骨再生用自己組織化ペプチドハイドロゲル
【課題】骨形成因子（ＢＭＰ）の有効濃度を局所的に維持することができ、かつ、骨形成の足場となることができる自己組織化ペプチドハイドロゲルからなる骨形成促進組成物の提供。
【解決手段】ＢＭＰおよび特定の配列からなる群から選択される自己組織化ペプチドを含有する骨形成促進組成物。該自己組織化ペプチドの濃度は、０．５〜５．０％（ｗ／ｖ）であることが好ましい。該ＢＭＰは、組換え型の骨形成因子であることが好ましい。該ＢＭＰの最終濃度は、２．５〜５００μｇ／ｍｌであることが好ましい。該自己組織化ペプチドハイドロゲルにＢＭＰを含ませることにより、ＢＭＰ単独および自己組織化ペプチドハイドロゲル単独の場合と比較して、骨の形成量や成熟速度を顕著に増加させることができる。
【解決手段】ＢＭＰおよび特定の配列からなる群から選択される自己組織化ペプチドを含有する骨形成促進組成物。該自己組織化ペプチドの濃度は、０．５〜５．０％（ｗ／ｖ）であることが好ましい。該ＢＭＰは、組換え型の骨形成因子であることが好ましい。該ＢＭＰの最終濃度は、２．５〜５００μｇ／ｍｌであることが好ましい。該自己組織化ペプチドハイドロゲルにＢＭＰを含ませることにより、ＢＭＰ単独および自己組織化ペプチドハイドロゲル単独の場合と比較して、骨の形成量や成熟速度を顕著に増加させることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢＭＰと自己組織化ペプチドを含む骨形成促進組成物、特に、骨再生用自己組織化ペプチドハイドロゲルに関する。
【背景技術】
【０００２】
組織工学に必要な足場材料として様々な材料が用いられてきたが、化学合成品の持つ安全性と3次元的環境を提供する細胞外マトリックスの特徴を併せ持った足場材料はこれまで実用化されていない。
【０００３】
自己組織化ペプチドは、そのアミノ酸配列により、多数のペプチド分子が規則正しく並んだ自己会合体を形成する特性を有する。近年、その物理的、化学的、生物学的性質から、新規マテリアルとして注目を浴びている（特許文献１〜３）。
【０００４】
自己組織化ペプチドを含むハイドロゲル（自己組織化ペプチドハイドロゲル）は、生分解性であり、分解産物が組織に悪影響を与えず、生体吸収性が高いことから、細胞の生着や増殖に適している。
【０００５】
特許文献４は、自己組織化ペプチドを用いた再生医療骨組成物を開示している。ここでは、犬の下顎歯槽骨に孔をあけ、その孔に自己組織化ペプチドハイドロゲル（PMハイドロゲル）、間葉系幹細胞（MSC）と自己組織化ペプチドハイドロゲルの混合物（PMハイドロゲル/MSC）、または多血小板血漿（PRP）ゲルおよび間葉系幹細胞（MSC）と自己組織化ペプチドハイドロゲルの混合物（PMハイドロゲル/MSC/PRPゲル）を充填し、新生骨の形成量および骨の成熟速度が、PMハイドロゲル、PMハイドロゲル/MSC、PMハイドロゲル/MSC/PRPゲルに順に増加することを開示している。しかし、PMハイドロゲル単独では、新生骨の形成が認められても骨が未成熟であったことを開示している。
【０００６】
骨形成を誘導する作用を有する蛋白質として、骨形成因子（ＢＭＰ：Bone morphogenetic protein、非特許文献１）が知られており、組換え型ヒトＢＭＰを用いた、骨または軟骨の欠損の修復および治療への臨床応用が研究されている。
【０００７】
一般に、ＢＭＰは、大量投与では、異所性の骨形成を誘導するなどの予期できない副作用の危険性があるため、ＢＭＰを用いた骨形成には、ＢＭＰを投与部位において安定かつ有効濃度に保持する必要がある。
【０００８】
特許文献５は、ＢＭＰの有効濃度を長時間にわたり維持するため、および骨形成の足場を提供するために、ＢＭＰをゼラチンハイドロゲルに含浸させて投与する方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許ＵＳ５，９５５，３４３
【特許文献２】米国特許ＵＳ５，６７０，４８３
【特許文献３】特表２００５−５１５７９６号公報
【特許文献４】特開２００７−１０５１８６号公報
【特許文献５】特開２００４−２０３８２９号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Wozney, et al., Science 1988 Dec 16;242(4885):1528-34
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ＢＭＰの有効濃度を局所的に維持することができ、かつ、骨形成の足場を提供することができる、自己組織化ペプチドハイドロゲルからなる骨形成促進組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、細胞培養の足場として利用されている自己組織化ペプチドハイドロゲルにＢＭＰを含ませることにより、ＢＭＰ単独および自己組織化ペプチドハイドロゲル単独の場合と比較して、骨の形成量や成熟速度を顕著に増加させることができることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、下記のとおりである。
［１］骨形成因子（ＢＭＰ）および配列番号１〜２０からなる群から選択される自己組織化ペプチドを含む、骨形成促進組成物。
［２］該自己組織化ペプチドの濃度が、０．５〜５．０％（ｗ／ｖ）である、上記［１］記載の骨形成促進組成物。
［３］骨形成因子が、組換え型の骨形成因子である、上記［１］〜［２］のいずれか一に記載の骨形成促進組成物。
