本発明は、ａ）対象の異種ヌクレオチド配列をコードする少なくも１つの第一ヌクレオチド配列；およびｂ）少なくとも２つの第二の異種ヌクレオチド配列を含む、単離された核酸を提供し、前記第二の異種ヌクレオチド配列は、各々、ｉ）第一イントロンを規定するスプライス要素の第一セット（前記第一イントロンは、スプライス要素の第二セットに活性が不在であるとき、生物学的機能を付与する第一ＲＮＡ分子を産生させるようにスプライシングすることによって除去される）；およびｉｉ）前記第一イントロンとは異なる１つ以上のイントロンを規定するスプライス要素の第二セット（前記第一イントロンとは異なる前記１つ以上のイントロンは、前記スプライス要素の第二セットが活性であるとき、ＲＮＡ分子を産生させないようにおよび／または生物学的機能を付与しない第二ＲＮＡ分子を産生させるようにスプライシングすることによって除去される）を含む。さらに、トランスジーン発現を調節するための本発明の核酸の使用方法を提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００５年４月２９日出願の米国特許仮出願第６０／６７６，１３９号の利益を合衆国法典３５巻１１９条（ｅ）項の下で主張するものである。前記仮出願の全内容は、引用により本明細書の一部をなすものとする。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、転写後レベルで核酸の発現を調節するための組成物およびそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子療法における最近の進展により、そのようなプロトコルによる様々な長期疾患の有効な治療への期待が高まっている。そして、安全で柔軟な治療には遺伝子発現の制御が望ましいことが、明らかになってきた。テトラサイクリン応答性の系、ラパマイシン調節タンパク質二量体化および多数の他のものを含む、多数の異なる調節系が、遺伝子療法ベクターに関して検査され、インビトロでもインビボでも遺伝子発現を調節することが証明された。これらの系の大多数は、転写活性化を制御することによって機能し、ならびにこれらは、外因性哺乳動物遺伝子調節経路由来のものであるか、転写活性化ドメインと組み合わされた薬物応答性成分の人工ハイブリッドである。これらの系は、トランスジーンに加えて１つ以上のタンパク質の発現、および外因性薬物、または転写を活性化するもしくは抑制する他の化合物の投与を必要とする。パッケージング容量が限られている遺伝子療法用ベクター、例えばアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレトロウイルスベクターは、トランスジーンのサイズを限定することがあり、またはすべての必須成分を送達するために２つの別のベクターの使用を必要とすることがある。これらの系を使用して転写を有効に制御することもできるが、これらの大きな系は、非現実的であるか扱い難い場合が多い。
【０００４】
内因性遺伝子発現は、外因性遺伝子発現の制御に活用することもできる幾つかの転写後レベルで調節される。ＲＮＡの産生は、転写速度により制御されるが、機能的なＲＮＡは、正しい遺伝子産物を産生させることができるに先立ち、正しいスプライシングを必要とする。トランスジーンＲＮＡのスプライシングを調節することにより、遺伝子産物の産生を制御することができる。
【０００５】
特に長期治療を必要とする疾病については、遺伝子療法用ベクターへの免疫応答も重要な問題になっている。免疫系は、ベクターそれら自体に応答し得るばかりでなく、それらが産生するタンパク質にも応答し得る。非常に成功した調節系の多くが、ハイブリッドまたは異種白質を含むため、これらは、誘導性免疫反応を特に受けやすく、また幾つかの系は、齧歯動物および非ヒト霊長類においてこのような免疫反応を誘導することが証明されている。
【０００６】
本発明は、以前に記載された遺伝子発現系の短所を伴わない遺伝子発現制御のための組成物および方法を提供することにより、当分野における以前の欠点を克服する。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、Ａ）関心のある異種ヌクレオチド配列をコードする少なくとも１つの第一ヌクレオチド配列；およびＢ）少なくとも２つの異種第二ヌクレオチド配列を含む、単離された核酸を提供し、この場合、前記異種第二ヌクレオチド配列の各々は、ｉ）第一イントロンを規定するスプライス要素の第一セット（前記第一イントロンは、スプライス要素の第二セットに活性が不在であるとき、生物学的機能を付与する第一ＲＮＡ分子を産生させるようにスプライシングすることによって除去される）；およびｉｉ）前記第一イントロンとは異なる１つ以上のイントロンを規定するスプライス要素の第二セット（前記第一イントロンとは異なる前記１つ以上のイントロンは、前記スプライス要素の第二セットが活性であるとき、ＲＮＡ分子を産生させないようにおよび／または生物学的機能を付与しない第二ＲＮＡ分子を産生させるようにスプライシングすることによって除去される）を含み；前記異種第二ヌクレオチド配列は、ａ）前記第一ヌクレオチド配列内のタンデムでの第二ヌクレオチド配列、ｂ）前記第一ヌクレオチド配列内の少なくとも２５塩基対離れた間隔に配置されている第二ヌクレオチド配列、ｃ）前記第一ヌクレオチド配列内の少なくとも５０塩基対離れた間隔に配置されている第二ヌクレオチド配列、ｄ）前記第一ヌクレオチド配列内の少なくとも７５塩基対離れた間隔に配置されている第二ヌクレオチド配列、ｅ）前記第一ヌクレオチド配列内の少なくとも１００塩基対離れた間隔に配置されている第二ヌクレオチド配列、ｆ）前記第一ヌクレオチド配列内の少なくとも２００塩基対離れた間隔に配置されている第二ヌクレオチド配列、ｇ）前記第一ヌクレオチド配列内の少なくとも３００塩基対離れた間隔に配置されている第二ヌクレオチド配列、ｈ）第一の第二ヌクレオチド配列がプロモーターと前記第一ヌクレオチド配列の間に位置し、且つ、第二の第二ヌクレオチド配列が前記第一ヌクレオチド配列内に位置する、第二ヌクレオチド配列；およびｉ）第一の第二ヌクレオチド配列が、前記第一ヌクレオチド配列内のオープンリーディングフレームとポリ（Ａ）テイルまたはポリＡシグナルの間に位置し、且つ、第二の第二ヌクレオチド配列が、前記第一ヌクレオチド配列の前記オープンリーディングフレーム内に位置する、第二ヌクレオチド配列、からなる群より選択される。
【０００８】
さらに、Ａ）関心のある異種ヌクレオチド配列をコードする少なくとも１つの第一ヌクレオチド配列；およびＢ）少なくとも１つの第二異種ヌクレオチド配列を含む、単離された核酸を本明細書において提供し、ｉ）第一イントロンを規定するスプライス要素の第一セット（前記第一イントロンは、スプライス要素の第二セットに活性が不在であるとき、生物学的機能を付与する第一ＲＮＡ分子を産生させるようにスプライシングすることによって除去される）；およびｉｉ）前記第一イントロンとは異なるイントロンを規定するスプライス要素の第二セット（前記第二イントロンは、前記スプライス要素の第二セットが活性であるとき、ＲＮＡ分子を産生させないようにおよび／または生物学的機能を付与しない第二ＲＮＡ分子を産生させるようにスプライシングすることによって除去される）を含み、前記第二ヌクレオチド配列は、ａ）配列番号５０（５６４ＣＴ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）、ｂ）配列番号５１（６５７Ｇ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）、ｃ）配列番号５２（６５８Ｔ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）、ｄ）配列番号２０（６５７ＧＴ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）、ｅ）配列番号５３（２００ｂｐ欠失を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）、ｆ）配列番号６８（１９７ｂｐのみを有するＩＶＳ２−６５４イントロン）、ｇ）配列番号５５（６Ａ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）、ｈ）配列番号５６（５６４Ｃ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）、ｉ）配列番号５７（８４１Ａ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）、ｊ）配列番号５９（５６４ＣＴ突然変異を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）、配列番号５０（５６４ＣＴ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）、配列番号５４（４２５ｂｐ欠失を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）、配列番号６９（２４７ｂｐのみを有するＩＶＳ２−６５４イントロン）、配列番号５９（５６４ＣＴ突然変異を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）、配列番号６０（６５７Ｇ突然変異を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）、配列番号６１（６５８Ｔ突然変異を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）、配列番号６２（６５７ＧＴ突然変異を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）、配列番号６３（２００ｂｐ欠失を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）、配列番号６４（４２５ｂｐ欠失を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）、配列番号６５（６Ａ突然変異を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）、配列番号６６（５６４Ｃ突然変異を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）、配列番号６７（８４１Ａ突然変異を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【０００９】
加えて、タンパク質を産生させるための方法を本明細書において提供し、ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で本発明の核酸とブロッキングオリゴヌクレオチドを接触させること（前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、スプライス要素の第二セットの構成要素をブロックし、その結果、スプライシングにより第一イントロンを除去し、第一ＲＮＡを産生させる）；およびｂ）その第一ＲＮＡを翻訳して、タンパク質を産生させることを含む。
【００１０】
生物学的機能を付与するＲＮＡを産生させるための方法も本明細書において提供し、ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で本発明の核酸とブロッキングオリゴヌクレオチドを接触させること（前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、スプライス要素の第二セットの構成要素をブロックし、その結果、スプライシングにより第一イントロンを除去し、第一ＲＮＡを産生させる）；およびｂ）その第一ＲＮＡを翻訳して、生物学的機能を付与するＲＮＡを産生させることを含む。
【００１１】
さらに、本発明は、生物学的機能を付与するＲＮＡを産生させるための方法を提供し、ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で本発明の核酸と小分子を接触させること（前記小分子は、スプライス要素の第二セットの構成要素をブロックし、その結果、第一イントロンを除去し、第一ＲＮＡを産生させる）；およびｂ）その第一ＲＮＡを翻訳して、生物学的機能を付与するＲＮＡを産生させることを含む。
【００１２】
加えて、被験者における生物学的機能を付与する異種ＲＮＡの産生を調節する方法を本明細書において提供し、ａ）本発明の核酸を被験者に導入すること；ならびにｂ）スプライス要素の第二セットの構成要素をブロックするブロッキングオリゴヌクレオチドおよび／または小分子を、前記異種ＲＮＡの産生を望む時点で、その被験者に導入することを含み、それによってその被験者における前記異種ＲＮＡの産生を調節する。
【００１３】
さらなる実施形態において、本発明は、被験者におけるタンパク質の産生を調節する方法を提供し、ａ）本発明の核酸を被験者に導入すること；ならびにｂ）スプライス要素の第二セットの構成要素をブロックするブロッキングオリゴヌクレオチドおよび／または小分子を、前記異種タンパク質の産生を望む時点で、その被験者に導入することを含み、それによってその被験者における前記異種タンパク質の産生を調節する。
【００１４】
さらに、本発明は、本発明の核酸のスプライス要素の第二セットの構成要素をブロックする化合物を同定する方法を提供し、ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で本発明の核酸をその化合物と接触させること；ならびにｂ）本発明の第一ＲＮＡの産生および／または本発明の第二ＲＮＡの産生を検出することを含み、それによって、第一ＲＮＡの産生により、本発明の核酸のスプライス要素の第二セットの構成要素をブロックする化合物を同定する。
【００１５】
生物学的機能を付与する異種ＲＮＡの産生を阻害するための方法も本明細書において提供し、ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で本発明の核酸と小分子を接触させることを含み、前記小分子がスプライス要素の第一セットの構成要素をブロックし、その結果、第二イントロンを除去し、それによって第一ＲＮＡの産生を阻害する。
【００１６】
加えて、本発明は、異種タンパク質の産生を阻害するための方法を提供し、ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で本発明の核酸と小分子を接触させることを含み、前記小分子がスプライス要素の第一セットの構成要素をブロックし、その結果、第二イントロンを除去し、それによって第一ＲＮＡの産生を阻害する。
【００１７】
さらなる実施形態において、本発明は、生物学的機能を付与する異種ＲＮＡの産生を阻害するための方法を提供し、ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で本発明の核酸とブロッキングオリゴヌクレオチドを接触させることを含み、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、スプライス要素の第一セットの構成要素をブロックし、その結果、第二イントロンを除去し、それによって第一ＲＮＡの産生を阻害する。
【００１８】
加えて、本発明は、異種タンパク質の産生を阻害するための方法を提供し、ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で本発明の核酸とブロッキングオリゴヌクレオチドを接触させることを含み、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、スプライス要素の第一セットの構成要素をブロックし、その結果、第二イントロンを除去し、それによって第一ＲＮＡの産生を阻害する。
【００１９】
本発明の上述および他の目的は、以下に示す本明細書の中で詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本明細書において、「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、そのような使用状況に依存して単数形または複数形であり得る。例えば、「ａ ｃｅｌｌ」は、単一の細胞を意味することもあり、または多数の細胞を意味することもある。
【００２１】
本明細書において、「および／または」は、付随して列挙される項目のうちの１つ以上の任意およびすべての可能な組み合わせ、ならびに選択肢（「または」）で解釈するときには組み合わせの欠如を指し、包含する。
【００２２】
さらに、測定可能な値、例えば、本発明の組成物の量、用量、時間、温度などに言及するときに本明細書において用いる用語「約」は、指定量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらに±０．１％の偏差を包含することを意味する。
【００２３】
本発明は、外因性核酸などの核酸の発現を、例えばインビボで、転写後レベルで調節することができるという予想外の発見に基づく。このような調節は、オリゴヌクレオチド、小分子、および／または特定部位のスプライシング活性を選択的にブロックする他の化合物の存在または不在によって、その核酸に付随する異なるイントロンを選択的スプライシングすることに基づく。従って、１つの実施形態において、本発明は、ａ）関心のある異種ヌクレオチド配列をコードする少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ以上）の第一の外因性ヌクレオチド配列；およびｂ）少なくとも１つ（例えば、２つ、３つ、４つ以上）の外因性または異種第二ヌクレオチド配列、を含む、から本質的になる、および／またはからなる単離された核酸を提供し、前記第二外因性または異種第二ヌクレオチド配列は、各々、ｉ）第一イントロンを規定するスプライス要素の第一セット（前記第一イントロンは、スプライス要素の第二セットに活性が不在であるとき、生物学的機能を付与する第一ＲＮＡ分子を産生させるようにスプライシングすることによって除去される）；およびｉｉ）前記第一イントロンとは異なる１つ以上のイントロンを規定するスプライス要素の第二セットを含み、前記第一イントロンとは異なる前記１つ以上のイントロンは、前記スプライス要素の第二セットが活性であるとき、ＲＮＡ分子を産生させないようにおよび／または生物学的機能を付与しない第二ＲＮＡ分子を産生させるようにスプライシングすることによって除去される。
【００２４】
利用可能な非常に多数の系、例えば公知突然変異イントロン系からのものを利用して、本発明の組成物を作ることおよび本発明の方法を行うことができる。例えば、一定のサレセミア（ｔｈａｌｌｅｓｅｍｉａｓ）の原因となるβ−グロビン突然変異イントロンを利用することができる（例えば、本明細書に記載するような追加の突然変異を伴うおよび／または伴わない、配列番号５８、配列番号１８、配列番号１９）（例えば、Ｓｕｗａｎｍａｎｅｅ ｅｔ ａｌ．「Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ＩＶＳ２−６５４ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉｃ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｆｒｅｅ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００２）６２：５４５−５５３（これは、その全体が引用により本明細書の一部をなすものとする）参照）。他の系としては、嚢胞性線維性膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子（例えば、追加の突然変異を伴うおよび伴わない、配列番号７０、配列番号７１）の突然変異イントロンが挙げられる（例えば、ＮＣＢＩゲノム注釈のビルド３６バージョン１からのアクセッション番号ＮＣ＿０００００７、ヌクレオチド１１６９０７２５３から１１７０９５９５１；Ｈｉｇｈｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）「Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｇｅｎｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｕｔ ｎｏｒｍａｌ ｓｗｅａｔ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ」Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３３１：９７４−９８０（これは、その全体が引用により本明細書の一部をなすものとする）参照）。
【００２５】
追加の系としては、ジストロフィン遺伝子（追加の突然変異を伴うおよび伴わない、配列番号７４、配列番号７５）の突然変異が挙げられる（例えば、ＮＣＢＩゲノム注釈のビルド３６バージョン１からのアクセッション番号ＮＣ＿００００２３、ヌクレオチド３１０４７２６６から３３２６７６４７；Ｔｕｆｆｅｒｙ−Ｇｉｒａｕｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）「Ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｕｓｅ ｏｆ ｃｒｙｐｔｉｃ ｓｐｌｉｃｅ ｓｉｔｅｓ ａｓ ａ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｄｅｆｅｃｔｓ」Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ １４：３５９−３６８；Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｌｔｉｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｍａｋｅｓ ｍｏｒｅ ｓｅｎｓｅ」Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７４：８３−９２；Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）「ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４６：２５５−２５９；Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ ９８：４２−４７；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．（２００３）「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｅｄ ｅｘｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｄｘ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｏｕｓｅ」Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１００９−１０１４；ＫｏＩｅ ｅｔ ａｌ．，（２００４）「ＲＮＡ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｂｙ ｓｐｌｉｃｅ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｐｏｌｏｎｉｃａ ５１：３７３−３７８（前記すべてが、それら全体を引用により本明細書の一部をなすものとする）参照）。
【００２６】
本発明の方法および組成物において利用することができるさらにもう１つの系は、選択的スプライシング異常の原因となる突然変異タウ遺伝子（例えば、配列番号７８）（例えば、Ｋａｌｂｆｕｓｓ ｅｔ ａｌ．「Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｉｎ ｔａｕ ｉｎ ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ ａｎｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １７」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４２９８６−４２９９３（２００１）（これは、その全体が引用により本明細書の一部をなすものとする））、ならびに現在知られているまたは将来同定されるような、スプライシング異常を生じさせる任意の他のそのような突然変異遺伝子である。選択的スプライスセットを導入する修飾イントロンも、当業者に周知の方法に従って、産生させ、検査することができる。
【００２７】
特定の実施形態において、本発明は、Ａ）関心のある異種ヌクレオチド配列をコードする少なくとも１つの第一ヌクレオチド配列；およびＢ）少なくとも２つの異種第二ヌクレオチド配列を含む、単離された核酸を提供し、前記異種第二ヌクレオチド配列は、各々、ｉ）第一イントロンを規定するスプライス要素の第一セット（前記第一イントロンは、スプライス要素の第二セットに活性が不在であるとき、生物学的機能を付与する第一ＲＮＡ分子を産生させるようにスプライシングすることによって除去される）；およびｉｉ）前記第一イントロンとは異なる１つ以上のイントロンを規定するスプライス要素の第二セット（前記第一イントロンとは異なる前記１つ以上のイントロンは、前記スプライス要素の第二セットが活性であるとき、ＲＮＡ分子を産生させないようにおよび／または生物学的機能を付与しない第二ＲＮＡ分子を産生させるようにスプライシングすることによって除去される）を含み；前記異種第二ヌクレオチド配列は、ａ）前記第一ヌクレオチド配列内のタンデムでの第二ヌクレオチド配列、ｂ）前記第一ヌクレオチド配列内の少なくとも２５塩基対離れた間隔に配置されている第二ヌクレオチド配列、ｃ）前記第一ヌクレオチド配列内の少なくとも５０塩基対離れた間隔に配置されている第二ヌクレオチド配列、ｄ）前記第一ヌクレオチド配列内の少なくとも７５塩基対離れた間隔に配置されている第二ヌクレオチド配列、ｅ）前記第一ヌクレオチド配列内の少なくとも１００塩基対離れた間隔に配置されている第二ヌクレオチド配列、ｆ）前記第一ヌクレオチド配列内の少なくとも２００塩基対離れた間隔に配置されている第二ヌクレオチド配列、ｇ）前記第一ヌクレオチド配列内の少なくとも３００塩基対離れた間隔に配置されている第二ヌクレオチド配列、ｈ）第一の第二ヌクレオチド配列が、プロモーターと前記第一ヌクレオチド配列の間に位置し、且つ、第二の第二ヌクレオチド配列が、前記第一ヌクレオチド配列内に位置する、第二ヌクレオチド配列；およびｉ）第一の第二ヌクレオチド配列が、前記第一ヌクレオチド配列内のオープンリーディングフレームとポリ（Ａ）テイルまたはポリＡシグナルの間に位置し、且つ、第二の第二ヌクレオチド配列が、前記第一ヌクレオチド配列の前記オープンリーディングフレーム内に位置する、第二ヌクレオチド配列、からなる群より選択される。これらは、イントロン間の距離の具体的な例であるとはいえ、本明細書に記載するように、２つ以上のイントロンがそれらを隔てている任意の数、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００など、の塩基対を有することがあることは、理解される。さらに、本発明の第二ヌクレオチド配列が、本明細書に記載するように、１つ以上の突然変異を任意の組み合わせで含むことができることは理解される。
【００２８】
さらなる実施形態において、本発明は、Ａ）関心のある異種ヌクレオチド配列をコードする少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ以上）の第一ヌクレオチド配列；およびＢ）第二異種ヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供し、ｉ）第一イントロンを規定するスプライス要素の第一セット（前記第一イントロンは、スプライス要素の第二セットに活性が不在であるとき、生物学的機能を付与する第一ＲＮＡ分子を産生させるようにスプライシングすることによって除去される）；およびｉｉ）前記第一イントロンとは異なる少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ以上）のイントロンを規定するスプライス要素の第二セット（第一イントロンとは異なる前記少なくとも１つのイントロンは、前記スプライス要素の第二セットが活性であるとき、ＲＮＡ分子を産生させないようにおよび／または生物学的機能を付与しない第二ＲＮＡ分子を産生させるようにスプライシングすることによって除去される）を含み、ならびに前記第二ヌクレオチド配列は、ａ）配列番号５０（５６４ＣＴ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）、ｂ）配列番号５１（６５７Ｇ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）、ｃ）配列番号５２（６５８Ｔ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）、ｄ）配列番号２０（６５７ＧＴ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）、ｅ）配列番号５３（２００ｂｐ欠失を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）、ｆ）配列番号６８（１９７ｂｐのみを有するＩＶＳ２−６５４イントロン）、ｇ）配列番号５５（６Ａ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）、ｈ）配列番号５６（５６４Ｃ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）、ｉ）配列番号５７（８４１Ａ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）、ｊ）配列番号５９（５６４ＣＴ突然変異を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）、ｋ）配列番号６０（６５７Ｇ突然変異を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）、ｌ）配列番号６１（６５８Ｔ突然変異を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）、ｍ）配列番号６２（６５７ＧＴ突然変異を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）、ｎ）配列番号６３（２００ｂｐ欠失を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）、ｏ）配列番号６４（４２５ｂｐ欠失を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）、ｐ）配列番号６５（６Ａ突然変異を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）、ｑ）配列番号６６（５６４Ｃ突然変異を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）、ｒ）配列番号６７（８４１Ａ突然変異を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）およびこれらの任意の組み合わせ（単独を含む）からなる群より選択される。
