走査型顕微鏡
【課題】より簡単に、より明るく鮮明な観察画像を得ることができるようにする。
【解決手段】試料１３への照明光の照射により生じた蛍光のうち、対物レンズ２７に入射した蛍光は光検出器３１により受光され、コンデンサレンズ３２に入射した蛍光は、光検出器３６に受光されて、それらの光検出器の出力から１つの観察画像が生成される。コンピュータ１１は、ステージ２８を上下方向に移動させて、試料１３の複数の観察面を観察する場合、ステージ２８の上下方向の位置に応じて光検出器３１と光検出器３６の受光感度を変化させる。このとき、ステージ２８の各位置に対して定められた受光感度を示す光検出器３６の受光感度テーブルは、光検出器３１の受光感度テーブルを位置方向に反転することにより生成される。本発明は、走査型顕微鏡に適用することができる。
【解決手段】試料１３への照明光の照射により生じた蛍光のうち、対物レンズ２７に入射した蛍光は光検出器３１により受光され、コンデンサレンズ３２に入射した蛍光は、光検出器３６に受光されて、それらの光検出器の出力から１つの観察画像が生成される。コンピュータ１１は、ステージ２８を上下方向に移動させて、試料１３の複数の観察面を観察する場合、ステージ２８の上下方向の位置に応じて光検出器３１と光検出器３６の受光感度を変化させる。このとき、ステージ２８の各位置に対して定められた受光感度を示す光検出器３６の受光感度テーブルは、光検出器３１の受光感度テーブルを位置方向に反転することにより生成される。本発明は、走査型顕微鏡に適用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の蛍光観察時において、より簡単に、より明るく鮮明な観察画像を得ることができるようにした走査型顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、スキャナを利用して試料の観察面を励起光で走査し、走査により生じた蛍光を受光して、試料を蛍光観察する走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。このような走査型顕微鏡では、ステージ上に載置された試料に対して、試料と対向する対物レンズから励起光が照射される。そして、試料から対物レンズに入射した蛍光と、試料からステージの対物レンズ側とは反対に出射した蛍光とが、それぞれ異なる光検出器により受光されて、１つの観察画像が生成される。
【０００３】
このような蛍光観察では、対物レンズの光軸方向（以下、ｚ方向と称する）に並ぶ、試料の複数の断面が観察面とされて、各観察面の観察画像が生成されることが多い。
【０００４】
ところが、試料にある程度の厚みがある場合、試料表面から遠い位置にある観察面で生じた蛍光は、その観察面から試料表面に到達するまでに、試料に吸収されてしまい、蛍光が弱まってしまうことがある。そうすると、光検出器では充分な光量の蛍光を受光することができず、観察画像が暗く不鮮明なものとなってしまう。
【０００５】
そこで走査型顕微鏡では、観察面の位置によらず、明るく鮮明な観察画像が得られるように、各観察面の走査時に、蛍光を受光する２つの光検出器の受光感度が、ステージのｚ方向の位置に応じて変化するように制御される。このような制御を行なえば、ステージのｚ方向の位置、すなわちどの観察面を観察するかによらず、一定の明るさの観察画像を得ることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−６２６９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上述した技術では、ユーザは、ステージを動かしながら観察面を実際に観察し、光検出器ごとに、手作業で各観察面に対する受光感度の設定を行なうという、煩雑な操作が必要であった。
【０００８】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、より簡単に、より明るく鮮明な観察画像を得ることができるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の走査型顕微鏡は、照明光で試料の観察面を走査して前記観察面の画像を取得する走査型顕微鏡であって、前記照明光を前記観察面に照射する照明光学系と、前記試料が載置され、前記照明光学系の光軸方向に移動するステージと、前記照明光の照射により生じた観察光のうち、前記照明光学系の方向である第１の方向に射出された観察光を第１の光検出器に導く第１の集光光学系と、前記観察光のうち、前記第１の方向と反対方向に射出された前記観察光を第２の光検出器に導く第２の集光光学系と、前記第１の光検出器が前記観察光を受光して得られたデータ、および前記第２の光検出器が前記観察光を受光して得られたデータから、前記画像を生成する画像生成手段と、前記ステージの前記光軸方向の各位置に対して定められた前記第１の光検出器の受光感度を示す第１の受光感度テーブルに基づいて、前記第１の光検出器の受光感度を変更するとともに、前記第１の受光感度テーブルの各位置の受光感度を位置方向に反転させて、前記ステージの前記光軸方向の各位置に対する前記第２の光検出器の受光感度を示す第２の受光感度テーブルを生成し、前記第２の受光感度テーブルに基づいて、前記第２の光検出器の受光感度を変更するテーブル生成手段とを備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、より簡単に、より明るく鮮明な観察画像を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明を適用した観察システムの一実施の形態の構成例を示す図である。
【図２】スポット形成領域の位置と蛍光の光量について説明する図である。
【図３】受光感度テーブルの一例を示す図である。
【図４】他の受光感度テーブルを反転して得られる受光感度テーブルの一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、図面を参照して、本発明を適用した実施の形態について説明する。
【００１３】
［観察システムの構成］
図１は、本発明を適用した観察システムの一実施の形態の構成例を示す図である。なお、図１において、横方向、奥行き方向、および縦方向は、互いに直交するｘ方向、ｙ方向、およびｚ方向を示している。
【００１４】
観察システムは、コンピュータ１１と、走査型顕微鏡１２とからなり、観察対象の試料１３のｘｙ方向と平行な断面が観察面とされて、ｚ方向に並ぶ複数の観察面が蛍光観察される。
【００１５】
試料１３の観察時において、光源２１から射出された励起光としての照明光の光束は、照明用レンズ２２および励起フィルタ２３を通り、ダイクロイックミラー２４で反射されてガルバノミラー２５に入射する。ガルバノミラー２５は、入射した照明光を偏向させることで、照明光を試料１３の観察面上で走査させる。
【００１６】
また、ガルバノミラー２５から出射した照明光は、蛍光導入用ダイクロイックミラー２６を透過し、対物レンズ２７により集光されて、ステージ２８上に載置された試料１３に照射される。これにより、試料１３の観察面には、照明光のスポットが形成される。なお、以下、試料１３の観察面におけるスポットが形成された領域を、スポット形成領域とも呼ぶこととする。
【００１７】
