本発明は、非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）および１種以上のＵＲＰを含むタンパク質を提供する。本発明は、マイクロプロテイン、トキシンおよび他の関連するタンパク質性実体、ならびにこれらの実体をディスプレイする遺伝子パッケージもまた提供する。本発明は、本発明のタンパク質性実体をコードする組換えポリペプチド含有ベクター、ならびにそれらのベクターを含む宿主細胞もまた提供する。本発明の組成物は、一定の範囲の薬学的適用を含む種々の有用性を有する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも４０個の連続するアミノ酸を含む非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）であって、該ＵＲＰは血清タンパク質への非特異的結合が実質的に不可能であり、そして、
（ａ）該ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の総和が、該ＵＲＰの全体のアミノ酸の約８０％より多くを構成し；ならびに／または
（ｂ）少なくとも５０％のアミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、
ポリマー。
【請求項２】
少なくとも４０個の連続するアミノ酸を含む非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）であって、該ＵＲＰは約２４時間より長いインビトロ血清分解半減期を有し、そして、
（ａ）該ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の総和が、該ＵＲＰの全体のアミノ酸の約８０％より多くを構成し；ならびに／または
（ｂ）少なくとも５０％のアミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、
ポリマー。
【請求項３】
前記ＵＲＰが非天然アミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のＵＲＰ。
【請求項４】
前記ＵＲＰが異種タンパク質への取り込みのために選択され、異種タンパク質への該ＵＲＰの取り込みの際に、該異種タンパク質は、該ＵＲＰが欠損している対応するタンパク質と比較して、より長い血清半減期および／またはより高い溶解性を示す、請求項１または２に記載のＵＲＰ。
【請求項５】
異種タンパク質への前記ＵＲＰの取り込みの際に、該異種タンパク質は、該ＵＲＰが欠損している対応するタンパク質と比較して、少なくとも２倍長い血清分泌半減期を示す、請求項１または２に記載のＵＲＰ。
【請求項６】
異種タンパク質への前記ＵＲＰの取り込みにより、サイズ排除クロマトグラフィによって概算したとき見かけのタンパク質の分子量の少なくとも２倍の増加をもたらす、請求項１または２に記載のＵＲＰ。
【請求項７】
−４未満のＴエピトープスコアを有する、請求項１または２に記載の前記ＵＲＰ。
【請求項８】
アミノ酸は大部分が親水性残基である、請求項１または２に記載のＵＲＰ。
【請求項９】
前記ＵＲＰの少なくとも５０％のアミノ酸が、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、請求項１または２に記載のＵＲＰ。
【請求項１０】
前記ＵＲＰに含まれるグリシン残基が、該ＵＲＰの全体のアミノ酸の少なくとも約５０％を構成する、請求項１または２に記載のＵＲＰ。
【請求項１１】
グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群より単独で選択されるアミノ酸の任意の１つの型が、該ＵＲＰの全体のアミノ酸の約２０％より多くを構成する、請求項１または２に記載のＵＲＰ。
【請求項１２】
グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群より単独で選択されるアミノ酸の任意の１つの型が、前記ＵＲＰの全体のアミノ酸の約４０％より多くを構成する、請求項１または２に記載のＵＲＰ。
【請求項１３】
前記ＵＲＰが約１００個より多くの連続するアミノ酸を含む、請求項１または２に記載のＵＲＰ。
【請求項１４】
前記ＵＲＰが約２００個より多くの連続するアミノ酸を含む、請求項１または２に記載のＵＲＰ。
【請求項１５】
反復配列を含む、請求項１または２に記載のＵＲＰ。
【請求項１６】
グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群より単独で選択されるアミノ酸の任意の１つの型が、前記ＵＲＰの全体のアミノ酸の５０％より多くを構成する、請求項１または２に記載のＵＲＰ。
【請求項１７】
前記１種以上のＵＲＰがタンパク質に関して異種である、請求項１または２に記載の１種以上のＵＲＰを含むタンパク質。
【請求項１８】
エフェクターモジュールを含む、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項１９】
結合モジュールを含む、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項２０】
エフェクターモジュールおよび結合モジュールを含む、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項２１】
複数の結合モジュールを含み、個々の該結合モジュールが同じまたは異なる標的に対する結合特異性を示す、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項２２】
凝集体中のＵＲＰの全長が約１５０アミノ酸を超える、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項２３】
１個以上の結合モジュールを含み、該結合モジュールが、システインの骨格内対合によって形成されるジスルフィド含有骨格を含む、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項２４】
細胞傷害性であるエフェクターモジュールを含む、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項２５】
標的分子に特異的な結合モジュールを含み、該標的が、細胞表面タンパク質、分泌タンパク質、細胞質ゾルタンパク質、および核タンパク質からなる群より選択される、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項２６】
