遺伝子発現の標的調節
本発明は、特定の核酸配列を標的とするように設計されたｓｎｏＲＮＡ分子またはｓｎｏＲＮＡ様分子または断片を用いて遺伝子発現を調節する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の核酸配列を標的とするように設計されたｓｎｏＲＮＡ分子またはｓｎｏＲＮＡ様分子または断片を用いて遺伝子発現を調節する方法に関する。
【０００２】
また、本発明は、遺伝子発現の標的調節に用いる修飾ｓｎｏＲＮＡ分子、ならびに修飾ｓｎｏＲＮＡ様分子および断片に関する。
【背景技術】
【０００３】
核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）はあらゆる真核細胞に存在する核小体ＲＮＡのファミリーを含む。ｓｎｏＲＮＡは核、特に核小体に集中し、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の修飾において機能し、あるいはリボソームサブユニット合成時にｒＲＮＡのプロセシングに関与する。ｓｎｏＲＮＡの２つの主要なクラス、ボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡおよびボックスＨ／ＡＣＡ ｓｎｏＲＮＡがあり、これらはそれぞれ２’−Ｏ−リボースメチル化、シュードリジン修飾（ｐｓｕｅｄｏｕｒｉｄｉｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に関与している（非特許文献３，１および２の総説）。
【０００４】
ｓｎｏＲＮＡは生体内においてＲＮＡ−タンパク質複合体（ｓｎｏＲＮＰ）として機能し、修飾部位をｒＲＮＡ上の特定の配列に対して（ボックスＣ／ＤおよびボックスＨ／ＡＣＡ ｓｎｏＲＮＡの場合）、またはシャペロンとして新生ｒＲＮＡ前駆体の成熟を補助する（例えば、Ｕ３ ｓｎｏＲＮＡ）ために、ＲＮＡ部分はｒＲＮＡ前駆体と塩基対を形成するガイドＲＮＡとして機能する。
【０００５】
ボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡは、ＮＯＰ５６，ＮＯＰ５８，ＴＩＰ４８，ＴＩＰ４９，１５．５Ｋおよび特異的な２−Ｏ−メチラーゼ活性を有する、高度に保存されたタンパク質フィブリラリンを含む一群のボックスＣ／Ｄタンパク質に対する結合部位として機能する、このサブファミリーにおける一般的なＲＮＡモチーフにちなんで名付けられている。ステムＩＩおよびボックスＤ領域のすぐ５’側のボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡの領域は、ガイドＲＮＡ領域と相補的なｒＲＮＡ配列内の所望のリボース残基の２’−ＯＨ位にメチル基を付加するために、フィブリラリン２’−Ｏ−メチラーゼを誘導するｒＲＮＡ上の特定の部位と相補的な「ガイド」配列を含む。同様の機能が酵母から哺乳動物細胞まで働くことが示されている。保存配列要素のため、ヒトボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡファミリーのメンバーを予測し、且つコンピュータ分析を通じてｒＲＮＡ上のそれらの推定２’−Ｏ−メチル化標的部位を予測するために、ゲノムＤＮＡ配列情報を用いることが可能である。しかし、これまでのところ、ヒトの場合にこれらの種のすべてが直接の実験により同定または実証されているわけではない。
【０００６】
ｒＲＮＡの修飾に加え、一部のボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡに対して他の２つの機能が提唱されている。第一に、いくつかのファミリーメンバーが、核内ｍＲＮＡ前駆体スプライシング機構のサブユニットである核内低分子ＲＮＡを含む他の非リボソームＲＮＡにおける２’−Ｏ−リボース基のメチル化を指定すると考えられている。これは基本的にｒＲＮＡに見られるものと同じ修飾反応であるが、これらが含むガイドＲＮＡ配列により、異なるＲＮＡ基質に向けられる。第二に、ボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡファミリーの１メンバー（ＨＢＩＩ−５２）（非特許文献５）は、スプライス部位の選択の変化を引き起こし得る代替スプライシング因子として作用し、セロトニン受容体２Ｃをコードする６エクソン神経細胞特異的転写物におけるエクソン５に作用することが報告されている。この場合、関与する機構は不明であり、ＨＢＩＩ−５２ ｓｎｏＲＮＡがｒＲＮＡの修飾にも関与しているか、または核小体に局在しているのかということも明らかではない。
【０００７】
遺伝子発現を制御できるということは多年にわたり研究されており、様々な技法が公知であって、そのすべてが利点と不利点とを有する。例えば、ＲＮＡｉ法は当技術分野において周知である。「ＲＮＡｉ」とは、標的ＲＮＡの領域と同一であってその分解をもたらす二本鎖ＲＮＡによって開始される、動物および植物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す（例えば、ＷＯ９９３２６１９，ＷＯ０１２９０５８およびＴｕｓｃｈｌ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５（２００１）を参照されたい）。しかし、ＲＮＡｉ法に関連する問題点は、特に、化学的手段を用いて分子を合成しなければならない際のコストである。更に、遺伝的手法を用いてＲＮＡｉ分子を作製する場合、分子を適切に生成することが困難であり得る。また、同じまたは異なる標的配列を標的とするために２つ以上のＲＮＡｉ分子を生成することは、前述の問題点を増大させるだけである。ＲＮＡｉに関する問題点は、特に、更なる遺伝子の不要な「オフターゲット」ノックダウンを生じさせることなく、標的遺伝子の高効率ノックダウンを達成する際にも生じ得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔ．Ｋｉｓｓ，Ｃｅｌｌ １０９，１４５（２００２）
【非特許文献２】Ｔ．Ｋｉｓｓら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ．７１，４０７−１７（２００６）
【非特許文献３】Ｆ−Ｍ．Ｂｏｉｓｖｅｒｔら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８，５７４−５８５（２００７）
【非特許文献４】Ａ．Ｋ．Ｌ．，Ｌｅｕｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７６，５５３−５６９（２００３）
【非特許文献５】Ｓ．ＫｉｓｈｏｒｅおよびＳ．Ｓｔａｍｍ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１１，２３０（２００６）
【非特許文献６】ＪＳ．Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ，１２，１−１１（２００２）
【非特許文献７】ＪＳ．Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ，４３３，７７−８３（２００５）
【非特許文献８】ＹＷ．Ｌａｍら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１７，７４９−６０（２００７）
【非特許文献９】ＸＤ．Ｚｈｏｕら、Ａｉ ｚｈｅｎｇ ４，３４１−５（２００２）
【非特許文献１０】Ｌ．Ｔｒｉｎｋｌｅ−Ｍｕｌｃａｈｙら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７２，６７９−９２（２００６）
【非特許文献１１】Ａ．Ｋ．Ｌ．，Ｌｅｕｎｇら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６６，７８７−８００（２００４）
【非特許文献１２】Ｇ．Ｓ．Ｐａｌｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５（８），ｅ６０（２００７）
【非特許文献１３】Ｄ．Ｈ．Ｍａｔｈｅｗｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（１９），７２８７−９２（２００４）
【非特許文献１４】Ｐ．Ｄｅ Ｒｉｊｋら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １９（２），２９９−３００（２００３）
【非特許文献１５】Ｌ．Ｔｒｉｎｋｌｅ−Ｍｕｌｃａｈｙら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７２，６７９−９２（２００６）
【非特許文献１６】Ｋ．Ｌ．Ｌｅｕｎｇら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６６，７８７−８００（２００４）
【非特許文献１７】Ｌ．Ｌｅｓｔｒａｄｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４，Ｄ１５８−１６２（２００６）
【非特許文献１８】Ｍａｄｅｎ，Ｂ．Ｅ．Ｈ．Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃ．Ａｃ．Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９，２４１−３０３（１９９０）
【非特許文献１９】Ｌｅｓｔｒａｄｅ，Ｌ．およびＷｅｂｅｒ，Ｗ．Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３４，Ｄ１５８−１６２（２００６）
【非特許文献２０】Ｍ．Ｚｕｋｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１３），３４０６−１５，（２００３）
【非特許文献２０】Ｄ．Ｈ．Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｊ．Ｓａｂｉｎａ，Ｍ．ＺｕｋｅｒおよびＤ．Ｈ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８８，９１１−９４０（１９９９）
【非特許文献２１】Ｋｅｎｔ，Ｗ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１２（６），９９６−１００６（２００２）
【非特許文献２２】Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６，２９９−３１１（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、遺伝子サイレンシングまたは発現の調節の更なるまたは代替の方法が望ましいであろう。本発明の目的は、少なくとも１つの前述の不利点を取り除き、且つ／或いは軽減することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、本発明によるｓｎｏＲＮＡ研究および、修飾ｓｎｏＲＮＡが形成されるように、ｓｎｏＲＮＡ配列の一部が標的特異的核酸配列に置換され得、それが細胞またはその断片に加えられると、標的特異的核酸配列を含む遺伝子の発現を調節することができるという確認試験に部分的に基づく。
【００１１】
第一の態様では、標的核酸の発現を調節する方法が提供され、その方法は、核酸をｓｎｏＲＮＡおよび／またはその断片が標的核酸の一部とハイブリダイズすることができる条件下にてｓｎｏＲＮＡと接触させるステップを含み、ｓｎｏＲＮＡまたはその断片の核酸の一部とのハイブリダイゼーションは、標的核酸の発現および／または機能を調節し、或いはその調節を引き起こす。ｓｎｏＲＮＡは天然ｓｎｏＲＮＡ分子でよく、または以下に更に述べられる修飾ｓｎｏＲＮＡ分子でよい。
【００１２】
標的核酸の発現を調節するのに用いる修飾ｓｎｏＲＮＡ配列も提供され、修飾ｓｎｏＲＮＡ配列は、標的核酸の一部とハイブリダイズし、且つ核酸の発現を調節するための、標的核酸の一部と実質的に相補的な核酸配列を含む。このような修飾ｓｎｏＲＮＡ分子がＨＢＩＩ−１８０Ｃ分子のような当技術分野において公知の天然ｓｎｏＲＮＡ分子と同一ではないことが理解されねばならない。一般的に、このような修飾ｓｎｏＲＮＡ分子は下述のように天然ｓｎｏＲＮＡ分子に基づくが、標的核酸の一部とハイブリダイズし、且つその発現を調節するため、特異的に選択されてｓｎｏＲＮＡ分子に導入される核酸の一部を含む。
【００１３】
本発明者らは、本発明によるｓｎｏＲＮＡ分子が、標的ＲＮＡまたはタンパク質の発現／機能を下方制御または低減することができることを認めた。理論にとらわれることを所望するわけではないが、標的配列と特異的にハイブリダイズすることができる配列を含むｓｎｏＲＮＡ分子の断片が標的ＲＮＡの発現／機能を調節する作用を有し得るように、修飾ｓｎｏＲＮＡが細胞内でプロセシングされ得ることがあり得るが、発現が特定の遺伝子座におけるＤＮＡへの結合を通じて調節され得ることもあり得る。このような配列は、本明細書で述べられる天然および修飾ｓｎｏＲＮＡに存在する配列と正確にまたは高度の特異性で対応し得、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列のような標的核酸配列の一部と実質的に相補的であり、或いは配列の塩基組成およびＧ／Ｃ含量に依存し、例えば、２〜１０ヌクレオチド長短い場合もある。原則的に、相補領域は、相補的塩基対合の公知の原理による標的ＲＮＡへの特異的結合を供するのに十分な長さおよび配列である。
【００１４】
本発明のｓｎｏＲＮＡ分子は、いわゆるボックスＣ／Ｄ−ｓｎｏＲＮＡまたはボックスＨ／ＡＣＡ−ｓｎｏＲＮＡに基づき得る。好ましいｓｎｏＲＮＡはボックスＣ／Ｄ−ｓｎｏＲＮＡに基づく。
【００１５】
本明細書で用いられるように、「ｓｎｏＲＮＡ」という表現は、通常、細胞の核質および／または核小体において合成され、且つ／或いは機能する小さいＲＮＡ分子を指す。好ましい実施形態に従って、本発明の核内低分子ＲＮＡはボックスＣ／Ｄを含むｓｎｏＲＮＡである。
【００１６】
ボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡの非限定例には、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ ｂ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３１６５６）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ Ｂ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ０４６５９８）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ Ｂ４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ０４６５９８）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ Ｂ５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ０４６５９８）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ ＴＳ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３１６５６）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ ＴＳ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３１６５６）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ ｇ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３１６５６）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ ｓｎｏＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０５００９５）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ｓｎｏＲＮＡ ９２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ５０１７１、Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ ｓｎｏＲＮＡ ９２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１６３９９）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ＴＢＣ４ ｓｎｏＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ｓｎｏ ２７０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ５０１７１）およびヒトＵ１４ ｓｎｏＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿００００２２）が含まれる。
【００１７】
本発明の修飾ｓｎｏＲＮＡは、ボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡに一般的に見出される１つ以上のＤ／Ｄ’ボックス核酸配列を含み得る。Ｄおよび／またはＤ’ボックスはヌクレオチドの保存配列であり、例えば、５’−ＣＵＧＡ−３’，５’−ＡＵＧＡ−３’，５’−ＣＣＧＡ−３’，５’−ＣＡＧＡ−３’，５’−ＣＵＵＡ−３’，５’−ＵＵＧＧ−３’および５’−ＣＡＧＣ−３’から選択される配列からなり得る。しかし、更なる修飾および／または誘導体が考えられ得る。
【００１８】
本発明の修飾ｓｎｏＲＮＡは２８Ｓ ｒＲＮＡおよび／またはボックスＣ配列と相補的な配列を更に含み得る。２８Ｓ ｒＲＮＡと相補的な配列は５〜１５ヌクレオチド長、例えば、８〜１２ヌクレオチド、特に１０ヌクレオチドでよいが、このｒＲＮＡ相補領域は変異し得、ｒＲＮＡとの相補性は活性を阻止することなく実質的にまたは完全に取り除かれ得る。典型的には、２８Ｓ ｒＲＮＡと相補的な配列は２８Ｓ ｒＲＮＡ配列の塩基３６８０におけるまたはその周囲のヌクレオチドと相補的であり得（ナンバリングは非特許文献１７、ｓｎｏＲＮＡ−ＬＢＭＥ−ｄｂ，ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｈ／ＡＣＡ ａｎｄ Ｃ／Ｄ ｂｏｘ ｓｎｏＲＮＡｓによる）、例えば、３６７０〜３６９０前後、例えば、３６７７〜３６８６である。ボックスＣ配列は典型的には５〜９ヌクレオチド長、例えば、７ヌクレオチドであり、配列ＡＵＧＡＵＧＵまたはその一部を含み得る。典型的には、存在する場合、ボックスＣ配列は、ボックスＤ’配列の５’側にある、ｒＲＮＡまたはｓｎｏＲＮＡの他の生理学的ＲＮＡ標的と相補的な配列の５’側に位置し、そのボックスＤ’配列は標的核酸配列の一部と実質的に相補的な核酸配列の５’側にある。好ましくは、ボックスＣ配列、ｒＲＮＡと相補的な配列、ボックスＤ’配列および／または標的核酸配列の一部と実質的に相補的な核酸配列の間に、わずか１〜３、例えば、１つのヌクレオチド塩基が見出される。ボックスＤ’配列と同一であるか、またはそうではないボックスＤ配列は、標的ＲＮＡ配列の一部と実質的に相補的な核酸配列の３’側に見出され得る。ボックスＤ配列は、標的核酸配列の一部と実質的に相補的な核酸配列の３’側塩基の２０〜３０ヌクレオチド３’側、例えば、２４〜２８ヌクレオチド、特に２６ヌクレオチド下流にあり得る。
【００１９】
本発明の修飾ｓｎｏＲＮＡ分子は、標的核酸配列を標的とし、且つこれとハイブリダイズすることができる、少なくとも１つの配列も含む。本明細書で提示される研究に基づき、本発明者らはｓｎｏＲＮＡ分子であるＨＢＩＩ−１８０Ｃを同定し、これは、ヒト線維芽細胞増殖因子３（ＦＧＦＲ３）から転写されるｍＲＮＡ前駆体のイントロン１７内に見出される２１ｎｔ配列と高度に相補的である、ボックスＤ’配列のすぐ下流にある配列を含んでいた。この配列を、特定の標的遺伝子配列と相補的であるように設計された、異なる配列に変えることにより、イントロンまたはエクソン配列であるにしても、本発明者らは所望の標的遺伝子の発現を調節することができた。
【００２０】
典型的には、標的核酸配列の一部と実質的に相補的な核酸配列は１５〜４５ヌクレオチド長、例えば、１７〜３０ヌクレオチドであるが、配列および塩基組成に依存してより長くてよい。「実質的に」相補的であるとは、標的核酸配列と、標的核酸とハイブリダイズするように設計されたｓｎｏＲＮＡ分子の配列との間に、正確な相補性が存在する必要はないということである。しかし、典型的には９０または９５％超の高度の同一性があるべきであり、それは、公知のＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡ塩基対合法則に従った特異的結合を確実にするのに十分であることが理解されねばならない。従って、典型的には相補領域の長さおよびＧ／Ｃ含量により、２つの配列間の多くてもわずか１〜３のミスマッチが許容され得る。標的核酸配列は、ＲＮＡ配列、典型的にはｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｒＲＮＡ配列またはＲＮＡウイルスゲノム配列若しくはそれに由来する転写産物、特にｍＲＮＡ配列であり得る。標的核酸配列内にて相補領域はイントロンまたはエクソンまたは、特にイントロン−エクソン接合部にあり得るが、５’または３’非翻訳領域にも存在し得る。
【００２１】
標的核酸分子とハイブリダイズするように設計された２つ以上の配列が本発明の修飾ｓｎｏＲＮＡ分子内に見出され得ることが理解されねばならない。２つ以上のそのような配列がある場合、異なる「標的化」配列が同じ標的核酸分子の異なる部分または異なる標的核酸分子を標的とするように設計され得る。
【００２２】
更なる態様では、本発明による少なくとも１つのｓｎｏＲＮＡ分子を発現することができる核酸構築物も提供される。
【００２３】
典型的には、核酸構築物は、本発明によるｓｎｏＲＮＡをコードすることができるイントロン核酸の領域に隣接するエクソン核酸の少なくとも２つの領域を含む。最も望ましくは、核酸構築物は、本発明による１つ以上のｓｎｏＲＮＡをコードすることができる配列を含む２つ以上のイントロン配列に隣接する多数のエクソン配列を含み得る。このような構築物は、単一の構築物として形成され得、標的細胞内での転写と同時にエクソン配列に対応するｍＲＮＡの生成およびイントロン配列のスプライシングアウトおよび、その後の本発明によるｓｎｏＲＮＡの生成をもたらす。
【００２４】
２つ以上の本発明のｓｎｏＲＮＡ配列を生成するために２つ以上のイントロン配列が用いられる場合、各ｓｎｏＲＮＡは同じまたは異なる標的ＲＮＡ分子を標的とするように設計され得る。
【００２５】
当業者はイントロンおよびエクソンを構成するものを周知していることが期待されるが、補助のために以下のことが提供される。
【００２６】
イントロンは、通常、タンパク質をコードする最終ｍＲＮＡ産物において発現される領域である真核生物ＤＮＡの部分、即ち、「エクソン」間に介在するそのＤＮＡの部分である。イントロンおよびエクソンはＲＮＡに転写され、「一次転写物、ｍＲＮＡ前駆体」（またはプレｍＲＮＡ）と称される。エクソンにコードされる天然タンパク質が生成され得るように、イントロンはｍＲＮＡ前駆体から除去されねばならない（本明細書で用いられる「天然タンパク質」という用語は、天然、野生型、変異または機能タンパク質をいう）。ｍＲＮＡ前駆体からのイントロンの除去およびその後のエクソンの結合はスプライシングプロセスにて行われる。
【００２７】
スプライシングプロセスは実際にはスプライシング因子に媒介される一連の反応であり、転写後であるが翻訳前にＲＮＡに対して行われる。従って、「ｍＲＮＡ前駆体」はエクソンおよびイントロンを含むＲＮＡであり、「ｍＲＮＡ」は、タンパク質がリボソームによって翻訳されるように、イントロンが除去され、エクソンが連続的に結合したＲＮＡである。
【００２８】
イントロンは、スプライシング反応を行う種々のスプライシング因子と結合する比較的短い保存ＲＮＡセグメントである一組の「スプライス要素」により定義付けされる。従って、各イントロンは５’スプライス部位、３’スプライス部位およびその間に位置する分岐点により定義付けされる。
【００２９】
核酸構築物は、従来の核酸ベクターに見出されることが多く、且つ当業者には周知の一般的な核酸特徴を更に含み得る。例えば、核酸構築物は、核酸構築物が形質転換またはトランスフェクトされた細胞の同定を容易にするための選択マーカー遺伝子を含み得る。好ましくは、核酸構築物は、ｓｎｏＲＮＡ分子をコードする核酸の発現を促進するための少なくとも１つのプロモーター、例えば、当技術分野において公知の構成的または調節可能なプロモーターを含む。好適なプロモーターの例には、ＣＭＶプロモーター、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６、ＳＶ４０、アデノウイルス主要後期プロモーターおよび当業者には公知の他のプロモーターが含まれる。
【００３０】
核酸構築物は、ｓｎｏＲＮＡによって調節される遺伝子／ＲＮＡのコピーを置換するように設計された天然、変異或いは標識形態の遺伝子／ＲＮＡのコピーも含み得る。
【００３１】
本発明のｓｎｏＲＮＡを細胞内に生成するために複数の手法が用いられ得る。
【００３２】
本発明の１つの好ましい実施形態に従って、本発明のｓｎｏＲＮＡ分子は、上述のｓｎｏＲＮＡ分子を発現することができる核酸構築物を細胞内に導入することによって生成され得る。
【００３３】
本発明のｓｎｏＲＮＡを細胞内に発現させるため、核酸配列は核酸構築物に結合され、核酸構築物はｓｎｏＲＮＡをコードする核酸配列の上流にあるプロモーターを含む。望ましくは、ｓｎｏＲＮＡをコードする配列は、転写と同時にｓｎｏＲＮＡをコードする配列のスプライシングアウトをもたらす、当業者によってエクソン配列およびスプライシング配列と同定可能な核酸の領域の両側にて隣接される。例えば、真核細胞における核酸配列の転写を誘導するのに適したプロモーターには、構成的または誘導性プロモーターが含まれる。
【００３４】
本発明での使用に適した構成的プロモーターは、大部分の環境条件および大部分のタイプの細胞において活性を示すプロモーター配列であり、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターである。本発明での使用に適した誘導性プロモーターには、例えば、低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）プロモーター（Ｒａｐｉｓａｒｄａ，Ａ．ら、２００２．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：４３１６−２４）およびテトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｓｒｏｕｒ，Ｍ．Ａ．ら、２００３．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９０：３９８−４９５）が含まれる。
【００３５】
通常、本発明の核酸構築物は、構築物を原核生物、真核生物または好ましくはその両方における複製および／または組込みに好適にさせる付加配列を含む（例えば、シャトルベクター）。典型的なクローニングベクターは転写および翻訳開始配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）および転写および翻訳ターミネーター（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。
【００３６】
核酸構築物の構築において、好ましくは、プロモーターはその自然な環境における転写開始部位からの距離とほぼ同じ異種転写開始部位からの距離に位置する。しかし、当技術分野において公知であるように、プロモーター機能の喪失なしに、この距離のある程度の変動が受け入れられ得る。
【００３７】
既述の要素に加え、通常、本発明の核酸構築物は、クローン核酸の発現レベルを高め、または組換えＤＮＡを保持する細胞の同定を容易にするように意図された他の特殊要素を含み得る。例えば、多くの動物ウイルスは、許容細胞型におけるウイルスゲノムの過剰染色体複製を促進するＤＮＡ配列を含む。これらのウイルスレプリコンを保持するプラスミドは、プラスミドに保持され、または宿主細胞のゲノムを含む遺伝子によって適切な因子が供されない限り、エピソームとして複製される。
【００３８】
核酸構築物は真核生物レプリコンを含む場合もあれば含まない場合もある。真核生物レプリコンが存在する場合、適切な選択可能マーカーを用いてベクターは真核細胞において増幅可能である。ベクターが真核生物レプリコンを含まない場合、エピソーム増幅は可能ではない。その代わり、組換えＤＮＡが操作された細胞のゲノムに組み込まれ、プロモーターが所望の核酸の発現を指示する。このような構築物は、核酸構築物を細胞のゲノムにおける特定の部位に標的化し、且つ細胞内に必要な酵素が存在する場合に特定の部位に組み込まれるように設計された部位特異的組換え部位も含み得る。種々の部位特異的組換え系が当業者には周知であり、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ、Ａｔｔ／λインテグラーゼ、ｆｒｔ／Ｆｌｐ、ガンマデルタリゾルバーゼ、Ｔｎ３リゾルバーゼおよびΦＣ２３１インテグラーゼが含まれる（当業者の関心が向けられるＧｏｖｅｒら、２００５を参照されたい）。
【００３９】
本発明の核酸構築物は、本発明のポリヌクレオチドを哺乳動物細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、Ｃｏｓ細胞）、酵母細胞（例えば、ＡＨ１０９，ＨＨＹ１０，ＫＤＹ８０）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、トリパノソーマ細胞（例えば、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ，Ｌ．ｍａｊｏｒ，Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ２９−１３）または細菌細胞（例えば、ＪＭ１０９，ＲＰ４３７，ＭＭ５０９，ＳＷ１０）において発現させるために用いられ得る。
【００４０】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、核酸配列を哺乳動物、酵母、トリパノソーマまたは細菌発現ベクターに結合することによって合成される。このようなベクターの例には、哺乳動物細胞に用いるのに適したｐｃＤＮＡ３．１，ｐＢＫ−ＣＭＢおよびｐＣＩベクター、酵母細胞に用いるのに適したｐＧＢＫＴ７、ｐＬＧＡＤＨ２−ｌａｃＺおよびｐＢＧＭ１８ベクター、トリパノソーマ細胞に用いるのに適したｐＸ−ｎｅｏエピソームベクター並びに細菌細胞に用いるのに適したＰａｃｋ０２ｓｃＫａｎ，ｐＭＬＢＡＤ，ｐＭＬＳ７ベクターが含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
好ましい実施形態に従って、本発明の核酸構築物は、好ましくは真核細胞発現、最も好ましくは哺乳動物細胞発現のために構築される。
【００４２】
哺乳動物発現ベクターの例には、限定されないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から市販されているｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、Ｐｇｌ３、ＰｚＥＯｓｖ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａ社から市販されているｐＣＩ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から市販されているｐＭｂａｃ，ｐＰｂａｃ，ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から市販されているｐＴＲＥＳ並びにそれらの誘導体が含まれる。
【００４３】
レトロウイルスのような真核生物ウイルス由来の調節要素を含む発現ベクターも用いられ得る。ＳＶ４０ベクターはｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２を含む。ウシパピローマウイルス由来のベクターはｐＢＶ−１ＭＴＨＡを含み、エプスタイン・バー・ウイルス由来のベクターはｐＨＥＢＯおよびｐ２０５を含む。他の代表的なベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥおよびＳＶ−４０早期プロモーターの指示下にてタンパク質の発現を可能にする他の任意のベクター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、多面体プロモーター或いは真核細胞における発現に有効であることが示される他のプロモーターが含まれる。
【００４４】
本発明の核酸構築物を哺乳動物細胞に導入するために種々の方法が用いられ得る。このような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、ニューヨーク（１９８９，１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ社、メリーランド州ボルティモア（１９８９）、Ｃｈａｎｇら、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ社、ミシガン州アナーバー（Ａｎ Ａｒｂｏｒ）（１９９５）、Ｖｅｇａら、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ社、ミシガン州アナーバー（Ａｎ Ａｒｂｏｒ）（１９９５）、Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ社、マサチューセッツ州ボストン（１９８８）およびＧｉｌｂｏａら［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４（６）：５０４−５１２，１９８６］に概述されており、例えば、安定的若しくは一過性導入、リポフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポソーム、イオン導入、受容体媒介性エンドサイトーシスおよび組換えウイルスベクターによる感染を含む。加えて、正・負の選択法に関して米国特許第５４６４７６４号および５４８７９９２号を参照されたい。例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素欠乏チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ ｄｈｆｒ−）細胞における安定導入では、本発明の発現ベクターはチミジンキナーゼプロモーターの制御下に配置されたジヒドロ葉酸還元酵素発現カセットを更に含む。
