遺伝子多型の検出方法および薬物のスクリーニング方法
【課題】 アミノ酸変異を伴う遺伝子多型の中から、薬物トランスポーター、特にABCB1およびABCG2、の機能に大きく影響を及ぼすものを見出して、その医薬品への影響および遺伝子多型の臨床判別する方法を提供する。
【解決手段】 被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出することにより、薬物の被検者体内での動態への影響を予測することを特徴とする遺伝子多型の検出方法、さらには薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型を被検薬物と接触させてその相互作用を検出することにより、該遺伝子多型によって影響をうける薬物をスクリーニングすることを特徴とする薬物のスクリーニング方法。遺伝子多型としては、ABCB1のAla893ProならびにABCG2のPhe208Ser、Ser248Pro、 Phe431LeuもしくはPhe489Leuが好適である。
【解決手段】 被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出することにより、薬物の被検者体内での動態への影響を予測することを特徴とする遺伝子多型の検出方法、さらには薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型を被検薬物と接触させてその相互作用を検出することにより、該遺伝子多型によって影響をうける薬物をスクリーニングすることを特徴とする薬物のスクリーニング方法。遺伝子多型としては、ABCB1のAla893ProならびにABCG2のPhe208Ser、Ser248Pro、 Phe431LeuもしくはPhe489Leuが好適である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子多型の検出方法および薬物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トランスポーターは細胞の膜を物質が通過する際に必要な通路を形成し、本来は栄養素等の生体機能維持に必須である物質もしくは体内代謝産物等を、体内に吸収、代謝もしくは排泄するのに重要な役割を果たしている。そして、このようなトランスポーターがこれらの物質もしくは体内代謝産物等と類似の構造を有する薬物をも認識することから、特に輸送基質として薬物を考えた場合に薬物トランスポーターと称されている。一つの薬物トランスポーターが認識する基質の種類は多く、その基質認識部位と類似性がない構造の薬物を輸送することもあり、その薬物選択の機構は不明な点が多い。
【０００３】
このような薬物トランスポーターとしては、ABC（ATP結合部位）トランスポーター、有機イオントランスポーター、ペプチドトランスポーター等が知られており、たとえばABCトランスポーターは、ヒトゲノム解析から、約５０種類のABCトランスポーター遺伝子の存在が予測されている。そして、他の遺伝子と同様にABCトランスポーター遺伝子にも種々の遺伝子多型が存在し、たとえば特定の1個の塩基が他の塩基に置換する一塩基多型（SNP）が代表的なものとして挙げられる。
【０００４】
そして、ABCトランスポーター遺伝子について、これまでの網羅的なSNP解析によってSNPの同定がなされてきており、数多くのSNP情報が提供されている。薬物トランスポーターの遺伝子に変異があって、これらの蛋白質のアミノ酸の置換が起きると、これらの蛋白質の機能が異常になり、機能変化をもたらすことがある。そして、これらの蛋白質の機能が変化した結果、薬の体内動態が異常になり、普通の投与量を投与したにもかかわらず、ある患者では効き過ぎによる副作用が見られることや、薬がほとんど効かないことがある。
【０００５】
このように、患者間での薬剤応答性の差異は、薬物トランスポーター遺伝子の多型や発現量の違いにより、活性が変化し、薬物トランスポーターによる細胞内への薬物の流入および排出の制御に差異が生じることが大きく関与していると考えられる。しかしながら、どのSNP (頻度 1%以上) または遺伝子変異 (頻度1%未満) 等の遺伝子多型が、薬物の体内動態に影響を及ぼすのかは従来必ずしも明らかにされていない。機能変化のデータなくして、これらの遺伝子多型情報だけでは薬物の体内動態を予測することはできず、臨床診断技術および創薬において重要な遺伝子多型を絞り込むことができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明者はアミノ酸変異を伴う遺伝子多型の中から、薬物トランスポーターの機能に影響を及ぼすものを見出し、その医薬品への影響および遺伝子多型の臨床判別する方法について検討し、本発明に到達した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記の課題を解決するために以下の発明を提供する。
（１）被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出することにより、薬物の被検者体内での動態への影響を予測することを特徴とする遺伝子多型の検出方法；
（２）被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出し、多型が検出される場合に薬物の体内動態への影響を受けやすい遺伝性素因を有すると判定し、多型が検出されない場合に薬物の体内動態への影響を受けにくい遺伝性素因を有すると判定することを特徴とする遺伝子多型の検出方法；
（３）被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出し、多型が検出された場合に薬物の被検者体内での動態への影響を予測することを特徴とする遺伝子多型の検出方法；
（４）遺伝子多型とその機能変化に関するデータに基づいて、薬物の体内動態への影響を予測し、薬理効果と副作用のリスクを予見する（３）記載の遺伝子多型の検出方法；
（５）被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出し、多型が検出された場合に薬物トランスポーターの機能もしくは発現量ならびに薬物動態に影響をおよぼす遺伝子多型を該DNA試料で判別することを特徴とする遺伝子多型の検出方法；
（６）遺伝子多型の検出を塩基配列決定法、質量分析法、PCR法もしくはハイブリダイゼーション法により行なう（１）〜（５）のいずれか記載の遺伝子多型の検出方法；
（７）遺伝子多型が一塩基多型である（１）〜（６）のいずれか記載の遺伝子多型の検出方法；
（８）遺伝子多型が、ABCB1のAla893ProならびにABCG2のPhe208Ser、Ser248Pro、Phe431LeuもしくはPhe489Leuである（７）記載の遺伝子多型の検出方法；
（９）薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型を被検薬物と接触させてその相互作用を検出することにより、該遺伝子多型によって影響をうける薬物をスクリーニングすることを特徴とする薬物のスクリーニング方法；
（１０）薬物トランスポーターの機能もしくは発現量および薬物動態が影響をうける薬物をスクリーニングする（９）記載の薬物のスクリーニング方法；
（１１）遺伝子多型の検出を塩基配列決定法、質量分析法、PCR法もしくはハイブリダイゼーション法により行なう（９）もしくは（１０）記載の薬物のスクリーニング方法；
（１２）遺伝子多型が一塩基多型である（９）〜（１１）のいずれか記載の薬物のスクリーニング方法；
（１３）遺伝子多型が、ABCB1のAla893ProならびにABCG2のPhe208Ser、Ser248Pro、 Phe431LeuもしくはPhe489Leuである（１２）記載の薬物のスクリーニング方法；
（１４）薬物トランスポーターの機能もしくは発現量；または薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子の一塩基多型を判別するためのプローブをプレート上に固定化してなる一塩基多型DNAアレイ；
（１５）プローブがオリゴヌクレオチドである（１４）記載の一塩基多型DNAアレイ；ならびに
（１６）プローブがガラススライド上にスポッティングされた後に固定化される（１４）記載の一塩基多型DNAアレイ、
である。
【発明の効果】
【０００８】
