観察装置及び培養観察装置
【課題】本発明は、無色の液滴をも検出することの可能な液滴の観察装置、及びそれを備えた培養観察装置を提供する。
【解決手段】本発明の観察装置は、透明な液滴（３０ａ）の形成された透明な部材（３０）を、その液滴より微細な明暗パターンを有した面光源（５２）で照明する照明手段と、前記面光源で照明された前記部材の透過像を撮像する撮像手段（５４）と、前記撮像手段が前記撮像で取得した明暗画像のパターンに基づき、その明暗画像における前記液滴の像の形成領域を検出する演算手段とを備える。
【解決手段】本発明の観察装置は、透明な液滴（３０ａ）の形成された透明な部材（３０）を、その液滴より微細な明暗パターンを有した面光源（５２）で照明する照明手段と、前記面光源で照明された前記部材の透過像を撮像する撮像手段（５４）と、前記撮像手段が前記撮像で取得した明暗画像のパターンに基づき、その明暗画像における前記液滴の像の形成領域を検出する演算手段とを備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、透明な培養容器や透明な基板に形成された透明な液滴を観察する観察装置、及びそれを備えた培養観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養や化学反応計測の分野では、数μｌ〜数十μｌの液滴中の実験（微量反応系の実験）が要求されることがある。生殖補助医療技術（ＡＲＴ）の分野では、ディッシュと呼ばれる培養容器の底面上に形成された液滴中で卵細胞や精子細胞を操作したり、受精卵を培養したりすることが一般的である。
【０００３】
通常、実験用の液滴はフェノールレッド等のｐＨ指示薬で色づけされているので、透明な培養容器中の透明な液滴の存在位置を見出すことは容易である。なお、特許文献１には液滴のサイズを自動検出する装置が開示されているが、その自動検出も、液滴が色づけされていれば容易である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−８８０３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、臨床用の液滴の色付けは避けるべきなので、無色のままで使用せざるを得ない。よって、その場合は、培養容器内で液滴の存在位置を見出すことは困難である。
【０００６】
そこで本発明は、無色の液滴をも検出することの可能な液滴の観察装置、及びそれを備えた培養観察装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の観察装置は、透明な液滴の形成された透明な部材を、その液滴より微細な明暗パターンを有した面光源で照明する照明手段と、前記面光源で照明された前記部材の透過像を撮像する撮像手段と、前記撮像手段が前記撮像で取得した明暗画像のパターンに基づき、その明暗画像における前記液滴の像の形成領域を検出する演算手段とを備える。
【０００８】
本発明の培養観察装置は、本発明の観察装置と、前記観察装置の観察対象となった前記部材の位相差顕微鏡画像を、その観察装置よりも狭い視野で取得する位相差顕微鏡と、前記位相差顕微鏡の視野に対する前記部材の位置を前記検出の結果に応じて制御することにより、前記液滴を前記位相差顕微鏡の視野で補足する位置制御手段と、前記観察装置及び前記位相差顕微鏡の観察対象である前記部材を収容する恒温室とを備える。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、無色の液滴をも検出することの可能な液滴の観察装置、及びそれを備えた培養観察装置が実現する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】インキュベータの正面図。
【図２】正面扉１８が開放されたときにおけるインキュベータの正面図。
【図３】観察ユニット２８の構成を示す概略図。
【図４】インキュベータ１１の回路ブロック図。
【図５】全体観察用の観察系に配置された培養容器３０を示す図。
【図６】ストライプ状の面光源の例。
【図７】登録モードにおける制御ユニット１４の動作フローチャート。
【図８】全体画像Ｉｗｈｏｌｅの例。
【図９】全体画像Ｉｗｈｏｌｅ’の例。
【図１０】ドロップ番号の付与された全体画像Ｉｗｈｏｌｅ’の例。
【図１１】観察モードにおける制御ユニット１４の動作フローチャート。
【図１２】チェッカーフラッグ状の面光源の例。
【図１３】格子状の面光源の例。
【図１４】チェッカーフラッグ状の面光源を採用した場合の全体画像Ｉｗｈｏｌｅの例。
【図１５】格子状の面光源を採用した場合の全体画像Ｉｗｈｏｌｅの例。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態を説明する。本実施形態はインキュベータの実施形態である。
【００１２】
先ず、本実施形態のインキュベータの構造を説明する。
【００１３】
図１は、本実施形態のインキュベータの正面図であり、図２は、正面扉１８が開放されたときにおけるインキュベータの正面図である。図１，図２に示すとおり、インキュベータ１１は、生体細胞の培養を行う第１筐体１２と、制御ユニット１４を収納する第２筐体１３とを有しており、第１筐体１２は第２筐体１３の上部に配置される。
【００１４】
第２筐体１３の前面には操作パネル５６が設けられており、その操作パネル５６には、モニタや入力釦などが設けられている。第２筐体１３の内部には、制御ユニット１４と、観察ユニット２８の一部とが配置される。
【００１５】
第１筐体１２の内部には、断熱材で覆われた恒温室１５（図２）が形成されている。この恒温室１５は、第１筐体１２の正面に形成された正面開口１６（図２）と、第１筐体１２の左側面に形成された搬出入口１７（図２）とによって外部と連絡している。このうち正面開口１６（図２）は、観音開きの正面扉１８によって開閉可能であり、搬出入口１７（図２）は、スライド式の自動扉１９（図１）によって開閉可能である。なお、搬出入口１７のサイズは培養容器３０（図２）が通過可能なサイズに設定されている。また、第１筐体１２の底面には、正面側からみて右寄りの位置に開口２０（図２）が形成されており、その開口２０（図２）から観察ユニット２８の一部が突設されている。
【００１６】
恒温室１５の壁面には、温度調整装置、噴霧装置、ガス導入部、環境センサユニットなどが内蔵されている。このうち温度調整装置はペルチェ素子を有しており、ペルチェ効果によって恒温室１５（図２）の加熱または冷却を行う。噴霧装置は、恒温室１５（図２）内に噴霧を行って恒温室１５（図２）内の湿度を調整する。ガス導入部は、インキュベータ外の二酸化炭素ボンベと接続されており、その二酸化炭素ボンベから恒温室１５（図２）へと二酸化炭素を導入することにより、恒温室１５（図２）内の二酸化炭素濃度を調整する。環境センサユニットは、恒温室１５（図２）内の温度、湿度、二酸化炭素濃度をそれぞれ検出する。
【００１７】
第１筐体１２の内部には、ストッカー２５と、容器搬出入機構２６（図２）と、容器搬送機構２７とが配置され、前述したとおり観察ユニット２８の一部も配置されている。
【００１８】
ストッカー２５の配置箇所は、第１筐体１２の正面からみて恒温室１５（図２）の左側である。ストッカー２５は、複数の棚を有しており、各々の棚に培養容器３０を収納することができる。ストッカー２５の最下段は、第１筐体１２の搬出入口１７（図２）に連続しており、その最下段のスペースには、培養容器３０を搬出入するための容器搬出入機構
２６（図２）が設置される。
【００１９】
容器搬送機構２７の配置箇所は、第１筐体１２の正面からみて恒温室１５（図２）の中央である。この容器搬送機構２７は、ストッカー２５、容器搬出入機構２６（図２）、観察ユニット２８との間で培養容器３０（図２）の受け渡しを行う。
【００２０】
観察ユニット２８の配置箇所は、第１筐体１２の正面からみて恒温室１５（図２）の右側である。この観察ユニット２８は、試料台４７（図２）と、試料台４７（図２）の上方に張り出したアーム４８（図２）と、本体部分４９（図２）とを有している。このうち試料台４７（図２）及びアーム４８（図２）が第１筐体１２の恒温室１５（図２）の側に位置し、本体部分４９（図２）が第２筐体１３の側に位置している。
【００２１】
図３は、観察ユニット２８の構成を示す概略図である。図３に示すとおり、観察ユニット２８は、試料台４７と、第１照明部５１と、第２照明部５２と、顕微観察部５３と、容器観察部５４と、画像処理部５５とを有している。
【００２２】
このうち、顕微観察部５３は本体部分４９に内蔵されており、照明部５１は、アーム４８のうち、顕微観察部５３と対向する位置に配置される。これらの顕微観察部５３と第１照明部５１とが位相差観察用の観察系を構成する。
【００２３】
また、容器観察部５４はアーム４８に収納されており、第２照明部５２は、本体部分４９のうち、容器観察部５４と対向する位置に配置される。これらの容器観察部５４と第２照明部５２とが全体観察用の観察系を構成する。
