子約１０ｃｃ（かさ容量）、それより徐々に望ましさは低下するが、８−１２ｃｃ、６−１４ｃｃ、或いは４−１６ｃｃを合わせる。
【００２１】
様々な大きさの移植片が必要な場合、本発明による繊維状骨対微粒子状骨の配合比（上述）に準拠する様々な大きさの複合型基質を用意することができることに注目されたい。例えば、微粒子状骨２０ｃｃ（推定均一かさ密度）を骨繊維４５０ｍｇと混合し、好適な複合型基質をつくることができる。
【００２２】
凝固材
凝固材は、移植者（または免疫学的に適合するドナー）の静脈または動脈から採取した血液から形成される血餅でよい。さらに好適には、凝固材は、最適には移植者から採取した抗凝固処理されていない骨髄吸引液から形成される骨髄クロットである。骨髄クロットが形成される骨髄吸引液は、手術中移植片処理段階において移植者から採取することが好ましい。それができない場合、凝固材は、従来技術に周知のフィブリングルー、フィブリン凝固材、血小板ゲル、および／または血小板濃縮物でもよい。
【００２３】
（抗凝固処理されていない骨髄吸引液から得た）骨髄クロットを始原細胞の濃度を高めた移植片基質に加えることにより得られる複合型骨髄移植片材料の有効性は、凝固材を加えない複合型移植片と比較して驚くほど大きく向上する。骨髄クロットのみに対し、（２倍以上の始原細胞を含み）５０−７０％多い有核細胞を産む同様の高濃度基質に骨髄クロットを加えた場合に得られる移植片は、高濃度基質のみの場合、および非高濃度基質と骨髄クロットを混合した場合のいずれよりも品質が優れていた。したがって、骨髄クロットを始原細胞の濃度を高めた基質に加えることにより、移植片の性能を向上させることができる。
【００２４】
特定の理論のいずれにも縛られることなく、以下の理由のうちの１つまたは複数により、骨髄クロットの添加は複合型骨移植片の有効性を向上させると考えられる。第１に、骨治療が成功するまでの過程に重要な細胞のいくつかが移植片基質に付着せず、したがって移植位置に十分に集中しない（または排除されることさえある）可能性があり、その結果当該位置においては効果を示さないか、または効果が不十分である。凝固カスケード（後述）の結果としてフィブリンにフィブリノーゲンを重合させると、移植位置における治癒反応に重要な細胞の付着および移動を促す貴重な追加的基質を得ることができる。そのような細胞には、増殖して血管形成により血管を形成する重要な前駆物質である環状構造を形成する移動性内皮細胞が含まれる。
【００２５】
第２の可能性は、移植位置での血餅形成の生理学的過程により、該位置に移植された骨形成原細胞の環境が向上することである。特に、抗凝固処理されていない骨髄吸引液が凝固すると、それに含まれる血小板が活性化し、血小板の脱果粒が起こる。次いで血小板の脱果粒により、そうでない場合には移植位置に存在しなくなる場合のある成長因子と骨回帰サイトカインを放出する。この段階において放出されるいくつかの重要な生物活性因子には、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、および形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ｂｅｔａ）が含まれる。また、凝固カスケードの結果であるフィブリノーゲンから形成されるフィブリン基質により、手術直後の期間中移植位置において重要な安定性を得ることができる。さらに、移植片の移植後数日間に亘って起こる線維素溶解活動の過程により、移植片が取り込まれる初期段階において、血管由来因子の追加的供給源（例えば、周知のフィブリン分割生成物）が与えられる。移植後移植位置において得られる血管形成により、該位置での新規血管の形成が促され、それが新しく移植された始原細胞およびその他細胞の栄養源となって骨治癒および成長が起こり、よって治癒反応を促進すると考えられる。
【実施例１】
【００２６】
本発明による複合型骨移植片作成方法の好適な実施例を説明する。本明細書に開示する装置部分は、好適には透明または半透明のプラスチックから作られることが好ましい。本発明の第１の好適な実施例では、図１に示すように、上述のように用意した複合型生物学的適合性移植可能基質１０を基質容器内に配置する。該容器は最適にはカラム１２である。（基質１０は、その材料および構造によって、隙間無く充填しても、ゆるく充填してもよい。）カラム１２は、特定の移植片のために必要な基質の量を収容するのに適した大きな内部容量を有するようにつくることができる。本明細書で使用する基質容量とは、特定の基質と同一の外形寸法を有する非多孔性固体の排除体積を指す。例えば、内部容量が５、１０、１５、２０、２５、３０ｃｃ、またはその他であるカラムを、様々な基質容量を収容するために使用することができる。好適には、カラム１２の内径は０．５−３．０ｃｍ、さらに好適には１−２ｃｍ、さらには１−１．５ｃｍである。カラム１２の好適な長さは、内径の１．５倍以上、さらに好適には２倍以上、最適には３倍以上である。ねじ込み接続、スナップ接続、またはその他任意の接続手段により、エンドキャップ１４が着脱可能にカラム１２に取り付けられる。
【００２７】
随意で、吸引液２０を通す一方で基質１０の粒子を保持する効果のあるスクリーンまたは膜１５をエンドキャップ１４に設けることができる（図８参照）。好適には、そのような膜は、直径が少なくとも２０μｍ、好適には３０μｍ、さらに好適には４０μｍの開口を複数有する。
【００２８】