薬剤応答性に関連する遺伝子を解明し、最適な薬物療法の実現等を推進すること、即ち薬が効く患者と効かない患者の遺伝子の塩基配列を比較することにより、遺伝子多型と薬の効果・副作用との関連を解明することは極めて重要である。2005年 3月には、FDAは「Guidance for Industry: Pharmacogenomics Data Submissions」と題した正式なガイダンスを公開した。FDAは製薬企業がINDおよびNDA申請する際、用量設定、患者特性、および安全性／有効性を導くために用いたデータとともに、ファーマコゲノミクス (PGx) データを提出するように勧告している。
【０００９】
本発明は、アミノ酸変異を伴う遺伝子多型の中から、薬物トランスポーター、特にABCB1およびABCG2、の機能に大きく影響を及ぼすものを見出して、その医薬品への影響および遺伝子多型の臨床判別する方法を提供する。本発明方法は、遺伝子多型によって薬物の体内動態を予測する上で重要であり、今後各国が取り組むべき「個の医療」（テーラード医療）において、臨床診断技術および創薬に対して大いに有用であると考えられる。またさらに、遺伝子多型の機能スクリーニング方法は、新薬の開発段階において、候補化合物が遺伝子多型によって影響を受けるかどうか、臨床開発の前段階でテストすることができる。そうすることによって、臨床開発および市場での副作用を予見することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の遺伝子多型の検出方法においては、被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出することにより、薬物の被検者体内での動態への影響を予測する。薬物トランスポーター遺伝子多型としては、ABC（ATP結合部位）トランスポーター、有機イオントランスポーター、ペプチドトランスポーター等のSNP等が挙げられる。そして、本発明方法においては、アミノ酸変異を伴う多型の中から、ある薬物に対してその動態に影響をもたらす多型を予め選択して用いることができる。ここで、影響をもたらすかどうかは、トランスポーターの発現量もしくは活性がなくなる、または発現量もしくは活性が５倍以上変化する場合には、薬物体内動態が影響されると判断される。
たとえば、脳 (特に血液脳関門) 、小腸、肝臓、癌等の組織において薬物輸送に関与する主要なトランスポーターであるヒトABCトランスポーターABCB1(P-糖蛋白質、MDR1)およびABCG2(BCRP)に関して、ヒト薬物トランスポーターABCB1 およびABCG2の機能に影響をもたらすと判断されるアミノ酸変異を伴う遺伝子多型としては、ABCB1においてAla893Pro（NCBI dbSNP, cluster ID rs2032582）、ならびにABCG2ではPhe208Ser （NCBI dbSNP, cluster ID rs1061018）Ser248Pro（NCBI dbSNP, cluster ID rs3116448）, Phe431LeuおよびPhe489Leu（Itoda et al., Drug Metab. Pharmacokin. 18: 212-217(2003)およびKobayashi et al. Drug Metab. Dispos. 1: 94-101(2005))であり、広範な薬物に関しその輸送機能に大きな変化をもたらす。
【００１１】
本発明の薬物トランスポーター遺伝子多型は、たとえば一般的な遺伝子工学的手法よって調製しうる。たとえば、ABCトランスポーターABCB1のcDNAをベクター に組み込みABCB1遺伝子多型 に関しては、NCBIのSNPデータに基づき、部位特異的変異法でABCB1のcDNAにSNPを導入して、調製できる。ついで、ベクターから発現用プラスミドを作成した後、宿主細胞に遺伝子改変ウイルスを感染させ、トランスポーターのタンパク質を発現させることができる。得られたタンパク質は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法、たとえば液相クロマトグラフィー等により精製することができる。
【００１２】
被検者のDNA試料の採取は常法によることができ、特に制限されない。
【００１３】
遺伝子多型の検出も、一般的な遺伝子多型検出法を利用して行なうことができ、たとえば塩基配列決定法、質量分析法、PCR法もしくはハイブリダイゼーション法により行なわれる。
【００１４】
さらに、本発明の遺伝子多型の検出方法においては、被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出し、多型が検出される場合に薬物の体内動態への影響を受けやすい遺伝性素因を有すると判定し、多型が検出されない場合に薬物の体内動態への影響を受けにくい遺伝性素因を有すると判定することができる。さらには、被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出し、多型が検出された場合に薬物の被検者体内での動態への影響を予測することができる。この予測に際しては、予め用意した遺伝子多型とその機能変化に関するデータにもとづくことができ、被検者への薬理効果と副作用のリスクを予見することができる。
【００１５】
さらには、本発明の遺伝子多型の検出方法においては、被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出し、多型が検出された場合に薬物トランスポーターの機能もしくは発現量ならびに薬物動態に影響をおよぼす遺伝子多型を該DNA試料で判別することができる。
【００１６】
さらに、本発明の薬物のスクリーニング方法においては、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型を被検薬物と接触させてその相互作用を検出することにより、該遺伝子多型によって影響をうける薬物をスクリーニングする。これにより、薬物トランスポーターの機能もしくは発現量および薬物動態が影響をうける薬物を同定または予見することができる。
【００１７】
以上のように、本発明において得られた遺伝子多型情報は、どの薬物が治療に最も有効であるか、その使用すべき薬物を選択するための情報源となる。それらの遺伝子中に存在する遺伝子多型の中に副作用と相関する多型がある場合にはこれを削除すること、あるいは条件付きで使用することが可能となり、この副作用と有効性の情報から薬物のスクリーニングが可能となる。
【００１８】
本発明の一塩基多型DNAアレイは、薬物トランスポーターの機能もしくは発現量；または薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子の一塩基多型を判別するためのプローブをプレート上に固定化してなる。たとえば、ガラス等のプレート上に多種類のプローブをスポッティング等により整列化し、固定し、その上で標識プローブのハイブリダイゼーションを行い、プローブ上の標識（たとえば蛍光）シグナルを検出する方法を利用して、ハイブリダイゼーションで完全マッチと一塩基ミスマッチを検出する。プローブとしては、たとえばオリゴヌクレオチドが選ばれる。オリゴヌクレオチドは、常法により合成されうる。塩基配列の長さは、好ましくは13塩基〜60塩基、さらに好ましくは18〜30塩基である。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限りこれらの実施例に限定されない。
実施例１
ABCB1遺伝子多型Ala893Proの機能解析
Ala893Proの多型を持つABCB1の作製と昆虫細胞での発現
ヒトABCトランスポーターを、増殖速度が速く、安価で大量培養が可能である昆虫細胞に発現させて、その細胞膜を用いて機能解析を行った。ABCB1蛋白質をSf9昆虫細胞に発現させるために、まずABCB1のcDNAをベクター (pFastBac1) に組み込んだ。ABCB1遺伝子多型 (Ala893Pro) に関しては、NCBIのSNPデータに基づき、部位特異的変異法でABCB1のcDNAにSNPを導入して、同様に昆虫細胞に発現させた。部位特異的変異法で用いたPCRのプライマーと実験条件を表1に示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】
ベクターから発現用バクミドを作成した後、昆虫細胞に遺伝子改変ウイルスを感染させ、トランスポーターのタンパク質を発現させた。その方法は以下の通りである。
【００２２】
