遊離細胞によるガラクトオリゴ糖の製造方法
本発明は交差流動式中空繊維微細濾過装置を備えた反応器において、微生物の全細胞を使用して純粋なガラクトオリゴ糖を高収率で製造する改良された方法に関する。この方法は細胞バイオマスを反復使用し、および最終生成物からの単糖類および二糖類を除去するためのダウンストリーム法の実行を省略することから経済的である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は高純度のガラクトオリゴ糖／オリゴ糖の製造方法に関する。本発明はさらに特に、微細濾過膜装置を備えたバイオリアクターに使用される微生物全細胞を用いることによるガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）の製造方法に関する。本方法の新規性は生物変換の反復サイクルにおける細胞バイオマスの再使用および単糖類および二糖類の分離を伴なわない高純度（＞９０％）ガラクトオリゴ糖の製造を包含する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ガラクトオリゴ糖はプレバイオティック（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ）化合物として工業界で広範な用途が見出されている。ガラクトオリゴ糖の製造には、多くの方法が開発されている。数種の方法は種々の微生物源、例えばアスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ブレラ シングラリス（Ｂｕｌｌｅｒａ ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルベロマイセス種（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、バチルス サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、ラクトバチルス ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス テルモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびビフィドバクテリウム種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）から得られるβ−ガラクトシダーゼ酵素の使用を包含する（Ａｋｉｙａｍａ等、２００１、Ｒｉｂｕ等、２００１、Ｔｚｏｒｉｔｅ等、２００５、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ等、２００１、Ｓｈｉｎ等、１９９８、ＵＳ５０３２５０９、ＥＰ００２７２９５Ａ２）。
【０００３】
遊離の全細胞または酵素を使用する代わりに不動化されたマトリックスにおいてβ−ガラクトシダーゼ酵素または全細胞を使用する方法がまた、報告されている（Ａｋｉｙａｍａ等、２００１、Ｒｉｂｕ等、２００１、Ｔｚｏｒｉｔｅ等、２００５、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ等、２００１、Ｓｈｉｎ等、１９９８、ＵＳ５０３２５０９、ＥＰ００２７２９５Ａ２）。β−ガラクトシダーゼ酵素とサッカロマイセス セレビシアエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞との組合せをアルギン酸カルシウムビーズに共不動化し、ホエーからエタノールが製造された（Ａｘｅｌｓｓｏｎ等、１９９１、ｌｅｗａｎｄｏｓｋａ等、２００３、およびＨｄｅｏ等、１９８４）。この目的は乳糖をグルコースとガラクトースとに分解させ、さらにエタノールを製造することができることにあった。
【０００４】
遊離の酵素に比較し、不動化された全細胞または酵素を包含する方法は或る種の利点、（１）触媒能力が安定化される、（２）不動化されたマトリックスを再循環することができ、価格を減少することができる、および（３）単純な方法で生成物を単離することができるという利点を有する。しかしながら、不動化された酵素の使用は価格的利益および技術的実行可能因子に依存する。数種の方法では、酵素の抽出および精製に費用がかかり、また数種の方法では、抽出後に酵素の変性が生じる。このような条件下に、不動化または共不動化された全細胞を使用すると、不動化された酵素の場合に比較し、追加の利点がえられる（Ｚｈａｎｇ等、１９９２、Ｋｉｓｓ等、１９９９）。
【０００５】
全細胞不動化の最も慣用の方法は、アルギン酸塩類、カラゲナン、ポリアクリルアミド、アガロース、ゼラチン、ゲランガムなどのハイドロコロイドに細胞を捕捉する方法である（ＵＳ５１７５０９３、ＵＳ５２８８６３２、ＵＳ５０９３２５３、ＵＳ４５７２８９７、ＵＳ５０７００１９、ＵＳ５７５９５７８、ＵＳ５９３９２９４およびＵＳ５０３４３２４、Ｂｉｒｎｂｈａｕｍ等、１９８１）。ＪＰ２００５０４２０３７、ＪＰ５８１５２３４およびＪＰ５６１１３２８９０は、別種のハイドロコロイドに対する成功する代用物質としてポリビニルアルコールをポリエチレングリコールおよびホウ酸と共に使用することを開示している。
【０００６】
Ｃｈａｎｇ等（１９９８）は少量のキサンタンガムを含有する塩化カルシウム溶液中で微生物細胞を混合し、次いでアルギン酸ナトリウム中に滴下した。カルシウムとアルギン酸塩との間のイオン結合によって形成されたカプセル膜は当該膜の膨潤を防止し、カプセル内に高濃度の微生物をもたらした。
【０００７】
ＵＳ５０３４３２４は、ポリビニルアルコールが微生物に対して高度の親和性を有し、全ての反応器において使用するのに充分な機械的強度および耐久性、ならびに水および化学物質に対する高度の抵抗性を付与することを開示している。Ｊｉａｎｌｏｎｇ等（２００４）は重合剤としてアクリルアミドを架橋剤としてのホウ酸と共に使用し、水性溶液中におけるポリビニルアルコールゲルの膨潤を克服した。
【０００８】
しかしながら、不動化された細胞の使用は、下記欠点を有する：
ａ．マトリックスおよび交差結合剤は食品級状態での使用にかかわる認可に完全に適合しなければならない、
ｂ．細胞を含む不動化されたビーズの機械的安定性は貧弱である、
ｃ．基質および生成物の拡散には無理があり、そのため生体変換効率は遊離細胞に比較して低い、
ｄ．低変換効率の故に、未反応基質および夾雑物からの生成物分離は困難を伴う作業である。
【０００９】
ＵＳ７１６４５１は、加水分解後に得られる糖溶液をエタノールと混合し、次いで活性炭カラムに通し、単糖類成分および二糖類成分を分離する方法を開示している。ガラクトオリゴ糖成分は純粋エタノールを用いて溶離されている。このダウンストリーム法は実質的に純粋なガラクトオリゴ糖溶液をもたらす。しかしながら、この方法はガラクトオリゴ糖の収率に損失が生じるために効果的ではない。また、エタノールの使用によって経済的でもない。
【００１０】
活性炭カラム処理の限界を克服するために、ＥＰ００２７２２０９５Ａ２およびＵＳ５０３２５０９は、強カチオン交換樹脂上に糖溶液を負荷し、次いでガラクトオリゴ糖を６０〜８０℃において水で溶離する方法を開示している。この方法はガラクトオリゴ糖の収率を改善することができる。しかしながら、高価な強カチオン性交換樹脂を使用するため、コスト的に有効でない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、高純度および高収率をもってガラクトオリゴ糖の製造をもたらす価格的に効果的な方法が探求され続けている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明の主目的は、微細濾過膜装置を備えたバイオリアクターにおいて酵母菌の全細胞を使用し、高純度および高収率でガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を製造する方法を提供することにある。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、ＧＯＳの製造に酵母菌の混合全細胞を使用することにある。
