金微粒子とその製造方法、およびその用途
【課題】特定の有機物が吸着したロッド形状の金微粒子と、該金微粒子を目標部位へ集積させる方法とその応用技術を提供する。
【解決手段】分散媒に相溶する部位(Ａ)と特定酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含有する有機物で修飾したナノサイズのロッド形状の金微粒子（金ナノロッド）、および、基質ペプチド(Ｂ)がプロテアーゼにより分解され、部位(Ａ)がロッド形状の金微粒子から脱離し、プロテアーゼの発現している特定部位に該金微粒子を凝集させる方法、および該方法を利用した治療方法等。
【解決手段】分散媒に相溶する部位(Ａ)と特定酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含有する有機物で修飾したナノサイズのロッド形状の金微粒子（金ナノロッド）、および、基質ペプチド(Ｂ)がプロテアーゼにより分解され、部位(Ａ)がロッド形状の金微粒子から脱離し、プロテアーゼの発現している特定部位に該金微粒子を凝集させる方法、および該方法を利用した治療方法等。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分散媒に相溶する部位(Ａ)と特定酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含有する有機物によって修飾したナノサイズのロッド形状の金微粒子（金ナノロッド）と、その製造方法と、その集積方法、およびその用途に関する。
【０００２】
本発明は、より具体的には、金ナノロッドへのリンカーである基質ペプチド部位が特定の酵素により分解されると、分散媒に相溶する部位が金ナノロッドから脱離して分散安定性が失われ、金ナノロッドが凝集することを利用した特定物質の検出方法と金ナノロッドの特定部位への集積方法などに関する。本発明の技術は、金ナノロッドが集積した部位のフォトサーマル治療やバイオイメージング、そして特定の酵素が存在する部位への薬物輸送方法として有用である。
【背景技術】
【０００３】
溶媒中に分散した金属微粒子に光を照射すると局在表面プラズモン共鳴（Localized Surface Plasmon resonance：ＬＳＰＲ）と呼ばれる共鳴吸収現象が生じる。この吸収現象は金属の種類と形状、そして金属微粒子周囲における媒体の屈折率によって吸収波長が決定される。例えば、球状の金微粒子が水に分散した場合は５３０nm付近に吸収域を持ち、金微粒子の形状を短軸１０ｎｍ程度のロッド状（金ナノロッド）にすると、ロッドの短軸に起因する５３０nm付近の吸収の他に、ロッドの長軸に起因する長波長側の吸収を有することが知られている（非特許文献１）。
【０００４】
これらの金属微粒子分散液は、低分子化合物や高分子化合物を保護剤として金属微粒子表面に吸着ないし結合させることによって、金属微粒子が凝集することなく安定に溶媒に分散させることができる。特に金ナノロッドは形状の変化や凝集状態変化、金ナノロッド周辺の環境によって分光特性が変化する特異な金微粒子であり（非特許文献２、３、４）、近赤外光をプローブとして用いる新しい分光分析の材料として可能性がある。
【０００５】
金ナノロッドはアスペクト比（長軸長さ／短軸長さ）が１より大きいロッド状のナノサイズの金微粒子であり、例えば、カチオン性界面活性剤である第四級アンモニウム塩のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）に溶解した水中で合成され、ＣＴＡＢ水溶液中の金イオンを化学還元、電気還元、光還元などによって合成することが可能であり、合成した金ナノロッドはＣＴＡＢの保護作用によって水中で安定に分散している（特許文献１、２、３、４）。
【０００６】
近年、金ナノロッドにアビジン−ビオチン、抗原−抗体などの相互作用による目的物質への特異的な吸着反応を利用した研究が報告されている（非特許文献５）。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）ゲルで埋包された金ナノロッドは、ＬＳＰＲを利用した光熱変換により担持物質を放出可能であることが報告されている（非特許文献６）。また、酵素基質ペプチドの両端に脂質と水溶性高分子を結合した結合体を組み込んだコロイダルキャリアーに薬物を担持したドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）が報告されている（特許文献５）。また、貴金属微粒子のＬＳＰＲをセンシング分野へ応用した開発が行われている（非特許文献７、８、特許文献６）。
【０００７】
非特許文献５によると、金ナノロッドを重量平均分子量１４０００のＰＳＳで表面処理しておき、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とした抗体をＰＳＳ処理した金ナノロッドに吸着させており、抗体を介してがん細胞に金ナノロッドを取り込ませることによって、金ナノロッドの二光子発光によるがん細胞のイメージングが可能であることを報告している。
【０００８】
非特許文献６の方法によると、金ナノロッドをＮＩＰＡＭで埋包した微粒子に担持した物質の放出が報告されている。ＬＳＰＲに相当する光を照射された金ナノロッドは光熱変換機能により周囲のＮＩＰＡＭを加熱し、感熱性樹脂であるＮＩＰＡＭは温度が上昇すると下限臨界共溶温度を境に親水性から疎水性に変化し、ＮＩＰＡＭ中に担持された物質が水とともに放出されることを報告している。
【０００９】
特許文献５によると、酵素基質ペプチドの両端に脂質と水溶性高分子を結合した結合体を組み込んだコロイダルキャリアーに薬物を担持しておき、疾患組織から特異的に分泌される酵素との特異的反応により酵素基質ペプチド部分が分解・切断されることで担持されている薬物が標的組織に放出されることを利用して、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）を構築可能である。
【００１０】
非特許文献７の方法によると、重量平均分子量５０００のチオール末端ポリエチレングリコールで被覆した金ナノロッドを、アミノプロピルトリエトキシシランで表面処理したガラス基板上に固定化し、メルカプトヘキサデカン酸とのカルボジイミド結合で捕捉物質となる抗体（rabbit IgG）を金ナノロッドに導入した分析用チップを作製しており、特異的に結合する抗体（goat antirabbit IgG）と、非特異的に結合する抗体（goat antimouse IgG）を接触させた場合における分析用チップの金ナノロッドによるＬＳＰＲの吸収スペクトルの変化を検出している。
【００１１】
非特許文献８の方法によると、メルカプトプロピルトリエトキシシランで表面処理したガラスに金ナノロッドを固定化し、その基板をポリアリルアミン塩酸塩（ＰＡＨ）とポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳ）を交互に１０回ずつ、計２０層のポリマー層で被覆した基板にビオチンを捕捉物質として修飾した分析用チップを作製しており、検出対象の標的物質であるストレプトアビジンと結合して生じた金ナノロッドによるＬＳＰＲの吸収スペクトルの変化を検出している。
【００１２】
特許文献６によると、金属微粒子（直径１０〜２０ｎｍの金微粒子）を任意の基板上に固定化したＬＳＰＲセンサーを検討しており、液体内に配置したＬＳＰＲセンサーに対して光を照射し、基板に固定された金属微粒子を透過した光の吸光度を測定することにより、基板に固定された金属微粒子近傍の媒質の屈折率を検出し、検出結果に応じてＬＳＰＲセンサーが配置された液体の屈折率を測定することが可能である。
【００１３】
非特許文献９の方法によると、ビオチン、またはアビジンで修飾されたデキストラン被覆酸化鉄微粒子に、マトリクスメタロプロテアーゼの基質ペプチドを結合させ、酸化鉄と結合している基質ペプチドにポリエチレングリコールを導入し立体的な反発力で、ビオチンとアビジンの結合による酸化鉄微粒子の集合を抑止している。この基質ペプチドは、マトリクスメタロプロテアーゼの酵素反応により分解されると、ポリエチレングリコールが酸化鉄微粒子から脱離し、ビオチンとアビジンの結合で酸化鉄微粒子が集合することを利用して、ＭＲＩの造影能の変化を検討している。
【００１４】
【非特許文献１】S.Link,M.B.Mohamed,M.A.El-Sayed,J.Phys.Chem.B,103,p3073（1999）
【非特許文献２】K.Honda,Y.Niidome,N.Nakashima,H.Kawazumi,S.Yamada,Chem.Lett.,35,p854（2006）
【非特許文献３】Y.Niidome,H.Takahashi,S.Urakawa,K.Nishioka,S.Yamada,Chem.Lett.,33,p454（2004）
【非特許文献４】S.Link,M.A.El-Sayed,J.Phys.Chem.B,109,p10531（2005）
【非特許文献５】N.J.Durr,T.Larson,D.K.Smith,B.A.Korgel,K.Sokolov,A.Ben-Yakar,Nano Letters,7,p941（2007）
【非特許文献６】A.Shiotami,T.Mori,T.Niidome,Y.Niidome,Y.Katayama,Langmuir,23,p4012 (2007)
【非特許文献７】K.M.Mayer,S.Lee,H.Liao,B.C.Rostro,A.Fuentes,P.T.Scully,C.L.Nehl,J.H.Hafner,ACS NANO,（2008）
【非特許文献８】S.M.Marinakos,S.Chen,A.Chilkoti,Anal.Chem.,79,p5278（2007）
【非特許文献９】T.J.Harris,G.von Maltzahn,A.M.Derfus,E.Ruoslahti,S.N.Bhatia,Angew.Chem.Int.Ed.,45,p3161(2006)
【特許文献１】特開２００４−２９２６２７号公報
【特許文献２】特開２００５−９７７１８号公報
【特許文献３】特開２００６−１６９５４４号公報
【特許文献４】特開２００６−１１８０３６号公報
【特許文献５】ＷＯ２００４／０６３２１６
【特許文献６】特開２０００−３５６５８７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
特許文献１〜４などの方法で合成された金ナノロッドはＣＴＡＢに被覆された状態で水中に分散しているが、特定部位で凝集・集積する機能は有していない。
【００１６】
非特許文献５は、金ナノロッドをＰＳＳで表面処理後に抗体と結合させているが、金ナノロッドの二光子発光を測定するための処理方法であり、金ナノロッドのＬＳＰＲをセンシング技術やバイオイメージングに応用したものではない。
【００１７】
非特許文献６の粒子は、ＮＩＰＡＭ中の担持物質を輸送・放出することは可能であるが、標的組織を認識して担持物質を放出する機能は有していない。
【００１８】
非特許文献７は、検出対象物質の捕捉により生じる金ナノロッド周囲の屈折率の変化に伴う吸収スペクトルの変化を検出原理とする分析用チップと分析方法であるが、分析用チップの作製には２０回の高分子膜をコーティングする必要がある。また、分析用チップが標的物質を検出した場合の金ナノロッドによる吸収スペクトルの変化は最大吸収波長のシフト量が４nm未満であり検出感度は低い。非特許文献８も非特許文献７と同様に、検出対象物質の捕捉により生じる金ナノロッド周囲の屈折率の変化に伴う吸収スペクトルの変化を検出原理とする分析用チップと分析方法であるが、分析用チップの作製には煩雑な工程を必要とする。また、分析用チップが標的物質を検出した場合の金ナノロッドによる吸収スペクトルの変化は最大吸収波長のシフト量が１０nm未満であり検出感度は低い。
【００１９】
特許文献５は、標的組織に存在する酵素を認識して薬物を放出するＤＤＳは構築可能であるが、薬物を放出した後はコロイダルキャリアーが分解されてしまうため伝達物質としての機能しかなく、標的組織に残存してマーカーとなる機能はなかった。また、特定物質を認識して変化を起こすセンシング素子としての機能はなかった。
【００２０】
特許文献６の金微粒子は、球状金微粒子のＬＳＰＲを利用して、特定物質の吸着による微粒子近傍の媒質による屈折率の変化を吸光度で測定するセンシング技術に関するものであるが、金ナノロッドを使用したものではなく、測定に利用できる吸収波長域は球状金微粒子を使用しているため５３０ｎｍ付近と限られている。また、特許文献６の免疫センサー用デバイスは、高分子で被覆した金属薄膜の表面プラズモン共鳴を分析センサーに応用しているが、金属微粒子のＬＳＰＲの吸収波長を利用したものではない。
【００２１】
非特許文献９の酸化鉄微粒子は、特定の酵素による基質ペプチドの分解とビオチン−アビジンによる結合を利用して酸化鉄微粒子を集合（凝集）させており、その酵素量や酸化鉄濃度の関係で磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）のＴ２緩和時間を調整する技術であり、金属微粒子の凝集で生ずるＬＳＰＲの大きな吸収スペクトル変化をセンシング技術やバイオイメージングに応用したものではない。
【００２２】
本発明は従来の上記技術では知られていない金ナノロッドの新規技術を提供する。具体的には、基質ペプチドと分散媒に相溶する部位からなる有機物を吸着した金ナノロッドとその製造方法を提供するものであり、さらに金ナノロッドの凝集を利用した特定物質の検出と金ナノロッドの特定部位への集積方法、そして金ナノロッドを集積させた特定部位へのフォトサーマル治療、バイオイメージング、及び薬物伝達システムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、以下に示す構成を有する金微粒子とその製造方法に関する。
〔１〕分散媒に相溶する部位(Ａ)と、特定の酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物によって修飾されているロッド形状の金微粒子であって、上記有機物が基質ペプチド(Ｂ)の部位をリンカーとして吸着していることを特徴とする金微粒子。
〔２〕分散媒に相溶する部位(Ａ)の一方の末端が基質ペプチド(Ｂ)と反応する官能基を有し、基質ペプチド(Ｂ)の一方の末端が上記部位(Ａ)の官能基と反応する一級アミンを有し、基質ペプチド(Ｂ)の他方の末端が金ナノロッドに吸着するチオール基を有する有機物によって修飾されている上記[１]の金微粒子。
〔３〕部位(Ａ)が水溶性高分子である上記[１]または上記[２]の金微粒子。
〔４〕部位(Ａ)が重合平均分子量４００００以下のポリエチレングリコールである上記[１]〜上記[３]の何れかに記載する金微粒子。
〔５〕基質ペプチド(Ｂ)がプロテアーゼの基質ペプチドである上記[１]〜上記[４]の何れかに記載する金微粒子。
〔６〕基質ペプチド(Ｂ)が部位特異的に発現しているプロテアーゼにより分解される基質ペプチドである上記[５]に記載する金微粒子。
〔７〕基質ぺプチド(Ｂ)が病巣特異的に発現しているプロテアーゼにより分解される基質ペプチドである上記[５]に記載する金微粒子。
〔８〕基質ペプチド(Ｂ)が、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター(ｕＰＡ)基質ペプチド、マトリクスメタロプロテアーゼ基質ペプチドから選ばれる基質ペプチドである上記[５]に記載する金微粒子。
〔９〕基質ペプチド(Ｂ)が、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター(ｕＰＡ)または／およびマトリクスメタロプロテアーゼで分解されるトリプシン基質ペプチド、キモトリプシン基質ペプチドから選ばれる基質ペプチドである上記[５]に記載する金微粒子。
〔１０〕長軸長さ４００ｎｍ未満であってアスペクト比が１より大きく、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００ｎｍの範囲である上記[１]〜上記[９]の何れかに記載する金微粒子。
〔１１〕基質ペプチド(Ｂ)がプロテアーゼにより分解され、部位(Ａ)がロッド形状の金微粒子から脱離し、プロテアーゼの発現している特定部位で該金微粒子が凝集する上記[１]〜上記[１０]の何れかに記載する金微粒子。
