酵素分解によるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造方法
【課題】本発明の目的は、既存の酸加水分解工程を要することなしにキチンからＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを得ることができるため、工程の単純化及び親環境的な製造工程を提供することにある。
【解決手段】キチンを膨潤させる段階；及び
膨潤したキチンにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン分解酵素を加えて酵素反応させ、キチンの酵素分解液を得る段階を包含するＮ-アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造方法。
【解決手段】キチンを膨潤させる段階；及び
膨潤したキチンにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン分解酵素を加えて酵素反応させ、キチンの酵素分解液を得る段階を包含するＮ-アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キチンからＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造する方法に係り、より詳細には、従来の酸加水分解工程を経ることなしにも、キチンからＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを得ることができるため、製造工程の簡略化及び親環境的なＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは、エビ、カニなどの甲殻類、イカの軟骨、カブトムシなどの昆虫類や真菌類の細胞壁などに含まれている、キチンの構成単位として自然界に広く存在する単糖類の１種である。
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造と関連して、特許文献１によると、先ず、キチンを、酸(塩酸、ギ酸、硫酸など)により部分加水分解し、水酸化ナトリウム溶液で中和した後、濾過して残存物を除去し、この溶液をイオン交換膜電気透析法によって脱塩処理して、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＮ−アセチルキトオリゴ糖を製造する。ここに、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖に対して加水部分解能を有する酵素を作用させてＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの含量を高めることによって、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造する方法が開示されている。
【０００３】
しかし、このような製造方法は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを得るために、原料であるキチンを対象として酸加水分解段階及び脱塩処理段階を必要とするので、その工程が煩雑であり、また、発生する廃水処理の問題だけでなく、得られたＮ−アセチルキトオリゴ糖とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの混合物からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを選択的に分離するための別途の分離膜技術を必要とするため、経済性が低いという問題がある。
【特許文献１】特開２０００-２８１６９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、前記のような従来技術が有する問題を解決するためになされたものであって、本発明の目的は、従来の酸加水分解及び脱塩工程を経ることなしにも、キチンからＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを得ることができるため、製造工程の簡略化及び親環境的なＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明はキチンを膨潤させる段階；及び
膨潤したキチンにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン分解酵素を加えて酵素反応させ、キチンの酵素分解液を得る段階を包含するＮ-アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造方法を提供する。
【０００６】
本発明は、好ましくは前記キチンが、αキチン、またはβキチンであるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造方法を提供する。
本発明は、好ましくは前記キチンを膨潤させる段階が、αキチンを燐酸に溶解させる段階と、所定量の水を加えて膨潤させたαキチンを溶剤から分離させる段階を包含する。
本発明は、好ましくは前記キチンを膨潤させる段階が、βキチンを粉末化させる段階と、前記βキチンの粉末を希酢酸溶液に浸漬させ、所定の時間放置した後、撹拌する段階を包含する。
本発明は、好ましくは前記分解酵素がトリコデルマ・レセイ(Trichoderma reesei)由来のエキソ型キチナーゼ又は、セルロモナス種(Cellulomonas sp.)由来のエキソ型キチナーゼであることを特徴とする。
本発明は、好ましくは前記分解酵素が、α膨潤キチン５重量％(水の重量基準)を基準として２０〜４０ｕｎｉｔ/ｇキチン量になるように添加することを特徴とする。
本発明は、好ましくは前記分解酵素が、βキチン２重量％(希酢酸溶液重量基準)を基準として２０〜４０ｕｎｉｔ/ｇキチン量になるように添加することを特徴とする。
【０００７】
又、本発明は、好ましくは酵素分解液を２段階にで濾過することにより未反応物質を除去し、さらに分離膜で濾過して酵素を除去する段階と、
前記分離膜を通過した濾過液を減圧濃縮し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを析出する段階と、
