還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの製造方法および光反応性溶液
【課題】生体系と同様にＰＳIIとＰＳＩとを併用して高効率で安全にＮＡＤＨを得ることが可能である還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの製造方法およびそれに適した反応性溶液を提供する。
【解決手段】光合成タンパク質複合体ＰＳIIおよび光合成タンパク質複合体ＰＳＩと、フェニル−ｐ−ベンゾキノンおよび水を含む光反応性溶液に光エネルギーを与えて酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元する、あるいは光合成タンパク質複合体ＰＳIIおよび光合成タンパク質複合体ＰＳＩと、２，６−ジクロロインドフェノールおよび水を含む光反応性溶液に光エネルギーを与えて酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの製造方法、及び前記の光反応性溶液。
【解決手段】光合成タンパク質複合体ＰＳIIおよび光合成タンパク質複合体ＰＳＩと、フェニル−ｐ−ベンゾキノンおよび水を含む光反応性溶液に光エネルギーを与えて酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元する、あるいは光合成タンパク質複合体ＰＳIIおよび光合成タンパク質複合体ＰＳＩと、２，６−ジクロロインドフェノールおよび水を含む光反応性溶液に光エネルギーを与えて酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの製造方法、及び前記の光反応性溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、光エネルギーおよび水を原料とする酵素の駆動源となる還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの製造方法およびそれに適した光反応性溶液に係り、さらに詳しくは光合成タンパク質複合体の１種であるＰＳII（光化学系IIともいう。以下、単にＰＳIIと略記することもある。）および光合成タンパク質複合体の他の１種であるＰＳＩ（光化学系Ｉともいう。以下、単にＰＳＩと略記することもある。）、特定の電子伝達メディエーター、水および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と略記することもある。）を含む光反応性溶液に光エネルギーを与えて酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと略記することもある。）の製造方法及びそれに適した光反応性溶液に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体系においては、ＮＡＤＨはＮＡＤ＋からＰＳIIおよびＰＳＩの協働（又は連結）によって還元されて生成されることが知られている。
これに対して、非生体系では、ＰＳIIおよびＰＳＩは生体外に分離・精製して別々に取り出され、個々の機能について研究されており、分離・精製して取り出された２種類の光合成タンパク質複合体を併用して使用する試みは今までなされていない。
【０００３】
一方、ＮＡＤＨは種々の酸化還元酵素を用いる酵素分析による医学的診断の用途や栄養補給剤用などに用いられる。さらに、ＮＡＤＨはギ酸脱水素酵素、ホルムアルデヒド脱水素酵素やアルコール脱水素酵素などの脱水素酵素を用いた酵素反応において電子供与体として働くことが知られている（特許文献１）。この酵素反応の具体例として、二酸化炭素からギ酸およびホルムアルデヒドを経由するメタノール合成を挙げることができる。
【０００４】
このような種々の用途を有するＮＡＤＨの製造法としては、例えばＮＡＤをＮＡＤＨに還元する酵素法が知られている（非特許文献１）。この場合、エタノールを出発原料として大過剰に使用し、生じる揮発性アセトアルデヒドを反応系から連続的に排除する必要がある。また、前記のＮＡＤＨを電子供与体として用いる酵素反応において、ＮＡＤＨが酸化されて生成したＮＡＤ＋を含む反応系内にほうれん草などの緑色植物から抽出したＰＳIIを加え、光照射することにより自動的にＮＡＤＨが生成することが知られている（特許文献１）。
また、ＮＡＤＨに類似した還元型ＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）の製造法として、ラン藻細胞の存在下、酸化型ＮＡＤＰを光化学的に還元する方法が知られている（特許文献２）。
【０００５】
【非特許文献１】アプライド・バイオケミストリー・アンド・バイオテクノロジー（Applied Biochemistry and Biotechnology）、第１４巻、１９８７、第１４７〜１９７頁
【特許文献１】米国特許第６４４０７１１号明細書
【特許文献２】特公昭６３−３２４３９号公報
【０００６】
しかし、前記非特許文献１においては合成のさいに毒性のあるアセトアルデヒドが生じ、前記特許文献１においてはＰＳIIを用いてＮＡＤ＋を直接還元してＮＡＤＨを生成させておりＰＳIIとＰＳＩとの併用については記載されてなく、前記特許文献２においてはＮＡＤＰＨの生産量が実施例によれば５μｍｏｌ／ｍｇＣｈｌ．ｈ．未満である。
このように、公知のＮＡＤＨの製造法では、生体系と同様にＰＳIIとＰＳＩとを併用することによって高効率で安全にＮＡＤＨを得ることはできなかったのである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、この発明の目的は、生体系と同様にＰＳIIとＰＳＩとを併用して高効率で安全にＮＡＤＨを得ることが可能である還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの製造方法及びそれに適した光反応性溶液を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この発明者らは、前記の目的を達成することを目的として鋭意検討した結果、非生体系ではＰＳIIとＰＳＩとを併用しても通常の条件ではこれらの協働は達成されないことを見出し、さらに検討を行った結果、この発明を完成した。
この発明は、光合成タンパク質複合体であるＰＳIIおよびＰＳＩ、フェニル−ｐ−ベンゾキノン、水および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と略記することもある。）を含む光反応性溶液に光エネルギーを与えて酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの製造方法に関する。
【０００９】
また、この発明は、光合成タンパク質複合体であるＰＳIIおよびＰＳＩ、２，６−ジクロロインドフェノール、水および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む光反応性溶液に光エネルギーを与えて酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの製造方法に関する。
【００１０】
さらに、この発明は、光合成タンパク質複合体であるＰＳIIおよびＰＳＩ、フェニル−ｐ−ベンゾキノン、水および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む光反応性溶液に関する。
さらに、この発明は、光合成タンパク質複合体であるＰＳIIおよびＰＳＩ、２，６−ジクロロインドフェノール、水および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む光反応性溶液に関する。
【発明の効果】
【００１１】
この発明によれば、生体系と同様に光合成タンパク質複合体であるＰＳIIとＰＳＩとを併用して高効率で安全に還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを得ることが可能である。
また、この発明によれば、光を照射して高効率で安全に還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを製造することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
この発明における好適な態様を次に示す。
１）ＰＳIIおよびＰＳＩおよびフェニル−ｐ−ベンゾキノン又は２，６−ジクロロインドフェノール（以下、Ｍｅｄと略記することもある。）の割合が、１００ｍＭ（モル）のＮＡＤ＋に対して、１００〜１００００μｇＣｈｌ（クロロフィル ）のＰＳIIおよび１００〜２００００μｇＣｈｌのＰＳIおよび２００〜１０００００μＭのＭｅｄである前記の製造方法。