〔１２〕分散媒に相溶する部位(Ａ)を含む有機物と、基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物とを反応させて、部位(Ａ)と基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物を合成する工程、該有機物の基質ペプチド(Ｂ)をリンカーとしてロッド形状の金微粒子に吸着させる工程を有する表面修飾金微粒子の製造方法。
〔１３〕両末端にメトキシ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を含むポリエチレングリコールと、一級アミンとチオール基を含むウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）基質ペプチドを、溶媒に溶解し、塩基を加えて攪拌し、反応させて、分散媒に相溶する部位(Ａ)と特定の酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物を合成し、該有機物によって金ナノロッドを表面処理する表面修飾金微粒子の製造方法。
【００２４】
また、本発明は上記金微粒子を利用した集積方法、および該集積方法を利用した用途に関する。
〔１４〕上記[１１]に記載する凝集によって特定部位にロッド形状の金微粒子を集めることを特徴とする金微粒子の集積方法。
〔１５〕部位(Ａ)と基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物のロッド形状の金微粒子への吸着量によって、特定部位に該金微粒子が凝集する時間を調整する上記[１４]に記載する金微粒子の集積方法。
〔１６〕上記[１４]または上記[１５]に記載する金微粒子の凝集によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルの変化で特定物質を検出することを特徴とする特定物質の検出方法。
〔１７〕上記[１４]または上記[１５]に記載する金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルを観察することを特徴とするバイオイメージング。
〔１８〕上記[１４]または上記[１５]に記載する集積方法によって生じる金微粒子の集積部位に、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、集積部位周辺の細胞を該金微粒子の光熱変換により発生した熱で死滅させることを特徴とするフォトサーマル治療。
〔１９〕上記[１４]または上記[１５]に記載する集積方法によって生じる金微粒子の集積部位に、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、集積部位周辺の細胞を該金微粒子の光熱変換によって発生した熱で該金微粒子に担持させた薬物を放出させることを特徴とするドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の金微粒子は、分散媒に相溶する部位と基質ペプチドを含有する有機物によって修飾され、基質ペプチドがリンカーとして金ナノロッドに吸着した金微粒子であり、特定の酵素によって基質ペプチドが分解されると、分散媒への相溶する部位が金ナノロッドから脱離するため、金ナノロッドの凝集が発生し、特定の酵素が存在する部位へ金ナノロッドを集積することができる。
【００２６】
また、本発明の金微粒子は、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００nmの範囲の金ナノロッドを用いているので、凝集・集積によってＬＳＰＲの分光特性が変化することを利用して、基質ペプチドに対して基質特異的な酵素を検出することができる。
【００２７】
さらに、金ナノロッドは光熱変換機能を有するので、金ナノロッドを集積させた部位周辺組織へのフォトサーマル治療、バイオイメージング、そしてドラックデリバリーシステムの構築が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明を実施形態に基づいて具体的に説明する。なお、濃度の％は特に示さない限り質量％である。
【００２９】
本発明の金微粒子は、分散媒に相溶する部位(Ａ)と、特定の酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物によって修飾されているロッド形状の金微粒子であって、上記有機物が基質ペプチド(Ｂ)の部位をリンカーとして吸着していることを特徴とする金微粒子である。
【００３０】
本発明の集積方法は、上記金ナノロッドを修飾している有機物の分解を利用したものであり、酵素により基質ペプチドが分解され、分散媒へ相溶する部位が金ナノロッドから脱離するため、金ナノロッドの凝集が発生し、特定の酵素が存在する部位へ金ナノロッドを集積することを利用したものである。
【００３１】
本発明の特定物質の検出方法は、上記金ナノロッドの集積方法を利用したものであり、金ナノロッドの凝集・集積によってＬＳＰＲの分光特性や散乱光強度が変化することを利用して、本発明の基質ペプチドに基質特異的な酵素を検出するものである。
【００３２】
本発明のフォトサーマル治療は、上記金ナノロッドがＬＰＳＲに相当する光を吸収して熱に変換する光熱変換機能を利用し、該金ナノロッドが集積している部位周辺の細胞（がん細胞など）を発生した熱で死滅させるものである。本発明のＤＤＳは、上記金ナノロッドに薬物を担持させて生体内に投与し、特定の酵素が存在する部位で金ナノロッドが集積するのを利用して特定部位に薬物を集中投与するシステムである。また、本発明のバイオイメージングは、上記金ナノロッドが集積している部位を金ナノロッドのＬＳＰＲを測定して画像化することによって確認するものである。なお、本発明における吸収スペクトルの変化とは、金ナノロッドの凝集に伴うＬＳＰＲの最大吸収波長の吸光度の低下や吸収スペクトル形状の変化を意味する。
【００３３】
〔修飾有機物〕
金ナノロッドに吸着させる有機物は、分散媒に相溶する部位(Ａ)、特定物質で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含有する。
【００３４】
分散媒に相溶する部位(Ａ)としては水溶性高分子を用いることができる。また、基質ペプチド(Ｂ)としてはプロテアーゼの基質ペプチドを用いることができる。金ナノロッドとしては、長軸長さ４００ｎｍ未満であってアスペクト比が１より大きく、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００ｎｍの範囲の金ナノロッドが使用できる。
【００３５】
金ナノロッドに吸着させる上記有機物において、部位(Ａ)の水溶性高分子としては、水と相溶して金ナノロッドを分散媒中で安定に分散させることができるような水溶性高分子であれば制限なく使用でき、例えば、ポリエチレングリコール、セルロース、ポリアクリル酸などが挙げられる。以下では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の例について説明する。
【００３６】
部位(Ａ)に使用するＰＥＧとしては、重量平均分子量４００００以下のＰＥＧを使用することができる。ＰＥＧの分子量は、好ましくは、１０００〜１００００であり、分子量が１０００より小さいと分散媒中での分散安定性が不足し、分子量が４００００より大きいと酵素による基質ペプチドの分解が起こりにくくなる。
【００３７】
本発明の部位(Ａ)に使用するＰＥＧの一方の末端は、基質ペプチド中の一級アミンと反応する官能基を有しており、官能基としては、一級アミンと反応するものであれば制限なく使用できる。特にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を末端に有するものは、基質ペプチドの一級アミンと安定なアミド結合を形成できるので好ましい。また、ＰＥＧのもう一方の末端は金と吸着を起こさない化学構造であるメトキシ基が好ましい。以下、末端に、ＮＨＳとメトキシ基を有するＰＥＧ（ＭＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、実施例１の式[１]に相当）を例に説明する。
【００３８】
本発明の金ナノロッドに吸着させる有機物において、部位(Ｂ)に使用する基質ペプチドとしては、プロテアーゼの基質ペプチドを制限なく使用することができる。プロテアーゼは、ペプチド結合を加水分解する酵素であり、一般にセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、金属プロテアーゼに大別される。
【００３９】
本発明に使用するセリンプロテアーゼには、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター(ｕＰＡ)、トリプシン、キモトリプシン、スブチリシン、エラスターゼ、スブチリシン、トロンビン、テルミターゼ、凝血因子Ｘａ、プラスミン、ケキシン、プロテイナーゼＫ、カテプシン、チマーゼ、アクロシン、スクテラリン、オルリジン、カテプシン、メトリジン、ククミシン、プロリルオリゴぺプチターゼ、ブラキウリン、カリクレイン、セレビシン、ヒポデルミンＣ、ベノムビン、サブチリシン、テルモミコリン、フリン、ミロブラスチン、セメノゲラーゼ、グランザイム、ストレプトグラシン、トガビリン、フラビビリン、ラクトセピン、アセンビリン、セパシビリン、セバルモシン、シュードモナリシン、キサントモナリシン、フィサロリシン、ヘプシン、マトリプターゼなどが挙げられる。
【００４０】
以下、基質ペプチドとして、セリンプロテアーゼの一種であるウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）の基質ペプチドを例に説明する。これはがん細胞で特異的に過剰発現している。また、このｕＰＡの基質ペプチド（ｕＰＡｓｕｂ）は、Ｆｍｏｃ固相合成法などによって合成することができる。
【００４１】
本発明の基質ペプチドの一方の末端は、部位(Ａ)の官能基と反応する一級アミンを有していればよい。基質ペプチドの他方の末端は、金ナノロッドに吸着するチオール基を有していればよい。チオール基は金と共有結合を形成するので、部位(Ａ)と部位(Ｂ)を含む有機物は部位(Ｂ)のチオール末端から優先的に金ナノロッドに吸着する。
【００４２】
以下、末端に、一級アミンとチオール基を有するｕＰＡｓｕｂ（Ｈ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2、実施例１の式[２]に相当）を例に説明する。
【００４３】
〔修飾有機物の合成〕
分散媒に相溶する部位(Ａ)を含む有機物と、基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物とを反応させて、部位(Ａ)と基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物を合成することができる。具体的には、例えば、両末端にメトキシ基とＮＨＳを含むポリエチレングリコール（ＭＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）と、一級アミンとチオール基を含むウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター基質ペプチド（Ｈ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2）を、溶媒に溶解し、好ましくは塩基を加え、室温で攪拌すると、ＭＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳのＮＨＳは、Ｈ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2の一級アミンとアミド結合を形成し、分散媒に相溶する部位(Ａ)と特定の酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ、実施例１の式[３]に相当）が得られる。
【００４４】
合成に使用する溶媒としては、ＭＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳとＨ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2を溶解するものであれば際限なく使用でき、好ましくは、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドを使用すればよい。また、塩基としては、反応を促進するものであればよく、好ましくは、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを使用すればよい。
【００４５】
〔金ナノロッド〕
本発明で使用する金ナノロッド（ＮＲｓ）は、長軸の長さが４００nm未満であって、アスペクト比が１より大きいロッド形状の金微粒子が好ましい。具体的には、ＬＳＰＲの最大吸収波長が波長７００〜２０００ｎｍの範囲内にあるアスペクト比の金ナノロッドが適当である。また金ナノロッドの長軸長さは２００ｎｍ以下がより好ましい。長軸長さがこより長いと、金ナノロッドが沈降しやすくなる傾向があり、分散媒中での分散安定性が失われる。
【００４６】
金ナノロッドは次式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩が溶解した水溶液中で金イ
オンを還元することによって合成することができる。例えば、ｎ＝１５のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を使用することによって、ＣＴＡＢが表面に吸着した金ナノロッドを得ることができる。この金ナノロッドはＣＴＡＢが吸着した状態で水中に安定に分散している。
ＣＨ3(ＣＨ2)nＮ+(ＣＨ3)3Ｂｒ- （ｎは１〜１５の整数） …[Ｉ]
【００４７】
上記金ナノロッド水分散液は、水中に存在する余剰の界面活性剤ＣＴＡＢを除去して使用するとよい。具体的には、金ナノロッド水分散液を遠心分離して金ナノロッドを遠沈管の底に沈降させ、ＣＴＡＢを含む上澄みを除去する。沈降した金ナノロッドは水を添加して再分散させる。この操作を１〜３回繰り返すことによって余剰なＣＴＡＢを除去することができる。なお、ＣＴＡＢを過剰に除去すると金ナノロッドが凝集して水に再分散しなくなる。
【００４８】
〔表面処理〕
余剰のＣＴＡＢを除去した金ナノロッド水分散液と、分散媒に相溶する部位(Ａ)と特定の酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物を混合して攪拌すると、部位(Ａ)−部位(Ｂ)−金ナノロッドの構成を有する修飾金ナノロッドが得られる。例えば、金ナノロッド水分散液とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓを混合し、室温で１２時間攪拌すると、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓのチオール基が金ナノロッドに吸着し、分散媒に相溶する部位(Ａ)と特定の酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物が吸着したＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓが得られる。
【００４９】
ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓにおいて、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着量は調整可能であり、金ナノロッド水分散液に対するＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの添加量を調整すればよい。例えば、ＮＲｓ（金原子として）：ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ＝１０：１、１０：２、１０：５とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂの添加量を増やした場合、金ナノロッドへのＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着量は増加する。