【００２９】
前記第一ヌクレオチド配列は、任意の組み合わせで、例えば、タンパク質もしくはペプチド；ＲＮＡとしての酵素的活性を有するヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡｉ）；リボザイムをコードするヌクレオチド配列；アンチセンス配列をコードするヌクレオチド配列；および／または核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）をコードすることができる。さらに、前記第一ヌクレオチド配列は、１つ以上の突然変異を含むことができ、一部の実施形態において、そのような突然変異は、スプライス部位の規定および／またはスプライシング活性の変調に一定の役割を果たし得る。
【００３０】
本発明の第一ヌクレオチド配列および第二ヌクレオチド配列が、本発明の単離された核酸において、反復および／または交互のあらゆる組み合わせに関して、同じである場合があり、および／または異なる場合があることも理解される。
【００３１】
本発明の第二ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列、すなわち、１つ以上の突然変異を含むイントロンを規定するヌクレオチド配列であり得、その存在により、スプライス要素の第一セットおよびスプライス要素の第二セットが生じ得る。一部の実施形態において、前記第二ヌクレオチド配列は、イントロン−エキソン−イントロン領域を規定する配列であり得、この場合、イントロンおよび／またはエキソン領域いずれかにおける突然変異により、スプライス要素の第一セットおよびスプライス要素の第二セットが存在することとなる。この後者の実施形態において、スプライス要素の第二セットが活性であるときの結果は、イントロン−エキソン−イントロン領域のエキソンを含むＲＮＡの産生である。
【００３２】
本発明の核酸を含むベクター、ならびに本発明の核酸またはベクターを含む細胞を本明細書においてさらに提供する。一部の実施形態において、ｈｅベクターは、非ウイルスベクター、ウイルスベクターおよび合成生物ナノ粒子であり得るが、これらに限定されない。本発明のウイルスベクターの非限定的な例としては、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、バキュロウイルスベクターおよびキメラウイルスベクターが挙げられる。
【００３３】
本発明は、本発明の核酸を利用する様々な方法も提供する。従って、一部の実施形態において、本発明は、タンパク質および／または生物学的機能を付与するＲＮＡを産生させるための方法を提供し、ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で本発明の核酸とブロッキングオリゴヌクレオチドを接触させること（前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、スプライス要素の第二セットの構成要素をブロックし、その結果、スプライシングにより第一イントロンを除去し、第一ＲＮＡを産生させる）；およびｂ）その第一ＲＮＡを翻訳してタンパク質を産生させること、生物学的機能を付与するＲＮＡを産生させることを含む。
【００３４】
本発明のブロッキングオリゴヌクレオチドおよび／または小分子および／または他のブロッキング化合物を、本発明の核酸を含む細胞に導入することができ、そのような細胞は、インビトロでまたは本明細書に記載するような本発明の被験者（例えば、動物はヒトである場合もある）に存在し得る。
【００３５】
追加の実施形態において、本発明は、タンパク質およびまたは生物学的機能を付与するＲＮＡを産生させるための方法を提供し、ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で本発明のいずれかの核酸と小分子を接触させること（前記小分子は、スプライス要素の第二セットの構成要素をブロックし、その結果、第一イントロンを除去し、第一ＲＮＡを産生させる）；ならびにｂ）その第一ＲＮＡを翻訳して、タンパク質を産生させること、および／または生物学的機能を付与するＲＮＡを産生させることを含む。
【００３６】
加えて、本発明は、被験者における生物学的機能を付与する異種タンパク質および／またはＲＮＡの産生を調節する方法を提供し、ａ）本発明の核酸を被験者に導入すること；ならびにｂ）スプライス要素の第二セットの構成要素をブロックするブロッキングオリゴヌクレオチドおよび／または小分子を、前記異種タンパク質および／またはＲＮＡの産生を望む時点で、その被験者に導入することを含み、それによってその被験者における前記ＲＮＡの産生を調節する。
【００３７】
スクリーニング方法、例えば、本発明の核酸のスプライス要素の第二セットの構成要素をブロックする化合物を同定する方法も提供し、ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で本発明の核酸をその化合物と接触させること；ならびにｂ）第一ＲＮＡの産生および／または第二ＲＮＡの産生を検出することを含み、それによって、第一ＲＮＡの産生により、スプライス要素の第二セットの構成要素をブロックする化合物を同定する。
【００３８】
本明細書に記載する一定の実施形態において、トランスジーン発現系はＯＦＦポジションで（例えば、被験者に）導入され、本発明のブロッキングオリゴヌクレオチドおよび／または小分子との接触がその系をＯＮポジションに切り替える。ＯＮポジションで（例えば、被験者に）導入される系をＯＦＦポジションにする方法、例えば、生物学的機能を付与する異種タンパク質および／またはＲＮＡの産生を阻害するための方法を本明細書においてさらに提供し、ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で本発明の核酸をブロッキングオリゴヌクレオチドおよび／または小分子と接触させることを含み、前記小分子が、スプライス要素の第一セットの構成要素をブロックし、その結果、第二イントロンを除去し、それによって第一ＲＮＡの産生を阻害する。
【００３９】
イントロンは、真核ＤＮＡもしくはＲＮＡのコード部分、すなわち「エクソン」、の間に存在するそのＤＮＡもしくはＲＮＡの一部分である。イントロンおよびエキソンは、ＤＮＡから「一次転写体、ＲＮＡへの前駆体」（または「ｐｒｅ−ｍＲＮＡ」）と呼ばれるＲＮＡに転写される。イントロンは、エキソンによりコードされているタンパク質を産生させることができるように、そのｐｒｅ−ｍＲＮＡから除去しなければならない（本明細書において、用語「タンパク質」は、自然発生、野生型、または機能的タンパク質を指す）。ｐｒｅ−ｍＲＮＡからのイントロンの除去およびエキソンのその後の連結は、スプライシングプロセスにおいて行われる。
【００４０】
前記スプライシングプロセスは、転写の後（すなわち、転写後的に）だが翻訳の前に行われる一連の反応であって、これらの反応はスプライシング因子によって媒介される。従って、「ｐｒｅ−ｍＲＮＡ」は、複数のエキソンと１つ以上のイントロンの両方を含有するＲＮＡであり、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡまたはＲＮＡ）」は、任意のイントロンが除去されたＲＮＡであり、この場合、エキソンは、その後に互いに連結して、それらから、リボソームでの機能的タンパク質への翻訳によってまたは機能的ＲＮＡへの翻訳によって、遺伝子産物を生じさせることができる。
【００４１】
本明細書において、用語「翻訳」は、アミノ酸配列をコードするコドンを含むメッセンジャーＲＮＡに沿って移動するリボソームによって指示されるアミノ酸鎖（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）の産生を含む。本明細書においての用語「翻訳」は、ＲＮＡ分子のヌクレオチド配列をコードする相補ヌクレオチド配列（例えば、エキソン）からの機能的ＲＮＡ分子（例えば、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｎＲＮＡなど）の産生も含む。
【００４２】
イントロンは、スプライシングメカニズムの一部であり、スプライシングに必要とされる、１セットの「スプライス要素（ｓｐｌｉｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）」によって特徴づけられる。イントロンは、比較的短く、スプライシング反応を行う様々なスプライシング因子に結合する核酸セグメントを保存している。従って、各イントロンは、５’スプライス部位、３’スプライス部位、およびそれらの間に位置する分岐点によって規定される。スプライス要素は、エキソン内に位置するエキソンスプライシングエンハンサおよびサイレンサ、ならびにスプライス部位および分岐点からある距離を置いてイントロン内に位置するイントロンスプライシングエンハンサおよびサイレンサも含む。スプライス部位および分岐点に加えて、これらの要素は、選択的スプライシング、異常スプライシングおよび構成的スプライシングを制御する。
【００４３】
本発明の実施形態によると、第一ヌクレオチド配列は、任意の組み合わせで、タンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列、ＲＮＡとしての酵素的活性を有するヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡｉ）、リボザイムをコードするヌクレオチド配列、アンチセンス配列をコードするヌクレオチド配列および／または核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列であり得るが、これらに限定されない。
【００４４】
本明細書において、用語「外因性」および／または「異種」は、それが収容されている核酸構成体および／または送達ベクター（例えば、ウイルス送達ベクター）の中で自然には発生しないヌクレオチド配列も含むことができ、ならびに（例えば、自然には会合しないプロモーターまたはコード配列との会合により）他のヌクレオチド配列を基準にして非自然発生的環境および／または位置に配置されるヌクレオチド配列も含むことができる。従って、一部の実施形態において、本発明の第一ヌクレオチド配列は、それが導入される細胞に対して外因性または異種である（すなわち、非自然発生的である、自然に発生する状態では存在しない、および／または修飾されているおよび／または複製されている）本発明のタンパク質、ペプチドおよび／またはＲＮＡをコードすることができる。第一ヌクレオチド配列は、それが配置されるベクター（例えば、ウイルスベクター）に対して外因性または異種である場合もある。さらに、第二ヌクレオチド配列は、それが配置されるベクターに対して、および／またはそれがイントロンとして会合している第一ヌクレオチド配列に対して、および／またはそれが配置される細胞に対して、外因性または異種である場合がある。
【００４５】
あるいは、第一ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質、ペプチドまたはＲＮＡは、細胞に対して内因性であり得る（すなわち、その細胞内で自然に発生するもの）が、単離された核酸としてその細胞に導入されるおよび／またはその細胞内に存在する。「単離された核酸」とは、自然な状態の核酸に付随して通常見出される成分が実質的にまたは本質的に無い核酸を意味する。このような成分としては、他の細胞材料、組換え生産からの培地、および／またはその核酸を化学合成する際に使用された様々な化学物質が挙げられる。本発明の「単離された」核酸には、その核酸を採取した生物のゲノムＤＮＡ中の関心のある核酸に隣接する核酸配列（例えば、５’または３’末端に存在するコード配列）が一般に無い。しかし、本発明の核酸は、その核酸の基本的な特徴に有害な影響を及ぼさない幾つかの追加の塩基または部分を含むことができる。
【００４６】
本発明の「単離された」タンパク質またはペプチドとは、自然な状態のタンパク質またはペプチドに付随して通常見出される成分が実質的に無いタンパク質またはペプチドを意味する。
【００４７】
生物学的機能を付与する本発明の分子は、メッセンジャーＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、リボザイム、ＲＮＡｉ、ｓｎＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどであり得る。従って、一部の実施形態において、生物学的機能を付与するＲＮＡは、生物学的機能を付与するタンパク質もしくはペプチドに翻訳されるＲＮＡであり、またはそれは、本明細書に記載するような生物学的機能を付与するＲＮＡ（例えば、リボザイム、ＲＮＡｉ、ｓｎＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなど）に翻訳される、および／もしくはそのようなＲＮＡとして直接機能するＲＮＡである。
【００４８】
本発明の核酸の非限定的な例としては、任意の組み合わせで、配列番号１（プラスミドＴＲＣＢＡ−ｉｎｔ−ｌｕｃ ｍｕｔ）、配列番号２（プラスミドＴＲＣＢＡ−ｉｎｔ−ｌｕｃ（ｗｔ））、配列番号３（プラスミドＴＲＣＢＡ−ｉｎｔ−ｌｕｃ（６５７ＧＴ））、配列番号４（プラスミドＧＬ３−ｉｎｔ−Ｌｕｃ（ｍｕｔ））、配列番号５（ＧＬ３−ｉｎｔ−Ｌｕｃ（ｗｔ））、配列番号６（ＧＬ３−ｉｎｔ−Ｌｕｃ（６５７ＧＴ））、配列番号７（ＧＬ３−２ｉｎｔ−ｆｒｏｎ−ｓｐｈ（ｍｕｔ））、配列番号８（ＧＬ３−３ｉｎｔ−２ｆｒｏｎ−ｓｐｈ（ｍｕｔ））、配列番号９（ＧＬ３−ｉｎｔ−Ｌｕｃ Ａ（ｍｕｔ））、配列番号１０（ＧＬ３−ｉｎｔ−Ｌｕｃ Ｂ））、配列番号１１（ＧＬ３−ｉｎｔ−Ｌｕｃ Ｃ）、配列番号１２（ＧＬ３−ｉｎｔ−ｆｒｏｎ（ｍｕｔ））、配列番号１３（ＧＬ３−２ｉｎｔ−ｓｐｈ（ｍｕｔ））、配列番号１４（ＧＬ３−２ｉｎｔ−Ｓｐｈ−Ｃ）、配列番号１５（ＧＬ３−ｓｉｎｔ２００−ｓｐｈ（ｍｕｔ））、配列番号１６（ＧＬ３−ｓｉｎｔ２００−ｓｐｈ（６５７ＧＴ））、配列番号１７（ＧＬ３−ｓｉｎｔ４２５−ｓｐｈ）および／または配列番号３５（ＴＲＣＢＡ−ｉｎｔ−ＡＡＴ−６５４ＣＴ）に記載のヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、および／またはからなる核酸が挙げられる。
【００４９】
本明細書に記載するようなこれらの配列の機能的領域の非限定的な例も提供する（例えば、配列番号１〜１７のイントロンおよびコード配列（すなわち配列番号２１〜３４）、６５４Ｃ−Ｔ突然変異を含むイントロン（配列番号１８）、野生型イントロン（配列番号１９）、６５４Ｃ−Ｔ突然変異および６５７ＴＡ−ＧＴ突然変異を含むイントロン（配列番号２０）、ならびに配列番号３５のイントロンおよびコード配列（配列番号３６））。従って、本発明の核酸は、本明細書において第一ヌクレオチド配列として同定する１つまたは１つより多くのヌクレオチド配列および／またはその機能的領域を含む、から本質的になる、および／または成ることができる。このような第一ヌクレオチド配列および／または機能的領域は、同じヌクレオチド配列の反復を含む任意の組み合わせで、任意の順序で、ならびに互いに対しておよび／または本発明の核酸および核酸構成体の他の成分に対して任意の位置で、存在することができる。
【００５０】
本発明の核酸は、第一ヌクレオチド配列の発現を指示するプロモーターをさらに含むことができる。本発明の核酸に含めることができ、本発明の第一ヌクレオチド配列と作動可能に会合させることができるプロモーターの例としては、構成的プロモーターおよび／または誘導プロモーターが挙げられるが、これらに限定されず、これらの一部の非限定的な例としては、ウイルスプロモータ（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０）、組織特異的プロモーター（例えば、筋肉ＭＣＫ）、心臓（例えば、ＮＳＥ）、目（例えば、ＭＳＫ）および合成プロモーター（ＳＰ１要素）が挙げられる。本発明のプロモーターの一例は、本明細書の実施例に記載するようなニワトリβアクチンプロモータ（ＣＢまたはＣＢＡ）である。本発明のプロモーターは、本発明の核酸上の任意の位置に存在し得、そこで、それは、第一ヌクレオチド配列と作動可能に会合した状態にある。同じである場合もあり異なる場合もある１つ以上のプロモーターが、同じ核酸分子内に一緒に存在することもあり、あるいはその核酸分子上の互いに異なる位置、ならびに／またはその核酸上に存在する第一ヌクレオチド配列および／もしくは第二ヌクレオチド配列に対して異なる位置にあることもある。さらに、内在性リボソーム侵入シグナル（ＩＲＥＳ）および／または他のリボソーム読み過ごし要素が、本核酸分子上に存在することがある。同じである場合もあり異なる場合もある１つ以上のこのようなＩＲＥＳおよび／またはリボソーム読み過ごし要素が、同じ核酸分子内に一緒に存在することもあり、および／またはその核酸分子上の異なる位置に存在することもある。多数の第一ヌクレオチド配列が本発明の核酸分子上に存在するときには、このようなＩＲＥＳおよびリボソーム読み過ごし要素を用いて、キャップ非依存性メカニズムによりメッセンジャーＲＮＡ配列を翻訳することができる。
【００５１】
本発明の単離された核酸上にプロモーターが存在する本発明の実施形態において、そのプロモーターは、第一ヌクレオチド配列および／または第二ヌクレオチド配列に対してその核酸分子内の任意の位置にあり得る。例えば、第二ヌクレオチド配列は、プロモーターと第一ヌクレオチド配列の間に位置することができる。さらに、第二ヌクレオチド配列は、第一ヌクレオチド配列に対してその核酸分子内の任意の位置にあり得る。例えば、第二ヌクレオチド配列は、第一ヌクレオチド配列の前、後および／または中に位置することができる。一部の実施形態において、第二ヌクレオチド配列は、第一ヌクレオチド配列のヌクレオチドの５’側三分の一の範囲内の任意の位置、第一ヌクレオチド配列のヌクレオチドの中央三分の一の範囲内の任意の位置、および／または第一ヌクレオチド配列のヌクレオチドの３’側三分の一の範囲内の任意の位置にあり得る。一部の実施形態において、第二ヌクレオチド配列は、第一ヌクレオチド配列内のオープンリーディングフレームとポリ（Ａ）部位の間の任意の位置にあり得る。
【００５２】
２つ以上のヌクレオチド配列が本発明の単離された核酸内に存在する一定の実施形態において、第二ヌクレオチド配列は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００または１０００のヌクレオチド（本明細書で具体的に挙げない５〜１０００の間の任意の数のヌクレオチドを含む）によって隔てられる位置にあり得る。
【００５３】
本発明の核酸分子の第二ヌクレオチド配列は、第一イントロンを規定するスプライス要素の第一セット（前記第一イントロンは、スプライス要素の第二セットに活性が不在であるとき、生物学的機能を付与する第一ＲＮＡ分子を産生させるようにスプライシングすることによって除去される）；および前記第一イントロンとは異なる第二イントロンを規定するスプライス要素の第二セット（前記第二イントロンは、前記スプライス要素の第二セットが活性であるとき、ＲＮＡ分子を産生させないようにおよび／または生物学的機能を付与しない第二ＲＮＡ分子を産生させるようにスプライシングすることによって除去される）を含む、から本質的になる、および／またはからなることができる。一部の実施形態において、本発明の第二ヌクレオチド配列は、１つ以上の突然変異を含むことができ、前記突然変異は、置換、付加、欠失などであり得る。
【００５４】
本発明の第二ヌクレオチド配列の特定の、しかし非限定的な例としては、配列番号１８〜２０、５０〜７１、７４、７５および７８のいずれかのヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の単離された核酸の特定の例としては、配列番号１〜１７および２１〜３６が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のブロッキングオリゴヌクレオチドの特定の、しかし非限定的な例としては、配列番号３７〜４９、７２、７３、７６、７９および８０が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本発明の核酸において、第一イントロンは、生物学的機能を付与する第一ＲＮＡ分子を産生させるようにスプライシングすることによって除去される機能的イントロンである。生物学的機能は、第一ヌクレオチド配列が機能的ＲＮＡである実施形態では直接付与することができ、および／または生物学的機能を付与するタンパク質、ペプチドもしくはＲＮＡへの第一ＲＮＡ分子の翻訳により間接的に付与することができる。このような生物学的機能としては、例えば、そうしなければ欠陥のあるおよび／または不十分なもしくは低量で存在するタンパク質、ペプチドおよび／またはＲＮＡの活性の回復および／または増加のための（例えば、疾病または疾患を結果として生じさせる遺伝子欠陥であって、遺伝子療法などの治療に応答する遺伝子欠陥を補正するための）遺伝子療法を含む、治療効果を挙げることができる。
【００５６】
本明細書において説明するように、本発明の核酸が、スプライシングが発生でき、且つ、本発明のブロッキング分子または化合物が不在である環境にあるとき、第二イントロンを規定するスプライス要素の第二セットを活性化し、第二イントロンを除去し、その結果として、その核酸からの第一ＲＮＡ分子の産生を無くす。第二イントロンを除去すると、本発明の生物学的機能を付与しない第二ＲＮＡ分子（すなわち、非機能的ＲＮＡ）が産生される、および／または第二ＲＮＡ分子がまったく産生されないという結果に成り得る。
【００５７】
本発明の核酸の第二ヌクレオチド配列は、単一のヌクレオチド配列としてその核酸分子上のいずれの位置にも存在することができ、または前記第二ヌクレオチド配列は、同じであり異なる場合もある２つ以上の第二ヌクレオチド配列と同じ核酸分子上に存在することができる。従って、例えば、前記第二ヌクレオチド配列は、２つ以上の同じおよび／または異なるヌクレオチド配列の倍数で存在することができ、これらは、タンデムで存在することがあり、その核酸分子全体にわたって異なる位置に分散されていることがあり、および／または一緒に（例えば、タンデムで）存在し、且つ、分散されていることがある。
【００５８】
本発明の核酸は、ベクター中に存在することができ、そのようなベクターは、細胞内に存在することができる。非ウイルスベクター（例えば、プラスミド、ポロキシマーおよびリポソーム）、ウイルスベクターおよび合成生物ナノ粒子（ＢＮＰ）（例えば、異なるアデノ関連ウイルスから合成設計されたもの、ならびに他のパルボウイルス）を含む（しかし、これらに限定されない）、任意の適するベクターが、本発明の実施形態に包含される。
【００５９】
任意の適するベクターを使用して本発明の異種核酸を送達できることは、当業者には明らかである。送達ベクターの選択は、ターゲット宿主の年齢および種、インビトロ対インビボ送達、所望の発現のレベルおよび持続性、使用目的（例えば、治療またはポリペプチド産生のため）、ターゲット細胞または器官、送達経路、単離された核酸のサイズ、安全性の問題などを含む当分野では公知の多数の因子に基づいて行うことができる。
【００６０】
適するベクターとしては、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、または単純疱疹ウイルス）、脂質ベクター、ポリ−リシンベクター、核酸分子と共に使用される合成ポリアミノポリマーベクター、例えばプラスミド、なども挙げられる。
【００６１】
当分野において公知である任意のウイルスベクターを本発明において使用することができる。このようなベクターの例としては、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）；ビルナウイルス科（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）；ブンヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）；カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、カピロウイルス（Ｃａｐｉｌｌｏｖｉｒｕｓ）属；カルラウイルス（Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ）属；カルムウイルス（Ｃａｒｍｏｖｉｒｕｓ ｖｉｒｕｓ）属；カウリモウイルス群（Ｇｒｏｕｐ Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ）；クロステロウイルス（Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）属；ツユクサ黄色斑紋ウイルス（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ）属；コモウイルス（Ｃｏｍｏｖｉｒｕｓ）ウイルス属；コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）；ＰＭ２ファージ群；コルチコウイルス科（Ｃｏｒｃｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）；潜伏ウイルス群（Ｇｒｏｕｐ Ｃｒｙｐｔｉｃ ｖｉｒｕｓ）；クリプトウイルス群（ｇｒｏｕｐ Ｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ）；ククモウイルス（Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ）ウイルス属ファミリー（［ＰＨｇｒ］６ファージ群；シストウイルス科（Ｃｙｓｉｏｖｉｒｉｄａｅ）；カーネーション輪点ウイルス群（Ｇｒｏｕｐ Ｃａｒｎａｔｉｏｎ ｒｉｎｇｓｐｏｔ）；ダイアンソウイルス（Ｄｉａｎｔｈｏｖｉｒｕｓ ｖｉｒｕｓ）属；ソラマメウイルトウイルス群（Ｇｒｏｕｐ Ｂｒｏａｄ ｂｅａｎ ｗｉｌｔ）；ファバウイルス（Ｆａｂａｖｉｒｕｓ ｖｉｒｕｓ）属；フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）；フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）；フロウイルス（Ｆｕｒｏｖｉｒｕｓ）属；ゲルミニウイルス群（Ｇｒｏｕｐ Ｇｅｒｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）；ジアルジアウイルス群（Ｇｒｏｕｐ Ｇｉａｒｄｉａｖｉｒｕｓ）；ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）；ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）；ホルデイウイルス（Ｈｏｒｄｅｉｖｉｒｕｓ）ウイルス属；イラルウイルスウイルス（Ｉｌｌａｒｖｉｒｕｓ ｖｉｒｕｓ）属；イノウイルス科（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）；イリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）；レヴィウイルス科（Ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ）；リポスリクスウイルス科（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）；ルテオウイルス（Ｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓ）属；マラフィウイルスウイルス（Ｍａｒａｆｉｖｉｒｕｓ ｖｉｒｕｓ）属；トウモロコシ・クロロティック・ドワーフウイルス（Ｍａｉｚｅ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ）属；イクロウイルス科（ｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ）；ミオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）；ネクロウイルス（Ｎｅｃｒｏｖｉｒｕｓ）属；ネポウイルス（Ｎｅｐｏｖｉｒｕｓ）ウイルス属；ノダウイルス科（Ｎｏｄａｖｉｒｉｄａｅ）；オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）；パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）；パースニップ黄斑ウイルス（Ｐａｒｓｎｉｐ ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｅｃｋ ｖｉｒｕｓ）属；パルティティウイルス科（Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｉｄａｅ）；パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）；エンドウひだ葉モザイクウイルス（Ｐｅａ ｅｎａｔｉｏｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）属；フィコドナウイルス科（Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）；ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）；プラズマウイルス科（Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ）；プロドウイルス科（Ｐｒｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）；ポリドナウイルス科（Ｐｏｌｙｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）；ポテックスウイルス（Ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ）属；ポティウイルス（Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）；ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）；レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）；レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）；リジディオウイルス群（Ｇｒｏｕｐ Ｒｈｉｚｉｄｉｏｖｉｒｕｓ）；サイフォウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）；ソベモウイルス（Ｓｏｂｅｍｏｖｉｒｕｓ）属；ＳＳＶ １型ファージ；テクティウイルス科（Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ）；テヌイウイルス（Ｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ）；テトラウイルス科（Ｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ）；タバコモザイクウイルス群（Ｇｒｏｕｐ Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）；トブラウイルス群（Ｇｒｏｕｐ Ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓ）；トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）；トンブスウイルス群（Ｇｒｏｕｐ Ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｕｓ）；トロウイルス群（Ｇｒｏｕｐ Ｔｏｒｏｖｉｒｕｓ）；トティウイルス科（Ｔｏｔｉｖｉｒｉｄａｅ）；チモウイルス群（Ｇｒｏｕｐ Ｔｙｍｏｖｉｒｕｓ）；および植物衛星ウイルス（Ｐｌａｎｔ ｖｉｒｕｓ ｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ）に由来するベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