（好適には抗凝固薬を含む）骨髄吸引液２０は、好ましくは移植者から、周知の手段により採取する。次いで吸引液２０を第１充填用シリンジ２８に充填する。最初、吸引液２０は始原細胞３２とそれ以外の有核細胞３３を、１：２０，０００から１：４０，０００の比率で含んでいる（図２Ａ参照）。吸引液はまた、血小板、赤血球、および血清（血清に溶解または懸濁可能な分子を含む）を含んでいる。充填用シリンジ２８には、エンドキャップコネクタ３１と一致するように構成されたシリンジコネクタ３０を取り付け、充填用シリンジ２８の対応する内部容積とカラム１２との間を液体が流れることができるようにする。第２充填用シリンジ２９にも、同様にエンドキャップコネクタ３１と一致するように構成されたシリンジコネクタ３０を取り付ける。図２に示すように、第１および第２充填用シリンジ２８、２９をカラム１２の両側で先述のコネクタを介してエンドキャップ１４に取り付け、よって第１充填用シリンジ２８、カラム１２、および第２充填用シリンジ２９の間で液体が流れることが可能になる。
【００２９】
次いで第１充填用シリンジ２８を押し込むと、吸引液２０はカラム１２内に流入して該カラム内の基質１０を通過するか、または基質１０と接触し、その後カラム１２の反対側で第２充填用シリンジ２９内に回収される。骨髄吸引液と基質とを接触させることで、基質内に吸引液を流すこと、基質を吸引液内で培養すること、または別の周知の手段により、濃度の高い基質を得ることができる。或いは、任意の周知の方法により吸引液２０に基質１０を接触させ、濃度の高い基質を得る。始原細胞は、有利にはおよび選択的に基質１０の表面に付着し、よって基質内に保持される。一方、他の余剰細胞（血球および骨髄由来の有核細胞）は基質内を比較的自由に流れ、第２充填用シリンジ２９に回収される。基質１０内の始原細胞の固体数を増やすために、基質１０内を流れる吸引液２０の容積は基質の容積を超えることが好ましい。このようにして、吸引液容積内に存在する始原細胞は好適に基質容積内で濃縮され、濃度の高い基質を得ることができる。ここで使用する「濃度の高い」という表現は、全有核骨髄細胞に対する始原細胞の比率が、元の骨髄吸引液内よりも基質内で高いことを意味する。好適には、濃度の高い基質内における、全骨髄由来有核細胞に対する始原細胞の比率は、１：２０，０００以上、好適には１：１０，０００以上、さらに好適には１：５，０００以上であり、これは始原細胞の浸透率または濃度が２倍以上、好適には４倍以上になっていることを示す。さらに好適には、濃度の高い基質における始原細胞の濃度は、骨髄クロットを含むが濃度を高めていない基質の５倍以上、好適には６倍以上、さらに好適には８倍以上である。吸引液容積：基質容積の比は、２：１以上であることが好ましく、さらに好適には３：１以上、さらには４：１以上である。例えば、基質容積１５ｃｃを有する基質を使用する場合、基質を通過させる吸引液の総容積は好適には３０ｃｃ以上、さらに好適には４５ｃｃ以上、さらには６０ｃｃ以上とする。随意で、カラム１２から第２充填用シリンジ２９に最初に流入した液を廃棄し、本方法を継続してもよい。
【００３０】
随意で、第１および第２充填用シリンジ２８、２９を交互に押し込むことにより、カラム１２内の基質１０に吸引液２０を両方向に流してもよい。特定の基質への細胞および前駆体の結合率に応じて、吸引液２０を基質１０に通して流すというこの手順を少なくとも１回、好適には２回以上、さらに好適には３回以上、さらには４回以上繰り返す。随意で、元の骨髄吸引液の懸濁液及び何らかの流出液が基質１０を通過した後に洗浄液を基質１０に通してもよい。洗浄液は、ｐＨ範囲が７．３から７．５である、無菌で等張性の緩衝液からなることが好ましい。適当な洗浄液は、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス平行塩類溶液、ヒト血清、および必要最小限の媒体を含む。
【００３１】
上述の手順の後、充填用シリンジ２８、２９をエンドキャップ１４から取り外す。図３に示すように、基質１０に保持された始原細胞３２は、基質１０内で不均一に分布している。特に、基質１０内には始原細胞の濃度勾配が存在し、始原細胞３２は、骨髄吸引液２０がカラム１２内に流入したとき最初に基質材料に接触した地点であるカラム１２の端部近傍の領域に集中している（図３Ｂ参照）。その結果、基質１０の中央の領域においては始原細胞３２の個体数がずっと少ない（図３Ａ参照）。これは、カラム１２に流入した際に始原細胞およびその他細胞が基質表面に急速に付着するためである。したがって、始原細胞がもっと均一に分布した濃度の高い基質を製造するのに、機械的混合段階を設けることが効果的である。
【００３２】
図４に示すように、カラム１２からエンドキャップを取り外し、カラム１２にシリンジアダプタ１３を取り付けてアプリケータシリンジ５０を形成する。シリンジアダプタ１３は、カラム１２を押し込み、そこから基質材料を放出するように構成されたプランジャを備える。このようにして、始原細胞の濃度を高めた基質材料１１をカラム１２から放出し、所定量の凝固材１８とともに混合ボウル４０に移す。凝固材１８は、好適には、上述のように凝固することが可能な、移植者から採取した抗凝固処理されていない骨髄吸引液である。随意で、抗凝固処理されていない骨髄吸引液を高濃度基質と合わせてから凝固させ、混合段階中および後に凝固が起こるようにすることもできる。凝固材の容量：始原細胞の濃度を高めた基質材料容量の比率は約１：１であることが好ましく、それが無理な場合は、約または最低１：５、１：４、１：３、１：２、２：１、３：１、４：１または５：１でもよい。混合ボウル４０内に入れた高濃度基質材料１１と凝固材１８とを機械的に混ぜ合わせ、不均質の移植可能な複合型骨移植片のほぼ一様な組成の混合物８を用意する（図５参照）。ほぼ一様な組成とは、複合型骨移植片混合物８が、繊維状および微粒子状の複合基質からなる骨材料と、個体数が増加した始原細胞と、凝固材とを含み、それらのすべてが混合物全体にほぼ均一に分布しており、よっていずれの構成要素についてもかさ濃度勾配をほとんど示さないことを意味する。このような機械的混合は、例えば、混合ボウル４０内でへら具３８により行うか、或いはその他任意の既知の機械的混合手段により行う。
