食道がんに対する放射線化学療法感受性マーカー
【課題】食道がん治療を選択するためのマーカー（すなわち、食道がん治療用選択マーカー）、食道がん治療後の予後を診断するためのマーカー（すなわち、食道がん治療予後用診断マーカー）およびそれらに使用するためのキット、並びにそれを使用した食道がん治療を選択する方法、食道がん治療予後を診断方法の提供。さらに、食道がんのための治療薬および治療方法の提供。
【解決手段】ＩＧＦＢＰ３遺伝子および／またはたんぱく質からなる、第１選択として食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するための、または、食道がんの手術治療後のがん再発のリスクを決定するためのマーカー。
【解決手段】ＩＧＦＢＰ３遺伝子および／またはたんぱく質からなる、第１選択として食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するための、または、食道がんの手術治療後のがん再発のリスクを決定するためのマーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食道がんの治療方法を選択するためのマーカー（すなわち、食道がんの治療用マーカー）、食道がんの手術治療後の再発のリスクを決定するためのマーカー（すなわち、食道がんの術後用マーカー）およびそれらに使用するためのキット、並びにそれを使用した食道がん治療方法を選択する方法、食道がんの手術治療後の再発のリスクを決定する方法に関する。さらに、食道がんのための治療薬および治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本における食道がん罹患数は、女性が２，４８３名、男性は、その５倍以上の１３，８４０名と、男性に圧倒的に多い（２００１年）。部位別にみると６番目に多く、他の消化器系の胃がん、結腸・直腸がんと比較して難治性であり、毎年、約１０，０００名が食道がんで亡くなっている。また、食道がんの５年生存率は、日本では２０％を超えているものの、諸外国においては２０％にも満たない（非特許文献１と２）。食道がんの組織型は、日本では扁平上皮がんが９０％以上を占め、喫煙、アルコールを始めとする慢性的な刺激がその危険因子として考えられている。一方、欧米では、腺がんの占める割合が多く、バレット食道（食道下部の粘膜が円柱上皮に置き換わった状態）との関連が指摘されている。特に、米国においては腺がんの占める割合は増加傾向にあり、欧米の臨床試験を評価する際には、患者の組織型をも考慮する必要がある。
【０００３】
食道がんの治療は、近年の内視鏡的治療や化学放射線療法などの内科的治療の進歩により、従来の手術療法を中心とした状況に変化がみられている。特に、根治的化学放射線療法が手術療法に匹敵するとの報告がなされてから、食道の温存が得られる化学放射線療法は、ＱＯＬの点からも治療の有望な選択肢の一つとなった。Hironakaらは、retrospectiveな研究結果ながら、StageII・III（Ｔ４を除く）の「化学放射線療法例（ｎ＝５３）」と「手術単独例（ｎ＝４５）」の生存成績を比較し、３年生存率と５年生存率が、化学放射線療法例では各々４９％、４６％、手術単独例では５７％、５１％と、ほぼ同等の成績であると報告した（非特許文献３）。また、ヨーロッパから報告された「化学放射線療法施行後に手術を行う群」と「継続して化学放射線療法を行う群」との無作為化比較試験では、両群間の生存成績に有意差は認められず、少なくとも化学放射線療法の途中評価で奏功が認められれば、その後に手術を行う意義は少ないと結論づけられた（非特許文献４、５）。これらの試験結果は扁平上皮がんを対象としたものであることから、日本人の食道がん患者においても十分に参考に出来ると思われる。このように、根治的化学放射線療法は、手術可能な食道がんの標準的な治療となり得るにもかかわらず、その治療法の選択自体は施設毎の考え方に依存し、明確な基準がないのが現状である。もし仮に化学放射線療法が効かない患者にその治療が選択された場合には、治療の間にがんが進行し、治癒の機会を逃す可能性もある。従って、治療前に効果が予測でき、あらかじめ、化学放射線療法が効かない患者を除外することができれば、副作用の問題や無駄な医療費の負担を改善することができ、かつ、その患者個人にあったより有効で最適な別の治療法を選択することも可能となる。それゆえ、化学放射線療法を行う前に、その治療効果を判定しうるバイオマーカーを同定することは、急務で重要な課題である。
【０００４】
がんに対する分子生物学的な理解が進んだにも関わらず、食道がんの化学放射線療法感受性を予測することは未だ困難な状況にある。アポトーシス、細胞周期（非特許文献６、７）、ＤＮＡ修復（非特許文献８）に関与する遺伝子、そして５−ＦＵに代表される抗がん剤の代謝関連酵素（非特許文献９）などは、感受性を規定する因子として従来から報告されてはいるものの、未だどれも実際の臨床治療には応用されていない。また、がん抑制遺伝子としてｐ５３とｐ１６、がん遺伝子として上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ｃ−ｍｙｃ、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１などが、食道がんにおける遺伝子変化として知られているが、肺がんや膵がんで報告の多いｒａｓの活性化は稀である（非特許文献１０，１１）。
【０００５】
近年、マイクロアレイ解析により、一度に数万の遺伝子転写産物の発現量を知ることが可能となり、この遺伝子発現プロファイルを利用した治療効果を予測する試みが、乳がん、前立腺がんなどでなされている（非特許文献１２〜１４）。食道がんにおいても、化学放射線療法感受性に関連する遺伝子を抽出する試みが幾つか報告されている。例えば、Ashidaらは、食道扁平上皮がん患者を、化学放射線療法後の生存期間により２群に分け、両者で発現量に差のある遺伝子群を同定し報告している（非特許文献１５）。また、Luthraらは、教師なし階層クラスタリング解析により、化学放射線療法感受性を反映するように、食道がん患者が２つのサブタイプに分けられることを報告している（非特許文献１６）。さらに、最近、Duongらは、食道扁平上皮がん患者の術前化学放射線療法に対する反応性を３２遺伝子で予測できたと報告している（非特許文献１７）。これらの報告は、マイクロアレイ解析が化学放射線療法感受性を解明する非常に有用な手段のひとつであることを示し、しかも抽出された遺伝子群の機能解析は、化学放射線療法反応性の作用機序を明らかにする手がかりを提供している可能性が高い。しかしながら、未だ抽出された遺伝子の機能と、化学放射線療法反応性の作用機序の解明までを試みた報告はない。また、食道がん患者の遺伝子発現プロファイルが臨床的に応用され、患者の病状を分子レベルで診断し、治療法を選択する際の一助となることは期待されてはいるものの、未だ実現には至っていないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Enzinger, P.C. & Mayer, R.J. Esophageal cancer. N Engl J Med 349, 2241-52 (2003).
【非特許文献２】Ilson, D.H. Oesophageal cancer: new developments in systemic therapy. Cancer Treat Rev 29, 525-32 (2003).
【非特許文献３】Hironaka, S. et al. Nonrandomized comparison between definitive chemoradiotherapy and radical surgery in patients with T(2-3)N(any) M(0) squamous cell carcinoma of the esophagus. Int J Radiat Oncol Biol Phys 57, 425-33 (2003).
【非特許文献４】Stahl, M. et al. Chemoradiation with and without surgery in patients with locally advanced squamous cell carcinoma of the esophagus. J Clin Oncol 23, 2310-7 (2005).
【非特許文献５】Bonnetain, F. et al. A comparative longitudinal quality of life study using the Spitzer quality of life index in a randomized multicenter phase III trial (FFCD 9102): chemoradiation followed by surgery compared with chemoradiation alone in locally advanced squamous resectable thoracic esophageal cancer. Ann Oncol 17, 827-34 (2006).
【非特許文献６】Okumura, H. et al. The predictive value of p53, p53R2, and p21 for the effect of chemoradiation therapy on oesophageal squamous cell carcinoma. Br J Cancer 92, 284-9 (2005).
【非特許文献７】Gibson, M.K. et al. Epidermal growth factor receptor, p53 mutation, and pathological response predict survival in patients with locally advanced esophageal cancer treated with preoperative chemoradiotherapy. Clin Cancer Res 9, 6461-8 (2003).
【非特許文献８】Zhao, H.J. et al. DNA-dependent protein kinase activity correlates with Ku70 expression and radiation sensitivity in esophageal cancer cell lines. Clin Cancer Res 6, 1073-8 (2000).
【非特許文献９】Schneider, S. et al. Downregulation of TS, DPD, ERCC1, GST-Pi, EGFR, and HER2 gene expression after neoadjuvant three-modality treatment in patients with esophageal cancer. J Am Coll Surg 200, 336-44 (2005).
【非特許文献１０】Kuwano, H. et al. Genetic alterations in esophageal cancer. Surg Today 35, 7-18 (2005).
【非特許文献１１】Okano, J., Snyder, L. & Rustgi, A.K. Genetic alterations in esophageal cancer. Methods Mol Biol 222, 131-45 (2003).
【非特許文献１２】Takata, R. et al. Predicting response to methotrexate, vinblastine, doxorubicin, and cisplatin neoadjuvant chemotherapy for bladder cancers through genome-wide gene expression profiling. Clin Cancer Res 11, 2625-36 (2005).
【非特許文献１３】Ghadimi, B.M. et al. Effectiveness of gene expression profiling for response prediction of rectal adenocarcinomas to preoperative chemoradiotherapy. J Clin Oncol 23, 1826-38 (2005).
【非特許文献１４】Chang, J.C. et al. Gene expression profiling for the prediction of therapeutic response to docetaxel in patients with breast cancer. Lancet 362, 362-9 (2003).
【非特許文献１５】Ashida, A. et al. Expression profiling of esophageal squamous cell carcinoma patients treated with definitive chemoradiotherapy: clinical implications. Int J Oncol 28, 1345-52 (2006).
【非特許文献１６】Luthra, R. et al. Gene expression profiling of localized esophageal carcinomas: association with pathologic response to preoperative chemoradiation. J Clin Oncol 24, 259-67 (2006).
【非特許文献１７】Duong, C. et al. Pretreatment gene expression profiles can be used to predict response to neoadjuvant chemoradiotherapy in esophageal cancer. Ann Surg Oncol 14, 3602-9 (2007).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、食道がんの治療方針を決定するためまたは食道がんの手術治療後の再発リスクを決定するためのマーカーを提供する。また、本発明は、食道がんの治療方針を決定するためまたは食道がんの手術治療後の再発リスクを決定するために使用するキットを提供する。また、本発明は、食道がんの治療方針を決定する方法、食道がんの手術治療後の再発リスクを決定する方法を提供する。また、本発明は、食道がんのための治療薬および治療方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（１）ＩＧＦＢＰ３遺伝子および／またはたんぱく質からなる、第１選択として食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するための、または、食道がんの手術治療後のがん再発のリスクを決定するためのマーカー；
（２）ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プローブ、ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プライマーおよびＩＧＦＢＰ３たんぱく質に対する特異抗体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、第１選択としての食道がんの治療方針を決定するための、または、食道がんの手術治療後のがん再発のリスクを決定するためのキット；
（３）第１選択として食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するための、または、食道がんの手術治療後の再発リスクを決定するための方法であって、
− 食道がん患者由来のがん組織を準備すること、
− 前記がん組織中のＩＧＦＢＰ３遺伝子およびβアクチン遺伝子の発現量を測定すること、および
− βアクチン遺伝子の発現量に対するＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量の比が、０．０５以上である場合、第１選択として手術療法を決定し、０．０４以下である場合、第１選択として放射線化学療法を決定すること、または
− βアクチン遺伝子の発現量に対するＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量の比が、０．０５以上である場合、再発のリスクは低く、０．０４以下である場合、再発のリスクは高いと決定すること
を含む方法；
（４）第１選択として食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するための、または食道がんの手術治療後の再発リスクを決定するための方法であって、
− 食道がん患者由来のがん組織と正常食道組織を準備すること、
− 前記がん組織と正常食道組織を抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色すること、
− 抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色された正常食道組織中の細胞とがん組織中のがん細胞を比較して、がん組織中のがん細胞の染色が、正常食道組織中の細胞の染色より強い場合、第１選択として手術療法を決定し、がん組織中のがん細胞の染色と正常食道組織中の細胞の染色が同等もしくはがん組織中のがん細胞の染色が正常食道組織中の細胞の染色より弱い場合、第１選択として放射線化学療法を決定すること、または
− 抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色された正常食道組織中の細胞とがん組織中のがん細胞を比較して、がん組織中のがん細胞の染色が、正常食道組織中の細胞の染色より強い場合、手術治療後の再発のリスクは低いと決定し、がん組織中のがん細胞の染色度と正常食道組織中の細胞の染色が同等もしくはがん組織中のがん細胞の染色が正常食道組織中の細胞の染色より弱い場合、手術治療後の再発のリスクは高いと決定すること
を含む方法；
（５）ＩＧＦＢＰ３遺伝子またはたんぱく質からなる、食道がんを治療するための医薬。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、第１選択として、食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するためのデータを提供し、第１選択の治療法を決定することができる。また、本発明によれば、食道がんの手術治療後の再発リスクを決定するためのデータを提供し、再発リスクを決定することができる。また、本発明によれば、食道がんを治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】化学放射線療法感受性とＩＧＦＢＰ３遺伝子、ＰＡＫ１ＩＰ１遺伝子転写産物の発現量との関係。化学放射線療法の「有効群」、「中間群」、「無効群」別のｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法によるＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現量を患者ごとにｐｌｏｔした。Ｙ軸はβ−ａｃｔｉｎ遺伝子の転写産物１０４コピーあたりの相対的なＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現量を示している。「無効群」は「有効群」と比較し、ＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現レベルが有意に高いことが認められた（Ｐ＝０．００１３３）。（−は平均値を示している。）
【図２】免疫組織化学的解析による食道がん組織におけるＩＧＦＢＰ３蛋白の発現。Ａは食道がん患者の正常食道上皮、Ｂ−Ｄは食道扁平上皮がん組織における抗ＩＧＦＢＰ３抗体による免疫組織染色像。倍率は全て２００倍。Ａ；基底層からその上層の全層にわたりＩＧＦＢＰ３蛋白の発現レベルが低い正常食道上皮。Ｂ；正常食道上皮と同等か弱く染色される癌細胞からなる扁平上皮がん組織。Ｃ，Ｄ；正常食道上皮より明らかに強く染色されるがん細胞からなる扁平上皮がん組織。ＩＧＦＢＰ３は細胞質に局在していたが、一部の標本では核に陽性像もみられた（Ｄ中の矢頭）。
【図３】ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現レベルと術後無再発生存期間との関連。術後補助療法を受けていない２４例の術後無再発生存期間を、ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現レベルによって比較した。術後４０ヶ月後での無再発生存率はＩＧＦＢＰ３高発現の患者では８６％（７名中６名）であり、これに対してＩＧＦＢＰ３低発現の患者では５３％（１７名中９名）であった。ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現レベルが高いほど、術後再発しにくい傾向が認められた。
【図４】食道がん細胞株におけるＩＧＦＢＰ３発現レベル。Ａ；ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法による食道がん細胞株８株におけるＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現量。Ｙ軸はβ−ａｃｔｉｎ遺伝子の転写産物１０４コピーあたりの相対的なＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現量を示す。Ｂ；ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによる食道がん細胞株８株におけるＩＧＦＢＰ３蛋白の発現レベル。ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌとしてα−チュブリンを使用した。Ｉｍａｇｅ Ｊを用いてデンシトメトリー解析を行い、α−チュブリンに対するＩＧＦＢＰ３のバンド強度の比を算出した。ＴＥ４細胞の発現を１．０としたときの各細胞の相対的な値を下部に示している。Ｃ；ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法による食道がん組織と食道がん細胞株におけるＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現量の比較。細胞株の発現量は、化学放射線療法感受性有効群と同等であることが確認された。
【図５】ＩＧＦＢＰ３の発現を抑制した細胞の作製。ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対しＲＮＡ干渉を誘導する配列を挿入したレンチウイルスベクターをＴＥ４、ＴＥ１１、ＴＥ８細胞の３株に感染させ、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現を抑制した。コントロールとして、ｌａｃＺ遺伝子に対しＲＮＡ干渉を誘導する配列を挿入したレンチウイルスベクターを感染させた。ＩＧＦＢＰ３の発現を抑制した細胞をＴＥ４−ＫＤ、ＴＥ１１−ＫＤ、ＴＥ８−ＫＤとして、コントロールの細胞をＴＥ４−ｌａｃＺ、ＴＥ１１−ｌａｃＺ、ＴＥ８−ｌａｃＺとして記載している。Ａ．Ｂ；ＴＥ４，ＴＥ１１，ＴＥ８細胞でのＩＧＦＢＰ３の発現抑制。Ａ；ＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現量が抑制されていることをｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。Ｙ軸はβ−ａｃｔｉｎ遺伝子の転写産物１０４コピーあたりの相対的なＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現量を示す。Ｂ；ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現が抑制されていることｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇにより確認した。ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌとしてα−チュブリンを使用した。Ｉｍａｇｅ Ｊを用いてデンシトメトリー解析を行い、α−チュブリンに対するＩＧＦＢＰ３のバンド強度の比を算出した。ＴＥ４細胞の発現を１．０としたときの各細胞の相対的な値を下部に示している。蛋白発現レベルで、８０％以上の抑制効果があることを確認した。
