非線形光学顕微鏡
【課題】検出感度の高い分光型の非線形光学顕微鏡を提供する。
【解決手段】本発明の非線形顕微鏡を例示する一態様は、光源（１２）から発せられた照明光を物体（１０Ａ）上に集光する集光光学系（１７）と、前記物体へ向かう前記照明光の進路を時間変化させることにより前記照明光の集光点で前記物体上を二次元走査する走査手段（１６）と、前記物体から前記照明光の強度と非線形な強度で発せられる信号光による前記物体の像を、前記走査手段を介することなく形成する結像光学系（２０）と、前記結像光学系の像面に二次元配置された受光素子アレイ（２１）と、前記受光素子アレイに向かう前記信号光を前記二次元走査の副走査方向にかけて分光する分光手段（１８）とを備える。
【解決手段】本発明の非線形顕微鏡を例示する一態様は、光源（１２）から発せられた照明光を物体（１０Ａ）上に集光する集光光学系（１７）と、前記物体へ向かう前記照明光の進路を時間変化させることにより前記照明光の集光点で前記物体上を二次元走査する走査手段（１６）と、前記物体から前記照明光の強度と非線形な強度で発せられる信号光による前記物体の像を、前記走査手段を介することなく形成する結像光学系（２０）と、前記結像光学系の像面に二次元配置された受光素子アレイ（２１）と、前記受光素子アレイに向かう前記信号光を前記二次元走査の副走査方向にかけて分光する分光手段（１８）とを備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二光子励起蛍光顕微鏡、コヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡（ＣＡＲＳ：Coherent anti-Stokes Raman scattering）などの非線形光学顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオ産業の勢いはとどまるところを知らず、とりわけ生体試料をターゲットとした三次元分解顕微鏡の需要は高まる一方である。その中でも共焦点蛍光顕微鏡は古くから現在に至るまで広く使われている。
通常の共焦点蛍光顕微鏡は、物体に照射する光（照明光）の強度と、物体で発生する光（信号光）の強度との関係が線形となる線形光学顕微鏡であるが、近年はその関係が非線形となる非線形光学顕微鏡の研究開発が盛んに行われている。
例えば、二光子励起蛍光顕微鏡（非特許文献１等を参照）は、長い波長の励起光（近赤外線）で蛍光物質を励起するので、被観察物の深部を観察することが可能である。
因みに、非線形光学顕微鏡へ分光機能を付加する場合には、検出側のピンホール（又はスリット）の後ろ側へ分光素子を配置し、分光素子で生じた各波長の回折光を互いに異なる受光素子で個別に検出すればよいと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Winfried Denk et al. "Two-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy", Science, New Series, Vol. 248, No. 4951(April 6, 1990), pp. 73-76
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、この分光方法では回折光が微弱となり、検出感度が不足する可能性の高いことが判明した。
【０００５】
そこで本発明は、検出感度の高い分光型の非線形光学顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の非線形顕微鏡を例示する一態様は、光源から発せられた照明光を物体上に集光する集光光学系と、前記物体へ向かう前記照明光の進路を時間変化させることにより前記照明光の集光点で前記物体上を二次元走査する走査手段と、前記物体から前記照明光の強度と非線形な強度で発せられる信号光による前記物体の像を、前記走査手段を介することなく形成する結像光学系と、前記結像光学系の像面に二次元配置された受光素子アレイと、前記受光素子アレイに向かう前記信号光を前記二次元走査の副走査方向にかけて分光する分光手段とを備える。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、検出感度の高い分光型の非線形光学顕微鏡が実現する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】二光子励起蛍光顕微鏡装置の構成図。
【図２】撮像素子２１上における各波長の回折光の入射領域を示す図。
【図３】スキャン時における入射領域Ａｓの移動パターンを示す図。
【図４】或るラインに対するｘスキャン時の入射領域Ａｓの軌跡Ｔと、次のラインに対するｘスキャン時の入射領域Ａｓの軌跡Ｔ’とを示す図。
【図５】第１実施形態のコントロールユニット３０の動作フローチャート。
【図６】ステップＳ１９を説明する図。
【図７】第２実施形態のコントロールユニット３０の動作フローチャート。
【図８】ステップＳ１９’を説明する図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態として分光型の二光子励起蛍光顕微鏡装置を説明する。
【００１０】
図１は、本装置の構成図である。図１に示すとおり本装置には、フェムト秒パルスレーザ光源１２と、ビームエキスパンダ１３と、スキャナ１６と、ダイクロイックミラー１５と、リレー光学系１４Ａと、対物レンズ１７と、標本ステージ１１と、リレー光学系１４Ｂと、分光検出部２００と、コントロールユニット３０とが備えられる。
【００１１】
ステージ１１には標本１０Ａが載置される。標本１０Ａは、蛍光色素により標識された細胞試料である。ここでは、その蛍光色素の励起波長（一光子励起により励起する波長）を４０５ｎｍとし、その蛍光色素の蛍光波長を５００ｎｍ及びその近傍とする。それに対応するべくフェムト秒パルスレーザ光源１２は、照明光として、中心波長が８１０ｎｍであるフェムト秒パルスレーザ光を例えば１００ｋＨｚの周波数で射出する。
【００１２】
フェムト秒パルスレーザ光源１２から射出した照明光は、ビームエキスパンダ１３により径の太い光束に変換され、スキャナ１６、ダイクロイックミラー１５、リレー光学系１４Ａ、対物レンズ１７を順に介した後、標本１０Ａに向けて集光する。なお、ダイクロイックミラー１５の特性は、波長が８１０ｎｍ及びその近傍である光を反射し、波長が５００ｎｍ及びその近傍である光を透過する特性に設定されている。
【００１３】
標本１０Ａにおいて、照明光の照射領域（レーザスポット）の中央に位置する微小領域では、蛍光分子が二光子励起され、波長が５００ｎｍ及びその近傍である蛍光（二光子励起蛍光）が発生する。この二光子励起蛍光が本装置の信号光である。レーザスポットの中央から外れた領域では、二光子励起が生じないので、蛍光は発生しない。なお、レーザスポットのサイズは、対物レンズ１７のＮＡが大きいほど小さくなり、それに伴い、前記した微小領域のサイズも小さくなる。
【００１４】
レーザスポットの微小領域で発生した二光子励起蛍光は、そのレーザスポットを形成した照明光の光路を逆向きに辿り、対物レンズ１７、リレー光学系１４Ａを通過後、ダイクロイックミラー１５を透過し、リレー光学系１４Ｂを介して分光検出部２００へ入射する。
【００１５】
分光検出部２００には、分光素子１８と、バンドパスフィルタ１９と、結像光学系２０と、撮像素子２１とがこの順で配置される。分光検出部２００の入射部には、ピンホールやスリットが設けられていない。
【００１６】