２）ＰＳIIに対するＰＳIとの割合［ＰＳI／ＰＳII（μｇＣｈｌ比）］が１：１０〜１０：１である前記の製造方法。
３）光反応性溶液が、水溶液である前記の製造方法。
４）光反応性溶液の温度が、０℃〜３５℃である前記の製造方法。
５）ＰＳIIおよびＰＳＩおよびＭｅｄの割合が、１００ｍＭ（モル）のＮＡＤ＋に対して、１００〜１００００μｇＣｈｌ（クロロフィル ）のＰＳIIおよび１００〜２００００μｇＣｈｌのＰＳIおよび２００〜１０００００μＭのＭｅｄである前記の光反応性溶液。
【００１３】
この発明においては、ＰＳIIおよびＰＳＩと水とＮＡＤ＋と親油性電子伝達メディエーターであるフェニル−ｐ−ベンゾキノンとを含む反応系又はＰＳIIおよびＰＳＩと水とＮＡＤ＋と親水性電子伝達メディエーターである２，６−ジクロロインドフェノールとを含む光反応性溶液であることが必要である。
【００１４】
光反応性溶液として、水およびＮＡＤ＋に加えて、１）フェニル−ｐ−ベンゾキノンおよび２，６−ジクロロインドフェノールのいずれかを含むが光合成タンパク質複合体として特許文献１のようにＰＳIIのみを含む場合、２）光合成タンパク質複合体としてＰＳIIおよびＰＳＩを併用するが電子伝達メディエーターを含まない場合、あるいは３）光合成タンパク質複合体としてＰＳIIおよびＰＳＩを併用するが前記特定の電子伝達メディエーター以外の他の電子伝達メディエーターを含む場合のいずれであっても、光照射によってＮＡＤ＋を還元して高効率でＮＡＤＨを得ることは困難である。
【００１５】
この発明における光合成タンパク質複合体であるＰＳIIおよびＰＳＩは、緑色植物の葉の中に存在し、例えばほうれん草などの緑色植物から抽出法によって各々単離取得することができる。前記の抽出法として、例えばＢＢＹ法が挙げられる。このＰＳIIおよびＰＳＩは生体系、例えば緑色植物の葉の中ではＰＳIIからＰＳＩへの電子伝達が可能でありＰＳIIとＰＳＩとが協働して酸化還元反応に関与し得る。しかし、緑色植物の葉から単離して非生体系で人工的に使用する場合には、ＰＳＩは電子の伝達に基づく反応に関与しないかほとんど関与しないことが知られている。このため、光合成タンパク質複合体を、緑色植物の葉から単離して人工的に使用する場合には、通常は前記特許文献１に記載されているようにＰＳIIが単独で使用される。
【００１６】
この発明における親油性電子伝達メディエーターであるフェニル−ｐ−ベンゾキノンあるいは親水性電子伝達メディエーターである２，６−ジクロロインドフェノール（これら２種の電子伝達メディエーターを総称してＭｅｄと略記することもある。）は、葉緑素中での存在は確認されていないが公知の化合物であり、各々以下の化学式で示される。なお、フェニル−ｐ−ベンゾキノンと２，６−ジクロロインドフェノールとは併用してもよく、フェニル−ｐ−ベンゾキノン又は２，６−ジクロロインドフェノールは他の電子伝達メディエーターと組み合わせてもよい。
【００１７】
【化１】
【００１８】
【化２】
【００１９】
以下、この発明の光反応性溶液によって水を原料として光エネルギーによってＮＡＤ＋からＮＡＤＨを製造する反応について、この発明の１実施態様の反応式の概念図である図１を用いて説明する。
図１に示すように、前記の反応は逐次的に行われる。
図１に示す反応において、光エネルギーを与えられた水がＰＳIIの関与によって酸素とプロトン（Ｈ＋）と電子（ｅ−）を放出し、放出された電子はＭｅｄに、さらにＰＳＩに伝達され、それを光エネルギーによってＦｄ（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ）が受け取り、さらにＦＮＲを介してＮＡＤ＋に電子が伝達され、ＮＡＤ＋の還元反応によってＮＡＤＨを生成すると考えられる。
【００２０】
図１に示す反応における前記のＦｄは、電子伝達体として機能し光合成を含む主要な代謝系に用いられるタンパク質であり、ＦＮＲはフェレドキシン酸化還元酵素である。ＦｄおよびＦＮＲは生体内の電子伝達反応に関与していることが知られている。
前記のＦｄおよびＦＮＲは、例えば、緑色植物の葉の中に存在し、ほうれん草などから周知の抽出方法によって取得することが可能であり、また市販品（例えば、シグマアルドリッチ社）を使用することも可能である。
【００２１】
この発明の製造方法について、この発明による一連の反応における酸化還元電位の変化を示す概念図である図２を用いて説明する。
図２において縦軸は酸化還元電位を、横軸は電子伝達の工程を示す。
図２に示すように、水からＰＳIIによって放出された電子の酸化還元電位が光エネルギーによって大幅に増大し、この電子はＭｅｄを介してＰＳＩに伝達され、その際減少した電子の酸化還元電位が光エネルギーによって大幅に増大し、この電子がＰＳＩからＦｄに伝達され、さらにＦＮＲを介してＮＡＤ＋に伝達され、ＮＡＤ＋と電子とが反応してＮＡＤＨを生成すると考えられる。
図２から明らかなように、前記の各成分のうちＭｅｄおよびＰＳＩを含まない反応系では、水からＰＳIIを経由してＮＡＤ＋への電子の受容−供与の一連の伝達がなされず、高効率でＮＡＤＨを得ることができないと考えられる。
従って、この発明の光反応性溶液においては水、ＰＳIIとともにＰＳＩおよび前記特定のＭｅｄが必須成分であることが理解される。
【００２２】
次に、この発明について、種々の電子伝達メディエーターの存在下又は不存在下でのＰＳIIからの電子受容性を最大酸素発生速度によって示すグラフである図３、およびこの発明における特定の電子伝達メディエーターの存在下でのＰＳIIからＰＳＩへの電子供与性を酸素濃度の経時変化によって示すグラフである図４を用いて説明する。
これら図３および図４は、後述の実施例の欄に詳細に説明される酸素電極を用いた酸素発生量、酸素吸収量を測定することによってＰＳIIからの電子受容性、ＰＳIIからＰＳＩへの電子供与性を評価した結果を示すグラフである。図３において、横軸は電子伝達メディエーターの種類（略号で表示）を示し、ｎは実験回数を示す。
【００２３】
前記の酸素電極を用いた酸素発生量、酸素吸収量測定の原理は、酸素電極の陰極側ではＯ２が白金表面で受け取った４ｅ−および４Ｈ＋と反応して水を生成し、陽極側では４Ａｇと４Ｃｌ−とから４ＡｇＣｌを生じ、さらに４ｅ−を電極に受け渡す。この４ｅ−の電極での授受を電流として測定し、測定された電流は陰極で消費される量と化学両論的に相関があることに基づいている。
前記の白金（Ｐｔ）陰極、銀（Ａｇ）陽極での反応を以下に示す。
Ｐｔ電極：Ｏ２＋４Ｈ＋＋４ｅ−→２Ｈ２Ｏ
Ａｇ電極：４Ａｇ＋４Ｃｌ−→４ＡｇＣｌ＋４ｅ−
【００２４】
図３から、この発明における前記の親油性電子伝達メディエーターであるフェニル−ｐ−ベンゾキノン又は親水性電子伝達メディエーターである２，６−ジクロロインドフェノールは、他の公知の電子伝達メディエーターあるいは電子伝達メディエーターがない場合と比べて最大酸素発生速度が約２倍以上であり、従ってＰＳIIからの電子受容性が高いことを示す。
また、図４から、ＰＳIIのみあるいはＰＳIIとＭｅｄとの組合せでは酸素濃度が時間の経過によっても平衡酸素濃度を下回ることがなくＰＳＩへの電子供与性が低いのに比べて、この発明におけるＰＳIIおよびＰＳＩとＭｅｄとの組合せでは酸素濃度が最大酸素発生後に時間の経過に伴い平衡酸素濃度を大幅に下回りＰＳＩへの電子供与性が高いことが理解される。
【００２５】
この発明における水とＰＳIIおよびＰＳＩとＭｅｄとを含む光反応性溶液において、水は原料であり水溶液として用いることが好ましい。
また、前記の反応性溶液において、ＰＳIIおよびＰＳＩおよびＭｅｄの各成分の割合は、１００ｍＭ（モル）のＮＡＤ＋に対して、１００〜１００００μｇＣｈｌ（Ｃｈｌ：クロロフィル ）、特に２００〜５０００μｇＣｈｌのＰＳIIおよび１００〜２００００μｇＣｈｌ、特に２００〜１００００μｇＣｈｌのＰＳIおよび２００〜１０００００μＭ、特に１０００〜５００００μＭのＭｅｄであることが好ましい。各成分の割合が過度に少ないと反応が遅く、各成分の割合が過度に多くても効果は増大しないので好ましくない。また、ＰＳIIに対するＰＳIとの割合［ＰＳI／ＰＳII（μｇＣｈｌ比）］は１：１０〜１０：１、特に１：１〜５：１であることが好ましい。さらに、水の量は、１００ｍＭ（モル）のＮＡＤ＋に対して、５００ｍＭ以上、特に１０００〜５００００ｍＭであることが好ましい。
また、前記以外の他の成分については、１００ｍＭのＮＡＤ＋に対して、１〜１００ｍｇ、特に５〜５０ｍｇのＦｄであることが好ましく、１〜５００単位、特に５〜１００単位のＦＮＲであることが好ましい。