【００３３】
図５に示すように、漏斗４１を（まだ複合型骨髄移植片材料８を含む）混合ボウル４０に取り付け、アプリケータシリンジ５０を漏斗４１に取り付ける。図５の器具全体を、図６のようにほぼ上下を逆転させ、混合ボウル４０の底蓋４２を取り外す。随意で、ボウルの内容物を、アプリケータシリンジ５０に取り付けた漏斗４１に注ぐか、またはすくい集めてもよい。次いで、移植可能な複合型骨髄移植片材料８をアプリケータシリンジ５０に詰める。該材料を詰めるのを補助するのにへら具３８を使用することができる。随意で、図に示すように、アプリケータシリンジ内に材料を詰めるためのプランジャーの一方の端部にへら具３８を装備してもよい。詰め込み後、アプリケータシリンジ５０を漏斗４１から取り外し、移植可能な複合型骨髄移植片材料８を患者に適用するために使用することができる。移植片材料８は、移植位置に骨治癒または骨再生を引き起こすのに効果がある。随意で、従来技術による他の機械的手段により、複合型骨髄材料を混合ボウルから患者に直接移してもよい。
【実施例２】
【００３４】
本発明による複合型骨髄移植片材料は、第２の好適な実施例にしたがって次のようにして調製することもできる。複合型基質１０および骨髄吸引液２０（好適には抗凝固薬を含む）を別個に用意して上述のように調製し、上述の実施例１で開示したものと同様の割合で混合ボウル４０内に別個に配置する。次いでへら具３８またはその他周知の機械的混合手段を使用して基質と吸引液を機械的に混合し、高濃度の基質を得る。その後高濃度基質１１から液状吸引液２０を以下のようにして排出する。図７に示すように、漏斗４１を混合ボウル４０に取り付け、カラム１２を漏斗４１に取り付けて、カラム１２の反対側の端部に単一のエンドキャップ１４を接続する。またエンドキャップ１４には、吸引液を通過させる一方、高濃度基質１１を保持する開口を複数有する膜またはスクリーン（図示せず）を取り付ける。開口の径は、２０μｍ以上、好適には３０μｍ以上、さらに好適には４０μｍ以上であることが好ましい。排水シリンジ４５を既知の接続手段を介してエンドキャップ１４に取り付け、それにより排水シリンジ４５の対応する内部容積とカラム１２の間を液体が流れるようにする。このような器具の全体図は、図７に示すように逆様になっており、底蓋４２は必要であれば取り外すことができる。混合ボウル４０内の液体を、カラム１２を通して排水シリンジ４５内に引き込む、または排出する。液体をカラム１２に押し戻しても良い。上述したように、この両方向への操作を数回繰り返すことができる。その後使用済みの液体を廃棄する。
【００３５】
或いは、液状吸引液２０は、容器の一方の壁部（例えば混合ボウル４０の底）と多孔性スクリーンまたは膜（図示せず）との間で高濃度基質を圧縮することにより、高濃度基質から排出させてもよい。当該スクリーンまたは膜は、吸引液は通過させるが容器の壁部に対して圧縮された高濃度基質を保持するように構成された開口を複数有する。次いで、膜を透過した液状吸引液を注ぎ出し、容器の壁部と多孔性膜の間で圧縮された高濃度基質を容器に残す。好適には、容器は、その出口の上流に多孔性膜を取り付けたシリンジであり、容器の壁部はシリンジプランジャである。この好適な実施例では、基質をシリンジ内で多孔性膜の方向へ押し出すことによって、吸引液を出口から放出し、一方で高濃度基質をシリンジ内に残すことにより、高濃度基質の圧縮を行う。
【００３６】
こうして濃度が高まった基質１１は、図４に示すように、次に所定量の凝固材１８と合わせ、その後好適な実施例１で説明したものと同様の方法により処理し、移植者の骨治癒および骨再生を引き起こすのに有効な移植可能複合型骨髄移植片材料８をつくる。
【００３７】
随意で、上述の両実施例のそれぞれにもう１つの段階を加えることができる。移植可能骨移植片材料８を移植する前に、一定量の抗凝固処理されていない骨髄吸引液を、凝固する前（例えば移植片材料８がアプリケータシリンジ５０内にある間）の移植片材料８に（放出するなどして）加える。このようにすることで液状吸引液は移植片材料８の空隙容積に浸透し、最終的にそこで凝固する。吸引液は、移植片材料に有効に浸透するのに十分な時間に亘って液状に保持されることを確実にするために、吸引後直ちに当該材料８に注入されなければならない。この段階は、移植可能移植片材料８に、追加的な骨髄由来有核細胞（追加的始原細胞を含む）を与える。
【００３８】
本発明の複合型骨髄移植片材料調製法を完了するのに必要な時間は、典型的に６０分未満である。よって、本方法は骨髄ドナー／移植者が手術室にいる間に行うことができる。したがって、本発明の方法を使用することにより、複合型骨移植片を受けるために移植者が受けなければならない外科処置の回数を減らすことができる。
【実施例３】
【００３９】