分光素子１８は、反射型の一次元回折格子であり、対物レンズ１７の瞳と共役な位置に配置される。分光素子１８は、リレー光学系１４Ｂの側から入射した二光子励起蛍光を各波長の回折光（一次回折光）に分離する。
【００１７】
バンドパスフィルタ１９は、分光素子１８から撮像素子２１に向けて不要な光が入射するのを防ぐ。ここでは、本装置の観察対象波長域を４００〜５８０ｎｍとし、バンドパスフィルタ１９の特性は、その波長域の光を透過し、他の波長域の光をカットする特性に設定されるものとする。
【００１８】
結像光学系２０は、対物レンズ１７及びリレー光学系１４Ｂと共に、撮像素子２１と標本１０Ａとを共役に結ぶ働きがある。分光素子１８から結像光学系２０へ入射した各波長の回折光は、結像光学系２０を通過した後、撮像素子２１上の互いに異なる位置へ入射する。なお、ここでは、結像光学系２０の焦点距離ｆを６０ｍｍとし、標本１０Ａから撮像素子２１までの全光学系の倍率Ｍを３０倍とする。
【００１９】
撮像素子２１は、二次元的に画素を配置した電子増倍ＣＣＤ（ＥＭ−ＣＣＤ）である。撮像素子２１は、電子シャッター又はメカシャッターを備え、そのシャッターはコントロールユニット３０によって駆動される。シャッターの開閉により、撮像素子２１の電荷蓄積タイミングは制御される。この制御により撮像素子２１が生成した画像（画像信号）は、コントロールユニット３０に取り込まれる。なお、ここでは、撮像素子２１の画素ピッチＰＣＣＤを８μｍとし、撮像素子２１の有効画素数を１０２４ｘ１０２４とする。
【００２０】
スキャナ１６には、１対のガルバノミラー（主走査用のｘスキャンミラー１６ｘ、副走査用のｙスキャンミラー１６ｙ）が、互いの回転軸が直交する姿勢関係で配置されている。このスキャナ１６は、コントロールユニット３０によって駆動される。
【００２１】
ｘスキャンミラー１６ｘが駆動されると、レーザスポットが標本１０Ａ上を所定方向（ｘ方向）へスキャン（ｘスキャン）する。また、スキャナ１６のｙスキャンミラー１６ｙが駆動されると、レーザスポットが標本１０Ａ上をｘ方向と垂直な方向（ｙ方向）へスキャン（ｙスキャン）する。よって、スキャナ１６がｘスキャンミラー１６ｘの角度を１往復させる毎にｙスキャンミラー１６ｙの角度を１ピッチ分ずつ変化させれば、レーザスポットで標本１０Ａ上を二次元的にスキャンすることができる。なお、ここでは、レーザスポットによる全スキャン領域（実視野）のサイズを、０．２×０．２ｍｍとする。
【００２２】
以上の構成では、標本１０Ａの側から分光検出部２００へ向かう二光子励起蛍光は、スキャナ１６を経由しない。さらに、ピンホールも用意されておらず、これによって減衰することもない。したがって、分光検出部２００へ入射する二光子励起蛍光の強度は、高く保たれる。但し、分光検出部２００へ入射する二光子励起蛍光がスキャナ１６を経由していない場合、分光素子１８に対する二光子励起蛍光の入射角度がスキャンに伴い変化する可能性がある。
【００２３】
それに対処するため、本装置では、分光素子１８の格子方向は、ｘスキャンに対応する方向に設定される。この場合、回折光の分岐方向は、ｙスキャンに対応する方向となる。なお、ここでは、分光素子１８の溝本数を１００本／ｍｍ（ピッチＰは１００μｍ）とする。
【００２４】
また、分光素子１８の配置姿勢は、ｙ方向のスキャン位置（スキャン座標ｙ）が全スキャン領域の中心にあるときにおける二光子励起蛍光の入射角度α０が４５°になるように設定される。
【００２５】
また、結像光学系２０の光軸方向は、スキャン座標ｙが全スキャン領域の中心にあるときに分光素子１８で発生する基準波長の回折光（ここでは波長５００ｎｍの回折光とする。）の進行方向と同じに設定される。なお、分光素子１８の配置姿勢及び溝本数が前述したとおりであった場合には、分光素子１８から射出する基準波長の回折光の出射角度φ０は、４９．２°となる。
【００２６】
図２は、撮像素子２１に対する各波長の回折光の入射領域Ａｓを示す図である（なお、図２では、スキャン位置が全スキャン領域の中心であるときの様子を示している。）。前述したとおり回折光の分岐方向はｙ方向に対応する方向（Ｙ方向）なので、入射領域ＡｓはＹ方向に長い領域となる。この入射領域Ａｓの中央が、基準波長の回折光の入射位置である。因みに、分光素子１８のピッチＰ、結像光学系の焦点距離ｆ、撮像素子２１の画素ピッチＰＣＣＤがそれぞれ前述した値に設定された場合、入射領域ＡｓのＹ方向の長さは約２００画素分になる。
【００２７】
また、入射領域Ａｓは、ｘスキャンに伴いそれに対応する方向（Ｘ方向）へ移動するが、入射領域Ａｓの長手方向はＹ方向なので、１ライン分のｘスキャン中には、同一画素へ互いに異なるスキャン位置からの二光子励起蛍光が重畳して入射する可能性は無い。
【００２８】
図３は、スキャン時における入射領域Ａｓの移動パターンを示す図である。図３に示したとおり入射領域Ａｓは、ｘスキャンに伴いＸ方向へ移動し、ｙスキャンに伴いＹ方向へ移動する（なお、ｙスキャンに伴い入射領域ＡｓのＹ方向の長さも若干変化する。また、点線で示した移動軌跡は、照明光がオフにされている期間の移動軌跡である。）。その結果、入射領域Ａｓは、全スキャン領域に対応する領域Ａ１内を二次元的に移動する（以下、この領域Ａ１を「全入射領域Ａ１」と称す。）。
【００２９】
但し、ｙスキャンのピッチは、撮像素子２１の１〜２画素分に相当し、入射領域ＡｓのＹ方向の長さより短い。よって、図４に示すとおり、或るラインに対するｘスキャン時の入射領域Ａｓの軌跡Ｔと、次のラインに対するｘスキャン時の入射領域Ａｓの軌跡Ｔ’とは、重複する。よって、或るラインに対するｘスキャンと次のラインに対するｘスキャンとを連続して行うと、同一画素へ互いに異なるスキャン位置からの二光子励起蛍光が重畳して入射する。
【００３０】
そこで、本実施形態のコントロールユニット３０は、１ライン分のｘスキャンを行う毎に撮像素子２１から画像を取り込む（詳細は後述）。
【００３１】
以下、標本１０Ａの上のスキャン位置（スキャン座標（ｘ，ｙ））と、撮像素子２１上の回折光の入射位置（ＣＣＤ座標（Ｘ，Ｙ））との関係を説明する。なお、ここでは、スキャン座標（ｘ，ｙ）の原点を全スキャン領域（実視野）の中心に採り、ＣＣＤ座標（Ｘ，Ｙ）の原点を全入射領域Ａ１の中心に採る。
【００３２】
先ず、スキャン座標ｘとＣＣＤ座標Ｘとの関係は、波長λに依存せず、以下の式（１）で表される。
【００３３】
Ｘ＝ｘＭ…（１）
一方、スキャン座標ｙとＣＣＤ座標Ｙとの関係は、波長λに依存し、以下の式（２）で表される。
【００３４】
Ｙ=ｆｓｉｎ（ｓｉｎ−１（λ／Ｐ−ｓｉｎ（α０＋ｓｉｎ−１（ｙＭ／ｆ）））−φ０）…（２）
したがって、本実施形態のコントロールユニット３０は、撮像素子２１が生成した画像を、これらの式（１）、（２）に基づき処理する（詳細は後述）。
【００３５】
図５は、本実施形態のコントロールユニット３０の動作フローチャートである。以下、各ステップを順に説明する。
【００３６】
ステップＳ１１：コントロールユニット３０は、ｙスキャンミラー１６ｙの角度設定により、スキャン座標ｙを初期値ｙ１（全スキャン領域の端）に設定する。
【００３７】
ステップＳ１２：コントロールユニット３０は、ｘスキャンミラー１６ｘの角度設定により、スキャン座標ｘを初期値ｘ１（全スキャン領域の端）に設定する。
【００３８】
ステップＳ１３：コントロールユニット３０は、撮像素子２１のシャッターを開放する。
【００３９】
ステップＳ１４：コントロールユニット３０は、ｘスキャンミラー１６ｘを駆動し、ｘスキャンを１ライン分だけ行う。
【００４０】
ステップＳ１５：コントロールユニット３０は、撮像素子２１のシャッターを閉鎖する。
【００４１】
ステップＳ１６：コントロールユニット３０は、撮像素子２１から画像を読み出し、その画像を、現在のスキャン座標ｙに対応付けてコントロールユニット３０内のメモリへ格納する。