【００２６】
また、前記の反応系として水溶液を用いる場合、前記の各成分に加えて、任意の緩衝剤、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンスルホン酸、ビシン、ヒスチジン、ビス−トリス、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）、イミダゾール、又はＭＥＳなどの緩衝剤を加えてもよく、あるいは前記の緩衝剤を含む緩衝液を加えてもよい。緩衝液としては、前記の緩衝剤の他に、通常はショ糖、塩化ナトリウムおよび／又は塩化マグネシウムが含まれる。
前記の各成分は、全成分を最初から同時に添加して反応性溶液に含有させておいてもよく又は各成分を逐次的に含有させてもよいが、通常は全成分を最初から同時に添加して反応性溶液に含有させることが好ましい。
【００２７】
反応の間に反応性溶液を、ｐＨの値が６〜９の範囲内、特に６．５〜８．５の範囲内の緩衝液によってｐＨを一定に維持することが好ましい。
前記の反応は、５０℃未満、好適には０℃〜３５℃、特に２５℃〜３５℃の温度で行うことが好ましい。
また、この発明における光は、太陽光、キセノンランプ、ハロゲンランプなど任意の光であってよい。
前記の光の反応性溶液への照射は、光照射によって反応性溶液の温度が過度に上昇しないように光透過性熱吸収装置、例えば水槽を通過した光を照射してもよい。この場合、必要であれば、水槽通過後の光線から特定範囲の波長域以外の光線をフィルターを通して除去し、集光して反応性溶液に照射することが好ましい。
【００２８】
この発明において、前記の各成分を含む反応性溶液、好適には水溶液を反応容器、例えばガラス製反応容器に入れて前記のいずれかの光源から光照射し、大気中、前記の室温で、０．５〜２４時間、特に０．５〜５時間の反応時間で光エネルギーによってＮＡＤ＋を還元することによって、高効率で安全にＮＡＤＨを生成させることができる。
【００２９】
この発明によって得られるＮＡＤＨの生成量は、それ自体公知の方法、例えばジアホラーゼの作用によるニトロテトラゾリウムブルーの還元で生じるホルマザン色素を紫外可視光光度計による分光分析で求めることができる。
この発明によって得られるＮＡＤＨは、反応後の溶液から分離取得してもよく又は分離取得することなくそのまま酵素の駆動源として種々の反応に用いることができる。
【実施例】
【００３０】
以下、この発明の実施例を示す。
以下の各例において、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの変化は波長３４０ｎｍの吸光度の測定により行った。
吸光度測定装置：株式会社日立ハイテクノロジー製 分光光度計 Ｕ−３０１０
１．酸素電極の実験方法
以下の各例において、図５に概略図を示す酸素電極による酸素発生量および吸収量を測定した。測定装置は白金電極と銀電極と攪拌子を備えた容器（セル）とハロゲンランプ光源からの照射光の熱を吸収した後、集光する集光レンズを備えている。光源はハロゲンランプで電圧１００Ｖ、５００Ｗ出力である。
【００３１】
実験手順：
純水１ｍＬをセルに入れて攪拌し、測定電圧を安定させる（測定電圧１）。
ハイドロサルファイトナトリウム（ジチオナイト）を大過剰入れ、ストッパーを閉じて測定電圧が安定するまで待つ（測定電圧２）。
測定電圧１と測定電圧２との差が純水中の酸素濃度（平衡状態）の２５３μＭ、２５℃、１気圧に相当する。
【００３２】
２．電子伝達メディエーターのスクリーニング
２−１．ＰＳIIからの電子受容性の測定
前記の酸素電極による測定装置を用いて、最終の溶液組成として、バッファー［２０ｍＭのＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）、２０ｍＭのＮａＣｌ、４００ｍＭのショ糖）］、０．５ｍＭの電子伝達メディエーターおよび１５μｇＣｈｌ／ｍＬのＰＳIIの合計１ｍＬを用いて、溶液温度２５℃で測定を行った。
セルにバッファーおよび電子伝達メディエーターを加えた状態で攪拌し、測定温度を安定させた。暗室にて溶液にＰＳIIを添加後、ストッパーを閉じ、測定電圧が安定していることを確認した後、光を照射し、測定電圧の変化をチャートに記録した。測定電圧変化から求められる酸素発生量の傾きから最大酸素発生速度を求めた。
酸素発生量の傾きから最大酸素発生速度を求める１例を図６に示す。
得られた最大酸素発生速度測定結果からＰＳIIからの電子受容性を判断した。最大酸素発生速度が大きいほどＰＳIIからの電子受容性が高い。
【００３３】
２−２．ＰＳIへの電子伝達の測定
上記と同様に、酸素電極による測定装置を用いて、最終の溶液組成として、バッファー［２０ｍＭのＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）、２０ｍＭのＮａＣｌ、４００ｍＭのショ糖）］、０．５ｍＭの電子伝達メディエーターと１０μｇＣｈｌ／ｍＬのＰＳIIと２０μｇＣｈｌ／ｍＬのＰＳIの合計１ｍＬを用いて測定を行った。
バッファー、電子伝達メディエーターを加えた状態で攪拌し、測定温度を安定させた。暗室にて溶液に添加後、ＰＳII単独又はＰＳIIとＰＳIとを溶液に添加後、ストッパーを閉じ、測定電圧が安定していることを確認した後、光を照射し、測定電圧の変化をチャートに記録した。酸素発生量がマイナス、すなわち酸素の吸収が認められればＰＳII⇒ＰＳIの電子伝達がおこっていると判断した。
【００３４】
以下の各例において、ＰＳIIおよびＰＳＩはＢＢＹ法（抽出法）によって得た。ＢＢＹ法に用いたリン酸バッファーおよび葉緑体の調製法、ＰＳIIおよびＰＳＩの調製法を以下に示す。
（１）リン酸バッファーの調製
リン酸バッファーとして、５０ｍＭのＮａ／Ｋリン酸（ｐＨ６．５）、３００ｍＭのショ糖、１００ｍＭのＮａＣｌからなる組成割合で調製した。
【００３５】
（２）葉緑体の調製
ほうれん草をジューサーで粉砕し、粉砕液を白い網目状の二重にした袋に入れて小型遠心ろ過器で葉緑体を搾り取った。
一連の操作の詳細は下記の通りである。
操作：５３００ｒｐｍ、１０分間で遠心分離した後、沈殿をリン酸バッファーで懸濁し、次いで２０００ｒｐｍ、３０秒間で遠心分離し、上澄液を５３００ｒｐｍ、８分間で遠心分離して、沈殿（葉緑体）を取得した。
（３）葉緑体のクロロフィル定量
８０％アセトンで５分間抽出し、５０００ｒｐｍ、３分間で遠心分離した。クロロフィル濃度を３〜５ｍｇＣｈｌ／ｍＬに調整した。常法による分光分析法でクロロフィル濃度をｍｇＣｈｌ／ｍＬ単位で定量した。
以上の（２）および（３）の操作は低温、暗室下で行った。
【００３６】
（４）ＰＳIIおよびＰＳＩの調製
総クロロフィル量の４倍の界面活性剤（ジキトニン）を投入し、０℃に保った状態で１時間攪拌し、以下の操作で沈殿物としてＰＳIIおよびＰＳＩを得た。
操作：３５０００ｒｐｍ、３０分間で遠心分離した後、沈殿としてＰＳIIを得た。上澄液（ＰＳＩを含有）を５３０００ｒｐｍ、９０分間で遠心分離し、沈殿を蒸留水で洗って、５３０００ｒｐｍ、９０分間で遠心分離し、さらに沈殿を蒸留水で洗って、５３０００ｒｐｍ、９０分間で遠心分離して、ＰＳＩである沈殿を蒸留水に溶かし、凍結乾燥して保存した。
【００３７】
また、以下の各例で用いた、フェニル−ｐ−ベンゾキノン又は２，６−ジクロロインドフェノール、Ｆｄ、ＦＮＲおよびＮＡＤ＋は以下のものを用いた。
フェニル−ｐ−ベンゾキノン：ＤＭＳＯに溶解させて用いた。
２，６−ジクロロインドフェノール：ナカライテスク社から購入したものをそのまま用いた。
Ｆｄ：シグマアルドリッチ社から購入したもの（ホウレン草より抽出、精製）をそのまま用いた。
ＦＮＲ：シグマアルドリッチ社から購入したもの（ホウレン草より抽出、精製）をそのまま用いた。
ＮＡＤ＋：ナカライテスク社から購入したものをそのまま用いた。
また、以下に検討を行った電子伝達メディエーターの具体例の略号と酸化還元電位（以下、ＯＲＰと略記することもある。ｐＨ７での値を示す。）と各々の化学式と性質とを併せて以下に示す。
【００３８】
Ｐ−ｐ−ＢＱ：フェニル−ｐ−ベンゾキノン、ＯＲＰ＝＋０ｍＶ、親油性
ＤＣＩＰ：２，６−ジクロロインドフェノール、ＯＲＰ＝＋２１７ｍＶ、親水性
ＯＨ−ＮＱ：２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、ＯＲＰ＝−１３９ｍＶ、親水性、化学式：
【００３９】
【化３】
Ｃｌ−ＮＱ：２，３−ジクロロ−１，４−ナフトキノン、ＯＲＰ＝＋１１ｍＶ、親油性、化学式：
【００４０】
【化４】
ＰＭＳ：Ｎ−メチルフェナゾニウムメソサルフェート、ＯＲＰ＝＋８０ｍＶ、親水性、化学式：
【００４１】
【化５】