【図６】ＩＧＦＢＰ３を強制的に発現させた細胞の作製。ＩＧＦＢＰ３遺伝子のｃＤＮＡを挿入したレンチウイルスベクターをＴＥ１、ＴＥ８細胞に感染させ、ＩＧＦＢＰ３遺伝子を強制的に発現させた。レンチウイルスの感染後サブクローニングを行い、それぞれ６クローンずつ樹立した。コントロールとして、ｌａｃＺ遺伝子に対しＲＮＡ干渉を誘導する配列を挿入したレンチウイルスベクターを感染させた細胞を使用した。ＩＧＦＢＰ３蛋白を強制的に発現させた細胞をＴＥ１−ＯＥ、ＴＥ８−ＯＥとして、コントロールの細胞をＴＥ１−ｌａｃＺ、ＴＥ８−ｌａｃＺとして記載している。Ａ．Ｂ；ＴＥ１細胞でのＩＧＦＢＰ３の強制発現。Ａ；ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ解析。Ｙ軸はβ−ａｃｔｉｎ遺伝子の転写産物１０４コピーあたりの相対的なＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現量を示す。Ｂ；ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ解析。ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌとしてα−チュブリンを使用した。Ｉｍａｇｅ Ｊを用いてデンシトメトリー解析を行い、α−チュブリンに対するＩＧＦＢＰ３のバンド強度の比を算出した。ＴＥ４細胞の発現を１．０としたときの各細胞の相対的な値を下部に示している。３クローン（ＴＥ１−ＯＥ１，４，１０）は、内因性にＩＧＦＢＰ３蛋白が最も高発現していたＴＥ４細胞より発現が高かった。Ｃ．Ｄ；ＴＥ８細胞でのＩＧＦＢＰ３の強制発現。Ｃ；ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ解析。Ｄ；ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ解析。３クローン（ＴＥ８−ＯＥ１，２，３）は内因性にＩＧＦＢＰ３蛋白が最も高発現していたＴＥ４細胞より発現が高かった。
【図７】遺伝子導入細胞株の増殖曲線。６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに５．０×１０４／ｗｅｌｌ（triplicate）で播種し、図に示した日数で細胞数を測定した。実験は２回から３回繰り返し行った。測定値は平均値±標準偏差で示している。Ａ；コントロール細胞の増殖曲線。Ｂ；ＴＥ１−ＯＥは、コントロール細胞と比較し増殖活性が低下した。Ｃ；ＴＥ４−ＫＤでは、コントロール細胞と比較し有意な変化が認められなかった。Ｄ；ＴＥ８−ＫＤは、コントロール細胞と比較し増殖活性が増加し、ＴＥ８−ＯＥは増殖活性が低下した。Ｅ；ＴＥ１１−ＫＤもコントロール細胞と比較し増殖活性が増加した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明における、ＩＧＦＢＰ３（インスリン様成長因子結合蛋白３型）遺伝子および／またはたんぱく質とは、ＩＧＦ（インスリン様成長因子）に特異的に結合する６種類の蛋白（ＩＧＦＢＰ１〜ＩＧＦＢＰ６）うちで、血中に最も多く存在するたんぱく質をコードする遺伝子を意味し、核酸配列およびアミノ酸配列は、例えば、ヒトについてはｇｅｎｅ ｂａｎｋにおいてアクセッション番号：ＮＭ＿００１０１３３９８で登録されている。また、ヒト以外の他の生物におけるＩＧＦＢＰ３遺伝子も本願発明には含まれる。ＩＧＦＢＰ３遺伝子は、全体であってもその一部であっても良い。
【００１２】
本発明における、食道がんとは、咽頭と胃の間をつなぐ管のような臓器（食道）に発生する上皮性由来の腫瘍、例えば、扁平上皮癌、腺癌などを意味する。食道がんは、好ましくは早期食道がんである。早期食道がんとは、原発層の壁深達度が、粘膜層にとどまり、リンパ節転移を認めない食道がんを意味する。また、食道がんであれば、生物の由来は限定されないが、イヌ、ネコなどの愛玩動物およびヒト、好ましくはヒトである。
【００１３】
本発明における、放射線化学療法とは、化学療法と放射線療法を併用してがん治療を行う、悪性腫瘍に対する治療法を意味する。放射線化学療法は、がん治療に用いれらている放射線化学療法であれば限定されない。
【００１４】
化学療法とは、抗がん剤を用いたがんを治療する方法を意味する。抗がん剤は、抗がん剤であれば限定されないが、例えば、ＣＤＤＰ（シスプラチン）、５−ＦＵ（フルオロウラシル）、イリノテカン、塩酸ゲムシタビン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ＴＳ−１（ＦＴ（テガフール）、ＣＤＨＰ（ギメラシル）及びＯｘｏ（オテラシルカリウム）の３成分を配合）、ニムスチン（ニドラン）、ラニムスチン（サイメリン）、テモゾロミド（テモダール）、カルボプラチン、シクロホスファミド、メトレキサート、ドキソルビシン、オキサリプラチン、テガフール・ウラシル、インターフェロン・α（アルファ）、メルファラン（アルケラン）、サリドマイド、それらの組み合わせなどが挙げられる。好ましくは、ＣＤＤＰ（シスプラチン）、５−ＦＵ（フルオロウラシル）、イリノテカン、塩酸ゲムシタビン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ＴＳ−１（ＦＴ（テガフール）、ＣＤＨＰ（ギメラシル）及びＯｘｏ（オテラシルカリウム）の３成分を配合）、それらの組み合わせである。また、他のホルモン剤等と併用してもよい。投与量と投与方法は、がん治療に使用されている投与量と投与方法であれば限定されない。
【００１５】
放射線療法は、放射線をがんに照射してがんを治療する方法を意味する。放射線の種類（例えば、Ｘ線、γ線、電子線、陽子線、重粒子線など）と照射量は、がん治療に使用されている放射線と照射量であれば限定されない。
【００１６】
本発明における、手術療法とは、外科的手術または内視鏡的手術によりがんを食道から取り去る治療法を意味する。レーザー光をがんに照射してがんを取り去るレーザー療法も含まれる。
【００１７】
本発明における、第１選択として食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するためのマーカーとは、食道がんの最初の治療を、放射線化学療法により行うかまたは手術療法により行うかを決定するための指標を意味する。
【００１８】
具体的には、食道がんにおける、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量（転写物および／または翻訳物）が高い（ＩＧＦＢＰ３遺伝子高発現型）場合、食道がんを手術療法により治療することを第１選択と決定する。一方、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量が低い（ＩＧＦＢＰ３遺伝子低発現型）場合、食道がんを放射線化学療法により治療することを第１選択と決定する。
【００１９】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量が高いとは、参照遺伝子の発現量に対してＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量が高いことを意味する。ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量が低いとは、参照遺伝子の発現量に対してＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量が低いことを意味する。
【００２０】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プローブは、ＩＧＦＢＰ３遺伝子（ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）とハイブリダイゼーションする相補配列を有するオリゴヌクレオチドであれば、その長さは限定されないが、好ましくは、１２〜２６００塩基、より好ましくは１５〜１０００塩基のＩＧＦＢＰ３遺伝子の相補配列を含むオリゴヌクレオチドである。
【００２１】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プライマーは、ＩＧＦＢＰ３遺伝子とハイブリダイゼーションしてＩＧＦＢＰ３遺伝子（ｃＤＮＡ）の酵素的増幅に使用できるオリゴヌクレオチドであれば、その長さは限定されないが、好ましくは、８〜６０塩基、より好ましくは１５〜３０塩基のＩＧＦＢＰ３遺伝子（ｃＤＮＡ）の配列または相補配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００２２】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プローブおよび／またはプライマーの配列設計は、市場より入手できるプライマーおよび／またはプローブ設計ソフトフェアー、例えばＬＵＸ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などを用いて行うことができる。プライマーおよび／またはプローブ合成は、市販のＤＮＡ自動合成機を使用して自ら合成しても良いし、業者に合成を依頼してもよい。
【００２３】
これらプライマーおよび／またはプローブは、検出を容易にするために、放射性物質、酵素、蛍光物質などで標識されていても良い。
【００２４】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プライマーには、例えば、
Forward primer:5'GACCATCAAGCGGGAGACAGAATATGGC3'（配列番号１）、
Reverse primer: 5'CCCTGGGACTCAGCACACATTG3'（配列番号２）が挙げられる。
【００２５】
これらプライマーは、ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プローブとして使用しても良い。
【００２６】
ＩＧＦＢＰ３たんぱく質に対する特異的抗体（抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体）は、ポリクローナル抗体であっても、モノクロナール抗体であっても良い。ＩＧＦＢＰ３たんぱく質に対するポリクローナル抗体は、市場（例えば、抗ＩＧＦＢＰ−３ポリクローナル抗体（R&D System）、Ｈｕｍａｎ ＩＧＦＢＰ−３ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Diagnostic Systems Laboratories, Inc.）より入手することができる。モノクロナール抗体は、当業者に周知な方法で作製することができる。
【００２７】
食道がんの治療方針を決定するためのキットは、さらに、ハイブリダイゼーションのための試薬、ＲＴ−ＰＣＲのために試薬、参照用遺伝子、参照用遺伝子に対する特異的なプローブ、プライマー、参照用たんぱく質、参照用たんぱく質に対する特異的な抗体、２次抗体、基質、実施方法を記載した指示書などを含んでも良い。
【００２８】
さらに、食道がんを、放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを判断するための基準を含んでいても良い。基準は、食道がんを、放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを判断するための数値であることが好ましい。
【００２９】
本発明における、食道がん患者由来のがん組織とは、治療開始前に、患者から検査のために採取された食道がん組織（生検サンプル）、または、手術により摘出された食道がん組織又はそれらの一部を意味する。さらに、生検サンプルまたは手術により摘出された食道がん組織又はそれらの一部は、マイクロダイセクションにより食道がん組織のみを選択的に回収されることが好ましい。また、正常食道組織とは、食道上皮を含む食道の正常組織を意味し、生検や手術時に食道がん組織と供に得られる食道組織の正常部分であってもよい。
【００３０】
本発明における、食道がんのＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量を測定するとは、食道がん中の、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の転写物（たとえば、ｍＲＮＡ）及び／又は翻訳物（例えば、たんぱく質）を測定すること意味する。また、食道がんの参照遺伝子の発現量を測定するとは、食道がん中の、参照遺伝子の転写物（たとえば、ｍＲＮＡ）及び／又は翻訳物（例えば、たんぱく質）を測定すること意味する。
【００３１】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量（転写産物量および／または翻訳産物量）の測定は、ＩＧＦＢＰ３ｍＲＮＡおよび／またはＩＧＦＢＰ３たんぱく質を測定できれば、ＩＧＦＢＰ３ｍＲＮＡおよび／またはＩＧＦＢＰ３たんぱく質の全体であっても一部であっても良い。また、参照遺伝子の発現量（転写産物量および／または翻訳産物量）の測定は、参照遺伝子のｍＲＮＡおよび／またはたんぱく質を測定できれば、参照遺伝子のｍＲＮＡおよび／またはたんぱく質の全体であっても一部であっても良い。
【００３２】
ｍＲＮＡおよび／またはたんぱく質の測定方法は、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどの当業者に周知な方法を用いて測定することができる。
【００３３】
本発明における、参照遺伝子は、細胞において構成的に発現している遺伝子であれば限定されないが、例えば、βアクチン、αチュブリン、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、１８Ｓ ｒＲＮＡなどが挙げられる。
【００３４】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量の測定は、参照遺伝子の発現量の測定と同時に実施しても良いし、別々に実施しても良い。
【００３５】
参照遺伝子として、βアクチン遺伝子を使用して、食道がん組織中のＩＧＦＢＰ３遺伝子とβアクチン遺伝子の発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した場合、βアクチン遺伝子１００００コピー対してＩＧＦＢＰ３遺伝子のコピー数が、５００以上、好ましくは７５０以上、より好ましく１０００コピー以上である場合、ＩＧＦＢＰ３遺伝子高発現型と判断し、第１選択として手術療法を決定することができる。一方、ＩＧＦＢＰ３遺伝子のコピー数が４００以下、好ましくは２００以下、より好ましく１００以下である場合、ＩＧＦＢＰ３遺伝子低発現型と判断し、第１選択として放射線化学療法を決定することができる。
【００３６】
よって、参照遺伝子の発現量とＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量を比較して、治療方針を決定するための基準値を決定することができる。例えば、参照遺伝子がβアクチン遺伝子の場合、（ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量」／（βアクチン遺伝子の発現量）＝０．０５以上、好ましくは０．０７５以上、より好ましくは０．１以上の場合、ＩＧＦＢＰ３遺伝子高発現型と判断し、第１選択として手術療法を決定することができる。一方、比が０．０４以下、好ましくは０．０２以下、より好ましくは０．０１以下の場合、ＩＧＦＢＰ３遺伝子低発現型と判断し、第１選択として放射線化学療法を決定することができる。
【００３７】
遺伝子の発現量は、ＲＴ−ＰＣＲやノーザンブロットを使用して発現量を測定した場合、参照遺伝子のバンドの強度およびＩＧＦＢＰ３遺伝子のバンドの強度として得られても良い。
【００３８】
他の参照遺伝子を使用した場合、治療方針を決定するための基準値（すなわち、βアクチン遺伝子の発現量に対するＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量の比である、０．０５以上、好ましくは０．０７５以上、より好ましくは０．１以上、および．０４以下、好ましくは０．０２以下、より好ましくは０．０１以下）は、変化してもよい。
【００３９】
がん組織と正常食道組織を抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色するとは、当業者に周知の免疫組織化学的手法による染色を意味する。
【００４０】
免疫組織化学的手法は、簡単には、組織切片と抗原特異抗体（例えば、抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体）を反応させ、組織切片中の抗原に結合した抗原特異抗体を酵素反応または蛍光物質を利用して組織切片上で発色させ、組織における抗原の存在を検出する方法である。この方法において発色が強ければ、抗原量が多いことを意味する。
【００４１】
組織から組織切片を作製する方法は、当業者に周知である。組織切片は、凍結切片であってもパラフィン包埋切片であってもよい。
【００４２】
抗原特異抗体（例えば、抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体）は、酵素、蛍光物質、ビオチン、アビジンなどで標識されていてもいなくても良い。標識されていない抗体（第１抗体）を使用した場合、第１抗体に対する標識された抗体（第２抗体）を使用する。抗体の検出は、抗体に結合している標識を検出することによって成される。例えば、標識が酵素であれば酵素反応により組織上に発色が生じる。また、標識が蛍光物質であれば組織上に蛍光の発色が生じる。
【００４３】
正常食道組織中の細胞とがん組織中のがん細胞を比較して、正常食道組織中の細胞よりがん組織中のがん細胞の方が抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体により強く染色されているかいなか判定は、目視により行う。好ましくは病理専門医が目視により判定を行う。
【００４４】
抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色された正常食道組織中の細胞とがん組織中のがん細胞を比較して、がん組織中のがん細胞の方が、正常食道組織中の細胞より抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で強く染色されている場合を高発現（ＩＧＦＢＰ３遺伝子高発現型）と判定し、第１選択として手術療法を決定する。また、がん組織中のがん細胞と正常食道組織中の細胞の抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体による染色の強さが同等、又は、がん組織中のがん細胞の方が、正常食道組織中の細胞より抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で弱く染色されている場合を低発現（ＩＧＦＢＰ３遺伝子低発現型）と判定し、第１選択として放射線化学療法を決定する。
【００４５】
本発明における、食道がんの手術後の再発のリスクを決定するとは、食道がんを手術により摘出後に、がんが再発するリスクを予測することを意味する。また、食道がんの手術治療後の再発リスクを決定するためのマーカーとは、食道がんの手術後の再発のリスクを決定するための指標を意味する。
【００４６】
再発リスクを決定するとは、食道がんにおける、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量（転写物および／または翻訳物）が高い（ＩＧＦＢＰ３遺伝子高発現型）場合、がん再発のリスクが低いと決定する。一方、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量が低い（ＩＧＦＢＰ３遺伝子低発現型）場合、がん再発のリスクが高いと決定する。
【００４７】
がん再発のリスクが低いとは、手術療法による治療後、４０ヶ月、好ましくは５年以内にがんの再発が起こりにくいこと、例えば、がん再発率が４０％以下、好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下であることを意味する。
【００４８】
がん再発のリスクが高いとは、手術療法による治療後、４０ヶ月、好ましくは５年以内にがんの再発が起こりやすいこと、例えば、がん再発率が４０％より高い、好ましく４５％以上、より好ましくは５０％以上であることを意味する。
【００４９】
がん再発率が４０％とは、手術療法による治療を受けた食道がん患者１００人のうち４０人に、治療後、４０ヶ月、好ましくは５年以内にがんの再発が検出されることを意味する。治療後の患者は、再発予防のための処置を受けていてもいなくても良い。
【００５０】
食道がん細胞株において、ＩＧＦＢＰ３遺伝子を強制発現させた場合、増殖速度が低下したことから、ＩＧＦＢＰ３遺伝子またはたんぱく質は、食道がんを治療するために医薬として使用できる。
【００５１】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子の強制発現は、ＩＧＦＢＰ３遺伝子を有する発現ベクター（例えば、発現プラスミドや組み換えウイルス）で食道がんに遺伝子導入して実施することができる。ＩＧＦＢＰ３遺伝子を有する発現ベクターの作成方法や遺伝子導入の方法は当業者に周知である。また、ＩＧＦＢＰ３たんぱく質で食道がんを治療しても良い。
【００５２】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子またはたんぱく質を含む医薬は、さらに、必要に応じ、その他の成分を含有することができる。
【００５３】
該その他の成分としては、特に制限されることなく、目的に応じて適宜選択することができる。たとえば、医薬的に許容され得る賦形剤や担体を挙げることができる。
【００５４】
医薬の剤型としては、特に制限はなく、たとえば、固形、液状の経口剤、注射剤などを挙げることができる。
【００５５】
本発明における、抗がん剤の投与量、投与回数及び投与時期は、特に制限されることなく、適用例に対応し、適宜選択することができる。
【実施例】
【００５６】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００５７】
１ 研究方法
１−１ 臨床検体
財団法人癌研究会付属病院で２０００年９月から２００４年５月までに同時化学放射線療法を受けたcStageII・IIIの食道扁平上皮がん患者の治療前の生検からサンプルを得た。そのサンプルから、Application Solutions Laser Microdissection System（Leica Microsystems, Wetzlar, Germany）を用いてマイクロダイセクションを行い、病理専門医により詳細な癌部の特定を行った上で、食道がん組織のみを選択的に回収した。本研究は、癌研究会治験・臨床研究倫理審査委員会で承認された（承認日；２００６年５月１７日）「がんの治療感受性および悪性度を規定する遺伝子の発現解析に関する研究」に基づいた方法で、患者よりインフォームドコンセントを得て行った。
【００５８】
１−２ 化学放射線療法プロトコル