本発明により、外科医が本発明の方法を行う際の補助となるキットもまた提供される。図８に示すように、そのようなキットは、好適には上述の好適な実施例のいずれかによる方法を実行することができ、滅菌された、好適にはプラスチックからなる透明または半透明の、少なくとも以下に挙げる器具を備える。該器具とは、１つの基質容器（例えば基質カラム１２）、既知の取り付け手段によって基質容器に開放可能に取り付けることができる少なくとも１つのエンドキャップ１４、エンドキャップ１４に取り付ける、充填用シリンジと液体を連通させるためのエンドキャップコネクタ３１、エンドキャップ１４と液体を連通させるためのシリンジコネクタ３０を有する少なくとも１つの充填用シリンジ２８、取り外し可能な底蓋４２を有する混合ボウル４０、一方の端部が混合ボウル４０の開口端と一致し、他方の端部がカラム１２と一致するように取り付けられる漏斗４１、カラム１２をアプリケータシリンジに変換するシリンジアダプタ１３、およびへら具３８である。最適には、キットは、上述したものと同様に構成される第２充填用シリンジ２９と第２エンドキャップ１４をさらに備える。随意で、キットには、骨移植片基質として使用するための多孔性生物学的適合性移植基板と、基質容器内に基質を保持するための多孔性膜１５を加えてもよい。随意で、本発明のキットは、ヘパリン骨髄吸引液シリンジ、吸引針、追加の充填用シリンジ、または骨移植術に有益な他の器具をさらに備えてもよい。
【００４０】
以下の治験例により本発明の様々な特徴をさらに説明する。
【００４１】
治験例１
高濃度基質を有する骨移植片材料が、濃度を高めていない移植片（特許文献１および２参照）よりも高い性能を示すということは既に示した。以下の実験は、高濃度基質と吸引した骨髄クロット（ＡＢＭＣ）を混合した骨材料のさらなる効果を実証した。
【００４２】
後部脊椎固定術を２２匹のビーグル犬に施した。各個体について、３つの異なる脊椎固定位置において部分固定を行った（Ｌ１−２、Ｌ３−４，およびＬ５−６）。基質材料に海綿骨片を用いて３種類の複合型骨移植片を調製した。犬１１匹に脱塩海綿骨片を使用し、残りの１１匹に鉱化海綿骨片を使用した。３種類の複合型移植片は、高濃度基質のみ、骨髄クロットを含む濃度を高めていない基質、および骨髄クロットを含む高濃度基質であった。濃縮は、上述のように、基質材料にそれよりも多い量の吸引液を合わせることにより行った。
【００４３】
結果を示す主要なパラメータとして癒合点を使用し、固定を比較した。また、ＣＴスキャンの定量分析を使用して各位置の骨容積を評価し、各位置において機械的実験を行った。表１および表２に、それぞれ鉱化基質および脱塩基質について、各個体の移植位置における各複合型移植片の癒合点をまとめた。
【表１】
【表２】
【００４４】
上記のデータは、骨髄クロット材料を骨移植基質に加えることにより、複合型移植片の効力が大きく促進されることを示す。鉱化海綿骨材料を使用したとき、高濃度基質＋ＡＢＭＣのグループで癒合点が最も高かった（ミーン値＝１．９）。さらに、高濃度基質＋ＡＢＭＣのグループの癒合点は、高濃度基質のみのグループの値（ミーン値＝０．６、ｐ＝０．００８）より有意に高かった。高濃度基質＋ＡＢＭＣのグループはまた、ＡＢＭＣのみのグループ（ミーン値１．２、ｐ＝０．０４）よりも統計的に優れていた。この優れた効能の度合いは予期せぬものであり、驚くほど大きかった。３種類の複合型移植材料、すなわち、高濃度基質＋ＡＢＭＣ、ＡＢＭＣのみ、高濃度基質のみの全体癒合率はそれぞれ、１１例のうち９（８１％）、１１例のうち７（６３％）および１１例のうち４（３６％）であった。高い癒合率を有する固定位置は、高濃度基質＋ＡＢＭＣグループに集まっていた。高濃度基質＋ＡＢＭＣグループでは、固定位置１１のうち４（３６％）が３．０以上の評価を受けた。対照的に、高濃度基質のみのグループでは１１のうちわずかに１（８．３％）、ＡＢＭＣのみのグループでは１１例のうち２（１８％）の固定位置が同様の評価を受けただけであった。
【００４５】
脱塩海綿骨基質を使用したときも、癒合点は高濃度基質＋ＡＢＭＣグループで最も高かった。３種類の複合型移植材料、すなわち、高濃度基質＋ＡＢＭＣ、ＡＢＭＣのみ、高濃度基質のみの全体癒合率はそれぞれ、１１例のうち７（６３％）、１１例のうち６（５４％）および１１例のうち５（４５％）であった。ここでも、高い癒合点を有する固定位置は高濃度基質＋ＡＢＭＣグループに集中していた。高濃度基質＋ＡＢＭＣグループでは、１１のうち５つの固定位置（４５％）が３．０以上の評価を受けた。対照的に、高濃度基質のみのグループでは１１のうちわずかに２（１８％）、ＡＢＭＣのみのグループでは１１例のうち３（２７％）の固定位置が同様の評価を受けただけであった。ＡＢＭＣと高濃度骨基質を組み合わせることにより、高濃度骨基質のみの場合と比較して、驚異的で意外な程優れた効能を示す骨移植片が得られた。
【００４６】
全ての標本に対して機械的実験も行った。骨癒合が明確な降伏点を示した標本についてのみ、最大荷重、欠損に至る変形、および欠損に至るエネルギーのデータを計算した。脱塩および鉱化試料それぞれについての機械的実験データを以下の表３および４にまとめる。
【００４７】
各移植片の剛性を測定し、脱塩および鉱化骨基質両方について、３種類の移植片それぞれのミーン値および標準偏差値を示すデータを表にした。鉱化骨基質では、高濃度基質のみ、ＡＢＭＣのみ、および高濃度基質＋ＡＢＭＣの移植片はそれぞれ、６．９±２．４、７．９±２．３、および８．２±４．２を示した。脱塩骨基質では、高濃度基質のみ、ＡＢＭＣのみ、および高濃度基質＋ＡＢＭＣの移植片はそれぞれ、９．１±６．０、９．４±６．２、および９．６±４．８を示した。
【００４８】