［４］骨形成因子の濃度が、最終濃度２．５〜５００μｇ／ｍｌである、上記［１］〜［３］のいずれか一に記載の骨形成促進組成物。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の骨形成促進組成物は、ＢＭＰを骨欠損部位などの体内で一定に放出することができ、かつ、骨形成の足場を提供することができるので、ＢＭＰ単独および自己組織化ペプチドハイドロゲル単独の場合と比較して、骨の形成量や成熟速度を顕著に増加させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】動物実験モデルの図。家兎頭頂骨を用いた骨造成モデル。Ａ：家兎頭頂骨を横から見た図。家兎頭頂骨上の黒四角形は、純チタン製円筒を示す。Ｂ：家兎頭頂骨を上から見た図。4個の黒丸は、家兎頭頂骨に設置された純チタン製円筒を示す。（１）: 骨膜を除去した頭頂骨と頭頂骨に空けた4箇所の溝（丸）とその中の5個の骨孔を示す。（２）：4箇所の溝（丸）の上に純チタン製円筒を設置した。（３）: 設置した純チタン製円筒に移植材料を充填した。または、空のままにした。（４）: 移植材料を充填後または空のまま、純チタン製円筒の上を遮蔽材（チタン板遮蔽）で封入した。
【図２】純チタン製円筒を示す。
【図３】組織図。(a) ピュアマトリックスとBMP併用群の組織像 (b) (a)中の丸で囲まれた上方部組織拡大像。 (c) (a)中の丸で囲まれた下方部組織拡大像。NB : 新生骨。CT : 結合組織。OB : 骨芽細胞様細胞。BV：血管
【図４】各実験群の組織像。Ｅｍｐｔｙ（コントロール）：移植材料なし、ＢＭＰ：ｈｒＢＭＰ−２（２５μｇ／ｍｌ）、ＰＭ：ピュアマトリックス、ＰＭ＋ＢＭＰ：ピュアマトリックス＋ｈｒBMP-2（２５μｇ／ｍｌ）。
【図５Ａ】円筒内増生組織量、円筒内最大骨高さ、円筒内新生骨量の比較
【図５Ｂ】円筒内増生組織量。図５Ａに示す表１中の増生組織量の値をグラフ化した。頭頂骨面、円筒内面、上面遮蔽材で囲まれた全体の面積に対する、新生骨、結合組織を含む増生組織の面積比（％）を測定して円筒内増生組織量とした。
【図５Ｃ】円筒内最大骨高さ。図５Ａに示す表１中の最大骨高さの値をグラフ化した。円筒を基準とし、頭頂骨面に対する垂直方向への新生骨の最大到達距離（ｍｍ）を測定して円筒内最大骨高さとした。
【図５Ｄ】円筒内新生骨量。図５Ａに示す表１中の新生骨量の値をグラフ化した。頭頂骨面、円筒内面、上面遮蔽材で囲まれた全体の面積に対する、新生骨の面積比（％）を測定して円筒内新生骨量とした。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明で用いる骨形成因子（ＢＭＰ：Bone morphogenetic protein）とは、未分化の間葉系細胞を軟骨細胞や骨芽細胞へ分化させる活性あるいは軟骨または骨を形成させる活性を有するタンパク質を意味する。
【００１７】
ＢＭＰは、３９６個のアミノ酸からなる前駆体タンパク質がＳＣＰｓ（subtilisin-like-conversion）によりＡｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇの部位で切断された後、そのクラスターである１１４個のアミノ酸のサブユニットで構成された2量体タンパク質（2つの同一のタンパク質の二量体または2つの関連する骨形成タンパク質のヘテロ二量体）である。
【００１８】
ヒトでは、例えば、ＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−９がクローニングされている。また、これらの機能的等価改変体（すなわち天然に存在するＢＭＰのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、天然に存在するＢＭＰと同じ活性を有するタンパク質）も挙げられる。骨形成因子としては、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）およびＢＭＰ−８（ＯＰ−２）が好ましく、ＢＭＰ−２がより好ましい。
【００１９】
ヒトBMP−2のmRNAの塩基配列は、GenBank Accession NM_001200に、preproproteinのアミノ酸配列は、GenPept Accession NP_001191に開示されている。ヒトＢＭＰ−２の成熟タンパク質はpreproprotein（全３９６アミノ酸）の第２８３位〜第３９６位に該当する。本発明のＢＭＰは、活性を有する限り限定されない。
【００２０】
ＢＭＰは、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。例えば、遺伝子工学的手法によりＢＭＰをコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＢＭＰを得ることができる。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母、昆虫、かいこ、または動物細胞などを用いることができる。
【００２１】
ＢＭＰの濃度は、限定されないが、最終濃度２．５〜５００μｇ／ｍｌ、好ましくは １０〜２５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは、２０〜１００μｇ／ｍｌである。
【００２２】