組換えウイルスベクターを産生させるためのプロトコルおよび核酸送達のためにウイルスベクターを使用するためのプロトコルは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９）および他の標準的な実験マニュアル（例えば、Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：１９９７）において見出すことができる。
【００６３】
本発明の方法において利用されるベクターの非限定的な例としては、核酸を細胞に送達するために使用される任意のヌクレオチド構成体、例えば、プラスミド、非ウイルスベクターまたはウイルスベクター、例えば組換えレトロウイルスゲノムをパッケージすることができるレトロウイルスベクター（例えば、Ｐａｓｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：４４８６（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５（１９８６）参照）が挙げられる。従って、例えば、組換えレトロウイルスを使用して感染させ、それによって本発明の核酸をその感染した細胞に送達することができる。改変された核酸を哺乳動物細胞に導入する的確な方法は、勿論、レトロウイルスベクターの使用に限定されない。アデノウイルスベクター（Ｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：９４１−９４８，１９９４）、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８４：１４９２−１５００，１９９４）、レンチウイルスベクター（Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３−２６７，１９９６）、偽型レトロウイルスベクター（Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：７３８−７４７，１９９６）および現在知られているまたは後に同定される任意の他のベクター系の使用を含む他の技術をこのために幅広く利用することができる。キメラウイルス粒子も含まれ、これらは、当分野において周知であり、ならびに機能的ウイルスベクターを産生させるための、２つ以上の異なるウイルスからのウイルスタンパク質および／または核酸を任意の組み合わせで含むことができる。本発明のキメラウイルス粒子は、非ウイルス起源のアミノ酸および／またはヌクレオチド配列も（例えば、特定に細胞もしくは組織へのベクターのターゲッティングを助長するために、および／または特定の免疫応答を誘導するために）含むことができる。本発明は、「ターゲッティングされた」ウイルス粒子（例えば、外因性ターゲッティング配列がそのパルボウイルスカプシドに挿入または代入された、パルボウイルスカプシドおよび組換えＡＡＶゲノムを含むパルボウイルベクター）も提供する。
【００６４】
物理的形質導入技術、例えばリポソーム送達ならびに受容体媒介および他のエンドサイトーシスメカニズム（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８７：４７２−４７８，１９９６参照）も用いることができる。本発明は、任意のこれらおよび／または他の一般的に用いられている核酸輸送方法と併用することができる。ウイルスベクター、キメラトランスフェクタント、または物理的メカニズムの方法、例えばＤＮＡのエレクトロポレーションおよび直接拡散を含む適切なトランスフェクション手段は、例えば、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５−１４６８，（１９９０）；およびＷｏｌｆｆ，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：８１５−８１８，（１９９１）によって記載されている。
【００６５】
従って、本発明の核酸の投与は、多数の周知アプローチのうちのいずれか１つ、例えば、プラスミドもしくはウイルスベクターでの核酸の直接輸送、または細胞でのもしくはカチオン性リポソームなどの担体と併用での輸送（これらに限定されない）によって達成することができる。このような方法は、当分野では周知であり、本明細書に記載する方法での使用に容易に適応させることができる。さらに、これらの方法は、担体のターゲッティング特性を用いることにより一定の疾病および組織、器官および／または細胞タイプおよび／または集団をターゲッティングするために用いることができ、これは、当業者には周知である。細胞および組織特異的プロモーターを本発明の核酸に利用して、特定の組織および細胞をターゲッティングできること、ならびに／または特定の疾病および疾患を治療できることも十分理解される。
【００６６】
本発明のベクターおよび／または核酸を含む細胞は、当分野では周知であるような、筋肉からの細胞（例えば、平滑筋、骨格筋、心筋筋細胞）、肝臓からの細胞（例えば、肝細胞）、心臓からの細胞、脳からの細胞（例えば、ニューロン）、目からの細胞（例えば、網膜細胞、角膜細胞）、膵臓からの細胞、腎臓からの細胞、内皮からの細胞、上皮からの細胞、幹細胞からの（例えば、骨髄、臍帯血）、組織培養細胞からの（例えば、ヒーラ細胞）などを含む（しかし、これらに限定されない）、本発明のベクターおよび／または核酸を含有することができるいずれの細胞であってもよい。
【００６７】
一部の実施形態において、本発明の核酸は、他の遺伝子発現調節系と比較したとき、低減された「漏出（ｌｅａｋｉｎｅｓｓ）」レベルを有する。「漏出」とは、その系が「ｏｆｆ」ポジションにあるときに産生される遺伝子産物または機能的ＲＮＡの量を意味する。例えば、本明細書に記載する一部の実施形態において、本系は、本発明の核酸が本発明のブロッキングオリゴヌクレオチド、小分子および／または他の化合物と接触しておらず、従って、第一イントロンがスプライシングされていないとき、「ｏｆｆ」ポジションにある。漏出は、そのような調節系に固有の問題であり得るが、漏出のレベルは、当分野において公知の系におけるより本系の実施形態におけるほうが少ないはずである。従って、本発明は、他の遺伝子発現調節系と比較して漏出が低減された遺伝子発現調節系も提供し、この系は、本発明の核酸および／または本発明のベクターを含む。他の系と比較して本系において漏出が低減される程度は、当分野では公知の系において観察される漏出量より５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％少なくあり得る。
【００６８】
一例として、系の漏出量は、その系内のレポーター遺伝子を利用し、その系が「ｏｆｆ」ポジションにあるときに産生されるレポーター遺伝子産物の量を検出することによって判定することができる。タンパク質検出アッセイ、例えばＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロッティング、ならびに核酸検出アッセイ、例えばポリメラーゼ連鎖反応、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティングを含む（しかし、これらに限定されない）任意の数のアッセイを利用して、レポーター遺伝子産物を検出することができる。遺伝子産物を検出するための他のアッセイとしては、機能的アッセイ、例えば、その遺伝子産物に寄与する生物活性の量の測定が挙げられる。本発明の核酸および方法を比較アッセイで用いて、他の公知遺伝子調節発現系およびそれに利用されている核酸との比較で、低減される漏出レベルを証明することができる。
【００６９】
本発明の核酸、ベクターおよび細胞を使用する様々な方法を本明細書においてさらに提供する。詳細には、本発明の第一ＲＮＡを産生させるための方法を本明細書において提供し、ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で、本発明のブロッキングオリゴヌクレオチドおよび／または小分子および／または他の化合物を本発明の核酸と接触させることを含み、この場合、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドおよび／または小分子および／または他の化合物が、スプライス要素の第二セットの構成要素をブロックし、その結果、スプライシングにより第一イントロンが除去され、第一ＲＮＡが産生される。
【００７０】
加えて、タンパク質を産生させるための方法を提供し、ａ）当分野では周知であるような、および本明細書に提供する実施例に記載するようなスプライシングを可能にさせる条件下で、本発明のブロッキングオリゴヌクレオチドおよび／または小分子および／または他の化合物を本発明の核酸と接触させること（この場合、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、スプライス要素の第二セットの構成要素をブロックし、その結果、スプライシングにより第一イントロンが除去され、第一ＲＮＡが産生される）、およびｂ）その第一ＲＮＡを翻訳してタンパク質を産生させることを含む。
【００７１】
さらなる実施形態において、生物学的機能を付与するＲＮＡを産生させるための方法を提供し、ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で、本発明のブロッキングオリゴヌクレオチドおよび／または小分子および／または他の化合物を本発明の核酸と接触させること（この場合、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドおよび／または小分子および／または他の化合物が、スプライス要素の第二セットの構成要素をブロックし、その結果、スプライシングにより第一イントロンが除去され、第一ＲＮＡが産生される）；およびｂ）その第一ＲＮＡを翻訳して、生物学的機能を付与するＲＮＡを産生させることを含む。一部の実施形態では、前記第一ＲＮＡは、生物学的機能を付与するＲＮＡとして直接作用することができ、他の実施形態では、前記第一ＲＮＡを、生物学的機能を付与するＲＮＡに翻訳することができる。
【００７２】
本明細書に記載する任意の方法において、本発明のブロッキングオリゴヌクレオチドおよび／または小分子および／または他の化合物は、本発明の核酸を含む細胞に導入することができ、そのような細胞は、動物におけるものであり得、前記動物は、ヒト、非ヒト哺乳動物（イヌ、ネコ、ウマ、ウシなど）または他の動物であり得る。
【００７３】
本発明のブロッキングオリゴヌクレオチドは、特定のスプライス部位でスプライシング活性を防止するオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは両方の組み合わせ）である。スプライシング事象を指示するスプライス事象セットの構成要素であるヌクレオチド配列にブロッキングオリゴヌクレオチドが結合し、それによってそのスプライシング要素の活性を阻害し、その結果スプライシング活性を阻害することとなるため、スプライシング活性が防止される。従って、本ブロッキングオリゴヌクレオチドは、スプライス連結部、５％スプライス要素、３’スプライス要素、潜在スプライス要素、分岐点、潜在分岐点、天然スプライス要素、突然変異スプライス要素などに相補的であり得る。本発明のブロッキングオリゴヌクレオチドの一部の非限定的な例としては、βグロビンイントロンの６５４Ｔ突然変異に特異的なＧＣＴＡＴＴＡＣＣＴＴＡＡＣＣＣＡＧ（配列番号３７）およびβグロビンイントロンの６５７ＧＴ突然変異に特異的なＧＣＡＣＴＴＡＣＣＴＴＡＡＣＣＣＡＧ（配列番号３８）が挙げられる。他の例としては、配列番号３７、３８、４２、４９、４６、４７、４８、３９、４０、４１、４３、４４、４５、７２、７３、７６、７９および８０のヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、および／またはからなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。これらのオリゴヌクレオチド配列に関連して「から本質的になる」とは、そのオリゴヌクレオチドが、そのオリゴヌクレオチド配列の３’末端または５’末端のいずれかに、そのオリゴヌクレオチドの機能または活性に著しい影響を及ぼさない追加の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の追加の）ヌクレオチドを含むことができることを意図する（例えば、これらの追加ヌクレオチドは、原オリゴヌクレオチド配列に相補的な配列にはハイブリダイズしない）。
【００７４】
ブロッキングオリゴヌクレオチドが本発明の方法において利用される場合の方法では、そのブロッキングオリゴヌクレオチドは、一部の実施形態において、ＲＮアーゼＨを活性化しないオリゴヌクレオチドであり得る。ＲＮアーゼＨを活性化しないオリゴヌクレオチドは、公知の技術に従って作製することができる。例えば、Ｐｅｄｅｒｓｏｎらの米国特許第５，１４９，７９７号参照。デオキシリボヌクレオチドである場合もありまたはリボヌクレオチド配列である場合もあるこのようなオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドをその一構成要素として含有する２本鎖分子へのＲＮアーゼＨの結合を立体的に妨害するまたは防止する任意の構造修飾を含有し、この構造修飾は、２本鎖形成を実質的に妨害せず、破壊しない。２本鎖形成に関与するオリゴヌクレオチドの部分は、それらへのＲＮアーゼＨの結合に関与するタンパク質とは実質的に異なるので、ＲＮアーゼＨを活性化しない非常に多数のオリゴヌクレオチドを利用できる。
【００７５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドであり得、ヌクレオチド間架橋リン酸残基の少なくとも１つのまたはすべてが、修飾ホスフェート、例えばメチルホスフェート、メチルホスホノチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデートおよびホスホルアミデートである。追加例として、ヌクレオチド間架橋リン酸残基の他のあらゆるものが、記載したように修飾されていることがある。もう１つの非限定的な例において、そのようなオリゴヌクレオチドは、そのヌクレオチドの少なくとも１つのまたはすべてが２’低級アルキル部分（例えば、Ｃ１〜Ｃ４線状または分枝、飽和または不飽和アルキル、例えばメチル、エチル、エテニル、プロピル、１−プロペニル、２−プロペニルおよびイソプロピル）を含有するオリゴヌクレオチドである。例えば、前記ヌクレオチドの他のあらゆるものが、記載したように修飾される（例えば、Ｆｕｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：９１９３−９２０４（１９８９）；Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１４０１−１４０５（１９９０）；Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８，３５３７−３５４３（１９９０）；Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：３３７３−３３８６（１９８９）；Ｗａｌｄｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｄｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５０１１−５０１５（１９８８）も参照）。従って、一部の実施形態において、本発明のブロッキングヌクレオチドは、任意の組み合わせでのメチル、ホスホロチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデートおよび／またはホスホルアミデートであり得る（しかし、これらに限定されない）、修飾ヌクレオチド間架橋リン酸残基を含むことができる。一定の実施形態において、本ロッキングオリゴヌクレオチドは、その２’位に低級アルキル置換基を有するヌクレオチドを含むことができる。
【００７６】
本発明の修飾オリゴヌクレオチドの追加の例としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる。
【００７７】
ＰＮＡにおける骨格は、ペプチド結合によって連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位の反復で作られている。異なる塩基（プリンおよびピリミジン）はメチレンカルボニル結合によって骨格に連結されている。ＤＮＡまたは他のＤＮＡ類似体とは異なり、ＰＮＡは、ペントース糖部分またはリン酸基を一切含有しない。ＰＮＡは、第１（左）位にＮ末端および右にＣ末端を有するペプチドのように描かれる。
【００７８】
ＰＮＡ骨格は、電荷を有さず、これは、ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖の間よりＰＮＡ／ＤＮＡ鎖間のほうがずっと強い結合をこのポリマーにもたらす。これは、ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖の間には電荷反発がないためである。
【００７９】
ホモピリミジン鎖を用いた初期の実験は、６量体ＰＮＡ Ｔ／ＤＮＡ ｄＡのＴ_mが、１０℃未満の温度で変性するＤＮＡ ｄＴ／ＤＮＡ ｄＡ ６量体と比較して、３１℃であると判定されたことを示した。
【００８０】
プリンおよびピリミジン塩基を有するペプチド骨格を伴うＰＮＡは、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼによって容易に認識される分子種ではない。例えば、それらは、酵素分解に対して耐性である。ＰＮＡは、広いｐＨ範囲にわたって安定でもある。それらは、酵素によって容易に分解されないので、これらのポリマーの寿命は、インビトロでもインビボでも長期にわたる。加えて、それらが電荷を有さないということが、それらの細胞膜の横断を助長し、且つ、それらのより強い結合特性が、遺伝子発現の調節に必要なオリゴヌクレオチドの量を減少させる。
【００８１】
ＬＮＡは、ヌクレオシドを含有する核酸の一類であり、その主な顕著な特徴は、リボース環の２’−Ｏ原子と４’−Ｃ原子の間のメチレン架橋の存在である。この架橋は、そのヌクレオチド類似体のリボフラノース環の可撓性を制限し、それを硬い二環式Ｎ型配座に固定する。さらに、ＬＮＡは、この配座を採るように隣接ＤＮＡ塩基を誘導し、その結果、標準的なワトソン−クリックの法則に従ってそれらの相補ヌクレオシドと塩基対合させることができるＤＮＡに見られる４つの共通核塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）を含有する熱力学的により安定な形態のＡ２本鎖ＬＮＡヌクレオシドが形成される。ＬＮＡは、標準的なホスホルアミダイトＤＮＡ合成化学を用いて、ＤＮＡまたはＲＮＡならびに他の核酸類似体と混合することができる。従って、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、例えばアミノ−リンカー、ビオチン、蛍光体などで容易に標識することができる。従って、プライマーおよびプローブの設計に非常に高い自由度が存在する。それらの固定された配座は、相補配列に対する結合親和性を増大させ、ならびに高感度で特異的な核酸検出のためにプライマーおよびプローブを最適化および微調整する新たな化学的アプローチをもたらす。この差は、実験的にはＬＮＡ−ＮＡヘテロ２本鎖の温度安定性増大として観察され、ならびにその配列中に存在するＬＮＡヌクレオシドの数にも、利用される核酸塩基の化学的性質にも依存する。この実験上の差は、標準的なハイブリダイゼーション法により特定の核酸ターゲットを検出するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブの特異性の変調に活用することができる。
【００８２】
本明細書において、「スプライス要素の第二セットの構成要素」は、第二イントロンのスプライシングの活性化に関与する任意の要素を含む。例えば、スプライス要素の第二セットの要素は、天然ＤＮＡおよび／またはｐｒｅ−ｍＲＮＡにおける突然変異の結果であり得、前記突然変異は、新たなスプライス要素を作る、置換突然変異および／または付加突然変異および／または欠失突然変異のいずれかであり得る。従って、この新たなスプライス要素は、第二イントロンを規定するスプライス要素の第二セットの１構成要素である。そのスプライス要素の第二セットの残りの構成要素は、第一イントロンを規定するスプライス要素のセットの構成要素である場合もある。例えば、その突然変異が、第一３’スプライス部位から上流（すなわち、５’方向に）でもあり、第一分岐点から下流（すなわち、３’方向）でもある位置に新たな第二３’スプライス部位を作る場合には、その第一５’スプライス部位およびその第一分岐点は、スプライス要素の第一セットとスプライス要素の第二セットの両方の構成要素として機能することができる。
【００８３】
ある状況では、スプライス要素の第二セットの導入により、通常は休眠状態であるか、スプライシング要素としての役割を果たさないＲＮＡの天然領域を、活性化するようにさせ、スプライシング要素として機能させることができる。このような要素は、「潜在」要素と呼ばれる。例えば、第一３’スプライス部位と第一分岐点の間に位置する新たな３’スプライス部位を導入すると、それが、その新たな３’スプライス部位と第一分岐点の間の潜在分岐点を活性化し得る。
【００８４】
他の状況では、第一分岐点と第一５’スプライス部位の間に位置する新たな５’スプライス部位の導入は、さらに、潜在３’スプライス部位および潜在分岐点をその新たな５’スプライス部位から上流に向かって逐次的に活性化し得る。この状況では、第一イントロンは、２つの異常イントロンに分割され、それらの間に新たなエキソンが位置することとなる。
【００８５】
さらに、第一スプライス要素（特に、分岐点）がスプライス要素の第二セットの構成要素でもある一部の状況では、第一要素をブロックし、潜在要素（すなわち、潜在分岐点）を活性化することができることがあり、この潜在要素が、スプライス要素の第一セットの残りの構成員を動員して、間違ったスプライシングに正しいスプライシングを強要することとなる。さらに、潜在スプライス要素を活性化したとき、それは、イントロンに位置することもあり、および／または隣接するエキソンのうちの１つに位置することもあることに留意しなければならない。
【００８６】
従って、上で述べたように、「スプライス要素の第二セット」を構成するスプライス要素のセットに依存して、本発明のブロッキングオリゴヌクレオチド、小分子および／または他の化合物は、様々な異なるスプライス要素をブロックして、本発明を行うことができる。例えば、突然変異要素、潜在要素、天然要素、５’スプライス部位、３’スプライス部位、および／または分岐点をブロックすることができる。勿論、上で論じたような、第一イントロンのスプライス要素のブロッキングが潜在要素を活性化し、それが、その後、スプライス要素の第一セットの代理構成要素として機能し、正しいスプライシングに関与するという状況を考慮に入れて、一般に、第一イントロンの規定もするスプライス要素はブロックしない。
【００８７】
ブロッキングオリゴヌクレオチドの長さ（すなわち、その中のヌクレオチドの数）は、それが対象となる位置に選択的に結合するのであれば重要ではなく、常例的な手順に従って決定することができる。従って、一部の実施形態において、本発明のブロッキングオリゴヌクレオチドは、約５ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの間の長さであり得る。詳細には、本発明のブロッキングヌクレオチドは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ヌクレオチドの長さであり得る。一部の実施形態において、本発明のブロッキングオリゴヌクレオチドは、８から５０ヌクレオチドの長さである。本発明のさらに他の実施形態において、本ブロッキングオリゴヌクレオチドは、１５〜２５ヌクレオチドの長さであり、１８〜２０ヌクレオチドの長さである場合もある。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載する方法において、同一のオリゴヌクレオチドの集団として、ならびに／または任意の組み合わせでおよび／もしくは互いに対して任意の比で存在する異なるオリゴヌクレオチドの集団として、使用することができる。
【００８８】
本発明の小分子は、他の小分子と比較して構造的におよび／または機能的に多様であり得、且つ、低分子量（例えば、≦５０００ダルトン）を有する活性化合物である。小分子は、天然物質である場合もあり、合成物質である場合もある。それらは、有機化学プロトコルによって合成することができ、および／または天然源、例えば植物、真菌よび微生物から単離することができる。小分子は、「薬のよう（ｄｒｕｇ−ｌｉｋｅ）」である（例えば、アスピリン、ペニシリン、化学療法薬）場合もあり、毒性である場合もあり、および／または天然のものである場合もある。小分子薬は、特定の生物学的ターゲット、例えば受容体、酵素またはイオンチャネル、と相互作用して治療効果を生じさせる１つ以上の活性化合物であり得、これらは、一般に、経口投与可能なピルとして調合される。本発明の小分子の具体的な、しかし非限定的な例としては、抗体、ヌクレオシド類似体（例えば、トヨカマイシン）およびアプタマー（例えば、ＲＮＡアプタマー、ＤＮＡアプタマー）が挙げられる。
【００８９】