【００４５】
本発明の核酸構築物は、ウイルスベクター、例えば、当技術分野において公知のレンチウイルス、レトロウイルスまたはアデノウイルス由来ベクターを用いて細胞内に送達されてもよい。
【００４６】
本発明の更なる態様では、本発明によるｓｎｏＲＮＡ分子を生成するのに用いる核酸ベクター構築物が提供され、その構築物は５’から３’方向に、
ｉ）転写を制御するためのプロモーター配列、
ｉｉ）第一のエクソン配列、
ｉｉｉ）第一のイントロンスプライシング配列、
ｉｖ）本発明のｓｎｏＲＮＡをコードする核酸配列のクローニングを容易にするためのクローニング部位または配列、
ｖ）第二のイントロンスプライシング配列および
ｖｉ）第二のエクソン配列
を含む。ｓｎｏＲＮＡは本明細書で述べられるように天然または修飾ｓｎｏＲＮＡ分子でよい。
【００４７】
当業者には理解されるように、様々な構成要素が転写的に結び付いていることが理解されねばならない。当然、ベクターは本明細書で述べられる他の構成要素を含み得、ベクター構築を容易にするために更なるクローニング部位を含み得る。
【００４８】
本発明の１つの特別な利点は、単一の転写物から多数のｓｎｏＲＮＡを提供する能力であり、これは同じまたは異なる標的核酸配列を標的とすることができる。
【００４９】
核酸構築物の使用の代替として、本発明のｓｎｏＲＮＡ分子が、例えば、固相合成を用いてＲＮＡオリゴヌクレオチドとして化学的に合成され得ることが理解されるであろう。
【００５０】
本発明の合成ｓｎｏＲＮＡ分子、ｓｎｏＲＮＡ様分子またはその断片を設計する際、いくつかのことが考慮されねばならない。遺伝子発現の効率的な生体内抑制のため、分子は望ましくは以下の要件を満たし得る：（ｉ）標的配列への結合における十分な特異性；（ｉｉ）水溶性；（ｉｉｉ）細胞内および細胞外ヌクレアーゼに対する安定性；（ｉｖ）細胞膜貫通能；および（ｖ）生物を処置するために使用される場合に低毒性。
【００５１】
非修飾ポリヌクレオチドは、短い生体内半減期を有し、その間にヌクレアーゼによって急速に分解され得るため、使用には非実用的であり得る。更に、非修飾ポリヌクレオチドはミリグラム量を超える量にて調製することが困難である。加えて、このようなポリヌクレオチドは細胞膜を貫通しにくい。
【００５２】
半減期および膜貫通を向上させるため、本発明のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド骨格は修飾され得る。
【００５３】
ポリヌクレオチドは塩基、糖またはリン酸部分において修飾され得る。これらの修飾は、例えば、メチルホスホン酸、モノチオリン酸、ジチオリン酸、ホスホロアミド酸、リン酸エステル、架橋ホスホロチオエート、架橋ホスホロアミド酸、架橋メチレンホスホン酸、並びにシロキサン架橋、炭酸架橋、カルボキシメチルエステル架橋、炭酸架橋、カルボキシメチルエステル架橋、アセトアミド架橋、カルバミン酸架橋、チオエーテル架橋、スルホキシル酸架橋、スルホノ架橋、アノマー架橋を有するデホスホヌクレオチド間類似体およびボラン誘導体の使用を含む（Ｃｏｏｋ，１９９１，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｆｕｔｕｒｅ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ６：５８５）。好ましくは、本発明の合成ポリヌクレオチドに生体内安定性を付与するため、リボース環の２位における酸素分子がメチル化され得、２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡオリゴヌクレオチドとなる。
【００５４】
国際特許出願ＷＯ８９／１２０６０は、定義された配列におけるポリヌクレオチド類似体を合成するための種々の構成要素および、そのような構成要素を結合して形成されるポリヌクレオチド類似体を開示している。構成要素は「強固」（即ち、環構造を含む）または「柔軟」（即ち、環構造を欠く）であり得る。どちらの場合でも構成要素はヒドロキシ基およびメルカプト基を含み、これを通じて構成要素が結合してポリヌクレオチド類似体を形成するといわれている。オリゴヌクレオチド類似体における結合部分は、硫化物（−Ｓ−）、スルホキシド（−ＳＯ−）およびスルホン（−ＳＯ２−）からなる群より選択される。
【００５５】
国際特許出願ＷＯ９２／２０７０２は、任意の選択化学核酸塩基または類似体が一列に並べられ、天然ＲＮＡでのようにコード文字として機能するペプチド骨格を含む非環状オリゴヌクレオチドを説明している。ペプチド核酸（ＰＮＡ）として公知のこれらの新規化合物は、天然の対応物より細胞において安定なだけではなく、天然核酸が互いに付着するより５０〜１００倍固く天然ＲＮＡに結合もする。ＰＮＡオリゴマーは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ペプチド合成により、ウリジン、シトシン、アデニン（ａｄｅｎｕｉｎｅ）およびグアニンを含む４つの保護モノマーから合成され得る。水溶性を高めて凝集を阻止するため、Ｃ末端領域にリジンアミド基が配置される。
【００５６】
ｓｎｏＲＮＡの安定性は、合成時に３’−デオキシチミジン若しくは２’−置換ヌクレオチド（例えば、アルキル基に置換される）をｓｎｏＲＮＡに組み入れ、ｓｎｏＲＮＡをフェニルイソ尿素誘導体として付与し、または他の分子、例えば、アミノアクリジンまたはポリリジンをｓｎｏＲＮＡの３’末端に結合させることによっても高められ得る（例えば、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０：１１６９−１１８２，１９９０を参照されたい）。本発明のｓｎｏＲＮＡのＲＮＡヌクレオチドの修飾は、ｓｎｏＲＮＡ全体にわたり、または選択領域、例えば、５’および／または３’末端に存在し得る。ｓｎｏＲＮＡｓは、例えば、それらを親油性化合物に結合することによって標的組織を貫通する能力を高めるためにも修飾され得る。本発明のｓｎｏＲＮＡｓは、これらをコードするＤＮＡの標準的化学合成および転写を含む当技術分野において公知の標準的方法によって作製され得る。加えて、ｓｎｏＲＮＡｓは、標的細胞の細胞表面上の受容体に特異的なリガンドにそれらを結合することにより、特定の細胞に標的化され得る。また、ｓｎｏＲＮＡは、細胞型特異的受容体に特異的に結合するモノクローナル抗体に結合されることにより、特定の細胞型に標的化され得る。
【００５７】
本発明の核酸構築物および／またはベクターは、本発明による修飾ｓｎｏＲＮＡを生成するように設計された２つ以上の配列を含み得る。２つ以上の配列が存在する場合、配列は同じ標的核酸または異なる標的核酸を標的とするように設計され得る。
【００５８】
核酸構築物、ベクターまたは実際に修飾ｓｎｏＲＮＡ自体をコードする核酸は、遺伝子発現を調節するために本発明のｓｎｏＲＮＡ分子と併せて用いられるＲＮＡｉ分子のような更なる分子を発現するように設計され得る。
【００５９】
従来のトランスジェニック動物が作製される必要がないように、本発明の技法を用いて疾患モデルを作成することも可能であり得る。従って、本発明の核酸、核酸構築物またはベクターは、宿主細胞／動物における正常な野生型遺伝子／タンパク質の発現を阻止または最小限にするためにｓｎｏＲＮＡを発現し、また、特定の疾患／病状と関連する遺伝子／タンパク質の変異形態を発現するように設計され得る。次に、治療が変異遺伝子／タンパク質の作用を処置または改善するかを確認するため、細胞／動物に潜在的治療法が加えられ／施され得る。
【００６０】
本発明のｓｎｏＲＮＡ、核酸、核酸構築物および／またはベクターは、細胞若しくは生物における遺伝子の機能を確定し、または更に、細胞若しくは生物における遺伝子の機能を調節するために用いられ得る。好ましくは、細胞は真核細胞または細胞株、例えば、植物細胞または動物細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、胚細胞、多能性幹細胞、腫瘍細胞、例えば、テラトカルシノーマ細胞またはウイルス感染細胞である。好ましくは、生物は真核生物、例えば、植物または動物、例えば、哺乳動物、特にヒトである。
【００６１】
本発明のｓｎｏＲＮＡ分子が目標とする標的遺伝子は病態と関連し得る。例えば、遺伝子は病原体関連遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子、腫瘍関連遺伝子または自己免疫疾患関連遺伝子であり得る。標的遺伝子は組換え細胞または遺伝子改変生物に発現される異種遺伝子でもあり得る。このような遺伝子の機能を確定または調節、特に抑制することにより、農業分野または医学若しくは獣医学分野における貴重な情報および治療上の利益が得られ得る。本発明は、典型的には単一のベクターを用いて細胞（またはウイルス）タンパク質（または機能性ＲＮＡ）の一形態を別の形態に置換するように設計された、核酸構築物およびｓｎｏＲＮＡの提供を可能にする。例えば、これは、生物または細胞に見出される異常、例えば、疾患の原因因子であることが公知であり得る変異遺伝子を矯正するために用いられ得る（例えば、嚢胞性線維症の発症につながるＣＦＴＲ遺伝子における遺伝子変異）。同じベクターが、変異遺伝子の発現を低下させるために標的化されるｓｎｏＲＮＡをコードし、また、正確なタンパク質を発現させるために同じ構築物内にて遺伝子の正確なコピーをコードするように設計され得る。正確なコピーは、ｃＤＮＡ配列によって提供され、或いは本発明の修飾ｓｎｏＲＮＡをコードするイントロンに隣接するエクソンにコードされ得る。他の例には、癌の進行と関連する変異ｐ５３遺伝子、ＢＲＣＡ遺伝子などの置換が含まれる。
【００６２】
有利には、ｓｎｏＲＮＡと置換核酸とは同じ転写物内にあり、発現をノックダウンするｓｎｏＲＮＡと同じプロモーターから発現され得る。これは、すべてのものが単一の転写物として発現されることを可能にするという利点を有する。更に、これは、ｓｎｏＲＮＡと発現置換核酸との発現レベルが均衡を保たれ、同時制御される（すなわち、同じプロモーターから）という利点も有する。
【００６３】
タンパク質をコードしない標的ＲＮＡ（例えば、ｓｎＲＮＡまたはｍｉＲＮＡまたは他の機能性ＲＮＡ）を同じＲＮＡの修飾形態に置換するために、同様の手法が用いられ得る。
【００６４】
この戦略は異常の矯正に限定されない。細胞またはウイルスにコードされる任意のタンパク質（またはＲＮＡ）を置換するために同様の戦略が用いられ得、そのタンパク質には、同じ遺伝子産物の異常、変異または修飾形態に置換される野生型および／または機能的形態のタンパク質（またはＲＮＡ）が含まれ、これは、ある種の適用、例えば、変異表現型を評価し、または薬物スクリーニング戦略を支援し、または標的を検証し、または既存の非標識細胞形態からの競合なしに標識形態のタンパク質を分析し、または他の適用若しくは研究用途に望ましい可能性がある。この戦略は、単一のベクターを用いて１つのタイプのタンパク質（またはＲＮＡ）を完全または実質的に異なるタンパク質（またはＲＮＡ）に置換するためにも用いられ得る。
【００６５】
図１〜３は本発明に従って用いられ得るベクターの例を概略的に示す。図１において、ベクターは、単一の遺伝子配列または複数の遺伝子配列の発現を調節するために標的化され得る複数のｓｎｏＲＮＡを発現させるものとして示されている。図２はタンパク質置換ベクターを概略的に示し、これは、ベクター内に見出されるｃＤＮＡにコードされる新たなタンパク質に置換され得る標的遺伝子Ｘの発現を抑制するｓｎｏＲＮＡを提供するように設計される。図３はタンパク質置換ベクターと同様のベクターを概略的に示すが、これは変異ＲＮＡのようなＲＮＡを抑制するためであり、ＲＮＡはベクターに存在する配列と異なる／新たなバージョンに置換され得る。
【００６６】
本発明の細胞または生物に対する更なる適用は、遺伝子発現プロファイルおよび／またはプロテオームの解析である。一実施形態では、１つまたは複数の標的タンパク質の変異体または突然変異形態の分析が行われ得、変異または突然変異形態は上述のように外因性標的核酸によって細胞または生物に再導入される。変異した、例えば、部分的に欠失した外因性標的を用いることによる内因性遺伝子のノックアウトとレスキューとの組合せは、ノックアウト細胞の使用に比べて利点を有する。更に、この方法は標的タンパク質の機能ドメインを同定するのに特に好適である。更なる好ましい実施形態では、例えば少なくとも２つの細胞または生物の遺伝子発現プロファイルおよび／またはプロテオームおよび／または表現型の特徴の比較が行われる。
【００６７】
本発明は、薬剤を同定し、且つ／或いは特徴付け、例えば、被験物質の集合から新規薬剤を同定し、且つ／或いは既知の薬剤の作用および／または副作用の機序を特徴付けるための処置にも適用を見出す。
【００６８】
従って、更なる態様では、標的遺伝子（単数または複数）の発現を調節、特に下方制御することが望ましい患者における疾患または病状を処置するのに用いる、本発明によるｓｎｏＲＮＡ、核酸、核酸構築物またはベクターが提供される。
【００６９】
一層更なる態様では、標的遺伝子（単数または複数）の発現を調節、特に下方制御することが望ましい患者における疾患または病状を処置するのに用いる薬剤の製造に用いる、本発明によるｓｎｏＲＮＡ、核酸、核酸構築物またはベクターが提供される。
【００７０】
一層更なる態様では、標的遺伝子（単数または複数）の発現を調節、特に下方制御することが望ましい患者における疾患または病状を処置する方法が提供され、この方法は、本発明による治療有効量のｓｎｏＲＮＡ、核酸、核酸構築物またはベクターを、これを必要とする患者に投与するステップを含む。
【００７１】
本明細書で用いられるように、「処置する」という表現は、疾患、障害若しくは病状を患い、またはそれと診断された患者において、疾患、障害または病状の進展を抑制または阻止し、且つ／或いは疾患、障害または病状の軽減、緩解または退行を引き起こすことをいう。当業者は、疾患、障害または病状の進展を評価するために用いられ得る種々の方法およびアッセイ、また、同様に、疾患、障害または病状の軽減、緩解または退行を評価するために用いられ得る種々の方法およびアッセイを認識するであろう。
【００７２】
本発明のこの態様による方法は、本発明の単離ポリヌクレオチドを患者の細胞に付与し、これにより、患者の細胞における標的ＲＮＡレベルを下方制御することによって達成される。
【００７３】
付与は、本発明のポリヌクレオチドを細胞に直接投与することにより、または上述のように細胞にポリヌクレオチドを発現させることによって達成され得る。発現は、本発明のポリヌクレオチドを発現することができる核酸構築物を患者の細胞に直接トランスフェクトすることにより（即ち、生体内トランスフェクション）、または核酸構築物を患者から単離された細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を患者に投与することによって（即ち、エクスビボトランスフェクション）達成され得る。
【００７４】
更なる態様では、本発明によるｓｎｏＲＮＡ若しくは本発明によるｓｎｏＲＮＡ分子を発現することができる核酸構築物および医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物が提供される。
【００７５】
医薬製剤には、経口、局所（経皮、頬側および舌下）、経直腸若しくは非経口（皮下、皮内、筋肉内および静脈内）、経鼻および肺内投与、例えば、吸入に好適なものが含まれる。製剤は必要に応じて個々の用量単位にて好都合に提示され得、薬学分野において周知の任意の方法により調製され得る。方法はすべて、活性化合物を液体担体または微細に分割された固体担体およびその両方と会合させ、次に、必要な場合、生成物を所望の製剤に成形するステップを含む。
【００７６】
担体が固体である経口投与に好適な医薬製剤は、単位用量製剤、例えば、各々が所定量の活性化合物を含むボーラス、カプセルまたは錠剤として最も好ましく提示される。錠剤は圧縮または成形によって作製され得、任意に１つ以上の副成分を含む。圧縮製剤は、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、平滑剤、表面活性剤または分散剤と任意に混合された易流動性形態、例えば、粉末または顆粒にて活性化合物を好適な機械にて圧縮することによって調製され得る。成形製剤は不活性液体希釈剤で活性化合物を成形することによって作製され得る。錠剤は任意にコーティングされ得、コーティングされない場合、任意に刻み目を付けられ得る。カプセルは、単独でまたは１つ以上の副成分との混合物にて活性化合物をカプセル殻に充填し、次に、通常の方法でそれらを密封することによって調製され得る。カシェはカプセルに類似し、任意の副成分とともに活性化合物がライスペーパー包装材料に密封される。活性化合物は、例えば、投与前に水中に懸濁され、または食物上に散らされ得る分散可能な顆粒としても製剤化され得る。顆粒は、例えば、サシェにパッケージングされ得る。担体が液体である経口投与に好適な製剤は、水性若しくは非水性液体中の溶液若しくは懸濁液または水中油型液体エマルションとして提示され得る。
【００７７】
経口投与用の製剤は、放出制御剤形、例えば、活性化合物が適切な放出制御マトリクスにて製剤化され、または好適な放出制御フィルムでコーティングされた錠剤を含む。このような製剤は予防的使用に特に好都合であり得る。
【００７８】
担体が固体である経直腸投与に好適な医薬製剤は、単位用量坐剤として最も好ましく提示される。好適な担体には、カカオバターおよび当技術分野において一般的に用いられる他の材料が含まれる。坐剤は、活性化合物の軟化または溶融担体との混合、次に、冷却および鋳型における成形によって好都合に形成され得る。
【００７９】
非経口投与に好適な医薬製剤には、水性または油性ビヒクル中の活性化合物の滅菌溶液または懸濁液が含まれる。
【００８０】
注入用製剤はボーラス注入または持続注入に適合され得る。このような製剤は、使用のために必要となるまで製剤の導入後に密封される単位用量または複数用量容器にて好都合に提示される。或いは、活性化合物は、使用前に滅菌発熱物質非含有水のような好適なビヒクルで構成された粉末形態でよい。
【００８１】
活性化合物は長時間作用持効性製剤としても製剤化され得、筋肉内注射または、例えば、皮下または筋肉内移植により投与され得る。持効性製剤は、例えば、好適なポリマー若しくは疎水性材料またはイオン交換樹脂を含み得る。このような長時間作用製剤は予防的使用に特に好都合である。
【００８２】
活性化合物を含み、望ましくは０．５〜７ミクロンの範囲の直径を有する粒子がレシピエントの気管支樹に送達されるように、口腔を介する肺内投与に好適な製剤が提示される。
【００８３】
１つの可能性として、このような製剤は、吸入デバイスで用いる、好適には、例えば、ゼラチンの貫通可能なカプセル、或いは活性化合物、好適な液体若しくは気体推進剤および、任意に、他の成分、例えば、界面活性剤および／または固体希釈剤を含む自力推進製剤として、好都合に提示され得る、微細に粉砕された粉末形態である。好適な液体推進剤はプロパンおよびクロロフルオロカーボンを含み、好適な気体推進剤は二酸化炭素を含む。活性化合物が溶液または懸濁液の液滴形態にて投与される自力推進製剤も用いられ得る。
【００８４】
このような自力推進製剤は当技術分野において公知のものに類似し、確立された手順によって調製され得る。好適には、自力推進製剤は、所望の噴霧特徴を有する手動または自動機能バルブを備えた容器にて提示される。有利には、バルブは各操作と同時に固定量、例えば、２５〜１００マイクロリットルを送達する計量タイプである。
【００８５】
更なる可能性として、活性化合物はアトマイザーまたはネブライザーに用いる溶液または懸濁液の形態でよく、これにより、吸入のための微液滴霧を生成するために加速気流または超音波攪拌が用いられる。
【００８６】
経鼻投与に好適な製剤は、肺内投与に関して上述したものに概して類似する製剤を含む。このような製剤は、投与される際、鼻腔における保持を可能にするために望ましくは１０〜２００ミクロンの範囲の粒子径を有するべきである。これは、必要に応じて好適な粒子サイズの粉末の使用または適切なバルブの選択によって達成され得る。他の好適な製剤には、鼻に接近して保持された容器から鼻道を通る急速吸入による投与のための、２０〜５００ミクロンの範囲の粒子径を有する粗粉末および、水性若しくは油性溶液若しくは懸濁液中０．２〜５％ ｗ／ｖの活性化合物を含む点鼻剤が含まれる。
【００８７】
前述の担体成分に加え、上述の医薬製剤は適切な１つ以上の更なる担体成分、例えば、希釈剤、緩衝剤、着香剤、結合剤、表面活性剤、増粘剤、潤滑剤、保存剤（酸化防止剤を含む）など、および製剤を対象レシピエントの血液と等張にさせることを目的として含有される物質を含み得ることが理解されるべきである。
【００８８】
医薬的に許容可能な担体は当業者には周知であり、０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍリン酸緩衝液または０．８％食塩水を含むが、これらに限定されない。加えて、このような医薬的に許容可能な担体は水性若しくは非水性溶液、懸濁液およびエマルションでよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、オレイン酸エチルのような注入可能な有機エステルである。水性担体は、食塩水および緩衝媒質を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルションまたは懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液または固定油を含む。保存剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤、不活性ガスなども存在し得る。
【００８９】
局所製剤に好適な製剤は、例えば、ゲル、クリームまたは軟膏として提供され得る。このような製剤は、創傷若しくは潰瘍の表面上に直接塗布され、または処置部位におよび処置部位上に適用され得る包帯、ガーゼ、メッシュなどのような好適な支持体に保有され、例えば、創傷または潰瘍に適用され得る。
【００９０】
処置部位、例えば、創傷または潰瘍に直接噴霧または撒き散らされ得る液体または粉末製剤も提供され得る。或いは、キャリア、例えば、包帯、ガーゼ、メッシュなどが製剤を噴霧または撒き散らされ、次に、処置部位に適用され得る。
【００９１】
獣医用の治療用製剤は好都合に粉末または液体濃縮物形態でよい。標準的な獣医学的製剤の習慣に従って、従来の水溶性賦形剤、例えば、ラクトースまたはスクロースがそれらの物理的特性を向上させるために粉末に取り込まれ得る。従って、本発明の特に好適な粉末は、５０〜１００％ ｗ／ｗ、好ましくは６０〜８０％ ｗ／ｗの活性成分および０〜５０％ ｗ／ｗ、好ましくは２０〜４０％ ｗ／ｗの従来の獣医学的賦形剤を含む。これらの粉末は、例えば、中間プレミックスとして動物飼料に加えられ、または動物飲料水中に希釈され得る。
【００９２】
本発明の液体濃縮物は、化合物またはその誘導体若しくは塩を好適に含み、獣医学的に許容可能な水混和性溶媒、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、グリセロールホルマールまたは最大３０％ ｖ／ｖエタノールと混合されたそのような溶媒を任意に含み得る。液体濃縮物は動物の飲料水に投与され得る。
【００９３】
これより、以下の非限定的実施例および図を参照して本発明が説明される。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】複数のｓｎｏＲＮＡを発現するように設計された本発明によるｓｎｏＲＮＡ発現ベクターを示す概略図である。
【図２】宿主細胞タンパク質をベクターにコードされたタンパク質に置換するように設計されたｓｎｏＲＮＡ発現ベクターを示す概略図である。
【図３】宿主細胞ＲＮＡをベクターにコードされたＲＮＡに置換するように設計されたｓｎｏＲＮＡ発現ベクターを示す概略図である。
【図４】ＨｅＬａ細胞の核小体ＲＮＡライブラリーを示す概略図である。（Ａ）ＨｅＬａ細胞核小体画分からの核小体ＲＮＡの単離およびクローニング。左パネルは分画前の無傷ＨｅＬａ細胞画像を示し、右パネルは単離核小体を示す。ＨｅＬａ細胞核小体は前述のように（非特許文献７）ショ糖密度勾配法により分画され、次に、全核小体ＲＮＡが核小体ペレットから単離された。全核小体ＲＮＡはポリＡポリメラーゼを用いて３’末端においてポリアデノシンの付加により修飾された。（Ｂ）増幅して（右側に図示）、また、増幅せずに（左側に図示）行われたｃＤＮＡ合成戦略を示す概略図。核小体ｃＤＮＡはポリＡテール核小体ＲＮＡをテンプレートとして用いて逆転写により合成された。増幅せずに（左側）作製されたライブラリーは主に豊富な核小体ＲＮＡ種を検出するために用いられ、一方、あまり豊富でない核小体ＲＮＡ種を含むライブラリーを作製するために増幅法（右側）を用いた。これらのライブラリーはともに独立して通常のプラスミドベクターにクローニングされ、ＤＮＡ塩基配列決定法により解析された。（Ｃ）核小体ｃＤＮＡライブラリーにおいて検出されたＲＮＡ種の概要。増幅および非増幅ライブラリーを独立して解析したが、円グラフは両方のライブラリーの総合結果を示す。
【図５】ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡおよび宿主遺伝子Ｃ１９ｏｒｆ４８の保存を示す概略図である。（Ａ）ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡの構造。ボックスＣ（Ａ／Ｇ）ＵＧＡＵＧＡ）およびボックスＤ若しくはＤ’（ＣＵＧＡ）は各々ボックス内に示される。リボース２’−Ｏ−メチル化部位を指定するための予測ｒＲＮＡ相補配列は下線により示される。（Ｂ）ＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡ前駆体と相補的であることが見出された領域を示すＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡの予測二次構造。ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡの二次構造はｍｆｏｌｄ（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｎｔｅｎｄ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍｆｏｌｄ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｒｎａ−ｆｏｒｍ１．ｃｇｉ）により計算された（非特許文献２０（Ｍｆｏｌｄ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）および非特許文献２０（Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ））（左側）。ボックスＣおよびボックスＤおよびＤ’は各々ボックス内に示される。ｒＲＮＡ相補配列（点線）およびＦＧＦＲ３相補配列（実線）はバーで示される。ＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡ前駆体の相補領域は右側に示され、潜在的な塩基対合相互作用を示す。（Ｃ）ヒトＣ１９ｏｒｆ４８遺伝子の構造。エクソンはローマ数字を有する縞模様ボックスとして示される。予測タンパク質コード領域は黒色にて示される。イントロンにコードされたｓｎｏＲＮＡ ＨＢＩＩ−１８０Ａ，ＨＢＩＩ−１８０ＢおよびＨＢＩＩ−１８０Ｃはソリッドグレー・ボックスとして示される。（Ｄ）Ｃ１９ｏｒｆ４８遺伝子の保存領域。この写真は、ＵＣＳＣ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ 非特許文献２１：Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｂｒｏｗｓｅｒ ａｔ ＵＣＳＣ）Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｍｕｌｔｉｚ ＡｌｉｇｎｍｅｎｔのＣ１９ｏｒｆ４８染色体位置に由来し、保存結果は黒色ボックスおよびバーとして示される。１７の脊椎動物種の間の保存領域がバーとして示される（保存）。最も保存された３つの領域は、３つの検出ＨＢＩＩ ｓｎｏＲＮＡに正確に対応する。
【図６】ＨＢＩＩ−１８０ＣのＦＧＦＲ３相補領域の配列特異的作用を示す概略図である。（Ａ）ノーザンブロット（左パネル）および半定量的ＲＴ−ＰＣＲ（右パネル）により解析されたＨＢＩＩ−１８０Ｃ発現レベル。左パネルはＨＢＩＩ−１８０Ｃ特異的プローブを用いたノーザンブロット解析の結果を示す。ヒト一次細胞株ＷＩ３８（ＷＩ３８）およびＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ）由来の同量の全核小体ＲＮＡ（核小体）または全細胞ＲＮＡ（細胞）がブロットされた。右パネルはＨＢＩＩ−１８０Ｃ特異的プライマーセットを用いた半定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。ＷＩ３８およびＨｅＬａ細胞由来の同量の全核小体ＲＮＡまたは全細胞ＲＮＡがテンプレートとして用いられた。（Ｂ）野生型および変異ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡに対するＨＢＩＩ−１８０Ｃ発現プラスミド。ＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡ前駆体と相補的なＨＢＩＩ−１８０Ｃにおける配列はＧＡＧＧからＡＴＡＡに変えられた（青色、ｍｕｔ１）。（Ｃ）ＷＩ３８細胞におけるｗｔまたは変異体１ ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡの発現の作用の比較。画像は、空プラスミドｐｃＤＮＡ３（ｐｃＤＮＡ３）、ＨＢＩＩ−１８０Ｃ野生型発現プラスミド（ＷＴ）またはＨＢＩＩ−１８０Ｃ変異発現プラスミド（ｍｕｔ１）によるＷＩ３８細胞のトランスフェクション後３日での細胞の代表例を示す。赤色矢印は死滅しようとしている細胞または死滅細胞の集団を示す。（Ｄ）上述のプラスミドによる発現後３日での死滅細胞のパーセントを示すグラフ。ＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡ前駆体相補領域の変異はＷＴと比べて細胞死のレベルを明らかに低下させた。
【図７】ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡのＦＧＦＲ３相補領域が別のＦＧＦＲ３スプライスアイソフォームのパターンと関連することを示す概略図である。（Ａ）内因性ＨＢＩＩ１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡの発現／活性を抑制するように設計された、野生型および変異体に対するＦＧＦＲ３イントロン１７発現プラスミド。変異構築物ではＦＧＦＲ３の相補領域はＣＣＴＣからＴＴＡＴに変えられた（青色、ＦＲｍ）。（Ｂ）ＷＩ３８およびＨｅＬａ細胞におけるＦＧＦＲ３スプライスｍＲＮＡアイソフォームに対する内因性発現パターン。ゲル（左画像）は別のＦＧＦＲ３スプライスｍＲＮＡアイソフォームを検出するためのＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す。右図はＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡ特異的プライマーセットに対する位置を示す。エクソンはローマ数字を有するボックスとして示される。ＰＣＲに用いられるプライマーが矢印として示される。（Ｃ）ＦＧＦＲ３代替スプライスｍＲＮＡアイソフォームパターンはＦＧＦＲ３ミニ遺伝子の過剰発現により変えられた。ゲル画像は、トランスフェクションなし（Ｎｏ、レーン１）、トランスフェクトされた空プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（ｐＣ、レーン２）、ＦＧＦＲ３イントロン１７の野生型ミニ遺伝子（ＦＲ３Ｗ、レーン３）および変異ミニ遺伝子（ＦＲｍ、レーン４）のＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。