まず、ヒト野生型ABCB1 cDNAが挿入された昆虫細胞発現用pFastBac1ベクターを用意し、一塩基変異を導入するための一対のプライマーを用いてPCRを行い、全長を複製した。このプラスミドをDH10Bacコンピテントセルに形質転換し、ABCB1のcDNAをバクミドに組み換えた。その後、組み換えバクミドをCellfectin試薬 (Invitrogen Co.) を用いてSf9昆虫細胞に遺伝子導入することにより、ABCB1のcDNAをゲノム中にもつ遺伝子改変バキュロウイルスを得た。Sf9昆虫細胞にこの遺伝子改変ウイルスを感染させ、ABCB1タンパク質を発現させた。
【００２３】
ABCB1タンパク質の発現を確認するために、抗ABCB1タンパク質モノクローナル抗体C219 (EMD Biosciences, Inc.) を用いたウェスタンブロッティングを行った。Sf9細胞の細胞溶解液を調製した後、7.5%のポリアクリルアミドゲル電気泳動 (25 mA、90分間) を行って、タンパク質を分離し、ニトロセルロース膜 (Amersham Biosciences Co.) に転写した (15 V、70分間)。転写した膜を0.5% (w/v) スキムミルク含有TTBS (0.05% Tween 20含有TBS) でブロッキングした後、TTBSでよく洗浄し、TTBSで100倍に希釈したC219に室温で1.5時間浸して抗原抗体反応を行った。さらにTTBSでよく洗浄し、TTBSで3000倍に希釈した抗マウスIgG抗体に室温で1時間浸して二次抗体反応を行った。ニトロセルロース膜をTTBSでよく洗浄した後、Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer Life Sciences, Inc.) に浸し、その化学発光をLumino Imaging Analyzer FAS-1000 (TOYOBO Co., Ltd.) で検出した。
ABCB1の野性型およびAla893ProのATPase活性測定
ABCトランスポーターであるABCB1はATPを加水分解し、その時のエネルギーを用いて化合物を細胞の外へと運ぶ。この際のATPase活性を測定する事により、試験化合物のABCB1への親和性を知る事が出来る。ATPase活性はATPaseの加水分解によって生じた無機リン酸量を定量し、加水分解によって生じた無機リン酸量を反応時間、用いたタンパク質量で割った値 (nmol Pi/min/mg protein) とした。無機リン酸の定量としてマラカイトグリーンを用いた。これは、モリブデン酸ナトリウムと無機リン酸を酸性下で反応させ、モリブデン酸リンを作り、これが塩基性染料であるマラカイトグリーンと複合体を作ることを利用している。高速化を図るために96ウェルプレートと自動分注機を用いたスクリーニング系を用いた。
【００２４】
ABCB1タンパク質を発現させた昆虫細胞より、細胞形質膜を調製し、その形質膜とABCB1の基質であるverapamil、nicardipine、vinblastine、gefitinibを用いて、Ala893Proの遺伝子多型のATPase活性への影響を調べた。
【００２５】
溶液の組成
反応溶液；50 mM Tris-Mes (pH6.8)
2 mM EGTA
2 mM ウワバイン
2 mM ジチオスレイトール
50 mM 塩化カリウム
5 mM アジ化ナトリウム
溶液A；2 N 塩酸：0.1 M モリブデン酸ナトリウム＝ 4 : 3
溶液B；0.084%(w/v) マラカイトグリーン
1%(w/v) ポリビニルアルコール
溶液C；7.8%(v/v) 硫酸
2 μgの膜画分を10 μlの反応溶液に懸濁した。基質を10 μl加え、37℃、3分間プレ・インキュベートした。そして、4 mM MgATP溶液を20 μl加えて反応を開始した。37℃、30分間インキュベートをした後、5％(v/v) トリクロロ酢酸を20 μl加え、反応を停止した。標準曲線を作成するために、順に0、0.05、0.1、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5 mMリン酸二水素ナトリウムニ水和物を20 μLずつ分注した。さらにdH2O、反応溶液を10 μlずつ、5%(v/v) トリクロロ酢酸を20 μlずつ分注した。無機リン酸の定量はバイオテック社の分注機HALCS-1を用いておこなった。具体的には、反応溶液および標準曲線溶液、60 μlに対して溶液Aを42 μl加え、直ちに溶液Bを18 μl加えた。よく混合した後、溶液Cを120 μl加えた。1時間、室温で放置した後、Multiskan JX (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) を用いて630 nmで吸光度を測定した。
【００２６】
verapamil、nicardipine、vinblastineおよびgefitinibを用いて、Ala893Proの遺伝子多型のATPase活性への影響の結果を図1に示す。野性型 (WT) に比較して、Ala893Pro (A893P) の遺伝子多型では、verapamil、nicardipine、gefitinibに対して活性が5倍以上に上昇した一方、vinblastineに対しては1.5倍程度の上昇が認められた。このようにアミノ酸変異の活性への影響は、基質の種類によって大きく異なることが解った。
ABCG2の遺伝子多型 Phe208Ser, Ser248Pro, Phe431Leu, Phe489Leuの機能解析
Phe208Ser,Ser248Pro, Phe431Leu, Phe489Leuの多型を持つABCG2の作製と昆虫細胞での発現
ヒトABCトランスポーターを昆虫細胞に発現させて、その細胞膜を用いて機能解析を行った。まずABCG2のcDNAをベクター (pFastBac1) に組み込んだ。ABCG2遺伝子多型に関しては、NCBIのSNPデータおよび文献データに基づき、部位特異的変異法でABCG2のcDNAにSNPを導入して、同様に昆虫細胞に発現させた。部位特異的変異法で用いたPCRのプライマーと実験条件を表2に示す。
【００２７】
【表２】
【００２８】
ベクターから発現用バクミドを作成した後、昆虫細胞に遺伝子改変ウイルスを感染させ、トランスポーターのタンパク質を発現させた。その方法は以下の通りである。
【００２９】
部位特異的変異法により一塩基変異を導入したABCG2のcDNAをもつpFastBac1ベクターをDH10Bacコンピテントセルに形質転換し、ABCG2のcDNAをバクミドに組み換えた。その後、組み換えバクミドをCellfectin試薬 (Invitrogen Co.) を用いてSf9昆虫細胞に遺伝子導入することにより、ABCG2のcDNAをゲノム中にもつ遺伝子改変ウイルスを得た。Sf9昆虫細胞にこの遺伝子改変ウイルスを感染させ、ABCG2タンパク質を発現させた。
【００３０】
ABCG2タンパク質の発現を確認するために、ABCG2特異的モノクローナル抗体BXP-21 (SIGNET) を用いたウェスタンブロッティングを行った。タンパク質を転写したニトロセルロース膜を0.5%(w/v) スキムミルク含有TTBS (0.05% Tween 20含有TBS) でブロッキングした後、0.5%(w/v) スキムミルク含有TTBSで500倍に希釈したBXP-21に室温で1.5時間浸して抗原抗体反応を行った。ニトロセルロース膜をTTBSで良く洗浄し、0.5%(w/v) スキムミルク含有TTBSで3000倍に希釈した抗マウスIgG抗体に室温で1時間浸して二次抗体反応を行った。ニトロセルロース膜をTTBSで良く洗浄した後、Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plusに浸し、その化学発光をLumino Imaging Analyzer FAS-1000 (TOYOBO Co., Ltd.) で検出した。
ABCG2の野性型およびPhe208Ser,Ser248Pro, Phe431Leu, Phe489Leu多型の輸送活性測定
ABCG2を発現させた昆虫細胞から形質膜を調製し、その膜ベシクルを用いて輸送活性のスクリーニングを行った。高速スクリーニング方法では96ウェル (日本ミリポア社製MultiScreen（商標)） と自動化システム (例えばバイオテック社製EDR384S) を用いてスピード化を図った。ABCG2の基質である[3H]メトトレキセート (MTX) を用いて、Phe208Ser,Ser248Pro (S248P), Phe431Leu (F431L), Phe489Leu (F489L) の遺伝子多型の輸送活性への影響を調べた。
[3H]MTX輸送活性測定の標準的アッセイ系は次のとおりである。
【００３１】
53 μl 250 mMショ糖・10 mM Tris/HEPES (pH7.4) 溶液
