集積化ＰＣＲ−ＣＥマイクロ流体デバイスにおける圧力を均一化するための圧力マニホールド
毛細管チャネルによって接続されていてもよい複数のウエルを有するチップ、並びにウエル及び毛細管チャネルの全てに均一の圧力をかけるためにチップ上に配置されるように構成されるマニホールド部材を含むデバイスが提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２００７年５月１５日に出願された米国特許出願番号第６０／９３８，１７１号の優先権を主張し、それは本明細書に参照によって組み入れられている。
【０００２】
［技術分野］
本発明は、毛細管チャネルによって接続されていてもよい複数のウエルを有するチップ、及びウエルとチャネルにおける液の蒸発、結露及び意図しない動きを防止するため、ウエル及び毛細管チャネルの全てに均一の圧力をかけるためにチップ上に配置されるように構成されたマニホールド部材、を含むデバイスに関する。
【背景技術】
【０００３】
Wilding及び共同研究者らがマイクロチップデバイス中のチャンバーにおいてＰＣＲを初めて実施して以来、マイクロ流体ＰＣＲが発展してきた(非特許文献１)。Northrupらは、異なる基材上に製作されたＰＣＲ反応器と毛細管電気泳動（ＣＥ）モジュールを連結したデバイスについて述べている(非特許文献２)。その後、Burnsのグループは、ＰＣＲ及びゲル電気泳動を実施可能な集積化デバイスを開発した(非特許文献３)。MathiesのグループのLagally及びACLARA Biosciences社のKohも集積化マイクロ流体デバイスにおけるＰＣＲ−ＣＥを実証した(非特許文献４及び非特許文献５)。Hessらは核酸ハイブリダイゼーションを制御するために高圧化でＰＣＲを実施するための反応器を使用した(特許文献１)。
【０００４】
ＰＣＲを行うために必要な温度は、水の沸点に近い９５℃にも達する。そのような高温では蒸発が激しく、それによって反応溶液中の濃度が変化し、そしてＰＣＲ効率が低下することがある。ＰＣＲチャンバー中の溶液内部で気泡が発生することがあり、その結果、マイクロ流体チャネル中で圧力差が生じて、目的とする領域外に液を押出してしまう（例えば、分離緩衝液がＣＥ分離チャネルの外に移動することがある）。更に、ゲルバルブ、ワックスバルブのようなバルブや多くのマイクロ流体デバイスにおいて一般的に使用される疎水性材料は再使用できず、ＰＣＲ反応の最終段階やＰＣＲ反応完了時点でのみのＰＣＲ増幅の検出にデバイスが限定されてしまう。
【０００５】
使い捨てＰＣＲデバイスは、キャリー・オーバー及び交差汚染の問題を避けることが望ましい。更に、蒸発と液の移動を防ぐためにバルブが使用できるものの、マイクロ流体ＰＣＲデバイス内へのバルブの組み込みによって、加工コストが実質的に上昇するおそれがある。バルブは一旦作動されるとその機能を失う傾向にあり、その結果、反応室から産物を連続して又は複数回サンプリングすることができなくなるので、マイクロ流体ＰＣＲシステムにおけるバルブの使用にも疑問がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第6753169号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Wilding, P., Shoffner, M.A., Kricka, L.J., PCR in a silicon microstructure，Clin. Chem., 1994, 40, 1815-1818.
【非特許文献２】Woolley, A.T., Hadley, D., Landre, Pl, deMelloA.J., Mathies, R.A., Northrup, M.A. Functional integration of PCR amplification and capillary electrophoresis in a microfabricated DNA analysis device, Anal. Chem., 1996, 68, 4081-4086.
【非特許文献３】Burns, M.A., Johnson, B.N., Brahmasandra, S.N., Handique, K, Webster, J.R., Krishnan, M., Sammarco, T.S., Man, P.M., Jones, D., Heldsinger, D., Mastrangelo, C.H., Burke,D.T., An integrated nanoliter DNA analysis device，Science, 1998, 282, 484-487.
【非特許文献４】Lagally, E.T., Simpson, P.C., Mathies,R.A., Monolithic integrated microfluidic DNA amplification and capillary electrophoresis analysis system，Sensors and Actuators B, 2000, 63, 138-146.
【非特許文献５】Koh, C.G., Tan, W., Zhao, M., Ricco, A.J.,Fan,Z.H., Integrating polymerase chain reaction, valving, and electrophoresis in a plastic device for bacterial detection，Anal. Chem., 2003, 75, 4591-4598.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
例えば、ＰＣＲサイクル中のマイクロ流体チャネル・ネットワークにおける圧力差に起因する液の蒸発、結露及び意図しない動きを抑制又は防止するために使用される、マニホールドを有するデバイスが提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
毛細管チャネルによって接続されていてもよい複数のウエルを有するチップ、及びウエル及び毛細管チャネルの全てに均一の圧力をかけるためにチップ上に配置されるように構成されるマニホールド部材を含むデバイスが提供される。
【００１０】
ＰＣＲサイクル中のウエル及びチップチャネル中の圧力差に起因するその中の液の蒸発、結露及び意図しない動きを抑制又は防止するために、マニホールド部材を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）毛細管電気泳動（ＣＥ）チップ上に配置してもよい。
【００１１】
これまでの一般的記述及び以下の詳細な記述の両者が、単に例示的かつ説明的なものであり、そしてクレームされたように本発明を制約するものではないと理解されるべきである。以下に記載される実施態様は、マイクロ流体ＰＣＲ−ＣＥチップと共にデバイスを使用することに関するものであるが、デバイス自体はそのようなチップと共に使用されることに制限されない。
【００１２】
この明細書中に組込まれ、そしてその一部を構成する添付図は、本発明の実施態様を例示し、そしてその記述と共に、本発明の原理を説明するのに役立つ。図の間で同じ参照番号が使用される場合、それらは同じ又は類似の要素を言及している。更に、この開示において記載される如何なる及び全ての参考文献は本明細書に参照によって組み入れられているものとする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のデバイスの実施態様である。
【図２】本発明のデバイスの実施態様である。
【図３】図３Ａは本発明の実施態様からの例示的測定結果を示す。図３Ｂは制御システムの測定結果を示す。
【図４】ＰＣＲ成長曲線である。
【図５】ＰＣＲ標的産物が検出可能となり始める１８サイクルでの毛細管電気泳動（ＣＥ）分離の電気泳動図である。
【図６】ゼロコピーから１０５コピーまでのＣＥ分離結果の電気泳動図である。
【図７】本発明のデバイスの別の実施態様である。
【図８】本発明のデバイスの更に別の実施態様である。
【図９】本発明のデバイスの別の実施態様である。
【図１０】本発明のデバイスの別の実施態様である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の例示的実施態様について詳細に言及するが、その実施例が添付図において図示されている。可能な限り、同じ又は同様の部品を参照するために、図全体を通して、同じ参照番号が使用されている。
【００１５】
ここに記載される本発明の実施態様は、ＰＣＲサイクル中のマイクロ流体チャネル中の圧力差に起因する液の蒸発、結露及び意図しない動きを抑制又は防止するためのマイクロ流体デバイスにおいて使用されるマニホールドである。このマニホールドは、ＰＣＲサイクル中に圧力差が生じないように、マイクロ流体デバイスのウエルとマイクロ流体チャネルを外部環境からシールすることを可能にする。また、これは外部圧力源が全てのウエルに接続されることを可能にする。外部圧力をかけると、ＰＣＲ溶液の沸点が上昇し、その結果、サーマルサイクル中での蒸発を抑制することができる。
