非組み換え宿主におけるエタノール産生
発酵主生成物としてエタノールを産生する非組み換え細菌、関連する核酸及びポリペプチド、この細菌を用いてエタノールを製造する方法、並びにキットを開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本発明は、２００６年５月１日出願の米国特許仮出願第６０／７９６，６５２号及び２００７年９月２９日出願の同第６０／８４８，２３４号の優先権を主張し、その全ての内容を参照として本明細書に明確に組み込む。
【０００２】
（米国政府の委託研究）
本発明は、助成金第ＤＥ-ＦＧ３６−０４ＧＯ１４０１９号に基づき、米国エネルギー省により一部が助成された。従って、米国政府は、本発明に対するある特定の権利を有している。
【背景技術】
【０００３】
エタノールは、少なくとも一部の石油に置換わる魅力的な代替輸送燃料である（Kheshgi, et al., 2000, Wooley, et al., 1999）。エタノールは現在米国においてサッカロマイセス・セレヴィシエ（Bothast, et al., 2005）を用いてコンスターチからグルコースを醗酵させることにより産生されているが、この工程を自動車燃料必要量の大部分を産生するように拡張することは、食品及び飼料産業に悪影響を与えるであろう。
【０００４】
リグノセルロース系バイオマスは、食品及び飼料の供給に影響を与えることなく、適切な前処理の後にエタノールへと発酵させることができる魅力的な代替原料である（Wyman, et al., 2003, Zaldivar, et al., 2001）。コンスターチとは対照的に、バイオマスは、酵母による発酵に対抗する相当量のペントース糖を含有している。
【０００５】
複合糖類のエタノールへの変換は、ヘキソース及びペントース糖の両方を効果的に発酵させる微生物生体触媒を必要とする。この目標に向けて、異種遺伝子が酵母、Ｚ．モビリス及び大腸菌のような土台生物に添加されている、組み換え生物が開発されている。例えば、ザイモモナス モビリス由来のｐｄｃ及びａｄｈ遺伝子を含有している組み換えのエタノール産生性の大腸菌は、ヘキソース及びペントース糖の両方をエタノールへ高速及び高収率で発酵させる（Ingram, et al., 1999）。加えて、ペントース利用のための遺伝子の添加による酵母及びＺ．モビリスの遺伝子操作は、組み換えエタノール産生性の大腸菌のペントース発酵特性に合致する生体触媒をもたらさなければならない（Kuyper, et al., 2005, Mohagheghi, et al., 2004）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のように、リグノセルロース供給原料のエタノールへの変換は、ヘキソース及びペントース糖の両方を効果的に発酵させる微生物生体触媒を必要とする。そのような微生物生体触媒は、そこにおいて異種遺伝子が、例えば、ザイモモナス・モビリス及び大腸菌といった酵母及び細菌のような土台の生物に添加されているような、組み換え生物を含む。
【０００７】
しかし、大規模な燃料生産のための組み換え生物の使用は、いくらか商業化への障壁があると考えられている。非組み換えエタノール産生の開発は、リグノセルロース原料からの商業的エタノール生産の障壁と考えられているものの一種を減少させることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明は、少なくとも部分的に、エタノール非産生性の微生物におけるホモエタノール経路を介する解糖に指向し直した変異の発見、及びこの発見に基づく嫌気性条件下でグルコース及びキシロースをエタノールへ発酵させる非組み換えのエタノール産生性微生物の開発に基づいている。特に、ｐｄｈオペロンはホモエタノール経路の由来源として認識されている。より具体的には、ｐｄｈオペロン内のｌｐｄ遺伝子は、嫌気性条件下で、例えば大腸菌によるホモエタノール発酵に関与するとして認識されている。
【０００９】
よって、一態様では、本発明は、非組み換え細菌を嫌気性条件下で糖１モル当たり４モルのＮＡＤＨを産生できるようにする変異を含んでなる、単離した非組み換え細菌を提供する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、非組み換え細菌が嫌気性条件下で発酵主生成物としてエタノールを産生することを可能にする、１つ又はそれ以上の変異を伴うｌｐｄ遺伝子を含んでなる、単離した非組み換え細菌を提供する。
【００１１】
本発明は、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（ＬＰＤ）ポリペプチド又はその機能的断片をコードする、単離した核酸分子を提供する。核酸分子が細胞、例えば細菌に発現すると、細胞は発酵主生成物としてエタノールを産生する。
【００１２】
よって、別の態様では、本発明は、核酸分子が、
（ａ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列と少なくとも６０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；
（ｂ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列を含んでなる核酸の、少なくとも１００ヌクレオチドの断片を含有してなる核酸分子；
（ｃ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｄ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片をコードする核酸分子であって、当該断片が配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列の少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基を含有してなる、核酸分子；
（ｅ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの天然のアレル変異体をコードする核酸分子であって、当該核酸分子がストリンジェントな条件下で配列番号１若しくは配列番号３に記載の配列を含有する核酸分子の相補配列とハイブリダイズする、核酸分子；
（ｆ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列を含んでなる核酸分子；
（ｇ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸分子；
からなる群より選択されて、当該核酸分子が、細胞内で発現すると、細胞が発酵主生成物としてエタノールを産生できるようにする、単離した核酸分子を提供する。
【００１３】
本発明は、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼポリペプチド又はその機能的断片をコードする単離した核酸分子を提供する。ポリペプチドが細胞、例えば細菌に発現すると、細胞は発酵主生成物としてエタノールを産生する。
【００１４】
よって、別の態様では、本発明は、ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片であって、当該断片が配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含有してなる、ポリペプチドの断片；
（ｂ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの天然のアレル変異体であって、当該ポリペプチドがストリンジェントな条件下で配列番号１若しくは配列番号３に記載の配列を含有する核酸分子の相補配列とハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、アレル変異体；
（ｃ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含んでなる核酸に少なくとも５０％の相同性である核酸分子によってコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２若しくは配列番号４に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性であるアミノ酸配列を含有してなるポリペプチド； 並びに
（ｅ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなる単離したポリペプチド；
からなる群より選択されて、当該ポリペプチドが、細胞内で発現すると、細胞が発酵主生成物としてエタノールを産生できるようにする、ポリペプチドを提供する。
【００１５】
一態様では、細胞により産生されたエタノールが、嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する。この様態の別の態様では、ポリペプチドは、嫌気性条件化でジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ活性を有する。更なる態様では、細胞は細菌細胞である。
【００１６】
更なる態様では、本発明は、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼポリペプチド又はその断片をコードする単離した核酸分子を含有する細菌宿主細胞を提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、方法が、
（ａ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列含んでなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片であって、当該断片が配列番号２又は配列番号４に記載の配列の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含有してなる、ポリペプチドの断片；並びに
（ｃ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの天然のアレル変異体であって、当該ポリペプチドが、ストリンジェントな条件下で配列番号１若しくは配列番号３に記載の配列を含んでなる核酸分子の相補配列とハイブリダイズする核酸分子によりコードされる、アレル変異体；
からなる群より選択されるポリペプチドを産生する方法であって、
核酸分子を発現する条件下でジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼポリペプチド又はその断片をコードする単離した核酸分子を含有する細菌宿主細胞を培養することを含んでなる、ポリペプチドを産生する方法を提供する。
【００１８】
更なる態様では、本発明は、上述の単離した核酸分子を含んでなる、上記のような非組み換え細菌を提供する。
【００１９】
本発明の更なる態様では、１つ又はそれ以上の変異を伴うｌｐｄ遺伝子を含有してなる非組み換え細菌であって、当該変異は非組み換え細菌が嫌気性条件下で発酵主生成物としてエタノールを産生することができるようにするものであり、そして細菌が、
（ａ）糖の多い培地で嫌気性生育条件下で、細菌の候補の変異株を生育させること；及び
（ｂ）発酵の主生成物としてエタノールを産生する変異体を選択すること：
の段階を含有してなる工程により製造される、非組み換え細菌を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、工程が、
（ａ）糖の多い培地で嫌気性生育条件下で、細菌の候補の変異株を生育させること；及び
（ｂ）発酵の主生成物としてエタノールを産生する変異体を選択すること：
を含有してなる、本発明のエタノール産生性の非組み換え細菌を製造する方法を提供する。
【００２１】
一態様では、本発明は、ｌｐｄ遺伝子における変異がＮＡＤＨ非感受性をもたらす、上記態様の何れかの単離した非組み換え細菌を提供する。
【００２２】
上述の様態の別の態様では、変異がｌｐｄ遺伝子における変異に起因する。特定の態様では、ｌｐｄ遺伝子における変異がＮＡＤＨ非感受性をもたらす。
【００２３】
別の態様では、本発明は、オリゴ糖源からエタノールを産生するための方法を提供する。方法は、オリゴ糖を上述のような本発明の非組み換え細菌又は宿主細胞と接触させて、それによってオリゴ糖源からエタノールを産生することを含んでなる。方法の特定の態様では、オリゴ糖は、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン、及びこれらの組み合わせの何れかからなる群より選択される。
【００２４】
更に別の態様では、本発明は、上述のような本発明の非組み換え細菌又は宿主細胞、及び本明細書に記載の方法及び工程によってエタノールを製造するのための説明書を含有してなるキットを提供する。一態様では、キットは糖供給源を含有している。
【００２５】
更に別の態様では、本発明は、２００６年９月２７日に、ｔｈｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ、 1815 N. University Street, Peoria, IL, USA）に寄託された、ＡＨ２１８（ＮＲＲＬ Ｂ-３０９６７）、ＡＨ２４１（ＮＲＲＬ Ｂ-３０９６８）、ＡＨ２４２（ＮＲＲＬ Ｂ-３０９６９）、ＳＥ２３７７（ＮＲＲＬ Ｂ-３０９７０）、ＳＥ２３７８（ＮＲＲＬ Ｂ-３０９７１）、ＳＥ２３８２（ＮＲＲＬ Ｂ-３０９７２）、ＳＥ２３８３（ＮＲＲＬ Ｂ-３０９７３）、ＳＥ２３８４（ＮＲＲＬ Ｂ-３０９７４）、及びＳＥ２３８５（ＮＲＲＬ Ｂ-３０９７５）株を含む、新規な大腸菌株を提供する。
【００２６】
本発明の他の特性及び利点は、下記の詳細の説明及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本発明の全範囲を明確に理解するために、以下の定義を記述する。
Ｉ．定義
本明細書で用いる「非組み換え宿主細菌」及び「細菌」という用語は、非相同性ポリヌクレオチド配列を含む又は含まず、そして例えば、トランスフェクトされるような、例えば、非相同性ポリヌクレオチド配列を取り込むことができる、例えば、遺伝子操作に適している、本発明の組成物及び方法を用いる更なる修飾に適している、細菌細胞を包含するように意図されている。前記用語は、もともとトランスフェクトされている細胞の子孫を含むように意図されている。特定の態様では、細胞は、グラム陽性細菌の細胞又はグラム陰性細菌の細胞である。「細菌由来のポリヌクレオチド又は遺伝子」のような「由来の」という用語は、表記された供給源（即ち、細菌）からのポリヌクレオチドセグメントの単離（全体又は部分）、又は表記された供給源（即ち、細菌）からのポリペプチドの精製を含むことを意図している。これに関して、この用語は、例えば、直接的なクローニング、ＰＣＲ増幅、又は表示されたポリヌクレオチド原料に関連する配列由来の若しくはそれに基づく人工的な合成を含むことを意図している。
【００２８】
「嫌気性条件」という用語は、酸素を含有しない条件、即ちそこには実質的に酸素が存在しない条件を含むことを意図している。本発明のある特定の態様では、嫌気性条件は、密閉された管又は容器、例えばストッパーで密閉された管を含有してなる。酸素を含まない条件を作成するために、気相を真空ポンプを用いて管又は容器から除去して、窒素ガスに置き換える。酸素レベルが検出できないほど低い場合、酸素は実質的に存在しない。「好気性条件」という用語は、酸素を含有する条件、即ちそこには酸素が存在している条件を含むことを意図している。
【００２９】
「エタノール産生性」という用語は、糖質から発酵主生成物としてエタノールを産生する微生物の能力を含むことを意図している。この用語は、天然のエタノール産生性の生物、天然の又は導入された突然変異を有するエタノール産生性の生物を含むことを意図している。
【００３０】
「エタノール非産生性」という用語は、糖質から発酵主生成物としてエタノールを産生できない細胞の能力を含むことを意図している。この用語は、非気体状発酵生成物の全量の４０％より少ない、少量発酵生成物としてエタノールを産生する微生物を含むことを意図している。
【００３１】
「発酵する(fermenting)」及び「発酵（fermentation)」という用語は、複合糖の分解又は解重合、及びこの糖残基のエタノール、アセテート及びスクシネートへの生物変換を含むことを意図している。この用語は、エタノールが、特に主要な発酵生成物として糖質から産生される、酵素の処理工程（例えば、細胞性又は無細胞性、例えば、溶解又は精製されたポリペプチド混合物）を包含することを意図している。
【００３２】
「発酵主生成物」及び「主要発酵生成物」という用語は、本明細書では交換可能に用いられ、非気体状生成物の全量の約５０％より多くを含有する発酵の非気体状生成物を含むことを意図している。発酵主生成物は、最も多い非気体状生成物である。本発明のある特定の態様では、発酵主生成物が、エタノールである。
【００３３】
本明細書で用いる「少量発酵生成物」という用語は、非気体状生成物の全量の４０％より少ない発酵の非気体状生成物を含むことを意図している。
【００３４】
本明細書で用いる「ホモエタノール発酵経路」という用語は、発酵主生成物としてのエタノールの産生を容易にする、生物、例えば、細菌における発酵経路を含むことを意図している。
【００３５】
本明細書で用いる「発酵の代替的経路」という用語は、そこではエタノールが発酵主生成物ではない、発酵経路を含むことを意図している。
【００３６】
本明細書で用いる「遺伝子」という用語は、例えば、ポリペプチドをコードする連続オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のようなコーディング配列を包含してもよく、又はそれ自身が生体内で機能を有していてもよい、酵素又はその他のポリペプチド分子を直接合成することができる核酸である。生体内の遺伝子は、本明細書で明示されるように、オペロンに集合させることができ、ここにおけるオペロンは、遺伝子間ＤＮＡによって他の遺伝子及び／又はオペロンから単離される。オペロン中に含まれる個々の遺伝子は、個々の遺伝子の間にある遺伝子間ＤＮＡなしで、重なり合うことができる。更に、「遺伝子」という用語は、選択された目的のための特定の遺伝子を含むことを意図している。遺伝子は、宿主細胞に内因性であってもよいし、例えばエピソームに保持されたプラスミド又はゲノムに安定に組み入れられたプラスミド（又はその断片）のように、宿主細胞に組み換え技術によって導入されていてもよい。異種遺伝子は、細胞内に導入される遺伝子であり、その細胞自生のものではない。
【００３７】
「ｐｄｈオペロン」及び「ｐｄｈ遺伝子座」という用語は、交換可能に用いられて、群として発現される遺伝子のＰｄｈＲ、ｌｐｄ及びａｃｅＥＦのクラスター、並びにそれらの関連するプロモーター及びオペレーターを示すことを意図している。言い換えれば、「ｐｄｈオペロン」という用語は、そのオペロンをコードする遺伝子を示し、一方「ＰＤＨ」という用語は、そのオペロンによりコードされるタンパク質の複合体を示す。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性は、ＴＣＡ回路のためのアセチルＣｏＡの産生及びエネルギー産生に関与している。用語ｐｄｈオペロンは、何れかの好気性生物由来のｐｄｈオペロンを包含することができる。真核生物からヒトまで、全ての好気性生物は、ＰＤＨの３つの構成要素を含有している。多くの細菌は、オペロンに含有されるＰＤＨをコードする遺伝子を有している。３つの遺伝子、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ及びｌｐｄはＰＤＨの活性にとって極めて重要であり、これらの３つの遺伝子は、好気性生物がオペロンとして又は独立した遺伝子としての何れで組織されていても、全ての好気性生物中に見出される。
【００３８】
「ジヒドロリポアミド アセチルトランスフェラーゼ」（ａｃｅＦ）という用語は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子座のＥ２アセチルトランスフェラーゼ酵素を含むことを意図している。言い換えれば、「ａｃｅＦ」という用語は、ジヒドロリポアミド アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を意味して、一方で用語「ＡｃｅＦ」は、ａｃｅＦ遺伝子産物、即ちジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼのポリペプチド又は酵素を意味する。
【００３９】
「ＰＤＨ複合体のピルビン酸デカルボキシラーゼ／デヒドロゲナーゼ」（ａｃｅＥ）という用語は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子座のＥ１デカルボキシラーゼ酵素を含むことを意図している。言い換えれば、用語「ａｃｅＥ」は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ／デヒドロゲナーゼ遺伝子示し、一方で「ＡｃｅＥ」はａｃｅＥ遺伝子産物、即ちピルビン酸デカルボキシラーゼ／デヒドロゲナーゼのポリペプチド又は酵素を意味する。
【００４０】
「ピルビン酸デヒドロゲナーゼリプレッサー」（ｐｄｈＲ）という用語は、ｐｄｈオペロンの転写リプレッサーを含むことを意図している。言い換えれば、用語「ｐｄｈＲ」は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼリプレッサー遺伝子を意味して、一方で用語「ＰｄｈＲ」は、ｐｄｈＲ遺伝子産物、即ちピルビン酸デヒドロゲナーゼリプレッサーポリペプチドを意味する。
【００４１】
「ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ」（ｌｐｄ）という用語は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子座又は「ｐｄｈオペロン」の部分である酵素を含むことを意図している。言い換えれば、用語「ｌｐｄ」は、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ遺伝子を意味して、一方で用語「ＬＰＤ」は、ｌｐｄ遺伝子産物、即ちジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼのポリペプチド又は酵素を意味する。
【００４２】
「乳酸デヒドロゲナーゼ」（ｌｄｈＡ）という用語は、発酵性条件下でピルビン酸を乳酸に変換する酵素を含むことを意図している。言い換えれば、用語「ｌｄｈＡ」は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を意味して、一方で用語「ＬＤＨＡ」は、ｌｄｈＡ遺伝子産物、即ち乳酸デヒドロゲナーゼのポリペプチド又は酵素を意味する。
【００４３】
「ピルビン酸ギ酸リアーゼ」（ｐｆｌ）という用語は、発酵性条件下でピルビン酸をアセチル-ＣｏＡ及びギ酸に変換する酵素を含むことを意図している。言い換えれば、用語「ｐｆｌ」は、ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子を意味して、一方で用語「ＰＦＬ」は、ｐｆｌ遺伝子産物、即ちピルビン酸ギ酸リアーゼのポリペプチド又は酵素を意味する。
【００４４】
「アルコールデヒドロゲナーゼ」（ａｄｈＥ）という用語は、発酵性条件下でアセチル-ＣｏＡをエタノールに変換する酵素を含むことを意図している。言い換えれば、用語「ａｄｈＥ」は、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を意味して、一方で用語「ＡＤＨＥ」は、ａｄｈＥ遺伝子産物、即ちアルコールデヒドロゲナーゼのポリペプチド又は酵素を意味する。
【００４５】
「ＮＡＤＨ非感受性」という用語は、ＮＡＤＨに対するＰＤＨの感受性の低下を示す。この用語は、部分的に低下する非感受性、又は感受性の完全な欠如を含むことを意図している。
【００４６】
「核酸」という用語は核酸分子、例えば、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、そして更に非コード調節配列及びイントロンを含むことができるポリヌクレオチドを含ことを意図している。更に、この用語は、機能座に位置付ける１つ又はそれ以上の遺伝子を含むことを意図している。更に、この用語は、選択された目的のための特定の遺伝子を含むことを意図している。一態様では、ポリヌクレオチドセグメントの遺伝子は、炭水化物のエタノールへの生物変換の少なくとも１つの工程に包含されている。従って、この用語は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、分泌ポリペプチド、又はポリサッカラーゼ、例えばグルカナーゼ、又はその組合せのようなポリペプチドをコードする何れかの遺伝子を含むことを意図している。生体内の遺伝子は、本明細書で明示されるように、オペロンに集合させることができ、ここにおけるオペロンは、遺伝子間ＤＮＡによって他の遺伝子及び／又はオペロンから単離される。ｐｄｈオペロン中に含まれる個々の遺伝子は、個々の遺伝子の間にある遺伝子間ＤＮＡなしで、重なり合うことができる。
【００４７】
本明細書で用いる「相同（の）」という用語は、第一及び第二のアミノ酸又はヌクレオチド配列が共通の構造ドメイン及び／又は共通の機能的活性を共有するように、第二のアミノ酸又はヌクレオチド配列に対して同一の又は均等なアミノ酸残基又はヌクレオチド、例えば、同様の側鎖を有するアミノ酸残基、の十分な又は最小の数を含有している第一のアミノ酸又はヌクレオチド配列を含むことを意図している。
【００４８】
「非相同性ポリペプチド」という用語は、何れかの供給源、例えば真核生物、原核生物、古細菌、ウィルス、又は合成の核酸断片、に由来する非相同性核酸によってコードされ得るポリペプチド又はその断片を含むことを意図している。
【００４９】
「単離したポリペプチド」（例えば、単離した又は精製した生合成酵素）という用語は、そのポリペプチドが由来する微生物からの細胞物質又は他の汚染ポリペプチドを実質的に含まない、又は化学的に合成した場合には、原料となる化学物質又は他の化学物質を実質的に含まない。
【００５０】
「ヌクレオチド断片」又は「ポリペプチド断片」のような「断片」という用語は、それが由来する配列の少なくとも一部と実質的に同一であり、そしてそこでポリペプチドがそれが由来する配列からの生物学的活性を保持している、ヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の一部を示すことを意図している。
【００５１】
「ｐＨ」という用語は、溶液中の水素イオンのモル濃度の程度を示すことを意図していて、それ自体は溶液の酸性又は塩基性の程度である。当該技術分野の標準に従い、用語ｐＨは、溶液を規定するために用いる。経験するｐＨ値の通常の範囲は、０及び１４の間であり、０は濃塩酸（１Ｍ ＨＣＬ）相当の値、７は純水（中性ｐＨ）相当の値、そして１４は濃水酸化ナトリウム（1Ｍ ＮａＯＨ）相当の値である。
【００５２】
「ｐＫ」という用語は、タンパク質結合親和性の程度を示すことを意図していて、多くの場合ｐＨと交換可能に用いられる。当業者は理解されるであろうように、用語ｐＫは、タンパク質、アミノ酸及びペプチドを規定するために用いる。アミノ酸のカルボキシル、アミノ及びイオン性Ｒ−基は、結合定数Ｋａ、又はより一般的にはＫａの負の対数、ｐＫａにより規定できることも当業者には理解されるであろう。
「ベクター」という用語は、目的のヌクレオチド配列のライゲーション及び宿主細胞への形質転換に適する何れかのプラスミドベクターを含むことを意図している。
【００５３】
「糖」という用語は、糖分子（複数も）を含有する何れかの糖質源を含むことを意図している。そのような糖は、本発明の生成物及び方法による発酵によって、（必要であれば）解重合及び続くアセトアルデヒドそして更にエタノールへの生物変換のための可能性のある糖源である。糖源は、デンプン、大部分の植物の燃料貯蔵の主要形態、そしてセルロース、植物の硬い細胞壁並びに繊維性及び木質の組織の主要細胞外構成成分を含む。この用語は、モノサッカライド、単糖とも呼ばれる、オリゴ糖、及びポリサッカライドを含むことを意図している。ある特定の態様では、糖は、例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びラクトースを含む。他の態様では、糖はグルコースである。
【００５４】
「グラム陰性細菌細胞」という用語は、この用語の当該技術分野で認識されている定義のものを含むことを意図している。例示的なグラム陰性細菌は、アシネトバクター属（Acinetobacter）、グルコノバクター属（Gluconobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、ジオバクター属（Geobacter）、シェワネラ属（Shewanella）、サルモネラ属（Salmonella）、エンテロバクター属（Enterobacter）及びクレブシエラ属（Klebsella）を包含する。
【００５５】
「グラム陽性細菌」という用語は、この用語の当該技術分野で認識されている定義のものを含むことを意図している。例示的なグラム陽性細菌は、バチルス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、オエノコッカス属（Oenococcus）、連鎖球菌属、及びユーバクテリウム属（Eubacterium）を包含する。
【００５６】
「変異核酸分子」又は「変異遺伝子」という用語は、ポリペプチド又は変異体でコードされ得るポリペプチドがそのポリペプチド又は野生型の核酸分子若しくは遺伝子でコードされ得るポリペプチドとは異なる活性を示すような、少なくとも１つの変化（例えば、置換、挿入、欠失）を含むヌクレオチド配列を有する核酸分子又は遺伝子を包含することを意図している。
【００５７】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質に規則的に生じる２０のαアミノ酸を含むことを意図している。塩基性の荷電アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン及びリジンを包含する。中性の荷電アミノ酸は、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンを包含する。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を包含する。
【００５８】
「変異誘発剤」という用語は、本発明の方法によりヌクレオチド配列を修飾するために用いることのできる何れかの薬剤を含むことを意図している。
「自然発生の変異」という用語は、変異源の不在下で生じる変異を含むことを意図している。この用語は、本発明の方法において変異誘発剤の添加なしで生じる変異を含んでもよい。
【００５９】
ＩＩ．非組み換え細菌
混合酸発酵の間に、解糖の酵素は、各１モルのグルコースを２モルのピルビン酸＋２モルのＮＡＤＨ及び正味２モルのＡＴＰに変換する。ピルビン酸をより還元した化合物（エタノール、乳酸等）の産生は、連続する解糖に必須の、ＮＡＤＨを酸化してＮＡＤ＋を再生するための機構として機能する。酵母、植物及び細菌（即ち、Ｚ．モビリス）中で展開する唯一の公知であるホモエタノール経路において、ピルビン酸は脱カルボキシル化されて、非酸化ピルビン酸デカルボキシラーゼにより二酸化炭素及びアセトアルデヒドを産生する。産生したアセトアルデヒドは、１つのエタノールの産生の間にアルコールデヒドロゲナーゼによるＮＡＤＨ酸化のための電子受容体として働く。
【００６０】
完全に異なるエタノール経路が多くの他の細菌の型に存在していて、そこにおいてピルビン酸は最初に、ピルビン酸ギ酸リアーゼにより、すなわち還元当量がギ酸水素リアーゼによりギ酸塩に含有されて水素ガス（及びＣＯ２)として分散する酸化的脱炭酸反応により、アセチル-ＣｏＡ及びギ酸塩に変換される。アセチルＣｏＡは、続いてａｄｈＥにコードされるアルデヒドアルコールデヒドロゲナーゼ活性による２つのＮＡＤＨ分子の酸化のための電子受容体として用いられる。１エタノール当たり２ＮＡＤＨを必要とするため、半分のアセチルＣｏＡが残り、酢酸塩及び更なるＡＴＰに変換する。よって、アセチルＣｏＡからのエタノールのための天然の大腸菌経路は、アセチルＣｏＡから産生される１エタノール当たり２ＮＡＤＨを必要とするために、ホモエタノール発酵を支持できない。酸化還元平衡は、酢酸産生によって維持される。これが、野生型大腸菌が発酵の間に等モル量の酢酸塩及びエタノールを産生する主な理由である。
【００６１】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼはピルビン酸をアセチルＣｏＡに酸化的脱炭酸化して、そして関連の還元体をＮＡＤＨとして保持する。これは、関連還元剤が中間体としてのギ酸を通して水素ガスとして分散して、グルコースの存在下で代射活性のために利用できないＰＦＬとは対照的である。ピルビン酸をＰＤＨと代射することにより、ピルビン酸当たりの更なるＮＡＤＨを、各アセチルＣｏＡをエタノールに完全に還元するために用いることを可能にする。ピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は一般に大腸菌の好気性及び嫌気性の両方の条件下で発現されるが、この複合体の活性は嫌気性の間の生育が極めて低い。
【００６２】
本発明は、少なくとも部分的に、エタノール非産生性以外の微生物におけるホモエタノール経路を介する解糖に指向し直した変異の発見、及びこの発見に基づく嫌気性条件下でグルコース及びキシロースをエタノールへ発酵させる非組み換えのエタノール産生性微生物の開発に基づいている。この再指向した解糖により、本発明の非組み換え細菌は、嫌気性条件下で、糖１モル当たり４モルのＮＡＤＨ、又はピルビン酸当たり２モルのＮＡＤＨを産生する。
【００６３】
よって、一態様では、本発明は、非組み換え細菌を嫌気性条件下で糖１モル当たり４モルのＮＡＤＨを産生できるようにする変異を含んでなる非組み換え細菌を提供する。一態様では、変異はｐｄｈオペロンに位置する。特定の態様では、ｐｄｈオペロンはｐｄｈＲ，ａｃｅＥＦ及びｌｐｄ遺伝子を包含する。更なる態様では、変異はｌｐｄ遺伝子に存在する。
【００６４】
別の態様では、糖１モル当たり４モルのＮＡＤＨの産生は、発酵主生成物としてエタノールの産生をもたらす。特定の態様では、糖は、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びラクトースからなる群より選択される。
【００６５】
別の態様では、本発明は、１つ又はそれ以上の変異を伴うｌｐｄ遺伝子を包含している非組み換え細菌を提供して、ここで変異は、非組み換え細菌が嫌気性条件下で発酵主生成物としてエタノールを産生することを可能にする。
一態様では、産生されたエタノールは、嫌気性条件下で非気体状発酵生成物の全量の５０％超を構成する。
【００６６】
更なる態様では、変異のない非組み換え細菌は、エタノール非産生性である。更に別の態様では、エタノール非産生性の細菌は、少量発酵生成物としてエタノールを産生する。一態様では、産生されたエタノールは、非気体状発酵生成物の全量の４０％未満を構成する。
【００６７】
本発明の更に別の態様では、ｌｐｄ遺伝子における変異は、それによってエタノールが発酵主生成物として細菌により産生されるホモエタノール経路を提供する。
【００６８】
更なる態様では、細菌における１つ又はそれ以上の発酵の代替的経路が不活性化されている。一態様では、代替的経路は、変異により不活性化される。そのような変異は、代替的経路の１つ又はそれ以上の遺伝子におけるヌクレオチドの欠失、置換及び付加を含む。別の態様では、変異はｌｄｈ遺伝子、例えばｌｄｈＡ遺伝子においてである。更に別の態様では、変異はｐｆｌ遺伝子、例えばｐｆｌＢ遺伝子においてである。更に別の態様では、発酵の代替的経路は、乳酸脱水素酵素（ｌｄｈ）による乳酸塩の産生、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）による酢酸塩、エタノール、ギ酸塩、若しくはＨ２及びＣＯ２（の）変換、又はコハク酸塩の産生を含んでいる。
【００６９】
本明細書に記述の非組み換えの細菌及び細菌細胞の多様な態様では、細菌は、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌からなる群より選択される。ある特定の態様では、細菌はグラム陰性細菌である。特定の態様では、グラム陰性細菌は、アシネトバクター属、グルコノバクター属、エシェリキア属、ジオバクター属、シェワネラ属、サルモネラ属、エンテロバクター属及びクレブシエラ属からなる群より選択される。他の態様では、細菌はグラム陽性細菌である。特定の態様では、グラム陽性細菌は、、バチルス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、オエノコッカス属、連鎖球菌属、及びユーバクテリウム属からなる群より選択される。更なる態様では、細菌は大腸菌である。
【００７０】
上述のように、本発明の非組み換え細菌は、１つ又はそれ以上の変異、例えば、ｌｐｄ遺伝子の変異を包含する。一態様では、変異はあるアミノ酸の別のアミノ酸との置換を包含していて、その置換が、変異されたｌｐｄ遺伝子によって発現されるポリペプチドのｐＫを変化させる。ある特定の態様では、ｌｐｄ遺伝子における変異が、ＮＡＤＨ非感受性をもたらす。即ち、そのような変異が起こる細胞は、ＮＡＤＨに対するＰＤＨ酵素の感受性の低下を明示する。よって、ＮＡＤＨ非感受性の細胞は、グルコース当たりＮＡＤＨ４分子を産生して（２つは解糖から及び２つはＰＤＨ反応から）、４つのＮＡＤＨ全てが、２つのアセチルＣｏＡのエタノールへの還元に用いることがきる。ある特定の態様では、ＮＡＤＨに対するＰＤＨのＮＡＤＨ非感受性、及び高いＮＡＤＨ/ＮＡＤ比を伴っていても機能するその能力は、細胞、例えば細菌がホモエタノールを産生する物となることを可能にする。
【００７１】
一態様では、ポリペプチドは配列番号６に記載の配列を包含していて、そして変異は野生型のアミノ酸の
（ａ）配列番号６に記載の配列の３２２位、又は３２２位のどちらかの側の約５０番目以内の何れかの位置、又は、
（ｂ）配列番号６に記載の配列の３５４位、又は３５４位のどちらかの側の約５０番目以内の何れかの位置、
の別のアミノ酸との置換を包含している。
【００７２】
ある特定の態様では、その他のアミノ酸は、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群より選択される中性アミノ酸である。他の態様では、その他のアミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、及びリジンからなる群より選択される塩基性アミノ酸である。
【００７３】
一態様では、変異は、３２２位のＨの何れかのアミノ酸での置換を包含するものであり、アミノ酸の置換が変異されたｌｐｄ遺伝子により発現されるポリペプチドの酸性を増加させる。特定の態様では、非組み換え細菌は、配列番号６に記載の配列の３２２位のＨのＹへの置換を包含する変異を伴っている。一態様では、非組み換え細菌は、大腸菌株ＳＥ２３７７であり、the Agricultural Research Culture Collectionに寄託された、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７０として示される。別の態様では、非組み換え細菌は、大腸菌株ＳＥ２３８３であり、the Agricultural Research Culture Collectionに寄託された、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７３として示される。更に別の態様では、非組み換え細菌は、大腸菌株ＳＥ２３８４であり、the Agricultural Research Culture Collectionに寄託された、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７４として示される。更なる態様では、株ＳＥ２３７７は配列番号１に記載の配列又はその断片を含有している。別の更なる態様では、株ＳＥ２３８３は配列番号１に記載の配列又はその断片を含有している。更なる別の態様では、株ＳＥ２３８４は配列番号１に記載の配列又はその断片を含有している。
【００７４】
別の態様では、変異は、３５４位のＥの何れかのアミノ酸での置換を包含していて、アミノ酸の置換が変異されたｌｐｄ遺伝子により発現されるポリペプチドの酸性を減少させる。特定の態様では、非組み換え細菌は、配列番号６に記載の配列の３５４位のＥのＫへの置換を包含している変異を伴っている。一態様では、非組み換え細菌は、大腸菌株ＳＥ２３７８であり、the Agricultural Research Culture Collectionに寄託された、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７１として示される。別の態様では、非組み換え細菌は、大腸菌株ＳＥ２３８２であり、the Agricultural Research Culture Collectionに寄託された、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７２として示される。更に別の態様では、非組み換え細菌は、大腸菌株ＳＥ２３８５であり、the Agricultural Research Culture Collectionに寄託された、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７５として示される。更なる態様では、株ＳＥ２３７８は配列番号３に記載の配列又はその断片を含有している。別の更なる態様では、株ＳＥ２３８２は配列番号３に記載の配列又はその断片を含有している。更なる別の態様では、株ＳＥ２３８５は配列番号３に記載の配列又はその断片を含有している。