本発明の小分子は、任意の数の小分子ライブラリーに存在する小分子であり得、それらの一部は、市販されている。本発明の小分子を含有し得るライブラリーの非限定的な例としては、様々な営利団体・企業（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）から得られる小分子ライブラリー、例えば、ＳＰＥＣＳ ａｎｄ ＢｉｏＳＰＥＣ Ｂ．Ｖ．（オランダ、ライスワイク）、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州、サンディエゴ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ ＵＳＡ Ｉｎｃ．（ニュージャージー州、プリンストン）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｔｄ．（英国、コーンウォール）、およびＡｓｉｎｅｘ（ロシア、モスクワ）が挙げら得る。１つの代表例は、ＤＩＶＥＲＳｅｔ（商標）として知られており、これは、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１６９８１ Ｖｉａ Ｔａｚｏｎ，Ｓｕｉｔｅ Ｇ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．９２１２７）から入手できる。ＤＩＶＥＲＳｅｔ（商標）は、薬のような、手で合成した（ｈａｎｄ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ）小分子を１０，０００から５０，０００個含有する。前記化合物は、最小限の化合物数で最大のファーマコフォア多様度をカバーし、且つ、高スループットまたはより低いスループットスクリーニングに適する「汎用」ライブラリーを形成するために、前もって選択される。追加のライブラリーの説明については、例えば、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．「Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｖｅｒ Ｔｗｏ Ｍｉｌｌｉｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｆｅａｔｕｒｅｓ Ｂｏｔｈ Ｒｅｍｉｎｉｓｃｅｎｔ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｗｉｔｈ Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ Ａｓｓａｙｓ」Ａｍ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１２０，８５６５−８５６６，１９９８；Ｆｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３６：９１−１６８，１９９９を参照のこと。非常に多数のライブラリーが、例えば、ＡｎａｌｙｔｉＣｏｎ ＵＳＡ Ｉｎｃ．（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ５９２６，Ｋｉｎｇｗｏｏｄ，Ｔｅｘ．７７３２５）；３−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（６６５ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｓｕｉｔｅ １０４，Ｅｘｔｏｎ，Ｐａ．１９３４１−１１５１）；Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．（１６９９ Ｈａｎｌｅｙ Ｒｄ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，６３１４４−２９１３）などから市販されている。
【００９０】
本発明の小分子および他の化合物は、様々なメカニズムにより、本発明の核酸におけるスプライシング事象を修飾するように動作することができる。例えば、本発明の小分子および他の化合物は、スプライシング複合体、スプライセオソーム、およびそれらの成分、例えばｈｎＲＮＰ、ｓｎＲＮＰ、ＳＲ−タンパク質および他のスプライシング因子または要素の形成および／または機能および／または他の特性に干渉し、その結果、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ分子におけるスプライシング事象を防止および／または誘導することができる。もう１つの例として、本発明の小分子および他の化合物は、特定のスプライセオソームの形成および／または機能に後に関与する遺伝子産物（例えば、ｈｎＲＮＰ、ｓｎＲＮＰ、ＳＲ−タンパク質および他のスプライシング因子を挙げることができるが、これらに限定されない）の転写を防止および／または修飾することができる。本発明の小分子および他の化合物は、特定のスプライセオソームの形成および／または機能に後に関与する遺伝子産物（ｈｎＲＮＰ、ｓｎＲＮＰ、ＳＲ−タンパク質および他のスプライシング因子を挙げることができるが、これらに限定されない）のリン酸化、グリコシル化および／または他の修飾を防止および／または修飾することもできる。加えて、本発明の小分子および他の化合物は、特定のｐｒｅ−ｍＲＮＡに結合および／または別様に影響を及ぼして、配列特異的な様式でのＲＮＡとの塩基対合を必要としないメカニズムにより、特定のスプライシング事象を防止または誘導することができる。
【００９１】
本発明は、被験者においてタンパク質および／または生物学的機能を付与するＲＮＡを産生させる方法をさらに提供し、ａ）本発明の核酸、ベクターおよび／または細胞を被験者に導入すること、ならびにｂ）スプライス要素の第二セットの構成要素をブロックする本発明のブロッキングオリゴヌクレオチドおよび／または小分子および／または他の化合物をその被験者に導入することを含み、それによって被験者においてタンパク質および／または生物学的機能を付与するＲＮＡを産生させる。
【００９２】
加えて、被験者におけるタンパク質および／または生物学的機能を付与するＲＮＡの産生を調節する方法を提供し、ａ）本発明の核酸、ベクターおよび／または細胞を被験者に導入すること、ならびにｂ）スプライス要素の第二セットの構成要素をブロックする本発明のブロッキングオリゴヌクレオチドおよび／または小分子および／または他の化合物を、そのタンパク質および／またはＲＮＡの産生を望む時点で、その被験者に導入することを含み、それによってその被験者におけるそのタンパク質および／またはＲＮＡの産生を調節する。被験者に存在するタンパク質および／またはＲＮＡの量を当分野において公知の方法に従って経時的にモニターし、その量が所望のレベルおよび／または治療レベルより下に落ちたら、本ブロッキングオリゴヌクレオチド、小分子および／または他の化合物を被験者に導入してそのタンパク質および／またはＲＮＡの産生を増加させ、このようにしてその産生を調節することができる。
【００９３】
本発明の核酸、ベクターおよび／または細胞を被験者に投与する、本明細書に記載の方法では、本核酸、ベクターおよび／または細胞は、ブロッキングオリゴヌクレオチドおよび／または小分子および／または他の化合物（これらの存在は、スプライス要素の第二セットの構成要素に対するブロッキングを生じさせる）が不在である被験者に最初に存在し得る。この状況では、スプライス要素の第二セットは活性であり、ならびに第一ヌクレオチド配列によってコードされているような、生物学的機能を付与する外因性タンパク質、ペプチドおよび／またはＲＮＡの被験者における産生は、無いか、極極少ない（例えば、有意でない）。本発明のブロッキングオリゴヌクレオチド、小分子および／または他の化合物が被験者に存在する場合、核酸上のスプライス要素の第二セットの構成要素はブロックされ、その結果、スプライシングにより第一イントロンが除去され、その後、生物学的機能を付与する第一ヌクレオチド配列によってコードされているタンパク質および／またはＲＮＡがその被験者において産生される。
【００９４】
本ブロッキングオリゴヌクレオチド、小分子および／または他の化合物は、本発明の核酸、ベクターおよび／または細胞の被験者への導入を基準にしていずれの時点においても被験者に導入することができる。例えば、本ブロッキングオリゴヌクレオチド、小分子および／または他の化合物は、被験者への本核酸、ベクターおよび／または細胞の導入前に、導入と当時に、および／または導入後にその被験者に導入することができる。さらに、本ブロッキングオリゴヌクレオチド、小分子および／または他の化合物は、１回または任意の時間間隔で複数回投与することができ、ならびにその被験者の寿命全体にわたり得る。
【００９５】
従って、一部の実施形態において、本発明は、被験者における疾病または疾患を治療する方法を提供し、ａ）本発明の核酸、ベクターおよび／または細胞の有効量を被験者に導入すること；ならびにｂ）本発明のブロッキングオリゴヌクレオチド、小分子、および／または他の化合物の有効量を被験者に導入することを含み、それによって被験者における疾患を治療する。本核酸、ベクターおよび／または細胞ならびに本ブロッキングオリゴヌクレオチド、小分子および／または他の化合物が被験者に存在する場合、それらは、そのブロッキングオリゴヌクレオチド、小分子および／または他の化合物がその核酸と接触し、スプライス要素の第二セットの構成要素をブロックすることができる条件下に存在し、それによって、被験者において生物学的機能を付与するタンパク質、ペプチドおよび／またはＲＮＡを産生させる。
【００９６】
本発明の追加の実施形態では、本発明の方法による遺伝子発現の調節は、本明細書に記載する系の逆で起こり得る。具体的に言うと、本発明の一部の実施形態において、その系は、スプライス媒介発現を調節するブロッキングオリゴヌクレオチド、小分子および／または他の化合物が不在の状態で、本明細書において説明するような「ＯＦＦ」ポジションにある（例えば、生物学的機能を付与するタンパク質、ペプチドおよび／またはＲＮＡの産生をもたらす第一ＲＮＡが産生されない）。一定の他の実施形態において、本発明の系は、スプライス媒介発現を調節するブロッキングオリゴヌクレオチド、小分子および／または他の化合物が不在の状態で、「ＯＮ」ポジションにあり得る。このような後述の実施形態では、結果的に第一イントロンを除去し、第一ＲＮＡを産生させる条件下に存在する本発明の核酸、ベクターおよび／または細胞を、本発明のブロッキングオリゴヌクレオチド、小分子および／または他の化合物と接触させ、その結果、スプライス要素の第一セットの構成要素をブロックし、それによってスプライシングおよび第二イントロンの除去を生じさせ、従って、第二ＲＮＡ分子を産生させない、および／または生物学的機能を付与しない第二ＲＮＡ分子を産生されるという本発明の方法を実施することができる。
【００９７】
本発明の核酸、ベクター、細胞、ブロッキングオリゴヌクレオチド、小分子および／または他の化合物の「有効量」は、有益であり得、および／または治療効果があり得る、所望の効果を生じさせるために十分ではあるが非毒性である量を指す。当業者には十分理解されるように、必要とされる正確な量は、被験者の年齢、性別、種、全身の健康状態、治療する状態の重症度、投与する特定の薬剤などに依存して、被験者ごとに異なる。当業者は、適切なテキストおよび文献（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（最新版））を参照することにより、および／または常用の薬理学的手順により、任意の個々のケースでの適切な「有効」量を決定することができる。
【００９８】
本明細書において、「治療する」または「治療」は、本発明のタンパク質および／またはＲＮＡにポジティブに応答し得る疾病または疾患を有すると診断される、有するリスクがある、有する疑いがある、および／または有する可能性が高い被験者に恩恵を授けるあらゆるタイプの治療を指す。恩恵としては、被験者の状態（例えば、１つ以上の症状）の改善、その状態の進行の遅延および／または反転、その疾病または疾患の発症の防止または遅延などを挙げることができる。
【００９９】
本明細書において述べるように、本発明は、本発明の疾患または疾病を治療する方法を提供し、ａ）本発明の核酸の有効量を被験者に導入すること、ならびにｂ）本発明のブロッキングオリゴヌクレオチドおよび／または小分子の有効量をその被験者に導入することを含み、それによって、被験者においてその疾患または疾病を治療する。
【０１００】
本発明の方法によって治療することができる疾病または疾患としては、生物学的機能を付与する本発明のタンパク質、ペプチドおよび／またはＲＮＡの被験者における存在および／または量の増加を伴う治療に応答するあらゆる疾病または疾患を挙げることができる。このようなタンパク質、ペプチドおよび／またはＲＮＡは、本発明の核酸、ベクターおよび／または細胞の被験者への導入ならびに本発明のブロッキングオリゴヌクレオチド、小分子および／または他の化合物の被験者への導入により、その被験者に存在し得る。
【０１０１】
本発明の方法によって治療することができる疾病および／または疾患の非限定的な例、ならびに本発明の第一ヌクレオチド配列によってコードされ得、且つ、治療効果を付与することができる遺伝子産物の一部の例としては、代謝性疾患、例えば糖尿病（インスリン）、成長／発達傷害（成長ホルモン；成長因子を調節するジンクフィンガータンパク質）、血液凝固障害（例えば、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子）；血友病Ｂ（第ＩＸ因子））、中枢神経系障害（例えば、発作、パーキンソン病（グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）およびＧＤＮＦ様成長因子）、アルツハイマー病（神経成長因子、ＧＤＮＦおよびＧＤＮＦ様成長因子）、筋萎縮性側索硬化症、脱髄疾患）、骨同種移植（骨形態形成タンパク質２（タンパク質１〜９、例えば、ＭＢＰ２））、炎症性疾患（例えば、関節炎、自己免疫疾患）、肥満、癌、心血管疾患（例えば、うっ血性心不全（ホスホランバン、およびＣａ⁺⁺ポンプと関係がある遺伝子））、黄斑変性（色素上皮由来因子（ＰＤＥＦ）、β−サラセミア、α−サラセミア、テイ・サックス症候群、フェニルケトン尿症、嚢胞性線維症および／またはウイルス感染が挙げられる。
【０１０２】
追加例としては、ＡＩＤＳの治療に使用される、可溶性ＣＤ４をコードする核酸、およびａ−アンチトリプシン欠損症によって引き起こされる肺気腫の治療に使用される、α−アンチトリプシンが挙げられる。本発明の方法および組成物によって治療することができる他の疾病、症候群および状態としては、例えば、アデノシンデアミナーゼ欠損症、鎌状赤血球欠損症、脳の疾患、例えばハンチングトン病、リソソーム蓄積症、ゴーシェ病、ハーラー病、クラッベ病、運動ニューロン疾患、例えば優性脊髄性小脳性運動失調症（例としては、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２およびＳＣＡ３が挙げられる）、サラセミア、血友病、フェニルケトン尿症、ならびに心疾患、例えばコレステロール代謝の変化によって引き起こされるもの、ならびに免疫系の異常が挙げられる。これらの方法によって治療することができる他の疾患としては、代謝性症候群、例えば筋骨格疾患、心血管疾患および癌が挙げられる。本発明の核酸を気道上皮に送達して、遺伝性疾患、例えば嚢胞性線維症、偽性低アルドステロン症および線毛不動症候群、ならびに非遺伝子性疾患（例えば、気管支炎、喘息）を治療することもできる。本発明の核酸を肺胞上皮に送達して、遺伝性疾患、例えばα−１−アンチトリプシン、ならびに肺疾患を治療すること（例えば、肺炎および肺気腫肺線維症、肺水腫の治療；サーファクタントタンパク質をコードする核酸の未熟児またはＡＲＤＳ患者への送達）ができる。
【０１０３】
一般に、本発明の核酸およびベクターは、生物学的機能を有する任意の核酸を送達して、遺伝子発現と関係がある任意の疾患に随伴する症状を治療または改善するために利用することができる。実例となる疾病状態としては、嚢胞性線維症（および肺の他の疾病）、血友病Ａ、血友病Ｂ、サラセミア、貧血および他の血液疾患、ＡＩＤＳ、癌（例えば、脳腫瘍）、糖尿病、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ病、ベッカー病）、ゴーシェ病、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、糖原蓄積病および他の代謝障害、ムコ多糖症、ならびに実質性器官（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓、肺、目）等の疾病などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
一定の実施形態において、本発明の送達ベクターは、遺伝性疾患、神経変性疾患、精神障害および／または腫瘍を含むＣＮＳの疾病を治療するために投与することができる。ＣＮＳの実例となる疾病としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチングトン病、レット症候群、キャナヴァン病、リー病、レフサム病、トゥーレット症候群、原発性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、進行性筋萎縮症、ピック病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、重症筋無力症、ビンスワンゲル病、脊髄または頭部損傷に起因する外傷、テイ・サックス病、レッシュ−ナイハン病、癲癇、脳梗塞、気分傷害（例えば、うつ病、双極性情動障害、持続性情動障害、二次性気分障害）を含む精神障害、統合失調症、薬物依存症（例えば、アルコール中毒および他の物質依存症）、神経症（例えば、不安、強迫性障害、身体表現性障害、解離性障害、悲嘆、分娩後うつ病）、精神病（例えば、幻覚および妄想）、認知症、パラノイア、注意欠陥障害、精神性欲異常、睡眠障害、疼痛障害、摂食障害または体重異常（例えば、肥満、悪液質、食欲低下および食欲亢進）ならびにＣＮＳの癌および腫瘍（例えば、下垂体腫瘍）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
本発明の方法に従って治療することができるＣＮＳの疾患としては、網膜、後部神経路（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｔｒａｃｔ）、視神経に関わる眼の疾患（例えば、色素性網膜炎、糖尿病性網膜症および他の網膜変性疾患、ブドウ膜炎、加齢性黄斑変性、緑内障）が挙げられる。
【０１０６】
すべてではないかもしれないが殆どの眼病および眼の疾患は、次の３つのタイプの指標のうちの１つ以上を随伴する。（１）脈管形成、（２）炎症、および（３）変性。本発明の送達ベクターは、抗脈管形成因子；抗炎症性因子：細胞変性を遅らせる、細胞倹約を促進する、または細胞増殖を促進する因子、ならびに前述のものの組み合わせ。
【０１０７】
例えば、糖尿病性網膜症は、脈管形成によって特徴付けられる。糖尿病性網膜症は、１つ以上の抗脈管形成因子を眼内に（例えば、硝子体の中に）または眼周辺に（例えば、テノン領域の近くに）送達することによって治療することができる。１つ以上の神経栄養因子を眼内に（例えば、硝子体内に）または眼周辺に共同送達することもできる。
【０１０８】
ブドウ膜炎は、炎症を伴う。１つ以上の抗炎症性因子を、本発明の核酸の眼内（例えば、硝子体または前眼房）投与によって、投与することができる。
【０１０９】
比較すると、色素性網膜炎は、網膜変性によって特徴付けられる。代表的な実施形態において、色素性網膜炎は、１つ以上の神経栄養因子をコードする送達ベクターの眼内（例えば、硝子体）投与によって、治療することができる。
【０１１０】
加齢性黄斑変性は、脈管形成と網膜変性の両方を伴う。この疾患は、１つ以上の神経栄養因子をコードする本発明の核酸を眼内（例えば、硝子体）に、および／または１つ以上の抗脈管形成因子を眼内または眼周辺（例えば、テノン領域の近く）に投与することによって、治療することができる。
【０１１１】
緑内障は、眼内圧上昇および網膜神経節細胞の喪失によって特徴づけられる。緑内障の治療としては、本発明の送達ベクターを使用する興奮毒性障害から細胞を保護する１つ以上の神経保護剤の投与が挙げられる。このような薬剤としては、眼内に、好ましくは硝子体内に送達される、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、サイトカイン、および神経栄養因子が挙げられる。
【０１１２】
他の実施形態では、本発明を用いて、発作を治療すること、例えば、発作の発現、発生率および／または重症度を減少させることができる。発作に対する治療的処置の効力は、行動（例えば、ふるえ、目もしくは口のチック）および／またはエレクトログラフ手段によって、アッセイすることができる（大部分の発作は、典型的なエレクトログラフ異常を有する）。従って、本発明は、一定の期間にわたる多数の発作を特徴とする癲癇を治療するために用いることもできる。
【０１１３】
さらなる例として、本発明の送達ベクターを使用して、ソマトスタチン（またはその活性フラグメント）を脳に投与して、下垂体腫瘍を治療することができる。この実施形態によると、ソマトスタチン（またはその活性フラグメント）をコードする送達ベクターを、マイクロインフュージョンによって下垂体に投与することができる。同様に、このような治療を用いて、先端巨大症（下垂体からの成長ホルモン異常分泌）を治療することができる。ソマトスタチンの核酸配列（例えば、ジーンバンクアクセッション番号Ｊ００３０６）およびアミノ酸配列（例えば、ジーンバンクアクセッション番号Ｐ０１１６６；プロセッシングされた活性ペプチド ソマトスタチン−２８およびソマトスタチン−１４を含有する）は、当分野では公知である。
【０１１４】
本発明は、本発明の核酸におけるスプライシング事象を変調する能力について化合物をスクリーニングするための方法も提供する。従って、追加の実施形態において、本発明は、本発明の核酸のスプライス要素の第二セットの構成要素をブロックする化合物を同定する方法を提供し、ａ）スプライシングを可能にさせる条件下でその化合物と本核酸を接触させること；ならびにｂ）第一ＲＮＡの産生または第二ＲＮＡの産生を検出することを含み、この場合、その第一ＲＮＡの産生によって、本発明の核酸のスプライス要素の第二セットの構成要素をブロックする化合物が同定され、ならびに第二ＲＮＡの産生によって、そのスプライス要素の第二セットの構成要素をブロックしない化合物が同定される。これらの方法を利用して、第一ＲＮＡおよび／または第二ＲＮＡの産生を増加させるまたは減少させることができる化合物を同定することもできる。本明細書に記載する方法によって同定された化合物は、生物学的機能を付与するタンパク質および／またはＲＮＡを産生させる方法を含む本発明の方法に、ならびに治療方法に用いることができる。他の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、小分子および／または化合物を用いることにより、選択的スプライシング事象を変調することができる。
【０１１５】
例えば、本発明の核酸、ベクターおよび／または細胞を本発明のブロッキングオリゴヌクレオチド、小分子および／または他の化合物と一緒に被験者に導入して、スプライスセットのうちの特定のセットでの活性化の結果として、被験者において生物学的機能を付与する第一タンパク質および／またはＲＮＡを産生させることができる。同核酸は、スプライスセットのうちの別のセットを活性化させることによってその被験者において生物学的機能を付与する別のタンパク質、ペプチドおよび／またはＲＮＡをコードするように工学することができる。その別のタンパク質および／またはＲＮＡは、本発明の別のブロッキングオリゴヌクレオチド、小分子および／または化合物がその被験者に導入されると、産生される。一例として、前記第一ＲＮＡは、第一ブロッキングオリゴヌクレオチド、小分子および／または他の化合物が存在するとき、関心のある第一タンパク質を産生させることができ、ならびに本発明の別の第二ブロッキングオリゴヌクレオチド、小分子および／または化合物の添加後、関心のある第二タンパク質または機能的ＲＮＡを産生させる第二のＲＮＡが得られる（例えば、第一タンパク質のアイソフォーム（例えば、インターロイキン（ＩＬ）−４およびそのスプライス変異体、ＩＬ−４Δ２）が産生され得る）（例えば、Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）−４ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔ ＩＬ−４Δ２ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｃｏｎｔａｃｔｓ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ」Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００４ Ａｕｇ；１１２（４）：６６９−７３；Ｍｉｎｎ ｅｔ ａｌ．「Ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔ」Ｌａｎｃｅｔ ２００４ Ｊａｎ ３１；３６３（９４０６）：３６３−７；Ｓｃｈｌｕｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．「Ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ＲＡＧＥ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｏｒｍｓ−ａ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ？」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２００３ Ｏｃｔ ２０；１６３０（１）：１−６；Ｖｅｇｒａｎ ｅｔ ａｌ．「Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｏｆ ｃａｓｐａｓｅ−３ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｉｎ ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ」Ｂｕｌｌ Ｃａｎｃｅｒ ２００５ Ｍａｒ；９２（３）：２１９−２６；Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．「Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ−２４−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ：Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｒｅｎａｌ １，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ Ｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５ Ｍａｒ ２３；ｅｔ ａｌ．「Ｍｕｔａｎｔ ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ：ａ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ １，２，ａｎｄ ３」Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ２００５ Ｊａｎ；６４（ｌ）：５８−６５；Ｄｉｎｇ ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｒ．「Ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＲＡＧＥ）ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ」Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ．２００５ Ｊａｎ ３；３７３（１）：６７−７２；ｅｔ ａｌ．「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｎｏｖｅｌ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ １−ｔｙｐｅ ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ，Ｃａｖｌ．２ α１ ｓｕｂｕｎｉｔ」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００４ Ｏｃｔ ２２；２７９（４３）：４４３３５−４３，Ｅｐｕｂ ２００４ Ａｕｇ ６参照。これらの参考文献のすべてが、それら全体として、引用により本明細書の一部をなすものとする）。
【０１１６】
本発明は、組成物中の本発明の核酸、ベクターおよび／または細胞をさらに提供する。従って、追加の実施形態において、本発明は、医薬的に許容される担体中の本発明の核酸、本発明のベクターおよび／または本発明の細胞を含む組成物を提供する。「医薬的に許容される担体」とは、その医薬組成物中の他の成分と相溶性であり、且つ、被験者に有害および有毒でない担体を意味する。特に、医薬的に許容される担体は、本発明の被験者に投与または送達するために調合される無菌担体であることを意図する。
【０１１７】
本発明の組成物および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。本明細書に記載する組成物は、公知の技術に従って医薬用担体中で投薬用に調合することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（最新版）参照。前記担体は、固体であってもよいし、液体であってもよいし、またはそれら両方であってもよく、ならびに好ましくは、本発明の組成物と共に単位用量調合物（これは、約０．０１または０．５重量％から約９５重量％または９９重量％の本組成物を含有し得る）、例えば錠剤として調合される。本医薬組成物は、１つ以上の補助成分を場合によっては含む成分を混合することを含む（しかし、これらに限定されない）任意の周知調剤技術によって作製される。
【０１１８】
本発明の医薬組成物は、経口、直腸内、局所、吸入（例えば、エーロゾルによる）口腔内（例えば、舌下）、経膣、非経口（例えば、皮下、筋肉内、経皮、関節内、胸膜内、腹腔内、脳内、動脈内または静脈内）、局所（すなわち、気道表面を含む、皮膚表面と粘膜表面の両方）および経皮投与に適するものを含むが、いずれの所与の症例においても、最も適する経路は、当分野では周知であるように、被験者の種、年齢、性別および総合的な健康状態、治療する状態の性質および重症度、ならびに／または投与することとなる特定の組成物の性質（すなわち、投薬量、調合）に依存する。
【０１１９】