【図８】修飾ｓｎｏＲＮＡ発現ベクターを用いたＧＦＰおよびＹＦＰの標的抑制を示す概略図である。（Ａ）ＧＦＰおよびＹＦＰが共有する配列を標的とするキメラ発現プラスミド。ＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡ前駆体と相補的なＷＴ ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡにおける配列は、５’−ＣＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＴＧＣＡ−３’から５’−ＧＡＣＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣ−３’（青色、キメラ１）または５’−ＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣ−３’（青色、キメラ２）に変えられた。その結果生じたキメラ１および２ ｓｎｏＲＮＡはｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質ｃＤＮＡを発現するベクターの３’領域にサブクローニングされた。（Ｂ）図は、ともに関連ＹＦＰ遺伝子にも存在する２つの別のＧＦＰ領域を標的とするキメラ１およびキメラ２の相補領域を示す。（Ｃ）非融合ＧＦＰのみを発現するＨｅＬａＧＦＰ安定細胞株におけるＧＦＰ発現に対するキメラ構築物の作用。画像は、ＨｅＬａＧＦＰ安定細胞株において空ｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミドｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１（ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１）、発現プラスミドＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ１または発現プラスミドＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ２をトランスフェクトする作用を示す。左パネルはトランスフェクションをしないＨｅＬａＧＦＰ安定細胞株の生細胞画像を示す（ＤＩＣ画像）。上部パネルは固定細胞から記録された画像のＧＦＰ蛍光シグナルを示す（緑色）。下部パネルはＧＦＰ（緑色）とｍＣｈｅｒｒｙ（赤色）シグナルとを合体させた融合画像を示す。矢印はトランスフェクトされた細胞を示し、矢頭はトランスフェクトされなかった細胞を示す。特に、ＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ１またはキメラ２をコードする発現プラスミドをトランスフェクトされた細胞におけるＧＦＰ発現の明らかな低下に留意されたい。（Ｄ）フィブリラリンのアミノ末端において融合したＹＦＰを発現するＨｅＬａＹＦＰ−ＦＩＢＲＩＬＬＡＲＩＮ安定細胞株におけるＹＦＰ発現に対するキメラ構築物の作用（非特許文献１１（１６））。写真は、ＨｅＬａＹＦＰ−ＦＩＢＲＩＬＬＡＲＩＮ安定細胞株における空ｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミドｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１（ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１）、発現プラスミドＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ１または発現プラスミドＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ２を用いたトランスフェクションの作用を示す。左パネルはトランスフェクションをしないＨｅＬａＹＦＰ−ＦＩＢＲＩＬＬＡＲＩＮ安定細胞株の生細胞画像を示す（ＤＩＣ画像）。上部パネルは固定細胞から記録された画像のＹＦＰ蛍光シグナルを示す（緑色）。下部パネルはＹＦＰ（緑色）、ｍＣｈｅｒｒｙ（赤色）およびＤＡＰＩシグナル（青色）を合体させた融合画像を示す。矢印はトランスフェクトされた細胞を示し、一方、矢頭はトランスフェクトされなかった細胞を示す。特に、ＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ１またはキメラ２をコードする発現プラスミドをトランスフェクトされた細胞におけるＹＦＰ−フィブリラリン発現の明らかな低下に留意されたい。一部の細胞ではＹＦＰシグナルはほぼ完全に除かれ、キメラｓｎｏＲＮＡ構築物によるＹＦＰ−フィブリラリンの効率的な抑制を示す。
【図９】ウエスタンおよびノーザンブロット法により検出されるＧＦＰおよびＹＦＰの標的ｓｎｏＲＮＡ抑制を示す概略図である。（Ａ）空ｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミドｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１（対照：レーン１）、発現プラスミドＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ１（レーン２）または発現プラスミドＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ２（レーン３）を用いた、ＨｅＬａＧＦＰおよびＨｅＬａＹＦＰ−ＦＩＢＲＩＬＬＡＲＩＮ安定細胞株のトランスフェクション後のＧＦＰ（上部）およびＹＦＰ−フィブリラリン（下部）に対するタンパク質レベルの検出。同等量のＨｅＬａ抽出物が各レーンに対してロードされ、タンパク質がＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離され、エレクトロブロットされ、モノクローナル抗ＧＦＰ抗体およびローディング対照としての抗チューブリンでプローブされた。特に、ＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ１または２をコードする発現プラスミドに関してチューブリンでなくＧＦＰおよびＹＦＰ−フィブリラリンレベルの低下に留意されたい。（Ｂ）グラフは３つの独立した実験の平均シグナル強度および標準偏差を示す。ＧＦＰシグナル比はチューブリンシグナルに規準化された。特に、ＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ１または２をコードする発現プラスミドに関してチューブリンでなくＧＦＰおよびＹＦＰ−フィブリラリンレベルの低下に留意されたい。（Ｃ）空ｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミドｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１（対照：レーン１）、発現プラスミドＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ１（レーン２）または発現プラスミドＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ２（レーン３）を用いた、ＨｅＬａＹＦＰ−ＦＩＢＲＩＬＬＡＲＩＮ安定細胞株のトランスフェクション後のＹＦＰ−フィブリラリンのＲＮＡレベルの検出。同等量のＨｅＬａ細胞全ＲＮＡが各レーンに対してロードされ、ＲＮＡが６．５％ホルムアルデヒド−０．８％アガロースゲルによって分離され、エレクトロブロットされ、放射標識された抗ＹＦＰオリゴおよびローディング対照としての抗１８Ｓ ｒＲＮＡでプローブされた。グラフは３つの独立した実験の平均シグナル強度および標準偏差を示す。ＹＦＰ−フィブリラリンシグナル比は１８Ｓ ｒＲＮＡシグナルに規準化された。（Ｄ）キメラｓｎｏＲＮＡプラスミドのトランスフェクション効率。ｍｃｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲにより定量された。一過性にトランスフェクトされたｍＣｈｅｒｒｙプラスミド（対照）およびキメラｓｎｏＲＮＡからＨｅＬａ細胞全ＲＮＡが単離された。グラフは３つの独立した実験の平均シグナル強度を示す。ｍＣｈｅｒｒｙシグナル比はＧＡＰＤＨシグナルに規準化された。
【図１０】キメラ１および２を用いた遺伝子ノックダウンの別例を示す概略図である。これは図８ＣおよびＤに示されるものと同じ実験設計であるが、この場合、安定細胞株ＨｅＬａＧＦＰ−ＳＭＮを用いている。ｍＣｈｅｒｒｙ−ＨＢＩＩ−１８０Ｃは、ｍＣｈｅｒｒｙ ｃＤＮＡの３’領域に野生型ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡ配列を有する別の陰性対照である。矢印はトランスフェクトされた細胞を示し、矢頭はトランスフェクトされなかった細胞を示す。特に、ＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ１またはキメラ２をコードする発現プラスミドをトランスフェクトされた細胞におけるＧＦＰ発現の明らかな低下に留意されたい。
【図１１】三重キメラｓｎｏＲＮＡプラスミドを用いた標的遺伝子ノックダウンを示す概略図である。（Ａ）三重キメラｓｎｏＲＮＡ構築物の構造および標的ＧＦＰ／ＹＦＰノックダウンの概略図。（Ｂ）（Ｃ）これは図８ＣおよびＤにおいて用いられるものと同じ実験設計であるが、この場合、トランスフェクションのために三重キメラプラスミドを用いている。Ｍｃｈｅｒｒｙ三重ＨＢＩＩ−１８０Ｃは、ｍＣｈｅｒｒｙ ｃＤＮＡの３’領域に野生型ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡ配列の３つのリピートを有する別の陰性対照である。矢印：トランスフェクト、矢頭：トランスフェクトされず。（Ｄ）ＧＦＰ／ＹＦＰに標的化された各キメラプラスミドのノックダウン効率がウエスタンブロット法により試験された（レーン１〜５）。ｍＣｈｅｒｒｙおよび野生型ＨＢＩＩ−１８０Ｃ発現プラスミドｍＣｈｅｒｒｙ−ＨＢＩＩ−１８０Ｃ（対照：レーン１）、発現プラスミドキメラ１（レーン２）、キメラ２（レーン３）、キメラ３（レーン４）、ＨＢＩＩ−１８０Ｃ三重キメラ（レーン５）を用いた、ＨｅＬａＹＦＰ−ＦＩＢＲＩＬＬＡＲＩＮ安定細胞株のトランスフェクション後のＹＦＰ−フィブリラリンに対するタンパク質レベルの検出。同等量のＨｅＬａ抽出物が各レーンに対してロードされ、タンパク質がＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離され、エレクトロブロットされ、モノクローナル抗ＧＦＰ抗体およびローディング対照としての抗Ｂ２３でプローブされた。グラフはＢ２３シグナルにより規準化したＹＦＰ−フィブリラリンシグナル強度を示した。特に、キメラ１，２および３をコードする発現プラスミドに関する、Ｂ２３でなくＹＦＰ−フィブリラリンレベルの低下に留意されたい。ＹＦＰ−フィブリラリン発現レベルを低下させる効率性は三重キメラプラスミドを用いることによって高められた。（Ｅ）これは図１１ＢおよびＣに示されるものと同じ実験設計であるが、この場合、キメラ安定細胞株ＨｅＬａＧＦＰ−ＳＭＮを用いている。三重キメラプラスミドに媒介される標的遺伝子発現の低下は、ＧＦＰ−ＳＭＮ融合タンパク質の別の安定細胞株を用いても検出された。矢印：トランスフェクト、矢頭：トランスフェクトされず。
【図１２】三重キメラプラスミドからのキメラｓｎｏＲＮＡの同定を示す概略図である。（Ａ）野生型ＨＢＩＩ−１８０ＣおよびキメラｓｎｏＲＮＡ（Ｃｙ３）の核小体局在を示す蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。ＤＮＡはＤＡＰＩによって染色される。バーは１０ｕＭである。三重キメラｓｎｏＲＮＡ構築物の構造は上部パネルに示される。矢印は核小体を示す。（Ｂ）ＨＢＩＩ−１８０ＣおよびキメラｓｎｏＲＮＡの特徴付け。ＨＢＩＩ−１８０ＣおよびキメラｓｎｏＲＮＡの細胞内分布を示すＲＮＡブロット。特定のプローブを用いてノーザンＲＮＡブロット解析により同量のＨｅＬａ細胞全ＲＮＡ（レーン１）、細胞質ＲＮＡ（レーン２）、核質ＲＮＡ（レーン３）および核小体ＲＮＡ（レーン４）が、一過性にトランスフェクトされた野生型またはキメラｓｎｏＲＮＡ発現ミニ遺伝子と比較された。ｔＲＮＡ−ＩＩｅ特異的プローブを用いて分画の質が試験された（下部パネル）。
【図１３】ＨＢＩＩ−１８０ＣおよびキメラｓｎｏＲＮＡ変異の分析を示す概略図である。（Ａ）８つの別個の３ヌクレオチドＡＡＡ変異の位置をｍ１〜ｍ８として（配列上に図示）ｓｎｏＲＮＡ ＨＢＩＩ−１８０Ｃの配列が示される。ボックスＣ，ＤおよびＤ’はボックスで示される。２８Ｓ ｒＲＮＡと相補的な予測ガイド配列はｓｎｏＲＮＡＢａｓｅに示されるように下線で示される（非特許文献１７（１９））。Ｍボックス領域は太字下線で示される。ＨｅＬａ細胞は、空プラスミドベクター（レーン２）または野生型ＨＢＩＩ−１８０Ｃ（レーン３）若しくはＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡ変異体ｍ１〜８（レーン４〜１１）を発現するプラスミドベクターを一過性にトランスフェクトされた。各レーンに対して同量の全ＨｅＬａ細胞ＲＮＡがロードされた（対照：トランスフェクションなし）。バンドは、ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡおよびｔＲＮＡをそれぞれ検出するために放射標識オリゴヌクレオチドプローブを用いた高感度ＲＮＡブロット法の結果を示す。Ｃ１９ｏｒｆ４８およびＧＡＰＤＨ特異的プライマーセット（Ｃ１９ｏｒｆ４８およびＧＡＰＤＨ）を用いた半定量的ＲＴ−ＰＣＲによってトランスフェクション効率が確認された。＊Ｃ１９ｏｒｆ４８プライマーは内因性Ｃ１９ｏｒｆ４８転写物とＨＢＩＩ−１８０Ｃミニ遺伝子とが共有する領域を検出する。（Ｂ）野生型プラスミド（ＣＭ２ＷＴ）および変異プラスミド（ＣＭ２ｍ１およびｍ７）はＧＦＰ単独安定細胞（ＨｅＬａＧＦＰ）またはＧＦＰ−ＳＭＮ融合タンパク質安定細胞株（ＨｅＬａＧＦＰ−ＳＭＮ）に一過性にトランスフェクトされた。矢印：トランスフェクト、矢頭：トランスフェクトされず。キメラ２プラスミド上のＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡのボックスＣ（ＣＭ２ｍ１）およびボックスＤ（ＣＭ２ｍ７）（図１３Ａ）がＧＦＰおよびＧＦＰ−ＳＭＮ発現レベルに対するノックダウン作用を示さなかったため、コア領域の変異に留意されたい。（Ｃ）変異プラスミド（ＣＭ２ｍ２−１，ｍ２−２およびｍ３）はＧＦＰ−ＳＭＮ融合タンパク質安定細胞株（ＨｅＬａＧＦＰ−ＳＭＮ）に一過性にトランスフェクトされた。矢印：トランスフェクト、矢頭：トランスフェクトされず。２８Ｓ ｒＲＮＡ相補配列を破壊された変異プラスミド（ＣＭｍ２−１およびｍ２−２）の明らかなノックダウン作用があることに留意されたい。（Ｄ）ＧＦＰとの相補性を高めるためにＭボックスに挿入（ＣＭ２Ｉｎ−１〜−３）またはＭボックスに欠失（ＣＭ２Ｄｅｌ−１〜−３）を有する変異プラスミドは、ＧＦＰ−ＳＭＮ融合タンパク質安定細胞株（ＨｅＬａＧＦＰ−ＳＭＮ）に一過性にトランスフェクトされた。矢印：トランスフェクト、矢頭：トランスフェクトされず。（Ｅ）Ｍボックスに点変異（ＣＭ２Ｘ−１〜−６）を有する変異プラスミドは、ＧＦＰ−ＳＭＮ融合タンパク質安定細胞株（ＨｅＬａＧＦＰ−ＳＭＮ）に一過性にトランスフェクトされた。矢印：トランスフェクト、矢頭：トランスフェクトされず。（Ｆ）キメラ２変異原性の結果の概要。左パネルはＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡのモチーフおよび各プラスミドの変異領域を示す（表中のプラスミド名および変異位置）。表は顕微鏡分析の結果を示す（図１３Ｂ〜Ｅ）。ノックダウン効率は、無作為に選択された３０個のトランスフェクトされた細胞を数えることにより決定されたＧＦＰ−ＳＭＮレベルの抑制を示した細胞の数を示す（＋＋＋：１６超、＋＋：１３〜１６、＋：９〜１２、−：５〜８，−−：５未満）。
【図１４】ｓｎｏＲＮＡ骨格変異の組合せを組み込んだ三重キメラプラスミドが標的遺伝子の発現のノックダウンを媒介することができることを示す概略図である。（Ａ）変異ｍ２，ｍ４およびｍ５配列はすべて組み合わせられ、三重キメラｓｎｏＲＮＡ（ｓｎｏＭＥＮｖ１）に組み込まれた。核小体局在を示す、Ｃｙ３標識キメラｓｎｏＲＮＡ特異的プローブ（Ｃｙ３）を用いた蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。ＤＮＡはＤＡＰＩによって染色される。バーは１５ｕｍである。矢印は核小体を示す。（Ｂ）これは図１１Ｅに示されるものと同じ実験設計であるが、但し三重キメラｓｎｏＭＥＮｖ１プラスミドがトランスフェクトされた。ｓｎｏＭＥＮｖ１プラスミドが野生型三重キメラプラスミドと同様の標的遺伝子の低下レベルを示したことに留意されたい。
【図１５】内因性ＳＭＮ１タンパク質の標的タンパク質置換を示す概略図である。（Ａ）標的内因性ＳＭＮ１遺伝子ノックダウンプラスミド（ＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１）およびＳＭＮ１タンパク質置換プラスミド（ＧＦＰ−ＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１−ＰＲ）の構造。これらの構築物は三重キメラｓｎｏＭＥＮｖ１と同様の三重ｓｎｏＭＥＮ配列を有するが（図１４Ａ）、但し、Ｍボックス配列は内因性ＳＭＮ１ ｍＲＮＡ前駆体特異的配列に対する相補配列を有する（材料および方法を参照されたい）。（Ｂ）標的内因性ＳＭＮ１プラスミド（ＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１）およびタンパク質置換プラスミド（ＧＦＰ−ＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１−ＰＲ）はＨｅＬａ細胞にトランスフェクトされた。ＧＦＰ ｃＤＮＡおよびｍｃｈｅｒｒｙ三重キメラプラスミド（図１４Ａ）を発現するＥＧＦＰ−Ｃ１も対照としてＨｅＬａ細胞に一過性にトランスフェクトされた（ＧＦＰおよび三重キメラ）。ＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１が、対照が示さなかった細胞傷害表現型を示したことに留意されたい。この細胞傷害作用はＧＦＰ−ＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１−ＰＲプラスミドを用いてＧＦＰ−ＳＭＮ１融合タンパク質の発現によってレスキューされた。矢印：トランスフェクトされた細胞、矢頭：細胞傷害表現型細胞。（Ｃ）ｍＣｈｅｒｒｙ三重キメラ（対照：レーン１）およびＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１（レーン２）を用いたＨｅＬａ細胞のトランスフェクション後の内因性ＳＭＮ１に対するタンパク質レベルの検出。同等量のＨｅＬａ抽出物が各レーンに対してロードされ、タンパク質がＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離され、エレクトロブロットされ、モノクローナル抗ＳＭＮ１抗体およびローディング対照としての抗Ｂ２３でプローブされた。グラフはＢ２３シグナルにより規準化したＳＭＮ１シグナル強度を示した。
【図１６】本発明のｓｎｏＲＮＡ分子を有するレンチウイルス系を示す概略図である。これは図１１Ｂにて行われ、説明されたものと同じ実験設計であるが、但し、この場合、発現ベクターはレンチウイルスベクター系（Ｌｅｎｔｉ−Ｘ（商標）Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてトランスフェクトされた。ｍＣｈｅｒｒｙ三重ＨＢＩＩ−１８０Ｃは、ｍＣｈｅｒｒｙ ｃＤＮＡの３’領域に野生型ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡ配列の３つのリピートを有する陰性対照である。矢印：トランスフェクトされた細胞、矢頭：トランスフェクトされなかった細胞。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
（略語）
ｓｎｏＲＮＡ：核小体低分子ＲＮＡ
ｓｎＲＮＡ：核内低分子ＲＮＡ
ｒＲＮＡ：リボソームＲＮＡ
ｔＲＮＡ：トランスファーＲＮＡ
ＦＧＦＲ３：線維芽細胞増殖因子受容体３
ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ
ｐｒｅ−ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ前駆体
ＧＡＰＤＨ：グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ
ＨＢＩＩ−１８０Ｃ：ヒト脳ｓｎｏＲＮＡ ＩＩ−１８０Ｃ
ＣＩＰ：仔ウシ腸管ホスファターゼ
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＣＭＶ：サイトメガロウイルス
【００９６】
（材料および方法）
核小体ｃＤＮＡライブラリーの構築。前述のようにショ糖密度勾配法を用いてＨｅＬａ細胞核小体を精製した（非特許文献７）。製造業者の指示に従って（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＤＮＡ分解酵素Ｉ処理によるＴＲＩｚｏｌ法によって精製核小体から核小体ＲＮＡを単離した。ポリＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて３’末端における２０〜３０ｍｅｒのポリアデニン配列の付加により核小体ＲＮＡを修飾した。非増幅ライブラリーの場合（図４Ｂ左側）、オリゴｄＴプライマーを用いた逆転写により、１０ｕｇのポリＡテール核小体ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。製造業者により説明されているように（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたニックトランスレーション置換法により第二鎖ｃＤＮＡを合成した。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端を生成した後、二本鎖ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにクローニングした。増幅ライブラリーの場合（図４Ｂ右側）、ＣＩＰステップなしにＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて核小体ｃＤＮＡを作製した。製造業者により説明されているように（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、アダプター特異的プライマーを用いた短時間のＰＣＲ増幅（例えば、５秒のポリメラーゼ反応）により、小さいサイズの二本鎖ｃＤＮＡを増幅した。製造業者の指示に従って、増幅されたｃＤＮＡをＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクターにクローニングした。
【００９７】
ノーザンブロット分析およびＲＴ−ＰＣＲ。製造業者の指示に従って（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＤＮＡ分解酵素Ｉ処理によるＴＲＩｚｏｌ法により、ＨｅＬａ細胞核小体およびＨｅＬａ細胞またはヒト線維芽細胞一次細胞株であるＷＩ３８細胞から核小体ＲＮＡおよび全細胞ＲＮＡを単離した。ＴＢＥ緩衝液中８Ｍ尿素ポリアクリルアミド変性ゲルによって同量のＲＮＡを分離する。エレクトロブロット法によりＲＮＡをナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社）上に移した。ＵＶ架橋結合後、標準的方法を用いてブロットされた膜を３２Ｐ標識特異的プローブとハイブリダイズした（Ｕ３：５’−ＣＡＣＴＣＡＧＡＣＣＧＣＧＴＴＣＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＡＡＴＡＣＧＧ−３’，ＨＢＩＩ−１８０Ｃ：５’−ＡＡＡＧＧＴＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＧＡＴＣＡＧＡ−３’．ＨＢＩＩ−８５：５’−ＡＣＧＡＣＧＧＴＡＴＧＡＧＴＴＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴＴＴＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＣＣ−３’）。各ｓｎｏＲＮＡの発現レベルを確認するためにＲＴ−ＰＣＲも行った。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ １ステップＲＴ−ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて遺伝子特異的プライマーにより逆転写およびＰＣＲを行った（Ｕ３：５’−ＡＧＡＧＧＴＡＧＣＧＴＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＧＣＧ−３’および５’−ＡＣＣＡＣＴＣＡＧＡＣＣＧＣＧＴＴＣＴＣ−３’，ＨＢＩＩ−１８０Ｃ：５’−ＣＴＣＣＣＡＴＧＡＴＧＴＣＣＡＧＣＡＣＴ−３’および５’−ＣＴＣＡＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＴＧＴＣＡＡ−３’，ＨＢＩＩ−８５：５’−ＧＡＴＣＧＡＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＣＣＣＡＴＡＡＡＡＡＣ−３’および５’−ＧＡＣＣＴＣＡＧＴＴＣＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣＧＡＣＧＧ−３’）。直線サイクルを決定するため、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ １ステップｑＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ＲＧ−３０００システム（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いたリアルタイムＰＣＲを用いた。テンプレートとして同量のＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ反応に用いた。各実験を独立して３回繰り返した。
【００９８】
プラスミドの構築およびトランスフェクション。Ｃ１９ｏｒｆ４８遺伝子のエクソン２〜３由来の配列をｐｃＤＮＡ３．１哺乳動物発現プラスミドのＣＭＶプロモーターの３’領域に挿入し、ＨＢＩＩ−１８０Ｃ発現ベクターを作製した。部位特異的変異誘発によって野生型構築物から変異構築物を樹立した（変異体１、図６Ｂ）。内因性ＨＢＩＩ−１８０Ｃの機能を抑制するためにＦＧＦＲ３イントロン１７発現ミニ遺伝子を樹立した。ＦＧＦＲ３配列のエクソン１７〜１８をｐｃＤＮＡ３．１哺乳動物発現プラスミドのＣＭＶプロモーターの３’領域に挿入した（図７Ａ）。部位特異的変異誘発によって野生型構築物から変異構築物を樹立した（Ｆｒｍ、図４Ａ）。部位特異的変異誘発によって野生型ＨＢＩＩ−１８０Ｃ発現構築物から抗ＧＦＰ／ＹＦＰ ＨＢＩＩ−１８０Ｃ構築物を樹立した（キメラ１および２、図８Ａ）。図８Ａに示すように、変異挿入物を哺乳動物発現プラスミドｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１のｍＣｈｅｒｒｙ ｃＤＮＡの３’領域にサブクローニングした。ＷＩ３８細胞に対してリン酸カルシウム法を用いて、また、ＨｅＬａ細胞および他のＨｅＬａ安定細胞株に対して「エフェクチン（ｅｆｆｅｃｔｉｎｅ）」トランスフェクション試薬（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、プラスミドをトランスフェクトした。リン酸カルシウム法は下述のように行った。
【００９９】
死滅細胞数。１０ｃｍの皿上にＷＩ３８細胞を散布した。細胞の付着と同時にプラスミドをトランスフェクトした。３日後に死滅細胞のパーセントを５回計算し、各回に計算のために１００個の細胞を無作為に選択した。次に、死滅細胞の平均パーセントを５回の別個の計数からの平均として計算した。各実験を独立して３回繰り返した（図８Ｄ）。
【０１００】
ＦＧＦＲ３スプライスｍＲＮＡバリアント（ｖａｌｉａｎｔ）の検出。遺伝子特異的プライマーセットを用いた１ステップＲＴ−ＰＣＲにより（ＦＧＦＲ３：５’−ＴＧＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＧＣＧＣＴＣＣＣＣＧＣ−３’および５’−ＣＣＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＣＧＧＧＣＣＣＧＡＧＡＣＡＧ−３’，ＧＡＰＤＨ：５’−ＣＧＣＡＴＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＣＣＡＧ−３’および５’−ＧＧＴＣＡＡＴＧＡＡＧＧＧＧＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＣ−３’）、ＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡのスプライシングバリアント（ｖａｌｉａｎｔ）を検出した（図７ＢおよびＣ）。ＦＧＦＲ３イントロン１７発現プラスミドをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。４８時間後、製造業者の指示に従って（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＤＮＡ分解酵素Ｉ処理によるＴＲＩｚｏｌ法により、ＨｅＬａ細胞、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞およびＷＩ３８細胞から全ＲＮＡを単離した。上述のように（ノーザンブロット分析およびＲＴ−ＰＣＲ）、各ＲＴ−ＰＣＲに対して同量のＲＮＡをテンプレートとして用いた。
【０１０１】
細胞の撮像。Ｄｅｌｔａｖｉｓｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｉｓ蛍光顕微鏡（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ社）を用いてすべての細胞画像を記録した。ＷＩ３８，ＨｅＬａ ＹＦＰ−ＦＩＢ細胞およびＨｅＬａ ＧＦＰ細胞の生細胞画像を過去に示されているように作成した（非特許文献７、非特許文献１０（１５）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌａｍｏｎｄｌａｂ．ｃｏｍ／ｆ７ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｈｔｍ）。６０倍（ＮＡ １．４）Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ対物レンズを用いて細胞を撮像した。各視野および各露出に対して０．５μｍ離れた１２の光学切片を記録した（ＳｏｆｔＷｏＲｘ画像処理ソフトウェア、Ａｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ社）（図４Ａ、図６Ｃ、図８ＣおよびＤ）。以下のように前述した手順を用いてＷＩ３８，ＨｅＬａ ＹＦＰ−ＦＩＢ細胞およびＨｅＬａ ＧＦＰ細胞の固定細胞画像を作成した。
【０１０２】
３．８％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定した。１％トリトンＸ−１００による透過処理後、ＤＡＰＩによって細胞を染色した。
【０１０３】
（結果セクション）
本発明者らは、哺乳動物細胞株から単離された核小体に関する大規模な精製およびプロテオミクス研究を行った（非特許文献６，７，８）。ヒト核小体プロテオームを詳細に特徴付けた（非特許文献４、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌａｍｏｎｄｌａｂ．ｃｏｍ／ＮＯＰｄｂ／も参照されたい）。ＨｅＬａ細胞から単離された核小体のＲＮＡ組成も分析した。ＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞から単離された、高度に濃縮された核小体調製物から精製され、短時間の増幅反応後にサイズ分画され、サブクローニングされ（図４における方法を参照されたい）、配列決定された。この分析により、５６２の既知のｓｎｏＲＮＡおよび７つの新規ｓｎｏＲＮＡを含む５８９のｓｎｏＲＮＡクローンが同定された。
【０１０４】
ＨＢＩＩ−１８０Ａ，ＨＢＩＩ−１８０ＢおよびＨＢＩＩ−１８０Ｃと称される、検出された３つの既知のボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡは各々、Ｃ１９ｏｒｆ４８と称される転写物の別個のイントロンにおいてコードされ（図５ＣおよびＤ）、Ｃ１９ｏｒｆ４８と称される転写物は多剤耐性癌細胞において増殖されることが過去に報告された（非特許文献９）。３つのＨＢＩＩ−１８０ ｓｎｏＲＮＡの各々は、２８Ｓ ｒＲＮＡ上のヌクレオチド位置３６８０における同じ２’−Ｏ−リボースメチル化部位を標的とする（図５ＡおよびＢ）。これらのｓｎｏＲＮＡをコードする遺伝子はｑ１３．３３位置にて第１９染色体上にある。Ｃ１９ｏｒｆ４８遺伝子配列の進化的比較は、主要な保存がそれぞれのエクソン配列ではなくイントロンにコードされたｓｎｏＲＮＡに対応することを示す。これは、Ｃ１９ｏｒｆ４８遺伝子の主な機能がタンパク質というよりもｓｎｏＲＮＡをコードすることである可能性があることを示す（図５）。
【０１０５】
予想外に、ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡの配列解析により、ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡが２８Ｓ ｒＲＮＡメチル化ガイド配列の３’側に位置する２１ヌクレオチド領域を有し、１９／２１ヌクレオチドがヒト線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）遺伝子から転写されるｍＲＮＡ前駆体のイントロン１７内の領域と相補的であることが明らかになった（図５ＡおよびＢ）。ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡの発現レベルの比較は、ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡがＨｅＬａ細胞において高度に発現されるが、一次線維芽細胞（ＷＩ３８細胞）においては低レベルでしか存在しないことを示した（図６Ａ）。
【０１０６】
本発明者らは、転写を促進するためにＣＭＶプロモーターを用いたＨＢＩＩ−１８０Ｃミニ遺伝子によるプラスミドベクターの一過性トランスフェクションにより、ＷＩ３８細胞においてＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡを外因的に過剰発現させた（図６Ｂ）。これはトランスフェクトされたＷＩ３８細胞のアポトーシスを生じさせた。しかし、本発明者らがＦＧＦＲ３のイントロン１７と相補的な領域内の３ヌクレオチドの配列変化によりＨＢＩＩ−１８０Ｃの変異体を一過性に発現させる（即ち、ＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡ前駆体との相補性を低下させる）と、これはもはやＷＩ３８細胞においてアポトーシスを生じさせなかった（図６Ｂ〜Ｄ）。ＨｅＬａ細胞では、内因性ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡと相補的な標的ＦＧＦＲ３イントロン１７配列のプラスミドベクターからの過剰発現は、発現されるＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡアイソフォームの比率の明瞭な変化を生じさせた（図７ＡおよびＢ）。これは、ＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡの短いアイソフォームのＨｅＬａ細胞の増加をもたらし、ＷＩ３８細胞において通常発現されるものと同様のＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡアイソフォームのパターンを生じさせた（図７Ｃ）。