【００７５】
上述の１つ又はそれ以上の変異を含有している非組み換え細菌は、糖からのエタノールの産生に適したものである。本発明によると、変異はホモエタノール発酵経路を提供する。ある特定の態様では、産生されたエタノールは、嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する。
【００７６】
一態様では、変異が自然発生の変異からもたらされる。別の態様では、細菌が変異誘発剤に晒される。特定の態様では、変異誘発剤が、メタンスルホン酸エチル、２-アミノプリン、ＩＣＲ−１９１、メタンスルホン酸メチル、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンからなる群より選択される。更に特定の態様では、変異誘発剤が、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）である。
【００７７】
別の態様では、細菌における１つ又はそれ以上の発酵の代替的経路が不活性化される。発酵の代替的経路は、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）及びコハク酸塩から出発する、乳酸脱水素酵素（ｌｄｈＡ）による乳酸塩、酢酸塩、エタノール、ギ酸塩、Ｈ２、及びＣＯ２の産生を含んでいる。一態様では、発酵の代替的経路は、変異によって不活性化される。特定の態様では、発酵の代替的経路は、細菌における欠失変異を導入することにより不活性化される。
【００７８】
ＩＩ．単離した核酸分子及び遺伝子
本発明は、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（ｌｐｄ）ポリペプチド又はその断片をコードする単離した核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、本発明の細菌に存在する場合に、嫌気性条件化での発酵主生成物として細菌によるエタノールの産生をもたらす、１つ又はそれ以上の変異を伴うｌｐｄ遺伝子を含有している。
【００７９】
本発明の核酸分子は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子並びにヌクレオチドアナログを用いて生成されたＤＮＡ又はＲＮＡのアナログを含有する。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であってよいが、有利には二本鎖ＤＮＡである。
【００８０】
一態様では、本発明は、単離した核酸分子が、
（ａ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列と少なくとも６０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；
（ｂ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列を含んでなる核酸の、少なくとも１００ヌクレオチドの断片を含有してなる核酸分子；
（ｃ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｄ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片をコードする核酸分子であって、当該断片が配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列の少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基を含有してなる、核酸分子；
（ｅ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの天然のアレル変異体をコードする核酸分子であって、当該核酸分子がストリンジェントな条件下で配列番号１若しくは配列番号３に記載の配列を含有する核酸分子の相補配列とハイブリダイズする、核酸分子；
（ｆ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列を含んでなる核酸分子；
（ｇ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸分子；
からなる群より選択されて、核酸分子が、細胞内で発現すると、細胞が発酵主生成物としてエタノールを産生できるようにする、単離した核酸分子を提供する。
【００８１】
一態様では、細胞により産生されたエタノールは、嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する。別の態様では、細胞が細菌細胞である。更に別の態様では、核酸分子の発現が無い細菌細胞はエタノール非産生性である。特定の態様では、エタノール非産生性の細菌細胞は少量発酵生成物、即ち、非気体状生成物の全量の約４０％未満を構成するものとしてエタノールを産生する。
【００８２】
別の態様では、細菌細胞は嫌気性条件下での発酵主生成物としてエタノールを産生する。特定の態様では、細菌細胞における核酸分子の発現が、発酵主生成物としてエタノールを産生する細菌細胞内でのホモエタノール発酵の経路を提供する。
【００８３】
本発明のこの様態の更に別の態様では、核酸分子は、配列番号１に記載の配列の断片を含有していて、ここでは核酸分子は少なくとも１００ヌクレオチドの長さであり、配列番号１に記載の配列の９９７位に対応する位置にＴを含有する。
【００８４】
別の態様では、核酸分子は、配列番号３に記載の配列の断片を含有していて、ここでは核酸分子は少なくとも１００ヌクレオチドの長さであり、配列番号１に記載の配列の１０２３位に対応する位置にＧを含有する。
【００８５】
一態様では、本発明のｌｐｄ核酸分子は、配列番号１及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列又はその相補配列に（例えば、そのヌクレオチド配列の全長と比較した場合に）少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又はそれ以上の相同性である。配列番号１及び配列番号３に記載の配列は、各々図１（Ａ)及び３（Ａ)に示される。
【００８６】
別の態様では、本発明は、配列番号１若しくは配列番号３に示されるヌクレオチド配列、又はその相補配列を含有している核酸分子の少なくとも１００、１５０、２００、２５０又は３００のヌクレオチドの断片を含有する単離した核酸分子を提供する。
【００８７】
別の特定の態様では、本発明は、図１（Ｂ)及び２（Ｂ)に示される、配列番号２及び配列番号４に記載のアミノ酸配列に、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又はそれ以上の相同性であるアミノ酸配列を含有しているポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００８８】
別の態様では、核酸分子は、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有しているポリペプチドの断片をコードして、ここではこの断片は、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列の少なくとも１５、２５、３５、４５、５５、６５個の連続したアミノ酸残基を含有している。
【００８９】
更なる態様では、本発明は、上述の単離した核酸分子を包含する上述のような非組み換え細菌を提供する。一態様では、非組み換え細菌は、糖からエタノールを産生する。別の態様では、糖は、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース、及びラクトースからなる群より選択される。
【００９０】
本明細書に記述（及び慣例によるイタリック体）のように、ｌｐｄ遺伝子は、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子又はその断片、具体的には、生体において、遺伝子間ＤＮＡ（即ち、生体の染色体ＤＮＡにおいて天然にその遺伝子を隣接する及び／又は遺伝子間を隔てる介在又はスペーサーＤＮＡ）により、別の遺伝子又は他の遺伝子から分離された、ポリペプチド又はＲＮＡがコードする核酸分子を包含する。遺伝子は、酵素又は他のポリペプチド分子の合成を導くことができ（例えば、コーディング配列、例（として）えば、ポリペプチドをコードする連続オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、を包含できる）、又はそれ自身が生体内で機能を有していてもよい。生体内の遺伝子は、本明細書に定義するように、オペロンに集合させることができ、ここにおけるオペロンは、遺伝子間ＤＮＡによって他の遺伝子及び／又はオペロンから分離される。オペロン中に含まれる個々の遺伝子は、個々の遺伝子の間にある遺伝子間ＤＮＡなしで、重なり合うことができる。
【００９１】
本発明の態様は、変異ｌｐｄ核酸分子又は遺伝子を特徴とする。一般に、本明細書に記述のように変異核酸分子又は変異遺伝子は、ポリペプチド又は変異体にコードされ得るポリペプチドがそのポリペプチド又は野生型の核酸分子若しくは遺伝子にコードされ得るポリペプチドとは異なる活性を示すように、少なくとも１つの変化（例えば、置換、挿入、欠失）を含むヌクレオチド配列を有する核酸分子又は遺伝子を包含する。有利には、変異核酸分子又は変異遺伝子（例えば、変異ｌｐｄ遺伝子）は、向上した活性、例えば、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ活性、を有するＬＰＤポリペプチドをコードする。
【００９２】
一態様では、本発明の核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１又は配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有している核酸分子にハイブリダイズする。そのようなストリンジェントな条件は、当業者にとって公知であり、「Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6」に見い出すことができる。ストリンジェントな（例えば、ハイストリンジェントな）ハイブリダイゼーション条件の、特別な限定されない例は、約４５℃で、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーション、次いで５０〜６５℃で、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回又はそれ以上の洗浄である。有利には、ストリンジェントな条件下で配列番号１若しくは配列番号３に記載の配列とハイブリダイズする本発明の単離した核酸分子が天然の核酸分子に対応する。一般には、天然の核酸分子は、天然に発生するヌクレオチド配列を有するＲＮＡ又はＤＮＡの分子を包含する。
【００９３】
本発明の核酸分子（例えば、配列番号１、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有している核酸分子）は、標準的な分子生物学技術及び本明細書で提供されている配列情報を用いて単離することができる。例えば、核酸分子は、標準的なハイブリダイゼーション及びクローニング技術を用いて単離できる（例えば、「Sambrook, J., Fritsh, E.F., and Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989」に記載のように）か、又は配列番号１、配列番号３に記載の配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる。本発明の核酸は、鋳型としてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はその代替のゲノムＤＮＡ、及び適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用い、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って増幅することができる。別の態様では、本発明の単離した核酸分子は、配列番号１、配列番号３に示されるヌクレオチド配列の相補配列である核酸分子を含有している。
【００９４】
更なるｌｐｄ核酸配列は、配列番号１、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含有するものであり、配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのホモログをコードして（例えば、配列番号２、配列番号４として示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はそれ以上の同一性を有し、そして実質的にポリペプチドと同一の活性を有するポリペプチドをコードして）、ストリンジェントな条件下で配列番号１、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子の全て若しくは断片に、又は配列番号２、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子の全て若しくは断片にハイブリダイズして、又は本明細書に示されるｌｐｄヌクレオチド配列に相補的であり、そしてｌｐｄ核酸配列が細胞内に発現すると、嫌気性条件下で発酵主生成物として細胞によるエタノールの産生をもたらすものである。
【００９５】
一態様では、核酸分子は、ポリペプチド又は配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドの生物学的に活性な断片をコードして、ここではそのポリペプチドまたは生物学的に活性な断片は宿主細胞におけるエタノール産生の能力を保持している。
【００９６】
別の態様では、ｌｐｄ核酸分子又は遺伝子は、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＬＰＤポリペプチドのホモログをコードする。一般に、「ホモログ」という用語は、ポリペプチド、又は野生型ポリペプチド若しくは本明細書に記載のポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも約３０〜３５％、有利には少なくとも約３５〜４０％、より有利には少なくとも約４０〜５０％、そして更に有利には少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上の同一性を共有し、そして野生型ポリペプチド又はポリペプチドと実質的に同等な機能又は生物学的活性を有しているポリペプチドを含む。例えば、ＬＰＤのホモログは、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも約６０％、有利には少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又はそれ以上の同一性を共有し、そして配列番号２又は配列番号４として示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同等な機能又は生物学的活性（即ち、機能的に同等である）を有している（例えば、実質的に同等なジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ活性を有する）。
【００９７】
一態様では、ｌｐｄ核酸分子又は遺伝子は、配列番号２又は配列番号４として示されるようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する。
別の態様では、ｌｐｄ核酸分子又は遺伝子は、配列番号１、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有する核酸分子の全て若しくは断片にハイブリダイズするか、又は配列番号２又は配列番号４の何れかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子の全て又は一部にハイブリダイズする。
【００９８】
そのようなハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知であり、そして「Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. (1995), sections 2, 4 and 6」に見い出すことができる。更なるストリンジェントな条件は、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), chapters 7, 9 and 11」に見い出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の、特別な限定されない例は、約６５〜７０℃で、４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーション（又は、約４２〜５０℃で、４×ＳＳＣ＋５０％のホルムアミド中のハイブリダイゼーション）、次いで約６５〜７０℃で、１×ＳＳＣ中で１回又はそれ以上の洗浄を含む。ハイストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の、特別な限定されない例は、約６５〜７０℃で、１×ＳＳＣ中のハイブリダイゼーション（又は、約４２〜５０℃で、１×ＳＳＣ＋５０％のホルムアミド中のハイブリダイゼーション）、次いで約６５〜７０℃で、０．３×ＳＳＣ中で１回又はそれ以上の洗浄を含む。低い程度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の、特別な限定されない例は、約５０〜６０℃で、４×ＳＳＣ中のハイブリダイゼーション（又は、約４０〜４５℃で、６×ＳＳＣ＋５０％のホルムアミド中の代替のハイブリダイゼーション）、次いで約５０〜６０℃で、２×ＳＳＣ中で１回又はそれ以上の洗浄を含む。上記の値の中間の範囲、例えば、６５〜７０℃又は４２〜５０℃も本発明に含まれるものと意図されている。ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４及び１．２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を、ハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液中で、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ及び１５ｍＭのクエン酸ナトリウムである）と置き換えることができ、ハイブリダイゼーションが完了した後、洗浄をそれぞれ１５分間実施する。長さ５０塩基対より少ないと予測されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）よりも５〜１０℃低くすべきであり、このＴｍは、以下の式に従って決められる。長さ１８塩基対より少ないハイブリッドのためには、Ｔｍ（℃）＝２（Ａの数＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇの数＋Ｃ塩基数）。長さ１８〜４９塩基対の範囲のハイブリッドのためには、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）。ここにおけるＮは、ハイブリッド中の塩基の数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度（１×ＳＳＣ＝０．１６５Ｍに対する［Ｎａ＋］）である。
【００９９】
当業者には認識されているが、追加の試薬を、膜（例えば、ニトロセルロース又はナイロン膜）への核酸分子の非特異的ハイブリダイゼーションを低減するために、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄緩衝液に加えることができる。試薬には、これらに限定されないが、ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ又はサケ若しくはニシン精子担体のＤＮＡ）、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、フィコール（Ficoll）、ＰＶＰ等が含まれる。ナイロン膜を使用する場合、具体的な、追加の限定されないストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約６５℃における０．２５〜０．５ＭのＮａＨ２ＰＯ４、７％のＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、次いで６５℃における０．０２ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１％のＳＤＳ（またあるいは、０．２×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ）で１回又はそれ以上の洗浄である。例えば、「Church and Gilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995」を参照されたい。別の態様では、単離した核酸分子は、本明細書に記載のｌｐｄヌクレオチド配列に相補的な（例えば、配列番号１又は配列番号３として示されるヌクレオチド配列に完全に相補的である）ヌクレオチド配列を包含する。
【０１００】
ＩＩＩ．ポリペプチド
本発明は、ポリペプチド（例えば、変異エタノール産生性酵素、例として、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（ＬＰＤ)）を特徴とする。ポリペプチドが細胞、例えば細菌に発現すると、細胞は嫌気性条件下でエタノールを発酵主生成物として産生する。
【０１０１】
よって別の態様では、本発明は、ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片であって、当該断片が配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含有してなる、ポリペプチドの断片；
（ｂ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの天然のアレル変異体であって、当該ポリペプチドがストリンジェントな条件下で配列番号１若しくは配列番号３に記載の配列を含有する核酸分子の相補配列とハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、アレル変異体；
（ｃ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含んでなる核酸に少なくとも５０％の相同性である核酸分子によってコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２若しくは配列番号４に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性であるアミノ酸配列を含有してなるポリペプチド； 並びに
（ｅ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなる単離したポリペプチド；
からなる群より選択されて、当該ポリペプチドが、細胞内で発現すると、細胞が発酵主生成物としてエタノールを産生できるようにする、ポリペプチドを提供する。
【０１０２】
一態様では、細胞によって産生されたエタノールが、嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する。この様態の別の態様では、ポリペプチドが、嫌気性条件下でジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ活性を有している。更なる態様では、細胞が細菌細胞である。
【０１０３】
更に別の態様では、ポリペプチドの発現が無い細菌細胞はエタノール非産生性である。特定の態様では、エタノール非産生性の細菌細胞は、少量発酵生成物として、即ち非気体状生成物の全量の４０％未満のエタノールを産生する。
【０１０４】
更なる態様では、細菌細胞が、嫌気性条件下での発酵主生成物としてエタノールを産生して、そして更に別の態様では、産生されたエタノールが、嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する。特定の態様では、細菌細胞におけるポリペプチドの発現が、細菌細胞内でのホモエタノール発酵の経路を提供する。
【０１０５】
別の態様では、本発明の単離したポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有しているポリペプチドの断片であり、ここではこの断片は、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列の少なくとも１５、２５、３５、４５、５５又は６５個の連続したアミノ酸残基を含有している。
【０１０６】
別の態様では、本発明は、配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又はそれ以上の相同性（例えば、そのアミノ酸配列の全長と比較した場合に）を有する単離したポリペプチドを提供する。
【０１０７】
更なる態様では、本発明は、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼポリペプチド又はその断片をコードする単離した核酸分子を含有する細菌宿主細胞を提供する。
一態様では、細菌宿主細胞は、配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、又はそれらの断片を含有しているベクターを含む。別の態様では、ベクターを含有する細菌宿主細胞は、ｐＫＹ３３である。
【０１０８】
本発明は、ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片であって、当該断片が配列番号２又は配列番号４に記載の配列の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含有してなる、ポリペプチドの断片；
（ｃ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの天然のアレル変異体であって、当該ポリペプチドが、ストリンジェントな条件下で配列番号１若しくは配列番号３に記載の配列を含んでなる核酸分子の相補配列とハイブリダイズする核酸分子によりコードされる、アレル変異体；
からなる群より選択されるポリペプチドを産生する方法であって、
核酸分子を発現する条件下でジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼポリペプチド又はその断片をコードする単離した核酸分子を含有する細菌宿主細胞を培養することを包含する、ポリペプチドを産生する方法を提供する。
【０１０９】
一態様では、ＬＰＤポリペプチド又は遺伝子産物は、非組み換えエタノール産生性のグラム陰性又はグラム陽性の細菌に由来する。例示的な態様では、ＬＰＤポリペプチド又は遺伝子産物は、アシネトバクター属、グルコノバクター属、エシェリキア属、ジオバクター属、シェワネラ属、サルモネラ属、エンテロバクター属及びクレブシエラ属からなる群より選択されるエタノール産生性のグラム陰性微生物に由来する。
【０１１０】
別の態様では、ＬＰＤポリペプチド又は遺伝子産物は、バチルス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、オエノコッカス属、連鎖球菌属、及びユーバクテリウム属からなる群より選択されるエタノール産生性のグラム陽性微生物に由来する。
【０１１１】
天然の細菌遺伝子にコードされる大腸菌由来のポリペプチド又は遺伝子産物であるＬＰＤポリペプチド又は遺伝子産物は、本発明の範囲内に含まれる。更に、天然の細菌及び／又は大腸菌の遺伝子（例えば、ｌｐｄ）、例えば、変異された、挿入された又は欠失した核酸を有する遺伝子、とは異なるが、本発明の天然の遺伝子産物と実質的に類似のポリペプチド（例えば、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ活性を含有する）をコードする細菌由来のポリペプチド又は遺伝子産物は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１１２】
当業者は同類アミノ酸置換をコードする核酸を変異（例えば、置換）できる、ということがよく理解されるであろう。当業者は、天然の遺伝子産物と比較して遺伝子産物（例えば、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ）の機能に実質的に影響を与えることなく、ある程度までアミノ酸を置換、付加又は欠失することができ、これらのどの場合も本発明の範囲内に含まれることを意図していることは更によく理解されるであろう。
【０１１３】
変異を含有するｌｐｄ遺伝子を含む非組み換え細菌は、本発明の範囲に包含されていて、ここにおいて、置換が、野生型ｌｐｄ遺伝子（配列番号６に記載の配列）における３２２位のＨ、又は３５４位のＥの何れかのアミノ酸への変異であり、このアミノ酸がこの領域の酸性を変化させるものである。更なる態様では、アミノ酸は、生理学的ｐＨにおいて中性の荷電アミノ酸である。さらに別の態様では、アミノ酸は、生理学的ｐＨにおいて塩基性の荷電アミノ酸である。
【０１１４】
一態様では、本発明の単離したポリペプチド（例えば、単離したジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ酵素）は、配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する。他の態様では、本発明の単離したポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４に記載の配列として示される少なくとも１つのポリペプチドのホモログであり（例えば、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約３０〜４０％同一、有利には約４０〜５０％同一、より有利には約５０〜６０％同一、そして更により有利には約６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、又はそれ以上同一である）、そして各々配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列にコードされるポリペプチドのそれと実質的に類似である活性を有している。
【０１１５】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸の同一性の割合を測定するために、最適な比較を目的として配列を整列させる（例えば、第１のアミノ酸又は核酸配列にギャップを導入することで、第２のアミノ酸又は核酸配列と最適な位置合わせができる）。第１配列の位置が、第２配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められている場合、この分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性の割合は、配列が共有する同一性の位置数の関数である（すなわち、同一性（％）＝同一性の位置の数／位置の総数×１００）であり、最適な位置合わせとするために必要なギャップの数及びそのギャップの大きさを計算に取り入れることが有利である。
配列の比較及び２つの配列間の同一性の割合の測定は、数学アルゴリズムを用いて実行することができる。配列の比較に用いられる数学アルゴリズムの、特別な非限定的な例は、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2246-68）であり、「Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77」として改良されている。このようなアルゴリズムは、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０；Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10）に組み込まれる。本発明の核酸分子に相同な核酸配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、語長＝１２）でＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施することができる。本発明のポリペプチド分子に相同なアミノ酸配列を求めるために、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０，語長＝３）でＢＬＡＳＴポリペプチド検索を実施することができる。比較のためのギャップのある位置合わせを得るために、「Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25 (17):3389-3402」に記載のように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合は、それぞれのプログラムのデフォルト・パラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）を用いることができる。「http://www.ncbi.nlm.nih.gov」を参照されたい。配列の比較に用いられる数学アルゴリズムの、別に特殊なその他の非限定的な例は、ＭｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Myers and Miller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17）である。このようなアルゴリズムは、例えば、ＧＥＮＥＳＴＲＥＡＭネットワークサーバー（IGH Montpellier, France) で、又はＩＳＲＥＣサーバーで得られる、ＡＬＩＧＮプログラムに組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合は、ＰＡＭ１２０の重量残渣表、１２ギャップ長ペナルティー及び４ギャップペナルティー（PAM120 weight residue table, a gap length penalty of 12 and a gap penalty of 4）を用いることができる。
【０１１６】
例えば、本発明の一態様では、２つのアミノ酸配列間の同一性の割合は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴサーバー又はthe European Biotechnology Institute.のＣｌｕｓｔａｌＷを用いて測定される。例えば、多種の生命体由来のジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、大腸菌ＬＰＤタンパク質のそれと比較されて、ある特異的配列の大腸菌配列に対する同一性の割合は、２つのデータベースのどちらかから得ることができる。表７及び図９はこれらの比較を示している。括弧内の値は、特異的タンパク質の大腸菌ＬＰＤに対する総同一性を表し、同一であるアミノ酸の両方の位置、更には同類置換が起こった位置も含んでいる。バチルス・ズブチリスに関して、２つのジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ、一方はＰＤＨ複合体由来、他方はアセトインデヒドロゲナーゼ由来を、対照として、含んでいた。
【０１１７】
当業者は理解されるであろうが、前述の算定に基づき、例えばグラム陽性及びグラム陰性の細菌、古細菌並びにストレプトミセスのような、系統発生学的に（１６ＳリポゾームＲＮＡ（ＤＮＡ）配列に基づく）互いにかけ離れた細菌を含む、細菌種の範囲内でのＬＰＤの高度な保存が存在する。
【０１１８】
酵素ピルビン酸デヒドロゲナーゼは全ての好気性生物において見出され、グルコースのエネルギーへの変換においてきわめて重要な酵素である。ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（Ｌｐｄ)は、ＰＤＨ複合体の３つのサブユニットの１つである。Ｌｐｄは、フラビン結合モチーフ（アミノ酸１５−４５）及びピリジンヌクレオチド-ジスルフィド酸化還元酵素モチーフ（アミノ酸３４７−４５６）（大腸菌Ｌｐｄ付番）の２つの固有のモチーフを含有している。いくつかの生物由来のＬｐｄタンパク質のアミノ酸配列は、ＰＤＨ複合体におけるそれらの固有の役割に起因して有意な相同性を有する。大腸菌と他の細菌性Ｌｐｄ間のアミノ酸配列の同一性は、３０％〜９９％の範囲にある。大腸菌及びヒト由来のＬｐｄの極端な場合では、その配列の４２％のアミノ酸が同一である。Ｌｐｄのフラビン結合領域（アミノ酸１５-４５）では、この配列の同一性は６７％に増加する。１８のアミノ酸のこの配列の１つのサブセクション（２８-５５位）では、１つ以外の全てのアミノ酸が大腸菌、ヒト及びマウスのＬｐｄ配列に保存されている。３２２位のヒスチジン及び３５４位のグルタミンもまたこれらのタンパク質間で保存されている。この極めて高度な配列の保存により、本明細書に記述する大腸菌Ｌｐｄの変異体は、他の生物からのＬｐｄタンパク質を導入されると同様の表現型を有するものと考えられる。よって、本発明の方法は、本明細書に教示する株に限定されない。
【０１１９】
ＩＶ． 非組み換え細菌を作製する方法
本発明の更なる態様は、１つ又はそれ以上の変異を伴うｌｐｄ遺伝子を含んでなる非組み換え細菌を提供して、ここいおいて、当該変異が非組み換え細菌を嫌気性条件下での発酵主生成物としのエタノールの産生を可能とするものであり、そして当該細菌が
（ａ）糖の多い培地で嫌気性条件下、細菌の候補の変異株を生育させること；及び、
（ｂ）発酵の主生成物としてエタノールを産生する変異体を選択すること：
の段階を含んでなる工程により調製される。
方法の一態様では、産生されたエタノールが嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する。
【０１２０】
別の態様では、本発明は、方法が、
（ａ）糖の多い培地で嫌気性条件下、細菌の候補の変異株を生育させること；及び
（ｂ）発酵の主生成物としてエタノールを産生する変異体を選択すること：
の工程を含有してなる、本発明のエタノール産生性の非組み換え細菌を製造する方法を提供する。
【０１２１】
本発明の前記方法及び工程の態様では、糖の多い培地における糖は、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース、及びラクトースからなる群より選択される。本発明の一態様では、前述の特性を有する非組み換え細菌はエタノール産生性でもある。従って、本発明は、エタノール産生性の非組み換え細菌を作製する方法を提供する。更には、本発明は、所望のエタノール産生性の表現型をスクリーニングする方法を提供する。
【０１２２】
本発明の親株は、糖の多い培地で生育させた場合、嫌気性条件下で低レベルのエタノールを産生することを特徴とする。そのような株の例はＡＨ２４２株であってもよいが、嫌気性条件下で低レベルのエタノールを産生することを特徴とする何れかの株が方法の使用に適切である。当該技術分野で公知の方法（Dastenko and Wanner, 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645）に従った親株の更なる変異は、親株が全培地で嫌気性生育できない（欠損の）ように実施される。更には、抗生物質に対する抵抗のためのカセットが、当該技術分野で公知の慣例に従い、選択目的のために付加される。
【０１２３】
一般に、選択は、指数増殖中期に到達するまで好気性条件で生育欠損株を培養して、寒天上に培養物を（展開）塗抹して、培養物を変異誘発剤に晒すことにより実施される。当業者は理解されるであろう様に、メタンスルホン酸エチル、２-アミノプリン、ＩＣＲ−１９１、メタンスルホン酸メチル、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、又はヌクレオチド配列における変化を引き起こすと知られる他の薬剤の何れかを含む、多くの変異誘発剤を用いることができる。嫌気性条件で変異誘発剤に晒した後、培養物を好気性条件に切り替えて、その後嫌気性条件に戻す。生育したコロニーを、選択して、新鮮プレート上に縞状にして、嫌気性条件下で生育させる。変異が親の抗生物質に対する抵抗を持ち越すことを確認するために、各々のコロニーは、個別に（培養して、）適切な抗生物質プレート上で培養及び生育させることができる。当業者は理解されるであろうように、細菌培養手順は当該技術分野の標準の方法に従って実施される。
【０１２４】
高性能液体クロマトグラフィーを、単離した変異体の使用済培地中の発酵生成物の収率を測定するために用いることができる。例えば、エタノール、酢酸塩、ギ酸塩及びコハク酸塩をＨＰＬＣによって検出できる。
【０１２５】
上述の例示に基づき、そして細菌株間の相同性に基づくと、本発明の方法は本出願に教示する株に限定されないということは、当業者に理解されるであろう。
【０１２６】
Ｖ． エタノールを産生する方法
別の態様では、本発明は、オリゴ糖源からエタノールを産生する方法を提供する。方法は、上述のように本発明の非組み換え細菌又は宿主細胞とオリゴ糖を接触させること、それによりオリゴ糖源からエタノールを産生させることを含んでなる。方法の特定の態様では、オリゴ糖は、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン、及びこれらの組み合わせの何れかからなる群より選択される。
【０１２７】