【００２４】
試料台４７は、透明な部材で構成されており、その上に培養容器３０が載置される。この試料台４７は、高精度なステージからなり、培養容器３０を水平方向（ＸＹ方向）に移動させることにより、培養容器３０を位相差観察用の顕微鏡（顕微観察部５３及び第１照明部５１）の光路へ挿入したり、全体観察用の観察系（容器観察部５４及び第２照明部５２）の光路へ挿入したりすることができる。
【００２５】
また、試料台４７は、培養容器３０と位相差観察用の顕微鏡との間のＺ方向の位置関係を変化させることにより、位相差観察用の顕微鏡の焦点調節を行うことができる。また、試料台４７は、培養容器３０と位相差観察用の顕微鏡とのＸＹ方向の位置関係を変化させることにより、位相差観察用の顕微鏡の観察ポイントを変更することができる。
【００２６】
観察ユニット２８は、培養容器３０を全体観察用の観察系（容器観察部５４及び第２照明部５２）の光路へ挿入した状態で、培養容器３０の全体像を撮像することができる。以下、この撮像によって取得される画像を「全体画像」という。
【００２７】
また、観察ユニット２８は、培養容器３０を位相差観察用の顕微鏡（顕微観察部５３及び第１照明部５１）の光路へ挿入した状態で、培養容器３０の一部の拡大位相差像を撮像することができる。以下、この撮像によって取得される画像を「位相差画像」という。
【００２８】
なお、顕微観察部５３の対物レンズ６１及び位相フィルタ６２の組み合わせは、観察倍率の異なる複数種類の組み合わせの間で切り替えることが可能である。例えば、対物レンズ６１及び位相フィルタ６２の組み合わせは、２倍観察用の組み合わせ（対物レンズ６１ｌｏｗ及び位相フィルタ６２ｌｏｗ）と、４倍観察用の組み合わせ（対物レンズ６１ｈｉｇｈ及び位相フィルタ６２ｈｉｇｈ）との間で切り替わる。
【００２９】
観察ユニット２８は、対物レンズ６１ｌｏｗ及び位相フィルタ６２ｌｏｗを光路に設定した状態で倍率２倍の位相差画像（低倍位相差画像）を取得することができ、対物レンズ６１ｈｉｇｈ及び位相フィルタ６２ｈｉｇｈを光路に設定した状態で倍率４倍の位相差画像（高倍位相差画像）を取得することができる。
【００３０】
画像処理部５５は、観察ユニット２８が取得した画像（全体画像、低倍位相差画像、高倍位相差画像）に対して各種の画像処理を施す。なお、画像処理部５５が実行可能な画像処理には、分散フィルタ処理（後述）やパターンマッチング処理（後述）などがある。
【００３１】
次に、インキュベータ１１の電気系統を説明する。
【００３２】
図４は、インキュベータ１１の回路ブロック図である。図４に示すとおり、インキュベータ１１の制御ユニット１４は、自動扉１９の扉開閉機構１９ａ、温度調整装置２１、噴霧装置２２、ガス導入部２３、環境センサユニット２４、容器搬出入機構２６、容器搬送機構２７、観察ユニット２８、モニタ５６ａ、入力釦５６ｂとそれぞれ接続されている。
【００３３】
制御ユニット１４は、所定の制御プログラムに従ってインキュベータ１１の各部を統括的に制御する。一例として、制御ユニット１４は、温度調整装置２１、噴霧装置２２、ガス導入部２３、環境センサユニット２４をそれぞれ制御して恒温室１５内を所定の環境条件に維持する。また、制御ユニット１４は、ユーザが入力した観察スケジュールに基づいて、観察ユニット２８および容器搬送機構２７を制御して、培養容器３０の観察シーケンスを自動的に実行する。
【００３４】
なお、本実施形態のインキュベータ１１には、観察に関する制御ユニット１４の動作モードとして、後述する「登録モード」や「観察モード」が搭載されているものとする。また、制御ユニット１４は、ハードディスクや不揮発性メモリなどで構成された記憶部１４ａを有しており、後述する各種のデータを記憶しておくこともできる。
【００３５】
次に、本実施形態の培養容器３０及び全体観察用の観察系を詳しく説明する。
【００３６】
図５は、全体観察用の観察系に配置された培養容器３０を示す図である。図５に示すとおり培養容器３０は、蓋付きの透明なディッシュである。培養容器３０の底面には、２０〜２５μｌ程度の透明な培養液滴（培地ドロップ）３０ａが複数個形成されており、個々の培地ドロップ３０ａの中で受精卵３０ｃが１個ずつ生育している。
【００３７】
個々の培地ドロップ３０ａの表面及び間隙は、乾燥を防ぐため透明のミネラルオイル３０ｂで満たされている。ミネラルオイル３０ｂの屈折率は例えば１．４６７であり、培地ドロップ３０ａの屈折率は例えば１．３３３である。また、培養容器３０の直径は、約３５ｍｍであり、個々の培地ドロップ３０ａの直径は、６〜７ｍｍ程度であり、個々の受精卵ａの直径は、１００μｍ程度である。
【００３８】
なお、複数の培地ドロップ３０ａのサイズ、及びそれらの配列パターンは未知であっても構わない。また、複数の培地ドロップ３０ａの各々は、フェノールレッドにより色付けされていても、無色であってもどちらでも構わない。但し、本実施形態では、個々の培地ドロップ３０ａは、培養容器３０の底面に付着しており、観察期間中に培養容器３０内を移動する可能性は無いものと仮定する。また、本実施形態では、複数の培地ドロップ３０ａのサイズは、培養容器３０内ではほぼ共通と仮定する。
【００３９】
全体観察用の観察系を構成する第２照明部５２は、培養容器３０の底面側に配置され、全体間接用の観察系を構成する容器観察部５４は、培養容器３０の上面側に配置される。
【００４０】
第２照明部５２は、バックライト付きの透過型液晶パネルからなり、容器観察部５４は、結像光学系５４ｂと、撮像素子５４ａとを備える。なお、撮像素子５４ａは、カラー撮像素子であってもモノクロ撮像素子であっても構わない。
【００４１】
透過型液晶パネルである第２照明部５２は、明部と暗部とを繰り返し配置したバイナリパターン（ここでは、ストライプパターンとする。）を表示する。この状態で、第２照明部５２上にはストライプ状の面光源（図６参照）が形成される。
【００４２】
面光源のストライプパターンは、培地ドロップ３０ａの直径（６〜７ｍｍ）と比較して十分に微細であり、培地ドロップ３０ａの直径サイズ内に少なくとも２周期分のストライプを配している。このストライプパターンの周期（面光源のストライプピッチ）は、例えば、１ｍｍ程度に設定される。なお、面光源のストライプピッチは、制御ユニット１４によって制御可能であり、所定範囲内（例えば０．５〜２ｍｍの範囲内）で可変である。
【００４３】
結像光学系５４ｂの視野は十分に大きく設定されており、その視野内に培養容器３０の全体が収まる。この結像光学系５４ｂにより、撮像素子５４ａの撮像面と培養容器３０の底面近傍とは、光学的に共役な関係に結ばれている。この構成により、容器観察部５４は、培養容器３０の全体画像を取得することができる。
【００４４】
第２照明部５２から培養容器３０までの間隔は、少なくとも容器観察部５４がストライプパターンを分解できる程度の間隔に設定されている。
【００４５】
次に、本実施形態の登録モードにおける制御ユニット１４の動作を説明する。
【００４６】
図７は、登録モードにおける制御ユニット１４の動作フローチャートである。なお、登録モードの開始時点では、前述した面光源のストライプピッチは可変範囲の最大値に設定されているものと仮定する。
【００４７】
ステップＳ１１：制御ユニット１４は、ユーザの操作に応じて培養容器３０を恒温室１５へ搬入すると共に、培養容器３０の搬送を容器搬送機構２７へ指示する。容器搬送機構２７は、その培養容器３０を搬送し、試料台４７の所定位置へ載置する。
【００４８】
ステップＳ１２：制御ユニット１４は、培養容器３０の全体画像を取得するよう観察ユニット２８へ指示する。観察ユニット２８は、試料台４７を駆動して培養容器３０を全体観察用の観察系（容器観察部５４及び第２照明部５２）の光路へ配置し、その状態で培養容器３０の全体画像Ｉｗｈｏｌｅを取得し、その全体画像Ｉｗｈｏｌｅをモニタ５６ａへ表示する（図８参照）。
【００４９】
図８に示すとおり、全体画像Ｉｗｈｏｌｅには、面光源のストライプパターンが反映されている。但し、図５に示したとおり培地ドロップ３０ａは、ミネラルオイル３０ｂとの界面は曲面になっているため、培地ドロップ３０ａは通過光束に対してレンズ作用を及ぼす。このため、図８に示すとおり全体画像Ｉｗｈｏｌｅのうち培地ドロップ３０ａに対応した領域に現れるストライプパターンのストライプピッチは、他の領域に現れるストライプパターンのストライプピッチよりも狭くなる。その結果、全体画像Ｉｗｈｏｌｅ上では培地ドロップ３０ａの像が可視化される。
【００５０】
ステップＳ１３：制御ユニット１４は、ステップＳ１２で取得された全体画像Ｉｗｈｏｌｅへ分散フィルタ処理を施すよう画像処理部５５へ指示する。画像処理部５５は、全体画像Ｉｗｈｏｌｅ上で着目画素をシフトさせながら、着目領域を中心とする局所領域（例えば３×３画素の局所領域）の標準偏差へ着目画素の画素値を置換する処理を繰り返し、分散フィルタ処理後の全体画像Ｉｗｈｏｌｅ’を取得する。この全体画像Ｉｗｈｏｌｅ’は、制御ユニット１４へ送出され、制御ユニット１４によってモニタ５６ａへ表示される（図９参照）。