癒合容積、癒合面積および癒合塊中の平均骨密度に関し、各複合型移植片についてＣＴ画像分析データを取得した。鉱化および脱塩海綿骨基質それぞれについて、表３および表４に該データをまとめる。表３および４から明らかであるように、癒合容積と癒合面積の両方が、高濃度基質＋ＡＢＭＣグループで最も大きかった。
【表３】
【表４】
【００４９】
上記に説明した本発明の実施例は好適な実施形態を構成するものであるが、添付の請求の範囲に規定される本発明の範囲から逸脱することなく、変形が可能であることは自明である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】エンドキャップを取り付けた移植片基質を含む基質容器の斜視図である。
【図２】図２は充填用シリンジを取り付けた図１の基質容器の斜視図である。図２Ａは始原細胞および骨髄由来有核細胞を示す骨髄吸引液の拡大図である。
【図３】図３は始原細胞が不均一に分布した移植片基質を含む基質容器の斜視図である。図３Ａは骨髄吸引液が通過した後の移植片基質の中央領域の拡大図であり、図３Ｂは同移植片基質の端部領域の拡大図である。
【図４】凝固材および高濃度基質材料を含む混合ボウルの斜視図である。
【図５】混合ボウル、漏斗およびアプリケータシリンジを備えるアセンブリの斜視図である。
【図６】本発明の好適な実施例を行うために上下を反転させた図５のアセンブリの斜視図である。
【図７】本発明の第２の好適な実施例を行うための、混合ボウル、漏斗、基質用容器、および排水シリンジを備えるアセンブリの斜視図である。
【図８】本発明によるキットの斜視図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔性生物学的適合性移植可能基質と凝固材とを含む、始原細胞の個体数を増加させた複合型骨髄移植片材料であって、
始原細胞の個体数の増加は、所定量の吸引骨髄を比較的少量の前記移植可能基質を通過するように流動させ、それによって吸引骨髄の始原細胞を選択的に基質の表面に付着させたことによって行われ、
前記基質は同一の外形寸法を有する非多孔性の固体と比較して、始原細胞の接着に使用可能な基質表面積が少なくとも２倍となるに十分な多孔性を有する、複合型骨髄移植片材料。
【請求項２】
さらに、機械的な混合手段を用いて凝固材を混合する、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項３】
前記始原細胞が結合組織始原細胞を含む、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項４】
前記始原細胞が幹細胞を含む、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項５】
前記幹細胞が多能性幹細胞を含む、請求項４に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項６】
前記移植可能基質が微粒子状骨材料および繊維状骨材料を含む、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項７】
前記微粒子状骨材料が同種異系移植片海綿骨粒子を含む、請求項６に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項８】
前記繊維状骨材料が同種異系移植片脱塩皮質骨繊維を含む、請求項６に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項９】
前記基質が、セラミック材、生体ガラス、コラーゲン、鉱化骨、脱塩骨、ヒアルロン酸、および合成生体高分子材料からなるグループから選択される、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項１０】
前記凝固材が骨髄吸引液から得られる骨髄クロットである、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項１１】
前記凝固材が血餅である、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項１２】
前記凝固材が、血小板ゲル、血小板濃縮物、フィブリン凝固材、およびフィブリングルーからなるグループから選択される、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項１３】
全骨髄由来有核細胞に対する始原細胞の比率が少なくとも１：２０，０００である、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項１４】
前記移植可能基質および前記凝固材が前記移植片材料中に容積比５：１から１：５で存在する、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項１５】
前記始原細胞、前記凝固材、および前記基質のすべてが、前記複合型骨髄移植片材料中に実質的に均一に分布している、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項１６】
細胞接着分子が前記移植可能基質の表面に結合している、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項１７】
前記移植片材料が移植者の骨治癒を引き起こすのに有効である、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項１８】
前記移植片材料が移植者の骨再生を引き起こすのに有効である、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項１９】