本発明の宿主細胞は、嫌気性条件下で低レベルのエタノールを産生することを特徴とする。嫌気性条件の間、野生型の大腸菌はエタノールと酢酸塩を１：１の比で産生する。生育静止期の間に、野生型大腸菌は、主生成物として乳酸塩を産生して、全発酵生成物中のエタノールのフラクションは約２０％である。これらの発酵の全生成物は多種の酸を含有しているので、混合酸発酵という表現を導く。一態様では、本発明は、１つ又はそれ以上の変異を伴うｌｐｄ遺伝子を含んでなる非組み換え細菌を提供して、ここにおいて当該変異が非組み換え細菌を嫌気性条件下での発酵主生成物としのエタノールの産生を可能とする。発酵主生成物は、非気体状生成物の全量の５０％超を構成する非気体状の発酵生成物を含むことを意図している。発酵主生成物は、最も豊富な非気体状生成物である。
【０１２８】
一般に、発酵条件は、プロデューサー宿主細胞株の最良の生育動態を促進するために最適なｐＨ及び温度並びに培養物により産生される酵素の触媒条件を提供するように選択される（Doran, et al., (1993) Biotechnol. Progress. 9:533-538）。例えば、クレブシエラ属、例としてＰ２株に対して、最適条件は、３５〜３７℃及びｐＨ５．０〜ｐＨ５．４の間であると確定された。これらの条件下で、外的に付加された真菌性のエンドグルカナーゼ及びエクソグルカナーゼでさえも極めて安定であり、長期間機能し続ける。他の条件は、実施例において検討する。更に、当業者は理解されるであろうように、本発明の所定の発酵反応を最適化するためには、当該技術分野で公知の技術を用いて、単に日常の実験が必要なだけである。例えば、米国特許第５，４２４，２０２号及び同第５，９１６，７８７号、これは特に参照して本明細書に組み込まれる、を参照されたい。
【０１２９】
更に別の態様では、本発明は、上述のような本発明の非組み換え細菌又は宿主細胞、及び本明細書に記載の方法及び工程によりエタノール製造のための説明書を含有してなるキットを提供する。一態様では、キットは糖供給源を含有している。
【０１３０】
ＶＩ． 実施例
本発明を以下の実施例を参照して更に説明するが、これは限定するものとして解釈されるものではない。以下の材料及び方法は、他に別段に規定されない限り、実施例を通して用いられる。
【０１３１】
材料及び方法
細菌株
大腸菌Ｋ-１２株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）及び誘導体、株ＡＨ２４２、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９６７としてthe Agricultural Research Culture Collectionに寄託された（△ｌｄｈＡ及び△（ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ））を本検討で用いた。株ＳＥ２３７８は株ＡＨ２４２のエタノール産生性の変異体である。遺伝子ｐｆｌＢ、ａｄｈＥ、ｍｇｓＡ及びａｃｅＦの欠失は、Dastenko, et al.による通りであった。ｌｄｈＡ欠失株は、トランスポゾンＴｎ１０のｌｄｈＡへの導入、続くフザリン酸培地中での選択の後に構築した（Klekner, et al. 1991; Mayloy, et al. 1981）。他の株の構築は、標準の遺伝学的及び分子生物学的手法を用いた（Maniatis, et al. 1982; Miller, et al. 1972）。本明細書で用いる細胞株の遺伝子型を下記の表１に示す。
【０１３２】
【表１】
【０１３３】
生育培地及び発酵
富栄養培地（Ｌ-ブロス）は、（リットル当たり）トリプチケースペプトン（１０ｇ）、酵母抽出物（５ｇ）及びＮａＣｌ（５ｇ）を含有していた（Lee, et al. 1985）。無機塩培地は、既に記載されている（Lee, et al. 1985）。必要であればグルコース又はキシロースを添加した。発酵は、既述のように（Hasona, et al. 2004）３７℃にて実施した。培養ｐＨは、ＫＯＨを添加して７．０に保持した。バッチ発酵を、既述のように（Patel, et al. 2006）、最頂部まで充填した１３ｘ１００ｍｍのスクリューキャップチューブにて実施した。
【０１３４】
ベクター及び形質転換
ｌｐｄ更にはｐｄｈ領域の遺伝子のクローニング及び発現は、当該技術分野に記述される標準的手順に従い達成される。形質転換に用いるベクターは、他の周知のベクターに加えて、ｐＴｒｃ９９ａ（ＧＥ）、ｐＣＲ２．１-ＴＯＰＯ、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＡＤ２４を含むことができる。Maniatis, et al.（1989）に見出される標準的手順に従い、ＣａＣｌ２ ベースの化学転換法を用いた。
【０１３５】
分析法
糖類及び発酵生成物は、ＨＰＬＣにより測定した（Underwood, et al. 2002）。ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、既述のように（Talarico, et al. 2001）、破壊細胞調製物にて測定した。
【実施例１】
【０１３６】
エタノール産生性非組み換え大腸菌株ＳＥ２３７７、ＳＥ２３７８、ＳＥ２３８２、ＳＥ２３８３、ＳＥ２３８４、ＳＥ２３８５の単離
この実施例では、細菌大腸菌の非組み換えエタノール産生性株の単離を記述する。
【０１３７】
出発株ＡＨ２４２を、記述した大腸菌のホモエタノール産生性の変異体の単離のために用いた。株ＡＨ２４２は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ)及びピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＰＦＬ)を各々コードするｌｄｈ及びｐｆｌＢにおける変異に起因して、糖類を含有する富栄養培地中では嫌気性生育ができない（Mat-Jan, et al. 1989）。これらの変異にもかかわらず、ＡＨ２４２の好気性生育は影響を受けないままである。ＡＨ２４２の嫌気性生育の阻止は、ＮＡＤＨのＮＡＤ＋、主要糖分解酵素グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ及び関連するＡＴＰ生成物のための必須基質、への再酸化不足の結果である。ＬＤＨが存在しないと、ピルビン酸の乳酸への還元によるＮＡＤＨの酸化が排除される。ＰＦＬにより通常生成されるアセチルＣｏＡが存在しないと、天然のアルデヒド及びアルコールデヒドロゲナーゼ活性による効率的なＮＡＤＨの酸化を可能にするアセチルＣｏＡが不足する。
【０１３８】
本発明では、ＡＨ２４２株で出発して、ｆｏｃＡ−及びｐｆｌＢ−（ピルビン酸ギ酸リアーゼ）欠失を既述の方法（Datsenko, et al. 2000）を用いて構築した。単一欠失変異体、ＡＨ２４０、−（ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ）及びＡＨ２４１−（ｌｄｈＡ）は、二重変異体ＡＨ２４２株の親株であった。欠失位置に、ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴカセットを挿入し、それによって株ＡＨ２４２をカナマイシン耐性にした。この二重変異に起因して、株ＡＨ２４２は、全ての培地において嫌気性生育が欠如している。下記の表２は、嫌気性発酵経路に変異を伴う大腸菌変異体の生育特性を示す。
【０１３９】
【表２】
【０１４０】
得られた嫌気性生育の欠如株ＡＨ２４２は、２００ＲＰＭのシェーカー中で、好気性条件、３７℃で５ｍｌのＬ-ブロスにて培養した。指数生育中期に、培養物をシェーカーから取り出して、グルコースを含むＬ−寒天又はグルコース＋ニュートラルレッドのレドックス色素を含むＬ−寒天上に塗抹した。ワットマンのろ紙を各寒天培地の表面に取り付けた。変異誘発剤メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）をディスクに添加して、プレートを、Ｏ２の無い環境を作成するようにパラジウム触媒で包囲したＨ２＋ＣＯ２ジェネレーターを含有する嫌気性の瓶に移した。変異生成に用いるのに適切な他の標準的薬剤が、本発明に使用できる。プレートを含む嫌気性の瓶を３７℃で５日間培養した。
【０１４１】
５日後指示された培地の何れにも可視的生育は検出されなかった。続いて、両方の皿を好気性条件下で２０時間培養した。この培養の最終時には、両方の培地の、ＥＭＳを含んだペーパーディスクを配置した位置の周囲領域を除く全ての領域で、細菌細胞の菌叢（lawn）が観察された。各々の培地の表面の細胞を、レプリカ平板法による同じ組成の新鮮培地に移して、５日間嫌気性の瓶の中に放置した。５日後、各々のプレートは、ＥＭＳを配置した位置を除く全ての領域に１００を超えるコロニーを有していた。各々のグルコース（１５コロニー）及びグルコース＋ニュートラルレッド（１６コロニー）のプレートから３１コロニーを選択して、新鮮なＬ−寒天＋グルコース上にストリークした。プレートを嫌気性条件下で生育させた。全てのコロニーが嫌気性条件下で生育した。
【０１４２】
３１の変異体をＬ−ブロス＋グルコースに接種して、各々の生育後Ｌ−寒天＋カナマイシンプレートの表面に移した。全ての変異体は、カナマイシンの存在下で生育して、親株ＡＨ２４２の抗生物質の抵抗性を持ち越したことを示した。
【０１４３】
３１の変異体は、スクリューキャップチューブ中のＬ-ブロス＋グルコースに移して、混合せずに３７℃で培養した。可視的生育を検出した後、培地を細胞から分離して、使用済培地の発酵生成物を高性能液体クロマトグラフィー（Underwood, et al. 2002）を用いて測定した。表３は、３１のうち３０の変異体が第一の又は主要な発酵生成物（７３％）としてエタノールを産生したことを示す。残りの生成物は、コハク酸塩及び酢酸塩の組合せであった。
【０１４４】
これらの結果は、嫌気性環境で生育できない、ＡＨ２４２親株からの非組み換え変異体が、嫌気性条件で生育可能なものに単離されて、発酵主生成物としてエタノールを産生することを示す。
【０１４５】
【表３】
【実施例２】
【０１４６】
エタノール産生性の非組み換え細菌の生育率及び発酵プロフィール
この実施例では、エタノール産生性の非組み換え細菌の生育率及び発酵プロフィールを記述する。
上記検討から、嫌気性条件で生育可能であり発酵主生成物としてエタノールを産生する変異株ＳＥ２３７８を更なる検討のために選択した。
【０１４７】
生育特性
嫌気性発酵経路における、変異を伴う大腸菌変異体の生育特性を試験した。上記表２に記載したように、富栄養培地で培養すると、株ＳＥ２３７８の好気性生育は、野生型大腸菌株Ｗ３１１０又は単一若しくは二重の（ｆｏｃＡ-ｐｆｌＢ）若しくはｌｄｈＡ変異体の何れにも匹敵するものであった。最小培地では、株ＳＥ２３７８の好気性生育率は、親株ＡＨ２４２の約半分であった。酢酸塩及びコハク酸塩を含む生育培地の添加により、親株のそれに近い生育率に回復した。株ＳＥ２３７８は嫌気的に生育するが、生育率は、富栄養培地においてでさえも、ＡＨ２４０及びＡＨ２４１単一変異体のそれの約５０％にしかすぎない（上記表２を参照されたい）。株ＳＥ２３７８は、グルコース−最小培地において、ｐｆｌＢ変異に関連する遺伝子型に嫌気的に生育しなかった（Clark, et al. 2004）。酢酸を含む最小培地の添加によって、ｐｆｌＢ変異体、株ＡＨ２４０の生育は支持されたが、エタノール産生性の誘導体株ＳＥ２３７８の生育は支持されなかった。株ＳＥ２３７８は、グルコース−最小培地における嫌気性生育のために酢酸塩に加えてグルタミン酸塩も必要であった。以前の検討では、エタノール産生性の大腸菌株ＫＯ１１がキシロースの最適な発酵のためにグルタミン酸塩も必要とすることが示されている（Underwood, et al. 2004）。このグルタミン酸塩を必要とすることは、保護的浸透圧調節物質、ベタインを培地に添加することにより解決する。しかし、最小培地での株ＳＥ２３７８の嫌気性の生育のためにグルタミン酸塩を必要とすることは、べタインによっては解消されず、浸透圧的必要性よりもむしろ、アセチルＣｏＡのグルタミン酸塩の前駆体である、２−ケトグルタル酸への流動の生合成的欠如を示している。アセチルＣｏＡはこのエタノール産生性体により迅速にエタノールに変換されたものと考えられ、アセチルＣｏＡは生合成の律速であると考えられる。これらの添加物により、最小培地での株ＳＥ２３７８の生育率は、ｐｆｌＢ親株、ＡＨ２４０のそれに達した。低価格の培地添加物である、コーンスティープリカーをグルコース最小培地における株ＳＥ２３７８の生育のためのグルタミン酸塩に置き換えて用いた。
【０１４８】
グルコース発酵
５０ｇ/ｌグルコースのｐＨ制御発酵（Hasona, et al. 2004）では、株ＳＥ２３７８は約６時間の遅延の後、０．４６／ｈの特異的な生育率で生育して、主生成物としてエタノールを産生した（下記図３及び表４）。直接の親株ＡＨ２４２は嫌気的に生育できないので、株ＳＥ２３７８の発酵を、野生型株Ｗ３１１０のそれと比較した。Ｗ３１１０が５０ｇ／ｌのグルコースの発酵を２４時間で完了した一方で、変異株は約７２時間を要した。この差は、２つの株の細胞密度の差（野生型の２．５ｍｇ乾燥重量／ｍｌに対して、変異体の1.7ｍｇ乾燥重量／ｍｌ）、及び２つの株の最大比糖代射率の差（野生型及び変異体、各々、４．１対３．３グルコースｇ／ｈ・ｇ／ｃｅｌｌ、下記表５）に主に起因するかもしれない。株ＳＥ２３７８は、約４８０ｍｍｏｌ／ｌのエタノール（２２ｇ／ｌ）、少量の酢酸塩、乳酸塩及びコハク酸塩を含む生成物の全量の８８％を産生した。これは、エタノールが生成物のわずか２７％、６．６ｇ／ｌしか存在しない（表４）株Ｗ３１１０とは対照的である。株ＳＥ２３７８に関して観察された最大比生産性は、１．３４ｇ／ｈ・ｇ／ｃｅｌｌ（表５）であり、酵母のバッチ発酵に関して報告されている１．６ｇ／ｈ・ｇ／ｃｅｌｌ（Smits, et al., 2000）に匹敵する。
【０１４９】
【表４】
【０１５０】
【表５】
【０１５１】
キシロース発酵
野生型Ｗ３１１０及び変異体ＳＥ２３７８の両方の株は、５０ｇ／ｌのキシロースを含んだ嫌気性発酵の間に同様の比率で生育したが、株ＳＥ２３７８がおよそ８時間遅延していた（図３並びに上記表４及び５）。キシロースの比生育率は、前に公開されている報告と一致して（Gonzalez, et al. 2002）、グルコースのそれらの８０％であった。変異株は、野生型Ｗ３１１０よりも迅速にキシロースを発酵させた。４８時間後、株ＳＥ２３７８に関するキシロースの利用率はグルコースの利用率を超えていた。株ＳＥ２３７８で再生された発酵生成物のおよそ８８％がエタノール、５０ｇ／ｌのキシロースから２０ｇ／ｌ、であった。キシロースを用いた株ＳＥ２３７８の最大比エタノール産生性は、２．２３ｇ／ｈ・ｇ／ｃｅｌｌであった。
【０１５２】
Ｗ３１１０及びＳＥ２３７８の両方の比エタノール産生性は、表５に示されるように、グルコースよりもキシロースの場合のほうが高かった。これは、キシロース代謝からのより低いエネルギー収率を示すものかもしれない（Hasona, et al. 2004）。野生型に関して、キシロースからの正味ＡＴＰ収率は、グルコース当たり３．０と比較して、キシロース当たりわずか約１．５である。これは、細胞が同じ量の細胞集団を産生するためにより多くのキシロースを使用する必要があることを示すのであろう。しかし野生型による比キシロース消費率は、上記表５に示され、グルコース発酵と比較してより低い細胞収率及びより長い発酵時間に関して説明したように、グルコースのそれをわずかに上回るものにすぎない（４．９３対４．１０ｇ／ｈ・ｇ／ｃｅｌｌ）。対照的に、株ＳＥ２３７８は、最小培地のキシロース発酵にとって重要な酵素である、ピルビン酸ギ酸リアーゼを欠如している（Hasona, et al. 2004）。この変異に起因して、株ＳＥ２３７８のキシロース発酵からの正味の計上ＡＴＰ収率は、キシロース当たりわずか０．６７にすぎない。このエタノール産生性変異体における高いキシロース流動を掌っているのは、明らかにこの低いＡＴＰ収率である。２．２３ｇ／ｈ・ｇ／ｃｅｌｌのキシロースからの比エタノール産生性は、酵母におけるグルコースの１．６ｇ／ｈ・ｇ／ｃｅｌｌの値（Smits, et al. 2000）、及びＺ．モビリスｐｄｃ及びａｄｈ遺伝子を持っているエタノール産生性大腸菌株ＫＯ１１におけるグルコース及びキシロースの値（約２ｇ／ｈ・ｇ／ｃｅｌｌ）よりも高い。
【０１５３】
これらの結果は、非組み換えＳＥ２３７８変異体がグルコース及びキシロースの両方から発酵主生成物としてエタノールを産生することを示す。更には、エタノール産生率は、他のエタノール産生性の生物に匹敵している。
【実施例３】
【０１５４】
非組み換えエタノール産生性の大腸菌由来の変異ｌｐｄ遺伝子の同定
この実施例では、大腸菌株ＳＥ２３７７、ＳＥ２３７８、ＳＥ２３８２、ＳＥ２３８３、ＳＥ２３７８４及びＳＥ２３８５由来のＬＰＤ遺伝子の同定を記述する。
【０１５５】
非組み換えエタノール産生性の大腸菌変異体株の変異を、ｚａｃ：：Ｔｎ１０での同時形質導入（co-transduction）によりマッピングした。ａｒｏＰ-ｐｄｈＲ-ａｃｅＥＦ遺伝子が同時形質導入により欠失された場合（図５）、野生型バックグラウンドの同じ欠失が嫌気性生育に影響を与えなかった一方で、形質導入株は嫌気性条件下で１％グルコースを含有するＬＢにおけるその生育能力を失った。これらの結果は、株ＳＥ２３７８の嫌気性生育におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼ酵素の役割を提示している。同定した変異株、ＳＥ２３７７、ＳＥ２３７８、ＳＥ２３８２のエタノール産生性遺伝子型に関与する変異を、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子座にマッピングした。
【０１５６】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＨ）は、３つの酵素、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／デカルボキシラーゼ（酵素１、Ｅ１)、リポ酸トランスアセチラーゼ（酵素２、Ｅ２）、及びジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（酵素３、Ｅ３）サブユニットで構成される。ｐｄｈＲプロモーターが、ａｃｅＥＦ及びｌｐｄ遺伝子の独立したプロモータが存在していても、ｐｄｈＲ-ａｃｅＥＦ-ｌｐｄ遺伝子の転写のプロモーターであるとことは公知である（Quail, et al. 1995）。ＰＤＨオペロンの発現がｐｄｈＲタンパク質により負に調節されて（Quail, et al. 1995）、ＳＥ２３７７、ＳＥ２３７８、ＳＥ２３８２のｐｄｈＲ遺伝子の配列が決定された（図６Ａ）。株ＳＥ２３７８の配列分析は、ｐｄｈＲのコード領域内の２つの変異、１つのアミノ酸置換（Ｓ１２Ｐ)及び１つの、アミノ酸１１８としてのロイシンのアミノ酸挿入を明らかにした。ＧからＡへの別のヌクレオチド置換が、ｐｄｈＲ遺伝子及びａｃｅＥ遺伝子の間の遺伝子間領域に見出された（図６Ｂ）。株ＳＥ２３７７及びＳＥ２３８２は、ゲノムＤＮＡのｐｄｈＲ-ａｃｅＥＦ領域に何れの変異も持っていなかった。しかし、これらの株、更には株ＳＥ２３８３、ＳＥ２３８４及びＳＥ２３８５は、全てｌｐｄ遺伝子に単一変異を有していた（図５Ａ)。ＰｄｈＲタンパク質はｐｄｈＲ−ｌｐｄオペロンのピルビン酸に感受性のレギュレーターであり、よってこのタンパク質の変異は期待されない。ｐｄｈＲ−ｌｐｄの転写に対するｐｄｈＲの開始時の出発部位に加えて、ａｃｅＥＦはａｃｅＥＦ-ｌｐｄに対するそれ自身の転写出発部位を含有している。よって、遺伝子間領域の変異は、嫌気性細胞のａｃｅＥＦ-ｌｐｄ発現のレベルの上昇も支持できる。大腸菌におけるＰＤＨ複合体のピルビン酸デヒドロゲナーゼ／デカルボキシラーゼ活性レベルが、嫌気性に対して好気性に生育した細胞において約５倍高いことが既に報告されている（deGraef, et al., 1999）。
これらの結果は、本発明の同定したエタノール産生性の大腸菌株における変異の位置を提供している。
【実施例４】
【０１５７】
ｌｐｄ遺伝子の変異はエタノール産生性の遺伝子型に関与する。
この実施例では、ＰＤＨ複合体、特にｌｐｄ遺伝子の変異がエタノール産生性の遺伝子型の原因となることが示されている。
【０１５８】
株ＳＥ２３７８の予備的な遺伝子分析は、嫌気性生育及びホモエタノール産生に関与する変異（複数も）が、ＰＤＨ複合体（ｐｄｈ遺伝子座：ｐｄｈＲ、ａｃｅＦ、ｌｐｄ）をコードする遺伝子に又は近くに位置することを明らかにした。株ＳＥ378のエタノール産生性の遺伝子のためにＰＤＨが必要であることを確認するために、ａｃｅＦ遺伝子（ジヒドロリピルアセチルトランスフェラーゼ；ＰＤＨのＥ２酵素）の変異を、カナマイシン耐性遺伝子を欠失している株ＳＥ２３７８の誘導体である、株ＹＫ１に形質導入した。形質導入株ＹＫ６３は、下記の表６に示されるように、嫌気的に生育する能力を欠失した。
【０１５９】
【表６】
【０１６０】
株ＹＫ９３の嫌気性−マイナス遺伝子型は、株ＳＥ２３７８の親株である、株ＡＨ２４２のそれと同様であった。細胞が生合成のためのアセチルＣｏＡを産生する能力が無いことに起因して、ａｃｅＦ変異体は最小培地の好気性−マイナスであっても、嫌気性生育条件下で、この機能はＰＦＬにより触媒されるものであり、よってａｃｅＦ変異は大腸菌の嫌気性生育に影響を与えない（表６に示すような、株ＹＫ１５３、ａｃｅＦ変異を伴うＷ３１１０）。株ＹＫ９３の嫌気性生育はテストした全ての培地で阻止された。株ＹＫ９３のａｃｅＦ変異はファージＰ１によりＷ３１１０（野生型）又はＳＥ２３７８（エタノール産生性）のいずれか由来の遺伝子と共にａｃｅＦ＋に形質導入されて、形質導入株は嫌気性条件下、最小培地での生育について選択された。形質導入株を、嫌気性生育及び発酵生成物に関してテストした。野生型株Ｗ３１１０由来のａｃｅＦ＋遺伝子を受け取った形質導入株は、最小培地で好気的に生育したが、ｌｄｈＡ及びｐｆｌＢの変異の存在に起因して、テストした培地の何れでも嫌気的に生育しなかった。株ＳＥ２３７８由来のａｃｅＦ＋遺伝子を受け取った全ての形質導入株は、嫌気的に生育して、テストした全ての形質導入株が発酵主生成物としてエタノールを産生した。この結果は、株ＳＥ２３７８のエタノール産生性遺伝子型が無傷のｐｄｈ遺伝子座及びＰＤＨ活性を必要とすることを示し、並びにエタノール産生のためのＰＤＨ依存の経路と一致している（図８Ｃを参照されたい）。ホモエタノール産生のためのこの経路では、ＰＤＨによってピルビン酸がアセチルＣｏＡへ酸化的脱二酸化炭素化されて、更にアルコールデヒドロゲナーゼによりアセチルアルデヒド及びエタノールへ還元される（図８Ｃ)。アセチルＣｏＡ産生に必要なａｃｅＦ（ＰＤＨ−マイナス；株ＹＫ９３）又はエタノール産生に必要なａｄｈＥ（ＡＤＨ−マイナス；株ＹＫ９１）どちらかの欠失は、ホモエタノール産生のためのこの経路の役割を支持する嫌気性生育陰性の遺伝子型、及び発酵の乳酸デヒドロゲナーゼ及びピルビン酸ギ酸リアーゼを欠如している株ＳＥ２３７８の酸化還元平衡をもたらした。
【０１６１】
実験の次の組では、ｌｐｄ遺伝子がエタノール産生性の遺伝子型の原因であることを示した。野生型株Ｗ３１１０由来及びエタノール産生性変異体株ＳＥ２３７８由来のｌｐｄ遺伝子は、誘導因子としてＩＰＴＧを伴うｔｒｃプロモーターからのＬＰＤタンパク質の産生のための発現ベクターにクローン化した。これらのプラスミドは、３つの欠失；ｌｄｈＡ、（ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ）、及びｌｐｄを持つ株ＹＫ１００に形質転換された。３つの変異を超越して、株ＹＫ１００はＷ３１１０株に類似する。３つの欠失に起因して、株ＹＫ１００はテストした全ての培地で嫌気性生育に欠如していて、最小培地での好気性生育に欠如している。前に検討したように、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＨ）は、３つの酵素、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／デカルボキシラーゼ（酵素１)、リポ酸トランスアセチラーゼ（酵素２）、及びリポアミドデヒドロゲナーゼ（酵素３）で構成される。大腸菌の好気性生育は、ＰＤＨ複合体の３つの構成要素の何れか１つの変異によって弱められる。
【０１６２】
株Ｗ３１１０由来のｌｐｄ遺伝子（Ｌｐｄ＋)を含有するプラスミドｐＫＹ３２（図７Ａ）又は株ＳＥ２３７８由来の変異体ｌｐｄ遺伝子（Ｌｐｄ＊)を含有するプラスミドｐＫＹ３３（図７Ｂ）を、株ＹＫ１００に形質転換して、アンピシリン耐性の形質転換体を選択した。これらの形質転換体は、最小培地における好気性生育によって分かるようにＰＤＨ−陽性であった；ＰＤＨ複合体の酵素１及び酵素２は染色体由来であって、Ｌｐｄはプラスミッド由来であった。エタノール産生性ＳＥ２３７８株由来のｌｐｄ遺伝子を持っているプラスミドｐＫｙ３３を有する形質転換体だけが嫌気性条件下で生育できた。エタノールは、株ＹＫ１００／ｐＫＹ３３（ＹＫ１２９と称す）由来の使用済培地において発酵主生成物であった。対照的に、Ｗ３１１０由来の天然のｌｐｄ遺伝子を持っているプラスミドｐＫＹ３２を有する株ＹＫ１００は嫌気性条件下で生育しなかった。
【０１６３】
総合すれば、これらの結果は、ＬＰＤタンパク質が嫌気性生育条件下でのピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の観察された活性に関与すること、更にはＬｐｄの変異された形態が大腸菌によるホモエタノール産生を支持するのに十分なものであることを示す。大腸菌のｌｐｄ変異体がエタノール産生性である根拠は、グルコース当たり４ＮＡＤＨを産生するその能力にある。
【実施例５】
【０１６４】
ｌｐｄ遺伝子の変異はＮＡＤＨ非感受性に関与する。
この実施例では、ｌｐｄ遺伝子の変異がＮＡＤＨ非感受性の原因であることを示す。より具体的には、野生型（天然）酵素においてＮＡＤＨ感受性であるジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（ＬＰＤ)活性が、図１０及び図１１に示されるように、変異体においてＮＡＤＨ非感受性に変化することが見出された。ＬＰＤはピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＨ）の構成成分であるので、このＬＰＤのＮＡＤＨ非感受性はエタノール産生性変異体からＰＤＨへと持続される。
【０１６５】
大腸菌野生型、株Ｗ３１１０又はエタノール産生性変異体、株ＳＥ２３７８を、グルコース−無機塩培地で指数生育中期まで培養した。次いで細胞を採取して、抽出物を調整した。細胞抽出物における酵素活性を、ピルビン酸、基質としてＮＡＤ、及び酵素活性の阻害剤として濃度を変化させたＮＡＤＨを用いて測定した。図１０は、ＮＡＤＨによるＰＤＨ活性の阻害を示す。上のグラフでは、ＮＡＤ濃度は野生型株Ｗ３１１０又はエタノール産生性変異体株ＳＥ２３７８の両方に関して２ｍＭ ＮＡＤであった。下のグラフでは、ＮＡＤ濃度は株Ｗ３１１０由来の天然酵素に関しては２ｍＭ ＮＡＤ、そして株ＳＥ２３７８由来の酵素の変異された形態に関しては１ｍＭ ＮＡＤであった。
【０１６６】
大腸菌野生型、株Ｗ３１１０由来及びエタノール産生性変異体、株ＳＥ２３７８由来のｌｐｄ遺伝子をＰＣＲにより増幅して、タンパク質発現ベクター、ｐＥＴ１５ｂにクローン化した。選択されたプラスミドのｌｐｄ遺伝子のＤＮＡ配列は、挿入ＤＮＡを配列化することにより検証した。プラスミドのｌｐｄ遺伝子の発現を誘発して、タンパク質を精製した。酵素活性を、２つの基質が１．５ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１ＭのＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中のリポアミド（３ｍＭ)）及びＮＡＤＨ（０．１ｍＭ）である逆反応にて測定した。図１１は、ＮＡＤＨによるＬＰＤの阻害を示す。これらの条件下では、天然の酵素は、図１１のグラフに示されるように、検出可能な活性を持たなかった。反応生成物であるＮＡＤは、酵素活性の活性化因子を必要として、活性はＮＡＤ濃度の上昇に伴い増加した。酵素の活性におけるＮＡＤＨのＮＡＤに対する比率を、天然体及び変異体由来の酵素の両方に関して測定して、結果を図１１に示す。
【０１６７】
ＰＤＨは全ての好気性生物（細菌からヒトまで）により産生される。この酵素はピルビン酸を酸化的脱二酸化炭素化してアセチルＣｏＡ、ＣＯ２及びＮＡＤＨを生成して、次いでアセチルＣｏＡは更なる酸化及び続くエネルギー産生のためのＴＣＡ回路に送り込まれる。大腸菌では、ＰＤＨは、嫌気性及び好気性の両方の条件下で産生される。しかし、嫌気性条件下で酵素はＮＡＤＨによるＰＤＨの阻害に起因して不活性である。ＮＡＤＨは通常は嫌気性細胞に高い濃度で存在して、よって外的電子受容体を欠如している細胞により酸化され得ないＮＡＤＨの産生を阻止する。結果として、細胞はグルコース当たり２ＮＡＤＨのみを生成して、還元剤の第２の組は水素ガスとして放出される。１つのアセチルＣｏＡのエタノールへの還元には２つのＮＡＤＨを必要とするために、野生型細胞はグルコース当たり２つのエタノールを産生することができない。
【０１６８】
本発明のエタノール産生性変異体株では、ＰＤＨはＮＡＤＨに対する感受性がより低い。この低下した感受性は、より高いＮＡＤＨプールを有する嫌気性条件下でさえも酵素が機能することを可能にする。この生化学的変化に起因して、細胞はグルコース当たり４つのＮＡＤＨ分子を産生することができる（２つは解糖系から及び２つはＰＤＨ反応から）。４つのＮＡＤＨの全ては、変異体をホモエタノールプロデューサーにして、２つのアセチルＣｏＡをエタノールに還元するために用いられる。ＰＤＨのＮＡＤＨに対する感受性の低下及び高いＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を有していても機能するその能力に起因して、生化学的に及び生理学的に細胞はホモエタノールプロデューサーである。
【０１６９】
最終に、更なる実験（データは示さず）では、株ＳＥ２３７８に見出されるＬＰＤの変異（Ｅ３５４Ｋ）を、好気性生物、バチルス・ズブティリスのＬＰＤに類似の位置に導入した。Ｅ３５６Ｋの変異は、変異体（ＭＲ１）の嫌気性生育を支持した。
【実施例６】
【０１７０】
他の生物由来のＬＰＤ配列の比較アラインメント
この実施例では、異なる生物由来のジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（ＬＰＤ）酵素のアミノ酸配列の比較アラインメントを比べて対照させた。
【０１７１】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）は細菌からヒトまでの全ての好気性生物に存在する。ＬＰＤは、ＰＤＨ酵素複合体の主要な構成要素であり、ＰＤＨ複合体及び２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体の両方に存在する。大腸菌では、ｌｐｄをこれら２つの酵素複合体が共有していて、この要求に起因して、ｌｐｄ遺伝子は、ｐｄｈＲ遺伝子の上流に位置しているプロモータに加えて、独立したプロモーターから転写される。
【０１７２】
Ｌｐｄホモログは、全ての生命ドメインに見出される。細菌株の中で、Ｌｐｄタンパク質は、４５８〜５８１のアミノ酸に範囲していて、４９０００〜６２０００Ｄａの無水分子量を有している。多様な系統発生学的群からの細菌由来の２０のＬｐｄホモログのアミノ酸配列の同定を下記表７に示す。
【０１７３】
多種の生物由来のジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴサーバー又はthe European Biotechnology Institute.のＣｌｕｓｔａｌＷを用いて、大腸菌ＬＰＤタンパク質のそれと比較した。大腸菌配列のそれに対する特異的配列の同一性の割合をこの２つのデータベースのどちらかから得た。カッコ内の値は、大腸菌のそれに対する特異的タンパク質の総類似性を示し、同一であるアミノ酸の両方の位置、更には同類置換の起こった位置を含んでいる。バチルス・ズブティリスに関して、２つのジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ、１方はＰＤＨ複合体から他方はアセトインデヒドロゲナーゼから、を比較のために含めた。
【０１７４】
配列同一性は、古細菌、メタノサルシナ バーケリ（Methanosarcina barkeri）の低い２４％から、グラム陰性細菌、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）株ＬＴ２の９８％と多様である。ネズミチフス菌株ＬＴ２のＬＰＤタンパク質は大腸菌のＬＰＤと最も関連性があり、同じ腸内細菌科ファミリーのグラム陰性細菌として２つの細菌の分類は一致している。大腸菌株Ｗ３１１０又はＭＧ１６５５のＬｐｄアミノ酸配列を、公知のＬｐｄ配列、アシネトバクターｓｐ．（Acinetobacter sp.）ＡＤＰ１、セレウス菌（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０９８７、バチルス ズブチリス株１６８、破傷風菌（Clostridium tetani）株マサチューセッツ／Ｅ８８、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）株ＡＴＣＣ１３０３２、ゲオバクター メタリレデューセンス（Geobacter metallireducens）ＧＳ-１５、グルコノバクター オキシダンス（Gluconobacter oxydans）６２１Ｈ、カセイ菌（Lactobacillus casei）ＡＴＣＣ３３４、乳酸連鎖球菌亜種クレモリス菌（Lactococcus lactis subspecies cremoris）ＳＫ１１、植物性乳酸菌（Lactobacillus plantarum）ＷＣＦＳ１、メタノサルシナ バーケリ（Methanosarcina barkeri）株Ｆｕｓａｒｏ、エノコッカス エニ（Oenococcus oeni）ＭＣＷ ＰＳＵ-１、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１（ＡＴＣＣ１５６９２）、ロドバクター スフェロイデス (Rhodobacter sphaeroides)２．４．１、ネズミチフス菌（salmonella typhimurium）ＬＴ２、低温菌（Shewanella sp）ＡＮＡ-３、連鎖球菌（Streptococcus）変異体ＡＴＣＣ７００６１０、ストレプトミセス セリカラー（Streptomyces coelicolor）Ｍ１４５、好熱性細菌（Thermoanaerobacter ethanolicus）、発光細菌（Vibrio fischeri）株ＡＴＣＣ７００６０１と整列させた。相同的アラインメントを図９に示す（この図は番号を付け直す必要があるであろう）。同一性の総合割合を比較した場合、大腸菌ＬＰＤは、他のグラム陰性ＬＰＤと最も似ているように見えるが、同一性の割合の計算を同類置換に基づき実施した場合、実験した種々の生物のＬＰＤタンパク質間の高い相同性の割合を表４が反映している。例えば、大腸菌ＬＰＤタンパク質のそれと比較した、バチルス・ズブティリス株１６８のＬＰＤタンパク質のアミノ酸配列同一性は、３４％である。しかし、同類置換だけを考慮すると、同一性のスコアは５７％に増加する。アラインメント図から見ることができるように、いくつかのアミノ酸が非常に多種の生物群由来の２０のＬＰＤホモログ間に高度に保存されている。生物間に共有されている残基をアスタリスク（＊）で強調する。目的の領域は下線付けしている。分析した種々の生物の配列の中で、配列同一性はＮ−末端領域で最も高い。配列同一性がアミノ酸４０及び５５（大腸菌ＬＰＤの番号付け）の間に見ることができ、これはフラビン部位候補を示すのかもしれない。同一性の別の領域は、アミノ酸１８０及び１９０の間である。この配列全体を通して、このアミノ酸の残基が分析した種々の生物由来の２０のＬＰＤ全てに保存されている、いくつかの位置が存在する。特に、アミノ酸３２２位はヒスチジン（Ｈ)をコードして、本発明の３つの株（ＳＥ２３７７、ＳＥ２３８３及びＳＥ２３８２）では、３２２位のヒスチジンのチロシン（Ｙ）への変異が存在する。３２２位のヒスチジンは、グラム陽性及びグラム陰性細菌から古細菌まで由来の２０ＬＰＤ全てに保存されている。この多岐の範囲にわたって保存されている他の残基は、３５５位のプロリン（１８/２０ＬＰＤ）及び３５６位のグルタミン酸（１７/２０ＬＰＤ）を含む。
【０１７５】
【表７】
【０１７６】
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【０１７７】
均等物
本明細書に記載の本発明の具体的な態様の多くの均等物を、当業者は認識できるであろう、又は単なる通常の実験を用いて確認できるであろう。このような均等物は、本発明に含まれるように意図されている。
【０１７８】
引例による援用
本明細書に開示された全ての刊行物、特許出願及び特許は、それらの全てを参照して本明細書に明確に取り込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１（Ａ）】図１（Ａ）は、（配列番号１の）塩基９９７に変異を伴うｌｐｄ遺伝子に対する核酸配列を示す。
【図１（Ｂ）】図１（Ｂ）は、（配列番号２の）対応するアミノ酸配列を示す。
【図２（Ａ）】図２（Ａ）は、（配列番号３の）塩基１０９３に変異を伴うｌｐｄ遺伝子に対する核酸配列を示す。
【図２（Ｂ）】図２（Ｂ）は、（配列番号４の）対応するアミノ酸配列を示す。
【図３（Ａ）】図３（Ａ）は、（配列番号５の）野生型ｌｐｄ遺伝子に対する核酸配列を示す。
【図３（Ｂ）】図３（Ｂ）は、（配列番号６の）対応するアミノ酸配列を示す。
【図４】図４Ａは、大腸菌野生型株Ｗ３１１０及びエタノール産生性変異体株ＳＥ２３７８の、グルコース又はキシロース（５０ｇ/Ｌ）を含むＬＢ培地、３７℃及びｐＨ７．０での生育及び発酵の特性を表しているグラフを示す。グラフ（Ａ）は野生型Ｗ３１１０株のグルコースにおいての生育を示し、グラフ（Ｂ）はＳＥ２３７８株のグルコースにおいての生育を示し、グラフ（Ｃ）は野生型Ｗ３１１０株のキシロースにおいての生育を示し、グラフ（Ｄ）はＳＥ２３７８株のキシロースにおいての生育を示す。
【図５】図５は、欠失変異（ａｒｏＰ−ａｃｅＥＦ）（Ａ）（△ａｒｏＰ-ａｃｅＥＦ）の株ＳＥ２３７８への形質導入（Ｂ）を示す。株ＳＥ２３７８の変異は、ｚａｃ：：Ｔｎ１０での同時形質導入（co-transduction）によりマッピングされた。ａｒｏＰ-ｐｄｈＲ-ａｃｅＥＦ遺伝子が同時形質導入により欠失した場合、野生型バックグラウンドの同じ欠失が嫌気性生育に影響を与えなかった一方で、形質導入株（Ｃ）は嫌気性条件下で１％グルコースを含有するＬＢにおけるその生育能力を失った。
【図６Ａ】図６Ａは、野生型Ｗ３１１０株及びＳＥ２３７８変異体由来のｐｄｈＲ遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは株ＳＥ２３７８の遺伝子間領域の核酸配列を示す。
【図７（Ａ）】図７（Ａ）はＹＫ１００宿主におけるＷ３１１０又はＳＥ２３７８ｌｐｄの発現のために用いたプラスミドを示す。プラスミドｐＫＹ３２は、野生型株Ｗ３１１０由来のｌｐｄ遺伝子を含有する。
【図７（Ｂ）】図７（Ｂ）はＹＫ１００宿主におけるＷ３１１０又はＳＥ２３７８の発現のために用いたプラスミドを示す。プラスミドｐＫＹ３３はエタノール産生性変異体ＳＥ２３７８由来のｌｐｄ遺伝子を含有する。
【図８】図８（Ａ〜Ｃ）は、大腸菌株ＳＥ２３７８、天然の大腸菌及び他のエタノール産生性の微生物のピルビン酸からのエタノール産生のための提案される経路を示す図式である。
【図９−１】図９は、選択されたＬＰＤ配列、即ち破傷風菌（Clostridium tetani）Ｅ８８、好熱性細菌（Thermoanaerobacter ethanolicus）、セレウス菌（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０９８７、植物性乳酸菌（Lactobacillus plantarum）ＷＣＦＳ１、乳酸連鎖球菌亜種クレモリス菌（Lactococcus lactis subspecies cremoris）ＳＫ１１、エノコッカス エニ（Oenococcus oeni）ＭＣＷ ＰＳＵ-１、ネズミチフス菌（salmonella typhimurium）ＬＴ２、発光細菌（Vibrio fischeri）ＡＴＣＣ７００６０１、低温菌（Shewanella sp）ＡＮＡ−３、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１（ＡＴＣＣ１５６９２）、ロドバクター スフェロイデス (Rhodobacter sphaeroides)２．４．１、ゲオバクター メタリレデューセンス（Geobacter metallireducens）ＧＳ-１５、アシネトバクターｓｐ．（Acinetobacter sp.）ＡＤＰ１、グルコノバクター オキシダンス（Gluconobacter oxydans）６２１Ｈ、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＤＳＭ２０３００、カセイ菌（Lactobacillus casei）ＡＴＣＣ３３４、ストレプトミセス セリカラー（Streptomyces coelicolor）Ｍ１４５／Ａ３（２）、連鎖球菌（Streptococcus）変異体ＡＴＣＣ７００６１０、メタノサルシナ バーケリ（Methanosarcina barkeri）Ｆｕｓａｒｏと共に、大腸菌Ｋ１２ ＭＧ１６５５のＬＰＤの多数アミノ酸配列アラインメントを示す（ＣＬＵＳＴＡＬ多配列アラインメントプログラムを用いる）。アミノ酸３２２位のヒスチジン残基、アミノ酸３５５位のプロリン残基及びアミノ酸３５６位のグルタミン酸残基はアスタリスク（＊）で強調されている。