【００５１】
ここで、本ステップの分散フィルタ処理には、全体画像Ｉｗｈｏｌｅのうち、輝度の段差部（明暗のエッジ）を多く含む領域の平均輝度値を高める効果がある。よって、全体画像Ｉｗｈｏｌｅ’のうちストライプピッチが狭い領域の平均輝度値、すなわち、培地ドロップ３０ａの像の平均輝度値は、他の領域の平均輝度値よりも高くなる。よって、全体画像Ｉｗｈｏｌｅ’上では培地ドロップ３０ａの像が強調されることになる。
【００５２】
ステップＳ１４：制御ユニット１４は、ステップＳ１３で取得された全体画像Ｉｗｈｏｌｅ’に対してパターンマッチング処理を施すよう画像処理部５５へ指示する。画像処理部５５は、予め記憶している基準パターン（下述）との相関が一定以上となる１又は複数の任意サイズの領域を全体画像Ｉｗｈｏｌｅ’の中から検出し、検出した１又は複数の領域の輪郭線を、ドロップ像の輪郭線（以下、「エッジ画像」と称す。）として制御ユニット１４へ送出する。
【００５３】
ここで、本ステップの基準パターンは、本装置の製造者又はユーザが予め行った測定（又はシミュレーション）によって取得されたものである。その測定（又はシミュレーション）では、比較的小サイズの基準培地ドロップが形成された培養容器と、面光源のストライプピッチが最大値に設定された本装置とを用意（想定）し、その装置に全体画像Ｉｗｈｏｌｅ’を取得させ、その全体画像Ｉｗｈｏｌｅ’に現れた基準培地ドロップの像を、基準パターンとすればよい。
【００５４】
ステップＳ１５：制御ユニット１４は、ステップＳ１４においてドロップ像が検出されたか否かを判別し、検出されなかった場合は面光源のストライプピッチを変更するべくステップＳ１６へ移行し、検出された場合は培養容器３０の登録を行うべくステップＳ１７へ移行する。
【００５５】
なお、培地ドロップ３０ａのサイズが基準培地ドロップのサイズと近かった場合には、培地ドロップ３０ａの像に現れるストライプの本数が基準培地ドロップの像に現れるストライプの本数と同じになるので、１回目のパターンマッチングでドロップ像が検出される。一方、培地ドロップ３０ａのサイズが基準培地ドロップのサイズより一定以上大きかった場合には、培地ドロップ３０ａの像に現れるストライプの本数が基準培地ドロップの像に現れるストライプの本数より多くなるため、１回目のパターンマッチングでドロップ像が検出できない可能性がある。本実施形態では、ステップＳ１４でドロップ像が検出されなかった場合には、面光源のストライプピッチを変更し、全体画像Ｉｗｈｏｌｅの再取得を試みる。
【００５６】
ステップＳ１６：制御ユニット１４は、面光源のストライプピッチを１段階だけ小さい値に変更してからステップＳ１２へ戻る。このように面光源のストライプピッチを小さい値に変更すれば、培地ドロップ３０ａの像に現れるストライプの本数を基準パターンにおけるストライプの本数と同じにすることができるので、次のパターンマッチングでドロップ像を検出できる可能性が高まる。
【００５７】
ステップＳ１７：制御ユニット１４は、ステップＳ１４で取得したエッジ画像を、モニタ５６ａ上の全体画像Ｉｗｈｏｌｅ’に対して重畳表示する（図１０参照）。
【００５８】
また、本ステップにおける制御ユニット１４は、エッジ画像に含まれる１又は複数のドロップ像の各々に対して個別のドロップ番号ｉを順番にラベリングする。これによって、制御ユニット１４は、培養容器３０に形成された培地ドロップ３０ａの総数（すなわちドロップ番号ｉの最終値）を既知とする。以下、図１０に示したとおり培地ドロップ３０ａの総数（すなわちドロップ番号ｉの最終値）を「８」と仮定する。
【００５９】
また、本ステップにおける制御ユニット１４は、エッジ画像に含まれる８個のドロップ像の各々のサイズを計算し、それらサイズの平均値を培養容器３０に関する平均ドロップサイズとして求める。
【００６０】
また、本ステップにおける制御ユニット１４は、エッジ画像に含まれる８個のドロップ像の各々の中心座標（ｘ１，ｙ１）〜（ｘ８，ｙ８）を算出し、それらの中心座標（ｘ１，ｙ１）〜（ｘ８，ｙ８）を、位相差観察用の試料台座標（ｘ１’，ｙ１’）〜（ｘ８’，ｙ８’）へと変換する。ここで、試料台座標（ｘｉ’，ｙｉ’）は、ｉ番目の培地ドロップ３０ａを位相差観察用の顕微鏡の視野中心に配置するための試料台座標である。
【００６１】
また、本ステップにおける制御ユニット１４は、培養容器３０の観察スケジュール（タイムラプス観察の時間間隔、観察期間など）をユーザに入力させる。
【００６２】
そして、本ステップにおける制御ユニット１４は、培養容器３０に関する以上の情報、すなわち、ラベリング済みのエッジ画像と、ドロップ番号ｉの最終値（ここでは８）と、平均ドロップサイズと、試料台座標（ｘ１’，ｙ１’）〜（ｘ８’，ｙ８’）と、観察スケジュールとを、培養容器３０の管理データとして記憶部１４ａへ記憶する。これによって、培養容器３０の登録が完了する。
【００６３】
ステップＳ１８：制御ユニット１４は、ドロップ番号ｉを初期値「１」に設定する。
【００６４】
ステップＳ１９：制御ユニット１４は、ドロップ番号ｉに対応する試料台座標（ｘｉ’，ｙｉ’）を記憶部１４ａから読み出し、その試料台座標（ｘｉ’，ｙｉ’）を観察ユニット２８へ指定すると共に、位相差画像を取得するよう観察ユニット２８へ指示する。観察ユニット２８は、培養容器３０を位相差観察用の顕微鏡（顕微観察部５３及び第１照明部５１）の光路へ挿入し、対物レンズ６１及び位相フィルタ６２の組み合わせを対物レンズ６１ｌｏｗ及び位相フィルタ６２ｌｏｗの組み合わせに設定し、試料台４７を試料台座標（ｘｉ’，ｙｉ’）へ配置し、その状態において低倍位相差画像を取得し、その低倍位相差画像を、ｉ番目の培地ドロップ３０ａのドロップ画像Ｉｄｉとして制御ユニット１４へ送出する。
【００６５】
なお、ｉ番目の培地ドロップ３０ａのサイズが大きい場合には、培地ドロップの像が低倍位相差画像Ｉｄｉに収まらない可能性がある。そこで、本ステップの制御ユニット１４は、培養容器３０の平均ドロップサイズを閾値と比較し、平均ドロップサイズが閾値以上であった場合には、試料台４７を試料台座標（ｘｉ’，ｙｉ’）の周辺でステップ状に移動させながら４枚の低倍位相差画像を取得するよう観察ユニット２８へ指示を出し、観察ユニット２８が取得した４枚の低倍位相差画像を繋ぎ合わせることにより、１枚のドロップ画像Ｉｄｉを取得することが望ましい。
【００６６】
さらに、本ステップの制御ユニット１４は、その培地ドロップ画像Ｉｄｉの中から受精卵３０ｃの像を探索し、その受精卵３０ｃを視野中心に配置した状態で高倍位相差画像を取得するよう観察ユニット２８へ指示を出し、観察ユニット２８が取得した高倍位相差画像を、ｉ番目の培地ドロップ３０ａの卵画像として取得してもよい。
【００６７】
そして、本ステップの制御ユニット１４は、本ステップで取得した位相差画像を、ｉ番目の培地ドロップの詳細画像としてモニタ５６ａへ表示する。
【００６８】
ステップＳ１１１：制御ユニット１４は、ステップＳ１９で取得した詳細画像を、現在の日時及び現在のドロップ番号ｉに対応付けた上で、培養容器３０の観察データとして記憶部１４ａへ記憶する。
【００６９】
ステップＳ１１２：制御ユニット１４は、ドロップ番号ｉが最終値（ここでは「８」）に達したか否かを判別し、達していなかった場合にはステップＳ１１３へ移行し、達していた場合にはステップＳ１１４へ移行する。
【００７０】
ステップＳ１１３：制御ユニット１４は、ドロップ番号ｉをインクリメントしてからステップＳ１９へ戻る。
【００７１】
ステップＳ１１４：制御ユニット１４は、培養容器３０をストッカー２５へ収納するよう容器搬送機構２７へ指示する。容器搬送機構２７は、培養容器３０をストッカー２５へ収納する。
【００７２】
次に、本実施形態の観察モードにおける制御ユニット１４の動作を説明する。
【００７３】
図１１は、観察モードにおける制御ユニット１４の動作フローチャートである。なお、観察モードは、登録モードの実行後に自動的に開始されるものとする。
【００７４】
ステップＳ２１：制御ユニット１４は、培養容器３０の管理データに書き込まれた観察スケジュールと現在日時とを比較して、培養容器３０の観察開始時期が到来したか否かを判別する。観察開始時期が到来した場合にはステップＳ２２に移行し、観察開始時期が到来していない場合には待機する。
【００７５】
ステップＳ２２：制御ユニット１４は、培養容器３０の搬送を容器搬送機構２７に指示する。容器搬送機構２７は、培養容器３０をストッカー２５から搬出して試料台４７の所定位置に載置する。
【００７６】
ステップＳ２３：制御ユニット１４は、ドロップ番号ｉを初期値「１」に設定する。
【００７７】
