遺伝子検査方法
【課題】 安価かつ簡便な操作で複数変異領域（ＳＮＰ）の検査が可能な遺伝子検査方法を提供し、臨床現場における遺伝子診断を現実のものとすること。
【解決手段】 検出すべき配列（ＳＮＰ領域）に相補的な配列を含むプローブを表面に固定した支持体に対し、５’末端にアンカー配列を有する試料核酸をハイブリダイズさせる工程と、前記試料核酸を鋳型として前記プローブの相補鎖伸長反応を行う工程と、前記伸長反応で合成された前記プローブ伸長鎖から前記試料核酸を解離させ、除去する工程と、解離した前記プローブ伸長鎖を鋳型として、前記アンカー配列と同じ配列を有するプライマーを用いて、相補鎖伸長反応を行う工程と、前記プライマーの伸長反応によって生じるピロリン酸を生物化学発光により検出することにより、前記試料核酸のＳＮＰ型を判定する。
【解決手段】 検出すべき配列（ＳＮＰ領域）に相補的な配列を含むプローブを表面に固定した支持体に対し、５’末端にアンカー配列を有する試料核酸をハイブリダイズさせる工程と、前記試料核酸を鋳型として前記プローブの相補鎖伸長反応を行う工程と、前記伸長反応で合成された前記プローブ伸長鎖から前記試料核酸を解離させ、除去する工程と、解離した前記プローブ伸長鎖を鋳型として、前記アンカー配列と同じ配列を有するプライマーを用いて、相補鎖伸長反応を行う工程と、前記プライマーの伸長反応によって生じるピロリン酸を生物化学発光により検出することにより、前記試料核酸のＳＮＰ型を判定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子検査技術、特にＤＮＡ中に含まれる遺伝子多型等の検出を目的とした遺伝子検査技術又は遺伝子診断技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトをはじめとする種々のモデル生物のゲノム配列が利用可能となった現在、医療、製薬を始めとする様々な分野で、これを有効に活用するための試みが活発に行われている。その中でも、ゲノム配列中の1塩基置換であるＳＮＰｓ（Single Nucleotide Polymorphisms）は、遺伝子と病気との関連あるいは医薬品感受性との関連を調べるという観点から大規模な解析が進められている。こうした解析から、個々のＳＮＰｓと病気との関連あるいは医薬品感受性との関連が明らかになってくると、個人のＳＮＰｓ情報から病気の診断や医薬品に対する感受性の検査が一般的なものとなり、遺伝子診断といわれる検査の需要が大きくなるものと考えられる。
【０００３】
遺伝子診断では、未知の遺伝子の解析とは異なり、すでに知られた遺伝子やその変異の有無が検査対象であって、低コストで検査できることが望ましく、そのための種々の方法も開発されてきている。また、成人病などのように複数の遺伝子と環境要因の複合によって発症すると考えられる疾患の遺伝子診断では、単一の遺伝子の検査に加えて、複数の遺伝子を検査することが重要となる。従って、複数の遺伝子を簡便かつ低コストで検査できる方法及び装置が求められている。
【０００４】
ＳＮＰｓの検出については種々の方法が提案されている。例えば、ＰＣＲ増幅に際してマーカープローブの分解に伴う蛍光の増加を検出するＴａｑｍａｎアッセイ（非特許文献１参照）、3本鎖ＤＮＡの形成とミスマッチを認識する酵素を組み合わせて消光状態の蛍光標識プローブを分解して蛍光検出するＩｎｖａｄｅｒアッセイ（非特許文献２参照）、変異を含むＤＮＡ鎖が高次構造形成の違いから電気泳動速度に差を生ずることを利用してゲル電気泳動分離して検出するＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphisms）法（非特許文献３参照）、ＤＮＡチップを用いる方法（非特許文献４参照）、カラーコードした微粒子にＤＮＡプローブを固定してこれらを集めてプローブアレイとして用いる方法(非特許文献５参照)等がある。これらの方法は、いずれもレーザを励起光源とした蛍光検出によるものである。
【０００５】
一方、レーザ励起蛍光を用いないＤＮＡの検出法としては、生物化学発光を用いたパイロシーケンシング法（非特許文献６参照）やＢＡＭＰＥＲ法（Bioluminometric Assay with Modified Primer Extension Reaction：非特許文献７参照）が報告されている。
【０００６】
ＢＡＭＰＥＲ法は、発明者らが開発した生物化学発光を用いた簡便で安価なＤＮＡ変異検出法である。この方法では、通常ＤＮＡプローブの３’末端をターゲットＤＮＡの変異部位に一致させておく。一般に、相補鎖合成反応に使用するプライマーの３’末端がターゲットＤＮＡの配列に相補的で、完全にハイブリダイズしていると、相補鎖合成反応は起こるが、相補的でない部分が存在すると、相補鎖合成反応は起こらないか、起こりにくい。すなわち、プライマーの３’末端の一致、不一致、つまりプライマーの３’末端がターゲットＤＮＡに相補的であるか、相補的でないかによって、相補鎖合成反応を制御できることになる。さらに、プライマーの３’末端近傍の塩基種を、ターゲットＤＮＡに相補的な塩基種と異なるものにしておくと、プライマーの３’末端近傍のハイブリダイゼーションは弱くなるため、プライマーの３’末端がターゲットＤＮＡに相補的なときは、相補鎖合成反応が元のプライマーの時とほぼ同等の効率で行われるが、相補的でない場合には相補鎖合成反応はほとんど行われない。ＢＡＭＰＥＲ法では、こうした人工的なミスマッチを３’末端近傍に導入したプライマーを用いて相補鎖合成反応を行い、生成するピロリン酸をＡＴＰに変換し、これにより誘起される生物化学発光を計測して、相補鎖合成反応の有無、即ちターゲットＤＮＡの変異の有無を検出する。
【０００７】
ＢＡＭＰＥＲ法では、相補鎖合成により伸長するＤＮＡ鎖の長さ分だけのピロリン酸が生成するため、原理的に相補鎖合成の際の一塩基伸長で生成するピロリン酸を検出するパイロシーケンス法と比較して２桁程度大きな信号が期待できる。また、ＳＮＰ部位のアレルを正確に識別するために、プローブとして、末端が各アレルに相補的な配列を有する２種類のものを用意して、それぞれを独立に反応させ、発生する生物化学発光量の比較から変異種の有無、それがヘテロかホモかといった判定も行える。
【０００８】
実用的な遺伝子診断手法に要請される事項として、簡便であること、高価な装置を必要としないこと、プロセスが単純であること、複数の検査部位を一括して調べられること、などがある。これまでに開発されたり、使用されたりしている方法の多くは、検査対象ごとにＤＮＡを増幅したり、試料調製を行って測定する方法であるため、複数の測定部位を持つ検査対象では手間と時間と費用がかかるという問題点があった。また、蛍光検出を用いる方法では、蛍光標識されたヌクレオチドあるいはプローブ試薬、及びレーザを搭載した装置が必要になるといった、コスト面での問題があった。こうした要請、問題点への対応として、発明者らは、上記のＢＡＭＰＥＲ法を提案し、良好な結果を得ていた。
【０００９】
しかしながら、ＢＡＭＰＥＲ法でも、測定に先立ってＰＣＲなどで対象となるＤＮＡを増幅してから、磁気ビーズなどを用いて一本鎖ＤＮＡを精製する必要があった。そこで、発明者らはＢＡＭＰＥＲ法を改良して、鋳型となる一本鎖ＤＮＡの精製を行わず、二本鎖ＤＮＡから直接、目的とする配列及び変異に特異的な相補鎖合成反応を行い、生成したピロリン酸を生物化学発光により検出するという方法を開発した（特許文献１参照）。この方法は、試料調製から検査計測までを原理的に一つの容器で行えるため、簡便で安価なＳＮＰｓタイピングを実現できるが、検査ターゲット領域の増幅工程後に、検体中に残存するピロリン酸、増幅用プライマー、ｄＮＴＰなどを酵素によって分解する工程が必要とされる。また、一つ一つの反応は、一つの反応容器内で行えるが、多因子の遺伝子疾患やハプロタイプ解析などで必要となる、複数ターゲット領域の検査を行うためには、複数の反応容器が必要となるといった問題があった。
【００１０】
発明者らは、さらに各ターゲットごとに区画されたサブセル内でＢＡＭＰＥＲ法による化学発光を同時に行なうことで複数ターゲット領域を有する試料を同時解析する方法を開発した（特許文献２参照）。この方法は、対象となるＤＮＡのコピー数を増幅せず相補鎖反応で生じるピロリン酸の量を増幅することで検出感度を高めることにより、ＰＣＲ増幅に伴う副産物の問題も克服している。しかしながら、この方法では、固相上で相補鎖伸長を行うため、基質とプローブとの接触確率が低くなり、相補鎖伸長反応の効率が液相上に比べて落ちるという問題があった。
【００１１】
【特許文献１】特開2003-135098号公報
【特許文献２】特開2003-135097号公報
【非特許文献１】Procedure Natural Academy of Sciences USA 88, p7276-7280 (1991)
【非特許文献２】Nature Biotechnology 17, p292-296 (1999)
【非特許文献３】Genomics 5, p874-879 (1989)
