複数の多型部位を有するＤＮＡ配列の特異的増幅方法
【課題】HLAのように多型のある複数の領域が組み合わされた形で多数の対立遺伝子が構成されているDNA配列であっても識別でき、目的とする遺伝子を特異的に増幅できる方法を提供する。
【解決手段】複数の多型部位を有する特定の標的DNA配列を当該多型性の有無に応じて選択的に増幅する方法であって、前記標的DNA配列を含むと予測されるDNA試料に対してLoop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)法に基づく増幅反応を実施することを含み、前記LAMP法において使用されるプライマーの3'末端領域及び5'末端領域の少なくとも2つが、前記複数の多型部位の少なくとも2つに相当する塩基配列又はそれの相補的な配列を含むことを特徴とする方法。
【解決手段】複数の多型部位を有する特定の標的DNA配列を当該多型性の有無に応じて選択的に増幅する方法であって、前記標的DNA配列を含むと予測されるDNA試料に対してLoop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)法に基づく増幅反応を実施することを含み、前記LAMP法において使用されるプライマーの3'末端領域及び5'末端領域の少なくとも2つが、前記複数の多型部位の少なくとも2つに相当する塩基配列又はそれの相補的な配列を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の多型部位を有するDNAを、当該多型部位の有無に応じて特異的に増幅する方法及びその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の塩墓配列のDNAの存在の有無を調べることは、基礎研究、医学的研究、検査等において極めて有用である。例えば「個人差」の原因となる染色体DNAやミトコンドリアDNAの多型を調べることは疾患の易罹患性、医薬品の奏功性・副作用予測等において重要であり、ウイルスや細菌等の病原体遺伝子存在の有無を調べることも、医療や食品の領域において重要である。
【０００３】
通常は、検体中のDNA量は少ないのでDNAの特定の領域だけを増幅した後に、プローブとのハイブリダイゼーションや塩基配列解析等により、目的とする塩基配列をもつDNAの存在の有無が調べられる。このような目的のために様々な方法が考案、開発されてきた。遺伝子増幅の方法としては、Polymerase Chain Reaction (PCR)，Transcription Mediated Amplification(TMA)，Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA)，Strand Displacement Amplification (SDA)，等々がある。また、増幅後あるいは増幅申に目的とする塩基配列の有無を調べる方法としては、Sequence-Specific Primers (SSP)-PCR、PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)、PCR-SSO (Sequence-Specific Oligonucleotides)、Real Time PCR (TaqMan PCR等)、HPA (Hybridization Protection Assay)、INVADER assay等々がある。等温増幅法のLoop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)もその一つであり、増幅効率が非常に良く１時間以内に１０９コピーの標的遺伝子の増幅産物が得られると報告されている (非特許文献１)。
【０００４】
さらに、増幅すべき標的配列に由来する塩基配列に対してハイブリダイズする工程を多く含むというLAMP法の特徴に基づいて、FIPおよびBIPの5'末端をSNP特異的な塩基とすることにより、標的塩基配列における変異及び／又は多型を検出する方法が提案され、当該方法は、「相補鎖合成の過程において、標的塩墓配列における堀墓配列を繰り返しチェックすることが可能な核酸の合成方法を利用して、標的塩基配列における変異や多型を検出することができる方法」であり、「標的塩基配列における変異や多型が反応生成物に正確に反映される」とされている (特許文献１)。
【０００５】
【特許文献１】国際公開第WO01/034838号パンフレット
【非特許文献１】Notomi T, 0kayama H，Masubuchi H，Yonekawa T, Watanabe K，Amino N，Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15; 28(12):E63.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上記従来の方法においては、実際には１塩基変異を特異的に検出するプライマーセットをデザインすることは難しい。また、上記の方法によって1つのSNPsをFIP及びBIPの5'末端に配置することにより、当該SNPsの有無を検出することができるが、例えばHLAのように多型のある複数の領域が組み合わされた形で多数の対立遺伝子が構成されているDNA配列を標的とすると、多型のある領域をそれぞれ独立に調べることになり、例えばA_12/B_21という対立遺伝子の組み合わせとA_21/B_12の対立遺伝子の組み合わせは区別できない場合がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
かかる課題を解決するため、本発明は、複数の多型部位を有する特定の標的DNA配列を当該多型性の有無に応じて選択的に増幅する方法であって、前記標的DNA配列を含むと 予測されるDNA試料に対してLoop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)法に基づく増幅反応を実施することを含み、前記LAMP法において使用されるプライマーの3'末端領域及び5'末端領域の少なくとも2つが、前記複数の多型部位の少なくとも2つに相当する堀基配列又はそれの相補的な配列を含むことを特徴とする方法を提供する。
【０００８】
即ち、本発明の方法では、多型性や変異の領域が多いものでは (例えばHLA等)、FIPおよびBIPの5'末端のみならず、FTPおよびBIPの5'末端領域、3'末端領域、F3およびB3プライマーの3'末端領域に１塩基〜数塩基の多型や変異が位置するようにプライマーをデザインすることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、多型性のある領域 (多型性を示す領域が多型を示す塩基と共通の塩基の数塩基から構成される場合は、末端の１塩基だけでなく共通の塩基を含めた数塩基 (１〜５塩基程度)から構成される領域)を、可能な限り多くのプライマーの末端領域(FIPおよびBIPの5'領域および3'領域、F3およびR3の3'領域、1oop primerの3'領域)に設定することにより、複数の共通した多型部位を持つアリルを特異的に増幅することができる。言い換えれば、同一DNA鎖上の多型 (ハプロタイプ)を同時に調べることが可能となる。
【００１０】
例えぱHLAのように多型のある複数の領域が組み合わされた形で多数の対立遺伝子が構成されているDNA配列を標的とするような場合も、各プライマーの末端領域に多型を設定することにより区別することが可能となる。また、HLA等の場合、非常に多くの対立遺伝子が存在するので (各口一カスごとに少なくとも数十種類以上)、各プライマー未端領域の対応する多型の組み合わせを調整することにより、対立遺伝子のグループ分けを行い、その後に対立遺伝子を同定することも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
まず、本発明の基礎となるLAMP法について簡単に述べる (詳細については、前記非特許文献１あるいは栄研化学株式会社のホームページ (http://www.loopamp.eiken.jp)を参照されたい)。この方法は、標的DNA配列を挟む2つの領域中の各々3力所の塩基配列に相補的な配列を有する4種類のプライマーを用いて標的DNA配列を増幅する方法である。即ち、図１（ａ）に示すような2本鎖DNA(標的DNA配列を含む)の試料を、標的DNA配列の3'末端側のF1cと実質的に同一な配列(F1c)とF2cと相補的な配列 (F2)とを有するプライマー (FIP)、標的DNA配列の5'末端側のB2と実質的に同一な配列(B2)とB1と相補的な配列(B1c)とを有するプライマ一 (BIP)、標的DNA配列の3'末端側のF3cと相補的な配列(F3)を有するプライマー(F3)、及び標的DNA配列の5'末端側のB3と実質的に同一な配列(B3)を有するプライマー(B3)といぅ4種類のプライマーを用いて標的DNA配列を増幅する方法である。
【００１２】
LAMP法では、両末端に互いに相補的な配列 (F1とF1c、B1とB1c)を有するため、図１（ｂ）に示すように、標的配列 (又はその相補的配列)の両側にループを形成したダンベル型の構造を介して増幅反応が進行するという特徴を有している。そして、ループ状の１本鎖部分 (BlとB2の間又はFlとF2の間)の領域に相補的な配列を持つループプライマー (各々、LPBスはLPFとする)を使用することにより、増幅効率を向上させることができる。
【００１３】
PCR法では、ブライマーに由来する塩基配列がそのまま鋳型として利用されるため、一度ミスリード等が起こるとそれを修正することができず、標的DMA配列を繰り返しチェックすることはできない。これに対してLAMP法では、標的DNA配列に由来する塩基配列に対してハイブリダイズする工程を多く含むため、標的塩基配列のわずかな相違を正確に検出できるとされている。上記の特許文献１に記載された発明は、このようなLAMP法の特徴に基づいて、標的DNA配列における変異又は多型を検出する方法である。
【００１４】
具体的には、プライマーFIP及びBIPの5'末端に変異／多型部位 (例えばSNPs)塩基がくるようにプライマーを設計する (図１（ｃ）参照)。そして、DNA試料に含まれる標的DNA配列がプライマーと同一の (又は相補的な)塩基を有する場合には増幅反応が進行するが、異なる塩基を有する場合には増幅反応が進行しないことに基づいて変異／多型の検出(SNPsタイピング)が行なわれる。
しかしながら、このような方法では、標的DNA配列における1力所の変異／多型 (例えばSNPs)の有無しか検出することができない。
【００１５】
本発明では、LAMP法におけるプライマーFIP及ぴBIPの5'末端に、標的DNA配列に存在する変異／多型部位 (第１の変異／多型部位)に相当する塩基配列を配置することに加えて、プライマーFIPおよぴBIPの3'領域、F3およびB3の3'領域、ループプライマー（LPB及びLPF)の3'領域の内の少なくとも１つ、好ましくは2つ以上に、標的DNA配列に存在する前記第１の変異／多型部位以外の変異／多型部位 (第ｎの変異／多型部位：ｎは2以上の整数)に相当する塩基配列が配置されるようにプライマー設計をすることにより、複数の変異／多型性部位を有する標的DNA配列を、複数のプライマーに配置した塩基配列の有無に応じて特異的に増幅させることができる。このような試みは従来になかったものであり、本発明者等は、多型のある領域が組み合わされた形で多数の対立遺伝子が構成されているHLAについて、実際に特異的増幅を実施し、対立遺伝子を特定の変異／多型部位の有無によってクループ分けすることに初めて成功した。
より詳細に説明すると、例えば、HLA領域に存在するDRBl遺伝子の場合、多型部位の有無及びその種類及び位置に基づいて以下の群に分類できる。
(第１群)DRBl*0101
(第２群)DRBl*1501,1502,1602
(第３群)DRBl*0301,1301,1302,1402,1403,1406
(第４群)DRBl*0401,0403,0404,0405,0406,0407,0410
(第５群)DRBl*1101,1307
(第６群)DRBl*1201,1202
(第７群)DRBl*1401,1405,1407
(第８群)DRBl*0701
(第９群)DRBl*0802,0803
(第１０群)DRB1*0901
(第１１群)DRBl*1001
【００１６】
例として、上記第３群に属するDRBl*0301,1301,1302,1402,1403,1406のエクソン２における塩基配列 (図４参照)を、第７群に属するDRBl*1401,1405,1407の同領域の塩基配列 (図８参照)と比較してみる。第３群に属する遺伝子は、共通して96番目及び97番目の塩基が共にaであるのに対し、第７群に属する遺伝子は、共通して96番目及び97番目の塩基が共にtである。従って、前記特許文献１に記載された方法 (以下 「従来方法」という)では、当該96番目又は97番目の塩基がFIP及びBIPの5'末端にくるようにプライマーを設計しさえすれば、設定した何れかの群の遺伝子のみが選択的に増幅されることになる。
【００１７】
しかしながら、例えば、上記第１０群に属するDRBl*0901においても96番目及び97番目の塩基はaであるため、前記のプライマーセットを使用したのでは、第３群と第１０群の遺伝子を識別することはできない。
これに対して、本発明では、第３群の遺伝子を選択的に増幅させるに当たり、FIP及びBIPの5'末端のみならず、F3及びB3プライマー並びにループプライマー（LF及びLB)の少なくとも１つに多型性部位を含ませることにより、複数の多型性部位を有する遺伝子群の選択的増幅の効率及び信頼性を格段に向上させることができる。
【００１８】
本発明の考え方に基づいて、前記第１群から第１１群のHLA-DRBl遺伝子を選択的に増幅するためのプライマー設計を図２から１２に示した。その結果、各々の群に対して設定され得るプライマーセットの代表例を以下に示す。
（第１群）DRBl*0101
F3: TTCGTGTCCCCACAGCA
FIP: GACTCCTCTTGGTTATAGATGCATCT-TTCTTGTGGCAGCTTAAGTTTGAA
B3: CGCCTCTGCTCCAGGAG
BIP: CCGTGCGCTTCGACAGC-GCTGTTCCAGTACTCGGCAT
LF: GCTCCGTCCCATTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTACCG
（第２群）DRBl*1501, 1502, 1602
F3: TGTCCCCACAGCACGT
FIP: GACTCCTCCTGGTTATAGAAGTATCTG-CCTGTGGCAGCCTAAGAGG
BIP: TCCGTGCGCTTCGACAG-TTCTGGCTGTTCCAGTACTCA
B3: GCGCCTGCTCCAGGAT 及びGCGCCTGTCTTCCAGGAGAG（混合物）
LF: GCTCCGTCCCATTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTACCG 及びACGTGGGGGAGTTCCG (混合物)
【００１９】
(第３群) DRBl*0301, 1301, 1302, 1402, 1403, 1406
F3: TTCGTGTCCCCACAGCA