本発明で使用する自己組織化ペプチドは、疎水性アミノ酸残基と親水性アミノ酸残基とが一定周期で交互に配置されて疎水性側鎖の非極性の面と親水性側鎖の極性の面とを備える。そして、前記自己組織化ペプチドは、適当な陽イオン存在下において、自己組織化的にナノファイバーを形成し、その結果、ペプチドナノファイバーからなるペプチドハイドロゲルを形成する。
【００２３】
前記自己組織化ペプチドにおいて、前記親水性アミノ酸残基は、その側鎖のチャージが正のものと負のものとが一定周期で交互に配置され、前記極性の面が、イオン的に相補的であることが好ましい。前記自己組織化ペプチドは、陽イオンが存在する水溶液中で、ペプチド間に生じる多数の相互作用によって自己組織化する。前記相互作用には、例えば、隣接しているペプチドにおける正チャージのアミノ酸（リジン：Ｋ）側鎖と負チャージのアミノ酸（アスパラギン酸：Ｄ）側鎖とが形成する相補的なイオン対が含まれる。また、アスパラギンやグルタミン等の親水性アミノ酸残基の非チャージ側鎖があれば、水素結合総合作用に関与する。隣接しているペプチドにおける疎水性側鎖は、ファンデルワールス相互作用に関与する。ペプチド骨格上のアミノ基及びカルボニル基もまた分子間水素結合相互作用に関与しうる。前記正チャージ側鎖のアミノ酸残基としては、アルギニン：Ｒ、リジン：Ｋ、ヒスチジン：Ｈがあげられ、前記負チャージ側鎖のアミノ酸残基としては、アスパラギン酸：Ｄ、グルタミン酸：Ｅがあげられ、非チャージ親水性側鎖のアミノ酸残基としては、アスパラギン：Ｎ、グルタミン：Ｑ、セリン：Ｓ、トレオニン：Ｔ、チロシン：Ｙがあげられ、疎水性側鎖のアミノ酸残基としては、アラニン：Ａ、グリシン：Ｇ、バリン：Ｖ、ロイシン：Ｌ、イソロイシン：Ｉ、プロリン：Ｐ、フェニルアラニン：Ｆ、メチオニン：Ｍ、トリプトファン：Ｗ、システイン：Ｃがあげられる。
【００２４】
前記自己組織化ペプチドにおいて、疎水性アミノ酸残基と親水性アミノ酸残基との配置の一定周期は、例えば、１残基、２残基、３残基、４残基の交互配置であってよく、好ましくは、１個のアミノ酸残基の交互配置である。
【００２５】
自己組織化ペプチドの長さは、例えば、８〜２００アミノ酸残基であって、好ましくは、８〜３６アミノ酸残基であり、より好ましくは、１２〜１６アミノ酸残基である。また、前記自己組織化ペプチドのＮ末端側は、アセチル化されていてもよい。また、Ｃ末端はアミド化されていてもよい。前記自己組織化ペプチドの製造方法は、特に制限されず、例えば、従来公知の化学合成方法により合成する方法があげられる。
【００２６】
本発明の骨形成促進組成物に含まれる前記自己組織化ペプチドは、一種類でもよく、複数種類でもよい。
【００２７】
これらの自己組織化ペプチドの中でも、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸およびアラニン（ＲＡＤＡ）の繰り返し配列を有する自己組織化ペプチドを好ましく使用することができ、そのようなペプチドの配列は、Ａｃ−（ＲＡＤＡ）p−ＣＯＮＨ2（ｐ＝２〜５０）で表される。またイソロイシン、グルタミン酸、イソロイシンおよびリジン（ＩＥＩＫ）の繰り返し配列を有する自己組織化ペプチドも好ましく使用することができ、そのようなペプチドの配列は、Ａｃ−（ＩＥＩＫ）pＩ−ＣＯＮＨ2（ｐ＝２〜５０）で表される。さらにリジン、ロイシン、アスパラギン酸およびロイシン（ＫＬＤＬ）の繰り返し配列を有する自己組織化ペプチドも好ましく使用することができ、そのようなペプチドの配列は、Ａｃ−（ＫＬＤＬ）p−ＣＯＮＨ2（ｐ＝２〜５０）で表される。
【００２８】
本発明における自己組織化ペプチドの好ましい具体例としては、（Ａｃ−（ＲＡＤＡ）4−ＣＯＮＨ2）配列（配列番号：１）を有するペプチドＲＡＤ１６−Ｉ、（Ａｃ−（ＩＥＩＫ）３Ｉ−ＣＯＮＨ2）配列（配列番号：２）を有するペプチドＩＥＩＫ１３、（Ａｃ−（ＫＬＤＬ）３−ＣＯＮＨ2）配列（配列番号：３）を有するペプチドＫＬＤが挙げられ、ＲＡＤ１６−Ｉは、PuraMatrix（登録商標）としてその１％水溶液が、株式会社スリー・ディー・マトリックスから製品化されている。PuraMatrix（登録商標）には、１％の（Ａｃ−（ＲＡＤＡ）4−ＣＯＮＨ2）配列（配列番号：１）を有するペプチドの他、水素イオン、塩化物イオンが含まれる。
【００２９】
さらに、自己組織化ペプチドは、例えば、米国特許ＵＳ５，９５５，３４３、米国特許ＵＳ５，６７０，４８３、特表２００５−５１５７９６号公報（国際公開ＷＯ２００２／０６２９６１号パンフレット）に開示されており、その一例を下記に示す。
【００３０】
ＩＥＩＫ９：ＩＥＩＫＩＥＩＫＩ（配列番号：４）
ＲＡＤ１６−ＩＩ：ＲＡＲＡＤＡＤＡＲＡＲＡＤＡＤＡ（配列番号：５）
ＥＡＫ１６−Ｉ：ＡＥＡＫＡＥＡＫＡＥＡＫＡＥＡＫ（配列番号：６）
ＲＡＥ−１６−Ｉ：ＲＡＥＡＲＡＥＡＲＡＥＡＲＡＥＡ（配列番号：７）
ＫＡＤ１６−Ｉ：ＫＡＤＡＫＡＤＡＫＡＤＡＫＡＤＡ（配列番号：８）
ＥＡＨ１６−Ｉ：ＡＥＡＥＡＨＡＨＡＥＡＥＡＨＡＨ（配列番号：９）
ＥＦＫ−１６−ＩＩ：ＦＥＦＥＦＫＦＫＦＥＦＥＦＫＦＫ（配列番号：１０）
ＥＦＫ８−Ｉ：ＦＥＦＫＦＥＦＫ（配列番号：１１）
ＥＬＫ１６−ＩＩ：ＬＥＬＥＬＫＬＫＬＥＬＥＬＫＬＫ（配列番号：１２）
ＥＡＫ１６−ＩＩ：ＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫ（配列番号：１３）
ＥＡＫ１２：ＡＥＡＥＡＥＡＥＡＫＡＫ（配列番号：１４）
ＫＡＥ１６−ＩＶ：ＫＡＫＡＫＡＫＡＥＡＥＡＥＡＥＡ（配列番号：１５）
