食中毒細菌の同時培養方法、及び検出方法
【課題】食中毒細菌を簡易かつ迅速に検出するために、主要な食中毒細菌を含む複数属の好気性細菌を同時に培養可能な細菌培養方法と、当該培養方法を用いた迅速な細菌検出方法を提供する。また、複数の菌属の好気性細菌を同時に培養できる増菌培地を提供する。
【解決方法】培養中の増菌培地のｐＨ値を５より大きく１０以下の範囲内に保持することで、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属とＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌の同時培養を一の増菌培地中で可能にする。さらに、増菌培地の塩濃度を１％〜４％とすることでＶｉｂｒｉｏ属の好気性・好塩性細菌の同時培養も可能にする。また、当該細菌培養方法とリアルタイムＰＣＲ法とを組み合わせることで、複数属の細菌を同時に検出する。
【解決方法】培養中の増菌培地のｐＨ値を５より大きく１０以下の範囲内に保持することで、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属とＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌の同時培養を一の増菌培地中で可能にする。さらに、増菌培地の塩濃度を１％〜４％とすることでＶｉｂｒｉｏ属の好気性・好塩性細菌の同時培養も可能にする。また、当該細菌培養方法とリアルタイムＰＣＲ法とを組み合わせることで、複数属の細菌を同時に検出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数属の細菌を単一培地で同時に培養する方法と、その培養方法を利用した細菌検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食中毒細菌の検出は、食の安全を確保する上で重要な検査技術の一つである。そのため、食品業界などでは分子遺伝学的手法や免疫学的手法に基づいた各種食中毒細菌の簡易迅速検出方法の開発が進んでいる。中でも特定の細菌の遺伝子などに特異的な塩基配列を増幅して検出を行う核酸増幅法は、その感度や迅速性、並びに特異性の高さから現在様々な食中毒細菌検出法に応用されている。
【０００３】
しかし、核酸増幅法を利用した検査法であっても、鋳型としての核酸を必要量得るには一定以上の菌数が必要となる。当該検出に必要な菌数の下限値は約１×１０３ｃｆｕ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）／ｍｌであり、食品から細菌を高感度に検出するためにはほとんどの場合で標的細菌を培養する必要がある。ところが、一般に性状の異なる細菌は培養条件も異なることから、複数種の細菌を検出するためには、標的細菌ごとにその至適培養条件で培養しなければならない。そのため、食中毒細菌の検出方法の簡易化や迅速化には、当該培養に要する手間や培養時間が大きな問題となる。このような問題を解決する手段としては、複数の食中毒細菌を一の培地で同時に培養する方法が挙げられる。ただし、そのためには複数種若しくは複数属の細菌を同時に培養可能な増菌培地の開発が不可欠となってくる。
【０００４】
複数属の食中毒細菌を培養可能な増菌培地としては、これまでＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属とＬｉｓｔｅｒｉａ属の細菌を同時に培養可能なＵＥＢ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ）（非特許文献１）や、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを同時に培養する緩衝ペプトン水を用いた培地などが知られている（非特許文献２）。しかし、これらの増菌培地は、いずれも、２、３種の食中毒細菌を同時に培養できるに過ぎない。したがって、より多くの食中毒細菌を同時に培養可能な増菌培地が求められている。
【非特許文献１】Ｂａｉｌｅｙ ＪＳ & ＮＡＣｏｘ ＮＡ，（１９９２）Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔ．，５５；２５６−２５９
【非特許文献２】Ａｌａｒｃｏｎ Ｂ，Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｎａｓ Ｖ，Ｃｉｆｕｅｎｔｅｓ Ａ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｒ & Ａｚｎａｒ Ｒ（２００４）Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．,５２；７１８０−７１８６
【非特許文献３】Ｎａｋａｔａ ＨＭ & Ｈａｌｖｏｒｓｏｎ ＨＯ，（１９６０）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，８０；８０１−８１０
【非特許文献４】Ｂｕｄｕ−Ａｍｏａｋｏ Ｅ，Ｔｏｏｒａ Ｓ，Ａｂｌｅｔｔ ＲＦ & Ｓｍｉｔｈ J，（１９９２）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５８；３１７７−３１７９
【非特許文献５】Ｂｕｓｃｈ ＳＶ & Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ＣＷ，（１９９２）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５８；１４−２０
【非特許文献６】大野茂男、西村善文 監修、（１９９７）細胞工学 別冊 実験プロトコールシリーズ タンパク実験プロトコール
【非特許文献７】Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．
【非特許文献８】Ｐｒｉｅｓｔ ＦＧ，Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ Ｍ，Ｔｏｄｄ Ｃ，（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３４；１８４７−１８８２
【非特許文献９】Ｓｅｅｌｉｇｅｒ ＨＰＲ & Ｊｏｎｅｓ Ｄ，（１９８６）Ｇｅｎｕｓ Ｌｉｓｔｅｒｉａｓ，Ｉｎ Ｂｅｒｇｅｙ’Ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ２， ｅｄ． Ｂｙ Ｓｎｅａｔｈ ＰＨＡ，ｐｐ１２３５−１２４５，Ｗｉｌｌｉａｍｓ & Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，ＵＳＡ．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、食中毒細菌を簡易かつ迅速に検出するために、主要な食中毒細菌が属する複数属の好気性細菌を同時に培養可能な細菌培養方法と、当該培養方法を用いた迅速な細菌検出方法を提供することである。また、複数の菌属の好気性細菌を同時に培養できる増菌培地を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明者らは主要な食中毒細菌が属する複数属の好気性細菌を同時に培養できる培養条件について研究を行った。本願の発明は、かかる研究結果に基づくものであり、以下の細菌培養方法、細菌検出方法、増菌培地、細菌検出用キットに関するものである。
【０００７】
本願第１の発明は、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を一の増菌培地中で同時に培養可能な細菌培養方法であって、増菌培地のｐＨ値を５より大きく１０以下に保持して培養する細菌培養方法である。
【０００８】
本願第２の発明は、さらに、Ｖｉｂｒｉｏ属の好気性・好塩性細菌を一の増菌培地中で同時に培養可能な細菌培養方法であって、増菌培地の塩濃度が水を溶媒として質量対容量百分率で１％〜４％であることを特徴とする第１の発明に記載の細菌培養方法である。
【０００９】
本願第３の発明は、増菌培地が水を溶媒として糖の含有率を質量対容量百分率で０．００１％以下とすることを特徴とする第１の発明又は第２の発明に記載の細菌培養方法である。
【００１０】
本願第４の発明は、増菌培地が水を溶媒として質量対容量百分率で、ペプトン：１％〜３％、リン酸二カリウム：０．１５％〜０．３５％、塩化ナトリウム：１％〜４％、及び酵母エクストラクト：０．０１％〜０．１％、よりなることを特徴とする第３の発明に記載の細菌培養方法である。
【００１１】
本願第５の発明は、少なくともＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属のうち、二以上の属の好気性細菌を同時に検出できる細菌検出方法であって、第１の発明から第４の発明のいずれか一に記載の細菌培養方法で培養する培養工程と、培養工程後に得られる細菌から所望の細菌を検出する検出工程と、を有する細菌検出方法である。
【００１２】
本願第６の発明は、検出工程が、さらに、培養工程後に得られる菌体から核酸を抽出する核酸抽出工程と、核酸抽出工程で得られる核酸に対して、所望の細菌のゲノムＤＮＡ上でその細菌に特有な塩基配列を認識するオリゴヌクレオチドを用いて所望の細菌を検出する核酸検出工程と、を有する第５の発明に記載の細菌検出方法である。
【００１３】
本願第７の発明は、核酸検出工程が、さらに、核酸抽出工程で得られる核酸を鋳型として、所望の細菌のゲノムＤＮＡ上でその細菌に特有な塩基配列を認識するオリゴヌクレオチドを用いて、核酸増幅法により所望の細菌の核酸を増幅する核酸増幅工程と、前記核酸増幅工程で増幅した核酸に基づいて所望の細菌を検出する増幅核酸検出工程と、を有する第６の発明に記載の細菌検出方法である。
【００１４】
本願第８の発明は、核酸増幅工程が二以上の細菌に対して、各細菌のゲノムＤＮＡ上でそれぞれの細菌に特有な塩基配列を認識するオリゴヌクレオチドを用いて、一の反応液中で同時にそれぞれの細菌の核酸を増幅する第７の発明に記載の細菌検出方法である。
【００１５】
本願第９の発明は、核酸検出工程がリアルタイムＰＣＲ法を用いる第７の発明、又は第８の発明に記載の細菌検出方法である。
【００１６】
本願第１０の発明は、核酸検出工程が前記所望の細菌のゲノムＤＮＡ上で、その細菌に特有な塩基配列を認識するオリゴヌクレオチドをプローブとしたハイブリダイゼーション法によって検出する第６の発明に記載の細菌検出方法である。
【００１７】
本願第１１の発明は、前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の各好気性細菌は、それぞれＳ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、及びＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである第５の発明から第１０の発明のいずれか一に記載の細菌検出方法である。
【００１８】
本願第１２の発明は、水を溶媒としたときの質量対容量百分率が、糖：０．００１％以下、ペプトン：１％〜３％、リン酸二カリウム：０．１５％〜０．３５％、塩化ナトリウム：１％〜４％、及び酵母エクストラクト：０．０１％〜０．１％となることを特徴とする増菌培地である。
【００１９】
本願第１３の発明は、前記ペプトンが自身の質量に対して１０％〜２０％のソイトンを含有することを特徴とする第１２の発明に記載の増菌培地である。
【００２０】
本願第１４の発明は、第１２の発明、又は第１３の発明に記載の増菌培地を含む細菌検出用キットである。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の細菌培養方法によれば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を単一の増菌培地で同時に培養できる。これによって、食中毒細菌の培養方法の簡易化、迅速化が図れる。また、それに伴って培地や培養装置、光熱費などの培養に要するコスト削減もできる。
【００２２】
本発明の細菌検出方法によれば、検査対象物から細菌を検出するまでの操作を簡易化できる。また、検出までに要する時間を短縮化できる。加えて、本発明の他の細菌検出法によれば、複数属の食中毒細菌を同時に検出できる。また、それによって、被検体からの細菌検出をより迅速に行える。
【００２３】
本発明の増菌培地によれば、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の細菌を同時に培養する際に、培養中も適正なｐＨ値を保持できる。それゆえ培養中に培地のｐＨ調節を行う必要がなくなり、培養操作の一層の簡易化、迅速化が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下で前記発明を実施するための最良の形態について説明する。ただし、本願の発明はこれらの実施形態に何ら限定されるものではなく、その作用効果を奏する範囲において種々なる態様で実施しうる。なお、実施形態１は、主に請求項１から４、及び請求項１２、１３に関する。また、実施形態２は主に請求項５から１１に関する。また、実施形態３は主に請求項１４に関する。
【００２５】
<<実施形態１>>
【００２６】
<実施形態１：概要>
実施形態１は、細菌培養方法、及び増菌培地に関する。本実施形態の細菌培養方法は、増菌培地のｐＨ値を５より大きく１０以下に保持して培養することで、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を同時に培養できることを特徴とする。また、本実施形態の増菌培地は、培養中に特段の操作を加えることなく、前記ｐＨ値を保持できることを特徴とする。
【００２７】
<実施形態１：発明に至る経緯>
本実施形態の細菌培養方法の詳細な説明に入る前に、まず、本発明に至った経緯について述べる。前述のように、課題解決のために本発明者らは主要な食中毒細菌が属する複数属の好気性細菌を同時に培養できる培養条件について研究を行った。現在、日本における主要な食中毒細菌としては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌：以下「Ｓ．ａｕｒｅｕｓ」とする）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（サルモネラ菌：以下「Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ」とする）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７（病原大腸菌Ｏ１５７：以下「Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７」とする）、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（腸炎ビブリオ：以下「Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ」とする）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ（嘔吐型セレウス菌：以下「Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ」とする）、及びＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（リステリア菌：以下「Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ」とする）などが挙げられる。これら６属６種の細菌をＴＳＢなどの一般的な増菌培地を用いて普通に用いられる培養条件下で同時に培養した結果、好塩性のＶ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓの増殖が抑制される結果が得られた。当該細菌の増殖抑制は、増菌培地の塩濃度を上げることで解決できた。
【００２８】
また、前記６属の細菌を同時培養した場合、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖が抑制される結果が得られた。Ｌｉｓｔｅｒｉａ属を同時に培養できる培養条件を見出すために、本発明者らは当該増殖抑制の原因を調べた。その結果、増殖抑制はＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓとＢ．ｃｅｒｅｕｓとを同時培養した際に生じること、及び当該増殖抑制はＢａｃｉｌｌｕｓ属の増殖による増菌培地のｐＨ値の低下に起因することを突き止めた。この発見に基づき、増菌培地のｐＨ値を５より大きく１０以下に保持して培養を行うことによって同時培養が困難であったＢａｃｉｌｌｕｓ属とＬｉｓｔｅｒｉａ属の二属を一の増菌培地で同時に培養できるという培養条件を見出した。この培養条件に加えて増菌培地の塩濃度を上げることで、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓを含む、上記６属の細菌全てを一の増菌培地で同時に培養することが可能となった。
【００２９】
さらに、本発明者らはＢａｃｉｌｌｕｓ属が増殖してもｐＨ値が低下しない増菌培地の開発を行った。非特許文献３よりＢａｃｉｌｌｕｓ属の増殖による増菌培地のｐＨ値の低下は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属が増菌培地中のブドウ糖を代謝分解する過程で有機酸などの酸を産生し、それを培地中に排出することが原因であると考えられた。そこで、増菌培地から糖を可能な限り除去し、それを補完する栄養素を添加することでＢａｃｉｌｌｕｓ属の増殖によってもｐＨ値が大幅に低下することなく、前記６属の細菌を同時に培養可能な増菌培地を開発することに成功した。本実施形態の細菌培養方法と増菌培地の発明は、かかる発見に基づくものである。
【００３０】
<実施形態１：構成>
本実施形態の細菌培養方法、及び増菌培地の各構成について以下で説明する。
【００３１】
（（細菌培養方法の構成））
【００３２】
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を同時に培養する場合）
少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を一の増菌培地中で同時に培養する本実施形態の細菌培養方法の構成要件は、増菌培地のｐＨ値を５より大きく１０以下に保持して培養することである。
【００３３】
「好気性細菌」とは、物質の代謝に酸素を必要とする細菌の総称をいう。ただし、本願では完全嫌気状態であっても増殖可能な通性好気性細菌（又は通性嫌気性細菌）も含むものとする。
【００３４】
「Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の好気性細菌」は、本願では特に増殖により培地のｐＨ値の低下を生じさせる好気性の菌種を指す。すなわち、増殖に伴って発生する酸を増菌培地中に排出する好気性の菌種をいう。例えば、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓが該当する。増殖条件に関して、これらの菌種は類似の性状を有している（非特許文献８）。
【００３５】
「Ｌｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌」は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｇｌｉｇｅｒｉなどが該当する。増殖条件に関して、これらの菌種は類似の性状を有している（非特許文献９）。
【００３６】
「増菌培地」とは、細菌を増殖させることを目的とする培地である。これについては後で詳述する。
【００３７】
「一の増菌培地」とは、同一容器内にある単一の増菌培地を意味する。
【００３８】
「同時に培養」とは、複数の菌種を一の増菌培地に接種した後、それらを共に増殖させることをいう。共に増殖しているかの判断基準は、例えば、各細菌の培地容量当たりの菌数がそれぞれの定常期までに所定の値以上あることとすればよい。「所定の値」としては、一例として約１×１０３ｃｆｕ／ｍｌが挙げられる。当該数値は、核酸増幅法などを用いた検出方法の検出下限菌数に相当するため、所定の値の最下限値としては適当だからである。各菌種が所定の菌数に達するまでの時間は問わない。例えば、ある菌種は培養後２時間で所定の菌数に達して、その１時間後には定常期に入り、他の種は培養後１０時間で所定の菌数に達した場合であっても、両者は同時に培養されたものとする。
【００３９】
「増菌培地のｐＨ値を５より大きく１０以下に保持」とは、増菌培地全体のｐＨ値を培養中に５よりも大きく１０以下の範囲内に保つことである。増菌培地のｐＨ値が当該範囲内であれば多少の変動は問わない。しかし、ｐＨ値が当該範囲外の場合は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の細菌を同時に培養する上で好ましくない。
【００４０】
増菌培地のｐＨ値をｐＨ５以下にすることが好ましくない理由は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属細菌の増殖が抑制されるためである。これについては、図１を用いて以下で詳細に説明する。図１は、各ｐＨ値の増菌培地におけるＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの培地容量当たりの菌数を示している。図１の実験は、ＨＣｌを用いて各ｐＨ値に調整した滅菌済みＴＳＢにＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを無菌条件下で最終菌濃度が１〜１０ｃｆｕ／ｍｌとなるように接種し、３７℃で１８時間静置培養後、ＴＳＢ寒天培地（以下「ＴＳＡ」とする）に希釈塗沫してコロニー数をカウントしたものである。この図が示すように、増菌培地のｐＨ値がｐＨ５以下の場合には、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓはほとんど検出できない。したがって、増菌培地のｐＨ値を５以下にすることはＬｉｓｔｅｒｉａ属細菌の増殖が抑制されてしまうため好ましくない。Ｂａｃｉｌｌｕｓ属とＬｉｓｔｅｒｉａ属の効率的な増殖を考慮した場合、増菌培地のｐＨ値は、５．２以上であることが好ましく、５．５以上であることがより好ましい。なお、ＴＳＢ、ＴＳＡの組成については、実施例１で詳述する。
【００４１】
また、増菌培地のｐＨ値が１０を越えることが好ましくない理由は、好アルカリ性細菌を除く多くの細菌は、ｐＨ１０を越える強アルカリ下で増殖が抑制されることが知られているからである。図示はしないが、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属細菌もｐＨ１０を越える環境下で増殖が抑制される（非特許文献９）。したがって、増菌培地のｐＨ値は１０を越えることは好ましくない。Ｂａｃｉｌｌｕｓ属とＬｉｓｔｅｒｉａ属の効率的な増殖を考慮した場合、増菌培地のｐＨ値は９以下であることが好ましく、８．７以下であることがより好ましい。
【００４２】