FIP: TTCTCCTCCTGGTTATGGAAGTATC-CGTTTCTTGGAGTACTCTACGTCT
BIP: AACGTGCGCTTCGACAGC-CATCAGGCCGCCCCA
B3: GTCCTTCTGGCTGTTCCAGTA
LF: GCTCCGTCCCATTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTACCG 及びACGTGGGGGAGTTCCG (混合物)
(第４群) DRBl*0401, 0403, 0404, 0405, 0406, 0407, 0410
F3: TCGTTCTTGTCCCCCCAG
FIP: GATAGAAGTATCTGTCCAGGAACCG-CGTTTCTTGGAGCAGGTTAAACAT
BIP: CACCAAGAGGAGTACGTGCG-GCCCCAGCTCCGTCAC
B3: TCGTTCTTGTCCCCCCAG
LF: CTCCGTCCCGTTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTACCG
【００２０】
(第５群) DRBl*1101, 1307
RF3: TTCGTGTCCCCACAGCA
FIP: TACTCCTCTTGGTTATAGAAGTATCTGTC-CGTTTCTTGGAGTACTCTACGTCT
BIP: TACGTGCGCTTCGACAGC-GTCCTTCTGGCTGTTCCAGTA
B3: CCGCCTGTCTTCCAGGAA
LF: GCTCCGTCCCATTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTTCCG
(第６群) DRBl*1201, 1202
F3: TTCGTGTCCCCCCAGC
FIP: GGAGCTCCTCCTGGTTATG-GAGTACTCTACGGGTGAGTGTT
BIP: CTCCTGCGCTTCGACAGC-TTCCAGGACTCGGCGAC
B3: CGGCGCGCCTGTCTT
LF: GCTCCGTCCCATTGAAGAAAT
LB: CTCCGTCCCGTTGAAGAAAT
【００２１】
(第７群) DRB1*1401, 1405, 1407
F3: TTCGTGTCCCCACAGCA
FIP: AACTCCTCCTGGTTATGGAAGTATC-CGTTTCTTGGAGTACTCTACGTCT
BIP: TTCGTGCGCTTCGACAGC-GTCCTTCTGGCTGTTCCAGT
B3: CCGCCTCCGCTCCAG
LF: GCTCCGTCCCATTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTACCG
(第８群) DRB1*0701
F3: TTGTGCCCCCACAGCA
FIP: AGTCTTTCCAGGAACTGCACC-GTTTCCTGTGGCAGGGTAAGTATA
BIP: CTCTTCTATAACCAGGAGGAGTTCG-ACAGGCCGCCCTAGCT
B3: TCCTTCTGGCTGTTCCAGG
LF: CTCCGTCCCGTTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTACCG
【００２２】
(第９群) DRB1*0802, 0803
F3: GTTCGTGTCCCCACAGCA
FIP: TACTCCTCTTGGTTATAGAAGTATCTGTC-CGTTTCTTGGAGTACTCTACGGG
BIP: TACGTGCGCTTCGACAGC-TGGCTGTTCCAGTACTCGG
B3: CCGCCTGTCTTCCAGGA
LF: GCTCCGTCCCATTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTACCG
(第１０群) DRB1*0901
F3: TTCGTGTCCCCCCAGC
FIP: TGCCTCTGTGCAGATACCG-CGTTTCTTGAAGCAGGATAAGTTTG
BIP: GGCATCTATAACCAAGAGGAGAAC-GTTCCAGGACTCGGCGA
B3: GCCTCCGCTCCAGGAAG
LF: CTCCGTCCCGTTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTACCG
【００２３】
(第１１群) DRB1*1001
F3: TTCGTGTCCCCACAGCA
FIP: TACTCCTCTTGGTTATGGACGC-CGTTTCTTGGAGGAGGTTAAGTTT
BIP: TACGCGCGCTACGACAG-GCTGTTCCAGTACTCGGCAT
B3: GCCTCCGCTCCAGGAG
LF: CTCCGTCCCGTTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTACCG
【００２４】
同様に、HLA-DQBl遺伝子について、以下の群（第１２群〜第２０群）各々に対し、下記の代表的なプライマーセットを設定した。
(第１２群) DQB1*0202
F3: CGCGTGCGTCTTGTGAG
B3: GTAGTTGTGTCTGCACACCC
FIP: AGCCCCAGCAGCGTCA-AGAAGCATCTATAACCGAGAAGAGAT
BIP: TGCCTGCCGCCGAGT-CACCGCCGCCCGTT
LP: ACGTCGCTGTCGAAGC
LB: CAGAAGGACATCCTGGAGAG
(第１３群) DQB1*0301, DQB1*0302, DQB1*0303
F3: CGGAGCGCGTGCGT
B3: TCTGCACACCGTGTCCAA
FIP: GGCCCCAGCGGCGT-CTATAACCGAGAGGAGTACGCA
BIP: CGCCTGMCGCCGAGTAC-CTCCGCCCGGGTCCT
LP: ACGTCGCTGTCGAAGC
LB: GCCAGAAGGAAGTCCTGG
【００２５】
(第１４群) DQB1*0401, DQB1*0402
F3: TATAACCGAGAGGAGTACGCG
B3: CAAGGTCGTGCGGAGCT
FIP: ATTCCAGTACTCGGCGTCAAG-GCGACGTGGGGGTGTAT
BIP: TAGCCAGAAGGACATCCTGGA-CAACTGGTAGTTGTGTCTGCAT
LF: CCCCAGCGGCGTCAC
LB: CGGGCGTCGGTGGAC
(第１５群) DQB1*0501
F3: CGTGTACCAGTTTAAGGGCC
B3: CAGGATCCCGCGGTACG
FIP: AACAGGCCGCCCCTGC-GCGGGGTGTGACCAGAC
BIP: TTGCCGAGTACTGGAACAGC-GTAGTTGTGTCTGCACACCC
LF: ACGTCGCTGTCGAAGC
LB: AGAAGGAAGTCCTGGAGGG
【００２６】
(第１６群) DQB1*0502
F3: CGTGTACCAGTTTAAGGGCC
B3: CAGGATCCCGCGGTACG
FIP: CTAGGCCGCCCCTGC-GCGGGGTGTGACCAGAC
BIP: AGCGCCGAGTACTGGAACA-CGTAGTTGTGTCTGCACACTC
LF: ACGTCGCTGTCGAAGC
LB: AGAAGGAAGTCCTGGAGGG
(第１７群) DQB1*0503
F3: CGTGTACCAGTTTAAGGGCC
B3: CAGGATCCCGCGGTACG
FIP: TCAGGCCGCCCCTGC-GCGGGGTGTGACCAGAC
BIP: ACGCCGAGTACTGGAACAG-CGTAGTTGTGTCTGCACACTC
LF: ACGTCGCTGTCGAAGC
LB: AGAAGGAAGTCCTGGAGGG
【００２７】
(第１８群) DQB1*0601
F3: CGGAGCGCGTGCGTTA
B3: CCTCGTAGTTGTGTCTGCAC
FIP: GTCAGGCCGCCCCTG-CTATAACCGAGAGGAGGACGT
BIP: ACGCCGAGTACTGGAACAG-CCGTGTCCAACTCCGCT
LF: ACGTCGCTGTCGAAGC
LB: CAGAAGGACATCCTGGAGAG
(第１９群) DQB1*0602, DQB1*0603
F3: GGAGCGCGTGCGTCT
B3: CAAGATCCCGCGGAACG
FIP: ATCAGGCCGCCCCTG-TCTATAACCGAGAGGAGTACGC
BIP: ATGCCGAGTACTGGAACAGC-TGCACACCGTGTCCAACT
LF: ACGTCGCTGTCGAAGC
LB: AGAAGGAAGTCCTGGAGGG
【００２８】
(第２０群) DQB1*0604, DQB1*0609
F3: AGCGCGTGCGTCTTGTA
B3: CAGGATCCCGCGGTACC
FIP: AACAGGCCGCCCCTG-AACCGAGAGGAGTACGCG
BIP: TTGCCGAGTACTGGAACAGC-GTAGTTGTGTCTGCACACCG
LF: ACGTCGCTGTCGAAGC
LB: GAAGTCCTGGAGAGGACCC
【００２９】
同様に、HLA-A遺伝子について、以下の群（第２１群〜第２９群）各々に対し、下記の代表的なプライマーセットを設定した
(第２１群) A*0101
F3: TCCCACTCCATGAGGTATTTCTT
B3: CAGGGTCCCCAGGTTCG
FIP: TTCTGGCTCGCGGCG-GCCCCGCTTCATCGCC
BIP: AGATGGAGCCGCGGGC-GTCTGTGAGTGGGCCTTCAT
LF: GCGTGTCGTCCACGTAG
LB: GGACCAGGAGACACGGAA
(第２２群) A*0201, A*0203, A*0206, A*0207, A*0210, A*0218
F3: CCTCCGCGGGTACCAC
B3: CCGTTCTCCAGGTATCTGCG
PIP: TGCTTGGTGGTCTGAGCTG-CAAGGATTACATCGCCCTGAAA
BIP: ACAAGTGGGAGGCGGC-GCCACTCCACGCACGT
LF: GTCCAAGAGCGCAGGTC
LB: GAGAGCCTACCTGGAGGG
【００３０】
(第２３群) A*0301, A*0302
F3: CTCCGCGGGTACCGG
B3: CCAGGTATCTGCGGAGCC
FIP: CGCCATGTCCGCCGC-CAAGGATTACATCGCCCTGAAC
BIP: AAGCGCAAGTGGGAGGC-CTCCACGCACGTGCCA
LF: GTCCAAGAGCGCAGGTC
LB: GAGCAGTTGAGAGCCTACC 及び AGCAGCAGAGAGCCTACC (混合物）
(第２４群) A*1101, A*1102
F3: GCGGGTACCGGCAGG
B3: GCCACTCCACGCACCG
FIP: TGCCATGTCCGCCGC-CAAGGATTACATCGCCCTGAAC
BIP: AGCTCAGATCACCAAGCGC-CCCTCCAGGTAGGCTCTCTG
LF: GTCCAAGAGCGCAGGTC
LB: AAGTGGGAGGCGGCC
【００３１】
(第２５群) A*2402, A*2404, A*2408
F3: CGCGGGTACCACCAGT
B3: GGTATCTGCGGAGCCCG
FIP: CGCCATGTCCGCCGC-CAAGGATTACATCGCCCTGAAA
BIP: GGCTCAGATCACCAAGCGC-CCCTCCAGGTAGGCTCTCTG
LF: GTCCAAGAGCGCAGGTC
LB: CCATGTGGCGGAGCAG
(第２６群) A*2601, A*2602, A*2603, A*2605
F3: GGTACCAGCAGGACGCTT
B3: GCCACTCCACGCACCG
FIP: CGCCATGTCCGCCGC-CAAGGATTACATCGCCCTGAAC
BIP: GGCTCAGATCACCCAGCG-CCTCCAGGTAGGCTCTCCA
LF: GTCCAAGAGCGCAGGTC
LB: GGGAGACGGCCCATGA
【００３２】
(第２７群) A*3001
F3: CTTCCTCCGCGGGTATGAA
B3: GCGTCTCCTTCCCGTTCT
FIP: CAACGGGCCGCCTCC-CAAGGATTACATCGCCCTGAAC
BIP: TGGGCGGAGCAGTTGAG-AGGTATCTGCGGAGCCAC
LF: GTCCAAGAGCGCAGGTC
LB: CTACCTGGAGGGCACGT
(第２８群) A*3101, A*3303
F3: CGCGGGTACCAGCAGG
B3: GTTCTCCAGGTATCTGCGGA
FIP: GGGTGATCTGAGCCGCC-GGCAAGGATTACATCGCCTT
BIP: CAGCGCAAGTGGGAGGC-GCCACTCCACGCACGT
LP: TCCAAGAGCGCAGGTC
LB: AGCAGTTGAGAGCCTACCT
【００３３】
(第２９群) A*6801
F3: CTCCGCGGGTACCGG
B3: CTGCGGAGCCACTCCA
FIP: GTCTGAGCTGCCATGTCCG-CAAGGATTACATCGCCCTGAAA
BIP: CCACCAAGCACAAGTGGGA-CCTCCAGGTAGGCTCTCC
LF: GTCCAAGAGCGCAGGTC
LB: CCATGTGGCGGAGCAG
【００３４】
同様に、HLA-C遺伝子について、以下の群（第３０群〜第３８群）各々に対し、下記の代表的なプライマーセットを設定した
(第３０群) Cw*0102, Cw*0103
F3: CTCCCACTCCATGAAGTATTTCTT
B3: CAGGCTCACTCGGTCAGT
FIP: CGGACTCGCGGCGT-TCCGTGTCCCGGCCT
BIP: GAGAGGGGAGCCGCG-CTGTGCCTGGCGCTTG
LF:CGTCCACGTAGCCCAC
LB: TGGGTGGAGCAGGAGG
(第３１群) Cw*0302, Cw*0303, Cw*0304
F3: AGGATGTATGGCTGCGACG
B3: AGCCACTCCACGCACAG
FIP: CGTGTCCGCGGCGGT-CCTCCTCCGCGGGTATG
BIP: GGCGGCTCAGATCACCC-CCCTCCAGGTAGGCTCTCA
LF: CAGGGCGATGTAATCCTTG
LB: CGTGAGGCGGAGCAG
【００３５】
(第３２群) Cw*0401
F3: TGCGACCTGGGGCCG
B3: CCTCCAGGTAGGCTCTCC
FIP: ATCCTCGTTCAGGGCGATG-GCCTCCTCCGCGGGTATA
BIP: TCTGCGCTCCTGGACCG-CCGCCTCCCACTTGCG
LF: CGTCGTAGGCGAACTGGT
LB: GCGGCTCAGATCACCCA
(第３３群) Cw*0502
F3: GGATGTATGGCTGCGACCT
B3: GCCACTCCACGCACGT
FIP: CTTGTCCGCGGCGGTC-TCCGCGGGTATAACCAGTT
BIP: AGGCGGCTCAGATCACCC-CCCTCCAGGTAGGCTCTCC