【００１６】
本発明の実施態様を図１に示す。マイクロ流体デバイス１００はマニホールドブロック２００及びマイクロ流体ＰＣＲ−ＣＥチップ３００を含む。マニホールドブロック２００は、マイクロ流体ＰＣＲ−ＣＥチップ３００において各ウエルとインターフェイスで接続できる相互接続しているチャネル２１０を有している。マニホールドブロックは、マニホールドブロック２００の頂部上に外部圧力ポート２２０も有している。マニホールドブロック２００は一つ以上の外部圧力ポートを有していてもよく、相互接続チャネルの一つのグループが一つのポートに繋がる一方で、チャネルの別のグループが別のポートに繋がっていてもよい。ＰＣＲ−ＣＥチップ３００は、チャネル３２０によって相互接続された全部で８個のウエル３１０と共に示されているが、必要に応じて、チップはそれより多くの又はそれより少ないウエルを有していてもよく、チャネルをそれに応じて配置させればよい。チャネル３２０はウエル３１０の底部から生じてチップ３００内に延びる。各ウエルのサイズは使用目的（application）に応じて、均一であっても互いに異なっていてもよい。Ｏ−リングのようなガスケット２５０がマニホールドブロック２００とＰＣＲ−ＣＥマイクロ流体チップ３００の間に挟まれている。ウエル３１０とチャネル３２０を外部環境からシールするために、マニホールドブロック２００、ガスケット２５０及びＰＣＲ−ＣＥマイクロ流体チップ３００が一緒に固定されている。マニホールドブロック２００の頂部上のポート２２０を通して、外部圧力源１４０からの調整された外部圧力をかけることができる。マニホールドブロック２００は、マイクロ流体デバイス１００中の気体又は蒸気によって生じる圧力差を均一化するのに役立つ。マイクロ流体デバイス１００における高い加熱温度での溶液の蒸発を制御するためには、１０ｐｓｉ以上〜１００ｐｓｉ以下の圧力が使用できる。この圧力は約２０ｐｓｉ〜４０ｐｓｉ、更には約３０ｐｓｉ〜４０ｐｓｉの間であってもよい。しかしながら、この圧力は１００ｐｓｉ以下に制限されるものではない。圧力の上限はより高い圧力の必要性に応じて、例えば、溶液の沸点を更に下げるために、より高いものであってもよい。
【００１７】
ＰＣＲでは、変性工程を通じて、温度を９５℃まで上昇させることがあり、ほぼその温度周辺で、蒸発が生じ、気泡が発生することがある。マイクロ流体デバイスにおいて、これらの変化は、異なる区画及びチャネルの間での大きな圧力差の発生につながり、制御不能な液の蒸発、結露及び意図しない動きを引き起すことがある。
【００１８】
本発明の別の例示的実施態様において、図２Ａの断面図において示されるマニホールドブロック４００はアクリル樹脂で作製されている。マニホールドブロック４００は、ウエルをシールするためのＯ−リング５１５（側面図では４つのみが示されている）を載置させた合計で８個のウエル５１０を有するマイクロ流体ＰＣＲ−ＣＥチップ５００上に配置されるように設計されているが、ウエルの数は必要に応じて変更してもよい。マニホールドブロック４００内に配置される相互接続チャネル４１０は、その両端部でＰＣＲチップ５００上の各ウエル５１０とインターフェイスで接続するように構成されている。相互接続チャネル４１０は、外部圧力源（図示されていない）につながる外部ポート４２０と一体となっている。別の例示的例において、図２Ｂは異なるタイプのウエルを示し、ここで各ウエル５１０は溝５３０に加えて管状の延長部５２０を有している。管状延長部５２０は、ウエルの溝５３０の液体の容量を増すのに役立つ。管状延長部５２０の体積は約５〜５０μLの範囲から選択される。しかしながら、図２Ａに示される通り、各ウエル５１０に対して必要な必須体積は、もっぱらチップ５００内の適切な寸法を有するように決定される。尚、図２Ｂの場合におけるマニホールドブロック４００には、電圧をかけるために、相互接続チャネル４１０を通ってブロックの頂部からウエル５１０に延びている電極４４０も示されている。ウエル５１０はその構成及び必要性に応じてそのような電極を有していても又は有していなくてもよい（図１及び図２Ａには如何なる電極も示されていないが、同様に電極を有していてもよい）。電極４４０を挿入するために開けられた孔はエポキシ接着剤４５０によってシールできる。また、この例において、良好なシールを達成するために、外部ポート４２０には、反対側の端でマニホールドブロック４００の側部にプラグ４３０が設置される。
【００１９】
図２Ｃに本発明の別の実施態様を示す。この実施態様の部品は図２Ｂにおける部品に対応しており、図２Ｂにおける要素と同じ参照番号である。図２Ｂと２Ｃの実施態様の主な相違点は、図２Ｃにおける電極４４０がマニホールドブロック４００内に集積化されており、電極４４０が、空気ダクト、つまり、相互接続チャネル４１０から分離されて配置されている点である。この構成によって、より良い電極絶縁が可能となり、そしてより確実にウエルをシールできる。
【００２０】
図２Ａの本実施態様において、各ウエル５１０の容量は約２５μLである。しかしながら、各ウエルの容量は、サンプル量に対応して適宜設計され、使用目的（application）によって０．１ｎＬ〜５００μＬの範囲から選択される。尚、ＰＣＲを行う場合には、サンプル量としては１μＬ〜１００μＬの範囲が一般的である。従って、ＰＣＲチップ５００に対して使用されるウエルは、ＰＣＲサンプルを収容するために、例えば、１μＬ〜１００μＬの容量を有するように適宜設計される。例示的マニホールドブロック４００における相互接続チャネルのチャネル幅は約１ｍｍであり、その深さは約５００μｍである。このチャネル寸法は例示的なものであり、デザイン及び目標とする使用目的（application）に応じて変更してもよい。マニホールドブロック４００の例示的寸法は３７ｍｍ×２２．４ｍｍ×１２ｍｍである。しかしながら、このブロックの寸法は、ここで述べた例示的寸法に制限されない。このブロック自身の寸法は、例えば、ＰＣＲチップのウエルの数及び／又はそれらの容積サイズに応じて変更してもよい。
【００２１】
ここで、図２ＡにおけるＰＣＲを行うための例示的方法について述べる。２５μLの各ＰＣＲ反応混合物は以下を含む：１×ＰＣＲ緩衝液；０．４ｍＭ ｄＮＴＰ；３ｍＭ ＭｇＣｌ２；２５０ｎＭ フォワードプライマー ＣＴＣＡＣＣＴＡＴＧＴＧＴＣＧＡＣＣＴＧ；２５０ｎＭ リバースプライマー ＧＧＴＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＴＴＣＴＴＧ；１μL ＢＣＧゲノムＤＮＡ（１０５コピー）；及び１Ｕ ｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼ。
【００２２】
２５μLのＰＣＲ反応混合物を、ひとつのウエル５１０からＰＣＲチップ５００内に添加した。次いで、ウエル５１０に、場合により、約１μLの鉱油を積層した。次いで、マニホールドブロック４００、Ｏ−リング５１５及びＰＣＲチップ５００を一緒に固定した。この組立てられた構成において、ＰＣＲチップ５００のウエル５１０は、マニホールドブロック４００内の相互接続チャネル４１０によって共通の圧力通路を有しており、それによって如何なる圧力差であってもそのバランスをとることができ、また液の蒸発、結露及び意図しない動きを更に抑制又は防止するために、ウエル５１０に外部圧力をかけることができる。次いで、この組立てられたマニホールド−ＰＣＲチップを、サーマルサイクラー６００の加熱ブロックの頂部の上に固定した（図２Ａを参照）。マニホールドブロック４００の頂部にある外部ポート４２０を通して３０ｐｓｉの外部圧力をかけた。標準システムとマニホールドブロック−ＰＣＲチップ組立て品のＤＮＡ収率を比較するために、チューブコントロール反応も実施した。
【００２３】
以下のサイクルプロトコールを用いてＰＣＲを行った：１×９６℃、３０ｓ；及び４０×９６℃、１５ｓ、６２℃、１５ｓ、及び７２℃、３０ｓ。１μLの産物を、ＤＮＡ １０００キットを用いてアジレント バイオアナライザー（Agilent Bioanalyzer）で解析した。
【００２４】
図３Ａは、ウエルに鉱油を積層し、組立て品に対して外部源から３０ｐｓｉの圧力をかけたマニホールドブロック−ＰＣＲチップ組立て品を用いてＰＣＲを行った結果であり、ＤＮＡ産物収率が１３．７３ｎｇ／μＬであったことを示す。図３Ｂは、チューブ中でＰＣＲ反応を行ったコントロール反応の結果であり、ＤＮＡ産物収率が１７．３６ｎｇ／μＬであったことを示す。この組立構成（setup）によって１５９−ｂｐ ＢＣＧターゲットを増幅できることが実証され、その収率は、コントロールチューブ反応に対して８０％であった。
【００２５】
液の蒸発、結露及び意図しない動きを抑制又は防止するという点について、マニホールドブロック４００の有効性を示すために、表Ａにまとめた一連の異なる実験を更に行った。以下に述べる実験１〜６では、ＰＣＲウエル５１０にＢＳＡ溶液を満たし、擬似的な増幅反応としてサイクルプロトコールを開始し、最後に１０サイクル（約２６分）後のウエル中のＢＳＡ溶液の量を求めた。
【００２６】
【表１】