ところで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属とＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を同時に培養する場合、通常の培養条件ではｐＨ値を上記範囲内に保持することは難しい。これは、前述のようにＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌の増殖により、増菌培地のｐＨ値が低下するからである。図２は、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓとＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを同時に培養したときの、各培養時間におけるそれぞれの細菌の培地容量当たりの菌数と培地のｐＨ値の関係を示している。図２の実験では、まず、滅菌済みＴＳＢにＢ．ｃｅｒｅｕｓとＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのそれぞれを最終菌濃度が約１００ｃｆｕ／ｍｌとなるように無菌条件下で接種し、３７℃で静置培養した。続いて、接種直後から１８時間後まで、２時間ごとに増菌培地溶液の一部を採取した後、それぞれの細菌の選択培地プレートに希釈塗沫して形成されたコロニー数をカウントした。また、この時同時に増菌培地溶液の一部を遠心し、上清を濾過滅菌後にｐＨ測定を行った。選択培地の組成については、実施例１で詳述する。この図で示すように、増菌培地のｐＨ値は、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓが増殖して定常期に入る培養後１２時間以降に急速に低下していることがわかる。また、増菌培地のｐＨ値の低下に伴い、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖がほとんど抑制されていることも示されている。このように、受動的な培養方法ではＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌が増殖することで、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属の増殖が抑制されるという二属を同時培養する上で相反する問題が発生する。
【００４３】
そこで、本実施形態は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属を培養中であっても増菌倍地中のｐＨ値を能動的に５より大きく１０以下の範囲内に保持させることを構成要件としている。それによって、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を一の増菌倍地中で同時に培養ことが可能となる。増菌培地のｐＨ値を保持する方法については、「実施形態１：方法」の項で述べる。また、アルカリ側に関しては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を同時に培養した場合であっても、一方の菌種の増加によって増菌培地のｐＨ値が増加するということはない。したがって、接種時に増菌培地のｐＨ値を１０以下に調整しておけばよい。
【００４４】
なお、増菌培地のｐＨ値を一時的に前記ｐＨ値の範囲外とした場合であっても、培養中に前記範囲内にｐＨ値を戻す場合、あるいはｐＨ値が戻る場合には、増菌培地のｐＨ値は当該範囲内に保持されているものとみなす。
【００４５】
「少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を一の増菌倍地中で同時に培養できる」とは、検査対象物中にＢａｃｉｌｌｕｓ属とＬｉｓｔｅｒｉａ属の各好気性細菌が存在する場合には、少なくとも当該二属の菌種に関しては、単一の培地で同時に培養できることをいう。したがって、本実施形態の細菌培養方法で同属の複数菌種が同時に培養されてもよい。また、検査対象物中に他の好気性細菌が存在する場合には、それらが当該二属の細菌と共に培養されてもよい。特に食中毒細菌を含む他の菌属が同時に培養されることは、本発明の目的に資するため好ましい。一例を挙げれば、ＴＳＢ培地を用いた本実施形態の細菌培養方法では、前記二属以外に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属（ここではＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅなどの非好塩性菌種に限る）などの同時培養が可能である。また、これ以外にもＳｈｉｇｅｌｌａ属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ属などが挙げられる。
【００４６】
（前記二属に加えて、さらにＶｉｂｒｉｏ属の好気性・好塩性細菌を同時培養する場合）
少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌に加えて、さらにＶｉｂｒｉｏ属の好気性・好塩性細菌を一の増菌培地中で同時に培養する本実施形態の細菌培養方法は、増菌培地のｐＨ値を５より大きく１０以下に保持して培養することに加えて、増菌培地の塩濃度を１％〜４％とすることを構成要件とする。このうち、前述した構成要件以外について、以下で説明する。
【００４７】
「Ｖｉｂｒｉｏ属の好気性・好塩性細菌」とは、Ｖｉｂｒｉｏ属に属する好気性細菌種であり、かつ増殖に一定濃度以上の塩を必要とする菌種をいう。例えば、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｄａｍｓｅｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｓが該当する。増殖条件に関して、これらの菌種は類似の性状を有している。
【００４８】
「塩濃度」とは、水を媒体とするときの塩の質量対容量（ｇ／ｍｌ）百分率を意味する。ここでいう「塩」とは、主として塩化ナトリウムを意味するが、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム、及び／又は塩化カリウムなどを含んでいてもよい。
【００４９】
塩濃度を１％以上４％以下とする理由は、好塩性Ｖｉｂｒｉｏ属をはじめとする好塩性菌種は海水中に生息するものが多く、増殖や生息には一般に海水の塩濃度に近い環境を必要とするためである。海水の塩濃度は約３．４％である。したがって、本実施形態では塩濃度を１％以上４％以下に設定した。この範囲外では、当該菌種の増殖が抑制される可能性があるため好ましくない。
【００５０】
塩濃度が好塩性Ｖｉｂｒｉｏ属の増殖に与える影響を、一例を挙げて説明する。図３は、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、及び好塩性細菌であるＶ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓを同時に培養したときの、それぞれの細菌の培地容量当たりの菌数を示している。（ａ）はＴＳＢ（塩濃度０．５％）で培養した結果を、また（ｂ）はＴＳＢにおいてＮａＣｌを質量対容量百分率で１．５％とした増菌培地（塩濃度１．５％）で培養した結果である。各実験は、それぞれの滅菌済み増菌培地に最終菌濃度が約１〜１０ｃｆｕ／ｍｌとなるように無菌状態下で接種し、３７℃で１８時間静置培養した後、ＴＳＡに希釈塗沫してコロニー数をカウントしたものである。これらの図で示すように、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓは、塩濃度０．５％下では増殖がほとんど抑制された。一方、塩濃度１．５％下では約１×１０６ｃｆｕ／ｍｌと、細菌検出上十分な菌数まで増殖した。なお、図３ではＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖が抑制されているが、これは当該実験に用いた増菌培地のｐＨ値を前記範囲内に保持していないためである。
【００５１】
以上のように、本実施形態においてＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属と共にＶｉｂｒｉｏ属の好気性・好塩性菌種を同時培養する場合には、増菌培地の塩濃度を１％以上４％以下とするのが好ましい。
【００５２】
（（増菌培地））
【００５３】
本実施形態の細菌培養方法では、培養中の増菌培地のｐＨ値を５より大きく１０以下の範囲内に能動的に保持する必要がある。増菌培地の組成は、培養中の増菌培地のｐＨ値を保持する方法に応じて適宜選択する。例えば、後述の「実施形態１：方法」の項の「培養工程」で述べる（Ａ）の増菌培地のｐＨ値を外部から強制調整する方法であれば、細菌培養に一般的に使用される汎用培地のＴＳＢを使用すればよい。また、（Ｂ）の増菌培地にｐＨ緩衝能を有する試薬を加えておく方法の場合にも同じくＴＳＢが使用できる。ただし、この場合、溶媒の１／１０容量程度でバッファとしてＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ：１３７ｍＭ ＨＣｌ、８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）などを加える必要がある。さらに、Ｖｉｂｒｉｏ属の好気性・好塩性細菌を一の増菌培地中で同時に培養するためには、（Ａ）、（Ｂ）のいずれの場合にも、増菌培地の塩濃度が最終濃度で１％〜４％となるように、前記ＴＳＢに塩化ナトリウムなどを追加しておけばよい。
【００５４】
ところで、前述のように、通常の細菌の培養条件ではＢａｃｉｌｌｕｓ属の増殖で増菌培地のｐＨ値の低下が生じてしまう。このＢａｃｉｌｌｕｓ属の増殖による増菌培地のｐＨ値の低下は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌が糖を代謝して酸を産生し、それを培地中に排出することに起因する。したがって、増菌培地中の糖を除去するか、若しくは限りなく少量に抑えれば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の増殖による増菌培地のｐＨ値の低下を抑制できる。具体的には、例えば、増菌培地中の糖の含有率を水を溶媒として質量対容量百分率で０．００１％以下となるようにすればよい。ただし、この場合、糖に代わる栄養素を増菌培地に加えて栄養的に補完することが好ましい。糖に代わる栄養素としては、各種ビタミン、ミネラル、核酸物質などを豊富に含むことが知られているイーストエクストラクト（非特許文献４、５）などが挙げられる。
【００５５】
本発明者らは、上記の点を考慮して本実施形態の増菌培地の趣旨に即した新たな増菌培地を開発した。本願では、当該新たな増菌培地を以下便宜的にＳＥＢ（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ）と呼ぶ。ＳＥＢは、ＴＳＢの組成に基づき糖含有量を質量対容量百分率０．００１％以下に抑え、それを補完するためにイーストエクストラクトを加えた増菌培地である。当該ＳＥＢは、水を溶媒としたときの質量対容量百分率でペプトン：１％〜３％、リン酸二カリウム：０．１５％〜０．３５％、塩化ナトリウム：１％〜４％、及び酵母エクストラクト：０．０１％〜０．１％を主な構成要素とする。前記ペプトンは、タンパク質を加水分解酵素により部分分解処理して断片化したものであれば特に限定はしない。例えば、カゼインをトリプシン処理したトリプトン（ＤＩＦＣＯ社）、細菌をペプシン処理したバクト・ペプトン（ＤＩＦＣＯ社）が利用できる。細菌のより効率的な増殖には、当該ペプトンの一部に大豆タンパク質を加水分解酵素により部分分解したソイトン（ＤＩＦＣＯ社）をペプトンの質量に対して１０％〜２０％加えるとよい。なお、前記ＳＥＢの組成はＶｉｂｒｉｏ属の好気性・好塩性細菌も同時に培養できるように、塩化ナトリウムの含有率を１％〜４％としているが、好塩性細菌を同時に培養する必要がない場合には、塩化ナトリウムの含有率はＴＳＢと同様の０．５％程度としても構わない。ＳＥＢを用いたＢａｃｉｌｌｕｓ属とＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌の同時培養の実施例は、実施例１、及び２で述べる。
【００５６】
複数菌種を同時に培養することを目的とする場合には、増菌培地の状態は原則として液体培地であることが好ましい。ただし、コロニーを形成させたい場合など、必要に応じて寒天培地などの固体培地を用いてもよい。
【００５７】
<実施形態１：方法>
実施形態１の細菌培養方法について例を挙げて説明する。図４は本実施形態における細菌培養方法のフローチャートの一例である。この図で示すように、本実施形態の細菌培養方法は、増菌培地調製工程（Ｓ０４０１）、接種工程（Ｓ０４０２）、培養工程（Ｓ０４０３）で構成される。以下で各工程について説明する。なお、以下の一連の操作は原則として無菌的環境下で行い、また、使用する培地や試薬、器具なども原則として滅菌済みのものを使用する。
【００５８】
「増菌培地調製工程」（Ｓ０４０１）とは、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を同時に培養できる増菌培地を調製する工程である。当該増菌培地は、前述の構成を有する増菌培地を適宜選択して調製すればよい。当該工程で用いる増菌培地は、液体培地が望ましい。増菌培地の分量は、用途に応じて定めるようにすればよい。例えば、本実施形態の培養方法により得られた培養液を用いて実施形態２で述べる核酸増幅法により所望の細菌を検出するのであれば、増菌培地の分量は５ｍｌ〜２０ｍｌあれば足りる。また、古典的なサザンハイブリダイゼーション法などを用いて所望の細菌を検出するのであれば、増菌培地の分量は５０ｍｌ〜５００ｍｌ程あることが好ましい。調製後の増菌培地は、１２１度で１５分〜２０分ほどオートクレーブ滅菌して使用する。なお、市販の増菌培地を用いるなど既存の培地を利用する場合であれば、本工程は省略してもよい。
【００５９】
「接種工程」（Ｓ０４０２）とは、検査対象物を増菌培地に添加することで、検査対象物中の細菌を増菌培地に接種する工程である。ここでいう検査対象物とは、本願発明を鑑みれば主として食品が該当するが、それ以外のものであってもよい。例えば、食品を包んでいたラップやパック、又は食器が挙げられる。検査対象物を増菌培地に添加する方法は、検査対象物中に存在する細菌を増菌培地に接種できる方法であれば特に限定しない。例えば、検査対象物である食品が液体や流動物（カレーのルーなど）であれば、その一部を直接増菌培地中に添加すればよい。また、検査対象物が固体食品などであれば、当該検査対象物をホモジェナイズした後、ホモジェネートの一部を直接増菌培地中に添加するか、ホモジェネートに無菌ＰＢＳなどのバッファを加えて混合した後、その懸濁液、もしくは上清を増菌培地中に添加してもよい。あるいは、当該検査対象物を無菌の増菌培地と共にホモジェナイズしたものをそのまま培養する方法であってもよい。さらに、食器やパックであれば、検査箇所を無菌ＰＢＳなどで洗浄し、当該洗浄後のＰＢＳを直接増菌培地中に添加するなどすればよい。
【００６０】
なお、本実施形態の細菌培養方法は、状況に応じて接種工程（Ｓ０４０２）と次の培養工程（Ｓ０４０３）との間に前培養工程を設けてもよい。「前培養工程」とは、培養工程の増菌培地に接種する菌数を所定数以上にするために予め比較的少量の増菌培地に検査対象物を接種して細菌数を増加させる工程である。当該工程を経るか否かは、通常、培養工程に用いる増菌培地の容量によって判断する。例えば、増菌培地の分量が１００ｍｌを越えるような場合には、当該工程を経ることが好ましい。細菌の対数増殖期までの時間を短縮できるからである。逆に、５０ｍｌ以下のような少量の培地への接種の場合、当該前培養工程を経なくともよい。前培養工程におけるｐＨ値の保持や塩濃度などの培養条件は、培養工程と同様にすることが望ましい。通常の培養条件では前培養の段階で各細菌の増殖に偏重を来たす可能性があるためである。前培養は、３６℃〜３８℃で６時間〜１２時間程度行えばよい。前培養後は、培養液を適量直接、若しくはＰＢＳなどの無菌バッファで適当に希釈した後、増菌培地に接種する。
【００６１】
「培養工程」（Ｓ０４０３）とは、接種後の増菌培地を一定条件下に置き、接種された細菌を培養する工程である。一定条件下とは、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を同時に培養する場合には、培養中の増菌培地のｐＨ値を５より大きく１０以下に保持することである。また、さらにＶｉｂｒｉｏ属の好気性・好塩性細菌を同時に培養するには、増菌培地の塩濃度を１〜４％としておくことである。
【００６２】
前述のように、通常の培養条件ではＢａｃｉｌｌｕｓ属の増殖によりｐＨ値の低下が生じる。したがって、本実施形態の細菌培養方法では、培養中の増菌培地のｐＨ値を能動的に保持する必要がある。以下、培養中に増菌培地のｐＨ値を保持する方法について具体例を挙げて説明する。
【００６３】
（Ａ）増菌培地のｐＨ値を外部から強制調整する方法
増菌培地のｐＨ値をモニタリングしながら、外部から薬剤などを加えて強制的にｐＨ値を調整することによって、増菌培地のｐＨ値を所定の範囲内に保持させる方法である。当該方法の具体例としては、滴定が挙げられる。例えば、培養中に増菌培地のｐＨ値をｐＨメーターで計測し、ｐＨ値が５以下となった場合には、０．１Ｎ程度のＮａＯＨ溶液を滴定して、５より大きく１０以下の範囲内となるように調整すればよい。逆にｐＨ値が１０を越えた場合には０．１Ｎ程度のＨＣｌ溶液を滴定して、同様に５より大きく１０以下の範囲内となるように調整すればよい。この方法で用いる増菌培地は汎用性の高い通常の増菌培地でよい。例えば、ＴＳＢなどが利用できる。なお、塩濃度については、必要に応じてＴＳＢに適宜添加し、調整すればよい。これらの調整は滴定装置とｐＨメーターを連結して、又は一体化して、自動で行えるようにすると便利である。
【００６４】
（Ｂ）増菌培地にｐＨ緩衝能を有する試薬を加えておく方法
ｐＨレンジが５より大きく１０以下の範囲内にあり、かつ細菌の増殖に影響をほとんど及ぼすことのない試薬を増菌培地に加えておく方法である。増菌培地自身がｐＨ緩衝能をもつことから、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の増殖によりｐＨ値の低下が生じても、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌が増殖可能なｐＨ値に自動調整されることから便利である。具体例としてはＰＢＳを増菌培地の溶媒として１／１０容量程度加える方法が挙げられる。当該方法で培養を行う場合には、前記増菌培地調製工程（Ｓ０４０１）で、ｐＨ緩衝能を有する試薬を加えた増菌培地を調製しておけばよい。
【００６５】
（Ｃ）糖含有量を抑制した増菌培地を使用する方法
前記「増菌培地」の項で述べたように増菌培地における糖の含有量を抑制する、若しくは糖を除去することで、培養中のｐＨ値の低下を防止する方法である。当該方法で培養を行う場合には、前記増菌培地調製工程（Ｓ０４０１）で、予め糖含有量を抑制した増菌培地を調製しておけばよい。この場合、前述のように増菌培地には糖を代替する栄養素を添加することが好ましい。増菌培地の具体例としては、前記「増菌培地」の項で述べたＳＥＢなどが挙げられる。
【００６６】
培養温度は３６℃〜３８℃、培養時間は６時間〜２４時間程度行えばよい。通常は、３７℃で１２時間〜２０時間程度培養すれば足りる。増菌培地は静置培養、振とう培養のいずれであってもよい。静置培養の場合にはインキュベーターなどを、また振とう培養の場合には恒温振とう培養器などを用いてもよい。
【００６７】
以上の工程を経ることで、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を同時に培養できる。なお、本実施形態の細菌培養方法に基づいた細菌培養の結果は、実施例２、及び３に示した。
【００６８】
<実施形態１：効果>
本実施形態の細菌培養方法によれば、複数属の食中毒細菌を単一培地で同時に培養することが可能となり、培養方法の簡易化、迅速化ができる。また、実施形態２の細菌検出方法における検出時間の短縮化にも繋がる。
【００６９】
本実施形態の増菌培地によれば、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の細菌を同時に培養する場合、培養中も適正なｐＨ値を保持できる。それによって、培養中に培地のｐＨ調節を行う必要がなくなり、培養操作の一層の簡易化、迅速化が可能となる。
【００７０】
<<実施形態２>>
【００７１】
<実施形態２：概要>
実施形態２は、細菌検出方法に関する。本実施形態の細菌検出方法は、前記実施形態１の細菌培養方法で細菌を培養する培養工程を含むことを特徴とする。本実施形態の細菌検出方法によれば、少なくともＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属のうち、二以上の属の好気性細菌を同時に検出することができる。したがって、食中毒細菌をはじめとする細菌の簡易迅速な検出方法として有用である。
【００７２】
<実施形態２：方法>
実施形態２の細菌検出方法について説明する。図５に本実施形態のフローチャートの一例を示す。この図のように、本実施形態の細菌検出方法は、培養工程（Ｓ０５０１）と検出工程（Ｓ０５０２）とを構成要件とする。以下、各工程について説明する。
【００７３】
「培養工程」（Ｓ０５０１）とは、実施形態１の細菌培養方法で培養を行う工程である。ここでいう、培養工程とは、「実施形態１：方法」の項で述べた培養工程のみならず、広く実施形態１の培養方法を用いた一連の培養工程をいう。すなわち、接種工程の他、必要に応じて増菌培地調製工程、及び前培養工程などを含むものとする。基本的な方法については実施形態１で述べた方法と同じでよい。当該培養工程後に得られる培地中の細菌を次の検出工程に用いる。
【００７４】
「検出工程」（Ｓ０５０２）とは、前記培養工程（Ｓ０５０１）後に得られる細菌から所望の細菌を検出する工程である。「所望の細菌」とは、存在の有無を確認したい標的細菌をいう。検出工程は、検出方法の違いによって、さらにいくつかに分類できる。第一は、増殖した生菌をそのまま用いて検出する方法である。第二は、増殖した細菌のタンパク質を検出する方法である。第三は、増殖した細菌の核酸を検出する方法である。以下、各方法について説明する。
【００７５】
（生菌を用いる方法）
培養工程で増殖した細菌を、生菌状態のままで検出する方法である。例えば、所望の細菌の選択培地を用いたコロニー形成法が挙げられる。コロニー形成法は、具体的には、培養後の培養液にＰＢＳなどのバッファを加えて１０倍連続希釈系列を作成し、所望の細菌の選択培地プレートに適当量塗抹した後、形成されるコロニー数に基づいて所望の細菌の存在や菌数を算出する方法である。選択培地は、「実施形態１：発明に至る経緯」で挙げた日本の主要な食中毒細菌であれば、実施例１及び２で詳述する選択培地が利用できる。
【００７６】
（タンパク質を検出する方法）
所望の細菌に特有のタンパク質を検出する方法である。例えば、抗体を用いた免疫学的な検出方法が挙げられる。具体例としては、ＥＬＩＳＡ法やウェスタンブロッティング法が利用できる。簡易性や迅速性を鑑みればＥＬＩＳＡ法が好ましい。これらの方法は、確立した周知の技術であることから具体的説明については省略する。なお、タンパク質は、細菌から抽出する方法と細菌の膜表面タンパク質を利用する方法があるが、いずれの方法であっても構わない。後者は、細菌の膜表面タンパク質を抗原とすることによりＥＬＩＳＡ法などで菌体のまま検出できるため、細菌検出の簡易性、迅速性の目的に資する点で便利である。細菌からタンパク質を抽出する方法も確立した周知の技術であり、例えば、非特許文献６に記載の方法に準じて処理すればよい。この方法で使用する抗体は、所望の細菌で知られる特有のタンパク質、若しくは特異的に発現するタンパク質などに対する抗体を用いる。これらは、市販の抗体などを利用すればよい。
【００７７】
（核酸を検出する方法）
培養工程で増殖した細菌から核酸を抽出後、所望の細菌に特有な塩基配列を有する核酸を検出する方法である。図６のフローチャートで示すように、当該方法は、検出工程（Ｓ０６０２）が、さらに、核酸抽出工程（Ｓ０６０３）と核酸検出工程（Ｓ０６０４）とを有することを特徴とする。以下で本方法に特徴的な工程である核酸抽出工程（Ｓ０６０３）と核酸検出工程（Ｓ０６０３）について説明する。なお、培養工程（Ｓ０６０１）の説明は上記Ｓ０５０１で既に説明したため省略する。