経口投与に適する医薬組成物は、本発明の組成物の所定量を各々が含有する個別の単位体、例えばカプセル、カシェ剤、ロゼンジまたは錠剤で、粉末もしくは顆粒として、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油型もしくは油中水型エマルジョンとして、提供することができる。経口送達は、動物の胃の中での消化酵素による消化に耐えることができる担体に本発明の組成物を複合させることによって行うことができる。このような担体の例としては、当分野において公知であるようなプラスチックカプセルまたは錠剤が挙げられる。このような調合物は、任意の適する調剤方法によって作製することができ、それらの方法は、本組成物と適する担体（これは、上で述べたような補助成分を１つ以上含有することができる）を会合させる段階を含む。一般に、本発明の実施形態による医薬組成物は、液体担体もしくは微粉固体担体または両方と本組成物を均一、且つ、均質に混合し、その後、必要な場合には、その得られた混合物を成形することによって作製する。例えば、錠剤は、本組成物と場合によっては１つ以上の補助成分とを含有する粉末または顆粒を圧縮または成形することによって作製することができる。圧縮錠剤は、結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤および／または界面活性剤／分散剤と場合によっては混合された粉末または顆粒などの易流動性形態の本組成物を適する機械で圧縮することによって作製する。成形錠剤は、不活性液体結合剤で湿潤させた粉末化合物を適する機械で成形することによって製造する。
【０１２０】
口腔内（舌下）投与に適する医薬組成物としては、着香基剤、通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴム中の本発明の組成物を含むロゼンジ；ならびに不活性基剤、例えばゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴム中の本組成物を含む香剤が挙げられる。
【０１２１】
非経口投与に適する本発明の医薬組成物は、本発明の組成物の滅菌水性および非水性注射溶液を含むことができ、これらの製剤は、好ましくは、対象となる受容者の血液と等張である。これらの製剤は、抗酸化物質、緩衝剤、静菌薬および溶質を含有することがあり、これらが、その組成物を対象となる受容者の血液と等張にする。水性および非水性滅菌懸濁液、溶液およびエマルジョンは、懸濁化剤および増粘剤を含むことができる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、食塩水および緩衝媒質を含む、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体および栄養補充物、電解質補充薬（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）などが挙げられる。保存薬および他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化物質、キレート剤および不活性ガスなどが存在し得る。
【０１２２】
本組成物は、単位用量または複数回分の用量用の容器に、例えば密封アンプルおよびバイアルに入れることができ、ならびに使用直前に無菌液体担体、例えば食塩水または注射用蒸留水を添加するだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管することができる。
【０１２３】
即時調合注射溶液および懸濁液は、前に説明した種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から作製することができる。例えば、密封容器に入った単位剤形で本発明の注射用安定無菌組成物を提供することができる。本組成物は、凍結乾燥物の形態で提供することができ、これを適する医薬的に許容される担体で再構成して、被験者への注射に適する液体組成物を形成することができる。この単位剤形は、約１μｇから約１０ｇの本発明の組成物であり得る。本組成物が実質的に水不溶性である場合、生理学的に許容される十分な量の乳化剤を水性担体中のその組成物を乳化するために十分な量で含めることができる。１つのこのような有用な乳化剤は、ホスファチジルコリンである。
【０１２４】
直腸内投与に適する医薬組成物は、好ましくは、単位用量坐剤として提供する。これらは、１つ以上の従来の固体担体、例えばカカオ脂などと本組成物を混合物し、その後、その得られた混合物を成形することによって作製することができる。
【０１２５】
皮膚への局所適用に適する本発明の医薬組成物は、好ましくは、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エーロゾルまたは油の形態をとる。使用することができる担体としては、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮吸収増進剤（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｅｎｈａｎｃｅｒ）、およびこれらのうちの２つ以上の組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。一部の実施形態において、例えば、局所送達は、本発明の医薬組成物と、皮膚に通すことができる親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）とを混合することによって行うことができる。
【０１２６】
経皮投与に適する医薬組成物は、長期間にわたって被験者の表皮と密接した状態のままでいられるようにした個別のパッチの形態であり得る。経皮投与に適する組成物は、イオン導入法（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３：３１８（１９８６））によって送達することもでき、ならびに典型的には本発明の組成物の場合によっては緩衝された水溶液の形態をとる。適する調合物は、シトレートまたはビストリス緩衝液（ｐＨ６）またはエタノール／水を含むことができ、ならびに０．１から０．２Ｍの活性成分を含有することができる。
【０１２７】
本発明の組成物の有効量は、組成物ごとにおよび被験者ごとに異なり、様々な要因、例えば、被験者の年齢、種、性別、体重、総合的な状態、および治療すべき特定の疾病または疾患に依存する。有効量は、通常の当業者には公知の常用の薬理学的手順に従って決定することができる。一部の実施形態において、約０．１μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇの範囲の投薬量が、治療効能を有する。本発明の核酸の送達にウイルスベクターを利用する実施形態では、利用するウイルスに依存して、ウイルス用量を測定して、特定の数のウイルス粒子またはプラーク形成単位（ｐｆｕ）または感染性粒子を含めることができる。例えば、一部の実施形態において、特定の単位用量は、１０³、１０⁴、１０⁵、１０⁶、１０⁷、１０⁸、１０⁹、１０¹⁰、１０¹¹、１０¹²、１０¹³または１０¹⁴ｐｆｕまたは感染性粒子を含むことができる。
【０１２８】
本発明の組成物の投与頻度は、所望の治療効果を授けるために必要なだけの頻度であり得る。例えば、本組成物は、特定の状態を制御するために、ならびに／または特定の効果および／もしくは恩恵を達成するために、１日に１、２、３、４回以上、１週間に１、２、３、４回以上、１月に１、２、３、４回以上、１年に１、２、３、または４回、および／または必要に応じて投与することができる。一部の実施形態では、被験者の生涯にわたって１、２、３または４用量が、所望の治療効果を達成するために妥当であり得る。本発明の組成物の投与量および頻度は、治療または予防する特定の状態および所望の治療効果に依存して変わる。
【０１２９】
本発明の組成物は、被験者の細胞にインビボでまたはエクスビボで投与することができる。被験者の細胞へのインビボでの投与について、ならびに被験者への投与については、本発明の組成物を、例えば、経口的に、非経口的に（例えば、静脈内に）、筋肉内注射により、皮内に（例えば、遺伝子銃により）、腹腔内注射、皮下注射により、経皮的に、体外的に、局所的になど、上で述べたように、投与することができる。また、本発明の組成物は、樹状細胞（これらは、当分野では周知の方法に従って被験者の細胞から単離または成長させる）に、または被験者からのバルクＰＢＭＣもしくはそれらの様々な細胞サブフラクションに、パルスすることができる。
【０１３０】
エクスビボ法を利用する場合、当分野では周知の標準的プロトコルに従って細胞または組織を除去し、体外で維持することができ、その間に本発明の組成物をそれらの細胞または組織に導入する。例えば、本発明の核酸およびベクターは、任意の遺伝子輸送メカニズム、例えばウイルス媒介遺伝子送達、リン酸カルシウム媒介遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたはプロテオリポソームなどによって細胞に導入することができる。その後、それらの形質導入されたおよび／またはトランスフェクトされた細胞を、その細胞または組織タイプについての標準的な方法により注入（例えば、医薬的に許容される担体中で）または移植して被験者に戻すことができる。被験者への様々な細胞の移植または注入についての標準的な方法は、公知である。
【０１３１】
本発明の調合物は、活性化合物の滅菌水性および非水性注射溶液を含むことができ、これらの製剤は、好ましくは、対象となる受容者の血液と等張であり、本質的に発熱物質不含である。これらの製剤は、抗酸化物質、緩衝剤、静菌薬および溶質を含有することがあり、これらが、その調合物を対象となる受容者の血液と等張にする。水性および非水性滅菌懸濁液は、懸濁化剤および増粘剤を含むことができる。これらの調合物は、単位用量または複数回分の用量用の容器に、例えば密封アンプルおよびバイアルに入れることができ、ならびに使用直前に無菌液体担体、例えば食塩水または注射用蒸留水を添加するだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管することができる。
【０１３２】
ある調合物では、本発明の組成物を、非経口投与に適当であり得る脂質粒子または小胞内、例えばリポソームまたは微結晶、の中に収容することができる。前記粒子は、化合物がその中に収容されるのであれば、単層または多層のいずれの適する構造のものであってもよい。正の電荷を有する脂質、例えば、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムエチルスルフェート、すなわち「ＤＯＴＡＰ」は、このような粒子および小胞に特に好ましい。このような脂質粒子の作製は、周知である。例えば、Ｊａｎｏｆｆらの米国特許第４，８８０，６３５号明細書、Ｋｕｒｏｎｏらの米国特許第４，９０６，４７７号明細書、Ｗａｌｌａｃｈらの米国特許第４，９１１，９２８号明細書、Ｗａｌｌａｃｈらの米国特許第４，９１７，９５１号明細書、Ａｌｌｅｎらの米国特許第４，９２０，０１６号明細書、Ｗｈｅａｔｌｅｙらの米国特許第４，９２１，７５７号明細書などを参照のこと。
【０１３３】
本発明の医薬組成物は、例えば、本明細書に記載するような疾病および／または疾患の治療のための薬物の生産に使用することができる。
【０１３４】
以下の配列は、本発明に含まれる。
配列番号１．プラスミドＴＲＣＢＡ−ｉｎｔ−ｌｕｃ ｍｕｔ．Ｎｔｓ １６３−２０３６：ＣＢＡプロモーター；ｎｔｓ．２７３９−４５７３：突然変異イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）；ｎｔｓ ４５９２−４８１３：ポリＡシグナル。
配列番号２．プラスミドＴＲＣＢＡ−ｉｎｔ−ｌｕｃ（ｗｔ）．Ｎｔｓ １６３−２０３６：ＣＢＡプロモーター；ｎｔｓ．２７３９−３５８８：ｗｔイントロン（６５４ Ｃ）；ｎｔｓ ２０７１−４５７３：ルシフェラーゼ中のイントロン；ｎｔｓ ４５９２−４８１３：ポリＡシグナル。
配列番号３．プラスミドＴＲＣＢＡ−ｉｎｔ−ｌｕｃ（６５７ＧＴ）．Ｎｔｓ １６３−２０３６：ＣＢＡプロモーター；ｎｔｓ．２７３９−３５８８：突然変異イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ；６５７ ＴＡ−ＧＴ）；ｎｔｓ ２０７１−４５７３：ルシフェラーゼ中のイントロン；ｎｔｓ ４５９２−４８１３：ポリＡシグナル。
配列番号４．プラスミドＧＬ３−ｉｎｔ−Ｌｕｃ（ｍｕｔ）．Ｎｔｓ ４８−２５０：ＳＶ４０プロモーター；ｎｔｓ．９４８−１７９７：突然変異イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）；ｎｔｓ ２８１４−３０３５：ポリＡシグナル；ｎｔｓ．２８０−２７８２：突然変異イントロンを有するルシフェラーゼ。
配列番号５．プラスミドＧＬ３−ｉｎｔ−Ｌｕｃ（ｗｔ）．Ｎｔｓ ４８−２５０：ＳＶ４０プロモーター；ｎｔｓ．９４８−１７９７：ｗｔイントロン（６５４ Ｃ）；ｎｔｓ ２８０−２７８２：イントロンを有するルシフェラーゼ；ｎｔｓ ２８１４−３０３５：ポリＡシグナル。
配列番号６．プラスミドＧＬ３−ｉｎｔ−Ｌｕｃ（６５７ＧＴ）．Ｎｔｓ ４８−２５０：ＳＶ４０プロモーター；ｎｔｓ．９４８−１７９７：イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ；６５７ＴＡ−ＧＴ）；ｎｔｓ ２８０−２７８２：突然変異イントロンを有するルシフェラーゼ；ｎｔｓ ２８１４−３０３５：ポリＡシグナル。
配列番号７．プラスミドＧＬ３−２ｉｎｔ−ｆｒｏｎ−ｓｐｈ（ｍｕｔ）．Ｎｔｓ ４８−２５０：ＳＶ４０プロモーター；ｎｔｓ．２５１−１１００；１７７１−２６２０：突然変異イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）；ｎｔｓ １１０３−３６３５：突然変異イントロンを有するルシフェラーゼ；ｎｔｓ ３６３７−３８５８：ポリＡシグナル。
配列番号８．プラスミドＧＬ３−３ｉｎｔ−２ｆｒｏｎ−ｓｐｈ（ｍｕｔ）．Ｎｔｓ ４８−２５０：ＳＶ４０プロモーター；ｎｔｓ．２５１−１１００；１１０６−１９６５；２６３５−３４８４：突然変異イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）；ｎｔｓ １９６７−４４６９：突然変異イントロンを有するルシフェラーゼ；ｎｔｓ ４５１４−４７３５：ポリＡシグナル。
配列番号９．プラスミドＧＬ３−ｉｎｔ−ｌｕｃ Ａ（ｍｕｔ）．Ｎｔｓ ４８−２５０：ＳＶ４０プロモーター；ｎｔｓ．６７３−１５２２：イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）；ｎｔｓ ２８０−２７８２：イントロンを有するルシフェラーゼ；ｎｔｓ ２８１４−３０３５：ポリＡシグナル。
配列番号１０．プラスミドＧＬ３−ｉｎｔ−Ｌｕｃ Ｂ（ｍｕｔ）．Ｎｔｓ ４８−２５０：ＳＶ４０プロモーター；ｎｔｓ．１４４０−２２８９：イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）；ｎｔｓ ２８０−２７８２：イントロンを有するルシフェラーゼ；ｎｔｓ ２８１４−３０３５：ポリＡシグナル。
配列番号１１．プラスミドＧＬ３−ｉｎｔ−Ｌｕｃ Ｃ（ｍｕｔ）．Ｎｔｓ ４８−２５０：ＳＶ４０プロモーター；ｎｔｓ．１６９１−２５４０：イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）；ｎｔｓ ２８０−２７８２：イントロンを有するルシフェラーゼ；ｎｔｓ ２８１４−３０３５：ポリＡシグナル。
配列番号１２．プラスミドＧＬ３−ｉｎｔ−ｆｒｏｎ（ｍｕｔ）．Ｎｔｓ ４８−２５０：ＳＶ４０プロモーター；ｎｔｓ．２５１−１１００：イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）；ｎｔｓ １１０３−２７５５：イントロンを有するルシフェラーゼ；ｎｔｓ ２７８７−３００８：ポリＡシグナル。
配列番号１３．プラスミドＧＬ３−２ｉｎｔ−ｓｐｈ（ｍｕｔ）．Ｎｔｓ ４８−２５０：ＳＶ４０プロモーター；ｎｔｓ．９４８−１７９７；１７９８−２６４７：イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）；ｎｔｓ ２８０−３６３２：イントロンを有するルシフェラーゼ；ｎｔｓ ３６６４−３８８５：ポリＡシグナル。
配列番号１４．プラスミドＧＬ３−２ｉｎｔ−ｓｐｈ Ｃ（ｍｕｔ）．Ｎｔｓ ４８−２５０：ＳＶ４０プロモーター；ｎｔｓ．９４８−１７９７；２５４１−３３９０：イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）；ｎｔｓ ２８０−３６３２：イントロンを有するルシフェラーゼ；ｎｔｓ ３６６４−３８８５：ポリＡシグナル。
配列番号１５．プラスミドＧＬ３−ｓｉｎｔ２００−ｓｐｈ（ｍｕｔ）．Ｎｔｓ ４８−２５０：ＳＶ４０プロモーター；ｎｔｓ．９４８−１５９７：イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）；ｎｔｓ ２８０−２５８２：イントロンを有するルシフェラーゼ；ｎｔｓ ２７９４−２８３５：ポリＡシグナル。
配列番号１６．プラスミドＧＬ３−ｓｉｎｔ２００−ｓｐｈ（６５７ ＧＴ）．Ｎｔｓ ４８−２５０：ＳＶ４０プロモーター；ｎｔｓ．９４８−１５９７：イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ；６５７ ＴＡ−ＧＴ）；ｎｔｓ ２８０−２５８２：イントロンを有するルシフェラーゼ；ｎｔｓ ２７９４−２８３５：ポリＡシグナル。
配列番号１７．プラスミドＧＬ３−ｓｉｎｔ４２５−ｓｐｈ．Ｎｔｓ ４８−２５０：ＳＶ４０プロモーター；ｎｔｓ．９４８−１３７３：イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）；ｎｔｓ ２８０−２３５８：イントロンを有するルシフェラーゼ；ｎｔｓ ２５６９−２６１５：ポリＡシグナル。
配列番号１８．突然変異イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）。
配列番号１９．ｗｔイントロン（６５４ Ｃ）。
配列番号２０．２つの突然変異を有するイントロン（６５４ Ｃ−Ｔ；６５７ ＴＡ−ＧＴ）。
配列番号２１．ｎｔｓ．６６９−１５１８に突然変異イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）を有するルシフェラーゼｃＤＮＡ。
配列番号２２．ｎｔｓ．６６９−１５１８に野生型イントロンを有するルシフェラーゼｃＤＮＡ。
配列番号２３．ｎｔｓ．６６９−１５１８に二重突然変異イントロン（Ｃ６５４ Ｃ−Ｔ；６５７ ＴＡ−ＧＴ）を有するルシフェラーゼｃＤＮＡ。
配列番号２４．ｎｔｓ．１−８５０に突然変異イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）およびｎｔｓ．１５２１−２３７０に突然変異イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）を有する、ルシフェラーゼｃＤＮＡ。
配列番号２５．ｎｔｓ．１−８５０に突然変異イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）およびｎｔｓ．８６１−１７１０およびｎｔｓ．２３８５−３２３４に２つの突然変異イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）を有する、ルシフェラーゼｃＤＮＡ。
配列番号２６．代替位置（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ）Ａ（ｎｔｓ．３９４−１２４３）に突然変異イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）を有するルシフェラーゼｃＤＮＡ。
配列番号２７．代替位置Ｂ（ｎｔｓ．１１６１−２０１０）に突然変異イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）を有するルシフェラーゼｃＤＮＡ。
配列番号２８．代替位置Ｃ（ｎｔｓ．１４１２−２２６１）に突然変異イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）を有するルシフェラーゼｃＤＮＡ。
配列番号２９．翻訳部位の上流（ｎｔｓ．１−８５０）に突然変異イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）を有するルシフェラーゼｃＤＮＡ。
配列番号３０．ｎｔｓ．６６９−１５１８およびｎｔｓ．１５１９−２３６８に２つの突然変異イントロンを有する、ルシフェラーゼｃＤＮＡ。
配列番号３１．ｎｔｓ．６６９−１５１８およびｎｔｓ．２２６２−３１１１に２つの突然変異イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）を有する、ルシフェラーゼｃＤＮＡ。
配列番号３２．ｎｔｓ．６６９−１３１８に突然変異イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）、および２００塩基対欠失を有する、ルシフェラーゼｃＤＮＡ。
配列番号３３．ｎｔｓ．６６９−１３１８に二重突然変異イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ；６５７ ＴＡ−ＧＴ）、および２００塩基対欠失を有する、ルシフェラーゼｃＤＮＡ。
配列番号３４．ｎｔｓ．６６９−１０９４に突然変異イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）、および４２５塩基対欠失を有する、ルシフェラーゼｃＤＮＡ。
配列番号３５．αアンチトリプシンｃＤＮＡおよびｎｔｓ．２８６６−３７１５に突然変異イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）を有する、プラスミドＴＲＣＢＡ。
配列番号３６．ｎｔｓ．７７２−１６２１に突然変異イントロン（６５４ Ｃ−Ｔ）を有するαアンチトリプシンｃＤＮＡ。
配列番号３７．ＩＶＳ２−６５４のためのブロッキングオリゴヌクレオチド ＧＣＴ ＡＴＴ ＡＣＣ ＴＴＡ ＡＣＣ ＣＡＧ。
配列番号３８．６５７ＧＴ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４のためのブロッキングオリゴヌクレオチド ＧＣＡ ＣＴＴ ＡＣＣ ＴＴＡ ＡＣＣ ＣＡＧ。
配列番号５０（５６４ＣＴ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）。
配列番号５１（６５７Ｇ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）。
配列番号５２（６５８Ｔ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）。
配列番号２０（６５７ＧＴ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）。
配列番号５３（２００ｂｐ欠失を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）。
配列番号５４（４２５ｂｐ欠失を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）。
配列番号６８（１９７ｂｐのみを有するＩＶＳ２−６５４イントロン）。
配列番号６９（２４７ｂｐのみを有するＩＶＳ２−６５４イントロン）。
配列番号５５（６Ａ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）。
配列番号５６（５６４Ｃ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）。
配列番号５７（８４１Ａ突然変異を有するＩＶＳ２−６５４イントロン）。
配列番号５８（ＩＶＳ２−７０５イントロン）。
配列番号５９（５６４ＣＴ突然変異を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）。
配列番号６０（６５７Ｇ突然変異を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）。
配列番号６１（６５８Ｔ突然変異を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）。
配列番号６２（６５７ＧＴ突然変異を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）。
配列番号６３（２００ｂｐ欠失を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）。
配列番号６４（４２５ｂｐ欠失を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）。
配列番号６５（６Ａ突然変異を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）。
配列番号６６（５６４Ｃ突然変異を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）。
配列番号６７（８４１Ａ突然変異を有するＩＶＳ２−７０５イントロン）。
配列番号７０（ＣＦＴＲエキソン１９野生型配列）。
配列番号７１（ＣＦＴＲエキソン１９ ３８４９ ＋ １０ｋｂ ＣからＴへの突然変異）。
配列番号７２（ＣＦＴＲエキソン１９野生型オリゴ）．
配列番号７３（ＣＦＴＲエキソン１９ ３８４９ ＋ １０ｋｂ ＣからＴへの突然変異 オリゴ）。
配列番号７４（マウスジストロフィン イントロン２２、エキソン２３およびイントロン２３野生型配列）。
配列番号７５（ｍｄｘマウスジストロフィン イントロン２２、エキソン２３およびイントロン２３ ナンセンス突然変異）。
配列番号７６（アンチセンス エキソン ２３ スキッピング誘導性オリゴ）。
配列番号３９（ＩＶＳ２−６５４における６Ａ突然変異のためのオリゴ）。
配列番号４０（ＩＶＳ２−６５４における５６４Ｃ突然変異のためのオリゴ）。
配列番号４１（ＩＶＳ２−６５４における５６４ＣＴ突然変異のためのオリゴ）。
配列番号４３（ＩＶＳ２−６５４における８４１Ａ突然変異のためのオリゴ）。
配列番号４４（ＩＶＳ２−６５４における６５７Ｇ突然変異のためのオリゴ）。
配列番号４５（ＩＶＳ２−６５４における６５８Ｔ突然変異のためのオリゴ）。
配列番号４２（ＩＶＳ２−７０５における７０５Ｇ突然変異のためのオリゴ）。
配列番号４９（ＩＶＳ２−７０５のためのオリゴ）。
配列番号４６（ＩＶＳ２−６５４のためのオリゴ）。
配列番号４７（ＩＶＳ２−６５４のためのオリゴ）。
配列番号４８（ＩＶＳ２−６５４のためのオリゴ）。
【０１３５】
以下の実施例は、本発明を例証するために示すものであり、本発明の限定と解釈すべきではない。
【実施例１】
【０１３６】
（ウイルスベクター誘導遺伝子発現のスプライシング媒介制御）
（プラスミドの構成）
プラスミドｐＧＬ３は、Ｐｒｏｍｅｇａから購入した。すべてのプライマーは、ＵＮＣ−ＣＨ ＬＣＣＣオリゴヌクレオチドコアファミリーから入手した。すべての酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｄｓからのものであり、この供給業者の推奨に従って使用した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）ｃＤＮＡの中央に潜在スプライス部位を有する野生型（ｗｔ）またはイントロン配列を挿入するために、ｐｒｅ−ｍＲＮＡにおけるコンセンサス配列に従って挿入部位を選択した（Ｌｕｃａ Ｃａｒｔｅｇｎｉ ｅｔ ａｌ．「Ｌｉｓｔｅｎｉｎｇ ｔｏ ｓｉｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｅｘｏｎｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ａｆｆｅｃｔ ｓｐｌｉｃｉｎｇ」 Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２００２ Ａｐｒ；３（４）：２８５−９８）。
【０１３７】
イントロンは、（番号１のルシフェラーゼｃＤＮＡ開始コドンＡＴＧに基づき）様々な位置に挿入した：３９３−３９４（Ａ）、６６８−６６９（Ｂ）、１１６０−１１６１（Ｃ）および１４１１−１４１２（Ｄ）。幾つかの試験では、イントロンをプロモーターとルシフェラーゼｃＤＮＡの間に挿入した。４フラグメントライゲーション戦略を適用した。Ｐｆｕ酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）を使用して、イントロンおよび隣接する、ＮｃｏＩを有する上流配列とＸｂａＩを有する下流配列の両方を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。ＧＬ３骨格はＮｃｏＩとＸｂａＩの両方で消化し、一方、そのＰＣＲ産物はＮｃｏＩまたはＸｂａＩのいずれかで消化した。イントロンを平滑末端ライゲーションによって挿入した。そのセグメントをｇｅｌから精製した。１時間後、Ｆａｓｔ Ｌｉｇａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）による室温ライゲーションを行い、その後、電子穿孔（ｅｌｅｂｔｒｏｐｅｒｆｏｒａｔｉｏｎ）によってその核酸をＤＨ１０Ｂ細菌細胞に形質転換させた。
【０１３８】
（ウイルス作製）
イントロン調節トランスジーンカセットを有するＡＡＶ２ベクターを、標準的な３−プラスミドコトランスフェクション手順（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｍｕｓｃｌｅ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｍｉｃｅ ｂｙ ａｄｅｎｏ− ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ」 Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９６ Ｎｏｖ；７０（１１）：８０９８−１０８）に従って作製した。その力価をドットブロットによって判定した。
【０１３９】
（インビトロでのルシフェラーゼ発現アッセイ）