ＣＤＤＰ ４０mg/m２をｄａｙ１とｄａｙ８に点滴静注、５−ＦＵ ４００mg/m２をｄａｙｓ１−５およびｄａｙｓ８−１２に２４時間持続点滴静注した。同時に放射線療法を２Ｇｙ／ｄａｙで、ｄａｙｓ１−５，８−１２，１５−１９に行った（計３０Ｇｙ）。以上５週間を１セットとして２セット（照射総量６０Ｇｙ）行った。解析対象とした全症例がこのプロトコルにより治療を開始され、治療基準（５０Ｇｙ以上の根治照射が行われ、ＣＤＤＰ １００mg/m２、５−ＦＵ １，０００mg/m２以上の投与が確保されている）を満たしている。
【００５９】
１−３ ＲＮＡ抽出
Qiagen RNeasy mini kit（Qiagen, Valencia, CA）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出、精製した。ｔｏｔａｌ ＲＮＡの純度は、Agilent 2100 Bioanalyzer Nanochip（Agilent Technologies, Palo Alto, CA）により検定し、基準（Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）によって開発された基準であるＲＩＮ（RNA integrity number）が５以上）を充たしたサンプルのみを解析に使用した。
【００６０】
１−４ ｃＤＮＡオリゴヌクレオチドマイクロアレイ解析
２２，５７５プローブセット（１７，７４６遺伝子）が配置されたAgilent JFCR custom-made human oligonucleotide microarrayを使用した。Low RNA Input Fluorescent Linear Amplification Kit（Agilent Technologies）により、Ｃｙ−５もしくはＣｙ−３で蛍光標識されたｃＲＮＡを合成し、スライド上にハイブリダイゼーションさせた後、洗浄を行った。Agilent dual laser DNA microarray scanner（Agilent Technologies）により蛍光強度をスキャンし、Agilent Feature Extraction software（Agilent Technologies）を用いて画像を数値化し解析を行った。
【００６１】
本研究では、化学放射線療法を受けていない食道がん患者５例の正常食道上皮から得られたＲＮＡをプールして、それを全ての症例の発現解析においてコントロールとすることによって、患者間の遺伝子転写産物レベルでの発現量の差を解析した。
【００６２】
１−５ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ解析
SuperScriptIII First-Strand Synthesis System（Invitrogen）を用いてｃＤＮＡを合成し、LUX Designer software（Invitrogen）で設計した各標的遺伝子ｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーペアを用い、ABI Prism 7900HT sequence detection system（Applied Biosystems, Foster City, CA）により、各標的遺伝子の発現レベルを検証した。発現解析に用いたＬＵＸ検出法用の１１種類の各標的遺伝子のプライマーの配列（forward primer; F-P, reverse primer; R-Pと略す）を以下に記載する。
【００６３】
IGFBP3（insulin-like growth factor binding protein3: NM_001013398）:
FAM-labeled F-P:5'-GACCATCAAGCGGGAGACAGAATATGG[FAM]C-3'（配列番号１、[FAM]は、３’末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P; 5'-CCCTGGGACTCAGCACACATTG-3'（配列番号２）
HBB（hemoglobin, beta: NM_000518）：
FAM-labeled F-P; 5'-GAACTTGCCCAGGAGCCTGAAG[FAM]TC-3'（配列番号３、[FAM]は、３'末端から３番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P; 5'-TGGCTCACCTGGACAACCTC-3'（配列番号４）
ADM（adrenomedullin: NM_001124）:
FAM-labeled F-P;5'-CACGCTAAAGTTGTTCGCCGCG[FAM]G-3'（配列番号５、[FAM]は、３’末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P;5 '-TCGGTGTTTCCTTCTTCCACA-3'（配列番号６）
WNT5A（wingless-type MMTV integration site family, member 5A: NM_003392）:
FAM-labeled F-P; 5'-GACCTGAATAGGCACGAAGGCACAGG[FAM]C-3'（配列番号７、[FAM]は、３'末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P;5'-CACGGCATCTCTCTTTCACCA-3'（配列番号８）
TMEM132A（transmembrane protein 132A: NM_017870）:
FAM-labeled F-P: 5'-CACTCGATCAACAAGCACCAGACGAG[FAM]G-3'（配列番号９、[FAM]は、３'末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P; 5'-AGCTCCTGACCCTCCACAGC-3'（配列番号１０）
APOBEC3A（apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like 3A: NM_145699）：
FAM-labeled F-P; 5'-CACCGACCATCCTGGCTAACACGG[FAM]G-3'（配列番号１１、[FAM]は、３’末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P; 5'-CCACCACGCCTGGCTAATTT-3'（配列番号１２）
MGST1（microsomal glutathione S-transferase 1: NM_145791）：
FAM-labeled F-P;5'-CACGGGCAATGGTGTGGTAGATCCG[FAM]G-3'（配列番号１３、[FAM]は、３'末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P; 5'-CCCTCTACAGCCATCCTGCAC-3'（配列番号１４）
AKR1C3（aldo-keto reductase family 1, member C3: NM_003739）：
FAM-labeled F-P; 5'-CACCATAAGCCCTGTGTGTGGATGG[FAM]G-3'（配列番号１５、[FAM]は、３'末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P; 5'-TGTCCAGTCACCGGCATAGA-3'（配列番号１６）
PAK1IP1（PAK1 interacting protein 1: NM_017906）:
FAM-labeled F-P; 5'-GACATGAGGAGGAAGGCTTTCTTTCATG[FAM]C-3'（配列番号１７、[FAM]は、３'末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P;5'-AAACACTAATGCCAGGCTGACG-3'（配列番号１８）
NODATA（AAA398608）:
FAM-labeled F-P; 5'-GACTTCATGGCTTTCATCTCCTCTGAAG[FAM]C-3'（配列番号１９、[FAM]は、３’末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P;5'-CAATGAGCAGCGCATCAGAC-3'（配列番号２０）
EDIL3（EGF-like repeats and discoidin I-like domains 3: BX648583）:
FAM-labeled F-P;5'-CACAGGTTGTTAGCTCCACATTTCCTG[FAM]G-3'（配列番号２１、[FAM]は、３'末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P;5'-CCTGTGCCTTCCTGGGAAAC-3'（配列番号２２）
定量化のためのコントロールとしてβ−ａｃｔｉｎ遺伝子を用いた。β−ａｃｔｉｎ ｃＤＮＡ増幅のためのβ−ａｃｔｉｎ遺伝子特異的プライマーは、インビトロジェン社のCERTIFIED LUX Primer Set for human ACTIN FAM-labeled Cat. No. 101H-01を用いた。
【００６４】
ｃＤＮＡ反応は、SuperScriptIII First-Strand Synthesis System（Invitrogen）を用いて以下のように行った。
【００６５】
ｃＤＮＡ合成反応のための反応組成物（２０μＬ）を以下のように調製した：
２Ｘ ＲＴ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ １０μｌ、
ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ ２μｌ、
ＲＮＡ （４０ｎｇ） ４０ｎｇのＲＮＡに相当する容量、および
ＤＥＰＣ処理した水を加え、合計２０μｌにした。
【００６６】
ｃＤＮＡ合成反応のために、上記組成物（２０μＬ）を
２５℃で１０分間、
５０℃で３０分間、
８５℃で５分間、
インキュベーションし、次いで、氷中で１μｌ（２Ｕ）のＥ． ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈを加え、３７℃で２０ｍｉｎインキュベーションした。反応終了後、反応液を水で４０倍に希釈した。
【００６７】
上記希釈したｃＤＮＡ反応液を用いてｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ（Invitrogen）を用いて以下のとおり行った。
【００６８】
ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲのための反応組成（２５μｌ）：
Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Quantitative PCR SuperMix-UDG １２．５μｌ
ROX reference Dye １μｌ
１０μＭ primer mix ０．５μｌ
５０mM ＭｇＣｌ２ ０．５μｌ
DEPC-treated Water ５．５μｌ
ｃＤＮＡ反応溶液 ５μｌ
ｃＤＮＡ反応溶液には、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １０ｐｇ−１００ｎｇ相当量が含まれる。
【００６９】
ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲのＰＣＲプログラムは、以下のとおりである。
ABI Prism 7900HT sequence detection system (Applied Biosystems, Foster City, CA)により、はじめに、
５０℃ ２ｍｉｎ
９５℃ ２ｍｉｎ
続いて、以下：
９５℃ １５ｓｅｃ
５５℃ ３０ｓｅｃ
７２℃ ３０ｓｅｃ
を４８サイクル行った。
【００７０】
なお、反応産物のＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅは、
９５℃ １５ｓｅｃ
６０℃ １５ｓｅｃ
９５℃ １５ｓｅｃ
で行い、シングルピークになることから増幅反応が特異的であることを確認した。
【００７１】
コピー数の計算は以下のように行った。あらかじめコピー数のわかっているβ−ａｃｔｉｎ遺伝子（Invitrogen、qPCR Plasmid Standards：Cat.No:11740-100）とβ−ａｃｔｉｎ遺伝子特異的プライマー（インビトロジェン社のCERTIFIED LUX Primer Set for human ACTIN FAM-labeled Cat. No. 101H-01）を用いて、上記のプログラムでｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲを行い、検量線を作成した。この検量線を用い、測定された標的遺伝子の蛍光値から標的遺伝子のコピー数を求めた。
【００７２】
１−６ 免疫組織化学的解析
凍結保存されている組織材料から厚さ８μｍの切片をクライオスタット（Leica Microsystems）にて作製し、ＩＧＦＢＰ３タンパクの 免疫組織染色をHistofine Simple Stain MAX PO kit（Nichirei, Tokyo）を用いて行った。凍結切片を４％ＰＦＡで固定し、１００％メタノール−３％過酸化水素水１０分の処理による内因性ペルオキシダーゼの失活処理を行った後、１０％ヤギ血清にてブロッキングした。８００倍希釈した抗ＩＧＦＢＰ３抗体（R&D systems Inc., Minneapolis, MN）を用いて、４℃で一晩抗原抗体反応を行った。次に、ｋｉｔに付属しているビオチン化抗体を室温で３０分反応させ、ＤＡＢ溶液（Nichirei）にて可視化し、さらにヘマトキシリンによるカウンター染色を行った。
【００７３】
１−７ 培養細胞株及び細胞培養
東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センターより供与された８種類のヒト食道がん細胞株（ＴＥシリーズ：ＴＥ１，４，５，８，９，１０，１１，１５）（Nishihira, T., Hashimoto, Y., Katayama, M., Mori, S. & Kuroki, T. Molecular and cellular features of esophageal cancer cells. J Cancer Res Clin Oncol 119, 441-9 (1993)）を、１０％ウシ胎児血清を加えたＲＰＭＩ １６４０を培地とし、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターにて培養した。
【００７４】
１−８ レンチウイルスベクターへの遺伝子導入
ＩＧＦＢＰ３遺伝子を強制的に発現させるために、レンチウイルスベクターｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５（Invitrogen）に、ヒトＩＧＦＢＰ３遺伝子のｃＤＮＡを挿入した。また、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現を抑制するために、ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対しＲＮＡ干渉を誘導する配列（5'-TGC TGA TCC GAA GAA TTG TGC CAT TAG TTT TGG CCA CTG ACT GAC TAA TGG CAA TTC TTC GGA T- 3'（配列番号２３）と5'-CCT GAT CCG AAG AAT TGC CAT TAG TCA GTC AGT GGC CAA AAC TAA TGG CAC AAT TCT TCG GAT C-3'（配列番号２４））を同じレンチウイルスベクターに挿入した。コントロールの細胞としてｌａｃＺ遺伝子に対しＲＮＡ干渉を誘導する配列（5'-TGC TGA AAT CGC TGA TTT GTG TAG TCG TTT TGG CCA CTG ACT GAC GAC TAC ACA TCA GCG ATT T- 3'（配列番号２５）と5' -CCT GAA ATC GCT GAT GTG TAG TCG TCA GTC AGT GGC CAA AAC GAC TAC ACA AAT CAG CGA TTT C-3'（配列番号２６））を同じレンチウイルスベクターに挿入した。レンチウイルスベクターへ挿入された目的の配列は、全てシークエンスにより確認した。
【００７５】
２９３Ｔ細胞へ上記のベクターをパッケージングベクター（Invitrogen）と共に導入しウイルス粒子を作製した。６ug/mlポリブレンの存在下、ウイルス粒子を食道がん細胞株に感染させ、２４時間後、培地を交換した。さらに２４時間培養後、導入した遺伝子を安定に発現している細胞を選択するために、ブラストシジンを加えた培地と交換した。ＩＧＦＢＰ３遺伝子を強制的に発現させた細胞はサブクローニングを行ったが、抑制した細胞は、薬剤選択後に回収した細胞集団として扱った。
【００７６】
１−９ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ
細胞をＰＢＳで洗浄した後、２０mmol/L Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０mmol/L ＮａＣｌ，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１mM ＥＤＴＡ，１mM ＥＧＤＡ，１mM β−glycerophosphate，１mM Ｎａ３ＶＯ４，１mM phenylmethylsulfonyl fluorideにprotease inhibitor mixture tablet（complete; Roche Applied Science, Indianapolis, IN）を加えたｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを用いて氷上で溶解させた。溶解液を超音波破砕し、１３，０００rpm、４℃にて遠心した後上清を回収した。タンパク質濃度はBio-Rad Protein Assay（Bio-Rad, Hercules, CA）を用いて測定した。
【００７７】
各細胞から抽出した等量のタンパク質をＳＤＳで変性させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。タンパク質を転写した膜を５％スキムミルクを加えたＴＢＳにて室温で１時間ブロッキングし、洗浄した後、４℃で一晩、各標的タンパクに対する以下の一次抗体と反応させた。
【００７８】
一次抗体には、抗ヒトＩＧＦＢＰ３抗体（DSL-R00536; Diagnostic Systems Laboratories, Webster, TX, ５００倍希釈で使用）、または抗αチュブリン抗体（Sigma、１０００倍希釈で使用）を使用した。
一次抗体と反応後、各一次抗体に対する適切な以下のＨＲＰ標識二次抗体と室温で１時間反応させた。
【００７９】
二次抗体には、抗ヒトＩＧＦＢＰ３抗体に対しては、抗ヤギＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch. Laboratories Inc., West Grove, PA, ２０００倍希釈で使用）、抗αチュブリン抗体に対しては、抗マウスＩｇＧ抗体（Bio-Rad, ２，０００倍希釈で使用）を使用した。
【００８０】
目的とするタンパク質の最終的な検出は、western blotting detection system（Amaersham, Arlington Heights, IL）を用いて、化学発光により行い、各バンドの濃度をα−チュブリンのバンド濃度との比較により、定量化した。すなわち（Ａ／Ｂ）ｘ（Ｃ／Ｄ）の式により測定した。（Ａ；ＴＥ４のα−チュブリンのバンド濃度、Ｂ；サンプルのα−チュブリンのバンド濃度、Ｃ；サンプルのＩＧＦＢＰ３のバンド濃度、Ｄ；ＴＥ４のＩＧＦＢＰ３のバンド濃度）。
【００８１】
１−１０ 細胞増殖試験
細胞を６−ｗｅｌｌプレートに５×１０４／ｗｅｌｌ（triplicate）の濃度で播種し、測定する日にトリプシン処理を行い、細胞数を数えた。
【００８２】
１−１１ 抗がん剤感受性試験
９６−ｗｅｌｌプレートに１×１０４／ｗｅｌｌの濃度で細胞を播種し、２４時間培養した後、種々の濃度のＣＤＤＰ、あるいは５−ＦＵ（Sigma, St Louis, MO）を添加した。生存細胞の測定はＷＳＴ−１アッセイ（Roche, Penzberg, Germany）により行い、ＣＤＤＰは添加後４８時間、５−ＦＵは添加後７２時間で判定した。実験は３−４回繰り返し行い、生存曲線より、５０％増殖阻止濃度であるＩＣ５０を算出した。
【００８３】
１−１２ コロニー形成法による放射線感受性試験
５０−１００個のコロニーをつくるような濃度で細胞を播種し、２４時間後にＸ線照射装置（CP160, Faxitro x-ray corp.）を使用し、管電圧１６０kV、管電流６．２mA、０．５mm Ａｌフィルター、照射線量率２．２２Ｇｙ／ｍｉｎの条件で、Ｘ線照射（０−８Ｇｙ）を行った。２−３週間培養後、ホルマリン固定、２％ギムザ染色を行い、細胞数５０個以上のコロニーを数えコロニー形成率を算出し、それをもとに補正後、生存率を求めた。
【００８４】
１−１３ 統計学的解析
免疫組織染色と臨床病理学的因子の相関関係の検定は、χ２− ｔｅｓｔおよびＦｉｓｈｅｒ'ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔにより行った。ＩＧＦＢＰ３タンパクの発現と全生存期間、無再発生存期間との関連はＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により行い、ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｔｅｓｔにより検定した。他の２群間の比較はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔにより行った。解析はＳｔａｔＶｉｅｗ ５．０（Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA）を用いて行い、ｐ＜０．０５を有意水準とした。
【００８５】
２．研究結果
２−１ 食道がん化学放射線療法感受性マーカー同定の試み
化学放射線療法治療前の生検材料から得られたサンプルの遺伝子発現プロファイルの解析から、化学放射線療法後の効果を予測・判定するバイオマーカーの同定を試みた。
【００８６】
２−１（１） 遺伝子転写産物発現レベルでの感受性予測の試み
２−１（１）Ａ 解析対象とした食道がん患者の臨床病理学的背景
癌研病院で、２０００年９月から２００４年５月までに同時放射線化学療法を受けたｃStageII・IIIの食道扁平上皮がん患者２７例を解析対象とした。全例が同一の放射線化学療法のプロトコルにより治療を開始され、治療基準（５０Ｇｙ以上の根治照射が行われ、ＣＤＤＰ１００mg/m２、５−ＦＵ１０００mg/m２以上の投与が確保されている）を満たした症例である。
【００８７】
２−１（１）Ｂ サンプルの調製
治療開始前の生検からサンプルを得た。マイクロダイセクションにより食道がん組織のみを選択的に回収し、その組織からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し精製した。得られたＲＮＡの質的な劣化が認められた５例を除く、全２２例より得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡに対し、ｃＤＮＡオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて、転写産物レベルでの包括的遺伝子発現解析を行った。この手法により、全１７７４６遺伝子の転写産物レベルでの発現量を解析することができる。
【００８８】