観察面に励起光としての照明光が照射されると、観察面のスポット形成領域からは、蛍光が生じ、この蛍光（以下、観察光とも称する）は図中、上下方向、すなわち対物レンズ２７の光軸方向と平行な方向に射出される。
【００１８】
スポット形成領域から図中、上方向に向かう観察光は、試料１３から対物レンズ２７を通って蛍光導入用ダイクロイックミラー２６で反射される。ここで、蛍光導入用ダイクロイックミラー２６の反射面は、照明光の波長帯域の光を透過させ、観察光の波長帯域の光を反射する特性を有している。
【００１９】
蛍光導入用ダイクロイックミラー２６で反射された観察光は、蛍光フィルタ２９を通り、集光レンズ３０により集光されて、光検出器３１に入射する。そして、光検出器３１に入射した観察光は光電変換されてデジタルデータとされ、光検出器３１からコンピュータ１１に供給される。
【００２０】
一方、スポット形成領域から図中、下方向に向かう観察光は、コンデンサレンズ３２を通って、蛍光導入用ダイクロイックミラー３３で反射される。さらに、蛍光導入用ダイクロイックミラー３３で反射された観察光は、蛍光フィルタ３４を通って集光レンズ３５により集光され、光検出器３６に入射する。そして、光検出器３６に入射した観察光は光電変換されてデジタルデータとされ、光検出器３６からコンピュータ１１に供給される。
【００２１】
このように、走査型顕微鏡１２では、照明用レンズ２２乃至対物レンズ２７からなる照明光学系により、照明光が試料１３に照射される。また、対物レンズ２７乃至集光レンズ３０からなる第１の集光光学系と、コンデンサレンズ３２乃至集光レンズ３５からなる第２の集光光学系のそれぞれにより、観察光が光検出器３１および光検出器３６に導かれる。
【００２２】
ここで、光検出器３１と光検出器３６に入射した観察光は、試料１３の同じスポット形成領域から射出された同じ蛍光である。そこで、コンピュータ１１は、光検出器３１と光検出器３６のそれぞれで観察光を受光して得られたデジタルデータから、観察画像の１画素分の画素データを生成し、記録する。コンピュータ１１は、このようにして得られた各画素データを、ガルバノミラー２５による観察面の走査のタイミングと同期させて並べることで観察画像を構築し、得られた観察画像を表示する。この観察画像は、照明光で走査された１つの観察面が表示される画像である。
【００２３】
さらに、試料１３の観察時において、コンピュータ１１は、電動ｚステージ３７を制御して、ステージ２８をｚ方向、つまり対物レンズ２７の光軸方向に移動させることで、試料１３におけるスポット形成領域の位置をｚ方向に変化させることができる。コンピュータ１１は、ステージ２８のｚ方向への移動を制御することで、観察画像の構築のタイミングと同期させて、ｚ方向に並ぶ観察面のうちの所望の観察面にスポットを形成させることができる。
【００２４】
［観察システムの動作の説明］
ところで、図２に示すように、試料１３はｚ方向に厚みがあるため、スポット形成領域６１から、図中、上方向に向かう観察光は、スポット形成領域６１と対物レンズ２７との間にある試料１３の部位に吸収されて、光量が弱まってしまう。なお、図２において、縦方向および横方向は、ｚ方向およびｘ方向を示している。
【００２５】
同様に、スポット形成領域６１から、図中、下方向に向かう観察光は、スポット形成領域６１とコンデンサレンズ３２との間にある試料１３の部位に吸収されて、光量が弱まってしまう。
【００２６】
そこで、コンピュータ１１はステージ２８のｚ方向の位置Ｓｚ、つまり試料１３におけるスポット形成領域６１が形成される位置に応じて、光検出器３１と光検出器３６の受光感度を設定し、ステージ２８の各位置Ｓｚに対する受光感度を示す受光感度テーブルを生成する。
【００２７】
例えば、光検出器３１の受光感度テーブルは、試料１３の図中、上側の表面から、スポット形成領域６１までの距離が長くなるほど、光検出器３１の受光感度が高くなるように生成される。逆に、光検出器３６の受光感度テーブルは、試料１３の図中、下側の表面から、スポット形成領域６１までの距離が長くなるほど、光検出器３６の受光感度が高くなるように生成される。
【００２８】
このような受光感度テーブルを用いて試料１３を蛍光観察すれば、スポット形成領域６１が試料１３のどの位置にある場合でも、一定の明るさ（輝度）の観察画像を得ることができる。なお、光検出器３１と光検出器３６の受光感度とは、光検出器３１や光検出器３６を構成するＰＭＴ（Photomultiplier Tube）などの受光素子自体の感度をいう。
【００２９】
次に、試料１３の観察時に用いられる受光感度テーブルの生成について説明する。
【００３０】
例えば、試料１３の観察時において、コンピュータ１１が、ステージ２８のｚ方向の位置Ｓｚ、すなわちステージ２８のｚ座標を−４０から４０まで変化させながら、複数の観察面の観察画像を取得するとする。なお、以下では図１中、上方向が＋ｚ方向であるとし、図１中、下方向が−ｚ方向であるとする。つまり、ステージ２８を＋ｚ方向に移動させると、スポット形成領域６１は、試料１３の図１中、下側の表面により近い位置に移動することになる。
【００３１】
このような場合、コンピュータ１１は、ユーザの操作に従って電動ｚステージ３７を制御し、ステージ２８の位置がＳｚ＝−４０となるようにステージ２８を移動させる。そして、コンピュータ１１は、光源２１から照明光を射出させるとともに、ガルバノミラー２５の動作を制御し、照明光での観察面の走査を開始させる。
【００３２】
このようにして試料１３の蛍光観察が開始されると、コンピュータ１１は、光検出器３１から供給されたデジタルデータに基づいて観察画像を生成し、表示する。ユーザは、表示された観察画像を見ながら、光検出器３１の受光感度を設定する。例えば、ユーザは、位置Ｓｚ＝−４０に対する光検出器３１の受光感度「８２」を入力する。すると、コンピュータ１１は、ユーザの入力に応じて、光検出器３１の受光感度テーブルにおける、位置Ｓｚ＝−４０に対する受光感度を数値「８２」とする。
【００３３】
次に、コンピュータ１１は、ユーザの操作に従って電動ｚステージ３７を制御し、ステージ２８の位置がＳｚ＝０となるようにステージ２８を移動させ、位置Ｓｚ＝０における観察画像を取得して表示する。
【００３４】
ユーザは、表示された観察画像を見ながら、位置Ｓｚ＝０における観察画像が、位置Ｓｚ＝−４０における観察画像と同じ明るさになるように、光検出器３１の受光感度を設定する。このとき、例えば、位置Ｓｚ＝０に対する光検出器３１の受光感度「１１８」が入力される。そして、コンピュータ１１は、ユーザの入力に応じて、光検出器３１の受光感度テーブルにおける、位置Ｓｚ＝０に対する受光感度を数値「１１８」とする。
【００３５】
さらに、コンピュータ１１はユーザの操作に従って、ステージ２８の位置がＳｚ＝４０となるようにステージ２８を移動させ、位置Ｓｚ＝４０における観察画像を取得して表示する。また、コンピュータ１１は、ユーザにより入力された受光感度に基づいて、光検出器３１の受光感度テーブルにおける、位置Ｓｚ＝４０に対する受光感度を定める。例えば、位置Ｓｚ＝４０に対する受光感度は、ユーザにより入力された数値「２２０」とされる。
【００３６】