【非特許文献４】Genomic Research 10, p853-860 (2000)
【非特許文献５】Science 287, p451-452 (2000)
【非特許文献６】Analitical Biochemistry 280, p103-110 (2000)
【非特許文献７】Nucleic Acids Research 29, e93 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、従来の遺伝子検査方法の問題点を解決し、より簡便なプロセスと装置を用いて、複数のターゲット領域の同時検査が可能な遺伝子検査方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明では、複数のターゲット領域に対応したプローブを固相表面に固定することにより、検査ターゲット領域の増幅工程で検体中に残存するピロリン酸、増幅用プライマー、ｄＮＴＰの酵素による分解工程を不要とし、複数ターゲット領域の単一デバイスによる同時検出を可能にした。
【００１４】
すなわち、本発明は、検出すべき配列に相補的な配列を含むプローブを表面に固定した支持体に対し、５’末端にアンカー配列を有する試料核酸をハイブリダイズさせる工程と、前記試料核酸を鋳型として前記プローブの相補鎖伸長反応を行う工程と、前記相補鎖伸長反応で合成された前記プローブ伸長鎖から前記試料核酸を解離し、除去する工程と、解離した前記プローブ伸長鎖を鋳型として、前記アンカー配列と同じ配列を有するプライマーを用いて、相補鎖伸長反応を行う工程と、前記プライマーの伸長反応によって生じるピロリン酸を生物化学発光により検出する工程とを含む、遺伝子検査方法に関する。
【００１５】
本発明の方法では、検査対象であるゲノムＤＮＡ等に対し、少なくともその一方の５'端に共通のアンカー配列を有するプライマーを用いて核酸増幅を行うことにより、少なくとも一方の５’末端に共通配列（アンカー配列に対応する配列）を有する試料核酸を得る。
【００１６】
次いで、上記アンカー配列を有する試料核酸を、ＤＮＡポリメラーゼと基質を含む相補鎖伸長用の反応液とともに、検出すべき配列に対応したプローブを固定した前記支持体表面に加え、相補鎖伸長反応を行う。これにより、支持体表面では試料核酸の配列に対応したプローブでのみ相補鎖が合成される。プローブからの相補鎖伸長は、常法に従い温度サイクル下で実施できる。
【００１７】
反応終了後、固体表面を洗浄し、変性剤を加えて支持体表面のプローブ伸長鎖を一本鎖ＤＮＡの状態にする。この洗浄により、検査ターゲット領域の増幅工程で検体中に残存するピロリン酸、増幅用プライマー、ｄＮＴＰも同時に除去される。ここに、前記アンカー配列と同一の配列を有するプライマー、ＤＮＡポリメラーゼと基質を含む相補鎖伸長用の反応液、及び相補鎖伸長反応の際に生成するピロリン酸から生物化学発光を生ぜしめる発光試薬を加える。かくして、生じる生物化学発光を検出することで、特異的相補鎖伸長反応が生じたプローブ固定領域を特定し、試料核酸の配列を特定することができる。
【００１８】
本発明の方法は、前記アンカー配列と同じ配列を有するプライマーを用いた相補鎖伸長を行う工程と、伸長反応によって生じるピロリン酸を生物化学発光により検出する工程とを同時に行うものであってもよい。
【００１９】
本発明の方法では、固定化プローブの伸長反応の鋳型として用いるゲノムＤＮＡの増幅産物として、二本鎖ＤＮＡの代わりに一本鎖ＤＮＡを用いてもよい。この場合、核酸増幅反応に用いるプライマーの一方をビオチン標識し、プライマーからの増幅産物を、ビオチン−アビジン反応によりアビジンを介して担体表面に固定化し、前記増幅産物を一本鎖核酸に変性することにより、一本鎖核酸からなる試料核酸を得る。
【００２０】
ある実施形態において、本発明の遺伝子検査方法は特定の変異部位のタイピングに用いられる。すなわち、前記支持体上に、検出すべき変異部位に予測される配列に対応した各プローブを区別できるように固定し、各プローブ固定領域からの生物化学発光により、前記試料核酸の変異のタイピングを行う。例えば、検出すべき変異が遺伝子多型であれば、当該多型の各アレルに対応したプローブを前記支持体上に固定し、各プローブ固定領域からの生物化学発光により、前記試料核酸の多型のタイピングを行う。
【００２１】
別な実施形態において、本発明の方法は、複数の変異の同時タイピングに用いられる。この場合、前記支持体上には、検出すべき複数の変異部位に予測される配列に対応した各プローブを区別できるように固定し、各プローブ固定領域からの生物化学発光により、前記試料核酸に含まれる複数の変異のタイピングを同時に行う。例えば、検出すべき複数の変異が複数の遺伝子多型であれば、当該複数の多型の各アレルに対応するプローブを同一の支持体上に区別できるように固定し、各プローブ固定領域からの生物化学発光により、前記試料核酸に含まれる複数の多型のタイピングを同時に行う。
【００２２】
上記のタイピングでは、各プローブの３’末端は変異部位（多型部位）に対応するように設計され、前記試料核酸がプローブの３’末端の配列に相補な配列を有する場合のみ特異的なハイブリダイゼーションと相補鎖伸長反応が起きる。
【００２３】
前記プローブには、さらに、その３’末端から２〜４番目にミスマッチを導入してもよい。これにより、プローブと試料核酸とのハイブリダイゼーションの特異性が高まり、検出感度が向上する。
【００２４】
ある態様において、前記変異は一塩基多型である。
好ましくは、前記支持体上において、前記プローブは各プローブ固定領域ごとに仕切りを設けて固定される。例えば、各プローブ固定領域ごとに、高さ１ｍｍ、幅２ｍｍ程度の仕切りを設けることにより、最後の相補鎖伸長反応の際に生成するピロリン酸の拡散による広がりが防止できるため、ピロリン酸からの発光が局在化し、検査精度の向上が実現できる。
【００２５】
本発明の方法において、前記アンカー配列は試料核酸に非特異的な配列であれば特に限定されないが、例えばポリＡ配列等を用いることができる。
【００２６】
本発明の方法において、前記支持体は、前記試料核酸あるいは反応試薬の注入及び排出のための部位を有する容器中に存在することが好ましい。また、生物化学発光を検出する光検出素子が、前記支持体のプローブ固定領域ごとに配置されていることが好ましい。
【００２７】
さらに、前記光検出素子と前記支持体の間には、導光路が配置されていることが好ましく、前記導光路としては、例えば、ロッドレンズ、球形レンズ、光ファイバーロッド等を用いることができる。
【００２８】
一般に、相補鎖伸長反応は固相上の場合に液相上より効率が落ちる。これは、基質とプローブ等の接触確率が低くなるためである。しかしながら、本発明の方法はピロリン酸を生じさせるプライマー伸長反応を、固相側からではなく、液相側から進めるため、伸長反応効率を高めてピロリン酸の生成効率を高めることができる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、複数のターゲット領域（例えば、ＳＮＰ部位）の解析において、ゲノムＤＮＡの増幅から計測までを実質的に１つのデバイスで実現できる。したがって、操作が簡便で検査コストも低廉であり、臨床現場における遺伝子検査が現実のものとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、図面を参照しながら、本発明について詳細に説明する。
【００３１】
１．アンカー配列
図1は、本発明を利用したＳＮＰ検出のプロセスを模式的に示したものである。まず、ヒトの血液試料などから抽出したゲノムＤＮＡ１を出発物質として、ＳＮＰ計測の対象となる複数の遺伝子部位に対応したＰＣＲプライマーセット２、３を用いて、複数の遺伝子部位を同時にＰＣＲ増幅５する。
【００３２】
各プライマーセットは検出対象であるＳＮＰ部位を含む、ゲノム上の約１００〜約１０００塩基長、好ましくは約１５０〜約３００塩基長の核酸断片を増幅するように設計する。また、各プライマーセットの一方３の５’末端には共通のアンカー配列４を付加しておく。これにより、各ＰＣＲ増幅産物６の一方の端には共通の配列４が導入される。前記アンカー配列は、１０〜４０塩基長、好ましくは１５〜２５塩基長の任意の塩基配列からなる、鋳型非特異的な配列であれば特に限定されず、例えばポリＡ配列等を用いることができる。
【００３３】
２．プローブ及び支持体（チップ）
次に、検出すべき配列に相補的な配列を含むＤＮＡプローブを表面に固定した支持体（ここでは、チップ）を用意する。前記支持体上に固定されるＤＮＡプローブは、検出すべき配列（ＳＮＰ等の変異）に相補的な塩基配列を有し、かつ、その３’末端が標的ＳＮＰ位置に一致するように設計されたオリゴヌクレオチドである。前記ＤＮＡプローブには、必要に応じてその３’末端から２〜４塩基目にミスマッチを導入してもよい。なお、ミスマッチの導入とは、鋳型配列とは非相補な塩基あるいは塩基相当物（スペーサー等）を当該プローブ中に挿入することを意味する。本発明において、前記ＤＮＡプローブの長さは特に限定されないが、約１０〜約５０塩基長、特に約２０〜約３０塩基長が好ましい。