【００５０】
ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓにおける部位(Ｂ)の基質ペプチドは、ｕＰＡの基質ペプチドであり、プロテアーゼにより分解される。例えば、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓにおいて、プロテアーゼによりｕＰＡｓｕｂが分解されると金ナノロッドからＰＥＧが脱離し、金ナノロッドの分散安定性が失われ、分散媒中で金ナノロッドの凝集が起こる。金ナノロッドの凝集は、金ナノロッドのＬＳＰＲの分光特性の変化や、金ナノロッド分散液の色の変化（赤色から紫色へ変化）によって確認することができる。
【００５１】
〔金ナノロッドの集積〕
上記有機物によって修飾された金ナノロッドは、基質ペプチド(Ｂ)がプロテアーゼにより分解されると、分散媒に相溶する部位(Ａ)が金ナノロッドから脱離し、プロテアーゼの発現している特定部位に凝集する。この凝集を利用して金ナノロッドを特定部位に集積させることができる。この集積時間は上記有機物の吸着量によって調整することができる。
【００５２】
また、基質ペプチドを分解する酵素の量は、金ナノロッドの凝集に関係する。例えば、ｕＰＡｓｕｂをトリプシンで分解する場合、ＰＥＧと金ナノロッドを切断するのに必要なトリプシンの量は、金が０.１mM含まれるＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓに対して、１nM以上であり、好ましくは、１０〜１０００nMである。トリプシンの量が１nMより少ないと、ｕＰＡｓｕｂの分解が不十分となり、金ナノロッドからＰＥＧが十分に脱離せず、金ナノロッドの凝集が不完全となる。
【００５３】
一定量のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓに対するトリプシンの量が多くなると、ｕＰＡｓｕｂの分解速度が速くなり、金ナノロッドの凝集速度も速くなる。また、金ナノロッドへのＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着量を調整することにより、一定量のトリプシンによるｕＰＡｓｕｂ分解時間、すなわち、金ナノロッドの凝集が生じるまでの時間を調整することができる。ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着量が多いほど、ｕＰＡｓｕｂの分解時間が長くなるため、金ナノロッドの凝集が起こるまでの時間も長くなる。
【００５４】
基質ペプチドの分解により凝集した金ナノロッドは、分解が起こった部位や溶液中で集積する。例えば、生体内の特定部位に存在する特定酵素により基質ペプチドが分解されると、特定酵素の存在する部位に金ナノロッドが集積する。
【００５５】
〔検出方法・治療方法等〕
本発明に使用する金ナノロッドは、７００〜２０００ｎｍにＬＳＰＲの吸収ピークを有しており、分散状態から凝集状態へ変化するとＬＳＰＲの分光特性が変化するため、特定酵素の検出や、特定酵素の存在する部位を検出することが可能である。この検出方法としては、金ナノロッドの吸収スペクトルの形状変化、吸光度の変化、散乱光強度の変化が挙げられる。特に波長８００nm〜１２００nmの近赤外光は水の吸収による影響が少なく（Near Infrared Window）、生体にも安全な波長域であり、生体外部から近赤外光を照射することによって、生体内に投与した金ナノロッドの分散状態や凝集状態による分光特性の変化を測定することが可能であり、近赤外光分析システムやバイオイメージングシステム（特定酵素部位の画像処理化など）を構築することができる。
【００５６】
特定酵素の存在部位に集積させた金ナノロッドにＬＳＰＲに相当する光を照射すると、金ナノロッドの光熱変換機能により集積している部位周辺の温度が上昇する。特に、生体内で集積させた金ナノロッドに近赤外線を照射した場合、集積部位周辺の細胞（例えばがん細胞）を発生した熱で死滅させることが可能であり、金ナノロッド集積部位をフォトサーマル治療用のターゲットマーカーとして使用することができる。
【００５７】
本発明の有機物で修飾した金ナノロッド（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ）に薬物を担持させて、生体内に投与した場合、特定酵素の存在する部位で特異的に集積するため、薬物を効率よく輸送・放出することが可能である。例えば、ｕＰＡはがん細胞で過剰発現しており、投与されたＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓのｕＰＡｓｕｂは、がん細胞部位のｕＰＡにて分解されて、金ナノロッドが集積し薬物を集中投与可能となるため、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓを薬物担持キャリアーとするＤＤＳが構築可能である。特に、金は生体に安全な材料であり、キャリアーとして有用である。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明を実施例によって具体的に示す。また、比較例を示す。なお、以下の実施例は、金ナノロッドの主に９００ｎｍ付近の波長域におけるＬＳＰＲの吸収波長シフトを測定しているが、金ナノロッドのアスペクト比を変更することによって７００〜２０００nmまでの波長域についても同様の吸収波長のシフトを測定することができる。
【００５９】
分光特性は日本分光株式会社製品のＶ−６７０で測定した。散乱光はMalverne社のZeta-sizer Nano-ZSで測定した。基質ペプチドを分解する酵素はプロテアーゼを制限なく使用できるが、実施例１〜７・比較例１〜３ではセリンプロテアーゼのひとつであるトリプシンを使用し、実施例８〜９ではセリンプロテアーゼのひとつであるｕＰＡを使用した。
【００６０】
〔ｕＰＡ基質ペプチドの合成〕
Ｆｍｏｃ固相合成法により、基質ペプチド（Ｈ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2）を合成した。Ｈ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2：Ｈ−ＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥ−Ｃｙｓ−ＮＨ2（分子量１３４６、Ｌ：ロイシン、Ｇ：グリシン、Ｓ：セリン、Ｒ：アルギニン、Ａ：アラニン、Ｎ：アスパラギン、Ｉ：イソロイシン、Ｅ：グルタミン酸、Ｃｙｓ：システイン）。
【００６１】
〔金ナノロッド水分散液の調製〕
４００mMのＣＴＡＢ水溶液中で合成された金ナノロッド水分散液を遠沈管に入れ、１４０００(×g)の相対遠心加速度（遠心加速度を地球の重力加速度で除したもの）で１０分間遠心分離して金ナノロッドを遠沈管の底に沈降させた。上澄み液を別の遠沈管に入れ、沈降した金ナノロッドは水で再分散させた。別の遠沈管に入れた上澄み液は、再び１４０００(×g)で１０分間遠心分離して金ナノロッドを沈降させ、この上澄み液を除去することにより余剰のＣＴＡＢを除去した。沈降した金ナノロッドは水で再分散させ、前の再分散液と合わせて、金ナノロッド水分散液を得た。吸光度から金ナノロッド水分散液中の金原子濃度を求めた。
【００６２】
〔実施例１〕
両末端にメトキシ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を含む式（１）のＰＥＧ（重合平均分子量５０００、ＭＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）２５.１mg（４.６４μmol）と一級アミンとチオール基を含む式（２）のｕＰＡｓｕｂ（Ｈ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2）１２.５mg（９.２８μmol）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド５９６μLに溶解し、塩基としてＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン４μL（２３.０μmol）を加え、これを室温で３日間攪拌した。攪拌終了後、分画分子量２０００の透析膜を用いて水中にて３日間透析を行い、未反応のＨ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2を除去した。この結果、式[１]中のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）は、式[２]の一級アミンと反応してアミド結合を形成し、式[３]の化合物（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ）が得られた。ＭＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳとＨ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2の結合は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳのマススペクトルで、反応後の質量ピークが増大することにより確認された（図１(Ａ)ＭＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、(Ｂ)ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−ＣｙｓのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）。
【００６３】
【化１】
【００６４】
【化２】
【００６５】
【化３】
【００６６】
〔実施例２〕
金原子とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの濃度比が１０：１となるように、ＮＲｓ水分散液とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ水溶液を混合した（金原子濃度１ｍM）。これを室温で１２時間攪拌し、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓを金ナノロッドに吸着させた。攪拌終了後、１４０００(×g)で１０分間遠心分離し金ナノロッドを沈降させ、上澄み液を除去し、水でＮＲｓを再分散させた。この遠心分離操作を２回繰り返して余剰のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓを除去した後、水でＮＲｓを再分散させ、分散媒に相溶するＰＥＧと、特定の酵素で分解される基質ペプチドｕＰＡｓｕｂを含む有機物がｕＰＡｓｕｂをリンカーとして吸着したＮＲｓ水分散液が得られた（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１水分散液）。得られたＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１水分散液の分光特性を図２(Ａ)に示す。ＮＲｓはＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着前後で、ＬＳＰＲの分光特性に変化はなく、水中に安定に分散していることが分かる。また、ＰＥＧ部位をリンタングステン酸により染色し、電子顕微鏡観察を行った結果、ＮＲｓの周囲に存在が確認された（図３(Ａ)）。
【００６７】
〔実施例３〕
金原子とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの濃度比が５：１である以外は実施例２と同様にして、ＮＲｓ水分散液を得た（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−２水分散液）。得られたＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−２水分散液の分光特性を図２(Ｂ)に示す。また、ＰＥＧ部位をリンタングステン酸により染色し、電子顕微鏡観察を行った結果、ＮＲｓの周囲に存在が確認され、コントラストが実施例２の場合より強く、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの添加量を増やすとＮＲｓへの吸着量が増加することが確認された（図３(Ｂ)）。
【００６８】
〔実施例４〕
金原子とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの濃度比が２：１である以外は実施例２と同様にして、ＮＲｓ水分散液を得た（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−３水分散液）。得られたＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−３水分散液の分光特性を図２（ｃ）に示す。また、ＰＥＧ部位をリンタングステン酸により染色し、電子顕微鏡観察を行った結果、ＮＲｓの周囲に存在が確認され、コントラストが実施例３の場合より強く、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの添加量を増やすとＮＲｓへの吸着量が増加することが確認された（図３（ｃ））。
【００６９】
〔実施例５〕
０.１mM（金原子濃度）のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１（実施例２のＮＲｓ水分散液）、１００nMトリプシン、１０mMＣａＣｌ2、５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）になるように調製してトリプシンによる酵素反応を行った。この結果、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１水分散液の色は、酵素反応前の赤色から、紫色に変化し、ｕＰＡｓｕｂが分解され、ＰＥＧ部位はＮＲｓより脱離し、ＮＲｓの水中での分散安定性が失われて凝集したことが確認された。図４に酵素反応（２０℃で１５分間）後のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１水分散液と、酵素なしで同条件においてインキュベーションしたサンプルの分光特性を示す。酵素トリプシンを添加した後は、ＮＲｓの凝集によりシャープな分光特性が無くなっている。図５に酵素反応（２０℃）中のＮＲｓ水分散液の分光特性で測定波長９００nmにおけるＮＲｓの吸光度の経時変化率（任意反応時間での吸光度／反応開始時の吸光度×１００％）を示す。酵素を添加後、ＮＲｓの凝集によって速やかに吸光度が減少することが確認された。図６に酵素反応（２５℃）中のＮＲｓ水分散液中のＮＲｓの散乱光強度を示す。酵素を添加後、ＮＲｓの凝集によって速やかに散乱光強度が増加することが確認された。酵素反応後のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１について電子顕微鏡観察を行った結果、ＮＲｓの凝集が確認された（図７）。
【００７０】
〔実施例６〕
０.１mM（金原子濃度）のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１（実施例２のＮＲｓ水分散液）をそれぞれ２５nM、５０nM、７５nMにし、１００nMトリプシン、１０mMＣａＣｌ2、５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）になるように調製してトリプシンによる酵素反応を行った。この結果、どのトリプシン量の場合でも、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１水分散液の色は、酵素反応前の赤色から、紫色に変化し、ｕＰＡｓｕｂが分解され、ＰＥＧ部位はＮＲｓより脱離し、ＮＲｓの水中での分散安定性が失われて凝集したことが確認された。図８に酵素反応（２０℃）中のＮＲｓ水分散液の分光特性で測定波長９００nmにおけるＮＲｓの吸光度の経時変化率を示す。酵素を添加するとＮＲｓの凝集により速やかに吸光度が減少することが確認された。図９に酵素反応（２５℃）中のＮＲｓ水分散液中のＮＲｓの散乱光強度を示す。酵素を添加するとＮＲｓの凝集により速やかに散乱光強度が増加することが確認された。トリプシンの添加量が多いほど分光特性や散乱光強度は速く変化し、その変化量も大きいことが確認された。