【０１０７】
これらのデータは、ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡの発現レベルがＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡの発現レベルに影響を及ぼし得ることを示す。更に、データは、この作用がＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡ前駆体のイントロン１７における領域と相補的な配列のＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡにおける存在に依存することを示す。
【０１０８】
次に、本発明者らは、ｓｎｏＲＮＡ ＨＢＩＩ−１８０ＣのＦＧＦＲ３ ＲＮＡ発現の発現を調節する能力が、ＨＢＩＩ−１８０Ｃの構造を修飾し、ＦＧＦＲ３相補配列領域を１つ以上の標的ＲＮＡと相補的な配列に置換することにより、特定の標的ＲＮＡの発現を調節するように適合され得るかを試験した。従って、ＣＭＶプロモーターから発現され、ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡ骨格を含み、ＨＢＩＩ−１８０Ｃイントロンを含むミニ遺伝子を有する、キメラ１および２と称される、図５ＡおよびＢに示されるベクターが構築された。ベクターは、ベクターを含むトランスフェクトされた細胞の即座の検出を可能にするため、ＣＭＶプロモーターから発現されるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質もコードした。ＨＢＩＩ−１８０ＣにおけるＦＧＦＲ３相補領域はＧＦＰ ＲＮＡと相補的な配列に置換された（図８、ＡおよびＢ参照）。挿入配列は、５’−ＧＡＣＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣ−３’（キメラ１）および５’−ＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣ−３’（キメラ２）であり、ｗｔ ＨＢＩＩ−１８０Ｃにおける５’−ＣＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＴＧＣＡ−３’を置換した。
【０１０９】
キメラ発現ベクターおよびｍＣｈｅｒｒｙのみを発現する等価なベクター（ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１）は各々、非融合ＧＦＰのみを安定に発現するａ／ａ ＨｅＬａ細胞株またはフィブリラリンと融合したＹＦＰを安定に発現するｂ／ａ ＨｅＬａ細胞株に一過性にトランスフェクトされた（図８、ＣおよびＤ）。細胞はトランスフェクション後４８時間にて固定され、蛍光顕微鏡法によりＧＦＰ／ＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ発現レベルが分析された。これは、それぞれのＨｅＬａ安定細胞株におけるＧＦＰ蛍光レベルが、ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡ骨格内にＧＦＰと相補的な配列を含むように操作されたベクターをトランスフェクトされた細胞において特異的に低下することを示した。この低下はｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞においてのみ認められ、トランスフェクトされた細胞において特異的に生じたことを確認した。対照的に、ｓｎｏＲＮＡを欠くｍＣｈｅｒｒｙベクターをトランスフェクトされた細胞は、ｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞とｍＣｈｅｒｒｙを発現しない細胞との間に有意なＧＦＰ蛍光の減少またはＧＦＰレベルの変動を示さなかった（図８ＣおよびＤ）。データは、ＧＦＰ単独或いは密接に関連するＹＦＰによって形成される融合タンパク質および細胞タンパク質（フィブリラリン）の発現がともに、特異的に標的化・操作されたｓｎｏＲＮＡ発現ベクターの発現を通じて調節され得ることを示す。
【０１１０】
これらのデータは、本発明者らが作製したｓｎｏＲＮＡ発現ベクターの配列および構造が所望の特定のＲＮＡ標的を標的とするように操作され、これにより、その発現を調節することができることを示す。
【０１１１】
（更なる材料および方法）
ノーザンおよび高感度ＲＮＡブロット分析。前述のようにショ糖密度勾配法を用いてＨｅＬａ細胞抽出物を分画した。製造業者の指示に従って（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＤＮＡ分解酵素Ｉ処理によるＴＲＩｚｏｌ法を用いて全ＨｅＬａ細胞ＲＮＡ並びに別個の細胞質、核質および核小体画分由来のＲＮＡを単離した。１倍ＴＢＥ緩衝液中８Ｍ尿素ポリアクリルアミド変性ゲル電気泳動によって各試料由来の同量のＲＮＡを分離し、エレクトロブロット法によりＲＮＡをナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社）上に移した。ＵＶ架橋結合後、膜を、以下のＲＮＡ種；（ＨＢＩＩ−１８０Ａ，ＨＢＩＩ−１８０Ｂ，ＨＢＩＩ−１８０ＣおよびｔＲＮＡ）に特異的な３２Ｐ ５’末端標識オリゴリボヌクレオチドプローブとハイブリダイズした。前述のように（非特許文献１２）、高感度ＲＮＡブロットを作成した。
【０１１２】
（二次構造）
すべてのＲＮＡ二次構造をＲＮＡｓｔｒａｃｔｕｒｅ ４．５（非特許文献１３）によって予測し、ＲｎａＶｉｚ ２．０（非特許文献１４）を用いてこれに注釈を付けた。
【０１１３】
（プラスミドの構築およびトランスフェクション）
Ｃ１９ｏｒｆ４８遺伝子のエクソン２〜３由来の配列をｐｃＤＮＡ３．１哺乳動物発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）におけるＣＭＶプロモーターの３’側に挿入し、ＨＢＩＩ−１８０Ｃ発現ベクターを作製した。部位特異的変異誘発によって野生型ＨＢＩＩ−１８０Ｃ発現ミニ遺伝子構築物からＨＢＩＩ−１８０Ａ，ＢおよびＨＢＩＩ−１８０Ｃの変異構築物を樹立した。「エフェクチン（ｅｆｆｅｃｔｉｎｅ）」トランスフェクション試薬（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。
【０１１４】
（細胞の撮像）
Ｄｅｌｔａｖｉｓｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｉｓ蛍光顕微鏡（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ社）を用いてすべての細胞画像を記録した。ＨｅＬａＹＦＰ−Ｆｌｂｒｉｌｌａｒｉｎ細胞およびＨｅＬａＧＦＰ細胞の生細胞画像を過去に示されているように作成した（非特許文献１０（１５）および１１（１６）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌａｍｏｎｄｌａｂ．ｃｏｍ／ｆ７ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｈｔｍ）。６０倍（ＮＡ １．４）Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ対物レンズを用いて細胞を撮像した。各視野および各露出に対して０．５μｍ離れた１２の光学切片を記録した（ＳｏｆｔＷｏＲｘ画像処理ソフトウェア、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ社）。
【０１１５】
（結果セクション）
（標的タンパク質および／またはｍＲＮＡ発現レベルに対する修飾ｓｎｏＲＮＡの作用）
ノーザンブロット分析は、Ｇ／ＹＦＰ ｍＲＮＡ配列に標的化されたキメラｓｎｏＲＮＡの一過性トランスフェクションがＧ／ＹＦＰ ｍＲＮＡレベルを抑制することを示した（図９ＣおよびＤ）。この結果は、既述のようにキメラｓｎｏＲＮＡが標的ｍＲＮＡ発現レベルに影響を及ぼし得ることを示唆した（図１および２）。複数の修飾ｓｎｏＲＮＡが、来れらの効率を高めるために１つの転写物に発現され得る。
【０１１６】
図１１Ａのように三重キメラｓｎｏＲＮＡ構築物を樹立した。このプラスミド（三重キメラ）は、この場合にトランスフェクションマーカーとして用いられるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質ｃＤＮＡの３’側のＧ／ＹＦＰ ｍＲＮＡ配列の異なる位置を標的とする３つの修飾ｓｎｏＲＮＡをコードする（図１１Ａ）。この三重キメラプラスミドを用いた一過性トランスフェクション実験は、蛍光顕微鏡法によって判定されるように単一キメラプラスミドで見られるものと同様のＧ／ＹＦＰおよびＧ／ＹＦＰ融合タンパク質に対する抑制作用を示した（図１１Ｂ，Ｃ，Ｅ）。ウエスタンブロット分析は、三重キメラ構築物の抑制効率が単一キメラｓｎｏＲＮＡより強いことを示した（図１１Ｄ）。各キメラｓｎｏＲＮＡに特異的なプローブを用いたＦＩＳＨ分析および分画ノーザンブロット分析は、三重キメラプラスミドが野生型ＨＢＩＩ−１８０Ｃに関して見られるような各修飾キメラ１〜３ ｓｎｏＲＮＡを生成することを示した（図１２ＡおよびＢ）。これらの結果は、複数のｓｎｏＲＮＡを１つの転写物に発現することにより（マルチプレクシング）、修飾ｓｎｏＲＮＡが標的ノックダウンの効率を高めることができることを示唆した。更に、三重キメラプラスミドはＧ／ＹＦＰおよびＧ／ＹＦＰ融合タンパク質の代わりにｍＣｈｅｒｒｙ赤色蛍光タンパク質を発現した（図１１Ｂ，Ｃ，Ｅ）。これらの結果は、修飾ｓｎｏＲＮＡを用いることによってＧ／ＹＦＰおよびＧ／ＹＦＰ融合タンパク質をｍＣｈｅｒｒｙに置換し、従って、「タンパク質置換」または「タンパク質ノックイン」作用を実証し得ることも示唆した。
【０１１７】
修飾ｓｎｏＲＮＡの詳細な構造分析およびそれらのノックダウン能力。修飾ｓｎｏＲＮＡのノックダウン能力は、プロセシングされたｓｎｏＲＮＡから生じ得、或いはｓｎｏＲＮＡプロセシングとは独立してＣ１９ｏｒｆ４８ ｍＲＮＡ前駆体から直接形成され得る（図５Ｃ）。後者の可能性は、Ｄｒｏｓｈａとは独立してプロセシングされる、イントロンにコードされたマイクロＲＮＡの近年の報告によって示唆されている。これらの可能性を区別するため、ＨＢＩＩ−１８０Ｃミニ遺伝子の８つの別個の領域に一連の３つの塩基変異を導入し、ＷＴとＨＢＩＩ−１８０Ｃの変異形態との間で両方の完全長ｓｎｏＲＮＡの発現を比較した（図１３Ａ）。ＷＴ ＨＢＩＩ−１８０Ｃミニ遺伝子ベクターの発現は内因性レベルを超えて完全長ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡのレベルを上昇させるが、空ベクターはこれを上昇させない（図１３Ａ、レーン１をレーン２および３と比較されたい）。保存ＣまたはＤボックス内の配列変化を含む多重変異は、外因性完全長ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡの発現を低下させ、または排除し、ｓｎｏＲＮＡの内因性レベルのみを残す（図１３Ａ、レーン４〜１１）。ＨＢＩＩ−１８０Ｃ発現レベルが低下する各々の場合、修飾ｓｎｏＲＮＡキメラ２のノックダウン能力レベルの対応する低下がある（図１３Ａ、レーン３をレーン４および１０と比較されたい。また、図１３Ｂ ｍ１およびｍ７、図１３Ｆ）。これは、修飾ｓｎｏＲＮＡのノックダウン能力が先行するｓｎｏＲＮＡプロセシングに依存することを示し、Ｃ１９ｏｒｆ４８ ｍＲＮＡ前駆体転写物から直接のノックダウン能力のためのｓｎｏＲＮＡから独立した経路がない可能性があることを主張するものである。ｓｎｏＲＮＡガイド配列において２８Ｓ ｒＲＮＡとの相補性を破壊するＨＢＩＩ−１８０Ｃにおけるｍ２変異は、ｓｎｏＲＮＡ形成および修飾ｓｎｏＲＮＡのノックダウン効率を阻止しない（図１３Ａ、レーン５、図１３ＣおよびＦ ｍ２−１，ｍ２−２）。従って、修飾ｓｎｏＲＮＡの標的遺伝子の発現をノックダウンする能力は、ｓｎｏＲＮＡのｒＲＮＡに結合し、これをメチル化する能力に依存しない。ボックスＤ’を破壊するＨＢＩＩ−１８０Ｃにおけるｍ３変異は、ｓｎｏＲＮＡ形成およびノックダウン効率をわずかに低下させ、阻止する（図１３Ａ，Ｃ，Ｆ）。これは、Ｍボックスの外側領域を変異させることによって修飾ｓｎｏＲＮＡのノックダウン能力を修飾し得ることを示唆した。
【０１１８】
ノックダウン能力とＭボックス配列長との関連を試験するため、修飾ｓｎｏＲＮＡ キメラ２におけるＭボックス配列の挿入および欠失変異体を樹立した（図１３ＤおよびＦ）。Ｇ／ＹＦＰ ｍＲＮＡと相補的な配列を増加させた３つの挿入変異体はすべて、野生型キメラ２プラスミドと同様のノックダウン活性を示した（図１３ＤおよびＦ Ｉｎ１−３）。注目すべきことに、Ｇ／ＹＦＰ ｍＲＮＡに対する８塩基の付加相補配列を有する挿入変異体ＣＭ２Ｉｎ−３は向上したノックダウン効率を示した（図１３Ｆ）。Ｍボックスにおける２および３塩基欠失変異体（ＣＭ２Ｄｅｌ−１および２）は依然としてノックダウン能力を示したが、野生型キメラ２と比べて効率が低かった（図１３Ｆ）。７塩基欠失変異体（ＣＭ２Ｄｅｌ−３）は野生型キメラ２と比べて有意なノックダウン活性を示さなかった（図１３Ｆ）。ノックダウン能力とＭボックスにおける塩基対ミスマッチとの関連を試験するため、Ｍボックスにおける６つの点変異体も樹立した（図１３ＥおよびＦ）。Ｍボックスにおける１〜３塩基ミスマッチ変異体（ＣＭ２Ｘ−１〜−３）は依然としてノックダウン能力を示したが、野生型キメラ２と比べて効率が低かった（図１３Ｆ）。Ｍボックスにおける４〜６塩基ミスマッチ変異体（ＣＭ２Ｘ−４〜−６）は野生型キメラ２と比べて効率的なノックダウン活性を示さなかった（図１３Ｆ）。これらの結果は、修飾ｓｎｏＲＮＡの遺伝子ノックダウンを調節する能力がＭボックス相補配列と標的ｍＲＮＡ配列とのハイブリダイゼーション親和性と関連することを示した。
【０１１９】
修飾ｓｎｏＲＮＡのノックダウン能力に影響を及ぼすとは思われないｍ２（２８Ｓ ｒＲＮＡ相補領域）、ｍ４およびｍ５の変異体の各々を組み込んだ組合せｓｎｏＲＮＡ（図１３ＡおよびＣ、図１４Ａ）は、蛍光顕微鏡法により判定されるように野生型三重キメラプラスミドと同様のノックダウン活性を示した（図１４Ｂ）。キメラ１，２，３特異的プローブを用いたＦＩＳＨ分析は、この組合せ変異プラスミド（三重キメラｓｎｏＭＥＮｖ１）が野生型三重キメラプラスミドに関しても見られるように各コードされたキメラ修飾ｓｎｏＲＮＡを発現させることを示した（図１２Ａおよび１４Ａ）。これらの変異体分析は、修飾ｓｎｏＲＮＡのノックダウン能力が、標的ＲＮＡに結合するｓｎｏＲＮＡと関連する配列の外側にある変異により、且つｓｎｏＲＮＡと標的配列との結合に必要な相補配列（即ち、Ｍボックス）内にある変異によって、調節され得ることを示唆した。
【０１２０】
（修飾ｓｎｏＲＮＡベクターはタンパク質置換によって致死遺伝子発現ノックダウン作用をレスキューすることができる）
三重キメラｓｎｏＭＥＮｖ１から、内因性ＳＭＮ１（運動ニューロンの生存（Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎｓ））ｍＲＮＡ前駆体に標的化される２つの修飾ｓｎｏＲＮＡプラスミドを樹立した（図１５Ａ）。プラスミドＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１は、ＧＦＰ ｃＤＮＡおよび内因性ＳＭＮ１ ｍＲＮＡ前駆体内の異なる位置に標的化される３つの修飾ｓｎｏＲＮＡをそれぞれコードする（図１５Ａ）。他方のプラスミドＧＦＰ−ＳＭＮｌ ｓｎｏＭＥＮｖ１−ＰＲは、ＧＦＰ−ＳＭＮ１融合タンパク質ｃＤＮＡ、および内因性ＳＭＮ１ ｍＲＮＡ前駆体内の異なる位置に標的化されるＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１を有する３つの同じ修飾ｓｎｏＲＮＡをそれぞれコードする（図１５Ａ）。一過性トランスフェクション分析は、ＧＦＰ単独およびｍＣｈｅｒｒｙ三重キメラプラスミドがＨｅＬａ細胞に対する有害作用を有さないことを示した。しかし、ＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１プラスミドは細胞にトランスフェクトされると、細胞傷害作用を示した（図１５Ｂ矢頭）。ウエスタンブロット分析は、内因性ＳＭＮ１レベルがＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１をトランスフェクトすることによって抑制されることを示した（図１５Ｃ）。ＳＭＮ１ノックアウトマウスの表現型が胚致死性であることが公知であるため、この結果は予期された（Ｈｓｉｅｈら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０００）。他方、ＧＦＰ−ＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１−ＰＲプラスミドの一過性トランスフェクションは、ＨｅＬａＧＦＰ−ＳＭＮ１安定細胞株に見られるような正確な局在パターンを示し（図１０）、重要なことに、ＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１に関して見られるような細胞傷害作用を示さなかった（図１５Ｂ）。これらの結果は、内因性ＳＭＮ１がＳＭＮ１ ｍＲＮＡ前駆体に標的化される修飾ｓｎｏＲＮＡによって抑制され、その細胞傷害作用がＧＦＰ−ＳＭＮ１融合タンパク質を発現させることによってレスキューされることを示した。
【０１２１】
（ウイルスベクター系から発現される場合の修飾ｓｎｏＲＮＡの機能）
三重キメラ修飾ｓｎｏＲＮＡ（レンチ三重キメラ）および野生型三重ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡ（レンチ三重ＨＢＩＩ−１８０Ｃ）を各々レンチＸウイルスベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にサブクローニングした。レンチ三重キメラは対応するプラスミドベクター三重キメラを用いて見られたのと同じノックダウン作用を示した（図１１Ｂと図１６とを比較されたい）。この結果は、修飾ｓｎｏＲＮＡの標的遺伝子をノックダウンする能力が単一のトランスフェクション系に依存せず、プラスミドおよびウイルスベクター系を用いて供給され得ることを示した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の核酸配列を標的とするように設計されたｓｎｏＲＮＡ分子またはｓｎｏＲＮＡ様分子または断片を用いて遺伝子発現を調節する方法に関する。
【０００２】
また、本発明は、遺伝子発現の標的調節に用いる修飾ｓｎｏＲＮＡ分子、ならびに修飾ｓｎｏＲＮＡ様分子および断片に関する。
【背景技術】
【０００３】
核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）はあらゆる真核細胞に存在する核小体ＲＮＡのファミリーを含む。ｓｎｏＲＮＡは核、特に核小体に集中し、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の修飾において機能し、あるいはリボソームサブユニット合成時にｒＲＮＡのプロセシングに関与する。ｓｎｏＲＮＡの２つの主要なクラス、ボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡおよびボックスＨ／ＡＣＡ ｓｎｏＲＮＡがあり、これらはそれぞれ２’−Ｏ−リボースメチル化、シュードリジン修飾（ｐｓｕｅｄｏｕｒｉｄｉｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に関与している（非特許文献３，１および２の総説）。
【０００４】
ｓｎｏＲＮＡは生体内においてＲＮＡ−タンパク質複合体（ｓｎｏＲＮＰ）として機能し、修飾部位をｒＲＮＡ上の特定の配列に対して（ボックスＣ／ＤおよびボックスＨ／ＡＣＡ ｓｎｏＲＮＡの場合）、またはシャペロンとして新生ｒＲＮＡ前駆体の成熟を補助する（例えば、Ｕ３ ｓｎｏＲＮＡ）ために、ＲＮＡ部分はｒＲＮＡ前駆体と塩基対を形成するガイドＲＮＡとして機能する。
【０００５】
ボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡは、ＮＯＰ５６，ＮＯＰ５８，ＴＩＰ４８，ＴＩＰ４９，１５．５Ｋおよび特異的な２−Ｏ−メチラーゼ活性を有する、高度に保存されたタンパク質フィブリラリンを含む一群のボックスＣ／Ｄタンパク質に対する結合部位として機能する、このサブファミリーにおける一般的なＲＮＡモチーフにちなんで名付けられている。ステムＩＩおよびボックスＤ領域のすぐ５’側のボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡの領域は、ガイドＲＮＡ領域と相補的なｒＲＮＡ配列内の所望のリボース残基の２’−ＯＨ位にメチル基を付加するために、フィブリラリン２’−Ｏ−メチラーゼを誘導するｒＲＮＡ上の特定の部位と相補的な「ガイド」配列を含む。同様の機能が酵母から哺乳動物細胞まで働くことが示されている。保存配列要素のため、ヒトボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡファミリーのメンバーを予測し、且つコンピュータ分析を通じてｒＲＮＡ上のそれらの推定２’−Ｏ−メチル化標的部位を予測するために、ゲノムＤＮＡ配列情報を用いることが可能である。しかし、これまでのところ、ヒトの場合にこれらの種のすべてが直接の実験により同定または実証されているわけではない。
【０００６】
ｒＲＮＡの修飾に加え、一部のボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡに対して他の２つの機能が提唱されている。第一に、いくつかのファミリーメンバーが、核内ｍＲＮＡ前駆体スプライシング機構のサブユニットである核内低分子ＲＮＡを含む他の非リボソームＲＮＡにおける２’−Ｏ−リボース基のメチル化を指定すると考えられている。これは基本的にｒＲＮＡに見られるものと同じ修飾反応であるが、これらが含むガイドＲＮＡ配列により、異なるＲＮＡ基質に向けられる。第二に、ボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡファミリーの１メンバー（ＨＢＩＩ−５２）（非特許文献５）は、スプライス部位の選択の変化を引き起こし得る代替スプライシング因子として作用し、セロトニン受容体２Ｃをコードする６エクソン神経細胞特異的転写物におけるエクソン５に作用することが報告されている。この場合、関与する機構は不明であり、ＨＢＩＩ−５２ ｓｎｏＲＮＡがｒＲＮＡの修飾にも関与しているか、または核小体に局在しているのかということも明らかではない。
【０００７】
遺伝子発現を制御できるということは多年にわたり研究されており、様々な技法が公知であって、そのすべてが利点と不利点とを有する。例えば、ＲＮＡｉ法は当技術分野において周知である。「ＲＮＡｉ」とは、標的ＲＮＡの領域と同一であってその分解をもたらす二本鎖ＲＮＡによって開始される、動物および植物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す（例えば、ＷＯ９９３２６１９，ＷＯ０１２９０５８およびＴｕｓｃｈｌ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５（２００１）を参照されたい）。しかし、ＲＮＡｉ法に関連する問題点は、特に、化学的手段を用いて分子を合成しなければならない際のコストである。更に、遺伝的手法を用いてＲＮＡｉ分子を作製する場合、分子を適切に生成することが困難であり得る。また、同じまたは異なる標的配列を標的とするために２つ以上のＲＮＡｉ分子を生成することは、前述の問題点を増大させるだけである。ＲＮＡｉに関する問題点は、特に、更なる遺伝子の不要な「オフターゲット」ノックダウンを生じさせることなく、標的遺伝子の高効率ノックダウンを達成する際にも生じ得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔ．Ｋｉｓｓ，Ｃｅｌｌ １０９，１４５（２００２）
【非特許文献２】Ｔ．Ｋｉｓｓら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ．７１，４０７−１７（２００６）
【非特許文献３】Ｆ−Ｍ．Ｂｏｉｓｖｅｒｔら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８，５７４−５８５（２００７）
【非特許文献４】Ａ．Ｋ．Ｌ．，Ｌｅｕｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７６，５５３−５６９（２００３）
【非特許文献５】Ｓ．ＫｉｓｈｏｒｅおよびＳ．Ｓｔａｍｍ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１１，２３０（２００６）
【非特許文献６】ＪＳ．Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ，１２，１−１１（２００２）
【非特許文献７】ＪＳ．Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ，４３３，７７−８３（２００５）
【非特許文献８】ＹＷ．Ｌａｍら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１７，７４９−６０（２００７）
【非特許文献９】ＸＤ．Ｚｈｏｕら、Ａｉ ｚｈｅｎｇ ４，３４１−５（２００２）
【非特許文献１０】Ｌ．Ｔｒｉｎｋｌｅ−Ｍｕｌｃａｈｙら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７２，６７９−９２（２００６）
【非特許文献１１】Ａ．Ｋ．Ｌ．，Ｌｅｕｎｇら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６６，７８７−８００（２００４）
【非特許文献１２】Ｇ．Ｓ．Ｐａｌｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５（８），ｅ６０（２００７）
【非特許文献１３】Ｄ．Ｈ．Ｍａｔｈｅｗｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（１９），７２８７−９２（２００４）
【非特許文献１４】Ｐ．Ｄｅ Ｒｉｊｋら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １９（２），２９９−３００（２００３）
【非特許文献１５】Ｌ．Ｔｒｉｎｋｌｅ−Ｍｕｌｃａｈｙら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７２，６７９−９２（２００６）
【非特許文献１６】Ｋ．Ｌ．Ｌｅｕｎｇら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６６，７８７−８００（２００４）
【非特許文献１７】Ｌ．Ｌｅｓｔｒａｄｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４，Ｄ１５８−１６２（２００６）
【非特許文献１８】Ｍａｄｅｎ，Ｂ．Ｅ．Ｈ．Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃ．Ａｃ．Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９，２４１−３０３（１９９０）
【非特許文献１９】Ｌｅｓｔｒａｄｅ，Ｌ．およびＷｅｂｅｒ，Ｗ．Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３４，Ｄ１５８−１６２（２００６）
【非特許文献２０】Ｍ．Ｚｕｋｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１３），３４０６−１５，（２００３）
【非特許文献２０】Ｄ．Ｈ．Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｊ．Ｓａｂｉｎａ，Ｍ．ＺｕｋｅｒおよびＤ．Ｈ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８８，９１１−９４０（１９９９）
【非特許文献２１】Ｋｅｎｔ，Ｗ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１２（６），９９６−１００６（２００２）
【非特許文献２２】Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６，２９９−３１１（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、遺伝子サイレンシングまたは発現の調節の更なるまたは代替の方法が望ましいであろう。本発明の目的は、少なくとも１つの前述の不利点を取り除き、且つ／或いは軽減することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、本発明によるｓｎｏＲＮＡ研究および、修飾ｓｎｏＲＮＡが形成されるように、ｓｎｏＲＮＡ配列の一部が標的特異的核酸配列に置換され得、それが細胞またはその断片に加えられると、標的特異的核酸配列を含む遺伝子の発現を調節することができるという確認試験に部分的に基づく。
【００１１】
第一の態様では、標的核酸の発現を調節する方法が提供され、その方法は、核酸をｓｎｏＲＮＡおよび／またはその断片が標的核酸の一部とハイブリダイズすることができる条件下にてｓｎｏＲＮＡと接触させるステップを含み、ｓｎｏＲＮＡまたはその断片の核酸の一部とのハイブリダイゼーションは、標的核酸の発現および／または機能を調節し、或いはその調節を引き起こす。ｓｎｏＲＮＡは天然ｓｎｏＲＮＡ分子でよく、または以下に更に述べられる修飾ｓｎｏＲＮＡ分子でよい。
【００１２】
標的核酸の発現を調節するのに用いる修飾ｓｎｏＲＮＡ配列も提供され、修飾ｓｎｏＲＮＡ配列は、標的核酸の一部とハイブリダイズし、且つ核酸の発現を調節するための、標的核酸の一部と実質的に相補的な核酸配列を含む。このような修飾ｓｎｏＲＮＡ分子がＨＢＩＩ−１８０Ｃ分子のような当技術分野において公知の天然ｓｎｏＲＮＡ分子と同一ではないことが理解されねばならない。一般的に、このような修飾ｓｎｏＲＮＡ分子は下述のように天然ｓｎｏＲＮＡ分子に基づくが、標的核酸の一部とハイブリダイズし、且つその発現を調節するため、特異的に選択されてｓｎｏＲＮＡ分子に導入される核酸の一部を含む。
【００１３】
本発明者らは、本発明によるｓｎｏＲＮＡ分子が、標的ＲＮＡまたはタンパク質の発現／機能を下方制御または低減することができることを認めた。理論にとらわれることを所望するわけではないが、標的配列と特異的にハイブリダイズすることができる配列を含むｓｎｏＲＮＡ分子の断片が標的ＲＮＡの発現／機能を調節する作用を有し得るように、修飾ｓｎｏＲＮＡが細胞内でプロセシングされ得ることがあり得るが、発現が特定の遺伝子座におけるＤＮＡへの結合を通じて調節され得ることもあり得る。このような配列は、本明細書で述べられる天然および修飾ｓｎｏＲＮＡに存在する配列と正確にまたは高度の特異性で対応し得、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列のような標的核酸配列の一部と実質的に相補的であり、或いは配列の塩基組成およびＧ／Ｃ含量に依存し、例えば、２〜１０ヌクレオチド長短い場合もある。原則的に、相補領域は、相補的塩基対合の公知の原理による標的ＲＮＡへの特異的結合を供するのに十分な長さおよび配列である。
【００１４】
本発明のｓｎｏＲＮＡ分子は、いわゆるボックスＣ／Ｄ−ｓｎｏＲＮＡまたはボックスＨ／ＡＣＡ−ｓｎｏＲＮＡに基づき得る。好ましいｓｎｏＲＮＡはボックスＣ／Ｄ−ｓｎｏＲＮＡに基づく。
【００１５】
本明細書で用いられるように、「ｓｎｏＲＮＡ」という表現は、通常、細胞の核質および／または核小体において合成され、且つ／或いは機能する小さいＲＮＡ分子を指す。好ましい実施形態に従って、本発明の核内低分子ＲＮＡはボックスＣ／Ｄを含むｓｎｏＲＮＡである。
【００１６】
ボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡの非限定例には、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ ｂ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３１６５６）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ Ｂ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ０４６５９８）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ Ｂ４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ０４６５９８）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ Ｂ５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ０４６５９８）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ ＴＳ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３１６５６）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ ＴＳ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３１６５６）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ ｇ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３１６５６）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ ｓｎｏＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０５００９５）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ｓｎｏＲＮＡ ９２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ５０１７１、Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ ｓｎｏＲＮＡ ９２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１６３９９）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ＴＢＣ４ ｓｎｏＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ｓｎｏ ２７０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ５０１７１）およびヒトＵ１４ ｓｎｏＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿００００２２）が含まれる。