ステップＳ２４：制御ユニット１４は、上述したステップＳ１９と同様にｉ番目の培地ドロップ３０ａの詳細画像を取得し、それをモニタ５６ａへ表示する。
【００７８】
ステップＳ２５：制御ユニット１４は、ステップＳ２４で取得した詳細画像を、現在の日時及び現在のドロップ番号ｉに対応付けた上で、培養容器３０の観察データとして記憶部１４ａへ記憶する。
【００７９】
ステップＳ２６：制御ユニット１４は、ドロップ番号ｉが最終値（ここでは「８」）に達したか否かを判別し、達していなかった場合にはステップＳ２７へ移行し、達していた場合にはステップＳ２８へ移行する。
【００８０】
ステップＳ２７：制御ユニット１４は、ドロップ番号ｉをインクリメントしてからステップＳ２４へ戻る。
【００８１】
ステップＳ２８：制御ユニット１４は、培養容器３０をストッカー２５へ収納するよう容器搬送機構２７へ指示する。容器搬送機構２７は、培養容器３０をストッカー２５へ収納する。
【００８２】
ステップＳ２９：制御ユニット１４は、培養容器３０の管理データに書き込まれた観察スケジュールと現在日時とを比較して、培養容器３０の観察終了時期が到来したか否かを判別する。観察終了時期が到来した場合にはその旨をモニタ５６ａへ表示してからフローを終了し、観察終了時期が到来していない場合にはステップＳ２１へ戻る。
【００８３】
以上、本実施形態の観察ユニット２８は、培養容器３０の全体画像Ｉｗｈｏｌｅを取得する際に、培地ドロップ３０ａよりも十分に微細な明暗パターンを有した面光源を採用する。よって、培地ドロップ３０ａが仮に無色であったとしても、全体画像Ｉｗｈｏｌｅ上で培地ドロップ３０ａの像は可視化される。
【００８４】
したがって、本実施形態の画像処理部５５は、その全体画像Ｉｗｈｏｌｅからドロップ像を検出することが可能である。特に、本実施形態の画像処理部５５は、パターンマッチング処理を全体画像Ｉｗｈｏｌｅへ施すので、ドロップ像の検出を高確度で行うことができる。
【００８５】
また、本実施形態の制御ユニット１４は、画像処理部５５がドロップ像の検出に失敗した場合には、面光源の明暗パターンのピッチを変更してから全体画像の取得及びドロップ像の検出を再度実行するので、ドロップ像を、そのサイズに依らず確実に検出することができる。
【００８６】
また、本実施形態の制御ユニット１４は、ドロップ像を強調するための画像処理（ここでは空間フィルタ処理の一種である分散フィルタ処理）をパターンマッチングの前に全体画像Ｉｗｈｏｌｅへ施すので、パターンマッチングの確度をより高めることができる。
【００８７】
また、本実施形態の観察ユニット２８は、面光源の明暗パターンとしてストライプパターンを採用するので、画像処理部５５は、ドロップ像の検出をシンプルな演算で確実に行うことが可能である。
【００８８】
また、本実施形態の制御ユニット１４は、ドロップ像の検出結果に応じて詳細画像の取得内容（試料台の配置先や位相差画像の取得手順など）を決定するので、詳細画像の取得を効率的に行うことができる。
【００８９】
なお、本実施形態の面光源は、ストライプパターン状であったが、均一輝度の面光源に変更することも可能なので、本実施形態の観察ユニット２８は、ストライプパターンの反映されていない培養容器３０の全体画像（つまり、培養容器３０の単なる透過観察画像）を取得することも可能である。よって、本実施形態の制御ユニット１４は、上述したステップＳ１２において全体画像Ｉｗｈｏｌｅと透過観察画像との双方を取得し、上述したステップＳ１７において他の管理データと共にその透過観察画像を記憶部１４ａへ記憶してもよい。
【００９０】
また、本実施形態の制御ユニット１４は、全体画像Ｉｗｈｏｌｅの取得時にストライプ状の面光源を採用したが、明部と暗部とを繰り返し配置した他種の面光源を採用してもよい。例えば、図１２に示すようなチェッカーフラッグ状の面光源や、図１３に示すような格子状の面光源を採用してもよい。因みに、チェッカーフラッグ状の面光源を採用した場合の全体画像Ｉｗｈｏｌｅの一例は、図１４に示すとおりであり、格子状の面光源を採用した場合の全体画像Ｉｗｈｏｌｅの一例は、図１５に示すとおりとなる。何れの場合も、培地ドロップ３０ａの像を可視化することができる。但し、面光源の種類を変更する場合には、画像処理部５５が予め記憶する基準パターンも変更する必要がある。
【００９１】
また、本実施形態の画像処理部５５は、パターンマッチングの前に全体画像Ｉｗｈｏｌｅへ施す画像処理を分散フィルタ処理としたが、他種の空間フィルタ処理や、空間フィルタ処理以外の画像処理としてもよい。例えば、全体画像Ｉｗｈｏｌｅを基準全体画像から減算する差分処理としてもよい。
【００９２】
ここで、基準全体画像は、本装置の製造者又はユーザが予め行った測定（又はシミュレーション）によって取得されたものである。その測定（又はシミュレーション）では、培地ドロップの形成されていない基準培養容器と、面光源のストライプピッチが最大値に設定された本装置とを用意（想定）し、その装置に全体画像Ｉｗｈｏｌｅを取得させ、その全体画像Ｉｗｈｏｌｅを、基準全体画像とすればよい。
【００９３】
但し、空間フィルタ処理の種類又は画像処理の種類を変更する場合には、画像処理部５５が予め記憶する基準パターンも変更する必要がある。
【００９４】
また、本実施形態の位相差観察用の顕微鏡は、位相差観察の観察倍率を２倍と４倍との間で切り換えたが、２倍と４倍と４０倍の間で切り換えてもよい。因みに、４０倍の観察倍率は、受精卵３０ｃの画像を高精細に取得するのに適している。
【００９５】
また、本実施形態では、培養容器３０としてディッシュを使用したが、他種の培養容器を使用してもよい。何れの場合も、液滴の形成先（滴下先）が透明な部材でありさえすれば、本実施形態と同様の観察が可能である。なお、本明細書では文言「透明」を、「可視光に対して透明」の意味で使用した。
【００９６】
また、本実施形態において、制御ユニット１４の動作の一部又は全部は、インキュベータに外付けされたコンピュータによって実行されてもよい。また、本実施形態において、画像処理部５５の動作の一部又は全部は、インキュベータに外付けされたコンピュータによって実行されてもよい。
【００９７】
また、本実施形態では、本発明の観察装置を培養観察装置に適用したものを説明したが、本発明の観察装置は、培養観察装置以外の装置、例えば化学反応計測装置や液滴形成装置などにも適用することが可能である。
【符号の説明】
【００９８】
１１…インキュベータ，１２…第１筐体，１３…第２筐体，５６…操作パネル，１４…制御ユニット，２８…観察ユニット，１５…恒温室，１６…正面開口，１７…搬出入口，１８…正面扉，１７…搬出入口，１９…自動扉１９，３０…培養容器，２０…開口，４７…試料台，５１…第１照明部，５２…第２照明部，５３…顕微観察部，５４…容器観察部，５５…画像処理部，４９…本体部分，６１…対物レンズ，６２…位相フィルタ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、透明な培養容器や透明な基板に形成された透明な液滴を観察する観察装置、及びそれを備えた培養観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養や化学反応計測の分野では、数μｌ〜数十μｌの液滴中の実験（微量反応系の実験）が要求されることがある。生殖補助医療技術（ＡＲＴ）の分野では、ディッシュと呼ばれる培養容器の底面上に形成された液滴中で卵細胞や精子細胞を操作したり、受精卵を培養したりすることが一般的である。
【０００３】
通常、実験用の液滴はフェノールレッド等のｐＨ指示薬で色づけされているので、透明な培養容器中の透明な液滴の存在位置を見出すことは容易である。なお、特許文献１には液滴のサイズを自動検出する装置が開示されているが、その自動検出も、液滴が色づけされていれば容易である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−８８０３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、臨床用の液滴の色付けは避けるべきなので、無色のままで使用せざるを得ない。よって、その場合は、培養容器内で液滴の存在位置を見出すことは困難である。
【０００６】
そこで本発明は、無色の液滴をも検出することの可能な液滴の観察装置、及びそれを備えた培養観察装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の観察装置は、透明な液滴の形成された透明な部材を、その液滴より微細な明暗パターンを有した面光源で照明する照明手段と、前記面光源で照明された前記部材の透過像を撮像する撮像手段と、前記撮像手段が前記撮像で取得した明暗画像のパターンに基づき、その明暗画像における前記液滴の像の形成領域を検出する演算手段とを備える。
【０００８】