ＤＡＤ：２，３，５，６−テトラメチルフェニレンジアミン、ＯＲＰ＝＋２６０ｍＶ、親油性、化学式：
【００４２】
【化６】
ＫＦｅＣＮ：フェロ／フェリシアン化カリウム、ＯＲＰ＝＋４０４〜＋５０１ｍＶ、親水性、代表的な化学式：
【００４３】
【化７】
【００４４】
参考例１
最大酸素発生速度測定によるＰＳIIからの電子受容性を、ＰＳIIおよび各種の電子伝達メディエーターを用いた場合と、電子伝達メディエーターなしの場合について評価した。
得られた結果をまとめて図３に示す。
図３から、電子伝達メディエーターとしてＰ−ｐ−ＢＱおよびＤＣＩＰが特に有効であることが明らかになった。
【００４５】
参考例２
酸素濃度の時間変化によるＰＳIへの電子供与性を、最終溶液として、（１）バッファーと０．５ｍＭのＭｅｄと１０μｇＣｈｌ／ｍＬのＰＳIIと２０μｇＣｈｌ／ｍＬのＰＳIの合計１ｍＬ、（２）バッファーと０．５ｍＭのＭｅｄと１０μｇＣｈｌ／ｍＬのＰＳIIとの合計１ｍＬ、および（３）バッファーと１０μｇＣｈｌ／ｍＬのＰＳIIの合計１ｍＬの３例を用いて測定を行った。
結果をまとめて概略図として図４に示す。
図４から、ＰＳIIとＰＳIとＭｅｄとの組合せの場合のみ、ＰＳII⇒ＰＳIの電子伝達がおこっていることが明らかになった。
【００４６】
実施例１
参考例１で用いたのと同じ装置を用いて、以下の溶液組成の反応性溶液からなる反応系に光照射して、ＮＡＤＨを生成させた。
溶液組成：
バッファー：２０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）、２０ｍＭのＮａＣｌ、４００ｍＭのショ糖）
ＰＳII：３．５μｇＣｈｌ／ｍＬ
Ｐ−ｐ−ＢＱ：２３μＭ
ＰＳI：７μｇＣｈｌ／ｍＬ
Ｆｄ：０．１ｍｇ／ｍＬ
ＦＮＲ：０．１単位／ｍＬ
ＮＡＤ＋：１ｍＭ
溶液全量：１ｍＬ
得られた結果を実施例２および比較例１の結果とまとめて、ＮＡＤＨの生成濃度の時間変化として図７に示す。
【００４７】
実施例２
Ｐ−ｐ−ＢＱに代えてＤＣＩＰを同量用いた他は実施例１と同様に実施した。得られた結果を実施例１および比較例１の結果とまとめて図７に示す。
【００４８】
比較例１
ＭｅｄおよびＰＳIを用いず、以下の溶液組成の反応性溶液について、光照射してＮＡＤＨを生成させた。
溶液組成：
バッファー：２０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）、２０ｍＭのＮａＣｌ、４００ｍＭのショ糖）
ＰＳII：３．５μｇＣｈｌ／ｍＬ
ＮＡＤ＋：１ｍＭ
溶液全量：１ｍＬ
得られた結果を実施例１および実施例２の結果とまとめて図７に示す。
【００４９】
実施例３
ＰＳII、Ｐ−ｐ−ＢＱおよびＰＳIの量を変えて、以下の溶液組成の反応性溶液に変えた他は実施例１と同様に実施した。
溶液組成：
バッファー、Ｆｄ、ＦＮＲ、ＮＡＤ＋、溶液全量：実施例１と同じ
ＰＳII：５μｇＣｈｌ／ｍＬ
Ｐ−ｐ−ＢＱ：３２μＭ
ＰＳI：９．８μｇＣｈｌ／ｍＬ
得られた結果を実施例４の結果とともにまとめて図８に示す。
【００５０】
実施例４
ＰＳII、Ｐ−ｐ−ＢＱおよびＰＳIの量を変えて、以下の溶液組成の反応性溶液に変えた他は実施例１と同様に実施した。
溶液組成：
バッファー、Ｆｄ、ＦＮＲ、ＮＡＤ＋、溶液全量：実施例１と同じ
ＰＳII：１０μｇＣｈｌ／ｍＬ
Ｐ−ｐ−ＢＱ：６４μＭ
ＰＳI：１９．６μｇＣｈｌ／ｍＬ
得られた結果を実施例３の結果とともにまとめて図８に示す。
【００５１】
実施例５
各成分の量を変えて以下の溶液組成の反応性溶液に変えた他は実施例１と同様に実施した。
溶液組成：
バッファー、Ｆｄ、ＮＡＤ＋、溶液液全量：実施例１と同じ
ＰＳII：１０μｇＣｈｌ／ｍＬ
Ｐ−ｐ−ＢＱ：６４μＭ
ＰＳI：１９．６μｇＣｈｌ／ｍＬ
ＦＮＲ：０．５単位／ｍＬ
得られた結果をまとめて図９に示す。
【００５２】
実施例６
Ｐ−ｐ−ＢＱおよびＦｄの量を変えて、以下の溶液組成の反応性溶液に変えた他は実施例１と同様に実施した。
溶液組成：
バッファー、ＰＳII、ＰＳI、ＦＮＲ、ＮＡＤ＋、溶液全量：実施例１と同じ
Ｐ−ｐ−ＢＱ：１１５μＭ
Ｆｄ：０．５ｍｇ／ｍＬ
得られた結果をまとめて図１０に示す。
【００５３】
図７から、この発明における水にＰＳIIおよびＰＳＩとＭｅｄとを組み合わせた反応性溶液により、ＰＳIIのみの場合と比較してＮＡＤＨ生成量が多く、特にこの発明によれば時間の経過とともにＮＡＤＨ生成量が増大するのに対して、反応時間が約１時間を経過して以後はＰＳIIのみの場合にはＮＡＤＨ生成量が時間の経過とともに低下する。つまり、反応時間の経過とともに実施例１および実施例２と比較例１とでＮＡＤＨ生成量の差が顕著となる。
【００５４】
以上の実施例１〜６の結果と比較例１の結果との比較から、この発明によれば特定の電子伝達メディエーターで電子の授受を行わせることにより、生体外であってもＰＳIIおよびＰＳＩを協働させ、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成させる一連の還元反応を高効率で起こさせることができたと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、この発明の反応の１実施態様の反応式の概念図である。
【図２】図２は、この発明による一連の反応における酸化還元電位の変化を示す概念図である。
【図３】図３は、種々の電子伝達メディエーターの存在下又は不存在下でのＰＳIIからの電子受容性を最大酸素発生速度によって示すグラフである。
【図４】図４は、この発明における特定の電子伝達メディエーターの存在下でのＰＳIIからＰＳＩへの電子供与性を酸素濃度の経時変化によって示すグラフである。
【図５】図５は、各例で用いた電子の受容および供与の程度について酸素電極による酸素発生および吸収量を測定して評価するために用いた測定装置の概略図である。
【図６】図６は、酸素発生量から最大酸素発生速度を求めるための１例を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例１〜２および比較例１のＮＡＤＨ生成量の経時変化を比較したグラフである。
【図８】図８は、実施例３〜４のＮＡＤＨ生成量の経時変化を示すグラフである。
【図９】図９は、実施例５のＮＡＤＨ生成量の経時変化を示すグラフである。
【図１０】図１０は、実施例６のＮＡＤＨ生成量の経時変化を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、光エネルギーおよび水を原料とする酵素の駆動源となる還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの製造方法およびそれに適した光反応性溶液に係り、さらに詳しくは光合成タンパク質複合体の１種であるＰＳII（光化学系IIともいう。以下、単にＰＳIIと略記することもある。）および光合成タンパク質複合体の他の１種であるＰＳＩ（光化学系Ｉともいう。以下、単にＰＳＩと略記することもある。）、特定の電子伝達メディエーター、水および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と略記することもある。）を含む光反応性溶液に光エネルギーを与えて酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと略記することもある。）の製造方法及びそれに適した光反応性溶液に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体系においては、ＮＡＤＨはＮＡＤ＋からＰＳIIおよびＰＳＩの協働（又は連結）によって還元されて生成されることが知られている。
これに対して、非生体系では、ＰＳIIおよびＰＳＩは生体外に分離・精製して別々に取り出され、個々の機能について研究されており、分離・精製して取り出された２種類の光合成タンパク質複合体を併用して使用する試みは今までなされていない。
【０００３】
一方、ＮＡＤＨは種々の酸化還元酵素を用いる酵素分析による医学的診断の用途や栄養補給剤用などに用いられる。さらに、ＮＡＤＨはギ酸脱水素酵素、ホルムアルデヒド脱水素酵素やアルコール脱水素酵素などの脱水素酵素を用いた酵素反応において電子供与体として働くことが知られている（特許文献１）。この酵素反応の具体例として、二酸化炭素からギ酸およびホルムアルデヒドを経由するメタノール合成を挙げることができる。
【０００４】