【００４２】
ステップＳ１７：コントロールユニット３０は、全スキャン領域のスキャンが終了したか否か（スキャン座標ｙが最終値ｙｅｎｄになったか否か）を判別し、終了していない場合にはステップＳ１８へ移行し、終了した場合にはステップＳ１９へ移行する。
【００４３】
ステップＳ１８：コントロールユニット３０は、ｙスキャンミラー１６ｙの角度調整によりスキャン座標ｙを次の値に変更してからステップＳ１２に戻る。よって、ステップＳ１２〜Ｓ１６は、スキャン座標ｙが最終値ｙｅｎｄになるまで繰り返され、コントロールユニット３０のメモリには、図６（Ａ）に示すとおりスキャン座標ｙの設定数と同数の画像が格納されることになる。これらの画像は、スキャン座標ｙが初期値ｙ１であったときの画像Ｉ１、スキャン座標ｙが２番目の値ｙ２であったときの画像Ｉ２、スキャン座標ｙが３番目の値ｙ３であったときの画像Ｉ３、…、及びスキャン座標ｙが最終値ｙｅｎｄであったときの画像Ｉｅｎｄである。
【００４４】
ステップＳ１９：コントロールユニット３０は、メモリに格納された複数の画像Ｉ１〜Ｉｅｎｄに基づき、全スキャン位置における二光子励起蛍光のスペクトルを算出する。これによって、標本１０Ａの蛍光スペクトル画像が得られたことになる。なお、本ステップにおけるスペクトルの算出はスキャン座標毎に行われ、個々の着目スキャン座標（ｘｆ，ｙｆ）に関するスペクトルの算出は、次の手順（ａ）〜（ｅ）によって行われる。
【００４５】
（ａ）コントロールユニット３０は、図６（Ａ）に示すとおり、画像Ｉ１〜Ｉｅｎｄの中から着目スキャン座標ｙｆに対応する画像（着目画像）Ｉｆを参照する。
【００４６】
（ｂ）コントロールユニット３０は、ｘ方向の着目スキャン座標ｘｆを、撮像素子２１上のＸ方向の画素番号Ｘｃｆへ変換する。なお、ｘ方向のスキャン座標ｘからＸ方向の画素番号Ｘｃへの変換は、上述した式（１）から導出された次式（３）によって行われる。
【００４７】
Ｘｃ＝ｘＭ／ＰＣＣＤ…（３）
（ｃ）コントロールユニット３０は、図６（Ｂ）に示すとおり、着目画像ＩｆのうちＸ方向の画素番号がＸｃｆである複数の画素信号（画素信号列）を参照する。この画素信号列は、図６（Ｃ）に示すとおり、着目スキャン座標（ｘｆ，ｙｆ）で発生した二光子励起蛍光のスペクトルを表している。但し、図６（Ｃ）に示すスペクトルの横軸は画素番号Ｙｃであるので、正確なスペクトルを知るためには、画素番号Ｙｃを波長λに変換する必要がある。
【００４８】
（ｄ）そこで、コントロールユニット３０は、そのスペクトルの横軸である画素番号Ｙｃを波長λへと変換する。その変換は、上述した式（２）から導出された次式（４）によって行われる。但し、変換に当たり、式（４）における「ｙ」には、着目スキャン座標ｙｆの値が当てはめられる。
【００４９】
λ＝Ｐ（ｓｉｎ（ｓｉｎ−１ （ＹｃＰＣＣＤ／ｆ）＋φ０）＋ｓｉｎ（α０＋ｓｉｎ−１（ｙＭ／ｆ）））…（４）
（ｅ）さらに、コントロールユニット３０は、変換後のスペクトルのうち、本装置の観察対象波長域（４００〜５８０ｎｍ）から外れた部分を削除する。その結果、図６（Ｄ）に示すとおり、着目スキャン座標（ｘｆ，ｙｆ）で発生した二光子励起蛍光のスペクトルが得られる（以上、着目スキャン座標に関するスペクトルの算出方法）。
【００５０】
以上、本装置の分光検出部２００は、標本１０Ａから発せられる二光子励起蛍光による標本１０Ａの像を、スキャナ１６、および、分光機能を持った従来の二光子蛍光顕微鏡に備えられているピンホールを介さずに形成するので、光量ロスが無い分だけ分光検出感度は高い。
【００５１】
但し、スキャナ１６を介さずに分光検出を行うと、分光検出部２００に対する二光子励起蛍光の入射位置は、スキャンに伴い移動してしまう。
【００５２】
そこで、本装置の分光検出部２００の分光素子１８は、撮像素子２１に向かう二光子励起蛍光の分岐方向を、ｘスキャンの方向ではなくｙスキャンの方向としている。この場合、少なくとも１回のｘスキャン中に撮像素子２１の同一画素へ互いに異なるスキャン位置からの二光子励起蛍光が入射することはない。
【００５３】
よって、本実施形態のコントロールユニット３０は、１ライン分のｘスキャンを行う毎に撮像素子２１から画像を取り込むという簡単な手順を踏むだけで、蛍光スペクトル画像を確実に取得することができる。
【００５４】
また、本装置の分光検出部２００は、ピンホールやスリットを設けていないので、ピンホールやスリットでの光量ロスが無い分だけ分光検出感度は高い。しかも、非線形顕微鏡である本装置の空間解像度は対物レンズ１７のＮＡによってほぼ決まるので、分光検出部２００にピンホールやスリットが設けられなくとも、空間解像度は低下しない。
【００５５】
なお、本装置では、コントロールユニット３０が標本ステージ１１を光軸方向へ上下動させながら上述したステップＳ１１〜Ｓ１９を繰り返せば、標本１０Ａの三次元蛍光スペクトル画像を取得することもできる。
【００５６】
また、本装置では、撮像素子２１の位置や姿勢が不変であったので、ｙスキャン時に入射領域ＡｓのＹ方向の位置が変位したが、ｙスキャン時に撮像素子２１を−Ｙ方向へ並進させることにより、入射領域ＡｓのＹ方向の位置を不変としてもよい。この場合、撮像素子２１のＹ方向の長さを、入射領域ＡｓのＹ方向の長さと同程度にまで短縮することができるので効率的である。また、その場合は、全スキャン位置における二光子励起蛍光のスペクトルを算出する際にスキャン座標ｙを考慮する必要が無くなるので、処理が簡略化される。なお、撮像素子２１を並進させる代わりに、撮像素子２１に対する基準波長の回折光のＹ方向の入射位置が不変となるよう、分光素子１８を回動させてもよい。
【００５７】
また、本装置の分光検出部２００は、分光素子１８で発生した回折光を検出し、分光素子１８で発生した正反射光を検出しなかったが、結像光学系及び撮像素子を正反射光の発生方向にも設置し、蛍光スペクトル画像と同時に非分光の蛍光画像を取得してもよい。
【００５８】
［第２実施形態］
以下、本発明の第２実施形態として分光型の二光子励起蛍光顕微鏡装置を説明する。ここでは、第１実施形態との相違点のみを説明する。相違点は、標本１０Ａを標識した複数種類の蛍光色素を同時に励起する点と、コントロールユニット３０の動作とにある。
【００５９】
ここでは、蛍光色素の種類をＭ種類とし、フェムト秒パルスレーザ光源１２は、それらの蛍光色素の各々を二光子励起するＭ種類の照明光を同時に出射するものとする。また、本実施形態の標本像において、個々の蛍光輝点は互いに近接しておらず、点在しているとみなせると仮定する。また、コントロールユニット３０は、Ｍ種類の蛍光色素の各々のリファレンススペクトルｒ１，…，ｒＭを予め記憶しているものとする。
【００６０】
さらに、本実施形態では、後述のアンミックスを可能とするために、Ｙ方向のスキャンピッチは、標本１０Ａ上を密にスキャンするためのスキャンピッチ（基準ピッチ）の整数倍（Ｎ倍）に設定され、Ｎは、蛍光色素の種類数Ｍ以上に設定される。
【００６１】
但し、この場合は、或るスキャンラインと次のスキャンラインとの間に（Ｎ−１）本の間引きラインが生じることになるので、データの欠けを防ぐため、標本１０Ａのスキャンは、スキャンの開始ラインを１ラインずつずらしながらＮ回繰り返されることが望ましい。なお、各回のスキャンで得られた各画像に対する処理は共通なので、ここでは、或る１回のスキャンに関する処理のみに着目して説明する。
【００６２】
図７は、本実施形態のコントロールユニット３０の動作フローチャートである。
【００６３】