【００７８】
「核酸抽出工程」（Ｓ０６０３）とは、培養工程後に得られる菌体から核酸を抽出する工程である。ここでいう「核酸」とは、ＤＮＡやＲＮＡが該当する。菌体から核酸を抽出する方法は、アルカリ法などの核酸抽出法として確立した公知の技術が利用できる。具体的な方法については非特許文献７に記載の方法などに準じればよい。
また、菌体から核酸を抽出する方法は、市販の核酸抽出キットなども利用できる。抽出後の核酸は、ＴＥバッファなどで懸濁した後、適当な濃度に調整して次の核酸検出工程で用いる。
【００７９】
「核酸検出工程」（Ｓ０６０４）とは、核酸抽出工程で得られる核酸に対して、所望の細菌のゲノムＤＮＡ上でその細菌に特有な塩基配列を認識するオリゴヌクレオチドを用いて所望の細菌を検出する工程である。
【００８０】
「オリゴヌクレオチド」とは、１０塩基〜５０塩基程度のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ＬＮＡ（登録商標；Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、又はそれらの組み合わせなどによって構成されている。本実施形態のオリゴヌクレオチドは、プローブ、又は核酸増幅におけるプライマーとしての機能を有する。
【００８１】
当該オリゴヌクレオチドを構成する一、又は二以上のヌクレオチドは糖鎖などで修飾されていてもよい。また、当該オリゴヌクレオチドは標識物質で標識されていてもよい。標識物質の使用は、増幅された核酸断片の検出が容易になるため便利である。「標識物質」とは、例えば、蛍光物質、蛍光抑制物質、ＲＩ、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）等のハプテン、又はビオチンが挙げられる。「蛍光物質」とは、特定波長の励起光を吸収することで励起状態となり、元の基底状態に戻る際に蛍光を発する性質を有する物質を言う。標識に用いる蛍光物質は、オリゴヌクレオチドに標識可能なものであれば、種類は特に問わない。例えば、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＦＩＴＣが挙げられる。「蛍光抑制物質」とは、いわゆるクエンチャーであって、蛍光物質の励起エネルギーを吸収する物質等をいう。例えば、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、Ｄａｂｃｙｌ、ＴＡＭＲＡが該当する。オリゴヌクレオチドの標識される位置は、使用する標識物質等の性質に応じて適宜決定すればよく、特に限定はしない。例えば、５’及び／又は３’末端であってもよいし、オリゴヌクレオチド内のいずれかのヌクレオチドであってもよい。なお、蛍光抑制物質を使用する場合は通常、蛍光物質とペアで標識される。この場合、蛍光物質はオリゴヌクレオチドの５’末端に標識され、蛍光抑制物質は同じオリゴヌクレオチドの３’末端に標識されることが一般的である。また、蛍光抑制物質は、種類によって蛍光の抑制範囲が異なる。したがって、蛍光抑制物質を使用する場合は、ペアとなる前記蛍光物質の発光を抑制できる種類を選択する必要がある。
【００８２】
「所望の細菌のゲノムＤＮＡ上でその細菌に特有な塩基配列」とは、標的細菌のゲノムＤＮＡ上に存在する当該標的細菌に特異的な塩基配列である。当該特有な塩基配列は、種特異的な塩基配列であることが好ましいが、亜属特異的、属特異的な塩基配列であってもよい。なぜなら、本実施形態の細菌検出方法では、必ずしも種レベルで検出する必要がないためである。例えば、食品のＶｉｂｒｉｏ属による汚染度を確認したい場合にはＶｉｂｒｉｏ属の有無が検出できれば十分であり、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓまでを検出する必要はない。このような場合であれば、Ｖｉｂｒｉｏ属に特異的な塩基配列が、ここでいう所望の細菌のゲノムＤＮＡ上でその細菌に特有な塩基配列に該当する。
【００８３】
当該特有な塩基配列としては、標的細菌が有する特異的な遺伝子の配列や塩基多型等が挙げられる。ここでいう特異的な遺伝子とは、例えば、種特異的若しくは属特異的な酵素が挙げられる。また、塩基多型とは、種特異的若しくは属特異的な、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｉｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、マイクロサテライト、ＶＮＴＲ（Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔ）、又はＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）等が該当する。具体的な塩基配列については、所望の細菌に応じて適宜検討、選択することが好ましい。例えば、主要食中毒細菌６属６種の場合であれば、実施例４の表２で挙げた遺伝子の塩基配列が利用できる。ただし、表２は、具体例の一つであり、本実施形態でいう所望の細菌のゲノムＤＮＡ上でその細菌に特有な塩基配列は、それに限られるものではない。
【００８４】
「認識する」とは、同定できることをいう。つまり、用いるオリゴヌクレオチドは、必ずしもそれ自身が所望の細菌に特有な塩基配列に相補的な塩基配列を有することで特有な塩基配列を認識する必要はない。オリゴヌクレオチド自身の塩基配列は所望の細菌に特有な塩基配列を含んでいなくとも、それを用いることで結果的に所望の細菌に特有な塩基配列を同定できるのであれば、認識するものとみなす。例えば、特有な塩基配列は有していないが、所望の細菌に特有なＳＮＰなどの塩基配列を含む特定の領域を増幅できるプライマーペアが該当する。
【００８５】
核酸検出工程は、検出方法によってさらにいくつかの方法に分けることができる。例えば、ハイブリダイゼーション法による方法や核酸増幅法を用いた方法が該当する。以下、各方法について説明する。
【００８６】
（ハイブリダイゼーション法による方法）
ハイブリダイゼーション法による核酸検出工程は、前記所望の細菌のゲノムＤＮＡ上でその細菌に特有な塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして、ハイブリダイゼーションにより標的細菌の有無を検出する方法である。例えば、ゲル・ブロッティング法や、核酸を直接固定したフィルターや基板を用いる方法が挙げられる。ゲル・ブロッティング法の具体例としてはサザンブロット・ハイブリダイゼーション法、ノザンブロット・ハイブリダイゼーション法、若しくはそれらを原理とするブロッティング法などが該当する。サザンブロット・ハイブリダイゼーション法は、電気泳動後のゲル中で分画されたＤＮＡをメンブレンに転写した後、標識されたプローブを当該メンブレン上の目的の塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズさせて検出することを基礎とするものである。ノザンブロット・ハイブリダイゼーション法は、ＤＮＡに代わってＲＮＡをメンブレンに転写して、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法と同様の処理を行う方法である。前記の方法はいずれも分子生物学分野で確立した極めて一般的な技術であり、非特許文献７などのプロトコールに準じて行えばよいことから詳細な説明については省略する。また、核酸が固定されたフィルターや基板を用いる方法の具体例としてはマクロアレイ、マイクロアレイ、又はＤＮＡチップなどの解析法等が該当する。これらの方法は、検出感度を高めるために、次に述べる核酸増幅法を用いた方法と組み合わせることが望ましい。マクロアレイ、マイクロアレイ、又はＤＮＡチップを用いる方法は、複数の細菌を同時検出できることから本発明の目的に資するので好ましい。これらの方法を用いた検出方法は、公知の技術であることから、詳細な説明は省略する。なお、マイクロアレイ、又はＤＮＡチップを用いた方法は基板など作製のための技術、労力、コストを考慮すると受託解析サービスを行っている専門業者を利用する方が便利である。
【００８７】
（核酸増幅法を用いた方法）
核酸増幅法を用いた方法による核酸検出工程は、図７のフローチャートで示すように、核酸検出工程（Ｓ０７０４）がさらに、核酸増幅工程（Ｓ０７０５）と増幅核酸検出工程（Ｓ０７０６）とを有することを特徴とする。以下で核酸増幅工程（Ｓ０７０５）と増幅核酸検出工程（Ｓ０７０６）について説明する。その他の工程の説明については、前述の各工程と同様であることから省略する。
【００８８】
「核酸増幅工程」（Ｓ０７０５）とは、核酸抽出工程で得られる核酸を鋳型として、所望の細菌のゲノムＤＮＡ上でその細菌に特有な塩基配列を認識するオリゴヌクレオチドを用いて、核酸増幅法により所望の細菌の核酸を増幅する工程である。核酸増幅工程による細菌検出方法は、培養工程で細菌数を増加させ、さらに細菌から抽出された核酸を当該核酸増幅法で増幅することにより、検査対象物中にわずかに存在する細菌であっても検出可能となることから、検出感度を高める上で有用である。また、前述のように、ハイブリダイゼーション法と組み合わせて用いることで、迅速性、簡易性を高めることができる。
【００８９】
「核酸増幅法」とは、ＤＮＡなどの核酸を鋳型とし、二つのプライマーに挟まれた特定の領域を酵素反応によって増幅する方法である。例えば、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、又はそれらの応用的な方法（例えば、リアルタイムＰＣＲ法）が挙げられる。いずれも公知の技術であるが、中でもＰＣＲ法は、医学、農学をはじめとする分子生物学の分野において現在世界中で広く使用されている方法であり、様々な応用技術も知られていることから便利である。
【００９０】
核酸増幅法における核酸増幅反応については、使用する核酸増幅法に応じて適宜定める。例えば、ＰＣＲ法であれば、通常、鋳型の熱変性反応、プライマーなどのアニーリング反応、プライマーの伸長反応の３反応を１サイクルとして、当該サイクルを繰り返す方法を基本としている。各反応における温度と時間は、熱変性反応を８８℃〜９８℃で３０秒間〜１分間、アニーリング反応を５２℃〜６０℃で３０秒間〜１分間、伸長反応を７０℃〜７５℃で４０秒間〜３分間程度行えばよい。効率的な増幅のためには、使用するプライマーの塩基配列や塩基数に応じて適宜定めることが好ましい。一方、ＩＣＡＮ法やＬＡＭＰ法は、５０℃から６５℃の一定温度で増幅が可能である。これらの核酸増幅法は、サーマルサイクラーなどの温度制御機器を必要としないため便利である。また、サイクル数は、使用するＤＮＡポリメラーゼの種類や所望する核酸の増幅量によって異なるが、通常、２５サイクルから４５サイクル程度で足りる。好ましくは２８サイクルから４２サイクル、特に好ましくは３０サイクルから４０サイクルである。
【００９１】
「核酸を鋳型として」とは、核酸の塩基配列を鋳型にしてということである。したがって、核酸抽出工程で得られた核酸そのものを必ずしも鋳型にする必要はない。例えば、核酸抽出工程で得られた核酸がｍＲＮＡであった場合には、そのｍＲＮＡから逆転写によって得られるｃＤＮＡを鋳型にしてもよい。
【００９２】
核酸増幅工程は、二以上の標的細菌のそれぞれに対する複数のプライマーペアなどを一の反応液中で混和して、各細菌の核酸を同時に増幅してもよい。具体的な方法としては、いわゆるＭｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ法などが挙げられる。当該方法によれば、一の核酸増幅反応で複数の標的細菌のそれぞれに特有な核酸断片を増幅できる。したがって、当該方法は、本願発明の細菌検出法の目的である簡易化、迅速化に資することからも好ましい。なお、各標的細菌に用いるオリゴヌクレオチドは、それらの塩基配列がお互いの核酸増幅を阻害しないようにすること、標識物質が細菌間で重複しないようにすることなどを考慮する必要がある。
【００９３】
「増幅核酸検出工程」（Ｓ０７０６）とは、核酸増幅工程で増幅した核酸に基づいて所望の細菌を検出する工程である。
【００９４】
「基づいて」とは、利用してという意味である。「増幅した核酸に基づいて」とは、増幅した核酸断片をそのまま利用してという意味、増幅した核酸断片に所定の処理をした後に利用してという意味、又は核酸の増幅に伴う現象を利用してという意味などを有する。それぞれ場合の具体的方法について、以下で例を挙げて説明する。
【００９５】
増幅した核酸断片をそのまま利用する方法は、増幅反応後の核酸断片の塩基長から標的細菌を検出する方法などが挙げられる。これは、それぞれの細菌で特有の塩基長の増幅断片が増幅されるように、予め各細菌を認識するプライマーの塩基配列を設定しておけばよい。増幅断片の塩基長を視認する方法は、ゲル電気泳動法が利用できる。ゲル電気泳動法は分子生物学の分野で頻用される確立した技術であり、その詳細な方法については非特許文献７をはじめとする各種プロトコールに準ずればよい。
【００９６】
増幅した核酸断片に所定の処理をした後に利用する方法は、増幅した核酸断片を所定の制限酵素で切断したときの切断断片のパターンから標的細菌を検出する方法などが挙げられる。増幅した核酸断片の塩基配列中に存在する制限酵素部位の相違によって標的細菌を検出する方法である。この方法は、増幅した核酸断片の塩基長が複数の標的細菌間で近似する場合であっても検出可能な点で便利である。制限酵素は、各標的細菌から増幅される核酸断片の塩基配列に基づいて適宜定めればよい。当該方法は、増幅した核酸断片に対して通常の制限酵素切断処理を行った後、前記ゲル電気泳動法によって検出すればよい。
【００９７】
核酸の増幅に伴う現象を利用する方法とは、標的の核酸断片の増加を経時的に検出する方法等が挙げられる。
ここで、「経時的」とは、時間経過的であることを意味する。核酸断片の増加を経時的に検出する方法としては、例えば、核酸断片の増加に伴う蛍光強度の増加を測定する方法が挙げられる。より具体的には、リアルタイムＰＣＲ法などが利用できる。増幅産物の増加を反映する蛍光強度の増加を経時的に検出できれば、その検出方法については問わない。例えば、５’ヌクレアーゼ法（ＴａｑＭａｎプローブ法）やサイクリングプローブ法が挙げられる。５’ヌクレアーゼ法は、５’末端を蛍光物質で、また３’末端を蛍光抑制物質で標識されたプローブがＰＣＲの伸長反応におけるＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって分解され、蛍光物質が遊離することで発せられる蛍光をリアルタイムで検出する方法である。サイクリングプローブ法は、末端を蛍光物質で標識されたＲＮＡを含むプローブがＲＮａｓｅＨの添加によりＲＮＡ部分が分解されることで発せられる蛍光をリアルタイムで検出する方法である。あるいは、ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ等の核酸染色剤を核酸増幅の反応液中に加えておき、核酸増幅反応とともに染色することによって拡散断片の増加を当該核酸染色剤から発せられる蛍光の強度により検出してもよい。リアルタイムＰＣＲでの検出は、増幅開始から検出完了までが６時間以内で可能である。したがって、実施形態１の細菌培養方法とＭｕｌｔｉｐｌｅｘ リアルタイムＰＣＲとを組み合わせることで、複数種の細菌を接種から検出までが１日以内で完了できる。それゆえ、簡易性、迅速性の点からもリアルタイムＰＣＲ法による細菌検出法は大変好ましい。
【００９８】
上記いずれかの方法によれば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、及びＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのうち、二以上の菌種を同時に検出できる。当該検出の具体例は、実施例２から４で述べる。
【００９９】
<実施形態２：効果>
本実施形態の細菌検出方法によれば、検査対象物から細菌を検出するまでの操作を簡易化できる。また、検出までに要する時間を短縮化できる。加えて、本実施形態の他の細菌検出法によれば、複数属の食中毒細菌を同時に検出できる。それによって、被検体からの細菌検出をより迅速に行うことができる。
【０１００】
本実施形態の細菌検出方法によれば、特にＭｕｌｔｉｐｌｅｘ リアルタイムＰＣＲ法を用いることで、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、及びＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓなどの複数属の食中毒細菌を接種から検出までを僅か１日以内で完了することが可能である。したがって、食の安全を確保するための検査を行う上で、極めて有用な簡易迅速検出方法を提供できる。
【０１０１】
<<実施形態３>>
【０１０２】
<実施形態３：概要>
実施形態３は、細菌検出用キットに関する。本実施形態の細菌検出用キットは、前記実施形態１の増菌培地を含むことを特徴とする。
【０１０３】
<実施形態３：構成>
本実施形態の細菌検出用キットは、キット内に前記実施形態１の増菌培地を含むように構成されている。ここでいう「実施形態１の増菌培地」とは、前記ＳＥＢを意味する。ただし、当該キットに含まれるＳＥＢは、使用前にあっては各構成成分が必ずしも最終濃度である必要はなく、また液体状態である必要もない。例えば、使用際に滅菌水で希釈するように、濃縮された液体状態でパッキングされていてもよいし、使用前に所定量の滅菌水で溶解する粉末状態でパッキングされていてもよい。
【０１０４】
本実施形態の細菌検出用キットは、ＳＥＢ以外では培養から標的細菌の検出までに必要とされる試薬等で構成されていることが好ましい。例えば、培養後の菌体から核酸を抽出のための溶菌剤、中和剤や、核酸増幅を行うためのＤＮＡポリメラーゼ、バッファ、ｄＡＴＰ／ｄＧＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＴＴＰ、特定の食中毒細菌を検出するためのプライマーセットが挙げられる。その他、必要なチューブやカラムなどを有していてもよい。
【０１０５】
<実施形態３：効果>
本実施形態の細菌検出用キットによれば、細菌検出の検査を行う者がＳＥＢをはじめ実施形態１の細菌培養方法や実施形態２の細菌検出方法で必要な各種試薬等を買い揃える必要ないため便利である。
【実施例１】
【０１０６】
<<ＳＥＢによるＢａｃｉｌｌｕｓ属とＬｉｓｔｅｒｉａ属の同時培養>>
【０１０７】
<目的>
ＳＥＢを増菌培地として用いた場合に、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属とＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌が同時に培養できることを確認する。
【０１０８】
<材料>
【０１０９】
（使用細菌種）
・Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ Ｎｏ．５５
・Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｌｉｓ１
【０１１０】
（各種培地の組成と調製）
【０１１１】
（１）ＴＳＢ
ＴＳＢ（ＤＩＦＣＯ社；１．７％ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ ｃａｓｅｉｎ、０．３％ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ、０．２５％ リン酸二カリウム、 ０．５％ ＮａＣｌ、 ０．５％ ブドウ糖）を水で溶解し、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌して作製した。
【０１１２】
（２）ＴＳＡプレート
ＴＳＡ（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ａｇａｒ；ＤＩＦＣＯ社）を１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌後、約１２ｍｌずつシャーレに分注して作製した。
【０１１３】
（３）ＳＥＢ
２％ ペプトン｛１．７％ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ ｃａｓｅｉｎ（Ｂｅｃｔｏｎ & Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社） ＋ ０．３％ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ（ＤＩＦＣＯ社）｝、０．２５％リン酸二カリウム（ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ナカライテスク社）、３％ ＮａＣｌ（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ；ナカライテスク社）、０．０５％ イーストエクストラクト（ＮＩＨＯＮ ＳＥＩＹＡＫＵ社）を水で溶解し、ＨＣｌを用いてｐＨ７．３に調整後、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌して使用した。
【０１１４】
（４）Ｂ．ｃｅｒｅｕｓの選択培地：卵黄加ＮＧＫＧ寒天培地
卵黄加ＮＧＫＧ寒天培地は、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌して作製したＮＧＫＧ寒天培地（日水製薬）４５０ｍｌを５０℃に保温したものに卵黄１０ｍｌと滅菌生理食塩水５０ｍｌを混和したものを加え、約１２mlずつシャーレに分注して作製した。
【０１１５】
（５）Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの選択培地：Ｏｘｆｏｒｄ寒天培地
Ｏｘｆｏｒｄ寒天培地は、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌して作製したＬｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇａｒ ｂａｓｅ（ＯＸＯＩＤ社）５００ｍｌを５０℃に保温したものに、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｒｄ ＳＲ０１４０Ｅ（ＯＸＯＩＤ社） １バイアルを７０％エタノール５ｍｌで溶解したものを混和し、約１２ｍｌずつシャーレに分注して作製した。
【０１１６】
<方法>
本実施例では、前記２種の細菌がＳＥＢで同時に培養可能であることを確認するために、同定済みの上記２種をＳＥＢに接種する方法で行った。以下の操作は、原則として全て無菌状態にて行った。また、使用する試薬、器具は、１２１℃で２０分間、オートクレーブで滅菌したものを用いた。
【０１１７】
スラントから掻き取った１白金耳の各菌体を５ｍｌのＴＳＢにそれぞれ接種し、３７℃で一晩培養した。次に、ＰＢＳを用いて前培養液の１０倍連続希釈系列を作成し、２２５ｍｌのＳＥＢに最終菌濃度が約１００ｃｆｕ／ｍｌなるように、５０μｌずつ混合接種した。接種後、増菌培地を３７℃のインキュベータ中で静置培養し、接種直後から２時間ごとに培養後１８時間後まで、培養液１０ｍｌずつを採取した。当該培養液を４０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清をＥＢ−Ｄｉｓｋ２５（孔径２．５μｍ；関東化学）を用いて濾過滅菌した後、ｐＨの測定を行った。また、同時にこの培養液からＰＢＳを用いて１０倍連続希釈系列を作成し、それぞれの細菌の選択培地プレートに１００μｌ塗抹して、培養後のコロニー数より生菌数を算出した。なお、各接種菌量は、ＴＳＡに１００μｌ塗抹し、培養後のコロニー数より算出した。