【００２７】
表Ａは、ＢＳＡ溶液を用いた実験１〜６及び対応する結果をまとめたものである。実験１では、マニホールドブロック４００を使用せずに、ＰＣＲチップ５００を開放したままの状態で実験を行った。その結果、１０サイクル後にウエルは乾燥し、液体は全く残っていなかった。
【００２８】
実験２では、ＰＣＲチップ５００とマニホールドブロック４００を一緒に固定したが、ＰＣＲサイクル中に外部ポート４２０を通して圧力を全くかけなかった。その結果、マニホールドの相互接続チャネル４１０中に若干の結露が生じた。また、気泡も観察され、元の溶液の約５０％だけが残っていた。
【００２９】
実験３では、マニホールドブロック４００とＰＣＲチップ５００を組立ててシールし、そして今回は、ＰＣＲサイクル中に外部ポート４２０を通して２０ｐｓｉの圧力をかけた。相互接続チャネル４１０中には、まだ若干の結露が観察されたが、ウエル５１０中の溶液には気泡は全く観察されなかった。しかしながら、ウエル５１０の各々の近傍には大きな気泡が観察された。ウエル５１０中には元の溶液の約８０％が残っていた。
【００３０】
実験４では、マニホールドブロック４００とＰＣＲチップ５００を組立ててシールし、ＰＣＲサイクル中に外部ポート４２０を通して３０ｐｓｉの圧力をかけた。この場合、相互接続チャネル４１０中には若干の結露が観察され、またウエル５１０の各々の近傍には大きな気泡が観察された。しかしながら、ウエル５１０中には元の溶液の約９０％が残っていた。
【００３１】
実験５では、ウエルに鉱油を積層し、マニホールドブロック４００とＰＣＲチップ５００を組立ててシールした。そしてＰＣＲサイクル中に外部ポート４２０を通して約３０ｐｓｉの圧力をかけた。今回は、結露が全く観察されず、溶液の約１００％がウエル中に残っていた。
【００３２】
実験６では、マニホールドブロック４００とＰＣＲチップ５００を組み立てた後に、ＰＣＲサイクル中に外部ポート４２０を通して４０ｐｓｉの圧力をかけた。この特別な組立て品では、圧力が原因でチップが剥離した。しかしながら、チップ５００として、より頑丈な構造体を用いれば、より高い圧力にも耐え得ると予測され、そのような構造体も本発明の範囲に包含される。
【００３３】
実験１〜５から、マニホールドブロックはチップ内の液の蒸発、結露及び意図しない動きの抑制又は防止に役立つことが判る。
【００３４】
鉱油はウエル中の蒸発を抑制するのに更に役立つかもしれないが、以下の実験８が示すように、鉱油は必須なものではない。
【００３５】
表Ｂに、マニホールドブロック４００、及びチップ５００と同様（図２Ｂに示されたものと同様）であるが、より高い圧力に耐えることができるより強い積層構造を有するように作られたＰＣＲ−ＣＥチップを用いた、二つの追加実験のまとめを示す。各実験では、約１時間の全継続時間、４０サイクルのＰＣＲを行った。
【００３６】
【表２】
【００３７】
実験７において、チップのより強い積層構造体は４０ｐｓｉの圧力に耐え得ることが確認された。この圧力でも剥離が全く起こらなかった。より強い材料及びより強化された構造体を用いれば、チップはもっと高い圧力に耐え得ると予測される。
【００３８】
実験８に、図４のリアルタイム４０サイクルＰＣＲ−ＣＥアッセイの結果を示す。ＰＣＲ−ＣＥチップのＣＥ分離チャネルをゲルマトリックスで満たし、２８μLのＰＣＲ反応混合物をチップチャンバーにロードした。マニホールドブロック４００及びＰＣＲ−ＣＥチップを組立て、サーマルサイクルヒーター上に設置した後、ＰＣＲサイクル中に外部ポート４２０を通して３５ｐｓｉの圧力をかけた。リアルタイム増幅を検出することができた。サイクル１４、１６、１８、２０、２２、２５及び３０でウエル間に電圧をかけることによって、チャンバーからのＰＣＲ産物サンプルを解析用のＣＥ分離チャネル内に移行誘導した。ＰＣＲ混合物中の内部マーカー（１００ｂｐのＤＮＡ）を用いて、ＰＣＲ産物のピーク面積を正規化し、図４に示すようにサイクル数に対してプロットして、リアルタイムＰＣＲ産物成長曲線を作成した。図５に、上記と同じリアルタイムＰＣＲ−ＣＥアッセイの１８サイクルでのＣＥ分離の電気泳動図を示す。標的ＰＣＲ産物サンプル（２００ｂｐ）が、１８ＰＣＲサイクル又はその近辺で検出可能となり始めることが実証された。蒸発が実質的に防止され、ＰＣＲの４０サイクル後に、基本的に１００％の液体がチャンバー中に残っていた。合計時間は１時間であり、ウエルに鉱油は使用しなかった。この例では、鉱油を使用しなくても蒸発を基本的に防止できることを示すために、鉱油を使用しなかった。
【００３９】
ＰＣＲウエルからの反応混合物の蒸発が、マニホールドと、３０ｐｓｉまでの外部圧力の印加とを組合せて使用することによって抑制された。溶液を添加した後にウエルに鉱油を添加すると、蒸発の低減に更に役立つと予測される。しかし、実験８で示されたように、本実施態様のデバイスを用いた場合には、ウエルの頂部上に鉱油を１滴滴下する一般的な方法によって、高温での蒸発を防ぐ必要がなくなる。
【００４０】
図２Ｂに示されたものと同様の構成で追加実験を実施した。これらの方法及びプロトコールは、基本的に前述の実験において報告したものと同じである。鉱油を使用せずに、３５ｐｓｉでの４０ＰＣＲサイクル エンド・ポイントＣＥアッセイを実施した結果を図６にグラフで示す。１００ｂｐ及び７００ｂｐは、内部参照マーカーを示す。実際のＰＣＲ産物は１００ｂｐ及び７００ｂｐの内部参照マーカーの間に位置する。電気泳動図Ａ〜Ｆに、１アッセイ当たり１０５〜１０のＤＮＡ標的コピー範囲の検出結果を示す。全ての実験において、全てのウエルとチャネルに対して等しい圧力を維持するために圧力マニホールドデバイスを適用すると、大量の液体の損失はなかった。
【００４１】
本発明の別の実施態様を図７に示す。この場合の圧力マニホールドブロック７００は、マイクロ流体ＰＣＲ−ＣＥチップ７１０上に配置させるための、単一のチャネルを有するブロックである。外部圧力ポート７０５が圧力マニホールドブロック７００の頂部に備わっている。マニホールドブロック７００は、ＰＣＲサーマルサイクル中にウエル７２０間に生じる圧力差を最小化又は抑制するために、マイクロ流体ウエル７２０及びチップ７１０の分離チャネル７３０の全てに亘って配置させるための蓋として機能する。シリコーンＯ−リングのようなガスケット７４０が、ウエル７２０及び分離チャネル７３０の全てを取り囲み、マニホールドブロック７００とＰＣＲ−ＣＥマイクロ流体チップ７１０の間に挟まれている。マニホールドブロック７００は、ブロック７００とチップ７１０の間に、ガスケット７４０によって共通の空隙空間が形成されるような固体ブロックであってもよい。また、図８に示されているように、マニホールドブロック７００は、チップ７１０とブロック７００の間に形成され、シールされた空洞８００を有していてもよい。図７及び８では、外部圧力ポート７０５は、空気通路（単一チャネル）７５０を通って空洞又は空隙につながっている。そして、完全なシールを確保するために、組立てられたマニホールドガスケット−ＰＣＲ−ＣＥチップは一緒に固定されている。全てのウエル７２０と分離チャネル７３０の上方の圧力を均一にするために、調節された外部圧力を、外部圧力ポート７０５を通してマニホールドブロック７００に印加することによって、チップ７１０内での溶液の蒸発、結露及び意図しない動きを抑制又は防止できる。
【００４２】
図９に、チップ７１０とマニホールドブロック７００の間に空洞８００が存在すること、及びガスケット７４０によってシールされることによって、ウエル７２０の管状延長部８１０の収容が可能となる、別の例示的実施態様を示す。ウエル７２０は溝８２０及び管状延長部８１０の両者からなっている。マニホールドブロック７００の寸法は、チップ７１０に亘って配置されるのに十分な大きさでよく、管状延長部８１０を受容れるのに十分大きなサイズの空洞を有していてもよい。図９では、マニホールドブロック７００の側部に、外部圧力ポート７０５及び空気通路７５０が示されているが、これらは頂部を含む如何なる場所に設置されていてもよい。この実施態様では、電極８３０が、ウエル７２０の各々に対して示されているが、チップ７１０のデザインによっては、全てのウエルが電極を必要とするものではない。図７及び８のような他の図では電極を示していないが、マニホールドブロックの図を単に簡略化するために電極を省略しただけである。
【００４３】