前記析出されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを洗滌及び濾過した後、乾燥してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの粉末を得る段階をさらに包含することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
上述のように、本発明によれば、従来の酸加水分解工程を経ることなく、単にキチンを膨潤させて酵素処理することによりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造するため、工程の単純化及び費用節減の効果が高く、かつ親環境的な製造工程が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の内容をより詳細に説明する。
本発明に用いられるキチンの原料としては、αキチン又はβキチンが挙げられる。αキチンは、２つの分子間の鎖が逆方向に平行になるように配列されているキチンであり、このようなキチンは、カニ、又はエビなどの甲殻類の殻に含有されている。βキチンは、分子間の鎖が同一方向に平行に配列されているキチンであり、このようなキチンは、イカなどの軟体動物の軟骨に含有されている。
【００１０】
本発明は、既存の酸加水分解工程を必要としなく、キチンを膨潤処理し、ここにキチン分解酵素を反応させてＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造する簡単な工程を提供する。
キチンの膨潤処理は、分解酵素の酵素反応を容易にし、キチンの種類によって具体的な処理工程は異なる場合もあるが、後述する２つの方法を例示することができる。
【００１１】
キチンが、αキチンである場合の膨潤処理は以下のとおりである。すなわちキチンと燐酸(H3PO4)を重量比で１：２〜１：６、好ましくは１：３〜１：５、より好ましくは１：３．５〜１：４．５になるように燐酸にキチンを溶解した後、常温で一定の時間放置する。放置時間は、夏の場合は２〜３時間の短時間で十分であり、冬の場合は２４時間程度まで放置することが良い。放置した後の前記溶液にキチン量の８〜１２倍量の水、好ましくは９〜１１倍量の水を前記溶液に撹拌しながら添加する。
一方、キチンが、βキチンである場合には、キチンを６０〜８０メッシュで粉砕した粉末を希酢酸溶液(０．０７５％)に重量比で０．１〜１０％、好ましくは０．５〜７％、より好ましくは１〜３％になるように浸漬させ、３〜６時間放置した後、ホモジェナイザーで３,０００〜５，０００rpmに高速撹拌してキチンを膨潤させることができる。
【００１２】
これによって、キチンは膨潤され、膨潤されたキチンは溶剤と分離させる。膨潤されたキチンの溶剤との分離過程は遠心分離３,０００〜５，０００rpmまたはフィルタープレス(filter press)、ドラムフィルターなどを用いることができる。
膨潤処理されたキチンを溶剤と分離した後、酵素の最適温度であるｐＨ４．０〜６．０、好ましくはｐＨ４．２〜５．５になるまで水による洗滌又は中和を行う。
前記酵素反応は、分解酵素を前記膨潤処理されたキチンに添加して行われる。本発明に使用することができる分解酵素としてはトリコデルマ・レセイ由来のエキソ型キチナーゼ、セルロモナス種由来のエキソ型キチナーゼなどがある。
【００１３】
酵素反応は、使用される具体的な酵素、酵素の力価、基質の種類及び濃度などによって異なることができる。例えば、キチンが、αキチンである場合、水重量の基準で膨潤されたキチン５重量％(膨潤キチンの重量対比１０重量％がキチン量)に対して分解酵素２０〜４０unit/gキチン量、好ましくは２５〜３５unit/gキチン量を添加して３５〜４５℃で４８〜７２時間分解させると十分である。一方、キチンが、βキチンである場合、希酢酸溶液を基準としてキチン２重量％に対して２０〜４０unit/gキチン量、好ましくは２５〜３５unit/gキチン量を添加して３５〜４５℃で４８〜７２時間分解させると十分である。
前記過程を経て得られる分解液はその後濾過される。濾過はフリーフィルター(1μｍ)−ゼータフィルター(0.7μｍ)で構成される２段階の濾過過程を経て、未反応物質を除去する工程を包含することが好ましい。また、酵素と目的物を分離するために分離膜を用いることができる。分離膜は特に限定されないが、例えば、限外濾過膜(MWCO 10,000)で濾過することによって酵素を除去することができる。
【００１４】
前記過程を経て得られる濾過液は濃縮され、次いで、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを析出する工程が行われる。濾過液の濃縮は、真空減圧濃縮器を用いて１〜２回にわたり約４０〜６０ＢＸ程度に減圧濃縮させ、４℃の低温で１２時間ぐらい保管してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを析出させるか、濾過液から１ステップで液を完全に蒸発させて、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを析出することもできる。この場合、液の蒸発には真空バッチ結晶化装置(Vaccum batch crystallizer，QE−04−026)を用いることができる。
析出されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは、洗滌及び濾過する過程を経て濾過液を乾燥すると、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの粉末を得ることができる。前記の洗滌過程では通常エタノールが使用され、濾過過程はグラスフィルター(glass filter)によって行われることができる。なお、濾過液の乾燥過程は真空乾燥或は、熱風乾燥による。
【００１５】
本発明によって、前記全過程を経ることによって純度の高い、αキチンとβキチンの種類に拘わらず、高収率のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを得ることができることが確認された。