ＥＡＫ１６−ＩＶ：ＥＡＥＡＥＡＥＡＫＡＫＡＫＡＫＡ（配列番号：１６）
ＲＡＤ１６−ＩＶ：ＲＡＲＡＲＡＲＡＤＡＤＡＤＡＤＡ（配列番号：１７）
ＤＡＲ１６−ＩＶ：ＡＤＡＤＡＤＡＤＡＲＡＲＡＲＡＲ（配列番号：１８）
ＤＡＲ１６−ＩＶ＊：ＤＡＤＡＤＡＤＡＲＡＲＡＲＡＲＡ（配列番号：１９）
ＤＡＲ３２−ＩＶ：ＡＤＡＤＡＤＡＤＡＲＡＲＡＲＡＲＡＤＡＤＡＤＡＤＡＲＡＲＡＲＡＲ（配列番号：２０）
【００３１】
好ましい自己組織化ペプチドは、配列番号：１〜２０、より好ましくは、配列番号：１〜３のアミノ酸配列を有するペプチドから選択される少なくとも1つである。
【００３２】
本発明において、自己組織化ペプチドハイドロゲルは、前記ペプチドが自己組織化によりナノファイバーを形成した結果として得らるものである。この自己組織化ペプチドハイドロゲルは、骨形成のスカフォールド（足場）として機能しうる。前記ナノファイバーとは、前記自己組織化ペプチドが、例えば、らせん状のβ−シート構造をとったものである。前記ナノファイバーの直径は、例えば、５００ｎｍ以下、１００ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、１０ｎｍ〜２０ｎｍ、５ｎｍ〜１０ｎｍ、５ｎｍ未満である。
【００３３】
本発明に用いる自己組織化ペプチドの自己組織化条件には、生理的条件のｐＨおよび陽イオンがあげられる。
【００３４】
本発明において、生理的ｐHは、ｐH６からｐH８、好ましくは、ｐH６．５からｐH７．５、さらに好ましくは、ｐH７．３からｐH７．５である。また、本発明において陽イオンとは、たとえば、５ｍＭ〜５Ｍのナトリウムイオンまたはカリウムイオンである。特に１価のアルカリ金属イオンの存在が重要である。つまり、生体内に多量に存在するナトリウムイオンおよびカリウムイオンがゲル化の促進に寄与する。一度ゲル化すると通常のタンパク質の変性条件、例えば高温、酸、アルカリ、タンパク質分解酵素、尿素、グアニジン塩酸塩等の変性剤を用いても、ゲルは分解しない。
【００３５】
前記自己組織化ペプチドハイドロゲルを形成する方法としては、例えば、最終濃度を、０．５ｗｔ％〜５．０ｗｔ％、好ましくは、０．５ｗｔ％〜３．０％、より好ましくは、０．５ｗｔ％〜１．０ｗｔ％の前記自己組織化ペプチドの水溶液とし、前記水溶液の塩濃度（例えば、ＮａＣｌ）を、５ｍＭ〜５Ｍとする方法があげられる。よって、自己組織化ペプチドは、生理食塩水、ＰＢＳ等でハイドロゲル化する。
【００３６】
本発明の、ＢＭＰおよび自己組織化ペプチドを含む骨形成促進組成物は、溶液、ゲルまたは固体（粉末も含む）であっても良い。骨形成促進組成物が溶液の場合、自己組織化ペプチドとＢＭＰを含む溶液を調製し、該溶液を目的の部位に充填しin situでゲル化させる。自己組織化ペプチドは、生体と接触させることによりゲル化する。
【００３７】
骨形成促進組成物がゲルの場合、ＢＭＰを含む自己組織化ペプチドハイドロゲルを目的の部位に充填する。ＢＭＰを含む自己組織化ペプチドハイドロゲルを調製方法は限定されない。例えば、自己組織化ペプチドとＢＭＰを含む溶液を調製しゲル化させてもよい。また、自己組織化ペプチドハイドロゲルを作成後に、該ゲルにＢＭＰを含ませることによって調製してもよい。自己組織化ペプチドハイドロゲルにＢＭＰを含ませることは、該ゲルをＢＭＰの溶液に浸漬したり、該ゲルにＢＭＰの溶液を注入することによっても良い。さらに、自己組織化ペプチドハイドロゲルを目的の部位に充填後、該ゲルにＢＭＰを注入しても良い。
【００３８】
固体の骨形成促進組成物は、ＢＭＰを含む自己組織化ペプチドハイドロゲルを凍結乾燥することによって調製できる。骨形成促進組成物が固体の場合、該凍結乾燥物を目的の部位に充填する。また、自己組織化ペプチドハイドロゲルの凍結乾燥物にＢＭＰの溶液を注入後、目的の部位に充填しても良い。また、自己組織化ペプチドハイドロゲルの凍結乾燥物を目的の部位に充填後、該凍結乾燥物にＢＭＰの溶液を注入しても良い。
【００３９】
使用の態様としては、ＢＭＰと自己組織化ペプチドを含む溶液を注射器、カテーテルやピペットで目的部位に適用する。注射器、カテーテルやピペットは２つ以上から構成されていてもよい。
【００４０】
また、注入可能な程度の流動性を備えている骨形成促進組成物を注射器、カテーテルやピペットで目的部位に注入してもよい。
【００４１】
また、この分野で通常用いられるガーゼ、包帯、インプラントなどの支持体や裏打ちの上に骨形成促進組成物を固定することも可能である。
【００４２】
その他、骨形成促進組成物の粉末もしくは溶液を充填した噴霧式スプレーを作製することができる。
【００４３】
骨形成促進組成物は、さらに、等浸透圧性溶質を含むことが好ましい。前記等浸透圧性溶質とは、前記水溶液中に溶解された非イオン性化合物をいう。前記等浸透圧性溶質としては、例えば、単糖類や二糖類等の糖類があげられ、そのなかでも、スクロース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、リボース、マンノース、アラビノース、キシロース等が好ましい。前記等浸透圧性溶質の濃度は、例えば、５０ｍＭ、１５０ｍＭ、３００ｍＭ、２００〜２５０ｍＭ、２５０〜２７０ｍＭ、２７０〜３００ｍＭ、３００〜４００ｍＭ、４００〜５００ｍＭ、５００〜６００ｍＭ、６００〜７００ｍＭ、７００〜８００ｍＭ、８００〜９００ｍＭである。その他の等浸透圧性溶質としては、例えば、５〜２０％（ｖ／ｖ）のグリセロールがあげられる。
【００４４】