図１０に、マニホールドブロック９１０と基板９２０の間に形成され、シールされた空洞９００が、ガスケット９２５によって、マニホールドブロック９１０が基板９２０と接触する周辺の回りで密閉してシールされる、別の例示的実施態様を示す。ウエル（管状延長部）９４０及びチャネル（図示していない）を有するチップ９３０は、空洞９００内に完全に取り囲まれている。また、この実施態様では、ウエル９４０に電圧をかけるための電極は、完全にチップ９３０中に埋設されているか又はチップ９３０の上にプリントされているので、ウエルに達するためにマニホールドブロックを貫通する電極は必要ではない。サーマルサイクラー９５０は、基板９２０の底部に取り付けるか、又はその中に集積化してもよい。基板９２０は銅やアルミニウムのような金属製であっても、又はサーマルサイクラー９５０からチップ９３０に適切に熱を伝えることができるプラスチック材料製であってもよい。基板９２０の形状は、チップ９３０及びマニホールドブロック９１０の接点の両者を支えるように適切な大きさに作られる。この構成の有利な点は、マニホールドブロック９１０がチップ９３０自身を完全に取り囲むため、チップにストレス（stress）を与えてしまうような、チップ９３０への追加の接触圧力がないことである。更に、チップ９３０の積層によって、空洞９００の等しい内部空気圧のみが得られ、図９のチップ７１０に於いてのような、空洞内圧と外部空気圧の圧力差が無くなる。従って、この構成によれば、チップ９３０に剥離、漏洩又はその他のタイプの損傷が生じるおそれがより少なくなる。また、チップ９３０が全体的に取り囲まれているため、全てのウエル及びチャネルを通して確実に圧力が均一になる。
【００４４】
加圧される前又は後で、マニホールドブロックによって創出される空洞内での結露の形成を更に防ぐために、いずれの実施態様のマニホールドブロックも、対流（例えば、熱空気を吹き込む）や伝導（例えば、抵抗加熱を適用する）によって加熱すればよい。
【００４５】
マニホールドブロックの使用目的（application）は、ＰＣＲチップでの使用に限定されるものではない。マニホールドブロックの本実施態様では、ＰＣＲ−ＣＥチップでの使用に関して示しているが、マニホールドブロックは、ＰＣＲを含まない、化学的又は生物学的反応を実施するためのウエルを有するマイクロ流体デバイスにおいて圧力を均一にするためにも使用することができる。
【００４６】
また、とりわけマニホールドブロック及びマイクロ流体チップで構成されるマイクロ流体デバイス内の圧力を維持するために、マイクロ流体デバイスに加圧された空気を供給する外部圧力源を閉じることができる。例えば、外部圧力源から高圧空気を供給するチューブは、空気を遮断し、マニホールドブロック−マイクロ流体チップデバイス中の圧力を維持するため、クランプ機構や同様の機構を有していてもよい。クローズドシステムとして、マニホールドブロック及びチップが、高圧を維持しながらも可搬型にできるように、チューブはクランプ機構の近傍で着脱可能としてもよい。
【００４７】
また、マイクロ流体チップと共に、マニホールドブロックは、クローズドシステムとして、即ち、十分にシールされた外部開口部を有するシステムや如何なる外部開口部も有さないシステムとして構成してもよい。このシステムにおいては、例えば、低沸点液を有する一つのウエルを選択的に加熱することによって、又はドライアイスをウエル中に置くことによって、マニホールド内部の圧力を内部的に上げてもよい。この配置におけるマニホールドブロック内の均一化された圧力は、残りのウェル中の液の蒸発、結露及びチャネル内の液の意図しない動きを抑制又は防止するための機能を果たすことになる。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
マニホールドブロックを有する、安価で使い捨て可能なデバイスが提供される。マニホールドブロックは、ＰＣＲサイクル中のＰＣＲチップチャネル中の圧力差に起因する、チャネル中の液の蒸発、結露及び意図しない動きを抑制又は防止するために、ＰＣＲチップ上をシールする。デバイスはマイクロ流体形態において使用されるが、より巨視的な規模においても使用できる。
【００４９】
本明細書に開示された本発明の明細書及び実施を考慮すれば、本発明の他の実施態様が当業者にとって明白であろう。明細書及び実施例は単に例示的なものとして考えられ、そして本発明の範囲と精神は以下の請求の範囲によって示されることを意図するものである。
【符号の説明】
【００５０】
１００ マイクロ流体デバイス
１４０ 外部圧力源
２００、４００、７００、９１０ マニホールドブロック
２１０、４１０ 相互接続チャネル
２２０、４２０、７０５ 外部圧力ポート
２５０、７４０、９２５ ガスケット
３００、５００、７１０、９３０ チップ
３１０、５１０、７２０、９４０ ウエル
３２０、７３０ (分離)チャネル
４３０ プラグ
４４０、８３０ 電極
４５０ エポキシ接着剤
５２０、８１０ 管状延長部
５３０、８２０ 溝
５１５ Ｏ−リング
６００、９５０ サーマルサイクラー
７５０ 空気通路
８００、９００ 空洞
９２０ 基板
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２００７年５月１５日に出願された米国特許出願番号第６０／９３８，１７１号の優先権を主張し、それは本明細書に参照によって組み入れられている。
【０００２】
［技術分野］
本発明は、毛細管チャネルによって接続されていてもよい複数のウエルを有するチップ、及びウエルとチャネルにおける液の蒸発、結露及び意図しない動きを防止するため、ウエル及び毛細管チャネルの全てに均一の圧力をかけるためにチップ上に配置されるように構成されたマニホールド部材、を含むデバイスに関する。
【背景技術】
【０００３】
Wilding及び共同研究者らがマイクロチップデバイス中のチャンバーにおいてＰＣＲを初めて実施して以来、マイクロ流体ＰＣＲが発展してきた(非特許文献１)。Northrupらは、異なる基材上に製作されたＰＣＲ反応器と毛細管電気泳動（ＣＥ）モジュールを連結したデバイスについて述べている(非特許文献２)。その後、Burnsのグループは、ＰＣＲ及びゲル電気泳動を実施可能な集積化デバイスを開発した(非特許文献３)。MathiesのグループのLagally及びACLARA Biosciences社のKohも集積化マイクロ流体デバイスにおけるＰＣＲ−ＣＥを実証した(非特許文献４及び非特許文献５)。Hessらは核酸ハイブリダイゼーションを制御するために高圧化でＰＣＲを実施するための反応器を使用した(特許文献１)。
【０００４】
ＰＣＲを行うために必要な温度は、水の沸点に近い９５℃にも達する。そのような高温では蒸発が激しく、それによって反応溶液中の濃度が変化し、そしてＰＣＲ効率が低下することがある。ＰＣＲチャンバー中の溶液内部で気泡が発生することがあり、その結果、マイクロ流体チャネル中で圧力差が生じて、目的とする領域外に液を押出してしまう（例えば、分離緩衝液がＣＥ分離チャネルの外に移動することがある）。更に、ゲルバルブ、ワックスバルブのようなバルブや多くのマイクロ流体デバイスにおいて一般的に使用される疎水性材料は再使用できず、ＰＣＲ反応の最終段階やＰＣＲ反応完了時点でのみのＰＣＲ増幅の検出にデバイスが限定されてしまう。
【０００５】
使い捨てＰＣＲデバイスは、キャリー・オーバー及び交差汚染の問題を避けることが望ましい。更に、蒸発と液の移動を防ぐためにバルブが使用できるものの、マイクロ流体ＰＣＲデバイス内へのバルブの組み込みによって、加工コストが実質的に上昇するおそれがある。バルブは一旦作動されるとその機能を失う傾向にあり、その結果、反応室から産物を連続して又は複数回サンプリングすることができなくなるので、マイクロ流体ＰＣＲシステムにおけるバルブの使用にも疑問がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第6753169号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Wilding, P., Shoffner, M.A., Kricka, L.J., PCR in a silicon microstructure，Clin. Chem., 1994, 40, 1815-1818.
【非特許文献２】Woolley, A.T., Hadley, D., Landre, Pl, deMelloA.J., Mathies, R.A., Northrup, M.A. Functional integration of PCR amplification and capillary electrophoresis in a microfabricated DNA analysis device, Anal. Chem., 1996, 68, 4081-4086.
【非特許文献３】Burns, M.A., Johnson, B.N., Brahmasandra, S.N., Handique, K, Webster, J.R., Krishnan, M., Sammarco, T.S., Man, P.M., Jones, D., Heldsinger, D., Mastrangelo, C.H., Burke,D.T., An integrated nanoliter DNA analysis device，Science, 1998, 282, 484-487.
【非特許文献４】Lagally, E.T., Simpson, P.C., Mathies,R.A., Monolithic integrated microfluidic DNA amplification and capillary electrophoresis analysis system，Sensors and Actuators B, 2000, 63, 138-146.