30 μl 3.33 mM ATP・33.3 mM クレアチンリン酸・33.3 mM MgCl2
(または 33.3 mM クレアチンリン酸・33.3 mM MgCl2)
5 μl 2 mg/ml クレアチンキナーゼ
2 μl 10 mM [3H]MTX (最終濃度200 μM)
10 μl Sf9細胞膜サンプル (計50 μg タンパク質)
計100 μl
インキュベーションは、37℃で行った。反応開始から20分後、反応混液に、氷冷した250 mMショ糖・2 mM EDTA・10 mM Tris/HEPES (pH7.4) 溶液1 mlを速やかに加えて、反応を停止させた。その溶液を270 μlずつMillipore MultiScreenTMのウェルに注いで、吸引した。そして氷冷した250 mMショ糖・10 mM Tris/HCl(pH7.4) 溶液200 μlで各ウェルを4回洗浄した。細胞膜ベシクルに取り込まれた[3H]MTXを定量するために、各ウェルのフィルターを2 ml液体シンチレーション液 (UltimaGOLD, Packard BioScience) に入れて放射活性を測定した。反応系にATPを加えたときの値から、ATPを加えないときの値を差し引いた値を、ATP依存のABCG2によるMTX輸送活性とした。その結果を図2に示す。いずれの遺伝子多型においても、ABCG2の野性型 (WT) と比較して、MTX輸送活性に顕著な低下が認められた。
一塩基多型の判別
図3に一塩基多型の判別方法の流れを示す。まず、ヒト血液の白血球細胞または口腔内皮細胞から通常の方法でDNAを抽出した。判別すべき一塩基部分を含む領域を増幅し、且つビオチンでラベル化するためにマルチプレックス（多重）PCRを行った。反応条件を図3に示す。PCRによるDNAのビオチンラベル化には、あらかじめ5’端にビオチンがついたプライマーを合成した。そうしてできたPCR産物（2.5 μl）を等量の0.6 M NaOHと混和した。
【００３２】
SNP判別用プローブを直径50 μmのスポット状に結合したガラス基盤上で、そのPCR産物とSNP判別用プローブ（オリゴDNA）とのハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション溶液は、200 mM クエン酸／リン酸緩衝液（pH 6.0）、2%ラウリル硫酸ナトリウム（SDS）、750 mM NaCl、0.1%アジ化ナトリウムを含んでおり、55℃で一晩の間ハイブリダイゼーションを行った。その後、ガラス基盤を1% SDSを含む2 X SSC溶液で洗浄して、余分のPCR産物とハイブリダイゼーション溶液を除去した。そして、0.025% Tween20を含む50 mM Tris/HCl緩衝溶液（pH 7.5）と共にガラス基盤を室温で15分間処理した。
【００３３】
ハイブリダイゼーションしたスポットを可視化するために、ガラス基盤上に結合したSNP判別用プローブとハイブリダイズしたPCR産物に蛍光ラベル化を施した。前述したように、PCR産物はビオチンラベル化されているので、それと強く結合するストレプトアビジンに蛍光ラベル化したもの（Cy5-streptavidin）を用いた。Cy5-streptavidin（2 μg/ml）を含むTNB溶液中とガラス基盤表面を反応させた（室温で30分間）。その後、0.1% SDSを含む2 X SSC溶液で5分間洗浄し、さらに1 X SSC溶液、0.1% SSC溶液でそれぞれ5分間ずつ洗浄した。最後にガラス基盤を室温で乾燥させた。
【００３４】
蛍光測定には、励起波長633 nmを持つヘリウム／ネオン(He/Ne)レーザーを用いて、ガラス基盤上のプローブに結合したPCR産物の量を670 nmで測定した。その結果、図4に示すように、遺伝子多型に応じてスポットの蛍光強度に差が認められた。例えば被検者サンプル1はT型プローブに対して強い蛍光が検出されたので、Phe431 (T型) のホモ接合体であると判定された。一方被検者サンプル2は、T型プローブとC型プローブの両方に対して同等に強い蛍光が検出された。このことにより、被検者サンプル2はPhe431 (T型)とLeu431 (C型) とのヘテロ接合体であると判定された。さらに被検者サンプル3では、C型プローブに対して強い蛍光が検出されたので、Leu431 (C型) のホモ接合体であると判定された。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明は、アミノ酸変異を伴う遺伝子多型の中から、薬物トランスポーター、特にABCB1およびABCG2、の機能に大きく影響を及ぼすものを見出して、その医薬品への影響さらには遺伝子多型の臨床判別する方法を提供する。本発明方法は、遺伝子多型によって薬物の体内動態を予測する上で重要であり、今後各国が取り組むべき「個の医療」（テーラード医療）において、臨床診断技術および創薬に対して大いに有用であると考えられる。またさらに、遺伝子多型の機能スクリーニング方法は、新薬の開発段階において、候補化合物が遺伝子多型によって影響を受けるかどうか、臨床開発の前段階でテストすることができる。そうすることによって、臨床開発および市場での副作用を予見することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】Ala893Pro遺伝子多型のATPase活性への影響を示す図。
【図２】ATP依存のABCG2によるMTX輸送活性を示す図。
【図３】一塩基多型の判別方法の流れを示す図。
【図４】一塩基多型の判別テスト結果を示す図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子多型の検出方法および薬物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トランスポーターは細胞の膜を物質が通過する際に必要な通路を形成し、本来は栄養素等の生体機能維持に必須である物質もしくは体内代謝産物等を、体内に吸収、代謝もしくは排泄するのに重要な役割を果たしている。そして、このようなトランスポーターがこれらの物質もしくは体内代謝産物等と類似の構造を有する薬物をも認識することから、特に輸送基質として薬物を考えた場合に薬物トランスポーターと称されている。一つの薬物トランスポーターが認識する基質の種類は多く、その基質認識部位と類似性がない構造の薬物を輸送することもあり、その薬物選択の機構は不明な点が多い。
【０００３】
このような薬物トランスポーターとしては、ABC（ATP結合部位）トランスポーター、有機イオントランスポーター、ペプチドトランスポーター等が知られており、たとえばABCトランスポーターは、ヒトゲノム解析から、約５０種類のABCトランスポーター遺伝子の存在が予測されている。そして、他の遺伝子と同様にABCトランスポーター遺伝子にも種々の遺伝子多型が存在し、たとえば特定の1個の塩基が他の塩基に置換する一塩基多型（SNP）が代表的なものとして挙げられる。
【０００４】
そして、ABCトランスポーター遺伝子について、これまでの網羅的なSNP解析によってSNPの同定がなされてきており、数多くのSNP情報が提供されている。薬物トランスポーターの遺伝子に変異があって、これらの蛋白質のアミノ酸の置換が起きると、これらの蛋白質の機能が異常になり、機能変化をもたらすことがある。そして、これらの蛋白質の機能が変化した結果、薬の体内動態が異常になり、普通の投与量を投与したにもかかわらず、ある患者では効き過ぎによる副作用が見られることや、薬がほとんど効かないことがある。
【０００５】
このように、患者間での薬剤応答性の差異は、薬物トランスポーター遺伝子の多型や発現量の違いにより、活性が変化し、薬物トランスポーターによる細胞内への薬物の流入および排出の制御に差異が生じることが大きく関与していると考えられる。しかしながら、どのSNP (頻度 1%以上) または遺伝子変異 (頻度1%未満) 等の遺伝子多型が、薬物の体内動態に影響を及ぼすのかは従来必ずしも明らかにされていない。機能変化のデータなくして、これらの遺伝子多型情報だけでは薬物の体内動態を予測することはできず、臨床診断技術および創薬において重要な遺伝子多型を絞り込むことができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明者はアミノ酸変異を伴う遺伝子多型の中から、薬物トランスポーターの機能に影響を及ぼすものを見出し、その医薬品への影響および遺伝子多型の臨床判別する方法について検討し、本発明に到達した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記の課題を解決するために以下の発明を提供する。