このように、コンピュータ１１は、ステージ２８を移動させながら、ステージ２８のいくつかの位置Ｓｚにおける観察画像を表示し、ユーザによる受光感度の入力を受け付ける。そして、コンピュータ１１は、ステージ２８の位置Ｓｚにおける光検出器３１の受光感度を、ユーザにより入力された値とする。
【００３７】
さらに、コンピュータ１１は、ユーザにより入力された受光感度に基づいて、ステージ２８の各位置Ｓｚにおける光検出器３１の受光感度を、補間処理により求める。
【００３８】
例えば、上述の例では、位置Ｓｚ＝−４０から位置Ｓｚ＝０までの間におけるステージ２８の各位置Ｓｚの受光感度が、位置Ｓｚ＝−４０の受光感度「８２」と、位置Ｓｚ＝０の受光感度「１１８」とを用いた多項式補間等の補間処理により求められる。同様にして、位置Ｓｚ＝０から位置Ｓｚ＝４０までの間における、ステージ２８の各位置Ｓｚの受光感度も補間処理により求められる。
【００３９】
補間処理が行われると、コンピュータ１１は、補間により得られた受光感度と、ユーザにより入力された受光感度とから、光検出器３１の受光感度テーブルを生成する。
【００４０】
これにより、例えば、図３に示す光検出器３１の受光感度テーブルが得られる。なお、図３において、縦軸および横軸は、光検出器３１の受光感度、およびステージ２８のｚ方向の位置Ｓｚを示している。
【００４１】
図３の受光感度テーブルでは、＋ｚ方向にあるステージ２８の位置Ｓｚほど、その位置Ｓｚにおける受光感度が高くなっている。これは、位置Ｓｚを示すｚ座標が大きくなるほど、つまりステージ２８を＋ｚ方向に移動させるほど、試料１３の対物レンズ２７側の表面から、スポット形成領域６１までの試料１３の厚みが増すためである。
【００４２】
ステージ２８の各位置Ｓｚに対する受光感度を示す曲線は、試料１３の対物レンズ２７側の表面から、スポット形成領域６１までの距離と、試料１３による蛍光の吸収率の関係から、非線形となることが多い。
【００４３】
コンピュータ１１は、以上の処理により得られた光検出器３１の受光感度テーブルを記録する。なお、以上においては、光検出器３１の受光感度がユーザにより設定されると説明したが、ユーザの操作によらず受光感度テーブルが生成されるようにしてもよい。
【００４４】
そのような場合、コンピュータ１１は、ステージ２８をｚ方向に移動させながら、ステージ２８の各位置Ｓｚでの観察画像に基づいて、位置Ｓｚに対する光検出器３１の受光感度を定める。例えば、コンピュータ１１は、観察画像における輝度値が所定の閾値以上である画素からなる領域を抽出し、抽出された領域を構成する画素の輝度値の平均値を算出する。そして、コンピュータ１１は、得られた平均値に対して、予め定められた値を光検出器３１の受光感度として設定する。
【００４５】
この場合、コンピュータ１１が補間処理を行わずに、ステージ２８のｚ方向の各位置について、観察画像から光検出器３１の受光感度を求めてもよい。また、コンピュータ１１が、ステージ２８のいくつかの位置について、観察画像から光検出器３１の受光感度を求め、求めた受光感度を用いて、ステージ２８の他の位置における光検出器３１の受光感度を補間処理により求めるようにしてもよい。
【００４６】
コンピュータ１１は、光検出器３１の受光感度テーブルを生成すると、次に、得られた光検出器３１の受光感度テーブルを用いて、光検出器３６の受光感度テーブルを生成する。
【００４７】
例えば、ステージ２８を＋ｚ方向に移動させていくと、照明光のスポットから、試料１３の対物レンズ２７側の表面までの距離は長くなっていくが、逆に、スポットから試料１３のコンデンサレンズ３２側の表面までの距離は短くなっていく。
【００４８】
このとき、スポットからコンデンサレンズ３２側の表面までの試料１３の厚みは、スポットから対物レンズ２７側の試料１３の厚みが厚くなっていくのと同じ分だけ薄くなっていく。そのため、ステージ２８の各位置Ｓｚに対する光検出器３６の受光感度は、図４に示すように、各位置Ｓｚに対する光検出器３１の受光感度を位置Ｓｚ方向に反転させたものとなると推定される。
【００４９】
なお、図４において、縦軸および横軸は、光検出器３１または光検出器３６の受光感度、およびステージ２８のｚ方向の位置Ｓｚを示している。また、図４において、実線の曲線は、各位置Ｓｚに対する光検出器３１の受光感度を示しており、点線の曲線は、各位置Ｓｚに対する光検出器３６の受光感度を示している。
【００５０】
図４において、光検出器３６の受光感度テーブルでは、＋ｚ方向にあるステージ２８の位置Ｓｚほど、その位置Ｓｚにおける受光感度が低くなっている。
【００５１】
ここで、光検出器３６の受光感度テーブルは、位置Ｓｚ方向に反転された光検出器３１の受光感度テーブルに、オフセット値が加算されたものとされている。
【００５２】
このオフセット値は、主に、スポット形成領域６１から光検出器３１までの間にある走査型顕微鏡１２の第１の集光光学系と、スポット形成領域６１から光検出器３６までの間にある走査型顕微鏡１２の第２の集光光学系との差により予め定められている。
【００５３】
すなわち、対物レンズ２７等からなる対物レンズ２７側の第１の集光光学系と、コンデンサレンズ３２等からなるコンデンサレンズ３２側の第２の集光光学系とでは、レンズ等の明るさが異なる。そのため、試料１３表面から射出された観察光の光量が同じであっても、光検出器３１と光検出器３６とでは、設定すべき受光感度には差が生じることになる。オフセット値は、このような受光感度の差分を補正するために、予め算出された補正値である。
【００５４】
このように、コンピュータ１１は、ステージ２８の位置Ｓｚを反転させた、光検出器３１の受光感度テーブルと、予め用意されたオフセット値とを用いて、光検出器３６の受光感度テーブルを生成し、記録する。
【００５５】
例えば、光検出器３１の受光感度テーブルにおいて、ステージ２８の位置Ｓｚが「−４０」、「０」、および「４０」のそれぞれにおける受光感度が、「１００」、「１１０」、および「１５０」であったとする。
【００５６】
このとき、受光感度テーブルを位置Ｓｚ方向に反転させると、反転後の位置Ｓｚ「−４０」、「０」、および「４０」のそれぞれにおける受光感度は、「１５０」、「１１０」、および「１００」となる。コンピュータ１１は、これらの反転後の各位置Ｓｚの受光感度に、オフセット値として、例えば「２０」を加算し、光検出器３６の受光感度テーブルとする。
【００５７】
この場合、光検出器３６の受光感度テーブルにおいて、ステージ２８の位置Ｓｚが「−４０」、「０」、および「４０」のそれぞれにおける受光感度は、「１７０」、「１３０」、および「１２０」となる。
【００５８】
このように、反転後の光検出器３１の受光感度テーブルにオフセット値を加算して、光検出器３６の受光感度テーブルとすることで、簡単に光検出器３６の受光感度テーブルを得ることができる。この場合、反転前後の受光感度テーブルにおいて、位置Ｓｚの変化に対する受光感度の変化量が同じとなる。
【００５９】
なお、反転前後の受光感度テーブルにおいて、位置Ｓｚの変化に対する受光感度の変化率が同じとなるように、受光感度テーブルが生成されてもよい。
【００６０】
そのような場合、コンピュータ１１は、例えば、光検出器３６の受光感度テーブルの注目する位置Ｓｚの受光感度を次のようにして求める。すなわち、これから得ようとする光検出器３６の受光感度テーブルの注目する位置Ｓｚを位置Ｓｚｃとする。また、反転後の光検出器３１の受光感度テーブルにおいて、基準となる位置Ｓｚ、その基準となる位置Ｓｚの受光感度、および位置Ｓｚｃの受光感度を、それぞれＳＯ、ｆ（Ｏ）、およびｆ（ｚｃ）とする。