図７を図５と比較すると明らかなとおり、本実施形態のコントロールユニット３０は、シャッター閉鎖及び画像の読み出し（ステップＳ１５及びステップＳ１６）を、全スキャン領域のスキャンが終了した後（ステップＳ１７の後段）に行う。よって、本実施形態で取得される画像の枚数は１となる。この画像の個々の画素には、互いに異なるスキャン位置からの二光子励起蛍光が入射している可能性がある。
【００６４】
また、図７を図５と比較すると明らかなとおり、本実施形態のコントロールユニット３０は、蛍光スペクトル画像を算出する（ステップ１９）代わりに、アンミックスを行う（ステップＳ１９’）。ステップＳ１９’におけるアンミックスは、スキャン座標毎に行われ、或る１つの着目スキャン座標（ｘｆ，ｙｆ）に関するアンミックスは、次の手順（ａ）〜（ｅ）によって行われる。
【００６５】
（ａ）コントロールユニット３０は、ｘ方向の着目スキャン座標ｘｆを、上述した式（３）により撮像素子２１上のＸ方向の画素番号Ｘｃｆへと変換する。
【００６６】
（ｂ）コントロールユニット３０は、メモリに格納された画像のうち、Ｘ方向の画素番号がＸｃｆである複数の画素信号（画素信号列）を参照する。この画素信号列は、図８（Ａ）に示すとおり、スキャン座標ｘｆを通りｙ方向に延びるＬ画素分の窓に関する輝度プロファイルであって、この窓内に存在する複数の蛍光輝点の各々から発現した蛍光スペクトルを、図８（Ｂ）に示すとおり加算したもの（合成スペクトル）である。但し、Ｌは十分に大きく、Ｌ≧Ｍ×Ｎを満たす。なお、本実施形態のスキャンではスキャンピッチが基準ピッチのＮ倍に設定されたので、この合成スペクトルに寄与する複数の蛍光輝点同士は、少なくともＮライン分は離れているはずである。
【００６７】
（ｃ）コントロールユニット３０は、図８（Ｃ）に示すようなＭ種類の蛍光色素のリファレンススペクトルｒ１，…，ｒＭの各々から、図８（Ｄ）に示すとおりＮ個のリファレンススペクトルを作成し、合計でＭ×Ｎ個のリファレンススペクトルを取得する。ここで、ｉ番目の蛍光色素に関するＮ個のリファレンススペクトルは、その蛍光色素のリファレンススペクトルｒｉを波長方向にかけて間引きラインの分だけ並進させたものである。以下、本手順で取得されたＭ×Ｎ個のリファレンススペクトルをまとめて、次式のとおり行列Ｓで表す。
【００６８】
【数１】
【００６９】
（ｄ）コントロールユニット３０は、手順（ｂ）で得られた合成スペクトルの横軸である画素番号Ｙｃを、上述した式（４）により波長λへと変換する。但し、変換に当たり、式（４）における「ｙ」には、着目スキャン座標ｙｆの値が当てはめられる。これによって、コントロールユニット３０は、着目スキャン座標（ｘｆ，ｙｆ）に関する観測スペクトルを取得する。以下、この観測スペクトルを、次式のとおりベクトルIで表す。
【００７０】
【数２】
【００７１】
ここで、着目スキャン座標（ｘｆ，ｙｆ）に対するＭ×Ｎ個のリファレンススペクトルの各々の寄与率をｐ（１１），…，ｐ（１Ｎ），…，ｐ（Ｍ１），…，ｐ（ＭＮ）と表し、これらの寄与率ｐ（１１），…，ｐ（１Ｎ），…，ｐ（Ｍ１），…，ｐ（ＭＮ）をまとめて、次式のとおりベクトルＰで表す。
【００７２】
【数３】
【００７３】
この場合、本手順で取得されたベクトルＩと、手順（ｃ）で作成された行列Ｓと、ベクトルＰの関係は、次式（５）で表される。
【００７４】
Ｉ＝Ｓ・Ｐ…（５）
（ｅ）そこで、コントロールユニット３０は、手順（ｄ）で取得したベクトルＩと、手順（ｃ）で作成した行列Ｓと、次式（６）とに基づく最小二乗法により、ベクトルＰの値を既知とする。
【００７５】
Ｐ＝（ＳｔＳ）−１ＳｔＩ…（６）
但し、［Ａ］ｔはＡの転置行列である。上述したとおり、この処理における未知数の個数、すなわちベクトルＰの要素数（Ｎ×Ｍ）は、この処理における方程式の個数Ｌより少ないので、この処理によれば、着目スキャン座標（ｘｆ，ｙｆ）に対する寄与率ｐ（１１），…，ｐ（１Ｎ），…，ｐ（Ｍ１），…，ｐ（ＭＮ）の各値が全て既知となる（以上、着目スキャン座標に関するアンミックス方法）。
【００７６】
以上、本実施形態のコントロールユニット３０は、蛍光色素のリファレンススペクトルを予め記憶し、それに基づき各スキャン位置に対する蛍光色素の寄与率を求めるので、画像取り込みの頻度を、１ライン毎ではなく１フレーム毎にすることができる。よって、必要な画像を取得するまでの所要時間を短縮することができる。
なお、本装置では、分光素子１８で反射した正反射光を検出する専用の結像光学系及び撮像素子を用意しなくとも、アンミックスの過程で得られるスペクトルに基づき、撮像素子２１上における正反射光の到達位置を推定できるので、その位置に配置された画素の画素信号から正反射光の強度を検知することができる。
【００７７】
［変形例］
なお、上述した各実施形態では、分光素子１８として反射型の回折格子が使用されたが、透過型の回折格子が使用されてもよい。また、回折格子の代わりに、プリズム及び回折格子を組み合わせてなる光学素子や、プリズムの単体などが使用されてもよい。
【００７８】
また、上述した各実施形態では、信号光の検出原理を二光子励起蛍光としたが、非線形顕微鏡の他の検出原理、例えば、多光子励起蛍光、コヒーレントアンチストークスラマン散乱、コヒーレントストークスラマン散乱の何れかとしてもよい。
【００７９】
なお、信号光の検出原理をコヒーレントアンチストークスラマン散乱、コヒーレントストークスラマン散乱の何れかとした場合には、照明光の波長と信号光の波長とが近接する。この場合に、もしもバンドパスフィルタ１９によって余分な波長の光を完全にカットできなかったならば、余分な波長の光を空間的にカットするためのマスクを撮像素子２１の入射側に設けてもよい。
【符号の説明】
【００８０】
１２…フェムト秒パルスレーザ光源、１３…ビームエキスパンダ、１４…リレー光学系、１５…ダイクロイックミラー、１６…スキャナ、１７…対物レンズ、２００…分光検出部、１８…分光素子、１９…バンドパスフィルタ、２０…結像光学系、２１…撮像素子、１１…標本ステージ、３０…コントロールユニット
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二光子励起蛍光顕微鏡、コヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡（ＣＡＲＳ：Coherent anti-Stokes Raman scattering）などの非線形光学顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオ産業の勢いはとどまるところを知らず、とりわけ生体試料をターゲットとした三次元分解顕微鏡の需要は高まる一方である。その中でも共焦点蛍光顕微鏡は古くから現在に至るまで広く使われている。
通常の共焦点蛍光顕微鏡は、物体に照射する光（照明光）の強度と、物体で発生する光（信号光）の強度との関係が線形となる線形光学顕微鏡であるが、近年はその関係が非線形となる非線形光学顕微鏡の研究開発が盛んに行われている。
例えば、二光子励起蛍光顕微鏡（非特許文献１等を参照）は、長い波長の励起光（近赤外線）で蛍光物質を励起するので、被観察物の深部を観察することが可能である。
因みに、非線形光学顕微鏡へ分光機能を付加する場合には、検出側のピンホール（又はスリット）の後ろ側へ分光素子を配置し、分光素子で生じた各波長の回折光を互いに異なる受光素子で個別に検出すればよいと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Winfried Denk et al. "Two-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy", Science, New Series, Vol. 248, No. 4951(April 6, 1990), pp. 73-76