【００１４】
本発明のさらにもう一つの目的は、あらゆる高価な樹脂を使用することなくＧＯＳを得ることにある。
【００１５】
さらに、本発明は濃縮装置とともに炭素研磨（ｃａｒｂｏｎ ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）を使用し、無色のＧＯＳシロップを提供する。
【００１６】
さらにまた、本発明はシロップ乾燥機／晶析装置を使用し、無定形の粉末／結晶ＧＯＳを提供する。
【００１７】
すなわち、本発明は下記工程を含む遊離細胞による高純度ガラクトオリゴ糖の製造方法を提供する：
ａ．最適培地および条件下に糖をオリゴ糖に加水分解する酵素を産生する微生物を増殖させ、ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）およびサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）の細胞バイオマスを得る、
ｂ．乳糖を加水分解し、生成されたグルコースを混合微生物培養物により利用する、
ｃ．微細濾過膜装置／遠心分離を用い、微生物培養物からガラクトオリゴ糖を分離する、
ｄ．コットンおよび活性炭／カーボンフィルターを備えた深床フィルターを用い、１０〜３０ｍｌ／分の流速で上記ガラクトオリゴ糖を濾過する、
ｅ．減圧蒸発器において４０〜６０℃の温度範囲でガラクトオリゴ糖を濃縮し、７０〜８０％溶解固形物を有するシロップを得る、
ｆ．このシロップを乾燥させ、高純度のガラクトオリゴ糖を無定形粉末として得る、
ｇ．この無定形粉末を結晶化させ、結晶ガラクトオリゴ糖を得る。
【００１８】
本発明の態様の一つにおいて、酵母菌の不動化された全細胞は一連の反応器から構成されている順次式反応器で使用し、これらの反応器において、反応器の一つからの加水分解生成物を一連の次の反応器の供給源として使用する。
【００１９】
もう一つの態様において、酵母菌細胞は共不動化し、単一の反応器で使用する。
【００２０】
本発明においては、夾雑している糖の分離用のダウンストリーム法を行う必要がない。
【００２１】
この全細胞の共不動化方法は、オリゴ糖、有機酸などの別種の生成物および微生物以外のものが包含される別の生物工学的な方法にも、適用することができる。
【００２２】
（図面の簡単な説明）
本発明が開示する方法は下記図面から明白になるであろう：
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ガラクトオリゴ糖製造における遊離細胞の再使用。
【図２】ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）の遊離細胞およびビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）およびサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）の混合細胞によるＧＯＳの製造。
【図３】不動化されたマトリックスの再使用によるＧＯＳ製造。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
遊離細胞による高純度のガラクトオリゴ糖の新規で、改良された製造方法は、最適増殖培地を用いる振とう器フラスコおよび／または醗酵器中における細胞バイオマスの生成、遠心分離／微細濾過膜装置を用いる醗酵培地からの細胞の分離、ＧＯＳ製造用のバイオリアクター内における混合培養物の使用および生成されるグルコースの利用、糖カラムを用いるＨＰＬＳによるＧＯＳの純度の推定、遠心分離／微細濾過膜装置を用いる微生物細胞からのＧＯＳの分離、フィルター手段および活性炭を備えた深層カーボンフィルター／深床フィルターを用いるＧＯＳの濾過、シロップ（７０〜８０％溶解固形物）形態を得るためのＧＯＳの濃縮、無定形／結晶粉末形態を得るためのＧＯＳの乾燥／結晶化を含んでいる。
【００２５】
第一の態様において、ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）およびサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）の細胞バイオマスの生成は、最適増殖培地を用い、振とう器フラスコおよび／または醗酵器中で行った。
【００２６】
第二の態様において、混合微生物培養物はビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）およびサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）の混合微生物培養物（乾燥重量に基づき１：１）であった。
【００２７】
第三の態様において、混合微生物細胞バイオマスは、微細濾過装置を備えた反応槽に移し、加水分解を乳糖１５〜４５％、好ましくは３０％を用い、約３〜１０のｐＨおよび約１０〜６０℃において約１２〜１８時間かけて約５０〜２００ｒｐｍの範囲の攪拌速度でＧＯＳの純度が９０％以上に達するように行った。加水分解されたバイオマスは微細濾過により循環させ、ダウンストリーム法用の透過物（反応したバイオマスの５０％）を採取した。乳糖溶液（３０％）の新鮮なバッチを二回目の加水分解サイクル用に反応器に装入した。加水分解サイクルは所望の変換効率が補償されるまで、すなわち追加の１０％細胞バイオマスを添加しても効率が１０〜２０％低下するまで、上記追加のバイオマスを添加することによって反復した。
【００２８】
ガラクトオリゴ糖の濾過は、コットンおよび活性炭／カーボンフィルターを備えた深床フィルターを用い、１０〜３０ｍｌ／分、好ましくは２０ｍｌ／分の流速で行う。
【００２９】
第四の態様において、透過物質を炭素研磨機に通し、次いで０．２ミクロン微細フィルターに通し、着色物質および懸濁炭素粒子を除去した。
【００３０】
第五の態様において、炭素研磨され、加水分解された溶液を真空下に４０〜６０℃において濃縮器に通し、７０〜８０％溶解固形物含有量を有するシロップを得た。
【００３１】
本発明の第六の態様において、炭素研磨され、加水分解された溶液を約１１０〜１４０℃の温度範囲においてノズルを通して加圧下に噴霧乾燥機に通し、乾燥粉末を得た。
【００３２】
本発明を下記例においてさらに説明する。しかしながら、本発明の範囲はこれらの例に制限されるべきではなく、当業者は成分の割合および組合せについて容易に変更することができる。
【００３３】
（例１）
乳糖加水分解性ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）培養物の単離：
ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）、ＴＣＬ−ＩＣ／ＮＵＴ−１は下記組成の酵母−麦芽−ペプトン（Ｙｅａｓｔ−Ｍａｌｔ−Ｐｅｐｔｏｎｅ）（ＹＭＰ）培地上において連続希釈法により乳製品の廃液（ｄａｉｒｙ ｅｆｆｌｕｅｎｔ）から単離した：酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ペプトン０．５％、デキストロース１％および乳糖１％、ならびに寒天２．０％、ｐＨ６．５。
【００３４】
操作用原料培養物：
培養物をＹＭＰ斜面に線状に塗布し、次いで２７℃で４８時間かけて培養した。これらの斜面培養物を操作用原料培養物として使用した。