【００７１】
〔実施例７〕
０.１mM（金原子濃度）のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１〜３（実施例２のＮＲｓ水分散液、実施例３のＮＲｓ水分散液、実施例４のＮＲｓ水分散液）を用い、１００nMトリプシン、１０mMＣａＣｌ2、５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）になるように調製してトリプシンによる酵素反応を行った。この結果、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１〜３の水分散液の色は、酵素反応前の赤色から、紫色に変化し、ｕＰＡｓｕｂが分解され、ＰＥＧ部位はＮＲｓより脱離し、ＮＲｓの水中での分散安定性が失われて凝集したことが確認された。酵素反応（２０℃で１５分間）後のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１〜３の水分散液と酵素なしで同条件においてインキュベーションしたサンプルの分光特性を示す（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１：図４、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−２：図１０、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−３：図１１）。それぞれ、酵素トリプシンを添加した後は、ＮＲｓの凝集によりシャープな分光特性が無くなっている。酵素反応（２０℃）中のＮＲｓ水分散液の分光特性で測定波長９００nmにおけるＮＲｓの吸光度の経時変化率を示す（図１２）。それぞれ、酵素を添加後、ＮＲｓの凝集により速やかに吸光度が減少することが確認された。酵素反応（２５℃）中のＮＲｓ水分散液中のＮＲｓの散乱光強度を示す（図１３）。それぞれ、酵素を添加後、ＮＲｓの凝集により速やかに散乱光強度が増加することが確認された。分光特性、吸光度の経時変化率、そして散乱光強度について、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着量の多いＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−３が最も変化量が少なかったことより、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着量により、ＮＲｓの凝集能を制御できることが確認できた。
【００７２】
〔実施例８〕
金原子とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの濃度比が１００：１となるように、ＮＲｓ水分散液とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ水溶液を混合した（金原子濃度１ｍM）。これを室温で１２時間攪拌し、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓを金ナノロッドに吸着させた。攪拌終了後、１２０００(×g)で１０分間遠心分離し金ナノロッドを沈降させた。上澄み液を除去し、水でＮＲｓを再分散させ、ＮＲｓ水分散液を得た（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−４水分散液）。得られたＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−４水分散液の分光特性を図１７に示す。ＮＲｓはＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着前後で、ＬＳＰＲの分光特性に変化はなく、水中に安定に分散していることが分かる。
【００７３】
〔実施例９〕
０.１mM（金原子濃度）のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−４（実施例８のＮＲｓ水分散液）、５５６nMｕＰＡ、１００mMＮａＣｌ、５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）になるように調製してｕＰＡによる酵素反応を行った。この結果、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−４水分散液の色は、酵素反応前の赤色から、紫色に変化し、ＮＲｓの水中での分散安定性が失われて凝集したことが確認された。図１８に酵素反応（２０℃で１時間）後のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−４水分散液と酵素なしで同条件においてインキュベーションしたサンプルの分光特性を示す。酵素ｕＰＡを添加した後は、ＮＲｓの凝集によりシャープな分光特性が無くなっている。図１９に酵素反応（２０℃）中のＮＲｓ水分散液の分光特性で測定波長９００nmにおけるＮＲｓの吸光度の経時変化率を示す。酵素を添加後、ＮＲｓの凝集により速やかに吸光度が減少することが確認された。
【００７４】
〔比較例１〕
ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの代わりに両末端がメトキシ基とチオール基であるＰＥＧ水溶液を用いた以外は実施例２と同様にして、金ナノロッド水分散液を得た（ＰＥＧ−ＮＲｓ−１水分散液）。得られたＰＥＧ−ＮＲｓ−１水分散液の分光特性を図２（ｄ）に示す。また、ＰＥＧ部位をリンタングステン酸によって染色し、電子顕微鏡観察を行った結果、金ナノロッドの周囲に存在が確認された（図３（ｄ））。
【００７５】
〔比較例２〕
０.１ｍM（金原子濃度）のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１（実施例２のＮＲｓ水分散液）、１０mMＣａＣｌ2、５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）になるように混合した。この結果、ｕＰＡｓｕｂが分解されず、ＮＲｓは水中で安定に分散し、溶液の色は変化せず、凝集は観察されなかった。図８（トリプシン添加量０nMの場合）に混合（２０℃）後のＮＲｓ水分散液の分光特性で測定波長９００nmにおけるＮＲｓの吸光度の経時変化率を示す。混合後、ＮＲｓの吸光度は変化しなかった。図９（トリプシン添加量０nMの場合）に混合（２５℃）後のＮＲｓ水分散液中のＮＲｓの散乱光強度を示す。混合後、ＮＲｓの散乱光強度は変化しなかった。これらの結果より、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１は酵素によるｕＰＡｓｕｂ分解により、ＰＥＧがＮＲｓより脱離して、ＮＲｓが凝集することが確認できた。
【００７６】
〔比較例３〕
ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１の代わりに、比較例１で得られたＰＥＧ−ＮＲｓ−１を使用する以外は、実施例５と同様に酵素反応を行った。結果、ＰＥＧ−ＮＲｓ−１水分散液の色は赤色のままであり、凝集は観察されなかった。図１４に酵素反応（２０℃で１５分間）後のＰＥＧ−ＮＲｓ−１水分散液と酵素なしで同条件においてインキュベーションしたサンプルの分光特性を示す。酵素トリプシンを添加した後も分光特性に変化は確認されなかった。図１５に酵素反応（２０℃）中のＮＲｓ水分散液の分光特性で測定波長９００nmにおけるＮＲｓの吸光度の経時変化率を示す。酵素を添加後も吸光度に変化は確認されなかった。図１６に酵素反応（２５℃）中のＮＲｓ水分散液中のＮＲｓの散乱光強度を示す。酵素を添加後も散乱光強度に変化は確認されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】(ａ)実施例１のME−PEG−NHSのMALDI−TOF−MS（マススペクトル図）(ｂ)実施例１のPEG−uPAsub−CysのMALDI−TOF−MS（マススペクトル図）
【図２】(ａ)実施例２のPEG−uPAsub−Cys−NRs−1水分散液の分光特性（吸光スペクトル図）(ｂ)実施例３のPEG−uPAsub−Cys−NRs−2水分散液の分光特性（吸光スペクトル図）(ｃ)実施例４のPEG−uPAsub−Cys−NRs−3水分散液の分光特性（吸光スペクトル図）(ｄ)比較例１のPEG−NRs−1水分散液の分光特性（吸光スペクトル図）
【図３】(ａ)実施例２のPEG−uPAsub−Cys−NRs−1のＴＥＭ写真(ｂ)実施例３のPEG−uPAsub−Cys−NRs−2のＴＥＭ写真(ｃ)実施例４のPEG−uPAsub−Cys−NRs−3のＴＥＭ写真(ｄ)比較例１のPEG−NRs−1のＴＥＭ写真
【図４】実施例５、実施例７のPEG−uPAsub−Cys−NRs−1水分散液の分光特性（吸光スペクトル図）
【図５】実施例５のPEG−uPAsub−Cys−NRs−1水分散液の吸光度の経時変化率グラフ
【図６】実施例５のPEG−uPAsub−Cys−NRs−1の散乱光強度グラフ
【図７】実施例５のPEG−uPAsub−Cys−NRs−1のＴＥＭ写真
【図８】実施例６、比較例２のPEG−uPAsub−Cys−NRs−1水分散液の吸光度の経時変化率グラフ
【図９】実施例６、比較例２のPEG−uPAsub−Cys−NRs−1の散乱光強度グラフ
【図１０】実施例７のPEG−uPAsub−Cys−NRs−2水分散液の分光特性。（吸光スペクトル図）
【図１１】実施例７のPEG−uPAsub−Cys−NRs−3水分散液の分光特性（吸光スペクトル図）。
【図１２】実施例７のPEG−uPAsub−Cys−NRs−1〜3水分散液の吸光度の経時変化率グラフ
【図１３】実施例７のPEG−uPAsub−Cys−NRs−1〜3の散乱光強度グラフ
【図１４】比較例３のPEG−NRs−1水分散液の分光特性（吸光スペクトル図）
【図１５】比較例３のPEG−NRs−1水分散液の吸光度の経時変化率グラフ
【図１６】比較例３のPEG−NRs−1の散乱光強度グラフ
【図１７】実施例８のPEG−uPAsub−Cys−NRs−4水分散液の分光特性（吸光スペクトル図）
【図１８】実施例９のPEG−uPAsub−Cys−NRs−4水分散液の分光特性（吸光スペクトル図）
【図１９】実施例９のPEG−uPAsub−Cys−NRs−4水分散液の吸光度の経時変化率グラフ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分散媒に相溶する部位(Ａ)と特定酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含有する有機物によって修飾したナノサイズのロッド形状の金微粒子（金ナノロッド）と、その製造方法と、その集積方法、およびその用途に関する。
【０００２】
本発明は、より具体的には、金ナノロッドへのリンカーである基質ペプチド部位が特定の酵素により分解されると、分散媒に相溶する部位が金ナノロッドから脱離して分散安定性が失われ、金ナノロッドが凝集することを利用した特定物質の検出方法と金ナノロッドの特定部位への集積方法などに関する。本発明の技術は、金ナノロッドが集積した部位のフォトサーマル治療やバイオイメージング、そして特定の酵素が存在する部位への薬物輸送方法として有用である。
【背景技術】
【０００３】
溶媒中に分散した金属微粒子に光を照射すると局在表面プラズモン共鳴（Localized Surface Plasmon resonance：ＬＳＰＲ）と呼ばれる共鳴吸収現象が生じる。この吸収現象は金属の種類と形状、そして金属微粒子周囲における媒体の屈折率によって吸収波長が決定される。例えば、球状の金微粒子が水に分散した場合は５３０nm付近に吸収域を持ち、金微粒子の形状を短軸１０ｎｍ程度のロッド状（金ナノロッド）にすると、ロッドの短軸に起因する５３０nm付近の吸収の他に、ロッドの長軸に起因する長波長側の吸収を有することが知られている（非特許文献１）。
【０００４】
これらの金属微粒子分散液は、低分子化合物や高分子化合物を保護剤として金属微粒子表面に吸着ないし結合させることによって、金属微粒子が凝集することなく安定に溶媒に分散させることができる。特に金ナノロッドは形状の変化や凝集状態変化、金ナノロッド周辺の環境によって分光特性が変化する特異な金微粒子であり（非特許文献２、３、４）、近赤外光をプローブとして用いる新しい分光分析の材料として可能性がある。
【０００５】
金ナノロッドはアスペクト比（長軸長さ／短軸長さ）が１より大きいロッド状のナノサイズの金微粒子であり、例えば、カチオン性界面活性剤である第四級アンモニウム塩のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）に溶解した水中で合成され、ＣＴＡＢ水溶液中の金イオンを化学還元、電気還元、光還元などによって合成することが可能であり、合成した金ナノロッドはＣＴＡＢの保護作用によって水中で安定に分散している（特許文献１、２、３、４）。
【０００６】
近年、金ナノロッドにアビジン−ビオチン、抗原−抗体などの相互作用による目的物質への特異的な吸着反応を利用した研究が報告されている（非特許文献５）。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）ゲルで埋包された金ナノロッドは、ＬＳＰＲを利用した光熱変換により担持物質を放出可能であることが報告されている（非特許文献６）。また、酵素基質ペプチドの両端に脂質と水溶性高分子を結合した結合体を組み込んだコロイダルキャリアーに薬物を担持したドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）が報告されている（特許文献５）。また、貴金属微粒子のＬＳＰＲをセンシング分野へ応用した開発が行われている（非特許文献７、８、特許文献６）。
【０００７】
非特許文献５によると、金ナノロッドを重量平均分子量１４０００のＰＳＳで表面処理しておき、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とした抗体をＰＳＳ処理した金ナノロッドに吸着させており、抗体を介してがん細胞に金ナノロッドを取り込ませることによって、金ナノロッドの二光子発光によるがん細胞のイメージングが可能であることを報告している。
【０００８】
非特許文献６の方法によると、金ナノロッドをＮＩＰＡＭで埋包した微粒子に担持した物質の放出が報告されている。ＬＳＰＲに相当する光を照射された金ナノロッドは光熱変換機能により周囲のＮＩＰＡＭを加熱し、感熱性樹脂であるＮＩＰＡＭは温度が上昇すると下限臨界共溶温度を境に親水性から疎水性に変化し、ＮＩＰＡＭ中に担持された物質が水とともに放出されることを報告している。
【０００９】
特許文献５によると、酵素基質ペプチドの両端に脂質と水溶性高分子を結合した結合体を組み込んだコロイダルキャリアーに薬物を担持しておき、疾患組織から特異的に分泌される酵素との特異的反応により酵素基質ペプチド部分が分解・切断されることで担持されている薬物が標的組織に放出されることを利用して、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）を構築可能である。
【００１０】
非特許文献７の方法によると、重量平均分子量５０００のチオール末端ポリエチレングリコールで被覆した金ナノロッドを、アミノプロピルトリエトキシシランで表面処理したガラス基板上に固定化し、メルカプトヘキサデカン酸とのカルボジイミド結合で捕捉物質となる抗体（rabbit IgG）を金ナノロッドに導入した分析用チップを作製しており、特異的に結合する抗体（goat antirabbit IgG）と、非特異的に結合する抗体（goat antimouse IgG）を接触させた場合における分析用チップの金ナノロッドによるＬＳＰＲの吸収スペクトルの変化を検出している。
【００１１】
非特許文献８の方法によると、メルカプトプロピルトリエトキシシランで表面処理したガラスに金ナノロッドを固定化し、その基板をポリアリルアミン塩酸塩（ＰＡＨ）とポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳ）を交互に１０回ずつ、計２０層のポリマー層で被覆した基板にビオチンを捕捉物質として修飾した分析用チップを作製しており、検出対象の標的物質であるストレプトアビジンと結合して生じた金ナノロッドによるＬＳＰＲの吸収スペクトルの変化を検出している。