【００６１】
このとき、コンピュータ１１は、受光感度ｆ（Ｏ）にオフセット値を加算して得られた値に、さらに受光感度ｆ（ｚｃ）と受光感度ｆ（Ｏ）の比を乗算し、その結果得られた値を、得ようとする光検出器３６の受光感度テーブルの位置Ｓｚｃに対する受光感度Ｆ（ｚｃ）とする。
【００６２】
例えば、光検出器３１の受光感度テーブルにおいて、ステージ２８の位置Ｓｚが「−４０」、「０」、および「４０」のそれぞれにおける受光感度が、「１００」、「１１０」、および「１５０」であり、オフセット値が「２０」であったとする。
【００６３】
この受光感度テーブルを位置方向に反転させると、反転後の受光感度テーブルにおいて、位置Ｓｚが「−４０」、「０」、および「４０」のそれぞれにおける受光感度は、「１５０」、「１１０」、および「１００」となる。
【００６４】
そして、反転後の位置Ｓｚ＝４０を基準となる位置ＳＯとすると、位置ＳＯに対する位置Ｓｚ＝０と、位置Ｓｚ＝−４０における受光感度の変化率は、それぞれ「１．１」（1.1＝110／100）および「１．５」（1.5＝150／100）となる。したがって、得ようとする光検出器３６の受光感度テーブルにおいて、位置Ｓｚが「−４０」、「０」、および「４０」のそれぞれにおける受光感度は、「１８０」（180＝（100＋20）×1.5）、「１３２」（132＝（100＋20）×1.1）、および「１２０」（120＝（100＋20）×1.0）となる。
【００６５】
このように、受光感度の変化率に基づいて、光検出器３６の受光感度テーブルを生成する場合においても、光検出器３１の受光感度テーブルから、光検出器３６の受光感度テーブルを簡単に得ることができる。
【００６６】
なお、光検出器３６の受光感度テーブルが生成されると、コンピュータ１１が、得られた受光感度テーブルをそのまま記録するようにしてもよいし、ユーザの操作に応じて、光検出器３６の受光感度テーブルが微調整されるようにしてもよい。
【００６７】
受光感度テーブルの微調整が行なわれる場合、例えばコンピュータ１１は、光検出器３６の受光感度テーブルを表示し、ユーザは、表示された受光感度テーブルを見ながら、位置Ｓｚに対する受光感度の値を変更させる。ユーザにより受光感度の変更後の値が指定されると、コンピュータ１１は、ユーザの指定に応じて位置Ｓｚの受光感度を変更し、最終的に得られた受光感度テーブルを、光検出器３６の受光感度テーブルとして記録する。
【００６８】
以上のようにして、受光感度テーブルが得られると、コンピュータ１１は、試料１３の観察時に、受光感度テーブルを用いて光検出器３１と光検出器３６の受光感度を変化させながら、各観察面の観察画像を取得する。
【００６９】
すなわち、コンピュータ１１は、光源２１から照明光を射出させるとともに、ガルバノミラー２５の動作を制御する。光源２１からの照明光は、照明用レンズ２２乃至対物レンズ２７を通って試料１３の観察面に照射される。このとき、ガルバノミラー２５は、照明光を偏向させることにより、照明光で観察面を走査する。
【００７０】
また、観察面に照明光が照射されると、照明光のスポット形成領域からは観察光が射出される。対物レンズ２７側に射出された観察光は、対物レンズ２７、蛍光導入用ダイクロイックミラー２６、蛍光フィルタ２９、および集光レンズ３０を通って光検出器３１に受光される。一方、コンデンサレンズ３２側に射出された観察光は、コンデンサレンズ３２乃至集光レンズ３５を通って、光検出器３６に受光される。
【００７１】
すると、光検出器３１と光検出器３６からコンピュータ１１には、観察光の受光強度に応じたデジタルデータが供給されるので、コンピュータ１１は、供給されたこれらのデジタルデータから観察画像の各画素データを生成し、記録する。
【００７２】
また、試料１３の観察時において、コンピュータ１１は、試料１３の目的とする観察面上に照明光のスポットが形成されるように、電動ｚステージ３７を制御してステージ２８を移動させる。さらに、コンピュータ１１は、記録している受光感度テーブルを参照し、ステージ２８の移動と同期させて、光検出器３１と光検出器３６の受光感度を変更する。すなわち、コンピュータ１１は、光検出器３１と光検出器３６の受光感度テーブルから、現時点のステージ２８の位置Ｓｚに対する受光感度を読み出して、光検出器３１と光検出器３６の受光感度を、読み出した受光感度に変更する。
【００７３】
以上のように、２つの光検出器のうちの一方の受光感度テーブルを反転させて、他方の光検出器の受光感度テーブルを生成することで、より簡単に受光感度テーブルを得ることができる。したがって、試料１３の蛍光観察時に、この受光感度テーブルを用いて、光検出器の受光感度を変更すれば、より簡単に、より明るく鮮明な観察画像を得ることができるようになる。
【００７４】
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００７５】
１１ コンピュータ， １２ 走査型顕微鏡， １３ 試料， ２７ 対物レンズ， ２８ ステージ， ３１ 光検出器， ３２ コンデンサレンズ， ３６ 光検出器， ３７ 電動ｚステージ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の蛍光観察時において、より簡単に、より明るく鮮明な観察画像を得ることができるようにした走査型顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、スキャナを利用して試料の観察面を励起光で走査し、走査により生じた蛍光を受光して、試料を蛍光観察する走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。このような走査型顕微鏡では、ステージ上に載置された試料に対して、試料と対向する対物レンズから励起光が照射される。そして、試料から対物レンズに入射した蛍光と、試料からステージの対物レンズ側とは反対に出射した蛍光とが、それぞれ異なる光検出器により受光されて、１つの観察画像が生成される。
【０００３】
このような蛍光観察では、対物レンズの光軸方向（以下、ｚ方向と称する）に並ぶ、試料の複数の断面が観察面とされて、各観察面の観察画像が生成されることが多い。
【０００４】
ところが、試料にある程度の厚みがある場合、試料表面から遠い位置にある観察面で生じた蛍光は、その観察面から試料表面に到達するまでに、試料に吸収されてしまい、蛍光が弱まってしまうことがある。そうすると、光検出器では充分な光量の蛍光を受光することができず、観察画像が暗く不鮮明なものとなってしまう。
【０００５】
そこで走査型顕微鏡では、観察面の位置によらず、明るく鮮明な観察画像が得られるように、各観察面の走査時に、蛍光を受光する２つの光検出器の受光感度が、ステージのｚ方向の位置に応じて変化するように制御される。このような制御を行なえば、ステージのｚ方向の位置、すなわちどの観察面を観察するかによらず、一定の明るさの観察画像を得ることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−６２６９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上述した技術では、ユーザは、ステージを動かしながら観察面を実際に観察し、光検出器ごとに、手作業で各観察面に対する受光感度の設定を行なうという、煩雑な操作が必要であった。