【０１１８】
<結果>
実施例１の結果を図８に示す。対照実験に相当する図２の結果と比較してもわかるように、ＳＥＢを増菌培地に用いた場合、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓが定常期に入る１２時間後も、培地のｐＨ値が図２の結果のような大幅な低下は生じることなかった。すなわち、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓが増殖しても増菌培地のｐＨ値をｐＨ５より大きくｐＨ１０以下の範囲を保持することができた。その結果、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓも約１×１０５ｃｆｕ／ｍｌ以上と、検出に十分な菌数にまで増殖可能であった。したがって、ＳＥＢを増菌培地とすることで、培養中に増菌培地のｐＨ調整を行わずとも、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属とＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を同時に培養できることが確認できた。
【実施例２】
【０１１９】
<<実施形態１の細菌培養方法に基づく主要６属６種の食中毒細菌の同時培養>>
【０１２０】
<目的>
実施形態１の細菌培養方法に基づき、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、及びＶｉｂｒｉｏ属のそれぞれに属する食中毒細菌、並びに他の主要な食中毒細菌を一の場増菌培地中で同時に培養可能であることを示す。
【０１２１】
<材料>
【０１２２】
（使用細菌種）
・Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＩＦＯ ３０６０
・Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＩＦＯ ３３１３
・Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７（ｓｔｘ１＋，ｓｔｘ２＋）
・Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ ＷＰ−１ （ｔｄｈ＋）
・Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ Ｎｏ．５５
・Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｌｉｓ１
【０１２３】
（各種培地の組成と調製）
【０１２４】
（１）Ｓ．ａｕｒｅｕｓの選択培地：卵黄加マンニット食塩培地
１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌して作製したマンニット食塩培地（日水製薬）５００ｍｌを５０℃に保温したものに、卵黄５０mlと３％滅菌食塩水５０ｍｌを混和したものを加え、約１２ｍｌずつシャーレに分注して作製した。
【０１２５】
（２）Ｅ．ｃｏｌｉ O１５７の選択培地：ＣＴ−ＳＭＡＣ培地
ＣＴ−ＳＭＡＣ培地（セフィキシム、亜テルル酸カリウム添加ソルビトールマッコンキー寒天培地）は、Ｓｏｌｂｉｔｏｌ ＭａｃＣＯＮＫＥＹ培地（ＯＸＯＩＤ社）５００ｍｌを１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌後、５０℃まで冷却したものに、Ｃｅｆｉｘｉｍｅ Ｔｅｌｌｕｒｉｔｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＯＸＯＩＤ社）１バイアルを滅菌水２ｍｌに溶解したものを混和した後、約１２ｍｌずつシャーレに分注して作製した。
【０１２６】
（３）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．の選択培地：ＤＨＬ寒天培地
ＤＨＬ寒天培地（日水製薬）は、処方に従って、加温溶解した後に約１２ｍｌずつシャーレに分注した。
【０１２７】
（４）Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓの選択培地：ＴＣＢＳ寒天培地
ＴＣＢＳ寒天培地（日水製薬）は処方に従って、加温溶解した後に約１２ｍｌずつシャーレに分注した。
【０１２８】
なお、本実施例では、上記培地以外にＴＳＢ、ＴＳＡプレート、ＳＥＢ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓの選択培地、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの選択培地を用いたが、いずれも実施例１と同様であることからその説明は省略する。ただし、ＴＳＢ、ＴＳＡプレートについては、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、及び／又はＶ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓを培養する場合にはＴＳＢに最終濃度でそれぞれ１．５％、３％のＮａＣｌ添加した。
【０１２９】
<方法>
本実施例では、前記６種の細菌が一の培地中で同時に培養可能であることを示すために、同定済みの各種細菌を増菌培地に接種する方法で行った。以下の操作は、原則として全て無菌状態にて行った。また、使用する試薬、器具は、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌処理したものを用いた。
【０１３０】
スラントから掻き取った１白金耳の各菌体を５ｍｌのＴＳＢにそれぞれ接種し、３７℃で一晩培養した。次に、ＰＢＳを用いて前培養液の１０倍連続希釈系列を作成し、１０ｍｌのＳＥＢに最終菌濃度が約１〜１０ｃｆｕ／ｍｌとなるように、それぞれ１０μｌずつ混合接種した。接種後、増菌培地を３７℃のインキュベータで１８時間静置培養した。培養後の菌数の測定は、ＰＢＳを用いて培養液の１０倍連続希釈系列を作成し、各細菌の選択培地プレートに１００μｌ塗抹して、培養後のコロニー数より算出した。なお、各接種菌量は、ＴＳＡに１００μｌ塗抹し、培養後のコロニー数より算出した。
【０１３１】
<結果>
実施例２の結果を図９に示す。この図で示すように、主要な食中毒細菌６属６種の全てが１８時間で１０５ｃｆｕ／ｍｌ以上まで増殖された。すなわち、ＳＥＢを増菌培地に用いた実施形態１の細菌培養方法によれば、日本で主要な食中毒細菌６種の全てを培養時間１８時間で同時に培養できることが確認された。
【実施例３】
【０１３２】
<<食品からの食中毒細菌の同時検出>>
【０１３３】
<目的>
実施形態２の細菌検出方法により、食品からＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を同時に検出可能であることを示す。
【０１３４】
<材料>
【０１３５】
（使用細菌種）
実施例２と同じ６属６種を使用した。
【０１３６】
（食品試料）
スーパーマーケットで市販の鶏肉、刺身用鯛の切り身、レタスを購入し、使用した。
【０１３７】
（各種培地の組成と調製）
実施例１及び実施例２と同様の各種培地を使用した。
【０１３８】
<方法>
本実施例では、食品から前記６属の細菌を同時に培養可能であることを確認するために、上記６属６種を食品に接種する方法で行った。以下の操作は、原則として全て無菌状態にて行った。また、使用する試薬、器具は、１２１℃で２０分間、オートクレーブで滅菌したものを用いた。
【０１３９】
食品試料２５ｇを２２５ｍｌのＳＥＢとともにフィルター付きストマッカー袋中で３０秒間破砕し、そのままインキュベータ中で３７℃、１８時間静置培養した。破砕液からＰＢＳを用いて１０倍連続希釈系列を作成し、ＴＳＡに１００μｌ塗抹して、培養後のコロニー数から食品試料中の生菌数を算出した。
【０１４０】
食品試料への食中毒細菌の接種は、まず、スラントから掻き取った１白金耳の食中毒細菌６種を５ｍｌのＴＳＢにそれぞれ接種し、３７℃で一晩培養した。次に、ＰＢＳを用いて前培養液の１０倍連続希釈系列を作成し、最終菌濃度で約１ｃｆｕ／ｇとなるように食品試料である鶏肉、刺身用鯛の切り身、レタスに混合接種した。各食品試料からの採菌と、培養は前記と同様に食品試料２５ｇから破砕によって採取した後、３７℃、１８時間静置培養した。その後、ＰＢＳを用いて培養液の１０倍連続希釈系列を作成し、実施例１及び２に記載の各細菌用選択培地に１００μｌ塗抹して、培養後のコロニー数から食品試料の生菌数を算出した。
【０１４１】
<結果>
表１に結果を示す。それぞれ鶏肉で２．３×１０５ｃｆｕ／ｇ、刺身用鯛の切り身で４．４×１０４ｃｆｕ／ｇ、レタスで１．２×１０６ｃｆｕ／ｇの共存菌（食品に元々存在していた細菌）が存在する食品サンプルにおいても、実施形態２の細菌検出方法により６種全ての標的食中毒細菌を検出できることが示された。
【表１】
【実施例４】
【０１４２】
<<リアルタイムＰＣＲを用いた食中毒細菌の同時検出>>
【０１４３】
<目的>
リアルタイムＰＣＲ法を用いた実施形態２の細菌検出方法により、日本で主要な食中毒細菌６属６種の全てを同時に検出可能であることを示す。
【０１４４】
<材料>
【０１４５】
（使用細菌種）
実施例２と同じ６属６種を使用した。
【０１４６】
（各種培地の組成と調製）
実施例１及び実施例２と同様の各種培地を使用した。
【０１４７】
（ＰＣＲ反応液）
本実施例では、６種の各細菌を認識するオリゴヌクレオチドを３種ずつに分けて２つの反応液（反応チューブＩ、反応チューブＩＩ）でＰＣＲ反応を行った。これは、本実施例で使用したリアルタイムＰＣＲ用サーマルサイクラーの蛍光色素の検出上限が４種であったためである。したがって、４種の蛍光色素を細菌検出用の３種及びモニター用の１種で２チューブに分けた。なお、１台で７種以上の蛍光色素を検出可能なリアルタイムＰＣＲ用２台のサーマルサイクラーであれば、主要な食中毒細菌６属６種を１の反応チューブで反応させることも可能である。
【０１４８】
（１）共通反応液組成
１０×ＥＸ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ） ２．５μｌ
ｄＮＴＰｓ ｆｏｒ ＥＸ Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ） ２．０μｌ
２０ｍＭ ＭｇＣｌ２（ＴＡＫＡＲＡ） ２．５μｌ
５×Ｒｏｘ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅ ０．５μｌ
５Ｕ／μｌ ＥＸ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ） ０．１２５μｌ
Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ ２．０μｌ
【０１４９】
（２）反応チューブＩ用プライマー及びプローブ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｎｕｃＡ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｎｕｃＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｎｕｃＡ ｐｒｏｂｅ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｅａｅＡ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｅａｅＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｅａｅＡ ｐｒｏｂｅ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｈｌｙＡ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ ｐｍｏｌ／μｌ ｈｌｙＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｈｌｙＡ ｐｒｏｂｅ ０．２５μｌ
【０１５０】
（３）反応チューブＩＩ用プライマー及びプローブ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｔｌ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｔｌ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｔｌ ｐｒｏｂｅ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｉｎｖＡ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｉｎｖＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｉｎｖＡ ｐｒｏｂｅ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｃｒｓ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｃｒｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｃｒｓ ｐｒｏｂｅ ０．２５μｌ
【０１５１】
前記共通反応液を各反応チューブ用のプライマー及びプローブと混合した。混合後のチューブを反応チューブＩ、反応チューブＩＩとしてリアルタイムＰＣＲに用いた。前記各プライマーおよびプローブの塩基配列は、表２に示す。
【表２】
【０１５２】
<方法>
【０１５３】
（培養）
実施例２で用いた６属６種の食中毒細菌をそれぞれ１〜１０ｃｆｕ／ｍｌとなるようにＳＥＢ１０ｍｌに混合接種し、１８時間３７℃にて静置培養した。基本的な培養方法は実施例２と同様である。当該培養は、実施形態２における培養工程に該当する。
【０１５４】
（核酸抽出）
前記培養後の培養液１．０ｍｌを６０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌後、ＤＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、付属のプロトコール（グラム陽性菌からの抽出法）に従ってゲノムＤＮＡの調製を行った。ただし、溶菌の際には１０ｍｇ／ｍｌ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅを２μｌ添加した。当該培養は、実施形態２における核酸抽出工程に該当する。
【０１５５】
（リアルタイムＰＣＲ反応）
上記反応液をそれぞれ０．２ｍｌリアルタイムＰＣＲ用マイクロチューブ中で調製し、全量が２５μｌになるように滅菌水を加えて十分に混合した後、リアルタイムＰＣＲ用サーマルサイクラー（ＭＸ３０００Ｐ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて核酸増幅反応を行った。反応条件は（９５℃で１分間→５５℃で１分間→７２℃で１分間）を１サイクルとして、４２サイクル行った。サイクルごとにそれぞれの蛍光色素強度を測定し、前記サーマルサイクラー付属の解析ソフトにて、解析を行った。
【０１５６】
ＰＣＲによる増幅産物の確認はアガロースゲル電気泳動で行った。アガロースゲルは、３％アガロースゲル／ＴＡＥアガロースゲルを使用した。当該電気泳動法は極めて一般的な技術であることから、ここではその説明を省略する。
【０１５７】
<結果>
図１０に本実施例のリアルタイムＰＣＲにおけるサイクルごとの相対蛍光強度プロットを示す。この図で示すように、２本の反応チューブの全ての蛍光色素で増幅が確認され、６種の食中毒細菌を同時に検出できることが示された。図１０によれば、各細菌の核酸増幅は３０サイクル前後で十分に検出できることも示された。したがって、サーマルサイクラーにセッティング後は、２〜２．５時間程度で検出結果が得られることとなる。実施例１で示すように、細菌培養方法による培養時間が１２時間から１８時間で足りることから、接種から検出までを２４時間以内で行うことが可能なことも実証された。なお、図１１で示すように、アガロースゲル電気泳動においても目的サイズの増幅が確認できた。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】各ｐＨ値の増菌培地におけるＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの培地容量当たりの菌数を示す図
【図２】Ｂ．ｃｅｒｅｕｓとＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを同時に培養したときの、各培養時間におけるそれぞれの細菌の培地容量当たりの菌数と培地のｐＨ値の関係を示す図
【図３】Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、及びＶ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓを同時に培養したときの、それぞれの細菌の培地容量当たりの菌数を示す図
【図４】実施形態４における細菌培養方法のフローチャート図
【図５】実施形態２のフローチャートの一例（１）
【図６】実施形態２のフローチャートの一例（２）
【図７】実施形態２のフローチャートの一例（３）
【図８】実施例１の結果を示す図
【図９】実施例２の結果を示す図
【図１０】実施例４におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示す図
【図１１】実施例４におけるＰＣＲの核酸増幅を示すアガロース電気泳動の結果を示す図
【符号の説明】
【０１５９】
図２ ＢＣ：Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、ＬＭ：Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ
図３ ＢＣ：Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、ＬＭ：Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、ＶＰ：Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ
図８ ＢＣ：Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、ＬＭ：Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ
図９ ＢＣ：Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、ＬＭ：Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、ＶＰ：Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、ＳＡ：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、ＳＥ：Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｏ１５７：Ｅ．ｃｏｌｉ ０１５７
図１０ ＢＣ：Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、ＬＭ：Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、ＶＰ：Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、ＳＡ：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、ＳＥ：Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｏ１５７：Ｅ．ｃｏｌｉ ０１５７
図１１ Ｍ：１００ｐｂマーカー、１：反応チューブＩ（ポジティブコントロール）、２：反応チューブＩＩ（ポジティブコントロール）、３：反応チューブＩ（培養液サンプル）、４：反応チューブＩＩ（培養液サンプル）、５：反応チューブＩ（ネガティブコントロール）、６：反応チューブＩＩ（ネガティブコントロール）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数属の細菌を単一培地で同時に培養する方法と、その培養方法を利用した細菌検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食中毒細菌の検出は、食の安全を確保する上で重要な検査技術の一つである。そのため、食品業界などでは分子遺伝学的手法や免疫学的手法に基づいた各種食中毒細菌の簡易迅速検出方法の開発が進んでいる。中でも特定の細菌の遺伝子などに特異的な塩基配列を増幅して検出を行う核酸増幅法は、その感度や迅速性、並びに特異性の高さから現在様々な食中毒細菌検出法に応用されている。
【０００３】
しかし、核酸増幅法を利用した検査法であっても、鋳型としての核酸を必要量得るには一定以上の菌数が必要となる。当該検出に必要な菌数の下限値は約１×１０３ｃｆｕ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）／ｍｌであり、食品から細菌を高感度に検出するためにはほとんどの場合で標的細菌を培養する必要がある。ところが、一般に性状の異なる細菌は培養条件も異なることから、複数種の細菌を検出するためには、標的細菌ごとにその至適培養条件で培養しなければならない。そのため、食中毒細菌の検出方法の簡易化や迅速化には、当該培養に要する手間や培養時間が大きな問題となる。このような問題を解決する手段としては、複数の食中毒細菌を一の培地で同時に培養する方法が挙げられる。ただし、そのためには複数種若しくは複数属の細菌を同時に培養可能な増菌培地の開発が不可欠となってくる。
【０００４】
複数属の食中毒細菌を培養可能な増菌培地としては、これまでＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属とＬｉｓｔｅｒｉａ属の細菌を同時に培養可能なＵＥＢ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ）（非特許文献１）や、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを同時に培養する緩衝ペプトン水を用いた培地などが知られている（非特許文献２）。しかし、これらの増菌培地は、いずれも、２、３種の食中毒細菌を同時に培養できるに過ぎない。したがって、より多くの食中毒細菌を同時に培養可能な増菌培地が求められている。
【非特許文献１】Ｂａｉｌｅｙ ＪＳ & ＮＡＣｏｘ ＮＡ，（１９９２）Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔ．，５５；２５６−２５９
【非特許文献２】Ａｌａｒｃｏｎ Ｂ，Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｎａｓ Ｖ，Ｃｉｆｕｅｎｔｅｓ Ａ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｒ & Ａｚｎａｒ Ｒ（２００４）Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．,５２；７１８０−７１８６
【非特許文献３】Ｎａｋａｔａ ＨＭ & Ｈａｌｖｏｒｓｏｎ ＨＯ，（１９６０）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，８０；８０１−８１０