【００１２】
特許文献６によると、金属微粒子（直径１０〜２０ｎｍの金微粒子）を任意の基板上に固定化したＬＳＰＲセンサーを検討しており、液体内に配置したＬＳＰＲセンサーに対して光を照射し、基板に固定された金属微粒子を透過した光の吸光度を測定することにより、基板に固定された金属微粒子近傍の媒質の屈折率を検出し、検出結果に応じてＬＳＰＲセンサーが配置された液体の屈折率を測定することが可能である。
【００１３】
非特許文献９の方法によると、ビオチン、またはアビジンで修飾されたデキストラン被覆酸化鉄微粒子に、マトリクスメタロプロテアーゼの基質ペプチドを結合させ、酸化鉄と結合している基質ペプチドにポリエチレングリコールを導入し立体的な反発力で、ビオチンとアビジンの結合による酸化鉄微粒子の集合を抑止している。この基質ペプチドは、マトリクスメタロプロテアーゼの酵素反応により分解されると、ポリエチレングリコールが酸化鉄微粒子から脱離し、ビオチンとアビジンの結合で酸化鉄微粒子が集合することを利用して、ＭＲＩの造影能の変化を検討している。
【００１４】
【非特許文献１】S.Link,M.B.Mohamed,M.A.El-Sayed,J.Phys.Chem.B,103,p3073（1999）
【非特許文献２】K.Honda,Y.Niidome,N.Nakashima,H.Kawazumi,S.Yamada,Chem.Lett.,35,p854（2006）
【非特許文献３】Y.Niidome,H.Takahashi,S.Urakawa,K.Nishioka,S.Yamada,Chem.Lett.,33,p454（2004）
【非特許文献４】S.Link,M.A.El-Sayed,J.Phys.Chem.B,109,p10531（2005）
【非特許文献５】N.J.Durr,T.Larson,D.K.Smith,B.A.Korgel,K.Sokolov,A.Ben-Yakar,Nano Letters,7,p941（2007）
【非特許文献６】A.Shiotami,T.Mori,T.Niidome,Y.Niidome,Y.Katayama,Langmuir,23,p4012 (2007)
【非特許文献７】K.M.Mayer,S.Lee,H.Liao,B.C.Rostro,A.Fuentes,P.T.Scully,C.L.Nehl,J.H.Hafner,ACS NANO,（2008）
【非特許文献８】S.M.Marinakos,S.Chen,A.Chilkoti,Anal.Chem.,79,p5278（2007）
【非特許文献９】T.J.Harris,G.von Maltzahn,A.M.Derfus,E.Ruoslahti,S.N.Bhatia,Angew.Chem.Int.Ed.,45,p3161(2006)
【特許文献１】特開２００４−２９２６２７号公報
【特許文献２】特開２００５−９７７１８号公報
【特許文献３】特開２００６−１６９５４４号公報
【特許文献４】特開２００６−１１８０３６号公報
【特許文献５】ＷＯ２００４／０６３２１６
【特許文献６】特開２０００−３５６５８７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
特許文献１〜４などの方法で合成された金ナノロッドはＣＴＡＢに被覆された状態で水中に分散しているが、特定部位で凝集・集積する機能は有していない。
【００１６】
非特許文献５は、金ナノロッドをＰＳＳで表面処理後に抗体と結合させているが、金ナノロッドの二光子発光を測定するための処理方法であり、金ナノロッドのＬＳＰＲをセンシング技術やバイオイメージングに応用したものではない。
【００１７】
非特許文献６の粒子は、ＮＩＰＡＭ中の担持物質を輸送・放出することは可能であるが、標的組織を認識して担持物質を放出する機能は有していない。
【００１８】
非特許文献７は、検出対象物質の捕捉により生じる金ナノロッド周囲の屈折率の変化に伴う吸収スペクトルの変化を検出原理とする分析用チップと分析方法であるが、分析用チップの作製には２０回の高分子膜をコーティングする必要がある。また、分析用チップが標的物質を検出した場合の金ナノロッドによる吸収スペクトルの変化は最大吸収波長のシフト量が４nm未満であり検出感度は低い。非特許文献８も非特許文献７と同様に、検出対象物質の捕捉により生じる金ナノロッド周囲の屈折率の変化に伴う吸収スペクトルの変化を検出原理とする分析用チップと分析方法であるが、分析用チップの作製には煩雑な工程を必要とする。また、分析用チップが標的物質を検出した場合の金ナノロッドによる吸収スペクトルの変化は最大吸収波長のシフト量が１０nm未満であり検出感度は低い。
【００１９】
特許文献５は、標的組織に存在する酵素を認識して薬物を放出するＤＤＳは構築可能であるが、薬物を放出した後はコロイダルキャリアーが分解されてしまうため伝達物質としての機能しかなく、標的組織に残存してマーカーとなる機能はなかった。また、特定物質を認識して変化を起こすセンシング素子としての機能はなかった。
【００２０】
特許文献６の金微粒子は、球状金微粒子のＬＳＰＲを利用して、特定物質の吸着による微粒子近傍の媒質による屈折率の変化を吸光度で測定するセンシング技術に関するものであるが、金ナノロッドを使用したものではなく、測定に利用できる吸収波長域は球状金微粒子を使用しているため５３０ｎｍ付近と限られている。また、特許文献６の免疫センサー用デバイスは、高分子で被覆した金属薄膜の表面プラズモン共鳴を分析センサーに応用しているが、金属微粒子のＬＳＰＲの吸収波長を利用したものではない。
【００２１】
非特許文献９の酸化鉄微粒子は、特定の酵素による基質ペプチドの分解とビオチン−アビジンによる結合を利用して酸化鉄微粒子を集合（凝集）させており、その酵素量や酸化鉄濃度の関係で磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）のＴ２緩和時間を調整する技術であり、金属微粒子の凝集で生ずるＬＳＰＲの大きな吸収スペクトル変化をセンシング技術やバイオイメージングに応用したものではない。
【００２２】
本発明は従来の上記技術では知られていない金ナノロッドの新規技術を提供する。具体的には、基質ペプチドと分散媒に相溶する部位からなる有機物を吸着した金ナノロッドとその製造方法を提供するものであり、さらに金ナノロッドの凝集を利用した特定物質の検出と金ナノロッドの特定部位への集積方法、そして金ナノロッドを集積させた特定部位へのフォトサーマル治療、バイオイメージング、及び薬物伝達システムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、以下に示す構成を有する金微粒子とその製造方法に関する。
〔１〕分散媒に相溶する部位(Ａ)と、特定の酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物によって修飾されているロッド形状の金微粒子であって、上記有機物が基質ペプチド(Ｂ)の部位をリンカーとして吸着していることを特徴とする金微粒子。
〔２〕分散媒に相溶する部位(Ａ)の一方の末端が基質ペプチド(Ｂ)と反応する官能基を有し、基質ペプチド(Ｂ)の一方の末端が上記部位(Ａ)の官能基と反応する一級アミンを有し、基質ペプチド(Ｂ)の他方の末端が金ナノロッドに吸着するチオール基を有する有機物によって修飾されている上記[１]の金微粒子。
〔３〕部位(Ａ)が水溶性高分子である上記[１]または上記[２]の金微粒子。
〔４〕部位(Ａ)が重合平均分子量４００００以下のポリエチレングリコールである上記[１]〜上記[３]の何れかに記載する金微粒子。
〔５〕基質ペプチド(Ｂ)がプロテアーゼの基質ペプチドである上記[１]〜上記[４]の何れかに記載する金微粒子。
〔６〕基質ペプチド(Ｂ)が部位特異的に発現しているプロテアーゼにより分解される基質ペプチドである上記[５]に記載する金微粒子。
〔７〕基質ぺプチド(Ｂ)が病巣特異的に発現しているプロテアーゼにより分解される基質ペプチドである上記[５]に記載する金微粒子。
〔８〕基質ペプチド(Ｂ)が、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター(ｕＰＡ)基質ペプチド、マトリクスメタロプロテアーゼ基質ペプチドから選ばれる基質ペプチドである上記[５]に記載する金微粒子。
〔９〕基質ペプチド(Ｂ)が、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター(ｕＰＡ)または／およびマトリクスメタロプロテアーゼで分解されるトリプシン基質ペプチド、キモトリプシン基質ペプチドから選ばれる基質ペプチドである上記[５]に記載する金微粒子。
〔１０〕長軸長さ４００ｎｍ未満であってアスペクト比が１より大きく、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００ｎｍの範囲である上記[１]〜上記[９]の何れかに記載する金微粒子。
〔１１〕基質ペプチド(Ｂ)がプロテアーゼにより分解され、部位(Ａ)がロッド形状の金微粒子から脱離し、プロテアーゼの発現している特定部位で該金微粒子が凝集する上記[１]〜上記[１０]の何れかに記載する金微粒子。
〔１２〕分散媒に相溶する部位(Ａ)を含む有機物と、基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物とを反応させて、部位(Ａ)と基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物を合成する工程、該有機物の基質ペプチド(Ｂ)をリンカーとしてロッド形状の金微粒子に吸着させる工程を有する表面修飾金微粒子の製造方法。
〔１３〕両末端にメトキシ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を含むポリエチレングリコールと、一級アミンとチオール基を含むウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）基質ペプチドを、溶媒に溶解し、塩基を加えて攪拌し、反応させて、分散媒に相溶する部位(Ａ)と特定の酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物を合成し、該有機物によって金ナノロッドを表面処理する表面修飾金微粒子の製造方法。
【００２４】
また、本発明は上記金微粒子を利用した集積方法、および該集積方法を利用した用途に関する。
〔１４〕上記[１１]に記載する凝集によって特定部位にロッド形状の金微粒子を集めることを特徴とする金微粒子の集積方法。
〔１５〕部位(Ａ)と基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物のロッド形状の金微粒子への吸着量によって、特定部位に該金微粒子が凝集する時間を調整する上記[１４]に記載する金微粒子の集積方法。
〔１６〕上記[１４]または上記[１５]に記載する金微粒子の凝集によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルの変化で特定物質を検出することを特徴とする特定物質の検出方法。
〔１７〕上記[１４]または上記[１５]に記載する金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルを観察することを特徴とするバイオイメージング。
〔１８〕上記[１４]または上記[１５]に記載する集積方法によって生じる金微粒子の集積部位に、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、集積部位周辺の細胞を該金微粒子の光熱変換により発生した熱で死滅させることを特徴とするフォトサーマル治療。
〔１９〕上記[１４]または上記[１５]に記載する集積方法によって生じる金微粒子の集積部位に、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、集積部位周辺の細胞を該金微粒子の光熱変換によって発生した熱で該金微粒子に担持させた薬物を放出させることを特徴とするドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の金微粒子は、分散媒に相溶する部位と基質ペプチドを含有する有機物によって修飾され、基質ペプチドがリンカーとして金ナノロッドに吸着した金微粒子であり、特定の酵素によって基質ペプチドが分解されると、分散媒への相溶する部位が金ナノロッドから脱離するため、金ナノロッドの凝集が発生し、特定の酵素が存在する部位へ金ナノロッドを集積することができる。
【００２６】
また、本発明の金微粒子は、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００nmの範囲の金ナノロッドを用いているので、凝集・集積によってＬＳＰＲの分光特性が変化することを利用して、基質ペプチドに対して基質特異的な酵素を検出することができる。
【００２７】
さらに、金ナノロッドは光熱変換機能を有するので、金ナノロッドを集積させた部位周辺組織へのフォトサーマル治療、バイオイメージング、そしてドラックデリバリーシステムの構築が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明を実施形態に基づいて具体的に説明する。なお、濃度の％は特に示さない限り質量％である。
【００２９】
本発明の金微粒子は、分散媒に相溶する部位(Ａ)と、特定の酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物によって修飾されているロッド形状の金微粒子であって、上記有機物が基質ペプチド(Ｂ)の部位をリンカーとして吸着していることを特徴とする金微粒子である。
【００３０】
本発明の集積方法は、上記金ナノロッドを修飾している有機物の分解を利用したものであり、酵素により基質ペプチドが分解され、分散媒へ相溶する部位が金ナノロッドから脱離するため、金ナノロッドの凝集が発生し、特定の酵素が存在する部位へ金ナノロッドを集積することを利用したものである。
【００３１】
本発明の特定物質の検出方法は、上記金ナノロッドの集積方法を利用したものであり、金ナノロッドの凝集・集積によってＬＳＰＲの分光特性や散乱光強度が変化することを利用して、本発明の基質ペプチドに基質特異的な酵素を検出するものである。
【００３２】
本発明のフォトサーマル治療は、上記金ナノロッドがＬＰＳＲに相当する光を吸収して熱に変換する光熱変換機能を利用し、該金ナノロッドが集積している部位周辺の細胞（がん細胞など）を発生した熱で死滅させるものである。本発明のＤＤＳは、上記金ナノロッドに薬物を担持させて生体内に投与し、特定の酵素が存在する部位で金ナノロッドが集積するのを利用して特定部位に薬物を集中投与するシステムである。また、本発明のバイオイメージングは、上記金ナノロッドが集積している部位を金ナノロッドのＬＳＰＲを測定して画像化することによって確認するものである。なお、本発明における吸収スペクトルの変化とは、金ナノロッドの凝集に伴うＬＳＰＲの最大吸収波長の吸光度の低下や吸収スペクトル形状の変化を意味する。
【００３３】
〔修飾有機物〕
金ナノロッドに吸着させる有機物は、分散媒に相溶する部位(Ａ)、特定物質で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含有する。
【００３４】
分散媒に相溶する部位(Ａ)としては水溶性高分子を用いることができる。また、基質ペプチド(Ｂ)としてはプロテアーゼの基質ペプチドを用いることができる。金ナノロッドとしては、長軸長さ４００ｎｍ未満であってアスペクト比が１より大きく、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００ｎｍの範囲の金ナノロッドが使用できる。
【００３５】
金ナノロッドに吸着させる上記有機物において、部位(Ａ)の水溶性高分子としては、水と相溶して金ナノロッドを分散媒中で安定に分散させることができるような水溶性高分子であれば制限なく使用でき、例えば、ポリエチレングリコール、セルロース、ポリアクリル酸などが挙げられる。以下では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の例について説明する。