本発明の培養観察装置は、本発明の観察装置と、前記観察装置の観察対象となった前記部材の位相差顕微鏡画像を、その観察装置よりも狭い視野で取得する位相差顕微鏡と、前記位相差顕微鏡の視野に対する前記部材の位置を前記検出の結果に応じて制御することにより、前記液滴を前記位相差顕微鏡の視野で補足する位置制御手段と、前記観察装置及び前記位相差顕微鏡の観察対象である前記部材を収容する恒温室とを備える。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、無色の液滴をも検出することの可能な液滴の観察装置、及びそれを備えた培養観察装置が実現する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】インキュベータの正面図。
【図２】正面扉１８が開放されたときにおけるインキュベータの正面図。
【図３】観察ユニット２８の構成を示す概略図。
【図４】インキュベータ１１の回路ブロック図。
【図５】全体観察用の観察系に配置された培養容器３０を示す図。
【図６】ストライプ状の面光源の例。
【図７】登録モードにおける制御ユニット１４の動作フローチャート。
【図８】全体画像Ｉｗｈｏｌｅの例。
【図９】全体画像Ｉｗｈｏｌｅ’の例。
【図１０】ドロップ番号の付与された全体画像Ｉｗｈｏｌｅ’の例。
【図１１】観察モードにおける制御ユニット１４の動作フローチャート。
【図１２】チェッカーフラッグ状の面光源の例。
【図１３】格子状の面光源の例。
【図１４】チェッカーフラッグ状の面光源を採用した場合の全体画像Ｉｗｈｏｌｅの例。
【図１５】格子状の面光源を採用した場合の全体画像Ｉｗｈｏｌｅの例。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態を説明する。本実施形態はインキュベータの実施形態である。
【００１２】
先ず、本実施形態のインキュベータの構造を説明する。
【００１３】
図１は、本実施形態のインキュベータの正面図であり、図２は、正面扉１８が開放されたときにおけるインキュベータの正面図である。図１，図２に示すとおり、インキュベータ１１は、生体細胞の培養を行う第１筐体１２と、制御ユニット１４を収納する第２筐体１３とを有しており、第１筐体１２は第２筐体１３の上部に配置される。
【００１４】
第２筐体１３の前面には操作パネル５６が設けられており、その操作パネル５６には、モニタや入力釦などが設けられている。第２筐体１３の内部には、制御ユニット１４と、観察ユニット２８の一部とが配置される。
【００１５】
第１筐体１２の内部には、断熱材で覆われた恒温室１５（図２）が形成されている。この恒温室１５は、第１筐体１２の正面に形成された正面開口１６（図２）と、第１筐体１２の左側面に形成された搬出入口１７（図２）とによって外部と連絡している。このうち正面開口１６（図２）は、観音開きの正面扉１８によって開閉可能であり、搬出入口１７（図２）は、スライド式の自動扉１９（図１）によって開閉可能である。なお、搬出入口１７のサイズは培養容器３０（図２）が通過可能なサイズに設定されている。また、第１筐体１２の底面には、正面側からみて右寄りの位置に開口２０（図２）が形成されており、その開口２０（図２）から観察ユニット２８の一部が突設されている。
【００１６】
恒温室１５の壁面には、温度調整装置、噴霧装置、ガス導入部、環境センサユニットなどが内蔵されている。このうち温度調整装置はペルチェ素子を有しており、ペルチェ効果によって恒温室１５（図２）の加熱または冷却を行う。噴霧装置は、恒温室１５（図２）内に噴霧を行って恒温室１５（図２）内の湿度を調整する。ガス導入部は、インキュベータ外の二酸化炭素ボンベと接続されており、その二酸化炭素ボンベから恒温室１５（図２）へと二酸化炭素を導入することにより、恒温室１５（図２）内の二酸化炭素濃度を調整する。環境センサユニットは、恒温室１５（図２）内の温度、湿度、二酸化炭素濃度をそれぞれ検出する。
【００１７】
第１筐体１２の内部には、ストッカー２５と、容器搬出入機構２６（図２）と、容器搬送機構２７とが配置され、前述したとおり観察ユニット２８の一部も配置されている。
【００１８】
ストッカー２５の配置箇所は、第１筐体１２の正面からみて恒温室１５（図２）の左側である。ストッカー２５は、複数の棚を有しており、各々の棚に培養容器３０を収納することができる。ストッカー２５の最下段は、第１筐体１２の搬出入口１７（図２）に連続しており、その最下段のスペースには、培養容器３０を搬出入するための容器搬出入機構
２６（図２）が設置される。
【００１９】
容器搬送機構２７の配置箇所は、第１筐体１２の正面からみて恒温室１５（図２）の中央である。この容器搬送機構２７は、ストッカー２５、容器搬出入機構２６（図２）、観察ユニット２８との間で培養容器３０（図２）の受け渡しを行う。
【００２０】
観察ユニット２８の配置箇所は、第１筐体１２の正面からみて恒温室１５（図２）の右側である。この観察ユニット２８は、試料台４７（図２）と、試料台４７（図２）の上方に張り出したアーム４８（図２）と、本体部分４９（図２）とを有している。このうち試料台４７（図２）及びアーム４８（図２）が第１筐体１２の恒温室１５（図２）の側に位置し、本体部分４９（図２）が第２筐体１３の側に位置している。
【００２１】
図３は、観察ユニット２８の構成を示す概略図である。図３に示すとおり、観察ユニット２８は、試料台４７と、第１照明部５１と、第２照明部５２と、顕微観察部５３と、容器観察部５４と、画像処理部５５とを有している。
【００２２】
このうち、顕微観察部５３は本体部分４９に内蔵されており、照明部５１は、アーム４８のうち、顕微観察部５３と対向する位置に配置される。これらの顕微観察部５３と第１照明部５１とが位相差観察用の観察系を構成する。
【００２３】
また、容器観察部５４はアーム４８に収納されており、第２照明部５２は、本体部分４９のうち、容器観察部５４と対向する位置に配置される。これらの容器観察部５４と第２照明部５２とが全体観察用の観察系を構成する。
【００２４】
試料台４７は、透明な部材で構成されており、その上に培養容器３０が載置される。この試料台４７は、高精度なステージからなり、培養容器３０を水平方向（ＸＹ方向）に移動させることにより、培養容器３０を位相差観察用の顕微鏡（顕微観察部５３及び第１照明部５１）の光路へ挿入したり、全体観察用の観察系（容器観察部５４及び第２照明部５２）の光路へ挿入したりすることができる。
【００２５】
また、試料台４７は、培養容器３０と位相差観察用の顕微鏡との間のＺ方向の位置関係を変化させることにより、位相差観察用の顕微鏡の焦点調節を行うことができる。また、試料台４７は、培養容器３０と位相差観察用の顕微鏡とのＸＹ方向の位置関係を変化させることにより、位相差観察用の顕微鏡の観察ポイントを変更することができる。
【００２６】
観察ユニット２８は、培養容器３０を全体観察用の観察系（容器観察部５４及び第２照明部５２）の光路へ挿入した状態で、培養容器３０の全体像を撮像することができる。以下、この撮像によって取得される画像を「全体画像」という。
【００２７】
また、観察ユニット２８は、培養容器３０を位相差観察用の顕微鏡（顕微観察部５３及び第１照明部５１）の光路へ挿入した状態で、培養容器３０の一部の拡大位相差像を撮像することができる。以下、この撮像によって取得される画像を「位相差画像」という。
【００２８】
なお、顕微観察部５３の対物レンズ６１及び位相フィルタ６２の組み合わせは、観察倍率の異なる複数種類の組み合わせの間で切り替えることが可能である。例えば、対物レンズ６１及び位相フィルタ６２の組み合わせは、２倍観察用の組み合わせ（対物レンズ６１ｌｏｗ及び位相フィルタ６２ｌｏｗ）と、４倍観察用の組み合わせ（対物レンズ６１ｈｉｇｈ及び位相フィルタ６２ｈｉｇｈ）との間で切り替わる。
【００２９】
観察ユニット２８は、対物レンズ６１ｌｏｗ及び位相フィルタ６２ｌｏｗを光路に設定した状態で倍率２倍の位相差画像（低倍位相差画像）を取得することができ、対物レンズ６１ｈｉｇｈ及び位相フィルタ６２ｈｉｇｈを光路に設定した状態で倍率４倍の位相差画像（高倍位相差画像）を取得することができる。
【００３０】
画像処理部５５は、観察ユニット２８が取得した画像（全体画像、低倍位相差画像、高倍位相差画像）に対して各種の画像処理を施す。なお、画像処理部５５が実行可能な画像処理には、分散フィルタ処理（後述）やパターンマッチング処理（後述）などがある。
【００３１】
次に、インキュベータ１１の電気系統を説明する。
【００３２】
図４は、インキュベータ１１の回路ブロック図である。図４に示すとおり、インキュベータ１１の制御ユニット１４は、自動扉１９の扉開閉機構１９ａ、温度調整装置２１、噴霧装置２２、ガス導入部２３、環境センサユニット２４、容器搬出入機構２６、容器搬送機構２７、観察ユニット２８、モニタ５６ａ、入力釦５６ｂとそれぞれ接続されている。
【００３３】