２−１（１）Ｃ 臨床効果判定による分類
化学放射線療法感受性を規定している遺伝子を解析するため、最終的に解析可能な対象２２例を、治療効果により、以下の３群に分類した。
２２例のうち、治療後の臨床効果がComplete Response（以後ＣＲ）で、少なくとも１年以上再発が認められなかった１１例を「有効群」、治療後ＣＲが得られなかった５例を「無効群」、一旦ＣＲは得られたが、１年以内に再発を認めた６例を「中間群」に、分類した（表１）。臨床効果の判定は、ＣＴおよび内視鏡検査によって行った。
【００８９】
【表１】
【００９０】
２−１（１）Ｄ マイクロアレイを用いた遺伝子の選定
本研究で使用したＡｇｉｌｅｎｔ ｃｕｓｔｏｍ ａｒｒａｙは、２色比較を行うｃＤＮＡオリゴヌクレオチドアレイで、アレイ上に１７７５６遺伝子のプローブセットが配置されている。これらの遺伝子すべてに関して、食道がん組織中の転写産物の量をコントロールＲＮＡ中の転写産物の量と比較したときの発現量の比を知ることができる。本研究では、放射線化学療法を受けていない食道がん患者５例の正常食道上皮から得られたＲＮＡをプールして、それをすべての症例の発現解析においてコントロールとすることによって、患者間の遺伝子転写産物レベルでの発現量の差を解析した。
【００９１】
化学放射線療法感受性を規定する遺伝子を選定するために、前述の有効群１１例と無効群５例の間に、臨床病理学的背景に有意な違いがないことを確認した上で（ｃＴ因子Ｐ＝０．５７２４、ｃＮ因子Ｐ＝０．５２３８、ｃＳｔａｇｅ Ｐ＝０．５０５５）、この２群間で転写産物レベルでの発現量の差が大きい遺伝子の選定をＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を用いて行った。検定の条件をｌｏｃａｔｉｏｎ ｓｈｉｆｔ ０．３，ｐ＜０．０５に設定して挙がってきた遺伝子は４８遺伝子、ｌｏｃａｔｉｏｎ ｓｈｉｆｔ ０．４，ｐ＜０．０５では２３遺伝子、そして、ｌｏｃａｔｉｏｎ ｓｈｉｆｔ ０．５，ｐ＜０．０５で抽出されたのは１２遺伝子であった（表２）。以下、これら１２遺伝子に関し、さらなる解析を行った。
なお、１２遺伝子中にＤＮＡ修復、薬剤耐性、薬剤代謝などに関与することが知られている遺伝子群は含まれなかった。
【００９２】
【表２】
【００９３】
２−１（１）Ｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ による選定遺伝子の解析
これらの１２遺伝子の中から、その転写産物の発現レベルが、最も化学放射線療法感受性と高い関連性を示す遺伝子を抽出するため、ダイナミックレンジが広く、発現値の定量化に優れるｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法により、さらに解析を行った。解析には、１−２で使用したＲＮＡを鋳型にして合成したｃＤＮＡを使用した。定量化のためのコントロールとしてβ−ａｃｔｉｎ遺伝子を用いて、各遺伝子に関してβ−ａｃｔｉｎ遺伝子の転写産物１０４コピーあたりの相対的な量を求め比較・解析した。解析できたのは、有効なプライマーを設計することができなかった１遺伝子を除いた１２遺伝子中１１遺伝子で、再度Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を行ったところ（マイクロアレイ解析の使用で、ＲＴ−ＰＣＲ解析に不足となってしまったＥＳ０１２を除外した有効群１０例と無効群５例の比較）、４遺伝子がｐ＜０．０５の条件で選定された（表３）。これらの４遺伝子中で、最も有意な差を認めたのはＩＧＦＢＰ３であった（Ｐ＝０．００１３３）。上記の方法で算出したＩＧＦＢＰ３遺伝子とＰＡＫ１ＩＰ１遺伝子転写産物の発現レベルを群別にｐｌｏｔしたのが図１である。
【００９４】
【表３】
【００９５】
２−１（２） 蛋白発現レベルでの感受性予測
バイオマーカーの候補として選定した遺伝子を臨床応用していくには、その汎用性を考えたときに、蛋白レベルで発現していることが有用であり、さらに、何らかのメカニズムで化学放射線療法感受性を規定しているのであれば、食道がん組織における発現量と発現部位も重要である。従って、以下の解析を進めていった。
【００９６】
２−１（２）Ａ 選定遺伝子の蛋白発現レベル免疫組織化学的手法を用いて
ＩＧＦＢＰ３遺伝子が、食道がん組織で蛋白として発現しているかどうか調べるために、免疫組織染色を行った（図２）。２００３年４月から２００６年３月まで、術前治療を施行されず、財団法人癌研究会付属病院で手術された４３例の食道扁平上皮がん患者から採取した手術材料による検討を行った。
【００９７】
正常の食道上皮では、基底層からその上層の全層にわたり発現レベルが低いことが観察された（図２Ａ）。一方、がん組織での発現レベルは症例間により様々であった（図２Ｂ−Ｄ）。ＩＧＦＢＰ３は主にがん細胞の細胞質に局在し、一部の標本では核に陽性像もみられたが、本研究では、その局在を判定の基準に含めなかった。判定は病理専門医がｂｌｉｎｄ形式で行った。
【００９８】
正常食道上皮での発現レベルと比較して、それより明らかに強く染色されるがん細胞を高発現、同等もしくは弱く染色されるがん細胞を低発現と分類した（図２Ｂ〜Ｄ）。
【００９９】
上記の判定基準により、蛋白の発現レベルと臨床病理的背景因子との関連を調べたが、年齢（Ｐ＝０．１１７５）、性別（Ｐ＝０．６４１８）、ｐＴ因子（Ｐ＝０．７５５６）、ｐＮ因子（Ｐ＝０．７３４６）、ｐＭ因子（Ｐ＝０．３７４３）、ｐＳｔａｇｅ（Ｐ＝０．５２３０）、分化度（Ｐ＝０．１１２６）、リンパ管侵襲（Ｐ＞０．９９９９）、脈管侵襲（Ｐ＝０．２３０２）のいずれとも関連はみられなかった。また、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により、発現レベルと術後予後として全生存期間との関連を解析したが、統計的有意差はみられなかった。
【０１００】
２−１（２）Ｂ 化学放射線療法効果予測への応用
次に、２−１（２）Ａの判定基準により、蛋白の発現レベルと化学放射線療法感受性との関連を調べた。２−１（１）Ｅのｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲで使用したサンプルのうち、サンプルの残りが確保されて染色が可能であった１４例（有効群９例、無効群５例）、ＲＮＡの質的な劣化で解析から除外した５例のうちサンプルが確保されていた４例（有効群）、さらに、追加症例５例（有効群２例、無効群３例）を合わせた計２３例（有効群１５例、無効群８例）の免疫組織染色を行った。
【０１０１】
その結果、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量は、蛋白レベルでも化学放射線療法感受性と強い負の相関を示した（表４、Ｐ＝０．００６２）。即ち、ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現が多ければ、化学放射線療法感受性が低くなり、一方、発現が低ければ感受性が高くなることが示された。これらの結果から、ＩＧＦＢＰ３が化学放射線療法感受性と関連するバイオマーカーとなり得ることが強く示唆された。
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
２−１（２）Ｃ 術後予後予測への応用の可能性
２−１（２）Ａの結果では、ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現レベルと予後との関連は示されなかった。しかし、２−１（２）Ａで解析対象とした全４３例には、何らかの形で化学放射線療法を受けた症例が２７例含まれていた。一方、２−１（２）Ｂで示したように、ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現レベルが放射線感受性と関連することが明らかになった。
【０１０４】
従って、術後予後の指標として、化学放射線療法の影響を受けていないと考えられる無再発生存期間を用い、ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現レベルと食道がんの予後との関連を改めて評価した。
【０１０５】
その結果、図３に示すごとく、ＩＧＦＢＰ３高発現の群で術後再発しにくい傾向が認められた。このことから、ＩＧＦＢＰ３は予後規定因子にもなり得る可能性も示唆された。ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現レベルによって、食道扁平上皮がん患者を２群に分けると、その発現が高ければ化学放射線療法感受性は悪くなるが、手術予後としては良くなる傾向が認められた。このことから、ＩＧＦＢＰ３は食道がんの性質に影響し、またその悪性度にも関与する可能性があることが示唆された。
【０１０６】
２−２ Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの感受性マーカー候補遺伝子の機能解析
ＩＧＦＢＰ３が化学放射線療法感受性と関連し、食道がんの悪性度にも関与する可能性があることが示唆されたが、その作用機序は不明である。従って、次に、食道がん細胞株を用いて、その生物学的な意義についてｉｎ ｖｉｔｒｏで検討を行った。
【０１０７】
２−２（１） 食道がん細胞株におけるＩＧＦＢＰ３発現レベル
２−２（１）Ａ 遺伝子転写産物発現レベルと蛋白発現レベル
まず、進行食道扁平上皮がんの手術材料より樹立された食道がん細胞株ＴＥシリーズ（胸水由来のＴＥ９以外は原発巣由来）８株におけるＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現レベルを、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲによって検討した。前章の５−１（１）Ｃと同様、β−ａｃｔｉｎ遺伝子の転写産物１０４コピーあたりのコピー数で比較を行った。その結果、８株の細胞株は、ＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現量によって以下の３つのグループに分けられた。ＴＥ４とＴＥ１１は、β−ａｃｔｉｎ遺伝子の転写産物１０４コピーあたり２００コピー以上、ＴＥ１，ＴＥ５，ＴＥ９，ＴＥ１０，ＴＥ１５は２０−５５コピー、ＴＥ８はそれらの中間で１００コピーであった。ゆえに、食道がん細胞株ＴＥシリーズは、ＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現レベルにより、高発現群２株（ＴＥ４，ＴＥ１１）、中発現１株（ＴＥ８）、低発現群５株（ＴＥ１，ＴＥ５，ＴＥ９，ＴＥ１０，ＴＥ１５）の３タイプが存在することが分かった（図４Ａ）。
【０１０８】
さらに、これらの細胞株におけるＩＧＦＢＰ３蛋白の発現をｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇにより確認した。遺伝子転写産物の発現量が多かったＴＥ４，ＴＥ１１は、蛋白レベルでも発現が高かった。遺伝子転写産物の発現量が中間だったＴＥ８を含めた他の６細胞株は発現が低く、差は認められなかった（図４Ｂ）。全体として、遺伝子転写産物の発現量に比例して、ＩＧＦＢＰ３蛋白が発現していることが確認された。
【０１０９】
次に、これらｉｎ ｖｉｔｒｏの食道がん細胞株のＩＧＦＢＰ３発現量を、ｉｎ ｖｉｖｏの食道がん組織における発現レベルと比較した。細胞株のＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現量は化学放射線療法感受性の有効群と同等であり、無効群の発現量と比較すると、有意に低いことが認められた（図４Ｃ）。従って、これらの細胞株は、ヒト食道がんにおけるＩＧＦＢＰ３の機能を解析するには有用と考えられたが、これらの細胞株を用いて感受性を検討する際には、細胞株のＩＧＦＢＰ３転写産物の発現量を高くし、それによって初めて生体内の治療応答性を反映できる可能性が高いと考えられた。
【０１１０】
２−２（１）Ｂ 発現抑制と強制発現
次に、これらの食道がん由来細胞株におけるＩＧＦＢＰ３遺伝子の機能を解析する目的で、その発現が抑制された細胞およびＩＧＦＢＰ３遺伝子を強制的に発現させた細胞を作製した。
【０１１１】
２−２（１）Ｂａ 発現抑制系
ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対してＲＮＡ干渉を誘導する配列を挿入したレンチウイルスベクターを用いて、高発現群２株（ＴＥ４，ＴＥ１１）、中発現１株（ＴＥ８）の３株に対して、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現抑制を試みた（図５）。コントロールの細胞として、ｌａｃＺ遺伝子に対しＲＮＡ干渉を誘導する配列を挿入したレンチウイルスベクターを感染させ、これらは、薬剤選択後に回収した細胞集団として扱った。得られた抑制効果の確認はｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ（図５Ａ）およびｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ（図５Ｂ）により行い、少なくとも、蛋白発現レベルで８０％以上の抑制効果があることを確認した上で以後の解析に使用した。（ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現を抑制した細胞をＴＥ４−ＫＤ、ＴＥ１１−ＫＤ、ＴＥ８−ＫＤとして、コントロールの細胞をＴＥ４−ｌａｃＺ、ＴＥ１１−ｌａｃＺ、ＴＥ８−ｌａｃＺとして記載する）。
【０１１２】
２−２（１）Ｂｂ強制発現系
一方、中発現１株（ＴＥ８）、低発現群１株（ＴＥ１）において、ＩＧＦＢＰ３遺伝子を強制的に発現させることを試みた（図６）。レンチウイルスの感染後サブクローニングを行い、それぞれ６クローンずつ樹立した（図６Ｂ，６Ｄ）。蛋白レベルで確認すると、その発現は様々であったが、３クローンは内因性にＩＧＦＢＰ３蛋白が最も高発現していた細胞株（ＴＥ４）より発現が高かった（図６Ｂ，６Ｄ）。さらに、その一部の遺伝子転写産物の発現レベルをｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲでも確認した（図６Ａ，６Ｃ）。（ＩＧＦＢＰ３蛋白を強制的に発現させた細胞をＴＥ１−ＯＥ、ＴＥ８−ＯＥとして、コントロールの細胞をＴＥ１−ｌａｃＺ、ＴＥ８−ｌａｃＺとして記載する）。
【０１１３】
２−２（２） 遺伝子導入細胞株を用いたＩＧＦＢＰ３遺伝子の機能解析
２−２（２）Ａ 細胞増殖について
非小細胞肺がん細胞株を使った実験で、ＩＧＦＢＰ３が細胞増殖抑制的に機能していることが報告されている（Hochscheid, R., Jaques, G. & Wegmann, B. Transfection of human insulin-like growth factor-binding protein 3 gene inhibits cell growth and tumorigenicity: a cell culture model for lung cancer. J Endocrinol 166, 553-63 (2000);Lee, H.Y. et al. Insulin-like growth factor binding protein-3 inhibits the growth of non-small cell lung cancer. Cancer Res 62, 3530-7 (2002)）。従って、まず初めに、５−２（１）Ｂで作製した遺伝子導入細胞株を利用し、ＩＧＦＢＰ３遺伝子が食道がん細胞株の増殖に及ぼす影響を検討した（図７）。
【０１１４】
コントロールの細胞の増殖活性とＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現レベルとに関連はみられなかった（図７Ａ）。ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現を抑制した高発現群の２株（ＴＥ４，ＴＥ１１）のうち、ＴＥ４−ＫＤについては、コントロール細胞と比較し有意な変化が認められなかったものの（図７Ｃ）、ＴＥ１１−ＫＤでは増殖速度の増加が認められ（図７Ｅ）、発現を抑制した中発現の１株（ＴＥ８）であるＴＥ８−ＫＤについても増殖速度が増加するという結果が得られた（図７Ｄ）。一方、ＩＧＦＢＰ３遺伝子を強制的に発現させた低発現群の１株（ＴＥ１）、中発現の１株（ＴＥ８）では、逆に、ＩＧＦＢＰ３発現が高くなることによって増殖速度が低下した（図７Ｂ，７Ｄ）。これらのことから、１細胞株を除いた全ての細胞株で、ＩＧＦＢＰ３の高発現は増殖を抑制する方向に働いていることが分かり、非小細胞肺がん細胞株の場合と同様に、食道がん細胞株においても、ＩＧＦＢＰ３は増殖抑制的に機能していることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明は、食道がんを、放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するために有用である。また、本発明は、食道がんの手術後の再発のリスクを診断するために有用である。また、本発明は、食道がんを治療するために有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食道がんの治療方法を選択するためのマーカー（すなわち、食道がんの治療用マーカー）、食道がんの手術治療後の再発のリスクを決定するためのマーカー（すなわち、食道がんの術後用マーカー）およびそれらに使用するためのキット、並びにそれを使用した食道がん治療方法を選択する方法、食道がんの手術治療後の再発のリスクを決定する方法に関する。さらに、食道がんのための治療薬および治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本における食道がん罹患数は、女性が２，４８３名、男性は、その５倍以上の１３，８４０名と、男性に圧倒的に多い（２００１年）。部位別にみると６番目に多く、他の消化器系の胃がん、結腸・直腸がんと比較して難治性であり、毎年、約１０，０００名が食道がんで亡くなっている。また、食道がんの５年生存率は、日本では２０％を超えているものの、諸外国においては２０％にも満たない（非特許文献１と２）。食道がんの組織型は、日本では扁平上皮がんが９０％以上を占め、喫煙、アルコールを始めとする慢性的な刺激がその危険因子として考えられている。一方、欧米では、腺がんの占める割合が多く、バレット食道（食道下部の粘膜が円柱上皮に置き換わった状態）との関連が指摘されている。特に、米国においては腺がんの占める割合は増加傾向にあり、欧米の臨床試験を評価する際には、患者の組織型をも考慮する必要がある。
【０００３】
食道がんの治療は、近年の内視鏡的治療や化学放射線療法などの内科的治療の進歩により、従来の手術療法を中心とした状況に変化がみられている。特に、根治的化学放射線療法が手術療法に匹敵するとの報告がなされてから、食道の温存が得られる化学放射線療法は、ＱＯＬの点からも治療の有望な選択肢の一つとなった。Hironakaらは、retrospectiveな研究結果ながら、StageII・III（Ｔ４を除く）の「化学放射線療法例（ｎ＝５３）」と「手術単独例（ｎ＝４５）」の生存成績を比較し、３年生存率と５年生存率が、化学放射線療法例では各々４９％、４６％、手術単独例では５７％、５１％と、ほぼ同等の成績であると報告した（非特許文献３）。また、ヨーロッパから報告された「化学放射線療法施行後に手術を行う群」と「継続して化学放射線療法を行う群」との無作為化比較試験では、両群間の生存成績に有意差は認められず、少なくとも化学放射線療法の途中評価で奏功が認められれば、その後に手術を行う意義は少ないと結論づけられた（非特許文献４、５）。これらの試験結果は扁平上皮がんを対象としたものであることから、日本人の食道がん患者においても十分に参考に出来ると思われる。このように、根治的化学放射線療法は、手術可能な食道がんの標準的な治療となり得るにもかかわらず、その治療法の選択自体は施設毎の考え方に依存し、明確な基準がないのが現状である。もし仮に化学放射線療法が効かない患者にその治療が選択された場合には、治療の間にがんが進行し、治癒の機会を逃す可能性もある。従って、治療前に効果が予測でき、あらかじめ、化学放射線療法が効かない患者を除外することができれば、副作用の問題や無駄な医療費の負担を改善することができ、かつ、その患者個人にあったより有効で最適な別の治療法を選択することも可能となる。それゆえ、化学放射線療法を行う前に、その治療効果を判定しうるバイオマーカーを同定することは、急務で重要な課題である。
【０００４】
がんに対する分子生物学的な理解が進んだにも関わらず、食道がんの化学放射線療法感受性を予測することは未だ困難な状況にある。アポトーシス、細胞周期（非特許文献６、７）、ＤＮＡ修復（非特許文献８）に関与する遺伝子、そして５−ＦＵに代表される抗がん剤の代謝関連酵素（非特許文献９）などは、感受性を規定する因子として従来から報告されてはいるものの、未だどれも実際の臨床治療には応用されていない。また、がん抑制遺伝子としてｐ５３とｐ１６、がん遺伝子として上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ｃ−ｍｙｃ、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１などが、食道がんにおける遺伝子変化として知られているが、肺がんや膵がんで報告の多いｒａｓの活性化は稀である（非特許文献１０，１１）。
【０００５】
近年、マイクロアレイ解析により、一度に数万の遺伝子転写産物の発現量を知ることが可能となり、この遺伝子発現プロファイルを利用した治療効果を予測する試みが、乳がん、前立腺がんなどでなされている（非特許文献１２〜１４）。食道がんにおいても、化学放射線療法感受性に関連する遺伝子を抽出する試みが幾つか報告されている。例えば、Ashidaらは、食道扁平上皮がん患者を、化学放射線療法後の生存期間により２群に分け、両者で発現量に差のある遺伝子群を同定し報告している（非特許文献１５）。また、Luthraらは、教師なし階層クラスタリング解析により、化学放射線療法感受性を反映するように、食道がん患者が２つのサブタイプに分けられることを報告している（非特許文献１６）。さらに、最近、Duongらは、食道扁平上皮がん患者の術前化学放射線療法に対する反応性を３２遺伝子で予測できたと報告している（非特許文献１７）。これらの報告は、マイクロアレイ解析が化学放射線療法感受性を解明する非常に有用な手段のひとつであることを示し、しかも抽出された遺伝子群の機能解析は、化学放射線療法反応性の作用機序を明らかにする手がかりを提供している可能性が高い。しかしながら、未だ抽出された遺伝子の機能と、化学放射線療法反応性の作用機序の解明までを試みた報告はない。また、食道がん患者の遺伝子発現プロファイルが臨床的に応用され、患者の病状を分子レベルで診断し、治療法を選択する際の一助となることは期待されてはいるものの、未だ実現には至っていないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
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【非特許文献５】Bonnetain, F. et al. A comparative longitudinal quality of life study using the Spitzer quality of life index in a randomized multicenter phase III trial (FFCD 9102): chemoradiation followed by surgery compared with chemoradiation alone in locally advanced squamous resectable thoracic esophageal cancer. Ann Oncol 17, 827-34 (2006).