本発明の前記Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造方法は、酸加水分解工程が全然含まれない。さらに、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを分離するための別途の分離膜技術も要しない。
従って、本発明による製造方法は、工程の単純化を通じて経済性を提供するとともに酸加水分解工程を要しないので、この工程における廃液処理の問題なども発生することがない。
【００１６】
以下、本発明の好ましい実施例及び比較例を通じて本発明をより詳細に説明する。なお、以下の実施例は本発明の説明と理解のためであり、本発明の範囲内で多様な変形や変更が行われることができることは、当技術分野で通常の知識を有する者には自明なことといえる。
【００１７】
［実施例１］
カニのキチン(αキチン)を基質として使用した。キチンと燐酸(H3PO4)を重量比で１：４になるように燐酸にキチンを溶解して常温で１２時間放置した後、キチン量の１０倍量の水を前記溶液に撹拌しながら添加した。膨潤されたキチンは遠心分離(5,000rpm)して溶剤と分離した後、ｐＨ４．５になるまで水による洗滌又は中和を行った。
前記の過程を通じて水重量の基準で膨潤されたキチン５重量％(膨潤キチン重量対比10重量％がキチン量)に対して分解酵素３０ｕｎｉｔ/ｇキチン量を添加して４０℃で７２時間分解させた。
分解液は、フーリフィルター(1μｍ)−ゼータフィルター(0.7μｍ)で構成される２段階の濾過過程を経て未反応物質を除去し、酵素と目的物を分離するために限外濾過膜(MWCO 10,000)で濾過して酵素を除去した。
濾過液は、真空減圧濃縮器を利用して１〜２回にわたり約５０ＢＸ程度で減圧濃縮させ、４℃の低温で１２時間程度保管することによってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを析出させた。
析出されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンをエタノールで洗滌してグラスフィルターで濾過した後、真空乾燥してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの粉末５０％(キチンの重量対比、以下同)を得た。
【００１８】
［実施例２］
カニのキチン(αキチン)を基質として使用した。キチンと燐酸(H3PO4)を重量比で１：４になるように燐酸にキチンを溶解して常温で１２時間放置した後、キチン量の１０倍量の水を前記溶液に撹拌しながら添加した。膨潤されたキチンは遠心分離(5,000rpm)して溶剤と分離した後、ｐＨ４．５になるまで水による洗滌又は中和を行った。
前記の過程を通じて水重量の基準で膨潤されたキチン５重量％(膨潤キチン重量対比10重量％がキチン量)に対して分解酵素３０ｕｎｉｔ/ｇキチン量を添加して４０℃で７２時間分解させた。
分解液は、フーリフィルター(1μｍ)−ゼータフィルター(0.7μｍ)で構成される２段階の濾過過程を経て未反応物質を除去し、酵素と目的物を分離するために限外濾過膜(MWCO 10,000)で濾過して酵素を除去した。
濾過液から１ステップで液を完全に蒸発させ、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを析出させた。
析出されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンをエタノールで洗滌してグラスフィルターで濾過した後、熱風乾燥してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの粉末５１％を得た。
【００１９】
［実施例３］
エビのキチン(αキチン)を基質として使用した。キチンと燐酸(H3PO4)を重量比で１：４になるように燐酸にキチンを溶解して常温で１２時間放置した後、キチン量の１０倍量の水を前記溶液に撹拌しながら添加した。膨潤されたキチンは遠心分離(5,000rpm)して溶剤と分離した後、ｐＨ４．５になるまで水による洗滌又は中和を行った。
前記の過程を通じて水重量の基準で膨潤されたキチン５重量％(膨潤キチン重量対比10重量％がキチン量)に対して分解酵素３０ｕｎｉｔ/ｇキチン量を添加して４０℃で７２時間分解させた。
分解液は、フーリフィルター(1μｍ)−ゼータフィルター(0.7μｍ)で構成される２段階の濾過過程を経て未反応物質を除去し、酵素と目的物を分離するために限外濾過膜(MWCO 10,000)で濾過して酵素を除去した。
濾過液は、真空減圧濃縮器を利用して１〜２回にわたり約５０ＢＸ程度で減圧濃縮させ、４℃の低温で１２時間程度保管することによってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを析出させた。
析出されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンをエタノールで洗滌してグラスフィルターで濾過した後、真空乾燥してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの粉末５２％を得た。
【００２０】
［実施例４］
エビのキチン(αキチン)を基質として使用した。キチンと燐酸(H3PO4)を重量比で１：４になるように燐酸にキチンを溶解して常温で１２時間放置した後、キチン量の１０倍量の水を前記溶液に撹拌しながら添加した。膨潤されたキチンは遠心分離(5,000rpm)して溶剤と分離した後、ｐＨ４．５になるまで水による洗滌又は中和を行った。
前記の過程を通じて水重量を基準で膨潤されたキチン５重量％(膨潤キチン重量対比10重量％がキチン量)に対して分解酵素３０ｕｎｉｔ/ｇキチン量を添加して４０℃で７２時間分解させた。
分解液は、フーリフィルター(1μｍ)−ゼータフィルター(0.7μｍ)で構成される２段階の濾過過程を経て未反応物質を除去し、酵素と目的物を分離するために限外濾過膜(MWCO 10,000)で濾過して酵素を除去した。
濾過液から１ステップで液を完全に蒸発させ、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを析出させた。
析出されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンをエタノールで洗滌してグラスフィルターで濾過した後、熱風乾燥してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの粉末５０％を得た。