【非特許文献５】Koh, C.G., Tan, W., Zhao, M., Ricco, A.J.,Fan,Z.H., Integrating polymerase chain reaction, valving, and electrophoresis in a plastic device for bacterial detection，Anal. Chem., 2003, 75, 4591-4598.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
例えば、ＰＣＲサイクル中のマイクロ流体チャネル・ネットワークにおける圧力差に起因する液の蒸発、結露及び意図しない動きを抑制又は防止するために使用される、マニホールドを有するデバイスが提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
毛細管チャネルによって接続されていてもよい複数のウエルを有するチップ、及びウエル及び毛細管チャネルの全てに均一の圧力をかけるためにチップ上に配置されるように構成されるマニホールド部材を含むデバイスが提供される。
【００１０】
ＰＣＲサイクル中のウエル及びチップチャネル中の圧力差に起因するその中の液の蒸発、結露及び意図しない動きを抑制又は防止するために、マニホールド部材を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）毛細管電気泳動（ＣＥ）チップ上に配置してもよい。
【００１１】
これまでの一般的記述及び以下の詳細な記述の両者が、単に例示的かつ説明的なものであり、そしてクレームされたように本発明を制約するものではないと理解されるべきである。以下に記載される実施態様は、マイクロ流体ＰＣＲ−ＣＥチップと共にデバイスを使用することに関するものであるが、デバイス自体はそのようなチップと共に使用されることに制限されない。
【００１２】
この明細書中に組込まれ、そしてその一部を構成する添付図は、本発明の実施態様を例示し、そしてその記述と共に、本発明の原理を説明するのに役立つ。図の間で同じ参照番号が使用される場合、それらは同じ又は類似の要素を言及している。更に、この開示において記載される如何なる及び全ての参考文献は本明細書に参照によって組み入れられているものとする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のデバイスの実施態様である。
【図２】本発明のデバイスの実施態様である。
【図３】図３Ａは本発明の実施態様からの例示的測定結果を示す。図３Ｂは制御システムの測定結果を示す。
【図４】ＰＣＲ成長曲線である。
【図５】ＰＣＲ標的産物が検出可能となり始める１８サイクルでの毛細管電気泳動（ＣＥ）分離の電気泳動図である。
【図６】ゼロコピーから１０５コピーまでのＣＥ分離結果の電気泳動図である。
【図７】本発明のデバイスの別の実施態様である。
【図８】本発明のデバイスの更に別の実施態様である。
【図９】本発明のデバイスの別の実施態様である。
【図１０】本発明のデバイスの別の実施態様である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の例示的実施態様について詳細に言及するが、その実施例が添付図において図示されている。可能な限り、同じ又は同様の部品を参照するために、図全体を通して、同じ参照番号が使用されている。
【００１５】
ここに記載される本発明の実施態様は、ＰＣＲサイクル中のマイクロ流体チャネル中の圧力差に起因する液の蒸発、結露及び意図しない動きを抑制又は防止するためのマイクロ流体デバイスにおいて使用されるマニホールドである。このマニホールドは、ＰＣＲサイクル中に圧力差が生じないように、マイクロ流体デバイスのウエルとマイクロ流体チャネルを外部環境からシールすることを可能にする。また、これは外部圧力源が全てのウエルに接続されることを可能にする。外部圧力をかけると、ＰＣＲ溶液の沸点が上昇し、その結果、サーマルサイクル中での蒸発を抑制することができる。
【００１６】
本発明の実施態様を図１に示す。マイクロ流体デバイス１００はマニホールドブロック２００及びマイクロ流体ＰＣＲ−ＣＥチップ３００を含む。マニホールドブロック２００は、マイクロ流体ＰＣＲ−ＣＥチップ３００において各ウエルとインターフェイスで接続できる相互接続しているチャネル２１０を有している。マニホールドブロックは、マニホールドブロック２００の頂部上に外部圧力ポート２２０も有している。マニホールドブロック２００は一つ以上の外部圧力ポートを有していてもよく、相互接続チャネルの一つのグループが一つのポートに繋がる一方で、チャネルの別のグループが別のポートに繋がっていてもよい。ＰＣＲ−ＣＥチップ３００は、チャネル３２０によって相互接続された全部で８個のウエル３１０と共に示されているが、必要に応じて、チップはそれより多くの又はそれより少ないウエルを有していてもよく、チャネルをそれに応じて配置させればよい。チャネル３２０はウエル３１０の底部から生じてチップ３００内に延びる。各ウエルのサイズは使用目的（application）に応じて、均一であっても互いに異なっていてもよい。Ｏ−リングのようなガスケット２５０がマニホールドブロック２００とＰＣＲ−ＣＥマイクロ流体チップ３００の間に挟まれている。ウエル３１０とチャネル３２０を外部環境からシールするために、マニホールドブロック２００、ガスケット２５０及びＰＣＲ−ＣＥマイクロ流体チップ３００が一緒に固定されている。マニホールドブロック２００の頂部上のポート２２０を通して、外部圧力源１４０からの調整された外部圧力をかけることができる。マニホールドブロック２００は、マイクロ流体デバイス１００中の気体又は蒸気によって生じる圧力差を均一化するのに役立つ。マイクロ流体デバイス１００における高い加熱温度での溶液の蒸発を制御するためには、１０ｐｓｉ以上〜１００ｐｓｉ以下の圧力が使用できる。この圧力は約２０ｐｓｉ〜４０ｐｓｉ、更には約３０ｐｓｉ〜４０ｐｓｉの間であってもよい。しかしながら、この圧力は１００ｐｓｉ以下に制限されるものではない。圧力の上限はより高い圧力の必要性に応じて、例えば、溶液の沸点を更に下げるために、より高いものであってもよい。
【００１７】
ＰＣＲでは、変性工程を通じて、温度を９５℃まで上昇させることがあり、ほぼその温度周辺で、蒸発が生じ、気泡が発生することがある。マイクロ流体デバイスにおいて、これらの変化は、異なる区画及びチャネルの間での大きな圧力差の発生につながり、制御不能な液の蒸発、結露及び意図しない動きを引き起すことがある。
【００１８】
本発明の別の例示的実施態様において、図２Ａの断面図において示されるマニホールドブロック４００はアクリル樹脂で作製されている。マニホールドブロック４００は、ウエルをシールするためのＯ−リング５１５（側面図では４つのみが示されている）を載置させた合計で８個のウエル５１０を有するマイクロ流体ＰＣＲ−ＣＥチップ５００上に配置されるように設計されているが、ウエルの数は必要に応じて変更してもよい。マニホールドブロック４００内に配置される相互接続チャネル４１０は、その両端部でＰＣＲチップ５００上の各ウエル５１０とインターフェイスで接続するように構成されている。相互接続チャネル４１０は、外部圧力源（図示されていない）につながる外部ポート４２０と一体となっている。別の例示的例において、図２Ｂは異なるタイプのウエルを示し、ここで各ウエル５１０は溝５３０に加えて管状の延長部５２０を有している。管状延長部５２０は、ウエルの溝５３０の液体の容量を増すのに役立つ。管状延長部５２０の体積は約５〜５０μLの範囲から選択される。しかしながら、図２Ａに示される通り、各ウエル５１０に対して必要な必須体積は、もっぱらチップ５００内の適切な寸法を有するように決定される。尚、図２Ｂの場合におけるマニホールドブロック４００には、電圧をかけるために、相互接続チャネル４１０を通ってブロックの頂部からウエル５１０に延びている電極４４０も示されている。ウエル５１０はその構成及び必要性に応じてそのような電極を有していても又は有していなくてもよい（図１及び図２Ａには如何なる電極も示されていないが、同様に電極を有していてもよい）。電極４４０を挿入するために開けられた孔はエポキシ接着剤４５０によってシールできる。また、この例において、良好なシールを達成するために、外部ポート４２０には、反対側の端でマニホールドブロック４００の側部にプラグ４３０が設置される。
【００１９】
図２Ｃに本発明の別の実施態様を示す。この実施態様の部品は図２Ｂにおける部品に対応しており、図２Ｂにおける要素と同じ参照番号である。図２Ｂと２Ｃの実施態様の主な相違点は、図２Ｃにおける電極４４０がマニホールドブロック４００内に集積化されており、電極４４０が、空気ダクト、つまり、相互接続チャネル４１０から分離されて配置されている点である。この構成によって、より良い電極絶縁が可能となり、そしてより確実にウエルをシールできる。
【００２０】
図２Ａの本実施態様において、各ウエル５１０の容量は約２５μLである。しかしながら、各ウエルの容量は、サンプル量に対応して適宜設計され、使用目的（application）によって０．１ｎＬ〜５００μＬの範囲から選択される。尚、ＰＣＲを行う場合には、サンプル量としては１μＬ〜１００μＬの範囲が一般的である。従って、ＰＣＲチップ５００に対して使用されるウエルは、ＰＣＲサンプルを収容するために、例えば、１μＬ〜１００μＬの容量を有するように適宜設計される。例示的マニホールドブロック４００における相互接続チャネルのチャネル幅は約１ｍｍであり、その深さは約５００μｍである。このチャネル寸法は例示的なものであり、デザイン及び目標とする使用目的（application）に応じて変更してもよい。マニホールドブロック４００の例示的寸法は３７ｍｍ×２２．４ｍｍ×１２ｍｍである。しかしながら、このブロックの寸法は、ここで述べた例示的寸法に制限されない。このブロック自身の寸法は、例えば、ＰＣＲチップのウエルの数及び／又はそれらの容積サイズに応じて変更してもよい。
【００２１】