LF: CAGGGCGATGTAATCCTTG
LB: CGTGAGGCGGAGCAG
【００３６】
(第３４群) Cw*0602, Cw*0702, Cw*0704
F3: CCCACTCCATGAGGTATTTCG
B3: CAGGTTCACTCGGTCAGC
FIP: CGGACTCGCGGCGTC-GAGAGCCCCGCTTCATCT
BIP: GAGAGGGGAGCCSCGG-CTGGCGCTTGTACTTCTGTG
LP: CGTCCACGTAGCCCAC
LB: TGGGTGGAGCAGGAGG
(第３５群) Cw*0801, Cw*0803
F3: GACCTGGGGCCCGAC
B3: GCCCTCCAGGTAGGCTC
FIP: CGTGTCCGCGGCGGT-CTCCGCGGGTATAACCAGTT
BIP: GGCGGCTCAGATCACCC-CAGCTGCTCCGCCGT
LF: TCCTTGCCGTCGTAGGC
LB: AGCGCAAGTGGGAGGC
【００３７】
(第３６群) Cw*1202, Cw*1203
F3: CCTCCAGAGGATGTACGGC
B3: TGCGGAGCCACTCCAC
FIP: CGTGTCCGCAGCGGT-CCGCGGGTATGACCAGTC
BIP: GGCGGCTCAGATCACCC-CCTCCAGGTAGGCTCTCCA
LF: CAGGGCGATGTAATCCTTG
LB: CGTGAGGCGGAGCAG
(第３７群) Cw*1402, Cw*1403
F3: ACACCCTCCAGTGGATGTT
B3: CCTCCAGGTAGGCTCTCC
FIP: ATCCTCGTTCAGGGCGATG-GACCTGGGGCCCGAC
BIP: TCTGCGCTCCTGGACCG-GGCCGCCTCCCACTT
LF: CGTAGGCGGACTGGTCAT
LB: GCGGCTCAGATCACCCA
【００３８】
(第３８群) Cw*1502, Cw*1505
F3: CCATGAGGTATTTCTACACCGCT
B3: GCGCAGTTTCCGCAGGT
FIP: TGGACTCGCGGCGTCG-CCGCGGAGAGCCCCA
BIP: AAGAGGGGAGCCGCGG-TGTGCCTGGCGCTTGTAG
LF: CGTCCACGTAGCCCAC
LB: TGGGTGGAGCAGGAGG
【００３９】
同様に、HLA-B遺伝子について、以下の群（第３９群〜第５７群）各々に対し、下記の代表的なプライマーセットを設定した
(第３９群) B*1302, B*5401, B*5502, B*5601, B*5901 (exon 3)
F3: GGTCTCACACTTGGCAGAC
B3: CGCCCTCCAGGTAGGC
FIP: CGCGGTCCAGGAGCTC-CCGCGGGCATAACCAGTTA
BIP: GGCGGACACCGCGG-CTCAGCTGCTCCGCCA
LF: TCCTTGCCGTCGTAGGC
LB: CACCCAGCTCAAGTGGGAG
(第４０群) B*1501, B*1507, B*1511, B*4601, B*5603 (exon 3)
F3: CCAGGGTCTCACACCCTC
B3: GCCACTCCACGCACAG
FIP: CGTGTCCGCCGCGG-TCCTCCGCGGGCATG
BIP: GGCGGCTCAGATCACCC-CCTCCAGGTAGGCTCTCCA
LF: TCCTTGCCGTCGTAGGC
LB: AGCGCAAGTGGGAGGC
【００４０】
(第４１群) B*2701 (exon 3)
F3: GGTCTCACACCCTCCAGAAT
B3: AGCCACTCCACGCACTC
FIP: GGCGGTCCAGGAGCTC-CTCCTCCGCGGGTACC
BIP: CGCGGACACGGCGG-CTCAGCTGCTCCGCCA
LF: TCCTTGCCGTCGTAGGC
LB: AGCGCAAGTGGGAGGC
(第４２群) B*3501, B*5701, B* 5801 (exon 3)
F3: GGCCAGGGTCTCACATCA
B3: GCCACTCCACGCACAG
FIP: TCAGGTCCTCGTTCAGGG-TCCTCCGCGGGCATG
BIP: AGCTCCTGGACCGCG-CTCAGCTGCTCCGCCA
LF: TCCTTGCCGTCGTAGGC
LB: AGCGCAAGTGGGAGGC
【００４１】
(第４３群) B*3701 (exon 3)
F3: ACACCATCCAGAGGATGTCT
B3: GCCACTCCACGCACGT
FIP: CGCGGTCCAGGAGCTC-GCCTCCTCCGCGGGT
LP: TCCTTGCCGTCGTAGGC
LB: AGCGCAAGTGGGAGGC
BIP: GGCGGACACCGCGG-CCTCCAGGTAGGCTCTGTC
(第４４群) B*3802, B*3901, B*3902, B*3904, B*6701 (exon 3)
F3: ACACCCTCCAGAGGATGTAC
B3: CTGCGGAGCCACTCCA
FIP: GGTGTCCGCCGCGG-CGCGGGCATAACCAGTT
BIP: CGCGGCTCAGATCACCC-GTGCCCTCCAGGTAGGT
LF: TCCTTGCCGTCGTAGGC
LB: AGCGCAAGTGGGAGGC
【００４２】
(第４５群) B*4801, B*5504, B*4002 (exon 3)
F3: TCTCACACCCTCCAGAGC
B3: GGAGCCACTCCACGCAC
FIP: GCAGGTCCTCGTTCAGGG-CCGCGGGCATAACCAGTA
BIP: CGCTCCTGGACCGCC-CTCAGCTGCTCCGCCA
LF: TCCTTGCCGTCGTAGGC
LB: AGCGCAAGTGGGAGGC
(第４６群) B*5101, B*5102, B*5201 (exon 3)
F3: GGTCTCACACTTGGCAGAC
B3: GCCACTCCACGCACAG
FIP: CGCGGTCCAGGAGCTC-CCGCGGGCATAACCAGTA
BIP: GGCGGACACCGCGG-CTCAGCTGCTCCGCCT
LF: GTAATCTTTGCCGTCGTAGGC
LB: AGCGCAAGTGGGAGGC
【００４３】
(第４７群) B*4402, B*4403 (exon 3)
F3: GGCCAGGGTCTCACATCA
B3: CCAGGTATCTGCGGAGCG
FIP: GGTGTCCGCCGCGG-TCCGCGGGTATGACCAGG
BIP: CGCGGCTCAGATCACCC-CCACGCACAGGCCCT
LP: TCCTTGCCGTCGTAGGC
LB: AGCGCAAGTGGGAGGC
(第４８群) B*0702 (exon 3)
F3: TCTCACACCCTCCAGAGC
B3: AGCCACTCCACGCACTC
FIP: GGCGGTCCAGGAGCG-CGCGGGCATGACCAGTA
BIP: CGCGGACACGGCGG-CCGCTGCTCCGCCT
LP: TCCTTGCCGTCGTAGGC
LB: AGCGCAAGTGGGAGGC
【００４４】
(第４９群) B*1518 (exon 3)
F3: GTCTCACACCCTCCAGAGG
B3: AGCCACTCCACGCACTC
FIP:CGTGTCCGCCGCGG-GCGGGCATGACCAGTCC
BIP: GGCGGCTCAGATCACCC-CTCAGCTGCTCCGCCT
LF: TCCTTGCCGTCGTAGGC
LB: AGCGCAAGTGGGAGGC
(第５０群) B*0702, B* 6701 (exon 2)
F3: CATGAGGTATTTCTACACCTCCG
B3: TCGGTCAGTCTGTGCCTG
FIP: CTCTCGGACTCGCGGC-GGAGCCCCGCTTCATCT
BIP: AGAGGAGCCGCGGGC-GGCCTTGTAGATCTGTGTGTT
LP: GCTGTCGAACCTCACGAAC
LB: GAGCAGGAGGGGCCG
【００４５】
(第５１群) B*1301, B*1302 (exon 2)
F3: GCCCCGCTTCATCACC
B3: TAGCGGAGCGCGGTG
FIP: GCCATCCTCGGACTCGT-GGCTACGTGGACGACACC
BIP: CCGGGCGCCATGGATA-AGTCTGTGTGTTGGTCTTGG
LF: GCTGTCGAACCTCACGAAC
LB: GAGCAGGAGGGGCCG
(第５２群) B*1518, B*3904 (exon 2)
F3: TGAGGTATTTCTACACCGCCA
B3: TAGTAGCCGCGCAGGTTC
FIP: CTCTCGGACTCGCGGC-GGAGCCCCGCTTCATCT
BIP: AGAGGAGCCGCGGGC-AAGTCTGTGTGTTGGTCTTGC
LP: GCTGTCGAACCTCACGAAC
LB: GAGCAGGAGGGGCCG
【００４６】
(第５３群) B*4001, B*4002, B*4003, B*4006 (exon 2)
F3: CCCACTCCATGAGGTATTTCC
B3: GTAGCCGCGCAGGTTC
FIP: TTCCTCGGACTCGTGGC-AGCCCCGCTTCATCACC
BIP: AAGGAGCCGCGGGC-AAGTCTGTGTGTTGGTCTTGG
LF: GCTGTCGAACCTCACGAAC
LB: GAGCAGGAGGGGCCG
(第５４群) B*4402, B*4403 (exon 2)
F3: TCCCACTCCATGAGGTATTTCT
B3: TAGCGGAGCGCGGTG
FIP: TTCCTCGGACTCGTGGC-AGCCCCGCTTCATCACC
BIP: AAGGAGCCGCGGGC-AAGTCTGTGTGTTGGTCTTGG
LF: GCTGTCGAACCTCACGAAC
LB: GAGCAGGAGGGGCCG
【００４７】
(第５５群) B*1501, B*1507, B*1511 (exon 2)
F3: TGAGGTATTTCTACACCGCCA
B3: TAGTAGCCGCGCAGGTTC
FIP: GCCATCCTCGGACTCGC-GCCCCGCTTCATCGCA
BIP: CCGGGCGCCATGGATA-CGGTAAGTCTGTGTGTTGGT
LF: GCTGTCGAACCTCACGAAC
LB: GAGCAGGAGGGGCCG
(第５６群) B*2701 (exon 2)
F3: CCCACTCCATGAGGTATTTCC
B3: TAGCGGACCGCGGTG
FIP: CTCTCGGACTCGCGGC-AGCCCCGCTTCATCACC
BIP: AGAGGAGCCGCGGGC-CTGTGCCTTGGCCTTGC
LF: GCTGTCGAACCTCACGAAC
LB: GAGCAGGAGGGGCCG
【００４８】
(第５７群) B*3701 (exon 2)
F3: GAGGTATTTCCACACCTCCG
B3: GCAGGGTCCGCAGGTC
FIP: GTCCTCGGACTCGCGG-GGAGCCCCGCTTCATCT
BIP: CGGAGCCCCGGGCG-AGTCTGTGTGTTGGTCTTGG
LP: GCTGTCGAACCTCACGAAC
LB: GAGCAGGAGGGGCCG
【実施例】
【００４９】
以下、実施例を参照して本発明を具体的に説明する。
（実施例１）HLA-DRB1アリルの群特異的増幅
図１３〜２３に記載したDRB1遺伝子群を含有する試料に対して、各々、前記第１群から第１１群に対して設定したプライマーセットを用いて増幅を行ったところ、第１群から第１１群に属する各アリルの特異的増幅がみられた。
なおLoop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)による増幅反応は以下の終濃度の組成で、65℃で行った。
【００５０】
20 mM Tris-HCL(pH8.8)、10mM KCl、10mM (NH4)2SO4、0.1% Triton X-l00、1.6M Betain、 1.4mM each dNTP、8mM MgS04、Bst DNA Polymerase、1.6μM FIPプライマー、1．6μM BIPプライマー、0.8μM LFプライマー、0.8μM LBプライマー、0.2μM F3プライマー、0.2μM B3プライマー。
図１３〜２３に示した結果は、サイバ−グリーン存在下でLAMP法による対象アリル (例えば、図１３においてはDRBl*0101)を含む試料を増幅した結果である。各図における縦軸は増幅した2本鎖DNAにインターカレートしたサイバ−グリ−ン由来の蛍光強度で、蛍光強度が強いほどDNAが増幅していることを示す。横軸のサイクル数はl cycleがl分に相当する。
【００５１】
(実施例２)HLA-DQBlアリルの群特異的増幅
図２４〜３１に記載したHLA-DQBl遺伝子群を含有する試料に対して、各々、前記第１２群から第２０群 (第１９群は除く)に対して設定したプライマーセットを用いて増幅を行ったところ、各群に属するアリルの特異的増幅がみられた。
なお、増幅反応は実施例１と同様の条件で実施し、結果は図１３〜２３と同様にして表示した。
【００５２】
(実施例３)HLA-Aアリルの群特異的増幅
図３２及び３３に記載したHLA-A遺伝子群を含有する試料に対して、各々、前記第２５群及び第２７群に対して設定したプライマーセットを用いて増幅を行ったところ、各群に属するアリルの特異的増幅がみられた。
なお、増幅反応は実施例１と同様の条件で実施し、結果は図１３〜２３と同様にして表示した。
【００５３】
(実施例４)HLA-Cwアリルの群特異的増幅
図３４、３５及び３６に記載したHLA-Cw遺伝子群を含有する試料に対して、各々、前記第３２群、第３５群及び第３８群に対して設定したプライマーセットを用いて増幅を行ったところ、各群に属するアリルの特異的増幅がみられた。
なお、増幅反応は実施例１と同様の条件で実施し、結果は図１３〜２３と同様にして表示した。
【００５４】
(実施例５)HLA-Bアリルの群特異的増幅
図３７〜４３に記載したHLA-B遺伝子群を含有する試料に対して、各々、前記第３９群、第４０群、第４３群、第４４群、第４６群、第４７群及び第５７群に対して設定したプライマーセットを用いて増幅を行ったところ、各群に属するアリルの特異的増幅がみられた。
なお、増幅反応は実施例１と同様の条件で実施し、結果は図１３〜２３と同様にして表示した。
【００５５】
(比較例１)
前記第３群に属するDRBl*1402(及び1403)と、第７群に属するDRBl*1401(及び1405)とを用い、FIP及ぴBIPの5'末端のみに多型部位を配置したプライマーセットを使用して増幅反応を実施した（この方法は、前記従来方法に該当する)。
まず、DRBl*1402,1403、1401及び1405の塩基配列を図４４に示す。次いで、図４４に示すように、FIP及びBIPの5'末端に71番目の塩基が配置されるように各プライマーを設定した。これらのプライマーは、本発明に基づいて設定されたプライマーセット（図４及び図８)とは異なり、FIP及びBIPの5 '末端のみ(下記下線部）に多型性部位が存在する。