【００３４】
好ましくは、前記ＤＮＡプローブは、複数の標的変異（ＳＮＰ）について、その野生型９と変異型１０に対応するプローブと、参照用の何も固定されていないもの１１をそれぞれ一組にして、チップ上の特定の位置に固定する。前記ＤＮＡプローブのチップ上への固定は、公知の方法（例えば、（Nucleic Acids Research 30, e87(2002)等）にしたがい、市販のスポッターを用いて、容易に実施することができる。あるいは、基盤上で当該ＤＮＡプローブを合成してチップを作製してもよい。
【００３５】
前記チップでは、各ＤＮＡプローブ固定領域の周囲に適宜仕切りを設けてもよい。例えば、高さ１ｍｍ、幅２ｍｍの仕切りを設けることにより、最後の相補鎖伸長反応の際に生成するピロリン酸の拡散による広がりが防止できるため、ピロリン酸からの発光が局在化し、検査精度の向上が実現できる。
【００３６】
なお、支持体はチップ（ガラス製、金属製あるいはプラスチック製）に限定されず、メンブレンフィルター、キャピラリー、ビーズ等、ＤＮＡが固定可能な固相であれば、いずれの支持体を用いてもよい。
【００３７】
３．特異的相補鎖伸長反応
ＰＣＲ増幅産物を、ＤＮＡ相補鎖伸長用の耐熱酵素と基質を含む反応溶液７とともに前記チップ８上に滴下し、反応溶液がチップのＤＮＡプローブ領域を覆った状態１２でサーマルサイクル反応１３にかける。このとき、ＰＣＲ増幅産物１４のＳＮＰ位置の配列と相補な３’末端を有するＤＮＡプローブ１５のみが伸長１６する。反応終了後、固体表面を洗浄１７し、アルカリなどの変性剤１８を加えることにより、チップ表面に固定されたＤＮＡプローブ伸長産物と未反応ＤＮＡプローブを、それぞれ一本鎖ＤＮＡ１９の状態にする。この際、ＤＮＡプローブ伸長産物の３’末端にはすべて共通のアンカー配列２０に相補的な配列が導入されている。
【００３８】
４．生物化学発光と検出
次に、前記アンカー配列と同一の塩基配列を有するプライマー、ＤＮＡ相補鎖伸長用の耐熱酵素、基質、及び発光試薬を含む反応溶液２１でチップのＤＮＡ固定領域を覆う。こうして、チップ上の伸長反応生成物を鋳型とした相補鎖伸長反応２２と、それにより生成するピロリン酸を基質とする発光反応を同時に行う。なお、反応溶液２１中には、拡散したピロリン酸の検出を避けるためにアピラーゼを添加しておいてもよい。
【００３９】
アンカー配列が導入されたＤＮＡプローブが固定された領域では、相補鎖伸長反応によってピロリン酸が生成する。このピロリン酸をルシフェリン−ルシフェラーゼにより生物化学発光２３として検出する。すなわち、ピロリン酸をピロリン酸ジホスホキナーゼあるいはＡＴＰスルフリラーゼを用いてＡＴＰに変換する。変換したＡＴＰとルシフェリンをルシフェラーゼにより酸化的に反応させ、オキシルシフェリン、ピロリン酸、及びその他の一連の物質が生成させる。この生成した励起状態の酸化ルシフェリンが基底状態に戻るとき、５３０ｎｍ近傍の発光を生じるので、この発光を発光位置識別能を有する光検出器で計測し、ゲノムＤＮＡ中のＳＮＰの型を判定する。
【００４０】
本発明の遺伝子検査方法は、単純なＤＮＡ存在の有無はもとより、上記したＳＮＰを始めとするＤＮＡ中の変異の検出に広く適用される。また、特定の塩基配列を有するＤＮＡの存在の有無の検査、あるいは検体中のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの分布を計測することによる遺伝子発現プロファイル解析などにも適用できる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４２】
実施例１：
ヒトゲノムＤＮＡを出発物質とする複数遺伝子部位の同時ＰＣＲは、Multiplex PCR Kit （QIAGEN社製品）のプロトコルをベースに以下の手順で進めた。まず、TE Buffer (Tris HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0)に、図2に示す9組の遺伝子特異的配列を有するプライマーセット計18種類のプライマー（配列番号１〜１８）を最終濃度2 μMになるよう希釈した。アンカー配列については任意の配列を用いることができるが、検出対象であるゲノム配列に対して非特異的な配列を選択する必要がある。本実施例においては、２０塩基からなるポリＡ配列をアンカー配列として図２に示されるプライマー２の５’末端に導入した。
【００４３】
次に、96ウェルPCRプレート中に、QIAGEN Multiplex PCR kitの Master Mix 20 μl, Q solution 4 μl, 上記プライマーMix 2 μl, 滅菌水11 μl, 匿名ボランティアの血液から抽出されたヒトゲノムＤＮＡ3 μlを加え、ピペッターでよく混和した。さらに、サーマルサイクラーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。（９５℃ １５分間後、９４℃ ３０秒間→５７℃ ９０秒間→７２℃ ９０秒間を４０サイクル、その後７２℃ １０分間を行って４℃に下げる。）PCR産物 １μlを使って電気泳動を行い、9種類の各Multiplex PCR産物濃度及び長さを確認した。
【００４４】
次に、プローブＤＮＡを固定するチップとしてガラス基板を用い、このガラス基板表面にプローブＤＮＡを固定した。なお、プローブＤＮＡ固定には様々な方法が利用できるが、本実施例ではガラスビーズにシランカップリング剤の一つである3−アミノプロピルトリメトキシシランでアミノ基を導入し、このアミノ基導入ビーズにN−（11−マレイミドウンデカノキシロキシ）スクシイミドでマレイミド基を導入したあとに５’末端チオール修飾のオリゴＤＮＡプローブを固定する方法（Nucleic Acids Research 30, e87 (2002)）を利用した。固定した１０組のＳＮＰ識別用のプローブ配列（配列番号１９〜３８）を図３に示した。各ＳＮＰには２つのアレルが存在するため、各アレル（メジャーアレルとマイナーアレル）に対応した１０組のプローブセット（合計２０）を準備した。
【００４５】
固定化ＤＮＡプローブの伸長反応では、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅産物に、TaqDNAポリメラーゼ(0.05ユニット/μL)、MgCl2(0.15mM)、dNTP(0.125mM)を添加し、９４℃で１０秒間、５０℃で１０秒間、７２℃で２０秒間のサイクルを５回繰り返した。
【００４６】
最後のアンカー配列からの相補鎖伸長反応と生成するピロリン酸の発光反応は、上記アンカー配列の相補鎖からなるＤＮＡプライマーに、TaqDNAポリメラーゼ、MgCl2、dNTPからなる上記伸長反応試薬、及び発光試薬（Nucleic Acids Research 29, e93 (2001)に記載のルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応用試薬）を用いて行った。得られた発光パターンの一例を図４に示す。本実施例では、チップ底面からの発光を、結像レンズ２４を介して、ＣＣＤカメラ（C3077-70、浜松フォトニクス）２５で計測した。
【００４７】
なお、固定化プローブの伸長反応の鋳型として用いるゲノムＤＮＡの増幅産物としては、上記の二本鎖ＤＮＡの代わりに一本鎖ＤＮＡを用いてもよい。この場合には、図２に示したプライマーセットのうち、アンカー配列が付いていないプライマーの5’末端にビオチンを標識しておく。そして、上記と同様の反応条件でＰＣＲ反応を行い、生成した増幅産物をストレプトアビジン標識セファロース(Amersham Biosciences社)と反応させ、増幅産物を上記セファロース上にトラップする。これに、0.2MのNaClからなる変性溶液を加え、溶液中に遊離してくる、アンカー配列付きの一本鎖ＤＮＡを回収する。これを中和したものを用いて、固定化ＤＮＡプローブの伸長反応を行う。固定化ＤＮＡプローブへの一本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーションは、適当なハイブリダイゼーション溶液下で、４２℃、３０分程度行えばよい。ハイブリダイゼーション反応後、チップ表面を滅菌水などで洗浄する。伸長反応は、上記の二本鎖ＤＮＡで用いた反応液と同じ組成の反応液を加えて、５５℃、１０分間程度行えばよい。
【００４８】
実施例２：
本発明の第二の実施例を図５を用いて説明する。本実施例は、本発明の実用化に適した発光計測装置に関するものである。ここでは、実施例１で示した１０個のＳＮＰ部位を計測するために、各３箇所からなる３０箇所の検出サイト２６からなるチップ２７を作製した。チップはガラス基板で、各サイトは直径１ｍｍの円形で、個々にそれぞれＤＮＡプローブ２８が固定化されている。各スポット間の距離は１．５ｍｍで、これが５行６列に配置されている。３０箇所の発光サイトからの発光をチップ底面から検出する。計測のための検出器としては、複数のフォトダイオードアレイをシリコン基板上に形成したものを用いた。各フォトダイオード２９の配置は、上記チップの検出サイトの配置と同じにした。