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【非特許文献１６】Luthra, R. et al. Gene expression profiling of localized esophageal carcinomas: association with pathologic response to preoperative chemoradiation. J Clin Oncol 24, 259-67 (2006).
【非特許文献１７】Duong, C. et al. Pretreatment gene expression profiles can be used to predict response to neoadjuvant chemoradiotherapy in esophageal cancer. Ann Surg Oncol 14, 3602-9 (2007).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、食道がんの治療方針を決定するためまたは食道がんの手術治療後の再発リスクを決定するためのマーカーを提供する。また、本発明は、食道がんの治療方針を決定するためまたは食道がんの手術治療後の再発リスクを決定するために使用するキットを提供する。また、本発明は、食道がんの治療方針を決定する方法、食道がんの手術治療後の再発リスクを決定する方法を提供する。また、本発明は、食道がんのための治療薬および治療方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（１）ＩＧＦＢＰ３遺伝子および／またはたんぱく質からなる、第１選択として食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するための、または、食道がんの手術治療後のがん再発のリスクを決定するためのマーカー；
（２）ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プローブ、ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プライマーおよびＩＧＦＢＰ３たんぱく質に対する特異抗体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、第１選択としての食道がんの治療方針を決定するための、または、食道がんの手術治療後のがん再発のリスクを決定するためのキット；
（３）第１選択として食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するための、または、食道がんの手術治療後の再発リスクを決定するための方法であって、
− 食道がん患者由来のがん組織を準備すること、
− 前記がん組織中のＩＧＦＢＰ３遺伝子およびβアクチン遺伝子の発現量を測定すること、および
− βアクチン遺伝子の発現量に対するＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量の比が、０．０５以上である場合、第１選択として手術療法を決定し、０．０４以下である場合、第１選択として放射線化学療法を決定すること、または
− βアクチン遺伝子の発現量に対するＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量の比が、０．０５以上である場合、再発のリスクは低く、０．０４以下である場合、再発のリスクは高いと決定すること
を含む方法；
（４）第１選択として食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するための、または食道がんの手術治療後の再発リスクを決定するための方法であって、
− 食道がん患者由来のがん組織と正常食道組織を準備すること、
− 前記がん組織と正常食道組織を抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色すること、
− 抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色された正常食道組織中の細胞とがん組織中のがん細胞を比較して、がん組織中のがん細胞の染色が、正常食道組織中の細胞の染色より強い場合、第１選択として手術療法を決定し、がん組織中のがん細胞の染色と正常食道組織中の細胞の染色が同等もしくはがん組織中のがん細胞の染色が正常食道組織中の細胞の染色より弱い場合、第１選択として放射線化学療法を決定すること、または
− 抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色された正常食道組織中の細胞とがん組織中のがん細胞を比較して、がん組織中のがん細胞の染色が、正常食道組織中の細胞の染色より強い場合、手術治療後の再発のリスクは低いと決定し、がん組織中のがん細胞の染色度と正常食道組織中の細胞の染色が同等もしくはがん組織中のがん細胞の染色が正常食道組織中の細胞の染色より弱い場合、手術治療後の再発のリスクは高いと決定すること
を含む方法；
（５）ＩＧＦＢＰ３遺伝子またはたんぱく質からなる、食道がんを治療するための医薬。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、第１選択として、食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するためのデータを提供し、第１選択の治療法を決定することができる。また、本発明によれば、食道がんの手術治療後の再発リスクを決定するためのデータを提供し、再発リスクを決定することができる。また、本発明によれば、食道がんを治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】化学放射線療法感受性とＩＧＦＢＰ３遺伝子、ＰＡＫ１ＩＰ１遺伝子転写産物の発現量との関係。化学放射線療法の「有効群」、「中間群」、「無効群」別のｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法によるＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現量を患者ごとにｐｌｏｔした。Ｙ軸はβ−ａｃｔｉｎ遺伝子の転写産物１０４コピーあたりの相対的なＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現量を示している。「無効群」は「有効群」と比較し、ＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現レベルが有意に高いことが認められた（Ｐ＝０．００１３３）。（−は平均値を示している。）
【図２】免疫組織化学的解析による食道がん組織におけるＩＧＦＢＰ３蛋白の発現。Ａは食道がん患者の正常食道上皮、Ｂ−Ｄは食道扁平上皮がん組織における抗ＩＧＦＢＰ３抗体による免疫組織染色像。倍率は全て２００倍。Ａ；基底層からその上層の全層にわたりＩＧＦＢＰ３蛋白の発現レベルが低い正常食道上皮。Ｂ；正常食道上皮と同等か弱く染色される癌細胞からなる扁平上皮がん組織。Ｃ，Ｄ；正常食道上皮より明らかに強く染色されるがん細胞からなる扁平上皮がん組織。ＩＧＦＢＰ３は細胞質に局在していたが、一部の標本では核に陽性像もみられた（Ｄ中の矢頭）。
【図３】ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現レベルと術後無再発生存期間との関連。術後補助療法を受けていない２４例の術後無再発生存期間を、ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現レベルによって比較した。術後４０ヶ月後での無再発生存率はＩＧＦＢＰ３高発現の患者では８６％（７名中６名）であり、これに対してＩＧＦＢＰ３低発現の患者では５３％（１７名中９名）であった。ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現レベルが高いほど、術後再発しにくい傾向が認められた。
【図４】食道がん細胞株におけるＩＧＦＢＰ３発現レベル。Ａ；ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法による食道がん細胞株８株におけるＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現量。Ｙ軸はβ−ａｃｔｉｎ遺伝子の転写産物１０４コピーあたりの相対的なＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現量を示す。Ｂ；ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによる食道がん細胞株８株におけるＩＧＦＢＰ３蛋白の発現レベル。ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌとしてα−チュブリンを使用した。Ｉｍａｇｅ Ｊを用いてデンシトメトリー解析を行い、α−チュブリンに対するＩＧＦＢＰ３のバンド強度の比を算出した。ＴＥ４細胞の発現を１．０としたときの各細胞の相対的な値を下部に示している。Ｃ；ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法による食道がん組織と食道がん細胞株におけるＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現量の比較。細胞株の発現量は、化学放射線療法感受性有効群と同等であることが確認された。
【図５】ＩＧＦＢＰ３の発現を抑制した細胞の作製。ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対しＲＮＡ干渉を誘導する配列を挿入したレンチウイルスベクターをＴＥ４、ＴＥ１１、ＴＥ８細胞の３株に感染させ、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現を抑制した。コントロールとして、ｌａｃＺ遺伝子に対しＲＮＡ干渉を誘導する配列を挿入したレンチウイルスベクターを感染させた。ＩＧＦＢＰ３の発現を抑制した細胞をＴＥ４−ＫＤ、ＴＥ１１−ＫＤ、ＴＥ８−ＫＤとして、コントロールの細胞をＴＥ４−ｌａｃＺ、ＴＥ１１−ｌａｃＺ、ＴＥ８−ｌａｃＺとして記載している。Ａ．Ｂ；ＴＥ４，ＴＥ１１，ＴＥ８細胞でのＩＧＦＢＰ３の発現抑制。Ａ；ＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現量が抑制されていることをｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。Ｙ軸はβ−ａｃｔｉｎ遺伝子の転写産物１０４コピーあたりの相対的なＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現量を示す。Ｂ；ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現が抑制されていることｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇにより確認した。ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌとしてα−チュブリンを使用した。Ｉｍａｇｅ Ｊを用いてデンシトメトリー解析を行い、α−チュブリンに対するＩＧＦＢＰ３のバンド強度の比を算出した。ＴＥ４細胞の発現を１．０としたときの各細胞の相対的な値を下部に示している。蛋白発現レベルで、８０％以上の抑制効果があることを確認した。
【図６】ＩＧＦＢＰ３を強制的に発現させた細胞の作製。ＩＧＦＢＰ３遺伝子のｃＤＮＡを挿入したレンチウイルスベクターをＴＥ１、ＴＥ８細胞に感染させ、ＩＧＦＢＰ３遺伝子を強制的に発現させた。レンチウイルスの感染後サブクローニングを行い、それぞれ６クローンずつ樹立した。コントロールとして、ｌａｃＺ遺伝子に対しＲＮＡ干渉を誘導する配列を挿入したレンチウイルスベクターを感染させた細胞を使用した。ＩＧＦＢＰ３蛋白を強制的に発現させた細胞をＴＥ１−ＯＥ、ＴＥ８−ＯＥとして、コントロールの細胞をＴＥ１−ｌａｃＺ、ＴＥ８−ｌａｃＺとして記載している。Ａ．Ｂ；ＴＥ１細胞でのＩＧＦＢＰ３の強制発現。Ａ；ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ解析。Ｙ軸はβ−ａｃｔｉｎ遺伝子の転写産物１０４コピーあたりの相対的なＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現量を示す。Ｂ；ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ解析。ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌとしてα−チュブリンを使用した。Ｉｍａｇｅ Ｊを用いてデンシトメトリー解析を行い、α−チュブリンに対するＩＧＦＢＰ３のバンド強度の比を算出した。ＴＥ４細胞の発現を１．０としたときの各細胞の相対的な値を下部に示している。３クローン（ＴＥ１−ＯＥ１，４，１０）は、内因性にＩＧＦＢＰ３蛋白が最も高発現していたＴＥ４細胞より発現が高かった。Ｃ．Ｄ；ＴＥ８細胞でのＩＧＦＢＰ３の強制発現。Ｃ；ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ解析。Ｄ；ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ解析。３クローン（ＴＥ８−ＯＥ１，２，３）は内因性にＩＧＦＢＰ３蛋白が最も高発現していたＴＥ４細胞より発現が高かった。
【図７】遺伝子導入細胞株の増殖曲線。６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに５．０×１０４／ｗｅｌｌ（triplicate）で播種し、図に示した日数で細胞数を測定した。実験は２回から３回繰り返し行った。測定値は平均値±標準偏差で示している。Ａ；コントロール細胞の増殖曲線。Ｂ；ＴＥ１−ＯＥは、コントロール細胞と比較し増殖活性が低下した。Ｃ；ＴＥ４−ＫＤでは、コントロール細胞と比較し有意な変化が認められなかった。Ｄ；ＴＥ８−ＫＤは、コントロール細胞と比較し増殖活性が増加し、ＴＥ８−ＯＥは増殖活性が低下した。Ｅ；ＴＥ１１−ＫＤもコントロール細胞と比較し増殖活性が増加した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明における、ＩＧＦＢＰ３（インスリン様成長因子結合蛋白３型）遺伝子および／またはたんぱく質とは、ＩＧＦ（インスリン様成長因子）に特異的に結合する６種類の蛋白（ＩＧＦＢＰ１〜ＩＧＦＢＰ６）うちで、血中に最も多く存在するたんぱく質をコードする遺伝子を意味し、核酸配列およびアミノ酸配列は、例えば、ヒトについてはｇｅｎｅ ｂａｎｋにおいてアクセッション番号：ＮＭ＿００１０１３３９８で登録されている。また、ヒト以外の他の生物におけるＩＧＦＢＰ３遺伝子も本願発明には含まれる。ＩＧＦＢＰ３遺伝子は、全体であってもその一部であっても良い。
【００１２】
本発明における、食道がんとは、咽頭と胃の間をつなぐ管のような臓器（食道）に発生する上皮性由来の腫瘍、例えば、扁平上皮癌、腺癌などを意味する。食道がんは、好ましくは早期食道がんである。早期食道がんとは、原発層の壁深達度が、粘膜層にとどまり、リンパ節転移を認めない食道がんを意味する。また、食道がんであれば、生物の由来は限定されないが、イヌ、ネコなどの愛玩動物およびヒト、好ましくはヒトである。
【００１３】
本発明における、放射線化学療法とは、化学療法と放射線療法を併用してがん治療を行う、悪性腫瘍に対する治療法を意味する。放射線化学療法は、がん治療に用いれらている放射線化学療法であれば限定されない。
【００１４】
化学療法とは、抗がん剤を用いたがんを治療する方法を意味する。抗がん剤は、抗がん剤であれば限定されないが、例えば、ＣＤＤＰ（シスプラチン）、５−ＦＵ（フルオロウラシル）、イリノテカン、塩酸ゲムシタビン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ＴＳ−１（ＦＴ（テガフール）、ＣＤＨＰ（ギメラシル）及びＯｘｏ（オテラシルカリウム）の３成分を配合）、ニムスチン（ニドラン）、ラニムスチン（サイメリン）、テモゾロミド（テモダール）、カルボプラチン、シクロホスファミド、メトレキサート、ドキソルビシン、オキサリプラチン、テガフール・ウラシル、インターフェロン・α（アルファ）、メルファラン（アルケラン）、サリドマイド、それらの組み合わせなどが挙げられる。好ましくは、ＣＤＤＰ（シスプラチン）、５−ＦＵ（フルオロウラシル）、イリノテカン、塩酸ゲムシタビン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ＴＳ−１（ＦＴ（テガフール）、ＣＤＨＰ（ギメラシル）及びＯｘｏ（オテラシルカリウム）の３成分を配合）、それらの組み合わせである。また、他のホルモン剤等と併用してもよい。投与量と投与方法は、がん治療に使用されている投与量と投与方法であれば限定されない。
【００１５】
放射線療法は、放射線をがんに照射してがんを治療する方法を意味する。放射線の種類（例えば、Ｘ線、γ線、電子線、陽子線、重粒子線など）と照射量は、がん治療に使用されている放射線と照射量であれば限定されない。
【００１６】
本発明における、手術療法とは、外科的手術または内視鏡的手術によりがんを食道から取り去る治療法を意味する。レーザー光をがんに照射してがんを取り去るレーザー療法も含まれる。
【００１７】
本発明における、第１選択として食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するためのマーカーとは、食道がんの最初の治療を、放射線化学療法により行うかまたは手術療法により行うかを決定するための指標を意味する。
【００１８】
具体的には、食道がんにおける、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量（転写物および／または翻訳物）が高い（ＩＧＦＢＰ３遺伝子高発現型）場合、食道がんを手術療法により治療することを第１選択と決定する。一方、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量が低い（ＩＧＦＢＰ３遺伝子低発現型）場合、食道がんを放射線化学療法により治療することを第１選択と決定する。
【００１９】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量が高いとは、参照遺伝子の発現量に対してＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量が高いことを意味する。ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量が低いとは、参照遺伝子の発現量に対してＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量が低いことを意味する。
【００２０】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プローブは、ＩＧＦＢＰ３遺伝子（ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）とハイブリダイゼーションする相補配列を有するオリゴヌクレオチドであれば、その長さは限定されないが、好ましくは、１２〜２６００塩基、より好ましくは１５〜１０００塩基のＩＧＦＢＰ３遺伝子の相補配列を含むオリゴヌクレオチドである。
【００２１】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プライマーは、ＩＧＦＢＰ３遺伝子とハイブリダイゼーションしてＩＧＦＢＰ３遺伝子（ｃＤＮＡ）の酵素的増幅に使用できるオリゴヌクレオチドであれば、その長さは限定されないが、好ましくは、８〜６０塩基、より好ましくは１５〜３０塩基のＩＧＦＢＰ３遺伝子（ｃＤＮＡ）の配列または相補配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００２２】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プローブおよび／またはプライマーの配列設計は、市場より入手できるプライマーおよび／またはプローブ設計ソフトフェアー、例えばＬＵＸ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などを用いて行うことができる。プライマーおよび／またはプローブ合成は、市販のＤＮＡ自動合成機を使用して自ら合成しても良いし、業者に合成を依頼してもよい。
【００２３】
これらプライマーおよび／またはプローブは、検出を容易にするために、放射性物質、酵素、蛍光物質などで標識されていても良い。