制御ユニット１４は、所定の制御プログラムに従ってインキュベータ１１の各部を統括的に制御する。一例として、制御ユニット１４は、温度調整装置２１、噴霧装置２２、ガス導入部２３、環境センサユニット２４をそれぞれ制御して恒温室１５内を所定の環境条件に維持する。また、制御ユニット１４は、ユーザが入力した観察スケジュールに基づいて、観察ユニット２８および容器搬送機構２７を制御して、培養容器３０の観察シーケンスを自動的に実行する。
【００３４】
なお、本実施形態のインキュベータ１１には、観察に関する制御ユニット１４の動作モードとして、後述する「登録モード」や「観察モード」が搭載されているものとする。また、制御ユニット１４は、ハードディスクや不揮発性メモリなどで構成された記憶部１４ａを有しており、後述する各種のデータを記憶しておくこともできる。
【００３５】
次に、本実施形態の培養容器３０及び全体観察用の観察系を詳しく説明する。
【００３６】
図５は、全体観察用の観察系に配置された培養容器３０を示す図である。図５に示すとおり培養容器３０は、蓋付きの透明なディッシュである。培養容器３０の底面には、２０〜２５μｌ程度の透明な培養液滴（培地ドロップ）３０ａが複数個形成されており、個々の培地ドロップ３０ａの中で受精卵３０ｃが１個ずつ生育している。
【００３７】
個々の培地ドロップ３０ａの表面及び間隙は、乾燥を防ぐため透明のミネラルオイル３０ｂで満たされている。ミネラルオイル３０ｂの屈折率は例えば１．４６７であり、培地ドロップ３０ａの屈折率は例えば１．３３３である。また、培養容器３０の直径は、約３５ｍｍであり、個々の培地ドロップ３０ａの直径は、６〜７ｍｍ程度であり、個々の受精卵ａの直径は、１００μｍ程度である。
【００３８】
なお、複数の培地ドロップ３０ａのサイズ、及びそれらの配列パターンは未知であっても構わない。また、複数の培地ドロップ３０ａの各々は、フェノールレッドにより色付けされていても、無色であってもどちらでも構わない。但し、本実施形態では、個々の培地ドロップ３０ａは、培養容器３０の底面に付着しており、観察期間中に培養容器３０内を移動する可能性は無いものと仮定する。また、本実施形態では、複数の培地ドロップ３０ａのサイズは、培養容器３０内ではほぼ共通と仮定する。
【００３９】
全体観察用の観察系を構成する第２照明部５２は、培養容器３０の底面側に配置され、全体間接用の観察系を構成する容器観察部５４は、培養容器３０の上面側に配置される。
【００４０】
第２照明部５２は、バックライト付きの透過型液晶パネルからなり、容器観察部５４は、結像光学系５４ｂと、撮像素子５４ａとを備える。なお、撮像素子５４ａは、カラー撮像素子であってもモノクロ撮像素子であっても構わない。
【００４１】
透過型液晶パネルである第２照明部５２は、明部と暗部とを繰り返し配置したバイナリパターン（ここでは、ストライプパターンとする。）を表示する。この状態で、第２照明部５２上にはストライプ状の面光源（図６参照）が形成される。
【００４２】
面光源のストライプパターンは、培地ドロップ３０ａの直径（６〜７ｍｍ）と比較して十分に微細であり、培地ドロップ３０ａの直径サイズ内に少なくとも２周期分のストライプを配している。このストライプパターンの周期（面光源のストライプピッチ）は、例えば、１ｍｍ程度に設定される。なお、面光源のストライプピッチは、制御ユニット１４によって制御可能であり、所定範囲内（例えば０．５〜２ｍｍの範囲内）で可変である。
【００４３】
結像光学系５４ｂの視野は十分に大きく設定されており、その視野内に培養容器３０の全体が収まる。この結像光学系５４ｂにより、撮像素子５４ａの撮像面と培養容器３０の底面近傍とは、光学的に共役な関係に結ばれている。この構成により、容器観察部５４は、培養容器３０の全体画像を取得することができる。
【００４４】
第２照明部５２から培養容器３０までの間隔は、少なくとも容器観察部５４がストライプパターンを分解できる程度の間隔に設定されている。
【００４５】
次に、本実施形態の登録モードにおける制御ユニット１４の動作を説明する。
【００４６】
図７は、登録モードにおける制御ユニット１４の動作フローチャートである。なお、登録モードの開始時点では、前述した面光源のストライプピッチは可変範囲の最大値に設定されているものと仮定する。
【００４７】
ステップＳ１１：制御ユニット１４は、ユーザの操作に応じて培養容器３０を恒温室１５へ搬入すると共に、培養容器３０の搬送を容器搬送機構２７へ指示する。容器搬送機構２７は、その培養容器３０を搬送し、試料台４７の所定位置へ載置する。
【００４８】
ステップＳ１２：制御ユニット１４は、培養容器３０の全体画像を取得するよう観察ユニット２８へ指示する。観察ユニット２８は、試料台４７を駆動して培養容器３０を全体観察用の観察系（容器観察部５４及び第２照明部５２）の光路へ配置し、その状態で培養容器３０の全体画像Ｉｗｈｏｌｅを取得し、その全体画像Ｉｗｈｏｌｅをモニタ５６ａへ表示する（図８参照）。
【００４９】
図８に示すとおり、全体画像Ｉｗｈｏｌｅには、面光源のストライプパターンが反映されている。但し、図５に示したとおり培地ドロップ３０ａは、ミネラルオイル３０ｂとの界面は曲面になっているため、培地ドロップ３０ａは通過光束に対してレンズ作用を及ぼす。このため、図８に示すとおり全体画像Ｉｗｈｏｌｅのうち培地ドロップ３０ａに対応した領域に現れるストライプパターンのストライプピッチは、他の領域に現れるストライプパターンのストライプピッチよりも狭くなる。その結果、全体画像Ｉｗｈｏｌｅ上では培地ドロップ３０ａの像が可視化される。
【００５０】
ステップＳ１３：制御ユニット１４は、ステップＳ１２で取得された全体画像Ｉｗｈｏｌｅへ分散フィルタ処理を施すよう画像処理部５５へ指示する。画像処理部５５は、全体画像Ｉｗｈｏｌｅ上で着目画素をシフトさせながら、着目領域を中心とする局所領域（例えば３×３画素の局所領域）の標準偏差へ着目画素の画素値を置換する処理を繰り返し、分散フィルタ処理後の全体画像Ｉｗｈｏｌｅ’を取得する。この全体画像Ｉｗｈｏｌｅ’は、制御ユニット１４へ送出され、制御ユニット１４によってモニタ５６ａへ表示される（図９参照）。
【００５１】
ここで、本ステップの分散フィルタ処理には、全体画像Ｉｗｈｏｌｅのうち、輝度の段差部（明暗のエッジ）を多く含む領域の平均輝度値を高める効果がある。よって、全体画像Ｉｗｈｏｌｅ’のうちストライプピッチが狭い領域の平均輝度値、すなわち、培地ドロップ３０ａの像の平均輝度値は、他の領域の平均輝度値よりも高くなる。よって、全体画像Ｉｗｈｏｌｅ’上では培地ドロップ３０ａの像が強調されることになる。
【００５２】
ステップＳ１４：制御ユニット１４は、ステップＳ１３で取得された全体画像Ｉｗｈｏｌｅ’に対してパターンマッチング処理を施すよう画像処理部５５へ指示する。画像処理部５５は、予め記憶している基準パターン（下述）との相関が一定以上となる１又は複数の任意サイズの領域を全体画像Ｉｗｈｏｌｅ’の中から検出し、検出した１又は複数の領域の輪郭線を、ドロップ像の輪郭線（以下、「エッジ画像」と称す。）として制御ユニット１４へ送出する。
【００５３】
ここで、本ステップの基準パターンは、本装置の製造者又はユーザが予め行った測定（又はシミュレーション）によって取得されたものである。その測定（又はシミュレーション）では、比較的小サイズの基準培地ドロップが形成された培養容器と、面光源のストライプピッチが最大値に設定された本装置とを用意（想定）し、その装置に全体画像Ｉｗｈｏｌｅ’を取得させ、その全体画像Ｉｗｈｏｌｅ’に現れた基準培地ドロップの像を、基準パターンとすればよい。
【００５４】
ステップＳ１５：制御ユニット１４は、ステップＳ１４においてドロップ像が検出されたか否かを判別し、検出されなかった場合は面光源のストライプピッチを変更するべくステップＳ１６へ移行し、検出された場合は培養容器３０の登録を行うべくステップＳ１７へ移行する。
【００５５】
なお、培地ドロップ３０ａのサイズが基準培地ドロップのサイズと近かった場合には、培地ドロップ３０ａの像に現れるストライプの本数が基準培地ドロップの像に現れるストライプの本数と同じになるので、１回目のパターンマッチングでドロップ像が検出される。一方、培地ドロップ３０ａのサイズが基準培地ドロップのサイズより一定以上大きかった場合には、培地ドロップ３０ａの像に現れるストライプの本数が基準培地ドロップの像に現れるストライプの本数より多くなるため、１回目のパターンマッチングでドロップ像が検出できない可能性がある。本実施形態では、ステップＳ１４でドロップ像が検出されなかった場合には、面光源のストライプピッチを変更し、全体画像Ｉｗｈｏｌｅの再取得を試みる。
【００５６】
ステップＳ１６：制御ユニット１４は、面光源のストライプピッチを１段階だけ小さい値に変更してからステップＳ１２へ戻る。このように面光源のストライプピッチを小さい値に変更すれば、培地ドロップ３０ａの像に現れるストライプの本数を基準パターンにおけるストライプの本数と同じにすることができるので、次のパターンマッチングでドロップ像を検出できる可能性が高まる。