【００４９】
すなわち、直径１ｍｍのフォトダイオードが、１．５ｍｍ間隔で、５行６列の配置をもつ。こうしたフォトダイオードアレイセンサ３０は、特開2003-329681にしたがって作製することができる。チップの下面には発光のクロストークを避けるために、３０箇所の直径１ｍｍの発光サイトの部分のみ透明なシート３１密着し、さらに直径２ｍｍのガラス円柱からなるロッドレンズ３２のアレイ３３を介してフォトダイオードアレイを配置した。結果として、本実施例においても、図４と同様な発光パターンが得られた。なお、ロッドレンズの代わりに、球形レンズや光ファイバーアレイを用いても発光のクロストークを低減できる。
【００５０】
実施例３：
本発明の第三の実施例を図６を用いて説明する。本実施例は、本発明の実用化に適したチップデバイスに関するものである。実施例２で示したディメンジョンで配置したチップ領域を覆うようなチップデバイス３４を構成し、試薬類を注入、排出するポート３５、３６を設けた。このチップデバイス３４にゲノムＤＮＡからの同時増幅産物と相補鎖伸長反応溶液を導入し、実施例１と同様の温度サイクルをかけ、チップ上のＤＮＡプローブの選択的伸長反応を行った。伸長反応終了後、排出ポートから反応溶液を排出し、さらに注入口から洗浄液、アルカリ溶液を順次、注入、排出し、チップ上の伸長ＤＮＡ産物を一本鎖化した。
【００５１】
次いで、実施例１と同様の反応液を加え、アンカー配列からの相補鎖伸長反応と生成するピロリン酸を利用した発光反応を行った。発光は、実施例２で示した構成の検出装置に本チップデバイス３４を載せることにより検出した。かくして、１つのチップデバイス３４を用いて、１０ＳＮＰ、合計３０サイトのＳＮＰ検査が一度に実現できた。
【００５２】
上記デバイスでは、各ＤＮＡプローブ固定サイトの周囲に仕切りを設けてもよい。例えば、高さ１ｍｍ、幅２ｍｍの仕切りを設けることにより、最後の相補鎖伸長反応の際に生成するピロリン酸の拡散による広がりが防止できるため、ピロリン酸からの発光の局在化が容易になり、検査精度の向上が実現できる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
ライフサイエンス分野では、ＳＮＰの大量解析が盛んに行われており、個々のＳＮＰと疾病との関連、あるいは薬効との関連が急速に判明しつつある。その結果、近い将来、個々人のＳＮＰを計測することにより、疾病の罹患リスク判定や、個人にあった薬剤の提供といった、テーラーメイド医療が現実のものとなると考えられる。テーラーメイド医療における遺伝子診断では、現在主流のＳＮＰの大規模タイピングとは異なり、各個人ごとに問題となる数十箇所のＳＮＰを安価かつ簡便に計測する方法、装置が求められる。本発明の遺伝子検査方法は、こうしたテーラーメイド医療における遺伝子診断に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００５４】
配列番号１〜１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
配列番号１９〜３８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プローブ）
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、本発明のプロセスを説明する模式図である。
【図２】図２は、本発明の実施例で用いたＰＣＲプライマーセットの例を示す。
【図３】図３は、本発明の実施例で用いたＳＮＰ識別用プローブの配列を示す。
【図４】図４は、本発明で得られた発光パターンの例を示す。
【図５】図５は、本発明の検出装置の構成図である。
【図６】図６は、本発明のチップデバイスの構成図である。
【符号の説明】
【００５６】
１：ゲノムＤＮＡ
２，３：ＰＣＲプライマーセット
４：アンカー配列
５：ＰＣＲ増幅
６：ＰＣＲ増幅産物
７：反応溶液
８：チップ
９：メジャーアレル用プローブ
１０：マイナーアレル用プローブ
１１：参照用プローブ
１２：反応溶液がチップのＤＮＡプローブ領域を覆ったもの
１３：サーマルサイクル反応
１４：ゲノムＤＮＡ増幅産物
１５：ＤＮＡプローブ
１６：伸長
１７：洗浄
１８：変性剤
１９：一本鎖ＤＮＡ
２０：アンカー配列
２１：反応溶液
２２：相補鎖伸長反応
２３：生物化学発光
２４：結像レンズ
２５：ＣＣＤカメラ
２６：検出サイト
２７：チップ
２８：ＤＮＡプローブ
２９：フォトダイオード
３０：フォトダイオードアレイセンサ
３１：シート
３２：ロッドレンズ
３３：ロッドレンズアレイ
３４：チップデバイス
３５：注入ポート
３６：排出ポート
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子検査技術、特にＤＮＡ中に含まれる遺伝子多型等の検出を目的とした遺伝子検査技術又は遺伝子診断技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトをはじめとする種々のモデル生物のゲノム配列が利用可能となった現在、医療、製薬を始めとする様々な分野で、これを有効に活用するための試みが活発に行われている。その中でも、ゲノム配列中の1塩基置換であるＳＮＰｓ（Single Nucleotide Polymorphisms）は、遺伝子と病気との関連あるいは医薬品感受性との関連を調べるという観点から大規模な解析が進められている。こうした解析から、個々のＳＮＰｓと病気との関連あるいは医薬品感受性との関連が明らかになってくると、個人のＳＮＰｓ情報から病気の診断や医薬品に対する感受性の検査が一般的なものとなり、遺伝子診断といわれる検査の需要が大きくなるものと考えられる。
【０００３】
遺伝子診断では、未知の遺伝子の解析とは異なり、すでに知られた遺伝子やその変異の有無が検査対象であって、低コストで検査できることが望ましく、そのための種々の方法も開発されてきている。また、成人病などのように複数の遺伝子と環境要因の複合によって発症すると考えられる疾患の遺伝子診断では、単一の遺伝子の検査に加えて、複数の遺伝子を検査することが重要となる。従って、複数の遺伝子を簡便かつ低コストで検査できる方法及び装置が求められている。
【０００４】
ＳＮＰｓの検出については種々の方法が提案されている。例えば、ＰＣＲ増幅に際してマーカープローブの分解に伴う蛍光の増加を検出するＴａｑｍａｎアッセイ（非特許文献１参照）、3本鎖ＤＮＡの形成とミスマッチを認識する酵素を組み合わせて消光状態の蛍光標識プローブを分解して蛍光検出するＩｎｖａｄｅｒアッセイ（非特許文献２参照）、変異を含むＤＮＡ鎖が高次構造形成の違いから電気泳動速度に差を生ずることを利用してゲル電気泳動分離して検出するＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphisms）法（非特許文献３参照）、ＤＮＡチップを用いる方法（非特許文献４参照）、カラーコードした微粒子にＤＮＡプローブを固定してこれらを集めてプローブアレイとして用いる方法(非特許文献５参照)等がある。これらの方法は、いずれもレーザを励起光源とした蛍光検出によるものである。
【０００５】
一方、レーザ励起蛍光を用いないＤＮＡの検出法としては、生物化学発光を用いたパイロシーケンシング法（非特許文献６参照）やＢＡＭＰＥＲ法（Bioluminometric Assay with Modified Primer Extension Reaction：非特許文献７参照）が報告されている。
【０００６】
ＢＡＭＰＥＲ法は、発明者らが開発した生物化学発光を用いた簡便で安価なＤＮＡ変異検出法である。この方法では、通常ＤＮＡプローブの３’末端をターゲットＤＮＡの変異部位に一致させておく。一般に、相補鎖合成反応に使用するプライマーの３’末端がターゲットＤＮＡの配列に相補的で、完全にハイブリダイズしていると、相補鎖合成反応は起こるが、相補的でない部分が存在すると、相補鎖合成反応は起こらないか、起こりにくい。すなわち、プライマーの３’末端の一致、不一致、つまりプライマーの３’末端がターゲットＤＮＡに相補的であるか、相補的でないかによって、相補鎖合成反応を制御できることになる。さらに、プライマーの３’末端近傍の塩基種を、ターゲットＤＮＡに相補的な塩基種と異なるものにしておくと、プライマーの３’末端近傍のハイブリダイゼーションは弱くなるため、プライマーの３’末端がターゲットＤＮＡに相補的なときは、相補鎖合成反応が元のプライマーの時とほぼ同等の効率で行われるが、相補的でない場合には相補鎖合成反応はほとんど行われない。ＢＡＭＰＥＲ法では、こうした人工的なミスマッチを３’末端近傍に導入したプライマーを用いて相補鎖合成反応を行い、生成するピロリン酸をＡＴＰに変換し、これにより誘起される生物化学発光を計測して、相補鎖合成反応の有無、即ちターゲットＤＮＡの変異の有無を検出する。
【０００７】