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、この分光方法では回折光が微弱となり、検出感度が不足する可能性の高いことが判明した。
【０００５】
そこで本発明は、検出感度の高い分光型の非線形光学顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の非線形顕微鏡を例示する一態様は、光源から発せられた照明光を物体上に集光する集光光学系と、前記物体へ向かう前記照明光の進路を時間変化させることにより前記照明光の集光点で前記物体上を二次元走査する走査手段と、前記物体から前記照明光の強度と非線形な強度で発せられる信号光による前記物体の像を、前記走査手段を介することなく形成する結像光学系と、前記結像光学系の像面に二次元配置された受光素子アレイと、前記受光素子アレイに向かう前記信号光を前記二次元走査の副走査方向にかけて分光する分光手段とを備える。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、検出感度の高い分光型の非線形光学顕微鏡が実現する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】二光子励起蛍光顕微鏡装置の構成図。
【図２】撮像素子２１上における各波長の回折光の入射領域を示す図。
【図３】スキャン時における入射領域Ａｓの移動パターンを示す図。
【図４】或るラインに対するｘスキャン時の入射領域Ａｓの軌跡Ｔと、次のラインに対するｘスキャン時の入射領域Ａｓの軌跡Ｔ’とを示す図。
【図５】第１実施形態のコントロールユニット３０の動作フローチャート。
【図６】ステップＳ１９を説明する図。
【図７】第２実施形態のコントロールユニット３０の動作フローチャート。
【図８】ステップＳ１９’を説明する図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態として分光型の二光子励起蛍光顕微鏡装置を説明する。
【００１０】
図１は、本装置の構成図である。図１に示すとおり本装置には、フェムト秒パルスレーザ光源１２と、ビームエキスパンダ１３と、スキャナ１６と、ダイクロイックミラー１５と、リレー光学系１４Ａと、対物レンズ１７と、標本ステージ１１と、リレー光学系１４Ｂと、分光検出部２００と、コントロールユニット３０とが備えられる。
【００１１】
ステージ１１には標本１０Ａが載置される。標本１０Ａは、蛍光色素により標識された細胞試料である。ここでは、その蛍光色素の励起波長（一光子励起により励起する波長）を４０５ｎｍとし、その蛍光色素の蛍光波長を５００ｎｍ及びその近傍とする。それに対応するべくフェムト秒パルスレーザ光源１２は、照明光として、中心波長が８１０ｎｍであるフェムト秒パルスレーザ光を例えば１００ｋＨｚの周波数で射出する。
【００１２】
フェムト秒パルスレーザ光源１２から射出した照明光は、ビームエキスパンダ１３により径の太い光束に変換され、スキャナ１６、ダイクロイックミラー１５、リレー光学系１４Ａ、対物レンズ１７を順に介した後、標本１０Ａに向けて集光する。なお、ダイクロイックミラー１５の特性は、波長が８１０ｎｍ及びその近傍である光を反射し、波長が５００ｎｍ及びその近傍である光を透過する特性に設定されている。
【００１３】
標本１０Ａにおいて、照明光の照射領域（レーザスポット）の中央に位置する微小領域では、蛍光分子が二光子励起され、波長が５００ｎｍ及びその近傍である蛍光（二光子励起蛍光）が発生する。この二光子励起蛍光が本装置の信号光である。レーザスポットの中央から外れた領域では、二光子励起が生じないので、蛍光は発生しない。なお、レーザスポットのサイズは、対物レンズ１７のＮＡが大きいほど小さくなり、それに伴い、前記した微小領域のサイズも小さくなる。
【００１４】
レーザスポットの微小領域で発生した二光子励起蛍光は、そのレーザスポットを形成した照明光の光路を逆向きに辿り、対物レンズ１７、リレー光学系１４Ａを通過後、ダイクロイックミラー１５を透過し、リレー光学系１４Ｂを介して分光検出部２００へ入射する。
【００１５】
分光検出部２００には、分光素子１８と、バンドパスフィルタ１９と、結像光学系２０と、撮像素子２１とがこの順で配置される。分光検出部２００の入射部には、ピンホールやスリットが設けられていない。
【００１６】
分光素子１８は、反射型の一次元回折格子であり、対物レンズ１７の瞳と共役な位置に配置される。分光素子１８は、リレー光学系１４Ｂの側から入射した二光子励起蛍光を各波長の回折光（一次回折光）に分離する。
【００１７】
バンドパスフィルタ１９は、分光素子１８から撮像素子２１に向けて不要な光が入射するのを防ぐ。ここでは、本装置の観察対象波長域を４００〜５８０ｎｍとし、バンドパスフィルタ１９の特性は、その波長域の光を透過し、他の波長域の光をカットする特性に設定されるものとする。
【００１８】
結像光学系２０は、対物レンズ１７及びリレー光学系１４Ｂと共に、撮像素子２１と標本１０Ａとを共役に結ぶ働きがある。分光素子１８から結像光学系２０へ入射した各波長の回折光は、結像光学系２０を通過した後、撮像素子２１上の互いに異なる位置へ入射する。なお、ここでは、結像光学系２０の焦点距離ｆを６０ｍｍとし、標本１０Ａから撮像素子２１までの全光学系の倍率Ｍを３０倍とする。
【００１９】
撮像素子２１は、二次元的に画素を配置した電子増倍ＣＣＤ（ＥＭ−ＣＣＤ）である。撮像素子２１は、電子シャッター又はメカシャッターを備え、そのシャッターはコントロールユニット３０によって駆動される。シャッターの開閉により、撮像素子２１の電荷蓄積タイミングは制御される。この制御により撮像素子２１が生成した画像（画像信号）は、コントロールユニット３０に取り込まれる。なお、ここでは、撮像素子２１の画素ピッチＰＣＣＤを８μｍとし、撮像素子２１の有効画素数を１０２４ｘ１０２４とする。
【００２０】
スキャナ１６には、１対のガルバノミラー（主走査用のｘスキャンミラー１６ｘ、副走査用のｙスキャンミラー１６ｙ）が、互いの回転軸が直交する姿勢関係で配置されている。このスキャナ１６は、コントロールユニット３０によって駆動される。
【００２１】
ｘスキャンミラー１６ｘが駆動されると、レーザスポットが標本１０Ａ上を所定方向（ｘ方向）へスキャン（ｘスキャン）する。また、スキャナ１６のｙスキャンミラー１６ｙが駆動されると、レーザスポットが標本１０Ａ上をｘ方向と垂直な方向（ｙ方向）へスキャン（ｙスキャン）する。よって、スキャナ１６がｘスキャンミラー１６ｘの角度を１往復させる毎にｙスキャンミラー１６ｙの角度を１ピッチ分ずつ変化させれば、レーザスポットで標本１０Ａ上を二次元的にスキャンすることができる。なお、ここでは、レーザスポットによる全スキャン領域（実視野）のサイズを、０．２×０．２ｍｍとする。
【００２２】
以上の構成では、標本１０Ａの側から分光検出部２００へ向かう二光子励起蛍光は、スキャナ１６を経由しない。さらに、ピンホールも用意されておらず、これによって減衰することもない。したがって、分光検出部２００へ入射する二光子励起蛍光の強度は、高く保たれる。但し、分光検出部２００へ入射する二光子励起蛍光がスキャナ１６を経由していない場合、分光素子１８に対する二光子励起蛍光の入射角度がスキャンに伴い変化する可能性がある。
【００２３】
それに対処するため、本装置では、分光素子１８の格子方向は、ｘスキャンに対応する方向に設定される。この場合、回折光の分岐方向は、ｙスキャンに対応する方向となる。なお、ここでは、分光素子１８の溝本数を１００本／ｍｍ（ピッチＰは１００μｍ）とする。
【００２４】