【非特許文献４】Ｂｕｄｕ−Ａｍｏａｋｏ Ｅ，Ｔｏｏｒａ Ｓ，Ａｂｌｅｔｔ ＲＦ & Ｓｍｉｔｈ J，（１９９２）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５８；３１７７−３１７９
【非特許文献５】Ｂｕｓｃｈ ＳＶ & Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ＣＷ，（１９９２）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５８；１４−２０
【非特許文献６】大野茂男、西村善文 監修、（１９９７）細胞工学 別冊 実験プロトコールシリーズ タンパク実験プロトコール
【非特許文献７】Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．
【非特許文献８】Ｐｒｉｅｓｔ ＦＧ，Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ Ｍ，Ｔｏｄｄ Ｃ，（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３４；１８４７−１８８２
【非特許文献９】Ｓｅｅｌｉｇｅｒ ＨＰＲ & Ｊｏｎｅｓ Ｄ，（１９８６）Ｇｅｎｕｓ Ｌｉｓｔｅｒｉａｓ，Ｉｎ Ｂｅｒｇｅｙ’Ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ２， ｅｄ． Ｂｙ Ｓｎｅａｔｈ ＰＨＡ，ｐｐ１２３５−１２４５，Ｗｉｌｌｉａｍｓ & Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，ＵＳＡ．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、食中毒細菌を簡易かつ迅速に検出するために、主要な食中毒細菌が属する複数属の好気性細菌を同時に培養可能な細菌培養方法と、当該培養方法を用いた迅速な細菌検出方法を提供することである。また、複数の菌属の好気性細菌を同時に培養できる増菌培地を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明者らは主要な食中毒細菌が属する複数属の好気性細菌を同時に培養できる培養条件について研究を行った。本願の発明は、かかる研究結果に基づくものであり、以下の細菌培養方法、細菌検出方法、増菌培地、細菌検出用キットに関するものである。
【０００７】
本願第１の発明は、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を一の増菌培地中で同時に培養可能な細菌培養方法であって、増菌培地のｐＨ値を５より大きく１０以下に保持して培養する細菌培養方法である。
【０００８】
本願第２の発明は、さらに、Ｖｉｂｒｉｏ属の好気性・好塩性細菌を一の増菌培地中で同時に培養可能な細菌培養方法であって、増菌培地の塩濃度が水を溶媒として質量対容量百分率で１％〜４％であることを特徴とする第１の発明に記載の細菌培養方法である。
【０００９】
本願第３の発明は、増菌培地が水を溶媒として糖の含有率を質量対容量百分率で０．００１％以下とすることを特徴とする第１の発明又は第２の発明に記載の細菌培養方法である。
【００１０】
本願第４の発明は、増菌培地が水を溶媒として質量対容量百分率で、ペプトン：１％〜３％、リン酸二カリウム：０．１５％〜０．３５％、塩化ナトリウム：１％〜４％、及び酵母エクストラクト：０．０１％〜０．１％、よりなることを特徴とする第３の発明に記載の細菌培養方法である。
【００１１】
本願第５の発明は、少なくともＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属のうち、二以上の属の好気性細菌を同時に検出できる細菌検出方法であって、第１の発明から第４の発明のいずれか一に記載の細菌培養方法で培養する培養工程と、培養工程後に得られる細菌から所望の細菌を検出する検出工程と、を有する細菌検出方法である。
【００１２】
本願第６の発明は、検出工程が、さらに、培養工程後に得られる菌体から核酸を抽出する核酸抽出工程と、核酸抽出工程で得られる核酸に対して、所望の細菌のゲノムＤＮＡ上でその細菌に特有な塩基配列を認識するオリゴヌクレオチドを用いて所望の細菌を検出する核酸検出工程と、を有する第５の発明に記載の細菌検出方法である。
【００１３】
本願第７の発明は、核酸検出工程が、さらに、核酸抽出工程で得られる核酸を鋳型として、所望の細菌のゲノムＤＮＡ上でその細菌に特有な塩基配列を認識するオリゴヌクレオチドを用いて、核酸増幅法により所望の細菌の核酸を増幅する核酸増幅工程と、前記核酸増幅工程で増幅した核酸に基づいて所望の細菌を検出する増幅核酸検出工程と、を有する第６の発明に記載の細菌検出方法である。
【００１４】
本願第８の発明は、核酸増幅工程が二以上の細菌に対して、各細菌のゲノムＤＮＡ上でそれぞれの細菌に特有な塩基配列を認識するオリゴヌクレオチドを用いて、一の反応液中で同時にそれぞれの細菌の核酸を増幅する第７の発明に記載の細菌検出方法である。
【００１５】
本願第９の発明は、核酸検出工程がリアルタイムＰＣＲ法を用いる第７の発明、又は第８の発明に記載の細菌検出方法である。
【００１６】
本願第１０の発明は、核酸検出工程が前記所望の細菌のゲノムＤＮＡ上で、その細菌に特有な塩基配列を認識するオリゴヌクレオチドをプローブとしたハイブリダイゼーション法によって検出する第６の発明に記載の細菌検出方法である。
【００１７】
本願第１１の発明は、前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の各好気性細菌は、それぞれＳ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、及びＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである第５の発明から第１０の発明のいずれか一に記載の細菌検出方法である。
【００１８】
本願第１２の発明は、水を溶媒としたときの質量対容量百分率が、糖：０．００１％以下、ペプトン：１％〜３％、リン酸二カリウム：０．１５％〜０．３５％、塩化ナトリウム：１％〜４％、及び酵母エクストラクト：０．０１％〜０．１％となることを特徴とする増菌培地である。
【００１９】
本願第１３の発明は、前記ペプトンが自身の質量に対して１０％〜２０％のソイトンを含有することを特徴とする第１２の発明に記載の増菌培地である。
【００２０】
本願第１４の発明は、第１２の発明、又は第１３の発明に記載の増菌培地を含む細菌検出用キットである。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の細菌培養方法によれば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を単一の増菌培地で同時に培養できる。これによって、食中毒細菌の培養方法の簡易化、迅速化が図れる。また、それに伴って培地や培養装置、光熱費などの培養に要するコスト削減もできる。
【００２２】
本発明の細菌検出方法によれば、検査対象物から細菌を検出するまでの操作を簡易化できる。また、検出までに要する時間を短縮化できる。加えて、本発明の他の細菌検出法によれば、複数属の食中毒細菌を同時に検出できる。また、それによって、被検体からの細菌検出をより迅速に行える。
【００２３】
本発明の増菌培地によれば、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の細菌を同時に培養する際に、培養中も適正なｐＨ値を保持できる。それゆえ培養中に培地のｐＨ調節を行う必要がなくなり、培養操作の一層の簡易化、迅速化が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下で前記発明を実施するための最良の形態について説明する。ただし、本願の発明はこれらの実施形態に何ら限定されるものではなく、その作用効果を奏する範囲において種々なる態様で実施しうる。なお、実施形態１は、主に請求項１から４、及び請求項１２、１３に関する。また、実施形態２は主に請求項５から１１に関する。また、実施形態３は主に請求項１４に関する。
【００２５】
<<実施形態１>>
【００２６】
<実施形態１：概要>
実施形態１は、細菌培養方法、及び増菌培地に関する。本実施形態の細菌培養方法は、増菌培地のｐＨ値を５より大きく１０以下に保持して培養することで、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を同時に培養できることを特徴とする。また、本実施形態の増菌培地は、培養中に特段の操作を加えることなく、前記ｐＨ値を保持できることを特徴とする。
【００２７】
<実施形態１：発明に至る経緯>
本実施形態の細菌培養方法の詳細な説明に入る前に、まず、本発明に至った経緯について述べる。前述のように、課題解決のために本発明者らは主要な食中毒細菌が属する複数属の好気性細菌を同時に培養できる培養条件について研究を行った。現在、日本における主要な食中毒細菌としては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌：以下「Ｓ．ａｕｒｅｕｓ」とする）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（サルモネラ菌：以下「Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ」とする）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７（病原大腸菌Ｏ１５７：以下「Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７」とする）、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（腸炎ビブリオ：以下「Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ」とする）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ（嘔吐型セレウス菌：以下「Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ」とする）、及びＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（リステリア菌：以下「Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ」とする）などが挙げられる。これら６属６種の細菌をＴＳＢなどの一般的な増菌培地を用いて普通に用いられる培養条件下で同時に培養した結果、好塩性のＶ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓの増殖が抑制される結果が得られた。当該細菌の増殖抑制は、増菌培地の塩濃度を上げることで解決できた。
【００２８】
また、前記６属の細菌を同時培養した場合、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖が抑制される結果が得られた。Ｌｉｓｔｅｒｉａ属を同時に培養できる培養条件を見出すために、本発明者らは当該増殖抑制の原因を調べた。その結果、増殖抑制はＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓとＢ．ｃｅｒｅｕｓとを同時培養した際に生じること、及び当該増殖抑制はＢａｃｉｌｌｕｓ属の増殖による増菌培地のｐＨ値の低下に起因することを突き止めた。この発見に基づき、増菌培地のｐＨ値を５より大きく１０以下に保持して培養を行うことによって同時培養が困難であったＢａｃｉｌｌｕｓ属とＬｉｓｔｅｒｉａ属の二属を一の増菌培地で同時に培養できるという培養条件を見出した。この培養条件に加えて増菌培地の塩濃度を上げることで、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓを含む、上記６属の細菌全てを一の増菌培地で同時に培養することが可能となった。
【００２９】
さらに、本発明者らはＢａｃｉｌｌｕｓ属が増殖してもｐＨ値が低下しない増菌培地の開発を行った。非特許文献３よりＢａｃｉｌｌｕｓ属の増殖による増菌培地のｐＨ値の低下は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属が増菌培地中のブドウ糖を代謝分解する過程で有機酸などの酸を産生し、それを培地中に排出することが原因であると考えられた。そこで、増菌培地から糖を可能な限り除去し、それを補完する栄養素を添加することでＢａｃｉｌｌｕｓ属の増殖によってもｐＨ値が大幅に低下することなく、前記６属の細菌を同時に培養可能な増菌培地を開発することに成功した。本実施形態の細菌培養方法と増菌培地の発明は、かかる発見に基づくものである。
【００３０】
<実施形態１：構成>
本実施形態の細菌培養方法、及び増菌培地の各構成について以下で説明する。
【００３１】
（（細菌培養方法の構成））
【００３２】
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を同時に培養する場合）
少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を一の増菌培地中で同時に培養する本実施形態の細菌培養方法の構成要件は、増菌培地のｐＨ値を５より大きく１０以下に保持して培養することである。
【００３３】
「好気性細菌」とは、物質の代謝に酸素を必要とする細菌の総称をいう。ただし、本願では完全嫌気状態であっても増殖可能な通性好気性細菌（又は通性嫌気性細菌）も含むものとする。
【００３４】
「Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の好気性細菌」は、本願では特に増殖により培地のｐＨ値の低下を生じさせる好気性の菌種を指す。すなわち、増殖に伴って発生する酸を増菌培地中に排出する好気性の菌種をいう。例えば、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓが該当する。増殖条件に関して、これらの菌種は類似の性状を有している（非特許文献８）。
【００３５】
「Ｌｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌」は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｇｌｉｇｅｒｉなどが該当する。増殖条件に関して、これらの菌種は類似の性状を有している（非特許文献９）。
【００３６】
「増菌培地」とは、細菌を増殖させることを目的とする培地である。これについては後で詳述する。
【００３７】
「一の増菌培地」とは、同一容器内にある単一の増菌培地を意味する。
【００３８】
「同時に培養」とは、複数の菌種を一の増菌培地に接種した後、それらを共に増殖させることをいう。共に増殖しているかの判断基準は、例えば、各細菌の培地容量当たりの菌数がそれぞれの定常期までに所定の値以上あることとすればよい。「所定の値」としては、一例として約１×１０３ｃｆｕ／ｍｌが挙げられる。当該数値は、核酸増幅法などを用いた検出方法の検出下限菌数に相当するため、所定の値の最下限値としては適当だからである。各菌種が所定の菌数に達するまでの時間は問わない。例えば、ある菌種は培養後２時間で所定の菌数に達して、その１時間後には定常期に入り、他の種は培養後１０時間で所定の菌数に達した場合であっても、両者は同時に培養されたものとする。
【００３９】
「増菌培地のｐＨ値を５より大きく１０以下に保持」とは、増菌培地全体のｐＨ値を培養中に５よりも大きく１０以下の範囲内に保つことである。増菌培地のｐＨ値が当該範囲内であれば多少の変動は問わない。しかし、ｐＨ値が当該範囲外の場合は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の細菌を同時に培養する上で好ましくない。
【００４０】
増菌培地のｐＨ値をｐＨ５以下にすることが好ましくない理由は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属細菌の増殖が抑制されるためである。これについては、図１を用いて以下で詳細に説明する。図１は、各ｐＨ値の増菌培地におけるＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの培地容量当たりの菌数を示している。図１の実験は、ＨＣｌを用いて各ｐＨ値に調整した滅菌済みＴＳＢにＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを無菌条件下で最終菌濃度が１〜１０ｃｆｕ／ｍｌとなるように接種し、３７℃で１８時間静置培養後、ＴＳＢ寒天培地（以下「ＴＳＡ」とする）に希釈塗沫してコロニー数をカウントしたものである。この図が示すように、増菌培地のｐＨ値がｐＨ５以下の場合には、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓはほとんど検出できない。したがって、増菌培地のｐＨ値を５以下にすることはＬｉｓｔｅｒｉａ属細菌の増殖が抑制されてしまうため好ましくない。Ｂａｃｉｌｌｕｓ属とＬｉｓｔｅｒｉａ属の効率的な増殖を考慮した場合、増菌培地のｐＨ値は、５．２以上であることが好ましく、５．５以上であることがより好ましい。なお、ＴＳＢ、ＴＳＡの組成については、実施例１で詳述する。
【００４１】
また、増菌培地のｐＨ値が１０を越えることが好ましくない理由は、好アルカリ性細菌を除く多くの細菌は、ｐＨ１０を越える強アルカリ下で増殖が抑制されることが知られているからである。図示はしないが、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属細菌もｐＨ１０を越える環境下で増殖が抑制される（非特許文献９）。したがって、増菌培地のｐＨ値は１０を越えることは好ましくない。Ｂａｃｉｌｌｕｓ属とＬｉｓｔｅｒｉａ属の効率的な増殖を考慮した場合、増菌培地のｐＨ値は９以下であることが好ましく、８．７以下であることがより好ましい。
【００４２】
ところで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属とＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を同時に培養する場合、通常の培養条件ではｐＨ値を上記範囲内に保持することは難しい。これは、前述のようにＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌の増殖により、増菌培地のｐＨ値が低下するからである。図２は、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓとＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを同時に培養したときの、各培養時間におけるそれぞれの細菌の培地容量当たりの菌数と培地のｐＨ値の関係を示している。図２の実験では、まず、滅菌済みＴＳＢにＢ．ｃｅｒｅｕｓとＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのそれぞれを最終菌濃度が約１００ｃｆｕ／ｍｌとなるように無菌条件下で接種し、３７℃で静置培養した。続いて、接種直後から１８時間後まで、２時間ごとに増菌培地溶液の一部を採取した後、それぞれの細菌の選択培地プレートに希釈塗沫して形成されたコロニー数をカウントした。また、この時同時に増菌培地溶液の一部を遠心し、上清を濾過滅菌後にｐＨ測定を行った。選択培地の組成については、実施例１で詳述する。この図で示すように、増菌培地のｐＨ値は、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓが増殖して定常期に入る培養後１２時間以降に急速に低下していることがわかる。また、増菌培地のｐＨ値の低下に伴い、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖がほとんど抑制されていることも示されている。このように、受動的な培養方法ではＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌が増殖することで、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属の増殖が抑制されるという二属を同時培養する上で相反する問題が発生する。
【００４３】
そこで、本実施形態は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属を培養中であっても増菌倍地中のｐＨ値を能動的に５より大きく１０以下の範囲内に保持させることを構成要件としている。それによって、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を一の増菌倍地中で同時に培養ことが可能となる。増菌培地のｐＨ値を保持する方法については、「実施形態１：方法」の項で述べる。また、アルカリ側に関しては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を同時に培養した場合であっても、一方の菌種の増加によって増菌培地のｐＨ値が増加するということはない。したがって、接種時に増菌培地のｐＨ値を１０以下に調整しておけばよい。
【００４４】
なお、増菌培地のｐＨ値を一時的に前記ｐＨ値の範囲外とした場合であっても、培養中に前記範囲内にｐＨ値を戻す場合、あるいはｐＨ値が戻る場合には、増菌培地のｐＨ値は当該範囲内に保持されているものとみなす。
【００４５】
「少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を一の増菌倍地中で同時に培養できる」とは、検査対象物中にＢａｃｉｌｌｕｓ属とＬｉｓｔｅｒｉａ属の各好気性細菌が存在する場合には、少なくとも当該二属の菌種に関しては、単一の培地で同時に培養できることをいう。したがって、本実施形態の細菌培養方法で同属の複数菌種が同時に培養されてもよい。また、検査対象物中に他の好気性細菌が存在する場合には、それらが当該二属の細菌と共に培養されてもよい。特に食中毒細菌を含む他の菌属が同時に培養されることは、本発明の目的に資するため好ましい。一例を挙げれば、ＴＳＢ培地を用いた本実施形態の細菌培養方法では、前記二属以外に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属（ここではＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅなどの非好塩性菌種に限る）などの同時培養が可能である。また、これ以外にもＳｈｉｇｅｌｌａ属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ属などが挙げられる。
【００４６】
（前記二属に加えて、さらにＶｉｂｒｉｏ属の好気性・好塩性細菌を同時培養する場合）
少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌に加えて、さらにＶｉｂｒｉｏ属の好気性・好塩性細菌を一の増菌培地中で同時に培養する本実施形態の細菌培養方法は、増菌培地のｐＨ値を５より大きく１０以下に保持して培養することに加えて、増菌培地の塩濃度を１％〜４％とすることを構成要件とする。このうち、前述した構成要件以外について、以下で説明する。
【００４７】
「Ｖｉｂｒｉｏ属の好気性・好塩性細菌」とは、Ｖｉｂｒｉｏ属に属する好気性細菌種であり、かつ増殖に一定濃度以上の塩を必要とする菌種をいう。例えば、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｄａｍｓｅｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｓが該当する。増殖条件に関して、これらの菌種は類似の性状を有している。