【００１７】
本発明の修飾ｓｎｏＲＮＡは、ボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡに一般的に見出される１つ以上のＤ／Ｄ’ボックス核酸配列を含み得る。Ｄおよび／またはＤ’ボックスはヌクレオチドの保存配列であり、例えば、５’−ＣＵＧＡ−３’，５’−ＡＵＧＡ−３’，５’−ＣＣＧＡ−３’，５’−ＣＡＧＡ−３’，５’−ＣＵＵＡ−３’，５’−ＵＵＧＧ−３’および５’−ＣＡＧＣ−３’から選択される配列からなり得る。しかし、更なる修飾および／または誘導体が考えられ得る。
【００１８】
本発明の修飾ｓｎｏＲＮＡは２８Ｓ ｒＲＮＡおよび／またはボックスＣ配列と相補的な配列を更に含み得る。２８Ｓ ｒＲＮＡと相補的な配列は５〜１５ヌクレオチド長、例えば、８〜１２ヌクレオチド、特に１０ヌクレオチドでよいが、このｒＲＮＡ相補領域は変異し得、ｒＲＮＡとの相補性は活性を阻止することなく実質的にまたは完全に取り除かれ得る。典型的には、２８Ｓ ｒＲＮＡと相補的な配列は２８Ｓ ｒＲＮＡ配列の塩基３６８０におけるまたはその周囲のヌクレオチドと相補的であり得（ナンバリングは非特許文献１７、ｓｎｏＲＮＡ−ＬＢＭＥ−ｄｂ，ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｈ／ＡＣＡ ａｎｄ Ｃ／Ｄ ｂｏｘ ｓｎｏＲＮＡｓによる）、例えば、３６７０〜３６９０前後、例えば、３６７７〜３６８６である。ボックスＣ配列は典型的には５〜９ヌクレオチド長、例えば、７ヌクレオチドであり、配列ＡＵＧＡＵＧＵまたはその一部を含み得る。典型的には、存在する場合、ボックスＣ配列は、ボックスＤ’配列の５’側にある、ｒＲＮＡまたはｓｎｏＲＮＡの他の生理学的ＲＮＡ標的と相補的な配列の５’側に位置し、そのボックスＤ’配列は標的核酸配列の一部と実質的に相補的な核酸配列の５’側にある。好ましくは、ボックスＣ配列、ｒＲＮＡと相補的な配列、ボックスＤ’配列および／または標的核酸配列の一部と実質的に相補的な核酸配列の間に、わずか１〜３、例えば、１つのヌクレオチド塩基が見出される。ボックスＤ’配列と同一であるか、またはそうではないボックスＤ配列は、標的ＲＮＡ配列の一部と実質的に相補的な核酸配列の３’側に見出され得る。ボックスＤ配列は、標的核酸配列の一部と実質的に相補的な核酸配列の３’側塩基の２０〜３０ヌクレオチド３’側、例えば、２４〜２８ヌクレオチド、特に２６ヌクレオチド下流にあり得る。
【００１９】
本発明の修飾ｓｎｏＲＮＡ分子は、標的核酸配列を標的とし、且つこれとハイブリダイズすることができる、少なくとも１つの配列も含む。本明細書で提示される研究に基づき、本発明者らはｓｎｏＲＮＡ分子であるＨＢＩＩ−１８０Ｃを同定し、これは、ヒト線維芽細胞増殖因子３（ＦＧＦＲ３）から転写されるｍＲＮＡ前駆体のイントロン１７内に見出される２１ｎｔ配列と高度に相補的である、ボックスＤ’配列のすぐ下流にある配列を含んでいた。この配列を、特定の標的遺伝子配列と相補的であるように設計された、異なる配列に変えることにより、イントロンまたはエクソン配列であるにしても、本発明者らは所望の標的遺伝子の発現を調節することができた。
【００２０】
典型的には、標的核酸配列の一部と実質的に相補的な核酸配列は１５〜４５ヌクレオチド長、例えば、１７〜３０ヌクレオチドであるが、配列および塩基組成に依存してより長くてよい。「実質的に」相補的であるとは、標的核酸配列と、標的核酸とハイブリダイズするように設計されたｓｎｏＲＮＡ分子の配列との間に、正確な相補性が存在する必要はないということである。しかし、典型的には９０または９５％超の高度の同一性があるべきであり、それは、公知のＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡ塩基対合法則に従った特異的結合を確実にするのに十分であることが理解されねばならない。従って、典型的には相補領域の長さおよびＧ／Ｃ含量により、２つの配列間の多くてもわずか１〜３のミスマッチが許容され得る。標的核酸配列は、ＲＮＡ配列、典型的にはｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｒＲＮＡ配列またはＲＮＡウイルスゲノム配列若しくはそれに由来する転写産物、特にｍＲＮＡ配列であり得る。標的核酸配列内にて相補領域はイントロンまたはエクソンまたは、特にイントロン−エクソン接合部にあり得るが、５’または３’非翻訳領域にも存在し得る。
【００２１】
標的核酸分子とハイブリダイズするように設計された２つ以上の配列が本発明の修飾ｓｎｏＲＮＡ分子内に見出され得ることが理解されねばならない。２つ以上のそのような配列がある場合、異なる「標的化」配列が同じ標的核酸分子の異なる部分または異なる標的核酸分子を標的とするように設計され得る。
【００２２】
更なる態様では、本発明による少なくとも１つのｓｎｏＲＮＡ分子を発現することができる核酸構築物も提供される。
【００２３】
典型的には、核酸構築物は、本発明によるｓｎｏＲＮＡをコードすることができるイントロン核酸の領域に隣接するエクソン核酸の少なくとも２つの領域を含む。最も望ましくは、核酸構築物は、本発明による１つ以上のｓｎｏＲＮＡをコードすることができる配列を含む２つ以上のイントロン配列に隣接する多数のエクソン配列を含み得る。このような構築物は、単一の構築物として形成され得、標的細胞内での転写と同時にエクソン配列に対応するｍＲＮＡの生成およびイントロン配列のスプライシングアウトおよび、その後の本発明によるｓｎｏＲＮＡの生成をもたらす。
【００２４】
２つ以上の本発明のｓｎｏＲＮＡ配列を生成するために２つ以上のイントロン配列が用いられる場合、各ｓｎｏＲＮＡは同じまたは異なる標的ＲＮＡ分子を標的とするように設計され得る。
【００２５】
当業者はイントロンおよびエクソンを構成するものを周知していることが期待されるが、補助のために以下のことが提供される。
【００２６】
イントロンは、通常、タンパク質をコードする最終ｍＲＮＡ産物において発現される領域である真核生物ＤＮＡの部分、即ち、「エクソン」間に介在するそのＤＮＡの部分である。イントロンおよびエクソンはＲＮＡに転写され、「一次転写物、ｍＲＮＡ前駆体」（またはプレｍＲＮＡ）と称される。エクソンにコードされる天然タンパク質が生成され得るように、イントロンはｍＲＮＡ前駆体から除去されねばならない（本明細書で用いられる「天然タンパク質」という用語は、天然、野生型、変異または機能タンパク質をいう）。ｍＲＮＡ前駆体からのイントロンの除去およびその後のエクソンの結合はスプライシングプロセスにて行われる。
【００２７】
スプライシングプロセスは実際にはスプライシング因子に媒介される一連の反応であり、転写後であるが翻訳前にＲＮＡに対して行われる。従って、「ｍＲＮＡ前駆体」はエクソンおよびイントロンを含むＲＮＡであり、「ｍＲＮＡ」は、タンパク質がリボソームによって翻訳されるように、イントロンが除去され、エクソンが連続的に結合したＲＮＡである。
【００２８】
イントロンは、スプライシング反応を行う種々のスプライシング因子と結合する比較的短い保存ＲＮＡセグメントである一組の「スプライス要素」により定義付けされる。従って、各イントロンは５’スプライス部位、３’スプライス部位およびその間に位置する分岐点により定義付けされる。
【００２９】
核酸構築物は、従来の核酸ベクターに見出されることが多く、且つ当業者には周知の一般的な核酸特徴を更に含み得る。例えば、核酸構築物は、核酸構築物が形質転換またはトランスフェクトされた細胞の同定を容易にするための選択マーカー遺伝子を含み得る。好ましくは、核酸構築物は、ｓｎｏＲＮＡ分子をコードする核酸の発現を促進するための少なくとも１つのプロモーター、例えば、当技術分野において公知の構成的または調節可能なプロモーターを含む。好適なプロモーターの例には、ＣＭＶプロモーター、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６、ＳＶ４０、アデノウイルス主要後期プロモーターおよび当業者には公知の他のプロモーターが含まれる。
【００３０】
核酸構築物は、ｓｎｏＲＮＡによって調節される遺伝子／ＲＮＡのコピーを置換するように設計された天然、変異或いは標識形態の遺伝子／ＲＮＡのコピーも含み得る。
【００３１】
本発明のｓｎｏＲＮＡを細胞内に生成するために複数の手法が用いられ得る。
【００３２】
本発明の１つの好ましい実施形態に従って、本発明のｓｎｏＲＮＡ分子は、上述のｓｎｏＲＮＡ分子を発現することができる核酸構築物を細胞内に導入することによって生成され得る。
【００３３】
本発明のｓｎｏＲＮＡを細胞内に発現させるため、核酸配列は核酸構築物に結合され、核酸構築物はｓｎｏＲＮＡをコードする核酸配列の上流にあるプロモーターを含む。望ましくは、ｓｎｏＲＮＡをコードする配列は、転写と同時にｓｎｏＲＮＡをコードする配列のスプライシングアウトをもたらす、当業者によってエクソン配列およびスプライシング配列と同定可能な核酸の領域の両側にて隣接される。例えば、真核細胞における核酸配列の転写を誘導するのに適したプロモーターには、構成的または誘導性プロモーターが含まれる。
【００３４】
本発明での使用に適した構成的プロモーターは、大部分の環境条件および大部分のタイプの細胞において活性を示すプロモーター配列であり、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターである。本発明での使用に適した誘導性プロモーターには、例えば、低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）プロモーター（Ｒａｐｉｓａｒｄａ，Ａ．ら、２００２．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：４３１６−２４）およびテトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｓｒｏｕｒ，Ｍ．Ａ．ら、２００３．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９０：３９８−４９５）が含まれる。
【００３５】
通常、本発明の核酸構築物は、構築物を原核生物、真核生物または好ましくはその両方における複製および／または組込みに好適にさせる付加配列を含む（例えば、シャトルベクター）。典型的なクローニングベクターは転写および翻訳開始配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）および転写および翻訳ターミネーター（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。
【００３６】
核酸構築物の構築において、好ましくは、プロモーターはその自然な環境における転写開始部位からの距離とほぼ同じ異種転写開始部位からの距離に位置する。しかし、当技術分野において公知であるように、プロモーター機能の喪失なしに、この距離のある程度の変動が受け入れられ得る。
【００３７】
既述の要素に加え、通常、本発明の核酸構築物は、クローン核酸の発現レベルを高め、または組換えＤＮＡを保持する細胞の同定を容易にするように意図された他の特殊要素を含み得る。例えば、多くの動物ウイルスは、許容細胞型におけるウイルスゲノムの過剰染色体複製を促進するＤＮＡ配列を含む。これらのウイルスレプリコンを保持するプラスミドは、プラスミドに保持され、または宿主細胞のゲノムを含む遺伝子によって適切な因子が供されない限り、エピソームとして複製される。
【００３８】
核酸構築物は真核生物レプリコンを含む場合もあれば含まない場合もある。真核生物レプリコンが存在する場合、適切な選択可能マーカーを用いてベクターは真核細胞において増幅可能である。ベクターが真核生物レプリコンを含まない場合、エピソーム増幅は可能ではない。その代わり、組換えＤＮＡが操作された細胞のゲノムに組み込まれ、プロモーターが所望の核酸の発現を指示する。このような構築物は、核酸構築物を細胞のゲノムにおける特定の部位に標的化し、且つ細胞内に必要な酵素が存在する場合に特定の部位に組み込まれるように設計された部位特異的組換え部位も含み得る。種々の部位特異的組換え系が当業者には周知であり、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ、Ａｔｔ／λインテグラーゼ、ｆｒｔ／Ｆｌｐ、ガンマデルタリゾルバーゼ、Ｔｎ３リゾルバーゼおよびΦＣ２３１インテグラーゼが含まれる（当業者の関心が向けられるＧｏｖｅｒら、２００５を参照されたい）。
【００３９】
本発明の核酸構築物は、本発明のポリヌクレオチドを哺乳動物細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、Ｃｏｓ細胞）、酵母細胞（例えば、ＡＨ１０９，ＨＨＹ１０，ＫＤＹ８０）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、トリパノソーマ細胞（例えば、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ，Ｌ．ｍａｊｏｒ，Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ２９−１３）または細菌細胞（例えば、ＪＭ１０９，ＲＰ４３７，ＭＭ５０９，ＳＷ１０）において発現させるために用いられ得る。
【００４０】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、核酸配列を哺乳動物、酵母、トリパノソーマまたは細菌発現ベクターに結合することによって合成される。このようなベクターの例には、哺乳動物細胞に用いるのに適したｐｃＤＮＡ３．１，ｐＢＫ−ＣＭＢおよびｐＣＩベクター、酵母細胞に用いるのに適したｐＧＢＫＴ７、ｐＬＧＡＤＨ２−ｌａｃＺおよびｐＢＧＭ１８ベクター、トリパノソーマ細胞に用いるのに適したｐＸ−ｎｅｏエピソームベクター並びに細菌細胞に用いるのに適したＰａｃｋ０２ｓｃＫａｎ，ｐＭＬＢＡＤ，ｐＭＬＳ７ベクターが含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
好ましい実施形態に従って、本発明の核酸構築物は、好ましくは真核細胞発現、最も好ましくは哺乳動物細胞発現のために構築される。
【００４２】
哺乳動物発現ベクターの例には、限定されないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から市販されているｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、Ｐｇｌ３、ＰｚＥＯｓｖ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａ社から市販されているｐＣＩ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から市販されているｐＭｂａｃ，ｐＰｂａｃ，ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から市販されているｐＴＲＥＳ並びにそれらの誘導体が含まれる。
【００４３】
レトロウイルスのような真核生物ウイルス由来の調節要素を含む発現ベクターも用いられ得る。ＳＶ４０ベクターはｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２を含む。ウシパピローマウイルス由来のベクターはｐＢＶ−１ＭＴＨＡを含み、エプスタイン・バー・ウイルス由来のベクターはｐＨＥＢＯおよびｐ２０５を含む。他の代表的なベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥおよびＳＶ−４０早期プロモーターの指示下にてタンパク質の発現を可能にする他の任意のベクター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、多面体プロモーター或いは真核細胞における発現に有効であることが示される他のプロモーターが含まれる。
【００４４】
本発明の核酸構築物を哺乳動物細胞に導入するために種々の方法が用いられ得る。このような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、ニューヨーク（１９８９，１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ社、メリーランド州ボルティモア（１９８９）、Ｃｈａｎｇら、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ社、ミシガン州アナーバー（Ａｎ Ａｒｂｏｒ）（１９９５）、Ｖｅｇａら、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ社、ミシガン州アナーバー（Ａｎ Ａｒｂｏｒ）（１９９５）、Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ社、マサチューセッツ州ボストン（１９８８）およびＧｉｌｂｏａら［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４（６）：５０４−５１２，１９８６］に概述されており、例えば、安定的若しくは一過性導入、リポフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポソーム、イオン導入、受容体媒介性エンドサイトーシスおよび組換えウイルスベクターによる感染を含む。加えて、正・負の選択法に関して米国特許第５４６４７６４号および５４８７９９２号を参照されたい。例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素欠乏チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ ｄｈｆｒ−）細胞における安定導入では、本発明の発現ベクターはチミジンキナーゼプロモーターの制御下に配置されたジヒドロ葉酸還元酵素発現カセットを更に含む。
【００４５】
本発明の核酸構築物は、ウイルスベクター、例えば、当技術分野において公知のレンチウイルス、レトロウイルスまたはアデノウイルス由来ベクターを用いて細胞内に送達されてもよい。
【００４６】
本発明の更なる態様では、本発明によるｓｎｏＲＮＡ分子を生成するのに用いる核酸ベクター構築物が提供され、その構築物は５’から３’方向に、
ｉ）転写を制御するためのプロモーター配列、
ｉｉ）第一のエクソン配列、
ｉｉｉ）第一のイントロンスプライシング配列、
ｉｖ）本発明のｓｎｏＲＮＡをコードする核酸配列のクローニングを容易にするためのクローニング部位または配列、
ｖ）第二のイントロンスプライシング配列および
ｖｉ）第二のエクソン配列
を含む。ｓｎｏＲＮＡは本明細書で述べられるように天然または修飾ｓｎｏＲＮＡ分子でよい。
【００４７】
当業者には理解されるように、様々な構成要素が転写的に結び付いていることが理解されねばならない。当然、ベクターは本明細書で述べられる他の構成要素を含み得、ベクター構築を容易にするために更なるクローニング部位を含み得る。
【００４８】
本発明の１つの特別な利点は、単一の転写物から多数のｓｎｏＲＮＡを提供する能力であり、これは同じまたは異なる標的核酸配列を標的とすることができる。
【００４９】
核酸構築物の使用の代替として、本発明のｓｎｏＲＮＡ分子が、例えば、固相合成を用いてＲＮＡオリゴヌクレオチドとして化学的に合成され得ることが理解されるであろう。
【００５０】
本発明の合成ｓｎｏＲＮＡ分子、ｓｎｏＲＮＡ様分子またはその断片を設計する際、いくつかのことが考慮されねばならない。遺伝子発現の効率的な生体内抑制のため、分子は望ましくは以下の要件を満たし得る：（ｉ）標的配列への結合における十分な特異性；（ｉｉ）水溶性；（ｉｉｉ）細胞内および細胞外ヌクレアーゼに対する安定性；（ｉｖ）細胞膜貫通能；および（ｖ）生物を処置するために使用される場合に低毒性。
【００５１】
非修飾ポリヌクレオチドは、短い生体内半減期を有し、その間にヌクレアーゼによって急速に分解され得るため、使用には非実用的であり得る。更に、非修飾ポリヌクレオチドはミリグラム量を超える量にて調製することが困難である。加えて、このようなポリヌクレオチドは細胞膜を貫通しにくい。
【００５２】
半減期および膜貫通を向上させるため、本発明のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド骨格は修飾され得る。
【００５３】
ポリヌクレオチドは塩基、糖またはリン酸部分において修飾され得る。これらの修飾は、例えば、メチルホスホン酸、モノチオリン酸、ジチオリン酸、ホスホロアミド酸、リン酸エステル、架橋ホスホロチオエート、架橋ホスホロアミド酸、架橋メチレンホスホン酸、並びにシロキサン架橋、炭酸架橋、カルボキシメチルエステル架橋、炭酸架橋、カルボキシメチルエステル架橋、アセトアミド架橋、カルバミン酸架橋、チオエーテル架橋、スルホキシル酸架橋、スルホノ架橋、アノマー架橋を有するデホスホヌクレオチド間類似体およびボラン誘導体の使用を含む（Ｃｏｏｋ，１９９１，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｆｕｔｕｒｅ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ６：５８５）。好ましくは、本発明の合成ポリヌクレオチドに生体内安定性を付与するため、リボース環の２位における酸素分子がメチル化され得、２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡオリゴヌクレオチドとなる。
【００５４】
国際特許出願ＷＯ８９／１２０６０は、定義された配列におけるポリヌクレオチド類似体を合成するための種々の構成要素および、そのような構成要素を結合して形成されるポリヌクレオチド類似体を開示している。構成要素は「強固」（即ち、環構造を含む）または「柔軟」（即ち、環構造を欠く）であり得る。どちらの場合でも構成要素はヒドロキシ基およびメルカプト基を含み、これを通じて構成要素が結合してポリヌクレオチド類似体を形成するといわれている。オリゴヌクレオチド類似体における結合部分は、硫化物（−Ｓ−）、スルホキシド（−ＳＯ−）およびスルホン（−ＳＯ２−）からなる群より選択される。
【００５５】
国際特許出願ＷＯ９２／２０７０２は、任意の選択化学核酸塩基または類似体が一列に並べられ、天然ＲＮＡでのようにコード文字として機能するペプチド骨格を含む非環状オリゴヌクレオチドを説明している。ペプチド核酸（ＰＮＡ）として公知のこれらの新規化合物は、天然の対応物より細胞において安定なだけではなく、天然核酸が互いに付着するより５０〜１００倍固く天然ＲＮＡに結合もする。ＰＮＡオリゴマーは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ペプチド合成により、ウリジン、シトシン、アデニン（ａｄｅｎｕｉｎｅ）およびグアニンを含む４つの保護モノマーから合成され得る。水溶性を高めて凝集を阻止するため、Ｃ末端領域にリジンアミド基が配置される。
【００５６】
ｓｎｏＲＮＡの安定性は、合成時に３’−デオキシチミジン若しくは２’−置換ヌクレオチド（例えば、アルキル基に置換される）をｓｎｏＲＮＡに組み入れ、ｓｎｏＲＮＡをフェニルイソ尿素誘導体として付与し、または他の分子、例えば、アミノアクリジンまたはポリリジンをｓｎｏＲＮＡの３’末端に結合させることによっても高められ得る（例えば、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０：１１６９−１１８２，１９９０を参照されたい）。本発明のｓｎｏＲＮＡのＲＮＡヌクレオチドの修飾は、ｓｎｏＲＮＡ全体にわたり、または選択領域、例えば、５’および／または３’末端に存在し得る。ｓｎｏＲＮＡｓは、例えば、それらを親油性化合物に結合することによって標的組織を貫通する能力を高めるためにも修飾され得る。本発明のｓｎｏＲＮＡｓは、これらをコードするＤＮＡの標準的化学合成および転写を含む当技術分野において公知の標準的方法によって作製され得る。加えて、ｓｎｏＲＮＡｓは、標的細胞の細胞表面上の受容体に特異的なリガンドにそれらを結合することにより、特定の細胞に標的化され得る。また、ｓｎｏＲＮＡは、細胞型特異的受容体に特異的に結合するモノクローナル抗体に結合されることにより、特定の細胞型に標的化され得る。
【００５７】
本発明の核酸構築物および／またはベクターは、本発明による修飾ｓｎｏＲＮＡを生成するように設計された２つ以上の配列を含み得る。２つ以上の配列が存在する場合、配列は同じ標的核酸または異なる標的核酸を標的とするように設計され得る。
【００５８】
核酸構築物、ベクターまたは実際に修飾ｓｎｏＲＮＡ自体をコードする核酸は、遺伝子発現を調節するために本発明のｓｎｏＲＮＡ分子と併せて用いられるＲＮＡｉ分子のような更なる分子を発現するように設計され得る。
【００５９】
従来のトランスジェニック動物が作製される必要がないように、本発明の技法を用いて疾患モデルを作成することも可能であり得る。従って、本発明の核酸、核酸構築物またはベクターは、宿主細胞／動物における正常な野生型遺伝子／タンパク質の発現を阻止または最小限にするためにｓｎｏＲＮＡを発現し、また、特定の疾患／病状と関連する遺伝子／タンパク質の変異形態を発現するように設計され得る。次に、治療が変異遺伝子／タンパク質の作用を処置または改善するかを確認するため、細胞／動物に潜在的治療法が加えられ／施され得る。
【００６０】
本発明のｓｎｏＲＮＡ、核酸、核酸構築物および／またはベクターは、細胞若しくは生物における遺伝子の機能を確定し、または更に、細胞若しくは生物における遺伝子の機能を調節するために用いられ得る。好ましくは、細胞は真核細胞または細胞株、例えば、植物細胞または動物細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、胚細胞、多能性幹細胞、腫瘍細胞、例えば、テラトカルシノーマ細胞またはウイルス感染細胞である。好ましくは、生物は真核生物、例えば、植物または動物、例えば、哺乳動物、特にヒトである。
【００６１】
本発明のｓｎｏＲＮＡ分子が目標とする標的遺伝子は病態と関連し得る。例えば、遺伝子は病原体関連遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子、腫瘍関連遺伝子または自己免疫疾患関連遺伝子であり得る。標的遺伝子は組換え細胞または遺伝子改変生物に発現される異種遺伝子でもあり得る。このような遺伝子の機能を確定または調節、特に抑制することにより、農業分野または医学若しくは獣医学分野における貴重な情報および治療上の利益が得られ得る。本発明は、典型的には単一のベクターを用いて細胞（またはウイルス）タンパク質（または機能性ＲＮＡ）の一形態を別の形態に置換するように設計された、核酸構築物およびｓｎｏＲＮＡの提供を可能にする。例えば、これは、生物または細胞に見出される異常、例えば、疾患の原因因子であることが公知であり得る変異遺伝子を矯正するために用いられ得る（例えば、嚢胞性線維症の発症につながるＣＦＴＲ遺伝子における遺伝子変異）。同じベクターが、変異遺伝子の発現を低下させるために標的化されるｓｎｏＲＮＡをコードし、また、正確なタンパク質を発現させるために同じ構築物内にて遺伝子の正確なコピーをコードするように設計され得る。正確なコピーは、ｃＤＮＡ配列によって提供され、或いは本発明の修飾ｓｎｏＲＮＡをコードするイントロンに隣接するエクソンにコードされ得る。他の例には、癌の進行と関連する変異ｐ５３遺伝子、ＢＲＣＡ遺伝子などの置換が含まれる。
【００６２】
有利には、ｓｎｏＲＮＡと置換核酸とは同じ転写物内にあり、発現をノックダウンするｓｎｏＲＮＡと同じプロモーターから発現され得る。これは、すべてのものが単一の転写物として発現されることを可能にするという利点を有する。更に、これは、ｓｎｏＲＮＡと発現置換核酸との発現レベルが均衡を保たれ、同時制御される（すなわち、同じプロモーターから）という利点も有する。
【００６３】
タンパク質をコードしない標的ＲＮＡ（例えば、ｓｎＲＮＡまたはｍｉＲＮＡまたは他の機能性ＲＮＡ）を同じＲＮＡの修飾形態に置換するために、同様の手法が用いられ得る。
【００６４】
この戦略は異常の矯正に限定されない。細胞またはウイルスにコードされる任意のタンパク質（またはＲＮＡ）を置換するために同様の戦略が用いられ得、そのタンパク質には、同じ遺伝子産物の異常、変異または修飾形態に置換される野生型および／または機能的形態のタンパク質（またはＲＮＡ）が含まれ、これは、ある種の適用、例えば、変異表現型を評価し、または薬物スクリーニング戦略を支援し、または標的を検証し、または既存の非標識細胞形態からの競合なしに標識形態のタンパク質を分析し、または他の適用若しくは研究用途に望ましい可能性がある。この戦略は、単一のベクターを用いて１つのタイプのタンパク質（またはＲＮＡ）を完全または実質的に異なるタンパク質（またはＲＮＡ）に置換するためにも用いられ得る。
【００６５】
図１〜３は本発明に従って用いられ得るベクターの例を概略的に示す。図１において、ベクターは、単一の遺伝子配列または複数の遺伝子配列の発現を調節するために標的化され得る複数のｓｎｏＲＮＡを発現させるものとして示されている。図２はタンパク質置換ベクターを概略的に示し、これは、ベクター内に見出されるｃＤＮＡにコードされる新たなタンパク質に置換され得る標的遺伝子Ｘの発現を抑制するｓｎｏＲＮＡを提供するように設計される。図３はタンパク質置換ベクターと同様のベクターを概略的に示すが、これは変異ＲＮＡのようなＲＮＡを抑制するためであり、ＲＮＡはベクターに存在する配列と異なる／新たなバージョンに置換され得る。
【００６６】
本発明の細胞または生物に対する更なる適用は、遺伝子発現プロファイルおよび／またはプロテオームの解析である。一実施形態では、１つまたは複数の標的タンパク質の変異体または突然変異形態の分析が行われ得、変異または突然変異形態は上述のように外因性標的核酸によって細胞または生物に再導入される。変異した、例えば、部分的に欠失した外因性標的を用いることによる内因性遺伝子のノックアウトとレスキューとの組合せは、ノックアウト細胞の使用に比べて利点を有する。更に、この方法は標的タンパク質の機能ドメインを同定するのに特に好適である。更なる好ましい実施形態では、例えば少なくとも２つの細胞または生物の遺伝子発現プロファイルおよび／またはプロテオームおよび／または表現型の特徴の比較が行われる。
【００６７】
本発明は、薬剤を同定し、且つ／或いは特徴付け、例えば、被験物質の集合から新規薬剤を同定し、且つ／或いは既知の薬剤の作用および／または副作用の機序を特徴付けるための処置にも適用を見出す。
【００６８】
従って、更なる態様では、標的遺伝子（単数または複数）の発現を調節、特に下方制御することが望ましい患者における疾患または病状を処置するのに用いる、本発明によるｓｎｏＲＮＡ、核酸、核酸構築物またはベクターが提供される。
【００６９】
一層更なる態様では、標的遺伝子（単数または複数）の発現を調節、特に下方制御することが望ましい患者における疾患または病状を処置するのに用いる薬剤の製造に用いる、本発明によるｓｎｏＲＮＡ、核酸、核酸構築物またはベクターが提供される。
【００７０】
一層更なる態様では、標的遺伝子（単数または複数）の発現を調節、特に下方制御することが望ましい患者における疾患または病状を処置する方法が提供され、この方法は、本発明による治療有効量のｓｎｏＲＮＡ、核酸、核酸構築物またはベクターを、これを必要とする患者に投与するステップを含む。
【００７１】
本明細書で用いられるように、「処置する」という表現は、疾患、障害若しくは病状を患い、またはそれと診断された患者において、疾患、障害または病状の進展を抑制または阻止し、且つ／或いは疾患、障害または病状の軽減、緩解または退行を引き起こすことをいう。当業者は、疾患、障害または病状の進展を評価するために用いられ得る種々の方法およびアッセイ、また、同様に、疾患、障害または病状の軽減、緩解または退行を評価するために用いられ得る種々の方法およびアッセイを認識するであろう。
【００７２】
本発明のこの態様による方法は、本発明の単離ポリヌクレオチドを患者の細胞に付与し、これにより、患者の細胞における標的ＲＮＡレベルを下方制御することによって達成される。
【００７３】
付与は、本発明のポリヌクレオチドを細胞に直接投与することにより、または上述のように細胞にポリヌクレオチドを発現させることによって達成され得る。発現は、本発明のポリヌクレオチドを発現することができる核酸構築物を患者の細胞に直接トランスフェクトすることにより（即ち、生体内トランスフェクション）、または核酸構築物を患者から単離された細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を患者に投与することによって（即ち、エクスビボトランスフェクション）達成され得る。
【００７４】
更なる態様では、本発明によるｓｎｏＲＮＡ若しくは本発明によるｓｎｏＲＮＡ分子を発現することができる核酸構築物および医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物が提供される。