【００３６】
部位(Ａ)に使用するＰＥＧとしては、重量平均分子量４００００以下のＰＥＧを使用することができる。ＰＥＧの分子量は、好ましくは、１０００〜１００００であり、分子量が１０００より小さいと分散媒中での分散安定性が不足し、分子量が４００００より大きいと酵素による基質ペプチドの分解が起こりにくくなる。
【００３７】
本発明の部位(Ａ)に使用するＰＥＧの一方の末端は、基質ペプチド中の一級アミンと反応する官能基を有しており、官能基としては、一級アミンと反応するものであれば制限なく使用できる。特にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を末端に有するものは、基質ペプチドの一級アミンと安定なアミド結合を形成できるので好ましい。また、ＰＥＧのもう一方の末端は金と吸着を起こさない化学構造であるメトキシ基が好ましい。以下、末端に、ＮＨＳとメトキシ基を有するＰＥＧ（ＭＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、実施例１の式[１]に相当）を例に説明する。
【００３８】
本発明の金ナノロッドに吸着させる有機物において、部位(Ｂ)に使用する基質ペプチドとしては、プロテアーゼの基質ペプチドを制限なく使用することができる。プロテアーゼは、ペプチド結合を加水分解する酵素であり、一般にセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、金属プロテアーゼに大別される。
【００３９】
本発明に使用するセリンプロテアーゼには、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター(ｕＰＡ)、トリプシン、キモトリプシン、スブチリシン、エラスターゼ、スブチリシン、トロンビン、テルミターゼ、凝血因子Ｘａ、プラスミン、ケキシン、プロテイナーゼＫ、カテプシン、チマーゼ、アクロシン、スクテラリン、オルリジン、カテプシン、メトリジン、ククミシン、プロリルオリゴぺプチターゼ、ブラキウリン、カリクレイン、セレビシン、ヒポデルミンＣ、ベノムビン、サブチリシン、テルモミコリン、フリン、ミロブラスチン、セメノゲラーゼ、グランザイム、ストレプトグラシン、トガビリン、フラビビリン、ラクトセピン、アセンビリン、セパシビリン、セバルモシン、シュードモナリシン、キサントモナリシン、フィサロリシン、ヘプシン、マトリプターゼなどが挙げられる。
【００４０】
以下、基質ペプチドとして、セリンプロテアーゼの一種であるウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）の基質ペプチドを例に説明する。これはがん細胞で特異的に過剰発現している。また、このｕＰＡの基質ペプチド（ｕＰＡｓｕｂ）は、Ｆｍｏｃ固相合成法などによって合成することができる。
【００４１】
本発明の基質ペプチドの一方の末端は、部位(Ａ)の官能基と反応する一級アミンを有していればよい。基質ペプチドの他方の末端は、金ナノロッドに吸着するチオール基を有していればよい。チオール基は金と共有結合を形成するので、部位(Ａ)と部位(Ｂ)を含む有機物は部位(Ｂ)のチオール末端から優先的に金ナノロッドに吸着する。
【００４２】
以下、末端に、一級アミンとチオール基を有するｕＰＡｓｕｂ（Ｈ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2、実施例１の式[２]に相当）を例に説明する。
【００４３】
〔修飾有機物の合成〕
分散媒に相溶する部位(Ａ)を含む有機物と、基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物とを反応させて、部位(Ａ)と基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物を合成することができる。具体的には、例えば、両末端にメトキシ基とＮＨＳを含むポリエチレングリコール（ＭＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）と、一級アミンとチオール基を含むウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター基質ペプチド（Ｈ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2）を、溶媒に溶解し、好ましくは塩基を加え、室温で攪拌すると、ＭＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳのＮＨＳは、Ｈ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2の一級アミンとアミド結合を形成し、分散媒に相溶する部位(Ａ)と特定の酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ、実施例１の式[３]に相当）が得られる。
【００４４】
合成に使用する溶媒としては、ＭＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳとＨ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2を溶解するものであれば際限なく使用でき、好ましくは、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドを使用すればよい。また、塩基としては、反応を促進するものであればよく、好ましくは、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを使用すればよい。
【００４５】
〔金ナノロッド〕
本発明で使用する金ナノロッド（ＮＲｓ）は、長軸の長さが４００nm未満であって、アスペクト比が１より大きいロッド形状の金微粒子が好ましい。具体的には、ＬＳＰＲの最大吸収波長が波長７００〜２０００ｎｍの範囲内にあるアスペクト比の金ナノロッドが適当である。また金ナノロッドの長軸長さは２００ｎｍ以下がより好ましい。長軸長さがこより長いと、金ナノロッドが沈降しやすくなる傾向があり、分散媒中での分散安定性が失われる。
【００４６】
金ナノロッドは次式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩が溶解した水溶液中で金イ
オンを還元することによって合成することができる。例えば、ｎ＝１５のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を使用することによって、ＣＴＡＢが表面に吸着した金ナノロッドを得ることができる。この金ナノロッドはＣＴＡＢが吸着した状態で水中に安定に分散している。
ＣＨ3(ＣＨ2)nＮ+(ＣＨ3)3Ｂｒ- （ｎは１〜１５の整数） …[Ｉ]
【００４７】
上記金ナノロッド水分散液は、水中に存在する余剰の界面活性剤ＣＴＡＢを除去して使用するとよい。具体的には、金ナノロッド水分散液を遠心分離して金ナノロッドを遠沈管の底に沈降させ、ＣＴＡＢを含む上澄みを除去する。沈降した金ナノロッドは水を添加して再分散させる。この操作を１〜３回繰り返すことによって余剰なＣＴＡＢを除去することができる。なお、ＣＴＡＢを過剰に除去すると金ナノロッドが凝集して水に再分散しなくなる。
【００４８】
〔表面処理〕
余剰のＣＴＡＢを除去した金ナノロッド水分散液と、分散媒に相溶する部位(Ａ)と特定の酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物を混合して攪拌すると、部位(Ａ)−部位(Ｂ)−金ナノロッドの構成を有する修飾金ナノロッドが得られる。例えば、金ナノロッド水分散液とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓを混合し、室温で１２時間攪拌すると、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓのチオール基が金ナノロッドに吸着し、分散媒に相溶する部位(Ａ)と特定の酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物が吸着したＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓが得られる。
【００４９】
ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓにおいて、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着量は調整可能であり、金ナノロッド水分散液に対するＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの添加量を調整すればよい。例えば、ＮＲｓ（金原子として）：ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ＝１０：１、１０：２、１０：５とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂの添加量を増やした場合、金ナノロッドへのＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着量は増加する。
【００５０】
ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓにおける部位(Ｂ)の基質ペプチドは、ｕＰＡの基質ペプチドであり、プロテアーゼにより分解される。例えば、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓにおいて、プロテアーゼによりｕＰＡｓｕｂが分解されると金ナノロッドからＰＥＧが脱離し、金ナノロッドの分散安定性が失われ、分散媒中で金ナノロッドの凝集が起こる。金ナノロッドの凝集は、金ナノロッドのＬＳＰＲの分光特性の変化や、金ナノロッド分散液の色の変化（赤色から紫色へ変化）によって確認することができる。
【００５１】
〔金ナノロッドの集積〕
上記有機物によって修飾された金ナノロッドは、基質ペプチド(Ｂ)がプロテアーゼにより分解されると、分散媒に相溶する部位(Ａ)が金ナノロッドから脱離し、プロテアーゼの発現している特定部位に凝集する。この凝集を利用して金ナノロッドを特定部位に集積させることができる。この集積時間は上記有機物の吸着量によって調整することができる。
【００５２】
また、基質ペプチドを分解する酵素の量は、金ナノロッドの凝集に関係する。例えば、ｕＰＡｓｕｂをトリプシンで分解する場合、ＰＥＧと金ナノロッドを切断するのに必要なトリプシンの量は、金が０.１mM含まれるＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓに対して、１nM以上であり、好ましくは、１０〜１０００nMである。トリプシンの量が１nMより少ないと、ｕＰＡｓｕｂの分解が不十分となり、金ナノロッドからＰＥＧが十分に脱離せず、金ナノロッドの凝集が不完全となる。
【００５３】
一定量のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓに対するトリプシンの量が多くなると、ｕＰＡｓｕｂの分解速度が速くなり、金ナノロッドの凝集速度も速くなる。また、金ナノロッドへのＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着量を調整することにより、一定量のトリプシンによるｕＰＡｓｕｂ分解時間、すなわち、金ナノロッドの凝集が生じるまでの時間を調整することができる。ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着量が多いほど、ｕＰＡｓｕｂの分解時間が長くなるため、金ナノロッドの凝集が起こるまでの時間も長くなる。
【００５４】
基質ペプチドの分解により凝集した金ナノロッドは、分解が起こった部位や溶液中で集積する。例えば、生体内の特定部位に存在する特定酵素により基質ペプチドが分解されると、特定酵素の存在する部位に金ナノロッドが集積する。
【００５５】
〔検出方法・治療方法等〕
本発明に使用する金ナノロッドは、７００〜２０００ｎｍにＬＳＰＲの吸収ピークを有しており、分散状態から凝集状態へ変化するとＬＳＰＲの分光特性が変化するため、特定酵素の検出や、特定酵素の存在する部位を検出することが可能である。この検出方法としては、金ナノロッドの吸収スペクトルの形状変化、吸光度の変化、散乱光強度の変化が挙げられる。特に波長８００nm〜１２００nmの近赤外光は水の吸収による影響が少なく（Near Infrared Window）、生体にも安全な波長域であり、生体外部から近赤外光を照射することによって、生体内に投与した金ナノロッドの分散状態や凝集状態による分光特性の変化を測定することが可能であり、近赤外光分析システムやバイオイメージングシステム（特定酵素部位の画像処理化など）を構築することができる。
【００５６】
特定酵素の存在部位に集積させた金ナノロッドにＬＳＰＲに相当する光を照射すると、金ナノロッドの光熱変換機能により集積している部位周辺の温度が上昇する。特に、生体内で集積させた金ナノロッドに近赤外線を照射した場合、集積部位周辺の細胞（例えばがん細胞）を発生した熱で死滅させることが可能であり、金ナノロッド集積部位をフォトサーマル治療用のターゲットマーカーとして使用することができる。
【００５７】
本発明の有機物で修飾した金ナノロッド（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ）に薬物を担持させて、生体内に投与した場合、特定酵素の存在する部位で特異的に集積するため、薬物を効率よく輸送・放出することが可能である。例えば、ｕＰＡはがん細胞で過剰発現しており、投与されたＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓのｕＰＡｓｕｂは、がん細胞部位のｕＰＡにて分解されて、金ナノロッドが集積し薬物を集中投与可能となるため、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓを薬物担持キャリアーとするＤＤＳが構築可能である。特に、金は生体に安全な材料であり、キャリアーとして有用である。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明を実施例によって具体的に示す。また、比較例を示す。なお、以下の実施例は、金ナノロッドの主に９００ｎｍ付近の波長域におけるＬＳＰＲの吸収波長シフトを測定しているが、金ナノロッドのアスペクト比を変更することによって７００〜２０００nmまでの波長域についても同様の吸収波長のシフトを測定することができる。
【００５９】
分光特性は日本分光株式会社製品のＶ−６７０で測定した。散乱光はMalverne社のZeta-sizer Nano-ZSで測定した。基質ペプチドを分解する酵素はプロテアーゼを制限なく使用できるが、実施例１〜７・比較例１〜３ではセリンプロテアーゼのひとつであるトリプシンを使用し、実施例８〜９ではセリンプロテアーゼのひとつであるｕＰＡを使用した。
【００６０】
〔ｕＰＡ基質ペプチドの合成〕
Ｆｍｏｃ固相合成法により、基質ペプチド（Ｈ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2）を合成した。Ｈ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2：Ｈ−ＬＧＧＳＧＲＳＡＮＡＩＬＥ−Ｃｙｓ−ＮＨ2（分子量１３４６、Ｌ：ロイシン、Ｇ：グリシン、Ｓ：セリン、Ｒ：アルギニン、Ａ：アラニン、Ｎ：アスパラギン、Ｉ：イソロイシン、Ｅ：グルタミン酸、Ｃｙｓ：システイン）。
【００６１】
〔金ナノロッド水分散液の調製〕
４００mMのＣＴＡＢ水溶液中で合成された金ナノロッド水分散液を遠沈管に入れ、１４０００(×g)の相対遠心加速度（遠心加速度を地球の重力加速度で除したもの）で１０分間遠心分離して金ナノロッドを遠沈管の底に沈降させた。上澄み液を別の遠沈管に入れ、沈降した金ナノロッドは水で再分散させた。別の遠沈管に入れた上澄み液は、再び１４０００(×g)で１０分間遠心分離して金ナノロッドを沈降させ、この上澄み液を除去することにより余剰のＣＴＡＢを除去した。沈降した金ナノロッドは水で再分散させ、前の再分散液と合わせて、金ナノロッド水分散液を得た。吸光度から金ナノロッド水分散液中の金原子濃度を求めた。