【００２１】
［実施例５］
イカ軟骨のキチン(βキチン)を基質として使用した。キチンを６０メッシュで粉砕した粉末を希酢酸溶液(0.075％)に重量比で２％になるように浸漬させ、１２時間放置した後、ホモジェナイザーで５，０００rpmに高速撹拌してキチンを膨潤させた。これに分解酵素３０ｕｎｉｔ/ｇキチン量を添加して４０℃で７２時間分解させた。
分解液は、フーリフィルター(1μｍ)−ゼータフィルター(0.7μｍ)で構成される２段階の濾過過程を経て未反応物質を除去し、酵素と目的物を分離するために限外濾過膜(MWCO 10,000)で濾過して酵素を除去した。
濾過液は、真空減圧濃縮器を利用して１〜２回にわたり約５０ＢＸ程度で減圧濃縮させ、４℃の低温で１２時間程度保管することによってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを析出させた。
析出されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンをエタノールで洗滌してグラスフィルターで濾過した後、真空乾燥してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの粉末７８％を得た。
【００２２】
［実施例６］
イカ軟骨のキチン(βキチン)を基質として使用した。キチンを６０メッシュで粉砕した粉末を希酢酸溶液(0.075％)に重量比で２％になるように浸漬させ、１２時間放置した後、ホモジェナイザーで５，０００rpmに高速撹拌してキチンを膨潤させた。これに分解酵素３０ｕｎｉｔ/ｇキチン量を添加して４０℃で７２時間分解させた。
分解液は、フーリフィルター(1μｍ)−ゼータフィルター(0.7μｍ)で構成される２段階の濾過過程を経て未反応物質を除去し、酵素と目的物を分離するために限外濾過膜(MWCO 10,000)で濾過して酵素を除去した。
濾過液から１ステップで液を完全に蒸発させてＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを析出させた。
析出されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンをエタノールで洗滌してグラスフィルターで濾過した後、熱風乾燥してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの粉末７５％を得た。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明によれば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造を、従来より単純かつ低コストで行うことができるのみならず、環境に対する負荷をより少なく実施することができる。したがって、本発明は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造業および関連産業の発展に寄与するところ大である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キチンからＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造する方法に係り、より詳細には、従来の酸加水分解工程を経ることなしにも、キチンからＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを得ることができるため、製造工程の簡略化及び親環境的なＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは、エビ、カニなどの甲殻類、イカの軟骨、カブトムシなどの昆虫類や真菌類の細胞壁などに含まれている、キチンの構成単位として自然界に広く存在する単糖類の１種である。
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造と関連して、特許文献１によると、先ず、キチンを、酸(塩酸、ギ酸、硫酸など)により部分加水分解し、水酸化ナトリウム溶液で中和した後、濾過して残存物を除去し、この溶液をイオン交換膜電気透析法によって脱塩処理して、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＮ−アセチルキトオリゴ糖を製造する。ここに、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖に対して加水部分解能を有する酵素を作用させてＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの含量を高めることによって、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造する方法が開示されている。
【０００３】
しかし、このような製造方法は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを得るために、原料であるキチンを対象として酸加水分解段階及び脱塩処理段階を必要とするので、その工程が煩雑であり、また、発生する廃水処理の問題だけでなく、得られたＮ−アセチルキトオリゴ糖とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの混合物からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを選択的に分離するための別途の分離膜技術を必要とするため、経済性が低いという問題がある。
【特許文献１】特開２０００-２８１６９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、前記のような従来技術が有する問題を解決するためになされたものであって、本発明の目的は、従来の酸加水分解及び脱塩工程を経ることなしにも、キチンからＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを得ることができるため、製造工程の簡略化及び親環境的なＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明はキチンを膨潤させる段階；及び