【０００８】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、より簡単に、より明るく鮮明な観察画像を得ることができるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の走査型顕微鏡は、照明光で試料の観察面を走査して前記観察面の画像を取得する走査型顕微鏡であって、前記照明光を前記観察面に照射する照明光学系と、前記試料が載置され、前記照明光学系の光軸方向に移動するステージと、前記照明光の照射により生じた観察光のうち、前記照明光学系の方向である第１の方向に射出された観察光を第１の光検出器に導く第１の集光光学系と、前記観察光のうち、前記第１の方向と反対方向に射出された前記観察光を第２の光検出器に導く第２の集光光学系と、前記第１の光検出器が前記観察光を受光して得られたデータ、および前記第２の光検出器が前記観察光を受光して得られたデータから、前記画像を生成する画像生成手段と、前記ステージの前記光軸方向の各位置に対して定められた前記第１の光検出器の受光感度を示す第１の受光感度テーブルに基づいて、前記第１の光検出器の受光感度を変更するとともに、前記第１の受光感度テーブルの各位置の受光感度を位置方向に反転させて、前記ステージの前記光軸方向の各位置に対する前記第２の光検出器の受光感度を示す第２の受光感度テーブルを生成し、前記第２の受光感度テーブルに基づいて、前記第２の光検出器の受光感度を変更するテーブル生成手段とを備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、より簡単に、より明るく鮮明な観察画像を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明を適用した観察システムの一実施の形態の構成例を示す図である。
【図２】スポット形成領域の位置と蛍光の光量について説明する図である。
【図３】受光感度テーブルの一例を示す図である。
【図４】他の受光感度テーブルを反転して得られる受光感度テーブルの一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、図面を参照して、本発明を適用した実施の形態について説明する。
【００１３】
［観察システムの構成］
図１は、本発明を適用した観察システムの一実施の形態の構成例を示す図である。なお、図１において、横方向、奥行き方向、および縦方向は、互いに直交するｘ方向、ｙ方向、およびｚ方向を示している。
【００１４】
観察システムは、コンピュータ１１と、走査型顕微鏡１２とからなり、観察対象の試料１３のｘｙ方向と平行な断面が観察面とされて、ｚ方向に並ぶ複数の観察面が蛍光観察される。
【００１５】
試料１３の観察時において、光源２１から射出された励起光としての照明光の光束は、照明用レンズ２２および励起フィルタ２３を通り、ダイクロイックミラー２４で反射されてガルバノミラー２５に入射する。ガルバノミラー２５は、入射した照明光を偏向させることで、照明光を試料１３の観察面上で走査させる。
【００１６】
また、ガルバノミラー２５から出射した照明光は、蛍光導入用ダイクロイックミラー２６を透過し、対物レンズ２７により集光されて、ステージ２８上に載置された試料１３に照射される。これにより、試料１３の観察面には、照明光のスポットが形成される。なお、以下、試料１３の観察面におけるスポットが形成された領域を、スポット形成領域とも呼ぶこととする。
【００１７】
観察面に励起光としての照明光が照射されると、観察面のスポット形成領域からは、蛍光が生じ、この蛍光（以下、観察光とも称する）は図中、上下方向、すなわち対物レンズ２７の光軸方向と平行な方向に射出される。
【００１８】
スポット形成領域から図中、上方向に向かう観察光は、試料１３から対物レンズ２７を通って蛍光導入用ダイクロイックミラー２６で反射される。ここで、蛍光導入用ダイクロイックミラー２６の反射面は、照明光の波長帯域の光を透過させ、観察光の波長帯域の光を反射する特性を有している。
【００１９】
蛍光導入用ダイクロイックミラー２６で反射された観察光は、蛍光フィルタ２９を通り、集光レンズ３０により集光されて、光検出器３１に入射する。そして、光検出器３１に入射した観察光は光電変換されてデジタルデータとされ、光検出器３１からコンピュータ１１に供給される。
【００２０】
一方、スポット形成領域から図中、下方向に向かう観察光は、コンデンサレンズ３２を通って、蛍光導入用ダイクロイックミラー３３で反射される。さらに、蛍光導入用ダイクロイックミラー３３で反射された観察光は、蛍光フィルタ３４を通って集光レンズ３５により集光され、光検出器３６に入射する。そして、光検出器３６に入射した観察光は光電変換されてデジタルデータとされ、光検出器３６からコンピュータ１１に供給される。
【００２１】
このように、走査型顕微鏡１２では、照明用レンズ２２乃至対物レンズ２７からなる照明光学系により、照明光が試料１３に照射される。また、対物レンズ２７乃至集光レンズ３０からなる第１の集光光学系と、コンデンサレンズ３２乃至集光レンズ３５からなる第２の集光光学系のそれぞれにより、観察光が光検出器３１および光検出器３６に導かれる。
【００２２】
ここで、光検出器３１と光検出器３６に入射した観察光は、試料１３の同じスポット形成領域から射出された同じ蛍光である。そこで、コンピュータ１１は、光検出器３１と光検出器３６のそれぞれで観察光を受光して得られたデジタルデータから、観察画像の１画素分の画素データを生成し、記録する。コンピュータ１１は、このようにして得られた各画素データを、ガルバノミラー２５による観察面の走査のタイミングと同期させて並べることで観察画像を構築し、得られた観察画像を表示する。この観察画像は、照明光で走査された１つの観察面が表示される画像である。
【００２３】
さらに、試料１３の観察時において、コンピュータ１１は、電動ｚステージ３７を制御して、ステージ２８をｚ方向、つまり対物レンズ２７の光軸方向に移動させることで、試料１３におけるスポット形成領域の位置をｚ方向に変化させることができる。コンピュータ１１は、ステージ２８のｚ方向への移動を制御することで、観察画像の構築のタイミングと同期させて、ｚ方向に並ぶ観察面のうちの所望の観察面にスポットを形成させることができる。
【００２４】
［観察システムの動作の説明］
ところで、図２に示すように、試料１３はｚ方向に厚みがあるため、スポット形成領域６１から、図中、上方向に向かう観察光は、スポット形成領域６１と対物レンズ２７との間にある試料１３の部位に吸収されて、光量が弱まってしまう。なお、図２において、縦方向および横方向は、ｚ方向およびｘ方向を示している。
【００２５】
同様に、スポット形成領域６１から、図中、下方向に向かう観察光は、スポット形成領域６１とコンデンサレンズ３２との間にある試料１３の部位に吸収されて、光量が弱まってしまう。
【００２６】
そこで、コンピュータ１１はステージ２８のｚ方向の位置Ｓｚ、つまり試料１３におけるスポット形成領域６１が形成される位置に応じて、光検出器３１と光検出器３６の受光感度を設定し、ステージ２８の各位置Ｓｚに対する受光感度を示す受光感度テーブルを生成する。