（１）被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出することにより、薬物の被検者体内での動態への影響を予測することを特徴とする遺伝子多型の検出方法；
（２）被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出し、多型が検出される場合に薬物の体内動態への影響を受けやすい遺伝性素因を有すると判定し、多型が検出されない場合に薬物の体内動態への影響を受けにくい遺伝性素因を有すると判定することを特徴とする遺伝子多型の検出方法；
（３）被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出し、多型が検出された場合に薬物の被検者体内での動態への影響を予測することを特徴とする遺伝子多型の検出方法；
（４）遺伝子多型とその機能変化に関するデータに基づいて、薬物の体内動態への影響を予測し、薬理効果と副作用のリスクを予見する（３）記載の遺伝子多型の検出方法；
（５）被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出し、多型が検出された場合に薬物トランスポーターの機能もしくは発現量ならびに薬物動態に影響をおよぼす遺伝子多型を該DNA試料で判別することを特徴とする遺伝子多型の検出方法；
（６）遺伝子多型の検出を塩基配列決定法、質量分析法、PCR法もしくはハイブリダイゼーション法により行なう（１）〜（５）のいずれか記載の遺伝子多型の検出方法；
（７）遺伝子多型が一塩基多型である（１）〜（６）のいずれか記載の遺伝子多型の検出方法；
（８）遺伝子多型が、ABCB1のAla893ProならびにABCG2のPhe208Ser、Ser248Pro、Phe431LeuもしくはPhe489Leuである（７）記載の遺伝子多型の検出方法；
（９）薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型を被検薬物と接触させてその相互作用を検出することにより、該遺伝子多型によって影響をうける薬物をスクリーニングすることを特徴とする薬物のスクリーニング方法；
（１０）薬物トランスポーターの機能もしくは発現量および薬物動態が影響をうける薬物をスクリーニングする（９）記載の薬物のスクリーニング方法；
（１１）遺伝子多型の検出を塩基配列決定法、質量分析法、PCR法もしくはハイブリダイゼーション法により行なう（９）もしくは（１０）記載の薬物のスクリーニング方法；
（１２）遺伝子多型が一塩基多型である（９）〜（１１）のいずれか記載の薬物のスクリーニング方法；
（１３）遺伝子多型が、ABCB1のAla893ProならびにABCG2のPhe208Ser、Ser248Pro、 Phe431LeuもしくはPhe489Leuである（１２）記載の薬物のスクリーニング方法；
（１４）薬物トランスポーターの機能もしくは発現量；または薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子の一塩基多型を判別するためのプローブをプレート上に固定化してなる一塩基多型DNAアレイ；
（１５）プローブがオリゴヌクレオチドである（１４）記載の一塩基多型DNAアレイ；ならびに
（１６）プローブがガラススライド上にスポッティングされた後に固定化される（１４）記載の一塩基多型DNAアレイ、
である。
【発明の効果】
【０００８】
薬剤応答性に関連する遺伝子を解明し、最適な薬物療法の実現等を推進すること、即ち薬が効く患者と効かない患者の遺伝子の塩基配列を比較することにより、遺伝子多型と薬の効果・副作用との関連を解明することは極めて重要である。2005年 3月には、FDAは「Guidance for Industry: Pharmacogenomics Data Submissions」と題した正式なガイダンスを公開した。FDAは製薬企業がINDおよびNDA申請する際、用量設定、患者特性、および安全性／有効性を導くために用いたデータとともに、ファーマコゲノミクス (PGx) データを提出するように勧告している。
【０００９】
本発明は、アミノ酸変異を伴う遺伝子多型の中から、薬物トランスポーター、特にABCB1およびABCG2、の機能に大きく影響を及ぼすものを見出して、その医薬品への影響および遺伝子多型の臨床判別する方法を提供する。本発明方法は、遺伝子多型によって薬物の体内動態を予測する上で重要であり、今後各国が取り組むべき「個の医療」（テーラード医療）において、臨床診断技術および創薬に対して大いに有用であると考えられる。またさらに、遺伝子多型の機能スクリーニング方法は、新薬の開発段階において、候補化合物が遺伝子多型によって影響を受けるかどうか、臨床開発の前段階でテストすることができる。そうすることによって、臨床開発および市場での副作用を予見することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の遺伝子多型の検出方法においては、被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出することにより、薬物の被検者体内での動態への影響を予測する。薬物トランスポーター遺伝子多型としては、ABC（ATP結合部位）トランスポーター、有機イオントランスポーター、ペプチドトランスポーター等のSNP等が挙げられる。そして、本発明方法においては、アミノ酸変異を伴う多型の中から、ある薬物に対してその動態に影響をもたらす多型を予め選択して用いることができる。ここで、影響をもたらすかどうかは、トランスポーターの発現量もしくは活性がなくなる、または発現量もしくは活性が５倍以上変化する場合には、薬物体内動態が影響されると判断される。
たとえば、脳 (特に血液脳関門) 、小腸、肝臓、癌等の組織において薬物輸送に関与する主要なトランスポーターであるヒトABCトランスポーターABCB1(P-糖蛋白質、MDR1)およびABCG2(BCRP)に関して、ヒト薬物トランスポーターABCB1 およびABCG2の機能に影響をもたらすと判断されるアミノ酸変異を伴う遺伝子多型としては、ABCB1においてAla893Pro（NCBI dbSNP, cluster ID rs2032582）、ならびにABCG2ではPhe208Ser （NCBI dbSNP, cluster ID rs1061018）Ser248Pro（NCBI dbSNP, cluster ID rs3116448）, Phe431LeuおよびPhe489Leu（Itoda et al., Drug Metab. Pharmacokin. 18: 212-217(2003)およびKobayashi et al. Drug Metab. Dispos. 1: 94-101(2005))であり、広範な薬物に関しその輸送機能に大きな変化をもたらす。
【００１１】
本発明の薬物トランスポーター遺伝子多型は、たとえば一般的な遺伝子工学的手法よって調製しうる。たとえば、ABCトランスポーターABCB1のcDNAをベクター に組み込みABCB1遺伝子多型 に関しては、NCBIのSNPデータに基づき、部位特異的変異法でABCB1のcDNAにSNPを導入して、調製できる。ついで、ベクターから発現用プラスミドを作成した後、宿主細胞に遺伝子改変ウイルスを感染させ、トランスポーターのタンパク質を発現させることができる。得られたタンパク質は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法、たとえば液相クロマトグラフィー等により精製することができる。
【００１２】
被検者のDNA試料の採取は常法によることができ、特に制限されない。
【００１３】
遺伝子多型の検出も、一般的な遺伝子多型検出法を利用して行なうことができ、たとえば塩基配列決定法、質量分析法、PCR法もしくはハイブリダイゼーション法により行なわれる。
【００１４】
さらに、本発明の遺伝子多型の検出方法においては、被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出し、多型が検出される場合に薬物の体内動態への影響を受けやすい遺伝性素因を有すると判定し、多型が検出されない場合に薬物の体内動態への影響を受けにくい遺伝性素因を有すると判定することができる。さらには、被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出し、多型が検出された場合に薬物の被検者体内での動態への影響を予測することができる。この予測に際しては、予め用意した遺伝子多型とその機能変化に関するデータにもとづくことができ、被検者への薬理効果と副作用のリスクを予見することができる。