また、分光素子１８の配置姿勢は、ｙ方向のスキャン位置（スキャン座標ｙ）が全スキャン領域の中心にあるときにおける二光子励起蛍光の入射角度α０が４５°になるように設定される。
【００２５】
また、結像光学系２０の光軸方向は、スキャン座標ｙが全スキャン領域の中心にあるときに分光素子１８で発生する基準波長の回折光（ここでは波長５００ｎｍの回折光とする。）の進行方向と同じに設定される。なお、分光素子１８の配置姿勢及び溝本数が前述したとおりであった場合には、分光素子１８から射出する基準波長の回折光の出射角度φ０は、４９．２°となる。
【００２６】
図２は、撮像素子２１に対する各波長の回折光の入射領域Ａｓを示す図である（なお、図２では、スキャン位置が全スキャン領域の中心であるときの様子を示している。）。前述したとおり回折光の分岐方向はｙ方向に対応する方向（Ｙ方向）なので、入射領域ＡｓはＹ方向に長い領域となる。この入射領域Ａｓの中央が、基準波長の回折光の入射位置である。因みに、分光素子１８のピッチＰ、結像光学系の焦点距離ｆ、撮像素子２１の画素ピッチＰＣＣＤがそれぞれ前述した値に設定された場合、入射領域ＡｓのＹ方向の長さは約２００画素分になる。
【００２７】
また、入射領域Ａｓは、ｘスキャンに伴いそれに対応する方向（Ｘ方向）へ移動するが、入射領域Ａｓの長手方向はＹ方向なので、１ライン分のｘスキャン中には、同一画素へ互いに異なるスキャン位置からの二光子励起蛍光が重畳して入射する可能性は無い。
【００２８】
図３は、スキャン時における入射領域Ａｓの移動パターンを示す図である。図３に示したとおり入射領域Ａｓは、ｘスキャンに伴いＸ方向へ移動し、ｙスキャンに伴いＹ方向へ移動する（なお、ｙスキャンに伴い入射領域ＡｓのＹ方向の長さも若干変化する。また、点線で示した移動軌跡は、照明光がオフにされている期間の移動軌跡である。）。その結果、入射領域Ａｓは、全スキャン領域に対応する領域Ａ１内を二次元的に移動する（以下、この領域Ａ１を「全入射領域Ａ１」と称す。）。
【００２９】
但し、ｙスキャンのピッチは、撮像素子２１の１〜２画素分に相当し、入射領域ＡｓのＹ方向の長さより短い。よって、図４に示すとおり、或るラインに対するｘスキャン時の入射領域Ａｓの軌跡Ｔと、次のラインに対するｘスキャン時の入射領域Ａｓの軌跡Ｔ’とは、重複する。よって、或るラインに対するｘスキャンと次のラインに対するｘスキャンとを連続して行うと、同一画素へ互いに異なるスキャン位置からの二光子励起蛍光が重畳して入射する。
【００３０】
そこで、本実施形態のコントロールユニット３０は、１ライン分のｘスキャンを行う毎に撮像素子２１から画像を取り込む（詳細は後述）。
【００３１】
以下、標本１０Ａの上のスキャン位置（スキャン座標（ｘ，ｙ））と、撮像素子２１上の回折光の入射位置（ＣＣＤ座標（Ｘ，Ｙ））との関係を説明する。なお、ここでは、スキャン座標（ｘ，ｙ）の原点を全スキャン領域（実視野）の中心に採り、ＣＣＤ座標（Ｘ，Ｙ）の原点を全入射領域Ａ１の中心に採る。
【００３２】
先ず、スキャン座標ｘとＣＣＤ座標Ｘとの関係は、波長λに依存せず、以下の式（１）で表される。
【００３３】
Ｘ＝ｘＭ…（１）
一方、スキャン座標ｙとＣＣＤ座標Ｙとの関係は、波長λに依存し、以下の式（２）で表される。
【００３４】
Ｙ=ｆｓｉｎ（ｓｉｎ−１（λ／Ｐ−ｓｉｎ（α０＋ｓｉｎ−１（ｙＭ／ｆ）））−φ０）…（２）
したがって、本実施形態のコントロールユニット３０は、撮像素子２１が生成した画像を、これらの式（１）、（２）に基づき処理する（詳細は後述）。
【００３５】
図５は、本実施形態のコントロールユニット３０の動作フローチャートである。以下、各ステップを順に説明する。
【００３６】
ステップＳ１１：コントロールユニット３０は、ｙスキャンミラー１６ｙの角度設定により、スキャン座標ｙを初期値ｙ１（全スキャン領域の端）に設定する。
【００３７】
ステップＳ１２：コントロールユニット３０は、ｘスキャンミラー１６ｘの角度設定により、スキャン座標ｘを初期値ｘ１（全スキャン領域の端）に設定する。
【００３８】
ステップＳ１３：コントロールユニット３０は、撮像素子２１のシャッターを開放する。
【００３９】
ステップＳ１４：コントロールユニット３０は、ｘスキャンミラー１６ｘを駆動し、ｘスキャンを１ライン分だけ行う。
【００４０】
ステップＳ１５：コントロールユニット３０は、撮像素子２１のシャッターを閉鎖する。
【００４１】
ステップＳ１６：コントロールユニット３０は、撮像素子２１から画像を読み出し、その画像を、現在のスキャン座標ｙに対応付けてコントロールユニット３０内のメモリへ格納する。
【００４２】
ステップＳ１７：コントロールユニット３０は、全スキャン領域のスキャンが終了したか否か（スキャン座標ｙが最終値ｙｅｎｄになったか否か）を判別し、終了していない場合にはステップＳ１８へ移行し、終了した場合にはステップＳ１９へ移行する。
【００４３】
ステップＳ１８：コントロールユニット３０は、ｙスキャンミラー１６ｙの角度調整によりスキャン座標ｙを次の値に変更してからステップＳ１２に戻る。よって、ステップＳ１２〜Ｓ１６は、スキャン座標ｙが最終値ｙｅｎｄになるまで繰り返され、コントロールユニット３０のメモリには、図６（Ａ）に示すとおりスキャン座標ｙの設定数と同数の画像が格納されることになる。これらの画像は、スキャン座標ｙが初期値ｙ１であったときの画像Ｉ１、スキャン座標ｙが２番目の値ｙ２であったときの画像Ｉ２、スキャン座標ｙが３番目の値ｙ３であったときの画像Ｉ３、…、及びスキャン座標ｙが最終値ｙｅｎｄであったときの画像Ｉｅｎｄである。
【００４４】
ステップＳ１９：コントロールユニット３０は、メモリに格納された複数の画像Ｉ１〜Ｉｅｎｄに基づき、全スキャン位置における二光子励起蛍光のスペクトルを算出する。これによって、標本１０Ａの蛍光スペクトル画像が得られたことになる。なお、本ステップにおけるスペクトルの算出はスキャン座標毎に行われ、個々の着目スキャン座標（ｘｆ，ｙｆ）に関するスペクトルの算出は、次の手順（ａ）〜（ｅ）によって行われる。
【００４５】
（ａ）コントロールユニット３０は、図６（Ａ）に示すとおり、画像Ｉ１〜Ｉｅｎｄの中から着目スキャン座標ｙｆに対応する画像（着目画像）Ｉｆを参照する。
【００４６】
（ｂ）コントロールユニット３０は、ｘ方向の着目スキャン座標ｘｆを、撮像素子２１上のＸ方向の画素番号Ｘｃｆへ変換する。なお、ｘ方向のスキャン座標ｘからＸ方向の画素番号Ｘｃへの変換は、上述した式（１）から導出された次式（３）によって行われる。
【００４７】
Ｘｃ＝ｘＭ／ＰＣＣＤ…（３）
（ｃ）コントロールユニット３０は、図６（Ｂ）に示すとおり、着目画像ＩｆのうちＸ方向の画素番号がＸｃｆである複数の画素信号（画素信号列）を参照する。この画素信号列は、図６（Ｃ）に示すとおり、着目スキャン座標（ｘｆ，ｙｆ）で発生した二光子励起蛍光のスペクトルを表している。但し、図６（Ｃ）に示すスペクトルの横軸は画素番号Ｙｃであるので、正確なスペクトルを知るためには、画素番号Ｙｃを波長λに変換する必要がある。
【００４８】
（ｄ）そこで、コントロールユニット３０は、そのスペクトルの横軸である画素番号Ｙｃを波長λへと変換する。その変換は、上述した式（２）から導出された次式（４）によって行われる。但し、変換に当たり、式（４）における「ｙ」には、着目スキャン座標ｙｆの値が当てはめられる。
【００４９】
λ＝Ｐ（ｓｉｎ（ｓｉｎ−１ （ＹｃＰＣＣＤ／ｆ）＋φ０）＋ｓｉｎ（α０＋ｓｉｎ−１（ｙＭ／ｆ）））…（４）
（ｅ）さらに、コントロールユニット３０は、変換後のスペクトルのうち、本装置の観察対象波長域（４００〜５８０ｎｍ）から外れた部分を削除する。その結果、図６（Ｄ）に示すとおり、着目スキャン座標（ｘｆ，ｙｆ）で発生した二光子励起蛍光のスペクトルが得られる（以上、着目スキャン座標に関するスペクトルの算出方法）。