【００２４】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プライマーには、例えば、
Forward primer:5'GACCATCAAGCGGGAGACAGAATATGGC3'（配列番号１）、
Reverse primer: 5'CCCTGGGACTCAGCACACATTG3'（配列番号２）が挙げられる。
【００２５】
これらプライマーは、ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プローブとして使用しても良い。
【００２６】
ＩＧＦＢＰ３たんぱく質に対する特異的抗体（抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体）は、ポリクローナル抗体であっても、モノクロナール抗体であっても良い。ＩＧＦＢＰ３たんぱく質に対するポリクローナル抗体は、市場（例えば、抗ＩＧＦＢＰ−３ポリクローナル抗体（R&D System）、Ｈｕｍａｎ ＩＧＦＢＰ−３ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Diagnostic Systems Laboratories, Inc.）より入手することができる。モノクロナール抗体は、当業者に周知な方法で作製することができる。
【００２７】
食道がんの治療方針を決定するためのキットは、さらに、ハイブリダイゼーションのための試薬、ＲＴ−ＰＣＲのために試薬、参照用遺伝子、参照用遺伝子に対する特異的なプローブ、プライマー、参照用たんぱく質、参照用たんぱく質に対する特異的な抗体、２次抗体、基質、実施方法を記載した指示書などを含んでも良い。
【００２８】
さらに、食道がんを、放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを判断するための基準を含んでいても良い。基準は、食道がんを、放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを判断するための数値であることが好ましい。
【００２９】
本発明における、食道がん患者由来のがん組織とは、治療開始前に、患者から検査のために採取された食道がん組織（生検サンプル）、または、手術により摘出された食道がん組織又はそれらの一部を意味する。さらに、生検サンプルまたは手術により摘出された食道がん組織又はそれらの一部は、マイクロダイセクションにより食道がん組織のみを選択的に回収されることが好ましい。また、正常食道組織とは、食道上皮を含む食道の正常組織を意味し、生検や手術時に食道がん組織と供に得られる食道組織の正常部分であってもよい。
【００３０】
本発明における、食道がんのＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量を測定するとは、食道がん中の、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の転写物（たとえば、ｍＲＮＡ）及び／又は翻訳物（例えば、たんぱく質）を測定すること意味する。また、食道がんの参照遺伝子の発現量を測定するとは、食道がん中の、参照遺伝子の転写物（たとえば、ｍＲＮＡ）及び／又は翻訳物（例えば、たんぱく質）を測定すること意味する。
【００３１】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量（転写産物量および／または翻訳産物量）の測定は、ＩＧＦＢＰ３ｍＲＮＡおよび／またはＩＧＦＢＰ３たんぱく質を測定できれば、ＩＧＦＢＰ３ｍＲＮＡおよび／またはＩＧＦＢＰ３たんぱく質の全体であっても一部であっても良い。また、参照遺伝子の発現量（転写産物量および／または翻訳産物量）の測定は、参照遺伝子のｍＲＮＡおよび／またはたんぱく質を測定できれば、参照遺伝子のｍＲＮＡおよび／またはたんぱく質の全体であっても一部であっても良い。
【００３２】
ｍＲＮＡおよび／またはたんぱく質の測定方法は、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどの当業者に周知な方法を用いて測定することができる。
【００３３】
本発明における、参照遺伝子は、細胞において構成的に発現している遺伝子であれば限定されないが、例えば、βアクチン、αチュブリン、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、１８Ｓ ｒＲＮＡなどが挙げられる。
【００３４】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量の測定は、参照遺伝子の発現量の測定と同時に実施しても良いし、別々に実施しても良い。
【００３５】
参照遺伝子として、βアクチン遺伝子を使用して、食道がん組織中のＩＧＦＢＰ３遺伝子とβアクチン遺伝子の発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した場合、βアクチン遺伝子１００００コピー対してＩＧＦＢＰ３遺伝子のコピー数が、５００以上、好ましくは７５０以上、より好ましく１０００コピー以上である場合、ＩＧＦＢＰ３遺伝子高発現型と判断し、第１選択として手術療法を決定することができる。一方、ＩＧＦＢＰ３遺伝子のコピー数が４００以下、好ましくは２００以下、より好ましく１００以下である場合、ＩＧＦＢＰ３遺伝子低発現型と判断し、第１選択として放射線化学療法を決定することができる。
【００３６】
よって、参照遺伝子の発現量とＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量を比較して、治療方針を決定するための基準値を決定することができる。例えば、参照遺伝子がβアクチン遺伝子の場合、（ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量」／（βアクチン遺伝子の発現量）＝０．０５以上、好ましくは０．０７５以上、より好ましくは０．１以上の場合、ＩＧＦＢＰ３遺伝子高発現型と判断し、第１選択として手術療法を決定することができる。一方、比が０．０４以下、好ましくは０．０２以下、より好ましくは０．０１以下の場合、ＩＧＦＢＰ３遺伝子低発現型と判断し、第１選択として放射線化学療法を決定することができる。
【００３７】
遺伝子の発現量は、ＲＴ−ＰＣＲやノーザンブロットを使用して発現量を測定した場合、参照遺伝子のバンドの強度およびＩＧＦＢＰ３遺伝子のバンドの強度として得られても良い。
【００３８】
他の参照遺伝子を使用した場合、治療方針を決定するための基準値（すなわち、βアクチン遺伝子の発現量に対するＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量の比である、０．０５以上、好ましくは０．０７５以上、より好ましくは０．１以上、および．０４以下、好ましくは０．０２以下、より好ましくは０．０１以下）は、変化してもよい。
【００３９】
がん組織と正常食道組織を抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色するとは、当業者に周知の免疫組織化学的手法による染色を意味する。
【００４０】
免疫組織化学的手法は、簡単には、組織切片と抗原特異抗体（例えば、抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体）を反応させ、組織切片中の抗原に結合した抗原特異抗体を酵素反応または蛍光物質を利用して組織切片上で発色させ、組織における抗原の存在を検出する方法である。この方法において発色が強ければ、抗原量が多いことを意味する。
【００４１】
組織から組織切片を作製する方法は、当業者に周知である。組織切片は、凍結切片であってもパラフィン包埋切片であってもよい。
【００４２】
抗原特異抗体（例えば、抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体）は、酵素、蛍光物質、ビオチン、アビジンなどで標識されていてもいなくても良い。標識されていない抗体（第１抗体）を使用した場合、第１抗体に対する標識された抗体（第２抗体）を使用する。抗体の検出は、抗体に結合している標識を検出することによって成される。例えば、標識が酵素であれば酵素反応により組織上に発色が生じる。また、標識が蛍光物質であれば組織上に蛍光の発色が生じる。
【００４３】
正常食道組織中の細胞とがん組織中のがん細胞を比較して、正常食道組織中の細胞よりがん組織中のがん細胞の方が抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体により強く染色されているかいなか判定は、目視により行う。好ましくは病理専門医が目視により判定を行う。
【００４４】
抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色された正常食道組織中の細胞とがん組織中のがん細胞を比較して、がん組織中のがん細胞の方が、正常食道組織中の細胞より抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で強く染色されている場合を高発現（ＩＧＦＢＰ３遺伝子高発現型）と判定し、第１選択として手術療法を決定する。また、がん組織中のがん細胞と正常食道組織中の細胞の抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体による染色の強さが同等、又は、がん組織中のがん細胞の方が、正常食道組織中の細胞より抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で弱く染色されている場合を低発現（ＩＧＦＢＰ３遺伝子低発現型）と判定し、第１選択として放射線化学療法を決定する。
【００４５】
本発明における、食道がんの手術後の再発のリスクを決定するとは、食道がんを手術により摘出後に、がんが再発するリスクを予測することを意味する。また、食道がんの手術治療後の再発リスクを決定するためのマーカーとは、食道がんの手術後の再発のリスクを決定するための指標を意味する。
【００４６】
再発リスクを決定するとは、食道がんにおける、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量（転写物および／または翻訳物）が高い（ＩＧＦＢＰ３遺伝子高発現型）場合、がん再発のリスクが低いと決定する。一方、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量が低い（ＩＧＦＢＰ３遺伝子低発現型）場合、がん再発のリスクが高いと決定する。
【００４７】
がん再発のリスクが低いとは、手術療法による治療後、４０ヶ月、好ましくは５年以内にがんの再発が起こりにくいこと、例えば、がん再発率が４０％以下、好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下であることを意味する。
【００４８】
がん再発のリスクが高いとは、手術療法による治療後、４０ヶ月、好ましくは５年以内にがんの再発が起こりやすいこと、例えば、がん再発率が４０％より高い、好ましく４５％以上、より好ましくは５０％以上であることを意味する。
【００４９】
がん再発率が４０％とは、手術療法による治療を受けた食道がん患者１００人のうち４０人に、治療後、４０ヶ月、好ましくは５年以内にがんの再発が検出されることを意味する。治療後の患者は、再発予防のための処置を受けていてもいなくても良い。
【００５０】
食道がん細胞株において、ＩＧＦＢＰ３遺伝子を強制発現させた場合、増殖速度が低下したことから、ＩＧＦＢＰ３遺伝子またはたんぱく質は、食道がんを治療するために医薬として使用できる。
【００５１】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子の強制発現は、ＩＧＦＢＰ３遺伝子を有する発現ベクター（例えば、発現プラスミドや組み換えウイルス）で食道がんに遺伝子導入して実施することができる。ＩＧＦＢＰ３遺伝子を有する発現ベクターの作成方法や遺伝子導入の方法は当業者に周知である。また、ＩＧＦＢＰ３たんぱく質で食道がんを治療しても良い。
【００５２】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子またはたんぱく質を含む医薬は、さらに、必要に応じ、その他の成分を含有することができる。
【００５３】
該その他の成分としては、特に制限されることなく、目的に応じて適宜選択することができる。たとえば、医薬的に許容され得る賦形剤や担体を挙げることができる。
【００５４】
医薬の剤型としては、特に制限はなく、たとえば、固形、液状の経口剤、注射剤などを挙げることができる。
【００５５】
本発明における、抗がん剤の投与量、投与回数及び投与時期は、特に制限されることなく、適用例に対応し、適宜選択することができる。
【実施例】
【００５６】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００５７】
１ 研究方法
１−１ 臨床検体
財団法人癌研究会付属病院で２０００年９月から２００４年５月までに同時化学放射線療法を受けたcStageII・IIIの食道扁平上皮がん患者の治療前の生検からサンプルを得た。そのサンプルから、Application Solutions Laser Microdissection System（Leica Microsystems, Wetzlar, Germany）を用いてマイクロダイセクションを行い、病理専門医により詳細な癌部の特定を行った上で、食道がん組織のみを選択的に回収した。本研究は、癌研究会治験・臨床研究倫理審査委員会で承認された（承認日；２００６年５月１７日）「がんの治療感受性および悪性度を規定する遺伝子の発現解析に関する研究」に基づいた方法で、患者よりインフォームドコンセントを得て行った。
【００５８】
１−２ 化学放射線療法プロトコル
ＣＤＤＰ ４０mg/m２をｄａｙ１とｄａｙ８に点滴静注、５−ＦＵ ４００mg/m２をｄａｙｓ１−５およびｄａｙｓ８−１２に２４時間持続点滴静注した。同時に放射線療法を２Ｇｙ／ｄａｙで、ｄａｙｓ１−５，８−１２，１５−１９に行った（計３０Ｇｙ）。以上５週間を１セットとして２セット（照射総量６０Ｇｙ）行った。解析対象とした全症例がこのプロトコルにより治療を開始され、治療基準（５０Ｇｙ以上の根治照射が行われ、ＣＤＤＰ １００mg/m２、５−ＦＵ １，０００mg/m２以上の投与が確保されている）を満たしている。
【００５９】
１−３ ＲＮＡ抽出
Qiagen RNeasy mini kit（Qiagen, Valencia, CA）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出、精製した。ｔｏｔａｌ ＲＮＡの純度は、Agilent 2100 Bioanalyzer Nanochip（Agilent Technologies, Palo Alto, CA）により検定し、基準（Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）によって開発された基準であるＲＩＮ（RNA integrity number）が５以上）を充たしたサンプルのみを解析に使用した。
【００６０】
１−４ ｃＤＮＡオリゴヌクレオチドマイクロアレイ解析
２２，５７５プローブセット（１７，７４６遺伝子）が配置されたAgilent JFCR custom-made human oligonucleotide microarrayを使用した。Low RNA Input Fluorescent Linear Amplification Kit（Agilent Technologies）により、Ｃｙ−５もしくはＣｙ−３で蛍光標識されたｃＲＮＡを合成し、スライド上にハイブリダイゼーションさせた後、洗浄を行った。Agilent dual laser DNA microarray scanner（Agilent Technologies）により蛍光強度をスキャンし、Agilent Feature Extraction software（Agilent Technologies）を用いて画像を数値化し解析を行った。
【００６１】
本研究では、化学放射線療法を受けていない食道がん患者５例の正常食道上皮から得られたＲＮＡをプールして、それを全ての症例の発現解析においてコントロールとすることによって、患者間の遺伝子転写産物レベルでの発現量の差を解析した。
【００６２】
１−５ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ解析
SuperScriptIII First-Strand Synthesis System（Invitrogen）を用いてｃＤＮＡを合成し、LUX Designer software（Invitrogen）で設計した各標的遺伝子ｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーペアを用い、ABI Prism 7900HT sequence detection system（Applied Biosystems, Foster City, CA）により、各標的遺伝子の発現レベルを検証した。発現解析に用いたＬＵＸ検出法用の１１種類の各標的遺伝子のプライマーの配列（forward primer; F-P, reverse primer; R-Pと略す）を以下に記載する。
【００６３】
IGFBP3（insulin-like growth factor binding protein3: NM_001013398）:
FAM-labeled F-P:5'-GACCATCAAGCGGGAGACAGAATATGG[FAM]C-3'（配列番号１、[FAM]は、３’末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P; 5'-CCCTGGGACTCAGCACACATTG-3'（配列番号２）
HBB（hemoglobin, beta: NM_000518）：
FAM-labeled F-P; 5'-GAACTTGCCCAGGAGCCTGAAG[FAM]TC-3'（配列番号３、[FAM]は、３'末端から３番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P; 5'-TGGCTCACCTGGACAACCTC-3'（配列番号４）
ADM（adrenomedullin: NM_001124）:
FAM-labeled F-P;5'-CACGCTAAAGTTGTTCGCCGCG[FAM]G-3'（配列番号５、[FAM]は、３’末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P;5 '-TCGGTGTTTCCTTCTTCCACA-3'（配列番号６）
WNT5A（wingless-type MMTV integration site family, member 5A: NM_003392）:
FAM-labeled F-P; 5'-GACCTGAATAGGCACGAAGGCACAGG[FAM]C-3'（配列番号７、[FAM]は、３'末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P;5'-CACGGCATCTCTCTTTCACCA-3'（配列番号８）
TMEM132A（transmembrane protein 132A: NM_017870）:
FAM-labeled F-P: 5'-CACTCGATCAACAAGCACCAGACGAG[FAM]G-3'（配列番号９、[FAM]は、３'末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P; 5'-AGCTCCTGACCCTCCACAGC-3'（配列番号１０）
APOBEC3A（apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like 3A: NM_145699）：
FAM-labeled F-P; 5'-CACCGACCATCCTGGCTAACACGG[FAM]G-3'（配列番号１１、[FAM]は、３’末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P; 5'-CCACCACGCCTGGCTAATTT-3'（配列番号１２）
MGST1（microsomal glutathione S-transferase 1: NM_145791）：
FAM-labeled F-P;5'-CACGGGCAATGGTGTGGTAGATCCG[FAM]G-3'（配列番号１３、[FAM]は、３'末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P; 5'-CCCTCTACAGCCATCCTGCAC-3'（配列番号１４）
AKR1C3（aldo-keto reductase family 1, member C3: NM_003739）：