前記自己組織化ペプチドハイドロゲルの水分含有量は、例えば、９９％を超え、好ましくは、９９．５％〜９９．９％である。前記ペプチドハイドロゲルの孔サイズは、例えば、５０ｎｍ〜４００ｎｍである。前記ペプチドハイドロゲルは、生体内分解性があり、骨形成とともに吸収される。その分解期間は、例えば、２〜８週間である。前記分解期間は、前記自己組織化ペプチドに、例えば、プロテアーゼによる切断部位を導入するなどして調整可能である。また、完全人工合成が可能であるから、他の動物由来材料と異なり病原菌の感染のおそれを排除できる。
【００４５】
本発明の骨形成促進組成物は、コラーゲンやフィブリン糊等の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質を含んでもよい。また、ゲル化材料を含んでも良い。例えば、トロンビンや塩化カルシウムを含んでもよい。トロンビンは血漿中のフィブリノーゲンに作用し、フィブリンが生ずる。そして、フィブリンの凝集作用により粘性が増加する。また、増粘剤を含んでも良い。例えば、アルギン酸ナトリウム等の増粘多糖類、グリセリン、ワセリン等があげられる。粘度が増すことにより適用部位における定着性が向上し、骨形成が効果的となる。
【００４６】
本発明の骨形成促進組成物は、骨組織又は歯周組織における欠損部位や損傷部位の、修復、復元又は再生の用途に使用できる。また、デンタルインプラント治療においても、デンタルインプラントを挿入するための骨移植が必要になる場合あり、そのような場合にも、本発明の骨形成促進組成物を使用して、骨移植の治癒時間の短縮をすることができる。なお、本発明の骨形成促進組成物の適用分野は、特に制限されず、例えば、頭蓋、顎、顔面の復元外科、美容外科、形成外科、整形外科、口腔外科、耳鼻咽喉科、歯科等の分野に適用できる。
【００４７】
したがって、本発明は、骨組織又は歯周組織の再生医療方法若しくは再生法であって、本発明の骨形成促進組成物を使用して、例えば、ヒト及び非ヒト動物の骨形成する工程を含む方法を含む。さらに、本発明は、デンタルインプラント治療方法であって、本発明の骨形成促進組成物を使用して、例えば、ヒト及び非ヒト動物の骨組織又は歯周組織の形成又は再生をする工程を含む治療方法を含む。また、本発明は、骨組織又は歯周組織の再生医療方法若しくは再生法、又は、デンタルインプラント治療方法における本発明の骨形成促進組成物の使用を含む。
【００４８】
さらに、本発明は、骨組織又は歯周組織の再生医療方法若しくは再生法、又は、デンタルインプラント治療方法のためのキットであって、前記自己組織化ペプチド、凍結乾燥又は凍結した前記ＢＭＰや、試薬等を含むキットを含む。
【００４９】
以下、実施例によって、本発明の骨形成促進組成物をさらに詳細に説明するが、本発明はその趣旨と適用範囲に逸脱しない限りこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５０】
［材料および方法］
（ウサギ動物実験モデル）
New Zealand White rabbit（8カ月齢、3〜4kg、日本エスエルシー株式会社）5匹を用いた。頭頂部皮膚を切開し、頭頂骨部の骨膜を除去した後、頭頂骨面にトレフィンバー（株式会社デンテック、ボーントレフィン６．０）を用いて、直径6mm、深さ1mmの溝を1匹につき4個形成し、溝の内部骨面に骨孔を各5個作製した（図１（１））後、内径6mm、外径7mm、高さ7mmの純チタン製円筒（株式会社ＳＰＦ、特注品、チタン＞９９．５％）を溝にはめ込み固定した（図１（２））。円筒は1匹につき各4個設置し、下記（１）〜（４）の各移植材料を円筒内に移植した。
【００５１】
（移植材料の処理）
rhBMP-2（ペプロテック社、Ｒｅｃｏｎｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＢＭＰ−２）は20%スクロース水溶液に溶解した（rhBMP-2の20% スクロース水溶液）。1%ピュアマトリックス（登録商標）（株式会社スリー・ディー・マトリックス）は超音波処理（ヤマト科学株式会社、８５１０Ｊ−ＤＴＨ、37℃、30分間）した後、0.22μmフィルターを通し、20%スクロース水溶液またはrhBMP-2の20% スクロース水溶液に溶解した。移植直前に、PBSを添加することでペプチドハイドロゲル化した。
【００５２】
（移植材料の移植）
（１）コントロール（Ｅｍｐｔｙ、移植物なし）
（２）rhBMP-2のみ（ＢＭＰ）
rhBMP-2（円筒内最終濃度25μg/ml）の20% スクロース水溶液：50μl
生理食塩水：50μl
リン酸バッファー(PBS)：100μl、
（合計200μl）
（３）ピュアマトリックスのみ（ＰＭ）
1% ピュアマトリックス（登録商標）：50μl
20% スクロース水溶液：50μl
リン酸バッファー(PBS)：100μl、
（合計200μl）
（４）ピュアマトリックスおよびrhBMP-2（ＰＭ＋ＢＭＰ）
1% ピュアマトリックス（登録商標）：50μl
rhBMP-2（円筒内最終濃度25μg/ml）の20% スクロース水溶液：50μl
リン酸バッファー(PBS)：100μl
（合計200μl）
【００５３】
rhBMP-2の溶液、ピュアマトリックスのゲル、またはrhBMP-2含有ピュアマトリックスゲル各２００μｌを頭頂骨部に予め設置してある各純チタン製円筒に、１ｍｌ注射用シリンジ（テルモ株式会社、テルモ１ｍｌシリンジ）と１８ゲージ針（テルモ株式会社、テルモ注射針１８Ｇ）を用いて注入した（図１（３））。
【００５４】