【図９−２】図９は、選択されたＬＰＤ配列、即ち破傷風菌（Clostridium tetani）Ｅ８８、好熱性細菌（Thermoanaerobacter ethanolicus）、セレウス菌（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０９８７、植物性乳酸菌（Lactobacillus plantarum）ＷＣＦＳ１、乳酸連鎖球菌亜種クレモリス菌（Lactococcus lactis subspecies cremoris）ＳＫ１１、エノコッカス エニ（Oenococcus oeni）ＭＣＷ ＰＳＵ-１、ネズミチフス菌（salmonella typhimurium）ＬＴ２、発光細菌（Vibrio fischeri）ＡＴＣＣ７００６０１、低温菌（Shewanella sp）ＡＮＡ−３、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１（ＡＴＣＣ１５６９２）、ロドバクター スフェロイデス (Rhodobacter sphaeroides)２．４．１、ゲオバクター メタリレデューセンス（Geobacter metallireducens）ＧＳ-１５、アシネトバクターｓｐ．（Acinetobacter sp.）ＡＤＰ１、グルコノバクター オキシダンス（Gluconobacter oxydans）６２１Ｈ、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＤＳＭ２０３００、カセイ菌（Lactobacillus casei）ＡＴＣＣ３３４、ストレプトミセス セリカラー（Streptomyces coelicolor）Ｍ１４５／Ａ３（２）、連鎖球菌（Streptococcus）変異体ＡＴＣＣ７００６１０、メタノサルシナ バーケリ（Methanosarcina barkeri）Ｆｕｓａｒｏと共に、大腸菌Ｋ１２ ＭＧ１６５５のＬＰＤの多数アミノ酸配列アラインメントを示す（ＣＬＵＳＴＡＬ多配列アラインメントプログラムを用いる）。アミノ酸３２２位のヒスチジン残基、アミノ酸３５５位のプロリン残基及びアミノ酸３５６位のグルタミン酸残基はアスタリスク（＊）で強調されている。
【図９−３】図９は、選択されたＬＰＤ配列、即ち破傷風菌（Clostridium tetani）Ｅ８８、好熱性細菌（Thermoanaerobacter ethanolicus）、セレウス菌（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０９８７、植物性乳酸菌（Lactobacillus plantarum）ＷＣＦＳ１、乳酸連鎖球菌亜種クレモリス菌（Lactococcus lactis subspecies cremoris）ＳＫ１１、エノコッカス エニ（Oenococcus oeni）ＭＣＷ ＰＳＵ-１、ネズミチフス菌（salmonella typhimurium）ＬＴ２、発光細菌（Vibrio fischeri）ＡＴＣＣ７００６０１、低温菌（Shewanella sp）ＡＮＡ−３、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１（ＡＴＣＣ１５６９２）、ロドバクター スフェロイデス (Rhodobacter sphaeroides)２．４．１、ゲオバクター メタリレデューセンス（Geobacter metallireducens）ＧＳ-１５、アシネトバクターｓｐ．（Acinetobacter sp.）ＡＤＰ１、グルコノバクター オキシダンス（Gluconobacter oxydans）６２１Ｈ、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＤＳＭ２０３００、カセイ菌（Lactobacillus casei）ＡＴＣＣ３３４、ストレプトミセス セリカラー（Streptomyces coelicolor）Ｍ１４５／Ａ３（２）、連鎖球菌（Streptococcus）変異体ＡＴＣＣ７００６１０、メタノサルシナ バーケリ（Methanosarcina barkeri）Ｆｕｓａｒｏと共に、大腸菌Ｋ１２ ＭＧ１６５５のＬＰＤの多数アミノ酸配列アラインメントを示す（ＣＬＵＳＴＡＬ多配列アラインメントプログラムを用いる）。アミノ酸３２２位のヒスチジン残基、アミノ酸３５５位のプロリン残基及びアミノ酸３５６位のグルタミン酸残基はアスタリスク（＊）で強調されている。
【図９−４】図９は、選択されたＬＰＤ配列、即ち破傷風菌（Clostridium tetani）Ｅ８８、好熱性細菌（Thermoanaerobacter ethanolicus）、セレウス菌（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０９８７、植物性乳酸菌（Lactobacillus plantarum）ＷＣＦＳ１、乳酸連鎖球菌亜種クレモリス菌（Lactococcus lactis subspecies cremoris）ＳＫ１１、エノコッカス エニ（Oenococcus oeni）ＭＣＷ ＰＳＵ-１、ネズミチフス菌（salmonella typhimurium）ＬＴ２、発光細菌（Vibrio fischeri）ＡＴＣＣ７００６０１、低温菌（Shewanella sp）ＡＮＡ−３、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１（ＡＴＣＣ１５６９２）、ロドバクター スフェロイデス (Rhodobacter sphaeroides)２．４．１、ゲオバクター メタリレデューセンス（Geobacter metallireducens）ＧＳ-１５、アシネトバクターｓｐ．（Acinetobacter sp.）ＡＤＰ１、グルコノバクター オキシダンス（Gluconobacter oxydans）６２１Ｈ、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＤＳＭ２０３００、カセイ菌（Lactobacillus casei）ＡＴＣＣ３３４、ストレプトミセス セリカラー（Streptomyces coelicolor）Ｍ１４５／Ａ３（２）、連鎖球菌（Streptococcus）変異体ＡＴＣＣ７００６１０、メタノサルシナ バーケリ（Methanosarcina barkeri）Ｆｕｓａｒｏと共に、大腸菌Ｋ１２ ＭＧ１６５５のＬＰＤの多数アミノ酸配列アラインメントを示す（ＣＬＵＳＴＡＬ多配列アラインメントプログラムを用いる）。アミノ酸３２２位のヒスチジン残基、アミノ酸３５５位のプロリン残基及びアミノ酸３５６位のグルタミン酸残基はアスタリスク（＊）で強調されている。
【図９−５】図９は、選択されたＬＰＤ配列、即ち破傷風菌（Clostridium tetani）Ｅ８８、好熱性細菌（Thermoanaerobacter ethanolicus）、セレウス菌（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０９８７、植物性乳酸菌（Lactobacillus plantarum）ＷＣＦＳ１、乳酸連鎖球菌亜種クレモリス菌（Lactococcus lactis subspecies cremoris）ＳＫ１１、エノコッカス エニ（Oenococcus oeni）ＭＣＷ ＰＳＵ-１、ネズミチフス菌（salmonella typhimurium）ＬＴ２、発光細菌（Vibrio fischeri）ＡＴＣＣ７００６０１、低温菌（Shewanella sp）ＡＮＡ−３、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１（ＡＴＣＣ１５６９２）、ロドバクター スフェロイデス (Rhodobacter sphaeroides)２．４．１、ゲオバクター メタリレデューセンス（Geobacter metallireducens）ＧＳ-１５、アシネトバクターｓｐ．（Acinetobacter sp.）ＡＤＰ１、グルコノバクター オキシダンス（Gluconobacter oxydans）６２１Ｈ、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＤＳＭ２０３００、カセイ菌（Lactobacillus casei）ＡＴＣＣ３３４、ストレプトミセス セリカラー（Streptomyces coelicolor）Ｍ１４５／Ａ３（２）、連鎖球菌（Streptococcus）変異体ＡＴＣＣ７００６１０、メタノサルシナ バーケリ（Methanosarcina barkeri）Ｆｕｓａｒｏと共に、大腸菌Ｋ１２ ＭＧ１６５５のＬＰＤの多数アミノ酸配列アラインメントを示す（ＣＬＵＳＴＡＬ多配列アラインメントプログラムを用いる）。アミノ酸３２２位のヒスチジン残基、アミノ酸３５５位のプロリン残基及びアミノ酸３５６位のグルタミン酸残基はアスタリスク（＊）で強調されている。
【図９−６】図９は、選択されたＬＰＤ配列、即ち破傷風菌（Clostridium tetani）Ｅ８８、好熱性細菌（Thermoanaerobacter ethanolicus）、セレウス菌（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０９８７、植物性乳酸菌（Lactobacillus plantarum）ＷＣＦＳ１、乳酸連鎖球菌亜種クレモリス菌（Lactococcus lactis subspecies cremoris）ＳＫ１１、エノコッカス エニ（Oenococcus oeni）ＭＣＷ ＰＳＵ-１、ネズミチフス菌（salmonella typhimurium）ＬＴ２、発光細菌（Vibrio fischeri）ＡＴＣＣ７００６０１、低温菌（Shewanella sp）ＡＮＡ−３、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１（ＡＴＣＣ１５６９２）、ロドバクター スフェロイデス (Rhodobacter sphaeroides)２．４．１、ゲオバクター メタリレデューセンス（Geobacter metallireducens）ＧＳ-１５、アシネトバクターｓｐ．（Acinetobacter sp.）ＡＤＰ１、グルコノバクター オキシダンス（Gluconobacter oxydans）６２１Ｈ、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＤＳＭ２０３００、カセイ菌（Lactobacillus casei）ＡＴＣＣ３３４、ストレプトミセス セリカラー（Streptomyces coelicolor）Ｍ１４５／Ａ３（２）、連鎖球菌（Streptococcus）変異体ＡＴＣＣ７００６１０、メタノサルシナ バーケリ（Methanosarcina barkeri）Ｆｕｓａｒｏと共に、大腸菌Ｋ１２ ＭＧ１６５５のＬＰＤの多数アミノ酸配列アラインメントを示す（ＣＬＵＳＴＡＬ多配列アラインメントプログラムを用いる）。アミノ酸３２２位のヒスチジン残基、アミノ酸３５５位のプロリン残基及びアミノ酸３５６位のグルタミン酸残基はアスタリスク（＊）で強調されている。
【図１０】図１０は、ＮＡＤＨによるＰＤＨ活性の阻害を示すグラフである。大腸菌野生型株Ｗ３１１０又はエタノール産生性変異体株ＳＥ２３７８。上のグラフでは、ＮＡＤ濃度は株Ｗ３１１０及び株ＳＥ２３７８の両方に関して２ｍＭであった。下のグラフでは、ＮＡＤ濃度は株Ｗ３１１０由来の天然酵素に関しては２ｍＭ ＮＡＤ、そして株ＳＥ２３７８由来の酵素の変異された形態に関しては１ｍＭであった。
【図１１】図１１は、ＮＡＤＨによるＬＰＤの阻害を示すグラフである。酵素の活性におけるＮＡＤＨのＮＡＤに対する比率を、ＬＰＤの天然体及び変異体の両方に関して測定した。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本発明は、２００６年５月１日出願の米国特許仮出願第６０／７９６，６５２号及び２００７年９月２９日出願の同第６０／８４８，２３４号の優先権を主張し、その全ての内容を参照として本明細書に明確に組み込む。
【０００２】
（米国政府の委託研究）
本発明は、助成金第ＤＥ-ＦＧ３６−０４ＧＯ１４０１９号に基づき、米国エネルギー省により一部が助成された。従って、米国政府は、本発明に対するある特定の権利を有している。
【背景技術】
【０００３】
エタノールは、少なくとも一部の石油に置換わる魅力的な代替輸送燃料である（Kheshgi, et al., 2000, Wooley, et al., 1999）。エタノールは現在米国においてサッカロマイセス・セレヴィシエ（Bothast, et al., 2005）を用いてコンスターチからグルコースを醗酵させることにより産生されているが、この工程を自動車燃料必要量の大部分を産生するように拡張することは、食品及び飼料産業に悪影響を与えるであろう。
【０００４】
リグノセルロース系バイオマスは、食品及び飼料の供給に影響を与えることなく、適切な前処理の後にエタノールへと発酵させることができる魅力的な代替原料である（Wyman, et al., 2003, Zaldivar, et al., 2001）。コンスターチとは対照的に、バイオマスは、酵母による発酵に対抗する相当量のペントース糖を含有している。
【０００５】
複合糖類のエタノールへの変換は、ヘキソース及びペントース糖の両方を効果的に発酵させる微生物生体触媒を必要とする。この目標に向けて、異種遺伝子が酵母、Ｚ．モビリス及び大腸菌のような土台生物に添加されている、組み換え生物が開発されている。例えば、ザイモモナス モビリス由来のｐｄｃ及びａｄｈ遺伝子を含有している組み換えのエタノール産生性の大腸菌は、ヘキソース及びペントース糖の両方をエタノールへ高速及び高収率で発酵させる（Ingram, et al., 1999）。加えて、ペントース利用のための遺伝子の添加による酵母及びＺ．モビリスの遺伝子操作は、組み換えエタノール産生性の大腸菌のペントース発酵特性に合致する生体触媒をもたらさなければならない（Kuyper, et al., 2005, Mohagheghi, et al., 2004）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のように、リグノセルロース供給原料のエタノールへの変換は、ヘキソース及びペントース糖の両方を効果的に発酵させる微生物生体触媒を必要とする。そのような微生物生体触媒は、そこにおいて異種遺伝子が、例えば、ザイモモナス・モビリス及び大腸菌といった酵母及び細菌のような土台の生物に添加されているような、組み換え生物を含む。
【０００７】
しかし、大規模な燃料生産のための組み換え生物の使用は、いくらか商業化への障壁があると考えられている。非組み換えエタノール産生の開発は、リグノセルロース原料からの商業的エタノール生産の障壁と考えられているものの一種を減少させることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明は、少なくとも部分的に、エタノール非産生性の微生物におけるホモエタノール経路を介する解糖に指向し直した変異の発見、及びこの発見に基づく嫌気性条件下でグルコース及びキシロースをエタノールへ発酵させる非組み換えのエタノール産生性微生物の開発に基づいている。特に、ｐｄｈオペロンはホモエタノール経路の由来源として認識されている。より具体的には、ｐｄｈオペロン内のｌｐｄ遺伝子は、嫌気性条件下で、例えば大腸菌によるホモエタノール発酵に関与するとして認識されている。
【０００９】
よって、一態様では、本発明は、非組み換え細菌を嫌気性条件下で糖１モル当たり４モルのＮＡＤＨを産生できるようにする変異を含んでなる、単離した非組み換え細菌を提供する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、非組み換え細菌が嫌気性条件下で発酵主生成物としてエタノールを産生することを可能にする、１つ又はそれ以上の変異を伴うｌｐｄ遺伝子を含んでなる、単離した非組み換え細菌を提供する。
【００１１】
本発明は、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（ＬＰＤ）ポリペプチド又はその機能的断片をコードする、単離した核酸分子を提供する。核酸分子が細胞、例えば細菌に発現すると、細胞は発酵主生成物としてエタノールを産生する。
【００１２】
よって、別の態様では、本発明は、核酸分子が、
（ａ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列と少なくとも６０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；
（ｂ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列を含んでなる核酸の、少なくとも１００ヌクレオチドの断片を含有してなる核酸分子；
（ｃ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｄ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片をコードする核酸分子であって、当該断片が配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列の少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基を含有してなる、核酸分子；
（ｅ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの天然のアレル変異体をコードする核酸分子であって、当該核酸分子がストリンジェントな条件下で配列番号１若しくは配列番号３に記載の配列を含有する核酸分子の相補配列とハイブリダイズする、核酸分子；
（ｆ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列を含んでなる核酸分子；
（ｇ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸分子；
からなる群より選択されて、当該核酸分子が、細胞内で発現すると、細胞が発酵主生成物としてエタノールを産生できるようにする、単離した核酸分子を提供する。
【００１３】
本発明は、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼポリペプチド又はその機能的断片をコードする単離した核酸分子を提供する。ポリペプチドが細胞、例えば細菌に発現すると、細胞は発酵主生成物としてエタノールを産生する。
【００１４】
よって、別の態様では、本発明は、ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片であって、当該断片が配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含有してなる、ポリペプチドの断片；
（ｂ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの天然のアレル変異体であって、当該ポリペプチドがストリンジェントな条件下で配列番号１若しくは配列番号３に記載の配列を含有する核酸分子の相補配列とハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、アレル変異体；
（ｃ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含んでなる核酸に少なくとも５０％の相同性である核酸分子によってコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２若しくは配列番号４に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性であるアミノ酸配列を含有してなるポリペプチド； 並びに
（ｅ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなる単離したポリペプチド；
からなる群より選択されて、当該ポリペプチドが、細胞内で発現すると、細胞が発酵主生成物としてエタノールを産生できるようにする、ポリペプチドを提供する。
【００１５】
一態様では、細胞により産生されたエタノールが、嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する。この様態の別の態様では、ポリペプチドは、嫌気性条件化でジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ活性を有する。更なる態様では、細胞は細菌細胞である。
【００１６】
更なる態様では、本発明は、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼポリペプチド又はその断片をコードする単離した核酸分子を含有する細菌宿主細胞を提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、方法が、
（ａ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列含んでなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片であって、当該断片が配列番号２又は配列番号４に記載の配列の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含有してなる、ポリペプチドの断片；並びに
（ｃ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの天然のアレル変異体であって、当該ポリペプチドが、ストリンジェントな条件下で配列番号１若しくは配列番号３に記載の配列を含んでなる核酸分子の相補配列とハイブリダイズする核酸分子によりコードされる、アレル変異体；
からなる群より選択されるポリペプチドを産生する方法であって、
核酸分子を発現する条件下でジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼポリペプチド又はその断片をコードする単離した核酸分子を含有する細菌宿主細胞を培養することを含んでなる、ポリペプチドを産生する方法を提供する。
【００１８】
更なる態様では、本発明は、上述の単離した核酸分子を含んでなる、上記のような非組み換え細菌を提供する。
【００１９】
本発明の更なる態様では、１つ又はそれ以上の変異を伴うｌｐｄ遺伝子を含有してなる非組み換え細菌であって、当該変異は非組み換え細菌が嫌気性条件下で発酵主生成物としてエタノールを産生することができるようにするものであり、そして細菌が、
（ａ）糖の多い培地で嫌気性生育条件下で、細菌の候補の変異株を生育させること；及び
（ｂ）発酵の主生成物としてエタノールを産生する変異体を選択すること：
の段階を含有してなる工程により製造される、非組み換え細菌を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、工程が、
（ａ）糖の多い培地で嫌気性生育条件下で、細菌の候補の変異株を生育させること；及び
（ｂ）発酵の主生成物としてエタノールを産生する変異体を選択すること：
を含有してなる、本発明のエタノール産生性の非組み換え細菌を製造する方法を提供する。
【００２１】
一態様では、本発明は、ｌｐｄ遺伝子における変異がＮＡＤＨ非感受性をもたらす、上記態様の何れかの単離した非組み換え細菌を提供する。
【００２２】
上述の様態の別の態様では、変異がｌｐｄ遺伝子における変異に起因する。特定の態様では、ｌｐｄ遺伝子における変異がＮＡＤＨ非感受性をもたらす。
【００２３】
別の態様では、本発明は、オリゴ糖源からエタノールを産生するための方法を提供する。方法は、オリゴ糖を上述のような本発明の非組み換え細菌又は宿主細胞と接触させて、それによってオリゴ糖源からエタノールを産生することを含んでなる。方法の特定の態様では、オリゴ糖は、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン、及びこれらの組み合わせの何れかからなる群より選択される。
【００２４】
更に別の態様では、本発明は、上述のような本発明の非組み換え細菌又は宿主細胞、及び本明細書に記載の方法及び工程によってエタノールを製造するのための説明書を含有してなるキットを提供する。一態様では、キットは糖供給源を含有している。
【００２５】
更に別の態様では、本発明は、２００６年９月２７日に、ｔｈｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ、 1815 N. University Street, Peoria, IL, USA）に寄託された、ＡＨ２１８（ＮＲＲＬ Ｂ-３０９６７）、ＡＨ２４１（ＮＲＲＬ Ｂ-３０９６８）、ＡＨ２４２（ＮＲＲＬ Ｂ-３０９６９）、ＳＥ２３７７（ＮＲＲＬ Ｂ-３０９７０）、ＳＥ２３７８（ＮＲＲＬ Ｂ-３０９７１）、ＳＥ２３８２（ＮＲＲＬ Ｂ-３０９７２）、ＳＥ２３８３（ＮＲＲＬ Ｂ-３０９７３）、ＳＥ２３８４（ＮＲＲＬ Ｂ-３０９７４）、及びＳＥ２３８５（ＮＲＲＬ Ｂ-３０９７５）株を含む、新規な大腸菌株を提供する。
【００２６】
本発明の他の特性及び利点は、下記の詳細の説明及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本発明の全範囲を明確に理解するために、以下の定義を記述する。
Ｉ．定義
本明細書で用いる「非組み換え宿主細菌」及び「細菌」という用語は、非相同性ポリヌクレオチド配列を含む又は含まず、そして例えば、トランスフェクトされるような、例えば、非相同性ポリヌクレオチド配列を取り込むことができる、例えば、遺伝子操作に適している、本発明の組成物及び方法を用いる更なる修飾に適している、細菌細胞を包含するように意図されている。前記用語は、もともとトランスフェクトされている細胞の子孫を含むように意図されている。特定の態様では、細胞は、グラム陽性細菌の細胞又はグラム陰性細菌の細胞である。「細菌由来のポリヌクレオチド又は遺伝子」のような「由来の」という用語は、表記された供給源（即ち、細菌）からのポリヌクレオチドセグメントの単離（全体又は部分）、又は表記された供給源（即ち、細菌）からのポリペプチドの精製を含むことを意図している。これに関して、この用語は、例えば、直接的なクローニング、ＰＣＲ増幅、又は表示されたポリヌクレオチド原料に関連する配列由来の若しくはそれに基づく人工的な合成を含むことを意図している。
【００２８】
「嫌気性条件」という用語は、酸素を含有しない条件、即ちそこには実質的に酸素が存在しない条件を含むことを意図している。本発明のある特定の態様では、嫌気性条件は、密閉された管又は容器、例えばストッパーで密閉された管を含有してなる。酸素を含まない条件を作成するために、気相を真空ポンプを用いて管又は容器から除去して、窒素ガスに置き換える。酸素レベルが検出できないほど低い場合、酸素は実質的に存在しない。「好気性条件」という用語は、酸素を含有する条件、即ちそこには酸素が存在している条件を含むことを意図している。
【００２９】
「エタノール産生性」という用語は、糖質から発酵主生成物としてエタノールを産生する微生物の能力を含むことを意図している。この用語は、天然のエタノール産生性の生物、天然の又は導入された突然変異を有するエタノール産生性の生物を含むことを意図している。
【００３０】
「エタノール非産生性」という用語は、糖質から発酵主生成物としてエタノールを産生できない細胞の能力を含むことを意図している。この用語は、非気体状発酵生成物の全量の４０％より少ない、少量発酵生成物としてエタノールを産生する微生物を含むことを意図している。
【００３１】
「発酵する(fermenting)」及び「発酵（fermentation)」という用語は、複合糖の分解又は解重合、及びこの糖残基のエタノール、アセテート及びスクシネートへの生物変換を含むことを意図している。この用語は、エタノールが、特に主要な発酵生成物として糖質から産生される、酵素の処理工程（例えば、細胞性又は無細胞性、例えば、溶解又は精製されたポリペプチド混合物）を包含することを意図している。
【００３２】
「発酵主生成物」及び「主要発酵生成物」という用語は、本明細書では交換可能に用いられ、非気体状生成物の全量の約５０％より多くを含有する発酵の非気体状生成物を含むことを意図している。発酵主生成物は、最も多い非気体状生成物である。本発明のある特定の態様では、発酵主生成物が、エタノールである。
【００３３】
本明細書で用いる「少量発酵生成物」という用語は、非気体状生成物の全量の４０％より少ない発酵の非気体状生成物を含むことを意図している。
【００３４】
本明細書で用いる「ホモエタノール発酵経路」という用語は、発酵主生成物としてのエタノールの産生を容易にする、生物、例えば、細菌における発酵経路を含むことを意図している。
【００３５】
本明細書で用いる「発酵の代替的経路」という用語は、そこではエタノールが発酵主生成物ではない、発酵経路を含むことを意図している。
【００３６】
本明細書で用いる「遺伝子」という用語は、例えば、ポリペプチドをコードする連続オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のようなコーディング配列を包含してもよく、又はそれ自身が生体内で機能を有していてもよい、酵素又はその他のポリペプチド分子を直接合成することができる核酸である。生体内の遺伝子は、本明細書で明示されるように、オペロンに集合させることができ、ここにおけるオペロンは、遺伝子間ＤＮＡによって他の遺伝子及び／又はオペロンから単離される。オペロン中に含まれる個々の遺伝子は、個々の遺伝子の間にある遺伝子間ＤＮＡなしで、重なり合うことができる。更に、「遺伝子」という用語は、選択された目的のための特定の遺伝子を含むことを意図している。遺伝子は、宿主細胞に内因性であってもよいし、例えばエピソームに保持されたプラスミド又はゲノムに安定に組み入れられたプラスミド（又はその断片）のように、宿主細胞に組み換え技術によって導入されていてもよい。異種遺伝子は、細胞内に導入される遺伝子であり、その細胞自生のものではない。
【００３７】
「ｐｄｈオペロン」及び「ｐｄｈ遺伝子座」という用語は、交換可能に用いられて、群として発現される遺伝子のＰｄｈＲ、ｌｐｄ及びａｃｅＥＦのクラスター、並びにそれらの関連するプロモーター及びオペレーターを示すことを意図している。言い換えれば、「ｐｄｈオペロン」という用語は、そのオペロンをコードする遺伝子を示し、一方「ＰＤＨ」という用語は、そのオペロンによりコードされるタンパク質の複合体を示す。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性は、ＴＣＡ回路のためのアセチルＣｏＡの産生及びエネルギー産生に関与している。用語ｐｄｈオペロンは、何れかの好気性生物由来のｐｄｈオペロンを包含することができる。真核生物からヒトまで、全ての好気性生物は、ＰＤＨの３つの構成要素を含有している。多くの細菌は、オペロンに含有されるＰＤＨをコードする遺伝子を有している。３つの遺伝子、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ及びｌｐｄはＰＤＨの活性にとって極めて重要であり、これらの３つの遺伝子は、好気性生物がオペロンとして又は独立した遺伝子としての何れで組織されていても、全ての好気性生物中に見出される。
【００３８】
「ジヒドロリポアミド アセチルトランスフェラーゼ」（ａｃｅＦ）という用語は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子座のＥ２アセチルトランスフェラーゼ酵素を含むことを意図している。言い換えれば、「ａｃｅＦ」という用語は、ジヒドロリポアミド アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を意味して、一方で用語「ＡｃｅＦ」は、ａｃｅＦ遺伝子産物、即ちジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼのポリペプチド又は酵素を意味する。
【００３９】
「ＰＤＨ複合体のピルビン酸デカルボキシラーゼ／デヒドロゲナーゼ」（ａｃｅＥ）という用語は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子座のＥ１デカルボキシラーゼ酵素を含むことを意図している。言い換えれば、用語「ａｃｅＥ」は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ／デヒドロゲナーゼ遺伝子示し、一方で「ＡｃｅＥ」はａｃｅＥ遺伝子産物、即ちピルビン酸デカルボキシラーゼ／デヒドロゲナーゼのポリペプチド又は酵素を意味する。
【００４０】
「ピルビン酸デヒドロゲナーゼリプレッサー」（ｐｄｈＲ）という用語は、ｐｄｈオペロンの転写リプレッサーを含むことを意図している。言い換えれば、用語「ｐｄｈＲ」は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼリプレッサー遺伝子を意味して、一方で用語「ＰｄｈＲ」は、ｐｄｈＲ遺伝子産物、即ちピルビン酸デヒドロゲナーゼリプレッサーポリペプチドを意味する。
【００４１】
「ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ」（ｌｐｄ）という用語は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子座又は「ｐｄｈオペロン」の部分である酵素を含むことを意図している。言い換えれば、用語「ｌｐｄ」は、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ遺伝子を意味して、一方で用語「ＬＰＤ」は、ｌｐｄ遺伝子産物、即ちジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼのポリペプチド又は酵素を意味する。
【００４２】
「乳酸デヒドロゲナーゼ」（ｌｄｈＡ）という用語は、発酵性条件下でピルビン酸を乳酸に変換する酵素を含むことを意図している。言い換えれば、用語「ｌｄｈＡ」は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を意味して、一方で用語「ＬＤＨＡ」は、ｌｄｈＡ遺伝子産物、即ち乳酸デヒドロゲナーゼのポリペプチド又は酵素を意味する。
【００４３】
「ピルビン酸ギ酸リアーゼ」（ｐｆｌ）という用語は、発酵性条件下でピルビン酸をアセチル-ＣｏＡ及びギ酸に変換する酵素を含むことを意図している。言い換えれば、用語「ｐｆｌ」は、ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子を意味して、一方で用語「ＰＦＬ」は、ｐｆｌ遺伝子産物、即ちピルビン酸ギ酸リアーゼのポリペプチド又は酵素を意味する。
【００４４】
「アルコールデヒドロゲナーゼ」（ａｄｈＥ）という用語は、発酵性条件下でアセチル-ＣｏＡをエタノールに変換する酵素を含むことを意図している。言い換えれば、用語「ａｄｈＥ」は、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を意味して、一方で用語「ＡＤＨＥ」は、ａｄｈＥ遺伝子産物、即ちアルコールデヒドロゲナーゼのポリペプチド又は酵素を意味する。
【００４５】
「ＮＡＤＨ非感受性」という用語は、ＮＡＤＨに対するＰＤＨの感受性の低下を示す。この用語は、部分的に低下する非感受性、又は感受性の完全な欠如を含むことを意図している。
【００４６】
「核酸」という用語は核酸分子、例えば、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、そして更に非コード調節配列及びイントロンを含むことができるポリヌクレオチドを含ことを意図している。更に、この用語は、機能座に位置付ける１つ又はそれ以上の遺伝子を含むことを意図している。更に、この用語は、選択された目的のための特定の遺伝子を含むことを意図している。一態様では、ポリヌクレオチドセグメントの遺伝子は、炭水化物のエタノールへの生物変換の少なくとも１つの工程に包含されている。従って、この用語は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、分泌ポリペプチド、又はポリサッカラーゼ、例えばグルカナーゼ、又はその組合せのようなポリペプチドをコードする何れかの遺伝子を含むことを意図している。生体内の遺伝子は、本明細書で明示されるように、オペロンに集合させることができ、ここにおけるオペロンは、遺伝子間ＤＮＡによって他の遺伝子及び／又はオペロンから単離される。ｐｄｈオペロン中に含まれる個々の遺伝子は、個々の遺伝子の間にある遺伝子間ＤＮＡなしで、重なり合うことができる。
【００４７】
本明細書で用いる「相同（の）」という用語は、第一及び第二のアミノ酸又はヌクレオチド配列が共通の構造ドメイン及び／又は共通の機能的活性を共有するように、第二のアミノ酸又はヌクレオチド配列に対して同一の又は均等なアミノ酸残基又はヌクレオチド、例えば、同様の側鎖を有するアミノ酸残基、の十分な又は最小の数を含有している第一のアミノ酸又はヌクレオチド配列を含むことを意図している。
【００４８】
「非相同性ポリペプチド」という用語は、何れかの供給源、例えば真核生物、原核生物、古細菌、ウィルス、又は合成の核酸断片、に由来する非相同性核酸によってコードされ得るポリペプチド又はその断片を含むことを意図している。
【００４９】
「単離したポリペプチド」（例えば、単離した又は精製した生合成酵素）という用語は、そのポリペプチドが由来する微生物からの細胞物質又は他の汚染ポリペプチドを実質的に含まない、又は化学的に合成した場合には、原料となる化学物質又は他の化学物質を実質的に含まない。
【００５０】
「ヌクレオチド断片」又は「ポリペプチド断片」のような「断片」という用語は、それが由来する配列の少なくとも一部と実質的に同一であり、そしてそこでポリペプチドがそれが由来する配列からの生物学的活性を保持している、ヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の一部を示すことを意図している。
【００５１】
「ｐＨ」という用語は、溶液中の水素イオンのモル濃度の程度を示すことを意図していて、それ自体は溶液の酸性又は塩基性の程度である。当該技術分野の標準に従い、用語ｐＨは、溶液を規定するために用いる。経験するｐＨ値の通常の範囲は、０及び１４の間であり、０は濃塩酸（１Ｍ ＨＣＬ）相当の値、７は純水（中性ｐＨ）相当の値、そして１４は濃水酸化ナトリウム（1Ｍ ＮａＯＨ）相当の値である。
【００５２】
「ｐＫ」という用語は、タンパク質結合親和性の程度を示すことを意図していて、多くの場合ｐＨと交換可能に用いられる。当業者は理解されるであろうように、用語ｐＫは、タンパク質、アミノ酸及びペプチドを規定するために用いる。アミノ酸のカルボキシル、アミノ及びイオン性Ｒ−基は、結合定数Ｋａ、又はより一般的にはＫａの負の対数、ｐＫａにより規定できることも当業者には理解されるであろう。
「ベクター」という用語は、目的のヌクレオチド配列のライゲーション及び宿主細胞への形質転換に適する何れかのプラスミドベクターを含むことを意図している。
【００５３】
「糖」という用語は、糖分子（複数も）を含有する何れかの糖質源を含むことを意図している。そのような糖は、本発明の生成物及び方法による発酵によって、（必要であれば）解重合及び続くアセトアルデヒドそして更にエタノールへの生物変換のための可能性のある糖源である。糖源は、デンプン、大部分の植物の燃料貯蔵の主要形態、そしてセルロース、植物の硬い細胞壁並びに繊維性及び木質の組織の主要細胞外構成成分を含む。この用語は、モノサッカライド、単糖とも呼ばれる、オリゴ糖、及びポリサッカライドを含むことを意図している。ある特定の態様では、糖は、例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びラクトースを含む。他の態様では、糖はグルコースである。
【００５４】
「グラム陰性細菌細胞」という用語は、この用語の当該技術分野で認識されている定義のものを含むことを意図している。例示的なグラム陰性細菌は、アシネトバクター属（Acinetobacter）、グルコノバクター属（Gluconobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、ジオバクター属（Geobacter）、シェワネラ属（Shewanella）、サルモネラ属（Salmonella）、エンテロバクター属（Enterobacter）及びクレブシエラ属（Klebsella）を包含する。
【００５５】
「グラム陽性細菌」という用語は、この用語の当該技術分野で認識されている定義のものを含むことを意図している。例示的なグラム陽性細菌は、バチルス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、オエノコッカス属（Oenococcus）、連鎖球菌属、及びユーバクテリウム属（Eubacterium）を包含する。
【００５６】
「変異核酸分子」又は「変異遺伝子」という用語は、ポリペプチド又は変異体でコードされ得るポリペプチドがそのポリペプチド又は野生型の核酸分子若しくは遺伝子でコードされ得るポリペプチドとは異なる活性を示すような、少なくとも１つの変化（例えば、置換、挿入、欠失）を含むヌクレオチド配列を有する核酸分子又は遺伝子を包含することを意図している。
【００５７】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質に規則的に生じる２０のαアミノ酸を含むことを意図している。塩基性の荷電アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン及びリジンを包含する。中性の荷電アミノ酸は、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンを包含する。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を包含する。