【００７５】
医薬製剤には、経口、局所（経皮、頬側および舌下）、経直腸若しくは非経口（皮下、皮内、筋肉内および静脈内）、経鼻および肺内投与、例えば、吸入に好適なものが含まれる。製剤は必要に応じて個々の用量単位にて好都合に提示され得、薬学分野において周知の任意の方法により調製され得る。方法はすべて、活性化合物を液体担体または微細に分割された固体担体およびその両方と会合させ、次に、必要な場合、生成物を所望の製剤に成形するステップを含む。
【００７６】
担体が固体である経口投与に好適な医薬製剤は、単位用量製剤、例えば、各々が所定量の活性化合物を含むボーラス、カプセルまたは錠剤として最も好ましく提示される。錠剤は圧縮または成形によって作製され得、任意に１つ以上の副成分を含む。圧縮製剤は、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、平滑剤、表面活性剤または分散剤と任意に混合された易流動性形態、例えば、粉末または顆粒にて活性化合物を好適な機械にて圧縮することによって調製され得る。成形製剤は不活性液体希釈剤で活性化合物を成形することによって作製され得る。錠剤は任意にコーティングされ得、コーティングされない場合、任意に刻み目を付けられ得る。カプセルは、単独でまたは１つ以上の副成分との混合物にて活性化合物をカプセル殻に充填し、次に、通常の方法でそれらを密封することによって調製され得る。カシェはカプセルに類似し、任意の副成分とともに活性化合物がライスペーパー包装材料に密封される。活性化合物は、例えば、投与前に水中に懸濁され、または食物上に散らされ得る分散可能な顆粒としても製剤化され得る。顆粒は、例えば、サシェにパッケージングされ得る。担体が液体である経口投与に好適な製剤は、水性若しくは非水性液体中の溶液若しくは懸濁液または水中油型液体エマルションとして提示され得る。
【００７７】
経口投与用の製剤は、放出制御剤形、例えば、活性化合物が適切な放出制御マトリクスにて製剤化され、または好適な放出制御フィルムでコーティングされた錠剤を含む。このような製剤は予防的使用に特に好都合であり得る。
【００７８】
担体が固体である経直腸投与に好適な医薬製剤は、単位用量坐剤として最も好ましく提示される。好適な担体には、カカオバターおよび当技術分野において一般的に用いられる他の材料が含まれる。坐剤は、活性化合物の軟化または溶融担体との混合、次に、冷却および鋳型における成形によって好都合に形成され得る。
【００７９】
非経口投与に好適な医薬製剤には、水性または油性ビヒクル中の活性化合物の滅菌溶液または懸濁液が含まれる。
【００８０】
注入用製剤はボーラス注入または持続注入に適合され得る。このような製剤は、使用のために必要となるまで製剤の導入後に密封される単位用量または複数用量容器にて好都合に提示される。或いは、活性化合物は、使用前に滅菌発熱物質非含有水のような好適なビヒクルで構成された粉末形態でよい。
【００８１】
活性化合物は長時間作用持効性製剤としても製剤化され得、筋肉内注射または、例えば、皮下または筋肉内移植により投与され得る。持効性製剤は、例えば、好適なポリマー若しくは疎水性材料またはイオン交換樹脂を含み得る。このような長時間作用製剤は予防的使用に特に好都合である。
【００８２】
活性化合物を含み、望ましくは０．５〜７ミクロンの範囲の直径を有する粒子がレシピエントの気管支樹に送達されるように、口腔を介する肺内投与に好適な製剤が提示される。
【００８３】
１つの可能性として、このような製剤は、吸入デバイスで用いる、好適には、例えば、ゼラチンの貫通可能なカプセル、或いは活性化合物、好適な液体若しくは気体推進剤および、任意に、他の成分、例えば、界面活性剤および／または固体希釈剤を含む自力推進製剤として、好都合に提示され得る、微細に粉砕された粉末形態である。好適な液体推進剤はプロパンおよびクロロフルオロカーボンを含み、好適な気体推進剤は二酸化炭素を含む。活性化合物が溶液または懸濁液の液滴形態にて投与される自力推進製剤も用いられ得る。
【００８４】
このような自力推進製剤は当技術分野において公知のものに類似し、確立された手順によって調製され得る。好適には、自力推進製剤は、所望の噴霧特徴を有する手動または自動機能バルブを備えた容器にて提示される。有利には、バルブは各操作と同時に固定量、例えば、２５〜１００マイクロリットルを送達する計量タイプである。
【００８５】
更なる可能性として、活性化合物はアトマイザーまたはネブライザーに用いる溶液または懸濁液の形態でよく、これにより、吸入のための微液滴霧を生成するために加速気流または超音波攪拌が用いられる。
【００８６】
経鼻投与に好適な製剤は、肺内投与に関して上述したものに概して類似する製剤を含む。このような製剤は、投与される際、鼻腔における保持を可能にするために望ましくは１０〜２００ミクロンの範囲の粒子径を有するべきである。これは、必要に応じて好適な粒子サイズの粉末の使用または適切なバルブの選択によって達成され得る。他の好適な製剤には、鼻に接近して保持された容器から鼻道を通る急速吸入による投与のための、２０〜５００ミクロンの範囲の粒子径を有する粗粉末および、水性若しくは油性溶液若しくは懸濁液中０．２〜５％ ｗ／ｖの活性化合物を含む点鼻剤が含まれる。
【００８７】
前述の担体成分に加え、上述の医薬製剤は適切な１つ以上の更なる担体成分、例えば、希釈剤、緩衝剤、着香剤、結合剤、表面活性剤、増粘剤、潤滑剤、保存剤（酸化防止剤を含む）など、および製剤を対象レシピエントの血液と等張にさせることを目的として含有される物質を含み得ることが理解されるべきである。
【００８８】
医薬的に許容可能な担体は当業者には周知であり、０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍリン酸緩衝液または０．８％食塩水を含むが、これらに限定されない。加えて、このような医薬的に許容可能な担体は水性若しくは非水性溶液、懸濁液およびエマルションでよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、オレイン酸エチルのような注入可能な有機エステルである。水性担体は、食塩水および緩衝媒質を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルションまたは懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液または固定油を含む。保存剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤、不活性ガスなども存在し得る。
【００８９】
局所製剤に好適な製剤は、例えば、ゲル、クリームまたは軟膏として提供され得る。このような製剤は、創傷若しくは潰瘍の表面上に直接塗布され、または処置部位におよび処置部位上に適用され得る包帯、ガーゼ、メッシュなどのような好適な支持体に保有され、例えば、創傷または潰瘍に適用され得る。
【００９０】
処置部位、例えば、創傷または潰瘍に直接噴霧または撒き散らされ得る液体または粉末製剤も提供され得る。或いは、キャリア、例えば、包帯、ガーゼ、メッシュなどが製剤を噴霧または撒き散らされ、次に、処置部位に適用され得る。
【００９１】
獣医用の治療用製剤は好都合に粉末または液体濃縮物形態でよい。標準的な獣医学的製剤の習慣に従って、従来の水溶性賦形剤、例えば、ラクトースまたはスクロースがそれらの物理的特性を向上させるために粉末に取り込まれ得る。従って、本発明の特に好適な粉末は、５０〜１００％ ｗ／ｗ、好ましくは６０〜８０％ ｗ／ｗの活性成分および０〜５０％ ｗ／ｗ、好ましくは２０〜４０％ ｗ／ｗの従来の獣医学的賦形剤を含む。これらの粉末は、例えば、中間プレミックスとして動物飼料に加えられ、または動物飲料水中に希釈され得る。
【００９２】
本発明の液体濃縮物は、化合物またはその誘導体若しくは塩を好適に含み、獣医学的に許容可能な水混和性溶媒、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、グリセロールホルマールまたは最大３０％ ｖ／ｖエタノールと混合されたそのような溶媒を任意に含み得る。液体濃縮物は動物の飲料水に投与され得る。
【００９３】
これより、以下の非限定的実施例および図を参照して本発明が説明される。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】複数のｓｎｏＲＮＡを発現するように設計された本発明によるｓｎｏＲＮＡ発現ベクターを示す概略図である。
【図２】宿主細胞タンパク質をベクターにコードされたタンパク質に置換するように設計されたｓｎｏＲＮＡ発現ベクターを示す概略図である。
【図３】宿主細胞ＲＮＡをベクターにコードされたＲＮＡに置換するように設計されたｓｎｏＲＮＡ発現ベクターを示す概略図である。
【図４】ＨｅＬａ細胞の核小体ＲＮＡライブラリーを示す概略図である。（Ａ）ＨｅＬａ細胞核小体画分からの核小体ＲＮＡの単離およびクローニング。左パネルは分画前の無傷ＨｅＬａ細胞画像を示し、右パネルは単離核小体を示す。ＨｅＬａ細胞核小体は前述のように（非特許文献７）ショ糖密度勾配法により分画され、次に、全核小体ＲＮＡが核小体ペレットから単離された。全核小体ＲＮＡはポリＡポリメラーゼを用いて３’末端においてポリアデノシンの付加により修飾された。（Ｂ）増幅して（右側に図示）、また、増幅せずに（左側に図示）行われたｃＤＮＡ合成戦略を示す概略図。核小体ｃＤＮＡはポリＡテール核小体ＲＮＡをテンプレートとして用いて逆転写により合成された。増幅せずに（左側）作製されたライブラリーは主に豊富な核小体ＲＮＡ種を検出するために用いられ、一方、あまり豊富でない核小体ＲＮＡ種を含むライブラリーを作製するために増幅法（右側）を用いた。これらのライブラリーはともに独立して通常のプラスミドベクターにクローニングされ、ＤＮＡ塩基配列決定法により解析された。（Ｃ）核小体ｃＤＮＡライブラリーにおいて検出されたＲＮＡ種の概要。増幅および非増幅ライブラリーを独立して解析したが、円グラフは両方のライブラリーの総合結果を示す。
【図５】ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡおよび宿主遺伝子Ｃ１９ｏｒｆ４８の保存を示す概略図である。（Ａ）ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡの構造。ボックスＣ（Ａ／Ｇ）ＵＧＡＵＧＡ）およびボックスＤ若しくはＤ’（ＣＵＧＡ）は各々ボックス内に示される。リボース２’−Ｏ−メチル化部位を指定するための予測ｒＲＮＡ相補配列は下線により示される。（Ｂ）ＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡ前駆体と相補的であることが見出された領域を示すＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡの予測二次構造。ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡの二次構造はｍｆｏｌｄ（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｎｔｅｎｄ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍｆｏｌｄ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｒｎａ−ｆｏｒｍ１．ｃｇｉ）により計算された（非特許文献２０（Ｍｆｏｌｄ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）および非特許文献２０（Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ））（左側）。ボックスＣおよびボックスＤおよびＤ’は各々ボックス内に示される。ｒＲＮＡ相補配列（点線）およびＦＧＦＲ３相補配列（実線）はバーで示される。ＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡ前駆体の相補領域は右側に示され、潜在的な塩基対合相互作用を示す。（Ｃ）ヒトＣ１９ｏｒｆ４８遺伝子の構造。エクソンはローマ数字を有する縞模様ボックスとして示される。予測タンパク質コード領域は黒色にて示される。イントロンにコードされたｓｎｏＲＮＡ ＨＢＩＩ−１８０Ａ，ＨＢＩＩ−１８０ＢおよびＨＢＩＩ−１８０Ｃはソリッドグレー・ボックスとして示される。（Ｄ）Ｃ１９ｏｒｆ４８遺伝子の保存領域。この写真は、ＵＣＳＣ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ 非特許文献２１：Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｂｒｏｗｓｅｒ ａｔ ＵＣＳＣ）Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｍｕｌｔｉｚ ＡｌｉｇｎｍｅｎｔのＣ１９ｏｒｆ４８染色体位置に由来し、保存結果は黒色ボックスおよびバーとして示される。１７の脊椎動物種の間の保存領域がバーとして示される（保存）。最も保存された３つの領域は、３つの検出ＨＢＩＩ ｓｎｏＲＮＡに正確に対応する。
【図６】ＨＢＩＩ−１８０ＣのＦＧＦＲ３相補領域の配列特異的作用を示す概略図である。（Ａ）ノーザンブロット（左パネル）および半定量的ＲＴ−ＰＣＲ（右パネル）により解析されたＨＢＩＩ−１８０Ｃ発現レベル。左パネルはＨＢＩＩ−１８０Ｃ特異的プローブを用いたノーザンブロット解析の結果を示す。ヒト一次細胞株ＷＩ３８（ＷＩ３８）およびＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ）由来の同量の全核小体ＲＮＡ（核小体）または全細胞ＲＮＡ（細胞）がブロットされた。右パネルはＨＢＩＩ−１８０Ｃ特異的プライマーセットを用いた半定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。ＷＩ３８およびＨｅＬａ細胞由来の同量の全核小体ＲＮＡまたは全細胞ＲＮＡがテンプレートとして用いられた。（Ｂ）野生型および変異ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡに対するＨＢＩＩ−１８０Ｃ発現プラスミド。ＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡ前駆体と相補的なＨＢＩＩ−１８０Ｃにおける配列はＧＡＧＧからＡＴＡＡに変えられた（青色、ｍｕｔ１）。（Ｃ）ＷＩ３８細胞におけるｗｔまたは変異体１ ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡの発現の作用の比較。画像は、空プラスミドｐｃＤＮＡ３（ｐｃＤＮＡ３）、ＨＢＩＩ−１８０Ｃ野生型発現プラスミド（ＷＴ）またはＨＢＩＩ−１８０Ｃ変異発現プラスミド（ｍｕｔ１）によるＷＩ３８細胞のトランスフェクション後３日での細胞の代表例を示す。赤色矢印は死滅しようとしている細胞または死滅細胞の集団を示す。（Ｄ）上述のプラスミドによる発現後３日での死滅細胞のパーセントを示すグラフ。ＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡ前駆体相補領域の変異はＷＴと比べて細胞死のレベルを明らかに低下させた。
【図７】ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡのＦＧＦＲ３相補領域が別のＦＧＦＲ３スプライスアイソフォームのパターンと関連することを示す概略図である。（Ａ）内因性ＨＢＩＩ１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡの発現／活性を抑制するように設計された、野生型および変異体に対するＦＧＦＲ３イントロン１７発現プラスミド。変異構築物ではＦＧＦＲ３の相補領域はＣＣＴＣからＴＴＡＴに変えられた（青色、ＦＲｍ）。（Ｂ）ＷＩ３８およびＨｅＬａ細胞におけるＦＧＦＲ３スプライスｍＲＮＡアイソフォームに対する内因性発現パターン。ゲル（左画像）は別のＦＧＦＲ３スプライスｍＲＮＡアイソフォームを検出するためのＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す。右図はＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡ特異的プライマーセットに対する位置を示す。エクソンはローマ数字を有するボックスとして示される。ＰＣＲに用いられるプライマーが矢印として示される。（Ｃ）ＦＧＦＲ３代替スプライスｍＲＮＡアイソフォームパターンはＦＧＦＲ３ミニ遺伝子の過剰発現により変えられた。ゲル画像は、トランスフェクションなし（Ｎｏ、レーン１）、トランスフェクトされた空プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（ｐＣ、レーン２）、ＦＧＦＲ３イントロン１７の野生型ミニ遺伝子（ＦＲ３Ｗ、レーン３）および変異ミニ遺伝子（ＦＲｍ、レーン４）のＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。
【図８】修飾ｓｎｏＲＮＡ発現ベクターを用いたＧＦＰおよびＹＦＰの標的抑制を示す概略図である。（Ａ）ＧＦＰおよびＹＦＰが共有する配列を標的とするキメラ発現プラスミド。ＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡ前駆体と相補的なＷＴ ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡにおける配列は、５’−ＣＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＴＧＣＡ−３’から５’−ＧＡＣＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣ−３’（青色、キメラ１）または５’−ＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣ−３’（青色、キメラ２）に変えられた。その結果生じたキメラ１および２ ｓｎｏＲＮＡはｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質ｃＤＮＡを発現するベクターの３’領域にサブクローニングされた。（Ｂ）図は、ともに関連ＹＦＰ遺伝子にも存在する２つの別のＧＦＰ領域を標的とするキメラ１およびキメラ２の相補領域を示す。（Ｃ）非融合ＧＦＰのみを発現するＨｅＬａＧＦＰ安定細胞株におけるＧＦＰ発現に対するキメラ構築物の作用。画像は、ＨｅＬａＧＦＰ安定細胞株において空ｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミドｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１（ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１）、発現プラスミドＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ１または発現プラスミドＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ２をトランスフェクトする作用を示す。左パネルはトランスフェクションをしないＨｅＬａＧＦＰ安定細胞株の生細胞画像を示す（ＤＩＣ画像）。上部パネルは固定細胞から記録された画像のＧＦＰ蛍光シグナルを示す（緑色）。下部パネルはＧＦＰ（緑色）とｍＣｈｅｒｒｙ（赤色）シグナルとを合体させた融合画像を示す。矢印はトランスフェクトされた細胞を示し、矢頭はトランスフェクトされなかった細胞を示す。特に、ＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ１またはキメラ２をコードする発現プラスミドをトランスフェクトされた細胞におけるＧＦＰ発現の明らかな低下に留意されたい。（Ｄ）フィブリラリンのアミノ末端において融合したＹＦＰを発現するＨｅＬａＹＦＰ−ＦＩＢＲＩＬＬＡＲＩＮ安定細胞株におけるＹＦＰ発現に対するキメラ構築物の作用（非特許文献１１（１６））。写真は、ＨｅＬａＹＦＰ−ＦＩＢＲＩＬＬＡＲＩＮ安定細胞株における空ｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミドｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１（ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１）、発現プラスミドＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ１または発現プラスミドＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ２を用いたトランスフェクションの作用を示す。左パネルはトランスフェクションをしないＨｅＬａＹＦＰ−ＦＩＢＲＩＬＬＡＲＩＮ安定細胞株の生細胞画像を示す（ＤＩＣ画像）。上部パネルは固定細胞から記録された画像のＹＦＰ蛍光シグナルを示す（緑色）。下部パネルはＹＦＰ（緑色）、ｍＣｈｅｒｒｙ（赤色）およびＤＡＰＩシグナル（青色）を合体させた融合画像を示す。矢印はトランスフェクトされた細胞を示し、一方、矢頭はトランスフェクトされなかった細胞を示す。特に、ＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ１またはキメラ２をコードする発現プラスミドをトランスフェクトされた細胞におけるＹＦＰ−フィブリラリン発現の明らかな低下に留意されたい。一部の細胞ではＹＦＰシグナルはほぼ完全に除かれ、キメラｓｎｏＲＮＡ構築物によるＹＦＰ−フィブリラリンの効率的な抑制を示す。
【図９】ウエスタンおよびノーザンブロット法により検出されるＧＦＰおよびＹＦＰの標的ｓｎｏＲＮＡ抑制を示す概略図である。（Ａ）空ｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミドｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１（対照：レーン１）、発現プラスミドＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ１（レーン２）または発現プラスミドＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ２（レーン３）を用いた、ＨｅＬａＧＦＰおよびＨｅＬａＹＦＰ−ＦＩＢＲＩＬＬＡＲＩＮ安定細胞株のトランスフェクション後のＧＦＰ（上部）およびＹＦＰ−フィブリラリン（下部）に対するタンパク質レベルの検出。同等量のＨｅＬａ抽出物が各レーンに対してロードされ、タンパク質がＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離され、エレクトロブロットされ、モノクローナル抗ＧＦＰ抗体およびローディング対照としての抗チューブリンでプローブされた。特に、ＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ１または２をコードする発現プラスミドに関してチューブリンでなくＧＦＰおよびＹＦＰ−フィブリラリンレベルの低下に留意されたい。（Ｂ）グラフは３つの独立した実験の平均シグナル強度および標準偏差を示す。ＧＦＰシグナル比はチューブリンシグナルに規準化された。特に、ＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ１または２をコードする発現プラスミドに関してチューブリンでなくＧＦＰおよびＹＦＰ−フィブリラリンレベルの低下に留意されたい。（Ｃ）空ｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミドｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１（対照：レーン１）、発現プラスミドＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ１（レーン２）または発現プラスミドＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ２（レーン３）を用いた、ＨｅＬａＹＦＰ−ＦＩＢＲＩＬＬＡＲＩＮ安定細胞株のトランスフェクション後のＹＦＰ−フィブリラリンのＲＮＡレベルの検出。同等量のＨｅＬａ細胞全ＲＮＡが各レーンに対してロードされ、ＲＮＡが６．５％ホルムアルデヒド−０．８％アガロースゲルによって分離され、エレクトロブロットされ、放射標識された抗ＹＦＰオリゴおよびローディング対照としての抗１８Ｓ ｒＲＮＡでプローブされた。グラフは３つの独立した実験の平均シグナル強度および標準偏差を示す。ＹＦＰ−フィブリラリンシグナル比は１８Ｓ ｒＲＮＡシグナルに規準化された。（Ｄ）キメラｓｎｏＲＮＡプラスミドのトランスフェクション効率。ｍｃｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲにより定量された。一過性にトランスフェクトされたｍＣｈｅｒｒｙプラスミド（対照）およびキメラｓｎｏＲＮＡからＨｅＬａ細胞全ＲＮＡが単離された。グラフは３つの独立した実験の平均シグナル強度を示す。ｍＣｈｅｒｒｙシグナル比はＧＡＰＤＨシグナルに規準化された。
【図１０】キメラ１および２を用いた遺伝子ノックダウンの別例を示す概略図である。これは図８ＣおよびＤに示されるものと同じ実験設計であるが、この場合、安定細胞株ＨｅＬａＧＦＰ−ＳＭＮを用いている。ｍＣｈｅｒｒｙ−ＨＢＩＩ−１８０Ｃは、ｍＣｈｅｒｒｙ ｃＤＮＡの３’領域に野生型ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡ配列を有する別の陰性対照である。矢印はトランスフェクトされた細胞を示し、矢頭はトランスフェクトされなかった細胞を示す。特に、ＨＢＩＩ−１８０Ｃキメラ１またはキメラ２をコードする発現プラスミドをトランスフェクトされた細胞におけるＧＦＰ発現の明らかな低下に留意されたい。
【図１１】三重キメラｓｎｏＲＮＡプラスミドを用いた標的遺伝子ノックダウンを示す概略図である。（Ａ）三重キメラｓｎｏＲＮＡ構築物の構造および標的ＧＦＰ／ＹＦＰノックダウンの概略図。（Ｂ）（Ｃ）これは図８ＣおよびＤにおいて用いられるものと同じ実験設計であるが、この場合、トランスフェクションのために三重キメラプラスミドを用いている。Ｍｃｈｅｒｒｙ三重ＨＢＩＩ−１８０Ｃは、ｍＣｈｅｒｒｙ ｃＤＮＡの３’領域に野生型ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡ配列の３つのリピートを有する別の陰性対照である。矢印：トランスフェクト、矢頭：トランスフェクトされず。（Ｄ）ＧＦＰ／ＹＦＰに標的化された各キメラプラスミドのノックダウン効率がウエスタンブロット法により試験された（レーン１〜５）。ｍＣｈｅｒｒｙおよび野生型ＨＢＩＩ−１８０Ｃ発現プラスミドｍＣｈｅｒｒｙ−ＨＢＩＩ−１８０Ｃ（対照：レーン１）、発現プラスミドキメラ１（レーン２）、キメラ２（レーン３）、キメラ３（レーン４）、ＨＢＩＩ−１８０Ｃ三重キメラ（レーン５）を用いた、ＨｅＬａＹＦＰ−ＦＩＢＲＩＬＬＡＲＩＮ安定細胞株のトランスフェクション後のＹＦＰ−フィブリラリンに対するタンパク質レベルの検出。同等量のＨｅＬａ抽出物が各レーンに対してロードされ、タンパク質がＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離され、エレクトロブロットされ、モノクローナル抗ＧＦＰ抗体およびローディング対照としての抗Ｂ２３でプローブされた。グラフはＢ２３シグナルにより規準化したＹＦＰ−フィブリラリンシグナル強度を示した。特に、キメラ１，２および３をコードする発現プラスミドに関する、Ｂ２３でなくＹＦＰ−フィブリラリンレベルの低下に留意されたい。ＹＦＰ−フィブリラリン発現レベルを低下させる効率性は三重キメラプラスミドを用いることによって高められた。（Ｅ）これは図１１ＢおよびＣに示されるものと同じ実験設計であるが、この場合、キメラ安定細胞株ＨｅＬａＧＦＰ−ＳＭＮを用いている。三重キメラプラスミドに媒介される標的遺伝子発現の低下は、ＧＦＰ−ＳＭＮ融合タンパク質の別の安定細胞株を用いても検出された。矢印：トランスフェクト、矢頭：トランスフェクトされず。
【図１２】三重キメラプラスミドからのキメラｓｎｏＲＮＡの同定を示す概略図である。（Ａ）野生型ＨＢＩＩ−１８０ＣおよびキメラｓｎｏＲＮＡ（Ｃｙ３）の核小体局在を示す蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。ＤＮＡはＤＡＰＩによって染色される。バーは１０ｕＭである。三重キメラｓｎｏＲＮＡ構築物の構造は上部パネルに示される。矢印は核小体を示す。（Ｂ）ＨＢＩＩ−１８０ＣおよびキメラｓｎｏＲＮＡの特徴付け。ＨＢＩＩ−１８０ＣおよびキメラｓｎｏＲＮＡの細胞内分布を示すＲＮＡブロット。特定のプローブを用いてノーザンＲＮＡブロット解析により同量のＨｅＬａ細胞全ＲＮＡ（レーン１）、細胞質ＲＮＡ（レーン２）、核質ＲＮＡ（レーン３）および核小体ＲＮＡ（レーン４）が、一過性にトランスフェクトされた野生型またはキメラｓｎｏＲＮＡ発現ミニ遺伝子と比較された。ｔＲＮＡ−ＩＩｅ特異的プローブを用いて分画の質が試験された（下部パネル）。
【図１３】ＨＢＩＩ−１８０ＣおよびキメラｓｎｏＲＮＡ変異の分析を示す概略図である。（Ａ）８つの別個の３ヌクレオチドＡＡＡ変異の位置をｍ１〜ｍ８として（配列上に図示）ｓｎｏＲＮＡ ＨＢＩＩ−１８０Ｃの配列が示される。ボックスＣ，ＤおよびＤ’はボックスで示される。２８Ｓ ｒＲＮＡと相補的な予測ガイド配列はｓｎｏＲＮＡＢａｓｅに示されるように下線で示される（非特許文献１７（１９））。Ｍボックス領域は太字下線で示される。ＨｅＬａ細胞は、空プラスミドベクター（レーン２）または野生型ＨＢＩＩ−１８０Ｃ（レーン３）若しくはＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡ変異体ｍ１〜８（レーン４〜１１）を発現するプラスミドベクターを一過性にトランスフェクトされた。各レーンに対して同量の全ＨｅＬａ細胞ＲＮＡがロードされた（対照：トランスフェクションなし）。バンドは、ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡおよびｔＲＮＡをそれぞれ検出するために放射標識オリゴヌクレオチドプローブを用いた高感度ＲＮＡブロット法の結果を示す。Ｃ１９ｏｒｆ４８およびＧＡＰＤＨ特異的プライマーセット（Ｃ１９ｏｒｆ４８およびＧＡＰＤＨ）を用いた半定量的ＲＴ−ＰＣＲによってトランスフェクション効率が確認された。＊Ｃ１９ｏｒｆ４８プライマーは内因性Ｃ１９ｏｒｆ４８転写物とＨＢＩＩ−１８０Ｃミニ遺伝子とが共有する領域を検出する。（Ｂ）野生型プラスミド（ＣＭ２ＷＴ）および変異プラスミド（ＣＭ２ｍ１およびｍ７）はＧＦＰ単独安定細胞（ＨｅＬａＧＦＰ）またはＧＦＰ−ＳＭＮ融合タンパク質安定細胞株（ＨｅＬａＧＦＰ−ＳＭＮ）に一過性にトランスフェクトされた。矢印：トランスフェクト、矢頭：トランスフェクトされず。キメラ２プラスミド上のＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡのボックスＣ（ＣＭ２ｍ１）およびボックスＤ（ＣＭ２ｍ７）（図１３Ａ）がＧＦＰおよびＧＦＰ−ＳＭＮ発現レベルに対するノックダウン作用を示さなかったため、コア領域の変異に留意されたい。（Ｃ）変異プラスミド（ＣＭ２ｍ２−１，ｍ２−２およびｍ３）はＧＦＰ−ＳＭＮ融合タンパク質安定細胞株（ＨｅＬａＧＦＰ−ＳＭＮ）に一過性にトランスフェクトされた。矢印：トランスフェクト、矢頭：トランスフェクトされず。２８Ｓ ｒＲＮＡ相補配列を破壊された変異プラスミド（ＣＭｍ２−１およびｍ２−２）の明らかなノックダウン作用があることに留意されたい。（Ｄ）ＧＦＰとの相補性を高めるためにＭボックスに挿入（ＣＭ２Ｉｎ−１〜−３）またはＭボックスに欠失（ＣＭ２Ｄｅｌ−１〜−３）を有する変異プラスミドは、ＧＦＰ−ＳＭＮ融合タンパク質安定細胞株（ＨｅＬａＧＦＰ−ＳＭＮ）に一過性にトランスフェクトされた。矢印：トランスフェクト、矢頭：トランスフェクトされず。（Ｅ）Ｍボックスに点変異（ＣＭ２Ｘ−１〜−６）を有する変異プラスミドは、ＧＦＰ−ＳＭＮ融合タンパク質安定細胞株（ＨｅＬａＧＦＰ−ＳＭＮ）に一過性にトランスフェクトされた。矢印：トランスフェクト、矢頭：トランスフェクトされず。（Ｆ）キメラ２変異原性の結果の概要。左パネルはＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡのモチーフおよび各プラスミドの変異領域を示す（表中のプラスミド名および変異位置）。表は顕微鏡分析の結果を示す（図１３Ｂ〜Ｅ）。ノックダウン効率は、無作為に選択された３０個のトランスフェクトされた細胞を数えることにより決定されたＧＦＰ−ＳＭＮレベルの抑制を示した細胞の数を示す（＋＋＋：１６超、＋＋：１３〜１６、＋：９〜１２、−：５〜８，−−：５未満）。
【図１４】ｓｎｏＲＮＡ骨格変異の組合せを組み込んだ三重キメラプラスミドが標的遺伝子の発現のノックダウンを媒介することができることを示す概略図である。（Ａ）変異ｍ２，ｍ４およびｍ５配列はすべて組み合わせられ、三重キメラｓｎｏＲＮＡ（ｓｎｏＭＥＮｖ１）に組み込まれた。核小体局在を示す、Ｃｙ３標識キメラｓｎｏＲＮＡ特異的プローブ（Ｃｙ３）を用いた蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。ＤＮＡはＤＡＰＩによって染色される。バーは１５ｕｍである。矢印は核小体を示す。（Ｂ）これは図１１Ｅに示されるものと同じ実験設計であるが、但し三重キメラｓｎｏＭＥＮｖ１プラスミドがトランスフェクトされた。ｓｎｏＭＥＮｖ１プラスミドが野生型三重キメラプラスミドと同様の標的遺伝子の低下レベルを示したことに留意されたい。