FAM-labeled F-P; 5'-CACCATAAGCCCTGTGTGTGGATGG[FAM]G-3'（配列番号１５、[FAM]は、３'末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P; 5'-TGTCCAGTCACCGGCATAGA-3'（配列番号１６）
PAK1IP1（PAK1 interacting protein 1: NM_017906）:
FAM-labeled F-P; 5'-GACATGAGGAGGAAGGCTTTCTTTCATG[FAM]C-3'（配列番号１７、[FAM]は、３'末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P;5'-AAACACTAATGCCAGGCTGACG-3'（配列番号１８）
NODATA（AAA398608）:
FAM-labeled F-P; 5'-GACTTCATGGCTTTCATCTCCTCTGAAG[FAM]C-3'（配列番号１９、[FAM]は、３’末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P;5'-CAATGAGCAGCGCATCAGAC-3'（配列番号２０）
EDIL3（EGF-like repeats and discoidin I-like domains 3: BX648583）:
FAM-labeled F-P;5'-CACAGGTTGTTAGCTCCACATTTCCTG[FAM]G-3'（配列番号２１、[FAM]は、３'末端から２番目のＧがＦＡＭで標識されていることを意味する）
R-P;5'-CCTGTGCCTTCCTGGGAAAC-3'（配列番号２２）
定量化のためのコントロールとしてβ−ａｃｔｉｎ遺伝子を用いた。β−ａｃｔｉｎ ｃＤＮＡ増幅のためのβ−ａｃｔｉｎ遺伝子特異的プライマーは、インビトロジェン社のCERTIFIED LUX Primer Set for human ACTIN FAM-labeled Cat. No. 101H-01を用いた。
【００６４】
ｃＤＮＡ反応は、SuperScriptIII First-Strand Synthesis System（Invitrogen）を用いて以下のように行った。
【００６５】
ｃＤＮＡ合成反応のための反応組成物（２０μＬ）を以下のように調製した：
２Ｘ ＲＴ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ １０μｌ、
ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ ２μｌ、
ＲＮＡ （４０ｎｇ） ４０ｎｇのＲＮＡに相当する容量、および
ＤＥＰＣ処理した水を加え、合計２０μｌにした。
【００６６】
ｃＤＮＡ合成反応のために、上記組成物（２０μＬ）を
２５℃で１０分間、
５０℃で３０分間、
８５℃で５分間、
インキュベーションし、次いで、氷中で１μｌ（２Ｕ）のＥ． ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈを加え、３７℃で２０ｍｉｎインキュベーションした。反応終了後、反応液を水で４０倍に希釈した。
【００６７】
上記希釈したｃＤＮＡ反応液を用いてｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ（Invitrogen）を用いて以下のとおり行った。
【００６８】
ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲのための反応組成（２５μｌ）：
Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Quantitative PCR SuperMix-UDG １２．５μｌ
ROX reference Dye １μｌ
１０μＭ primer mix ０．５μｌ
５０mM ＭｇＣｌ２ ０．５μｌ
DEPC-treated Water ５．５μｌ
ｃＤＮＡ反応溶液 ５μｌ
ｃＤＮＡ反応溶液には、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １０ｐｇ−１００ｎｇ相当量が含まれる。
【００６９】
ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲのＰＣＲプログラムは、以下のとおりである。
ABI Prism 7900HT sequence detection system (Applied Biosystems, Foster City, CA)により、はじめに、
５０℃ ２ｍｉｎ
９５℃ ２ｍｉｎ
続いて、以下：
９５℃ １５ｓｅｃ
５５℃ ３０ｓｅｃ
７２℃ ３０ｓｅｃ
を４８サイクル行った。
【００７０】
なお、反応産物のＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅは、
９５℃ １５ｓｅｃ
６０℃ １５ｓｅｃ
９５℃ １５ｓｅｃ
で行い、シングルピークになることから増幅反応が特異的であることを確認した。
【００７１】
コピー数の計算は以下のように行った。あらかじめコピー数のわかっているβ−ａｃｔｉｎ遺伝子（Invitrogen、qPCR Plasmid Standards：Cat.No:11740-100）とβ−ａｃｔｉｎ遺伝子特異的プライマー（インビトロジェン社のCERTIFIED LUX Primer Set for human ACTIN FAM-labeled Cat. No. 101H-01）を用いて、上記のプログラムでｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲを行い、検量線を作成した。この検量線を用い、測定された標的遺伝子の蛍光値から標的遺伝子のコピー数を求めた。
【００７２】
１−６ 免疫組織化学的解析
凍結保存されている組織材料から厚さ８μｍの切片をクライオスタット（Leica Microsystems）にて作製し、ＩＧＦＢＰ３タンパクの 免疫組織染色をHistofine Simple Stain MAX PO kit（Nichirei, Tokyo）を用いて行った。凍結切片を４％ＰＦＡで固定し、１００％メタノール−３％過酸化水素水１０分の処理による内因性ペルオキシダーゼの失活処理を行った後、１０％ヤギ血清にてブロッキングした。８００倍希釈した抗ＩＧＦＢＰ３抗体（R&D systems Inc., Minneapolis, MN）を用いて、４℃で一晩抗原抗体反応を行った。次に、ｋｉｔに付属しているビオチン化抗体を室温で３０分反応させ、ＤＡＢ溶液（Nichirei）にて可視化し、さらにヘマトキシリンによるカウンター染色を行った。
【００７３】
１−７ 培養細胞株及び細胞培養
東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センターより供与された８種類のヒト食道がん細胞株（ＴＥシリーズ：ＴＥ１，４，５，８，９，１０，１１，１５）（Nishihira, T., Hashimoto, Y., Katayama, M., Mori, S. & Kuroki, T. Molecular and cellular features of esophageal cancer cells. J Cancer Res Clin Oncol 119, 441-9 (1993)）を、１０％ウシ胎児血清を加えたＲＰＭＩ １６４０を培地とし、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターにて培養した。
【００７４】
１−８ レンチウイルスベクターへの遺伝子導入
ＩＧＦＢＰ３遺伝子を強制的に発現させるために、レンチウイルスベクターｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５（Invitrogen）に、ヒトＩＧＦＢＰ３遺伝子のｃＤＮＡを挿入した。また、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現を抑制するために、ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対しＲＮＡ干渉を誘導する配列（5'-TGC TGA TCC GAA GAA TTG TGC CAT TAG TTT TGG CCA CTG ACT GAC TAA TGG CAA TTC TTC GGA T- 3'（配列番号２３）と5'-CCT GAT CCG AAG AAT TGC CAT TAG TCA GTC AGT GGC CAA AAC TAA TGG CAC AAT TCT TCG GAT C-3'（配列番号２４））を同じレンチウイルスベクターに挿入した。コントロールの細胞としてｌａｃＺ遺伝子に対しＲＮＡ干渉を誘導する配列（5'-TGC TGA AAT CGC TGA TTT GTG TAG TCG TTT TGG CCA CTG ACT GAC GAC TAC ACA TCA GCG ATT T- 3'（配列番号２５）と5' -CCT GAA ATC GCT GAT GTG TAG TCG TCA GTC AGT GGC CAA AAC GAC TAC ACA AAT CAG CGA TTT C-3'（配列番号２６））を同じレンチウイルスベクターに挿入した。レンチウイルスベクターへ挿入された目的の配列は、全てシークエンスにより確認した。
【００７５】
２９３Ｔ細胞へ上記のベクターをパッケージングベクター（Invitrogen）と共に導入しウイルス粒子を作製した。６ug/mlポリブレンの存在下、ウイルス粒子を食道がん細胞株に感染させ、２４時間後、培地を交換した。さらに２４時間培養後、導入した遺伝子を安定に発現している細胞を選択するために、ブラストシジンを加えた培地と交換した。ＩＧＦＢＰ３遺伝子を強制的に発現させた細胞はサブクローニングを行ったが、抑制した細胞は、薬剤選択後に回収した細胞集団として扱った。
【００７６】
１−９ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ
細胞をＰＢＳで洗浄した後、２０mmol/L Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０mmol/L ＮａＣｌ，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１mM ＥＤＴＡ，１mM ＥＧＤＡ，１mM β−glycerophosphate，１mM Ｎａ３ＶＯ４，１mM phenylmethylsulfonyl fluorideにprotease inhibitor mixture tablet（complete; Roche Applied Science, Indianapolis, IN）を加えたｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを用いて氷上で溶解させた。溶解液を超音波破砕し、１３，０００rpm、４℃にて遠心した後上清を回収した。タンパク質濃度はBio-Rad Protein Assay（Bio-Rad, Hercules, CA）を用いて測定した。
【００７７】
各細胞から抽出した等量のタンパク質をＳＤＳで変性させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。タンパク質を転写した膜を５％スキムミルクを加えたＴＢＳにて室温で１時間ブロッキングし、洗浄した後、４℃で一晩、各標的タンパクに対する以下の一次抗体と反応させた。
【００７８】
一次抗体には、抗ヒトＩＧＦＢＰ３抗体（DSL-R00536; Diagnostic Systems Laboratories, Webster, TX, ５００倍希釈で使用）、または抗αチュブリン抗体（Sigma、１０００倍希釈で使用）を使用した。
一次抗体と反応後、各一次抗体に対する適切な以下のＨＲＰ標識二次抗体と室温で１時間反応させた。
【００７９】
二次抗体には、抗ヒトＩＧＦＢＰ３抗体に対しては、抗ヤギＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch. Laboratories Inc., West Grove, PA, ２０００倍希釈で使用）、抗αチュブリン抗体に対しては、抗マウスＩｇＧ抗体（Bio-Rad, ２，０００倍希釈で使用）を使用した。
【００８０】
目的とするタンパク質の最終的な検出は、western blotting detection system（Amaersham, Arlington Heights, IL）を用いて、化学発光により行い、各バンドの濃度をα−チュブリンのバンド濃度との比較により、定量化した。すなわち（Ａ／Ｂ）ｘ（Ｃ／Ｄ）の式により測定した。（Ａ；ＴＥ４のα−チュブリンのバンド濃度、Ｂ；サンプルのα−チュブリンのバンド濃度、Ｃ；サンプルのＩＧＦＢＰ３のバンド濃度、Ｄ；ＴＥ４のＩＧＦＢＰ３のバンド濃度）。
【００８１】
１−１０ 細胞増殖試験
細胞を６−ｗｅｌｌプレートに５×１０４／ｗｅｌｌ（triplicate）の濃度で播種し、測定する日にトリプシン処理を行い、細胞数を数えた。
【００８２】
１−１１ 抗がん剤感受性試験
９６−ｗｅｌｌプレートに１×１０４／ｗｅｌｌの濃度で細胞を播種し、２４時間培養した後、種々の濃度のＣＤＤＰ、あるいは５−ＦＵ（Sigma, St Louis, MO）を添加した。生存細胞の測定はＷＳＴ−１アッセイ（Roche, Penzberg, Germany）により行い、ＣＤＤＰは添加後４８時間、５−ＦＵは添加後７２時間で判定した。実験は３−４回繰り返し行い、生存曲線より、５０％増殖阻止濃度であるＩＣ５０を算出した。
【００８３】
１−１２ コロニー形成法による放射線感受性試験
５０−１００個のコロニーをつくるような濃度で細胞を播種し、２４時間後にＸ線照射装置（CP160, Faxitro x-ray corp.）を使用し、管電圧１６０kV、管電流６．２mA、０．５mm Ａｌフィルター、照射線量率２．２２Ｇｙ／ｍｉｎの条件で、Ｘ線照射（０−８Ｇｙ）を行った。２−３週間培養後、ホルマリン固定、２％ギムザ染色を行い、細胞数５０個以上のコロニーを数えコロニー形成率を算出し、それをもとに補正後、生存率を求めた。
【００８４】
１−１３ 統計学的解析
免疫組織染色と臨床病理学的因子の相関関係の検定は、χ２− ｔｅｓｔおよびＦｉｓｈｅｒ'ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔにより行った。ＩＧＦＢＰ３タンパクの発現と全生存期間、無再発生存期間との関連はＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により行い、ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｔｅｓｔにより検定した。他の２群間の比較はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔにより行った。解析はＳｔａｔＶｉｅｗ ５．０（Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA）を用いて行い、ｐ＜０．０５を有意水準とした。
【００８５】
２．研究結果
２−１ 食道がん化学放射線療法感受性マーカー同定の試み
化学放射線療法治療前の生検材料から得られたサンプルの遺伝子発現プロファイルの解析から、化学放射線療法後の効果を予測・判定するバイオマーカーの同定を試みた。
【００８６】
２−１（１） 遺伝子転写産物発現レベルでの感受性予測の試み
２−１（１）Ａ 解析対象とした食道がん患者の臨床病理学的背景
癌研病院で、２０００年９月から２００４年５月までに同時放射線化学療法を受けたｃStageII・IIIの食道扁平上皮がん患者２７例を解析対象とした。全例が同一の放射線化学療法のプロトコルにより治療を開始され、治療基準（５０Ｇｙ以上の根治照射が行われ、ＣＤＤＰ１００mg/m２、５−ＦＵ１０００mg/m２以上の投与が確保されている）を満たした症例である。
【００８７】
２−１（１）Ｂ サンプルの調製
治療開始前の生検からサンプルを得た。マイクロダイセクションにより食道がん組織のみを選択的に回収し、その組織からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し精製した。得られたＲＮＡの質的な劣化が認められた５例を除く、全２２例より得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡに対し、ｃＤＮＡオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて、転写産物レベルでの包括的遺伝子発現解析を行った。この手法により、全１７７４６遺伝子の転写産物レベルでの発現量を解析することができる。
【００８８】
２−１（１）Ｃ 臨床効果判定による分類
化学放射線療法感受性を規定している遺伝子を解析するため、最終的に解析可能な対象２２例を、治療効果により、以下の３群に分類した。
２２例のうち、治療後の臨床効果がComplete Response（以後ＣＲ）で、少なくとも１年以上再発が認められなかった１１例を「有効群」、治療後ＣＲが得られなかった５例を「無効群」、一旦ＣＲは得られたが、１年以内に再発を認めた６例を「中間群」に、分類した（表１）。臨床効果の判定は、ＣＴおよび内視鏡検査によって行った。
【００８９】
【表１】
【００９０】
２−１（１）Ｄ マイクロアレイを用いた遺伝子の選定
本研究で使用したＡｇｉｌｅｎｔ ｃｕｓｔｏｍ ａｒｒａｙは、２色比較を行うｃＤＮＡオリゴヌクレオチドアレイで、アレイ上に１７７５６遺伝子のプローブセットが配置されている。これらの遺伝子すべてに関して、食道がん組織中の転写産物の量をコントロールＲＮＡ中の転写産物の量と比較したときの発現量の比を知ることができる。本研究では、放射線化学療法を受けていない食道がん患者５例の正常食道上皮から得られたＲＮＡをプールして、それをすべての症例の発現解析においてコントロールとすることによって、患者間の遺伝子転写産物レベルでの発現量の差を解析した。
【００９１】
化学放射線療法感受性を規定する遺伝子を選定するために、前述の有効群１１例と無効群５例の間に、臨床病理学的背景に有意な違いがないことを確認した上で（ｃＴ因子Ｐ＝０．５７２４、ｃＮ因子Ｐ＝０．５２３８、ｃＳｔａｇｅ Ｐ＝０．５０５５）、この２群間で転写産物レベルでの発現量の差が大きい遺伝子の選定をＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を用いて行った。検定の条件をｌｏｃａｔｉｏｎ ｓｈｉｆｔ ０．３，ｐ＜０．０５に設定して挙がってきた遺伝子は４８遺伝子、ｌｏｃａｔｉｏｎ ｓｈｉｆｔ ０．４，ｐ＜０．０５では２３遺伝子、そして、ｌｏｃａｔｉｏｎ ｓｈｉｆｔ ０．５，ｐ＜０．０５で抽出されたのは１２遺伝子であった（表２）。以下、これら１２遺伝子に関し、さらなる解析を行った。
なお、１２遺伝子中にＤＮＡ修復、薬剤耐性、薬剤代謝などに関与することが知られている遺伝子群は含まれなかった。
【００９２】
【表２】
【００９３】
２−１（１）Ｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ による選定遺伝子の解析
これらの１２遺伝子の中から、その転写産物の発現レベルが、最も化学放射線療法感受性と高い関連性を示す遺伝子を抽出するため、ダイナミックレンジが広く、発現値の定量化に優れるｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法により、さらに解析を行った。解析には、１−２で使用したＲＮＡを鋳型にして合成したｃＤＮＡを使用した。定量化のためのコントロールとしてβ−ａｃｔｉｎ遺伝子を用いて、各遺伝子に関してβ−ａｃｔｉｎ遺伝子の転写産物１０４コピーあたりの相対的な量を求め比較・解析した。解析できたのは、有効なプライマーを設計することができなかった１遺伝子を除いた１２遺伝子中１１遺伝子で、再度Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を行ったところ（マイクロアレイ解析の使用で、ＲＴ−ＰＣＲ解析に不足となってしまったＥＳ０１２を除外した有効群１０例と無効群５例の比較）、４遺伝子がｐ＜０．０５の条件で選定された（表３）。これらの４遺伝子中で、最も有意な差を認めたのはＩＧＦＢＰ３であった（Ｐ＝０．００１３３）。上記の方法で算出したＩＧＦＢＰ３遺伝子とＰＡＫ１ＩＰ１遺伝子転写産物の発現レベルを群別にｐｌｏｔしたのが図１である。
【００９４】
【表３】
【００９５】
２−１（２） 蛋白発現レベルでの感受性予測
バイオマーカーの候補として選定した遺伝子を臨床応用していくには、その汎用性を考えたときに、蛋白レベルで発現していることが有用であり、さらに、何らかのメカニズムで化学放射線療法感受性を規定しているのであれば、食道がん組織における発現量と発現部位も重要である。従って、以下の解析を進めていった。