【００５８】
「変異誘発剤」という用語は、本発明の方法によりヌクレオチド配列を修飾するために用いることのできる何れかの薬剤を含むことを意図している。
「自然発生の変異」という用語は、変異源の不在下で生じる変異を含むことを意図している。この用語は、本発明の方法において変異誘発剤の添加なしで生じる変異を含んでもよい。
【００５９】
ＩＩ．非組み換え細菌
混合酸発酵の間に、解糖の酵素は、各１モルのグルコースを２モルのピルビン酸＋２モルのＮＡＤＨ及び正味２モルのＡＴＰに変換する。ピルビン酸をより還元した化合物（エタノール、乳酸等）の産生は、連続する解糖に必須の、ＮＡＤＨを酸化してＮＡＤ＋を再生するための機構として機能する。酵母、植物及び細菌（即ち、Ｚ．モビリス）中で展開する唯一の公知であるホモエタノール経路において、ピルビン酸は脱カルボキシル化されて、非酸化ピルビン酸デカルボキシラーゼにより二酸化炭素及びアセトアルデヒドを産生する。産生したアセトアルデヒドは、１つのエタノールの産生の間にアルコールデヒドロゲナーゼによるＮＡＤＨ酸化のための電子受容体として働く。
【００６０】
完全に異なるエタノール経路が多くの他の細菌の型に存在していて、そこにおいてピルビン酸は最初に、ピルビン酸ギ酸リアーゼにより、すなわち還元当量がギ酸水素リアーゼによりギ酸塩に含有されて水素ガス（及びＣＯ２)として分散する酸化的脱炭酸反応により、アセチル-ＣｏＡ及びギ酸塩に変換される。アセチルＣｏＡは、続いてａｄｈＥにコードされるアルデヒドアルコールデヒドロゲナーゼ活性による２つのＮＡＤＨ分子の酸化のための電子受容体として用いられる。１エタノール当たり２ＮＡＤＨを必要とするため、半分のアセチルＣｏＡが残り、酢酸塩及び更なるＡＴＰに変換する。よって、アセチルＣｏＡからのエタノールのための天然の大腸菌経路は、アセチルＣｏＡから産生される１エタノール当たり２ＮＡＤＨを必要とするために、ホモエタノール発酵を支持できない。酸化還元平衡は、酢酸産生によって維持される。これが、野生型大腸菌が発酵の間に等モル量の酢酸塩及びエタノールを産生する主な理由である。
【００６１】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼはピルビン酸をアセチルＣｏＡに酸化的脱炭酸化して、そして関連の還元体をＮＡＤＨとして保持する。これは、関連還元剤が中間体としてのギ酸を通して水素ガスとして分散して、グルコースの存在下で代射活性のために利用できないＰＦＬとは対照的である。ピルビン酸をＰＤＨと代射することにより、ピルビン酸当たりの更なるＮＡＤＨを、各アセチルＣｏＡをエタノールに完全に還元するために用いることを可能にする。ピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は一般に大腸菌の好気性及び嫌気性の両方の条件下で発現されるが、この複合体の活性は嫌気性の間の生育が極めて低い。
【００６２】
本発明は、少なくとも部分的に、エタノール非産生性以外の微生物におけるホモエタノール経路を介する解糖に指向し直した変異の発見、及びこの発見に基づく嫌気性条件下でグルコース及びキシロースをエタノールへ発酵させる非組み換えのエタノール産生性微生物の開発に基づいている。この再指向した解糖により、本発明の非組み換え細菌は、嫌気性条件下で、糖１モル当たり４モルのＮＡＤＨ、又はピルビン酸当たり２モルのＮＡＤＨを産生する。
【００６３】
よって、一態様では、本発明は、非組み換え細菌を嫌気性条件下で糖１モル当たり４モルのＮＡＤＨを産生できるようにする変異を含んでなる非組み換え細菌を提供する。一態様では、変異はｐｄｈオペロンに位置する。特定の態様では、ｐｄｈオペロンはｐｄｈＲ，ａｃｅＥＦ及びｌｐｄ遺伝子を包含する。更なる態様では、変異はｌｐｄ遺伝子に存在する。
【００６４】
別の態様では、糖１モル当たり４モルのＮＡＤＨの産生は、発酵主生成物としてエタノールの産生をもたらす。特定の態様では、糖は、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース及びラクトースからなる群より選択される。
【００６５】
別の態様では、本発明は、１つ又はそれ以上の変異を伴うｌｐｄ遺伝子を包含している非組み換え細菌を提供して、ここで変異は、非組み換え細菌が嫌気性条件下で発酵主生成物としてエタノールを産生することを可能にする。
一態様では、産生されたエタノールは、嫌気性条件下で非気体状発酵生成物の全量の５０％超を構成する。
【００６６】
更なる態様では、変異のない非組み換え細菌は、エタノール非産生性である。更に別の態様では、エタノール非産生性の細菌は、少量発酵生成物としてエタノールを産生する。一態様では、産生されたエタノールは、非気体状発酵生成物の全量の４０％未満を構成する。
【００６７】
本発明の更に別の態様では、ｌｐｄ遺伝子における変異は、それによってエタノールが発酵主生成物として細菌により産生されるホモエタノール経路を提供する。
【００６８】
更なる態様では、細菌における１つ又はそれ以上の発酵の代替的経路が不活性化されている。一態様では、代替的経路は、変異により不活性化される。そのような変異は、代替的経路の１つ又はそれ以上の遺伝子におけるヌクレオチドの欠失、置換及び付加を含む。別の態様では、変異はｌｄｈ遺伝子、例えばｌｄｈＡ遺伝子においてである。更に別の態様では、変異はｐｆｌ遺伝子、例えばｐｆｌＢ遺伝子においてである。更に別の態様では、発酵の代替的経路は、乳酸脱水素酵素（ｌｄｈ）による乳酸塩の産生、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）による酢酸塩、エタノール、ギ酸塩、若しくはＨ２及びＣＯ２（の）変換、又はコハク酸塩の産生を含んでいる。
【００６９】
本明細書に記述の非組み換えの細菌及び細菌細胞の多様な態様では、細菌は、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌からなる群より選択される。ある特定の態様では、細菌はグラム陰性細菌である。特定の態様では、グラム陰性細菌は、アシネトバクター属、グルコノバクター属、エシェリキア属、ジオバクター属、シェワネラ属、サルモネラ属、エンテロバクター属及びクレブシエラ属からなる群より選択される。他の態様では、細菌はグラム陽性細菌である。特定の態様では、グラム陽性細菌は、、バチルス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、オエノコッカス属、連鎖球菌属、及びユーバクテリウム属からなる群より選択される。更なる態様では、細菌は大腸菌である。
【００７０】
上述のように、本発明の非組み換え細菌は、１つ又はそれ以上の変異、例えば、ｌｐｄ遺伝子の変異を包含する。一態様では、変異はあるアミノ酸の別のアミノ酸との置換を包含していて、その置換が、変異されたｌｐｄ遺伝子によって発現されるポリペプチドのｐＫを変化させる。ある特定の態様では、ｌｐｄ遺伝子における変異が、ＮＡＤＨ非感受性をもたらす。即ち、そのような変異が起こる細胞は、ＮＡＤＨに対するＰＤＨ酵素の感受性の低下を明示する。よって、ＮＡＤＨ非感受性の細胞は、グルコース当たりＮＡＤＨ４分子を産生して（２つは解糖から及び２つはＰＤＨ反応から）、４つのＮＡＤＨ全てが、２つのアセチルＣｏＡのエタノールへの還元に用いることがきる。ある特定の態様では、ＮＡＤＨに対するＰＤＨのＮＡＤＨ非感受性、及び高いＮＡＤＨ/ＮＡＤ比を伴っていても機能するその能力は、細胞、例えば細菌がホモエタノールを産生する物となることを可能にする。
【００７１】
一態様では、ポリペプチドは配列番号６に記載の配列を包含していて、そして変異は野生型のアミノ酸の
（ａ）配列番号６に記載の配列の３２２位、又は３２２位のどちらかの側の約５０番目以内の何れかの位置、又は、
（ｂ）配列番号６に記載の配列の３５４位、又は３５４位のどちらかの側の約５０番目以内の何れかの位置、
の別のアミノ酸との置換を包含している。
【００７２】
ある特定の態様では、その他のアミノ酸は、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群より選択される中性アミノ酸である。他の態様では、その他のアミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、及びリジンからなる群より選択される塩基性アミノ酸である。
【００７３】
一態様では、変異は、３２２位のＨの何れかのアミノ酸での置換を包含するものであり、アミノ酸の置換が変異されたｌｐｄ遺伝子により発現されるポリペプチドの酸性を増加させる。特定の態様では、非組み換え細菌は、配列番号６に記載の配列の３２２位のＨのＹへの置換を包含する変異を伴っている。一態様では、非組み換え細菌は、大腸菌株ＳＥ２３７７であり、the Agricultural Research Culture Collectionに寄託された、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７０として示される。別の態様では、非組み換え細菌は、大腸菌株ＳＥ２３８３であり、the Agricultural Research Culture Collectionに寄託された、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７３として示される。更に別の態様では、非組み換え細菌は、大腸菌株ＳＥ２３８４であり、the Agricultural Research Culture Collectionに寄託された、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７４として示される。更なる態様では、株ＳＥ２３７７は配列番号１に記載の配列又はその断片を含有している。別の更なる態様では、株ＳＥ２３８３は配列番号１に記載の配列又はその断片を含有している。更なる別の態様では、株ＳＥ２３８４は配列番号１に記載の配列又はその断片を含有している。
【００７４】
別の態様では、変異は、３５４位のＥの何れかのアミノ酸での置換を包含していて、アミノ酸の置換が変異されたｌｐｄ遺伝子により発現されるポリペプチドの酸性を減少させる。特定の態様では、非組み換え細菌は、配列番号６に記載の配列の３５４位のＥのＫへの置換を包含している変異を伴っている。一態様では、非組み換え細菌は、大腸菌株ＳＥ２３７８であり、the Agricultural Research Culture Collectionに寄託された、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７１として示される。別の態様では、非組み換え細菌は、大腸菌株ＳＥ２３８２であり、the Agricultural Research Culture Collectionに寄託された、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７２として示される。更に別の態様では、非組み換え細菌は、大腸菌株ＳＥ２３８５であり、the Agricultural Research Culture Collectionに寄託された、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７５として示される。更なる態様では、株ＳＥ２３７８は配列番号３に記載の配列又はその断片を含有している。別の更なる態様では、株ＳＥ２３８２は配列番号３に記載の配列又はその断片を含有している。更なる別の態様では、株ＳＥ２３８５は配列番号３に記載の配列又はその断片を含有している。
【００７５】
上述の１つ又はそれ以上の変異を含有している非組み換え細菌は、糖からのエタノールの産生に適したものである。本発明によると、変異はホモエタノール発酵経路を提供する。ある特定の態様では、産生されたエタノールは、嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する。
【００７６】
一態様では、変異が自然発生の変異からもたらされる。別の態様では、細菌が変異誘発剤に晒される。特定の態様では、変異誘発剤が、メタンスルホン酸エチル、２-アミノプリン、ＩＣＲ−１９１、メタンスルホン酸メチル、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンからなる群より選択される。更に特定の態様では、変異誘発剤が、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）である。
【００７７】
別の態様では、細菌における１つ又はそれ以上の発酵の代替的経路が不活性化される。発酵の代替的経路は、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）及びコハク酸塩から出発する、乳酸脱水素酵素（ｌｄｈＡ）による乳酸塩、酢酸塩、エタノール、ギ酸塩、Ｈ２、及びＣＯ２の産生を含んでいる。一態様では、発酵の代替的経路は、変異によって不活性化される。特定の態様では、発酵の代替的経路は、細菌における欠失変異を導入することにより不活性化される。
【００７８】
ＩＩ．単離した核酸分子及び遺伝子
本発明は、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（ｌｐｄ）ポリペプチド又はその断片をコードする単離した核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、本発明の細菌に存在する場合に、嫌気性条件化での発酵主生成物として細菌によるエタノールの産生をもたらす、１つ又はそれ以上の変異を伴うｌｐｄ遺伝子を含有している。
【００７９】
本発明の核酸分子は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子並びにヌクレオチドアナログを用いて生成されたＤＮＡ又はＲＮＡのアナログを含有する。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であってよいが、有利には二本鎖ＤＮＡである。
【００８０】
一態様では、本発明は、単離した核酸分子が、
（ａ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列と少なくとも６０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；
（ｂ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列を含んでなる核酸の、少なくとも１００ヌクレオチドの断片を含有してなる核酸分子；
（ｃ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｄ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片をコードする核酸分子であって、当該断片が配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列の少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基を含有してなる、核酸分子；
（ｅ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの天然のアレル変異体をコードする核酸分子であって、当該核酸分子がストリンジェントな条件下で配列番号１若しくは配列番号３に記載の配列を含有する核酸分子の相補配列とハイブリダイズする、核酸分子；
（ｆ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列を含んでなる核酸分子；
（ｇ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸分子；
からなる群より選択されて、核酸分子が、細胞内で発現すると、細胞が発酵主生成物としてエタノールを産生できるようにする、単離した核酸分子を提供する。
【００８１】
一態様では、細胞により産生されたエタノールは、嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する。別の態様では、細胞が細菌細胞である。更に別の態様では、核酸分子の発現が無い細菌細胞はエタノール非産生性である。特定の態様では、エタノール非産生性の細菌細胞は少量発酵生成物、即ち、非気体状生成物の全量の約４０％未満を構成するものとしてエタノールを産生する。
【００８２】
別の態様では、細菌細胞は嫌気性条件下での発酵主生成物としてエタノールを産生する。特定の態様では、細菌細胞における核酸分子の発現が、発酵主生成物としてエタノールを産生する細菌細胞内でのホモエタノール発酵の経路を提供する。
【００８３】
本発明のこの様態の更に別の態様では、核酸分子は、配列番号１に記載の配列の断片を含有していて、ここでは核酸分子は少なくとも１００ヌクレオチドの長さであり、配列番号１に記載の配列の９９７位に対応する位置にＴを含有する。
【００８４】
別の態様では、核酸分子は、配列番号３に記載の配列の断片を含有していて、ここでは核酸分子は少なくとも１００ヌクレオチドの長さであり、配列番号１に記載の配列の１０２３位に対応する位置にＧを含有する。
【００８５】
一態様では、本発明のｌｐｄ核酸分子は、配列番号１及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列又はその相補配列に（例えば、そのヌクレオチド配列の全長と比較した場合に）少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又はそれ以上の相同性である。配列番号１及び配列番号３に記載の配列は、各々図１（Ａ)及び３（Ａ)に示される。
【００８６】
別の態様では、本発明は、配列番号１若しくは配列番号３に示されるヌクレオチド配列、又はその相補配列を含有している核酸分子の少なくとも１００、１５０、２００、２５０又は３００のヌクレオチドの断片を含有する単離した核酸分子を提供する。
【００８７】
別の特定の態様では、本発明は、図１（Ｂ)及び２（Ｂ)に示される、配列番号２及び配列番号４に記載のアミノ酸配列に、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又はそれ以上の相同性であるアミノ酸配列を含有しているポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００８８】
別の態様では、核酸分子は、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有しているポリペプチドの断片をコードして、ここではこの断片は、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列の少なくとも１５、２５、３５、４５、５５、６５個の連続したアミノ酸残基を含有している。
【００８９】
更なる態様では、本発明は、上述の単離した核酸分子を包含する上述のような非組み換え細菌を提供する。一態様では、非組み換え細菌は、糖からエタノールを産生する。別の態様では、糖は、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース、及びラクトースからなる群より選択される。
【００９０】
本明細書に記述（及び慣例によるイタリック体）のように、ｌｐｄ遺伝子は、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子又はその断片、具体的には、生体において、遺伝子間ＤＮＡ（即ち、生体の染色体ＤＮＡにおいて天然にその遺伝子を隣接する及び／又は遺伝子間を隔てる介在又はスペーサーＤＮＡ）により、別の遺伝子又は他の遺伝子から分離された、ポリペプチド又はＲＮＡがコードする核酸分子を包含する。遺伝子は、酵素又は他のポリペプチド分子の合成を導くことができ（例えば、コーディング配列、例（として）えば、ポリペプチドをコードする連続オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、を包含できる）、又はそれ自身が生体内で機能を有していてもよい。生体内の遺伝子は、本明細書に定義するように、オペロンに集合させることができ、ここにおけるオペロンは、遺伝子間ＤＮＡによって他の遺伝子及び／又はオペロンから分離される。オペロン中に含まれる個々の遺伝子は、個々の遺伝子の間にある遺伝子間ＤＮＡなしで、重なり合うことができる。
【００９１】
本発明の態様は、変異ｌｐｄ核酸分子又は遺伝子を特徴とする。一般に、本明細書に記述のように変異核酸分子又は変異遺伝子は、ポリペプチド又は変異体にコードされ得るポリペプチドがそのポリペプチド又は野生型の核酸分子若しくは遺伝子にコードされ得るポリペプチドとは異なる活性を示すように、少なくとも１つの変化（例えば、置換、挿入、欠失）を含むヌクレオチド配列を有する核酸分子又は遺伝子を包含する。有利には、変異核酸分子又は変異遺伝子（例えば、変異ｌｐｄ遺伝子）は、向上した活性、例えば、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ活性、を有するＬＰＤポリペプチドをコードする。
【００９２】
一態様では、本発明の核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１又は配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有している核酸分子にハイブリダイズする。そのようなストリンジェントな条件は、当業者にとって公知であり、「Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6」に見い出すことができる。ストリンジェントな（例えば、ハイストリンジェントな）ハイブリダイゼーション条件の、特別な限定されない例は、約４５℃で、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーション、次いで５０〜６５℃で、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回又はそれ以上の洗浄である。有利には、ストリンジェントな条件下で配列番号１若しくは配列番号３に記載の配列とハイブリダイズする本発明の単離した核酸分子が天然の核酸分子に対応する。一般には、天然の核酸分子は、天然に発生するヌクレオチド配列を有するＲＮＡ又はＤＮＡの分子を包含する。
【００９３】
本発明の核酸分子（例えば、配列番号１、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有している核酸分子）は、標準的な分子生物学技術及び本明細書で提供されている配列情報を用いて単離することができる。例えば、核酸分子は、標準的なハイブリダイゼーション及びクローニング技術を用いて単離できる（例えば、「Sambrook, J., Fritsh, E.F., and Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989」に記載のように）か、又は配列番号１、配列番号３に記載の配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる。本発明の核酸は、鋳型としてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はその代替のゲノムＤＮＡ、及び適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用い、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って増幅することができる。別の態様では、本発明の単離した核酸分子は、配列番号１、配列番号３に示されるヌクレオチド配列の相補配列である核酸分子を含有している。
【００９４】
更なるｌｐｄ核酸配列は、配列番号１、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含有するものであり、配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのホモログをコードして（例えば、配列番号２、配列番号４として示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はそれ以上の同一性を有し、そして実質的にポリペプチドと同一の活性を有するポリペプチドをコードして）、ストリンジェントな条件下で配列番号１、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子の全て若しくは断片に、又は配列番号２、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子の全て若しくは断片にハイブリダイズして、又は本明細書に示されるｌｐｄヌクレオチド配列に相補的であり、そしてｌｐｄ核酸配列が細胞内に発現すると、嫌気性条件下で発酵主生成物として細胞によるエタノールの産生をもたらすものである。
【００９５】
一態様では、核酸分子は、ポリペプチド又は配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドの生物学的に活性な断片をコードして、ここではそのポリペプチドまたは生物学的に活性な断片は宿主細胞におけるエタノール産生の能力を保持している。
【００９６】
別の態様では、ｌｐｄ核酸分子又は遺伝子は、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＬＰＤポリペプチドのホモログをコードする。一般に、「ホモログ」という用語は、ポリペプチド、又は野生型ポリペプチド若しくは本明細書に記載のポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも約３０〜３５％、有利には少なくとも約３５〜４０％、より有利には少なくとも約４０〜５０％、そして更に有利には少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上の同一性を共有し、そして野生型ポリペプチド又はポリペプチドと実質的に同等な機能又は生物学的活性を有しているポリペプチドを含む。例えば、ＬＰＤのホモログは、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも約６０％、有利には少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又はそれ以上の同一性を共有し、そして配列番号２又は配列番号４として示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同等な機能又は生物学的活性（即ち、機能的に同等である）を有している（例えば、実質的に同等なジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ活性を有する）。
【００９７】
一態様では、ｌｐｄ核酸分子又は遺伝子は、配列番号２又は配列番号４として示されるようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する。
別の態様では、ｌｐｄ核酸分子又は遺伝子は、配列番号１、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有する核酸分子の全て若しくは断片にハイブリダイズするか、又は配列番号２又は配列番号４の何れかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子の全て又は一部にハイブリダイズする。
【００９８】
そのようなハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知であり、そして「Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. (1995), sections 2, 4 and 6」に見い出すことができる。更なるストリンジェントな条件は、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), chapters 7, 9 and 11」に見い出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の、特別な限定されない例は、約６５〜７０℃で、４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーション（又は、約４２〜５０℃で、４×ＳＳＣ＋５０％のホルムアミド中のハイブリダイゼーション）、次いで約６５〜７０℃で、１×ＳＳＣ中で１回又はそれ以上の洗浄を含む。ハイストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の、特別な限定されない例は、約６５〜７０℃で、１×ＳＳＣ中のハイブリダイゼーション（又は、約４２〜５０℃で、１×ＳＳＣ＋５０％のホルムアミド中のハイブリダイゼーション）、次いで約６５〜７０℃で、０．３×ＳＳＣ中で１回又はそれ以上の洗浄を含む。低い程度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の、特別な限定されない例は、約５０〜６０℃で、４×ＳＳＣ中のハイブリダイゼーション（又は、約４０〜４５℃で、６×ＳＳＣ＋５０％のホルムアミド中の代替のハイブリダイゼーション）、次いで約５０〜６０℃で、２×ＳＳＣ中で１回又はそれ以上の洗浄を含む。上記の値の中間の範囲、例えば、６５〜７０℃又は４２〜５０℃も本発明に含まれるものと意図されている。ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４及び１．２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を、ハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液中で、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ及び１５ｍＭのクエン酸ナトリウムである）と置き換えることができ、ハイブリダイゼーションが完了した後、洗浄をそれぞれ１５分間実施する。長さ５０塩基対より少ないと予測されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）よりも５〜１０℃低くすべきであり、このＴｍは、以下の式に従って決められる。長さ１８塩基対より少ないハイブリッドのためには、Ｔｍ（℃）＝２（Ａの数＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇの数＋Ｃ塩基数）。長さ１８〜４９塩基対の範囲のハイブリッドのためには、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）。ここにおけるＮは、ハイブリッド中の塩基の数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度（１×ＳＳＣ＝０．１６５Ｍに対する［Ｎａ＋］）である。
【００９９】
当業者には認識されているが、追加の試薬を、膜（例えば、ニトロセルロース又はナイロン膜）への核酸分子の非特異的ハイブリダイゼーションを低減するために、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄緩衝液に加えることができる。試薬には、これらに限定されないが、ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ又はサケ若しくはニシン精子担体のＤＮＡ）、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、フィコール（Ficoll）、ＰＶＰ等が含まれる。ナイロン膜を使用する場合、具体的な、追加の限定されないストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約６５℃における０．２５〜０．５ＭのＮａＨ２ＰＯ４、７％のＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、次いで６５℃における０．０２ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１％のＳＤＳ（またあるいは、０．２×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ）で１回又はそれ以上の洗浄である。例えば、「Church and Gilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995」を参照されたい。別の態様では、単離した核酸分子は、本明細書に記載のｌｐｄヌクレオチド配列に相補的な（例えば、配列番号１又は配列番号３として示されるヌクレオチド配列に完全に相補的である）ヌクレオチド配列を包含する。
【０１００】
ＩＩＩ．ポリペプチド
本発明は、ポリペプチド（例えば、変異エタノール産生性酵素、例として、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（ＬＰＤ)）を特徴とする。ポリペプチドが細胞、例えば細菌に発現すると、細胞は嫌気性条件下でエタノールを発酵主生成物として産生する。
【０１０１】
よって別の態様では、本発明は、ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片であって、当該断片が配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含有してなる、ポリペプチドの断片；
（ｂ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの天然のアレル変異体であって、当該ポリペプチドがストリンジェントな条件下で配列番号１若しくは配列番号３に記載の配列を含有する核酸分子の相補配列とハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、アレル変異体；
（ｃ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含んでなる核酸に少なくとも５０％の相同性である核酸分子によってコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２若しくは配列番号４に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性であるアミノ酸配列を含有してなるポリペプチド； 並びに
（ｅ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなる単離したポリペプチド；
からなる群より選択されて、当該ポリペプチドが、細胞内で発現すると、細胞が発酵主生成物としてエタノールを産生できるようにする、ポリペプチドを提供する。
【０１０２】
一態様では、細胞によって産生されたエタノールが、嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する。この様態の別の態様では、ポリペプチドが、嫌気性条件下でジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ活性を有している。更なる態様では、細胞が細菌細胞である。
【０１０３】
更に別の態様では、ポリペプチドの発現が無い細菌細胞はエタノール非産生性である。特定の態様では、エタノール非産生性の細菌細胞は、少量発酵生成物として、即ち非気体状生成物の全量の４０％未満のエタノールを産生する。
【０１０４】
更なる態様では、細菌細胞が、嫌気性条件下での発酵主生成物としてエタノールを産生して、そして更に別の態様では、産生されたエタノールが、嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する。特定の態様では、細菌細胞におけるポリペプチドの発現が、細菌細胞内でのホモエタノール発酵の経路を提供する。
【０１０５】
別の態様では、本発明の単離したポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有しているポリペプチドの断片であり、ここではこの断片は、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列の少なくとも１５、２５、３５、４５、５５又は６５個の連続したアミノ酸残基を含有している。
【０１０６】
別の態様では、本発明は、配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又はそれ以上の相同性（例えば、そのアミノ酸配列の全長と比較した場合に）を有する単離したポリペプチドを提供する。
【０１０７】
更なる態様では、本発明は、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼポリペプチド又はその断片をコードする単離した核酸分子を含有する細菌宿主細胞を提供する。
一態様では、細菌宿主細胞は、配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、又はそれらの断片を含有しているベクターを含む。別の態様では、ベクターを含有する細菌宿主細胞は、ｐＫＹ３３である。
【０１０８】
本発明は、ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片であって、当該断片が配列番号２又は配列番号４に記載の配列の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含有してなる、ポリペプチドの断片；
（ｃ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの天然のアレル変異体であって、当該ポリペプチドが、ストリンジェントな条件下で配列番号１若しくは配列番号３に記載の配列を含んでなる核酸分子の相補配列とハイブリダイズする核酸分子によりコードされる、アレル変異体；
からなる群より選択されるポリペプチドを産生する方法であって、
核酸分子を発現する条件下でジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼポリペプチド又はその断片をコードする単離した核酸分子を含有する細菌宿主細胞を培養することを包含する、ポリペプチドを産生する方法を提供する。
【０１０９】
一態様では、ＬＰＤポリペプチド又は遺伝子産物は、非組み換えエタノール産生性のグラム陰性又はグラム陽性の細菌に由来する。例示的な態様では、ＬＰＤポリペプチド又は遺伝子産物は、アシネトバクター属、グルコノバクター属、エシェリキア属、ジオバクター属、シェワネラ属、サルモネラ属、エンテロバクター属及びクレブシエラ属からなる群より選択されるエタノール産生性のグラム陰性微生物に由来する。
【０１１０】
別の態様では、ＬＰＤポリペプチド又は遺伝子産物は、バチルス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、オエノコッカス属、連鎖球菌属、及びユーバクテリウム属からなる群より選択されるエタノール産生性のグラム陽性微生物に由来する。
【０１１１】
天然の細菌遺伝子にコードされる大腸菌由来のポリペプチド又は遺伝子産物であるＬＰＤポリペプチド又は遺伝子産物は、本発明の範囲内に含まれる。更に、天然の細菌及び／又は大腸菌の遺伝子（例えば、ｌｐｄ）、例えば、変異された、挿入された又は欠失した核酸を有する遺伝子、とは異なるが、本発明の天然の遺伝子産物と実質的に類似のポリペプチド（例えば、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ活性を含有する）をコードする細菌由来のポリペプチド又は遺伝子産物は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１１２】
当業者は同類アミノ酸置換をコードする核酸を変異（例えば、置換）できる、ということがよく理解されるであろう。当業者は、天然の遺伝子産物と比較して遺伝子産物（例えば、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ）の機能に実質的に影響を与えることなく、ある程度までアミノ酸を置換、付加又は欠失することができ、これらのどの場合も本発明の範囲内に含まれることを意図していることは更によく理解されるであろう。
【０１１３】
変異を含有するｌｐｄ遺伝子を含む非組み換え細菌は、本発明の範囲に包含されていて、ここにおいて、置換が、野生型ｌｐｄ遺伝子（配列番号６に記載の配列）における３２２位のＨ、又は３５４位のＥの何れかのアミノ酸への変異であり、このアミノ酸がこの領域の酸性を変化させるものである。更なる態様では、アミノ酸は、生理学的ｐＨにおいて中性の荷電アミノ酸である。さらに別の態様では、アミノ酸は、生理学的ｐＨにおいて塩基性の荷電アミノ酸である。
【０１１４】
一態様では、本発明の単離したポリペプチド（例えば、単離したジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ酵素）は、配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する。他の態様では、本発明の単離したポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４に記載の配列として示される少なくとも１つのポリペプチドのホモログであり（例えば、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約３０〜４０％同一、有利には約４０〜５０％同一、より有利には約５０〜６０％同一、そして更により有利には約６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、又はそれ以上同一である）、そして各々配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列にコードされるポリペプチドのそれと実質的に類似である活性を有している。