幾つかの実験において、２４ウエルプレート内で２９３細胞をトランスフェクトした。各ウエルにつき、１０ｎｇのプラスミド ５μＬ、２．５ＭのＣａＣｌ₂ １０μＬおよびｄｄＨ₂Ｏ ８５μＬを共に混合した後、１００μＬの２Ｘ ＨｅＢＳを添加した。これは、光学顕微鏡法のもとで沈殿が形成した後、細胞に添加した。同時に幾つかの細胞をオリゴ（例えば、０．０５ｍＭ、１０μＬ）で処理した。
【０１４０】
３７℃、５％ＣＯ₂での２４時間のインキュベーション後、２００μＬの１×ＰＢＳで洗浄した後に、それらの細胞を各ウエルにつき１００μＬの１×溶解緩衝液で溶解した。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｒｏｐｉｘ）を使用するルシフェラーゼアッセイのために、２０μＬ量を取って９６ウエル不透明プレートに入れた。ルシフェラーゼ基質は、Ｐｒｏｍｅｇａから購入した。
【０１４１】
（動物研究）
ウイルス注射の１週間後、２．５ｍＭのアベルチンまたはイソフルランの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により動物を麻酔した。ルシフェラーゼ基質（１２５μＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、Ｐｒｏｍｅｇａ）をｉ．ｐ．投与して、蛍光反応を惹起した。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＩＶＩＳ撮像システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を適用して、その動物全体からルシフェラーゼ蛍光の「現時間」撮像を捕捉した。画像は、最初に（第０日）取得し、その後２日続けてオリゴヌクレオチドを投与した（ｉ．ｐ．２５ｍｇ／ｋｇ）後に、取得した。
【０１４２】
この実施例では、β−グロビンイントロンにおける自然発生突然変異を用いて、調節されたスプライシング系を発生させた。これらのイントロン突然変異は、β−サラセミアの患者で発見されたものであり、新たな５’スプライスドナー部位を作ることによって疾病を生じさせることが判明した。潜在３’スプライスアクセプターと協力して、この新たなドナー部位が、インフレーム停止シグナルを有するイントロンの一部分のｍＲＮＡへの包含を生じさせる。
【０１４３】
具体的には、この実施例において、ＡＡＶベクターの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）トランスジーンに含まれている突然変異イントロンを完全ベクター調節系として使用できることを証明する。突然変異を指示するオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）の付加は、インビトロでもインビボでもスプライシング異常を補正し、正しい遺伝子発現を誘導する。
【０１４４】
ＡＡＶプラスミドベクターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターまたはハイブリッドＣＭＶニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＢもしくはＣＢＡ）の後に組み込まれた野生型または突然変異β−グロビンイントロンを含有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはルシフェラーゼレポーター遺伝子をクローニングすることによって構成した。２つの異なるスプライス突然変異を、別個のＡＡＶベクター（そのイントロンのｎｔ ６５４での突然変異（ＡＡＶ−６５４）、および潜在スプライス部位での追加の突然変異を有するｎｔ ７０５での突然変異（ＡＡＶ−７０５）に組み込んだ。ＨＥＫ２９３細胞またはＨｅＬａ細胞へのこれらのＡＡＶ構成体のトランスフェクションは、結果として、野生型イントロンでの良好な遺伝子発現および突然変異イントロンでの低い遺伝子発現をもたらした。その後、それらの細胞を、ｎｔ ６５４での突然変異またはｎｔ ７０５での突然変異をそれぞれ指示する２’−Ｏ−メトキシエチルホスホロチオエート（ＭＯＥ）オリゴヌクレオチドでトランスフェクションすることで、６５４および７０５Ｕ突然変異体からの遺伝子発現を、それぞれ増加させた。
【０１４５】
組換えＡＡＶを産生させ、ＨＥＫ２９３細胞とＨｅＬａ細胞の両方で検査した。ＡＡＶ感染の２４時間後、対応する突然変異を指示するＭＯＥオリゴヌクレオチドで細胞をトランスフェクトし、そのオリゴトランスフェクション後２４および４８時間の時点でレポーター遺伝子発現を観察した。ＡＡＶ−６５４またはＡＡＶ−７０５Ｕで感染させ、オリゴで感染させていない細胞は、トランスフェクション後２４時間の時点でＧＥＰ発現を実質的に示さず、４８時間の時点でほんのわずかな遺伝子発現を示した。対照的に、オリゴでトレンスフェクトした細胞は、２４時間の時点で有意な遺伝子発現を示し、４８時間の時点で強度が多少上昇したが、細胞数は増加しなかった。ＧＦＰポジティブ細胞のカウントは、４８時間の時点で、６５４突然変異体についてはオリゴの付加で２００倍までの誘導および７０５突然変異体については７０倍の誘導を示した。ＧＦＰ蛍光細胞カウント数によりおよび全場蛍光によりアッセイしたところ、７０５Ｕ突然変異体は、ＨｅＬａ細胞およびＨＥＫ ２９３細胞においてあまり強くない誘導を示した。これは、遺伝子発現のわずかに高い基底レベルおよびオリゴの付加へのあまり強くない応答に起因すると思われた。
【０１４６】
野生型イントロン（ＡＡＶ−ｗｔ ｉｎｔ）を含有するｒＡＡＶでの感染は、ほぼ１００％の細胞において、突然変異体と同じ感染多重度（ＭＯＩ）で強いＧＦＰ発現を一貫してもたらした。このＡＡＶ−ｗｔイントロンは、オリゴの存在下でいずれの突然変異体よりも有意に大きい遺伝子発現を示した。これは、そのオリゴによる不完全な補正を示している。半定量ＲＴ−ＰＣＲにより、オリゴの存在下、ＡＡＶ−６５４感染細胞とＡＡＶ−７０６Ｕ感染細胞の両方において、正しくスプライシングされた種と正しくなくスプライシングされた種の両方が確認された。しかし、オリゴの用量の増加は、遺伝子発現を実質的に増加させなかった。ウイルスの量の増加は、全場強度を多少増加させるが、ＧＦＰポジティブ細胞の数は増加させなかった。
【０１４７】
表１は、ルシフェラーゼｃＤＮＡを基準にして異なる位置での１つのイントロンの補正効率を示すものである。
【０１４８】
表２は、多数のイントロンの挿入に伴うルシフェラーゼトランスジーン発現の変化を示すものである。
【０１４９】
表３は、塩基対１５１〜３５０を欠失させることによりその長さを四分の一に短縮したイントロン（配列番号５３）のトランスジーン補正効率を示すものである。
【実施例２】
【０１５０】
（インビボ試験）
オリゴヌクレオチドによるＡＡＶ媒介遺伝子発現の誘導を、ＣＢプロモーターによって駆動された６５４突然変異イントロン構成体（ＡＡＶ−ＣＢ−６５４）を用いて、インビボでも調査した。ルシフェラーゼレポーター遺伝子内に６５４突然変異イントロンを有するｒＡＡＶタイプ２ベクター（５ｘ１０¹⁰ ベクター粒子）を門脈注射によりマウス肝臓に送達した。１年後、オリゴを、１日１回２５ｍｇ／ｋｇで２日間、腹腔内投与した。３日目にルシフェラーゼ撮像を行った。オリゴ治療を受けていない動物と比較したとき、ルシフェラーゼ発現は、８〜１０倍高かった。インビボで観察されたオリゴ誘導アップレギュレーションは１ヶ月にわたって存続し、その後、低下してベースラインレベルに戻った。１週間ベクターを投与し、その後、オリゴを投与した動物の第二のセットは、トランスジーン発現の特徴的なアップレギュレーション、その後、１ヶ月にわたっての低下という結果となった。オリゴの反復投与により、イントロン調節トランスジーン発現を再び活性化することもできた。この結果は、ベクター特異的構成プロモーターは長期間にわたってｍＲＮＡを発現し続ける（インビボでのＡＡＶ媒介トランスジーン発現と一致）が、機能的遺伝子産物は「スプライス媒介」薬（例えば、オリゴヌクレオチド）の投与後にしか観察されないことを明示している。
【０１５１】
これらの結果は、非機能的ｍＲＮＡから機能的ｍＲＮＡへとベクター産生ＲＮＡのスプライシングを調節することによる機能的遺伝子発現の調節を明示している。
【０１５２】
このオリゴの付加は、遺伝子発現を相当急速に誘導して、組織培養では２４時間までに、インビボでは１から２日以内に発現を生じさせた。遺伝子発現の継続時間は、そのトランスジーンによって産生されるタンパク質の半減期およびそのオリゴヌクレオチドの半減期による影響を受ける。オリゴヌクレオチド、例えば２’−Ｏ−メトキシエチルホスホロチオエート骨格は、インビボで長い半減期を有し、８時間後、ラットでは完全にそのまま維持される。継続的ｍＲＮＡ補正およびタンパク質発現が、１回のＭＯＥまたはＬＮＡオリゴ注射で、かなり長い間、続くことがあった。オリゴヌクレオチドの骨格および用量を変えることによって遺伝子補正の継続時間を変えることができるはずである。異なる骨格は、有意に異なる生体内安定性を明示し、これらを用いて、遺伝子発現継続時間をより正確に制御することができた。スプライシングされたｍＲＮＡが速いまたは遅い交替速度を有するようにさせるシス作用性要素を含めることにより、ターゲットｍＲＮＡの半減期を制御することもできる。このような要素の使用は、当分野では一般的であり、当業者によく知られている。強いポリＡシグナルの付加も、プロセッシングされたメッセージの半減期に影響を及ぼす。従って、「スプライス媒介」薬が機能的ｍＲＮＡをアップレギュレートする能力は、与えられる量、生体内分布、安定性および／またはターゲット配列への親和性、ならびにターゲットｍＲＮＡの存在度および安定性による影響を受け得る。これらのパラメータのすべてを、当分野では公知の方法に従って修飾して、「スプライス媒介」調節をより正確に制御することができた。
【０１５３】
遺伝子発現を調節するためにイントロンを使用することにより、トランスジーン以外の異種タンパク質の付加の必要をなくし、そのようにして調節トランスアクチベータへの一連の免疫反応についての可能性を回避する。加えて、このイントロンは、サイズが様々であり得（１０００ｂｐ以下）、ならびにオリゴの付加後に単一のベクターにおいて組織特異性およびタンパク質発現調節を生じさせる組織特異的プロモーターと容易に併用することができる。より多くの従来的な調節系において、一般に、これには、２つのベクターおよび２つの別のプロモーター（すなわち、トランスジーン発現を駆動するための調節プロモーターおよびトランスアクチベータを駆動するための組織特異的プロモーター）が必要である。
【０１５４】
この系の使用効果をさらに実証するために、機能的治療用トランスジーン（α１−アンチトリプシン；ＡＡＴ）をイントロン調節遺伝子カセット系でＡＡＶベクターにクローニングした。ベクター粒子の門脈注射後、機能的ＡＡＴトランスジーン活性をＥＬＩＳＡアッセイにより経時的に測定した。「スプライス媒介」オリゴ不在下で検出されたヒトＡＡＴは、少ないか無かった。しかし、薬物（この実施例では、ＬＮＡオリゴ）の存在下では、血液中でのトランスジーン発現のアップレギュレーション（１００倍）をモニターすることができ、レポーター遺伝子について説明したものに類似した反応速度および継続時間（３０日を越える）であった。ＡＡＶベクターと一致して、ベクター送達後、トランスジーン発現は、ターゲット組織において遺伝子発現カセット（レポーターまたは治療用）にかかわらず確実であり、持続する。「スプライス媒介」制御ベクターに関しては、ベクター送達のすべての態様が、機能的ｍＲＮＡの発現の例外と一致する。この態様は、外因性「スプライス媒介性」薬の存在によってのみ制御され、ならびに選択された時間でのみおよび／または反復的に生じさせて、トランスジーンｍＲＮＡの所望の機能的活性を達成することができる。
【実施例３】
【０１５５】
（図１〜３に示す試験）
本発明の一部の実施形態において、ＡＡＶプラスミドベクターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターまたはハイブリッドＣＭＶニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＢ）のいずれかの後のコード配列内に突然変異β−グロビンイントロンを含有するレポーター遺伝子カセット（緑色蛍光タンパク質−ＧＦＰまたはルシフェラーゼ−Ｌｕｃ）をクローニングすることによって構成した。ＡＡＶベクターは、標準的な３−プラスミドコトランスフェクション手順（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９８））に従って産生させた。イントロン突然変異配列の存在に基づき、これらのベクターカセットからのＲＮＡ発現の結果、ｐｒｅ−ｍＲＮＡが形成される（図１（１））。外因性オリゴヌクレオチドが不在の場合、ｐｒｅ−ｍＲＮＡは、潜在スプライス部位を用いてスプライシングすることとなる。これは、そのイントロンのｎｔ ６５４に位置する単点突然変異の結果であり、その突然変異の結果、選択的スプライス部位（図１（１）（ｉ）におけるｐｒｅ−ｍＲＮＡの上の小さな三角）が形成される。この反応から産生されるスプライシングされたｍＲＮＡは、２つのコード配列間にそのイントロン配列の一部分を含有する（図１（２）（ｉ））。このｍＲＮＡは、非機能的であり、機能的産物を発現しない（図１（３）（ｉ））。ｎｔ ６５４（図１（１）（ｉｉ）における黒棒の右側）での突然変異を指示する２’−Ｏ−メトキシエチルホスホロチオエート（ＭＯＥ）オリゴヌクレオチドのその後のトランスフェクションは、選択的スプライシングをブロックし、その結果、正しいスプライシング（図１（２）（ｉｉ））および機能的遺伝子産物（図１（３）（ｉｉ））が生じる。
【０１５６】
上記カセットを有する組換えＡＡＶベクターを産生させ、ヒト細胞（ＨｅＬａ細胞）において調節されたトランスジーン発現について検査した。ＡＡＶ感染の２４時間後、それらの細胞の１／２を、６５４突然変異を指示するＭＯＥオリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、そのオリゴトランスフェクション後４８時間の時点でレポーター遺伝子発現を観察した。オリゴヌクレオチドでではなくＡＡＶ−６５４ベクターで感染させた細胞は、検出可能なＧＦＰ発現を実質的に示さなかった。対照的に、６５４特異的オリゴヌクレオチドでトランスフェクトさせた細胞は、有意な遺伝子発現を示した。ＧＦＰポジティブ細胞のカウントは、６５４突然変異体について、そのオリゴヌクレオチドの付加で２００倍までの誘導を示した。
【０１５７】
「スプライス媒介」イントロンによって制御されたルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するＡＡＶベクターを本明細書において説明するとおり産生させ、それらを使用して、門脈注射によりマウス肝臓を感染させた。１セットの動物では、オリゴ薬送達の１年前にベクターを投与した（図２Ａ）。腹腔内注射により２日続けてスプライス特異的オリゴを投与した後、ルシフェリン基質の注射後に動物の実現時間撮像を行って、フォトンの放出および収集（ならびに発光単位（ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）への変換）により機能的ルシフェラーゼ活性を検出した。図２Ａに示されているように、オリゴを受けたマウス（図２Ａ（ｉｉ）および図２Ｃ）は、未治療動物と比較したとき、増加したルシフェラーゼ活性（濃いグレーのシェーディングおよび増加した表面積量）を示した。これらの結果は、ベクター特異的構成プロモーターが非機能的ｍＲＮＡを発現し続けること、およびこの活性が１年より長きにわたって持続したことも明示している。図１において説明したように、「スプライス媒介」オリゴ用量の付加後にのみ、非機能的ｍＲＮＡは、機能的ｍＲＮＡに変換する。
【０１５８】
「スプライス媒介」ベクタートランスジーンカセットで感染させた別のセットの動物では、調節は、オリゴ投与後に誘導され、１ケ月を超えて持続し、一定して低下してベースラインに戻った。オリゴの反復投与（図２Ｂ；矢印）は、第一薬物投与と一致してトランスジーン活性のアップレギュレーションを明示した（図２Ｂ；ひし形）。アップレギュレーションの証拠は、「スプライス媒介」オリゴ薬を受けていない動物では観察されなかった（図２Ｂ；黒丸）。これらの実験は、ベクター送達トランスジーンカセットが、そのオリゴ薬の存在にインビボで応答し、そのオリゴ薬の持続時間に影響されやすいことを明示している。当業者は、薬物送達に関連した非常に多数の実験パラメータを、調節されるトランスジーン機能（例えば、薬物の用量および生体内分布、薬物およびターゲットｍＲＮＡの半減期、ｍＲＮＡ産物の安定性など）のレベルおよび持続時間に影響を及ぼすように調整することができる。
【０１５９】
調節された治療用トランスジーン（アルファ１−アンチトリプシン；ＡＡＴ）を有するＡＡＶベクターを使用して、類似した実験をインビボで行った。この実施例では、ＡＡＶベクターを門脈注射によってマウス肝臓に投与した。１週間後、動物のサブセットに腹腔内注射によって所与のＬＮＡオリゴを投与し、その後、ＥＬＩＳＡアッセイによってＡＡＴタンパク質の循環レベルを測定した。ＡＡＴ発現は、約１週間でピークに達し（図３；四角）、そして１ケ月にわたってゆっくりと低下した。ベクターのみを受けた動物（図３；ひし形）では、この実験の継続時間の間、ベースラインより上のＡＡＴ発現の形跡は観察されなかった。主として、２つの重要な要素、すなわち、使用されるオリゴおよびタンパク質産物それぞれの半減期、が、この実験において誘導されるトランスジーンの寿命を決める。使用されるオリゴのタイプ（ＰＮＡ 対 ＬＮＡなど）および調節のターゲットとなるトランスジーン（ＡＡＴ 対 成長因子 対 サイトカインなど）に依存して、種々の結果を達成することができる。それにもかかわらず、これらの全体にわたっての結果は、「スプライス媒介」調節レポーター遺伝子のものによく似ており、ならびに「スプライシング媒介」調節メカニズムにより薬物の外因性投与後にインビボでの治療用トランスジーン発現を調節できることを明示している。
【実施例４】
【０１６０】
（二重イントロン系）
インビトロおよびインビボでトランスジーン発現を調節するための選択的スプライシングの使用。ヒトβ−グロビン遺伝子の異常スプライシングされた突然変異イントロン、ＩＶＳ２−６５４を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現カセットに挿入した。ＩＶＳ２−６５４イントロンは、８５０ｂｐのサイズであり、４つのスプライス部位を含有する。ＩＶＳ２−６５４イントロンのヌクレオチド配列（配列番号１９）を下に示す。２つの選択的イントロン（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｉｎｔｏｒｎ）が、ヌクレオチド１〜１５９および６５３〜８５０にある。選択的エキソン（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｅｘｏｎ）は、ヌクレオチド５８０〜６５２にある。２つの矢印は、選択的イントロン−エキソン間の接合点を指定している。４つのスプライス部位および４つの潜在的分岐部位点を直線の下線および曲線の下線によってそれぞれ示す。５’ｓｓ ６５２／１８ ＡＯＮのターゲット配列は、太字エンボス文字である。十分なスプライシングおよび３’末端形成に必要な配列は、太字斜体である。
【化１】

【０１６１】
得られたプラスミドを、リン酸カルシウムトランスフェクション法を用いることにより、２９３細胞、ヒト腎臓上皮細胞系に、トランスフェクトした。その後、０．５μＭの最終濃度で特異的ＡＯＮを２つの同一のトランスフェクト細胞セットのうちの一方に付加させて、ＧＦＰ発現を誘導した。５’ｓｓ ６５２／１８ ＡＯＮという名のこの特異的ＡＯＮは、５’選択的スプライス部位に相補的な１８量体オリゴヌクレオチドであり、異常エキソンの包含を阻害することができる。ポジティブ対照として、２９３細胞を、そのＧＦＰ発現カセット内の同じ部位に挿入された野生型イントロンを含有するプラスミドで、別途、トランスフェクトした。これらのポジティブ対照細胞は、５’ｓｓ ６５２／１８ ＡＯＮで処理しなかった。そのトランスフェクションの２４時間後、蛍光顕微鏡法を用いてそれらの細胞をＧＦＰ発現について検査した。この実験群において、トランスフェクトしたがこのＡＯＮで処理していない細胞は、検出可能なＧＦＰレベルを発現することができなかった。対照的に、このＡＯＮで処理した細胞は、ポジティブ対照群のものと類似したレベルで機能的ＧＦＰを発現した。従って、選択的スプライシングを用いて、トランスジーン発現をインビトロで制御することができた。
【０１６２】
選択的スプライシングを用いてトランスジーン発現をインビボでも制御できるかどうかを判定するために、８５０ｂｐ ＩＶＳ２−６５４イントロンの１つのコピーが挿入されたルシフェラーゼ発現カセットを有する組換えＡＡＶプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）を構成した。このルシフェラーゼ遺伝子は、マウスにおいて構成的トランスジーン発現を駆動できることが証明されている、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチンプロモーターによって駆動した。ＡＡＶは、アデノウイルスを利用しない産生計画を用いて産生させ、この計画は、３つのプラスミド（組換えＡＡＶプラスミド；構造ＡＡＶ遺伝子と非構造ＡＡＶ遺伝子の両方を供給するＡＡＶ−ヘルパープラスミド；およびＡＡＶベクター産生に必須のヘルパー遺伝子を供給するアデノウイルス−ヘルパープラスミド）での２９３細胞のトランスフェクションを含むものであった。結果として生じたＡＡＶベクターは、イオジキサノール勾配およびヘパリンスルフェートクロマトグラフィー段階を含む精製プロトコルを利用することによって精製した。その後、その精製されたＡＡＶの５ｘ１０¹⁰の粒子を各マウスに投与した。注射の１週間後、２日続けて１日１回、２５ｍｇ／ｋｇで５’ｓｓ ６５２／１８ ＡＯＮを腹腔内注射することにより、ルシフェラーゼ発現を誘導した。ルシフェラーゼ発現レベルは、ルシフェリン投与後、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる全身撮像によって判定した。門脈注射によりＡＡＶを肝臓にターゲッティングしたとき、その器官でのルシフェラーゼ発現は、１０．４倍まで誘導され、８日目にピークに達し、２９日より長く続いた。直接注射によって心臓にターゲッティングしたＡＡＶも、類似した誘導トランスジーン発現パターンを示した。ＡＯＮをそのマウスにＡＡＶ注射の１年後にも投与し、肝臓におけるルシフェラーゼ発現は、同様のレベルまで誘導された。これは、ＡＡＶベクターへのイントロンの組み込みが、ＡＡＶゲノムの残存に影響を及ぼさないかったことを示している。
【０１６３】
トランスジーン発現レベルをより正確に定量するために、および選択的スプライシングがインビボでの関心のある他の遺伝子の発現を制御できるかどうかを判定するために、８５０ｂｐ ＩＶＳ２−６５４イントロンの１つのコピーが挿入されたα１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）発現カセットを有する別のＡＡＶベクターを構成した。得られた精製ＡＡＶを門脈注射によってマウスに投与した。ＡＡＴ発現を５’ｓｓ ６５２／１８ ＡＯＮの投与によって誘導し、ＥＬＩＳＡアッセイによって定量した。ルシフェラーゼ発現パターンに類似して、ＡＡＴ発現は、８．９倍まで誘導され、８日目および２９日目にピークに達し、４３日より長く続いた。これらの結果は、選択的スプライシングを用いて、インビトロでもインビボでもトランスジーン発現を制御できることを示している。
【０１６４】
（トランスジーン発現を制御するための選択的スプライシングの最適化）
トランスジーン発現を制御するための選択的スプライシングの最適化を助長するために、蛍ルシフェラーゼマーカー遺伝子を、８５０ｂｐの選択的にスプライシングされたイントロン ＩＶＳ２−６５４の挿入に用いた。従って、トランスジーン発現の制御は、エキソン包含とエキソンスキッピングの両方の条件下で、すなわち５’ｓｓ ６５２／１８ ＡＯＮの存在下または不在下で、ルシフェラーゼ発現レベルをアッセイすることによって、適便に判定することができた。トランスジーン発現を制御するためのこの選択的スプライシングを最適化するために、以下の３セットの実験を行った。
【０１６５】
１）トランスジーン発現を制御するためのルシフェラーゼ発現カセットへのＩＶＳ２−６５４イントロンの単一コピーの挿入。挿入部位がそのイントロンのスプライシングに影響を及ぼすかどうかを判定するために、８５０ｂ ＩＶＳ２−６５４イントロンの単一コピーを、ヌクレオチド３９３〜３９４（Ａ）、６６８〜６６９（Ｂ）、１１６０〜１１６１（Ｃ）または１４１１〜１４１２（Ｄ）、ならびに翻訳開始の直ぐ上流（Ｆ）の間に、すなわち、そのルシフェラーゼ発現カセットの位置Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＦに、挿入した。それらのコード配列の上流にイントロンを挿入する理由は、異常エキソンそれ自体が、上流ＡＴＧ開始コドンと下流ＴＴＡ停止コドンの両方を含有するからである。従って、位置Ｆでの異常エキソンの包含は、ルシフェラーゼタンパク質の合成を妨げるはずである。結果として生じたプラスミドを、リン酸カルシウムトランスフェクション法を用いることにより、２９３細胞に別々にトランスフェクトした。その後、０．５μＭの最終濃度で、遊離５’ｓｓ ６５２／１８ ＡＯＮを、そのトランスフェクトされた細胞の２つの同一のセットのうちの一方に付加させた。そのトランスフェクションの２４時間後、ルシフェラーゼ発現を定量するためにそれらの細胞を回収した。位置Ａ〜Ｄでのイントロン挿入については、実際のルシフェラーゼ発現レベルが、同じ条件下で、すなわち前記ＡＯＮの不在下または存在下、いずれかで、３．８倍まで有意に変動した。しかし、４つの構成体の誘導レベルは類似しており、４．０から５．７倍であった。構成体Ａ〜Ｄについての誘導レベルにおける類似性は、隣接する配列がその選択的スプライシングに劇的な影響を及ぼさないことを示唆していた。驚くべきことに、位置Ｆでの挿入は、低い誘導発現レベルおよび比較的高い発現バックグラウンドレベルをもたらした。この低い誘導レベルは、５’選択的スプライス部位の認識が５’キャップ構造によって強化され、その結果、より効率的なエキソン包含が生じたためであり得る。この高いバックグラウンドレベルは、正しい開始コドンで開始された翻訳に起因し得る。
【０１６６】
ルシフェラーゼ発現系は、誘導レベルと実際の発現レベルの両方を適便に定量することができるため、選択的スプライシングアプローチと自己切断リボザイムアプローチ（３８）との並列比較を行った。８３ｂｐ Ｎ７９リボザイムの単一コピーを、そのルシフェラーゼ発現カセットのコザック配列およびＡＴＧ開始コドンの上流に挿入した。結果として生じたプラスミドおよび構成体Ｃを、リン酸カルシウムトランスフェクション法を用いることにより、２９３細胞に別々にトランスフェクトした。リボザイム含有構成体については、１．５μＭの最終濃度で、トヨカマイシンを、それらのトランスフェクト細胞の２つの同一のセットのうちの一方に添加した。イントロン含有構成体については、０．５μＭの最終濃度で、遊離の５’ｓｓ ６５２／１８ ＡＯＮを、それらのトランスフェクト細胞の２つの同一のセットのうちの一方に添加した。そのトランスフェクションの２４時間後、ルシフェラーゼ発現を定量するために、それらの細胞を回収した。それらのイントロンおよびリボザイム含有構成体についての誘導レベルは、それぞれ、５．３倍および１．８倍であった。加えて、リボザイム含有構成体についての実際のルシフェラーゼ発現レベルは、イントロン含有構成体についてのものの０．４％であった。リボザイム含有構成体についてのより低いルシフェラーゼ発現レベルは、翻訳開始の上流のＡＵＧ含有リボザイムの配置が、突然変異タンパク質の正しい翻訳または合成のいずれかの阻害に至るという考えと一致する。イントロン含有構成体についてのより高いルシフェラーゼ発現レベルは、イントロン配列の存在下でのｍＲＮＡの３’末端のより効率的な形成に起因する可能性が高かった。リボザイムアプローチについて報告されている約２６０倍のルシフェラーゼ発現誘導が、ルシフェラーゼ発現カセットに挿入されたＮ７９リボザイムの２つのコピーを有する安定な細胞系に基づくものであったことは、明らかにすべきである（３８）。
【０１６７】
２）トランスジーン発現を制御するためのルシフェラーゼ発現カセットへのＩＶＳ２−６５４イントロンの２つのコピーの挿入。この実験セットの目的は、イントロンの２つのコピーの挿入が、トランスジーン発現の誘導レベルを改善するかどうか、および２つのイントロン間の距離が、その誘導レベルに対して何らかの影響を及ぼすかどうかを検査することであった。従って、１，７００ｂｐの総合サイズを有するＩＶＳ２−６５４イントロンの２つのコピーを、間に様々な距離を有する２つの異なる部位（ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＢＣ、ＢＤおおびＦＢ）にまたはタンデムで１つの部位（ＢＢ）に配置した。結果として生じたプラスミドを、リン酸カルシウムトランスフェクション法を用いることにより、２９３細胞に別々にトランスフェクトした。引き続いて０．５μＭの最終濃度で、遊離５’ｓｓ ６５２／１８ ＡＯＮを、それらのトランスフェクト細胞の２つの同一のセットのうちの一方に添加した。そのトランスフェクションの２４時間後、それらの細胞を、ルシフェラーゼ発現を定量するために回収した。ＢＢを除くすべての構成体が、有意に低減されたバックグラウンド発現レベルに至った。結果として、それらの誘導レベルは、大きく改善され、１０．１倍から１４３．３倍に及んだ。それらの誘導レベルは、タンデムでの２つのイントロンの場合、すなわちＢＢ構成体の場合を除き、２つのイントロン間の距離にほぼ逆相関していた。イントロンの２つのコピーがある程度まで極めて近接している場合、その低減されたバックグラウンド発現レベル、および、その結果、改善されたトランスジーン発現誘導レベルは、選択的スプライス部位の認識が強化されたため、および／またはｍＲＮＡのナンセンス媒介崩壊が加速されたためであり得る。ナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊は、不完全なポリペプチドをコードする異常ｍＲＮＡを削除することによて遺伝子発現のエラーを減少させる監視経路である。ＢＢ構成体についての発現のバックグラウンドレベルは、その群の残りのものより有意に高かった。おそらく、このより高いバックグラウンド発現レベルは、上流イントロンの３’スプライス部位および下流イントロンの５’スプライス部位が互いに近すぎるので、それらのスプライス部位の認識が損なわれていしまうためであった。その結果として、２つの最も外側のスプライス部位が、認識される主な部位と成り得た。これらの結果は、イントロンの多数のコピーの挿入が、トランスジーン発現の誘導レベルを改善し得ることを示している。それらは、最高誘導レベルを生じさせるイントロン間の最適な距離があり得ることも示していた。