【００５６】
具体的には、以下のプライマーセノトを準備した。
第７群(DRBl*1401)増幅のためのブライマーセット
F3: CCGCCTGTGTGACTGGA
FIP: GTCCAGGAACCGCACCC-TCGTGTCCCCACAGCAC
BIP: CAGATACTTCCATAACCAGGAGGA-CCCAGCTCCGTCACCG
B3: AGGTCCTTCTGGCTGTTCC
LF: CACTCAGACGTAGAGTACTCCAA
LB: CAGCGACGTGGGGGAG
第３群(DRBl*1402)増幅のためのプライマーセット
F3: CCGCCTGTGTGACTGGA
FIP: CTCCAGGAACCGCACCC-TCGTGTCCCCACAGCAC
BIP: GAGATACTTCCATAACCAGGAGGAG-CCCAGCTCCGTCACCG
B3: AGGTCCTTCTGGCTGTTCC
LF: CACTCAGACGTAGAGTACTCCAA
LB: CAGCGACGTGGGGGAG
【００５７】
これらのプライマーセットにおいては、Tmをそろえるために第３群増幅のためのプライマーBIPのB1の3' 側を1塩基のばしてある。
なお、塩基配列の共通性から、DRBl*1401増幅のためのプライマーセットではDRBl*1405、DRBl*1407、DRBl*1402増幅のためのプライマーセットではDRBl*1403、DRBl*1406、DRBl*0301、DRBl*1301、DRBl*1302も増幅されると考えられる。
【００５８】
これらのプライマーセットを用いて、実施例１に示した条件で遺伝子増幅を実施した。その結果、FIP及 びBIPの5' 末端のみが異なり、他は同じ配列になるようにデザインしたプ ライマーセットを用いて増幅を行った場合、それぞれの遺伝子を特異的に増幅することはできなかった(図４５、図 ４６) 。
またDRBl*0803はどちらのプライマーセットでも増幅しているが、DRBl*14に比べ立ち上がりが遅く、一方 DRBl*0401は増幅されなかった。これらはプライマー部分の塩基配 列がDRB1*0803は DRBl*0401よりもDRBl*14との共通性が大きいためと考えられる(図 ４４) 。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】（ａ）LAMP法において使用されるプライマー等を示す説明図、（ｂ）LAMP法において生成されるダンベル型構造を示す模式図、及び（ｃ）LAMP法を用いた従来のSNPs検出方法を示す概略図である。
【図２】第１群のHLA-DRBl遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるプライマーの位置を示す図である。
【図３】第2群のHLA-DRBl遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるプライマーの位置を示す図である。
【図４】第3群のHLA-DRBl遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるプライマーの位置を示す図である。
【図５】第4群のHLA-DRBl遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるブライマーの位置を示す図である。
【図６】第5群のHLA-DRBl遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるブライマーの位置を示す図である。
【図７】第6群のHLA-DRBl遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるブライマーの位置を示す図である。
【図８】第７群のHLA-DRBl遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるプライマーの位置を示す図である。
【図９】第８群のHLA-DRBl遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるプライマーの位置を示す図である。
【図１０】第９群のHLA-DRBl遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるプライマーの位置を示す図である。
【図１１】第１０群のHLA-DRBl遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるプライマーの位置を示す図である。
【図１２】第１１群のHLA-DRBl遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるプライマーの位置を示す図である。
【図１３】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第１群 (DRB1*0101)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図１４】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第２群 (DRB1*15)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図１５】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第３群 (DRB1*1402)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図１６】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第４群 (DRB1*0401)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図１７】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第５群 (DRB1*1101)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図１８】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第６群 (DRB1*1201)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図１９】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第７群 (DRB1*1405)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図２０】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第８群 (DRB1*0701)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図２１】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第９群 (DRB1*0803)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図２２】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第１０群 (DRB1*0901)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図２３】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第１１群 (DRB1*1001)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図２４】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第１２群 (DQB1*0202)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図２５】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第１３群 (DQB1*0302)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図２６】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第１４群 (DQB1*0401)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図２７】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第１５群 (DQB1*0501)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図２８】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第１６群 (DQB1*0502)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図２９】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第１７群 (DQB1*0503)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図３０】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第１８群 (DQB1*0601)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図３１】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第２０群 (DQB1*0604)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図３２】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第２５群 (A*2402)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図３３】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第２７群 (A*3001)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図３４】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第３２群 (Cw*0401)アリルの特異的増幅を示すクラフである。
【図３５】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第３５群 (Cw*0801)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図３６】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第３８群 (Cw*l502)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図３７】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第３９群 (B*5401、B5901)アリルの特異的増幅を示すクラフである。
【図３８】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第４０群 (B*l501、B*4601)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図３９】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第４３群 (B*3701)アリル(exon3)の特異的増幅を示すグラフである。
【図４０】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第４４群 (B*6701)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図４１】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第４６群 (B*5101)アリルの特異的増幅を示すクラフである。
【図４２】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第４７群 (B*4403)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図４３】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第５７群 (B*3701)アリル(exon2)の特異的増幅を示すグラフである。
【図４４】第３群及び第７群の遺伝子 (DRBl*1402、1403、1401及び1405)の塩基配列及び従来技術に基づいて設定したプライマーセットの位置を示す図である。
【図４５】従来技術に基づくプライマーセットを用いた遺伝子増幅の結果を示すグラフである。
【図４６】従来技術に基づくプライマーセットを用いた遺伝子増幅の結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の多型部位を有するDNAを、当該多型部位の有無に応じて特異的に増幅する方法及びその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の塩墓配列のDNAの存在の有無を調べることは、基礎研究、医学的研究、検査等において極めて有用である。例えば「個人差」の原因となる染色体DNAやミトコンドリアDNAの多型を調べることは疾患の易罹患性、医薬品の奏功性・副作用予測等において重要であり、ウイルスや細菌等の病原体遺伝子存在の有無を調べることも、医療や食品の領域において重要である。
【０００３】
通常は、検体中のDNA量は少ないのでDNAの特定の領域だけを増幅した後に、プローブとのハイブリダイゼーションや塩基配列解析等により、目的とする塩基配列をもつDNAの存在の有無が調べられる。このような目的のために様々な方法が考案、開発されてきた。遺伝子増幅の方法としては、Polymerase Chain Reaction (PCR)，Transcription Mediated Amplification(TMA)，Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA)，Strand Displacement Amplification (SDA)，等々がある。また、増幅後あるいは増幅申に目的とする塩基配列の有無を調べる方法としては、Sequence-Specific Primers (SSP)-PCR、PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)、PCR-SSO (Sequence-Specific Oligonucleotides)、Real Time PCR (TaqMan PCR等)、HPA (Hybridization Protection Assay)、INVADER assay等々がある。等温増幅法のLoop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)もその一つであり、増幅効率が非常に良く１時間以内に１０９コピーの標的遺伝子の増幅産物が得られると報告されている (非特許文献１)。