【００５７】
ステップＳ１７：制御ユニット１４は、ステップＳ１４で取得したエッジ画像を、モニタ５６ａ上の全体画像Ｉｗｈｏｌｅ’に対して重畳表示する（図１０参照）。
【００５８】
また、本ステップにおける制御ユニット１４は、エッジ画像に含まれる１又は複数のドロップ像の各々に対して個別のドロップ番号ｉを順番にラベリングする。これによって、制御ユニット１４は、培養容器３０に形成された培地ドロップ３０ａの総数（すなわちドロップ番号ｉの最終値）を既知とする。以下、図１０に示したとおり培地ドロップ３０ａの総数（すなわちドロップ番号ｉの最終値）を「８」と仮定する。
【００５９】
また、本ステップにおける制御ユニット１４は、エッジ画像に含まれる８個のドロップ像の各々のサイズを計算し、それらサイズの平均値を培養容器３０に関する平均ドロップサイズとして求める。
【００６０】
また、本ステップにおける制御ユニット１４は、エッジ画像に含まれる８個のドロップ像の各々の中心座標（ｘ１，ｙ１）〜（ｘ８，ｙ８）を算出し、それらの中心座標（ｘ１，ｙ１）〜（ｘ８，ｙ８）を、位相差観察用の試料台座標（ｘ１’，ｙ１’）〜（ｘ８’，ｙ８’）へと変換する。ここで、試料台座標（ｘｉ’，ｙｉ’）は、ｉ番目の培地ドロップ３０ａを位相差観察用の顕微鏡の視野中心に配置するための試料台座標である。
【００６１】
また、本ステップにおける制御ユニット１４は、培養容器３０の観察スケジュール（タイムラプス観察の時間間隔、観察期間など）をユーザに入力させる。
【００６２】
そして、本ステップにおける制御ユニット１４は、培養容器３０に関する以上の情報、すなわち、ラベリング済みのエッジ画像と、ドロップ番号ｉの最終値（ここでは８）と、平均ドロップサイズと、試料台座標（ｘ１’，ｙ１’）〜（ｘ８’，ｙ８’）と、観察スケジュールとを、培養容器３０の管理データとして記憶部１４ａへ記憶する。これによって、培養容器３０の登録が完了する。
【００６３】
ステップＳ１８：制御ユニット１４は、ドロップ番号ｉを初期値「１」に設定する。
【００６４】
ステップＳ１９：制御ユニット１４は、ドロップ番号ｉに対応する試料台座標（ｘｉ’，ｙｉ’）を記憶部１４ａから読み出し、その試料台座標（ｘｉ’，ｙｉ’）を観察ユニット２８へ指定すると共に、位相差画像を取得するよう観察ユニット２８へ指示する。観察ユニット２８は、培養容器３０を位相差観察用の顕微鏡（顕微観察部５３及び第１照明部５１）の光路へ挿入し、対物レンズ６１及び位相フィルタ６２の組み合わせを対物レンズ６１ｌｏｗ及び位相フィルタ６２ｌｏｗの組み合わせに設定し、試料台４７を試料台座標（ｘｉ’，ｙｉ’）へ配置し、その状態において低倍位相差画像を取得し、その低倍位相差画像を、ｉ番目の培地ドロップ３０ａのドロップ画像Ｉｄｉとして制御ユニット１４へ送出する。
【００６５】
なお、ｉ番目の培地ドロップ３０ａのサイズが大きい場合には、培地ドロップの像が低倍位相差画像Ｉｄｉに収まらない可能性がある。そこで、本ステップの制御ユニット１４は、培養容器３０の平均ドロップサイズを閾値と比較し、平均ドロップサイズが閾値以上であった場合には、試料台４７を試料台座標（ｘｉ’，ｙｉ’）の周辺でステップ状に移動させながら４枚の低倍位相差画像を取得するよう観察ユニット２８へ指示を出し、観察ユニット２８が取得した４枚の低倍位相差画像を繋ぎ合わせることにより、１枚のドロップ画像Ｉｄｉを取得することが望ましい。
【００６６】
さらに、本ステップの制御ユニット１４は、その培地ドロップ画像Ｉｄｉの中から受精卵３０ｃの像を探索し、その受精卵３０ｃを視野中心に配置した状態で高倍位相差画像を取得するよう観察ユニット２８へ指示を出し、観察ユニット２８が取得した高倍位相差画像を、ｉ番目の培地ドロップ３０ａの卵画像として取得してもよい。
【００６７】
そして、本ステップの制御ユニット１４は、本ステップで取得した位相差画像を、ｉ番目の培地ドロップの詳細画像としてモニタ５６ａへ表示する。
【００６８】
ステップＳ１１１：制御ユニット１４は、ステップＳ１９で取得した詳細画像を、現在の日時及び現在のドロップ番号ｉに対応付けた上で、培養容器３０の観察データとして記憶部１４ａへ記憶する。
【００６９】
ステップＳ１１２：制御ユニット１４は、ドロップ番号ｉが最終値（ここでは「８」）に達したか否かを判別し、達していなかった場合にはステップＳ１１３へ移行し、達していた場合にはステップＳ１１４へ移行する。
【００７０】
ステップＳ１１３：制御ユニット１４は、ドロップ番号ｉをインクリメントしてからステップＳ１９へ戻る。
【００７１】
ステップＳ１１４：制御ユニット１４は、培養容器３０をストッカー２５へ収納するよう容器搬送機構２７へ指示する。容器搬送機構２７は、培養容器３０をストッカー２５へ収納する。
【００７２】
次に、本実施形態の観察モードにおける制御ユニット１４の動作を説明する。
【００７３】
図１１は、観察モードにおける制御ユニット１４の動作フローチャートである。なお、観察モードは、登録モードの実行後に自動的に開始されるものとする。
【００７４】
ステップＳ２１：制御ユニット１４は、培養容器３０の管理データに書き込まれた観察スケジュールと現在日時とを比較して、培養容器３０の観察開始時期が到来したか否かを判別する。観察開始時期が到来した場合にはステップＳ２２に移行し、観察開始時期が到来していない場合には待機する。
【００７５】
ステップＳ２２：制御ユニット１４は、培養容器３０の搬送を容器搬送機構２７に指示する。容器搬送機構２７は、培養容器３０をストッカー２５から搬出して試料台４７の所定位置に載置する。
【００７６】
ステップＳ２３：制御ユニット１４は、ドロップ番号ｉを初期値「１」に設定する。
【００７７】
ステップＳ２４：制御ユニット１４は、上述したステップＳ１９と同様にｉ番目の培地ドロップ３０ａの詳細画像を取得し、それをモニタ５６ａへ表示する。
【００７８】
ステップＳ２５：制御ユニット１４は、ステップＳ２４で取得した詳細画像を、現在の日時及び現在のドロップ番号ｉに対応付けた上で、培養容器３０の観察データとして記憶部１４ａへ記憶する。
【００７９】
ステップＳ２６：制御ユニット１４は、ドロップ番号ｉが最終値（ここでは「８」）に達したか否かを判別し、達していなかった場合にはステップＳ２７へ移行し、達していた場合にはステップＳ２８へ移行する。
【００８０】
ステップＳ２７：制御ユニット１４は、ドロップ番号ｉをインクリメントしてからステップＳ２４へ戻る。
【００８１】
ステップＳ２８：制御ユニット１４は、培養容器３０をストッカー２５へ収納するよう容器搬送機構２７へ指示する。容器搬送機構２７は、培養容器３０をストッカー２５へ収納する。
【００８２】
ステップＳ２９：制御ユニット１４は、培養容器３０の管理データに書き込まれた観察スケジュールと現在日時とを比較して、培養容器３０の観察終了時期が到来したか否かを判別する。観察終了時期が到来した場合にはその旨をモニタ５６ａへ表示してからフローを終了し、観察終了時期が到来していない場合にはステップＳ２１へ戻る。
【００８３】
以上、本実施形態の観察ユニット２８は、培養容器３０の全体画像Ｉｗｈｏｌｅを取得する際に、培地ドロップ３０ａよりも十分に微細な明暗パターンを有した面光源を採用する。よって、培地ドロップ３０ａが仮に無色であったとしても、全体画像Ｉｗｈｏｌｅ上で培地ドロップ３０ａの像は可視化される。
【００８４】
したがって、本実施形態の画像処理部５５は、その全体画像Ｉｗｈｏｌｅからドロップ像を検出することが可能である。特に、本実施形態の画像処理部５５は、パターンマッチング処理を全体画像Ｉｗｈｏｌｅへ施すので、ドロップ像の検出を高確度で行うことができる。
【００８５】
また、本実施形態の制御ユニット１４は、画像処理部５５がドロップ像の検出に失敗した場合には、面光源の明暗パターンのピッチを変更してから全体画像の取得及びドロップ像の検出を再度実行するので、ドロップ像を、そのサイズに依らず確実に検出することができる。
【００８６】
また、本実施形態の制御ユニット１４は、ドロップ像を強調するための画像処理（ここでは空間フィルタ処理の一種である分散フィルタ処理）をパターンマッチングの前に全体画像Ｉｗｈｏｌｅへ施すので、パターンマッチングの確度をより高めることができる。
【００８７】
また、本実施形態の観察ユニット２８は、面光源の明暗パターンとしてストライプパターンを採用するので、画像処理部５５は、ドロップ像の検出をシンプルな演算で確実に行うことが可能である。
【００８８】
また、本実施形態の制御ユニット１４は、ドロップ像の検出結果に応じて詳細画像の取得内容（試料台の配置先や位相差画像の取得手順など）を決定するので、詳細画像の取得を効率的に行うことができる。
【００８９】