ここで、図２ＡにおけるＰＣＲを行うための例示的方法について述べる。２５μLの各ＰＣＲ反応混合物は以下を含む：１×ＰＣＲ緩衝液；０．４ｍＭ ｄＮＴＰ；３ｍＭ ＭｇＣｌ２；２５０ｎＭ フォワードプライマー ＣＴＣＡＣＣＴＡＴＧＴＧＴＣＧＡＣＣＴＧ；２５０ｎＭ リバースプライマー ＧＧＴＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＴＴＣＴＴＧ；１μL ＢＣＧゲノムＤＮＡ（１０５コピー）；及び１Ｕ ｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼ。
【００２２】
２５μLのＰＣＲ反応混合物を、ひとつのウエル５１０からＰＣＲチップ５００内に添加した。次いで、ウエル５１０に、場合により、約１μLの鉱油を積層した。次いで、マニホールドブロック４００、Ｏ−リング５１５及びＰＣＲチップ５００を一緒に固定した。この組立てられた構成において、ＰＣＲチップ５００のウエル５１０は、マニホールドブロック４００内の相互接続チャネル４１０によって共通の圧力通路を有しており、それによって如何なる圧力差であってもそのバランスをとることができ、また液の蒸発、結露及び意図しない動きを更に抑制又は防止するために、ウエル５１０に外部圧力をかけることができる。次いで、この組立てられたマニホールド−ＰＣＲチップを、サーマルサイクラー６００の加熱ブロックの頂部の上に固定した（図２Ａを参照）。マニホールドブロック４００の頂部にある外部ポート４２０を通して３０ｐｓｉの外部圧力をかけた。標準システムとマニホールドブロック−ＰＣＲチップ組立て品のＤＮＡ収率を比較するために、チューブコントロール反応も実施した。
【００２３】
以下のサイクルプロトコールを用いてＰＣＲを行った：１×９６℃、３０ｓ；及び４０×９６℃、１５ｓ、６２℃、１５ｓ、及び７２℃、３０ｓ。１μLの産物を、ＤＮＡ １０００キットを用いてアジレント バイオアナライザー（Agilent Bioanalyzer）で解析した。
【００２４】
図３Ａは、ウエルに鉱油を積層し、組立て品に対して外部源から３０ｐｓｉの圧力をかけたマニホールドブロック−ＰＣＲチップ組立て品を用いてＰＣＲを行った結果であり、ＤＮＡ産物収率が１３．７３ｎｇ／μＬであったことを示す。図３Ｂは、チューブ中でＰＣＲ反応を行ったコントロール反応の結果であり、ＤＮＡ産物収率が１７．３６ｎｇ／μＬであったことを示す。この組立構成（setup）によって１５９−ｂｐ ＢＣＧターゲットを増幅できることが実証され、その収率は、コントロールチューブ反応に対して８０％であった。
【００２５】
液の蒸発、結露及び意図しない動きを抑制又は防止するという点について、マニホールドブロック４００の有効性を示すために、表Ａにまとめた一連の異なる実験を更に行った。以下に述べる実験１〜６では、ＰＣＲウエル５１０にＢＳＡ溶液を満たし、擬似的な増幅反応としてサイクルプロトコールを開始し、最後に１０サイクル（約２６分）後のウエル中のＢＳＡ溶液の量を求めた。
【００２６】
【表１】
【００２７】
表Ａは、ＢＳＡ溶液を用いた実験１〜６及び対応する結果をまとめたものである。実験１では、マニホールドブロック４００を使用せずに、ＰＣＲチップ５００を開放したままの状態で実験を行った。その結果、１０サイクル後にウエルは乾燥し、液体は全く残っていなかった。
【００２８】
実験２では、ＰＣＲチップ５００とマニホールドブロック４００を一緒に固定したが、ＰＣＲサイクル中に外部ポート４２０を通して圧力を全くかけなかった。その結果、マニホールドの相互接続チャネル４１０中に若干の結露が生じた。また、気泡も観察され、元の溶液の約５０％だけが残っていた。
【００２９】
実験３では、マニホールドブロック４００とＰＣＲチップ５００を組立ててシールし、そして今回は、ＰＣＲサイクル中に外部ポート４２０を通して２０ｐｓｉの圧力をかけた。相互接続チャネル４１０中には、まだ若干の結露が観察されたが、ウエル５１０中の溶液には気泡は全く観察されなかった。しかしながら、ウエル５１０の各々の近傍には大きな気泡が観察された。ウエル５１０中には元の溶液の約８０％が残っていた。
【００３０】
実験４では、マニホールドブロック４００とＰＣＲチップ５００を組立ててシールし、ＰＣＲサイクル中に外部ポート４２０を通して３０ｐｓｉの圧力をかけた。この場合、相互接続チャネル４１０中には若干の結露が観察され、またウエル５１０の各々の近傍には大きな気泡が観察された。しかしながら、ウエル５１０中には元の溶液の約９０％が残っていた。
【００３１】
実験５では、ウエルに鉱油を積層し、マニホールドブロック４００とＰＣＲチップ５００を組立ててシールした。そしてＰＣＲサイクル中に外部ポート４２０を通して約３０ｐｓｉの圧力をかけた。今回は、結露が全く観察されず、溶液の約１００％がウエル中に残っていた。
【００３２】
実験６では、マニホールドブロック４００とＰＣＲチップ５００を組み立てた後に、ＰＣＲサイクル中に外部ポート４２０を通して４０ｐｓｉの圧力をかけた。この特別な組立て品では、圧力が原因でチップが剥離した。しかしながら、チップ５００として、より頑丈な構造体を用いれば、より高い圧力にも耐え得ると予測され、そのような構造体も本発明の範囲に包含される。
【００３３】
実験１〜５から、マニホールドブロックはチップ内の液の蒸発、結露及び意図しない動きの抑制又は防止に役立つことが判る。
【００３４】
鉱油はウエル中の蒸発を抑制するのに更に役立つかもしれないが、以下の実験８が示すように、鉱油は必須なものではない。
【００３５】
表Ｂに、マニホールドブロック４００、及びチップ５００と同様（図２Ｂに示されたものと同様）であるが、より高い圧力に耐えることができるより強い積層構造を有するように作られたＰＣＲ−ＣＥチップを用いた、二つの追加実験のまとめを示す。各実験では、約１時間の全継続時間、４０サイクルのＰＣＲを行った。
【００３６】
【表２】
【００３７】
実験７において、チップのより強い積層構造体は４０ｐｓｉの圧力に耐え得ることが確認された。この圧力でも剥離が全く起こらなかった。より強い材料及びより強化された構造体を用いれば、チップはもっと高い圧力に耐え得ると予測される。
【００３８】
実験８に、図４のリアルタイム４０サイクルＰＣＲ−ＣＥアッセイの結果を示す。ＰＣＲ−ＣＥチップのＣＥ分離チャネルをゲルマトリックスで満たし、２８μLのＰＣＲ反応混合物をチップチャンバーにロードした。マニホールドブロック４００及びＰＣＲ−ＣＥチップを組立て、サーマルサイクルヒーター上に設置した後、ＰＣＲサイクル中に外部ポート４２０を通して３５ｐｓｉの圧力をかけた。リアルタイム増幅を検出することができた。サイクル１４、１６、１８、２０、２２、２５及び３０でウエル間に電圧をかけることによって、チャンバーからのＰＣＲ産物サンプルを解析用のＣＥ分離チャネル内に移行誘導した。ＰＣＲ混合物中の内部マーカー（１００ｂｐのＤＮＡ）を用いて、ＰＣＲ産物のピーク面積を正規化し、図４に示すようにサイクル数に対してプロットして、リアルタイムＰＣＲ産物成長曲線を作成した。図５に、上記と同じリアルタイムＰＣＲ−ＣＥアッセイの１８サイクルでのＣＥ分離の電気泳動図を示す。標的ＰＣＲ産物サンプル（２００ｂｐ）が、１８ＰＣＲサイクル又はその近辺で検出可能となり始めることが実証された。蒸発が実質的に防止され、ＰＣＲの４０サイクル後に、基本的に１００％の液体がチャンバー中に残っていた。合計時間は１時間であり、ウエルに鉱油は使用しなかった。この例では、鉱油を使用しなくても蒸発を基本的に防止できることを示すために、鉱油を使用しなかった。
【００３９】
ＰＣＲウエルからの反応混合物の蒸発が、マニホールドと、３０ｐｓｉまでの外部圧力の印加とを組合せて使用することによって抑制された。溶液を添加した後にウエルに鉱油を添加すると、蒸発の低減に更に役立つと予測される。しかし、実験８で示されたように、本実施態様のデバイスを用いた場合には、ウエルの頂部上に鉱油を１滴滴下する一般的な方法によって、高温での蒸発を防ぐ必要がなくなる。
【００４０】
図２Ｂに示されたものと同様の構成で追加実験を実施した。これらの方法及びプロトコールは、基本的に前述の実験において報告したものと同じである。鉱油を使用せずに、３５ｐｓｉでの４０ＰＣＲサイクル エンド・ポイントＣＥアッセイを実施した結果を図６にグラフで示す。１００ｂｐ及び７００ｂｐは、内部参照マーカーを示す。実際のＰＣＲ産物は１００ｂｐ及び７００ｂｐの内部参照マーカーの間に位置する。電気泳動図Ａ〜Ｆに、１アッセイ当たり１０５〜１０のＤＮＡ標的コピー範囲の検出結果を示す。全ての実験において、全てのウエルとチャネルに対して等しい圧力を維持するために圧力マニホールドデバイスを適用すると、大量の液体の損失はなかった。
【００４１】
本発明の別の実施態様を図７に示す。この場合の圧力マニホールドブロック７００は、マイクロ流体ＰＣＲ−ＣＥチップ７１０上に配置させるための、単一のチャネルを有するブロックである。外部圧力ポート７０５が圧力マニホールドブロック７００の頂部に備わっている。マニホールドブロック７００は、ＰＣＲサーマルサイクル中にウエル７２０間に生じる圧力差を最小化又は抑制するために、マイクロ流体ウエル７２０及びチップ７１０の分離チャネル７３０の全てに亘って配置させるための蓋として機能する。シリコーンＯ−リングのようなガスケット７４０が、ウエル７２０及び分離チャネル７３０の全てを取り囲み、マニホールドブロック７００とＰＣＲ−ＣＥマイクロ流体チップ７１０の間に挟まれている。マニホールドブロック７００は、ブロック７００とチップ７１０の間に、ガスケット７４０によって共通の空隙空間が形成されるような固体ブロックであってもよい。また、図８に示されているように、マニホールドブロック７００は、チップ７１０とブロック７００の間に形成され、シールされた空洞８００を有していてもよい。図７及び８では、外部圧力ポート７０５は、空気通路（単一チャネル）７５０を通って空洞又は空隙につながっている。そして、完全なシールを確保するために、組立てられたマニホールドガスケット−ＰＣＲ−ＣＥチップは一緒に固定されている。全てのウエル７２０と分離チャネル７３０の上方の圧力を均一にするために、調節された外部圧力を、外部圧力ポート７０５を通してマニホールドブロック７００に印加することによって、チップ７１０内での溶液の蒸発、結露及び意図しない動きを抑制又は防止できる。