【００４８】
「塩濃度」とは、水を媒体とするときの塩の質量対容量（ｇ／ｍｌ）百分率を意味する。ここでいう「塩」とは、主として塩化ナトリウムを意味するが、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム、及び／又は塩化カリウムなどを含んでいてもよい。
【００４９】
塩濃度を１％以上４％以下とする理由は、好塩性Ｖｉｂｒｉｏ属をはじめとする好塩性菌種は海水中に生息するものが多く、増殖や生息には一般に海水の塩濃度に近い環境を必要とするためである。海水の塩濃度は約３．４％である。したがって、本実施形態では塩濃度を１％以上４％以下に設定した。この範囲外では、当該菌種の増殖が抑制される可能性があるため好ましくない。
【００５０】
塩濃度が好塩性Ｖｉｂｒｉｏ属の増殖に与える影響を、一例を挙げて説明する。図３は、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、及び好塩性細菌であるＶ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓを同時に培養したときの、それぞれの細菌の培地容量当たりの菌数を示している。（ａ）はＴＳＢ（塩濃度０．５％）で培養した結果を、また（ｂ）はＴＳＢにおいてＮａＣｌを質量対容量百分率で１．５％とした増菌培地（塩濃度１．５％）で培養した結果である。各実験は、それぞれの滅菌済み増菌培地に最終菌濃度が約１〜１０ｃｆｕ／ｍｌとなるように無菌状態下で接種し、３７℃で１８時間静置培養した後、ＴＳＡに希釈塗沫してコロニー数をカウントしたものである。これらの図で示すように、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓは、塩濃度０．５％下では増殖がほとんど抑制された。一方、塩濃度１．５％下では約１×１０６ｃｆｕ／ｍｌと、細菌検出上十分な菌数まで増殖した。なお、図３ではＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖が抑制されているが、これは当該実験に用いた増菌培地のｐＨ値を前記範囲内に保持していないためである。
【００５１】
以上のように、本実施形態においてＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属と共にＶｉｂｒｉｏ属の好気性・好塩性菌種を同時培養する場合には、増菌培地の塩濃度を１％以上４％以下とするのが好ましい。
【００５２】
（（増菌培地））
【００５３】
本実施形態の細菌培養方法では、培養中の増菌培地のｐＨ値を５より大きく１０以下の範囲内に能動的に保持する必要がある。増菌培地の組成は、培養中の増菌培地のｐＨ値を保持する方法に応じて適宜選択する。例えば、後述の「実施形態１：方法」の項の「培養工程」で述べる（Ａ）の増菌培地のｐＨ値を外部から強制調整する方法であれば、細菌培養に一般的に使用される汎用培地のＴＳＢを使用すればよい。また、（Ｂ）の増菌培地にｐＨ緩衝能を有する試薬を加えておく方法の場合にも同じくＴＳＢが使用できる。ただし、この場合、溶媒の１／１０容量程度でバッファとしてＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ：１３７ｍＭ ＨＣｌ、８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）などを加える必要がある。さらに、Ｖｉｂｒｉｏ属の好気性・好塩性細菌を一の増菌培地中で同時に培養するためには、（Ａ）、（Ｂ）のいずれの場合にも、増菌培地の塩濃度が最終濃度で１％〜４％となるように、前記ＴＳＢに塩化ナトリウムなどを追加しておけばよい。
【００５４】
ところで、前述のように、通常の細菌の培養条件ではＢａｃｉｌｌｕｓ属の増殖で増菌培地のｐＨ値の低下が生じてしまう。このＢａｃｉｌｌｕｓ属の増殖による増菌培地のｐＨ値の低下は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌が糖を代謝して酸を産生し、それを培地中に排出することに起因する。したがって、増菌培地中の糖を除去するか、若しくは限りなく少量に抑えれば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の増殖による増菌培地のｐＨ値の低下を抑制できる。具体的には、例えば、増菌培地中の糖の含有率を水を溶媒として質量対容量百分率で０．００１％以下となるようにすればよい。ただし、この場合、糖に代わる栄養素を増菌培地に加えて栄養的に補完することが好ましい。糖に代わる栄養素としては、各種ビタミン、ミネラル、核酸物質などを豊富に含むことが知られているイーストエクストラクト（非特許文献４、５）などが挙げられる。
【００５５】
本発明者らは、上記の点を考慮して本実施形態の増菌培地の趣旨に即した新たな増菌培地を開発した。本願では、当該新たな増菌培地を以下便宜的にＳＥＢ（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ）と呼ぶ。ＳＥＢは、ＴＳＢの組成に基づき糖含有量を質量対容量百分率０．００１％以下に抑え、それを補完するためにイーストエクストラクトを加えた増菌培地である。当該ＳＥＢは、水を溶媒としたときの質量対容量百分率でペプトン：１％〜３％、リン酸二カリウム：０．１５％〜０．３５％、塩化ナトリウム：１％〜４％、及び酵母エクストラクト：０．０１％〜０．１％を主な構成要素とする。前記ペプトンは、タンパク質を加水分解酵素により部分分解処理して断片化したものであれば特に限定はしない。例えば、カゼインをトリプシン処理したトリプトン（ＤＩＦＣＯ社）、細菌をペプシン処理したバクト・ペプトン（ＤＩＦＣＯ社）が利用できる。細菌のより効率的な増殖には、当該ペプトンの一部に大豆タンパク質を加水分解酵素により部分分解したソイトン（ＤＩＦＣＯ社）をペプトンの質量に対して１０％〜２０％加えるとよい。なお、前記ＳＥＢの組成はＶｉｂｒｉｏ属の好気性・好塩性細菌も同時に培養できるように、塩化ナトリウムの含有率を１％〜４％としているが、好塩性細菌を同時に培養する必要がない場合には、塩化ナトリウムの含有率はＴＳＢと同様の０．５％程度としても構わない。ＳＥＢを用いたＢａｃｉｌｌｕｓ属とＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌の同時培養の実施例は、実施例１、及び２で述べる。
【００５６】
複数菌種を同時に培養することを目的とする場合には、増菌培地の状態は原則として液体培地であることが好ましい。ただし、コロニーを形成させたい場合など、必要に応じて寒天培地などの固体培地を用いてもよい。
【００５７】
<実施形態１：方法>
実施形態１の細菌培養方法について例を挙げて説明する。図４は本実施形態における細菌培養方法のフローチャートの一例である。この図で示すように、本実施形態の細菌培養方法は、増菌培地調製工程（Ｓ０４０１）、接種工程（Ｓ０４０２）、培養工程（Ｓ０４０３）で構成される。以下で各工程について説明する。なお、以下の一連の操作は原則として無菌的環境下で行い、また、使用する培地や試薬、器具なども原則として滅菌済みのものを使用する。
【００５８】
「増菌培地調製工程」（Ｓ０４０１）とは、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を同時に培養できる増菌培地を調製する工程である。当該増菌培地は、前述の構成を有する増菌培地を適宜選択して調製すればよい。当該工程で用いる増菌培地は、液体培地が望ましい。増菌培地の分量は、用途に応じて定めるようにすればよい。例えば、本実施形態の培養方法により得られた培養液を用いて実施形態２で述べる核酸増幅法により所望の細菌を検出するのであれば、増菌培地の分量は５ｍｌ〜２０ｍｌあれば足りる。また、古典的なサザンハイブリダイゼーション法などを用いて所望の細菌を検出するのであれば、増菌培地の分量は５０ｍｌ〜５００ｍｌ程あることが好ましい。調製後の増菌培地は、１２１度で１５分〜２０分ほどオートクレーブ滅菌して使用する。なお、市販の増菌培地を用いるなど既存の培地を利用する場合であれば、本工程は省略してもよい。
【００５９】
「接種工程」（Ｓ０４０２）とは、検査対象物を増菌培地に添加することで、検査対象物中の細菌を増菌培地に接種する工程である。ここでいう検査対象物とは、本願発明を鑑みれば主として食品が該当するが、それ以外のものであってもよい。例えば、食品を包んでいたラップやパック、又は食器が挙げられる。検査対象物を増菌培地に添加する方法は、検査対象物中に存在する細菌を増菌培地に接種できる方法であれば特に限定しない。例えば、検査対象物である食品が液体や流動物（カレーのルーなど）であれば、その一部を直接増菌培地中に添加すればよい。また、検査対象物が固体食品などであれば、当該検査対象物をホモジェナイズした後、ホモジェネートの一部を直接増菌培地中に添加するか、ホモジェネートに無菌ＰＢＳなどのバッファを加えて混合した後、その懸濁液、もしくは上清を増菌培地中に添加してもよい。あるいは、当該検査対象物を無菌の増菌培地と共にホモジェナイズしたものをそのまま培養する方法であってもよい。さらに、食器やパックであれば、検査箇所を無菌ＰＢＳなどで洗浄し、当該洗浄後のＰＢＳを直接増菌培地中に添加するなどすればよい。
【００６０】
なお、本実施形態の細菌培養方法は、状況に応じて接種工程（Ｓ０４０２）と次の培養工程（Ｓ０４０３）との間に前培養工程を設けてもよい。「前培養工程」とは、培養工程の増菌培地に接種する菌数を所定数以上にするために予め比較的少量の増菌培地に検査対象物を接種して細菌数を増加させる工程である。当該工程を経るか否かは、通常、培養工程に用いる増菌培地の容量によって判断する。例えば、増菌培地の分量が１００ｍｌを越えるような場合には、当該工程を経ることが好ましい。細菌の対数増殖期までの時間を短縮できるからである。逆に、５０ｍｌ以下のような少量の培地への接種の場合、当該前培養工程を経なくともよい。前培養工程におけるｐＨ値の保持や塩濃度などの培養条件は、培養工程と同様にすることが望ましい。通常の培養条件では前培養の段階で各細菌の増殖に偏重を来たす可能性があるためである。前培養は、３６℃〜３８℃で６時間〜１２時間程度行えばよい。前培養後は、培養液を適量直接、若しくはＰＢＳなどの無菌バッファで適当に希釈した後、増菌培地に接種する。
【００６１】
「培養工程」（Ｓ０４０３）とは、接種後の増菌培地を一定条件下に置き、接種された細菌を培養する工程である。一定条件下とは、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を同時に培養する場合には、培養中の増菌培地のｐＨ値を５より大きく１０以下に保持することである。また、さらにＶｉｂｒｉｏ属の好気性・好塩性細菌を同時に培養するには、増菌培地の塩濃度を１〜４％としておくことである。
【００６２】
前述のように、通常の培養条件ではＢａｃｉｌｌｕｓ属の増殖によりｐＨ値の低下が生じる。したがって、本実施形態の細菌培養方法では、培養中の増菌培地のｐＨ値を能動的に保持する必要がある。以下、培養中に増菌培地のｐＨ値を保持する方法について具体例を挙げて説明する。
【００６３】
（Ａ）増菌培地のｐＨ値を外部から強制調整する方法
増菌培地のｐＨ値をモニタリングしながら、外部から薬剤などを加えて強制的にｐＨ値を調整することによって、増菌培地のｐＨ値を所定の範囲内に保持させる方法である。当該方法の具体例としては、滴定が挙げられる。例えば、培養中に増菌培地のｐＨ値をｐＨメーターで計測し、ｐＨ値が５以下となった場合には、０．１Ｎ程度のＮａＯＨ溶液を滴定して、５より大きく１０以下の範囲内となるように調整すればよい。逆にｐＨ値が１０を越えた場合には０．１Ｎ程度のＨＣｌ溶液を滴定して、同様に５より大きく１０以下の範囲内となるように調整すればよい。この方法で用いる増菌培地は汎用性の高い通常の増菌培地でよい。例えば、ＴＳＢなどが利用できる。なお、塩濃度については、必要に応じてＴＳＢに適宜添加し、調整すればよい。これらの調整は滴定装置とｐＨメーターを連結して、又は一体化して、自動で行えるようにすると便利である。
【００６４】
（Ｂ）増菌培地にｐＨ緩衝能を有する試薬を加えておく方法
ｐＨレンジが５より大きく１０以下の範囲内にあり、かつ細菌の増殖に影響をほとんど及ぼすことのない試薬を増菌培地に加えておく方法である。増菌培地自身がｐＨ緩衝能をもつことから、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の増殖によりｐＨ値の低下が生じても、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌が増殖可能なｐＨ値に自動調整されることから便利である。具体例としてはＰＢＳを増菌培地の溶媒として１／１０容量程度加える方法が挙げられる。当該方法で培養を行う場合には、前記増菌培地調製工程（Ｓ０４０１）で、ｐＨ緩衝能を有する試薬を加えた増菌培地を調製しておけばよい。
【００６５】
（Ｃ）糖含有量を抑制した増菌培地を使用する方法
前記「増菌培地」の項で述べたように増菌培地における糖の含有量を抑制する、若しくは糖を除去することで、培養中のｐＨ値の低下を防止する方法である。当該方法で培養を行う場合には、前記増菌培地調製工程（Ｓ０４０１）で、予め糖含有量を抑制した増菌培地を調製しておけばよい。この場合、前述のように増菌培地には糖を代替する栄養素を添加することが好ましい。増菌培地の具体例としては、前記「増菌培地」の項で述べたＳＥＢなどが挙げられる。
【００６６】
培養温度は３６℃〜３８℃、培養時間は６時間〜２４時間程度行えばよい。通常は、３７℃で１２時間〜２０時間程度培養すれば足りる。増菌培地は静置培養、振とう培養のいずれであってもよい。静置培養の場合にはインキュベーターなどを、また振とう培養の場合には恒温振とう培養器などを用いてもよい。
【００６７】
以上の工程を経ることで、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を同時に培養できる。なお、本実施形態の細菌培養方法に基づいた細菌培養の結果は、実施例２、及び３に示した。
【００６８】
<実施形態１：効果>
本実施形態の細菌培養方法によれば、複数属の食中毒細菌を単一培地で同時に培養することが可能となり、培養方法の簡易化、迅速化ができる。また、実施形態２の細菌検出方法における検出時間の短縮化にも繋がる。
【００６９】
本実施形態の増菌培地によれば、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の細菌を同時に培養する場合、培養中も適正なｐＨ値を保持できる。それによって、培養中に培地のｐＨ調節を行う必要がなくなり、培養操作の一層の簡易化、迅速化が可能となる。
【００７０】
<<実施形態２>>
【００７１】
<実施形態２：概要>
実施形態２は、細菌検出方法に関する。本実施形態の細菌検出方法は、前記実施形態１の細菌培養方法で細菌を培養する培養工程を含むことを特徴とする。本実施形態の細菌検出方法によれば、少なくともＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属のうち、二以上の属の好気性細菌を同時に検出することができる。したがって、食中毒細菌をはじめとする細菌の簡易迅速な検出方法として有用である。
【００７２】
<実施形態２：方法>
実施形態２の細菌検出方法について説明する。図５に本実施形態のフローチャートの一例を示す。この図のように、本実施形態の細菌検出方法は、培養工程（Ｓ０５０１）と検出工程（Ｓ０５０２）とを構成要件とする。以下、各工程について説明する。
【００７３】
「培養工程」（Ｓ０５０１）とは、実施形態１の細菌培養方法で培養を行う工程である。ここでいう、培養工程とは、「実施形態１：方法」の項で述べた培養工程のみならず、広く実施形態１の培養方法を用いた一連の培養工程をいう。すなわち、接種工程の他、必要に応じて増菌培地調製工程、及び前培養工程などを含むものとする。基本的な方法については実施形態１で述べた方法と同じでよい。当該培養工程後に得られる培地中の細菌を次の検出工程に用いる。
【００７４】
「検出工程」（Ｓ０５０２）とは、前記培養工程（Ｓ０５０１）後に得られる細菌から所望の細菌を検出する工程である。「所望の細菌」とは、存在の有無を確認したい標的細菌をいう。検出工程は、検出方法の違いによって、さらにいくつかに分類できる。第一は、増殖した生菌をそのまま用いて検出する方法である。第二は、増殖した細菌のタンパク質を検出する方法である。第三は、増殖した細菌の核酸を検出する方法である。以下、各方法について説明する。
【００７５】
（生菌を用いる方法）
培養工程で増殖した細菌を、生菌状態のままで検出する方法である。例えば、所望の細菌の選択培地を用いたコロニー形成法が挙げられる。コロニー形成法は、具体的には、培養後の培養液にＰＢＳなどのバッファを加えて１０倍連続希釈系列を作成し、所望の細菌の選択培地プレートに適当量塗抹した後、形成されるコロニー数に基づいて所望の細菌の存在や菌数を算出する方法である。選択培地は、「実施形態１：発明に至る経緯」で挙げた日本の主要な食中毒細菌であれば、実施例１及び２で詳述する選択培地が利用できる。
【００７６】
（タンパク質を検出する方法）
所望の細菌に特有のタンパク質を検出する方法である。例えば、抗体を用いた免疫学的な検出方法が挙げられる。具体例としては、ＥＬＩＳＡ法やウェスタンブロッティング法が利用できる。簡易性や迅速性を鑑みればＥＬＩＳＡ法が好ましい。これらの方法は、確立した周知の技術であることから具体的説明については省略する。なお、タンパク質は、細菌から抽出する方法と細菌の膜表面タンパク質を利用する方法があるが、いずれの方法であっても構わない。後者は、細菌の膜表面タンパク質を抗原とすることによりＥＬＩＳＡ法などで菌体のまま検出できるため、細菌検出の簡易性、迅速性の目的に資する点で便利である。細菌からタンパク質を抽出する方法も確立した周知の技術であり、例えば、非特許文献６に記載の方法に準じて処理すればよい。この方法で使用する抗体は、所望の細菌で知られる特有のタンパク質、若しくは特異的に発現するタンパク質などに対する抗体を用いる。これらは、市販の抗体などを利用すればよい。
【００７７】
（核酸を検出する方法）
培養工程で増殖した細菌から核酸を抽出後、所望の細菌に特有な塩基配列を有する核酸を検出する方法である。図６のフローチャートで示すように、当該方法は、検出工程（Ｓ０６０２）が、さらに、核酸抽出工程（Ｓ０６０３）と核酸検出工程（Ｓ０６０４）とを有することを特徴とする。以下で本方法に特徴的な工程である核酸抽出工程（Ｓ０６０３）と核酸検出工程（Ｓ０６０３）について説明する。なお、培養工程（Ｓ０６０１）の説明は上記Ｓ０５０１で既に説明したため省略する。
【００７８】
「核酸抽出工程」（Ｓ０６０３）とは、培養工程後に得られる菌体から核酸を抽出する工程である。ここでいう「核酸」とは、ＤＮＡやＲＮＡが該当する。菌体から核酸を抽出する方法は、アルカリ法などの核酸抽出法として確立した公知の技術が利用できる。具体的な方法については非特許文献７に記載の方法などに準じればよい。
また、菌体から核酸を抽出する方法は、市販の核酸抽出キットなども利用できる。抽出後の核酸は、ＴＥバッファなどで懸濁した後、適当な濃度に調整して次の核酸検出工程で用いる。
【００７９】
「核酸検出工程」（Ｓ０６０４）とは、核酸抽出工程で得られる核酸に対して、所望の細菌のゲノムＤＮＡ上でその細菌に特有な塩基配列を認識するオリゴヌクレオチドを用いて所望の細菌を検出する工程である。
【００８０】
「オリゴヌクレオチド」とは、１０塩基〜５０塩基程度のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ＬＮＡ（登録商標；Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、又はそれらの組み合わせなどによって構成されている。本実施形態のオリゴヌクレオチドは、プローブ、又は核酸増幅におけるプライマーとしての機能を有する。
【００８１】
当該オリゴヌクレオチドを構成する一、又は二以上のヌクレオチドは糖鎖などで修飾されていてもよい。また、当該オリゴヌクレオチドは標識物質で標識されていてもよい。標識物質の使用は、増幅された核酸断片の検出が容易になるため便利である。「標識物質」とは、例えば、蛍光物質、蛍光抑制物質、ＲＩ、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）等のハプテン、又はビオチンが挙げられる。「蛍光物質」とは、特定波長の励起光を吸収することで励起状態となり、元の基底状態に戻る際に蛍光を発する性質を有する物質を言う。標識に用いる蛍光物質は、オリゴヌクレオチドに標識可能なものであれば、種類は特に問わない。例えば、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＦＩＴＣが挙げられる。「蛍光抑制物質」とは、いわゆるクエンチャーであって、蛍光物質の励起エネルギーを吸収する物質等をいう。例えば、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、Ｄａｂｃｙｌ、ＴＡＭＲＡが該当する。オリゴヌクレオチドの標識される位置は、使用する標識物質等の性質に応じて適宜決定すればよく、特に限定はしない。例えば、５’及び／又は３’末端であってもよいし、オリゴヌクレオチド内のいずれかのヌクレオチドであってもよい。なお、蛍光抑制物質を使用する場合は通常、蛍光物質とペアで標識される。この場合、蛍光物質はオリゴヌクレオチドの５’末端に標識され、蛍光抑制物質は同じオリゴヌクレオチドの３’末端に標識されることが一般的である。また、蛍光抑制物質は、種類によって蛍光の抑制範囲が異なる。したがって、蛍光抑制物質を使用する場合は、ペアとなる前記蛍光物質の発光を抑制できる種類を選択する必要がある。
【００８２】
「所望の細菌のゲノムＤＮＡ上でその細菌に特有な塩基配列」とは、標的細菌のゲノムＤＮＡ上に存在する当該標的細菌に特異的な塩基配列である。当該特有な塩基配列は、種特異的な塩基配列であることが好ましいが、亜属特異的、属特異的な塩基配列であってもよい。なぜなら、本実施形態の細菌検出方法では、必ずしも種レベルで検出する必要がないためである。例えば、食品のＶｉｂｒｉｏ属による汚染度を確認したい場合にはＶｉｂｒｉｏ属の有無が検出できれば十分であり、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓまでを検出する必要はない。このような場合であれば、Ｖｉｂｒｉｏ属に特異的な塩基配列が、ここでいう所望の細菌のゲノムＤＮＡ上でその細菌に特有な塩基配列に該当する。
【００８３】
当該特有な塩基配列としては、標的細菌が有する特異的な遺伝子の配列や塩基多型等が挙げられる。ここでいう特異的な遺伝子とは、例えば、種特異的若しくは属特異的な酵素が挙げられる。また、塩基多型とは、種特異的若しくは属特異的な、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｉｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、マイクロサテライト、ＶＮＴＲ（Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔ）、又はＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）等が該当する。具体的な塩基配列については、所望の細菌に応じて適宜検討、選択することが好ましい。例えば、主要食中毒細菌６属６種の場合であれば、実施例４の表２で挙げた遺伝子の塩基配列が利用できる。ただし、表２は、具体例の一つであり、本実施形態でいう所望の細菌のゲノムＤＮＡ上でその細菌に特有な塩基配列は、それに限られるものではない。