標的分子に特異的な結合モジュールを含み、該標的がイオンチャネルである、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項２７】
前記ＵＲＰが欠損している対応するタンパク質と比較して、少なくとも２倍長い血清分泌半減期を示す、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項２８】
少なくとも３反復単位のアミノ酸配列を含む非天然タンパク質であって、各反復単位が少なくとも６アミノ酸を含み、少なくとも３反復単位の約６個〜約１５個の連続するアミノ酸を含むセグメントの大部分が１つ以上のネイティブヒトタンパク質に存在する、非天然タンパク質。
【請求項２９】
前記反復単位内に約９個〜約１５個の連続するアミノ酸を含むセグメントの大部分が１つ以上のネイティブヒトタンパク質に存在する、請求項２８に記載のタンパク質。
【請求項３０】
前記タンパク質中に約６個〜約１５個の連続するアミノ酸を含む各セグメントが少なくとも１つのネイティブヒトタンパク質中に存在する、請求項２８に記載のタンパク質。
【請求項３１】
前記タンパク質中に約９個〜約１５個の連続するアミノ酸を含む各セグメントが少なくとも１つのネイティブヒトタンパク質中に存在する、請求項２８に記載のタンパク質。
【請求項３２】
前記少なくとも３つの反復単位が約８０％より多くの配列同一性を共有する、請求項２８に記載のタンパク質。
【請求項３３】
前記各反復単位が約６個〜約１５個の連続するアミノ酸を含む、請求項２８に記載のタンパク質。
【請求項３４】
前記各反復単位が約９個の連続するアミノ酸を含む、請求項２８に記載のタンパク質。
【請求項３５】
結合モジュール、エフェクターモジュール、多量体化モジュール、Ｃ末端モジュール、およびＮ末端モジュールからなる群より選択される１つ以上のモジュールを含む、請求項２８に記載のタンパク質。
【請求項３６】
個々の反復単位が非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）を含む、請求項２８に記載のタンパク質。
【請求項３７】
前記ＵＲＰは少なくとも４０個の連続するアミノ酸を含み、該ＵＲＰは血清タンパク質への非特異的結合が実質的に不可能であり、そして、
（ａ）該ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の総和が、該ＵＲＰの全体のアミノ酸の約８０％より多くを構成し；ならびに／または
（ｂ）少なくとも５０％のアミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、
請求項３６に記載のタンパク質。
【請求項３８】
前記ＵＲＰは約２４時間より長いインビトロ血清分解半減期を有し、そして、
（ａ）該ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の総和が、該ＵＲＰの全体のアミノ酸の約８０％より多くを構成し；ならびに／または
（ｂ）少なくとも５０％のアミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、
請求項３６に記載のタンパク質。
【請求項３９】
請求項１または２に記載のＵＲＰをコードするコード配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項４０】
請求項１７に記載のタンパク質をコードするコード配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項２８に記載のタンパク質をコードするコード配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項４２】
請求項４０に記載の組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項４３】
請求項４１に記載の組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項４４】
請求項４０に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４５】
請求項４１に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４６】
請求項４４に記載のベクターの１つより多くを含む発現ベクターの選択ライブラリー。
【請求項４７】
請求項４５に記載のベクターの１つより多くを含む発現ベクターの選択ライブラリー。
【請求項４８】
請求項４６に記載のライブラリーをディスプレイする遺伝子パッケージ。
【請求項４９】
請求項４７に記載のライブラリーをディスプレイする遺伝子パッケージ。
【請求項５０】
非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）を含むタンパク質を産生する方法であって：
（ｉ）該タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する工程であって、該タンパク質は１つ以上のＵＲＰを含み、該ＵＲＰは少なくとも４０個の連続するアミノ酸を含み、該ＵＲＰは血清タンパク質への非特異的結合が実質的に不可能であり、そして、
（ａ）該ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の総和が、該ＵＲＰの全体のアミノ酸の約８０％より多くを構成し；ならびに／または
（ｂ）少なくとも５０％のアミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、工程と；
（ｉｉ）該ポリヌクレオチドからの該タンパク質の発現をもたらすための条件下で、適切な培養培地中で該宿主細胞を培養する工程と
を包含する方法。
【請求項５１】
前記ＵＲＰが約２４時間よりも長いインビトロ血清分解半減期を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記宿主細胞が真核細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記宿主細胞が原核細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
タンパク質の血清分泌半減期を増加させる方法であって：
該タンパク質を１つ以上の非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）と融合させる工程であって、該ＵＲＰは少なくとも約４０個の連続するアミノ酸を含み、そして、