【００２７】
例えば、光検出器３１の受光感度テーブルは、試料１３の図中、上側の表面から、スポット形成領域６１までの距離が長くなるほど、光検出器３１の受光感度が高くなるように生成される。逆に、光検出器３６の受光感度テーブルは、試料１３の図中、下側の表面から、スポット形成領域６１までの距離が長くなるほど、光検出器３６の受光感度が高くなるように生成される。
【００２８】
このような受光感度テーブルを用いて試料１３を蛍光観察すれば、スポット形成領域６１が試料１３のどの位置にある場合でも、一定の明るさ（輝度）の観察画像を得ることができる。なお、光検出器３１と光検出器３６の受光感度とは、光検出器３１や光検出器３６を構成するＰＭＴ（Photomultiplier Tube）などの受光素子自体の感度をいう。
【００２９】
次に、試料１３の観察時に用いられる受光感度テーブルの生成について説明する。
【００３０】
例えば、試料１３の観察時において、コンピュータ１１が、ステージ２８のｚ方向の位置Ｓｚ、すなわちステージ２８のｚ座標を−４０から４０まで変化させながら、複数の観察面の観察画像を取得するとする。なお、以下では図１中、上方向が＋ｚ方向であるとし、図１中、下方向が−ｚ方向であるとする。つまり、ステージ２８を＋ｚ方向に移動させると、スポット形成領域６１は、試料１３の図１中、下側の表面により近い位置に移動することになる。
【００３１】
このような場合、コンピュータ１１は、ユーザの操作に従って電動ｚステージ３７を制御し、ステージ２８の位置がＳｚ＝−４０となるようにステージ２８を移動させる。そして、コンピュータ１１は、光源２１から照明光を射出させるとともに、ガルバノミラー２５の動作を制御し、照明光での観察面の走査を開始させる。
【００３２】
このようにして試料１３の蛍光観察が開始されると、コンピュータ１１は、光検出器３１から供給されたデジタルデータに基づいて観察画像を生成し、表示する。ユーザは、表示された観察画像を見ながら、光検出器３１の受光感度を設定する。例えば、ユーザは、位置Ｓｚ＝−４０に対する光検出器３１の受光感度「８２」を入力する。すると、コンピュータ１１は、ユーザの入力に応じて、光検出器３１の受光感度テーブルにおける、位置Ｓｚ＝−４０に対する受光感度を数値「８２」とする。
【００３３】
次に、コンピュータ１１は、ユーザの操作に従って電動ｚステージ３７を制御し、ステージ２８の位置がＳｚ＝０となるようにステージ２８を移動させ、位置Ｓｚ＝０における観察画像を取得して表示する。
【００３４】
ユーザは、表示された観察画像を見ながら、位置Ｓｚ＝０における観察画像が、位置Ｓｚ＝−４０における観察画像と同じ明るさになるように、光検出器３１の受光感度を設定する。このとき、例えば、位置Ｓｚ＝０に対する光検出器３１の受光感度「１１８」が入力される。そして、コンピュータ１１は、ユーザの入力に応じて、光検出器３１の受光感度テーブルにおける、位置Ｓｚ＝０に対する受光感度を数値「１１８」とする。
【００３５】
さらに、コンピュータ１１はユーザの操作に従って、ステージ２８の位置がＳｚ＝４０となるようにステージ２８を移動させ、位置Ｓｚ＝４０における観察画像を取得して表示する。また、コンピュータ１１は、ユーザにより入力された受光感度に基づいて、光検出器３１の受光感度テーブルにおける、位置Ｓｚ＝４０に対する受光感度を定める。例えば、位置Ｓｚ＝４０に対する受光感度は、ユーザにより入力された数値「２２０」とされる。
【００３６】
このように、コンピュータ１１は、ステージ２８を移動させながら、ステージ２８のいくつかの位置Ｓｚにおける観察画像を表示し、ユーザによる受光感度の入力を受け付ける。そして、コンピュータ１１は、ステージ２８の位置Ｓｚにおける光検出器３１の受光感度を、ユーザにより入力された値とする。
【００３７】
さらに、コンピュータ１１は、ユーザにより入力された受光感度に基づいて、ステージ２８の各位置Ｓｚにおける光検出器３１の受光感度を、補間処理により求める。
【００３８】
例えば、上述の例では、位置Ｓｚ＝−４０から位置Ｓｚ＝０までの間におけるステージ２８の各位置Ｓｚの受光感度が、位置Ｓｚ＝−４０の受光感度「８２」と、位置Ｓｚ＝０の受光感度「１１８」とを用いた多項式補間等の補間処理により求められる。同様にして、位置Ｓｚ＝０から位置Ｓｚ＝４０までの間における、ステージ２８の各位置Ｓｚの受光感度も補間処理により求められる。
【００３９】
補間処理が行われると、コンピュータ１１は、補間により得られた受光感度と、ユーザにより入力された受光感度とから、光検出器３１の受光感度テーブルを生成する。
【００４０】
これにより、例えば、図３に示す光検出器３１の受光感度テーブルが得られる。なお、図３において、縦軸および横軸は、光検出器３１の受光感度、およびステージ２８のｚ方向の位置Ｓｚを示している。
【００４１】
図３の受光感度テーブルでは、＋ｚ方向にあるステージ２８の位置Ｓｚほど、その位置Ｓｚにおける受光感度が高くなっている。これは、位置Ｓｚを示すｚ座標が大きくなるほど、つまりステージ２８を＋ｚ方向に移動させるほど、試料１３の対物レンズ２７側の表面から、スポット形成領域６１までの試料１３の厚みが増すためである。
【００４２】
ステージ２８の各位置Ｓｚに対する受光感度を示す曲線は、試料１３の対物レンズ２７側の表面から、スポット形成領域６１までの距離と、試料１３による蛍光の吸収率の関係から、非線形となることが多い。
【００４３】
コンピュータ１１は、以上の処理により得られた光検出器３１の受光感度テーブルを記録する。なお、以上においては、光検出器３１の受光感度がユーザにより設定されると説明したが、ユーザの操作によらず受光感度テーブルが生成されるようにしてもよい。
【００４４】
そのような場合、コンピュータ１１は、ステージ２８をｚ方向に移動させながら、ステージ２８の各位置Ｓｚでの観察画像に基づいて、位置Ｓｚに対する光検出器３１の受光感度を定める。例えば、コンピュータ１１は、観察画像における輝度値が所定の閾値以上である画素からなる領域を抽出し、抽出された領域を構成する画素の輝度値の平均値を算出する。そして、コンピュータ１１は、得られた平均値に対して、予め定められた値を光検出器３１の受光感度として設定する。
【００４５】
この場合、コンピュータ１１が補間処理を行わずに、ステージ２８のｚ方向の各位置について、観察画像から光検出器３１の受光感度を求めてもよい。また、コンピュータ１１が、ステージ２８のいくつかの位置について、観察画像から光検出器３１の受光感度を求め、求めた受光感度を用いて、ステージ２８の他の位置における光検出器３１の受光感度を補間処理により求めるようにしてもよい。
【００４６】
コンピュータ１１は、光検出器３１の受光感度テーブルを生成すると、次に、得られた光検出器３１の受光感度テーブルを用いて、光検出器３６の受光感度テーブルを生成する。
【００４７】
例えば、ステージ２８を＋ｚ方向に移動させていくと、照明光のスポットから、試料１３の対物レンズ２７側の表面までの距離は長くなっていくが、逆に、スポットから試料１３のコンデンサレンズ３２側の表面までの距離は短くなっていく。
【００４８】