このような種々の用途を有するＮＡＤＨの製造法としては、例えばＮＡＤをＮＡＤＨに還元する酵素法が知られている（非特許文献１）。この場合、エタノールを出発原料として大過剰に使用し、生じる揮発性アセトアルデヒドを反応系から連続的に排除する必要がある。また、前記のＮＡＤＨを電子供与体として用いる酵素反応において、ＮＡＤＨが酸化されて生成したＮＡＤ＋を含む反応系内にほうれん草などの緑色植物から抽出したＰＳIIを加え、光照射することにより自動的にＮＡＤＨが生成することが知られている（特許文献１）。
また、ＮＡＤＨに類似した還元型ＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）の製造法として、ラン藻細胞の存在下、酸化型ＮＡＤＰを光化学的に還元する方法が知られている（特許文献２）。
【０００５】
【非特許文献１】アプライド・バイオケミストリー・アンド・バイオテクノロジー（Applied Biochemistry and Biotechnology）、第１４巻、１９８７、第１４７〜１９７頁
【特許文献１】米国特許第６４４０７１１号明細書
【特許文献２】特公昭６３−３２４３９号公報
【０００６】
しかし、前記非特許文献１においては合成のさいに毒性のあるアセトアルデヒドが生じ、前記特許文献１においてはＰＳIIを用いてＮＡＤ＋を直接還元してＮＡＤＨを生成させておりＰＳIIとＰＳＩとの併用については記載されてなく、前記特許文献２においてはＮＡＤＰＨの生産量が実施例によれば５μｍｏｌ／ｍｇＣｈｌ．ｈ．未満である。
このように、公知のＮＡＤＨの製造法では、生体系と同様にＰＳIIとＰＳＩとを併用することによって高効率で安全にＮＡＤＨを得ることはできなかったのである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、この発明の目的は、生体系と同様にＰＳIIとＰＳＩとを併用して高効率で安全にＮＡＤＨを得ることが可能である還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの製造方法及びそれに適した光反応性溶液を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この発明者らは、前記の目的を達成することを目的として鋭意検討した結果、非生体系ではＰＳIIとＰＳＩとを併用しても通常の条件ではこれらの協働は達成されないことを見出し、さらに検討を行った結果、この発明を完成した。
この発明は、光合成タンパク質複合体であるＰＳIIおよびＰＳＩ、フェニル−ｐ−ベンゾキノン、水および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と略記することもある。）を含む光反応性溶液に光エネルギーを与えて酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの製造方法に関する。
【０００９】
また、この発明は、光合成タンパク質複合体であるＰＳIIおよびＰＳＩ、２，６−ジクロロインドフェノール、水および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む光反応性溶液に光エネルギーを与えて酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの製造方法に関する。
【００１０】
さらに、この発明は、光合成タンパク質複合体であるＰＳIIおよびＰＳＩ、フェニル−ｐ−ベンゾキノン、水および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む光反応性溶液に関する。
さらに、この発明は、光合成タンパク質複合体であるＰＳIIおよびＰＳＩ、２，６−ジクロロインドフェノール、水および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む光反応性溶液に関する。
【発明の効果】
【００１１】
この発明によれば、生体系と同様に光合成タンパク質複合体であるＰＳIIとＰＳＩとを併用して高効率で安全に還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを得ることが可能である。
また、この発明によれば、光を照射して高効率で安全に還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを製造することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
この発明における好適な態様を次に示す。
１）ＰＳIIおよびＰＳＩおよびフェニル−ｐ−ベンゾキノン又は２，６−ジクロロインドフェノール（以下、Ｍｅｄと略記することもある。）の割合が、１００ｍＭ（モル）のＮＡＤ＋に対して、１００〜１００００μｇＣｈｌ（クロロフィル ）のＰＳIIおよび１００〜２００００μｇＣｈｌのＰＳIおよび２００〜１０００００μＭのＭｅｄである前記の製造方法。
２）ＰＳIIに対するＰＳIとの割合［ＰＳI／ＰＳII（μｇＣｈｌ比）］が１：１０〜１０：１である前記の製造方法。
３）光反応性溶液が、水溶液である前記の製造方法。
４）光反応性溶液の温度が、０℃〜３５℃である前記の製造方法。
５）ＰＳIIおよびＰＳＩおよびＭｅｄの割合が、１００ｍＭ（モル）のＮＡＤ＋に対して、１００〜１００００μｇＣｈｌ（クロロフィル ）のＰＳIIおよび１００〜２００００μｇＣｈｌのＰＳIおよび２００〜１０００００μＭのＭｅｄである前記の光反応性溶液。
【００１３】
この発明においては、ＰＳIIおよびＰＳＩと水とＮＡＤ＋と親油性電子伝達メディエーターであるフェニル−ｐ−ベンゾキノンとを含む反応系又はＰＳIIおよびＰＳＩと水とＮＡＤ＋と親水性電子伝達メディエーターである２，６−ジクロロインドフェノールとを含む光反応性溶液であることが必要である。
【００１４】
光反応性溶液として、水およびＮＡＤ＋に加えて、１）フェニル−ｐ−ベンゾキノンおよび２，６−ジクロロインドフェノールのいずれかを含むが光合成タンパク質複合体として特許文献１のようにＰＳIIのみを含む場合、２）光合成タンパク質複合体としてＰＳIIおよびＰＳＩを併用するが電子伝達メディエーターを含まない場合、あるいは３）光合成タンパク質複合体としてＰＳIIおよびＰＳＩを併用するが前記特定の電子伝達メディエーター以外の他の電子伝達メディエーターを含む場合のいずれであっても、光照射によってＮＡＤ＋を還元して高効率でＮＡＤＨを得ることは困難である。
【００１５】
この発明における光合成タンパク質複合体であるＰＳIIおよびＰＳＩは、緑色植物の葉の中に存在し、例えばほうれん草などの緑色植物から抽出法によって各々単離取得することができる。前記の抽出法として、例えばＢＢＹ法が挙げられる。このＰＳIIおよびＰＳＩは生体系、例えば緑色植物の葉の中ではＰＳIIからＰＳＩへの電子伝達が可能でありＰＳIIとＰＳＩとが協働して酸化還元反応に関与し得る。しかし、緑色植物の葉から単離して非生体系で人工的に使用する場合には、ＰＳＩは電子の伝達に基づく反応に関与しないかほとんど関与しないことが知られている。このため、光合成タンパク質複合体を、緑色植物の葉から単離して人工的に使用する場合には、通常は前記特許文献１に記載されているようにＰＳIIが単独で使用される。
【００１６】
この発明における親油性電子伝達メディエーターであるフェニル−ｐ−ベンゾキノンあるいは親水性電子伝達メディエーターである２，６−ジクロロインドフェノール（これら２種の電子伝達メディエーターを総称してＭｅｄと略記することもある。）は、葉緑素中での存在は確認されていないが公知の化合物であり、各々以下の化学式で示される。なお、フェニル−ｐ−ベンゾキノンと２，６−ジクロロインドフェノールとは併用してもよく、フェニル−ｐ−ベンゾキノン又は２，６−ジクロロインドフェノールは他の電子伝達メディエーターと組み合わせてもよい。
【００１７】
【化１】
【００１８】
【化２】
【００１９】
以下、この発明の光反応性溶液によって水を原料として光エネルギーによってＮＡＤ＋からＮＡＤＨを製造する反応について、この発明の１実施態様の反応式の概念図である図１を用いて説明する。
図１に示すように、前記の反応は逐次的に行われる。
図１に示す反応において、光エネルギーを与えられた水がＰＳIIの関与によって酸素とプロトン（Ｈ＋）と電子（ｅ−）を放出し、放出された電子はＭｅｄに、さらにＰＳＩに伝達され、それを光エネルギーによってＦｄ（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ）が受け取り、さらにＦＮＲを介してＮＡＤ＋に電子が伝達され、ＮＡＤ＋の還元反応によってＮＡＤＨを生成すると考えられる。
【００２０】
図１に示す反応における前記のＦｄは、電子伝達体として機能し光合成を含む主要な代謝系に用いられるタンパク質であり、ＦＮＲはフェレドキシン酸化還元酵素である。ＦｄおよびＦＮＲは生体内の電子伝達反応に関与していることが知られている。