【００５０】
以上、本装置の分光検出部２００は、標本１０Ａから発せられる二光子励起蛍光による標本１０Ａの像を、スキャナ１６、および、分光機能を持った従来の二光子蛍光顕微鏡に備えられているピンホールを介さずに形成するので、光量ロスが無い分だけ分光検出感度は高い。
【００５１】
但し、スキャナ１６を介さずに分光検出を行うと、分光検出部２００に対する二光子励起蛍光の入射位置は、スキャンに伴い移動してしまう。
【００５２】
そこで、本装置の分光検出部２００の分光素子１８は、撮像素子２１に向かう二光子励起蛍光の分岐方向を、ｘスキャンの方向ではなくｙスキャンの方向としている。この場合、少なくとも１回のｘスキャン中に撮像素子２１の同一画素へ互いに異なるスキャン位置からの二光子励起蛍光が入射することはない。
【００５３】
よって、本実施形態のコントロールユニット３０は、１ライン分のｘスキャンを行う毎に撮像素子２１から画像を取り込むという簡単な手順を踏むだけで、蛍光スペクトル画像を確実に取得することができる。
【００５４】
また、本装置の分光検出部２００は、ピンホールやスリットを設けていないので、ピンホールやスリットでの光量ロスが無い分だけ分光検出感度は高い。しかも、非線形顕微鏡である本装置の空間解像度は対物レンズ１７のＮＡによってほぼ決まるので、分光検出部２００にピンホールやスリットが設けられなくとも、空間解像度は低下しない。
【００５５】
なお、本装置では、コントロールユニット３０が標本ステージ１１を光軸方向へ上下動させながら上述したステップＳ１１〜Ｓ１９を繰り返せば、標本１０Ａの三次元蛍光スペクトル画像を取得することもできる。
【００５６】
また、本装置では、撮像素子２１の位置や姿勢が不変であったので、ｙスキャン時に入射領域ＡｓのＹ方向の位置が変位したが、ｙスキャン時に撮像素子２１を−Ｙ方向へ並進させることにより、入射領域ＡｓのＹ方向の位置を不変としてもよい。この場合、撮像素子２１のＹ方向の長さを、入射領域ＡｓのＹ方向の長さと同程度にまで短縮することができるので効率的である。また、その場合は、全スキャン位置における二光子励起蛍光のスペクトルを算出する際にスキャン座標ｙを考慮する必要が無くなるので、処理が簡略化される。なお、撮像素子２１を並進させる代わりに、撮像素子２１に対する基準波長の回折光のＹ方向の入射位置が不変となるよう、分光素子１８を回動させてもよい。
【００５７】
また、本装置の分光検出部２００は、分光素子１８で発生した回折光を検出し、分光素子１８で発生した正反射光を検出しなかったが、結像光学系及び撮像素子を正反射光の発生方向にも設置し、蛍光スペクトル画像と同時に非分光の蛍光画像を取得してもよい。
【００５８】
［第２実施形態］
以下、本発明の第２実施形態として分光型の二光子励起蛍光顕微鏡装置を説明する。ここでは、第１実施形態との相違点のみを説明する。相違点は、標本１０Ａを標識した複数種類の蛍光色素を同時に励起する点と、コントロールユニット３０の動作とにある。
【００５９】
ここでは、蛍光色素の種類をＭ種類とし、フェムト秒パルスレーザ光源１２は、それらの蛍光色素の各々を二光子励起するＭ種類の照明光を同時に出射するものとする。また、本実施形態の標本像において、個々の蛍光輝点は互いに近接しておらず、点在しているとみなせると仮定する。また、コントロールユニット３０は、Ｍ種類の蛍光色素の各々のリファレンススペクトルｒ１，…，ｒＭを予め記憶しているものとする。
【００６０】
さらに、本実施形態では、後述のアンミックスを可能とするために、Ｙ方向のスキャンピッチは、標本１０Ａ上を密にスキャンするためのスキャンピッチ（基準ピッチ）の整数倍（Ｎ倍）に設定され、Ｎは、蛍光色素の種類数Ｍ以上に設定される。
【００６１】
但し、この場合は、或るスキャンラインと次のスキャンラインとの間に（Ｎ−１）本の間引きラインが生じることになるので、データの欠けを防ぐため、標本１０Ａのスキャンは、スキャンの開始ラインを１ラインずつずらしながらＮ回繰り返されることが望ましい。なお、各回のスキャンで得られた各画像に対する処理は共通なので、ここでは、或る１回のスキャンに関する処理のみに着目して説明する。
【００６２】
図７は、本実施形態のコントロールユニット３０の動作フローチャートである。
【００６３】
図７を図５と比較すると明らかなとおり、本実施形態のコントロールユニット３０は、シャッター閉鎖及び画像の読み出し（ステップＳ１５及びステップＳ１６）を、全スキャン領域のスキャンが終了した後（ステップＳ１７の後段）に行う。よって、本実施形態で取得される画像の枚数は１となる。この画像の個々の画素には、互いに異なるスキャン位置からの二光子励起蛍光が入射している可能性がある。
【００６４】
また、図７を図５と比較すると明らかなとおり、本実施形態のコントロールユニット３０は、蛍光スペクトル画像を算出する（ステップ１９）代わりに、アンミックスを行う（ステップＳ１９’）。ステップＳ１９’におけるアンミックスは、スキャン座標毎に行われ、或る１つの着目スキャン座標（ｘｆ，ｙｆ）に関するアンミックスは、次の手順（ａ）〜（ｅ）によって行われる。
【００６５】
（ａ）コントロールユニット３０は、ｘ方向の着目スキャン座標ｘｆを、上述した式（３）により撮像素子２１上のＸ方向の画素番号Ｘｃｆへと変換する。
【００６６】
（ｂ）コントロールユニット３０は、メモリに格納された画像のうち、Ｘ方向の画素番号がＸｃｆである複数の画素信号（画素信号列）を参照する。この画素信号列は、図８（Ａ）に示すとおり、スキャン座標ｘｆを通りｙ方向に延びるＬ画素分の窓に関する輝度プロファイルであって、この窓内に存在する複数の蛍光輝点の各々から発現した蛍光スペクトルを、図８（Ｂ）に示すとおり加算したもの（合成スペクトル）である。但し、Ｌは十分に大きく、Ｌ≧Ｍ×Ｎを満たす。なお、本実施形態のスキャンではスキャンピッチが基準ピッチのＮ倍に設定されたので、この合成スペクトルに寄与する複数の蛍光輝点同士は、少なくともＮライン分は離れているはずである。
【００６７】
（ｃ）コントロールユニット３０は、図８（Ｃ）に示すようなＭ種類の蛍光色素のリファレンススペクトルｒ１，…，ｒＭの各々から、図８（Ｄ）に示すとおりＮ個のリファレンススペクトルを作成し、合計でＭ×Ｎ個のリファレンススペクトルを取得する。ここで、ｉ番目の蛍光色素に関するＮ個のリファレンススペクトルは、その蛍光色素のリファレンススペクトルｒｉを波長方向にかけて間引きラインの分だけ並進させたものである。以下、本手順で取得されたＭ×Ｎ個のリファレンススペクトルをまとめて、次式のとおり行列Ｓで表す。
【００６８】
【数１】
【００６９】
（ｄ）コントロールユニット３０は、手順（ｂ）で得られた合成スペクトルの横軸である画素番号Ｙｃを、上述した式（４）により波長λへと変換する。但し、変換に当たり、式（４）における「ｙ」には、着目スキャン座標ｙｆの値が当てはめられる。これによって、コントロールユニット３０は、着目スキャン座標（ｘｆ，ｙｆ）に関する観測スペクトルを取得する。以下、この観測スペクトルを、次式のとおりベクトルIで表す。
【００７０】
【数２】
【００７１】
ここで、着目スキャン座標（ｘｆ，ｙｆ）に対するＭ×Ｎ個のリファレンススペクトルの各々の寄与率をｐ（１１），…，ｐ（１Ｎ），…，ｐ（Ｍ１），…，ｐ（ＭＮ）と表し、これらの寄与率ｐ（１１），…，ｐ（１Ｎ），…，ｐ（Ｍ１），…，ｐ（ＭＮ）をまとめて、次式のとおりベクトルＰで表す。
【００７２】
【数３】
【００７３】
この場合、本手順で取得されたベクトルＩと、手順（ｃ）で作成された行列Ｓと、ベクトルＰの関係は、次式（５）で表される。