【００４２】
図９に、チップ７１０とマニホールドブロック７００の間に空洞８００が存在すること、及びガスケット７４０によってシールされることによって、ウエル７２０の管状延長部８１０の収容が可能となる、別の例示的実施態様を示す。ウエル７２０は溝８２０及び管状延長部８１０の両者からなっている。マニホールドブロック７００の寸法は、チップ７１０に亘って配置されるのに十分な大きさでよく、管状延長部８１０を受容れるのに十分大きなサイズの空洞を有していてもよい。図９では、マニホールドブロック７００の側部に、外部圧力ポート７０５及び空気通路７５０が示されているが、これらは頂部を含む如何なる場所に設置されていてもよい。この実施態様では、電極８３０が、ウエル７２０の各々に対して示されているが、チップ７１０のデザインによっては、全てのウエルが電極を必要とするものではない。図７及び８のような他の図では電極を示していないが、マニホールドブロックの図を単に簡略化するために電極を省略しただけである。
【００４３】
図１０に、マニホールドブロック９１０と基板９２０の間に形成され、シールされた空洞９００が、ガスケット９２５によって、マニホールドブロック９１０が基板９２０と接触する周辺の回りで密閉してシールされる、別の例示的実施態様を示す。ウエル（管状延長部）９４０及びチャネル（図示していない）を有するチップ９３０は、空洞９００内に完全に取り囲まれている。また、この実施態様では、ウエル９４０に電圧をかけるための電極は、完全にチップ９３０中に埋設されているか又はチップ９３０の上にプリントされているので、ウエルに達するためにマニホールドブロックを貫通する電極は必要ではない。サーマルサイクラー９５０は、基板９２０の底部に取り付けるか、又はその中に集積化してもよい。基板９２０は銅やアルミニウムのような金属製であっても、又はサーマルサイクラー９５０からチップ９３０に適切に熱を伝えることができるプラスチック材料製であってもよい。基板９２０の形状は、チップ９３０及びマニホールドブロック９１０の接点の両者を支えるように適切な大きさに作られる。この構成の有利な点は、マニホールドブロック９１０がチップ９３０自身を完全に取り囲むため、チップにストレス（stress）を与えてしまうような、チップ９３０への追加の接触圧力がないことである。更に、チップ９３０の積層によって、空洞９００の等しい内部空気圧のみが得られ、図９のチップ７１０に於いてのような、空洞内圧と外部空気圧の圧力差が無くなる。従って、この構成によれば、チップ９３０に剥離、漏洩又はその他のタイプの損傷が生じるおそれがより少なくなる。また、チップ９３０が全体的に取り囲まれているため、全てのウエル及びチャネルを通して確実に圧力が均一になる。
【００４４】
加圧される前又は後で、マニホールドブロックによって創出される空洞内での結露の形成を更に防ぐために、いずれの実施態様のマニホールドブロックも、対流（例えば、熱空気を吹き込む）や伝導（例えば、抵抗加熱を適用する）によって加熱すればよい。
【００４５】
マニホールドブロックの使用目的（application）は、ＰＣＲチップでの使用に限定されるものではない。マニホールドブロックの本実施態様では、ＰＣＲ−ＣＥチップでの使用に関して示しているが、マニホールドブロックは、ＰＣＲを含まない、化学的又は生物学的反応を実施するためのウエルを有するマイクロ流体デバイスにおいて圧力を均一にするためにも使用することができる。
【００４６】
また、とりわけマニホールドブロック及びマイクロ流体チップで構成されるマイクロ流体デバイス内の圧力を維持するために、マイクロ流体デバイスに加圧された空気を供給する外部圧力源を閉じることができる。例えば、外部圧力源から高圧空気を供給するチューブは、空気を遮断し、マニホールドブロック−マイクロ流体チップデバイス中の圧力を維持するため、クランプ機構や同様の機構を有していてもよい。クローズドシステムとして、マニホールドブロック及びチップが、高圧を維持しながらも可搬型にできるように、チューブはクランプ機構の近傍で着脱可能としてもよい。
【００４７】
また、マイクロ流体チップと共に、マニホールドブロックは、クローズドシステムとして、即ち、十分にシールされた外部開口部を有するシステムや如何なる外部開口部も有さないシステムとして構成してもよい。このシステムにおいては、例えば、低沸点液を有する一つのウエルを選択的に加熱することによって、又はドライアイスをウエル中に置くことによって、マニホールド内部の圧力を内部的に上げてもよい。この配置におけるマニホールドブロック内の均一化された圧力は、残りのウェル中の液の蒸発、結露及びチャネル内の液の意図しない動きを抑制又は防止するための機能を果たすことになる。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
マニホールドブロックを有する、安価で使い捨て可能なデバイスが提供される。マニホールドブロックは、ＰＣＲサイクル中のＰＣＲチップチャネル中の圧力差に起因する、チャネル中の液の蒸発、結露及び意図しない動きを抑制又は防止するために、ＰＣＲチップ上をシールする。デバイスはマイクロ流体形態において使用されるが、より巨視的な規模においても使用できる。
【００４９】
本明細書に開示された本発明の明細書及び実施を考慮すれば、本発明の他の実施態様が当業者にとって明白であろう。明細書及び実施例は単に例示的なものとして考えられ、そして本発明の範囲と精神は以下の請求の範囲によって示されることを意図するものである。
【符号の説明】
【００５０】
１００ マイクロ流体デバイス
１４０ 外部圧力源
２００、４００、７００、９１０ マニホールドブロック
２１０、４１０ 相互接続チャネル
２２０、４２０、７０５ 外部圧力ポート
２５０、７４０、９２５ ガスケット
３００、５００、７１０、９３０ チップ
３１０、５１０、７２０、９４０ ウエル
３２０、７３０ (分離)チャネル
４３０ プラグ
４４０、８３０ 電極
４５０ エポキシ接着剤
５２０、８１０ 管状延長部
５３０、８２０ 溝
５１５ Ｏ−リング
６００、９５０ サーマルサイクラー
７５０ 空気通路
８００、９００ 空洞
９２０ 基板
【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛細管チャネルによって接続されていてもよいウエルを有するマイクロ流体チップと共に使用するためのマニホールドデバイスであって：
ウエル及び毛細管チャネルの全てに均一の圧力をかけるためにチップ上に配置されるように構成されるマニホールド部材
を含む当該マニホールドデバイス。
【請求項２】
マニホールド部材が、更に相互接続しているチャネルを有し、その相互接続しているチャネルの各端部がチップに向かって各ウエル上に各々配列するように構成され、その相互接続しているチャネルがマニホールド部材の面で開口部につながるように構成されており、そして各ウエルに対して一つのガスケットが存在し、かつ各ガスケットが各ウエルに配置され、マニホールド部材と各ウエルとの境界面をシールするように構成されている、請求項１記載のマニホールドデバイス。
【請求項３】
各ウエルが、管状の延長部を有する場合、ガスケットが各ウエルの管状の延長部の上に配置され、そしてマニホールドデバイスが、各管状の延長部のガスケット上に配置されるように構成される、請求項２に記載のマニホールドデバイス。
【請求項４】
マニホールド部材が全てのウエル及び毛細管チャネルに均一の圧力をかけるためにチップ上に配置されるように、マニホールド部材とチップとの境界面をシールするために、一つのガスケットがウエルと毛細管チャネルを囲む、請求項１記載のマニホールドデバイス。
【請求項５】
マニホールド部材が、全てのウエル及び毛細管チャネル覆うように空洞を有し、そしてマニホールド部材の面開口部から空洞につながる空気通路を有する、請求項４記載のマニホールドデバイス。
【請求項６】
各ウエルが管状の延長部を有し、そして空洞内でウエルをシールするために、マニホールド部材が、管状の延長部を有する各ウエルの上に配置される、請求項５記載のマニホールドデバイス。
【請求項７】
マニホールド部材がバルブ無しのマニホールドブロックである、請求項１記載のマニホールドデバイス。
【請求項８】
チップが基板上に配置され、マニホールド部材は、マニホールド部材がガスケットを介して基板と接触して、マニホールド部材と基板の間に形成された空洞内にチップを完全に囲むように構成される、請求項１記載のマニホールドデバイス。
【請求項９】
マニホールド部材は、チップのウエルに達するような電極を有する、請求項１記載のマニホールドデバイス。
【請求項１０】
チップが、チップのウエルに電圧をかけるために、マニホールド部材を通してではなく、チップの中に埋設されて又はその上にプリントされて配置される電極を有する、請求項１記載のマニホールドデバイス。
【請求項１１】
毛細管チャネルによって接続されていてもよい複数のウエルを有するマイクロ流体チップと共に使用するためのマニホールドデバイスであって：
チップ上に配置されるように構成されるマニホールド部材を含み、
マニホールド部材が、相互接続しているチャネルのグループを有し、各グループの相互接続しているチャネルの各端部が、チップに向かって各ウエル上に各々配列するように構成され、そして各グループの相互接続しているチャネルがマニホールド部材の面開口部につながるようにグループの数と同じ数の開口部が存在するように、構成されているマニホールドデバイス。
【請求項１２】
マニホールド部材と各ウエルとの境界面をシールするために、チップの各ウエルに配置されるガスケットを更に含む、請求項１１記載のマニホールドデバイス。
【請求項１３】
前記緩衝液の電気伝導率は前記緩衝液の塩又はイオンの濃度とほぼ比例する、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
チップのウエルをシールするために、マニホールド部材が、各管状の延長部上のガスケットに接触するように構成される、請求項１３記載のマニホールドデバイス。
【請求項１５】
マニホールド部材がバルブ無しのマニホールドブロックである、請求項１１記載のマニホールドデバイス。
【請求項１６】