注入後は直径7mm、厚さ0.3mmの純チタン板（株式会社東京チタニウム、チタン薄板）で円筒上部を閉鎖（図１（４））し、頭頂部皮膚のフラップを閉じて手術終了とした。注入後8週において屠殺し、非脱灰研磨切片を作製し、0.1%トルイジンブルー染色にて円筒内部の組織量、最大骨高さ、骨量について顕微鏡（株式会社キーエンス、ＢＺ−８０００）、画像解析ソフト（アメリカ国立衛生研究所、Image J）を用いて計測し、実験群間で比較評価した。
【００５５】
［結果］
全ての実験群の円筒内増生組織中に新生骨および結合組織の増生が認められ、組織中には血管構造や骨芽細胞様細胞の存在が認められた（図３）。組織像（図４）に示す通り、4群の中ではピュアマトリックスとBMP併用群で最も多くの増生組織が認められた。
【００５６】
画像解析ソフトで定量化したグラフでは、ピュアマトリックスとBMPの併用群は円筒内増生組織量で、コントロール群に比べ有意に増加が認められた(図５Ａ、Ｂ)。次に、円筒内最大骨高さでは、ピュアマトリックスとBMP併用群は他のすべての群に比べて有意に増加が認められた(図５Ａ、Ｃ)。同様に円筒内骨量においても、ピュアマトリックスとBMP併用群は、コントロール群に比べ有意に増加が認められた(図５Ａ、Ｄ)。
【００５７】
［考察］
本実験において、ピュアマトリックスとBMPの併用は、コントロールまたはピュアマトリックスやBMPの単独使用群と比べて、骨形成に有用であることが認められた。
【００５８】
ピュアマトリックスによる骨形成作用のみでは、骨誘導効果が小さく、骨増生量としては不十分であった。また、ＢＭＰ単独では空間内での維持が困難なため骨増生量が得られにくかった。そこで、ピュアマトリックスとＢＭＰを混合することで、ピュアマトリックス内にＢＭＰが蓄積・保持されることで、空間内全体の適切な濃度維持が可能になり骨誘導効果が発揮されたため、骨形成作用が増加したと考えられる。
【００５９】
ピュアマトリックスは骨形成における細胞の足場や、BMPのキャリアーとして機能しうることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の骨形成促進組成物は、例えば、頭蓋、顎、顔面の復元外科、美容外科、形成外科、整形外科、口腔外科、耳鼻咽喉科、歯科等の分野において、骨組織や歯周組織の欠損・損傷部位の修復、復元、再生のための使用に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢＭＰと自己組織化ペプチドを含む骨形成促進組成物、特に、骨再生用自己組織化ペプチドハイドロゲルに関する。
【背景技術】
【０００２】
組織工学に必要な足場材料として様々な材料が用いられてきたが、化学合成品の持つ安全性と3次元的環境を提供する細胞外マトリックスの特徴を併せ持った足場材料はこれまで実用化されていない。
【０００３】
自己組織化ペプチドは、そのアミノ酸配列により、多数のペプチド分子が規則正しく並んだ自己会合体を形成する特性を有する。近年、その物理的、化学的、生物学的性質から、新規マテリアルとして注目を浴びている（特許文献１〜３）。
【０００４】
自己組織化ペプチドを含むハイドロゲル（自己組織化ペプチドハイドロゲル）は、生分解性であり、分解産物が組織に悪影響を与えず、生体吸収性が高いことから、細胞の生着や増殖に適している。
【０００５】
特許文献４は、自己組織化ペプチドを用いた再生医療骨組成物を開示している。ここでは、犬の下顎歯槽骨に孔をあけ、その孔に自己組織化ペプチドハイドロゲル（PMハイドロゲル）、間葉系幹細胞（MSC）と自己組織化ペプチドハイドロゲルの混合物（PMハイドロゲル/MSC）、または多血小板血漿（PRP）ゲルおよび間葉系幹細胞（MSC）と自己組織化ペプチドハイドロゲルの混合物（PMハイドロゲル/MSC/PRPゲル）を充填し、新生骨の形成量および骨の成熟速度が、PMハイドロゲル、PMハイドロゲル/MSC、PMハイドロゲル/MSC/PRPゲルに順に増加することを開示している。しかし、PMハイドロゲル単独では、新生骨の形成が認められても骨が未成熟であったことを開示している。
【０００６】
骨形成を誘導する作用を有する蛋白質として、骨形成因子（ＢＭＰ：Bone morphogenetic protein、非特許文献１）が知られており、組換え型ヒトＢＭＰを用いた、骨または軟骨の欠損の修復および治療への臨床応用が研究されている。
【０００７】
一般に、ＢＭＰは、大量投与では、異所性の骨形成を誘導するなどの予期できない副作用の危険性があるため、ＢＭＰを用いた骨形成には、ＢＭＰを投与部位において安定かつ有効濃度に保持する必要がある。
【０００８】
特許文献５は、ＢＭＰの有効濃度を長時間にわたり維持するため、および骨形成の足場を提供するために、ＢＭＰをゼラチンハイドロゲルに含浸させて投与する方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許ＵＳ５，９５５，３４３
【特許文献２】米国特許ＵＳ５，６７０，４８３
【特許文献３】特表２００５−５１５７９６号公報
【特許文献４】特開２００７−１０５１８６号公報
【特許文献５】特開２００４−２０３８２９号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Wozney, et al., Science 1988 Dec 16;242(4885):1528-34