【０００４】
さらに、増幅すべき標的配列に由来する塩基配列に対してハイブリダイズする工程を多く含むというLAMP法の特徴に基づいて、FIPおよびBIPの5'末端をSNP特異的な塩基とすることにより、標的塩基配列における変異及び／又は多型を検出する方法が提案され、当該方法は、「相補鎖合成の過程において、標的塩墓配列における堀墓配列を繰り返しチェックすることが可能な核酸の合成方法を利用して、標的塩基配列における変異や多型を検出することができる方法」であり、「標的塩基配列における変異や多型が反応生成物に正確に反映される」とされている (特許文献１)。
【０００５】
【特許文献１】国際公開第WO01/034838号パンフレット
【非特許文献１】Notomi T, 0kayama H，Masubuchi H，Yonekawa T, Watanabe K，Amino N，Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15; 28(12):E63.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上記従来の方法においては、実際には１塩基変異を特異的に検出するプライマーセットをデザインすることは難しい。また、上記の方法によって1つのSNPsをFIP及びBIPの5'末端に配置することにより、当該SNPsの有無を検出することができるが、例えばHLAのように多型のある複数の領域が組み合わされた形で多数の対立遺伝子が構成されているDNA配列を標的とすると、多型のある領域をそれぞれ独立に調べることになり、例えばA_12/B_21という対立遺伝子の組み合わせとA_21/B_12の対立遺伝子の組み合わせは区別できない場合がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
かかる課題を解決するため、本発明は、複数の多型部位を有する特定の標的DNA配列を当該多型性の有無に応じて選択的に増幅する方法であって、前記標的DNA配列を含むと 予測されるDNA試料に対してLoop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)法に基づく増幅反応を実施することを含み、前記LAMP法において使用されるプライマーの3'末端領域及び5'末端領域の少なくとも2つが、前記複数の多型部位の少なくとも2つに相当する堀基配列又はそれの相補的な配列を含むことを特徴とする方法を提供する。
【０００８】
即ち、本発明の方法では、多型性や変異の領域が多いものでは (例えばHLA等)、FIPおよびBIPの5'末端のみならず、FTPおよびBIPの5'末端領域、3'末端領域、F3およびB3プライマーの3'末端領域に１塩基〜数塩基の多型や変異が位置するようにプライマーをデザインすることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、多型性のある領域 (多型性を示す領域が多型を示す塩基と共通の塩基の数塩基から構成される場合は、末端の１塩基だけでなく共通の塩基を含めた数塩基 (１〜５塩基程度)から構成される領域)を、可能な限り多くのプライマーの末端領域(FIPおよびBIPの5'領域および3'領域、F3およびR3の3'領域、1oop primerの3'領域)に設定することにより、複数の共通した多型部位を持つアリルを特異的に増幅することができる。言い換えれば、同一DNA鎖上の多型 (ハプロタイプ)を同時に調べることが可能となる。
【００１０】
例えぱHLAのように多型のある複数の領域が組み合わされた形で多数の対立遺伝子が構成されているDNA配列を標的とするような場合も、各プライマーの末端領域に多型を設定することにより区別することが可能となる。また、HLA等の場合、非常に多くの対立遺伝子が存在するので (各口一カスごとに少なくとも数十種類以上)、各プライマー未端領域の対応する多型の組み合わせを調整することにより、対立遺伝子のグループ分けを行い、その後に対立遺伝子を同定することも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
まず、本発明の基礎となるLAMP法について簡単に述べる (詳細については、前記非特許文献１あるいは栄研化学株式会社のホームページ (http://www.loopamp.eiken.jp)を参照されたい)。この方法は、標的DNA配列を挟む2つの領域中の各々3力所の塩基配列に相補的な配列を有する4種類のプライマーを用いて標的DNA配列を増幅する方法である。即ち、図１（ａ）に示すような2本鎖DNA(標的DNA配列を含む)の試料を、標的DNA配列の3'末端側のF1cと実質的に同一な配列(F1c)とF2cと相補的な配列 (F2)とを有するプライマー (FIP)、標的DNA配列の5'末端側のB2と実質的に同一な配列(B2)とB1と相補的な配列(B1c)とを有するプライマ一 (BIP)、標的DNA配列の3'末端側のF3cと相補的な配列(F3)を有するプライマー(F3)、及び標的DNA配列の5'末端側のB3と実質的に同一な配列(B3)を有するプライマー(B3)といぅ4種類のプライマーを用いて標的DNA配列を増幅する方法である。
【００１２】
LAMP法では、両末端に互いに相補的な配列 (F1とF1c、B1とB1c)を有するため、図１（ｂ）に示すように、標的配列 (又はその相補的配列)の両側にループを形成したダンベル型の構造を介して増幅反応が進行するという特徴を有している。そして、ループ状の１本鎖部分 (BlとB2の間又はFlとF2の間)の領域に相補的な配列を持つループプライマー (各々、LPBスはLPFとする)を使用することにより、増幅効率を向上させることができる。
【００１３】
PCR法では、ブライマーに由来する塩基配列がそのまま鋳型として利用されるため、一度ミスリード等が起こるとそれを修正することができず、標的DMA配列を繰り返しチェックすることはできない。これに対してLAMP法では、標的DNA配列に由来する塩基配列に対してハイブリダイズする工程を多く含むため、標的塩基配列のわずかな相違を正確に検出できるとされている。上記の特許文献１に記載された発明は、このようなLAMP法の特徴に基づいて、標的DNA配列における変異又は多型を検出する方法である。
【００１４】
具体的には、プライマーFIP及びBIPの5'末端に変異／多型部位 (例えばSNPs)塩基がくるようにプライマーを設計する (図１（ｃ）参照)。そして、DNA試料に含まれる標的DNA配列がプライマーと同一の (又は相補的な)塩基を有する場合には増幅反応が進行するが、異なる塩基を有する場合には増幅反応が進行しないことに基づいて変異／多型の検出(SNPsタイピング)が行なわれる。
しかしながら、このような方法では、標的DNA配列における1力所の変異／多型 (例えばSNPs)の有無しか検出することができない。
【００１５】
本発明では、LAMP法におけるプライマーFIP及ぴBIPの5'末端に、標的DNA配列に存在する変異／多型部位 (第１の変異／多型部位)に相当する塩基配列を配置することに加えて、プライマーFIPおよぴBIPの3'領域、F3およびB3の3'領域、ループプライマー（LPB及びLPF)の3'領域の内の少なくとも１つ、好ましくは2つ以上に、標的DNA配列に存在する前記第１の変異／多型部位以外の変異／多型部位 (第ｎの変異／多型部位：ｎは2以上の整数)に相当する塩基配列が配置されるようにプライマー設計をすることにより、複数の変異／多型性部位を有する標的DNA配列を、複数のプライマーに配置した塩基配列の有無に応じて特異的に増幅させることができる。このような試みは従来になかったものであり、本発明者等は、多型のある領域が組み合わされた形で多数の対立遺伝子が構成されているHLAについて、実際に特異的増幅を実施し、対立遺伝子を特定の変異／多型部位の有無によってクループ分けすることに初めて成功した。
より詳細に説明すると、例えば、HLA領域に存在するDRBl遺伝子の場合、多型部位の有無及びその種類及び位置に基づいて以下の群に分類できる。
(第１群)DRBl*0101
(第２群)DRBl*1501,1502,1602
(第３群)DRBl*0301,1301,1302,1402,1403,1406
(第４群)DRBl*0401,0403,0404,0405,0406,0407,0410
(第５群)DRBl*1101,1307
(第６群)DRBl*1201,1202
(第７群)DRBl*1401,1405,1407
(第８群)DRBl*0701
(第９群)DRBl*0802,0803
(第１０群)DRB1*0901
(第１１群)DRBl*1001
【００１６】
例として、上記第３群に属するDRBl*0301,1301,1302,1402,1403,1406のエクソン２における塩基配列 (図４参照)を、第７群に属するDRBl*1401,1405,1407の同領域の塩基配列 (図８参照)と比較してみる。第３群に属する遺伝子は、共通して96番目及び97番目の塩基が共にaであるのに対し、第７群に属する遺伝子は、共通して96番目及び97番目の塩基が共にtである。従って、前記特許文献１に記載された方法 (以下 「従来方法」という)では、当該96番目又は97番目の塩基がFIP及びBIPの5'末端にくるようにプライマーを設計しさえすれば、設定した何れかの群の遺伝子のみが選択的に増幅されることになる。
【００１７】
しかしながら、例えば、上記第１０群に属するDRBl*0901においても96番目及び97番目の塩基はaであるため、前記のプライマーセットを使用したのでは、第３群と第１０群の遺伝子を識別することはできない。
これに対して、本発明では、第３群の遺伝子を選択的に増幅させるに当たり、FIP及びBIPの5'末端のみならず、F3及びB3プライマー並びにループプライマー（LF及びLB)の少なくとも１つに多型性部位を含ませることにより、複数の多型性部位を有する遺伝子群の選択的増幅の効率及び信頼性を格段に向上させることができる。
【００１８】
本発明の考え方に基づいて、前記第１群から第１１群のHLA-DRBl遺伝子を選択的に増幅するためのプライマー設計を図２から１２に示した。その結果、各々の群に対して設定され得るプライマーセットの代表例を以下に示す。
（第１群）DRBl*0101
F3: TTCGTGTCCCCACAGCA
FIP: GACTCCTCTTGGTTATAGATGCATCT-TTCTTGTGGCAGCTTAAGTTTGAA
B3: CGCCTCTGCTCCAGGAG
BIP: CCGTGCGCTTCGACAGC-GCTGTTCCAGTACTCGGCAT
LF: GCTCCGTCCCATTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTACCG
（第２群）DRBl*1501, 1502, 1602
F3: TGTCCCCACAGCACGT
FIP: GACTCCTCCTGGTTATAGAAGTATCTG-CCTGTGGCAGCCTAAGAGG
BIP: TCCGTGCGCTTCGACAG-TTCTGGCTGTTCCAGTACTCA
B3: GCGCCTGCTCCAGGAT 及びGCGCCTGTCTTCCAGGAGAG（混合物）
LF: GCTCCGTCCCATTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTACCG 及びACGTGGGGGAGTTCCG (混合物)
【００１９】
(第３群) DRBl*0301, 1301, 1302, 1402, 1403, 1406
F3: TTCGTGTCCCCACAGCA
FIP: TTCTCCTCCTGGTTATGGAAGTATC-CGTTTCTTGGAGTACTCTACGTCT
BIP: AACGTGCGCTTCGACAGC-CATCAGGCCGCCCCA
B3: GTCCTTCTGGCTGTTCCAGTA
LF: GCTCCGTCCCATTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTACCG 及びACGTGGGGGAGTTCCG (混合物)
(第４群) DRBl*0401, 0403, 0404, 0405, 0406, 0407, 0410
F3: TCGTTCTTGTCCCCCCAG
FIP: GATAGAAGTATCTGTCCAGGAACCG-CGTTTCTTGGAGCAGGTTAAACAT
BIP: CACCAAGAGGAGTACGTGCG-GCCCCAGCTCCGTCAC
B3: TCGTTCTTGTCCCCCCAG
LF: CTCCGTCCCGTTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTACCG
【００２０】
(第５群) DRBl*1101, 1307
RF3: TTCGTGTCCCCACAGCA
FIP: TACTCCTCTTGGTTATAGAAGTATCTGTC-CGTTTCTTGGAGTACTCTACGTCT
BIP: TACGTGCGCTTCGACAGC-GTCCTTCTGGCTGTTCCAGTA
B3: CCGCCTGTCTTCCAGGAA
LF: GCTCCGTCCCATTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTTCCG
(第６群) DRBl*1201, 1202
F3: TTCGTGTCCCCCCAGC
FIP: GGAGCTCCTCCTGGTTATG-GAGTACTCTACGGGTGAGTGTT
BIP: CTCCTGCGCTTCGACAGC-TTCCAGGACTCGGCGAC
B3: CGGCGCGCCTGTCTT
LF: GCTCCGTCCCATTGAAGAAAT
LB: CTCCGTCCCGTTGAAGAAAT
【００２１】
(第７群) DRB1*1401, 1405, 1407
F3: TTCGTGTCCCCACAGCA
FIP: AACTCCTCCTGGTTATGGAAGTATC-CGTTTCTTGGAGTACTCTACGTCT
BIP: TTCGTGCGCTTCGACAGC-GTCCTTCTGGCTGTTCCAGT
B3: CCGCCTCCGCTCCAG
LF: GCTCCGTCCCATTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTACCG
(第８群) DRB1*0701
F3: TTGTGCCCCCACAGCA
FIP: AGTCTTTCCAGGAACTGCACC-GTTTCCTGTGGCAGGGTAAGTATA
BIP: CTCTTCTATAACCAGGAGGAGTTCG-ACAGGCCGCCCTAGCT
B3: TCCTTCTGGCTGTTCCAGG
LF: CTCCGTCCCGTTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTACCG
【００２２】
(第９群) DRB1*0802, 0803
F3: GTTCGTGTCCCCACAGCA
FIP: TACTCCTCTTGGTTATAGAAGTATCTGTC-CGTTTCTTGGAGTACTCTACGGG
BIP: TACGTGCGCTTCGACAGC-TGGCTGTTCCAGTACTCGG
B3: CCGCCTGTCTTCCAGGA
LF: GCTCCGTCCCATTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTACCG
(第１０群) DRB1*0901
F3: TTCGTGTCCCCCCAGC
FIP: TGCCTCTGTGCAGATACCG-CGTTTCTTGAAGCAGGATAAGTTTG
BIP: GGCATCTATAACCAAGAGGAGAAC-GTTCCAGGACTCGGCGA
B3: GCCTCCGCTCCAGGAAG
LF: CTCCGTCCCGTTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTACCG
【００２３】
(第１１群) DRB1*1001
F3: TTCGTGTCCCCACAGCA
FIP: TACTCCTCTTGGTTATGGACGC-CGTTTCTTGGAGGAGGTTAAGTTT
BIP: TACGCGCGCTACGACAG-GCTGTTCCAGTACTCGGCAT
B3: GCCTCCGCTCCAGGAG
LF: CTCCGTCCCGTTGAAGAAAT
LB: ACGTGGGGGAGTACCG
【００２４】
同様に、HLA-DQBl遺伝子について、以下の群（第１２群〜第２０群）各々に対し、下記の代表的なプライマーセットを設定した。
(第１２群) DQB1*0202
F3: CGCGTGCGTCTTGTGAG
B3: GTAGTTGTGTCTGCACACCC
FIP: AGCCCCAGCAGCGTCA-AGAAGCATCTATAACCGAGAAGAGAT
BIP: TGCCTGCCGCCGAGT-CACCGCCGCCCGTT
LP: ACGTCGCTGTCGAAGC
LB: CAGAAGGACATCCTGGAGAG
(第１３群) DQB1*0301, DQB1*0302, DQB1*0303
F3: CGGAGCGCGTGCGT
B3: TCTGCACACCGTGTCCAA
FIP: GGCCCCAGCGGCGT-CTATAACCGAGAGGAGTACGCA
BIP: CGCCTGMCGCCGAGTAC-CTCCGCCCGGGTCCT
LP: ACGTCGCTGTCGAAGC
LB: GCCAGAAGGAAGTCCTGG
【００２５】
(第１４群) DQB1*0401, DQB1*0402
F3: TATAACCGAGAGGAGTACGCG
B3: CAAGGTCGTGCGGAGCT
FIP: ATTCCAGTACTCGGCGTCAAG-GCGACGTGGGGGTGTAT
BIP: TAGCCAGAAGGACATCCTGGA-CAACTGGTAGTTGTGTCTGCAT
LF: CCCCAGCGGCGTCAC
LB: CGGGCGTCGGTGGAC
(第１５群) DQB1*0501
F3: CGTGTACCAGTTTAAGGGCC
B3: CAGGATCCCGCGGTACG
FIP: AACAGGCCGCCCCTGC-GCGGGGTGTGACCAGAC
BIP: TTGCCGAGTACTGGAACAGC-GTAGTTGTGTCTGCACACCC
LF: ACGTCGCTGTCGAAGC
LB: AGAAGGAAGTCCTGGAGGG
【００２６】
(第１６群) DQB1*0502
F3: CGTGTACCAGTTTAAGGGCC
B3: CAGGATCCCGCGGTACG
FIP: CTAGGCCGCCCCTGC-GCGGGGTGTGACCAGAC
BIP: AGCGCCGAGTACTGGAACA-CGTAGTTGTGTCTGCACACTC
LF: ACGTCGCTGTCGAAGC
LB: AGAAGGAAGTCCTGGAGGG
(第１７群) DQB1*0503
F3: CGTGTACCAGTTTAAGGGCC
B3: CAGGATCCCGCGGTACG
FIP: TCAGGCCGCCCCTGC-GCGGGGTGTGACCAGAC
BIP: ACGCCGAGTACTGGAACAG-CGTAGTTGTGTCTGCACACTC
LF: ACGTCGCTGTCGAAGC
LB: AGAAGGAAGTCCTGGAGGG
【００２７】
(第１８群) DQB1*0601
F3: CGGAGCGCGTGCGTTA
B3: CCTCGTAGTTGTGTCTGCAC
FIP: GTCAGGCCGCCCCTG-CTATAACCGAGAGGAGGACGT
BIP: ACGCCGAGTACTGGAACAG-CCGTGTCCAACTCCGCT
LF: ACGTCGCTGTCGAAGC
LB: CAGAAGGACATCCTGGAGAG
(第１９群) DQB1*0602, DQB1*0603
F3: GGAGCGCGTGCGTCT
B3: CAAGATCCCGCGGAACG
FIP: ATCAGGCCGCCCCTG-TCTATAACCGAGAGGAGTACGC
BIP: ATGCCGAGTACTGGAACAGC-TGCACACCGTGTCCAACT
LF: ACGTCGCTGTCGAAGC
LB: AGAAGGAAGTCCTGGAGGG
【００２８】
(第２０群) DQB1*0604, DQB1*0609
F3: AGCGCGTGCGTCTTGTA
B3: CAGGATCCCGCGGTACC
FIP: AACAGGCCGCCCCTG-AACCGAGAGGAGTACGCG
BIP: TTGCCGAGTACTGGAACAGC-GTAGTTGTGTCTGCACACCG
LF: ACGTCGCTGTCGAAGC
LB: GAAGTCCTGGAGAGGACCC
【００２９】
同様に、HLA-A遺伝子について、以下の群（第２１群〜第２９群）各々に対し、下記の代表的なプライマーセットを設定した
(第２１群) A*0101
F3: TCCCACTCCATGAGGTATTTCTT
B3: CAGGGTCCCCAGGTTCG
FIP: TTCTGGCTCGCGGCG-GCCCCGCTTCATCGCC
BIP: AGATGGAGCCGCGGGC-GTCTGTGAGTGGGCCTTCAT
LF: GCGTGTCGTCCACGTAG
LB: GGACCAGGAGACACGGAA
(第２２群) A*0201, A*0203, A*0206, A*0207, A*0210, A*0218
F3: CCTCCGCGGGTACCAC
B3: CCGTTCTCCAGGTATCTGCG
PIP: TGCTTGGTGGTCTGAGCTG-CAAGGATTACATCGCCCTGAAA
BIP: ACAAGTGGGAGGCGGC-GCCACTCCACGCACGT
LF: GTCCAAGAGCGCAGGTC
LB: GAGAGCCTACCTGGAGGG
【００３０】
(第２３群) A*0301, A*0302
F3: CTCCGCGGGTACCGG
B3: CCAGGTATCTGCGGAGCC
FIP: CGCCATGTCCGCCGC-CAAGGATTACATCGCCCTGAAC
BIP: AAGCGCAAGTGGGAGGC-CTCCACGCACGTGCCA
LF: GTCCAAGAGCGCAGGTC
LB: GAGCAGTTGAGAGCCTACC 及び AGCAGCAGAGAGCCTACC (混合物）
(第２４群) A*1101, A*1102
F3: GCGGGTACCGGCAGG
B3: GCCACTCCACGCACCG
FIP: TGCCATGTCCGCCGC-CAAGGATTACATCGCCCTGAAC
BIP: AGCTCAGATCACCAAGCGC-CCCTCCAGGTAGGCTCTCTG
LF: GTCCAAGAGCGCAGGTC
LB: AAGTGGGAGGCGGCC
【００３１】
(第２５群) A*2402, A*2404, A*2408
F3: CGCGGGTACCACCAGT
B3: GGTATCTGCGGAGCCCG
FIP: CGCCATGTCCGCCGC-CAAGGATTACATCGCCCTGAAA
BIP: GGCTCAGATCACCAAGCGC-CCCTCCAGGTAGGCTCTCTG
LF: GTCCAAGAGCGCAGGTC
LB: CCATGTGGCGGAGCAG
(第２６群) A*2601, A*2602, A*2603, A*2605
F3: GGTACCAGCAGGACGCTT
B3: GCCACTCCACGCACCG
FIP: CGCCATGTCCGCCGC-CAAGGATTACATCGCCCTGAAC
BIP: GGCTCAGATCACCCAGCG-CCTCCAGGTAGGCTCTCCA
LF: GTCCAAGAGCGCAGGTC
LB: GGGAGACGGCCCATGA
【００３２】
(第２７群) A*3001
F3: CTTCCTCCGCGGGTATGAA
B3: GCGTCTCCTTCCCGTTCT
FIP: CAACGGGCCGCCTCC-CAAGGATTACATCGCCCTGAAC
BIP: TGGGCGGAGCAGTTGAG-AGGTATCTGCGGAGCCAC
LF: GTCCAAGAGCGCAGGTC
LB: CTACCTGGAGGGCACGT
(第２８群) A*3101, A*3303
F3: CGCGGGTACCAGCAGG
B3: GTTCTCCAGGTATCTGCGGA
FIP: GGGTGATCTGAGCCGCC-GGCAAGGATTACATCGCCTT
BIP: CAGCGCAAGTGGGAGGC-GCCACTCCACGCACGT
LP: TCCAAGAGCGCAGGTC
LB: AGCAGTTGAGAGCCTACCT
【００３３】
(第２９群) A*6801
F3: CTCCGCGGGTACCGG
B3: CTGCGGAGCCACTCCA
FIP: GTCTGAGCTGCCATGTCCG-CAAGGATTACATCGCCCTGAAA
BIP: CCACCAAGCACAAGTGGGA-CCTCCAGGTAGGCTCTCC
LF: GTCCAAGAGCGCAGGTC
LB: CCATGTGGCGGAGCAG
【００３４】
同様に、HLA-C遺伝子について、以下の群（第３０群〜第３８群）各々に対し、下記の代表的なプライマーセットを設定した
(第３０群) Cw*0102, Cw*0103
F3: CTCCCACTCCATGAAGTATTTCTT
B3: CAGGCTCACTCGGTCAGT
FIP: CGGACTCGCGGCGT-TCCGTGTCCCGGCCT
BIP: GAGAGGGGAGCCGCG-CTGTGCCTGGCGCTTG
LF:CGTCCACGTAGCCCAC
LB: TGGGTGGAGCAGGAGG
(第３１群) Cw*0302, Cw*0303, Cw*0304
F3: AGGATGTATGGCTGCGACG
B3: AGCCACTCCACGCACAG
FIP: CGTGTCCGCGGCGGT-CCTCCTCCGCGGGTATG
BIP: GGCGGCTCAGATCACCC-CCCTCCAGGTAGGCTCTCA
LF: CAGGGCGATGTAATCCTTG
LB: CGTGAGGCGGAGCAG
【００３５】
(第３２群) Cw*0401
F3: TGCGACCTGGGGCCG
B3: CCTCCAGGTAGGCTCTCC
FIP: ATCCTCGTTCAGGGCGATG-GCCTCCTCCGCGGGTATA
BIP: TCTGCGCTCCTGGACCG-CCGCCTCCCACTTGCG
LF: CGTCGTAGGCGAACTGGT
LB: GCGGCTCAGATCACCCA
(第３３群) Cw*0502
F3: GGATGTATGGCTGCGACCT
B3: GCCACTCCACGCACGT
FIP: CTTGTCCGCGGCGGTC-TCCGCGGGTATAACCAGTT
BIP: AGGCGGCTCAGATCACCC-CCCTCCAGGTAGGCTCTCC
LF: CAGGGCGATGTAATCCTTG
LB: CGTGAGGCGGAGCAG
【００３６】
(第３４群) Cw*0602, Cw*0702, Cw*0704
F3: CCCACTCCATGAGGTATTTCG
B3: CAGGTTCACTCGGTCAGC
FIP: CGGACTCGCGGCGTC-GAGAGCCCCGCTTCATCT
BIP: GAGAGGGGAGCCSCGG-CTGGCGCTTGTACTTCTGTG
LP: CGTCCACGTAGCCCAC
LB: TGGGTGGAGCAGGAGG
(第３５群) Cw*0801, Cw*0803
F3: GACCTGGGGCCCGAC
B3: GCCCTCCAGGTAGGCTC
FIP: CGTGTCCGCGGCGGT-CTCCGCGGGTATAACCAGTT
BIP: GGCGGCTCAGATCACCC-CAGCTGCTCCGCCGT
LF: TCCTTGCCGTCGTAGGC
LB: AGCGCAAGTGGGAGGC
【００３７】
(第３６群) Cw*1202, Cw*1203
F3: CCTCCAGAGGATGTACGGC
B3: TGCGGAGCCACTCCAC
FIP: CGTGTCCGCAGCGGT-CCGCGGGTATGACCAGTC
BIP: GGCGGCTCAGATCACCC-CCTCCAGGTAGGCTCTCCA
LF: CAGGGCGATGTAATCCTTG
LB: CGTGAGGCGGAGCAG
(第３７群) Cw*1402, Cw*1403
F3: ACACCCTCCAGTGGATGTT
B3: CCTCCAGGTAGGCTCTCC
FIP: ATCCTCGTTCAGGGCGATG-GACCTGGGGCCCGAC
BIP: TCTGCGCTCCTGGACCG-GGCCGCCTCCCACTT
LF: CGTAGGCGGACTGGTCAT
LB: GCGGCTCAGATCACCCA
【００３８】
(第３８群) Cw*1502, Cw*1505
F3: CCATGAGGTATTTCTACACCGCT
B3: GCGCAGTTTCCGCAGGT
FIP: TGGACTCGCGGCGTCG-CCGCGGAGAGCCCCA
BIP: AAGAGGGGAGCCGCGG-TGTGCCTGGCGCTTGTAG
LF: CGTCCACGTAGCCCAC
LB: TGGGTGGAGCAGGAGG
【００３９】
同様に、HLA-B遺伝子について、以下の群（第３９群〜第５７群）各々に対し、下記の代表的なプライマーセットを設定した
(第３９群) B*1302, B*5401, B*5502, B*5601, B*5901 (exon 3)
F3: GGTCTCACACTTGGCAGAC
B3: CGCCCTCCAGGTAGGC
FIP: CGCGGTCCAGGAGCTC-CCGCGGGCATAACCAGTTA
BIP: GGCGGACACCGCGG-CTCAGCTGCTCCGCCA
LF: TCCTTGCCGTCGTAGGC
LB: CACCCAGCTCAAGTGGGAG
(第４０群) B*1501, B*1507, B*1511, B*4601, B*5603 (exon 3)
F3: CCAGGGTCTCACACCCTC