このとき、スポットからコンデンサレンズ３２側の表面までの試料１３の厚みは、スポットから対物レンズ２７側の試料１３の厚みが厚くなっていくのと同じ分だけ薄くなっていく。そのため、ステージ２８の各位置Ｓｚに対する光検出器３６の受光感度は、図４に示すように、各位置Ｓｚに対する光検出器３１の受光感度を位置Ｓｚ方向に反転させたものとなると推定される。
【００４９】
なお、図４において、縦軸および横軸は、光検出器３１または光検出器３６の受光感度、およびステージ２８のｚ方向の位置Ｓｚを示している。また、図４において、実線の曲線は、各位置Ｓｚに対する光検出器３１の受光感度を示しており、点線の曲線は、各位置Ｓｚに対する光検出器３６の受光感度を示している。
【００５０】
図４において、光検出器３６の受光感度テーブルでは、＋ｚ方向にあるステージ２８の位置Ｓｚほど、その位置Ｓｚにおける受光感度が低くなっている。
【００５１】
ここで、光検出器３６の受光感度テーブルは、位置Ｓｚ方向に反転された光検出器３１の受光感度テーブルに、オフセット値が加算されたものとされている。
【００５２】
このオフセット値は、主に、スポット形成領域６１から光検出器３１までの間にある走査型顕微鏡１２の第１の集光光学系と、スポット形成領域６１から光検出器３６までの間にある走査型顕微鏡１２の第２の集光光学系との差により予め定められている。
【００５３】
すなわち、対物レンズ２７等からなる対物レンズ２７側の第１の集光光学系と、コンデンサレンズ３２等からなるコンデンサレンズ３２側の第２の集光光学系とでは、レンズ等の明るさが異なる。そのため、試料１３表面から射出された観察光の光量が同じであっても、光検出器３１と光検出器３６とでは、設定すべき受光感度には差が生じることになる。オフセット値は、このような受光感度の差分を補正するために、予め算出された補正値である。
【００５４】
このように、コンピュータ１１は、ステージ２８の位置Ｓｚを反転させた、光検出器３１の受光感度テーブルと、予め用意されたオフセット値とを用いて、光検出器３６の受光感度テーブルを生成し、記録する。
【００５５】
例えば、光検出器３１の受光感度テーブルにおいて、ステージ２８の位置Ｓｚが「−４０」、「０」、および「４０」のそれぞれにおける受光感度が、「１００」、「１１０」、および「１５０」であったとする。
【００５６】
このとき、受光感度テーブルを位置Ｓｚ方向に反転させると、反転後の位置Ｓｚ「−４０」、「０」、および「４０」のそれぞれにおける受光感度は、「１５０」、「１１０」、および「１００」となる。コンピュータ１１は、これらの反転後の各位置Ｓｚの受光感度に、オフセット値として、例えば「２０」を加算し、光検出器３６の受光感度テーブルとする。
【００５７】
この場合、光検出器３６の受光感度テーブルにおいて、ステージ２８の位置Ｓｚが「−４０」、「０」、および「４０」のそれぞれにおける受光感度は、「１７０」、「１３０」、および「１２０」となる。
【００５８】
このように、反転後の光検出器３１の受光感度テーブルにオフセット値を加算して、光検出器３６の受光感度テーブルとすることで、簡単に光検出器３６の受光感度テーブルを得ることができる。この場合、反転前後の受光感度テーブルにおいて、位置Ｓｚの変化に対する受光感度の変化量が同じとなる。
【００５９】
なお、反転前後の受光感度テーブルにおいて、位置Ｓｚの変化に対する受光感度の変化率が同じとなるように、受光感度テーブルが生成されてもよい。
【００６０】
そのような場合、コンピュータ１１は、例えば、光検出器３６の受光感度テーブルの注目する位置Ｓｚの受光感度を次のようにして求める。すなわち、これから得ようとする光検出器３６の受光感度テーブルの注目する位置Ｓｚを位置Ｓｚｃとする。また、反転後の光検出器３１の受光感度テーブルにおいて、基準となる位置Ｓｚ、その基準となる位置Ｓｚの受光感度、および位置Ｓｚｃの受光感度を、それぞれＳＯ、ｆ（Ｏ）、およびｆ（ｚｃ）とする。
【００６１】
このとき、コンピュータ１１は、受光感度ｆ（Ｏ）にオフセット値を加算して得られた値に、さらに受光感度ｆ（ｚｃ）と受光感度ｆ（Ｏ）の比を乗算し、その結果得られた値を、得ようとする光検出器３６の受光感度テーブルの位置Ｓｚｃに対する受光感度Ｆ（ｚｃ）とする。
【００６２】
例えば、光検出器３１の受光感度テーブルにおいて、ステージ２８の位置Ｓｚが「−４０」、「０」、および「４０」のそれぞれにおける受光感度が、「１００」、「１１０」、および「１５０」であり、オフセット値が「２０」であったとする。
【００６３】
この受光感度テーブルを位置方向に反転させると、反転後の受光感度テーブルにおいて、位置Ｓｚが「−４０」、「０」、および「４０」のそれぞれにおける受光感度は、「１５０」、「１１０」、および「１００」となる。
【００６４】
そして、反転後の位置Ｓｚ＝４０を基準となる位置ＳＯとすると、位置ＳＯに対する位置Ｓｚ＝０と、位置Ｓｚ＝−４０における受光感度の変化率は、それぞれ「１．１」（1.1＝110／100）および「１．５」（1.5＝150／100）となる。したがって、得ようとする光検出器３６の受光感度テーブルにおいて、位置Ｓｚが「−４０」、「０」、および「４０」のそれぞれにおける受光感度は、「１８０」（180＝（100＋20）×1.5）、「１３２」（132＝（100＋20）×1.1）、および「１２０」（120＝（100＋20）×1.0）となる。
【００６５】
このように、受光感度の変化率に基づいて、光検出器３６の受光感度テーブルを生成する場合においても、光検出器３１の受光感度テーブルから、光検出器３６の受光感度テーブルを簡単に得ることができる。
【００６６】
なお、光検出器３６の受光感度テーブルが生成されると、コンピュータ１１が、得られた受光感度テーブルをそのまま記録するようにしてもよいし、ユーザの操作に応じて、光検出器３６の受光感度テーブルが微調整されるようにしてもよい。
【００６７】
受光感度テーブルの微調整が行なわれる場合、例えばコンピュータ１１は、光検出器３６の受光感度テーブルを表示し、ユーザは、表示された受光感度テーブルを見ながら、位置Ｓｚに対する受光感度の値を変更させる。ユーザにより受光感度の変更後の値が指定されると、コンピュータ１１は、ユーザの指定に応じて位置Ｓｚの受光感度を変更し、最終的に得られた受光感度テーブルを、光検出器３６の受光感度テーブルとして記録する。
【００６８】
以上のようにして、受光感度テーブルが得られると、コンピュータ１１は、試料１３の観察時に、受光感度テーブルを用いて光検出器３１と光検出器３６の受光感度を変化させながら、各観察面の観察画像を取得する。
【００６９】
すなわち、コンピュータ１１は、光源２１から照明光を射出させるとともに、ガルバノミラー２５の動作を制御する。光源２１からの照明光は、照明用レンズ２２乃至対物レンズ２７を通って試料１３の観察面に照射される。このとき、ガルバノミラー２５は、照明光を偏向させることにより、照明光で観察面を走査する。
【００７０】
また、観察面に照明光が照射されると、照明光のスポット形成領域からは観察光が射出される。対物レンズ２７側に射出された観察光は、対物レンズ２７、蛍光導入用ダイクロイックミラー２６、蛍光フィルタ２９、および集光レンズ３０を通って光検出器３１に受光される。一方、コンデンサレンズ３２側に射出された観察光は、コンデンサレンズ３２乃至集光レンズ３５を通って、光検出器３６に受光される。
【００７１】