【０１１５】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸の同一性の割合を測定するために、最適な比較を目的として配列を整列させる（例えば、第１のアミノ酸又は核酸配列にギャップを導入することで、第２のアミノ酸又は核酸配列と最適な位置合わせができる）。第１配列の位置が、第２配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められている場合、この分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性の割合は、配列が共有する同一性の位置数の関数である（すなわち、同一性（％）＝同一性の位置の数／位置の総数×１００）であり、最適な位置合わせとするために必要なギャップの数及びそのギャップの大きさを計算に取り入れることが有利である。
配列の比較及び２つの配列間の同一性の割合の測定は、数学アルゴリズムを用いて実行することができる。配列の比較に用いられる数学アルゴリズムの、特別な非限定的な例は、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2246-68）であり、「Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77」として改良されている。このようなアルゴリズムは、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０；Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10）に組み込まれる。本発明の核酸分子に相同な核酸配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、語長＝１２）でＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施することができる。本発明のポリペプチド分子に相同なアミノ酸配列を求めるために、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０，語長＝３）でＢＬＡＳＴポリペプチド検索を実施することができる。比較のためのギャップのある位置合わせを得るために、「Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25 (17):3389-3402」に記載のように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合は、それぞれのプログラムのデフォルト・パラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）を用いることができる。「http://www.ncbi.nlm.nih.gov」を参照されたい。配列の比較に用いられる数学アルゴリズムの、別に特殊なその他の非限定的な例は、ＭｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Myers and Miller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17）である。このようなアルゴリズムは、例えば、ＧＥＮＥＳＴＲＥＡＭネットワークサーバー（IGH Montpellier, France) で、又はＩＳＲＥＣサーバーで得られる、ＡＬＩＧＮプログラムに組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合は、ＰＡＭ１２０の重量残渣表、１２ギャップ長ペナルティー及び４ギャップペナルティー（PAM120 weight residue table, a gap length penalty of 12 and a gap penalty of 4）を用いることができる。
【０１１６】
例えば、本発明の一態様では、２つのアミノ酸配列間の同一性の割合は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴサーバー又はthe European Biotechnology Institute.のＣｌｕｓｔａｌＷを用いて測定される。例えば、多種の生命体由来のジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、大腸菌ＬＰＤタンパク質のそれと比較されて、ある特異的配列の大腸菌配列に対する同一性の割合は、２つのデータベースのどちらかから得ることができる。表７及び図９はこれらの比較を示している。括弧内の値は、特異的タンパク質の大腸菌ＬＰＤに対する総同一性を表し、同一であるアミノ酸の両方の位置、更には同類置換が起こった位置も含んでいる。バチルス・ズブチリスに関して、２つのジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ、一方はＰＤＨ複合体由来、他方はアセトインデヒドロゲナーゼ由来を、対照として、含んでいた。
【０１１７】
当業者は理解されるであろうが、前述の算定に基づき、例えばグラム陽性及びグラム陰性の細菌、古細菌並びにストレプトミセスのような、系統発生学的に（１６ＳリポゾームＲＮＡ（ＤＮＡ）配列に基づく）互いにかけ離れた細菌を含む、細菌種の範囲内でのＬＰＤの高度な保存が存在する。
【０１１８】
酵素ピルビン酸デヒドロゲナーゼは全ての好気性生物において見出され、グルコースのエネルギーへの変換においてきわめて重要な酵素である。ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（Ｌｐｄ)は、ＰＤＨ複合体の３つのサブユニットの１つである。Ｌｐｄは、フラビン結合モチーフ（アミノ酸１５−４５）及びピリジンヌクレオチド-ジスルフィド酸化還元酵素モチーフ（アミノ酸３４７−４５６）（大腸菌Ｌｐｄ付番）の２つの固有のモチーフを含有している。いくつかの生物由来のＬｐｄタンパク質のアミノ酸配列は、ＰＤＨ複合体におけるそれらの固有の役割に起因して有意な相同性を有する。大腸菌と他の細菌性Ｌｐｄ間のアミノ酸配列の同一性は、３０％〜９９％の範囲にある。大腸菌及びヒト由来のＬｐｄの極端な場合では、その配列の４２％のアミノ酸が同一である。Ｌｐｄのフラビン結合領域（アミノ酸１５-４５）では、この配列の同一性は６７％に増加する。１８のアミノ酸のこの配列の１つのサブセクション（２８-５５位）では、１つ以外の全てのアミノ酸が大腸菌、ヒト及びマウスのＬｐｄ配列に保存されている。３２２位のヒスチジン及び３５４位のグルタミンもまたこれらのタンパク質間で保存されている。この極めて高度な配列の保存により、本明細書に記述する大腸菌Ｌｐｄの変異体は、他の生物からのＬｐｄタンパク質を導入されると同様の表現型を有するものと考えられる。よって、本発明の方法は、本明細書に教示する株に限定されない。
【０１１９】
ＩＶ． 非組み換え細菌を作製する方法
本発明の更なる態様は、１つ又はそれ以上の変異を伴うｌｐｄ遺伝子を含んでなる非組み換え細菌を提供して、ここいおいて、当該変異が非組み換え細菌を嫌気性条件下での発酵主生成物としのエタノールの産生を可能とするものであり、そして当該細菌が
（ａ）糖の多い培地で嫌気性条件下、細菌の候補の変異株を生育させること；及び、
（ｂ）発酵の主生成物としてエタノールを産生する変異体を選択すること：
の段階を含んでなる工程により調製される。
方法の一態様では、産生されたエタノールが嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する。
【０１２０】
別の態様では、本発明は、方法が、
（ａ）糖の多い培地で嫌気性条件下、細菌の候補の変異株を生育させること；及び
（ｂ）発酵の主生成物としてエタノールを産生する変異体を選択すること：
の工程を含有してなる、本発明のエタノール産生性の非組み換え細菌を製造する方法を提供する。
【０１２１】
本発明の前記方法及び工程の態様では、糖の多い培地における糖は、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース、及びラクトースからなる群より選択される。本発明の一態様では、前述の特性を有する非組み換え細菌はエタノール産生性でもある。従って、本発明は、エタノール産生性の非組み換え細菌を作製する方法を提供する。更には、本発明は、所望のエタノール産生性の表現型をスクリーニングする方法を提供する。
【０１２２】
本発明の親株は、糖の多い培地で生育させた場合、嫌気性条件下で低レベルのエタノールを産生することを特徴とする。そのような株の例はＡＨ２４２株であってもよいが、嫌気性条件下で低レベルのエタノールを産生することを特徴とする何れかの株が方法の使用に適切である。当該技術分野で公知の方法（Dastenko and Wanner, 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645）に従った親株の更なる変異は、親株が全培地で嫌気性生育できない（欠損の）ように実施される。更には、抗生物質に対する抵抗のためのカセットが、当該技術分野で公知の慣例に従い、選択目的のために付加される。
【０１２３】
一般に、選択は、指数増殖中期に到達するまで好気性条件で生育欠損株を培養して、寒天上に培養物を（展開）塗抹して、培養物を変異誘発剤に晒すことにより実施される。当業者は理解されるであろう様に、メタンスルホン酸エチル、２-アミノプリン、ＩＣＲ−１９１、メタンスルホン酸メチル、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、又はヌクレオチド配列における変化を引き起こすと知られる他の薬剤の何れかを含む、多くの変異誘発剤を用いることができる。嫌気性条件で変異誘発剤に晒した後、培養物を好気性条件に切り替えて、その後嫌気性条件に戻す。生育したコロニーを、選択して、新鮮プレート上に縞状にして、嫌気性条件下で生育させる。変異が親の抗生物質に対する抵抗を持ち越すことを確認するために、各々のコロニーは、個別に（培養して、）適切な抗生物質プレート上で培養及び生育させることができる。当業者は理解されるであろうように、細菌培養手順は当該技術分野の標準の方法に従って実施される。
【０１２４】
高性能液体クロマトグラフィーを、単離した変異体の使用済培地中の発酵生成物の収率を測定するために用いることができる。例えば、エタノール、酢酸塩、ギ酸塩及びコハク酸塩をＨＰＬＣによって検出できる。
【０１２５】
上述の例示に基づき、そして細菌株間の相同性に基づくと、本発明の方法は本出願に教示する株に限定されないということは、当業者に理解されるであろう。
【０１２６】
Ｖ． エタノールを産生する方法
別の態様では、本発明は、オリゴ糖源からエタノールを産生する方法を提供する。方法は、上述のように本発明の非組み換え細菌又は宿主細胞とオリゴ糖を接触させること、それによりオリゴ糖源からエタノールを産生させることを含んでなる。方法の特定の態様では、オリゴ糖は、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン、及びこれらの組み合わせの何れかからなる群より選択される。
【０１２７】
本発明の宿主細胞は、嫌気性条件下で低レベルのエタノールを産生することを特徴とする。嫌気性条件の間、野生型の大腸菌はエタノールと酢酸塩を１：１の比で産生する。生育静止期の間に、野生型大腸菌は、主生成物として乳酸塩を産生して、全発酵生成物中のエタノールのフラクションは約２０％である。これらの発酵の全生成物は多種の酸を含有しているので、混合酸発酵という表現を導く。一態様では、本発明は、１つ又はそれ以上の変異を伴うｌｐｄ遺伝子を含んでなる非組み換え細菌を提供して、ここにおいて当該変異が非組み換え細菌を嫌気性条件下での発酵主生成物としのエタノールの産生を可能とする。発酵主生成物は、非気体状生成物の全量の５０％超を構成する非気体状の発酵生成物を含むことを意図している。発酵主生成物は、最も豊富な非気体状生成物である。
【０１２８】
一般に、発酵条件は、プロデューサー宿主細胞株の最良の生育動態を促進するために最適なｐＨ及び温度並びに培養物により産生される酵素の触媒条件を提供するように選択される（Doran, et al., (1993) Biotechnol. Progress. 9:533-538）。例えば、クレブシエラ属、例としてＰ２株に対して、最適条件は、３５〜３７℃及びｐＨ５．０〜ｐＨ５．４の間であると確定された。これらの条件下で、外的に付加された真菌性のエンドグルカナーゼ及びエクソグルカナーゼでさえも極めて安定であり、長期間機能し続ける。他の条件は、実施例において検討する。更に、当業者は理解されるであろうように、本発明の所定の発酵反応を最適化するためには、当該技術分野で公知の技術を用いて、単に日常の実験が必要なだけである。例えば、米国特許第５，４２４，２０２号及び同第５，９１６，７８７号、これは特に参照して本明細書に組み込まれる、を参照されたい。
【０１２９】
更に別の態様では、本発明は、上述のような本発明の非組み換え細菌又は宿主細胞、及び本明細書に記載の方法及び工程によりエタノール製造のための説明書を含有してなるキットを提供する。一態様では、キットは糖供給源を含有している。
【０１３０】
ＶＩ． 実施例
本発明を以下の実施例を参照して更に説明するが、これは限定するものとして解釈されるものではない。以下の材料及び方法は、他に別段に規定されない限り、実施例を通して用いられる。
【０１３１】
材料及び方法
細菌株
大腸菌Ｋ-１２株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）及び誘導体、株ＡＨ２４２、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９６７としてthe Agricultural Research Culture Collectionに寄託された（△ｌｄｈＡ及び△（ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ））を本検討で用いた。株ＳＥ２３７８は株ＡＨ２４２のエタノール産生性の変異体である。遺伝子ｐｆｌＢ、ａｄｈＥ、ｍｇｓＡ及びａｃｅＦの欠失は、Dastenko, et al.による通りであった。ｌｄｈＡ欠失株は、トランスポゾンＴｎ１０のｌｄｈＡへの導入、続くフザリン酸培地中での選択の後に構築した（Klekner, et al. 1991; Mayloy, et al. 1981）。他の株の構築は、標準の遺伝学的及び分子生物学的手法を用いた（Maniatis, et al. 1982; Miller, et al. 1972）。本明細書で用いる細胞株の遺伝子型を下記の表１に示す。
【０１３２】
【表１】
【０１３３】
生育培地及び発酵
富栄養培地（Ｌ-ブロス）は、（リットル当たり）トリプチケースペプトン（１０ｇ）、酵母抽出物（５ｇ）及びＮａＣｌ（５ｇ）を含有していた（Lee, et al. 1985）。無機塩培地は、既に記載されている（Lee, et al. 1985）。必要であればグルコース又はキシロースを添加した。発酵は、既述のように（Hasona, et al. 2004）３７℃にて実施した。培養ｐＨは、ＫＯＨを添加して７．０に保持した。バッチ発酵を、既述のように（Patel, et al. 2006）、最頂部まで充填した１３ｘ１００ｍｍのスクリューキャップチューブにて実施した。
【０１３４】
ベクター及び形質転換
ｌｐｄ更にはｐｄｈ領域の遺伝子のクローニング及び発現は、当該技術分野に記述される標準的手順に従い達成される。形質転換に用いるベクターは、他の周知のベクターに加えて、ｐＴｒｃ９９ａ（ＧＥ）、ｐＣＲ２．１-ＴＯＰＯ、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＡＤ２４を含むことができる。Maniatis, et al.（1989）に見出される標準的手順に従い、ＣａＣｌ２ ベースの化学転換法を用いた。
【０１３５】
分析法
糖類及び発酵生成物は、ＨＰＬＣにより測定した（Underwood, et al. 2002）。ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、既述のように（Talarico, et al. 2001）、破壊細胞調製物にて測定した。
【実施例１】
【０１３６】
エタノール産生性非組み換え大腸菌株ＳＥ２３７７、ＳＥ２３７８、ＳＥ２３８２、ＳＥ２３８３、ＳＥ２３８４、ＳＥ２３８５の単離
この実施例では、細菌大腸菌の非組み換えエタノール産生性株の単離を記述する。
【０１３７】
出発株ＡＨ２４２を、記述した大腸菌のホモエタノール産生性の変異体の単離のために用いた。株ＡＨ２４２は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ)及びピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＰＦＬ)を各々コードするｌｄｈ及びｐｆｌＢにおける変異に起因して、糖類を含有する富栄養培地中では嫌気性生育ができない（Mat-Jan, et al. 1989）。これらの変異にもかかわらず、ＡＨ２４２の好気性生育は影響を受けないままである。ＡＨ２４２の嫌気性生育の阻止は、ＮＡＤＨのＮＡＤ＋、主要糖分解酵素グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ及び関連するＡＴＰ生成物のための必須基質、への再酸化不足の結果である。ＬＤＨが存在しないと、ピルビン酸の乳酸への還元によるＮＡＤＨの酸化が排除される。ＰＦＬにより通常生成されるアセチルＣｏＡが存在しないと、天然のアルデヒド及びアルコールデヒドロゲナーゼ活性による効率的なＮＡＤＨの酸化を可能にするアセチルＣｏＡが不足する。
【０１３８】
本発明では、ＡＨ２４２株で出発して、ｆｏｃＡ−及びｐｆｌＢ−（ピルビン酸ギ酸リアーゼ）欠失を既述の方法（Datsenko, et al. 2000）を用いて構築した。単一欠失変異体、ＡＨ２４０、−（ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ）及びＡＨ２４１−（ｌｄｈＡ）は、二重変異体ＡＨ２４２株の親株であった。欠失位置に、ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴカセットを挿入し、それによって株ＡＨ２４２をカナマイシン耐性にした。この二重変異に起因して、株ＡＨ２４２は、全ての培地において嫌気性生育が欠如している。下記の表２は、嫌気性発酵経路に変異を伴う大腸菌変異体の生育特性を示す。
【０１３９】
【表２】
【０１４０】
得られた嫌気性生育の欠如株ＡＨ２４２は、２００ＲＰＭのシェーカー中で、好気性条件、３７℃で５ｍｌのＬ-ブロスにて培養した。指数生育中期に、培養物をシェーカーから取り出して、グルコースを含むＬ−寒天又はグルコース＋ニュートラルレッドのレドックス色素を含むＬ−寒天上に塗抹した。ワットマンのろ紙を各寒天培地の表面に取り付けた。変異誘発剤メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）をディスクに添加して、プレートを、Ｏ２の無い環境を作成するようにパラジウム触媒で包囲したＨ２＋ＣＯ２ジェネレーターを含有する嫌気性の瓶に移した。変異生成に用いるのに適切な他の標準的薬剤が、本発明に使用できる。プレートを含む嫌気性の瓶を３７℃で５日間培養した。
【０１４１】
５日後指示された培地の何れにも可視的生育は検出されなかった。続いて、両方の皿を好気性条件下で２０時間培養した。この培養の最終時には、両方の培地の、ＥＭＳを含んだペーパーディスクを配置した位置の周囲領域を除く全ての領域で、細菌細胞の菌叢（lawn）が観察された。各々の培地の表面の細胞を、レプリカ平板法による同じ組成の新鮮培地に移して、５日間嫌気性の瓶の中に放置した。５日後、各々のプレートは、ＥＭＳを配置した位置を除く全ての領域に１００を超えるコロニーを有していた。各々のグルコース（１５コロニー）及びグルコース＋ニュートラルレッド（１６コロニー）のプレートから３１コロニーを選択して、新鮮なＬ−寒天＋グルコース上にストリークした。プレートを嫌気性条件下で生育させた。全てのコロニーが嫌気性条件下で生育した。
【０１４２】
３１の変異体をＬ−ブロス＋グルコースに接種して、各々の生育後Ｌ−寒天＋カナマイシンプレートの表面に移した。全ての変異体は、カナマイシンの存在下で生育して、親株ＡＨ２４２の抗生物質の抵抗性を持ち越したことを示した。
【０１４３】
３１の変異体は、スクリューキャップチューブ中のＬ-ブロス＋グルコースに移して、混合せずに３７℃で培養した。可視的生育を検出した後、培地を細胞から分離して、使用済培地の発酵生成物を高性能液体クロマトグラフィー（Underwood, et al. 2002）を用いて測定した。表３は、３１のうち３０の変異体が第一の又は主要な発酵生成物（７３％）としてエタノールを産生したことを示す。残りの生成物は、コハク酸塩及び酢酸塩の組合せであった。
【０１４４】
これらの結果は、嫌気性環境で生育できない、ＡＨ２４２親株からの非組み換え変異体が、嫌気性条件で生育可能なものに単離されて、発酵主生成物としてエタノールを産生することを示す。
【０１４５】
【表３】
【実施例２】
【０１４６】
エタノール産生性の非組み換え細菌の生育率及び発酵プロフィール
この実施例では、エタノール産生性の非組み換え細菌の生育率及び発酵プロフィールを記述する。
上記検討から、嫌気性条件で生育可能であり発酵主生成物としてエタノールを産生する変異株ＳＥ２３７８を更なる検討のために選択した。
【０１４７】
生育特性
嫌気性発酵経路における、変異を伴う大腸菌変異体の生育特性を試験した。上記表２に記載したように、富栄養培地で培養すると、株ＳＥ２３７８の好気性生育は、野生型大腸菌株Ｗ３１１０又は単一若しくは二重の（ｆｏｃＡ-ｐｆｌＢ）若しくはｌｄｈＡ変異体の何れにも匹敵するものであった。最小培地では、株ＳＥ２３７８の好気性生育率は、親株ＡＨ２４２の約半分であった。酢酸塩及びコハク酸塩を含む生育培地の添加により、親株のそれに近い生育率に回復した。株ＳＥ２３７８は嫌気的に生育するが、生育率は、富栄養培地においてでさえも、ＡＨ２４０及びＡＨ２４１単一変異体のそれの約５０％にしかすぎない（上記表２を参照されたい）。株ＳＥ２３７８は、グルコース−最小培地において、ｐｆｌＢ変異に関連する遺伝子型に嫌気的に生育しなかった（Clark, et al. 2004）。酢酸を含む最小培地の添加によって、ｐｆｌＢ変異体、株ＡＨ２４０の生育は支持されたが、エタノール産生性の誘導体株ＳＥ２３７８の生育は支持されなかった。株ＳＥ２３７８は、グルコース−最小培地における嫌気性生育のために酢酸塩に加えてグルタミン酸塩も必要であった。以前の検討では、エタノール産生性の大腸菌株ＫＯ１１がキシロースの最適な発酵のためにグルタミン酸塩も必要とすることが示されている（Underwood, et al. 2004）。このグルタミン酸塩を必要とすることは、保護的浸透圧調節物質、ベタインを培地に添加することにより解決する。しかし、最小培地での株ＳＥ２３７８の嫌気性の生育のためにグルタミン酸塩を必要とすることは、べタインによっては解消されず、浸透圧的必要性よりもむしろ、アセチルＣｏＡのグルタミン酸塩の前駆体である、２−ケトグルタル酸への流動の生合成的欠如を示している。アセチルＣｏＡはこのエタノール産生性体により迅速にエタノールに変換されたものと考えられ、アセチルＣｏＡは生合成の律速であると考えられる。これらの添加物により、最小培地での株ＳＥ２３７８の生育率は、ｐｆｌＢ親株、ＡＨ２４０のそれに達した。低価格の培地添加物である、コーンスティープリカーをグルコース最小培地における株ＳＥ２３７８の生育のためのグルタミン酸塩に置き換えて用いた。
【０１４８】
グルコース発酵
５０ｇ/ｌグルコースのｐＨ制御発酵（Hasona, et al. 2004）では、株ＳＥ２３７８は約６時間の遅延の後、０．４６／ｈの特異的な生育率で生育して、主生成物としてエタノールを産生した（下記図３及び表４）。直接の親株ＡＨ２４２は嫌気的に生育できないので、株ＳＥ２３７８の発酵を、野生型株Ｗ３１１０のそれと比較した。Ｗ３１１０が５０ｇ／ｌのグルコースの発酵を２４時間で完了した一方で、変異株は約７２時間を要した。この差は、２つの株の細胞密度の差（野生型の２．５ｍｇ乾燥重量／ｍｌに対して、変異体の1.7ｍｇ乾燥重量／ｍｌ）、及び２つの株の最大比糖代射率の差（野生型及び変異体、各々、４．１対３．３グルコースｇ／ｈ・ｇ／ｃｅｌｌ、下記表５）に主に起因するかもしれない。株ＳＥ２３７８は、約４８０ｍｍｏｌ／ｌのエタノール（２２ｇ／ｌ）、少量の酢酸塩、乳酸塩及びコハク酸塩を含む生成物の全量の８８％を産生した。これは、エタノールが生成物のわずか２７％、６．６ｇ／ｌしか存在しない（表４）株Ｗ３１１０とは対照的である。株ＳＥ２３７８に関して観察された最大比生産性は、１．３４ｇ／ｈ・ｇ／ｃｅｌｌ（表５）であり、酵母のバッチ発酵に関して報告されている１．６ｇ／ｈ・ｇ／ｃｅｌｌ（Smits, et al., 2000）に匹敵する。
【０１４９】
【表４】
【０１５０】
【表５】
【０１５１】
キシロース発酵
野生型Ｗ３１１０及び変異体ＳＥ２３７８の両方の株は、５０ｇ／ｌのキシロースを含んだ嫌気性発酵の間に同様の比率で生育したが、株ＳＥ２３７８がおよそ８時間遅延していた（図３並びに上記表４及び５）。キシロースの比生育率は、前に公開されている報告と一致して（Gonzalez, et al. 2002）、グルコースのそれらの８０％であった。変異株は、野生型Ｗ３１１０よりも迅速にキシロースを発酵させた。４８時間後、株ＳＥ２３７８に関するキシロースの利用率はグルコースの利用率を超えていた。株ＳＥ２３７８で再生された発酵生成物のおよそ８８％がエタノール、５０ｇ／ｌのキシロースから２０ｇ／ｌ、であった。キシロースを用いた株ＳＥ２３７８の最大比エタノール産生性は、２．２３ｇ／ｈ・ｇ／ｃｅｌｌであった。
【０１５２】
Ｗ３１１０及びＳＥ２３７８の両方の比エタノール産生性は、表５に示されるように、グルコースよりもキシロースの場合のほうが高かった。これは、キシロース代謝からのより低いエネルギー収率を示すものかもしれない（Hasona, et al. 2004）。野生型に関して、キシロースからの正味ＡＴＰ収率は、グルコース当たり３．０と比較して、キシロース当たりわずか約１．５である。これは、細胞が同じ量の細胞集団を産生するためにより多くのキシロースを使用する必要があることを示すのであろう。しかし野生型による比キシロース消費率は、上記表５に示され、グルコース発酵と比較してより低い細胞収率及びより長い発酵時間に関して説明したように、グルコースのそれをわずかに上回るものにすぎない（４．９３対４．１０ｇ／ｈ・ｇ／ｃｅｌｌ）。対照的に、株ＳＥ２３７８は、最小培地のキシロース発酵にとって重要な酵素である、ピルビン酸ギ酸リアーゼを欠如している（Hasona, et al. 2004）。この変異に起因して、株ＳＥ２３７８のキシロース発酵からの正味の計上ＡＴＰ収率は、キシロース当たりわずか０．６７にすぎない。このエタノール産生性変異体における高いキシロース流動を掌っているのは、明らかにこの低いＡＴＰ収率である。２．２３ｇ／ｈ・ｇ／ｃｅｌｌのキシロースからの比エタノール産生性は、酵母におけるグルコースの１．６ｇ／ｈ・ｇ／ｃｅｌｌの値（Smits, et al. 2000）、及びＺ．モビリスｐｄｃ及びａｄｈ遺伝子を持っているエタノール産生性大腸菌株ＫＯ１１におけるグルコース及びキシロースの値（約２ｇ／ｈ・ｇ／ｃｅｌｌ）よりも高い。
【０１５３】
これらの結果は、非組み換えＳＥ２３７８変異体がグルコース及びキシロースの両方から発酵主生成物としてエタノールを産生することを示す。更には、エタノール産生率は、他のエタノール産生性の生物に匹敵している。
【実施例３】
【０１５４】
非組み換えエタノール産生性の大腸菌由来の変異ｌｐｄ遺伝子の同定
この実施例では、大腸菌株ＳＥ２３７７、ＳＥ２３７８、ＳＥ２３８２、ＳＥ２３８３、ＳＥ２３７８４及びＳＥ２３８５由来のＬＰＤ遺伝子の同定を記述する。
【０１５５】
非組み換えエタノール産生性の大腸菌変異体株の変異を、ｚａｃ：：Ｔｎ１０での同時形質導入（co-transduction）によりマッピングした。ａｒｏＰ-ｐｄｈＲ-ａｃｅＥＦ遺伝子が同時形質導入により欠失された場合（図５）、野生型バックグラウンドの同じ欠失が嫌気性生育に影響を与えなかった一方で、形質導入株は嫌気性条件下で１％グルコースを含有するＬＢにおけるその生育能力を失った。これらの結果は、株ＳＥ２３７８の嫌気性生育におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼ酵素の役割を提示している。同定した変異株、ＳＥ２３７７、ＳＥ２３７８、ＳＥ２３８２のエタノール産生性遺伝子型に関与する変異を、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子座にマッピングした。
【０１５６】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＨ）は、３つの酵素、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／デカルボキシラーゼ（酵素１、Ｅ１)、リポ酸トランスアセチラーゼ（酵素２、Ｅ２）、及びジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（酵素３、Ｅ３）サブユニットで構成される。ｐｄｈＲプロモーターが、ａｃｅＥＦ及びｌｐｄ遺伝子の独立したプロモータが存在していても、ｐｄｈＲ-ａｃｅＥＦ-ｌｐｄ遺伝子の転写のプロモーターであるとことは公知である（Quail, et al. 1995）。ＰＤＨオペロンの発現がｐｄｈＲタンパク質により負に調節されて（Quail, et al. 1995）、ＳＥ２３７７、ＳＥ２３７８、ＳＥ２３８２のｐｄｈＲ遺伝子の配列が決定された（図６Ａ）。株ＳＥ２３７８の配列分析は、ｐｄｈＲのコード領域内の２つの変異、１つのアミノ酸置換（Ｓ１２Ｐ)及び１つの、アミノ酸１１８としてのロイシンのアミノ酸挿入を明らかにした。ＧからＡへの別のヌクレオチド置換が、ｐｄｈＲ遺伝子及びａｃｅＥ遺伝子の間の遺伝子間領域に見出された（図６Ｂ）。株ＳＥ２３７７及びＳＥ２３８２は、ゲノムＤＮＡのｐｄｈＲ-ａｃｅＥＦ領域に何れの変異も持っていなかった。しかし、これらの株、更には株ＳＥ２３８３、ＳＥ２３８４及びＳＥ２３８５は、全てｌｐｄ遺伝子に単一変異を有していた（図５Ａ)。ＰｄｈＲタンパク質はｐｄｈＲ−ｌｐｄオペロンのピルビン酸に感受性のレギュレーターであり、よってこのタンパク質の変異は期待されない。ｐｄｈＲ−ｌｐｄの転写に対するｐｄｈＲの開始時の出発部位に加えて、ａｃｅＥＦはａｃｅＥＦ-ｌｐｄに対するそれ自身の転写出発部位を含有している。よって、遺伝子間領域の変異は、嫌気性細胞のａｃｅＥＦ-ｌｐｄ発現のレベルの上昇も支持できる。大腸菌におけるＰＤＨ複合体のピルビン酸デヒドロゲナーゼ／デカルボキシラーゼ活性レベルが、嫌気性に対して好気性に生育した細胞において約５倍高いことが既に報告されている（deGraef, et al., 1999）。
これらの結果は、本発明の同定したエタノール産生性の大腸菌株における変異の位置を提供している。
【実施例４】
【０１５７】
ｌｐｄ遺伝子の変異はエタノール産生性の遺伝子型に関与する。
この実施例では、ＰＤＨ複合体、特にｌｐｄ遺伝子の変異がエタノール産生性の遺伝子型の原因となることが示されている。
【０１５８】
株ＳＥ２３７８の予備的な遺伝子分析は、嫌気性生育及びホモエタノール産生に関与する変異（複数も）が、ＰＤＨ複合体（ｐｄｈ遺伝子座：ｐｄｈＲ、ａｃｅＦ、ｌｐｄ）をコードする遺伝子に又は近くに位置することを明らかにした。株ＳＥ378のエタノール産生性の遺伝子のためにＰＤＨが必要であることを確認するために、ａｃｅＦ遺伝子（ジヒドロリピルアセチルトランスフェラーゼ；ＰＤＨのＥ２酵素）の変異を、カナマイシン耐性遺伝子を欠失している株ＳＥ２３７８の誘導体である、株ＹＫ１に形質導入した。形質導入株ＹＫ６３は、下記の表６に示されるように、嫌気的に生育する能力を欠失した。
【０１５９】
【表６】
【０１６０】
株ＹＫ９３の嫌気性−マイナス遺伝子型は、株ＳＥ２３７８の親株である、株ＡＨ２４２のそれと同様であった。細胞が生合成のためのアセチルＣｏＡを産生する能力が無いことに起因して、ａｃｅＦ変異体は最小培地の好気性−マイナスであっても、嫌気性生育条件下で、この機能はＰＦＬにより触媒されるものであり、よってａｃｅＦ変異は大腸菌の嫌気性生育に影響を与えない（表６に示すような、株ＹＫ１５３、ａｃｅＦ変異を伴うＷ３１１０）。株ＹＫ９３の嫌気性生育はテストした全ての培地で阻止された。株ＹＫ９３のａｃｅＦ変異はファージＰ１によりＷ３１１０（野生型）又はＳＥ２３７８（エタノール産生性）のいずれか由来の遺伝子と共にａｃｅＦ＋に形質導入されて、形質導入株は嫌気性条件下、最小培地での生育について選択された。形質導入株を、嫌気性生育及び発酵生成物に関してテストした。野生型株Ｗ３１１０由来のａｃｅＦ＋遺伝子を受け取った形質導入株は、最小培地で好気的に生育したが、ｌｄｈＡ及びｐｆｌＢの変異の存在に起因して、テストした培地の何れでも嫌気的に生育しなかった。株ＳＥ２３７８由来のａｃｅＦ＋遺伝子を受け取った全ての形質導入株は、嫌気的に生育して、テストした全ての形質導入株が発酵主生成物としてエタノールを産生した。この結果は、株ＳＥ２３７８のエタノール産生性遺伝子型が無傷のｐｄｈ遺伝子座及びＰＤＨ活性を必要とすることを示し、並びにエタノール産生のためのＰＤＨ依存の経路と一致している（図８Ｃを参照されたい）。ホモエタノール産生のためのこの経路では、ＰＤＨによってピルビン酸がアセチルＣｏＡへ酸化的脱二酸化炭素化されて、更にアルコールデヒドロゲナーゼによりアセチルアルデヒド及びエタノールへ還元される（図８Ｃ)。アセチルＣｏＡ産生に必要なａｃｅＦ（ＰＤＨ−マイナス；株ＹＫ９３）又はエタノール産生に必要なａｄｈＥ（ＡＤＨ−マイナス；株ＹＫ９１）どちらかの欠失は、ホモエタノール産生のためのこの経路の役割を支持する嫌気性生育陰性の遺伝子型、及び発酵の乳酸デヒドロゲナーゼ及びピルビン酸ギ酸リアーゼを欠如している株ＳＥ２３７８の酸化還元平衡をもたらした。
【０１６１】
実験の次の組では、ｌｐｄ遺伝子がエタノール産生性の遺伝子型の原因であることを示した。野生型株Ｗ３１１０由来及びエタノール産生性変異体株ＳＥ２３７８由来のｌｐｄ遺伝子は、誘導因子としてＩＰＴＧを伴うｔｒｃプロモーターからのＬＰＤタンパク質の産生のための発現ベクターにクローン化した。これらのプラスミドは、３つの欠失；ｌｄｈＡ、（ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ）、及びｌｐｄを持つ株ＹＫ１００に形質転換された。３つの変異を超越して、株ＹＫ１００はＷ３１１０株に類似する。３つの欠失に起因して、株ＹＫ１００はテストした全ての培地で嫌気性生育に欠如していて、最小培地での好気性生育に欠如している。前に検討したように、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＨ）は、３つの酵素、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／デカルボキシラーゼ（酵素１)、リポ酸トランスアセチラーゼ（酵素２）、及びリポアミドデヒドロゲナーゼ（酵素３）で構成される。大腸菌の好気性生育は、ＰＤＨ複合体の３つの構成要素の何れか１つの変異によって弱められる。
【０１６２】
株Ｗ３１１０由来のｌｐｄ遺伝子（Ｌｐｄ＋)を含有するプラスミドｐＫＹ３２（図７Ａ）又は株ＳＥ２３７８由来の変異体ｌｐｄ遺伝子（Ｌｐｄ＊)を含有するプラスミドｐＫＹ３３（図７Ｂ）を、株ＹＫ１００に形質転換して、アンピシリン耐性の形質転換体を選択した。これらの形質転換体は、最小培地における好気性生育によって分かるようにＰＤＨ−陽性であった；ＰＤＨ複合体の酵素１及び酵素２は染色体由来であって、Ｌｐｄはプラスミッド由来であった。エタノール産生性ＳＥ２３７８株由来のｌｐｄ遺伝子を持っているプラスミドｐＫｙ３３を有する形質転換体だけが嫌気性条件下で生育できた。エタノールは、株ＹＫ１００／ｐＫＹ３３（ＹＫ１２９と称す）由来の使用済培地において発酵主生成物であった。対照的に、Ｗ３１１０由来の天然のｌｐｄ遺伝子を持っているプラスミドｐＫＹ３２を有する株ＹＫ１００は嫌気性条件下で生育しなかった。
【０１６３】
総合すれば、これらの結果は、ＬＰＤタンパク質が嫌気性生育条件下でのピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の観察された活性に関与すること、更にはＬｐｄの変異された形態が大腸菌によるホモエタノール産生を支持するのに十分なものであることを示す。大腸菌のｌｐｄ変異体がエタノール産生性である根拠は、グルコース当たり４ＮＡＤＨを産生するその能力にある。
【実施例５】
【０１６４】
ｌｐｄ遺伝子の変異はＮＡＤＨ非感受性に関与する。
この実施例では、ｌｐｄ遺伝子の変異がＮＡＤＨ非感受性の原因であることを示す。より具体的には、野生型（天然）酵素においてＮＡＤＨ感受性であるジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（ＬＰＤ)活性が、図１０及び図１１に示されるように、変異体においてＮＡＤＨ非感受性に変化することが見出された。ＬＰＤはピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＨ）の構成成分であるので、このＬＰＤのＮＡＤＨ非感受性はエタノール産生性変異体からＰＤＨへと持続される。
【０１６５】
大腸菌野生型、株Ｗ３１１０又はエタノール産生性変異体、株ＳＥ２３７８を、グルコース−無機塩培地で指数生育中期まで培養した。次いで細胞を採取して、抽出物を調整した。細胞抽出物における酵素活性を、ピルビン酸、基質としてＮＡＤ、及び酵素活性の阻害剤として濃度を変化させたＮＡＤＨを用いて測定した。図１０は、ＮＡＤＨによるＰＤＨ活性の阻害を示す。上のグラフでは、ＮＡＤ濃度は野生型株Ｗ３１１０又はエタノール産生性変異体株ＳＥ２３７８の両方に関して２ｍＭ ＮＡＤであった。下のグラフでは、ＮＡＤ濃度は株Ｗ３１１０由来の天然酵素に関しては２ｍＭ ＮＡＤ、そして株ＳＥ２３７８由来の酵素の変異された形態に関しては１ｍＭ ＮＡＤであった。
【０１６６】
大腸菌野生型、株Ｗ３１１０由来及びエタノール産生性変異体、株ＳＥ２３７８由来のｌｐｄ遺伝子をＰＣＲにより増幅して、タンパク質発現ベクター、ｐＥＴ１５ｂにクローン化した。選択されたプラスミドのｌｐｄ遺伝子のＤＮＡ配列は、挿入ＤＮＡを配列化することにより検証した。プラスミドのｌｐｄ遺伝子の発現を誘発して、タンパク質を精製した。酵素活性を、２つの基質が１．５ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１ＭのＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中のリポアミド（３ｍＭ)）及びＮＡＤＨ（０．１ｍＭ）である逆反応にて測定した。図１１は、ＮＡＤＨによるＬＰＤの阻害を示す。これらの条件下では、天然の酵素は、図１１のグラフに示されるように、検出可能な活性を持たなかった。反応生成物であるＮＡＤは、酵素活性の活性化因子を必要として、活性はＮＡＤ濃度の上昇に伴い増加した。酵素の活性におけるＮＡＤＨのＮＡＤに対する比率を、天然体及び変異体由来の酵素の両方に関して測定して、結果を図１１に示す。
【０１６７】
ＰＤＨは全ての好気性生物（細菌からヒトまで）により産生される。この酵素はピルビン酸を酸化的脱二酸化炭素化してアセチルＣｏＡ、ＣＯ２及びＮＡＤＨを生成して、次いでアセチルＣｏＡは更なる酸化及び続くエネルギー産生のためのＴＣＡ回路に送り込まれる。大腸菌では、ＰＤＨは、嫌気性及び好気性の両方の条件下で産生される。しかし、嫌気性条件下で酵素はＮＡＤＨによるＰＤＨの阻害に起因して不活性である。ＮＡＤＨは通常は嫌気性細胞に高い濃度で存在して、よって外的電子受容体を欠如している細胞により酸化され得ないＮＡＤＨの産生を阻止する。結果として、細胞はグルコース当たり２ＮＡＤＨのみを生成して、還元剤の第２の組は水素ガスとして放出される。１つのアセチルＣｏＡのエタノールへの還元には２つのＮＡＤＨを必要とするために、野生型細胞はグルコース当たり２つのエタノールを産生することができない。
【０１６８】
本発明のエタノール産生性変異体株では、ＰＤＨはＮＡＤＨに対する感受性がより低い。この低下した感受性は、より高いＮＡＤＨプールを有する嫌気性条件下でさえも酵素が機能することを可能にする。この生化学的変化に起因して、細胞はグルコース当たり４つのＮＡＤＨ分子を産生することができる（２つは解糖系から及び２つはＰＤＨ反応から）。４つのＮＡＤＨの全ては、変異体をホモエタノールプロデューサーにして、２つのアセチルＣｏＡをエタノールに還元するために用いられる。ＰＤＨのＮＡＤＨに対する感受性の低下及び高いＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を有していても機能するその能力に起因して、生化学的に及び生理学的に細胞はホモエタノールプロデューサーである。
【０１６９】
最終に、更なる実験（データは示さず）では、株ＳＥ２３７８に見出されるＬＰＤの変異（Ｅ３５４Ｋ）を、好気性生物、バチルス・ズブティリスのＬＰＤに類似の位置に導入した。Ｅ３５６Ｋの変異は、変異体（ＭＲ１）の嫌気性生育を支持した。
【実施例６】
【０１７０】
他の生物由来のＬＰＤ配列の比較アラインメント
この実施例では、異なる生物由来のジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（ＬＰＤ）酵素のアミノ酸配列の比較アラインメントを比べて対照させた。