【００３５】
接種材料の調製：
２５０ｍｌフラスコ中のＹＭＰ培地５０ｍｌに上記斜面培養物を完全ループ形態で接種し、次いで振とう器において２７℃で４８時間かけ１８０ｒｐｍで培養した。
【００３６】
振とうフラスコ実験：
５００ｍｌフラスコ中のＹＭＰ培地１５０ｍｌに、５％接種材料を接種し、次いで振とう器において２７℃および１８０ｒｐｍで４８時間かけて培養した。試料を振とうフラスコから無菌条件下に採取し、次いで例２に示されているとおりにＧＯＳの生成について分析を行った。
【００３７】
醗酵実験：
ＹＭＰ培地３ｌを５ｌ醗酵器に装入し、次いで殺菌した。この醗酵器に振とうフラスコからの５％接種材料を接種した。醗酵は２７℃、ｐＨ４．５、６００ｒｐｍ攪拌で、４０〜６０％溶解酸素を維持するために空気１ｖｖｍを用いて行った。醗酵器からの試料を、２４時間、４８時間および６７時間の時点で採取し、例２に示されているとおりに最高ＧＯＳ生成を測定した。
【００３８】
（例２）
ガラクトオリゴ糖生成についての分析：
振とうフラスコまたは醗酵器からの細胞懸濁液２５ｍｌを遠心分離し、細胞ペレットを得た。この細胞ペレットを４０％乳糖溶液１５ｍｌ中に懸濁し、振とう器上に５０℃および２８０ｒｐｍ攪拌において保持した。試料０．５ｍｌを採取し、遠心分離し、細胞バイオマスを分離した。この上清をミリＱ（ｍｉｌｌｉ Ｑ）水により５０倍に希釈した。希釈された試料５μｌをＨＰＬＣ装置に注入した。
【００３９】
ＨＰＬＣ分析：
糖（グルコース、ガラクトース、乳糖およびガラクトオリゴ糖）の濃度をＨＰＬＣにより測定した。ＨＰＬＣ（ウオータース（Ｗａｔｅｒｓ）７１７）装置は、屈折率検出器（ウオータースＷ２４６７）および炭水化物カラムフェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）（ＰＮＭ００ｈ−０３１６、ＲＥＺＥＸ３００ｍｍＬＸ７．５ｍｍ、孔サイズ８μ−）ＩＤカラムから構成されていた。カラム温度は８０℃に維持した。流動溶媒として、水を０．５ｍｌ／分の流速で使用した。ガラクトオリゴ糖およびその他の糖はピーク面積に基づき総糖の重量パーセントとして測定した。
【００４０】
（実験例３）
ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）の遊離細胞によるガラクトオリゴ糖の製造：
振とうフラスコまたは醗酵器からの細胞懸濁液２５ｍｌを遠心分離し、細胞ペレットを得た。この細胞ペレットを３０％ラクトース溶液１５ｍｌに懸濁し、振とう器上に５０℃および１８０ｒｐｍ攪拌において保持した。
【００４１】
【表１】
【００４２】
表１の結果はガラクトオリゴ糖の生成がＹａｎｇ等により報告されているより高いことを示しているが、他方でＳｈｉｎ等、１９９により報告されている程度と同一であることを示している。
【００４３】
（実験例４）
ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）の完全細胞によるガラクトオリゴ糖の生成に対する乳糖濃度の効果：
硬化ビーズ１００ｇを加水分解用の２０％および４０％水性乳糖溶液中に懸濁した。加水分解は１８０ｒｐｍおよび３０℃において振とうフラスコで行った。相違する時間間隔で試料０．５ｍｌを採取し、ＨＰＬＣによりガラクトオリゴ糖について処理した。
【００４４】
【表２】
【００４５】
乳糖濃度を２０〜４０％に増加させてもＧＯＳ生成における有意の相違はなかった（表２）。
【００４６】
（実験例５）
ＧＯＳ生成の反応速度：
【表３】
【００４７】
表３の結果は、乳糖濃度が低いほどガラクトオリゴ糖の生成は高くなることを示している。高乳糖濃度における低ガラクトオリゴ糖生成は、乳糖の加水分解中に生成されるグルコースおよび／または基質抑制によるものであることがある。
【００４８】
（実験例６）
サッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）の単離：
この菌株は、麦芽エキス０．３％、酵母エキス０．３％、グルコース１．０％、ペプトン０．５％および寒天２．０％、ｐＨ６．４から構成されているＭＹＧＰ培地上において夾雑デキストロースシロップから単離した。菌株をグルコースおよび乳糖の利用性について特徴確認した。グルコースのみが存在し、乳糖が存在しない場合に増殖する菌株ＴＣＬ−ＩＣ／ＮＵＴ−２を選択した（ｌａｃ−、ｇｌｃ＋）。この菌種からの振とうフラスコおよび醗酵器内における細胞バイオマス製造は増殖培地を除いてビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）と同様であった。
【００４９】
（実験例７）
サッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）による乳糖およびグルコースの加水分解：
振とうフラスコおよび醗酵器からの細胞懸濁液２５ｍｌを遠心分離し、細胞ペレットを得た。この細胞ペレットを乳糖２０％およびグルコース２％溶液１５ｍｌ中に懸濁し、振とう器上で５０℃および１８０ｒｐｍ攪拌下に維持した。試料を一定の時間間隔で採取し、例２に記載のとおりにＨＰＬＣにより残留乳糖およびグルコース濃度について分析した。
【００５０】
【表４】
【００５１】
表４の結果は、サッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）が、乳糖に比較し、グルコースを好んで利用することを示している。すなわち、この培養物の特性は、ｌａｃ−、ｇｌｃ＋とされた。
【００５２】
（実験例８）
ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）およびサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）の混合遊離細胞の効果：
振とうフラスコまたは醗酵器からのビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）の細胞懸濁液２５ｍｌおよびサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）の懸濁液２５ｍｌを混合し、次いで遠心分離し、細胞ペレットを得た。この細胞ペレットを３０％乳糖溶液１５ｍｌ中に懸濁し、振とう器上で３０℃および１８０ｒｐｍ攪拌下に維持した。試料０．５ｍｌを相違する時間間隔で採取し、ＨＰＬＣによりガラクトオリゴ糖について分析した。
【００５３】
【表５】
【００５４】
表５の結果は、ＧＯＳの純度がビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）による３５％ガラクトオリゴ糖（表３）に比較し、７時間で７０．２６％まで増加したことを示している。
【００５５】
（実験例９）
微細濾過装置を備えた反応器における混合細胞によるガラクトオリゴ糖の製造：
ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）およびサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）の全細胞を等濃度（乾燥重量に基づき１：１）で反応器内において３０重量／重量％乳糖溶液と混合した。反応温度は３０℃に維持した。２４時間後、試料を採取し、ＧＯＳ濃度について分析した（表６）。
【００５６】
【表６】
【００５７】
（例１０）
ＧＯＳ製造の反復サイクル：
ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）およびサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）の全細胞を、孔サイズ０．５ミクロン、腔径（ＩＤ）３４０ｍｍおよび面積０．６メーターのポリエチレンスルホネートから形成された膜を有する交差流動式微細濾過装置に連結した反応器内で例９と同様に混合した。ＧＯＳの純度か９０％以上に到達した時点で、この溶液の５０％パーセントを交差流動式微細濾過装置に通すことによって透過により分離し、次いで新鮮な乳糖溶液３０％を添加し、反応器内の容量を引続くサイクルの出発時容量にした。このサイクルをＧＯＳの純度が１０％低下するまで反復した。
【００５８】
図１からの結果は、９０％以上の純度のＧＯＳが当該反応器において３９回の反復サイクルで生成されること、すなわち細胞バイオマスがＧＯＳ製造に再使用されたことを示している。
【００５９】
（実験例１１）
ＧＯＳの濃度：
実験例１０で得られた溶液を集め、活性炭パッドに通して濾過し、着色物質を除去した。この炭素研磨され、加水分解された溶液を４０〜６０℃において真空下に濃縮器に通し、７０〜８０％溶解固形物含有量を有するシロップを得た。
【００６０】
（実験例１２）
ＧＯＳの噴霧乾燥：
希ガラクトオリゴ糖（ｄｉｌｕｔｅ ｇａｌａｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）を、ＧＯＳ粉末の製造に使用される４ｋｇ／時間の能力を有する噴霧乾燥機（ボバン（Ｂｏｖａｎ）製）によって噴霧した。２５０Ｂｒｉｘを有する希ＧＯＳ ５リットルを、ノズルを通し４０ｍ／分の速度で散布した。流動速度以外に維持したその他の処理パラメーターは、加圧下に１２５〜１３０℃の範囲の温度である。得られた生成物は白色粉末を示した。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は高純度のガラクトオリゴ糖／オリゴ糖の製造方法に関する。本発明はさらに特に、微細濾過膜装置を備えたバイオリアクターに使用される微生物全細胞を用いることによるガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）の製造方法に関する。本方法の新規性は生物変換の反復サイクルにおける細胞バイオマスの再使用および単糖類および二糖類の分離を伴なわない高純度（＞９０％）ガラクトオリゴ糖の製造を包含する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ガラクトオリゴ糖はプレバイオティック（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ）化合物として工業界で広範な用途が見出されている。ガラクトオリゴ糖の製造には、多くの方法が開発されている。数種の方法は種々の微生物源、例えばアスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ブレラ シングラリス（Ｂｕｌｌｅｒａ ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルベロマイセス種（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、バチルス サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、ラクトバチルス ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス テルモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびビフィドバクテリウム種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）から得られるβ−ガラクトシダーゼ酵素の使用を包含する（Ａｋｉｙａｍａ等、２００１、Ｒｉｂｕ等、２００１、Ｔｚｏｒｉｔｅ等、２００５、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ等、２００１、Ｓｈｉｎ等、１９９８、ＵＳ５０３２５０９、ＥＰ００２７２９５Ａ２）。
【０００３】
遊離の全細胞または酵素を使用する代わりに不動化されたマトリックスにおいてβ−ガラクトシダーゼ酵素または全細胞を使用する方法がまた、報告されている（Ａｋｉｙａｍａ等、２００１、Ｒｉｂｕ等、２００１、Ｔｚｏｒｉｔｅ等、２００５、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ等、２００１、Ｓｈｉｎ等、１９９８、ＵＳ５０３２５０９、ＥＰ００２７２９５Ａ２）。β−ガラクトシダーゼ酵素とサッカロマイセス セレビシアエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞との組合せをアルギン酸カルシウムビーズに共不動化し、ホエーからエタノールが製造された（Ａｘｅｌｓｓｏｎ等、１９９１、ｌｅｗａｎｄｏｓｋａ等、２００３、およびＨｄｅｏ等、１９８４）。この目的は乳糖をグルコースとガラクトースとに分解させ、さらにエタノールを製造することができることにあった。
【０００４】
遊離の酵素に比較し、不動化された全細胞または酵素を包含する方法は或る種の利点、（１）触媒能力が安定化される、（２）不動化されたマトリックスを再循環することができ、価格を減少することができる、および（３）単純な方法で生成物を単離することができるという利点を有する。しかしながら、不動化された酵素の使用は価格的利益および技術的実行可能因子に依存する。数種の方法では、酵素の抽出および精製に費用がかかり、また数種の方法では、抽出後に酵素の変性が生じる。このような条件下に、不動化または共不動化された全細胞を使用すると、不動化された酵素の場合に比較し、追加の利点がえられる（Ｚｈａｎｇ等、１９９２、Ｋｉｓｓ等、１９９９）。
【０００５】
全細胞不動化の最も慣用の方法は、アルギン酸塩類、カラゲナン、ポリアクリルアミド、アガロース、ゼラチン、ゲランガムなどのハイドロコロイドに細胞を捕捉する方法である（ＵＳ５１７５０９３、ＵＳ５２８８６３２、ＵＳ５０９３２５３、ＵＳ４５７２８９７、ＵＳ５０７００１９、ＵＳ５７５９５７８、ＵＳ５９３９２９４およびＵＳ５０３４３２４、Ｂｉｒｎｂｈａｕｍ等、１９８１）。ＪＰ２００５０４２０３７、ＪＰ５８１５２３４およびＪＰ５６１１３２８９０は、別種のハイドロコロイドに対する成功する代用物質としてポリビニルアルコールをポリエチレングリコールおよびホウ酸と共に使用することを開示している。
【０００６】
Ｃｈａｎｇ等（１９９８）は少量のキサンタンガムを含有する塩化カルシウム溶液中で微生物細胞を混合し、次いでアルギン酸ナトリウム中に滴下した。カルシウムとアルギン酸塩との間のイオン結合によって形成されたカプセル膜は当該膜の膨潤を防止し、カプセル内に高濃度の微生物をもたらした。
【０００７】
ＵＳ５０３４３２４は、ポリビニルアルコールが微生物に対して高度の親和性を有し、全ての反応器において使用するのに充分な機械的強度および耐久性、ならびに水および化学物質に対する高度の抵抗性を付与することを開示している。Ｊｉａｎｌｏｎｇ等（２００４）は重合剤としてアクリルアミドを架橋剤としてのホウ酸と共に使用し、水性溶液中におけるポリビニルアルコールゲルの膨潤を克服した。
【０００８】
しかしながら、不動化された細胞の使用は、下記欠点を有する：
ａ．マトリックスおよび交差結合剤は食品級状態での使用にかかわる認可に完全に適合しなければならない、
ｂ．細胞を含む不動化されたビーズの機械的安定性は貧弱である、
ｃ．基質および生成物の拡散には無理があり、そのため生体変換効率は遊離細胞に比較して低い、
ｄ．低変換効率の故に、未反応基質および夾雑物からの生成物分離は困難を伴う作業である。
【０００９】