【００６２】
〔実施例１〕
両末端にメトキシ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を含む式（１）のＰＥＧ（重合平均分子量５０００、ＭＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）２５.１mg（４.６４μmol）と一級アミンとチオール基を含む式（２）のｕＰＡｓｕｂ（Ｈ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2）１２.５mg（９.２８μmol）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド５９６μLに溶解し、塩基としてＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン４μL（２３.０μmol）を加え、これを室温で３日間攪拌した。攪拌終了後、分画分子量２０００の透析膜を用いて水中にて３日間透析を行い、未反応のＨ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2を除去した。この結果、式[１]中のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）は、式[２]の一級アミンと反応してアミド結合を形成し、式[３]の化合物（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ）が得られた。ＭＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳとＨ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＨ2の結合は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳのマススペクトルで、反応後の質量ピークが増大することにより確認された（図１(Ａ)ＭＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、(Ｂ)ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−ＣｙｓのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）。
【００６３】
【化１】
【００６４】
【化２】
【００６５】
【化３】
【００６６】
〔実施例２〕
金原子とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの濃度比が１０：１となるように、ＮＲｓ水分散液とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ水溶液を混合した（金原子濃度１ｍM）。これを室温で１２時間攪拌し、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓを金ナノロッドに吸着させた。攪拌終了後、１４０００(×g)で１０分間遠心分離し金ナノロッドを沈降させ、上澄み液を除去し、水でＮＲｓを再分散させた。この遠心分離操作を２回繰り返して余剰のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓを除去した後、水でＮＲｓを再分散させ、分散媒に相溶するＰＥＧと、特定の酵素で分解される基質ペプチドｕＰＡｓｕｂを含む有機物がｕＰＡｓｕｂをリンカーとして吸着したＮＲｓ水分散液が得られた（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１水分散液）。得られたＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１水分散液の分光特性を図２(Ａ)に示す。ＮＲｓはＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着前後で、ＬＳＰＲの分光特性に変化はなく、水中に安定に分散していることが分かる。また、ＰＥＧ部位をリンタングステン酸により染色し、電子顕微鏡観察を行った結果、ＮＲｓの周囲に存在が確認された（図３(Ａ)）。
【００６７】
〔実施例３〕
金原子とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの濃度比が５：１である以外は実施例２と同様にして、ＮＲｓ水分散液を得た（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−２水分散液）。得られたＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−２水分散液の分光特性を図２(Ｂ)に示す。また、ＰＥＧ部位をリンタングステン酸により染色し、電子顕微鏡観察を行った結果、ＮＲｓの周囲に存在が確認され、コントラストが実施例２の場合より強く、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの添加量を増やすとＮＲｓへの吸着量が増加することが確認された（図３(Ｂ)）。
【００６８】
〔実施例４〕
金原子とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの濃度比が２：１である以外は実施例２と同様にして、ＮＲｓ水分散液を得た（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−３水分散液）。得られたＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−３水分散液の分光特性を図２（ｃ）に示す。また、ＰＥＧ部位をリンタングステン酸により染色し、電子顕微鏡観察を行った結果、ＮＲｓの周囲に存在が確認され、コントラストが実施例３の場合より強く、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの添加量を増やすとＮＲｓへの吸着量が増加することが確認された（図３（ｃ））。
【００６９】
〔実施例５〕
０.１mM（金原子濃度）のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１（実施例２のＮＲｓ水分散液）、１００nMトリプシン、１０mMＣａＣｌ2、５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）になるように調製してトリプシンによる酵素反応を行った。この結果、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１水分散液の色は、酵素反応前の赤色から、紫色に変化し、ｕＰＡｓｕｂが分解され、ＰＥＧ部位はＮＲｓより脱離し、ＮＲｓの水中での分散安定性が失われて凝集したことが確認された。図４に酵素反応（２０℃で１５分間）後のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１水分散液と、酵素なしで同条件においてインキュベーションしたサンプルの分光特性を示す。酵素トリプシンを添加した後は、ＮＲｓの凝集によりシャープな分光特性が無くなっている。図５に酵素反応（２０℃）中のＮＲｓ水分散液の分光特性で測定波長９００nmにおけるＮＲｓの吸光度の経時変化率（任意反応時間での吸光度／反応開始時の吸光度×１００％）を示す。酵素を添加後、ＮＲｓの凝集によって速やかに吸光度が減少することが確認された。図６に酵素反応（２５℃）中のＮＲｓ水分散液中のＮＲｓの散乱光強度を示す。酵素を添加後、ＮＲｓの凝集によって速やかに散乱光強度が増加することが確認された。酵素反応後のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１について電子顕微鏡観察を行った結果、ＮＲｓの凝集が確認された（図７）。
【００７０】
〔実施例６〕
０.１mM（金原子濃度）のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１（実施例２のＮＲｓ水分散液）をそれぞれ２５nM、５０nM、７５nMにし、１００nMトリプシン、１０mMＣａＣｌ2、５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）になるように調製してトリプシンによる酵素反応を行った。この結果、どのトリプシン量の場合でも、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１水分散液の色は、酵素反応前の赤色から、紫色に変化し、ｕＰＡｓｕｂが分解され、ＰＥＧ部位はＮＲｓより脱離し、ＮＲｓの水中での分散安定性が失われて凝集したことが確認された。図８に酵素反応（２０℃）中のＮＲｓ水分散液の分光特性で測定波長９００nmにおけるＮＲｓの吸光度の経時変化率を示す。酵素を添加するとＮＲｓの凝集により速やかに吸光度が減少することが確認された。図９に酵素反応（２５℃）中のＮＲｓ水分散液中のＮＲｓの散乱光強度を示す。酵素を添加するとＮＲｓの凝集により速やかに散乱光強度が増加することが確認された。トリプシンの添加量が多いほど分光特性や散乱光強度は速く変化し、その変化量も大きいことが確認された。
【００７１】
〔実施例７〕
０.１mM（金原子濃度）のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１〜３（実施例２のＮＲｓ水分散液、実施例３のＮＲｓ水分散液、実施例４のＮＲｓ水分散液）を用い、１００nMトリプシン、１０mMＣａＣｌ2、５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）になるように調製してトリプシンによる酵素反応を行った。この結果、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１〜３の水分散液の色は、酵素反応前の赤色から、紫色に変化し、ｕＰＡｓｕｂが分解され、ＰＥＧ部位はＮＲｓより脱離し、ＮＲｓの水中での分散安定性が失われて凝集したことが確認された。酵素反応（２０℃で１５分間）後のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１〜３の水分散液と酵素なしで同条件においてインキュベーションしたサンプルの分光特性を示す（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１：図４、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−２：図１０、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−３：図１１）。それぞれ、酵素トリプシンを添加した後は、ＮＲｓの凝集によりシャープな分光特性が無くなっている。酵素反応（２０℃）中のＮＲｓ水分散液の分光特性で測定波長９００nmにおけるＮＲｓの吸光度の経時変化率を示す（図１２）。それぞれ、酵素を添加後、ＮＲｓの凝集により速やかに吸光度が減少することが確認された。酵素反応（２５℃）中のＮＲｓ水分散液中のＮＲｓの散乱光強度を示す（図１３）。それぞれ、酵素を添加後、ＮＲｓの凝集により速やかに散乱光強度が増加することが確認された。分光特性、吸光度の経時変化率、そして散乱光強度について、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着量の多いＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−３が最も変化量が少なかったことより、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着量により、ＮＲｓの凝集能を制御できることが確認できた。
【００７２】
〔実施例８〕
金原子とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの濃度比が１００：１となるように、ＮＲｓ水分散液とＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ水溶液を混合した（金原子濃度１ｍM）。これを室温で１２時間攪拌し、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓを金ナノロッドに吸着させた。攪拌終了後、１２０００(×g)で１０分間遠心分離し金ナノロッドを沈降させた。上澄み液を除去し、水でＮＲｓを再分散させ、ＮＲｓ水分散液を得た（ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−４水分散液）。得られたＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−４水分散液の分光特性を図１７に示す。ＮＲｓはＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの吸着前後で、ＬＳＰＲの分光特性に変化はなく、水中に安定に分散していることが分かる。
【００７３】
〔実施例９〕
０.１mM（金原子濃度）のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−４（実施例８のＮＲｓ水分散液）、５５６nMｕＰＡ、１００mMＮａＣｌ、５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）になるように調製してｕＰＡによる酵素反応を行った。この結果、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−４水分散液の色は、酵素反応前の赤色から、紫色に変化し、ＮＲｓの水中での分散安定性が失われて凝集したことが確認された。図１８に酵素反応（２０℃で１時間）後のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−４水分散液と酵素なしで同条件においてインキュベーションしたサンプルの分光特性を示す。酵素ｕＰＡを添加した後は、ＮＲｓの凝集によりシャープな分光特性が無くなっている。図１９に酵素反応（２０℃）中のＮＲｓ水分散液の分光特性で測定波長９００nmにおけるＮＲｓの吸光度の経時変化率を示す。酵素を添加後、ＮＲｓの凝集により速やかに吸光度が減少することが確認された。
【００７４】
〔比較例１〕
ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓの代わりに両末端がメトキシ基とチオール基であるＰＥＧ水溶液を用いた以外は実施例２と同様にして、金ナノロッド水分散液を得た（ＰＥＧ−ＮＲｓ−１水分散液）。得られたＰＥＧ−ＮＲｓ−１水分散液の分光特性を図２（ｄ）に示す。また、ＰＥＧ部位をリンタングステン酸によって染色し、電子顕微鏡観察を行った結果、金ナノロッドの周囲に存在が確認された（図３（ｄ））。
【００７５】
〔比較例２〕
０.１ｍM（金原子濃度）のＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１（実施例２のＮＲｓ水分散液）、１０mMＣａＣｌ2、５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）になるように混合した。この結果、ｕＰＡｓｕｂが分解されず、ＮＲｓは水中で安定に分散し、溶液の色は変化せず、凝集は観察されなかった。図８（トリプシン添加量０nMの場合）に混合（２０℃）後のＮＲｓ水分散液の分光特性で測定波長９００nmにおけるＮＲｓの吸光度の経時変化率を示す。混合後、ＮＲｓの吸光度は変化しなかった。図９（トリプシン添加量０nMの場合）に混合（２５℃）後のＮＲｓ水分散液中のＮＲｓの散乱光強度を示す。混合後、ＮＲｓの散乱光強度は変化しなかった。これらの結果より、ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１は酵素によるｕＰＡｓｕｂ分解により、ＰＥＧがＮＲｓより脱離して、ＮＲｓが凝集することが確認できた。
【００７６】
〔比較例３〕