ＢＡＭＰＥＲ法では、相補鎖合成により伸長するＤＮＡ鎖の長さ分だけのピロリン酸が生成するため、原理的に相補鎖合成の際の一塩基伸長で生成するピロリン酸を検出するパイロシーケンス法と比較して２桁程度大きな信号が期待できる。また、ＳＮＰ部位のアレルを正確に識別するために、プローブとして、末端が各アレルに相補的な配列を有する２種類のものを用意して、それぞれを独立に反応させ、発生する生物化学発光量の比較から変異種の有無、それがヘテロかホモかといった判定も行える。
【０００８】
実用的な遺伝子診断手法に要請される事項として、簡便であること、高価な装置を必要としないこと、プロセスが単純であること、複数の検査部位を一括して調べられること、などがある。これまでに開発されたり、使用されたりしている方法の多くは、検査対象ごとにＤＮＡを増幅したり、試料調製を行って測定する方法であるため、複数の測定部位を持つ検査対象では手間と時間と費用がかかるという問題点があった。また、蛍光検出を用いる方法では、蛍光標識されたヌクレオチドあるいはプローブ試薬、及びレーザを搭載した装置が必要になるといった、コスト面での問題があった。こうした要請、問題点への対応として、発明者らは、上記のＢＡＭＰＥＲ法を提案し、良好な結果を得ていた。
【０００９】
しかしながら、ＢＡＭＰＥＲ法でも、測定に先立ってＰＣＲなどで対象となるＤＮＡを増幅してから、磁気ビーズなどを用いて一本鎖ＤＮＡを精製する必要があった。そこで、発明者らはＢＡＭＰＥＲ法を改良して、鋳型となる一本鎖ＤＮＡの精製を行わず、二本鎖ＤＮＡから直接、目的とする配列及び変異に特異的な相補鎖合成反応を行い、生成したピロリン酸を生物化学発光により検出するという方法を開発した（特許文献１参照）。この方法は、試料調製から検査計測までを原理的に一つの容器で行えるため、簡便で安価なＳＮＰｓタイピングを実現できるが、検査ターゲット領域の増幅工程後に、検体中に残存するピロリン酸、増幅用プライマー、ｄＮＴＰなどを酵素によって分解する工程が必要とされる。また、一つ一つの反応は、一つの反応容器内で行えるが、多因子の遺伝子疾患やハプロタイプ解析などで必要となる、複数ターゲット領域の検査を行うためには、複数の反応容器が必要となるといった問題があった。
【００１０】
発明者らは、さらに各ターゲットごとに区画されたサブセル内でＢＡＭＰＥＲ法による化学発光を同時に行なうことで複数ターゲット領域を有する試料を同時解析する方法を開発した（特許文献２参照）。この方法は、対象となるＤＮＡのコピー数を増幅せず相補鎖反応で生じるピロリン酸の量を増幅することで検出感度を高めることにより、ＰＣＲ増幅に伴う副産物の問題も克服している。しかしながら、この方法では、固相上で相補鎖伸長を行うため、基質とプローブとの接触確率が低くなり、相補鎖伸長反応の効率が液相上に比べて落ちるという問題があった。
【００１１】
【特許文献１】特開2003-135098号公報
【特許文献２】特開2003-135097号公報
【非特許文献１】Procedure Natural Academy of Sciences USA 88, p7276-7280 (1991)
【非特許文献２】Nature Biotechnology 17, p292-296 (1999)
【非特許文献３】Genomics 5, p874-879 (1989)
【非特許文献４】Genomic Research 10, p853-860 (2000)
【非特許文献５】Science 287, p451-452 (2000)
【非特許文献６】Analitical Biochemistry 280, p103-110 (2000)
【非特許文献７】Nucleic Acids Research 29, e93 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、従来の遺伝子検査方法の問題点を解決し、より簡便なプロセスと装置を用いて、複数のターゲット領域の同時検査が可能な遺伝子検査方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明では、複数のターゲット領域に対応したプローブを固相表面に固定することにより、検査ターゲット領域の増幅工程で検体中に残存するピロリン酸、増幅用プライマー、ｄＮＴＰの酵素による分解工程を不要とし、複数ターゲット領域の単一デバイスによる同時検出を可能にした。
【００１４】
すなわち、本発明は、検出すべき配列に相補的な配列を含むプローブを表面に固定した支持体に対し、５’末端にアンカー配列を有する試料核酸をハイブリダイズさせる工程と、前記試料核酸を鋳型として前記プローブの相補鎖伸長反応を行う工程と、前記相補鎖伸長反応で合成された前記プローブ伸長鎖から前記試料核酸を解離し、除去する工程と、解離した前記プローブ伸長鎖を鋳型として、前記アンカー配列と同じ配列を有するプライマーを用いて、相補鎖伸長反応を行う工程と、前記プライマーの伸長反応によって生じるピロリン酸を生物化学発光により検出する工程とを含む、遺伝子検査方法に関する。
【００１５】
本発明の方法では、検査対象であるゲノムＤＮＡ等に対し、少なくともその一方の５'端に共通のアンカー配列を有するプライマーを用いて核酸増幅を行うことにより、少なくとも一方の５’末端に共通配列（アンカー配列に対応する配列）を有する試料核酸を得る。
【００１６】
次いで、上記アンカー配列を有する試料核酸を、ＤＮＡポリメラーゼと基質を含む相補鎖伸長用の反応液とともに、検出すべき配列に対応したプローブを固定した前記支持体表面に加え、相補鎖伸長反応を行う。これにより、支持体表面では試料核酸の配列に対応したプローブでのみ相補鎖が合成される。プローブからの相補鎖伸長は、常法に従い温度サイクル下で実施できる。
【００１７】
反応終了後、固体表面を洗浄し、変性剤を加えて支持体表面のプローブ伸長鎖を一本鎖ＤＮＡの状態にする。この洗浄により、検査ターゲット領域の増幅工程で検体中に残存するピロリン酸、増幅用プライマー、ｄＮＴＰも同時に除去される。ここに、前記アンカー配列と同一の配列を有するプライマー、ＤＮＡポリメラーゼと基質を含む相補鎖伸長用の反応液、及び相補鎖伸長反応の際に生成するピロリン酸から生物化学発光を生ぜしめる発光試薬を加える。かくして、生じる生物化学発光を検出することで、特異的相補鎖伸長反応が生じたプローブ固定領域を特定し、試料核酸の配列を特定することができる。
【００１８】
本発明の方法は、前記アンカー配列と同じ配列を有するプライマーを用いた相補鎖伸長を行う工程と、伸長反応によって生じるピロリン酸を生物化学発光により検出する工程とを同時に行うものであってもよい。
【００１９】
本発明の方法では、固定化プローブの伸長反応の鋳型として用いるゲノムＤＮＡの増幅産物として、二本鎖ＤＮＡの代わりに一本鎖ＤＮＡを用いてもよい。この場合、核酸増幅反応に用いるプライマーの一方をビオチン標識し、プライマーからの増幅産物を、ビオチン−アビジン反応によりアビジンを介して担体表面に固定化し、前記増幅産物を一本鎖核酸に変性することにより、一本鎖核酸からなる試料核酸を得る。
【００２０】
ある実施形態において、本発明の遺伝子検査方法は特定の変異部位のタイピングに用いられる。すなわち、前記支持体上に、検出すべき変異部位に予測される配列に対応した各プローブを区別できるように固定し、各プローブ固定領域からの生物化学発光により、前記試料核酸の変異のタイピングを行う。例えば、検出すべき変異が遺伝子多型であれば、当該多型の各アレルに対応したプローブを前記支持体上に固定し、各プローブ固定領域からの生物化学発光により、前記試料核酸の多型のタイピングを行う。
【００２１】
別な実施形態において、本発明の方法は、複数の変異の同時タイピングに用いられる。この場合、前記支持体上には、検出すべき複数の変異部位に予測される配列に対応した各プローブを区別できるように固定し、各プローブ固定領域からの生物化学発光により、前記試料核酸に含まれる複数の変異のタイピングを同時に行う。例えば、検出すべき複数の変異が複数の遺伝子多型であれば、当該複数の多型の各アレルに対応するプローブを同一の支持体上に区別できるように固定し、各プローブ固定領域からの生物化学発光により、前記試料核酸に含まれる複数の多型のタイピングを同時に行う。
【００２２】
上記のタイピングでは、各プローブの３’末端は変異部位（多型部位）に対応するように設計され、前記試料核酸がプローブの３’末端の配列に相補な配列を有する場合のみ特異的なハイブリダイゼーションと相補鎖伸長反応が起きる。
【００２３】
前記プローブには、さらに、その３’末端から２〜４番目にミスマッチを導入してもよい。これにより、プローブと試料核酸とのハイブリダイゼーションの特異性が高まり、検出感度が向上する。
【００２４】
ある態様において、前記変異は一塩基多型である。
好ましくは、前記支持体上において、前記プローブは各プローブ固定領域ごとに仕切りを設けて固定される。例えば、各プローブ固定領域ごとに、高さ１ｍｍ、幅２ｍｍ程度の仕切りを設けることにより、最後の相補鎖伸長反応の際に生成するピロリン酸の拡散による広がりが防止できるため、ピロリン酸からの発光が局在化し、検査精度の向上が実現できる。