【００１５】
さらには、本発明の遺伝子多型の検出方法においては、被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出し、多型が検出された場合に薬物トランスポーターの機能もしくは発現量ならびに薬物動態に影響をおよぼす遺伝子多型を該DNA試料で判別することができる。
【００１６】
さらに、本発明の薬物のスクリーニング方法においては、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型を被検薬物と接触させてその相互作用を検出することにより、該遺伝子多型によって影響をうける薬物をスクリーニングする。これにより、薬物トランスポーターの機能もしくは発現量および薬物動態が影響をうける薬物を同定または予見することができる。
【００１７】
以上のように、本発明において得られた遺伝子多型情報は、どの薬物が治療に最も有効であるか、その使用すべき薬物を選択するための情報源となる。それらの遺伝子中に存在する遺伝子多型の中に副作用と相関する多型がある場合にはこれを削除すること、あるいは条件付きで使用することが可能となり、この副作用と有効性の情報から薬物のスクリーニングが可能となる。
【００１８】
本発明の一塩基多型DNAアレイは、薬物トランスポーターの機能もしくは発現量；または薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子の一塩基多型を判別するためのプローブをプレート上に固定化してなる。たとえば、ガラス等のプレート上に多種類のプローブをスポッティング等により整列化し、固定し、その上で標識プローブのハイブリダイゼーションを行い、プローブ上の標識（たとえば蛍光）シグナルを検出する方法を利用して、ハイブリダイゼーションで完全マッチと一塩基ミスマッチを検出する。プローブとしては、たとえばオリゴヌクレオチドが選ばれる。オリゴヌクレオチドは、常法により合成されうる。塩基配列の長さは、好ましくは13塩基〜60塩基、さらに好ましくは18〜30塩基である。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限りこれらの実施例に限定されない。
実施例１
ABCB1遺伝子多型Ala893Proの機能解析
Ala893Proの多型を持つABCB1の作製と昆虫細胞での発現
ヒトABCトランスポーターを、増殖速度が速く、安価で大量培養が可能である昆虫細胞に発現させて、その細胞膜を用いて機能解析を行った。ABCB1蛋白質をSf9昆虫細胞に発現させるために、まずABCB1のcDNAをベクター (pFastBac1) に組み込んだ。ABCB1遺伝子多型 (Ala893Pro) に関しては、NCBIのSNPデータに基づき、部位特異的変異法でABCB1のcDNAにSNPを導入して、同様に昆虫細胞に発現させた。部位特異的変異法で用いたPCRのプライマーと実験条件を表1に示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】
ベクターから発現用バクミドを作成した後、昆虫細胞に遺伝子改変ウイルスを感染させ、トランスポーターのタンパク質を発現させた。その方法は以下の通りである。
【００２２】
まず、ヒト野生型ABCB1 cDNAが挿入された昆虫細胞発現用pFastBac1ベクターを用意し、一塩基変異を導入するための一対のプライマーを用いてPCRを行い、全長を複製した。このプラスミドをDH10Bacコンピテントセルに形質転換し、ABCB1のcDNAをバクミドに組み換えた。その後、組み換えバクミドをCellfectin試薬 (Invitrogen Co.) を用いてSf9昆虫細胞に遺伝子導入することにより、ABCB1のcDNAをゲノム中にもつ遺伝子改変バキュロウイルスを得た。Sf9昆虫細胞にこの遺伝子改変ウイルスを感染させ、ABCB1タンパク質を発現させた。
【００２３】
ABCB1タンパク質の発現を確認するために、抗ABCB1タンパク質モノクローナル抗体C219 (EMD Biosciences, Inc.) を用いたウェスタンブロッティングを行った。Sf9細胞の細胞溶解液を調製した後、7.5%のポリアクリルアミドゲル電気泳動 (25 mA、90分間) を行って、タンパク質を分離し、ニトロセルロース膜 (Amersham Biosciences Co.) に転写した (15 V、70分間)。転写した膜を0.5% (w/v) スキムミルク含有TTBS (0.05% Tween 20含有TBS) でブロッキングした後、TTBSでよく洗浄し、TTBSで100倍に希釈したC219に室温で1.5時間浸して抗原抗体反応を行った。さらにTTBSでよく洗浄し、TTBSで3000倍に希釈した抗マウスIgG抗体に室温で1時間浸して二次抗体反応を行った。ニトロセルロース膜をTTBSでよく洗浄した後、Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer Life Sciences, Inc.) に浸し、その化学発光をLumino Imaging Analyzer FAS-1000 (TOYOBO Co., Ltd.) で検出した。
ABCB1の野性型およびAla893ProのATPase活性測定
ABCトランスポーターであるABCB1はATPを加水分解し、その時のエネルギーを用いて化合物を細胞の外へと運ぶ。この際のATPase活性を測定する事により、試験化合物のABCB1への親和性を知る事が出来る。ATPase活性はATPaseの加水分解によって生じた無機リン酸量を定量し、加水分解によって生じた無機リン酸量を反応時間、用いたタンパク質量で割った値 (nmol Pi/min/mg protein) とした。無機リン酸の定量としてマラカイトグリーンを用いた。これは、モリブデン酸ナトリウムと無機リン酸を酸性下で反応させ、モリブデン酸リンを作り、これが塩基性染料であるマラカイトグリーンと複合体を作ることを利用している。高速化を図るために96ウェルプレートと自動分注機を用いたスクリーニング系を用いた。
【００２４】
ABCB1タンパク質を発現させた昆虫細胞より、細胞形質膜を調製し、その形質膜とABCB1の基質であるverapamil、nicardipine、vinblastine、gefitinibを用いて、Ala893Proの遺伝子多型のATPase活性への影響を調べた。
【００２５】
溶液の組成
反応溶液；50 mM Tris-Mes (pH6.8)
2 mM EGTA
2 mM ウワバイン
2 mM ジチオスレイトール
50 mM 塩化カリウム
5 mM アジ化ナトリウム
溶液A；2 N 塩酸：0.1 M モリブデン酸ナトリウム＝ 4 : 3
溶液B；0.084%(w/v) マラカイトグリーン
1%(w/v) ポリビニルアルコール
溶液C；7.8%(v/v) 硫酸
2 μgの膜画分を10 μlの反応溶液に懸濁した。基質を10 μl加え、37℃、3分間プレ・インキュベートした。そして、4 mM MgATP溶液を20 μl加えて反応を開始した。37℃、30分間インキュベートをした後、5％(v/v) トリクロロ酢酸を20 μl加え、反応を停止した。標準曲線を作成するために、順に0、0.05、0.1、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5 mMリン酸二水素ナトリウムニ水和物を20 μLずつ分注した。さらにdH2O、反応溶液を10 μlずつ、5%(v/v) トリクロロ酢酸を20 μlずつ分注した。無機リン酸の定量はバイオテック社の分注機HALCS-1を用いておこなった。具体的には、反応溶液および標準曲線溶液、60 μlに対して溶液Aを42 μl加え、直ちに溶液Bを18 μl加えた。よく混合した後、溶液Cを120 μl加えた。1時間、室温で放置した後、Multiskan JX (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) を用いて630 nmで吸光度を測定した。
【００２６】
verapamil、nicardipine、vinblastineおよびgefitinibを用いて、Ala893Proの遺伝子多型のATPase活性への影響の結果を図1に示す。野性型 (WT) に比較して、Ala893Pro (A893P) の遺伝子多型では、verapamil、nicardipine、gefitinibに対して活性が5倍以上に上昇した一方、vinblastineに対しては1.5倍程度の上昇が認められた。このようにアミノ酸変異の活性への影響は、基質の種類によって大きく異なることが解った。