【００８４】
「認識する」とは、同定できることをいう。つまり、用いるオリゴヌクレオチドは、必ずしもそれ自身が所望の細菌に特有な塩基配列に相補的な塩基配列を有することで特有な塩基配列を認識する必要はない。オリゴヌクレオチド自身の塩基配列は所望の細菌に特有な塩基配列を含んでいなくとも、それを用いることで結果的に所望の細菌に特有な塩基配列を同定できるのであれば、認識するものとみなす。例えば、特有な塩基配列は有していないが、所望の細菌に特有なＳＮＰなどの塩基配列を含む特定の領域を増幅できるプライマーペアが該当する。
【００８５】
核酸検出工程は、検出方法によってさらにいくつかの方法に分けることができる。例えば、ハイブリダイゼーション法による方法や核酸増幅法を用いた方法が該当する。以下、各方法について説明する。
【００８６】
（ハイブリダイゼーション法による方法）
ハイブリダイゼーション法による核酸検出工程は、前記所望の細菌のゲノムＤＮＡ上でその細菌に特有な塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして、ハイブリダイゼーションにより標的細菌の有無を検出する方法である。例えば、ゲル・ブロッティング法や、核酸を直接固定したフィルターや基板を用いる方法が挙げられる。ゲル・ブロッティング法の具体例としてはサザンブロット・ハイブリダイゼーション法、ノザンブロット・ハイブリダイゼーション法、若しくはそれらを原理とするブロッティング法などが該当する。サザンブロット・ハイブリダイゼーション法は、電気泳動後のゲル中で分画されたＤＮＡをメンブレンに転写した後、標識されたプローブを当該メンブレン上の目的の塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズさせて検出することを基礎とするものである。ノザンブロット・ハイブリダイゼーション法は、ＤＮＡに代わってＲＮＡをメンブレンに転写して、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法と同様の処理を行う方法である。前記の方法はいずれも分子生物学分野で確立した極めて一般的な技術であり、非特許文献７などのプロトコールに準じて行えばよいことから詳細な説明については省略する。また、核酸が固定されたフィルターや基板を用いる方法の具体例としてはマクロアレイ、マイクロアレイ、又はＤＮＡチップなどの解析法等が該当する。これらの方法は、検出感度を高めるために、次に述べる核酸増幅法を用いた方法と組み合わせることが望ましい。マクロアレイ、マイクロアレイ、又はＤＮＡチップを用いる方法は、複数の細菌を同時検出できることから本発明の目的に資するので好ましい。これらの方法を用いた検出方法は、公知の技術であることから、詳細な説明は省略する。なお、マイクロアレイ、又はＤＮＡチップを用いた方法は基板など作製のための技術、労力、コストを考慮すると受託解析サービスを行っている専門業者を利用する方が便利である。
【００８７】
（核酸増幅法を用いた方法）
核酸増幅法を用いた方法による核酸検出工程は、図７のフローチャートで示すように、核酸検出工程（Ｓ０７０４）がさらに、核酸増幅工程（Ｓ０７０５）と増幅核酸検出工程（Ｓ０７０６）とを有することを特徴とする。以下で核酸増幅工程（Ｓ０７０５）と増幅核酸検出工程（Ｓ０７０６）について説明する。その他の工程の説明については、前述の各工程と同様であることから省略する。
【００８８】
「核酸増幅工程」（Ｓ０７０５）とは、核酸抽出工程で得られる核酸を鋳型として、所望の細菌のゲノムＤＮＡ上でその細菌に特有な塩基配列を認識するオリゴヌクレオチドを用いて、核酸増幅法により所望の細菌の核酸を増幅する工程である。核酸増幅工程による細菌検出方法は、培養工程で細菌数を増加させ、さらに細菌から抽出された核酸を当該核酸増幅法で増幅することにより、検査対象物中にわずかに存在する細菌であっても検出可能となることから、検出感度を高める上で有用である。また、前述のように、ハイブリダイゼーション法と組み合わせて用いることで、迅速性、簡易性を高めることができる。
【００８９】
「核酸増幅法」とは、ＤＮＡなどの核酸を鋳型とし、二つのプライマーに挟まれた特定の領域を酵素反応によって増幅する方法である。例えば、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、又はそれらの応用的な方法（例えば、リアルタイムＰＣＲ法）が挙げられる。いずれも公知の技術であるが、中でもＰＣＲ法は、医学、農学をはじめとする分子生物学の分野において現在世界中で広く使用されている方法であり、様々な応用技術も知られていることから便利である。
【００９０】
核酸増幅法における核酸増幅反応については、使用する核酸増幅法に応じて適宜定める。例えば、ＰＣＲ法であれば、通常、鋳型の熱変性反応、プライマーなどのアニーリング反応、プライマーの伸長反応の３反応を１サイクルとして、当該サイクルを繰り返す方法を基本としている。各反応における温度と時間は、熱変性反応を８８℃〜９８℃で３０秒間〜１分間、アニーリング反応を５２℃〜６０℃で３０秒間〜１分間、伸長反応を７０℃〜７５℃で４０秒間〜３分間程度行えばよい。効率的な増幅のためには、使用するプライマーの塩基配列や塩基数に応じて適宜定めることが好ましい。一方、ＩＣＡＮ法やＬＡＭＰ法は、５０℃から６５℃の一定温度で増幅が可能である。これらの核酸増幅法は、サーマルサイクラーなどの温度制御機器を必要としないため便利である。また、サイクル数は、使用するＤＮＡポリメラーゼの種類や所望する核酸の増幅量によって異なるが、通常、２５サイクルから４５サイクル程度で足りる。好ましくは２８サイクルから４２サイクル、特に好ましくは３０サイクルから４０サイクルである。
【００９１】
「核酸を鋳型として」とは、核酸の塩基配列を鋳型にしてということである。したがって、核酸抽出工程で得られた核酸そのものを必ずしも鋳型にする必要はない。例えば、核酸抽出工程で得られた核酸がｍＲＮＡであった場合には、そのｍＲＮＡから逆転写によって得られるｃＤＮＡを鋳型にしてもよい。
【００９２】
核酸増幅工程は、二以上の標的細菌のそれぞれに対する複数のプライマーペアなどを一の反応液中で混和して、各細菌の核酸を同時に増幅してもよい。具体的な方法としては、いわゆるＭｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ法などが挙げられる。当該方法によれば、一の核酸増幅反応で複数の標的細菌のそれぞれに特有な核酸断片を増幅できる。したがって、当該方法は、本願発明の細菌検出法の目的である簡易化、迅速化に資することからも好ましい。なお、各標的細菌に用いるオリゴヌクレオチドは、それらの塩基配列がお互いの核酸増幅を阻害しないようにすること、標識物質が細菌間で重複しないようにすることなどを考慮する必要がある。
【００９３】
「増幅核酸検出工程」（Ｓ０７０６）とは、核酸増幅工程で増幅した核酸に基づいて所望の細菌を検出する工程である。
【００９４】
「基づいて」とは、利用してという意味である。「増幅した核酸に基づいて」とは、増幅した核酸断片をそのまま利用してという意味、増幅した核酸断片に所定の処理をした後に利用してという意味、又は核酸の増幅に伴う現象を利用してという意味などを有する。それぞれ場合の具体的方法について、以下で例を挙げて説明する。
【００９５】
増幅した核酸断片をそのまま利用する方法は、増幅反応後の核酸断片の塩基長から標的細菌を検出する方法などが挙げられる。これは、それぞれの細菌で特有の塩基長の増幅断片が増幅されるように、予め各細菌を認識するプライマーの塩基配列を設定しておけばよい。増幅断片の塩基長を視認する方法は、ゲル電気泳動法が利用できる。ゲル電気泳動法は分子生物学の分野で頻用される確立した技術であり、その詳細な方法については非特許文献７をはじめとする各種プロトコールに準ずればよい。
【００９６】
増幅した核酸断片に所定の処理をした後に利用する方法は、増幅した核酸断片を所定の制限酵素で切断したときの切断断片のパターンから標的細菌を検出する方法などが挙げられる。増幅した核酸断片の塩基配列中に存在する制限酵素部位の相違によって標的細菌を検出する方法である。この方法は、増幅した核酸断片の塩基長が複数の標的細菌間で近似する場合であっても検出可能な点で便利である。制限酵素は、各標的細菌から増幅される核酸断片の塩基配列に基づいて適宜定めればよい。当該方法は、増幅した核酸断片に対して通常の制限酵素切断処理を行った後、前記ゲル電気泳動法によって検出すればよい。
【００９７】
核酸の増幅に伴う現象を利用する方法とは、標的の核酸断片の増加を経時的に検出する方法等が挙げられる。
ここで、「経時的」とは、時間経過的であることを意味する。核酸断片の増加を経時的に検出する方法としては、例えば、核酸断片の増加に伴う蛍光強度の増加を測定する方法が挙げられる。より具体的には、リアルタイムＰＣＲ法などが利用できる。増幅産物の増加を反映する蛍光強度の増加を経時的に検出できれば、その検出方法については問わない。例えば、５’ヌクレアーゼ法（ＴａｑＭａｎプローブ法）やサイクリングプローブ法が挙げられる。５’ヌクレアーゼ法は、５’末端を蛍光物質で、また３’末端を蛍光抑制物質で標識されたプローブがＰＣＲの伸長反応におけるＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって分解され、蛍光物質が遊離することで発せられる蛍光をリアルタイムで検出する方法である。サイクリングプローブ法は、末端を蛍光物質で標識されたＲＮＡを含むプローブがＲＮａｓｅＨの添加によりＲＮＡ部分が分解されることで発せられる蛍光をリアルタイムで検出する方法である。あるいは、ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ等の核酸染色剤を核酸増幅の反応液中に加えておき、核酸増幅反応とともに染色することによって拡散断片の増加を当該核酸染色剤から発せられる蛍光の強度により検出してもよい。リアルタイムＰＣＲでの検出は、増幅開始から検出完了までが６時間以内で可能である。したがって、実施形態１の細菌培養方法とＭｕｌｔｉｐｌｅｘ リアルタイムＰＣＲとを組み合わせることで、複数種の細菌を接種から検出までが１日以内で完了できる。それゆえ、簡易性、迅速性の点からもリアルタイムＰＣＲ法による細菌検出法は大変好ましい。
【００９８】
上記いずれかの方法によれば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、及びＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのうち、二以上の菌種を同時に検出できる。当該検出の具体例は、実施例２から４で述べる。
【００９９】
<実施形態２：効果>
本実施形態の細菌検出方法によれば、検査対象物から細菌を検出するまでの操作を簡易化できる。また、検出までに要する時間を短縮化できる。加えて、本実施形態の他の細菌検出法によれば、複数属の食中毒細菌を同時に検出できる。それによって、被検体からの細菌検出をより迅速に行うことができる。
【０１００】
本実施形態の細菌検出方法によれば、特にＭｕｌｔｉｐｌｅｘ リアルタイムＰＣＲ法を用いることで、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、及びＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓなどの複数属の食中毒細菌を接種から検出までを僅か１日以内で完了することが可能である。したがって、食の安全を確保するための検査を行う上で、極めて有用な簡易迅速検出方法を提供できる。
【０１０１】
<<実施形態３>>
【０１０２】
<実施形態３：概要>
実施形態３は、細菌検出用キットに関する。本実施形態の細菌検出用キットは、前記実施形態１の増菌培地を含むことを特徴とする。
【０１０３】
<実施形態３：構成>
本実施形態の細菌検出用キットは、キット内に前記実施形態１の増菌培地を含むように構成されている。ここでいう「実施形態１の増菌培地」とは、前記ＳＥＢを意味する。ただし、当該キットに含まれるＳＥＢは、使用前にあっては各構成成分が必ずしも最終濃度である必要はなく、また液体状態である必要もない。例えば、使用際に滅菌水で希釈するように、濃縮された液体状態でパッキングされていてもよいし、使用前に所定量の滅菌水で溶解する粉末状態でパッキングされていてもよい。
【０１０４】
本実施形態の細菌検出用キットは、ＳＥＢ以外では培養から標的細菌の検出までに必要とされる試薬等で構成されていることが好ましい。例えば、培養後の菌体から核酸を抽出のための溶菌剤、中和剤や、核酸増幅を行うためのＤＮＡポリメラーゼ、バッファ、ｄＡＴＰ／ｄＧＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＴＴＰ、特定の食中毒細菌を検出するためのプライマーセットが挙げられる。その他、必要なチューブやカラムなどを有していてもよい。
【０１０５】
<実施形態３：効果>
本実施形態の細菌検出用キットによれば、細菌検出の検査を行う者がＳＥＢをはじめ実施形態１の細菌培養方法や実施形態２の細菌検出方法で必要な各種試薬等を買い揃える必要ないため便利である。
【実施例１】
【０１０６】
<<ＳＥＢによるＢａｃｉｌｌｕｓ属とＬｉｓｔｅｒｉａ属の同時培養>>
【０１０７】
<目的>
ＳＥＢを増菌培地として用いた場合に、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属とＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌が同時に培養できることを確認する。
【０１０８】
<材料>
【０１０９】
（使用細菌種）
・Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ Ｎｏ．５５
・Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｌｉｓ１
【０１１０】
（各種培地の組成と調製）
【０１１１】
（１）ＴＳＢ
ＴＳＢ（ＤＩＦＣＯ社；１．７％ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ ｃａｓｅｉｎ、０．３％ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ、０．２５％ リン酸二カリウム、 ０．５％ ＮａＣｌ、 ０．５％ ブドウ糖）を水で溶解し、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌して作製した。
【０１１２】
（２）ＴＳＡプレート
ＴＳＡ（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ａｇａｒ；ＤＩＦＣＯ社）を１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌後、約１２ｍｌずつシャーレに分注して作製した。
【０１１３】
（３）ＳＥＢ
２％ ペプトン｛１．７％ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ ｃａｓｅｉｎ（Ｂｅｃｔｏｎ & Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社） ＋ ０．３％ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ（ＤＩＦＣＯ社）｝、０．２５％リン酸二カリウム（ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ナカライテスク社）、３％ ＮａＣｌ（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ；ナカライテスク社）、０．０５％ イーストエクストラクト（ＮＩＨＯＮ ＳＥＩＹＡＫＵ社）を水で溶解し、ＨＣｌを用いてｐＨ７．３に調整後、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌して使用した。
【０１１４】
（４）Ｂ．ｃｅｒｅｕｓの選択培地：卵黄加ＮＧＫＧ寒天培地
卵黄加ＮＧＫＧ寒天培地は、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌して作製したＮＧＫＧ寒天培地（日水製薬）４５０ｍｌを５０℃に保温したものに卵黄１０ｍｌと滅菌生理食塩水５０ｍｌを混和したものを加え、約１２mlずつシャーレに分注して作製した。
【０１１５】
（５）Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの選択培地：Ｏｘｆｏｒｄ寒天培地
Ｏｘｆｏｒｄ寒天培地は、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌して作製したＬｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇａｒ ｂａｓｅ（ＯＸＯＩＤ社）５００ｍｌを５０℃に保温したものに、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｒｄ ＳＲ０１４０Ｅ（ＯＸＯＩＤ社） １バイアルを７０％エタノール５ｍｌで溶解したものを混和し、約１２ｍｌずつシャーレに分注して作製した。
【０１１６】
<方法>
本実施例では、前記２種の細菌がＳＥＢで同時に培養可能であることを確認するために、同定済みの上記２種をＳＥＢに接種する方法で行った。以下の操作は、原則として全て無菌状態にて行った。また、使用する試薬、器具は、１２１℃で２０分間、オートクレーブで滅菌したものを用いた。
【０１１７】
スラントから掻き取った１白金耳の各菌体を５ｍｌのＴＳＢにそれぞれ接種し、３７℃で一晩培養した。次に、ＰＢＳを用いて前培養液の１０倍連続希釈系列を作成し、２２５ｍｌのＳＥＢに最終菌濃度が約１００ｃｆｕ／ｍｌなるように、５０μｌずつ混合接種した。接種後、増菌培地を３７℃のインキュベータ中で静置培養し、接種直後から２時間ごとに培養後１８時間後まで、培養液１０ｍｌずつを採取した。当該培養液を４０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清をＥＢ−Ｄｉｓｋ２５（孔径２．５μｍ；関東化学）を用いて濾過滅菌した後、ｐＨの測定を行った。また、同時にこの培養液からＰＢＳを用いて１０倍連続希釈系列を作成し、それぞれの細菌の選択培地プレートに１００μｌ塗抹して、培養後のコロニー数より生菌数を算出した。なお、各接種菌量は、ＴＳＡに１００μｌ塗抹し、培養後のコロニー数より算出した。
【０１１８】
<結果>
実施例１の結果を図８に示す。対照実験に相当する図２の結果と比較してもわかるように、ＳＥＢを増菌培地に用いた場合、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓが定常期に入る１２時間後も、培地のｐＨ値が図２の結果のような大幅な低下は生じることなかった。すなわち、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓが増殖しても増菌培地のｐＨ値をｐＨ５より大きくｐＨ１０以下の範囲を保持することができた。その結果、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓも約１×１０５ｃｆｕ／ｍｌ以上と、検出に十分な菌数にまで増殖可能であった。したがって、ＳＥＢを増菌培地とすることで、培養中に増菌培地のｐＨ調整を行わずとも、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属とＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を同時に培養できることが確認できた。
【実施例２】
【０１１９】
<<実施形態１の細菌培養方法に基づく主要６属６種の食中毒細菌の同時培養>>
【０１２０】
<目的>
実施形態１の細菌培養方法に基づき、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、及びＶｉｂｒｉｏ属のそれぞれに属する食中毒細菌、並びに他の主要な食中毒細菌を一の場増菌培地中で同時に培養可能であることを示す。
【０１２１】
<材料>
【０１２２】
（使用細菌種）
・Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＩＦＯ ３０６０
・Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＩＦＯ ３３１３
・Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７（ｓｔｘ１＋，ｓｔｘ２＋）
・Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ ＷＰ−１ （ｔｄｈ＋）
・Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ Ｎｏ．５５
・Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｌｉｓ１
【０１２３】
（各種培地の組成と調製）
【０１２４】
（１）Ｓ．ａｕｒｅｕｓの選択培地：卵黄加マンニット食塩培地
１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌して作製したマンニット食塩培地（日水製薬）５００ｍｌを５０℃に保温したものに、卵黄５０mlと３％滅菌食塩水５０ｍｌを混和したものを加え、約１２ｍｌずつシャーレに分注して作製した。
【０１２５】
（２）Ｅ．ｃｏｌｉ O１５７の選択培地：ＣＴ−ＳＭＡＣ培地
ＣＴ−ＳＭＡＣ培地（セフィキシム、亜テルル酸カリウム添加ソルビトールマッコンキー寒天培地）は、Ｓｏｌｂｉｔｏｌ ＭａｃＣＯＮＫＥＹ培地（ＯＸＯＩＤ社）５００ｍｌを１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌後、５０℃まで冷却したものに、Ｃｅｆｉｘｉｍｅ Ｔｅｌｌｕｒｉｔｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＯＸＯＩＤ社）１バイアルを滅菌水２ｍｌに溶解したものを混和した後、約１２ｍｌずつシャーレに分注して作製した。
【０１２６】
（３）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．の選択培地：ＤＨＬ寒天培地
ＤＨＬ寒天培地（日水製薬）は、処方に従って、加温溶解した後に約１２ｍｌずつシャーレに分注した。
【０１２７】
（４）Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓの選択培地：ＴＣＢＳ寒天培地
ＴＣＢＳ寒天培地（日水製薬）は処方に従って、加温溶解した後に約１２ｍｌずつシャーレに分注した。
【０１２８】
なお、本実施例では、上記培地以外にＴＳＢ、ＴＳＡプレート、ＳＥＢ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓの選択培地、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの選択培地を用いたが、いずれも実施例１と同様であることからその説明は省略する。ただし、ＴＳＢ、ＴＳＡプレートについては、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、及び／又はＶ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓを培養する場合にはＴＳＢに最終濃度でそれぞれ１．５％、３％のＮａＣｌ添加した。