【００７４】
Ｉ＝Ｓ・Ｐ…（５）
（ｅ）そこで、コントロールユニット３０は、手順（ｄ）で取得したベクトルＩと、手順（ｃ）で作成した行列Ｓと、次式（６）とに基づく最小二乗法により、ベクトルＰの値を既知とする。
【００７５】
Ｐ＝（ＳｔＳ）−１ＳｔＩ…（６）
但し、［Ａ］ｔはＡの転置行列である。上述したとおり、この処理における未知数の個数、すなわちベクトルＰの要素数（Ｎ×Ｍ）は、この処理における方程式の個数Ｌより少ないので、この処理によれば、着目スキャン座標（ｘｆ，ｙｆ）に対する寄与率ｐ（１１），…，ｐ（１Ｎ），…，ｐ（Ｍ１），…，ｐ（ＭＮ）の各値が全て既知となる（以上、着目スキャン座標に関するアンミックス方法）。
【００７６】
以上、本実施形態のコントロールユニット３０は、蛍光色素のリファレンススペクトルを予め記憶し、それに基づき各スキャン位置に対する蛍光色素の寄与率を求めるので、画像取り込みの頻度を、１ライン毎ではなく１フレーム毎にすることができる。よって、必要な画像を取得するまでの所要時間を短縮することができる。
なお、本装置では、分光素子１８で反射した正反射光を検出する専用の結像光学系及び撮像素子を用意しなくとも、アンミックスの過程で得られるスペクトルに基づき、撮像素子２１上における正反射光の到達位置を推定できるので、その位置に配置された画素の画素信号から正反射光の強度を検知することができる。
【００７７】
［変形例］
なお、上述した各実施形態では、分光素子１８として反射型の回折格子が使用されたが、透過型の回折格子が使用されてもよい。また、回折格子の代わりに、プリズム及び回折格子を組み合わせてなる光学素子や、プリズムの単体などが使用されてもよい。
【００７８】
また、上述した各実施形態では、信号光の検出原理を二光子励起蛍光としたが、非線形顕微鏡の他の検出原理、例えば、多光子励起蛍光、コヒーレントアンチストークスラマン散乱、コヒーレントストークスラマン散乱の何れかとしてもよい。
【００７９】
なお、信号光の検出原理をコヒーレントアンチストークスラマン散乱、コヒーレントストークスラマン散乱の何れかとした場合には、照明光の波長と信号光の波長とが近接する。この場合に、もしもバンドパスフィルタ１９によって余分な波長の光を完全にカットできなかったならば、余分な波長の光を空間的にカットするためのマスクを撮像素子２１の入射側に設けてもよい。
【符号の説明】
【００８０】
１２…フェムト秒パルスレーザ光源、１３…ビームエキスパンダ、１４…リレー光学系、１５…ダイクロイックミラー、１６…スキャナ、１７…対物レンズ、２００…分光検出部、１８…分光素子、１９…バンドパスフィルタ、２０…結像光学系、２１…撮像素子、１１…標本ステージ、３０…コントロールユニット
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源から発せられた照明光を物体上に集光する集光光学系と、
前記物体へ向かう前記照明光の進路を時間変化させることにより前記照明光の集光点で前記物体上を二次元走査する走査手段と、
前記物体から前記照明光の強度と非線形な強度で発せられる信号光による前記物体の像を、前記走査手段を介することなく形成する結像光学系と、
前記結像光学系の像面に二次元配置された受光素子アレイと、
前記受光素子アレイに向かう前記信号光を前記二次元走査の副走査方向にかけて分光する分光手段と、
を備えることを特徴とする非線形光学顕微鏡。
【請求項２】
請求項１に記載の非線形光学顕微鏡において、
前記二次元走査の主走査が行われる毎に前記受光素子アレイから信号群を読み出す読み出し手段と、
前記二次元走査が行われる毎に前記読み出し手段が読み出した複数組みの信号群に基づき、前記物体上の各走査位置で発せられた信号光のスペクトルを求める演算手段と
を更に備えたことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
【請求項３】
請求項１に記載の非線形光学顕微鏡において、
前記二次元走査が行われる毎に前記受光素子アレイから信号群を読み出す読み出し手段と、
前記読み出し手段が読み出した前記信号群と、前記信号光の発光元となった物質の特性情報とに基づき、前記物体上の各走査位置に対する前記物質の寄与率を求める演算手段と
を更に備えたことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
【請求項４】
請求項１〜請求項３の何れか一項に記載の非線形光学顕微鏡において、
前記分光手段は、
プリズム、回折格子の少なくとも一方を含む
ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
【請求項５】
請求項１〜請求項４の何れか一項に記載の非線形光学顕微鏡において、
前記信号光の検出原理は、
多光子励起蛍光、コヒーレントアンチストークスラマン散乱、コヒーレントストークスラマン散乱の少なくとも１つである
ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
【請求項１】
光源から発せられた照明光を物体上に集光する集光光学系と、
前記物体へ向かう前記照明光の進路を時間変化させることにより前記照明光の集光点で前記物体上を二次元走査する走査手段と、
前記物体から前記照明光の強度と非線形な強度で発せられる信号光による前記物体の像を、前記走査手段を介することなく形成する結像光学系と、
前記結像光学系の像面に二次元配置された受光素子アレイと、
前記受光素子アレイに向かう前記信号光を前記二次元走査の副走査方向にかけて分光する分光手段と、
を備えることを特徴とする非線形光学顕微鏡。
【請求項２】
請求項１に記載の非線形光学顕微鏡において、
前記二次元走査の主走査が行われる毎に前記受光素子アレイから信号群を読み出す読み出し手段と、
前記二次元走査が行われる毎に前記読み出し手段が読み出した複数組みの信号群に基づき、前記物体上の各走査位置で発せられた信号光のスペクトルを求める演算手段と
を更に備えたことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
【請求項３】
請求項１に記載の非線形光学顕微鏡において、
前記二次元走査が行われる毎に前記受光素子アレイから信号群を読み出す読み出し手段と、
前記読み出し手段が読み出した前記信号群と、前記信号光の発光元となった物質の特性情報とに基づき、前記物体上の各走査位置に対する前記物質の寄与率を求める演算手段と
を更に備えたことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
【請求項４】
請求項１〜請求項３の何れか一項に記載の非線形光学顕微鏡において、
前記分光手段は、
プリズム、回折格子の少なくとも一方を含む
ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
【請求項５】
請求項１〜請求項４の何れか一項に記載の非線形光学顕微鏡において、
前記信号光の検出原理は、
多光子励起蛍光、コヒーレントアンチストークスラマン散乱、コヒーレントストークスラマン散乱の少なくとも１つである
ことを特徴とする非線形光学顕微鏡。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１０−２７１５２２（Ｐ２０１０−２７１５２２Ａ）
【公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１２２９３２（Ｐ２００９−１２２９３２）
【出願日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]