ａ）骨髄吸引液を用意する段階、
ｂ）多孔性生物学的適合性移植可能基質を用意する段階、ここで該基質は同一の外形寸法を有する非多孔性の固体と比較して、始原細胞の接着に使用可能な基質表面積が少なくとも２倍となるに十分な多孔性を有し、
ｃ）前記骨髄吸引液と前記基質を接触させて高濃度基質を得る段階であって、高濃度基質は、所定量の吸引骨髄を比較的少量の前記移植可能基質を通過するように流動させ、それによって吸引骨髄の始原細胞を選択的に基質の表面に付着させたことによって行われる段階、および
ｄ）前記高濃度基質を凝固材と機械的に混合し、始原細胞が前記複合型骨髄移植片材料に実質的に均一に分布した複合型骨髄移植片材料を生成する段階
を含む複合型骨髄移植片材料の調製方法。
【請求項２０】
前記凝固材によって、移植位置における治癒反応に重要な細胞の付着および移動を促す貴重な追加的基質を得るとともに、移植位置での新規血管の形成が促され、それが新しく移植された始原細胞およびその他細胞の栄養源となって骨治癒反応を促進する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記移植可能基質が微粒子状骨材料および繊維状骨材料を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記微粒子状骨材料が同種異系移植片海綿骨粒子を含み、前記繊維状骨材料が脱塩皮質骨繊維を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記移植可能基質がかさ容積約１−２５ｃｃの微粒子状骨粒子と、乾燥重量約２５−１０００ｍｇの骨繊維とを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記骨繊維の長さが５ｍｍ−１５ｃｍである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
抗凝固処理していない骨髄吸引液を前記高濃度基質に加える段階をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
基質容器、第１エンドキャップ、第２エンドキャップ、第１充填用シリンジ、および第２充填用シリンジを備える複合型骨髄移植片材料調製用キットであって、前記第１エンドキャップを前記基質容器に開放可能にとりつけることができ、前記第１エンドキャップと前記第１充填用シリンジは、前記第１充填用シリンジと前記基質容器の間で液体が連通するように、互いに接続するように構成されており、前記第２エンドキャップを前記基質容器に開放可能にとりつけることができ、前記第２エンドキャップと前記第２充填用シリンジは、前記第２充填用シリンジと前記基質容器の間で液体が連通するように、互いに接続するように構成されている、キット。
【請求項２７】
多孔性生物学的適合性移植可能基質をさらに含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
ヘパリン吸引シリンジおよび吸引針をさらに備える、請求項２６に記載のキット。
【請求項２９】
前記基質容器と一致することによりアプリケータシリンジを形成するように構成されたシリンジアダプタをさらに備える、請求項２６に記載のキット。
【請求項３０】
取り外し可能な底蓋と、漏斗とを有する混合ボウルをさらに備え、前記漏斗の一端が前記混合ボウルの開口端と、他端が前記アプリケータシリンジと一致するように構成されている、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
一方の端にプランジャを有するへら具をさらに備え、前記プランジャは移植片材料を前記基質容器に詰めるように構成されている、請求項２６に記載のキット。
【請求項３２】
基質材料を前記容器内に保持するのに効果的な多孔性膜をさらに備える、請求項２６に記載のキット。
【請求項３３】
前記基質容器が基質カラムである、請求項２６に記載のキット。
【請求項３４】
基質容器、第１エンドキャップ、第１充填用シリンジ、およびへら具を備える複合型骨髄移植片材料調製用キットであって、前記第１エンドキャップを前記基質容器に開放可能にとりつけることができ、前記第１エンドキャップと前記第１充填用シリンジは、前記第１充填用シリンジと前記基質容器の間で液体が連通するように、互いに接続するように構成されており、前記へら具は一方の端にプランジャを有し、前記プランジャは移植片材料を前記基質容器に詰めるように構成されている、キット。
【請求項３５】
多孔性生物学的適合性移植可能基質をさらに含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
ヘパリン吸引シリンジおよび吸引針をさらに備える、請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
取り外し可能な底蓋と、漏斗とを有する混合ボウルをさらに備え、前記漏斗の一端が前記混合ボウルの開口端と、他端が前記アプリケータシリンジと一致するように構成されている、請求項３４に記載のキット。
【請求項３８】
基質材料を前記容器内に保持するのに効果的な多孔性膜をさらに備える、請求項３４に記載のキット。
【請求項３９】
多孔性生物学的適合性移植可能基質と凝固材とを含む、始原細胞の個体数を増加させた複合型骨髄移植片材料であって、
始原細胞の個体数の増加は、所定量の吸引骨髄を比較的少量の前記移植可能基質を通過するように流動させ、それによって吸引骨髄の始原細胞を選択的に基質の表面に付着させたことによって行われ、