ＵＳ７１６４５１は、加水分解後に得られる糖溶液をエタノールと混合し、次いで活性炭カラムに通し、単糖類成分および二糖類成分を分離する方法を開示している。ガラクトオリゴ糖成分は純粋エタノールを用いて溶離されている。このダウンストリーム法は実質的に純粋なガラクトオリゴ糖溶液をもたらす。しかしながら、この方法はガラクトオリゴ糖の収率に損失が生じるために効果的ではない。また、エタノールの使用によって経済的でもない。
【００１０】
活性炭カラム処理の限界を克服するために、ＥＰ００２７２２０９５Ａ２およびＵＳ５０３２５０９は、強カチオン交換樹脂上に糖溶液を負荷し、次いでガラクトオリゴ糖を６０〜８０℃において水で溶離する方法を開示している。この方法はガラクトオリゴ糖の収率を改善することができる。しかしながら、高価な強カチオン性交換樹脂を使用するため、コスト的に有効でない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、高純度および高収率をもってガラクトオリゴ糖の製造をもたらす価格的に効果的な方法が探求され続けている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明の主目的は、微細濾過膜装置を備えたバイオリアクターにおいて酵母菌の全細胞を使用し、高純度および高収率でガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を製造する方法を提供することにある。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、ＧＯＳの製造に酵母菌の混合全細胞を使用することにある。
【００１４】
本発明のさらにもう一つの目的は、あらゆる高価な樹脂を使用することなくＧＯＳを得ることにある。
【００１５】
さらに、本発明は濃縮装置とともに炭素研磨（ｃａｒｂｏｎ ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）を使用し、無色のＧＯＳシロップを提供する。
【００１６】
さらにまた、本発明はシロップ乾燥機／晶析装置を使用し、無定形の粉末／結晶ＧＯＳを提供する。
【００１７】
すなわち、本発明は下記工程を含む遊離細胞による高純度ガラクトオリゴ糖の製造方法を提供する：
ａ．最適培地および条件下に糖をオリゴ糖に加水分解する酵素を産生する微生物を増殖させ、ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）およびサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）の細胞バイオマスを得る、
ｂ．乳糖を加水分解し、生成されたグルコースを混合微生物培養物により利用する、
ｃ．微細濾過膜装置／遠心分離を用い、微生物培養物からガラクトオリゴ糖を分離する、
ｄ．コットンおよび活性炭／カーボンフィルターを備えた深床フィルターを用い、１０〜３０ｍｌ／分の流速で上記ガラクトオリゴ糖を濾過する、
ｅ．減圧蒸発器において４０〜６０℃の温度範囲でガラクトオリゴ糖を濃縮し、７０〜８０％溶解固形物を有するシロップを得る、
ｆ．このシロップを乾燥させ、高純度のガラクトオリゴ糖を無定形粉末として得る、
ｇ．この無定形粉末を結晶化させ、結晶ガラクトオリゴ糖を得る。
【００１８】
本発明の態様の一つにおいて、酵母菌の不動化された全細胞は一連の反応器から構成されている順次式反応器で使用し、これらの反応器において、反応器の一つからの加水分解生成物を一連の次の反応器の供給源として使用する。
【００１９】
もう一つの態様において、酵母菌細胞は共不動化し、単一の反応器で使用する。
【００２０】
本発明においては、夾雑している糖の分離用のダウンストリーム法を行う必要がない。
【００２１】
この全細胞の共不動化方法は、オリゴ糖、有機酸などの別種の生成物および微生物以外のものが包含される別の生物工学的な方法にも、適用することができる。
【００２２】
（図面の簡単な説明）
本発明が開示する方法は下記図面から明白になるであろう：
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ガラクトオリゴ糖製造における遊離細胞の再使用。
【図２】ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）の遊離細胞およびビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）およびサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）の混合細胞によるＧＯＳの製造。
【図３】不動化されたマトリックスの再使用によるＧＯＳ製造。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
遊離細胞による高純度のガラクトオリゴ糖の新規で、改良された製造方法は、最適増殖培地を用いる振とう器フラスコおよび／または醗酵器中における細胞バイオマスの生成、遠心分離／微細濾過膜装置を用いる醗酵培地からの細胞の分離、ＧＯＳ製造用のバイオリアクター内における混合培養物の使用および生成されるグルコースの利用、糖カラムを用いるＨＰＬＳによるＧＯＳの純度の推定、遠心分離／微細濾過膜装置を用いる微生物細胞からのＧＯＳの分離、フィルター手段および活性炭を備えた深層カーボンフィルター／深床フィルターを用いるＧＯＳの濾過、シロップ（７０〜８０％溶解固形物）形態を得るためのＧＯＳの濃縮、無定形／結晶粉末形態を得るためのＧＯＳの乾燥／結晶化を含んでいる。
【００２５】
第一の態様において、ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）およびサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）の細胞バイオマスの生成は、最適増殖培地を用い、振とう器フラスコおよび／または醗酵器中で行った。
【００２６】
第二の態様において、混合微生物培養物はビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）およびサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）の混合微生物培養物（乾燥重量に基づき１：１）であった。
【００２７】
第三の態様において、混合微生物細胞バイオマスは、微細濾過装置を備えた反応槽に移し、加水分解を乳糖１５〜４５％、好ましくは３０％を用い、約３〜１０のｐＨおよび約１０〜６０℃において約１２〜１８時間かけて約５０〜２００ｒｐｍの範囲の攪拌速度でＧＯＳの純度が９０％以上に達するように行った。加水分解されたバイオマスは微細濾過により循環させ、ダウンストリーム法用の透過物（反応したバイオマスの５０％）を採取した。乳糖溶液（３０％）の新鮮なバッチを二回目の加水分解サイクル用に反応器に装入した。加水分解サイクルは所望の変換効率が補償されるまで、すなわち追加の１０％細胞バイオマスを添加しても効率が１０〜２０％低下するまで、上記追加のバイオマスを添加することによって反復した。
【００２８】
ガラクトオリゴ糖の濾過は、コットンおよび活性炭／カーボンフィルターを備えた深床フィルターを用い、１０〜３０ｍｌ／分、好ましくは２０ｍｌ／分の流速で行う。
【００２９】
第四の態様において、透過物質を炭素研磨機に通し、次いで０．２ミクロン微細フィルターに通し、着色物質および懸濁炭素粒子を除去した。
【００３０】
第五の態様において、炭素研磨され、加水分解された溶液を真空下に４０〜６０℃において濃縮器に通し、７０〜８０％溶解固形物含有量を有するシロップを得た。
【００３１】