前記のＦｄおよびＦＮＲは、例えば、緑色植物の葉の中に存在し、ほうれん草などから周知の抽出方法によって取得することが可能であり、また市販品（例えば、シグマアルドリッチ社）を使用することも可能である。
【００２１】
この発明の製造方法について、この発明による一連の反応における酸化還元電位の変化を示す概念図である図２を用いて説明する。
図２において縦軸は酸化還元電位を、横軸は電子伝達の工程を示す。
図２に示すように、水からＰＳIIによって放出された電子の酸化還元電位が光エネルギーによって大幅に増大し、この電子はＭｅｄを介してＰＳＩに伝達され、その際減少した電子の酸化還元電位が光エネルギーによって大幅に増大し、この電子がＰＳＩからＦｄに伝達され、さらにＦＮＲを介してＮＡＤ＋に伝達され、ＮＡＤ＋と電子とが反応してＮＡＤＨを生成すると考えられる。
図２から明らかなように、前記の各成分のうちＭｅｄおよびＰＳＩを含まない反応系では、水からＰＳIIを経由してＮＡＤ＋への電子の受容−供与の一連の伝達がなされず、高効率でＮＡＤＨを得ることができないと考えられる。
従って、この発明の光反応性溶液においては水、ＰＳIIとともにＰＳＩおよび前記特定のＭｅｄが必須成分であることが理解される。
【００２２】
次に、この発明について、種々の電子伝達メディエーターの存在下又は不存在下でのＰＳIIからの電子受容性を最大酸素発生速度によって示すグラフである図３、およびこの発明における特定の電子伝達メディエーターの存在下でのＰＳIIからＰＳＩへの電子供与性を酸素濃度の経時変化によって示すグラフである図４を用いて説明する。
これら図３および図４は、後述の実施例の欄に詳細に説明される酸素電極を用いた酸素発生量、酸素吸収量を測定することによってＰＳIIからの電子受容性、ＰＳIIからＰＳＩへの電子供与性を評価した結果を示すグラフである。図３において、横軸は電子伝達メディエーターの種類（略号で表示）を示し、ｎは実験回数を示す。
【００２３】
前記の酸素電極を用いた酸素発生量、酸素吸収量測定の原理は、酸素電極の陰極側ではＯ２が白金表面で受け取った４ｅ−および４Ｈ＋と反応して水を生成し、陽極側では４Ａｇと４Ｃｌ−とから４ＡｇＣｌを生じ、さらに４ｅ−を電極に受け渡す。この４ｅ−の電極での授受を電流として測定し、測定された電流は陰極で消費される量と化学両論的に相関があることに基づいている。
前記の白金（Ｐｔ）陰極、銀（Ａｇ）陽極での反応を以下に示す。
Ｐｔ電極：Ｏ２＋４Ｈ＋＋４ｅ−→２Ｈ２Ｏ
Ａｇ電極：４Ａｇ＋４Ｃｌ−→４ＡｇＣｌ＋４ｅ−
【００２４】
図３から、この発明における前記の親油性電子伝達メディエーターであるフェニル−ｐ−ベンゾキノン又は親水性電子伝達メディエーターである２，６−ジクロロインドフェノールは、他の公知の電子伝達メディエーターあるいは電子伝達メディエーターがない場合と比べて最大酸素発生速度が約２倍以上であり、従ってＰＳIIからの電子受容性が高いことを示す。
また、図４から、ＰＳIIのみあるいはＰＳIIとＭｅｄとの組合せでは酸素濃度が時間の経過によっても平衡酸素濃度を下回ることがなくＰＳＩへの電子供与性が低いのに比べて、この発明におけるＰＳIIおよびＰＳＩとＭｅｄとの組合せでは酸素濃度が最大酸素発生後に時間の経過に伴い平衡酸素濃度を大幅に下回りＰＳＩへの電子供与性が高いことが理解される。
【００２５】
この発明における水とＰＳIIおよびＰＳＩとＭｅｄとを含む光反応性溶液において、水は原料であり水溶液として用いることが好ましい。
また、前記の反応性溶液において、ＰＳIIおよびＰＳＩおよびＭｅｄの各成分の割合は、１００ｍＭ（モル）のＮＡＤ＋に対して、１００〜１００００μｇＣｈｌ（Ｃｈｌ：クロロフィル ）、特に２００〜５０００μｇＣｈｌのＰＳIIおよび１００〜２００００μｇＣｈｌ、特に２００〜１００００μｇＣｈｌのＰＳIおよび２００〜１０００００μＭ、特に１０００〜５００００μＭのＭｅｄであることが好ましい。各成分の割合が過度に少ないと反応が遅く、各成分の割合が過度に多くても効果は増大しないので好ましくない。また、ＰＳIIに対するＰＳIとの割合［ＰＳI／ＰＳII（μｇＣｈｌ比）］は１：１０〜１０：１、特に１：１〜５：１であることが好ましい。さらに、水の量は、１００ｍＭ（モル）のＮＡＤ＋に対して、５００ｍＭ以上、特に１０００〜５００００ｍＭであることが好ましい。
また、前記以外の他の成分については、１００ｍＭのＮＡＤ＋に対して、１〜１００ｍｇ、特に５〜５０ｍｇのＦｄであることが好ましく、１〜５００単位、特に５〜１００単位のＦＮＲであることが好ましい。
【００２６】
また、前記の反応系として水溶液を用いる場合、前記の各成分に加えて、任意の緩衝剤、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンスルホン酸、ビシン、ヒスチジン、ビス−トリス、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）、イミダゾール、又はＭＥＳなどの緩衝剤を加えてもよく、あるいは前記の緩衝剤を含む緩衝液を加えてもよい。緩衝液としては、前記の緩衝剤の他に、通常はショ糖、塩化ナトリウムおよび／又は塩化マグネシウムが含まれる。
前記の各成分は、全成分を最初から同時に添加して反応性溶液に含有させておいてもよく又は各成分を逐次的に含有させてもよいが、通常は全成分を最初から同時に添加して反応性溶液に含有させることが好ましい。
【００２７】
反応の間に反応性溶液を、ｐＨの値が６〜９の範囲内、特に６．５〜８．５の範囲内の緩衝液によってｐＨを一定に維持することが好ましい。
前記の反応は、５０℃未満、好適には０℃〜３５℃、特に２５℃〜３５℃の温度で行うことが好ましい。
また、この発明における光は、太陽光、キセノンランプ、ハロゲンランプなど任意の光であってよい。
前記の光の反応性溶液への照射は、光照射によって反応性溶液の温度が過度に上昇しないように光透過性熱吸収装置、例えば水槽を通過した光を照射してもよい。この場合、必要であれば、水槽通過後の光線から特定範囲の波長域以外の光線をフィルターを通して除去し、集光して反応性溶液に照射することが好ましい。
【００２８】
この発明において、前記の各成分を含む反応性溶液、好適には水溶液を反応容器、例えばガラス製反応容器に入れて前記のいずれかの光源から光照射し、大気中、前記の室温で、０．５〜２４時間、特に０．５〜５時間の反応時間で光エネルギーによってＮＡＤ＋を還元することによって、高効率で安全にＮＡＤＨを生成させることができる。
【００２９】
この発明によって得られるＮＡＤＨの生成量は、それ自体公知の方法、例えばジアホラーゼの作用によるニトロテトラゾリウムブルーの還元で生じるホルマザン色素を紫外可視光光度計による分光分析で求めることができる。
この発明によって得られるＮＡＤＨは、反応後の溶液から分離取得してもよく又は分離取得することなくそのまま酵素の駆動源として種々の反応に用いることができる。
【実施例】
【００３０】
以下、この発明の実施例を示す。
以下の各例において、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの変化は波長３４０ｎｍの吸光度の測定により行った。
吸光度測定装置：株式会社日立ハイテクノロジー製 分光光度計 Ｕ−３０１０
１．酸素電極の実験方法
以下の各例において、図５に概略図を示す酸素電極による酸素発生量および吸収量を測定した。測定装置は白金電極と銀電極と攪拌子を備えた容器（セル）とハロゲンランプ光源からの照射光の熱を吸収した後、集光する集光レンズを備えている。光源はハロゲンランプで電圧１００Ｖ、５００Ｗ出力である。
【００３１】
実験手順：
純水１ｍＬをセルに入れて攪拌し、測定電圧を安定させる（測定電圧１）。
ハイドロサルファイトナトリウム（ジチオナイト）を大過剰入れ、ストッパーを閉じて測定電圧が安定するまで待つ（測定電圧２）。
測定電圧１と測定電圧２との差が純水中の酸素濃度（平衡状態）の２５３μＭ、２５℃、１気圧に相当する。
【００３２】
２．電子伝達メディエーターのスクリーニング
２−１．ＰＳIIからの電子受容性の測定
前記の酸素電極による測定装置を用いて、最終の溶液組成として、バッファー［２０ｍＭのＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）、２０ｍＭのＮａＣｌ、４００ｍＭのショ糖）］、０．５ｍＭの電子伝達メディエーターおよび１５μｇＣｈｌ／ｍＬのＰＳIIの合計１ｍＬを用いて、溶液温度２５℃で測定を行った。