該基質の孔の大きさは２０μｍより大きい、複合型骨髄移植片材料。
【請求項１】
多孔性生物学的適合性移植可能基質と凝固材とを含む、始原細胞の個体数を増加させた複合型骨髄移植片材料であって、
始原細胞の個体数の増加は、所定量の吸引骨髄を比較的少量の前記移植可能基質を通過するように流動させ、それによって吸引骨髄の始原細胞を選択的に基質の表面に付着させたことによって行われ、
前記基質は同一の外形寸法を有する非多孔性の固体と比較して、始原細胞の接着に使用可能な基質表面積が少なくとも２倍となるに十分な多孔性を有する、複合型骨髄移植片材料。
【請求項２】
さらに、機械的な混合手段を用いて凝固材を混合する、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項３】
前記始原細胞が結合組織始原細胞を含む、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項４】
前記始原細胞が幹細胞を含む、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項５】
前記幹細胞が多能性幹細胞を含む、請求項４に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項６】
前記移植可能基質が微粒子状骨材料および繊維状骨材料を含む、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項７】
前記微粒子状骨材料が同種異系移植片海綿骨粒子を含む、請求項６に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項８】
前記繊維状骨材料が同種異系移植片脱塩皮質骨繊維を含む、請求項６に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項９】
前記基質が、セラミック材、生体ガラス、コラーゲン、鉱化骨、脱塩骨、ヒアルロン酸、および合成生体高分子材料からなるグループから選択される、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項１０】
前記凝固材が骨髄吸引液から得られる骨髄クロットである、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項１１】
前記凝固材が血餅である、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項１２】
前記凝固材が、血小板ゲル、血小板濃縮物、フィブリン凝固材、およびフィブリングルーからなるグループから選択される、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項１３】
全骨髄由来有核細胞に対する始原細胞の比率が少なくとも１：２０，０００である、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項１４】
前記移植可能基質および前記凝固材が前記移植片材料中に容積比５：１から１：５で存在する、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項１５】
前記始原細胞、前記凝固材、および前記基質のすべてが、前記複合型骨髄移植片材料中に実質的に均一に分布している、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項１６】
細胞接着分子が前記移植可能基質の表面に結合している、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項１７】
前記移植片材料が移植者の骨治癒を引き起こすのに有効である、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項１８】
前記移植片材料が移植者の骨再生を引き起こすのに有効である、請求項１に記載の複合型骨髄移植片材料。
【請求項１９】
ａ）骨髄吸引液を用意する段階、
ｂ）多孔性生物学的適合性移植可能基質を用意する段階、ここで該基質は同一の外形寸法を有する非多孔性の固体と比較して、始原細胞の接着に使用可能な基質表面積が少なくとも２倍となるに十分な多孔性を有し、
ｃ）前記骨髄吸引液と前記基質を接触させて高濃度基質を得る段階であって、高濃度基質は、所定量の吸引骨髄を比較的少量の前記移植可能基質を通過するように流動させ、それによって吸引骨髄の始原細胞を選択的に基質の表面に付着させたことによって行われる段階、および
ｄ）前記高濃度基質を凝固材と機械的に混合し、始原細胞が前記複合型骨髄移植片材料に実質的に均一に分布した複合型骨髄移植片材料を生成する段階
を含む複合型骨髄移植片材料の調製方法。
【請求項２０】
前記凝固材によって、移植位置における治癒反応に重要な細胞の付着および移動を促す貴重な追加的基質を得るとともに、移植位置での新規血管の形成が促され、それが新しく移植された始原細胞およびその他細胞の栄養源となって骨治癒反応を促進する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記移植可能基質が微粒子状骨材料および繊維状骨材料を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記微粒子状骨材料が同種異系移植片海綿骨粒子を含み、前記繊維状骨材料が脱塩皮質骨繊維を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記移植可能基質がかさ容積約１−２５ｃｃの微粒子状骨粒子と、乾燥重量約２５−１０００ｍｇの骨繊維とを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記骨繊維の長さが５ｍｍ−１５ｃｍである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