B3: GCCACTCCACGCACAG
FIP: CGTGTCCGCCGCGG-TCCTCCGCGGGCATG
BIP: GGCGGCTCAGATCACCC-CCTCCAGGTAGGCTCTCCA
LF: TCCTTGCCGTCGTAGGC
LB: AGCGCAAGTGGGAGGC
【００４０】
(第４１群) B*2701 (exon 3)
F3: GGTCTCACACCCTCCAGAAT
B3: AGCCACTCCACGCACTC
FIP: GGCGGTCCAGGAGCTC-CTCCTCCGCGGGTACC
BIP: CGCGGACACGGCGG-CTCAGCTGCTCCGCCA
LF: TCCTTGCCGTCGTAGGC
LB: AGCGCAAGTGGGAGGC
(第４２群) B*3501, B*5701, B* 5801 (exon 3)
F3: GGCCAGGGTCTCACATCA
B3: GCCACTCCACGCACAG
FIP: TCAGGTCCTCGTTCAGGG-TCCTCCGCGGGCATG
BIP: AGCTCCTGGACCGCG-CTCAGCTGCTCCGCCA
LF: TCCTTGCCGTCGTAGGC
LB: AGCGCAAGTGGGAGGC
【００４１】
(第４３群) B*3701 (exon 3)
F3: ACACCATCCAGAGGATGTCT
B3: GCCACTCCACGCACGT
FIP: CGCGGTCCAGGAGCTC-GCCTCCTCCGCGGGT
LP: TCCTTGCCGTCGTAGGC
LB: AGCGCAAGTGGGAGGC
BIP: GGCGGACACCGCGG-CCTCCAGGTAGGCTCTGTC
(第４４群) B*3802, B*3901, B*3902, B*3904, B*6701 (exon 3)
F3: ACACCCTCCAGAGGATGTAC
B3: CTGCGGAGCCACTCCA
FIP: GGTGTCCGCCGCGG-CGCGGGCATAACCAGTT
BIP: CGCGGCTCAGATCACCC-GTGCCCTCCAGGTAGGT
LF: TCCTTGCCGTCGTAGGC
LB: AGCGCAAGTGGGAGGC
【００４２】
(第４５群) B*4801, B*5504, B*4002 (exon 3)
F3: TCTCACACCCTCCAGAGC
B3: GGAGCCACTCCACGCAC
FIP: GCAGGTCCTCGTTCAGGG-CCGCGGGCATAACCAGTA
BIP: CGCTCCTGGACCGCC-CTCAGCTGCTCCGCCA
LF: TCCTTGCCGTCGTAGGC
LB: AGCGCAAGTGGGAGGC
(第４６群) B*5101, B*5102, B*5201 (exon 3)
F3: GGTCTCACACTTGGCAGAC
B3: GCCACTCCACGCACAG
FIP: CGCGGTCCAGGAGCTC-CCGCGGGCATAACCAGTA
BIP: GGCGGACACCGCGG-CTCAGCTGCTCCGCCT
LF: GTAATCTTTGCCGTCGTAGGC
LB: AGCGCAAGTGGGAGGC
【００４３】
(第４７群) B*4402, B*4403 (exon 3)
F3: GGCCAGGGTCTCACATCA
B3: CCAGGTATCTGCGGAGCG
FIP: GGTGTCCGCCGCGG-TCCGCGGGTATGACCAGG
BIP: CGCGGCTCAGATCACCC-CCACGCACAGGCCCT
LP: TCCTTGCCGTCGTAGGC
LB: AGCGCAAGTGGGAGGC
(第４８群) B*0702 (exon 3)
F3: TCTCACACCCTCCAGAGC
B3: AGCCACTCCACGCACTC
FIP: GGCGGTCCAGGAGCG-CGCGGGCATGACCAGTA
BIP: CGCGGACACGGCGG-CCGCTGCTCCGCCT
LP: TCCTTGCCGTCGTAGGC
LB: AGCGCAAGTGGGAGGC
【００４４】
(第４９群) B*1518 (exon 3)
F3: GTCTCACACCCTCCAGAGG
B3: AGCCACTCCACGCACTC
FIP:CGTGTCCGCCGCGG-GCGGGCATGACCAGTCC
BIP: GGCGGCTCAGATCACCC-CTCAGCTGCTCCGCCT
LF: TCCTTGCCGTCGTAGGC
LB: AGCGCAAGTGGGAGGC
(第５０群) B*0702, B* 6701 (exon 2)
F3: CATGAGGTATTTCTACACCTCCG
B3: TCGGTCAGTCTGTGCCTG
FIP: CTCTCGGACTCGCGGC-GGAGCCCCGCTTCATCT
BIP: AGAGGAGCCGCGGGC-GGCCTTGTAGATCTGTGTGTT
LP: GCTGTCGAACCTCACGAAC
LB: GAGCAGGAGGGGCCG
【００４５】
(第５１群) B*1301, B*1302 (exon 2)
F3: GCCCCGCTTCATCACC
B3: TAGCGGAGCGCGGTG
FIP: GCCATCCTCGGACTCGT-GGCTACGTGGACGACACC
BIP: CCGGGCGCCATGGATA-AGTCTGTGTGTTGGTCTTGG
LF: GCTGTCGAACCTCACGAAC
LB: GAGCAGGAGGGGCCG
(第５２群) B*1518, B*3904 (exon 2)
F3: TGAGGTATTTCTACACCGCCA
B3: TAGTAGCCGCGCAGGTTC
FIP: CTCTCGGACTCGCGGC-GGAGCCCCGCTTCATCT
BIP: AGAGGAGCCGCGGGC-AAGTCTGTGTGTTGGTCTTGC
LP: GCTGTCGAACCTCACGAAC
LB: GAGCAGGAGGGGCCG
【００４６】
(第５３群) B*4001, B*4002, B*4003, B*4006 (exon 2)
F3: CCCACTCCATGAGGTATTTCC
B3: GTAGCCGCGCAGGTTC
FIP: TTCCTCGGACTCGTGGC-AGCCCCGCTTCATCACC
BIP: AAGGAGCCGCGGGC-AAGTCTGTGTGTTGGTCTTGG
LF: GCTGTCGAACCTCACGAAC
LB: GAGCAGGAGGGGCCG
(第５４群) B*4402, B*4403 (exon 2)
F3: TCCCACTCCATGAGGTATTTCT
B3: TAGCGGAGCGCGGTG
FIP: TTCCTCGGACTCGTGGC-AGCCCCGCTTCATCACC
BIP: AAGGAGCCGCGGGC-AAGTCTGTGTGTTGGTCTTGG
LF: GCTGTCGAACCTCACGAAC
LB: GAGCAGGAGGGGCCG
【００４７】
(第５５群) B*1501, B*1507, B*1511 (exon 2)
F3: TGAGGTATTTCTACACCGCCA
B3: TAGTAGCCGCGCAGGTTC
FIP: GCCATCCTCGGACTCGC-GCCCCGCTTCATCGCA
BIP: CCGGGCGCCATGGATA-CGGTAAGTCTGTGTGTTGGT
LF: GCTGTCGAACCTCACGAAC
LB: GAGCAGGAGGGGCCG
(第５６群) B*2701 (exon 2)
F3: CCCACTCCATGAGGTATTTCC
B3: TAGCGGACCGCGGTG
FIP: CTCTCGGACTCGCGGC-AGCCCCGCTTCATCACC
BIP: AGAGGAGCCGCGGGC-CTGTGCCTTGGCCTTGC
LF: GCTGTCGAACCTCACGAAC
LB: GAGCAGGAGGGGCCG
【００４８】
(第５７群) B*3701 (exon 2)
F3: GAGGTATTTCCACACCTCCG
B3: GCAGGGTCCGCAGGTC
FIP: GTCCTCGGACTCGCGG-GGAGCCCCGCTTCATCT
BIP: CGGAGCCCCGGGCG-AGTCTGTGTGTTGGTCTTGG
LP: GCTGTCGAACCTCACGAAC
LB: GAGCAGGAGGGGCCG
【実施例】
【００４９】
以下、実施例を参照して本発明を具体的に説明する。
（実施例１）HLA-DRB1アリルの群特異的増幅
図１３〜２３に記載したDRB1遺伝子群を含有する試料に対して、各々、前記第１群から第１１群に対して設定したプライマーセットを用いて増幅を行ったところ、第１群から第１１群に属する各アリルの特異的増幅がみられた。
なおLoop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)による増幅反応は以下の終濃度の組成で、65℃で行った。
【００５０】
20 mM Tris-HCL(pH8.8)、10mM KCl、10mM (NH4)2SO4、0.1% Triton X-l00、1.6M Betain、 1.4mM each dNTP、8mM MgS04、Bst DNA Polymerase、1.6μM FIPプライマー、1．6μM BIPプライマー、0.8μM LFプライマー、0.8μM LBプライマー、0.2μM F3プライマー、0.2μM B3プライマー。
図１３〜２３に示した結果は、サイバ−グリーン存在下でLAMP法による対象アリル (例えば、図１３においてはDRBl*0101)を含む試料を増幅した結果である。各図における縦軸は増幅した2本鎖DNAにインターカレートしたサイバ−グリ−ン由来の蛍光強度で、蛍光強度が強いほどDNAが増幅していることを示す。横軸のサイクル数はl cycleがl分に相当する。
【００５１】
(実施例２)HLA-DQBlアリルの群特異的増幅
図２４〜３１に記載したHLA-DQBl遺伝子群を含有する試料に対して、各々、前記第１２群から第２０群 (第１９群は除く)に対して設定したプライマーセットを用いて増幅を行ったところ、各群に属するアリルの特異的増幅がみられた。
なお、増幅反応は実施例１と同様の条件で実施し、結果は図１３〜２３と同様にして表示した。
【００５２】
(実施例３)HLA-Aアリルの群特異的増幅
図３２及び３３に記載したHLA-A遺伝子群を含有する試料に対して、各々、前記第２５群及び第２７群に対して設定したプライマーセットを用いて増幅を行ったところ、各群に属するアリルの特異的増幅がみられた。
なお、増幅反応は実施例１と同様の条件で実施し、結果は図１３〜２３と同様にして表示した。
【００５３】
(実施例４)HLA-Cwアリルの群特異的増幅
図３４、３５及び３６に記載したHLA-Cw遺伝子群を含有する試料に対して、各々、前記第３２群、第３５群及び第３８群に対して設定したプライマーセットを用いて増幅を行ったところ、各群に属するアリルの特異的増幅がみられた。
なお、増幅反応は実施例１と同様の条件で実施し、結果は図１３〜２３と同様にして表示した。
【００５４】
(実施例５)HLA-Bアリルの群特異的増幅
図３７〜４３に記載したHLA-B遺伝子群を含有する試料に対して、各々、前記第３９群、第４０群、第４３群、第４４群、第４６群、第４７群及び第５７群に対して設定したプライマーセットを用いて増幅を行ったところ、各群に属するアリルの特異的増幅がみられた。
なお、増幅反応は実施例１と同様の条件で実施し、結果は図１３〜２３と同様にして表示した。
【００５５】
(比較例１)
前記第３群に属するDRBl*1402(及び1403)と、第７群に属するDRBl*1401(及び1405)とを用い、FIP及ぴBIPの5'末端のみに多型部位を配置したプライマーセットを使用して増幅反応を実施した（この方法は、前記従来方法に該当する)。
まず、DRBl*1402,1403、1401及び1405の塩基配列を図４４に示す。次いで、図４４に示すように、FIP及びBIPの5'末端に71番目の塩基が配置されるように各プライマーを設定した。これらのプライマーは、本発明に基づいて設定されたプライマーセット（図４及び図８)とは異なり、FIP及びBIPの5 '末端のみ(下記下線部）に多型性部位が存在する。
【００５６】
具体的には、以下のプライマーセノトを準備した。
第７群(DRBl*1401)増幅のためのブライマーセット
F3: CCGCCTGTGTGACTGGA
FIP: GTCCAGGAACCGCACCC-TCGTGTCCCCACAGCAC
BIP: CAGATACTTCCATAACCAGGAGGA-CCCAGCTCCGTCACCG
B3: AGGTCCTTCTGGCTGTTCC
LF: CACTCAGACGTAGAGTACTCCAA
LB: CAGCGACGTGGGGGAG
第３群(DRBl*1402)増幅のためのプライマーセット
F3: CCGCCTGTGTGACTGGA
FIP: CTCCAGGAACCGCACCC-TCGTGTCCCCACAGCAC
BIP: GAGATACTTCCATAACCAGGAGGAG-CCCAGCTCCGTCACCG
B3: AGGTCCTTCTGGCTGTTCC
LF: CACTCAGACGTAGAGTACTCCAA
LB: CAGCGACGTGGGGGAG
【００５７】
これらのプライマーセットにおいては、Tmをそろえるために第３群増幅のためのプライマーBIPのB1の3' 側を1塩基のばしてある。
なお、塩基配列の共通性から、DRBl*1401増幅のためのプライマーセットではDRBl*1405、DRBl*1407、DRBl*1402増幅のためのプライマーセットではDRBl*1403、DRBl*1406、DRBl*0301、DRBl*1301、DRBl*1302も増幅されると考えられる。
【００５８】
これらのプライマーセットを用いて、実施例１に示した条件で遺伝子増幅を実施した。その結果、FIP及 びBIPの5' 末端のみが異なり、他は同じ配列になるようにデザインしたプ ライマーセットを用いて増幅を行った場合、それぞれの遺伝子を特異的に増幅することはできなかった(図４５、図 ４６) 。
またDRBl*0803はどちらのプライマーセットでも増幅しているが、DRBl*14に比べ立ち上がりが遅く、一方 DRBl*0401は増幅されなかった。これらはプライマー部分の塩基配 列がDRB1*0803は DRBl*0401よりもDRBl*14との共通性が大きいためと考えられる(図 ４４) 。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】（ａ）LAMP法において使用されるプライマー等を示す説明図、（ｂ）LAMP法において生成されるダンベル型構造を示す模式図、及び（ｃ）LAMP法を用いた従来のSNPs検出方法を示す概略図である。
【図２】第１群のHLA-DRBl遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるプライマーの位置を示す図である。
【図３】第2群のHLA-DRBl遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるプライマーの位置を示す図である。
【図４】第3群のHLA-DRBl遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるプライマーの位置を示す図である。