なお、本実施形態の面光源は、ストライプパターン状であったが、均一輝度の面光源に変更することも可能なので、本実施形態の観察ユニット２８は、ストライプパターンの反映されていない培養容器３０の全体画像（つまり、培養容器３０の単なる透過観察画像）を取得することも可能である。よって、本実施形態の制御ユニット１４は、上述したステップＳ１２において全体画像Ｉｗｈｏｌｅと透過観察画像との双方を取得し、上述したステップＳ１７において他の管理データと共にその透過観察画像を記憶部１４ａへ記憶してもよい。
【００９０】
また、本実施形態の制御ユニット１４は、全体画像Ｉｗｈｏｌｅの取得時にストライプ状の面光源を採用したが、明部と暗部とを繰り返し配置した他種の面光源を採用してもよい。例えば、図１２に示すようなチェッカーフラッグ状の面光源や、図１３に示すような格子状の面光源を採用してもよい。因みに、チェッカーフラッグ状の面光源を採用した場合の全体画像Ｉｗｈｏｌｅの一例は、図１４に示すとおりであり、格子状の面光源を採用した場合の全体画像Ｉｗｈｏｌｅの一例は、図１５に示すとおりとなる。何れの場合も、培地ドロップ３０ａの像を可視化することができる。但し、面光源の種類を変更する場合には、画像処理部５５が予め記憶する基準パターンも変更する必要がある。
【００９１】
また、本実施形態の画像処理部５５は、パターンマッチングの前に全体画像Ｉｗｈｏｌｅへ施す画像処理を分散フィルタ処理としたが、他種の空間フィルタ処理や、空間フィルタ処理以外の画像処理としてもよい。例えば、全体画像Ｉｗｈｏｌｅを基準全体画像から減算する差分処理としてもよい。
【００９２】
ここで、基準全体画像は、本装置の製造者又はユーザが予め行った測定（又はシミュレーション）によって取得されたものである。その測定（又はシミュレーション）では、培地ドロップの形成されていない基準培養容器と、面光源のストライプピッチが最大値に設定された本装置とを用意（想定）し、その装置に全体画像Ｉｗｈｏｌｅを取得させ、その全体画像Ｉｗｈｏｌｅを、基準全体画像とすればよい。
【００９３】
但し、空間フィルタ処理の種類又は画像処理の種類を変更する場合には、画像処理部５５が予め記憶する基準パターンも変更する必要がある。
【００９４】
また、本実施形態の位相差観察用の顕微鏡は、位相差観察の観察倍率を２倍と４倍との間で切り換えたが、２倍と４倍と４０倍の間で切り換えてもよい。因みに、４０倍の観察倍率は、受精卵３０ｃの画像を高精細に取得するのに適している。
【００９５】
また、本実施形態では、培養容器３０としてディッシュを使用したが、他種の培養容器を使用してもよい。何れの場合も、液滴の形成先（滴下先）が透明な部材でありさえすれば、本実施形態と同様の観察が可能である。なお、本明細書では文言「透明」を、「可視光に対して透明」の意味で使用した。
【００９６】
また、本実施形態において、制御ユニット１４の動作の一部又は全部は、インキュベータに外付けされたコンピュータによって実行されてもよい。また、本実施形態において、画像処理部５５の動作の一部又は全部は、インキュベータに外付けされたコンピュータによって実行されてもよい。
【００９７】
また、本実施形態では、本発明の観察装置を培養観察装置に適用したものを説明したが、本発明の観察装置は、培養観察装置以外の装置、例えば化学反応計測装置や液滴形成装置などにも適用することが可能である。
【符号の説明】
【００９８】
１１…インキュベータ，１２…第１筐体，１３…第２筐体，５６…操作パネル，１４…制御ユニット，２８…観察ユニット，１５…恒温室，１６…正面開口，１７…搬出入口，１８…正面扉，１７…搬出入口，１９…自動扉１９，３０…培養容器，２０…開口，４７…試料台，５１…第１照明部，５２…第２照明部，５３…顕微観察部，５４…容器観察部，５５…画像処理部，４９…本体部分，６１…対物レンズ，６２…位相フィルタ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明な液滴の形成された透明な部材を、その液滴より微細な明暗パターンを有した面光源で照明する照明手段と、
前記面光源で照明された前記部材の透過像を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段が前記撮像で取得した明暗画像のパターンに基づき、その明暗画像における前記液滴の像の形成領域を検出する演算手段と、
を備えたことを特徴とする観察装置。
【請求項２】
請求項１に記載の観察装置において、
前記演算手段は、
パターンマッチングにより前記検出を行う
ことを特徴とする観察装置。
【請求項３】
請求項２に記載の観察装置において、
前記検出に失敗した場合には、前記明暗パターンのピッチを変更してから前記撮像及び前記検出を再度実行させる繰り返し手段を更に備えた
ことを特徴とする観察装置。
【請求項４】
請求項２又は請求項３に記載の観察装置において、
前記演算手段は、
前記液滴の像を強調するための画像処理を前記パターンマッチングの前に前記明暗画像へ施す
ことを特徴とする観察装置。
【請求項５】
請求項４に記載の観察装置において、
前記画像処理は、空間フィルタ処理である
ことを特徴とする観察装置。
【請求項６】
請求項４に記載の観察装置において、
前記画像処理は、前記明暗画像と、前記液滴が未形成である前記部材の明暗画像との間の差分処理である
ことを特徴とする観察装置。
【請求項７】
請求項２〜請求項６の何れか一項に記載の観察装置において、
前記明暗パターンは、ストライプパターンである
ことを特徴とする観察装置。
【請求項８】
請求項１〜請求項７の何れか一項に記載の観察装置と、
前記観察装置の観察対象となった前記部材の位相差顕微鏡画像を、その観察装置よりも狭い視野で取得する位相差顕微鏡と、
前記位相差顕微鏡の視野に対する前記部材の位置を前記検出の結果に応じて制御することにより、前記液滴を前記位相差顕微鏡の視野で補足する位置制御手段と、
前記観察装置及び前記位相差顕微鏡の観察対象である前記部材を収容する恒温室と、
を備えたことを特徴とする培養観察装置。
【請求項１】
透明な液滴の形成された透明な部材を、その液滴より微細な明暗パターンを有した面光源で照明する照明手段と、
前記面光源で照明された前記部材の透過像を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段が前記撮像で取得した明暗画像のパターンに基づき、その明暗画像における前記液滴の像の形成領域を検出する演算手段と、
を備えたことを特徴とする観察装置。
【請求項２】
請求項１に記載の観察装置において、
前記演算手段は、
パターンマッチングにより前記検出を行う
ことを特徴とする観察装置。
【請求項３】
請求項２に記載の観察装置において、
前記検出に失敗した場合には、前記明暗パターンのピッチを変更してから前記撮像及び前記検出を再度実行させる繰り返し手段を更に備えた
ことを特徴とする観察装置。
【請求項４】
請求項２又は請求項３に記載の観察装置において、
前記演算手段は、
前記液滴の像を強調するための画像処理を前記パターンマッチングの前に前記明暗画像へ施す
ことを特徴とする観察装置。
【請求項５】
請求項４に記載の観察装置において、
前記画像処理は、空間フィルタ処理である
ことを特徴とする観察装置。
【請求項６】
請求項４に記載の観察装置において、
前記画像処理は、前記明暗画像と、前記液滴が未形成である前記部材の明暗画像との間の差分処理である
ことを特徴とする観察装置。
【請求項７】
請求項２〜請求項６の何れか一項に記載の観察装置において、
前記明暗パターンは、ストライプパターンである
ことを特徴とする観察装置。
【請求項８】
請求項１〜請求項７の何れか一項に記載の観察装置と、
前記観察装置の観察対象となった前記部材の位相差顕微鏡画像を、その観察装置よりも狭い視野で取得する位相差顕微鏡と、
前記位相差顕微鏡の視野に対する前記部材の位置を前記検出の結果に応じて制御することにより、前記液滴を前記位相差顕微鏡の視野で補足する位置制御手段と、
前記観察装置及び前記位相差顕微鏡の観察対象である前記部材を収容する恒温室と、
を備えたことを特徴とする培養観察装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１１−１２７９７２（Ｐ２０１１−１２７９７２Ａ）
【公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２８５４９８（Ｐ２００９−２８５４９８）
【出願日】平成２１年１２月１６日（２００９．１２．１６）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１６日（２００９．１２．１６）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
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