【０１６８】
３）選択的スプライシングを調節するためのＩＶＳ２−６５４イントロンの選択的スプライス部位の突然変異。８５０ｂｐ ＩＶＳ２−６５４イントロンにおける選択的スプライス部位を突然変異させて、それらの長さを変えた。第一の実験は、構成体Ｂにおける上流選択的イントロン内の２つの潜在的分岐点のうちの一方をノックアウトすることを含む。ヌクレオチド５６４および５６５のＡＡＡをＣＴに変換して、そのコンセンサス配列にあまり類似していない上流潜在的分岐点を作製する。結果として生じたプラスミドを、リン酸カルシウムトランスフェクション法を用いることによって、２９３細胞にトランスフェクトした。その後、０．５μＭの最終濃度で、遊離５’ｓｓ ６５２／１８ ＡＯＮを、それらのトランスフェクト細胞の同一のセットに添加した。そのトランスフェクションの２４時間後、それらの細胞を、ルシフェラーゼ発現を定量するために回収した。このＡＡ→ＣＴの突然変異は、誘導レベルを４．３から１３倍に増大させたが、比較的高いトランスジーン発現誘導レベルを維持していた。これは、分岐部位の使用が、選択的スプライシングを調節するメカニズムの１つであるという現行の考えと一致する。第二の実験は、構成体Ｂにおけるヌクレオチド６５７のＴをＧへ、ヌクレオチド６５８のＡをＴへ、またはその両方ＴＡからＧＴへ変換させることにより選択的スプライシングを最適化するように設計した。これらの突然変異は、そのコンセンサス配列とより類似しているまたは同一であるスプライス部位を作製することによって選択的５’スプライス部位の強度を増加させるものであった。そのスプライス部位に単一塩基変換を有する２つの構成体は、両方とも、誘導レベルの約２倍増加を生じさせた。一方、２塩基変換は、結果として、誘導レベルの５５倍増加を生じさせた。この誘導レベルの増加は、トランスジーン発現の誘導レベルの低下より劇的に大きい、トランスジーン発現のバックグラウンドレベルの低下に起因するように見受けられた。これらの結果は、分岐部位点の使用および選択的スプライス部位の強度を調整することによって、トランスジーン発現を制御するために選択的スプライシングを最適化することができることを示唆していた。
【０１６９】
選択的スプライシングのための小さなイントロンの開発。ＩＶＳ２−６５４イントロンは、８５０塩基対（ｂｐ）の長さである。このサイズが、ＡＡＶにより媒介されるトランスジーン発現を制御するためにそのイントロンの多数のコピーを挿入するには問題であることはわかるはずである。これは、ＡＡＶのパッケージング限界が４．７ｋｇであるためである。イントロンのサイズを最小にするために、２００ｂｐフラグメント、ヌクレオチド１５１から３５０、を構成体Ｂにおけるイントロンから欠失させて、構成体ＢΔ２００を生じさせた。この配列がイントロンのスプライシングにおいて一定の役割を果たすことは証明されていない。構成体ＢΔ２００は、構成体Ｂと比較したとき、誘導レベルは低減しなかった。１９７ｂｐのイントロンもＩＶＳ２−６５４から誘導した。これは４つの必須スプライス部位および１つの改変された選択的エキソン、ならびにβ−グロビンｍＲＮＡの３’末端の効率的なスプライシングおよび形成に必要な、その５’末端の最初の３２ｂｐおよびその３’末端の最後の５７ｂｐを含有する。１９７ｂｐイントロンのルシフェラーゼ遺伝子への挿入は、構成体Ｂと比較して、誘導レベルは減少されたが、そのメッセージの選択的スプライシングを生じさせた。これらの結果は、誘導レベルに有意な影響を及ぼすことなくＩＶＳ２−６５４イントロンを短縮できることを示していた。
【０１７０】
選択的スプライシングイントロンを含有するルシフェラーゼ発現カセットを有するトランスジェニックマウスの産生。原型８５０ｂｐ ＩＶＳ２−６５４イントロンの単一コピーが挿入された蛍ルシフェラーゼ発現カセットを有するトランスジェニックマウスを産生させた。ＩＶＳ２−６５４に対する特異的ＡＯＮの送達成功は、エキソン包含を阻害し、エキソンスキッピングを誘導し、その結果、機能的ルシフェラーゼタンパク質の翻訳を生じさせる。例えば、ＡＯＮの送達をモニターするために、ルシフェラーゼ発現の全身撮像を適便に用いることができよう。このトランスジェニックマウスアッセイ系は、ＡＯＮを標識付けすることまたは実験用マウスを犠牲にすることを必要としないため、ＡＯＮ送達の最適化を大いに助長する。ＡＯＮ投与後のトランスジェニックマウスにおけるルシフェラーゼ発現の誘導成功は、ＡＮＯ送達の使用およびインビボでのトランスジーン発現の調節の実行可能性を明示していた。
【０１７１】
選択的スプライシングイントロンのさらなる最適化。ＩＶＳ２−６５４イントロンの２つのコピーの同じ発現カセットへの挿入は、トランスジーン発現のバックグラウンドレベルを著しく減少させ、誘導レベルを増加させた。しかし、効率的にパッケージすることができるＡＡＶゲノムのサイズは、４．７ｋｂに限られているため、８５０ｂｐ ＩＶＳ２−６５４イントロンの多数のコピーの挿入は、ＡＡＶベクターのクローニング能力を有意に低下させる。２００ｂｐフラグメントを欠失させることによるＩＶＳ２−６４５イントロンの短縮は、類似したトランスジーン発現誘導レベルを生じさせ、小さな１９７ｂｐイントロンからＩＶＳ２−６５４イントロンへの誘導は、低減された誘導レベルでではあるが、選択的スプライシングを受ける能力を未だ保持していた。従って、ＩＶＳ２−６５４イントロンの系統的欠失により、許容可能な誘導レベルとＡＡＶベクターへの組み込みに適する低減されたサイズの両方を有する選択的スプライシングイントロンを生じさせることができると思われる。トランスジーン発現を制御するために、エキソン包含のための条件下ではトランスジーン発現の低いバックグラウンドレベルおよびエキソンスキッピングのための条件下ではトランスジーン発現の高い誘導レベルを生じさせる選択的スプライシングイントロンを有することは、望ましいことである。分岐部位の使用を変更することおよび選択的スプライス部位の強度を微調整することによって、そのような望ましいイントロンを得ることができた。これは、分岐部位の１つの突然変異がその誘導レベルを有意に増加させるためである。加えて、スプライス部位の配列の突然変異は、その誘導レベルを大いに増加させたが、同時に、トランスジーン発現の実際のレベルを有意に減少させた。イントロンのサイズを最小にすることができ、分岐部位が変更された一連の最小イントロンを産生させることができ、および／またはライブラリーを作製して突然変異スプライス部位を有する最小イントロンをスクリーニングして、トランスジーン発現の低いバッググラウンドレベルおよび高い誘導レベルを有する最適化されたイントロンを産生させることができる。
【０１７２】
例えば、効率的な選択的スプライシングが可能な最小イントロンを開発することができる。本明細書において説明するように、ＩＶＳ２−６５４イントロンからの２００ｂｐフラグメントの欠失は、誘導レベルを減少させなかった。ＩＶＳ２−６５４イントロンにおけるスプライシングのための必須要素をすべて含有する小さな１９７ｂｐのイントロンの合成は、選択的スプライシングを受ける能力をなお保っていた。しかし、この小さなイントロンは、ＩＶＳ２−６５４イントロンについての４．３倍より有意に低い、２．３倍の誘導レベルしか有さなかった。ＩＶＳ２−６５４イントロンのものと類似した誘導レベルをなお有する最大欠失を判定するために、２００ｂｐ欠失を有するプラスミドをさらに欠失させて、欠失を５’末端の方向にヌクレオチド１５０から３３まで拡大させてもよい。欠失を３’末端方向にヌクレオチド３５０から５１９まで、別途、拡大させてもよい。ヌクレオチド６６０と７９３の間の下流選択的イントロンに、別途、さらなる欠失を作ってもよい。各欠失領域について、欠失させるフラグメントのサイズは、最初は約３０ｂｐの増分、そして後に、欠失サイズをさらに最大にするために、約１０ｂｐの増分であり得る。これらの欠失突然変異体は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔを使用して産生させることにする。この方法は、所望の突然変異を有するプライマーを使用する突然変異体標準物質の合成と、親プラスミドを除去するためのＤｐｎＩでの消化と、２本鎖プラスミドに変換させるための合成１本鎖プラスミドの細菌宿主への形質転換とを含む。トランスジーン発現の誘導レベルを迅速、且つ、定量的に判定するために、ルシフェラーゼアッセイ系を用いることにする。しかし、各突然変異イントロンの作用を左右するメカニズムを理解することが、トランスジーン発現を制御するためのイントロンのより良好な設計には必須である。従って、別の試験のもとで、ｍＲＮＡレベルとスプライシングのパターンの両方を分析してもよい。得られた構成体は２９３細胞に個々にトランスフェクトして、それらのルシフェラーゼ発現誘導レベルについてアッセイすることにする。その３つの各々についての最大欠失を判定した後、１つの構成体においてそれらを併用し、結果として生じたイントロンをルシフェラーゼ発現の誘導レベルについて検査することになる。最小イントロンの使用は、トランスジーン発現を制御するためにそのイントロンの多数のコピーを挿入した後、ＡＡＶクローニング能力を最大にするから、提案する試験の残りについては、その最小イントロンを使用して、この実験セットから産生させることにする。
【０１７３】
突然変異分岐部位を有する改変された最小イントロンの産生および評価。本明細書に記載するように、上流選択的イントロンにおける２つの潜在的分岐部位のうちの１つの突然変異は、誘導レベルを４．３倍から１３倍に増加させた。イントロン挿入後にＡＡＶクローニング能力を最大にするために使用される最小イントロンを最適化するために、４つの潜在的分岐部位を別々に突然変異させ、それらの遺伝子発現誘導レベルを評価することになる。その上流選択的イントロンにおける２つの分岐部位は、ヌクレオチド５２０〜５２６のＴＴＴＴＡＡＴおよび５６０〜５６６のＣＣＣＴＡＡＴであり、その下流選択的イントロンにおける２つの分岐部位は、８１３〜８１９のＴＧＣＴＡＡＴおよび８３１〜８３７のＣＴＣＴＴＡＴである。コンセンサス分岐部位配列は、ＰｙＮＰｙＵＰｕＡＰｙ（この場合、Ｐｙ＝ＣまたはＵ、Ｐｕ＝ＡまたはＧ）であり、下線を引いたＡは、高度に保存されるため、上流のＡに加えてこの保存ＡもＣＴに変換されるである。８３１〜８３７の潜在的分岐部位ＣＴＣＴＴＡＴは、保存Ａの上流に保存Ｐｕの代わりにＴを有するので、その保存Ａのみが突然変異を受ける。分岐部位と３’スプライス部位の間の距離は、一般には１８塩基であるが、広範に変わる。この距離がその誘導レベルになんらかの影響を及ぼすかどうかを判定するために、その誘導レベルをさらに最適化する試みで、その距離を変えることにする。突然変異は、記載したようなＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔを使用することにより、産生させることにする。トランスジーン発現の誘導レベルを迅速、且つ、定量的に判定するために、ルシフェラーゼアッセイ系を使用することにする。各突然変異イントロンの作用を左右するメカニズムを理解して、トランスジーン発現を制御するためのイントロンをより良好に設計するたために、別の試験のもとで、ｍＲＮＡレベルとスプライシングのパターンの両方を分析することにする。得られた構成体を２９３細胞に個々にトランスフェクトして、それらのルシフェラーゼ発現誘導レベルについてアッセイすることにする。上流および下流選択的イントロンについての最適な改変を１つの構成体において併用し、結果として生じたイントロンを改善された誘導レベルについて検査することにする。
【０１７４】
トランスジーン発現の低いバックグラウンドレベルおよび高い誘導レベルを有する最適化されたイントロンについての突然変異スプライス部位を有する最小イントロンのライブラリーからの産生およびスクリーニング。イントロン挿入後、ＡＡＶクローニング能力を最大にするために、突然変異スプライス部位を有するイントロンのライブラリーを作製するためのテンプレートとして最小イントロンを使用することにする。最適化されたイントロンのスクリーニングを助長するために、そのライブラリーの作製前にその最小イントロンをマーカー発現カセットに挿入することにする。使用することとなるマーカー発現カセットは、ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼと単純疱疹ウイルス１型チミジンキナーゼのトランケーションバージョンとの間の二官能性融合タンパク質（ｐｕΔｔｋ）を発現するものとする。このｐｕΔｔｋ融合タンパク質は、ピューロマイシンおよびガンシクロビルの類似体、１−（−２−デオキシ−２−フルオロ−１−β−Ｄ−アラビノ−フラノシル）−５−ヨードウラシル（ＦＩＡＵ）をそれぞれ使用する、そのタンパク質を発現する細胞のポジティブ選択とネガティブ選択の両方が可能であることが、明らかになった。開発済みの他のポジティブ／ネガティブ選択可能マーカーは、幾つか存在し、このライブラリーのスクリーニングに同じ程度によく役立つ。イントロンの誘導レベルを最適化するために、５’選択的スプライス部位を突然変異させることにする。これは、スプライス部位の強度計算方法に従って、この５’選択的スプライス部位の強度が、その５’および３’スプライス部位の強度ならびに３’選択的スプライス部位の強度より有意に弱いためである。この選択は、その配列の改変による５’選択的スプライス部位の強度の増加が、その誘導レベルを有意に増加させた（しかし、同時に、トランスジーン発現のその総合レベルを減少させた）ためでもある。そのコンセンサス５’スプライス部位配列、^-2ＡＧ↓ＧＵＰｕＡＧＵ⁺⁶（この場合、矢印は、エキソン−イントロン連結部を指定している）において、位置＋１および＋２のＧＵは、１００％保存されるので、これらのヌクレオチドを位置−２および−１ならびに＋３から＋６で突然変異させることにする。突然変異イントロンのライブラリーを作製するために、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔを使用することにする。
【０１７５】
突然変異イントロンのライブラリーを作製するための別の方法として、一対のオーバーラッププライマー（突然変異される位置に変性塩基を有する５’選択的スプライス部位全体にわたる一方のプライマーと、そのイントロンの上流または下流のもう一方のプライマー）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において別々に使用することにする。この２つの別の反応からのＰＣＲ産物を別のＰＣＲ反応ラウンドのためのテンプレートとして併用して、突然変異イントロンを再構成することにする。結果として生じるＰＣＲ産物を制限酵素で消化し、それらを使用して、親プラスミド内の対応するフラグメントを置換し、それによって突然変異イントロンのライブラリーを作ることにする。
【０１７６】
以下の戦略を用いて、トランスジーン発現の低いバックグラウンドレベルおよび高い誘導レベルを有する最適化されたイントロンについてスクリーニングすることにする。そのライブラリーの各クローンを個々に発現させ、選択することができるように、そのライブラリーをエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プラスミドの骨格で作製することにする。エピソームとして増殖するその能力のため、ＥＢＶプラスミドベクターは、薬物選択用の細胞を形質転換させるために従来から用いられいる。結果として生じるプラスミドライブラリーを２９３またはＨｅＬａ細胞にトランスフェクトすることにする。特異的ＡＯＮの存在下で効率的なエキソンスキッピングを受けるそれらの能力により、高いトランスジーン発現誘導レベルを有する突然変異イントロンを選択するために、それらの細胞をそのＡＯＮで処理し、ピューロマイシンで選択することにする。このライブラリーは、その５’ｓｓ ６５２／１８ ＡＯＮが相補的である５’選択的スプライス部位に突然変異を有するから、別のＡＯＮ、３’ｓｓ ５７９／１８、をこのライブラリーのスクリーニングに使用することにする。この３’ｓｓ ５７９／１８ ＡＯＮは、３’選択的スプライス部位に相補的な１８量体オリゴヌクレオチドであり、５’ｓｓ ６５２／１８ ＡＯＮのものと同じ効率で異常エキソンの包含を阻害することができる。ＡＯＮの不在下では効率的なエキソン包含を受けることができないことから高いトランスジーン発現バックグラウンドレベルを有する突然変異イントロンを削除するために、ピューロマイシンの選択後、耐性細胞は、ＡＯＮ処理を中止することにする。その後、それらの細胞をＦＩＡＵで処理して、低いｐｕΔｔｋ発現レベルを有する細胞を選択することにする。この薬物選択のための濃度を変化させて、トランスジーン発現の最高誘導レベルを有するイントロンをスクリーニングできるようにする。選択された細胞からそれらのイントロンを回収するために、低分子量ＤＮＡをその細胞から抽出し、エレクトロポレーションを行って細菌宿主、ＤＨ５αに送り込むことにする。回収したイントロンをルシフェラーゼ発現カセットに再挿入して、それらのトランスジーン発現誘導レベルを定量できるようにする。スクリーニングされた各イントロンについての作用メカニズムを理解するために、別の試験のもとで、ｍＲＮＡレベルとスプライシングのパターンの両方を分析することにする。このようにして特定された高いトランスジーン発現誘導レベルを有する突然変異イントロンをＤＮＡ塩基配列決定に付して、それらの配列を特定することにする。
【０１７７】
動物モデルにおけるトランスジーン発現を長期間制御するためのＡＡＶベクターへの選択的スプライシングイントロンの組み込み。
選択的スプライシングをインビボで用いてトランスジーン発現を制御することができるので、ＡＡＶベクターに選択的スプライシングイントロンを組み込みむことにより、その治療を受ける動物において長期間にわたってトランスジーン発現を制御することができるようになる。ＩＶＳ２−６５４イントロンの２つのコピーの挿入が、その誘導レベルを著しく増加させたため、およびＡＡＶベクターのパッケージング限界が、わずか４．７ｋｂであるため、最適化された最小イントロンをＡＡＶベクターに組み込んで、そのイントロン挿入後、ＡＡＶクローニング能力を最大にすることにする。イントロン間の距離が、トランスジーン発現の誘導レベルに影響を及ぼし得る（図７）ことを仮定して、様々な位置に最適化された選択的イントロンおよび様々なコピー数が挿入されたＡＡＶプラスミドを構成し、結果として生じるＡＡＶベクターをインビボでのトランスジーン発現の最適な誘導について評価することにする。イントロンの多数のコピーを挿入することによる誘導レベルの改善を、より大きなパッケージング容量を有する他の遺伝子輸送ベクターに容易に適応させることもできよう。従って、トランスジーン発現の誘導レベルに対して相乗効果を有するイントロンの最適な数を決めることは重要である。
【０１７８】
最適化された選択的スプライシングイントロンが挿入されたマーカー遺伝子を有するＡＡＶプラスミドのインビトロでの構成および評価。本明細書において説明するように、２つのイントロンを挿入した後の誘導レベルは、それらのイントロン間の距離と逆相関関係にあった。この例外は、タンデムでの２つのイントロンが、誘導レベルをわずかにしか改善しないことであった。従って、最高の誘導レベルを生じさせる、イントロン間の最適な距離があるはずである。この最適な距離を決めるために、最適化されたイントロンの２つのコピーを、間の距離を様々にしてルシフェラーゼ遺伝子に挿入することにする。結果として生じるＡＡＶゲノムの期待サイズは、４．０ｋｂ未満である。これは、４．７ｋｂ ＡＡＶパッケージング限界の範囲内である（４．０ｋｇ ＡＡＶゲノム ＝ ２つの末端繰り返し単位＋プロモーター＋ルシフェラーゼｃＤＮＡ＋２つのイントロン＋ポリＡ＝０．２９＋０．５６＋１．６５＋２ｘ０．６５＋０．２、最小イントロンは、６５０ｂｐ未満である）。５’ＡＧＰｕ ３’配列（この場合、Ｐｕ＝ＧまたはＡ）が、最適化されたイントロンの挿入のためにルシフェラーゼ遺伝子内で選択されることとなる。この基準は、５’および３’スプライス部位配列の圧倒的多数が、それぞれ、コンセンサス^-2ＡＧ↓ＧＵＰｕＡＧＵ⁺⁶および^-4ＮＰｙＡＧ↓ＰｕＮ⁺²（この場合、矢印は、エキソン−イントロン連結部を指定している）という事実に基づく。従って、配列５’ＡＧとＰｕ ３’間へのイントロンの挿入は、両方のコンセンサス５’および３’スプライス部位を回復させる。ＡＢ構成体は、２７３倍の最高誘導レベルを生じさせ、２７５ｂｐのイントロン間距離を有したので、最適化されたイントロンの２つのコピーを（１つを位置Ｂに、およびもう１つを位置ＡとＢの間の各候補部位に）挿入することにより、２７５ｂｐの距離の減少を開始することにする。このプラスミドセットは、イントロンの２つのコピー間に１９１、１１８、１０５、９８、４９、３０および１５ｂｐの距離を有する。イントロンの２つのコピー間の配列が、トランスジーン発現の誘導レベルに影響を及ぼすかどうかを判定するために、ヌクレオチド９６４〜９６５の間に挿入されたイントロンの１つのコピーと、ヌクレオチド９８８および１１６１の間（両端の値を含む）の７つの候補部位の各々にイントロンの別のコピーとを含有する、もう１つのセットの挿入プラスミドを構成することにする。従って、イントロンの２つのコピー間には１９７、１５３、９９、６９、５２、４０および２４ｂｐの距離が存在することになる。結果として生じる構成体を２９３細胞に別々にトランスフェクトして、それらのトランスジーン発現誘導レベルについてアッセイすることとする。このイントロン間の距離を誘導レベルと相関させることとなる。最適化されたイントロンの３つのコピーの挿入が、トランスジーン発現の誘導レベルをさらに改善するかどうかを調査するために、本発明者らは、イントロンの別のコピーを挿入するための上述の実験から選択したイントロンの２つのコピーが挿入された最適な構成体を使用することにする。そのイントロンの３つのコピーを含有するＡＡＶゲノムの期待サイズは、４．６５ｋｂ未満である。これは、４．７ｋｂ ＡＡＶパッケージング限界の範囲内である（４．６５ｋｇ ＡＡＶゲノム ＝ ２つの末端繰り返し単位＋プロモーター＋ルシフェラーゼｃＤＮＡ＋３つのイントロン＋ポリＡ＝０．２９＋０．５６＋１．６５＋３ｘ０．６５＋０．２、最小イントロンは、６５０ｂｐ未満である）。第三のイントロンは、その第三イントロンと最も近いイントロンの間に約８００、６００、４００、２００、１００および５０ｂｐの距離が存在するように、様々な位置に挿入することにする。結果として生じる構成体を２９３細胞に別々にトランスフェクトして、それらのトランスジーン発現誘導レベルについてアッセイすることにする。蛍ルシフェラーゼｃＤＮＡの以下のヌクレオチド配列（配列番号７７）において、イントロン挿入の潜在的部位に下線を引く。位置Ａ〜Ｄは、曲線の下線によって示し、対応する文字よって左側にも示す。
【化２Ａ】

【化２Ｂ】

【０１７９】
結果として生じたＡＡＶベクターによって媒介されるトランスジーン発現の長期間にわたるインビボでの制御の評価。上で説明したようにトランスジーン発現の最適な制御を判定するＡＡＶプラスミドをウイルスベクターにパッケージすることにする。これらのベクターは、アデノウイルスを利用しない産生計画を用いて産生させ、この計画は、３つのプラスミド（組換えＡＡＶプラスミド；構造ＡＡＶ遺伝子と非構造ＡＡＶ遺伝子の両方を供給するＡＡＶ−ヘルパープラスミド；およびＡＡＶベクター産生に必須のヘルパー遺伝子を供給するアデノウイルス−ヘルパープラスミド）での２９３細胞のトランスフェクションを含む。結果として生じるＡＡＶベクターは、イオジキサノール勾配およびヘパリンスルフェートクロマトグラフィー段階を含む精製プロトコルを利用することによって精製することにする。その後、インビボでの長期にわたって制御可能なトランスジーン発現を媒介するＡＡＶベクターの能力を、本明細書に記載するように、それらの精製されたベクターを門脈注射により肝臓にならびに直接注射により骨格筋および心臓に向かわせることによってアッセイすることにする。ルシフェラーゼ遺伝子発現の誘導レベルは、マウスを、それらの動物に対照またはイントロン特異的ＡＯＮのいずれかを注射した後、撮像することによって判定することとなる。対照ベクターとして、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現カセットを有するＡＡＶをこの実験セットに含めることとする。
【０１８０】
マウスに異なる経路（例えば、門脈、直接筋肉、直接心臓）でＡＡＶベクターを注射することにする。特異的ＡＯＮおよび対照ＡＯＮの両方を投与して、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を調節することとする。ルシフェラーゼ発現のレベルは、全身撮像によって判定することとする。ＡＡＶ−ｌｕｃ−ｉｎｔおよびＡＡＶ−ＧＦＰは、イントロンが挿入されたルシフェラーゼ発現カセットおよびＧＦＰ発現カセットをそれぞれ有するＡＡＶベクターを示す。
【０１８１】
長期にわたってルシフェラーゼ遺伝子の発現を制御する能力を判定するために、以前に誘導されたルシフェラーゼ発現がバックグラウンドレベルに戻った後、ＡＯＮをマウスに再び投与することとする。新たに誘導された発現を全身撮像によって再びモニターすることとする。この誘導発現サイクルを反復して、トランスジーン発現の長期制御を評価することとする。
【０１８２】
第三のイントロンと最も近いイントロンの間に様々な距離を生じさせるように第三のイントロンを挿入することに関する潜在的な問題は、所望の位置に挿入するための必要５’ＡＧＰｕ ３’配列が存在しない場合があることである。この場合、各アミノ酸のために多数のコドン使用法を用いて、挿入のためのそのような必要配列を作ることとなる。例えば、５’（ＮＮＸ）（ＧＰｕＮ）３’（この場合、括弧の各ペアは、コドンを指定している）の場合、ヌクレオチドＸをサイレント突然変異としてＡに変換し、それによってイントロン挿入のための必要５’ＡＧＰｕ ３’配列を産生させることができよう。同様に、５’（ＮＡＺ）（ＰｕＮＮ）３’の配列において、ヌクレオチドＺは、サイレント突然変異としてＧに変換させることができよう。２０のアミノ酸に関しては、それらのうちの１１が、代替使用として、それらのコドンの最後の位置にＧを含有し、およびそれらのうちの１２が、Ａを含有する。従って、所望の位置に挿入部位を作ることができる可能性は、比較的高い。ＡＡＶ感染マウスにおけるルシフェラーゼ発現の反復誘導により、インビボでのトランスジーン発現の長期制御を評価することができよう。
【実施例５】
【０１８３】
（ＲＥＴＴ症候群の研究）
ＲＴＴには有効な治療が存在しない。治療アプローチが発見されれば、その生後６ヶ月から１８ヶ月の無症状期間により、永久神経細胞損傷が発生する前に、介入を開始することが可能となり得る。ＣＮＳに正常な遺伝子を送達するためにＡＡＶを使用することは、妥当なアプローチである。理想的なベクターがこの研究には必須である。適するベクターの発見は、将来、この疾病の症状を治癒または改善するという可能性に直接光をあてることができる。調節系として選択的スプライシングを用いることにより、関心のある遺伝子の過剰または過少発現を回避することができ、固有の発生期で発現を制御することができ、およびＣＮＡの正常な機能の要件を満たすことができる。長期的な目標は、ＲＴＴを表している動物モデルにおける脳特異的送達に理想的なベクターと選択的スプライシングの制御調節とのカップリングである。これらの研究は、最終的に患者における安全で効果的なトランスジーン発現の開発につながることが期待される。
【０１８４】
インビボでの異なる血清型のｒＡＡＶベクターでの形質導入パターン。インビボで異なる血清型のＡＡＶベクターの親和性を判定するために、血清型１〜５および８のＡＡＶベクターをマウス肝臓、筋肉およびラット網膜に導入した。様々な組織におけるトランスジーン発現は、被験血清型間で大いに異なる。ＡＡＶ１およびＡＡＶ８は、肝臓および筋肉において最高のトランスジーン発現を開始させることができるが、ＡＡＶ５およびＡＡＶ４は、他の血清型より効率的に網膜細胞を形質導入することができる。注射後４６日以内に、トランスジーン（緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ）発現は比例的に増加し、これらの動物は、実験継続期間（４ヶ月）にわたってポジティブのままであった。出版物に掲載された包括的遺伝子送達アプローチを用いて、類似の分析をマウスの脳において行うことにする。
【０１８５】
トランスジーンは、ニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＢＡ）とＣＭＶエンハンサー駆動ｈＡＡＴ（ａ）およびＣＭＶ媒介早期プロモーター駆動ＥＧＦＰ（ｂ）であった。スコアは、各セットの動物について観察された最大タンパク質レベル（＋＋＋＋＋）からその群における最低発現レベル（＋）にわたった。
【０１８６】
インビトロで遺伝子発現を変調させるための相補的ＡＯＮの使用。トランスジーンカセットにおいて既知突然変異イントロン（ヒトβ−グロビンイントロン２）を使用することにより、ＡＯＮの付加後、レポーター遺伝子発現の調節成功を達成した。
【０１８７】
レポーターとしてのイントロン特異的ＧＦＰの使用およびＡＯＮによる補正効果。突然変異ヒトβ−グロビンイントロン２をＧＦＰｃＤＮＡおよびプラスミド（ｐＥＧＦＰ−ｍｕｔ−ｉｎｔ）またはウイルス（ＡＡＶ２／ＥＧＦＰ−ｍｕｔ−ｉｎｔ）に構成し、それらをそれぞれ使用して、２９３細胞をトランスフェクトまたはを感染させた。トランスジーン発現に対するＡＯＮの影響を経時的に測定した。処置の４８時間後、蛍光顕微鏡法（Ｌｅｉｔｚ ＤＭ ＩＲＢ，Ｖａｓｈａｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を用いてＧＦＰの発現を測定した。ｐｒｅ−ｍＲＮＡの異常スプライシングを補正するＡＯＮの効率ＧＦＰポジティブ細胞によって示す。