本発明の第六の態様において、炭素研磨され、加水分解された溶液を約１１０〜１４０℃の温度範囲においてノズルを通して加圧下に噴霧乾燥機に通し、乾燥粉末を得た。
【００３２】
本発明を下記例においてさらに説明する。しかしながら、本発明の範囲はこれらの例に制限されるべきではなく、当業者は成分の割合および組合せについて容易に変更することができる。
【００３３】
（例１）
乳糖加水分解性ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）培養物の単離：
ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）、ＴＣＬ−ＩＣ／ＮＵＴ−１は下記組成の酵母−麦芽−ペプトン（Ｙｅａｓｔ−Ｍａｌｔ−Ｐｅｐｔｏｎｅ）（ＹＭＰ）培地上において連続希釈法により乳製品の廃液（ｄａｉｒｙ ｅｆｆｌｕｅｎｔ）から単離した：酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ペプトン０．５％、デキストロース１％および乳糖１％、ならびに寒天２．０％、ｐＨ６．５。
【００３４】
操作用原料培養物：
培養物をＹＭＰ斜面に線状に塗布し、次いで２７℃で４８時間かけて培養した。これらの斜面培養物を操作用原料培養物として使用した。
【００３５】
接種材料の調製：
２５０ｍｌフラスコ中のＹＭＰ培地５０ｍｌに上記斜面培養物を完全ループ形態で接種し、次いで振とう器において２７℃で４８時間かけ１８０ｒｐｍで培養した。
【００３６】
振とうフラスコ実験：
５００ｍｌフラスコ中のＹＭＰ培地１５０ｍｌに、５％接種材料を接種し、次いで振とう器において２７℃および１８０ｒｐｍで４８時間かけて培養した。試料を振とうフラスコから無菌条件下に採取し、次いで例２に示されているとおりにＧＯＳの生成について分析を行った。
【００３７】
醗酵実験：
ＹＭＰ培地３ｌを５ｌ醗酵器に装入し、次いで殺菌した。この醗酵器に振とうフラスコからの５％接種材料を接種した。醗酵は２７℃、ｐＨ４．５、６００ｒｐｍ攪拌で、４０〜６０％溶解酸素を維持するために空気１ｖｖｍを用いて行った。醗酵器からの試料を、２４時間、４８時間および６７時間の時点で採取し、例２に示されているとおりに最高ＧＯＳ生成を測定した。
【００３８】
（例２）
ガラクトオリゴ糖生成についての分析：
振とうフラスコまたは醗酵器からの細胞懸濁液２５ｍｌを遠心分離し、細胞ペレットを得た。この細胞ペレットを４０％乳糖溶液１５ｍｌ中に懸濁し、振とう器上に５０℃および２８０ｒｐｍ攪拌において保持した。試料０．５ｍｌを採取し、遠心分離し、細胞バイオマスを分離した。この上清をミリＱ（ｍｉｌｌｉ Ｑ）水により５０倍に希釈した。希釈された試料５μｌをＨＰＬＣ装置に注入した。
【００３９】
ＨＰＬＣ分析：
糖（グルコース、ガラクトース、乳糖およびガラクトオリゴ糖）の濃度をＨＰＬＣにより測定した。ＨＰＬＣ（ウオータース（Ｗａｔｅｒｓ）７１７）装置は、屈折率検出器（ウオータースＷ２４６７）および炭水化物カラムフェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）（ＰＮＭ００ｈ−０３１６、ＲＥＺＥＸ３００ｍｍＬＸ７．５ｍｍ、孔サイズ８μ−）ＩＤカラムから構成されていた。カラム温度は８０℃に維持した。流動溶媒として、水を０．５ｍｌ／分の流速で使用した。ガラクトオリゴ糖およびその他の糖はピーク面積に基づき総糖の重量パーセントとして測定した。
【００４０】
（実験例３）
ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）の遊離細胞によるガラクトオリゴ糖の製造：
振とうフラスコまたは醗酵器からの細胞懸濁液２５ｍｌを遠心分離し、細胞ペレットを得た。この細胞ペレットを３０％ラクトース溶液１５ｍｌに懸濁し、振とう器上に５０℃および１８０ｒｐｍ攪拌において保持した。
【００４１】
【表１】
【００４２】
表１の結果はガラクトオリゴ糖の生成がＹａｎｇ等により報告されているより高いことを示しているが、他方でＳｈｉｎ等、１９９により報告されている程度と同一であることを示している。
【００４３】
（実験例４）
ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）の完全細胞によるガラクトオリゴ糖の生成に対する乳糖濃度の効果：
硬化ビーズ１００ｇを加水分解用の２０％および４０％水性乳糖溶液中に懸濁した。加水分解は１８０ｒｐｍおよび３０℃において振とうフラスコで行った。相違する時間間隔で試料０．５ｍｌを採取し、ＨＰＬＣによりガラクトオリゴ糖について処理した。
【００４４】
【表２】
【００４５】
乳糖濃度を２０〜４０％に増加させてもＧＯＳ生成における有意の相違はなかった（表２）。
【００４６】
（実験例５）
ＧＯＳ生成の反応速度：
【表３】
【００４７】
表３の結果は、乳糖濃度が低いほどガラクトオリゴ糖の生成は高くなることを示している。高乳糖濃度における低ガラクトオリゴ糖生成は、乳糖の加水分解中に生成されるグルコースおよび／または基質抑制によるものであることがある。
【００４８】
（実験例６）
サッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）の単離：
この菌株は、麦芽エキス０．３％、酵母エキス０．３％、グルコース１．０％、ペプトン０．５％および寒天２．０％、ｐＨ６．４から構成されているＭＹＧＰ培地上において夾雑デキストロースシロップから単離した。菌株をグルコースおよび乳糖の利用性について特徴確認した。グルコースのみが存在し、乳糖が存在しない場合に増殖する菌株ＴＣＬ−ＩＣ／ＮＵＴ−２を選択した（ｌａｃ−、ｇｌｃ＋）。この菌種からの振とうフラスコおよび醗酵器内における細胞バイオマス製造は増殖培地を除いてビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）と同様であった。
【００４９】
（実験例７）
サッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）による乳糖およびグルコースの加水分解：
振とうフラスコおよび醗酵器からの細胞懸濁液２５ｍｌを遠心分離し、細胞ペレットを得た。この細胞ペレットを乳糖２０％およびグルコース２％溶液１５ｍｌ中に懸濁し、振とう器上で５０℃および１８０ｒｐｍ攪拌下に維持した。試料を一定の時間間隔で採取し、例２に記載のとおりにＨＰＬＣにより残留乳糖およびグルコース濃度について分析した。
【００５０】
【表４】
【００５１】
表４の結果は、サッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）が、乳糖に比較し、グルコースを好んで利用することを示している。すなわち、この培養物の特性は、ｌａｃ−、ｇｌｃ＋とされた。
【００５２】
（実験例８）
ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）およびサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）の混合遊離細胞の効果：
振とうフラスコまたは醗酵器からのビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）の細胞懸濁液２５ｍｌおよびサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）の懸濁液２５ｍｌを混合し、次いで遠心分離し、細胞ペレットを得た。この細胞ペレットを３０％乳糖溶液１５ｍｌ中に懸濁し、振とう器上で３０℃および１８０ｒｐｍ攪拌下に維持した。試料０．５ｍｌを相違する時間間隔で採取し、ＨＰＬＣによりガラクトオリゴ糖について分析した。
【００５３】
【表５】
【００５４】