ＰＥＧ−ｕＰＡｓｕｂ−Ｃｙｓ−ＮＲｓ−１の代わりに、比較例１で得られたＰＥＧ−ＮＲｓ−１を使用する以外は、実施例５と同様に酵素反応を行った。結果、ＰＥＧ−ＮＲｓ−１水分散液の色は赤色のままであり、凝集は観察されなかった。図１４に酵素反応（２０℃で１５分間）後のＰＥＧ−ＮＲｓ−１水分散液と酵素なしで同条件においてインキュベーションしたサンプルの分光特性を示す。酵素トリプシンを添加した後も分光特性に変化は確認されなかった。図１５に酵素反応（２０℃）中のＮＲｓ水分散液の分光特性で測定波長９００nmにおけるＮＲｓの吸光度の経時変化率を示す。酵素を添加後も吸光度に変化は確認されなかった。図１６に酵素反応（２５℃）中のＮＲｓ水分散液中のＮＲｓの散乱光強度を示す。酵素を添加後も散乱光強度に変化は確認されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】(ａ)実施例１のME−PEG−NHSのMALDI−TOF−MS（マススペクトル図）(ｂ)実施例１のPEG−uPAsub−CysのMALDI−TOF−MS（マススペクトル図）
【図２】(ａ)実施例２のPEG−uPAsub−Cys−NRs−1水分散液の分光特性（吸光スペクトル図）(ｂ)実施例３のPEG−uPAsub−Cys−NRs−2水分散液の分光特性（吸光スペクトル図）(ｃ)実施例４のPEG−uPAsub−Cys−NRs−3水分散液の分光特性（吸光スペクトル図）(ｄ)比較例１のPEG−NRs−1水分散液の分光特性（吸光スペクトル図）
【図３】(ａ)実施例２のPEG−uPAsub−Cys−NRs−1のＴＥＭ写真(ｂ)実施例３のPEG−uPAsub−Cys−NRs−2のＴＥＭ写真(ｃ)実施例４のPEG−uPAsub−Cys−NRs−3のＴＥＭ写真(ｄ)比較例１のPEG−NRs−1のＴＥＭ写真
【図４】実施例５、実施例７のPEG−uPAsub−Cys−NRs−1水分散液の分光特性（吸光スペクトル図）
【図５】実施例５のPEG−uPAsub−Cys−NRs−1水分散液の吸光度の経時変化率グラフ
【図６】実施例５のPEG−uPAsub−Cys−NRs−1の散乱光強度グラフ
【図７】実施例５のPEG−uPAsub−Cys−NRs−1のＴＥＭ写真
【図８】実施例６、比較例２のPEG−uPAsub−Cys−NRs−1水分散液の吸光度の経時変化率グラフ
【図９】実施例６、比較例２のPEG−uPAsub−Cys−NRs−1の散乱光強度グラフ
【図１０】実施例７のPEG−uPAsub−Cys−NRs−2水分散液の分光特性。（吸光スペクトル図）
【図１１】実施例７のPEG−uPAsub−Cys−NRs−3水分散液の分光特性（吸光スペクトル図）。
【図１２】実施例７のPEG−uPAsub−Cys−NRs−1〜3水分散液の吸光度の経時変化率グラフ
【図１３】実施例７のPEG−uPAsub−Cys−NRs−1〜3の散乱光強度グラフ
【図１４】比較例３のPEG−NRs−1水分散液の分光特性（吸光スペクトル図）
【図１５】比較例３のPEG−NRs−1水分散液の吸光度の経時変化率グラフ
【図１６】比較例３のPEG−NRs−1の散乱光強度グラフ
【図１７】実施例８のPEG−uPAsub−Cys−NRs−4水分散液の分光特性（吸光スペクトル図）
【図１８】実施例９のPEG−uPAsub−Cys−NRs−4水分散液の分光特性（吸光スペクトル図）
【図１９】実施例９のPEG−uPAsub−Cys−NRs−4水分散液の吸光度の経時変化率グラフ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分散媒に相溶する部位(Ａ)と、特定の酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物によって修飾されているロッド形状の金微粒子であって、上記有機物が基質ペプチド(Ｂ)の部位をリンカーとして吸着していることを特徴とする金微粒子。
【請求項２】
分散媒に相溶する部位(Ａ)の一方の末端が基質ペプチド(Ｂ)と反応する官能基を有し、基質ペプチド(Ｂ)の一方の末端が上記部位(Ａ)の官能基と反応する一級アミンを有し、基質ペプチド(Ｂ)の他方の末端が金ナノロッドに吸着するチオール基を有する有機物によって修飾されている請求項１の金微粒子。
【請求項３】
部位(Ａ)が水溶性高分子である請求項１または請求項２の金微粒子。
【請求項４】
部位(Ａ)が重合平均分子量４００００以下のポリエチレングリコールである請求項１〜請求項３の何れかに記載する金微粒子。
【請求項５】
基質ペプチド(Ｂ)がプロテアーゼの基質ペプチドである請求項１〜４の何れかに記載する金微粒子。
【請求項６】
基質ペプチド(Ｂ)が部位特異的に発現しているプロテアーゼにより分解される基質ペプチドである請求項５に記載する金微粒子。
【請求項７】
基質ぺプチド(Ｂ)が病巣特異的に発現しているプロテアーゼにより分解される基質ペプチドである請求項５に記載する金微粒子。
【請求項８】
基質ペプチド(Ｂ)が、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター(ｕＰＡ)基質ペプチド、マトリクスメタロプロテアーゼ基質ペプチドから選ばれる基質ペプチドである請求項５に記載する金微粒子。
【請求項９】
基質ペプチド(Ｂ)が、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター(ｕＰＡ)または／およびマトリクスメタロプロテアーゼで分解されるトリプシン基質ペプチド、キモトリプシン基質ペプチドから選ばれる基質ペプチドである請求項５に記載する金微粒子。
【請求項１０】
長軸長さ４００ｎｍ未満であってアスペクト比が１より大きく、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００ｎｍの範囲である請求項１〜９の何れかに記載する金微粒子。
【請求項１１】
基質ペプチド(Ｂ)がプロテアーゼにより分解され、部位(Ａ)がロッド形状の金微粒子から脱離し、プロテアーゼの発現している特定部位で該金微粒子が凝集する請求項１〜１０の何れかに記載する金微粒子。
【請求項１２】
分散媒に相溶する部位(Ａ)を含む有機物と、基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物とを反応させて、部位(Ａ)と基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物を合成する工程、該有機物の基質ペプチド(Ｂ)をリンカーとしてロッド形状の金微粒子に吸着させる工程を有する表面修飾金微粒子の製造方法。
【請求項１３】
両末端にメトキシ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を含むポリエチレングリコールと、一級アミンとチオール基を含むウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）基質ペプチドを、溶媒に溶解し、塩基を加えて攪拌し、反応させて、分散媒に相溶する部位(Ａ)と特定の酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物を合成し、該有機物によって金ナノロッドを表面処理する表面修飾金微粒子の製造方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載する凝集によって特定部位にロッド形状の金微粒子を集めることを特徴とする金微粒子の集積方法。
【請求項１５】
部位(Ａ)と基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物のロッド形状の金微粒子への吸着量によって、特定部位に該金微粒子が凝集する時間を調整する請求項１４に記載する金微粒子の集積方法。
【請求項１６】
請求項１４または請求項１５に記載する金微粒子の凝集によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルの変化で特定物質を検出することを特徴とする特定物質の検出方法。
【請求項１７】
請求項１４または請求項１５に記載する金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルを観察することを特徴とするバイオイメージング。
【請求項１８】
請求項１４または１５に記載する集積方法によって生じる金微粒子の集積部位に、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、集積部位周辺の細胞を該金微粒子の光熱変換により発生した熱で死滅させることを特徴とするフォトサーマル治療。
【請求項１９】
請求項１４または１５に記載する集積方法によって生じる金微粒子の集積部位に、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、集積部位周辺の細胞を該金微粒子の光熱変換によって発生した熱で該金微粒子に担持させた薬物を放出させることを特徴とするドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）。
【請求項１】
分散媒に相溶する部位(Ａ)と、特定の酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物によって修飾されているロッド形状の金微粒子であって、上記有機物が基質ペプチド(Ｂ)の部位をリンカーとして吸着していることを特徴とする金微粒子。
【請求項２】
分散媒に相溶する部位(Ａ)の一方の末端が基質ペプチド(Ｂ)と反応する官能基を有し、基質ペプチド(Ｂ)の一方の末端が上記部位(Ａ)の官能基と反応する一級アミンを有し、基質ペプチド(Ｂ)の他方の末端が金ナノロッドに吸着するチオール基を有する有機物によって修飾されている請求項１の金微粒子。
【請求項３】
部位(Ａ)が水溶性高分子である請求項１または請求項２の金微粒子。
【請求項４】
部位(Ａ)が重合平均分子量４００００以下のポリエチレングリコールである請求項１〜請求項３の何れかに記載する金微粒子。
【請求項５】
基質ペプチド(Ｂ)がプロテアーゼの基質ペプチドである請求項１〜４の何れかに記載する金微粒子。
【請求項６】
基質ペプチド(Ｂ)が部位特異的に発現しているプロテアーゼにより分解される基質ペプチドである請求項５に記載する金微粒子。
【請求項７】
基質ぺプチド(Ｂ)が病巣特異的に発現しているプロテアーゼにより分解される基質ペプチドである請求項５に記載する金微粒子。
【請求項８】
基質ペプチド(Ｂ)が、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター(ｕＰＡ)基質ペプチド、マトリクスメタロプロテアーゼ基質ペプチドから選ばれる基質ペプチドである請求項５に記載する金微粒子。
【請求項９】
基質ペプチド(Ｂ)が、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター(ｕＰＡ)または／およびマトリクスメタロプロテアーゼで分解されるトリプシン基質ペプチド、キモトリプシン基質ペプチドから選ばれる基質ペプチドである請求項５に記載する金微粒子。
【請求項１０】
長軸長さ４００ｎｍ未満であってアスペクト比が１より大きく、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００ｎｍの範囲である請求項１〜９の何れかに記載する金微粒子。
【請求項１１】
基質ペプチド(Ｂ)がプロテアーゼにより分解され、部位(Ａ)がロッド形状の金微粒子から脱離し、プロテアーゼの発現している特定部位で該金微粒子が凝集する請求項１〜１０の何れかに記載する金微粒子。
【請求項１２】
分散媒に相溶する部位(Ａ)を含む有機物と、基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物とを反応させて、部位(Ａ)と基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物を合成する工程、該有機物の基質ペプチド(Ｂ)をリンカーとしてロッド形状の金微粒子に吸着させる工程を有する表面修飾金微粒子の製造方法。
【請求項１３】
両末端にメトキシ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を含むポリエチレングリコールと、一級アミンとチオール基を含むウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）基質ペプチドを、溶媒に溶解し、塩基を加えて攪拌し、反応させて、分散媒に相溶する部位(Ａ)と特定の酵素で分解される基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物を合成し、該有機物によって金ナノロッドを表面処理する表面修飾金微粒子の製造方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載する凝集によって特定部位にロッド形状の金微粒子を集めることを特徴とする金微粒子の集積方法。
【請求項１５】
部位(Ａ)と基質ペプチド(Ｂ)を含む有機物のロッド形状の金微粒子への吸着量によって、特定部位に該金微粒子が凝集する時間を調整する請求項１４に記載する金微粒子の集積方法。
【請求項１６】
請求項１４または請求項１５に記載する金微粒子の凝集によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルの変化で特定物質を検出することを特徴とする特定物質の検出方法。
【請求項１７】
請求項１４または請求項１５に記載する金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルを観察することを特徴とするバイオイメージング。
【請求項１８】
請求項１４または１５に記載する集積方法によって生じる金微粒子の集積部位に、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、集積部位周辺の細胞を該金微粒子の光熱変換により発生した熱で死滅させることを特徴とするフォトサーマル治療。
【請求項１９】
請求項１４または１５に記載する集積方法によって生じる金微粒子の集積部位に、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、集積部位周辺の細胞を該金微粒子の光熱変換によって発生した熱で該金微粒子に担持させた薬物を放出させることを特徴とするドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）。
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図３】
【図７】
【図２】
【図４】
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【図６】
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【図９】
【図１０】
【図１１】
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【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図３】
【図７】
【公開番号】特開２０１０−７１６９（Ｐ２０１０−７１６９Ａ）
【公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１７１３００（Ｐ２００８−１７１３００）
【出願日】平成２０年６月３０日（２００８．６．３０）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（０００００３３２２）大日本塗料株式会社 (275)
【出願人】（０００００６２６４）三菱マテリアル株式会社 (4,417)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月３０日（２００８．６．３０）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（０００００３３２２）大日本塗料株式会社 (275)
【出願人】（０００００６２６４）三菱マテリアル株式会社 (4,417)
【Ｆターム（参考）】
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