ABCG2の遺伝子多型 Phe208Ser, Ser248Pro, Phe431Leu, Phe489Leuの機能解析
Phe208Ser,Ser248Pro, Phe431Leu, Phe489Leuの多型を持つABCG2の作製と昆虫細胞での発現
ヒトABCトランスポーターを昆虫細胞に発現させて、その細胞膜を用いて機能解析を行った。まずABCG2のcDNAをベクター (pFastBac1) に組み込んだ。ABCG2遺伝子多型に関しては、NCBIのSNPデータおよび文献データに基づき、部位特異的変異法でABCG2のcDNAにSNPを導入して、同様に昆虫細胞に発現させた。部位特異的変異法で用いたPCRのプライマーと実験条件を表2に示す。
【００２７】
【表２】
【００２８】
ベクターから発現用バクミドを作成した後、昆虫細胞に遺伝子改変ウイルスを感染させ、トランスポーターのタンパク質を発現させた。その方法は以下の通りである。
【００２９】
部位特異的変異法により一塩基変異を導入したABCG2のcDNAをもつpFastBac1ベクターをDH10Bacコンピテントセルに形質転換し、ABCG2のcDNAをバクミドに組み換えた。その後、組み換えバクミドをCellfectin試薬 (Invitrogen Co.) を用いてSf9昆虫細胞に遺伝子導入することにより、ABCG2のcDNAをゲノム中にもつ遺伝子改変ウイルスを得た。Sf9昆虫細胞にこの遺伝子改変ウイルスを感染させ、ABCG2タンパク質を発現させた。
【００３０】
ABCG2タンパク質の発現を確認するために、ABCG2特異的モノクローナル抗体BXP-21 (SIGNET) を用いたウェスタンブロッティングを行った。タンパク質を転写したニトロセルロース膜を0.5%(w/v) スキムミルク含有TTBS (0.05% Tween 20含有TBS) でブロッキングした後、0.5%(w/v) スキムミルク含有TTBSで500倍に希釈したBXP-21に室温で1.5時間浸して抗原抗体反応を行った。ニトロセルロース膜をTTBSで良く洗浄し、0.5%(w/v) スキムミルク含有TTBSで3000倍に希釈した抗マウスIgG抗体に室温で1時間浸して二次抗体反応を行った。ニトロセルロース膜をTTBSで良く洗浄した後、Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plusに浸し、その化学発光をLumino Imaging Analyzer FAS-1000 (TOYOBO Co., Ltd.) で検出した。
ABCG2の野性型およびPhe208Ser,Ser248Pro, Phe431Leu, Phe489Leu多型の輸送活性測定
ABCG2を発現させた昆虫細胞から形質膜を調製し、その膜ベシクルを用いて輸送活性のスクリーニングを行った。高速スクリーニング方法では96ウェル (日本ミリポア社製MultiScreen（商標)） と自動化システム (例えばバイオテック社製EDR384S) を用いてスピード化を図った。ABCG2の基質である[3H]メトトレキセート (MTX) を用いて、Phe208Ser,Ser248Pro (S248P), Phe431Leu (F431L), Phe489Leu (F489L) の遺伝子多型の輸送活性への影響を調べた。
[3H]MTX輸送活性測定の標準的アッセイ系は次のとおりである。
【００３１】
53 μl 250 mMショ糖・10 mM Tris/HEPES (pH7.4) 溶液
30 μl 3.33 mM ATP・33.3 mM クレアチンリン酸・33.3 mM MgCl2
(または 33.3 mM クレアチンリン酸・33.3 mM MgCl2)
5 μl 2 mg/ml クレアチンキナーゼ
2 μl 10 mM [3H]MTX (最終濃度200 μM)
10 μl Sf9細胞膜サンプル (計50 μg タンパク質)
計100 μl
インキュベーションは、37℃で行った。反応開始から20分後、反応混液に、氷冷した250 mMショ糖・2 mM EDTA・10 mM Tris/HEPES (pH7.4) 溶液1 mlを速やかに加えて、反応を停止させた。その溶液を270 μlずつMillipore MultiScreenTMのウェルに注いで、吸引した。そして氷冷した250 mMショ糖・10 mM Tris/HCl(pH7.4) 溶液200 μlで各ウェルを4回洗浄した。細胞膜ベシクルに取り込まれた[3H]MTXを定量するために、各ウェルのフィルターを2 ml液体シンチレーション液 (UltimaGOLD, Packard BioScience) に入れて放射活性を測定した。反応系にATPを加えたときの値から、ATPを加えないときの値を差し引いた値を、ATP依存のABCG2によるMTX輸送活性とした。その結果を図2に示す。いずれの遺伝子多型においても、ABCG2の野性型 (WT) と比較して、MTX輸送活性に顕著な低下が認められた。
一塩基多型の判別
図3に一塩基多型の判別方法の流れを示す。まず、ヒト血液の白血球細胞または口腔内皮細胞から通常の方法でDNAを抽出した。判別すべき一塩基部分を含む領域を増幅し、且つビオチンでラベル化するためにマルチプレックス（多重）PCRを行った。反応条件を図3に示す。PCRによるDNAのビオチンラベル化には、あらかじめ5’端にビオチンがついたプライマーを合成した。そうしてできたPCR産物（2.5 μl）を等量の0.6 M NaOHと混和した。
【００３２】
SNP判別用プローブを直径50 μmのスポット状に結合したガラス基盤上で、そのPCR産物とSNP判別用プローブ（オリゴDNA）とのハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション溶液は、200 mM クエン酸／リン酸緩衝液（pH 6.0）、2%ラウリル硫酸ナトリウム（SDS）、750 mM NaCl、0.1%アジ化ナトリウムを含んでおり、55℃で一晩の間ハイブリダイゼーションを行った。その後、ガラス基盤を1% SDSを含む2 X SSC溶液で洗浄して、余分のPCR産物とハイブリダイゼーション溶液を除去した。そして、0.025% Tween20を含む50 mM Tris/HCl緩衝溶液（pH 7.5）と共にガラス基盤を室温で15分間処理した。
【００３３】
ハイブリダイゼーションしたスポットを可視化するために、ガラス基盤上に結合したSNP判別用プローブとハイブリダイズしたPCR産物に蛍光ラベル化を施した。前述したように、PCR産物はビオチンラベル化されているので、それと強く結合するストレプトアビジンに蛍光ラベル化したもの（Cy5-streptavidin）を用いた。Cy5-streptavidin（2 μg/ml）を含むTNB溶液中とガラス基盤表面を反応させた（室温で30分間）。その後、0.1% SDSを含む2 X SSC溶液で5分間洗浄し、さらに1 X SSC溶液、0.1% SSC溶液でそれぞれ5分間ずつ洗浄した。最後にガラス基盤を室温で乾燥させた。
【００３４】
蛍光測定には、励起波長633 nmを持つヘリウム／ネオン(He/Ne)レーザーを用いて、ガラス基盤上のプローブに結合したPCR産物の量を670 nmで測定した。その結果、図4に示すように、遺伝子多型に応じてスポットの蛍光強度に差が認められた。例えば被検者サンプル1はT型プローブに対して強い蛍光が検出されたので、Phe431 (T型) のホモ接合体であると判定された。一方被検者サンプル2は、T型プローブとC型プローブの両方に対して同等に強い蛍光が検出された。このことにより、被検者サンプル2はPhe431 (T型)とLeu431 (C型) とのヘテロ接合体であると判定された。さらに被検者サンプル3では、C型プローブに対して強い蛍光が検出されたので、Leu431 (C型) のホモ接合体であると判定された。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明は、アミノ酸変異を伴う遺伝子多型の中から、薬物トランスポーター、特にABCB1およびABCG2、の機能に大きく影響を及ぼすものを見出して、その医薬品への影響さらには遺伝子多型の臨床判別する方法を提供する。本発明方法は、遺伝子多型によって薬物の体内動態を予測する上で重要であり、今後各国が取り組むべき「個の医療」（テーラード医療）において、臨床診断技術および創薬に対して大いに有用であると考えられる。またさらに、遺伝子多型の機能スクリーニング方法は、新薬の開発段階において、候補化合物が遺伝子多型によって影響を受けるかどうか、臨床開発の前段階でテストすることができる。そうすることによって、臨床開発および市場での副作用を予見することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】Ala893Pro遺伝子多型のATPase活性への影響を示す図。