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ＢＭＰの有効濃度を局所的に維持することができ、かつ、骨形成の足場を提供することができる、自己組織化ペプチドハイドロゲルからなる骨形成促進組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、細胞培養の足場として利用されている自己組織化ペプチドハイドロゲルにＢＭＰを含ませることにより、ＢＭＰ単独および自己組織化ペプチドハイドロゲル単独の場合と比較して、骨の形成量や成熟速度を顕著に増加させることができることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、下記のとおりである。
［１］骨形成因子（ＢＭＰ）および配列番号１〜２０からなる群から選択される自己組織化ペプチドを含む、骨形成促進組成物。
［２］該自己組織化ペプチドの濃度が、０．５〜５．０％（ｗ／ｖ）である、上記［１］記載の骨形成促進組成物。
［３］骨形成因子が、組換え型の骨形成因子である、上記［１］〜［２］のいずれか一に記載の骨形成促進組成物。
［４］骨形成因子の濃度が、最終濃度２．５〜５００μｇ／ｍｌである、上記［１］〜［３］のいずれか一に記載の骨形成促進組成物。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の骨形成促進組成物は、ＢＭＰを骨欠損部位などの体内で一定に放出することができ、かつ、骨形成の足場を提供することができるので、ＢＭＰ単独および自己組織化ペプチドハイドロゲル単独の場合と比較して、骨の形成量や成熟速度を顕著に増加させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】動物実験モデルの図。家兎頭頂骨を用いた骨造成モデル。Ａ：家兎頭頂骨を横から見た図。家兎頭頂骨上の黒四角形は、純チタン製円筒を示す。Ｂ：家兎頭頂骨を上から見た図。4個の黒丸は、家兎頭頂骨に設置された純チタン製円筒を示す。（１）: 骨膜を除去した頭頂骨と頭頂骨に空けた4箇所の溝（丸）とその中の5個の骨孔を示す。（２）：4箇所の溝（丸）の上に純チタン製円筒を設置した。（３）: 設置した純チタン製円筒に移植材料を充填した。または、空のままにした。（４）: 移植材料を充填後または空のまま、純チタン製円筒の上を遮蔽材（チタン板遮蔽）で封入した。
【図２】純チタン製円筒を示す。
【図３】組織図。(a) ピュアマトリックスとBMP併用群の組織像 (b) (a)中の丸で囲まれた上方部組織拡大像。 (c) (a)中の丸で囲まれた下方部組織拡大像。NB : 新生骨。CT : 結合組織。OB : 骨芽細胞様細胞。BV：血管
【図４】各実験群の組織像。Ｅｍｐｔｙ（コントロール）：移植材料なし、ＢＭＰ：ｈｒＢＭＰ−２（２５μｇ／ｍｌ）、ＰＭ：ピュアマトリックス、ＰＭ＋ＢＭＰ：ピュアマトリックス＋ｈｒBMP-2（２５μｇ／ｍｌ）。
【図５Ａ】円筒内増生組織量、円筒内最大骨高さ、円筒内新生骨量の比較
【図５Ｂ】円筒内増生組織量。図５Ａに示す表１中の増生組織量の値をグラフ化した。頭頂骨面、円筒内面、上面遮蔽材で囲まれた全体の面積に対する、新生骨、結合組織を含む増生組織の面積比（％）を測定して円筒内増生組織量とした。
【図５Ｃ】円筒内最大骨高さ。図５Ａに示す表１中の最大骨高さの値をグラフ化した。円筒を基準とし、頭頂骨面に対する垂直方向への新生骨の最大到達距離（ｍｍ）を測定して円筒内最大骨高さとした。
【図５Ｄ】円筒内新生骨量。図５Ａに示す表１中の新生骨量の値をグラフ化した。頭頂骨面、円筒内面、上面遮蔽材で囲まれた全体の面積に対する、新生骨の面積比（％）を測定して円筒内新生骨量とした。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明で用いる骨形成因子（ＢＭＰ：Bone morphogenetic protein）とは、未分化の間葉系細胞を軟骨細胞や骨芽細胞へ分化させる活性あるいは軟骨または骨を形成させる活性を有するタンパク質を意味する。
【００１７】
ＢＭＰは、３９６個のアミノ酸からなる前駆体タンパク質がＳＣＰｓ（subtilisin-like-conversion）によりＡｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇの部位で切断された後、そのクラスターである１１４個のアミノ酸のサブユニットで構成された2量体タンパク質（2つの同一のタンパク質の二量体または2つの関連する骨形成タンパク質のヘテロ二量体）である。
【００１８】
ヒトでは、例えば、ＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−９がクローニングされている。また、これらの機能的等価改変体（すなわち天然に存在するＢＭＰのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、天然に存在するＢＭＰと同じ活性を有するタンパク質）も挙げられる。骨形成因子としては、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）およびＢＭＰ−８（ＯＰ−２）が好ましく、ＢＭＰ−２がより好ましい。
【００１９】
ヒトBMP−2のmRNAの塩基配列は、GenBank Accession NM_001200に、preproproteinのアミノ酸配列は、GenPept Accession NP_001191に開示されている。ヒトＢＭＰ−２の成熟タンパク質はpreproprotein（全３９６アミノ酸）の第２８３位〜第３９６位に該当する。本発明のＢＭＰは、活性を有する限り限定されない。