膨潤したキチンにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン分解酵素を加えて酵素反応させ、キチンの酵素分解液を得る段階を包含するＮ-アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造方法を提供する。
【０００６】
本発明は、好ましくは前記キチンが、αキチン、またはβキチンであるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造方法を提供する。
本発明は、好ましくは前記キチンを膨潤させる段階が、αキチンを燐酸に溶解させる段階と、所定量の水を加えて膨潤させたαキチンを溶剤から分離させる段階を包含する。
本発明は、好ましくは前記キチンを膨潤させる段階が、βキチンを粉末化させる段階と、前記βキチンの粉末を希酢酸溶液に浸漬させ、所定の時間放置した後、撹拌する段階を包含する。
本発明は、好ましくは前記分解酵素がトリコデルマ・レセイ(Trichoderma reesei)由来のエキソ型キチナーゼ又は、セルロモナス種(Cellulomonas sp.)由来のエキソ型キチナーゼであることを特徴とする。
本発明は、好ましくは前記分解酵素が、α膨潤キチン５重量％(水の重量基準)を基準として２０〜４０ｕｎｉｔ/ｇキチン量になるように添加することを特徴とする。
本発明は、好ましくは前記分解酵素が、βキチン２重量％(希酢酸溶液重量基準)を基準として２０〜４０ｕｎｉｔ/ｇキチン量になるように添加することを特徴とする。
【０００７】
又、本発明は、好ましくは酵素分解液を２段階にで濾過することにより未反応物質を除去し、さらに分離膜で濾過して酵素を除去する段階と、
前記分離膜を通過した濾過液を減圧濃縮し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを析出する段階と、
前記析出されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを洗滌及び濾過した後、乾燥してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの粉末を得る段階をさらに包含することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
上述のように、本発明によれば、従来の酸加水分解工程を経ることなく、単にキチンを膨潤させて酵素処理することによりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造するため、工程の単純化及び費用節減の効果が高く、かつ親環境的な製造工程が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の内容をより詳細に説明する。
本発明に用いられるキチンの原料としては、αキチン又はβキチンが挙げられる。αキチンは、２つの分子間の鎖が逆方向に平行になるように配列されているキチンであり、このようなキチンは、カニ、又はエビなどの甲殻類の殻に含有されている。βキチンは、分子間の鎖が同一方向に平行に配列されているキチンであり、このようなキチンは、イカなどの軟体動物の軟骨に含有されている。
【００１０】
本発明は、既存の酸加水分解工程を必要としなく、キチンを膨潤処理し、ここにキチン分解酵素を反応させてＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを製造する簡単な工程を提供する。
キチンの膨潤処理は、分解酵素の酵素反応を容易にし、キチンの種類によって具体的な処理工程は異なる場合もあるが、後述する２つの方法を例示することができる。
【００１１】
キチンが、αキチンである場合の膨潤処理は以下のとおりである。すなわちキチンと燐酸(H3PO4)を重量比で１：２〜１：６、好ましくは１：３〜１：５、より好ましくは１：３．５〜１：４．５になるように燐酸にキチンを溶解した後、常温で一定の時間放置する。放置時間は、夏の場合は２〜３時間の短時間で十分であり、冬の場合は２４時間程度まで放置することが良い。放置した後の前記溶液にキチン量の８〜１２倍量の水、好ましくは９〜１１倍量の水を前記溶液に撹拌しながら添加する。
一方、キチンが、βキチンである場合には、キチンを６０〜８０メッシュで粉砕した粉末を希酢酸溶液(０．０７５％)に重量比で０．１〜１０％、好ましくは０．５〜７％、より好ましくは１〜３％になるように浸漬させ、３〜６時間放置した後、ホモジェナイザーで３,０００〜５，０００rpmに高速撹拌してキチンを膨潤させることができる。
【００１２】
これによって、キチンは膨潤され、膨潤されたキチンは溶剤と分離させる。膨潤されたキチンの溶剤との分離過程は遠心分離３,０００〜５，０００rpmまたはフィルタープレス(filter press)、ドラムフィルターなどを用いることができる。
膨潤処理されたキチンを溶剤と分離した後、酵素の最適温度であるｐＨ４．０〜６．０、好ましくはｐＨ４．２〜５．５になるまで水による洗滌又は中和を行う。
前記酵素反応は、分解酵素を前記膨潤処理されたキチンに添加して行われる。本発明に使用することができる分解酵素としてはトリコデルマ・レセイ由来のエキソ型キチナーゼ、セルロモナス種由来のエキソ型キチナーゼなどがある。
【００１３】
酵素反応は、使用される具体的な酵素、酵素の力価、基質の種類及び濃度などによって異なることができる。例えば、キチンが、αキチンである場合、水重量の基準で膨潤されたキチン５重量％(膨潤キチンの重量対比１０重量％がキチン量)に対して分解酵素２０〜４０unit/gキチン量、好ましくは２５〜３５unit/gキチン量を添加して３５〜４５℃で４８〜７２時間分解させると十分である。一方、キチンが、βキチンである場合、希酢酸溶液を基準としてキチン２重量％に対して２０〜４０unit/gキチン量、好ましくは２５〜３５unit/gキチン量を添加して３５〜４５℃で４８〜７２時間分解させると十分である。