【００２５】
本発明の方法において、前記アンカー配列は試料核酸に非特異的な配列であれば特に限定されないが、例えばポリＡ配列等を用いることができる。
【００２６】
本発明の方法において、前記支持体は、前記試料核酸あるいは反応試薬の注入及び排出のための部位を有する容器中に存在することが好ましい。また、生物化学発光を検出する光検出素子が、前記支持体のプローブ固定領域ごとに配置されていることが好ましい。
【００２７】
さらに、前記光検出素子と前記支持体の間には、導光路が配置されていることが好ましく、前記導光路としては、例えば、ロッドレンズ、球形レンズ、光ファイバーロッド等を用いることができる。
【００２８】
一般に、相補鎖伸長反応は固相上の場合に液相上より効率が落ちる。これは、基質とプローブ等の接触確率が低くなるためである。しかしながら、本発明の方法はピロリン酸を生じさせるプライマー伸長反応を、固相側からではなく、液相側から進めるため、伸長反応効率を高めてピロリン酸の生成効率を高めることができる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、複数のターゲット領域（例えば、ＳＮＰ部位）の解析において、ゲノムＤＮＡの増幅から計測までを実質的に１つのデバイスで実現できる。したがって、操作が簡便で検査コストも低廉であり、臨床現場における遺伝子検査が現実のものとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、図面を参照しながら、本発明について詳細に説明する。
【００３１】
１．アンカー配列
図1は、本発明を利用したＳＮＰ検出のプロセスを模式的に示したものである。まず、ヒトの血液試料などから抽出したゲノムＤＮＡ１を出発物質として、ＳＮＰ計測の対象となる複数の遺伝子部位に対応したＰＣＲプライマーセット２、３を用いて、複数の遺伝子部位を同時にＰＣＲ増幅５する。
【００３２】
各プライマーセットは検出対象であるＳＮＰ部位を含む、ゲノム上の約１００〜約１０００塩基長、好ましくは約１５０〜約３００塩基長の核酸断片を増幅するように設計する。また、各プライマーセットの一方３の５’末端には共通のアンカー配列４を付加しておく。これにより、各ＰＣＲ増幅産物６の一方の端には共通の配列４が導入される。前記アンカー配列は、１０〜４０塩基長、好ましくは１５〜２５塩基長の任意の塩基配列からなる、鋳型非特異的な配列であれば特に限定されず、例えばポリＡ配列等を用いることができる。
【００３３】
２．プローブ及び支持体（チップ）
次に、検出すべき配列に相補的な配列を含むＤＮＡプローブを表面に固定した支持体（ここでは、チップ）を用意する。前記支持体上に固定されるＤＮＡプローブは、検出すべき配列（ＳＮＰ等の変異）に相補的な塩基配列を有し、かつ、その３’末端が標的ＳＮＰ位置に一致するように設計されたオリゴヌクレオチドである。前記ＤＮＡプローブには、必要に応じてその３’末端から２〜４塩基目にミスマッチを導入してもよい。なお、ミスマッチの導入とは、鋳型配列とは非相補な塩基あるいは塩基相当物（スペーサー等）を当該プローブ中に挿入することを意味する。本発明において、前記ＤＮＡプローブの長さは特に限定されないが、約１０〜約５０塩基長、特に約２０〜約３０塩基長が好ましい。
【００３４】
好ましくは、前記ＤＮＡプローブは、複数の標的変異（ＳＮＰ）について、その野生型９と変異型１０に対応するプローブと、参照用の何も固定されていないもの１１をそれぞれ一組にして、チップ上の特定の位置に固定する。前記ＤＮＡプローブのチップ上への固定は、公知の方法（例えば、（Nucleic Acids Research 30, e87(2002)等）にしたがい、市販のスポッターを用いて、容易に実施することができる。あるいは、基盤上で当該ＤＮＡプローブを合成してチップを作製してもよい。
【００３５】
前記チップでは、各ＤＮＡプローブ固定領域の周囲に適宜仕切りを設けてもよい。例えば、高さ１ｍｍ、幅２ｍｍの仕切りを設けることにより、最後の相補鎖伸長反応の際に生成するピロリン酸の拡散による広がりが防止できるため、ピロリン酸からの発光が局在化し、検査精度の向上が実現できる。
【００３６】
なお、支持体はチップ（ガラス製、金属製あるいはプラスチック製）に限定されず、メンブレンフィルター、キャピラリー、ビーズ等、ＤＮＡが固定可能な固相であれば、いずれの支持体を用いてもよい。
【００３７】
３．特異的相補鎖伸長反応
ＰＣＲ増幅産物を、ＤＮＡ相補鎖伸長用の耐熱酵素と基質を含む反応溶液７とともに前記チップ８上に滴下し、反応溶液がチップのＤＮＡプローブ領域を覆った状態１２でサーマルサイクル反応１３にかける。このとき、ＰＣＲ増幅産物１４のＳＮＰ位置の配列と相補な３’末端を有するＤＮＡプローブ１５のみが伸長１６する。反応終了後、固体表面を洗浄１７し、アルカリなどの変性剤１８を加えることにより、チップ表面に固定されたＤＮＡプローブ伸長産物と未反応ＤＮＡプローブを、それぞれ一本鎖ＤＮＡ１９の状態にする。この際、ＤＮＡプローブ伸長産物の３’末端にはすべて共通のアンカー配列２０に相補的な配列が導入されている。
【００３８】
４．生物化学発光と検出
次に、前記アンカー配列と同一の塩基配列を有するプライマー、ＤＮＡ相補鎖伸長用の耐熱酵素、基質、及び発光試薬を含む反応溶液２１でチップのＤＮＡ固定領域を覆う。こうして、チップ上の伸長反応生成物を鋳型とした相補鎖伸長反応２２と、それにより生成するピロリン酸を基質とする発光反応を同時に行う。なお、反応溶液２１中には、拡散したピロリン酸の検出を避けるためにアピラーゼを添加しておいてもよい。
【００３９】
アンカー配列が導入されたＤＮＡプローブが固定された領域では、相補鎖伸長反応によってピロリン酸が生成する。このピロリン酸をルシフェリン−ルシフェラーゼにより生物化学発光２３として検出する。すなわち、ピロリン酸をピロリン酸ジホスホキナーゼあるいはＡＴＰスルフリラーゼを用いてＡＴＰに変換する。変換したＡＴＰとルシフェリンをルシフェラーゼにより酸化的に反応させ、オキシルシフェリン、ピロリン酸、及びその他の一連の物質が生成させる。この生成した励起状態の酸化ルシフェリンが基底状態に戻るとき、５３０ｎｍ近傍の発光を生じるので、この発光を発光位置識別能を有する光検出器で計測し、ゲノムＤＮＡ中のＳＮＰの型を判定する。
【００４０】
本発明の遺伝子検査方法は、単純なＤＮＡ存在の有無はもとより、上記したＳＮＰを始めとするＤＮＡ中の変異の検出に広く適用される。また、特定の塩基配列を有するＤＮＡの存在の有無の検査、あるいは検体中のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの分布を計測することによる遺伝子発現プロファイル解析などにも適用できる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４２】
実施例１：
ヒトゲノムＤＮＡを出発物質とする複数遺伝子部位の同時ＰＣＲは、Multiplex PCR Kit （QIAGEN社製品）のプロトコルをベースに以下の手順で進めた。まず、TE Buffer (Tris HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0)に、図2に示す9組の遺伝子特異的配列を有するプライマーセット計18種類のプライマー（配列番号１〜１８）を最終濃度2 μMになるよう希釈した。アンカー配列については任意の配列を用いることができるが、検出対象であるゲノム配列に対して非特異的な配列を選択する必要がある。本実施例においては、２０塩基からなるポリＡ配列をアンカー配列として図２に示されるプライマー２の５’末端に導入した。
【００４３】
次に、96ウェルPCRプレート中に、QIAGEN Multiplex PCR kitの Master Mix 20 μl, Q solution 4 μl, 上記プライマーMix 2 μl, 滅菌水11 μl, 匿名ボランティアの血液から抽出されたヒトゲノムＤＮＡ3 μlを加え、ピペッターでよく混和した。さらに、サーマルサイクラーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。（９５℃ １５分間後、９４℃ ３０秒間→５７℃ ９０秒間→７２℃ ９０秒間を４０サイクル、その後７２℃ １０分間を行って４℃に下げる。）PCR産物 １μlを使って電気泳動を行い、9種類の各Multiplex PCR産物濃度及び長さを確認した。
【００４４】
次に、プローブＤＮＡを固定するチップとしてガラス基板を用い、このガラス基板表面にプローブＤＮＡを固定した。なお、プローブＤＮＡ固定には様々な方法が利用できるが、本実施例ではガラスビーズにシランカップリング剤の一つである3−アミノプロピルトリメトキシシランでアミノ基を導入し、このアミノ基導入ビーズにN−（11−マレイミドウンデカノキシロキシ）スクシイミドでマレイミド基を導入したあとに５’末端チオール修飾のオリゴＤＮＡプローブを固定する方法（Nucleic Acids Research 30, e87 (2002)）を利用した。固定した１０組のＳＮＰ識別用のプローブ配列（配列番号１９〜３８）を図３に示した。各ＳＮＰには２つのアレルが存在するため、各アレル（メジャーアレルとマイナーアレル）に対応した１０組のプローブセット（合計２０）を準備した。