抗凝固処理していない骨髄吸引液を前記高濃度基質に加える段階をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
基質容器、第１エンドキャップ、第２エンドキャップ、第１充填用シリンジ、および第２充填用シリンジを備える複合型骨髄移植片材料調製用キットであって、前記第１エンドキャップを前記基質容器に開放可能にとりつけることができ、前記第１エンドキャップと前記第１充填用シリンジは、前記第１充填用シリンジと前記基質容器の間で液体が連通するように、互いに接続するように構成されており、前記第２エンドキャップを前記基質容器に開放可能にとりつけることができ、前記第２エンドキャップと前記第２充填用シリンジは、前記第２充填用シリンジと前記基質容器の間で液体が連通するように、互いに接続するように構成されている、キット。
【請求項２７】
多孔性生物学的適合性移植可能基質をさらに含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
ヘパリン吸引シリンジおよび吸引針をさらに備える、請求項２６に記載のキット。
【請求項２９】
前記基質容器と一致することによりアプリケータシリンジを形成するように構成されたシリンジアダプタをさらに備える、請求項２６に記載のキット。
【請求項３０】
取り外し可能な底蓋と、漏斗とを有する混合ボウルをさらに備え、前記漏斗の一端が前記混合ボウルの開口端と、他端が前記アプリケータシリンジと一致するように構成されている、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
一方の端にプランジャを有するへら具をさらに備え、前記プランジャは移植片材料を前記基質容器に詰めるように構成されている、請求項２６に記載のキット。
【請求項３２】
基質材料を前記容器内に保持するのに効果的な多孔性膜をさらに備える、請求項２６に記載のキット。
【請求項３３】
前記基質容器が基質カラムである、請求項２６に記載のキット。
【請求項３４】
基質容器、第１エンドキャップ、第１充填用シリンジ、およびへら具を備える複合型骨髄移植片材料調製用キットであって、前記第１エンドキャップを前記基質容器に開放可能にとりつけることができ、前記第１エンドキャップと前記第１充填用シリンジは、前記第１充填用シリンジと前記基質容器の間で液体が連通するように、互いに接続するように構成されており、前記へら具は一方の端にプランジャを有し、前記プランジャは移植片材料を前記基質容器に詰めるように構成されている、キット。
【請求項３５】
多孔性生物学的適合性移植可能基質をさらに含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
ヘパリン吸引シリンジおよび吸引針をさらに備える、請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
取り外し可能な底蓋と、漏斗とを有する混合ボウルをさらに備え、前記漏斗の一端が前記混合ボウルの開口端と、他端が前記アプリケータシリンジと一致するように構成されている、請求項３４に記載のキット。
【請求項３８】
基質材料を前記容器内に保持するのに効果的な多孔性膜をさらに備える、請求項３４に記載のキット。
【請求項３９】
多孔性生物学的適合性移植可能基質と凝固材とを含む、始原細胞の個体数を増加させた複合型骨髄移植片材料であって、
始原細胞の個体数の増加は、所定量の吸引骨髄を比較的少量の前記移植可能基質を通過するように流動させ、それによって吸引骨髄の始原細胞を選択的に基質の表面に付着させたことによって行われ、
該基質の孔の大きさは２０μｍより大きい、複合型骨髄移植片材料。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００７−５０２７２（Ｐ２００７−５０２７２Ａ）
【公開日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００６−２７７７３６（Ｐ２００６−２７７７３６）
【出願日】平成１８年１０月１１日（２００６．１０．１１）
【分割の表示】特願２００２−５６７３７３（Ｐ２００２−５６７３７３）の分割
【原出願日】平成１４年２月２６日（２００２．２．２６）
【出願人】（５０００６４７０８）ザ クリーブランド クリニック ファウンデーション (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２７７７３６（Ｐ２００６−２７７７３６）
【出願日】平成１８年１０月１１日（２００６．１０．１１）
【分割の表示】特願２００２−５６７３７３（Ｐ２００２−５６７３７３）の分割
【原出願日】平成１４年２月２６日（２００２．２．２６）
【出願人】（５０００６４７０８）ザ クリーブランド クリニック ファウンデーション (12)
【Ｆターム（参考）】
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