【図１５】内因性ＳＭＮ１タンパク質の標的タンパク質置換を示す概略図である。（Ａ）標的内因性ＳＭＮ１遺伝子ノックダウンプラスミド（ＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１）およびＳＭＮ１タンパク質置換プラスミド（ＧＦＰ−ＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１−ＰＲ）の構造。これらの構築物は三重キメラｓｎｏＭＥＮｖ１と同様の三重ｓｎｏＭＥＮ配列を有するが（図１４Ａ）、但し、Ｍボックス配列は内因性ＳＭＮ１ ｍＲＮＡ前駆体特異的配列に対する相補配列を有する（材料および方法を参照されたい）。（Ｂ）標的内因性ＳＭＮ１プラスミド（ＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１）およびタンパク質置換プラスミド（ＧＦＰ−ＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１−ＰＲ）はＨｅＬａ細胞にトランスフェクトされた。ＧＦＰ ｃＤＮＡおよびｍｃｈｅｒｒｙ三重キメラプラスミド（図１４Ａ）を発現するＥＧＦＰ−Ｃ１も対照としてＨｅＬａ細胞に一過性にトランスフェクトされた（ＧＦＰおよび三重キメラ）。ＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１が、対照が示さなかった細胞傷害表現型を示したことに留意されたい。この細胞傷害作用はＧＦＰ−ＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１−ＰＲプラスミドを用いてＧＦＰ−ＳＭＮ１融合タンパク質の発現によってレスキューされた。矢印：トランスフェクトされた細胞、矢頭：細胞傷害表現型細胞。（Ｃ）ｍＣｈｅｒｒｙ三重キメラ（対照：レーン１）およびＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１（レーン２）を用いたＨｅＬａ細胞のトランスフェクション後の内因性ＳＭＮ１に対するタンパク質レベルの検出。同等量のＨｅＬａ抽出物が各レーンに対してロードされ、タンパク質がＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離され、エレクトロブロットされ、モノクローナル抗ＳＭＮ１抗体およびローディング対照としての抗Ｂ２３でプローブされた。グラフはＢ２３シグナルにより規準化したＳＭＮ１シグナル強度を示した。
【図１６】本発明のｓｎｏＲＮＡ分子を有するレンチウイルス系を示す概略図である。これは図１１Ｂにて行われ、説明されたものと同じ実験設計であるが、但し、この場合、発現ベクターはレンチウイルスベクター系（Ｌｅｎｔｉ−Ｘ（商標）Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてトランスフェクトされた。ｍＣｈｅｒｒｙ三重ＨＢＩＩ−１８０Ｃは、ｍＣｈｅｒｒｙ ｃＤＮＡの３’領域に野生型ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡ配列の３つのリピートを有する陰性対照である。矢印：トランスフェクトされた細胞、矢頭：トランスフェクトされなかった細胞。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
（略語）
ｓｎｏＲＮＡ：核小体低分子ＲＮＡ
ｓｎＲＮＡ：核内低分子ＲＮＡ
ｒＲＮＡ：リボソームＲＮＡ
ｔＲＮＡ：トランスファーＲＮＡ
ＦＧＦＲ３：線維芽細胞増殖因子受容体３
ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ
ｐｒｅ−ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ前駆体
ＧＡＰＤＨ：グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ
ＨＢＩＩ−１８０Ｃ：ヒト脳ｓｎｏＲＮＡ ＩＩ−１８０Ｃ
ＣＩＰ：仔ウシ腸管ホスファターゼ
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＣＭＶ：サイトメガロウイルス
【００９６】
（材料および方法）
核小体ｃＤＮＡライブラリーの構築。前述のようにショ糖密度勾配法を用いてＨｅＬａ細胞核小体を精製した（非特許文献７）。製造業者の指示に従って（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＤＮＡ分解酵素Ｉ処理によるＴＲＩｚｏｌ法によって精製核小体から核小体ＲＮＡを単離した。ポリＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて３’末端における２０〜３０ｍｅｒのポリアデニン配列の付加により核小体ＲＮＡを修飾した。非増幅ライブラリーの場合（図４Ｂ左側）、オリゴｄＴプライマーを用いた逆転写により、１０ｕｇのポリＡテール核小体ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。製造業者により説明されているように（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたニックトランスレーション置換法により第二鎖ｃＤＮＡを合成した。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端を生成した後、二本鎖ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにクローニングした。増幅ライブラリーの場合（図４Ｂ右側）、ＣＩＰステップなしにＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて核小体ｃＤＮＡを作製した。製造業者により説明されているように（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、アダプター特異的プライマーを用いた短時間のＰＣＲ増幅（例えば、５秒のポリメラーゼ反応）により、小さいサイズの二本鎖ｃＤＮＡを増幅した。製造業者の指示に従って、増幅されたｃＤＮＡをＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクターにクローニングした。
【００９７】
ノーザンブロット分析およびＲＴ−ＰＣＲ。製造業者の指示に従って（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＤＮＡ分解酵素Ｉ処理によるＴＲＩｚｏｌ法により、ＨｅＬａ細胞核小体およびＨｅＬａ細胞またはヒト線維芽細胞一次細胞株であるＷＩ３８細胞から核小体ＲＮＡおよび全細胞ＲＮＡを単離した。ＴＢＥ緩衝液中８Ｍ尿素ポリアクリルアミド変性ゲルによって同量のＲＮＡを分離する。エレクトロブロット法によりＲＮＡをナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社）上に移した。ＵＶ架橋結合後、標準的方法を用いてブロットされた膜を３２Ｐ標識特異的プローブとハイブリダイズした（Ｕ３：５’−ＣＡＣＴＣＡＧＡＣＣＧＣＧＴＴＣＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＡＡＴＡＣＧＧ−３’，ＨＢＩＩ−１８０Ｃ：５’−ＡＡＡＧＧＴＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＧＡＴＣＡＧＡ−３’．ＨＢＩＩ−８５：５’−ＡＣＧＡＣＧＧＴＡＴＧＡＧＴＴＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴＴＴＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＣＣ−３’）。各ｓｎｏＲＮＡの発現レベルを確認するためにＲＴ−ＰＣＲも行った。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ １ステップＲＴ−ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて遺伝子特異的プライマーにより逆転写およびＰＣＲを行った（Ｕ３：５’−ＡＧＡＧＧＴＡＧＣＧＴＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＧＣＧ−３’および５’−ＡＣＣＡＣＴＣＡＧＡＣＣＧＣＧＴＴＣＴＣ−３’，ＨＢＩＩ−１８０Ｃ：５’−ＣＴＣＣＣＡＴＧＡＴＧＴＣＣＡＧＣＡＣＴ−３’および５’−ＣＴＣＡＧＡＣＣＣＣＣＡＧＧＴＧＴＣＡＡ−３’，ＨＢＩＩ−８５：５’−ＧＡＴＣＧＡＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＣＣＣＡＴＡＡＡＡＡＣ−３’および５’−ＧＡＣＣＴＣＡＧＴＴＣＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣＧＡＣＧＧ−３’）。直線サイクルを決定するため、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ １ステップｑＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ＲＧ−３０００システム（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いたリアルタイムＰＣＲを用いた。テンプレートとして同量のＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ反応に用いた。各実験を独立して３回繰り返した。
【００９８】
プラスミドの構築およびトランスフェクション。Ｃ１９ｏｒｆ４８遺伝子のエクソン２〜３由来の配列をｐｃＤＮＡ３．１哺乳動物発現プラスミドのＣＭＶプロモーターの３’領域に挿入し、ＨＢＩＩ−１８０Ｃ発現ベクターを作製した。部位特異的変異誘発によって野生型構築物から変異構築物を樹立した（変異体１、図６Ｂ）。内因性ＨＢＩＩ−１８０Ｃの機能を抑制するためにＦＧＦＲ３イントロン１７発現ミニ遺伝子を樹立した。ＦＧＦＲ３配列のエクソン１７〜１８をｐｃＤＮＡ３．１哺乳動物発現プラスミドのＣＭＶプロモーターの３’領域に挿入した（図７Ａ）。部位特異的変異誘発によって野生型構築物から変異構築物を樹立した（Ｆｒｍ、図４Ａ）。部位特異的変異誘発によって野生型ＨＢＩＩ−１８０Ｃ発現構築物から抗ＧＦＰ／ＹＦＰ ＨＢＩＩ−１８０Ｃ構築物を樹立した（キメラ１および２、図８Ａ）。図８Ａに示すように、変異挿入物を哺乳動物発現プラスミドｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１のｍＣｈｅｒｒｙ ｃＤＮＡの３’領域にサブクローニングした。ＷＩ３８細胞に対してリン酸カルシウム法を用いて、また、ＨｅＬａ細胞および他のＨｅＬａ安定細胞株に対して「エフェクチン（ｅｆｆｅｃｔｉｎｅ）」トランスフェクション試薬（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、プラスミドをトランスフェクトした。リン酸カルシウム法は下述のように行った。
【００９９】
死滅細胞数。１０ｃｍの皿上にＷＩ３８細胞を散布した。細胞の付着と同時にプラスミドをトランスフェクトした。３日後に死滅細胞のパーセントを５回計算し、各回に計算のために１００個の細胞を無作為に選択した。次に、死滅細胞の平均パーセントを５回の別個の計数からの平均として計算した。各実験を独立して３回繰り返した（図８Ｄ）。
【０１００】
ＦＧＦＲ３スプライスｍＲＮＡバリアント（ｖａｌｉａｎｔ）の検出。遺伝子特異的プライマーセットを用いた１ステップＲＴ−ＰＣＲにより（ＦＧＦＲ３：５’−ＴＧＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＧＣＧＣＴＣＣＣＣＧＣ−３’および５’−ＣＣＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＣＧＧＧＣＣＣＧＡＧＡＣＡＧ−３’，ＧＡＰＤＨ：５’−ＣＧＣＡＴＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＣＣＡＧ−３’および５’−ＧＧＴＣＡＡＴＧＡＡＧＧＧＧＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＣ−３’）、ＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡのスプライシングバリアント（ｖａｌｉａｎｔ）を検出した（図７ＢおよびＣ）。ＦＧＦＲ３イントロン１７発現プラスミドをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。４８時間後、製造業者の指示に従って（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＤＮＡ分解酵素Ｉ処理によるＴＲＩｚｏｌ法により、ＨｅＬａ細胞、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞およびＷＩ３８細胞から全ＲＮＡを単離した。上述のように（ノーザンブロット分析およびＲＴ−ＰＣＲ）、各ＲＴ−ＰＣＲに対して同量のＲＮＡをテンプレートとして用いた。
【０１０１】
細胞の撮像。Ｄｅｌｔａｖｉｓｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｉｓ蛍光顕微鏡（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ社）を用いてすべての細胞画像を記録した。ＷＩ３８，ＨｅＬａ ＹＦＰ−ＦＩＢ細胞およびＨｅＬａ ＧＦＰ細胞の生細胞画像を過去に示されているように作成した（非特許文献７、非特許文献１０（１５）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌａｍｏｎｄｌａｂ．ｃｏｍ／ｆ７ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｈｔｍ）。６０倍（ＮＡ １．４）Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ対物レンズを用いて細胞を撮像した。各視野および各露出に対して０．５μｍ離れた１２の光学切片を記録した（ＳｏｆｔＷｏＲｘ画像処理ソフトウェア、Ａｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ社）（図４Ａ、図６Ｃ、図８ＣおよびＤ）。以下のように前述した手順を用いてＷＩ３８，ＨｅＬａ ＹＦＰ−ＦＩＢ細胞およびＨｅＬａ ＧＦＰ細胞の固定細胞画像を作成した。
【０１０２】
３．８％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定した。１％トリトンＸ−１００による透過処理後、ＤＡＰＩによって細胞を染色した。
【０１０３】
（結果セクション）
本発明者らは、哺乳動物細胞株から単離された核小体に関する大規模な精製およびプロテオミクス研究を行った（非特許文献６，７，８）。ヒト核小体プロテオームを詳細に特徴付けた（非特許文献４、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌａｍｏｎｄｌａｂ．ｃｏｍ／ＮＯＰｄｂ／も参照されたい）。ＨｅＬａ細胞から単離された核小体のＲＮＡ組成も分析した。ＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞から単離された、高度に濃縮された核小体調製物から精製され、短時間の増幅反応後にサイズ分画され、サブクローニングされ（図４における方法を参照されたい）、配列決定された。この分析により、５６２の既知のｓｎｏＲＮＡおよび７つの新規ｓｎｏＲＮＡを含む５８９のｓｎｏＲＮＡクローンが同定された。
【０１０４】
ＨＢＩＩ−１８０Ａ，ＨＢＩＩ−１８０ＢおよびＨＢＩＩ−１８０Ｃと称される、検出された３つの既知のボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡは各々、Ｃ１９ｏｒｆ４８と称される転写物の別個のイントロンにおいてコードされ（図５ＣおよびＤ）、Ｃ１９ｏｒｆ４８と称される転写物は多剤耐性癌細胞において増殖されることが過去に報告された（非特許文献９）。３つのＨＢＩＩ−１８０ ｓｎｏＲＮＡの各々は、２８Ｓ ｒＲＮＡ上のヌクレオチド位置３６８０における同じ２’−Ｏ−リボースメチル化部位を標的とする（図５ＡおよびＢ）。これらのｓｎｏＲＮＡをコードする遺伝子はｑ１３．３３位置にて第１９染色体上にある。Ｃ１９ｏｒｆ４８遺伝子配列の進化的比較は、主要な保存がそれぞれのエクソン配列ではなくイントロンにコードされたｓｎｏＲＮＡに対応することを示す。これは、Ｃ１９ｏｒｆ４８遺伝子の主な機能がタンパク質というよりもｓｎｏＲＮＡをコードすることである可能性があることを示す（図５）。
【０１０５】
予想外に、ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡの配列解析により、ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡが２８Ｓ ｒＲＮＡメチル化ガイド配列の３’側に位置する２１ヌクレオチド領域を有し、１９／２１ヌクレオチドがヒト線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）遺伝子から転写されるｍＲＮＡ前駆体のイントロン１７内の領域と相補的であることが明らかになった（図５ＡおよびＢ）。ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡの発現レベルの比較は、ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡがＨｅＬａ細胞において高度に発現されるが、一次線維芽細胞（ＷＩ３８細胞）においては低レベルでしか存在しないことを示した（図６Ａ）。
【０１０６】
本発明者らは、転写を促進するためにＣＭＶプロモーターを用いたＨＢＩＩ−１８０Ｃミニ遺伝子によるプラスミドベクターの一過性トランスフェクションにより、ＷＩ３８細胞においてＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡを外因的に過剰発現させた（図６Ｂ）。これはトランスフェクトされたＷＩ３８細胞のアポトーシスを生じさせた。しかし、本発明者らがＦＧＦＲ３のイントロン１７と相補的な領域内の３ヌクレオチドの配列変化によりＨＢＩＩ−１８０Ｃの変異体を一過性に発現させる（即ち、ＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡ前駆体との相補性を低下させる）と、これはもはやＷＩ３８細胞においてアポトーシスを生じさせなかった（図６Ｂ〜Ｄ）。ＨｅＬａ細胞では、内因性ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡと相補的な標的ＦＧＦＲ３イントロン１７配列のプラスミドベクターからの過剰発現は、発現されるＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡアイソフォームの比率の明瞭な変化を生じさせた（図７ＡおよびＢ）。これは、ＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡの短いアイソフォームのＨｅＬａ細胞の増加をもたらし、ＷＩ３８細胞において通常発現されるものと同様のＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡアイソフォームのパターンを生じさせた（図７Ｃ）。
【０１０７】
これらのデータは、ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡの発現レベルがＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡの発現レベルに影響を及ぼし得ることを示す。更に、データは、この作用がＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡ前駆体のイントロン１７における領域と相補的な配列のＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡにおける存在に依存することを示す。
【０１０８】
次に、本発明者らは、ｓｎｏＲＮＡ ＨＢＩＩ−１８０ＣのＦＧＦＲ３ ＲＮＡ発現の発現を調節する能力が、ＨＢＩＩ−１８０Ｃの構造を修飾し、ＦＧＦＲ３相補配列領域を１つ以上の標的ＲＮＡと相補的な配列に置換することにより、特定の標的ＲＮＡの発現を調節するように適合され得るかを試験した。従って、ＣＭＶプロモーターから発現され、ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡ骨格を含み、ＨＢＩＩ−１８０Ｃイントロンを含むミニ遺伝子を有する、キメラ１および２と称される、図５ＡおよびＢに示されるベクターが構築された。ベクターは、ベクターを含むトランスフェクトされた細胞の即座の検出を可能にするため、ＣＭＶプロモーターから発現されるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質もコードした。ＨＢＩＩ−１８０ＣにおけるＦＧＦＲ３相補領域はＧＦＰ ＲＮＡと相補的な配列に置換された（図８、ＡおよびＢ参照）。挿入配列は、５’−ＧＡＣＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣ−３’（キメラ１）および５’−ＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣ−３’（キメラ２）であり、ｗｔ ＨＢＩＩ−１８０Ｃにおける５’−ＣＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＴＧＣＡ−３’を置換した。
【０１０９】
キメラ発現ベクターおよびｍＣｈｅｒｒｙのみを発現する等価なベクター（ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１）は各々、非融合ＧＦＰのみを安定に発現するａ／ａ ＨｅＬａ細胞株またはフィブリラリンと融合したＹＦＰを安定に発現するｂ／ａ ＨｅＬａ細胞株に一過性にトランスフェクトされた（図８、ＣおよびＤ）。細胞はトランスフェクション後４８時間にて固定され、蛍光顕微鏡法によりＧＦＰ／ＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ発現レベルが分析された。これは、それぞれのＨｅＬａ安定細胞株におけるＧＦＰ蛍光レベルが、ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡ骨格内にＧＦＰと相補的な配列を含むように操作されたベクターをトランスフェクトされた細胞において特異的に低下することを示した。この低下はｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞においてのみ認められ、トランスフェクトされた細胞において特異的に生じたことを確認した。対照的に、ｓｎｏＲＮＡを欠くｍＣｈｅｒｒｙベクターをトランスフェクトされた細胞は、ｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞とｍＣｈｅｒｒｙを発現しない細胞との間に有意なＧＦＰ蛍光の減少またはＧＦＰレベルの変動を示さなかった（図８ＣおよびＤ）。データは、ＧＦＰ単独或いは密接に関連するＹＦＰによって形成される融合タンパク質および細胞タンパク質（フィブリラリン）の発現がともに、特異的に標的化・操作されたｓｎｏＲＮＡ発現ベクターの発現を通じて調節され得ることを示す。
【０１１０】
これらのデータは、本発明者らが作製したｓｎｏＲＮＡ発現ベクターの配列および構造が所望の特定のＲＮＡ標的を標的とするように操作され、これにより、その発現を調節することができることを示す。
【０１１１】
（更なる材料および方法）
ノーザンおよび高感度ＲＮＡブロット分析。前述のようにショ糖密度勾配法を用いてＨｅＬａ細胞抽出物を分画した。製造業者の指示に従って（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＤＮＡ分解酵素Ｉ処理によるＴＲＩｚｏｌ法を用いて全ＨｅＬａ細胞ＲＮＡ並びに別個の細胞質、核質および核小体画分由来のＲＮＡを単離した。１倍ＴＢＥ緩衝液中８Ｍ尿素ポリアクリルアミド変性ゲル電気泳動によって各試料由来の同量のＲＮＡを分離し、エレクトロブロット法によりＲＮＡをナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社）上に移した。ＵＶ架橋結合後、膜を、以下のＲＮＡ種；（ＨＢＩＩ−１８０Ａ，ＨＢＩＩ−１８０Ｂ，ＨＢＩＩ−１８０ＣおよびｔＲＮＡ）に特異的な３２Ｐ ５’末端標識オリゴリボヌクレオチドプローブとハイブリダイズした。前述のように（非特許文献１２）、高感度ＲＮＡブロットを作成した。
【０１１２】
（二次構造）
すべてのＲＮＡ二次構造をＲＮＡｓｔｒａｃｔｕｒｅ ４．５（非特許文献１３）によって予測し、ＲｎａＶｉｚ ２．０（非特許文献１４）を用いてこれに注釈を付けた。
【０１１３】
（プラスミドの構築およびトランスフェクション）
Ｃ１９ｏｒｆ４８遺伝子のエクソン２〜３由来の配列をｐｃＤＮＡ３．１哺乳動物発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）におけるＣＭＶプロモーターの３’側に挿入し、ＨＢＩＩ−１８０Ｃ発現ベクターを作製した。部位特異的変異誘発によって野生型ＨＢＩＩ−１８０Ｃ発現ミニ遺伝子構築物からＨＢＩＩ−１８０Ａ，ＢおよびＨＢＩＩ−１８０Ｃの変異構築物を樹立した。「エフェクチン（ｅｆｆｅｃｔｉｎｅ）」トランスフェクション試薬（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。
【０１１４】
（細胞の撮像）
Ｄｅｌｔａｖｉｓｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｉｓ蛍光顕微鏡（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ社）を用いてすべての細胞画像を記録した。ＨｅＬａＹＦＰ−Ｆｌｂｒｉｌｌａｒｉｎ細胞およびＨｅＬａＧＦＰ細胞の生細胞画像を過去に示されているように作成した（非特許文献１０（１５）および１１（１６）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌａｍｏｎｄｌａｂ．ｃｏｍ／ｆ７ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｈｔｍ）。６０倍（ＮＡ １．４）Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ対物レンズを用いて細胞を撮像した。各視野および各露出に対して０．５μｍ離れた１２の光学切片を記録した（ＳｏｆｔＷｏＲｘ画像処理ソフトウェア、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ社）。
【０１１５】
（結果セクション）
（標的タンパク質および／またはｍＲＮＡ発現レベルに対する修飾ｓｎｏＲＮＡの作用）
ノーザンブロット分析は、Ｇ／ＹＦＰ ｍＲＮＡ配列に標的化されたキメラｓｎｏＲＮＡの一過性トランスフェクションがＧ／ＹＦＰ ｍＲＮＡレベルを抑制することを示した（図９ＣおよびＤ）。この結果は、既述のようにキメラｓｎｏＲＮＡが標的ｍＲＮＡ発現レベルに影響を及ぼし得ることを示唆した（図１および２）。複数の修飾ｓｎｏＲＮＡが、来れらの効率を高めるために１つの転写物に発現され得る。
【０１１６】
図１１Ａのように三重キメラｓｎｏＲＮＡ構築物を樹立した。このプラスミド（三重キメラ）は、この場合にトランスフェクションマーカーとして用いられるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質ｃＤＮＡの３’側のＧ／ＹＦＰ ｍＲＮＡ配列の異なる位置を標的とする３つの修飾ｓｎｏＲＮＡをコードする（図１１Ａ）。この三重キメラプラスミドを用いた一過性トランスフェクション実験は、蛍光顕微鏡法によって判定されるように単一キメラプラスミドで見られるものと同様のＧ／ＹＦＰおよびＧ／ＹＦＰ融合タンパク質に対する抑制作用を示した（図１１Ｂ，Ｃ，Ｅ）。ウエスタンブロット分析は、三重キメラ構築物の抑制効率が単一キメラｓｎｏＲＮＡより強いことを示した（図１１Ｄ）。各キメラｓｎｏＲＮＡに特異的なプローブを用いたＦＩＳＨ分析および分画ノーザンブロット分析は、三重キメラプラスミドが野生型ＨＢＩＩ−１８０Ｃに関して見られるような各修飾キメラ１〜３ ｓｎｏＲＮＡを生成することを示した（図１２ＡおよびＢ）。これらの結果は、複数のｓｎｏＲＮＡを１つの転写物に発現することにより（マルチプレクシング）、修飾ｓｎｏＲＮＡが標的ノックダウンの効率を高めることができることを示唆した。更に、三重キメラプラスミドはＧ／ＹＦＰおよびＧ／ＹＦＰ融合タンパク質の代わりにｍＣｈｅｒｒｙ赤色蛍光タンパク質を発現した（図１１Ｂ，Ｃ，Ｅ）。これらの結果は、修飾ｓｎｏＲＮＡを用いることによってＧ／ＹＦＰおよびＧ／ＹＦＰ融合タンパク質をｍＣｈｅｒｒｙに置換し、従って、「タンパク質置換」または「タンパク質ノックイン」作用を実証し得ることも示唆した。
【０１１７】
修飾ｓｎｏＲＮＡの詳細な構造分析およびそれらのノックダウン能力。修飾ｓｎｏＲＮＡのノックダウン能力は、プロセシングされたｓｎｏＲＮＡから生じ得、或いはｓｎｏＲＮＡプロセシングとは独立してＣ１９ｏｒｆ４８ ｍＲＮＡ前駆体から直接形成され得る（図５Ｃ）。後者の可能性は、Ｄｒｏｓｈａとは独立してプロセシングされる、イントロンにコードされたマイクロＲＮＡの近年の報告によって示唆されている。これらの可能性を区別するため、ＨＢＩＩ−１８０Ｃミニ遺伝子の８つの別個の領域に一連の３つの塩基変異を導入し、ＷＴとＨＢＩＩ−１８０Ｃの変異形態との間で両方の完全長ｓｎｏＲＮＡの発現を比較した（図１３Ａ）。ＷＴ ＨＢＩＩ−１８０Ｃミニ遺伝子ベクターの発現は内因性レベルを超えて完全長ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡのレベルを上昇させるが、空ベクターはこれを上昇させない（図１３Ａ、レーン１をレーン２および３と比較されたい）。保存ＣまたはＤボックス内の配列変化を含む多重変異は、外因性完全長ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡの発現を低下させ、または排除し、ｓｎｏＲＮＡの内因性レベルのみを残す（図１３Ａ、レーン４〜１１）。ＨＢＩＩ−１８０Ｃ発現レベルが低下する各々の場合、修飾ｓｎｏＲＮＡキメラ２のノックダウン能力レベルの対応する低下がある（図１３Ａ、レーン３をレーン４および１０と比較されたい。また、図１３Ｂ ｍ１およびｍ７、図１３Ｆ）。これは、修飾ｓｎｏＲＮＡのノックダウン能力が先行するｓｎｏＲＮＡプロセシングに依存することを示し、Ｃ１９ｏｒｆ４８ ｍＲＮＡ前駆体転写物から直接のノックダウン能力のためのｓｎｏＲＮＡから独立した経路がない可能性があることを主張するものである。ｓｎｏＲＮＡガイド配列において２８Ｓ ｒＲＮＡとの相補性を破壊するＨＢＩＩ−１８０Ｃにおけるｍ２変異は、ｓｎｏＲＮＡ形成および修飾ｓｎｏＲＮＡのノックダウン効率を阻止しない（図１３Ａ、レーン５、図１３ＣおよびＦ ｍ２−１，ｍ２−２）。従って、修飾ｓｎｏＲＮＡの標的遺伝子の発現をノックダウンする能力は、ｓｎｏＲＮＡのｒＲＮＡに結合し、これをメチル化する能力に依存しない。ボックスＤ’を破壊するＨＢＩＩ−１８０Ｃにおけるｍ３変異は、ｓｎｏＲＮＡ形成およびノックダウン効率をわずかに低下させ、阻止する（図１３Ａ，Ｃ，Ｆ）。これは、Ｍボックスの外側領域を変異させることによって修飾ｓｎｏＲＮＡのノックダウン能力を修飾し得ることを示唆した。
【０１１８】
ノックダウン能力とＭボックス配列長との関連を試験するため、修飾ｓｎｏＲＮＡ キメラ２におけるＭボックス配列の挿入および欠失変異体を樹立した（図１３ＤおよびＦ）。Ｇ／ＹＦＰ ｍＲＮＡと相補的な配列を増加させた３つの挿入変異体はすべて、野生型キメラ２プラスミドと同様のノックダウン活性を示した（図１３ＤおよびＦ Ｉｎ１−３）。注目すべきことに、Ｇ／ＹＦＰ ｍＲＮＡに対する８塩基の付加相補配列を有する挿入変異体ＣＭ２Ｉｎ−３は向上したノックダウン効率を示した（図１３Ｆ）。Ｍボックスにおける２および３塩基欠失変異体（ＣＭ２Ｄｅｌ−１および２）は依然としてノックダウン能力を示したが、野生型キメラ２と比べて効率が低かった（図１３Ｆ）。７塩基欠失変異体（ＣＭ２Ｄｅｌ−３）は野生型キメラ２と比べて有意なノックダウン活性を示さなかった（図１３Ｆ）。ノックダウン能力とＭボックスにおける塩基対ミスマッチとの関連を試験するため、Ｍボックスにおける６つの点変異体も樹立した（図１３ＥおよびＦ）。Ｍボックスにおける１〜３塩基ミスマッチ変異体（ＣＭ２Ｘ−１〜−３）は依然としてノックダウン能力を示したが、野生型キメラ２と比べて効率が低かった（図１３Ｆ）。Ｍボックスにおける４〜６塩基ミスマッチ変異体（ＣＭ２Ｘ−４〜−６）は野生型キメラ２と比べて効率的なノックダウン活性を示さなかった（図１３Ｆ）。これらの結果は、修飾ｓｎｏＲＮＡの遺伝子ノックダウンを調節する能力がＭボックス相補配列と標的ｍＲＮＡ配列とのハイブリダイゼーション親和性と関連することを示した。
【０１１９】
修飾ｓｎｏＲＮＡのノックダウン能力に影響を及ぼすとは思われないｍ２（２８Ｓ ｒＲＮＡ相補領域）、ｍ４およびｍ５の変異体の各々を組み込んだ組合せｓｎｏＲＮＡ（図１３ＡおよびＣ、図１４Ａ）は、蛍光顕微鏡法により判定されるように野生型三重キメラプラスミドと同様のノックダウン活性を示した（図１４Ｂ）。キメラ１，２，３特異的プローブを用いたＦＩＳＨ分析は、この組合せ変異プラスミド（三重キメラｓｎｏＭＥＮｖ１）が野生型三重キメラプラスミドに関しても見られるように各コードされたキメラ修飾ｓｎｏＲＮＡを発現させることを示した（図１２Ａおよび１４Ａ）。これらの変異体分析は、修飾ｓｎｏＲＮＡのノックダウン能力が、標的ＲＮＡに結合するｓｎｏＲＮＡと関連する配列の外側にある変異により、且つｓｎｏＲＮＡと標的配列との結合に必要な相補配列（即ち、Ｍボックス）内にある変異によって、調節され得ることを示唆した。
【０１２０】
（修飾ｓｎｏＲＮＡベクターはタンパク質置換によって致死遺伝子発現ノックダウン作用をレスキューすることができる）