前記過程を経て得られる分解液はその後濾過される。濾過はフリーフィルター(1μｍ)−ゼータフィルター(0.7μｍ)で構成される２段階の濾過過程を経て、未反応物質を除去する工程を包含することが好ましい。また、酵素と目的物を分離するために分離膜を用いることができる。分離膜は特に限定されないが、例えば、限外濾過膜(MWCO 10,000)で濾過することによって酵素を除去することができる。
【００１４】
前記過程を経て得られる濾過液は濃縮され、次いで、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを析出する工程が行われる。濾過液の濃縮は、真空減圧濃縮器を用いて１〜２回にわたり約４０〜６０ＢＸ程度に減圧濃縮させ、４℃の低温で１２時間ぐらい保管してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを析出させるか、濾過液から１ステップで液を完全に蒸発させて、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを析出することもできる。この場合、液の蒸発には真空バッチ結晶化装置(Vaccum batch crystallizer，QE−04−026)を用いることができる。
析出されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは、洗滌及び濾過する過程を経て濾過液を乾燥すると、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの粉末を得ることができる。前記の洗滌過程では通常エタノールが使用され、濾過過程はグラスフィルター(glass filter)によって行われることができる。なお、濾過液の乾燥過程は真空乾燥或は、熱風乾燥による。
【００１５】
本発明によって、前記全過程を経ることによって純度の高い、αキチンとβキチンの種類に拘わらず、高収率のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを得ることができることが確認された。
本発明の前記Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造方法は、酸加水分解工程が全然含まれない。さらに、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを分離するための別途の分離膜技術も要しない。
従って、本発明による製造方法は、工程の単純化を通じて経済性を提供するとともに酸加水分解工程を要しないので、この工程における廃液処理の問題なども発生することがない。
【００１６】
以下、本発明の好ましい実施例及び比較例を通じて本発明をより詳細に説明する。なお、以下の実施例は本発明の説明と理解のためであり、本発明の範囲内で多様な変形や変更が行われることができることは、当技術分野で通常の知識を有する者には自明なことといえる。
【００１７】
［実施例１］
カニのキチン(αキチン)を基質として使用した。キチンと燐酸(H3PO4)を重量比で１：４になるように燐酸にキチンを溶解して常温で１２時間放置した後、キチン量の１０倍量の水を前記溶液に撹拌しながら添加した。膨潤されたキチンは遠心分離(5,000rpm)して溶剤と分離した後、ｐＨ４．５になるまで水による洗滌又は中和を行った。
前記の過程を通じて水重量の基準で膨潤されたキチン５重量％(膨潤キチン重量対比10重量％がキチン量)に対して分解酵素３０ｕｎｉｔ/ｇキチン量を添加して４０℃で７２時間分解させた。
分解液は、フーリフィルター(1μｍ)−ゼータフィルター(0.7μｍ)で構成される２段階の濾過過程を経て未反応物質を除去し、酵素と目的物を分離するために限外濾過膜(MWCO 10,000)で濾過して酵素を除去した。
濾過液は、真空減圧濃縮器を利用して１〜２回にわたり約５０ＢＸ程度で減圧濃縮させ、４℃の低温で１２時間程度保管することによってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを析出させた。
析出されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンをエタノールで洗滌してグラスフィルターで濾過した後、真空乾燥してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの粉末５０％(キチンの重量対比、以下同)を得た。
【００１８】
［実施例２］
カニのキチン(αキチン)を基質として使用した。キチンと燐酸(H3PO4)を重量比で１：４になるように燐酸にキチンを溶解して常温で１２時間放置した後、キチン量の１０倍量の水を前記溶液に撹拌しながら添加した。膨潤されたキチンは遠心分離(5,000rpm)して溶剤と分離した後、ｐＨ４．５になるまで水による洗滌又は中和を行った。
前記の過程を通じて水重量の基準で膨潤されたキチン５重量％(膨潤キチン重量対比10重量％がキチン量)に対して分解酵素３０ｕｎｉｔ/ｇキチン量を添加して４０℃で７２時間分解させた。
分解液は、フーリフィルター(1μｍ)−ゼータフィルター(0.7μｍ)で構成される２段階の濾過過程を経て未反応物質を除去し、酵素と目的物を分離するために限外濾過膜(MWCO 10,000)で濾過して酵素を除去した。
濾過液から１ステップで液を完全に蒸発させ、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを析出させた。
析出されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンをエタノールで洗滌してグラスフィルターで濾過した後、熱風乾燥してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの粉末５１％を得た。
【００１９】
［実施例３］
エビのキチン(αキチン)を基質として使用した。キチンと燐酸(H3PO4)を重量比で１：４になるように燐酸にキチンを溶解して常温で１２時間放置した後、キチン量の１０倍量の水を前記溶液に撹拌しながら添加した。膨潤されたキチンは遠心分離(5,000rpm)して溶剤と分離した後、ｐＨ４．５になるまで水による洗滌又は中和を行った。
前記の過程を通じて水重量の基準で膨潤されたキチン５重量％(膨潤キチン重量対比10重量％がキチン量)に対して分解酵素３０ｕｎｉｔ/ｇキチン量を添加して４０℃で７２時間分解させた。