すると、光検出器３１と光検出器３６からコンピュータ１１には、観察光の受光強度に応じたデジタルデータが供給されるので、コンピュータ１１は、供給されたこれらのデジタルデータから観察画像の各画素データを生成し、記録する。
【００７２】
また、試料１３の観察時において、コンピュータ１１は、試料１３の目的とする観察面上に照明光のスポットが形成されるように、電動ｚステージ３７を制御してステージ２８を移動させる。さらに、コンピュータ１１は、記録している受光感度テーブルを参照し、ステージ２８の移動と同期させて、光検出器３１と光検出器３６の受光感度を変更する。すなわち、コンピュータ１１は、光検出器３１と光検出器３６の受光感度テーブルから、現時点のステージ２８の位置Ｓｚに対する受光感度を読み出して、光検出器３１と光検出器３６の受光感度を、読み出した受光感度に変更する。
【００７３】
以上のように、２つの光検出器のうちの一方の受光感度テーブルを反転させて、他方の光検出器の受光感度テーブルを生成することで、より簡単に受光感度テーブルを得ることができる。したがって、試料１３の蛍光観察時に、この受光感度テーブルを用いて、光検出器の受光感度を変更すれば、より簡単に、より明るく鮮明な観察画像を得ることができるようになる。
【００７４】
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００７５】
１１ コンピュータ， １２ 走査型顕微鏡， １３ 試料， ２７ 対物レンズ， ２８ ステージ， ３１ 光検出器， ３２ コンデンサレンズ， ３６ 光検出器， ３７ 電動ｚステージ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
照明光で試料の観察面を走査して前記観察面の画像を取得する走査型顕微鏡であって、
前記照明光を前記観察面に照射する照明光学系と、
前記試料が載置され、前記照明光学系の光軸方向に移動するステージと、
前記照明光の照射により生じた観察光のうち、前記照明光学系の方向である第１の方向に射出された観察光を第１の光検出器に導く第１の集光光学系と、
前記観察光のうち、前記第１の方向と反対方向に射出された前記観察光を第２の光検出器に導く第２の集光光学系と、
前記第１の光検出器が前記観察光を受光して得られたデータ、および前記第２の光検出器が前記観察光を受光して得られたデータから、前記画像を生成する画像生成手段と、
前記ステージの前記光軸方向の各位置に対して定められた前記第１の光検出器の受光感度を示す第１の受光感度テーブルに基づいて、前記第１の光検出器の受光感度を変更するとともに、前記第１の受光感度テーブルの各位置の受光感度を位置方向に反転させて、前記ステージの前記光軸方向の各位置に対する前記第２の光検出器の受光感度を示す第２の受光感度テーブルを生成し、前記第２の受光感度テーブルに基づいて、前記第２の光検出器の受光感度を変更するテーブル生成手段と
を備えることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記テーブル生成手段は、前記光軸方向に並ぶ前記試料の複数の前記観察面のそれぞれの前記画像に基づいて、前記第１の受光感度テーブルを生成する
ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記テーブル生成手段は、反転後の前記第１の受光感度テーブルが示す前記ステージの各位置の受光感度に、予め求められたオフセット値を加算することにより、前記第２の受光感度テーブルを生成する
ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項４】
前記テーブル生成手段は、反転後の前記第１の受光感度テーブルが示す前記ステージの基準位置の受光感度と、所定の位置の受光感度との比を求め、反転後の前記第１の受光感度テーブルが示す前記基準位置の受光感度に予め求められたオフセット値を加算し、前記オフセット値が加算された受光感度に前記比を乗算することで、前記第２の受光感度テーブルが示す前記所定の位置の受光感度を算出する
ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項１】
照明光で試料の観察面を走査して前記観察面の画像を取得する走査型顕微鏡であって、
前記照明光を前記観察面に照射する照明光学系と、
前記試料が載置され、前記照明光学系の光軸方向に移動するステージと、
前記照明光の照射により生じた観察光のうち、前記照明光学系の方向である第１の方向に射出された観察光を第１の光検出器に導く第１の集光光学系と、
前記観察光のうち、前記第１の方向と反対方向に射出された前記観察光を第２の光検出器に導く第２の集光光学系と、
前記第１の光検出器が前記観察光を受光して得られたデータ、および前記第２の光検出器が前記観察光を受光して得られたデータから、前記画像を生成する画像生成手段と、
前記ステージの前記光軸方向の各位置に対して定められた前記第１の光検出器の受光感度を示す第１の受光感度テーブルに基づいて、前記第１の光検出器の受光感度を変更するとともに、前記第１の受光感度テーブルの各位置の受光感度を位置方向に反転させて、前記ステージの前記光軸方向の各位置に対する前記第２の光検出器の受光感度を示す第２の受光感度テーブルを生成し、前記第２の受光感度テーブルに基づいて、前記第２の光検出器の受光感度を変更するテーブル生成手段と
を備えることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記テーブル生成手段は、前記光軸方向に並ぶ前記試料の複数の前記観察面のそれぞれの前記画像に基づいて、前記第１の受光感度テーブルを生成する
ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記テーブル生成手段は、反転後の前記第１の受光感度テーブルが示す前記ステージの各位置の受光感度に、予め求められたオフセット値を加算することにより、前記第２の受光感度テーブルを生成する
ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項４】
前記テーブル生成手段は、反転後の前記第１の受光感度テーブルが示す前記ステージの基準位置の受光感度と、所定の位置の受光感度との比を求め、反転後の前記第１の受光感度テーブルが示す前記基準位置の受光感度に予め求められたオフセット値を加算し、前記オフセット値が加算された受光感度に前記比を乗算することで、前記第２の受光感度テーブルが示す前記所定の位置の受光感度を算出する
ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−２８６１（Ｐ２０１２−２８６１Ａ）
【公開日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１３５１１０（Ｐ２０１０−１３５１１０）
【出願日】平成２２年６月１４日（２０１０．６．１４）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１４日（２０１０．６．１４）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
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