表５の結果は、ＧＯＳの純度がビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）による３５％ガラクトオリゴ糖（表３）に比較し、７時間で７０．２６％まで増加したことを示している。
【００５５】
（実験例９）
微細濾過装置を備えた反応器における混合細胞によるガラクトオリゴ糖の製造：
ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）およびサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）の全細胞を等濃度（乾燥重量に基づき１：１）で反応器内において３０重量／重量％乳糖溶液と混合した。反応温度は３０℃に維持した。２４時間後、試料を採取し、ＧＯＳ濃度について分析した（表６）。
【００５６】
【表６】
【００５７】
（例１０）
ＧＯＳ製造の反復サイクル：
ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）およびサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）の全細胞を、孔サイズ０．５ミクロン、腔径（ＩＤ）３４０ｍｍおよび面積０．６メーターのポリエチレンスルホネートから形成された膜を有する交差流動式微細濾過装置に連結した反応器内で例９と同様に混合した。ＧＯＳの純度か９０％以上に到達した時点で、この溶液の５０％パーセントを交差流動式微細濾過装置に通すことによって透過により分離し、次いで新鮮な乳糖溶液３０％を添加し、反応器内の容量を引続くサイクルの出発時容量にした。このサイクルをＧＯＳの純度が１０％低下するまで反復した。
【００５８】
図１からの結果は、９０％以上の純度のＧＯＳが当該反応器において３９回の反復サイクルで生成されること、すなわち細胞バイオマスがＧＯＳ製造に再使用されたことを示している。
【００５９】
（実験例１１）
ＧＯＳの濃度：
実験例１０で得られた溶液を集め、活性炭パッドに通して濾過し、着色物質を除去した。この炭素研磨され、加水分解された溶液を４０〜６０℃において真空下に濃縮器に通し、７０〜８０％溶解固形物含有量を有するシロップを得た。
【００６０】
（実験例１２）
ＧＯＳの噴霧乾燥：
希ガラクトオリゴ糖（ｄｉｌｕｔｅ ｇａｌａｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）を、ＧＯＳ粉末の製造に使用される４ｋｇ／時間の能力を有する噴霧乾燥機（ボバン（Ｂｏｖａｎ）製）によって噴霧した。２５０Ｂｒｉｘを有する希ＧＯＳ ５リットルを、ノズルを通し４０ｍ／分の速度で散布した。流動速度以外に維持したその他の処理パラメーターは、加圧下に１２５〜１３０℃の範囲の温度である。得られた生成物は白色粉末を示した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遊離細胞による高純度ガラクトオリゴ糖の製造方法であって、以下を含む製造方法：
ａ）ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）およびサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）の細胞バイオマスを得るために、最適培地および条件下に糖をオリゴ糖に加水分解する酵素を産生する微生物を増殖させること
ｂ）乳糖を加水分解し、生成されたグルコースを混合微生物培養物により利用すること
ｃ）微細濾過膜装置または遠心分離を使用し、微生物培養物からガラクトオリゴ糖を分離すること
ｄ）前記ガラクトオリゴ糖をコットンおよび活性炭またはカーボンフィルターを備えた深床フィルターを使用し、１０〜３０ｍｌ／分の流速で濾過すること
ｅ）真空蒸発器において４０〜６０℃の温度範囲でガラクトオリゴ糖を濃縮し、７０〜８０％溶解固形物を含有するシロップを得ること
ｆ）前記シロップを乾燥させ、高純度のガラクトオリゴ糖を無定形粉末として得ること
ｇ）前記無定形粉末を結晶化させ、結晶ガラクトオリゴ糖を得ること。
【請求項２】
ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）およびサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）を、ホエー廃液および夾雑糖溶液からそれぞれ単離する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）がｌａｃ−ｇｌｕ＋またはｇａｌ＋である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記細胞バイオマスが任意に、アスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｏｒｙｚａｅ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルベロマイセス種（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、バチルス サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、ラクトバチルス ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス テルモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびビフィドバクテリウム種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）から選択されるβ−ガラクトシダーゼ酵素産生性微生物培養物から製造される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記細胞バイオマスの増殖を振とう器フラスコおよび醗酵器により行う、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
乳糖をオリゴ糖に加水分解する上記酵素がβ−ガラクトシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、カタラーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼおよびその組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
微生物細胞の比が乾燥重量に基づき１：１〜１：２である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
加水分解反応をバイオリアクターにおいて、約３〜約１０のｐＨを有する約１５〜約４５％乳糖溶液を使用し、約１０〜６０℃において約５０〜２００ｒｐｍの範囲の攪拌速度で約１２〜４８時間かけて行う、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
加水分解サイクルを上記追加のバイオマスの添加により反復し、所望の変換効率を補償する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
上記ガラクトオリゴ糖の濾過をコットンおよび活性炭／カーボンフィルターを備えた深床フィルターを２０ｍｌ／分の流速で使用して行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
透過液を炭素研磨器に通し、次いで０．２ミクロン微細濾過膜装置に通し、着色物質および懸濁炭素粒子を除去する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