セルにバッファーおよび電子伝達メディエーターを加えた状態で攪拌し、測定温度を安定させた。暗室にて溶液にＰＳIIを添加後、ストッパーを閉じ、測定電圧が安定していることを確認した後、光を照射し、測定電圧の変化をチャートに記録した。測定電圧変化から求められる酸素発生量の傾きから最大酸素発生速度を求めた。
酸素発生量の傾きから最大酸素発生速度を求める１例を図６に示す。
得られた最大酸素発生速度測定結果からＰＳIIからの電子受容性を判断した。最大酸素発生速度が大きいほどＰＳIIからの電子受容性が高い。
【００３３】
２−２．ＰＳIへの電子伝達の測定
上記と同様に、酸素電極による測定装置を用いて、最終の溶液組成として、バッファー［２０ｍＭのＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）、２０ｍＭのＮａＣｌ、４００ｍＭのショ糖）］、０．５ｍＭの電子伝達メディエーターと１０μｇＣｈｌ／ｍＬのＰＳIIと２０μｇＣｈｌ／ｍＬのＰＳIの合計１ｍＬを用いて測定を行った。
バッファー、電子伝達メディエーターを加えた状態で攪拌し、測定温度を安定させた。暗室にて溶液に添加後、ＰＳII単独又はＰＳIIとＰＳIとを溶液に添加後、ストッパーを閉じ、測定電圧が安定していることを確認した後、光を照射し、測定電圧の変化をチャートに記録した。酸素発生量がマイナス、すなわち酸素の吸収が認められればＰＳII⇒ＰＳIの電子伝達がおこっていると判断した。
【００３４】
以下の各例において、ＰＳIIおよびＰＳＩはＢＢＹ法（抽出法）によって得た。ＢＢＹ法に用いたリン酸バッファーおよび葉緑体の調製法、ＰＳIIおよびＰＳＩの調製法を以下に示す。
（１）リン酸バッファーの調製
リン酸バッファーとして、５０ｍＭのＮａ／Ｋリン酸（ｐＨ６．５）、３００ｍＭのショ糖、１００ｍＭのＮａＣｌからなる組成割合で調製した。
【００３５】
（２）葉緑体の調製
ほうれん草をジューサーで粉砕し、粉砕液を白い網目状の二重にした袋に入れて小型遠心ろ過器で葉緑体を搾り取った。
一連の操作の詳細は下記の通りである。
操作：５３００ｒｐｍ、１０分間で遠心分離した後、沈殿をリン酸バッファーで懸濁し、次いで２０００ｒｐｍ、３０秒間で遠心分離し、上澄液を５３００ｒｐｍ、８分間で遠心分離して、沈殿（葉緑体）を取得した。
（３）葉緑体のクロロフィル定量
８０％アセトンで５分間抽出し、５０００ｒｐｍ、３分間で遠心分離した。クロロフィル濃度を３〜５ｍｇＣｈｌ／ｍＬに調整した。常法による分光分析法でクロロフィル濃度をｍｇＣｈｌ／ｍＬ単位で定量した。
以上の（２）および（３）の操作は低温、暗室下で行った。
【００３６】
（４）ＰＳIIおよびＰＳＩの調製
総クロロフィル量の４倍の界面活性剤（ジキトニン）を投入し、０℃に保った状態で１時間攪拌し、以下の操作で沈殿物としてＰＳIIおよびＰＳＩを得た。
操作：３５０００ｒｐｍ、３０分間で遠心分離した後、沈殿としてＰＳIIを得た。上澄液（ＰＳＩを含有）を５３０００ｒｐｍ、９０分間で遠心分離し、沈殿を蒸留水で洗って、５３０００ｒｐｍ、９０分間で遠心分離し、さらに沈殿を蒸留水で洗って、５３０００ｒｐｍ、９０分間で遠心分離して、ＰＳＩである沈殿を蒸留水に溶かし、凍結乾燥して保存した。
【００３７】
また、以下の各例で用いた、フェニル−ｐ−ベンゾキノン又は２，６−ジクロロインドフェノール、Ｆｄ、ＦＮＲおよびＮＡＤ＋は以下のものを用いた。
フェニル−ｐ−ベンゾキノン：ＤＭＳＯに溶解させて用いた。
２，６−ジクロロインドフェノール：ナカライテスク社から購入したものをそのまま用いた。
Ｆｄ：シグマアルドリッチ社から購入したもの（ホウレン草より抽出、精製）をそのまま用いた。
ＦＮＲ：シグマアルドリッチ社から購入したもの（ホウレン草より抽出、精製）をそのまま用いた。
ＮＡＤ＋：ナカライテスク社から購入したものをそのまま用いた。
また、以下に検討を行った電子伝達メディエーターの具体例の略号と酸化還元電位（以下、ＯＲＰと略記することもある。ｐＨ７での値を示す。）と各々の化学式と性質とを併せて以下に示す。
【００３８】
Ｐ−ｐ−ＢＱ：フェニル−ｐ−ベンゾキノン、ＯＲＰ＝＋０ｍＶ、親油性
ＤＣＩＰ：２，６−ジクロロインドフェノール、ＯＲＰ＝＋２１７ｍＶ、親水性
ＯＨ−ＮＱ：２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、ＯＲＰ＝−１３９ｍＶ、親水性、化学式：
【００３９】
【化３】
Ｃｌ−ＮＱ：２，３−ジクロロ−１，４−ナフトキノン、ＯＲＰ＝＋１１ｍＶ、親油性、化学式：
【００４０】
【化４】
ＰＭＳ：Ｎ−メチルフェナゾニウムメソサルフェート、ＯＲＰ＝＋８０ｍＶ、親水性、化学式：
【００４１】
【化５】
ＤＡＤ：２，３，５，６−テトラメチルフェニレンジアミン、ＯＲＰ＝＋２６０ｍＶ、親油性、化学式：
【００４２】
【化６】
ＫＦｅＣＮ：フェロ／フェリシアン化カリウム、ＯＲＰ＝＋４０４〜＋５０１ｍＶ、親水性、代表的な化学式：
【００４３】
【化７】
【００４４】
参考例１
最大酸素発生速度測定によるＰＳIIからの電子受容性を、ＰＳIIおよび各種の電子伝達メディエーターを用いた場合と、電子伝達メディエーターなしの場合について評価した。
得られた結果をまとめて図３に示す。
図３から、電子伝達メディエーターとしてＰ−ｐ−ＢＱおよびＤＣＩＰが特に有効であることが明らかになった。
【００４５】
参考例２
酸素濃度の時間変化によるＰＳIへの電子供与性を、最終溶液として、（１）バッファーと０．５ｍＭのＭｅｄと１０μｇＣｈｌ／ｍＬのＰＳIIと２０μｇＣｈｌ／ｍＬのＰＳIの合計１ｍＬ、（２）バッファーと０．５ｍＭのＭｅｄと１０μｇＣｈｌ／ｍＬのＰＳIIとの合計１ｍＬ、および（３）バッファーと１０μｇＣｈｌ／ｍＬのＰＳIIの合計１ｍＬの３例を用いて測定を行った。
結果をまとめて概略図として図４に示す。
図４から、ＰＳIIとＰＳIとＭｅｄとの組合せの場合のみ、ＰＳII⇒ＰＳIの電子伝達がおこっていることが明らかになった。
【００４６】
実施例１
参考例１で用いたのと同じ装置を用いて、以下の溶液組成の反応性溶液からなる反応系に光照射して、ＮＡＤＨを生成させた。
溶液組成：
バッファー：２０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）、２０ｍＭのＮａＣｌ、４００ｍＭのショ糖）
ＰＳII：３．５μｇＣｈｌ／ｍＬ
Ｐ−ｐ−ＢＱ：２３μＭ
ＰＳI：７μｇＣｈｌ／ｍＬ
Ｆｄ：０．１ｍｇ／ｍＬ
ＦＮＲ：０．１単位／ｍＬ
ＮＡＤ＋：１ｍＭ
溶液全量：１ｍＬ
得られた結果を実施例２および比較例１の結果とまとめて、ＮＡＤＨの生成濃度の時間変化として図７に示す。
【００４７】
実施例２
Ｐ−ｐ−ＢＱに代えてＤＣＩＰを同量用いた他は実施例１と同様に実施した。得られた結果を実施例１および比較例１の結果とまとめて図７に示す。
【００４８】
比較例１
ＭｅｄおよびＰＳIを用いず、以下の溶液組成の反応性溶液について、光照射してＮＡＤＨを生成させた。
溶液組成：
バッファー：２０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）、２０ｍＭのＮａＣｌ、４００ｍＭのショ糖）
ＰＳII：３．５μｇＣｈｌ／ｍＬ
ＮＡＤ＋：１ｍＭ
溶液全量：１ｍＬ
得られた結果を実施例１および実施例２の結果とまとめて図７に示す。
【００４９】
実施例３
ＰＳII、Ｐ−ｐ−ＢＱおよびＰＳIの量を変えて、以下の溶液組成の反応性溶液に変えた他は実施例１と同様に実施した。
溶液組成：
バッファー、Ｆｄ、ＦＮＲ、ＮＡＤ＋、溶液全量：実施例１と同じ
ＰＳII：５μｇＣｈｌ／ｍＬ
Ｐ−ｐ−ＢＱ：３２μＭ
ＰＳI：９．８μｇＣｈｌ／ｍＬ
得られた結果を実施例４の結果とともにまとめて図８に示す。
【００５０】
実施例４
ＰＳII、Ｐ−ｐ−ＢＱおよびＰＳIの量を変えて、以下の溶液組成の反応性溶液に変えた他は実施例１と同様に実施した。
溶液組成：
バッファー、Ｆｄ、ＦＮＲ、ＮＡＤ＋、溶液全量：実施例１と同じ
ＰＳII：１０μｇＣｈｌ／ｍＬ
Ｐ−ｐ−ＢＱ：６４μＭ
ＰＳI：１９．６μｇＣｈｌ／ｍＬ
得られた結果を実施例３の結果とともにまとめて図８に示す。
【００５１】
実施例５
各成分の量を変えて以下の溶液組成の反応性溶液に変えた他は実施例１と同様に実施した。
溶液組成：
バッファー、Ｆｄ、ＮＡＤ＋、溶液液全量：実施例１と同じ
ＰＳII：１０μｇＣｈｌ／ｍＬ
Ｐ−ｐ−ＢＱ：６４μＭ
ＰＳI：１９．６μｇＣｈｌ／ｍＬ
ＦＮＲ：０．５単位／ｍＬ
得られた結果をまとめて図９に示す。
【００５２】
実施例６
Ｐ−ｐ−ＢＱおよびＦｄの量を変えて、以下の溶液組成の反応性溶液に変えた他は実施例１と同様に実施した。
溶液組成：
バッファー、ＰＳII、ＰＳI、ＦＮＲ、ＮＡＤ＋、溶液全量：実施例１と同じ
Ｐ−ｐ−ＢＱ：１１５μＭ