【０１７１】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）は細菌からヒトまでの全ての好気性生物に存在する。ＬＰＤは、ＰＤＨ酵素複合体の主要な構成要素であり、ＰＤＨ複合体及び２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体の両方に存在する。大腸菌では、ｌｐｄをこれら２つの酵素複合体が共有していて、この要求に起因して、ｌｐｄ遺伝子は、ｐｄｈＲ遺伝子の上流に位置しているプロモータに加えて、独立したプロモーターから転写される。
【０１７２】
Ｌｐｄホモログは、全ての生命ドメインに見出される。細菌株の中で、Ｌｐｄタンパク質は、４５８〜５８１のアミノ酸に範囲していて、４９０００〜６２０００Ｄａの無水分子量を有している。多様な系統発生学的群からの細菌由来の２０のＬｐｄホモログのアミノ酸配列の同定を下記表７に示す。
【０１７３】
多種の生物由来のジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴサーバー又はthe European Biotechnology Institute.のＣｌｕｓｔａｌＷを用いて、大腸菌ＬＰＤタンパク質のそれと比較した。大腸菌配列のそれに対する特異的配列の同一性の割合をこの２つのデータベースのどちらかから得た。カッコ内の値は、大腸菌のそれに対する特異的タンパク質の総類似性を示し、同一であるアミノ酸の両方の位置、更には同類置換の起こった位置を含んでいる。バチルス・ズブティリスに関して、２つのジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ、１方はＰＤＨ複合体から他方はアセトインデヒドロゲナーゼから、を比較のために含めた。
【０１７４】
配列同一性は、古細菌、メタノサルシナ バーケリ（Methanosarcina barkeri）の低い２４％から、グラム陰性細菌、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）株ＬＴ２の９８％と多様である。ネズミチフス菌株ＬＴ２のＬＰＤタンパク質は大腸菌のＬＰＤと最も関連性があり、同じ腸内細菌科ファミリーのグラム陰性細菌として２つの細菌の分類は一致している。大腸菌株Ｗ３１１０又はＭＧ１６５５のＬｐｄアミノ酸配列を、公知のＬｐｄ配列、アシネトバクターｓｐ．（Acinetobacter sp.）ＡＤＰ１、セレウス菌（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０９８７、バチルス ズブチリス株１６８、破傷風菌（Clostridium tetani）株マサチューセッツ／Ｅ８８、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）株ＡＴＣＣ１３０３２、ゲオバクター メタリレデューセンス（Geobacter metallireducens）ＧＳ-１５、グルコノバクター オキシダンス（Gluconobacter oxydans）６２１Ｈ、カセイ菌（Lactobacillus casei）ＡＴＣＣ３３４、乳酸連鎖球菌亜種クレモリス菌（Lactococcus lactis subspecies cremoris）ＳＫ１１、植物性乳酸菌（Lactobacillus plantarum）ＷＣＦＳ１、メタノサルシナ バーケリ（Methanosarcina barkeri）株Ｆｕｓａｒｏ、エノコッカス エニ（Oenococcus oeni）ＭＣＷ ＰＳＵ-１、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１（ＡＴＣＣ１５６９２）、ロドバクター スフェロイデス (Rhodobacter sphaeroides)２．４．１、ネズミチフス菌（salmonella typhimurium）ＬＴ２、低温菌（Shewanella sp）ＡＮＡ-３、連鎖球菌（Streptococcus）変異体ＡＴＣＣ７００６１０、ストレプトミセス セリカラー（Streptomyces coelicolor）Ｍ１４５、好熱性細菌（Thermoanaerobacter ethanolicus）、発光細菌（Vibrio fischeri）株ＡＴＣＣ７００６０１と整列させた。相同的アラインメントを図９に示す（この図は番号を付け直す必要があるであろう）。同一性の総合割合を比較した場合、大腸菌ＬＰＤは、他のグラム陰性ＬＰＤと最も似ているように見えるが、同一性の割合の計算を同類置換に基づき実施した場合、実験した種々の生物のＬＰＤタンパク質間の高い相同性の割合を表４が反映している。例えば、大腸菌ＬＰＤタンパク質のそれと比較した、バチルス・ズブティリス株１６８のＬＰＤタンパク質のアミノ酸配列同一性は、３４％である。しかし、同類置換だけを考慮すると、同一性のスコアは５７％に増加する。アラインメント図から見ることができるように、いくつかのアミノ酸が非常に多種の生物群由来の２０のＬＰＤホモログ間に高度に保存されている。生物間に共有されている残基をアスタリスク（＊）で強調する。目的の領域は下線付けしている。分析した種々の生物の配列の中で、配列同一性はＮ−末端領域で最も高い。配列同一性がアミノ酸４０及び５５（大腸菌ＬＰＤの番号付け）の間に見ることができ、これはフラビン部位候補を示すのかもしれない。同一性の別の領域は、アミノ酸１８０及び１９０の間である。この配列全体を通して、このアミノ酸の残基が分析した種々の生物由来の２０のＬＰＤ全てに保存されている、いくつかの位置が存在する。特に、アミノ酸３２２位はヒスチジン（Ｈ)をコードして、本発明の３つの株（ＳＥ２３７７、ＳＥ２３８３及びＳＥ２３８２）では、３２２位のヒスチジンのチロシン（Ｙ）への変異が存在する。３２２位のヒスチジンは、グラム陽性及びグラム陰性細菌から古細菌まで由来の２０ＬＰＤ全てに保存されている。この多岐の範囲にわたって保存されている他の残基は、３５５位のプロリン（１８/２０ＬＰＤ）及び３５６位のグルタミン酸（１７/２０ＬＰＤ）を含む。
【０１７５】
【表７】
【０１７６】
参照文献
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【０１７７】
均等物
本明細書に記載の本発明の具体的な態様の多くの均等物を、当業者は認識できるであろう、又は単なる通常の実験を用いて確認できるであろう。このような均等物は、本発明に含まれるように意図されている。
【０１７８】
引例による援用
本明細書に開示された全ての刊行物、特許出願及び特許は、それらの全てを参照して本明細書に明確に取り込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１（Ａ）】図１（Ａ）は、（配列番号１の）塩基９９７に変異を伴うｌｐｄ遺伝子に対する核酸配列を示す。
【図１（Ｂ）】図１（Ｂ）は、（配列番号２の）対応するアミノ酸配列を示す。
【図２（Ａ）】図２（Ａ）は、（配列番号３の）塩基１０９３に変異を伴うｌｐｄ遺伝子に対する核酸配列を示す。
【図２（Ｂ）】図２（Ｂ）は、（配列番号４の）対応するアミノ酸配列を示す。
【図３（Ａ）】図３（Ａ）は、（配列番号５の）野生型ｌｐｄ遺伝子に対する核酸配列を示す。
【図３（Ｂ）】図３（Ｂ）は、（配列番号６の）対応するアミノ酸配列を示す。
【図４】図４Ａは、大腸菌野生型株Ｗ３１１０及びエタノール産生性変異体株ＳＥ２３７８の、グルコース又はキシロース（５０ｇ/Ｌ）を含むＬＢ培地、３７℃及びｐＨ７．０での生育及び発酵の特性を表しているグラフを示す。グラフ（Ａ）は野生型Ｗ３１１０株のグルコースにおいての生育を示し、グラフ（Ｂ）はＳＥ２３７８株のグルコースにおいての生育を示し、グラフ（Ｃ）は野生型Ｗ３１１０株のキシロースにおいての生育を示し、グラフ（Ｄ）はＳＥ２３７８株のキシロースにおいての生育を示す。
【図５】図５は、欠失変異（ａｒｏＰ−ａｃｅＥＦ）（Ａ）（△ａｒｏＰ-ａｃｅＥＦ）の株ＳＥ２３７８への形質導入（Ｂ）を示す。株ＳＥ２３７８の変異は、ｚａｃ：：Ｔｎ１０での同時形質導入（co-transduction）によりマッピングされた。ａｒｏＰ-ｐｄｈＲ-ａｃｅＥＦ遺伝子が同時形質導入により欠失した場合、野生型バックグラウンドの同じ欠失が嫌気性生育に影響を与えなかった一方で、形質導入株（Ｃ）は嫌気性条件下で１％グルコースを含有するＬＢにおけるその生育能力を失った。
【図６Ａ】図６Ａは、野生型Ｗ３１１０株及びＳＥ２３７８変異体由来のｐｄｈＲ遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは株ＳＥ２３７８の遺伝子間領域の核酸配列を示す。
【図７（Ａ）】図７（Ａ）はＹＫ１００宿主におけるＷ３１１０又はＳＥ２３７８ｌｐｄの発現のために用いたプラスミドを示す。プラスミドｐＫＹ３２は、野生型株Ｗ３１１０由来のｌｐｄ遺伝子を含有する。
【図７（Ｂ）】図７（Ｂ）はＹＫ１００宿主におけるＷ３１１０又はＳＥ２３７８の発現のために用いたプラスミドを示す。プラスミドｐＫＹ３３はエタノール産生性変異体ＳＥ２３７８由来のｌｐｄ遺伝子を含有する。
【図８】図８（Ａ〜Ｃ）は、大腸菌株ＳＥ２３７８、天然の大腸菌及び他のエタノール産生性の微生物のピルビン酸からのエタノール産生のための提案される経路を示す図式である。
【図９−１】図９は、選択されたＬＰＤ配列、即ち破傷風菌（Clostridium tetani）Ｅ８８、好熱性細菌（Thermoanaerobacter ethanolicus）、セレウス菌（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０９８７、植物性乳酸菌（Lactobacillus plantarum）ＷＣＦＳ１、乳酸連鎖球菌亜種クレモリス菌（Lactococcus lactis subspecies cremoris）ＳＫ１１、エノコッカス エニ（Oenococcus oeni）ＭＣＷ ＰＳＵ-１、ネズミチフス菌（salmonella typhimurium）ＬＴ２、発光細菌（Vibrio fischeri）ＡＴＣＣ７００６０１、低温菌（Shewanella sp）ＡＮＡ−３、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１（ＡＴＣＣ１５６９２）、ロドバクター スフェロイデス (Rhodobacter sphaeroides)２．４．１、ゲオバクター メタリレデューセンス（Geobacter metallireducens）ＧＳ-１５、アシネトバクターｓｐ．（Acinetobacter sp.）ＡＤＰ１、グルコノバクター オキシダンス（Gluconobacter oxydans）６２１Ｈ、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＤＳＭ２０３００、カセイ菌（Lactobacillus casei）ＡＴＣＣ３３４、ストレプトミセス セリカラー（Streptomyces coelicolor）Ｍ１４５／Ａ３（２）、連鎖球菌（Streptococcus）変異体ＡＴＣＣ７００６１０、メタノサルシナ バーケリ（Methanosarcina barkeri）Ｆｕｓａｒｏと共に、大腸菌Ｋ１２ ＭＧ１６５５のＬＰＤの多数アミノ酸配列アラインメントを示す（ＣＬＵＳＴＡＬ多配列アラインメントプログラムを用いる）。アミノ酸３２２位のヒスチジン残基、アミノ酸３５５位のプロリン残基及びアミノ酸３５６位のグルタミン酸残基はアスタリスク（＊）で強調されている。
【図９−２】図９は、選択されたＬＰＤ配列、即ち破傷風菌（Clostridium tetani）Ｅ８８、好熱性細菌（Thermoanaerobacter ethanolicus）、セレウス菌（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０９８７、植物性乳酸菌（Lactobacillus plantarum）ＷＣＦＳ１、乳酸連鎖球菌亜種クレモリス菌（Lactococcus lactis subspecies cremoris）ＳＫ１１、エノコッカス エニ（Oenococcus oeni）ＭＣＷ ＰＳＵ-１、ネズミチフス菌（salmonella typhimurium）ＬＴ２、発光細菌（Vibrio fischeri）ＡＴＣＣ７００６０１、低温菌（Shewanella sp）ＡＮＡ−３、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１（ＡＴＣＣ１５６９２）、ロドバクター スフェロイデス (Rhodobacter sphaeroides)２．４．１、ゲオバクター メタリレデューセンス（Geobacter metallireducens）ＧＳ-１５、アシネトバクターｓｐ．（Acinetobacter sp.）ＡＤＰ１、グルコノバクター オキシダンス（Gluconobacter oxydans）６２１Ｈ、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＤＳＭ２０３００、カセイ菌（Lactobacillus casei）ＡＴＣＣ３３４、ストレプトミセス セリカラー（Streptomyces coelicolor）Ｍ１４５／Ａ３（２）、連鎖球菌（Streptococcus）変異体ＡＴＣＣ７００６１０、メタノサルシナ バーケリ（Methanosarcina barkeri）Ｆｕｓａｒｏと共に、大腸菌Ｋ１２ ＭＧ１６５５のＬＰＤの多数アミノ酸配列アラインメントを示す（ＣＬＵＳＴＡＬ多配列アラインメントプログラムを用いる）。アミノ酸３２２位のヒスチジン残基、アミノ酸３５５位のプロリン残基及びアミノ酸３５６位のグルタミン酸残基はアスタリスク（＊）で強調されている。
【図９−３】図９は、選択されたＬＰＤ配列、即ち破傷風菌（Clostridium tetani）Ｅ８８、好熱性細菌（Thermoanaerobacter ethanolicus）、セレウス菌（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０９８７、植物性乳酸菌（Lactobacillus plantarum）ＷＣＦＳ１、乳酸連鎖球菌亜種クレモリス菌（Lactococcus lactis subspecies cremoris）ＳＫ１１、エノコッカス エニ（Oenococcus oeni）ＭＣＷ ＰＳＵ-１、ネズミチフス菌（salmonella typhimurium）ＬＴ２、発光細菌（Vibrio fischeri）ＡＴＣＣ７００６０１、低温菌（Shewanella sp）ＡＮＡ−３、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１（ＡＴＣＣ１５６９２）、ロドバクター スフェロイデス (Rhodobacter sphaeroides)２．４．１、ゲオバクター メタリレデューセンス（Geobacter metallireducens）ＧＳ-１５、アシネトバクターｓｐ．（Acinetobacter sp.）ＡＤＰ１、グルコノバクター オキシダンス（Gluconobacter oxydans）６２１Ｈ、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＤＳＭ２０３００、カセイ菌（Lactobacillus casei）ＡＴＣＣ３３４、ストレプトミセス セリカラー（Streptomyces coelicolor）Ｍ１４５／Ａ３（２）、連鎖球菌（Streptococcus）変異体ＡＴＣＣ７００６１０、メタノサルシナ バーケリ（Methanosarcina barkeri）Ｆｕｓａｒｏと共に、大腸菌Ｋ１２ ＭＧ１６５５のＬＰＤの多数アミノ酸配列アラインメントを示す（ＣＬＵＳＴＡＬ多配列アラインメントプログラムを用いる）。アミノ酸３２２位のヒスチジン残基、アミノ酸３５５位のプロリン残基及びアミノ酸３５６位のグルタミン酸残基はアスタリスク（＊）で強調されている。
【図９−４】図９は、選択されたＬＰＤ配列、即ち破傷風菌（Clostridium tetani）Ｅ８８、好熱性細菌（Thermoanaerobacter ethanolicus）、セレウス菌（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０９８７、植物性乳酸菌（Lactobacillus plantarum）ＷＣＦＳ１、乳酸連鎖球菌亜種クレモリス菌（Lactococcus lactis subspecies cremoris）ＳＫ１１、エノコッカス エニ（Oenococcus oeni）ＭＣＷ ＰＳＵ-１、ネズミチフス菌（salmonella typhimurium）ＬＴ２、発光細菌（Vibrio fischeri）ＡＴＣＣ７００６０１、低温菌（Shewanella sp）ＡＮＡ−３、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１（ＡＴＣＣ１５６９２）、ロドバクター スフェロイデス (Rhodobacter sphaeroides)２．４．１、ゲオバクター メタリレデューセンス（Geobacter metallireducens）ＧＳ-１５、アシネトバクターｓｐ．（Acinetobacter sp.）ＡＤＰ１、グルコノバクター オキシダンス（Gluconobacter oxydans）６２１Ｈ、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＤＳＭ２０３００、カセイ菌（Lactobacillus casei）ＡＴＣＣ３３４、ストレプトミセス セリカラー（Streptomyces coelicolor）Ｍ１４５／Ａ３（２）、連鎖球菌（Streptococcus）変異体ＡＴＣＣ７００６１０、メタノサルシナ バーケリ（Methanosarcina barkeri）Ｆｕｓａｒｏと共に、大腸菌Ｋ１２ ＭＧ１６５５のＬＰＤの多数アミノ酸配列アラインメントを示す（ＣＬＵＳＴＡＬ多配列アラインメントプログラムを用いる）。アミノ酸３２２位のヒスチジン残基、アミノ酸３５５位のプロリン残基及びアミノ酸３５６位のグルタミン酸残基はアスタリスク（＊）で強調されている。
【図９−５】図９は、選択されたＬＰＤ配列、即ち破傷風菌（Clostridium tetani）Ｅ８８、好熱性細菌（Thermoanaerobacter ethanolicus）、セレウス菌（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０９８７、植物性乳酸菌（Lactobacillus plantarum）ＷＣＦＳ１、乳酸連鎖球菌亜種クレモリス菌（Lactococcus lactis subspecies cremoris）ＳＫ１１、エノコッカス エニ（Oenococcus oeni）ＭＣＷ ＰＳＵ-１、ネズミチフス菌（salmonella typhimurium）ＬＴ２、発光細菌（Vibrio fischeri）ＡＴＣＣ７００６０１、低温菌（Shewanella sp）ＡＮＡ−３、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１（ＡＴＣＣ１５６９２）、ロドバクター スフェロイデス (Rhodobacter sphaeroides)２．４．１、ゲオバクター メタリレデューセンス（Geobacter metallireducens）ＧＳ-１５、アシネトバクターｓｐ．（Acinetobacter sp.）ＡＤＰ１、グルコノバクター オキシダンス（Gluconobacter oxydans）６２１Ｈ、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＤＳＭ２０３００、カセイ菌（Lactobacillus casei）ＡＴＣＣ３３４、ストレプトミセス セリカラー（Streptomyces coelicolor）Ｍ１４５／Ａ３（２）、連鎖球菌（Streptococcus）変異体ＡＴＣＣ７００６１０、メタノサルシナ バーケリ（Methanosarcina barkeri）Ｆｕｓａｒｏと共に、大腸菌Ｋ１２ ＭＧ１６５５のＬＰＤの多数アミノ酸配列アラインメントを示す（ＣＬＵＳＴＡＬ多配列アラインメントプログラムを用いる）。アミノ酸３２２位のヒスチジン残基、アミノ酸３５５位のプロリン残基及びアミノ酸３５６位のグルタミン酸残基はアスタリスク（＊）で強調されている。
【図９−６】図９は、選択されたＬＰＤ配列、即ち破傷風菌（Clostridium tetani）Ｅ８８、好熱性細菌（Thermoanaerobacter ethanolicus）、セレウス菌（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０９８７、植物性乳酸菌（Lactobacillus plantarum）ＷＣＦＳ１、乳酸連鎖球菌亜種クレモリス菌（Lactococcus lactis subspecies cremoris）ＳＫ１１、エノコッカス エニ（Oenococcus oeni）ＭＣＷ ＰＳＵ-１、ネズミチフス菌（salmonella typhimurium）ＬＴ２、発光細菌（Vibrio fischeri）ＡＴＣＣ７００６０１、低温菌（Shewanella sp）ＡＮＡ−３、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１（ＡＴＣＣ１５６９２）、ロドバクター スフェロイデス (Rhodobacter sphaeroides)２．４．１、ゲオバクター メタリレデューセンス（Geobacter metallireducens）ＧＳ-１５、アシネトバクターｓｐ．（Acinetobacter sp.）ＡＤＰ１、グルコノバクター オキシダンス（Gluconobacter oxydans）６２１Ｈ、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＤＳＭ２０３００、カセイ菌（Lactobacillus casei）ＡＴＣＣ３３４、ストレプトミセス セリカラー（Streptomyces coelicolor）Ｍ１４５／Ａ３（２）、連鎖球菌（Streptococcus）変異体ＡＴＣＣ７００６１０、メタノサルシナ バーケリ（Methanosarcina barkeri）Ｆｕｓａｒｏと共に、大腸菌Ｋ１２ ＭＧ１６５５のＬＰＤの多数アミノ酸配列アラインメントを示す（ＣＬＵＳＴＡＬ多配列アラインメントプログラムを用いる）。アミノ酸３２２位のヒスチジン残基、アミノ酸３５５位のプロリン残基及びアミノ酸３５６位のグルタミン酸残基はアスタリスク（＊）で強調されている。
【図１０】図１０は、ＮＡＤＨによるＰＤＨ活性の阻害を示すグラフである。大腸菌野生型株Ｗ３１１０又はエタノール産生性変異体株ＳＥ２３７８。上のグラフでは、ＮＡＤ濃度は株Ｗ３１１０及び株ＳＥ２３７８の両方に関して２ｍＭであった。下のグラフでは、ＮＡＤ濃度は株Ｗ３１１０由来の天然酵素に関しては２ｍＭ ＮＡＤ、そして株ＳＥ２３７８由来の酵素の変異された形態に関しては１ｍＭであった。
【図１１】図１１は、ＮＡＤＨによるＬＰＤの阻害を示すグラフである。酵素の活性におけるＮＡＤＨのＮＡＤに対する比率を、ＬＰＤの天然体及び変異体の両方に関して測定した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異が、非組み換え細菌を嫌気性条件下で糖１モル当たり４モルのＮＡＤＨを産生できるようにする、当該変異を含んでなる単離した非組み換え細菌。
【請求項２】
変異がｐｄｈオペロンで生起している、請求項１に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項３】
ｐｄｈオペロンが、ｐｄｈＲ、ａｃｅＥＦ及びｌｐｄ遺伝子を含有してなる、請求項２に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項４】
変異がｌｐｄ遺伝子においてである、請求項３に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項５】
糖１モル当たり４モルのＮＡＤＨの産生が、発酵主生成物としてエタノールの産生をもたらす、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項６】
糖が、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース、及びラクトースからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項７】
変異が、非組み換え細菌を嫌気性条件下での発酵主生成物としてのエタノールの産生を可能とするものである、当該変異を伴うｌｐｄ遺伝子を含んでなる単離した非組み換え細菌。
【請求項８】
産生されたエタノールが嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する、請求項５又は７のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項９】
変異されていない細菌が、エタノール非産生性である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項１０】
エタノールが、少量発酵生成物であり、非気体状生成物の全量の４０％未満を構成する、請求項９に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項１１】
変異が、ホモエタノール発酵の経路を提供する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項１２】
細菌における１つ又はそれ以上の発酵の代替的経路が不活性化されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項１３】
発酵の代替的経路が、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）及びコハク酸塩から出発する、乳酸脱水素酵素（ｌｄｈＡ）による乳酸塩、酢酸塩、エタノール、ギ酸塩、Ｈ２、及びＣＯ２の産生を含む、請求項１２に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項１４】
発酵の代替的経路が、変異によって不活性化される、請求項１３に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項１５】
変異がｌｄｈＡ遺伝子においてである、請求項１３に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項１６】
変異がｐｆｌ遺伝子においてである、請求項１３に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項１７】
変異が、ｌｄｈＡ遺伝子又はｐｆｌＢ遺伝子においてである、請求項１５又は１６に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項１８】
単離した核酸分子が、
（ａ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列と少なくとも６０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；
（ｂ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列を含んでなる核酸の、少なくとも１００ヌクレオチドの断片を含有してなる核酸分子；
（ｃ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｄ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片をコードする核酸分子であって、当該断片が配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列の少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基を含有してなる、核酸分子；
（ｅ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの天然のアレル変異体をコードする核酸分子であって、当該核酸分子がストリンジェントな条件下で配列番号１若しくは配列番号３に記載の配列を含有する核酸分子の相補配列とハイブリダイズする、核酸分子；
（ｆ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列を含んでなる核酸分子；
（ｇ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸分子；
からなる群より選択されて、当該核酸分子が、細胞内で発現すると、細胞が発酵主生成物としてエタノールを産生できるようにする、核酸分子。
【請求項１９】
産生されたエタノールが、嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する、請求項１８に記載の単離した核酸分子。
【請求項２０】
細胞が細菌細胞である、請求項１８に記載の単離した核酸分子。
【請求項２１】
核酸分子の発現が無い場合の細菌細胞がエタノール非産生性である、請求項２０に記載の単離した核酸分子。
【請求項２２】
エタノールが少量発酵生成物であり、非気体状生成物の全量の４０％未満を構成する、請求項２１に記載の単離した核酸分子。
【請求項２３】
細菌細胞が嫌気性条件下での発酵主生成物としてエタノールを産生する、請求項１９に記載の単離した核酸分子。
【請求項２４】
細菌細胞における核酸分子の発現が、細菌細胞内でのホモエタノール発酵の経路を提供する、請求項１９に記載の単離した核酸分子。
【請求項２５】
核酸分子が、配列番号１に記載の配列の断片を含んでなり、少なくとも１００ヌクレオチドの長さであり、配列番号１に記載の配列の９９７位に対応する位置にＴを含有する、請求項１８に記載の単離した核酸分子。
【請求項２６】
核酸分子が、配列番号３に記載の配列の断片を含んでなり、少なくとも１００ヌクレオチドの長さであり、配列番号１に記載の配列の１０２３位に対応する位置にＧを含有する、請求項１８に記載の単離した核酸分子。
【請求項２７】
単離したポリペプチドが、
（ａ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片であって、当該断片が配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含有してなる、ポリペプチドの断片；
（ｂ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの天然のアレル変異体であって、当該ポリペプチドがストリンジェントな条件下で配列番号１若しくは配列番号３に記載の配列を含有する核酸分子の相補配列とハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、アレル変異体；
（ｃ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含んでなる核酸に少なくとも５０％の相同性である核酸分子によってコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２若しくは配列番号４に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性であるアミノ酸配列を含有してなるポリペプチド； 並びに
（ｅ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなる単離したポリペプチド；
からなる群より選択されて、当該ポリペプチドが、細胞内で、細胞が発酵主生成物としてエタノールを産生できるようにする、ポリペプチド。
【請求項２８】
産生されたエタノールが、嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する、請求項２７に記載の単離したポリペプチド。
【請求項２９】
ポリペプチドが、嫌気性条件下でジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ活性を有している、請求項２７に記載の単離したポリペプチド。
【請求項３０】
細胞が細菌細胞である、請求項２７に記載の単離したポリペプチド。
【請求項３１】
前記ポリペプチドの発現が無い場合の細菌細胞が、エタノール非産生性である、請求項３０に記載の単離したポリペプチド。
【請求項３２】
エタノールが少量発酵生成物であり、非気体状生成物の全量の４０％未満を構成する、請求項３０に記載の単離したポリペプチド。
【請求項３３】
細菌細胞が、嫌気性条件下での発酵主生成物としてエタノールを産生する、請求項２７に記載の単離したポリペプチド。
【請求項３４】
産生されたエタノールが、嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する、請求項３０に記載の単離したポリペプチド。
【請求項３５】
細菌細胞におけるポリペプチドの発現が、細菌細胞内でのホモエタノール発酵の経路を提供する、請求項３０に記載の単離したポリペプチド。
【請求項３６】
請求項１８〜２６のいずれか一項に記載の核酸分子を含有してなる細菌宿主細胞。
【請求項３７】
配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、又はそれらの断片を含有しているベクターを含んでなる、請求項３６に記載の細菌宿主細胞。
【請求項３８】
ベクターがｐＫＹ３３である、請求項３０に記載の細菌宿主細胞。
【請求項３９】
核酸分子を発現するように遺伝子操作されている、請求項３６に記載の細菌宿主細胞。
【請求項４０】
請求項２７〜３５のいずれか一項に記載のポリペプチドを含有してなる細菌宿主細胞。
【請求項４１】
方法が、
（ａ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片であって、当該断片が配列番号２又は配列番号４に記載の配列の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含有してなる、ポリペプチドの断片；
（ｃ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの天然のアレル変異体であって、当該ポリペプチドが、ストリンジェントな条件下で配列番号１若しくは配列番号３に記載の配列を含んでなる核酸分子の相補配列とハイブリダイズする核酸分子によりコードされる、アレル変異体；
からなる群より選択されるポリペプチドを産生する方法であって、
核酸分子を発現する条件下で請求項３０に記載の宿主細胞を培養することを含んでなる、ポリペプチドを産生する方法。
【請求項４２】
請求項１８に記載の核酸分子を含有してなる、請求項１〜５及び７のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項４３】
エタノールが糖から産生される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項４４】
糖が、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース、及びラクトースからなる群より選択される、請求項４２又は４３に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項４５】
細菌が、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌、請求項１８に記載の単離した核酸分子、請求項２７に記載の単離したポリペプチド、又は請求項３６に記載の細菌宿主細胞。
【請求項４６】
細菌が、グラム陰性細菌である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌、請求項１８に記載の単離した核酸分子、請求項２７に記載の単離したポリペプチド、又は請求項３６に記載の細菌宿主細胞。
【請求項４７】
グラム陰性細菌が、アシネトバクター属（Acinetobacter）、グルコノバクター属（Gluconobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、ジオバクター属（Geobacter）、シェワネラ属（Shewanella）、サルモネラ属（Salmonella）、エンテロバクター属（Enterobacter）及びクレブシエラ属（Klebsella）からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌、請求項１８に記載の単離した核酸分子、請求項２７に記載の単離したポリペプチド、又は請求項３６に記載の細菌宿主細胞。
【請求項４８】
細菌が、グラム陽性細菌である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌、請求項１８に記載の単離した核酸分子、請求項２７に記載の単離したポリペプチド、又は請求項３６に記載の細菌宿主細胞。
【請求項４９】
グラム陽性細菌が、バチルス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、オエノコッカス属（Oenococcus）、連鎖球菌属、及びユーバクテリウム属（Eubacterium）からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌、請求項１８に記載の単離した核酸分子、請求項２７に記載の単離したポリペプチド、又は請求項３６に記載の細菌宿主細胞。
【請求項５０】
細菌が大腸菌である請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌、請求項１８に記載の単離した核酸分子、請求項２７に記載の単離したポリペプチド、又は請求項３６に記載の細菌宿主細胞。
【請求項５１】
変異されたｌｐｄ遺伝子により発現されるポリペプチドのアミノ酸の別のアミノ酸との置換を含んでなり、当該置換がポリペプチドのｐＫを変化させるものである、請求項４又は７に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項５２】
ポリペプチドが、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含有してなるポリペプチドであって、変異が野生型のアミノ酸の別のアミノ酸との
（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列の３２２位、又は３２２位のどちらかの側の約５０番目以内の何れかの位置、又は、
（ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列の３５４位、又は３５４位のどちらかの側の約５０番目以内の何れかの位置、
での置換を含んでなるものである、請求項５１に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項５３】
別のアミノ酸が、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群より選択される中性アミノ酸である、請求項５１又は５２に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項５４】
別のアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、及びリジンからなる群より選択される塩基性アミノ酸である、請求項５１又は５２に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項５５】
変異が、アミノ酸の置換が変異されたｌｐｄ遺伝子により発現されるポリペプチドの酸性を増加させるように、３２２位のＨを何れかのアミノ酸で置換することを含んでなる、請求項５２に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項５６】
変異が、配列番号６に記載の配列の３２２位のＨのＹへの置換を含んでなる（ものである）、請求項５５に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項５７】
変異が、アミノ酸の置換が変異されたｌｐｄ遺伝子により発現されるポリペプチドの酸性を減少させるように、３５４位のＥを何れかのアミノ酸で置換することを含んでなる、請求項５２に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項５８】
変異が、配列番号６に記載の配列の３５４位のＥのＫへの置換を含んでなる（ものである）、請求項５７に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項５９】
細菌が大腸菌株ＳＥ２３７７である、請求項５６に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項６０】
細菌が配列番号１に記載の配列又はその断片を含有してなる、請求項５９に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項６１】
細菌が大腸菌株ＳＥ２３７８である、請求項５８に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項６２】
細菌が配列番号３に記載の配列又はその断片を含有してなる、請求項６１に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項６３】
細菌が大腸菌株ＳＥ２３８２である、請求項５８に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項６４】
細菌が配列番号３に記載の配列又はその断片を含有してなる、請求項６３に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項６５】