三重キメラｓｎｏＭＥＮｖ１から、内因性ＳＭＮ１（運動ニューロンの生存（Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎｓ））ｍＲＮＡ前駆体に標的化される２つの修飾ｓｎｏＲＮＡプラスミドを樹立した（図１５Ａ）。プラスミドＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１は、ＧＦＰ ｃＤＮＡおよび内因性ＳＭＮ１ ｍＲＮＡ前駆体内の異なる位置に標的化される３つの修飾ｓｎｏＲＮＡをそれぞれコードする（図１５Ａ）。他方のプラスミドＧＦＰ−ＳＭＮｌ ｓｎｏＭＥＮｖ１−ＰＲは、ＧＦＰ−ＳＭＮ１融合タンパク質ｃＤＮＡ、および内因性ＳＭＮ１ ｍＲＮＡ前駆体内の異なる位置に標的化されるＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１を有する３つの同じ修飾ｓｎｏＲＮＡをそれぞれコードする（図１５Ａ）。一過性トランスフェクション分析は、ＧＦＰ単独およびｍＣｈｅｒｒｙ三重キメラプラスミドがＨｅＬａ細胞に対する有害作用を有さないことを示した。しかし、ＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１プラスミドは細胞にトランスフェクトされると、細胞傷害作用を示した（図１５Ｂ矢頭）。ウエスタンブロット分析は、内因性ＳＭＮ１レベルがＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１をトランスフェクトすることによって抑制されることを示した（図１５Ｃ）。ＳＭＮ１ノックアウトマウスの表現型が胚致死性であることが公知であるため、この結果は予期された（Ｈｓｉｅｈら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０００）。他方、ＧＦＰ−ＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１−ＰＲプラスミドの一過性トランスフェクションは、ＨｅＬａＧＦＰ−ＳＭＮ１安定細胞株に見られるような正確な局在パターンを示し（図１０）、重要なことに、ＳＭＮ１ ｓｎｏＭＥＮｖ１に関して見られるような細胞傷害作用を示さなかった（図１５Ｂ）。これらの結果は、内因性ＳＭＮ１がＳＭＮ１ ｍＲＮＡ前駆体に標的化される修飾ｓｎｏＲＮＡによって抑制され、その細胞傷害作用がＧＦＰ−ＳＭＮ１融合タンパク質を発現させることによってレスキューされることを示した。
【０１２１】
（ウイルスベクター系から発現される場合の修飾ｓｎｏＲＮＡの機能）
三重キメラ修飾ｓｎｏＲＮＡ（レンチ三重キメラ）および野生型三重ＨＢＩＩ−１８０Ｃ ｓｎｏＲＮＡ（レンチ三重ＨＢＩＩ−１８０Ｃ）を各々レンチＸウイルスベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にサブクローニングした。レンチ三重キメラは対応するプラスミドベクター三重キメラを用いて見られたのと同じノックダウン作用を示した（図１１Ｂと図１６とを比較されたい）。この結果は、修飾ｓｎｏＲＮＡの標的遺伝子をノックダウンする能力が単一のトランスフェクション系に依存せず、プラスミドおよびウイルスベクター系を用いて供給され得ることを示した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の発現を調節する方法であって、前記核酸をｓｎｏＲＮＡまたは修飾ｓｎｏＲＮＡと、前記ｓｎｏＲＮＡ若しくは修飾ｓｎｏＲＮＡおよび／またはその断片が標的核酸の一部とハイブリダイズすることができる条件下で接触させるステップを含み、前記ｓｎｏＲＮＡまたはその断片の前記核酸の一部とのハイブリダイゼーションが前記標的核酸の発現および／または機能を調節する、方法。
【請求項２】
標的核酸の発現の調節に用いる修飾ｓｎｏＲＮＡ配列であって、前記標的核酸の一部とハイブリダイズし、且つ前記標的核酸の発現を調節するための、前記標的配列の一部と実質的に相補的な核酸配列を含む、修飾ｓｎｏＲＮＡ配列。
【請求項３】
前記標的核酸配列がＲＮＡ配列である、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ配列。
【請求項４】
前記ｓｎｏＲＮＡ分子が、いわゆるボックスＣ／Ｄ−ｓｎｏＲＮＡまたはボックスＨ／ＡＣＡ−ｓｎｏＲＮＡを含む細胞ｓｎｏＲＮＡに基づく、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ配列。
【請求項５】
前記ボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡが、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ ｂ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３１６５６）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ Ｂ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ０４６５９８）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ Ｂ４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ０４６５９８）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ Ｂ５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ０４６５９８）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ ＴＳ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３１６５６）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ ＴＳ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３１６５６）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ ｇ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３１６５６）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ ｓｎｏＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０５００９５）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ｓｎｏＲＮＡ ９２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ５０１７１、Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ ｓｎｏＲＮＡ ９２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１６３９９）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ＴＢＣ４ ｓｎｏＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ｓｎｏ ２７０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ５０１７１）およびヒトＵ１４ ｓｎｏＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿００００２２）を含む、請求項３に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ。
【請求項６】
ボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡに一般的に見出される１つ以上のＤ／Ｄ’ボックス核酸配列を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ。
【請求項７】
前記少なくとも１つ以上のＤおよび／またはＤ’ボックスが、例えば、５’−ＣＵＧＡ−３’，５’−ＡＵＧＡ−３’，５’−ＣＣＧＡ−３’，５’−ＣＡＧＡ−３’，５’−ＣＵＵＡ−３’，５’−ＵＵＧＧ−３’および５’−ＣＡＧＣ−３’から選択される配列を含む、請求項５に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ。
【請求項８】
前記修飾ｓｎｏＲＮＡ分子が、ボックスＣ配列および／または、任意に、２８Ｓ ｒＲＮＡ若しくはｓｎｏＲＮＡ修飾の他の生理学的標的と相補的な更なる領域を更に含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ。
【請求項９】
前記ｓｎｏＲＮＡをコードする配列が、確立されたｓｎｏＲＮＡプロセシング経路に従ってイントロンからのプロセシングを供与するために必要な構造要素を含む、請求項４に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ。
【請求項１０】
前記ボックスＣ配列が５〜９ヌクレオチド長である、請求項７に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ。
【請求項１１】
標的ＲＮＡ配列の一部と実質的に相補的な前記配列が、イントロン若しくはエクソン配列、またはイントロン−エクソン結合配列、または前記標的核酸の５’若しくは３’非翻訳領域内の領域若しくはその接合部における領域と実質的に相補的である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ。
【請求項１２】
前記標的ＲＮＡ配列の一部と実質的に相補的な前記核酸配列が、通常、１５〜４５ヌクレオチド長である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ。
【請求項１３】
前記標的ＲＮＡ配列が、ｍＲＮＡ，ｔＲＮＡ，ｍｉＲＮＡまたはｒＲＮＡ配列またはＲＮＡウイルスゲノム配列またはそれから生じる転写産物である、請求項３に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ。
【請求項１４】
前記修飾ｓｎｏＲＮＡ分子が、標的核酸分子とハイブリダイズするように設計された２つ以上の配列を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ。
【請求項１５】
前記標的核酸分子とハイブリダイズするように設計された２つ以上の配列が、同じ標的核酸分子の異なる部分または異なる標的核酸分子を標的とすることができる、請求項１３に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ。
【請求項１６】
請求項２〜１５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの修飾ｓｎｏＲＮＡ分子を発現することができる、プラスミドおよびウイルスベクターを含む核酸構築物。
【請求項１７】
修飾ｓｎｏＲＮＡをコードすることができるイントロンの核酸の領域に隣接するエクソンの核酸の少なくとも２つの領域を含む、請求項１６に記載の核酸構築物。
【請求項１８】
前記核酸構築物が、１つ以上のｓｎｏＲＮＡをコードすることができる配列を含む２つ以上のイントロン配列に隣接する多数のエクソン配列を含む、請求項１６または１７のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項１９】
前記構築物が、単一の構築物として形成され、標的細胞内における転写と同時に、エクソン配列に対応するｍＲＮＡの生成およびイントロン配列のスプライシングアウトおよびその後の修飾ｓｎｏＲＮＡの生成をもたらす、請求項１８に記載の核酸構築物。
【請求項２０】
２つ以上のｓｎｏＲＮＡ配列を生成するために２つ以上のイントロン配列が用いられ、各ｓｎｏＲＮＡが同じまたは異なる標的ＲＮＡ分子を標的とするように設計された、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項２１】
前記核酸構築物が形質転換され、またはトランスフェクトされた細胞の同定を容易にするための選択マーカー遺伝子を更に含む、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項２２】
少なくとも１つのプロモーター、例えば、構成的または制御可能なプロモーターを含む、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項２３】
宿主細胞のゲノムへの部位特異的組込みを容易にするように設計された部位特異的組換え部位を更に含む、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項２４】
請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の核酸構築物で形質転換され、またはトランスフェクトされる宿主細胞。
【請求項２５】
前記細胞が、真核細胞、特に哺乳動物細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、Ｃｏｓ細胞）、酵母細胞（例えば、ＡＨ１０９，ＨＨＹ１０，ＫＤＹ８０）昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、トリパノソーマ細胞（例えば、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ，Ｌ．ｍａｊｏｒ，Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ２９−１３）、細菌細胞（例えば、ＪＭ１０９，ＲＰ４３７，ＭＭ５０９，ＳＷ１０）または植物細胞から選択される、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
修飾ｓｎｏＲＮＡ分子を生成するのに用いる核酸ベクター構築物であって、５’から３’方向に、
ｉ）転写を制御するためのプロモーター配列と、
ｉｉ）第一のエクソン配列と、
ｉｉｉ）第一のイントロンスプライシング配列と、
ｉｖ）請求項２〜１５のいずれか１項に記載の修飾ｓｎｏＲＮＡをコードする核酸配列のクローニングを促進するためのクローニング部位または配列と、
ｖ）第二のイントロンスプライシング配列と、
ｖｉ）第二のエクソン配列と
を含む、核酸ベクター構築物。
【請求項２７】
５’から３’方向に、
ｖｉｉ）第三の、または更なるイントロンスプライシング配列と、
ｖｉｉ）請求項２〜１５のいずれか１項に記載の修飾ｓｎｏＲＮＡをコードする核酸配列のクローニングを促進するための第二の、または更なるクローニング部位または配列と、
ｖｉｉｉ）第四の、または更なるイントロンスプライシング配列と、
ｉｘ）第三の、または更なるエクソン配列と
を更に含む、請求項２６に記載の核酸ベクター構築物。
【請求項２８】
標的ＲＮＡまたは前記１つ以上のｓｎｏＲＮＡによって調節されるタンパク質を機能的に置換するためにタンパク質、ＲＮＡ、標識タンパク質、変異タンパク質などをコードする発現可能なコード配列を更に含む、請求項２６または２７のいずれか１項に記載の核酸ベクター構築物。
【請求項２９】
前記ｓｎｏＲＮＡ核酸および、標的ＲＮＡ若しくは前記１つ以上のｓｎｏＲＮＡによって調節されるタンパク質を機能的に置換するためにタンパク質、ＲＮＡ、標識タンパク質、変異タンパク質などをコードする発現可能なコード配列が、同じプロモーターの制御下にあり、単一の転写物として発現される、請求項２８に記載の核酸ベクター構築物。
【請求項３０】
標的核酸の発現を調節し、特に下方制御することが望ましい患者における疾患または病状を処置するのに用いる、ｓｎｏＲＮＡ、修飾ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ若しくは修飾ｓｎｏＲＮＡをコードする核酸構築物、またはｓｎｏＲＮＡ若しくは修飾ｓｎｏＲＮＡを発現することができる細胞。
【請求項３１】
ｓｎｏＲＮＡ、修飾ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ若しくは修飾ｓｎｏＲＮＡをコードする核酸構築物、またはｓｎｏＲＮＡ若しくは修飾ｓｎｏＲＮＡを発現することができる細胞、および医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項３２】
請求項２〜２９のいずれか１項に記載の修飾ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ若しくは修飾ｓｎｏＲＮＡをコードする核酸構築物、またはｓｎｏＲＮＡ若しくは修飾ｓｎｏＲＮＡを発現することができる細胞を含む、請求項３０または３１のいずれか１項に記載の生成物または組成物。
【請求項３３】
変異表現型を評価し、または薬物スクリーニング戦略を支援し、または標的を検証し、既存の未標識細胞型からの競合なしに標識形態のタンパク質を分析するための、または他の適用若しくは研究用途のための、請求項２８または２９のいずれか１項に記載のベクターの使用。
【請求項１】
標的核酸の発現を調節する方法であって、前記核酸をｓｎｏＲＮＡまたは修飾ｓｎｏＲＮＡと、前記ｓｎｏＲＮＡ若しくは修飾ｓｎｏＲＮＡおよび／またはその断片が標的核酸の一部とハイブリダイズすることができる条件下で接触させるステップを含み、前記ｓｎｏＲＮＡまたはその断片の前記核酸の一部とのハイブリダイゼーションが前記標的核酸の発現および／または機能を調節する、方法。
【請求項２】
標的核酸の発現の調節に用いる修飾ｓｎｏＲＮＡ配列であって、前記標的核酸の一部とハイブリダイズし、且つ前記標的核酸の発現を調節するための、前記標的配列の一部と実質的に相補的な核酸配列を含む、修飾ｓｎｏＲＮＡ配列。
【請求項３】
前記標的核酸配列がＲＮＡ配列である、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ配列。
【請求項４】
前記ｓｎｏＲＮＡ分子が、いわゆるボックスＣ／Ｄ−ｓｎｏＲＮＡまたはボックスＨ／ＡＣＡ−ｓｎｏＲＮＡを含む細胞ｓｎｏＲＮＡに基づく、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ配列。
【請求項５】
前記ボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡが、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ ｂ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３１６５６）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ Ｂ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ０４６５９８）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ Ｂ４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ０４６５９８）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ Ｂ５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ０４６５９８）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ ＴＳ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３１６５６）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ ＴＳ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３１６５６）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ ｇ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３１６５６）、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ ｓｎｏＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０５００９５）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ｓｎｏＲＮＡ ９２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ５０１７１、Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ ｓｎｏＲＮＡ ９２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１６３９９）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ＴＢＣ４ ｓｎｏＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ｓｎｏ ２７０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ５０１７１）およびヒトＵ１４ ｓｎｏＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿００００２２）を含む、請求項３に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ。
【請求項６】
ボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡに一般的に見出される１つ以上のＤ／Ｄ’ボックス核酸配列を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ。
【請求項７】
前記少なくとも１つ以上のＤおよび／またはＤ’ボックスが、例えば、５’−ＣＵＧＡ−３’，５’−ＡＵＧＡ−３’，５’−ＣＣＧＡ−３’，５’−ＣＡＧＡ−３’，５’−ＣＵＵＡ−３’，５’−ＵＵＧＧ−３’および５’−ＣＡＧＣ−３’から選択される配列を含む、請求項５に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ。
【請求項８】
前記修飾ｓｎｏＲＮＡ分子が、ボックスＣ配列および／または、任意に、２８Ｓ ｒＲＮＡ若しくはｓｎｏＲＮＡ修飾の他の生理学的標的と相補的な更なる領域を更に含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ。
【請求項９】
前記ｓｎｏＲＮＡをコードする配列が、確立されたｓｎｏＲＮＡプロセシング経路に従ってイントロンからのプロセシングを供与するために必要な構造要素を含む、請求項４に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ。
【請求項１０】
前記ボックスＣ配列が５〜９ヌクレオチド長である、請求項７に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ。
【請求項１１】
標的ＲＮＡ配列の一部と実質的に相補的な前記配列が、イントロン若しくはエクソン配列、またはイントロン−エクソン結合配列、または前記標的核酸の５’若しくは３’非翻訳領域内の領域若しくはその接合部における領域と実質的に相補的である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ。
【請求項１２】
前記標的ＲＮＡ配列の一部と実質的に相補的な前記核酸配列が、通常、１５〜４５ヌクレオチド長である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ。
【請求項１３】
前記標的ＲＮＡ配列が、ｍＲＮＡ，ｔＲＮＡ，ｍｉＲＮＡまたはｒＲＮＡ配列またはＲＮＡウイルスゲノム配列またはそれから生じる転写産物である、請求項３に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ。
【請求項１４】
前記修飾ｓｎｏＲＮＡ分子が、標的核酸分子とハイブリダイズするように設計された２つ以上の配列を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ。
【請求項１５】
前記標的核酸分子とハイブリダイズするように設計された２つ以上の配列が、同じ標的核酸分子の異なる部分または異なる標的核酸分子を標的とすることができる、請求項１３に記載の方法または修飾ｓｎｏＲＮＡ。
【請求項１６】
請求項２〜１５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの修飾ｓｎｏＲＮＡ分子を発現することができる、プラスミドおよびウイルスベクターを含む核酸構築物。
【請求項１７】
修飾ｓｎｏＲＮＡをコードすることができるイントロンの核酸の領域に隣接するエクソンの核酸の少なくとも２つの領域を含む、請求項１６に記載の核酸構築物。
【請求項１８】
前記核酸構築物が、１つ以上のｓｎｏＲＮＡをコードすることができる配列を含む２つ以上のイントロン配列に隣接する多数のエクソン配列を含む、請求項１６または１７のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項１９】
前記構築物が、単一の構築物として形成され、標的細胞内における転写と同時に、エクソン配列に対応するｍＲＮＡの生成およびイントロン配列のスプライシングアウトおよびその後の修飾ｓｎｏＲＮＡの生成をもたらす、請求項１８に記載の核酸構築物。
【請求項２０】
２つ以上のｓｎｏＲＮＡ配列を生成するために２つ以上のイントロン配列が用いられ、各ｓｎｏＲＮＡが同じまたは異なる標的ＲＮＡ分子を標的とするように設計された、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項２１】
前記核酸構築物が形質転換され、またはトランスフェクトされた細胞の同定を容易にするための選択マーカー遺伝子を更に含む、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項２２】
少なくとも１つのプロモーター、例えば、構成的または制御可能なプロモーターを含む、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項２３】
宿主細胞のゲノムへの部位特異的組込みを容易にするように設計された部位特異的組換え部位を更に含む、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項２４】
請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の核酸構築物で形質転換され、またはトランスフェクトされる宿主細胞。
【請求項２５】
前記細胞が、真核細胞、特に哺乳動物細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、Ｃｏｓ細胞）、酵母細胞（例えば、ＡＨ１０９，ＨＨＹ１０，ＫＤＹ８０）昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、トリパノソーマ細胞（例えば、Ｌ．ｃｏｌｌｏｓｏｍａ，Ｌ．ｍａｊｏｒ，Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ２９−１３）、細菌細胞（例えば、ＪＭ１０９，ＲＰ４３７，ＭＭ５０９，ＳＷ１０）または植物細胞から選択される、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
修飾ｓｎｏＲＮＡ分子を生成するのに用いる核酸ベクター構築物であって、５’から３’方向に、
ｉ）転写を制御するためのプロモーター配列と、
ｉｉ）第一のエクソン配列と、
ｉｉｉ）第一のイントロンスプライシング配列と、
ｉｖ）請求項２〜１５のいずれか１項に記載の修飾ｓｎｏＲＮＡをコードする核酸配列のクローニングを促進するためのクローニング部位または配列と、
ｖ）第二のイントロンスプライシング配列と、
ｖｉ）第二のエクソン配列と
を含む、核酸ベクター構築物。
【請求項２７】
５’から３’方向に、
ｖｉｉ）第三の、または更なるイントロンスプライシング配列と、
ｖｉｉ）請求項２〜１５のいずれか１項に記載の修飾ｓｎｏＲＮＡをコードする核酸配列のクローニングを促進するための第二の、または更なるクローニング部位または配列と、
ｖｉｉｉ）第四の、または更なるイントロンスプライシング配列と、
ｉｘ）第三の、または更なるエクソン配列と
を更に含む、請求項２６に記載の核酸ベクター構築物。
【請求項２８】
標的ＲＮＡまたは前記１つ以上のｓｎｏＲＮＡによって調節されるタンパク質を機能的に置換するためにタンパク質、ＲＮＡ、標識タンパク質、変異タンパク質などをコードする発現可能なコード配列を更に含む、請求項２６または２７のいずれか１項に記載の核酸ベクター構築物。
【請求項２９】
前記ｓｎｏＲＮＡ核酸および、標的ＲＮＡ若しくは前記１つ以上のｓｎｏＲＮＡによって調節されるタンパク質を機能的に置換するためにタンパク質、ＲＮＡ、標識タンパク質、変異タンパク質などをコードする発現可能なコード配列が、同じプロモーターの制御下にあり、単一の転写物として発現される、請求項２８に記載の核酸ベクター構築物。
【請求項３０】
標的核酸の発現を調節し、特に下方制御することが望ましい患者における疾患または病状を処置するのに用いる、ｓｎｏＲＮＡ、修飾ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ若しくは修飾ｓｎｏＲＮＡをコードする核酸構築物、またはｓｎｏＲＮＡ若しくは修飾ｓｎｏＲＮＡを発現することができる細胞。
【請求項３１】
ｓｎｏＲＮＡ、修飾ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ若しくは修飾ｓｎｏＲＮＡをコードする核酸構築物、またはｓｎｏＲＮＡ若しくは修飾ｓｎｏＲＮＡを発現することができる細胞、および医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項３２】
請求項２〜２９のいずれか１項に記載の修飾ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ若しくは修飾ｓｎｏＲＮＡをコードする核酸構築物、またはｓｎｏＲＮＡ若しくは修飾ｓｎｏＲＮＡを発現することができる細胞を含む、請求項３０または３１のいずれか１項に記載の生成物または組成物。
【請求項３３】
変異表現型を評価し、または薬物スクリーニング戦略を支援し、または標的を検証し、既存の未標識細胞型からの競合なしに標識形態のタンパク質を分析するための、または他の適用若しくは研究用途のための、請求項２８または２９のいずれか１項に記載のベクターの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ−Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ−Ｂ】
【図５Ｃ−Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ−Ｄ】
【図７】
【図８Ａ−Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ−Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ−１】
【図１３Ｂ−２】
【図１３Ｂ−３】
【図１３Ｃ−１】
【図１３Ｃ−２】
【図１３Ｄ−１】
【図１３Ｄ−２】
【図１３Ｄ−３】
【図１３Ｅ−１】
【図１３Ｅ−２】
【図１３Ｆ】
【図１４Ａ−１】
【図１４Ａ−２】
【図１４Ｂ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４Ａ−Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ−Ｂ】
【図５Ｃ−Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ−Ｄ】
【図７】
【図８Ａ−Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ−Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ−１】
【図１３Ｂ−２】
【図１３Ｂ−３】
【図１３Ｃ−１】
【図１３Ｃ−２】
【図１３Ｄ−１】
【図１３Ｄ−２】
【図１３Ｄ−３】
【図１３Ｅ−１】
【図１３Ｅ−２】
【図１３Ｆ】
【図１４Ａ−１】
【図１４Ａ−２】
【図１４Ｂ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【公表番号】特表２０１０−５３９８９５（Ｐ２０１０−５３９８９５Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２５４３９（Ｐ２０１０−５２５４３９）
【出願日】平成２０年９月２２日（２００８．９．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３２１１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３７４９０
【国際公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【出願人】（５０７４１９８３９）ザ ユニヴァーシティー コート オブ ザ ユニヴァーシティー オブ ダンディー (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月２２日（２００８．９．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３２１１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３７４９０
【国際公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【出願人】（５０７４１９８３９）ザ ユニヴァーシティー コート オブ ザ ユニヴァーシティー オブ ダンディー (8)
【Ｆターム（参考）】
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