Ｆｄ：０．５ｍｇ／ｍＬ
得られた結果をまとめて図１０に示す。
【００５３】
図７から、この発明における水にＰＳIIおよびＰＳＩとＭｅｄとを組み合わせた反応性溶液により、ＰＳIIのみの場合と比較してＮＡＤＨ生成量が多く、特にこの発明によれば時間の経過とともにＮＡＤＨ生成量が増大するのに対して、反応時間が約１時間を経過して以後はＰＳIIのみの場合にはＮＡＤＨ生成量が時間の経過とともに低下する。つまり、反応時間の経過とともに実施例１および実施例２と比較例１とでＮＡＤＨ生成量の差が顕著となる。
【００５４】
以上の実施例１〜６の結果と比較例１の結果との比較から、この発明によれば特定の電子伝達メディエーターで電子の授受を行わせることにより、生体外であってもＰＳIIおよびＰＳＩを協働させ、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成させる一連の還元反応を高効率で起こさせることができたと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、この発明の反応の１実施態様の反応式の概念図である。
【図２】図２は、この発明による一連の反応における酸化還元電位の変化を示す概念図である。
【図３】図３は、種々の電子伝達メディエーターの存在下又は不存在下でのＰＳIIからの電子受容性を最大酸素発生速度によって示すグラフである。
【図４】図４は、この発明における特定の電子伝達メディエーターの存在下でのＰＳIIからＰＳＩへの電子供与性を酸素濃度の経時変化によって示すグラフである。
【図５】図５は、各例で用いた電子の受容および供与の程度について酸素電極による酸素発生および吸収量を測定して評価するために用いた測定装置の概略図である。
【図６】図６は、酸素発生量から最大酸素発生速度を求めるための１例を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例１〜２および比較例１のＮＡＤＨ生成量の経時変化を比較したグラフである。
【図８】図８は、実施例３〜４のＮＡＤＨ生成量の経時変化を示すグラフである。
【図９】図９は、実施例５のＮＡＤＨ生成量の経時変化を示すグラフである。
【図１０】図１０は、実施例６のＮＡＤＨ生成量の経時変化を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光合成タンパク質複合体であるＰＳIIおよびＰＳＩ、フェニル−ｐ−ベンゾキノン、水および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と略記することもある。）を含む光反応性溶液に光エネルギーを与えて酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの製造方法。
【請求項２】
光合成タンパク質複合体であるＰＳIIおよびＰＳＩ、２，６−ジクロロインドフェノール、水および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む光反応性溶液に光エネルギーを与えて酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの製造方法。
【請求項３】
ＰＳIIおよびＰＳＩおよびフェニル−ｐ−ベンゾキノン又は２，６−ジクロロインドフェノール（以下、Ｍｅｄと略記することもある。）の割合が、１００ｍＭ（モル）のＮＡＤ＋に対して、１００〜１００００μｇＣｈｌ（クロロフィル ）のＰＳIIおよび１００〜２００００μｇＣｈｌのＰＳIおよび２００〜１０００００μＭのＭｅｄである請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
ＰＳIIに対するＰＳIとの割合［ＰＳI／ＰＳII（μｇＣｈｌ比）］が１：１０〜１０：１である請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
光反応性溶液が、水溶液である請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
光反応性溶液の温度が、０℃〜３５℃である請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
光合成タンパク質複合体であるＰＳIIおよびＰＳＩ、フェニル−ｐ−ベンゾキノン、水および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む光反応性溶液。
【請求項８】
光合成タンパク質複合体であるＰＳIIおよびＰＳＩ、２，６−ジクロロインドフェノール、水および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む光反応性溶液。
【請求項９】
ＰＳIIおよびＰＳＩおよびＭｅｄの割合が、１００ｍＭ（モル）のＮＡＤ＋に対して、１００〜１００００μｇＣｈｌ（クロロフィル ）のＰＳIIおよび１００〜２００００μｇＣｈｌのＰＳIおよび２００〜１０００００μＭのＭｅｄである請求項７又は８に記載の光反応性溶液。
【請求項１】
光合成タンパク質複合体であるＰＳIIおよびＰＳＩ、フェニル−ｐ−ベンゾキノン、水および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と略記することもある。）を含む光反応性溶液に光エネルギーを与えて酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの製造方法。
【請求項２】
光合成タンパク質複合体であるＰＳIIおよびＰＳＩ、２，６−ジクロロインドフェノール、水および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む光反応性溶液に光エネルギーを与えて酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの製造方法。
【請求項３】
ＰＳIIおよびＰＳＩおよびフェニル−ｐ−ベンゾキノン又は２，６−ジクロロインドフェノール（以下、Ｍｅｄと略記することもある。）の割合が、１００ｍＭ（モル）のＮＡＤ＋に対して、１００〜１００００μｇＣｈｌ（クロロフィル ）のＰＳIIおよび１００〜２００００μｇＣｈｌのＰＳIおよび２００〜１０００００μＭのＭｅｄである請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
ＰＳIIに対するＰＳIとの割合［ＰＳI／ＰＳII（μｇＣｈｌ比）］が１：１０〜１０：１である請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
光反応性溶液が、水溶液である請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
光反応性溶液の温度が、０℃〜３５℃である請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
光合成タンパク質複合体であるＰＳIIおよびＰＳＩ、フェニル−ｐ−ベンゾキノン、水および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む光反応性溶液。
【請求項８】
光合成タンパク質複合体であるＰＳIIおよびＰＳＩ、２，６−ジクロロインドフェノール、水および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む光反応性溶液。
【請求項９】
ＰＳIIおよびＰＳＩおよびＭｅｄの割合が、１００ｍＭ（モル）のＮＡＤ＋に対して、１００〜１００００μｇＣｈｌ（クロロフィル ）のＰＳIIおよび１００〜２００００μｇＣｈｌのＰＳIおよび２００〜１０００００μＭのＭｅｄである請求項７又は８に記載の光反応性溶液。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１０−７０４７６（Ｐ２０１０−７０４７６Ａ）
【公開日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２３８４６８（Ｐ２００８−２３８４６８）
【出願日】平成２０年９月１７日（２００８．９．１７）
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月１７日（２００８．９．１７）
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
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