【図５】第4群のHLA-DRBl遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるブライマーの位置を示す図である。
【図６】第5群のHLA-DRBl遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるブライマーの位置を示す図である。
【図７】第6群のHLA-DRBl遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるブライマーの位置を示す図である。
【図８】第７群のHLA-DRBl遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるプライマーの位置を示す図である。
【図９】第８群のHLA-DRBl遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるプライマーの位置を示す図である。
【図１０】第９群のHLA-DRBl遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるプライマーの位置を示す図である。
【図１１】第１０群のHLA-DRBl遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるプライマーの位置を示す図である。
【図１２】第１１群のHLA-DRBl遺伝子を特異的に増幅するための本発明によるプライマーの位置を示す図である。
【図１３】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第１群 (DRB1*0101)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図１４】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第２群 (DRB1*15)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図１５】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第３群 (DRB1*1402)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図１６】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第４群 (DRB1*0401)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図１７】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第５群 (DRB1*1101)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図１８】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第６群 (DRB1*1201)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図１９】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第７群 (DRB1*1405)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図２０】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第８群 (DRB1*0701)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図２１】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第９群 (DRB1*0803)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図２２】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第１０群 (DRB1*0901)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図２３】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第１１群 (DRB1*1001)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図２４】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第１２群 (DQB1*0202)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図２５】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第１３群 (DQB1*0302)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図２６】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第１４群 (DQB1*0401)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図２７】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第１５群 (DQB1*0501)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図２８】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第１６群 (DQB1*0502)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図２９】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第１７群 (DQB1*0503)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図３０】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第１８群 (DQB1*0601)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図３１】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第２０群 (DQB1*0604)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図３２】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第２５群 (A*2402)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図３３】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第２７群 (A*3001)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図３４】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第３２群 (Cw*0401)アリルの特異的増幅を示すクラフである。
【図３５】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第３５群 (Cw*0801)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図３６】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第３８群 (Cw*l502)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図３７】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第３９群 (B*5401、B5901)アリルの特異的増幅を示すクラフである。
【図３８】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第４０群 (B*l501、B*4601)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図３９】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第４３群 (B*3701)アリル(exon3)の特異的増幅を示すグラフである。
【図４０】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第４４群 (B*6701)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図４１】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第４６群 (B*5101)アリルの特異的増幅を示すクラフである。
【図４２】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第４７群 (B*4403)アリルの特異的増幅を示すグラフである。
【図４３】ヒト末梢血から抽出したDNAを用いた第５７群 (B*3701)アリル(exon2)の特異的増幅を示すグラフである。
【図４４】第３群及び第７群の遺伝子 (DRBl*1402、1403、1401及び1405)の塩基配列及び従来技術に基づいて設定したプライマーセットの位置を示す図である。
【図４５】従来技術に基づくプライマーセットを用いた遺伝子増幅の結果を示すグラフである。
【図４６】従来技術に基づくプライマーセットを用いた遺伝子増幅の結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の多型部位を有する特定の標的DNA配列を当該多型性の有無に応じて選択的に増幅する方法であって、
前記標的ＤＮＡ配列を含むと予測されるDNA試料に対してLoop-MediatedIsothermal Amplification(ＬＡＭＰ)法に基づく増幅反応を実施することを含み、
前記ＬＡＭＰ法において使用されるプライマーの3'未端領域及び5'末端領域の少なくとも2つが、前記複数の多型部位の少なくとも2つに相当する塩基配列又はそれの相補的な配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記プライマーの3'末端領域及び5'末端領域が、FIP及びBIPの5'末端領域および3'領域、F3およびB3の3'領域から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的ＤＮＡ配列がＨＬＡアリルの塩基配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の増幅方法を用いて多型部位の有無を検出することを含む、ＨＬＡのタイピング方法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか一項に記載の増幅方法を用いて多型部位の有無を検出することを含む、ＨＬＡアリルのグループ分け方法。
【請求項６】
複数の多型部位を有する特定の標的ＤＮＡ配列を含むと予測されるＤＮＡ試料に対してloop-MediatedIsothermalAmplification(ＬＡＭＰ)法に基づく増幅反応を実施するためのプライマーセットであって、その3'末端領域及び5'末端領域の少なくとも2つが、前記複数の多型部位の少なくとも2つに相当する塩基配列又はそれの相補的な配列を含むプライマーセットを含む、前記標的ＤＮＡ配列を前記多型性の有無に応じて選択的に増幅するためのキット。
【請求項７】
請求項６に記載のプライマーセットを含む、ＨＬＡタイピング又はＨＬＡアリルグループ分けのための測定キット。
【請求項１】
複数の多型部位を有する特定の標的DNA配列を当該多型性の有無に応じて選択的に増幅する方法であって、
前記標的ＤＮＡ配列を含むと予測されるDNA試料に対してLoop-MediatedIsothermal Amplification(ＬＡＭＰ)法に基づく増幅反応を実施することを含み、
前記ＬＡＭＰ法において使用されるプライマーの3'未端領域及び5'末端領域の少なくとも2つが、前記複数の多型部位の少なくとも2つに相当する塩基配列又はそれの相補的な配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記プライマーの3'末端領域及び5'末端領域が、FIP及びBIPの5'末端領域および3'領域、F3およびB3の3'領域から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的ＤＮＡ配列がＨＬＡアリルの塩基配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の増幅方法を用いて多型部位の有無を検出することを含む、ＨＬＡのタイピング方法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか一項に記載の増幅方法を用いて多型部位の有無を検出することを含む、ＨＬＡアリルのグループ分け方法。
【請求項６】
複数の多型部位を有する特定の標的ＤＮＡ配列を含むと予測されるＤＮＡ試料に対してloop-MediatedIsothermalAmplification(ＬＡＭＰ)法に基づく増幅反応を実施するためのプライマーセットであって、その3'末端領域及び5'末端領域の少なくとも2つが、前記複数の多型部位の少なくとも2つに相当する塩基配列又はそれの相補的な配列を含むプライマーセットを含む、前記標的ＤＮＡ配列を前記多型性の有無に応じて選択的に増幅するためのキット。
【請求項７】
請求項６に記載のプライマーセットを含む、ＨＬＡタイピング又はＨＬＡアリルグループ分けのための測定キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【公開番号】特開２００８−３０１７２５（Ｐ２００８−３０１７２５Ａ）
【公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１４９８１７（Ｐ２００７−１４９８１７）
【出願日】平成１９年６月５日（２００７．６．５）
【出願人】（５０４３８３５１９）ジェノダイブファーマ株式会社 (5)
【出願人】（０００１２５３６９）学校法人東海大学 (352)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月５日（２００７．６．５）
【出願人】（５０４３８３５１９）ジェノダイブファーマ株式会社 (5)
【出願人】（０００１２５３６９）学校法人東海大学 (352)
【Ｆターム（参考）】
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