【０１８８】
トランスジーン発現を変調するためのルシフェラーゼｃＤＮＡへの野生型または突然変異イントロンの挿入。プラスミドｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ）のリーディングフレームに野生型ヒトβ−グロビンイントロン２または突然変異ヒトβ−グロビンイントロン２のいずれかを挿入することにより、ルシフェラーゼｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを改変した。その後、その再構成されたプラスミド（ｐＧＬ３−ｉｎｔ−ｌｕｃ）を２９３細胞にトランスフェクトした。同時に、幾つかの細胞をＡＯＮで処理した。２４時間の時点でルシフェラーゼの発現をＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｒｏｐｉｘ）で検査して、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシング効率を評価した。データは、ＡＯＮの存在下で、突然変異イントロンを有するプラスミドの発現が原プラスミドのものより２〜３倍増加したことを示している。加えて、バックグラウンドを相当低レベルに減少させることができる。遺伝子発現の補正は、ＡＯＮ用量依存関係を示している。
【０１８９】
インビボでの遺伝子発現を変調するための相補的ＡＯＮの使用。ＡＯＮはインビトロで非常に効率的に遺伝子発現を変調させることができるので、この調節系をインビボで検査した。肝臓および筋肉をターゲット器官として使用した。組織特異的プロモーターを使用したためである。「現時間」Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して発現は容易に観察される。結果は、ＡＯＮがインビボで選択的スプライシングを有効に補正できることを示唆している。
【０１９０】
レポーター遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ）を使用するニューロンを特異的に形質導入する理想的なＡＡＶ血清型ベクターの同定。ＡＡＶ２と他の血清型の間にはカプシドのアミノ酸配列に関して幾つかの違いがあるが、ＡＡＶ２ゲノム、またはＡＡＶ２逆方向末端反復配列に隣接するトランスジーンを異なる血清型のカプシドにパッケージして、形質導入ビリオンを形成することができる。これは、インビボで感染に関与する血清型カプシドの機能を直接比較するための卓越したツールとなる。
【０１９１】
実験計画および方法。ＡＡＶ２／ＧＦＰゲノムをＡＡＶ血清型１から８カプシドにそれぞれパッケージして、インビボ検査用の生存可能ＡＡＶ組換え体のコレクションを産生させることにする。以下の実験を行うことにする。１）同じ粒子数の異なるＡＡＶ血清型をマウスに投与して、どの血清型がＣＮＳにおいて最高の発現を達成できるかを判定することにする。ニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＢＡ）を使用して、検査すべきすべての血清型においてＧＦＰ発現を駆動することとする。これは、構成的非組織特異的プロモーターである。必要な場合には、他のプロモーター、例えばＮＳＥプロモーター、を選択された血清型において使用して、ニューロンにおけるトランスジーン発現の強度および特異性をさらに比較することとする。２）ＭｅＣＰ２ ｃＤＮＡを、最適なプロモーターにより駆動される最良のＡＡＶ血清型において構成し、そのウイルスを、ＲＴＴマウスモデルのＣＮＳにおいてＭｅＣＰ２遺伝子送達について検査することとする。遺伝子発現を免疫組織化学によって、ならびに行動表現型のレスキューによって特性付けすることとする。
【０１９２】
マウスのＣＮＳにトランスジーンを送達するために適するＡＡＶ血清型の同定。ＡＡＶ１から８ベクターを、ＣＢＡプロモーターおよびＧＦＰプロモーター遺伝子を有する同じＡＡＶ２ベクターゲノムを用いて作製することとする（ｒＡＡＶ１〜８／ＣＢＡ−ＧＦＰ）。３プラスミドコトランスフェクション法に従ってウイルスを作製し、ＤＮアーゼ耐性ドットブロット法によってそれらの粒子数をアッセイすることとする。２００μＬ マンニトール（２５％）の静脈内注射の１５〜２０分後、各血清型の約１×１０¹²個の粒子を各野生型Ｃ５７ＢＬ株マウス脳の後脳槽に注射することとする。注射後１４日の時点でそれらのマウスを犠牲にすることとする。注射していない対照も同じ時点で犠牲にすることとする。切片を前頭面または傍矢状平面で切断し、必要な場合には蛍光顕微鏡法（Ｌｅｉｔｚ ＤＭ ＩＲＢ，Ｖａｓｈａｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）、免疫組織化学（Ｐｉｅｒｃｅ）およびウエスタンブロットを用いることにより、脳の異なる部分におけるＧＦＰの発現を研究することとする。
【０１９３】
ＭｅＣＰ２遺伝子欠失動物へのＭｅＣＰ２トランスジーン送達についての最適ベクターの検査。ＭｅＣＰ２欠失マウスモデルは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手することとなる。このモデルは、ヒト患者における症状を模倣するものである。この動物モデルを使用することにより、インビボで送達される遺伝子の効果を観察することができる。ＭｅＣＰ２ ｃＤＮＡを選択されたＡＡＶベクターに構成し（ＡＡＶ／ＭｅＣＰ２）、槽内注射（粒子数 ２×１０¹⁰）によってマウス脳に導入することとする。動物を次のように２つの群にセットすることとする。群１は、注射後１４日の時点で遺伝子発現について検査し、一方、群２は、生きたまま保持して生存時間を評価し、１年までにわたって長期的に行動および症状を観察することとする。
【０１９４】
すべての動物を以下の基準によってモニターすることとする。１）（同年齢の正常および突然変異動物と比較した）体重、脳重量、生存時間、および赤外線活性化運動モニター室（Ｏｐｔｏ−Ｖａｒｉｍａｘ−ＭｉｎｉＡ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）の使用による運動活性などの症状の改善。他の症状、例えば振戦および荒い呼吸も観察される。ＭｅＣＰ２の過剰発現の結果として生じ得る症状（例えば、食餌のための競争不能、サイズ、または仲間に対する拒絶）には特に注意を払うこととする。２）ウサギ抗ＭｅＣＰ２抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ）、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌｏｖｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、およびＶｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌｏｖｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用することによる免疫組織化学によって、その時の脳におけるトランスジーン発現を検出することとする。
【０１９５】
Ｌｕｉｋｅｎｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ．（「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭｅＣＰ２ ｉｎ ｐｏｓｔｍｉｔｏｔｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ｒｅｓｃｕｅｓ Ｒｅｔｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｎ ｍｉｃｅ」 ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０１（１６）：６０３３−８（Ｅ．ｐｕｂ Ａｐｒｉｌ ６，２００４）；これは、その全体が引用により本明細書の一部をなすものとする）によって記載されたように、動物モデル表現型をレスキューする望みがある最大ウイルス用量を用いることとする。
【０１９６】
選択的スプライシングによるマウス脳におけるトランスジーン発現の新規調節方法の特性付け。遺伝子欠失は、ＲＴＴを含む遺伝子疾患の原因となり得るが、一定の遺伝子の過発現も深刻な問題をもたらすことがある。ニューロンが、重症運動機能障害が発生する前の正常なレベルより２〜３倍高いＭｅＣｐ２発現にしか耐えることができないことは、研究により証明されている。このため、正確なレベルが重要な問題となってくる。ＡＡＶベクターは、小さすぎて、ＭｅＣｐ２組織特異的プロモーターカセットを有することができない。過発現を制御するために、本明細書に記載するような選択的スプライシング調節系をベクターカセットに導入することとする。
【０１９７】
２つの理由で、ルシフェラーゼをレポーター遺伝子として選択した：１）基質ルシフェリンは、腹腔内注射することができ、且つ、ＢＢＢを通過する（この場合、この領域におけるルシフェラーゼタンパク質発現により、それに対して作用することができる）；および２）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｐｅｒ）により、動物を犠牲にすることなく、脳におけるルシフェラーゼ発現の現時間変化の観察を行うことができる。ＡＯＮ用量依存的に示されるルシフェラーゼ発現を検査することとする。投与すべきＡＯＮの頻度および用量を確立し、対照（ＧＦＰベクターのみ）と比較することとする。ＭｅＣＰ２イントロン依存性トランスジーンカセットで検査する前に、ＣＮＳにおけるこのベクターの性能を確立することとする。
【０１９８】
本明細書に記載する研究は、ＡＯＮが、イントロン補正によりトランスジーンの発現を増加させることによって、またはオリゴがクリアされる場合には発現を減少させることによって作用できることを実証した。これにより、ＡＯＮによるトランスジーン調節は、免疫応答しやすいことが証明されている現在利用されているトランス活性化カセットの魅力的な代替になる。直接頭蓋内注射によって達成されるのと同じ発現レベルを得るために、静脈内注射（ＩＶ）によると、より高いＡＯＮ用量が必要となるが、ＩＶアプローチのほうがより便利であり、実際的である。
【０１９９】
実験計画および方法。本明細書に記載する研究を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子において野生型イントロンカセットまたは突然変異イントロンカセットのいずれかを構成することによって展開することとする。このイントロン依存性カセットを、適切なプロモーターによって駆動される選択されたＡＡＶベクターに構成することとする。ウイルスは、上で説明したとおり産生させ、Ｃ５７ＢＬマウス脳の後脳槽に直接注射することとする（粒子数 ２×１０¹⁰／マウス）。ベースライン画像を収集し、注射の２週間後、ＡＯＮを投与してルシフェラーゼ発現を誘導することとする。トランスジーン発現のレスキューのためのＡＯＮ投与の用量および頻度を評価することとする。結果は、週に１度、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｐｅｒ）を使用することにより、直接観察することとする。
【０２００】
注射すべきＡＯＮの適する用量を判定するために、異なる用量のＡＯＮ（例えば、１００μＬの食塩水中、０．０２μｇ、１μｇ、４μｇ、２０μｇおよび１００μｇ）を静脈内注射によってマウスに注射して、用量依存性トランスジーン発現曲線を得ることとする。対照群には同量の食塩水のみを投与することとする。これらのデータは、脳においてＭｅＣＰ２トランスジーン発現に依存してＡＯＮがイントロンを発現させるために必要な用量を判定する助けとなるはずである。
【０２０１】
本明細書に記載の研究によると、ＡＯＮ誘導インビボトランスジーン発現は、一定の時間の後、次第に減少する。そのため、理論的には、ＡＯＮの第一投与によって誘導されるルシフェラーゼの発現は、一定の期間の後、減少する。この減少を現時間で観察できるので、発現が原発現レベルの半分に低下した時点で、再びＡＯＮを投与することとする。Ｌｕ発現を用い、ＭｅＣＰ２についての類似した発現時間点に外挿することによって、トランスジーン発現を定常レベルで維持することとする。問題のタンパク質の半減期が、この実験アプローチの最終的な条件（例えば、分対時間）を決める。これらのタンパク質の半減期は、Ｓ³⁵標識メチオニンでの従来のパルス・チェイス実験を用いて組織培養で確立することとする。これらの実験条件の確立により、定レベルでＭｅＣＰ２発現を維持する頻度でＡＯＮを投与することができる。血液脳関門の横断効率に関する問題に対処するために、化学修飾されたＡＯＮ、例えばホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いることができる。脳におけるＡＡＶ調節ベクターの確立は、全体としては遺伝子療法分野にとって、より重要にはＲｅｔｔ症候群などの脳障害全体に関係する神経学的コミュニティーにとって、有意な価値がある。
【０２０２】
マウス脳にＭｅＣＰ２トランスジーンを送達するための選ばれた血清型特異的ベクターおよびイントロン依存性スプライシング調節系の使用。突然変異ヒトβ−グロビンイントロン２に依存する調節系をＭｅＣＰ２ ｃＤＮＡに構成することとする（ＡＡＶ／ＭｅＣＰ２−ｍｕｔ−ｉｎｔ）。このトランスジーンカセットを理想的な血清型ベクターに組み込み、選択されたプロモーター（ＮＳＥ、ＣＢＡなど）によって駆動することとする。トランスジーンマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに注文することとする。ＡＯＮは、上で確立された量および頻度でそれらのマウスに投与することとする。トランスジーン発現のためにＡＯＮを送達した後、動物を特性付けし（上で説明したとおり）、本明細書において説明するとおり行動変化についてモニターすることとする。
【０２０３】
上記実施例は、本発明の例示となるものであり、本発明の限定と解釈すべきものではない。本発明は、後続の特許請求の範囲によって記述されるものであり、本特許請求の範囲に記載のものと等価のものは、本発明に包含される。
【０２０４】
本明細書において引用したすべての出版物、特許出願、特許、公開特許および他の参考文献は、その引用箇所が提示されている文および／または段落に関連した教示について、それら全体が引用により本明細書の一部をなすものとする。
【０２０５】
【表１】

【０２０６】
【表２】

【０２０７】
【表３】

【図面の簡単な説明】
【０２０８】
【図１】本発明の核酸構成体の一部分の略図であり、これは、本明細書において説明するような、外因性オリゴヌクレオチドの存在または不在に基づく、ルシフェラーゼ配列の発現を調節するメカニズムを示す。
【図２Ａ−２Ｂ】１×１０¹¹ベクター粒子の門脈注射後のインビボでのＡＡＶ Ｌｕｃ発現を示す。ベクター注射の１年および７日後、２５ｍｇ／ｋｇのＬＮＡオリゴヌクレオチドを腹腔内注射により投与した（Ａ ｉｉ；Ｂ 矢印の時点）。ルシフェラーゼトランスジーン活性を、現時間撮像を用いて測定し（Ａ）、発光単位×１０⁶として経時的に表した。Ｂ：オリゴ＝ひし形；オリゴなし＝丸。
【図３】オリゴヌクレオチド治療後のインビボでのＡＡＴ発現を示す。イントロン調節ＡＡＴコード配列カセットを発現するＡＡＶベクターを形質導入したマウス肝臓を、０．６２５ｍｇ／２００μＬのＬＮＡオリゴヌクレオチドで２日間、腹腔内注射により治療した（矢印）。血液サンプルのＥＬＩＳＡアッセイにより、ヒトＡＡＴの循環レベルを経時的に分析した。
【図４】６５４突然変異体への異なる突然変異の追加に基づくルシフェラーゼ発現の変化を示す。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を取扱説明書に従って使用して、以下の突然変異を発生させた（番号付けは、ＩＶＳ−６５４の５’スプライス部位から離れている塩基対の数に基づく）：６ ＴからＡ、５６４ ＡからＣ、５６４ ＡＡからＣＴ、６５７ ＴＡからＧＴ、および８４１ ＣからＡ。新たなイントロンをルシフェラーゼｃＤＮＡにクローニングした。２９３の細胞を、本明細書において説明するようなベクターおよびオリゴでトランスフェクトした。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸であって、前記核酸は、
Ａ）目的とする異種ヌクレオチド配列をコードする少なくとも１つの第一ヌクレオチド配列、および
Ｂ）少なくとも２つの異種第二ヌクレオチド配列
を含み、前記異種第二ヌクレオチド配列の各々が、
ｉ）第一イントロンを規定する第一のスプライス要素セット（前記第一イントロンは、第二のスプライス要素セットに活性がないとき、生物学的機能を与える第一ＲＮＡ分子を産生させるようにスプライシングすることによって除去される）、および
ｉｉ）前記第一イントロンとは異なる１つ以上のイントロンを規定する第二のスプライス要素セット（前記第一イントロンとは異なる前記１つ以上のイントロンは、前記第二のスプライス要素セットが活性であるとき、ＲＮＡ分子を産生させないようにおよび／または生物学的機能を付与しない第二ＲＮＡ分子を産生させるようにスプライシングすることによって除去される）
を含み、前記異種第二ヌクレオチド配列が、
ａ）前記第一ヌクレオチド配列内にタンデムで配置される第二ヌクレオチド配列、
ｂ）前記第一ヌクレオチド配列内の少なくとも２５塩基対離れた間隔に配置されている第二ヌクレオチド配列、
ｃ）前記第一ヌクレオチド配列内の少なくとも５０塩基対離れた間隔に配置されている第二ヌクレオチド配列、
ｄ）前記第一ヌクレオチド配列内の少なくとも７５塩基対離れた間隔に配置されている第二ヌクレオチド配列、
ｅ）前記第一ヌクレオチド配列内の少なくとも１００塩基対離れた間隔に配置されている第二ヌクレオチド配列、
ｆ）前記第一ヌクレオチド配列内の少なくとも２００塩基対離れた間隔に配置されている第二ヌクレオチド配列、
ｇ）前記第一ヌクレオチド配列内の少なくとも３００塩基対離れた間隔に配置されている第二ヌクレオチド配列、
ｈ）第一の第二ヌクレオチド配列が、プロモーターと前記第一ヌクレオチド配列の間に位置し、且つ、第二の第二ヌクレオチド配列が、前記第一ヌクレオチド配列内に位置する、第二ヌクレオチド配列、および
ｉ）第一の第二ヌクレオチド配列が、前記第一ヌクレオチド配列内のオープンリーディングフレームとポリ（Ａ）テイルまたはポリＡシグナルの間に位置し、且つ、第二の第二ヌクレオチド配列が、前記第一ヌクレオチド配列の前記オープンリーディングフレーム内に位置する、第二ヌクレオチド配列、
からなる群より選択される核酸。
【請求項２】
前記第一ヌクレオチド配列が、任意の組み合わせで、タンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列、ＲＮＡとしての酵素的活性を有するヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡｉ）、リボザイムをコードするヌクレオチド配列、アンチセンス配列をコードするヌクレオチド配列および／または核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）からなる群より選択される、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
同じまたは異なる２つ以上の第一ヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載の核酸。
【請求項４】
同じである２つ以上の第二ヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸。
【請求項５】
互いに異なる２つ以上の第二ヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかの核酸を含むベクター。
【請求項７】
非ウイルスベクター、ウイルスベクターおよび合成生物ナノ粒子からなる群より選択される、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、バキュロウイルスベクターおよびキメラウイルスベクターからなる群より選択される、請求項６に記載のベクター。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかの核酸を含む細胞。
【請求項１０】
請求項６〜８のいずれかのベクターを含む細胞。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれかの核酸および医薬的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１２】
請求項６〜８のいずれかのベクターおよび医薬的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１３】
請求項９〜１０のいずれかの細胞および医薬的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１４】
タンパク質を産生させるための方法であって、
ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で請求項１〜５のいずれかの核酸とブロッキングオリゴヌクレオチドを接触させること（前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、スプライス要素の第二セットの構成要素をブロックし、その結果、スプライシングにより第一イントロンを除去し、第一ＲＮＡを産生させる）、および
ｂ）前記第一ＲＮＡを翻訳して、タンパク質を産生させること
を含む方法。
【請求項１５】
生物学的機能を付与するＲＮＡを産生させるための方法であって、
ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で請求項１〜５のいずれかの核酸とブロッキングオリゴヌクレオチドを接触させること（前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、スプライス要素の第二セットの構成要素をブロックし、その結果、スプライシングにより第一イントロンを除去し、第一ＲＮＡを産生させる）、および
ｂ）前記第一ＲＮＡを翻訳して、生物学的機能を付与するＲＮＡを産生させること
を含む方法。
【請求項１６】
前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、前記核酸を含む細胞に導入される、請求項１４〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、動物における細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記動物が、ヒトである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、ＲＮアーゼＨを活性化しない、請求項１４〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、メチルホスホロチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデートおよびホスホルアミデートからなる群より選択されるヌクレオチド間を架橋する修飾リン酸残基を含む、請求項１４〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、その２’位に低級アルキル置換基を有するヌクレオチドを含む、請求項１４〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、８から５０ヌクレオチドの長さである、請求項１４〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
タンパク質を産生させるための方法であって、
ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で請求項１〜５のいずれかの核酸と小分子を接触させること（前記小分子は、第二のスプライス要素セットの構成要素をブロックし、その結果、第一イントロンを除去し、第一ＲＮＡを産生させる）、および
ｂ）前記第一ＲＮＡを翻訳して、タンパク質を産生させること
を含む方法。
【請求項２４】
生物学的機能を付与するＲＮＡを産生させるための方法であって、
ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で請求項１〜５のいずれかの核酸と小分子を接触させること（前記小分子は、第二のスプライス要素セットの構成要素をブロックし、その結果、第一イントロンを除去し、第一ＲＮＡを産生させる）、および
ｂ）前記第一ＲＮＡを翻訳して、生物学的機能を付与するＲＮＡを産生させること
を含む方法。
【請求項２５】
前記小分子が、前記核酸を含む細胞に導入される、請求項２３〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、動物における細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記動物が、ヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
被験体における生物学的機能を付与する異種ＲＮＡの産生を調節する方法であって、
ａ）請求項１〜５のいずれかの核酸を対象に導入すること、ならびに
ｂ）第二のスプライス要素セットの構成要素をブロックするブロッキングオリゴヌクレオチドおよび／または小分子を、前記異種ＲＮＡの産生を望む時点で、前記対象に導入することにより、前記対象における前記ＲＮＡの産生を調節する
ことを含む方法。
【請求項２９】
被験体における異種タンパク質の産生を調節する方法であって、
ａ）請求項１〜５のいずれかの核酸を対象に導入すること、ならびに
ｂ）第二のスプライス要素セットの構成要素をブロックするブロッキングオリゴヌクレオチドおよび／または小分子を、前記異種タンパク質の産生を望む時点で、前記対象に導入することにより、前記対象における前記タンパク質の産生を調節する
ことを含む方法。
【請求項３０】
被験体における疾患を治療する方法であって、
ａ）請求項１〜５のいずれかの核酸を対象に導入すること、ならびに
ｂ）ブロッキングオリゴヌクレオチドおよび／または小分子を前記対象に導入することにより前記対象における疾患を治療する
ことを含む方法。
【請求項３１】
請求項１の核酸の第二のスプライス要素セットの構成要素をブロックする化合物を同定する方法であって、
ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で請求項１の核酸を前記化合物と接触させること、ならびに
ｂ）請求項１の第一ＲＮＡの産生および／または第二ＲＮＡの産生を検出することにより請求項１の第一ＲＮＡの産生により、請求項１のスプライス要素の第二セットの構成要素をブロックする化合物を同定する
ことを含む方法。
【請求項３２】
生物学的機能を付与する異種ＲＮＡの産生を阻害するための方法であって、
ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で請求項１〜５のいずれかの核酸と小分子を接触させることにより、前記小分子が、第一のスプライス要素セットの構成要素をブロックし、その結果、第二イントロンを除去し、それによって第一ＲＮＡの産生を阻害する
ことを含む方法。
【請求項３３】
異種タンパク質の産生を阻害するための方法であって、
ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で請求項１〜５のいずれかの核酸と小分子を接触させることにより、前記小分子が、スプライス要素の第一セットの構成要素をブロックし、その結果、第二イントロンを除去し、それによって第一ＲＮＡの産生を阻害する
ことを含む方法。
【請求項３４】
生物学的機能を付与する異種ＲＮＡの産生を阻害するための方法であって、
ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で請求項１〜５のいずれかの核酸とブロッキングオリゴヌクレオチドを接触させることにより、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、スプライス要素の第一セットの構成要素をブロックし、その結果、第二イントロンを除去し、それによって第一ＲＮＡの産生を阻害する
ことを含む方法。
【請求項３５】
異種タンパク質の産生を阻害するための方法であって、
ａ）スプライシングを可能にさせる条件下で請求項１〜５のいずれかの核酸とブロッキングオリゴヌクレオチドを接触させることにより、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、スプライス要素の第一セットの構成要素をブロックし、その結果、第二イントロンを除去し、それによって第一ＲＮＡの産生を阻害する
ことを含む方法。

【図１】

【図２Ａ−２Ｂ】

【図２Ｃ】

【図３】

【図４】

【公表番号】特表２００８−５３９６９８（Ｐ２００８−５３９６９８Ａ）
【公表日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０９２２０（Ｐ２００８−５０９２２０）
【出願日】平成１８年４月２８日（２００６．４．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１６５１４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１９１３７
【国際公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【出願人】（５０００９３８３４）ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル (14)
【Ｆターム（参考）】