マニホールド部材は、チップのウエルに達するような電極を有する、請求項１１記載のマニホールドデバイス。
【請求項１７】
チップが、チップのウエルに電圧をかけるために、マニホールド部材を通してではなく、チップの中に埋設されて又はその上にプリントされて配置される電極を有する、請求項１１記載のマニホールドデバイス。
【請求項１８】
デバイスにおける圧力を制御する方法であって：
毛細管チャネルによって接続されていてもよい複数のウエルを有するチップを供すること；
チップ上に配置されるマニホールド部材を供すること、ここでマニホールド部材は外部圧力を導入するための開口部を有する；
ウエルに適切な試薬と反応混合物を充填した後、マニホールド部材によってチップのウエルをシールすること；及び
マニホールド部材によりウエルとチャネルの全てに均一の圧力をかけることによって、反応プロセス中にウエルにおいて気泡が発生することを抑制又は防止するためおよび、液の蒸発、結露及び意図しない動きを抑制又は防止するために、マニホールド部材上の開口部を通して外部圧力を供すること；
を含むデバイスにおける圧力を制御する方法。
【請求項１９】
ウエルをマニホールド部材でシールする前に、ウエルに鉱油を供する工程を更に含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
毛細管チャネルによって接続されていてもよい複数のウエルを有するチップ；及び
請求項１記載のマニホールドデバイス；
を含むデバイス。
【請求項２１】
デバイスがマイクロ流体デバイスであり、そしてチップがポリメラーゼ連鎖反応及び毛細管電気泳動を行うように構成されている、請求項２０記載のデバイス。
【請求項２２】
液の蒸発、結露及び意図しない動きを抑制又は防止するために、ウエルの全てに均一の圧力をかけるためにマニホールド部材の開口部に接続された圧力源を更に含む、請求項２０記載のデバイス。
【請求項２３】
毛細管チャネルによって接続されていてもよい複数のウエルを有するチップ；及び
請求項１１記載のマニホールドデバイス；
を含むデバイス。
【請求項２４】
デバイスがマイクロ流体デバイスであり、そしてチップがポリメラーゼ連鎖反応及び毛細管電気泳動を行うように構成されている、請求項２３記載のデバイス。
【請求項２５】
相互接続しているチャネル及びウエルにおいて圧力を調整するためにマニホールド部材の各開口部に接続された圧力源を更に含む、請求項２３記載のデバイス。
【請求項１】
毛細管チャネルによって接続されていてもよいウエルを有するマイクロ流体チップと共に使用するためのマニホールドデバイスであって：
ウエル及び毛細管チャネルの全てに均一の圧力をかけるためにチップ上に配置されるように構成されるマニホールド部材
を含む当該マニホールドデバイス。
【請求項２】
マニホールド部材が、更に相互接続しているチャネルを有し、その相互接続しているチャネルの各端部がチップに向かって各ウエル上に各々配列するように構成され、その相互接続しているチャネルがマニホールド部材の面で開口部につながるように構成されており、そして各ウエルに対して一つのガスケットが存在し、かつ各ガスケットが各ウエルに配置され、マニホールド部材と各ウエルとの境界面をシールするように構成されている、請求項１記載のマニホールドデバイス。
【請求項３】
各ウエルが、管状の延長部を有する場合、ガスケットが各ウエルの管状の延長部の上に配置され、そしてマニホールドデバイスが、各管状の延長部のガスケット上に配置されるように構成される、請求項２に記載のマニホールドデバイス。
【請求項４】
マニホールド部材が全てのウエル及び毛細管チャネルに均一の圧力をかけるためにチップ上に配置されるように、マニホールド部材とチップとの境界面をシールするために、一つのガスケットがウエルと毛細管チャネルを囲む、請求項１記載のマニホールドデバイス。
【請求項５】
マニホールド部材が、全てのウエル及び毛細管チャネル覆うように空洞を有し、そしてマニホールド部材の面開口部から空洞につながる空気通路を有する、請求項４記載のマニホールドデバイス。
【請求項６】
各ウエルが管状の延長部を有し、そして空洞内でウエルをシールするために、マニホールド部材が、管状の延長部を有する各ウエルの上に配置される、請求項５記載のマニホールドデバイス。
【請求項７】
マニホールド部材がバルブ無しのマニホールドブロックである、請求項１記載のマニホールドデバイス。
【請求項８】
チップが基板上に配置され、マニホールド部材は、マニホールド部材がガスケットを介して基板と接触して、マニホールド部材と基板の間に形成された空洞内にチップを完全に囲むように構成される、請求項１記載のマニホールドデバイス。
【請求項９】
マニホールド部材は、チップのウエルに達するような電極を有する、請求項１記載のマニホールドデバイス。
【請求項１０】
チップが、チップのウエルに電圧をかけるために、マニホールド部材を通してではなく、チップの中に埋設されて又はその上にプリントされて配置される電極を有する、請求項１記載のマニホールドデバイス。
【請求項１１】
毛細管チャネルによって接続されていてもよい複数のウエルを有するマイクロ流体チップと共に使用するためのマニホールドデバイスであって：
チップ上に配置されるように構成されるマニホールド部材を含み、
マニホールド部材が、相互接続しているチャネルのグループを有し、各グループの相互接続しているチャネルの各端部が、チップに向かって各ウエル上に各々配列するように構成され、そして各グループの相互接続しているチャネルがマニホールド部材の面開口部につながるようにグループの数と同じ数の開口部が存在するように、構成されているマニホールドデバイス。
【請求項１２】
マニホールド部材と各ウエルとの境界面をシールするために、チップの各ウエルに配置されるガスケットを更に含む、請求項１１記載のマニホールドデバイス。
【請求項１３】
前記緩衝液の電気伝導率は前記緩衝液の塩又はイオンの濃度とほぼ比例する、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
チップのウエルをシールするために、マニホールド部材が、各管状の延長部上のガスケットに接触するように構成される、請求項１３記載のマニホールドデバイス。
【請求項１５】
マニホールド部材がバルブ無しのマニホールドブロックである、請求項１１記載のマニホールドデバイス。
【請求項１６】
マニホールド部材は、チップのウエルに達するような電極を有する、請求項１１記載のマニホールドデバイス。
【請求項１７】
チップが、チップのウエルに電圧をかけるために、マニホールド部材を通してではなく、チップの中に埋設されて又はその上にプリントされて配置される電極を有する、請求項１１記載のマニホールドデバイス。
【請求項１８】
デバイスにおける圧力を制御する方法であって：
毛細管チャネルによって接続されていてもよい複数のウエルを有するチップを供すること；
チップ上に配置されるマニホールド部材を供すること、ここでマニホールド部材は外部圧力を導入するための開口部を有する；
ウエルに適切な試薬と反応混合物を充填した後、マニホールド部材によってチップのウエルをシールすること；及び
マニホールド部材によりウエルとチャネルの全てに均一の圧力をかけることによって、反応プロセス中にウエルにおいて気泡が発生することを抑制又は防止するためおよび、液の蒸発、結露及び意図しない動きを抑制又は防止するために、マニホールド部材上の開口部を通して外部圧力を供すること；
を含むデバイスにおける圧力を制御する方法。
【請求項１９】
ウエルをマニホールド部材でシールする前に、ウエルに鉱油を供する工程を更に含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
毛細管チャネルによって接続されていてもよい複数のウエルを有するチップ；及び
請求項１記載のマニホールドデバイス；
を含むデバイス。
【請求項２１】
デバイスがマイクロ流体デバイスであり、そしてチップがポリメラーゼ連鎖反応及び毛細管電気泳動を行うように構成されている、請求項２０記載のデバイス。
【請求項２２】
液の蒸発、結露及び意図しない動きを抑制又は防止するために、ウエルの全てに均一の圧力をかけるためにマニホールド部材の開口部に接続された圧力源を更に含む、請求項２０記載のデバイス。
【請求項２３】
毛細管チャネルによって接続されていてもよい複数のウエルを有するチップ；及び
請求項１１記載のマニホールドデバイス；
を含むデバイス。
【請求項２４】
デバイスがマイクロ流体デバイスであり、そしてチップがポリメラーゼ連鎖反応及び毛細管電気泳動を行うように構成されている、請求項２３記載のデバイス。
【請求項２５】
相互接続しているチャネル及びウエルにおいて圧力を調整するためにマニホールド部材の各開口部に接続された圧力源を更に含む、請求項２３記載のデバイス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５２８２６４（Ｐ２０１０−５２８２６４Ａ）
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０８４３３（Ｐ２０１０−５０８４３３）
【出願日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６２６６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４３９５９
【国際公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（０００２５２３００）和光純薬工業株式会社 (105)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６２６６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４３９５９
【国際公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（０００２５２３００）和光純薬工業株式会社 (105)
【Ｆターム（参考）】
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