分解液は、フーリフィルター(1μｍ)−ゼータフィルター(0.7μｍ)で構成される２段階の濾過過程を経て未反応物質を除去し、酵素と目的物を分離するために限外濾過膜(MWCO 10,000)で濾過して酵素を除去した。
濾過液は、真空減圧濃縮器を利用して１〜２回にわたり約５０ＢＸ程度で減圧濃縮させ、４℃の低温で１２時間程度保管することによってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを析出させた。
析出されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンをエタノールで洗滌してグラスフィルターで濾過した後、真空乾燥してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの粉末５２％を得た。
【００２０】
［実施例４］
エビのキチン(αキチン)を基質として使用した。キチンと燐酸(H3PO4)を重量比で１：４になるように燐酸にキチンを溶解して常温で１２時間放置した後、キチン量の１０倍量の水を前記溶液に撹拌しながら添加した。膨潤されたキチンは遠心分離(5,000rpm)して溶剤と分離した後、ｐＨ４．５になるまで水による洗滌又は中和を行った。
前記の過程を通じて水重量を基準で膨潤されたキチン５重量％(膨潤キチン重量対比10重量％がキチン量)に対して分解酵素３０ｕｎｉｔ/ｇキチン量を添加して４０℃で７２時間分解させた。
分解液は、フーリフィルター(1μｍ)−ゼータフィルター(0.7μｍ)で構成される２段階の濾過過程を経て未反応物質を除去し、酵素と目的物を分離するために限外濾過膜(MWCO 10,000)で濾過して酵素を除去した。
濾過液から１ステップで液を完全に蒸発させ、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを析出させた。
析出されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンをエタノールで洗滌してグラスフィルターで濾過した後、熱風乾燥してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの粉末５０％を得た。
【００２１】
［実施例５］
イカ軟骨のキチン(βキチン)を基質として使用した。キチンを６０メッシュで粉砕した粉末を希酢酸溶液(0.075％)に重量比で２％になるように浸漬させ、１２時間放置した後、ホモジェナイザーで５，０００rpmに高速撹拌してキチンを膨潤させた。これに分解酵素３０ｕｎｉｔ/ｇキチン量を添加して４０℃で７２時間分解させた。
分解液は、フーリフィルター(1μｍ)−ゼータフィルター(0.7μｍ)で構成される２段階の濾過過程を経て未反応物質を除去し、酵素と目的物を分離するために限外濾過膜(MWCO 10,000)で濾過して酵素を除去した。
濾過液は、真空減圧濃縮器を利用して１〜２回にわたり約５０ＢＸ程度で減圧濃縮させ、４℃の低温で１２時間程度保管することによってＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを析出させた。
析出されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンをエタノールで洗滌してグラスフィルターで濾過した後、真空乾燥してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの粉末７８％を得た。
【００２２】
［実施例６］
イカ軟骨のキチン(βキチン)を基質として使用した。キチンを６０メッシュで粉砕した粉末を希酢酸溶液(0.075％)に重量比で２％になるように浸漬させ、１２時間放置した後、ホモジェナイザーで５，０００rpmに高速撹拌してキチンを膨潤させた。これに分解酵素３０ｕｎｉｔ/ｇキチン量を添加して４０℃で７２時間分解させた。
分解液は、フーリフィルター(1μｍ)−ゼータフィルター(0.7μｍ)で構成される２段階の濾過過程を経て未反応物質を除去し、酵素と目的物を分離するために限外濾過膜(MWCO 10,000)で濾過して酵素を除去した。
濾過液から１ステップで液を完全に蒸発させてＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを析出させた。
析出されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンをエタノールで洗滌してグラスフィルターで濾過した後、熱風乾燥してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの粉末７５％を得た。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明によれば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造を、従来より単純かつ低コストで行うことができるのみならず、環境に対する負荷をより少なく実施することができる。したがって、本発明は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造業および関連産業の発展に寄与するところ大である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キチンを膨潤させる段階；及び
膨潤した前記キチンにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン分解酵素を加えて酵素反応させ、キチンの酵素分解液を得る段階を包含するＮ-アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造方法。
【請求項２】
キチンが、αキチン、又はβキチンであることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
キチンを膨潤させる段階が、αキチンを燐酸に溶解させる段階と、
所定量の水を添加して膨潤させたαキチンを溶剤から分離させる段階とを包含することを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