【００９６】
２−１（２）Ａ 選定遺伝子の蛋白発現レベル免疫組織化学的手法を用いて
ＩＧＦＢＰ３遺伝子が、食道がん組織で蛋白として発現しているかどうか調べるために、免疫組織染色を行った（図２）。２００３年４月から２００６年３月まで、術前治療を施行されず、財団法人癌研究会付属病院で手術された４３例の食道扁平上皮がん患者から採取した手術材料による検討を行った。
【００９７】
正常の食道上皮では、基底層からその上層の全層にわたり発現レベルが低いことが観察された（図２Ａ）。一方、がん組織での発現レベルは症例間により様々であった（図２Ｂ−Ｄ）。ＩＧＦＢＰ３は主にがん細胞の細胞質に局在し、一部の標本では核に陽性像もみられたが、本研究では、その局在を判定の基準に含めなかった。判定は病理専門医がｂｌｉｎｄ形式で行った。
【００９８】
正常食道上皮での発現レベルと比較して、それより明らかに強く染色されるがん細胞を高発現、同等もしくは弱く染色されるがん細胞を低発現と分類した（図２Ｂ〜Ｄ）。
【００９９】
上記の判定基準により、蛋白の発現レベルと臨床病理的背景因子との関連を調べたが、年齢（Ｐ＝０．１１７５）、性別（Ｐ＝０．６４１８）、ｐＴ因子（Ｐ＝０．７５５６）、ｐＮ因子（Ｐ＝０．７３４６）、ｐＭ因子（Ｐ＝０．３７４３）、ｐＳｔａｇｅ（Ｐ＝０．５２３０）、分化度（Ｐ＝０．１１２６）、リンパ管侵襲（Ｐ＞０．９９９９）、脈管侵襲（Ｐ＝０．２３０２）のいずれとも関連はみられなかった。また、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により、発現レベルと術後予後として全生存期間との関連を解析したが、統計的有意差はみられなかった。
【０１００】
２−１（２）Ｂ 化学放射線療法効果予測への応用
次に、２−１（２）Ａの判定基準により、蛋白の発現レベルと化学放射線療法感受性との関連を調べた。２−１（１）Ｅのｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲで使用したサンプルのうち、サンプルの残りが確保されて染色が可能であった１４例（有効群９例、無効群５例）、ＲＮＡの質的な劣化で解析から除外した５例のうちサンプルが確保されていた４例（有効群）、さらに、追加症例５例（有効群２例、無効群３例）を合わせた計２３例（有効群１５例、無効群８例）の免疫組織染色を行った。
【０１０１】
その結果、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量は、蛋白レベルでも化学放射線療法感受性と強い負の相関を示した（表４、Ｐ＝０．００６２）。即ち、ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現が多ければ、化学放射線療法感受性が低くなり、一方、発現が低ければ感受性が高くなることが示された。これらの結果から、ＩＧＦＢＰ３が化学放射線療法感受性と関連するバイオマーカーとなり得ることが強く示唆された。
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
２−１（２）Ｃ 術後予後予測への応用の可能性
２−１（２）Ａの結果では、ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現レベルと予後との関連は示されなかった。しかし、２−１（２）Ａで解析対象とした全４３例には、何らかの形で化学放射線療法を受けた症例が２７例含まれていた。一方、２−１（２）Ｂで示したように、ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現レベルが放射線感受性と関連することが明らかになった。
【０１０４】
従って、術後予後の指標として、化学放射線療法の影響を受けていないと考えられる無再発生存期間を用い、ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現レベルと食道がんの予後との関連を改めて評価した。
【０１０５】
その結果、図３に示すごとく、ＩＧＦＢＰ３高発現の群で術後再発しにくい傾向が認められた。このことから、ＩＧＦＢＰ３は予後規定因子にもなり得る可能性も示唆された。ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現レベルによって、食道扁平上皮がん患者を２群に分けると、その発現が高ければ化学放射線療法感受性は悪くなるが、手術予後としては良くなる傾向が認められた。このことから、ＩＧＦＢＰ３は食道がんの性質に影響し、またその悪性度にも関与する可能性があることが示唆された。
【０１０６】
２−２ Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの感受性マーカー候補遺伝子の機能解析
ＩＧＦＢＰ３が化学放射線療法感受性と関連し、食道がんの悪性度にも関与する可能性があることが示唆されたが、その作用機序は不明である。従って、次に、食道がん細胞株を用いて、その生物学的な意義についてｉｎ ｖｉｔｒｏで検討を行った。
【０１０７】
２−２（１） 食道がん細胞株におけるＩＧＦＢＰ３発現レベル
２−２（１）Ａ 遺伝子転写産物発現レベルと蛋白発現レベル
まず、進行食道扁平上皮がんの手術材料より樹立された食道がん細胞株ＴＥシリーズ（胸水由来のＴＥ９以外は原発巣由来）８株におけるＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現レベルを、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲによって検討した。前章の５−１（１）Ｃと同様、β−ａｃｔｉｎ遺伝子の転写産物１０４コピーあたりのコピー数で比較を行った。その結果、８株の細胞株は、ＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現量によって以下の３つのグループに分けられた。ＴＥ４とＴＥ１１は、β−ａｃｔｉｎ遺伝子の転写産物１０４コピーあたり２００コピー以上、ＴＥ１，ＴＥ５，ＴＥ９，ＴＥ１０，ＴＥ１５は２０−５５コピー、ＴＥ８はそれらの中間で１００コピーであった。ゆえに、食道がん細胞株ＴＥシリーズは、ＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現レベルにより、高発現群２株（ＴＥ４，ＴＥ１１）、中発現１株（ＴＥ８）、低発現群５株（ＴＥ１，ＴＥ５，ＴＥ９，ＴＥ１０，ＴＥ１５）の３タイプが存在することが分かった（図４Ａ）。
【０１０８】
さらに、これらの細胞株におけるＩＧＦＢＰ３蛋白の発現をｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇにより確認した。遺伝子転写産物の発現量が多かったＴＥ４，ＴＥ１１は、蛋白レベルでも発現が高かった。遺伝子転写産物の発現量が中間だったＴＥ８を含めた他の６細胞株は発現が低く、差は認められなかった（図４Ｂ）。全体として、遺伝子転写産物の発現量に比例して、ＩＧＦＢＰ３蛋白が発現していることが確認された。
【０１０９】
次に、これらｉｎ ｖｉｔｒｏの食道がん細胞株のＩＧＦＢＰ３発現量を、ｉｎ ｖｉｖｏの食道がん組織における発現レベルと比較した。細胞株のＩＧＦＢＰ３遺伝子転写産物の発現量は化学放射線療法感受性の有効群と同等であり、無効群の発現量と比較すると、有意に低いことが認められた（図４Ｃ）。従って、これらの細胞株は、ヒト食道がんにおけるＩＧＦＢＰ３の機能を解析するには有用と考えられたが、これらの細胞株を用いて感受性を検討する際には、細胞株のＩＧＦＢＰ３転写産物の発現量を高くし、それによって初めて生体内の治療応答性を反映できる可能性が高いと考えられた。
【０１１０】
２−２（１）Ｂ 発現抑制と強制発現
次に、これらの食道がん由来細胞株におけるＩＧＦＢＰ３遺伝子の機能を解析する目的で、その発現が抑制された細胞およびＩＧＦＢＰ３遺伝子を強制的に発現させた細胞を作製した。
【０１１１】
２−２（１）Ｂａ 発現抑制系
ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対してＲＮＡ干渉を誘導する配列を挿入したレンチウイルスベクターを用いて、高発現群２株（ＴＥ４，ＴＥ１１）、中発現１株（ＴＥ８）の３株に対して、ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現抑制を試みた（図５）。コントロールの細胞として、ｌａｃＺ遺伝子に対しＲＮＡ干渉を誘導する配列を挿入したレンチウイルスベクターを感染させ、これらは、薬剤選択後に回収した細胞集団として扱った。得られた抑制効果の確認はｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ（図５Ａ）およびｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ（図５Ｂ）により行い、少なくとも、蛋白発現レベルで８０％以上の抑制効果があることを確認した上で以後の解析に使用した。（ＩＧＦＢＰ３蛋白の発現を抑制した細胞をＴＥ４−ＫＤ、ＴＥ１１−ＫＤ、ＴＥ８−ＫＤとして、コントロールの細胞をＴＥ４−ｌａｃＺ、ＴＥ１１−ｌａｃＺ、ＴＥ８−ｌａｃＺとして記載する）。
【０１１２】
２−２（１）Ｂｂ強制発現系
一方、中発現１株（ＴＥ８）、低発現群１株（ＴＥ１）において、ＩＧＦＢＰ３遺伝子を強制的に発現させることを試みた（図６）。レンチウイルスの感染後サブクローニングを行い、それぞれ６クローンずつ樹立した（図６Ｂ，６Ｄ）。蛋白レベルで確認すると、その発現は様々であったが、３クローンは内因性にＩＧＦＢＰ３蛋白が最も高発現していた細胞株（ＴＥ４）より発現が高かった（図６Ｂ，６Ｄ）。さらに、その一部の遺伝子転写産物の発現レベルをｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲでも確認した（図６Ａ，６Ｃ）。（ＩＧＦＢＰ３蛋白を強制的に発現させた細胞をＴＥ１−ＯＥ、ＴＥ８−ＯＥとして、コントロールの細胞をＴＥ１−ｌａｃＺ、ＴＥ８−ｌａｃＺとして記載する）。
【０１１３】
２−２（２） 遺伝子導入細胞株を用いたＩＧＦＢＰ３遺伝子の機能解析
２−２（２）Ａ 細胞増殖について
非小細胞肺がん細胞株を使った実験で、ＩＧＦＢＰ３が細胞増殖抑制的に機能していることが報告されている（Hochscheid, R., Jaques, G. & Wegmann, B. Transfection of human insulin-like growth factor-binding protein 3 gene inhibits cell growth and tumorigenicity: a cell culture model for lung cancer. J Endocrinol 166, 553-63 (2000);Lee, H.Y. et al. Insulin-like growth factor binding protein-3 inhibits the growth of non-small cell lung cancer. Cancer Res 62, 3530-7 (2002)）。従って、まず初めに、５−２（１）Ｂで作製した遺伝子導入細胞株を利用し、ＩＧＦＢＰ３遺伝子が食道がん細胞株の増殖に及ぼす影響を検討した（図７）。
【０１１４】
コントロールの細胞の増殖活性とＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現レベルとに関連はみられなかった（図７Ａ）。ＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現を抑制した高発現群の２株（ＴＥ４，ＴＥ１１）のうち、ＴＥ４−ＫＤについては、コントロール細胞と比較し有意な変化が認められなかったものの（図７Ｃ）、ＴＥ１１−ＫＤでは増殖速度の増加が認められ（図７Ｅ）、発現を抑制した中発現の１株（ＴＥ８）であるＴＥ８−ＫＤについても増殖速度が増加するという結果が得られた（図７Ｄ）。一方、ＩＧＦＢＰ３遺伝子を強制的に発現させた低発現群の１株（ＴＥ１）、中発現の１株（ＴＥ８）では、逆に、ＩＧＦＢＰ３発現が高くなることによって増殖速度が低下した（図７Ｂ，７Ｄ）。これらのことから、１細胞株を除いた全ての細胞株で、ＩＧＦＢＰ３の高発現は増殖を抑制する方向に働いていることが分かり、非小細胞肺がん細胞株の場合と同様に、食道がん細胞株においても、ＩＧＦＢＰ３は増殖抑制的に機能していることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明は、食道がんを、放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するために有用である。また、本発明は、食道がんの手術後の再発のリスクを診断するために有用である。また、本発明は、食道がんを治療するために有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子および／またはたんぱく質からなる、第１選択として食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するための、または、食道がんの手術治療後のがん再発のリスクを決定するためのマーカー。
【請求項２】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プローブ、ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プライマーおよびＩＧＦＢＰ３たんぱく質に対する特異抗体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、第１選択としての食道がんの治療方針を決定するための、または、食道がんの手術治療後のがん再発のリスクを決定するためのキット。
【請求項３】
第１選択として食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するための、または、食道がんの手術治療後の再発リスクを決定するための方法であって、
− 食道がん患者由来のがん組織を準備すること、
− 前記がん組織中のＩＧＦＢＰ３遺伝子およびβアクチン遺伝子の発現量を測定すること、および
− βアクチン遺伝子の発現量に対するＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量の比が、０．０５以上である場合、第１選択として手術療法を決定し、０．０４以下である場合、第１選択として放射線化学療法を決定すること、または
− βアクチン遺伝子の発現量に対するＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量の比が、０．０５以上である場合、再発のリスクは低く、０．０４以下である場合、再発のリスクは高いと決定すること
を含む方法。
【請求項４】
第１選択として食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するための、または食道がんの手術治療後の再発リスクを決定するための方法であって、
− 食道がん患者由来のがん組織と正常食道組織を準備すること、
− 前記がん組織と正常食道組織を抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色すること、
− 抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色された正常食道組織中の細胞とがん組織中のがん細胞を比較して、がん組織中のがん細胞の染色が、正常食道組織中の細胞の染色より強い場合、第１選択として手術療法を決定し、がん組織中のがん細胞の染色と正常食道組織中の細胞の染色が同等もしくはがん組織中のがん細胞の染色が正常食道組織中の細胞の染色より弱い場合、第１選択として放射線化学療法を決定すること、または
− 抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色された正常食道組織中の細胞とがん組織中のがん細胞を比較して、がん組織中のがん細胞の染色が、正常食道組織中の細胞の染色より強い場合、手術治療後の再発のリスクは低いと決定し、がん組織中のがん細胞の染色度と正常食道組織中の細胞の染色が同等もしくはがん組織中のがん細胞の染色が正常食道組織中の細胞の染色より弱い場合、手術治療後の再発のリスクは高いと決定すること
を含む方法。
【請求項５】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子またはたんぱく質からなる、食道がんを治療するための医薬。
【請求項１】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子および／またはたんぱく質からなる、第１選択として食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するための、または、食道がんの手術治療後のがん再発のリスクを決定するためのマーカー。
【請求項２】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プローブ、ＩＧＦＢＰ３遺伝子に対する特異的プライマーおよびＩＧＦＢＰ３たんぱく質に対する特異抗体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、第１選択としての食道がんの治療方針を決定するための、または、食道がんの手術治療後のがん再発のリスクを決定するためのキット。
【請求項３】
第１選択として食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するための、または、食道がんの手術治療後の再発リスクを決定するための方法であって、
− 食道がん患者由来のがん組織を準備すること、
− 前記がん組織中のＩＧＦＢＰ３遺伝子およびβアクチン遺伝子の発現量を測定すること、および
− βアクチン遺伝子の発現量に対するＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量の比が、０．０５以上である場合、第１選択として手術療法を決定し、０．０４以下である場合、第１選択として放射線化学療法を決定すること、または
− βアクチン遺伝子の発現量に対するＩＧＦＢＰ３遺伝子の発現量の比が、０．０５以上である場合、再発のリスクは低く、０．０４以下である場合、再発のリスクは高いと決定すること
を含む方法。
【請求項４】
第１選択として食道がんを放射線化学療法により治療するかまたは手術療法により治療するかを決定するための、または食道がんの手術治療後の再発リスクを決定するための方法であって、
− 食道がん患者由来のがん組織と正常食道組織を準備すること、
− 前記がん組織と正常食道組織を抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色すること、
− 抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色された正常食道組織中の細胞とがん組織中のがん細胞を比較して、がん組織中のがん細胞の染色が、正常食道組織中の細胞の染色より強い場合、第１選択として手術療法を決定し、がん組織中のがん細胞の染色と正常食道組織中の細胞の染色が同等もしくはがん組織中のがん細胞の染色が正常食道組織中の細胞の染色より弱い場合、第１選択として放射線化学療法を決定すること、または
− 抗ＩＧＦＢＰ３特異抗体で染色された正常食道組織中の細胞とがん組織中のがん細胞を比較して、がん組織中のがん細胞の染色が、正常食道組織中の細胞の染色より強い場合、手術治療後の再発のリスクは低いと決定し、がん組織中のがん細胞の染色度と正常食道組織中の細胞の染色が同等もしくはがん組織中のがん細胞の染色が正常食道組織中の細胞の染色より弱い場合、手術治療後の再発のリスクは高いと決定すること
を含む方法。
【請求項５】
ＩＧＦＢＰ３遺伝子またはたんぱく質からなる、食道がんを治療するための医薬。
【図１】
【図３】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図３】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１０−２００６２５（Ｐ２０１０−２００６２５Ａ）
【公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−４６８１０（Ｐ２００９−４６８１０）
【出願日】平成２１年２月２７日（２００９．２．２７）
【出願人】（０００１７３５８８）財団法人癌研究会 (34)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２７日（２００９．２．２７）
【出願人】（０００１７３５８８）財団法人癌研究会 (34)
【Ｆターム（参考）】
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