【００４５】
固定化ＤＮＡプローブの伸長反応では、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅産物に、TaqDNAポリメラーゼ(0.05ユニット/μL)、MgCl2(0.15mM)、dNTP(0.125mM)を添加し、９４℃で１０秒間、５０℃で１０秒間、７２℃で２０秒間のサイクルを５回繰り返した。
【００４６】
最後のアンカー配列からの相補鎖伸長反応と生成するピロリン酸の発光反応は、上記アンカー配列の相補鎖からなるＤＮＡプライマーに、TaqDNAポリメラーゼ、MgCl2、dNTPからなる上記伸長反応試薬、及び発光試薬（Nucleic Acids Research 29, e93 (2001)に記載のルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応用試薬）を用いて行った。得られた発光パターンの一例を図４に示す。本実施例では、チップ底面からの発光を、結像レンズ２４を介して、ＣＣＤカメラ（C3077-70、浜松フォトニクス）２５で計測した。
【００４７】
なお、固定化プローブの伸長反応の鋳型として用いるゲノムＤＮＡの増幅産物としては、上記の二本鎖ＤＮＡの代わりに一本鎖ＤＮＡを用いてもよい。この場合には、図２に示したプライマーセットのうち、アンカー配列が付いていないプライマーの5’末端にビオチンを標識しておく。そして、上記と同様の反応条件でＰＣＲ反応を行い、生成した増幅産物をストレプトアビジン標識セファロース(Amersham Biosciences社)と反応させ、増幅産物を上記セファロース上にトラップする。これに、0.2MのNaClからなる変性溶液を加え、溶液中に遊離してくる、アンカー配列付きの一本鎖ＤＮＡを回収する。これを中和したものを用いて、固定化ＤＮＡプローブの伸長反応を行う。固定化ＤＮＡプローブへの一本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーションは、適当なハイブリダイゼーション溶液下で、４２℃、３０分程度行えばよい。ハイブリダイゼーション反応後、チップ表面を滅菌水などで洗浄する。伸長反応は、上記の二本鎖ＤＮＡで用いた反応液と同じ組成の反応液を加えて、５５℃、１０分間程度行えばよい。
【００４８】
実施例２：
本発明の第二の実施例を図５を用いて説明する。本実施例は、本発明の実用化に適した発光計測装置に関するものである。ここでは、実施例１で示した１０個のＳＮＰ部位を計測するために、各３箇所からなる３０箇所の検出サイト２６からなるチップ２７を作製した。チップはガラス基板で、各サイトは直径１ｍｍの円形で、個々にそれぞれＤＮＡプローブ２８が固定化されている。各スポット間の距離は１．５ｍｍで、これが５行６列に配置されている。３０箇所の発光サイトからの発光をチップ底面から検出する。計測のための検出器としては、複数のフォトダイオードアレイをシリコン基板上に形成したものを用いた。各フォトダイオード２９の配置は、上記チップの検出サイトの配置と同じにした。
【００４９】
すなわち、直径１ｍｍのフォトダイオードが、１．５ｍｍ間隔で、５行６列の配置をもつ。こうしたフォトダイオードアレイセンサ３０は、特開2003-329681にしたがって作製することができる。チップの下面には発光のクロストークを避けるために、３０箇所の直径１ｍｍの発光サイトの部分のみ透明なシート３１密着し、さらに直径２ｍｍのガラス円柱からなるロッドレンズ３２のアレイ３３を介してフォトダイオードアレイを配置した。結果として、本実施例においても、図４と同様な発光パターンが得られた。なお、ロッドレンズの代わりに、球形レンズや光ファイバーアレイを用いても発光のクロストークを低減できる。
【００５０】
実施例３：
本発明の第三の実施例を図６を用いて説明する。本実施例は、本発明の実用化に適したチップデバイスに関するものである。実施例２で示したディメンジョンで配置したチップ領域を覆うようなチップデバイス３４を構成し、試薬類を注入、排出するポート３５、３６を設けた。このチップデバイス３４にゲノムＤＮＡからの同時増幅産物と相補鎖伸長反応溶液を導入し、実施例１と同様の温度サイクルをかけ、チップ上のＤＮＡプローブの選択的伸長反応を行った。伸長反応終了後、排出ポートから反応溶液を排出し、さらに注入口から洗浄液、アルカリ溶液を順次、注入、排出し、チップ上の伸長ＤＮＡ産物を一本鎖化した。
【００５１】
次いで、実施例１と同様の反応液を加え、アンカー配列からの相補鎖伸長反応と生成するピロリン酸を利用した発光反応を行った。発光は、実施例２で示した構成の検出装置に本チップデバイス３４を載せることにより検出した。かくして、１つのチップデバイス３４を用いて、１０ＳＮＰ、合計３０サイトのＳＮＰ検査が一度に実現できた。
【００５２】
上記デバイスでは、各ＤＮＡプローブ固定サイトの周囲に仕切りを設けてもよい。例えば、高さ１ｍｍ、幅２ｍｍの仕切りを設けることにより、最後の相補鎖伸長反応の際に生成するピロリン酸の拡散による広がりが防止できるため、ピロリン酸からの発光の局在化が容易になり、検査精度の向上が実現できる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
ライフサイエンス分野では、ＳＮＰの大量解析が盛んに行われており、個々のＳＮＰと疾病との関連、あるいは薬効との関連が急速に判明しつつある。その結果、近い将来、個々人のＳＮＰを計測することにより、疾病の罹患リスク判定や、個人にあった薬剤の提供といった、テーラーメイド医療が現実のものとなると考えられる。テーラーメイド医療における遺伝子診断では、現在主流のＳＮＰの大規模タイピングとは異なり、各個人ごとに問題となる数十箇所のＳＮＰを安価かつ簡便に計測する方法、装置が求められる。本発明の遺伝子検査方法は、こうしたテーラーメイド医療における遺伝子診断に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００５４】
配列番号１〜１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
配列番号１９〜３８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プローブ）
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、本発明のプロセスを説明する模式図である。
【図２】図２は、本発明の実施例で用いたＰＣＲプライマーセットの例を示す。
【図３】図３は、本発明の実施例で用いたＳＮＰ識別用プローブの配列を示す。
【図４】図４は、本発明で得られた発光パターンの例を示す。
【図５】図５は、本発明の検出装置の構成図である。
【図６】図６は、本発明のチップデバイスの構成図である。
【符号の説明】
【００５６】
１：ゲノムＤＮＡ
２，３：ＰＣＲプライマーセット
４：アンカー配列
５：ＰＣＲ増幅
６：ＰＣＲ増幅産物
７：反応溶液
８：チップ
９：メジャーアレル用プローブ
１０：マイナーアレル用プローブ
１１：参照用プローブ
１２：反応溶液がチップのＤＮＡプローブ領域を覆ったもの
１３：サーマルサイクル反応
１４：ゲノムＤＮＡ増幅産物
１５：ＤＮＡプローブ
１６：伸長
１７：洗浄
１８：変性剤
１９：一本鎖ＤＮＡ
２０：アンカー配列
２１：反応溶液
２２：相補鎖伸長反応
２３：生物化学発光
２４：結像レンズ
２５：ＣＣＤカメラ
２６：検出サイト
２７：チップ
２８：ＤＮＡプローブ
２９：フォトダイオード
３０：フォトダイオードアレイセンサ
３１：シート
３２：ロッドレンズ
３３：ロッドレンズアレイ
３４：チップデバイス
３５：注入ポート
３６：排出ポート
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出すべき配列に相補的な配列を含むプローブを表面に固定した支持体に対し、５’末端にアンカー配列を有する試料核酸をハイブリダイズさせる工程と、
前記試料核酸を鋳型として前記プローブの相補鎖伸長反応を行う工程と、
前記相補鎖伸長反応で合成された前記プローブ伸長鎖から前記試料核酸を解離し、除去する工程と、
解離した前記プローブ伸長鎖を鋳型として、前記アンカー配列と同じ配列を有するプライマーを用いて、相補鎖伸長反応を行う工程と、
前記プライマーの伸長反応によって生じるピロリン酸を生物化学発光により検出する工程とを含む、遺伝子検査方法。
【請求項２】
前記アンカー配列と同じ配列を有するプライマーを用いた相補鎖伸長を行う工程と、伸長反応によって生じるピロリン酸を生物化学発光により検出する工程を同時に行うことを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子検査方法。