【０１２９】
<方法>
本実施例では、前記６種の細菌が一の培地中で同時に培養可能であることを示すために、同定済みの各種細菌を増菌培地に接種する方法で行った。以下の操作は、原則として全て無菌状態にて行った。また、使用する試薬、器具は、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌処理したものを用いた。
【０１３０】
スラントから掻き取った１白金耳の各菌体を５ｍｌのＴＳＢにそれぞれ接種し、３７℃で一晩培養した。次に、ＰＢＳを用いて前培養液の１０倍連続希釈系列を作成し、１０ｍｌのＳＥＢに最終菌濃度が約１〜１０ｃｆｕ／ｍｌとなるように、それぞれ１０μｌずつ混合接種した。接種後、増菌培地を３７℃のインキュベータで１８時間静置培養した。培養後の菌数の測定は、ＰＢＳを用いて培養液の１０倍連続希釈系列を作成し、各細菌の選択培地プレートに１００μｌ塗抹して、培養後のコロニー数より算出した。なお、各接種菌量は、ＴＳＡに１００μｌ塗抹し、培養後のコロニー数より算出した。
【０１３１】
<結果>
実施例２の結果を図９に示す。この図で示すように、主要な食中毒細菌６属６種の全てが１８時間で１０５ｃｆｕ／ｍｌ以上まで増殖された。すなわち、ＳＥＢを増菌培地に用いた実施形態１の細菌培養方法によれば、日本で主要な食中毒細菌６種の全てを培養時間１８時間で同時に培養できることが確認された。
【実施例３】
【０１３２】
<<食品からの食中毒細菌の同時検出>>
【０１３３】
<目的>
実施形態２の細菌検出方法により、食品からＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を同時に検出可能であることを示す。
【０１３４】
<材料>
【０１３５】
（使用細菌種）
実施例２と同じ６属６種を使用した。
【０１３６】
（食品試料）
スーパーマーケットで市販の鶏肉、刺身用鯛の切り身、レタスを購入し、使用した。
【０１３７】
（各種培地の組成と調製）
実施例１及び実施例２と同様の各種培地を使用した。
【０１３８】
<方法>
本実施例では、食品から前記６属の細菌を同時に培養可能であることを確認するために、上記６属６種を食品に接種する方法で行った。以下の操作は、原則として全て無菌状態にて行った。また、使用する試薬、器具は、１２１℃で２０分間、オートクレーブで滅菌したものを用いた。
【０１３９】
食品試料２５ｇを２２５ｍｌのＳＥＢとともにフィルター付きストマッカー袋中で３０秒間破砕し、そのままインキュベータ中で３７℃、１８時間静置培養した。破砕液からＰＢＳを用いて１０倍連続希釈系列を作成し、ＴＳＡに１００μｌ塗抹して、培養後のコロニー数から食品試料中の生菌数を算出した。
【０１４０】
食品試料への食中毒細菌の接種は、まず、スラントから掻き取った１白金耳の食中毒細菌６種を５ｍｌのＴＳＢにそれぞれ接種し、３７℃で一晩培養した。次に、ＰＢＳを用いて前培養液の１０倍連続希釈系列を作成し、最終菌濃度で約１ｃｆｕ／ｇとなるように食品試料である鶏肉、刺身用鯛の切り身、レタスに混合接種した。各食品試料からの採菌と、培養は前記と同様に食品試料２５ｇから破砕によって採取した後、３７℃、１８時間静置培養した。その後、ＰＢＳを用いて培養液の１０倍連続希釈系列を作成し、実施例１及び２に記載の各細菌用選択培地に１００μｌ塗抹して、培養後のコロニー数から食品試料の生菌数を算出した。
【０１４１】
<結果>
表１に結果を示す。それぞれ鶏肉で２．３×１０５ｃｆｕ／ｇ、刺身用鯛の切り身で４．４×１０４ｃｆｕ／ｇ、レタスで１．２×１０６ｃｆｕ／ｇの共存菌（食品に元々存在していた細菌）が存在する食品サンプルにおいても、実施形態２の細菌検出方法により６種全ての標的食中毒細菌を検出できることが示された。
【表１】
【実施例４】
【０１４２】
<<リアルタイムＰＣＲを用いた食中毒細菌の同時検出>>
【０１４３】
<目的>
リアルタイムＰＣＲ法を用いた実施形態２の細菌検出方法により、日本で主要な食中毒細菌６属６種の全てを同時に検出可能であることを示す。
【０１４４】
<材料>
【０１４５】
（使用細菌種）
実施例２と同じ６属６種を使用した。
【０１４６】
（各種培地の組成と調製）
実施例１及び実施例２と同様の各種培地を使用した。
【０１４７】
（ＰＣＲ反応液）
本実施例では、６種の各細菌を認識するオリゴヌクレオチドを３種ずつに分けて２つの反応液（反応チューブＩ、反応チューブＩＩ）でＰＣＲ反応を行った。これは、本実施例で使用したリアルタイムＰＣＲ用サーマルサイクラーの蛍光色素の検出上限が４種であったためである。したがって、４種の蛍光色素を細菌検出用の３種及びモニター用の１種で２チューブに分けた。なお、１台で７種以上の蛍光色素を検出可能なリアルタイムＰＣＲ用２台のサーマルサイクラーであれば、主要な食中毒細菌６属６種を１の反応チューブで反応させることも可能である。
【０１４８】
（１）共通反応液組成
１０×ＥＸ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ） ２．５μｌ
ｄＮＴＰｓ ｆｏｒ ＥＸ Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ） ２．０μｌ
２０ｍＭ ＭｇＣｌ２（ＴＡＫＡＲＡ） ２．５μｌ
５×Ｒｏｘ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅ ０．５μｌ
５Ｕ／μｌ ＥＸ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ） ０．１２５μｌ
Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ ２．０μｌ
【０１４９】
（２）反応チューブＩ用プライマー及びプローブ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｎｕｃＡ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｎｕｃＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｎｕｃＡ ｐｒｏｂｅ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｅａｅＡ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｅａｅＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｅａｅＡ ｐｒｏｂｅ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｈｌｙＡ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ ｐｍｏｌ／μｌ ｈｌｙＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｈｌｙＡ ｐｒｏｂｅ ０．２５μｌ
【０１５０】
（３）反応チューブＩＩ用プライマー及びプローブ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｔｌ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｔｌ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｔｌ ｐｒｏｂｅ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｉｎｖＡ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｉｎｖＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｉｎｖＡ ｐｒｏｂｅ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｃｒｓ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｃｒｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ０．２５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ ｃｒｓ ｐｒｏｂｅ ０．２５μｌ
【０１５１】
前記共通反応液を各反応チューブ用のプライマー及びプローブと混合した。混合後のチューブを反応チューブＩ、反応チューブＩＩとしてリアルタイムＰＣＲに用いた。前記各プライマーおよびプローブの塩基配列は、表２に示す。
【表２】
【０１５２】
<方法>
【０１５３】
（培養）
実施例２で用いた６属６種の食中毒細菌をそれぞれ１〜１０ｃｆｕ／ｍｌとなるようにＳＥＢ１０ｍｌに混合接種し、１８時間３７℃にて静置培養した。基本的な培養方法は実施例２と同様である。当該培養は、実施形態２における培養工程に該当する。
【０１５４】
（核酸抽出）
前記培養後の培養液１．０ｍｌを６０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌後、ＤＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、付属のプロトコール（グラム陽性菌からの抽出法）に従ってゲノムＤＮＡの調製を行った。ただし、溶菌の際には１０ｍｇ／ｍｌ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅを２μｌ添加した。当該培養は、実施形態２における核酸抽出工程に該当する。
【０１５５】
（リアルタイムＰＣＲ反応）
上記反応液をそれぞれ０．２ｍｌリアルタイムＰＣＲ用マイクロチューブ中で調製し、全量が２５μｌになるように滅菌水を加えて十分に混合した後、リアルタイムＰＣＲ用サーマルサイクラー（ＭＸ３０００Ｐ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて核酸増幅反応を行った。反応条件は（９５℃で１分間→５５℃で１分間→７２℃で１分間）を１サイクルとして、４２サイクル行った。サイクルごとにそれぞれの蛍光色素強度を測定し、前記サーマルサイクラー付属の解析ソフトにて、解析を行った。
【０１５６】
ＰＣＲによる増幅産物の確認はアガロースゲル電気泳動で行った。アガロースゲルは、３％アガロースゲル／ＴＡＥアガロースゲルを使用した。当該電気泳動法は極めて一般的な技術であることから、ここではその説明を省略する。
【０１５７】
<結果>
図１０に本実施例のリアルタイムＰＣＲにおけるサイクルごとの相対蛍光強度プロットを示す。この図で示すように、２本の反応チューブの全ての蛍光色素で増幅が確認され、６種の食中毒細菌を同時に検出できることが示された。図１０によれば、各細菌の核酸増幅は３０サイクル前後で十分に検出できることも示された。したがって、サーマルサイクラーにセッティング後は、２〜２．５時間程度で検出結果が得られることとなる。実施例１で示すように、細菌培養方法による培養時間が１２時間から１８時間で足りることから、接種から検出までを２４時間以内で行うことが可能なことも実証された。なお、図１１で示すように、アガロースゲル電気泳動においても目的サイズの増幅が確認できた。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】各ｐＨ値の増菌培地におけるＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの培地容量当たりの菌数を示す図
【図２】Ｂ．ｃｅｒｅｕｓとＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを同時に培養したときの、各培養時間におけるそれぞれの細菌の培地容量当たりの菌数と培地のｐＨ値の関係を示す図
【図３】Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、及びＶ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓを同時に培養したときの、それぞれの細菌の培地容量当たりの菌数を示す図
【図４】実施形態４における細菌培養方法のフローチャート図
【図５】実施形態２のフローチャートの一例（１）
【図６】実施形態２のフローチャートの一例（２）
【図７】実施形態２のフローチャートの一例（３）
【図８】実施例１の結果を示す図
【図９】実施例２の結果を示す図
【図１０】実施例４におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示す図
【図１１】実施例４におけるＰＣＲの核酸増幅を示すアガロース電気泳動の結果を示す図
【符号の説明】
【０１５９】
図２ ＢＣ：Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、ＬＭ：Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ
図３ ＢＣ：Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、ＬＭ：Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、ＶＰ：Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ
図８ ＢＣ：Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、ＬＭ：Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ
図９ ＢＣ：Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、ＬＭ：Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、ＶＰ：Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、ＳＡ：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、ＳＥ：Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｏ１５７：Ｅ．ｃｏｌｉ ０１５７
図１０ ＢＣ：Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、ＬＭ：Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、ＶＰ：Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、ＳＡ：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、ＳＥ：Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｏ１５７：Ｅ．ｃｏｌｉ ０１５７
図１１ Ｍ：１００ｐｂマーカー、１：反応チューブＩ（ポジティブコントロール）、２：反応チューブＩＩ（ポジティブコントロール）、３：反応チューブＩ（培養液サンプル）、４：反応チューブＩＩ（培養液サンプル）、５：反応チューブＩ（ネガティブコントロール）、６：反応チューブＩＩ（ネガティブコントロール）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属の好気性細菌、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を一の増菌培地中で同時に培養可能な細菌培養方法であって、
増菌培地のｐＨ値を５より大きく１０以下に保持して培養する細菌培養方法。
【請求項２】
さらに、Ｖｉｂｒｉｏ属の好気性・好塩性細菌を一の増菌培地中で同時に培養可能な細菌培養方法であって、
増菌培地の塩濃度が水を溶媒として質量対容量百分率で１％〜４％である請求項１に記載の細菌培養方法。
【請求項３】
増菌培地は、水を溶媒として糖の含有率を質量対容量百分率で０．００１％以下とする請求項１又は２に記載の細菌培養方法。
【請求項４】
増菌培地は、水を溶媒として質量対容量百分率で、ペプトン：１％〜３％、リン酸二カリウム：０．１５％〜０．３５％、塩化ナトリウム：１％〜４％、及び酵母エクストラクト：０．０１％〜０．１％、よりなる請求項３に記載の細菌培養方法。
【請求項５】
少なくともＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属のうち、二以上の属の好気性細菌を同時に検出できる細菌検出方法であって、
請求項１から４のいずれか一に記載の細菌培養方法で培養する培養工程と
培養工程後に得られる細菌から所望の細菌を検出する検出工程と、
を有する細菌検出方法。
【請求項６】
検出工程は、さらに
培養工程後に得られる菌体から核酸を抽出する核酸抽出工程と、
核酸抽出工程で得られる核酸に対して、所望の細菌のゲノムＤＮＡ上でその細菌に特有な塩基配列を認識するオリゴヌクレオチドを用いて所望の細菌を検出する核酸検出工程と、
を有する請求項５に記載の細菌検出方法。
【請求項７】
核酸検出工程は、さらに、
核酸抽出工程で得られる核酸を鋳型として、所望の細菌のゲノムＤＮＡ上でその細菌に特有な塩基配列を認識するオリゴヌクレオチドを用いて、核酸増幅法により所望の細菌の核酸を増幅する核酸増幅工程と、
前記核酸増幅工程で増幅した核酸に基づいて所望の細菌を検出する増幅核酸検出工程と
を有する請求項６に記載の細菌検出方法。
【請求項８】
核酸増幅工程は、二以上の細菌に対して、各細菌のゲノムＤＮＡ上でそれぞれの細菌に特有な塩基配列を認識するオリゴヌクレオチドを用いて、一の反応液中で同時にそれぞれの細菌の核酸を増幅する請求項７に記載の細菌検出方法。
【請求項９】
核酸検出工程は、リアルタイムＰＣＲ法を用いる請求項７又は８に記載の細菌検出方法。
【請求項１０】
核酸検出工程は、前記所望の細菌のゲノムＤＮＡ上でその細菌に特有な塩基配列を認識するオリゴヌクレオチドをプローブとしたハイブリダイゼーション法によって検出する請求項６に記載の細菌検出方法。
【請求項１１】
前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の各好気性細菌は、それぞれＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、及びＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである請求項５から１０のいずれか一に記載の細菌検出方法。
【請求項１２】
水を溶媒としたときの質量対容量百分率が、糖：０．００１％以下、ペプトン：１％〜３％、リン酸二カリウム：０．１５％〜０．３５％、塩化ナトリウム：１％〜４％、及び酵母エクストラクト：０．０１％〜０．１％となる増菌培地。
【請求項１３】
前記ペプトンは、ソイトンをペプトンの質量に対して１０％〜２０％含有する請求項１２に記載の増菌培地。
【請求項１４】
請求項１２、又は１３に記載の増菌培地を含む細菌検出用キット。
【請求項１】
少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ属の好気性細菌、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の好気性細菌を一の増菌培地中で同時に培養可能な細菌培養方法であって、
増菌培地のｐＨ値を５より大きく１０以下に保持して培養する細菌培養方法。
【請求項２】
さらに、Ｖｉｂｒｉｏ属の好気性・好塩性細菌を一の増菌培地中で同時に培養可能な細菌培養方法であって、
増菌培地の塩濃度が水を溶媒として質量対容量百分率で１％〜４％である請求項１に記載の細菌培養方法。
【請求項３】
増菌培地は、水を溶媒として糖の含有率を質量対容量百分率で０．００１％以下とする請求項１又は２に記載の細菌培養方法。
【請求項４】
増菌培地は、水を溶媒として質量対容量百分率で、ペプトン：１％〜３％、リン酸二カリウム：０．１５％〜０．３５％、塩化ナトリウム：１％〜４％、及び酵母エクストラクト：０．０１％〜０．１％、よりなる請求項３に記載の細菌培養方法。
【請求項５】
少なくともＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属のうち、二以上の属の好気性細菌を同時に検出できる細菌検出方法であって、
請求項１から４のいずれか一に記載の細菌培養方法で培養する培養工程と
培養工程後に得られる細菌から所望の細菌を検出する検出工程と、
を有する細菌検出方法。
【請求項６】
検出工程は、さらに
培養工程後に得られる菌体から核酸を抽出する核酸抽出工程と、
核酸抽出工程で得られる核酸に対して、所望の細菌のゲノムＤＮＡ上でその細菌に特有な塩基配列を認識するオリゴヌクレオチドを用いて所望の細菌を検出する核酸検出工程と、
を有する請求項５に記載の細菌検出方法。
【請求項７】
核酸検出工程は、さらに、
核酸抽出工程で得られる核酸を鋳型として、所望の細菌のゲノムＤＮＡ上でその細菌に特有な塩基配列を認識するオリゴヌクレオチドを用いて、核酸増幅法により所望の細菌の核酸を増幅する核酸増幅工程と、
前記核酸増幅工程で増幅した核酸に基づいて所望の細菌を検出する増幅核酸検出工程と
を有する請求項６に記載の細菌検出方法。
【請求項８】
核酸増幅工程は、二以上の細菌に対して、各細菌のゲノムＤＮＡ上でそれぞれの細菌に特有な塩基配列を認識するオリゴヌクレオチドを用いて、一の反応液中で同時にそれぞれの細菌の核酸を増幅する請求項７に記載の細菌検出方法。
【請求項９】
核酸検出工程は、リアルタイムＰＣＲ法を用いる請求項７又は８に記載の細菌検出方法。
【請求項１０】
核酸検出工程は、前記所望の細菌のゲノムＤＮＡ上でその細菌に特有な塩基配列を認識するオリゴヌクレオチドをプローブとしたハイブリダイゼーション法によって検出する請求項６に記載の細菌検出方法。
【請求項１１】
前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬｉｓｔｅｒｉａ属の各好気性細菌は、それぞれＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、及びＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである請求項５から１０のいずれか一に記載の細菌検出方法。
【請求項１２】
水を溶媒としたときの質量対容量百分率が、糖：０．００１％以下、ペプトン：１％〜３％、リン酸二カリウム：０．１５％〜０．３５％、塩化ナトリウム：１％〜４％、及び酵母エクストラクト：０．０１％〜０．１％となる増菌培地。
【請求項１３】
前記ペプトンは、ソイトンをペプトンの質量に対して１０％〜２０％含有する請求項１２に記載の増菌培地。
【請求項１４】
請求項１２、又は１３に記載の増菌培地を含む細菌検出用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００８−４８６７０（Ｐ２００８−４８６７０Ａ）
【公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２２８４７４（Ｐ２００６−２２８４７４）
【出願日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（５０６２６２３４６）株式会社ＩＢＣ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（５０６２６２３４６）株式会社ＩＢＣ (2)
【Ｆターム（参考）】
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