細菌が大腸菌株ＳＥ２３８３である、請求項５６に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項６６】
細菌が配列番号１に記載の配列又はその断片を含有してなる、請求項６５に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項６７】
細菌が大腸菌株ＳＥ２３８４である、請求項５６に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項６８】
細菌が配列番号１に記載の配列又はその断片を含有してなる、請求項６７に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項６９】
細菌が大腸菌株ＳＥ２３８５である、請求項５８に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項７０】
細菌が配列番号３に記載の配列又はその断片を含有してなる、請求項６９に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項７１】
細菌が、糖からのエタノールの産生に適しているものである、請求項５６〜７０のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項７２】
１つ又はそれ以上の変異を伴うｌｐｄ遺伝子を含んでなる単離した非組み換え細菌であって、当該変異が非組み換え細菌を嫌気性条件下での発酵主生成物としてのエタノールの産生を可能とするものであり、当該細菌が
（ａ）糖の多い培地で嫌気性生育条件下で、細菌の候補の変異株を生育させること；及び、
（ｂ）発酵の主生成物としてエタノールを産生する変異体を選択すること：
の段階を含んでなる工程により製造される単離した非組み換え細菌。
【請求項７３】
産生されたエタノールが、嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
方法が、
（ａ）糖の多い培地で嫌気性生育条件下、細菌の候補の変異株を生育させること；及び
（ｂ）発酵の主生成物としてエタノールを産生する変異体を選択すること：
の工程を含有してなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌を製造する方法。
【請求項７５】
産生されたエタノールが、嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
変異が自然発生の変異からもたらされる、請求項７２に記載の単離した非組み換え細菌又は請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
細菌が変異誘発剤に晒される、請求項７２に記載の単離した非組み換え細菌又は請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
変異誘発剤が、メタンスルホン酸エチル、２-アミノプリン、ＩＣＲ−１９１、メタンスルホン酸メチル、Ｎ−メチル-Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンからなる群より選択される、請求項７２に記載の単離した非組み換え細菌又は請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
変異誘発剤が、メタンスルホン酸エチルである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
糖の多い培地における糖が、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース、及びラクトースからなる群より選択される、請求項７２に記載の単離した非組み換え細菌又は請求項７４に記載の方法。
【請求項８１】
細菌における発酵の代替的経路を不活性化させる工程をさらに含んでなる、請求項７２に記載の単離した非組み換え細菌又は請求項７４に記載の方法。
【請求項８２】
発酵の代替的経路が、細菌における欠失変異を導入することにより不活性化される、請求項７２に記載の単離した非組み換え細菌又は請求項７４に記載の方法。
【請求項８３】
変異されていない細菌が、エタノール非産生性である、請求項７２に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項８４】
エタノールが少量発酵生成物であり、非気体状生成物の全量の４０％未満を構成する、請求項８３に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項８５】
細菌が、嫌気性条件化で発酵主生成物としてエタノールを産生する、請求項７２に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項８６】
産生されたエタノールが嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する、請求項８５に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項８７】
変異が、ホモエタノールの発酵経路を提供する、請求項７２に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項８８】
細菌における１つ又はそれ以上の発酵の代替的経路が不活性化される、請求項８７に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項８９】
発酵の代替的経路が変異により不活性化される、請求項８８に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項９０】
発酵の代替的経路が、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）及びコハク酸塩から出発する、乳酸脱水素酵素（ｌｄｈＡ）による乳酸塩、酢酸塩、エタノール、ギ酸塩、Ｈ２、及びＣＯ２の産生を含む、請求項８８に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項９１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌又は請求項３６に記載の細菌宿主細胞にオリゴ糖を接触させること、それによりオリゴ糖源からエタノールを産生させることを含んでなる、オリゴ糖源からエタノールを産生する方法。
【請求項９２】
オリゴ糖が、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン、及びこれらの組み合わせの何れかからなる群より選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌、及びエタノール製造のための説明書を含有してなるキット。
【請求項９４】
糖源をさらに含有してなる、請求項９３に記載のキット。
【請求項９５】
寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９６７としてthe Agricultural Research Culture Collectionに寄託された大腸菌株ＡＨ２１８。
【請求項９６】
寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９６８としてthe Agricultural Research Culture Collectionに寄託された大腸菌株ＡＨ２４１。
【請求項９７】
寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９６９としてthe Agricultural Research Culture Collectionに寄託された大腸菌株ＡＨ２４２。
【請求項９８】
寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７０としてthe Agricultural Research Culture Collectionに寄託された大腸菌株ＳＥ２３７７。
【請求項９９】
寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７１としてthe Agricultural Research Culture Collectionに寄託された大腸菌株ＳＥ２３７８。
【請求項１００】
寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７２としてthe Agricultural Research Culture Collectionに寄託された大腸菌株ＳＥ２３８２。
【請求項１０１】
寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７３としてthe Agricultural Research Culture Collectionに寄託された大腸菌株ＳＥ２３８３。
【請求項１０２】
寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７４としてthe Agricultural Research Culture Collectionに寄託された大腸菌株ＳＥ２３８４。
【請求項１０３】
寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７５としてthe Agricultural Research Culture Collectionに寄託された大腸菌株ＳＥ２３８５。
【請求項１０４】
ｌｐｄ遺伝子における変異がＮＡＤＨ非感受性をもたらす、請求項４、７、又は７２に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項１０５】
変異がｌｐｄ遺伝子における変異に起因する、請求項７２、７４、又は９１に記載の方法、又は請求項９３に記載のキット。
【請求項１０６】
ｌｐｄ遺伝子における変異がＮＡＤＨ非感受性をもたらす、請求項１０５に記載の方法又はキット。
【請求項１】
変異が、非組み換え細菌を嫌気性条件下で糖１モル当たり４モルのＮＡＤＨを産生できるようにする、当該変異を含んでなる単離した非組み換え細菌。
【請求項２】
変異がｐｄｈオペロンで生起している、請求項１に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項３】
ｐｄｈオペロンが、ｐｄｈＲ、ａｃｅＥＦ及びｌｐｄ遺伝子を含有してなる、請求項２に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項４】
変異がｌｐｄ遺伝子においてである、請求項３に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項５】
糖１モル当たり４モルのＮＡＤＨの産生が、発酵主生成物としてエタノールの産生をもたらす、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項６】
糖が、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース、及びラクトースからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項７】
変異が、非組み換え細菌を嫌気性条件下での発酵主生成物としてのエタノールの産生を可能とするものである、当該変異を伴うｌｐｄ遺伝子を含んでなる単離した非組み換え細菌。
【請求項８】
産生されたエタノールが嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する、請求項５又は７のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項９】
変異されていない細菌が、エタノール非産生性である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項１０】
エタノールが、少量発酵生成物であり、非気体状生成物の全量の４０％未満を構成する、請求項９に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項１１】
変異が、ホモエタノール発酵の経路を提供する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項１２】
細菌における１つ又はそれ以上の発酵の代替的経路が不活性化されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項１３】
発酵の代替的経路が、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）及びコハク酸塩から出発する、乳酸脱水素酵素（ｌｄｈＡ）による乳酸塩、酢酸塩、エタノール、ギ酸塩、Ｈ２、及びＣＯ２の産生を含む、請求項１２に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項１４】
発酵の代替的経路が、変異によって不活性化される、請求項１３に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項１５】
変異がｌｄｈＡ遺伝子においてである、請求項１３に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項１６】
変異がｐｆｌ遺伝子においてである、請求項１３に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項１７】
変異が、ｌｄｈＡ遺伝子又はｐｆｌＢ遺伝子においてである、請求項１５又は１６に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項１８】
単離した核酸分子が、
（ａ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列と少なくとも６０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；
（ｂ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列を含んでなる核酸の、少なくとも１００ヌクレオチドの断片を含有してなる核酸分子；
（ｃ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｄ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片をコードする核酸分子であって、当該断片が配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列の少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基を含有してなる、核酸分子；
（ｅ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの天然のアレル変異体をコードする核酸分子であって、当該核酸分子がストリンジェントな条件下で配列番号１若しくは配列番号３に記載の配列を含有する核酸分子の相補配列とハイブリダイズする、核酸分子；
（ｆ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、又はそれらの相補配列を含んでなる核酸分子；
（ｇ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸分子；
からなる群より選択されて、当該核酸分子が、細胞内で発現すると、細胞が発酵主生成物としてエタノールを産生できるようにする、核酸分子。
【請求項１９】
産生されたエタノールが、嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する、請求項１８に記載の単離した核酸分子。
【請求項２０】
細胞が細菌細胞である、請求項１８に記載の単離した核酸分子。
【請求項２１】
核酸分子の発現が無い場合の細菌細胞がエタノール非産生性である、請求項２０に記載の単離した核酸分子。
【請求項２２】
エタノールが少量発酵生成物であり、非気体状生成物の全量の４０％未満を構成する、請求項２１に記載の単離した核酸分子。
【請求項２３】
細菌細胞が嫌気性条件下での発酵主生成物としてエタノールを産生する、請求項１９に記載の単離した核酸分子。
【請求項２４】
細菌細胞における核酸分子の発現が、細菌細胞内でのホモエタノール発酵の経路を提供する、請求項１９に記載の単離した核酸分子。
【請求項２５】
核酸分子が、配列番号１に記載の配列の断片を含んでなり、少なくとも１００ヌクレオチドの長さであり、配列番号１に記載の配列の９９７位に対応する位置にＴを含有する、請求項１８に記載の単離した核酸分子。
【請求項２６】
核酸分子が、配列番号３に記載の配列の断片を含んでなり、少なくとも１００ヌクレオチドの長さであり、配列番号１に記載の配列の１０２３位に対応する位置にＧを含有する、請求項１８に記載の単離した核酸分子。
【請求項２７】
単離したポリペプチドが、
（ａ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片であって、当該断片が配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含有してなる、ポリペプチドの断片；
（ｂ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの天然のアレル変異体であって、当該ポリペプチドがストリンジェントな条件下で配列番号１若しくは配列番号３に記載の配列を含有する核酸分子の相補配列とハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、アレル変異体；
（ｃ）配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含んでなる核酸に少なくとも５０％の相同性である核酸分子によってコードされるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２若しくは配列番号４に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性であるアミノ酸配列を含有してなるポリペプチド； 並びに
（ｅ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなる単離したポリペプチド；
からなる群より選択されて、当該ポリペプチドが、細胞内で、細胞が発酵主生成物としてエタノールを産生できるようにする、ポリペプチド。
【請求項２８】
産生されたエタノールが、嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する、請求項２７に記載の単離したポリペプチド。
【請求項２９】
ポリペプチドが、嫌気性条件下でジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ活性を有している、請求項２７に記載の単離したポリペプチド。
【請求項３０】
細胞が細菌細胞である、請求項２７に記載の単離したポリペプチド。
【請求項３１】
前記ポリペプチドの発現が無い場合の細菌細胞が、エタノール非産生性である、請求項３０に記載の単離したポリペプチド。
【請求項３２】
エタノールが少量発酵生成物であり、非気体状生成物の全量の４０％未満を構成する、請求項３０に記載の単離したポリペプチド。
【請求項３３】
細菌細胞が、嫌気性条件下での発酵主生成物としてエタノールを産生する、請求項２７に記載の単離したポリペプチド。
【請求項３４】
産生されたエタノールが、嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する、請求項３０に記載の単離したポリペプチド。
【請求項３５】
細菌細胞におけるポリペプチドの発現が、細菌細胞内でのホモエタノール発酵の経路を提供する、請求項３０に記載の単離したポリペプチド。
【請求項３６】
請求項１８〜２６のいずれか一項に記載の核酸分子を含有してなる細菌宿主細胞。
【請求項３７】
配列番号１若しくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、又はそれらの断片を含有しているベクターを含んでなる、請求項３６に記載の細菌宿主細胞。
【請求項３８】
ベクターがｐＫＹ３３である、請求項３０に記載の細菌宿主細胞。
【請求項３９】
核酸分子を発現するように遺伝子操作されている、請求項３６に記載の細菌宿主細胞。
【請求項４０】
請求項２７〜３５のいずれか一項に記載のポリペプチドを含有してなる細菌宿主細胞。
【請求項４１】
方法が、
（ａ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片であって、当該断片が配列番号２又は配列番号４に記載の配列の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含有してなる、ポリペプチドの断片；
（ｃ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの天然のアレル変異体であって、当該ポリペプチドが、ストリンジェントな条件下で配列番号１若しくは配列番号３に記載の配列を含んでなる核酸分子の相補配列とハイブリダイズする核酸分子によりコードされる、アレル変異体；
からなる群より選択されるポリペプチドを産生する方法であって、
核酸分子を発現する条件下で請求項３０に記載の宿主細胞を培養することを含んでなる、ポリペプチドを産生する方法。
【請求項４２】
請求項１８に記載の核酸分子を含有してなる、請求項１〜５及び７のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項４３】
エタノールが糖から産生される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項４４】
糖が、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース、及びラクトースからなる群より選択される、請求項４２又は４３に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項４５】
細菌が、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌、請求項１８に記載の単離した核酸分子、請求項２７に記載の単離したポリペプチド、又は請求項３６に記載の細菌宿主細胞。
【請求項４６】
細菌が、グラム陰性細菌である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌、請求項１８に記載の単離した核酸分子、請求項２７に記載の単離したポリペプチド、又は請求項３６に記載の細菌宿主細胞。
【請求項４７】
グラム陰性細菌が、アシネトバクター属（Acinetobacter）、グルコノバクター属（Gluconobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、ジオバクター属（Geobacter）、シェワネラ属（Shewanella）、サルモネラ属（Salmonella）、エンテロバクター属（Enterobacter）及びクレブシエラ属（Klebsella）からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌、請求項１８に記載の単離した核酸分子、請求項２７に記載の単離したポリペプチド、又は請求項３６に記載の細菌宿主細胞。
【請求項４８】
細菌が、グラム陽性細菌である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌、請求項１８に記載の単離した核酸分子、請求項２７に記載の単離したポリペプチド、又は請求項３６に記載の細菌宿主細胞。
【請求項４９】
グラム陽性細菌が、バチルス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、オエノコッカス属（Oenococcus）、連鎖球菌属、及びユーバクテリウム属（Eubacterium）からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌、請求項１８に記載の単離した核酸分子、請求項２７に記載の単離したポリペプチド、又は請求項３６に記載の細菌宿主細胞。
【請求項５０】
細菌が大腸菌である請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌、請求項１８に記載の単離した核酸分子、請求項２７に記載の単離したポリペプチド、又は請求項３６に記載の細菌宿主細胞。
【請求項５１】
変異されたｌｐｄ遺伝子により発現されるポリペプチドのアミノ酸の別のアミノ酸との置換を含んでなり、当該置換がポリペプチドのｐＫを変化させるものである、請求項４又は７に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項５２】
ポリペプチドが、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含有してなるポリペプチドであって、変異が野生型のアミノ酸の別のアミノ酸との
（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列の３２２位、又は３２２位のどちらかの側の約５０番目以内の何れかの位置、又は、
（ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列の３５４位、又は３５４位のどちらかの側の約５０番目以内の何れかの位置、
での置換を含んでなるものである、請求項５１に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項５３】
別のアミノ酸が、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群より選択される中性アミノ酸である、請求項５１又は５２に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項５４】
別のアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、及びリジンからなる群より選択される塩基性アミノ酸である、請求項５１又は５２に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項５５】
変異が、アミノ酸の置換が変異されたｌｐｄ遺伝子により発現されるポリペプチドの酸性を増加させるように、３２２位のＨを何れかのアミノ酸で置換することを含んでなる、請求項５２に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項５６】
変異が、配列番号６に記載の配列の３２２位のＨのＹへの置換を含んでなる（ものである）、請求項５５に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項５７】
変異が、アミノ酸の置換が変異されたｌｐｄ遺伝子により発現されるポリペプチドの酸性を減少させるように、３５４位のＥを何れかのアミノ酸で置換することを含んでなる、請求項５２に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項５８】
変異が、配列番号６に記載の配列の３５４位のＥのＫへの置換を含んでなる（ものである）、請求項５７に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項５９】
細菌が大腸菌株ＳＥ２３７７である、請求項５６に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項６０】
細菌が配列番号１に記載の配列又はその断片を含有してなる、請求項５９に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項６１】
細菌が大腸菌株ＳＥ２３７８である、請求項５８に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項６２】
細菌が配列番号３に記載の配列又はその断片を含有してなる、請求項６１に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項６３】
細菌が大腸菌株ＳＥ２３８２である、請求項５８に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項６４】
細菌が配列番号３に記載の配列又はその断片を含有してなる、請求項６３に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項６５】
細菌が大腸菌株ＳＥ２３８３である、請求項５６に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項６６】
細菌が配列番号１に記載の配列又はその断片を含有してなる、請求項６５に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項６７】
細菌が大腸菌株ＳＥ２３８４である、請求項５６に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項６８】
細菌が配列番号１に記載の配列又はその断片を含有してなる、請求項６７に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項６９】
細菌が大腸菌株ＳＥ２３８５である、請求項５８に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項７０】
細菌が配列番号３に記載の配列又はその断片を含有してなる、請求項６９に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項７１】
細菌が、糖からのエタノールの産生に適しているものである、請求項５６〜７０のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項７２】
１つ又はそれ以上の変異を伴うｌｐｄ遺伝子を含んでなる単離した非組み換え細菌であって、当該変異が非組み換え細菌を嫌気性条件下での発酵主生成物としてのエタノールの産生を可能とするものであり、当該細菌が
（ａ）糖の多い培地で嫌気性生育条件下で、細菌の候補の変異株を生育させること；及び、
（ｂ）発酵の主生成物としてエタノールを産生する変異体を選択すること：
の段階を含んでなる工程により製造される単離した非組み換え細菌。
【請求項７３】
産生されたエタノールが、嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
方法が、
（ａ）糖の多い培地で嫌気性生育条件下、細菌の候補の変異株を生育させること；及び
（ｂ）発酵の主生成物としてエタノールを産生する変異体を選択すること：
の工程を含有してなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌を製造する方法。
【請求項７５】
産生されたエタノールが、嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
変異が自然発生の変異からもたらされる、請求項７２に記載の単離した非組み換え細菌又は請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
細菌が変異誘発剤に晒される、請求項７２に記載の単離した非組み換え細菌又は請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
変異誘発剤が、メタンスルホン酸エチル、２-アミノプリン、ＩＣＲ−１９１、メタンスルホン酸メチル、Ｎ−メチル-Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンからなる群より選択される、請求項７２に記載の単離した非組み換え細菌又は請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
変異誘発剤が、メタンスルホン酸エチルである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
糖の多い培地における糖が、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、スクロース、及びラクトースからなる群より選択される、請求項７２に記載の単離した非組み換え細菌又は請求項７４に記載の方法。
【請求項８１】
細菌における発酵の代替的経路を不活性化させる工程をさらに含んでなる、請求項７２に記載の単離した非組み換え細菌又は請求項７４に記載の方法。
【請求項８２】
発酵の代替的経路が、細菌における欠失変異を導入することにより不活性化される、請求項７２に記載の単離した非組み換え細菌又は請求項７４に記載の方法。
【請求項８３】
変異されていない細菌が、エタノール非産生性である、請求項７２に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項８４】
エタノールが少量発酵生成物であり、非気体状生成物の全量の４０％未満を構成する、請求項８３に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項８５】
細菌が、嫌気性条件化で発酵主生成物としてエタノールを産生する、請求項７２に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項８６】
産生されたエタノールが嫌気性条件下での非気体状生成物の全量の５０％超を構成する、請求項８５に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項８７】
変異が、ホモエタノールの発酵経路を提供する、請求項７２に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項８８】
細菌における１つ又はそれ以上の発酵の代替的経路が不活性化される、請求項８７に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項８９】
発酵の代替的経路が変異により不活性化される、請求項８８に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項９０】
発酵の代替的経路が、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）及びコハク酸塩から出発する、乳酸脱水素酵素（ｌｄｈＡ）による乳酸塩、酢酸塩、エタノール、ギ酸塩、Ｈ２、及びＣＯ２の産生を含む、請求項８８に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項９１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌又は請求項３６に記載の細菌宿主細胞にオリゴ糖を接触させること、それによりオリゴ糖源からエタノールを産生させることを含んでなる、オリゴ糖源からエタノールを産生する方法。
【請求項９２】
オリゴ糖が、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン、及びこれらの組み合わせの何れかからなる群より選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離した非組み換え細菌、及びエタノール製造のための説明書を含有してなるキット。
【請求項９４】
糖源をさらに含有してなる、請求項９３に記載のキット。
【請求項９５】
寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９６７としてthe Agricultural Research Culture Collectionに寄託された大腸菌株ＡＨ２１８。
【請求項９６】
寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９６８としてthe Agricultural Research Culture Collectionに寄託された大腸菌株ＡＨ２４１。
【請求項９７】
寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９６９としてthe Agricultural Research Culture Collectionに寄託された大腸菌株ＡＨ２４２。
【請求項９８】
寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７０としてthe Agricultural Research Culture Collectionに寄託された大腸菌株ＳＥ２３７７。
【請求項９９】
寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７１としてthe Agricultural Research Culture Collectionに寄託された大腸菌株ＳＥ２３７８。
【請求項１００】
寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７２としてthe Agricultural Research Culture Collectionに寄託された大腸菌株ＳＥ２３８２。
【請求項１０１】
寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７３としてthe Agricultural Research Culture Collectionに寄託された大腸菌株ＳＥ２３８３。
【請求項１０２】
寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７４としてthe Agricultural Research Culture Collectionに寄託された大腸菌株ＳＥ２３８４。
【請求項１０３】
寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９７５としてthe Agricultural Research Culture Collectionに寄託された大腸菌株ＳＥ２３８５。
【請求項１０４】
ｌｐｄ遺伝子における変異がＮＡＤＨ非感受性をもたらす、請求項４、７、又は７２に記載の単離した非組み換え細菌。
【請求項１０５】
変異がｌｐｄ遺伝子における変異に起因する、請求項７２、７４、又は９１に記載の方法、又は請求項９３に記載のキット。
【請求項１０６】
ｌｐｄ遺伝子における変異がＮＡＤＨ非感受性をもたらす、請求項１０５に記載の方法又はキット。
【図１（Ａ）】
【図１（Ｂ）】
【図２（Ａ）】
【図２（Ｂ）】
【図３（Ａ）】
【図３（Ｂ）】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７（Ａ）】
【図７（Ｂ）】
【図８】
【図９−１】
【図９−２】
【図９−３】
【図９−４】
【図９−５】
【図９−６】
【図１０】
【図１１】
【図１（Ｂ）】
【図２（Ａ）】
【図２（Ｂ）】
【図３（Ａ）】
【図３（Ｂ）】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７（Ａ）】
【図７（Ｂ）】
【図８】
【図９−１】
【図９−２】
【図９−３】
【図９−４】
【図９−５】
【図９−６】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１０−５２４４２８（Ｐ２０１０−５２４４２８Ａ）
【公表日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０９６２６（Ｐ２００９−５０９６２６）
【出願日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１０３０６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１８９３０
【国際公開日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【出願人】（５０１４５３３０７）ユニバーシティー オブ フロリダ リサーチ ファンデーション， インク． (2)
【住所又は居所原語表記】２２３ Ｇｒｉｎｔｅｒ Ｈａｌｌ Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ １１５５００ Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ， Ｆｌｏｒｉｄａ ３２６０６ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１０３０６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１８９３０
【国際公開日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【出願人】（５０１４５３３０７）ユニバーシティー オブ フロリダ リサーチ ファンデーション， インク． (2)
【住所又は居所原語表記】２２３ Ｇｒｉｎｔｅｒ Ｈａｌｌ Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ １１５５００ Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ， Ｆｌｏｒｉｄａ ３２６０６ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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