【請求項３】
前記５’末端にアンカー配列を有する試料核酸が、前記アンカー配列を５’末端に含むプライマーを用いた核酸増幅反応によって得られることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子検査方法。
【請求項４】
前記試料核酸が二本鎖核酸であって、前記プローブ伸長反応を温度サイクル下で行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
【請求項５】
前記核酸増幅反応に用いるプライマーの一方がビオチン標識されていて、ビオチン、アビジン反応によってアビジンが表面に固定された担体に増幅産物を固定化する工程と、上記増幅産物を一本鎖核酸に変性する工程により、一本鎖核酸からなる試料核酸を得ることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
【請求項６】
検出すべき配列が変異部位であって、当該変異部位に予測される配列に対応した各プローブをそれぞれ前記支持体上に区別できるように固定し、各プローブ固定領域からの生物化学発光により、前記試料核酸の変異のタイピングを行うことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
【請求項７】
検出すべき複数の変異部位について、当該複数の変異部位に予測される配列に対応した各プローブをそれぞれ同一の支持体上に区別できるように固定し、各プローブ固定領域からの生物化学発光により、前記試料核酸に含まれる複数の変異のタイピングを同時に行うことを特徴とする、請求項６に記載の遺伝子検査方法。
【請求項８】
前記プローブの３’末端が変異部位に対応するように設計されていることを特徴とする、請求項６又は７に記載の遺伝子検査方法。
【請求項９】
前記プローブが、さらに３’末端から２〜４番目にミスマッチを含むことを特徴とする、請求項８に記載の遺伝子検査方法。
【請求項１０】
前記変異が一塩基多型であることを特徴とする、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記支持体上において、前記プローブが各プローブ固定領域ごとに仕切りを設けて固定されていることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
【請求項１２】
前記アンカー配列がポリＡ配列であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
【請求項１３】
前記支持体が前記試料核酸あるいは反応試薬の注入及び排出のための部位を有する容器中に存在することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
【請求項１４】
生物化学発光を検出する光検出素子が、前記支持体のプローブ固定領域ごとに配置されていることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
【請求項１５】
前記光検出素子と前記支持体の間に、導光路が配置されていることを特徴とする、請求項１４に記載の遺伝子検査方法。
【請求項１６】
前記導光路がロッドレンズ、球形レンズ、光ファイバーロッドのいずれかであることを特徴とする、請求項１４又は１５に記載の遺伝子検査方法。
【請求項１】
検出すべき配列に相補的な配列を含むプローブを表面に固定した支持体に対し、５’末端にアンカー配列を有する試料核酸をハイブリダイズさせる工程と、
前記試料核酸を鋳型として前記プローブの相補鎖伸長反応を行う工程と、
前記相補鎖伸長反応で合成された前記プローブ伸長鎖から前記試料核酸を解離し、除去する工程と、
解離した前記プローブ伸長鎖を鋳型として、前記アンカー配列と同じ配列を有するプライマーを用いて、相補鎖伸長反応を行う工程と、
前記プライマーの伸長反応によって生じるピロリン酸を生物化学発光により検出する工程とを含む、遺伝子検査方法。
【請求項２】
前記アンカー配列と同じ配列を有するプライマーを用いた相補鎖伸長を行う工程と、伸長反応によって生じるピロリン酸を生物化学発光により検出する工程を同時に行うことを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子検査方法。
【請求項３】
前記５’末端にアンカー配列を有する試料核酸が、前記アンカー配列を５’末端に含むプライマーを用いた核酸増幅反応によって得られることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子検査方法。
【請求項４】
前記試料核酸が二本鎖核酸であって、前記プローブ伸長反応を温度サイクル下で行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
【請求項５】
前記核酸増幅反応に用いるプライマーの一方がビオチン標識されていて、ビオチン、アビジン反応によってアビジンが表面に固定された担体に増幅産物を固定化する工程と、上記増幅産物を一本鎖核酸に変性する工程により、一本鎖核酸からなる試料核酸を得ることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
【請求項６】
検出すべき配列が変異部位であって、当該変異部位に予測される配列に対応した各プローブをそれぞれ前記支持体上に区別できるように固定し、各プローブ固定領域からの生物化学発光により、前記試料核酸の変異のタイピングを行うことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
【請求項７】
検出すべき複数の変異部位について、当該複数の変異部位に予測される配列に対応した各プローブをそれぞれ同一の支持体上に区別できるように固定し、各プローブ固定領域からの生物化学発光により、前記試料核酸に含まれる複数の変異のタイピングを同時に行うことを特徴とする、請求項６に記載の遺伝子検査方法。
【請求項８】
前記プローブの３’末端が変異部位に対応するように設計されていることを特徴とする、請求項６又は７に記載の遺伝子検査方法。
【請求項９】
前記プローブが、さらに３’末端から２〜４番目にミスマッチを含むことを特徴とする、請求項８に記載の遺伝子検査方法。
【請求項１０】
前記変異が一塩基多型であることを特徴とする、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記支持体上において、前記プローブが各プローブ固定領域ごとに仕切りを設けて固定されていることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
【請求項１２】
前記アンカー配列がポリＡ配列であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
【請求項１３】
前記支持体が前記試料核酸あるいは反応試薬の注入及び排出のための部位を有する容器中に存在することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
【請求項１４】
生物化学発光を検出する光検出素子が、前記支持体のプローブ固定領域ごとに配置されていることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の遺伝子検査方法。
【請求項１５】
前記光検出素子と前記支持体の間に、導光路が配置されていることを特徴とする、請求項１４に記載の遺伝子検査方法。
【請求項１６】
前記導光路がロッドレンズ、球形レンズ、光ファイバーロッドのいずれかであることを特徴とする、請求項１４又は１５に記載の遺伝子検査方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−６２７４（Ｐ２００６−６２７４Ａ）
【公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−１９１７８１（Ｐ２００４−１９１７８１）
【出願日】平成１６年６月２９日（２００４．６．２９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１５年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構（再）委託研究、産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月２９日（２００４．６．２９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１５年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構（再）委託研究、産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
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