炭素研磨され、加水分解された溶液を減圧下に４０〜６０℃において濃縮器に通し、７０〜８０％溶解固形物を含有するシロップを得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
上記膜装置が、ＰＥＳ、ＰＴＦＥ、再生セルロースまたはセラミック中空繊維、ＴＦＦカセット膜から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
希ガラクトオリゴ糖の噴霧を、加圧下において、ノズルを通して１００〜１３５℃の温度範囲において行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１】
遊離細胞による高純度ガラクトオリゴ糖の製造方法であって、以下を含む製造方法：
ａ）ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）およびサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）の細胞バイオマスを得るために、最適培地および条件下に糖をオリゴ糖に加水分解する酵素を産生する微生物を増殖させること
ｂ）乳糖を加水分解し、生成されたグルコースを混合微生物培養物により利用すること
ｃ）微細濾過膜装置または遠心分離を使用し、微生物培養物からガラクトオリゴ糖を分離すること
ｄ）前記ガラクトオリゴ糖をコットンおよび活性炭またはカーボンフィルターを備えた深床フィルターを使用し、１０〜３０ｍｌ／分の流速で濾過すること
ｅ）真空蒸発器において４０〜６０℃の温度範囲でガラクトオリゴ糖を濃縮し、７０〜８０％溶解固形物を含有するシロップを得ること
ｆ）前記シロップを乾燥させ、高純度のガラクトオリゴ糖を無定形粉末として得ること
ｇ）前記無定形粉末を結晶化させ、結晶ガラクトオリゴ糖を得ること。
【請求項２】
ビー．シングラリス（Ｂ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）およびサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）を、ホエー廃液および夾雑糖溶液からそれぞれ単離する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）がｌａｃ−ｇｌｕ＋またはｇａｌ＋である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記細胞バイオマスが任意に、アスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｏｒｙｚａｅ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルベロマイセス種（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、バチルス サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、ラクトバチルス ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス テルモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびビフィドバクテリウム種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）から選択されるβ−ガラクトシダーゼ酵素産生性微生物培養物から製造される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記細胞バイオマスの増殖を振とう器フラスコおよび醗酵器により行う、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
乳糖をオリゴ糖に加水分解する上記酵素がβ−ガラクトシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、カタラーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼおよびその組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
微生物細胞の比が乾燥重量に基づき１：１〜１：２である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
加水分解反応をバイオリアクターにおいて、約３〜約１０のｐＨを有する約１５〜約４５％乳糖溶液を使用し、約１０〜６０℃において約５０〜２００ｒｐｍの範囲の攪拌速度で約１２〜４８時間かけて行う、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
加水分解サイクルを上記追加のバイオマスの添加により反復し、所望の変換効率を補償する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
上記ガラクトオリゴ糖の濾過をコットンおよび活性炭／カーボンフィルターを備えた深床フィルターを２０ｍｌ／分の流速で使用して行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
透過液を炭素研磨器に通し、次いで０．２ミクロン微細濾過膜装置に通し、着色物質および懸濁炭素粒子を除去する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
炭素研磨され、加水分解された溶液を減圧下に４０〜６０℃において濃縮器に通し、７０〜８０％溶解固形物を含有するシロップを得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
上記膜装置が、ＰＥＳ、ＰＴＦＥ、再生セルロースまたはセラミック中空繊維、ＴＦＦカセット膜から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
希ガラクトオリゴ糖の噴霧を、加圧下において、ノズルを通して１００〜１３５℃の温度範囲において行う、請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１１−５１７５５３（Ｐ２０１１−５１７５５３Ａ）
【公表日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５５０３１９（Ｐ２０１０−５５０３１９）
【出願日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０５１０２７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１１３０３０
【国際公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【出願人】（５１０２４２２１１）タタ ケミカルズ リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０５１０２７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１１３０３０
【国際公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【出願人】（５１０２４２２１１）タタ ケミカルズ リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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