【図２】ATP依存のABCG2によるMTX輸送活性を示す図。
【図３】一塩基多型の判別方法の流れを示す図。
【図４】一塩基多型の判別テスト結果を示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出することにより、薬物の被検者体内での動態への影響を予測することを特徴とする遺伝子多型の検出方法。
【請求項２】
被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出し、多型が検出される場合に薬物の体内動態への影響を受けやすい遺伝性素因を有すると判定し、多型が検出されない場合に薬物の体内動態への影響を受けにくい遺伝性素因を有すると判定することを特徴とする遺伝子多型の検出方法。
【請求項３】
被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出し、多型が検出された場合に薬物の被検者体内での動態への影響を予測することを特徴とする遺伝子多型の検出方法。
【請求項４】
遺伝子多型とその機能変化に関するデータに基づいて、薬物の体内動態への影響を予測し、薬理効果と副作用のリスクを予見する請求項３記載の遺伝子多型の検出方法。
【請求項５】
被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出し、多型が検出された場合に薬物トランスポーターの機能もしくは発現量ならびに薬物動態に影響をおよぼす遺伝子多型を該DNA試料で判別することを特徴とする遺伝子多型の検出方法。
【請求項６】
遺伝子多型の検出を塩基配列決定法、質量分析法、PCR法もしくはハイブリダイゼーション法により行なう請求項１〜５のいずれか記載の遺伝子多型の検出方法。
【請求項７】
遺伝子多型が一塩基多型である請求項１〜６のいずれか記載の遺伝子多型の検出方法。
【請求項８】
遺伝子多型が、ABCB1のAla893ProならびにABCのPhe208Ser、Ser248Pro、Phe431LeuもしくはPhe489Leuである請求項７記載の遺伝子多型の検出方法。
【請求項９】
薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型を被検薬物と接触させてその相互作用を検出することにより、該遺伝子多型によって影響をうける薬物をスクリーニングすることを特徴とする薬物のスクリーニング方法。
【請求項１０】
薬物トランスポーターの機能もしくは発現量および薬物動態が影響をうける薬物をスクリーニングする請求項９記載の薬物のスクリーニング方法。
【請求項１１】
遺伝子多型の検出を塩基配列決定法、質量分析法、PCR法もしくはハイブリダイゼーション法により行なう請求項９もしくは１０記載の薬物のスクリーニング方法。
【請求項１２】
遺伝子多型が一塩基多型である請求項９〜１１のいずれか記載の薬物のスクリーニング方法。
【請求項１３】
遺伝子多型が、ABCB1のAla893ProならびにABCG2のPhe208Ser、Ser248Pro、Phe431LeuもしくはPhe489Leuである請求項１２記載の薬物のスクリーニング方法。
【請求項１４】
薬物トランスポーターの機能もしくは発現量または薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子の一塩基多型を判別するためのプローブをプレート上に固定化してなる一塩基多型DNAアレイ。
【請求項１５】
プローブがオリゴヌクレオチドである請求項１４記載の一塩基多型DNAアレイ。
【請求項１６】
プローブがガラススライド上にスポッティングされた後に固定化される請求項１４記載の一塩基多型DNAアレイ。
【請求項１】
被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出することにより、薬物の被検者体内での動態への影響を予測することを特徴とする遺伝子多型の検出方法。
【請求項２】
被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出し、多型が検出される場合に薬物の体内動態への影響を受けやすい遺伝性素因を有すると判定し、多型が検出されない場合に薬物の体内動態への影響を受けにくい遺伝性素因を有すると判定することを特徴とする遺伝子多型の検出方法。
【請求項３】
被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出し、多型が検出された場合に薬物の被検者体内での動態への影響を予測することを特徴とする遺伝子多型の検出方法。
【請求項４】
遺伝子多型とその機能変化に関するデータに基づいて、薬物の体内動態への影響を予測し、薬理効果と副作用のリスクを予見する請求項３記載の遺伝子多型の検出方法。
【請求項５】
被検者のDNA試料について、薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型の有無を検出し、多型が検出された場合に薬物トランスポーターの機能もしくは発現量ならびに薬物動態に影響をおよぼす遺伝子多型を該DNA試料で判別することを特徴とする遺伝子多型の検出方法。
【請求項６】
遺伝子多型の検出を塩基配列決定法、質量分析法、PCR法もしくはハイブリダイゼーション法により行なう請求項１〜５のいずれか記載の遺伝子多型の検出方法。
【請求項７】
遺伝子多型が一塩基多型である請求項１〜６のいずれか記載の遺伝子多型の検出方法。
【請求項８】
遺伝子多型が、ABCB1のAla893ProならびにABCのPhe208Ser、Ser248Pro、Phe431LeuもしくはPhe489Leuである請求項７記載の遺伝子多型の検出方法。
【請求項９】
薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子多型を被検薬物と接触させてその相互作用を検出することにより、該遺伝子多型によって影響をうける薬物をスクリーニングすることを特徴とする薬物のスクリーニング方法。
【請求項１０】
薬物トランスポーターの機能もしくは発現量および薬物動態が影響をうける薬物をスクリーニングする請求項９記載の薬物のスクリーニング方法。
【請求項１１】
遺伝子多型の検出を塩基配列決定法、質量分析法、PCR法もしくはハイブリダイゼーション法により行なう請求項９もしくは１０記載の薬物のスクリーニング方法。
【請求項１２】
遺伝子多型が一塩基多型である請求項９〜１１のいずれか記載の薬物のスクリーニング方法。
【請求項１３】
遺伝子多型が、ABCB1のAla893ProならびにABCG2のPhe208Ser、Ser248Pro、Phe431LeuもしくはPhe489Leuである請求項１２記載の薬物のスクリーニング方法。
【請求項１４】
薬物トランスポーターの機能もしくは発現量または薬物動態に影響をもたらすアミノ酸変異を伴う薬物トランスポーター遺伝子の一塩基多型を判別するためのプローブをプレート上に固定化してなる一塩基多型DNAアレイ。
【請求項１５】
プローブがオリゴヌクレオチドである請求項１４記載の一塩基多型DNAアレイ。
【請求項１６】
プローブがガラススライド上にスポッティングされた後に固定化される請求項１４記載の一塩基多型DNAアレイ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−６０９６７（Ｐ２００７−６０９６７Ａ）
【公開日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２５００８４（Ｐ２００５−２５００８４）
【出願日】平成１７年８月３０日（２００５．８．３０）
【出願人】（３０４０２１４１７）国立大学法人東京工業大学 (1,821)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月３０日（２００５．８．３０）
【出願人】（３０４０２１４１７）国立大学法人東京工業大学 (1,821)
【Ｆターム（参考）】
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