（ａ）該ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の総和が、該ＵＲＰの全体のアミノ酸の約８０％より多くを構成し；ならびに／または
（ｂ）少なくとも５０％のアミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いており、該ＵＲＰは血清タンパク質への非特異的結合が実質的に不可能である、工程
を包含する方法。
【請求項５６】
タンパク質の血清分泌半減期を少なくとも２倍延長する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
遺伝子パッケージ上にディスプレイされる、標的と外因性タンパク質との間の特異的相互作用の存在または不在を検出する方法であって、該タンパク質は、１つ以上の非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）を含み、該方法は：
（ａ）１つ以上の非構造組換えポリマー（ＵＲＰ）を含むタンパク質をディスプレイする遺伝子パッケージを提供する工程；
（ｂ）安定なタンパク質−標的複合体を産生するために適切な条件下で、遺伝子パッケージを該標的と接触させる工程；および
（ｃ）該遺伝子パッケージ上での安定なタンパク質−標的複合体の形成を検出し、それによって、特異的相互作用の存在を検出する工程
を包含する方法。
【請求項５８】
前記外因性タンパク質をコードする前記遺伝子パッケージからヌクレオチド配列を得る工程をさらに包含する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記特異的相互作用の存在または不在が、前記ＵＲＰと血清タンパク質を含む標的との間である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記特異的相互作用の存在または不在が、前記ＵＲＰと血清プロテアーゼを含む標的との間である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記標的または前記タンパク質が、細胞表面タンパク質、分泌タンパク質、細胞質ゾルタンパク質、および核タンパク質からなる群より選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記遺伝子パッケージがファージである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＵＲＰが少なくとも約４０個の連続するアミノ酸を含み、該ＵＲＰは血清タンパク質への非特異的結合が実質的に不可能であり、そしてさらに、
（ａ）ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の総和が、全体のアミノ酸の約８０％より多くを構成し；ならびに／または
（ｂ）少なくとも５０％のアミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、
請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＵＲＰが少なくとも約４０個の連続するアミノ酸を含み、該ＵＲＰが約２４時間よりも長いインビトロ血清分解半減期を有する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＵＲＰが非天然アミノ酸配列を含む、請求項５０、５５、または５７に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＵＲＰが−４以下のＴエピトープスコアを有する、請求項５０、５５、または５７に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＵＲＰがＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴニズムによって決定したとき二次構造を欠いている、請求項５０、５５、または５７に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＵＲＰに含まれるグリシン残基が、該ＵＲＰの全体のアミノ酸の少なくとも約５０％を構成する、請求項５０、５５、または５７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＵＲＰに含まれるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）の残基の総和が、該ＵＲＰの全体のアミノ酸の約６０％より多くを構成する、請求項５０、５５、または５７に記載の方法。
【請求項７０】
グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群より選択されるアミノ酸の１つの型が、前記ＵＲＰの全体のアミノ酸の５０％より多くを構成する、請求項５０または５１に記載のＵＲＰ。
【請求項７１】
前記ＵＲＰが１００個より多くの連続するアミノ酸を含む、請求項５０、５５、または５７に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＵＲＰが反復配列を含む、請求項５０、５５、または５７に記載の方法。
【請求項７３】
前記タンパク質が治療タンパク質である、請求項５０、５５、または５７に記載の方法。
【請求項７４】
前記タンパク質が、結合モジュール、エフェクターモジュール、多量体化モジュール、Ｃ末端モジュール、およびＮ末端モジュールからなる群より選択される１つ以上のモジュールを含む、請求項５０、５５、または５７に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５】

【図４６】

【図４７】

【公表番号】特表２００９−５４３５４１（Ｐ２００９−５４３５４１Ａ）
【公表日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５８４０３（Ｐ２００８−５５８４０３）
【出願日】平成１９年３月６日（２００７．３．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００５９５２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０３５１５
【国際公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【出願人】（５０８０９１４１０）アムニクス，　インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】