水の添加を、膨潤したαキチン全体の重量に対して１０重量％の量のαキチンに、膨潤したαキチンの量が前記水に対して５重量％となるように行い、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン分解酵素の添加を、２０〜４０unit/gキチンの量で行うことを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記キチンを膨潤させる段階が、βキチンを粉末化させる段階と、
前記βキチンの粉末を希酢酸溶液に浸漬させ、所定の時間放置した後、撹拌する段階とを包含することを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
【請求項６】
希酢酸溶液の添加を、膨潤したβキチンの量が前記希酢酸溶液に対して２重量％となるように行い、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン分解酵素の添加を、２０〜４０unit/gキチンの量で行うことを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン分解酵素が、トリコデルマ・レセイ由来のエキソ型キチナーゼ又はセルロモナス種由来のエキソ型キチナーゼであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
酵素分解液を２段階で濾過することにより未反応物質を除去し、さらに分離膜で濾過して酵素を除去する段階と、
前記分離膜を通過した濾過液を減圧濃縮し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを析出する段階と、
前記析出されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを洗滌及び濾過した後、乾燥してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの粉末を得る段階とをさらに包含する請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１】
キチンを膨潤させる段階；及び
膨潤した前記キチンにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン分解酵素を加えて酵素反応させ、キチンの酵素分解液を得る段階を包含するＮ-アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造方法。
【請求項２】
キチンが、αキチン、又はβキチンであることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
キチンを膨潤させる段階が、αキチンを燐酸に溶解させる段階と、
所定量の水を添加して膨潤させたαキチンを溶剤から分離させる段階とを包含することを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
水の添加を、膨潤したαキチン全体の重量に対して１０重量％の量のαキチンに、膨潤したαキチンの量が前記水に対して５重量％となるように行い、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン分解酵素の添加を、２０〜４０unit/gキチンの量で行うことを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記キチンを膨潤させる段階が、βキチンを粉末化させる段階と、
前記βキチンの粉末を希酢酸溶液に浸漬させ、所定の時間放置した後、撹拌する段階とを包含することを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
【請求項６】
希酢酸溶液の添加を、膨潤したβキチンの量が前記希酢酸溶液に対して２重量％となるように行い、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン分解酵素の添加を、２０〜４０unit/gキチンの量で行うことを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン分解酵素が、トリコデルマ・レセイ由来のエキソ型キチナーゼ又はセルロモナス種由来のエキソ型キチナーゼであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
酵素分解液を２段階で濾過することにより未反応物質を除去し、さらに分離膜で濾過して酵素を除去する段階と、
前記分離膜を通過した濾過液を減圧濃縮し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを析出する段階と、
前記析出されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを洗滌及び濾過した後、乾燥してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの粉末を得る段階とをさらに包含する請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【公開番号】特開２００７−９７４６６（Ｐ２００７−９７４６６Ａ）
【公開日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２９１０５８（Ｐ２００５−２９１０５８）
【出願日】平成１７年１０月４日（２００５．１０．４）
【出願人】（５０５３７１３４６）株式会社キットライフ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＫＩＴＴＯ ＬＩＦＥ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月４日（２００５．１０．４）
【出願人】（５０５３７１３４６）株式会社キットライフ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＫＩＴＴＯ ＬＩＦＥ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【Ｆターム（参考）】
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