【００２０】
ＢＭＰは、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。例えば、遺伝子工学的手法によりＢＭＰをコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＢＭＰを得ることができる。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母、昆虫、かいこ、または動物細胞などを用いることができる。
【００２１】
ＢＭＰの濃度は、限定されないが、最終濃度２．５〜５００μｇ／ｍｌ、好ましくは １０〜２５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは、２０〜１００μｇ／ｍｌである。
【００２２】
本発明で使用する自己組織化ペプチドは、疎水性アミノ酸残基と親水性アミノ酸残基とが一定周期で交互に配置されて疎水性側鎖の非極性の面と親水性側鎖の極性の面とを備える。そして、前記自己組織化ペプチドは、適当な陽イオン存在下において、自己組織化的にナノファイバーを形成し、その結果、ペプチドナノファイバーからなるペプチドハイドロゲルを形成する。
【００２３】
前記自己組織化ペプチドにおいて、前記親水性アミノ酸残基は、その側鎖のチャージが正のものと負のものとが一定周期で交互に配置され、前記極性の面が、イオン的に相補的であることが好ましい。前記自己組織化ペプチドは、陽イオンが存在する水溶液中で、ペプチド間に生じる多数の相互作用によって自己組織化する。前記相互作用には、例えば、隣接しているペプチドにおける正チャージのアミノ酸（リジン：Ｋ）側鎖と負チャージのアミノ酸（アスパラギン酸：Ｄ）側鎖とが形成する相補的なイオン対が含まれる。また、アスパラギンやグルタミン等の親水性アミノ酸残基の非チャージ側鎖があれば、水素結合総合作用に関与する。隣接しているペプチドにおける疎水性側鎖は、ファンデルワールス相互作用に関与する。ペプチド骨格上のアミノ基及びカルボニル基もまた分子間水素結合相互作用に関与しうる。前記正チャージ側鎖のアミノ酸残基としては、アルギニン：Ｒ、リジン：Ｋ、ヒスチジン：Ｈがあげられ、前記負チャージ側鎖のアミノ酸残基としては、アスパラギン酸：Ｄ、グルタミン酸：Ｅがあげられ、非チャージ親水性側鎖のアミノ酸残基としては、アスパラギン：Ｎ、グルタミン：Ｑ、セリン：Ｓ、トレオニン：Ｔ、チロシン：Ｙがあげられ、疎水性側鎖のアミノ酸残基としては、アラニン：Ａ、グリシン：Ｇ、バリン：Ｖ、ロイシン：Ｌ、イソロイシン：Ｉ、プロリン：Ｐ、フェニルアラニン：Ｆ、メチオニン：Ｍ、トリプトファン：Ｗ、システイン：Ｃがあげられる。
【００２４】
前記自己組織化ペプチドにおいて、疎水性アミノ酸残基と親水性アミノ酸残基との配置の一定周期は、例えば、１残基、２残基、３残基、４残基の交互配置であってよく、好ましくは、１個のアミノ酸残基の交互配置である。
【００２５】
自己組織化ペプチドの長さは、例えば、８〜２００アミノ酸残基であって、好ましくは、８〜３６アミノ酸残基であり、より好ましくは、１２〜１６アミノ酸残基である。また、前記自己組織化ペプチドのＮ末端側は、アセチル化されていてもよい。また、Ｃ末端はアミド化されていてもよい。前記自己組織化ペプチドの製造方法は、特に制限されず、例えば、従来公知の化学合成方法により合成する方法があげられる。
【００２６】
本発明の骨形成促進組成物に含まれる前記自己組織化ペプチドは、一種類でもよく、複数種類でもよい。
【００２７】
これらの自己組織化ペプチドの中でも、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸およびアラニン（ＲＡＤＡ）の繰り返し配列を有する自己組織化ペプチドを好ましく使用することができ、そのようなペプチドの配列は、Ａｃ−（ＲＡＤＡ）p−ＣＯＮＨ2（ｐ＝２〜５０）で表される。またイソロイシン、グルタミン酸、イソロイシンおよびリジン（ＩＥＩＫ）の繰り返し配列を有する自己組織化ペプチドも好ましく使用することができ、そのようなペプチドの配列は、Ａｃ−（ＩＥＩＫ）pＩ−ＣＯＮＨ2（ｐ＝２〜５０）で表される。さらにリジン、ロイシン、アスパラギン酸およびロイシン（ＫＬＤＬ）の繰り返し配列を有する自己組織化ペプチドも好ましく使用することができ、そのようなペプチドの配列は、Ａｃ−（ＫＬＤＬ）p−ＣＯＮＨ2（ｐ＝２〜５０）で表される。
【００２８】
本発明における自己組織化ペプチドの好ましい具体例としては、（Ａｃ−（ＲＡＤＡ）4−ＣＯＮＨ2）配列（配列番号：１）を有するペプチドＲＡＤ１６−Ｉ、（Ａｃ−（ＩＥＩＫ）３Ｉ−ＣＯＮＨ2）配列（配列番号：２）を有するペプチドＩＥＩＫ１３、（Ａｃ−（ＫＬＤＬ）３−ＣＯＮＨ2）配列（配列番号：３）を有するペプチドＫＬＤが挙げられ、ＲＡＤ１６−Ｉは、PuraMatrix（登録商標）としてその１％水溶液が、株式会社スリー・ディー・マトリックスから製品化されている。PuraMatrix（登録商標）には、１％の（Ａｃ−（ＲＡＤＡ）4−ＣＯＮＨ2）配列（配列番号：１）を有するペプチドの他、水素イオン、塩化物イオンが含まれる。
【００２９】
さらに、自己組織化ペプチドは、例えば、米国特許ＵＳ５，９５５，３４３、米国特許ＵＳ５，６７０，４８３、特表２００５−５１５７９６号公報（国際公開ＷＯ２００２／０６２９６１号パンフレット）に開示されており、その一例を下記に示す。
【００３０】
ＩＥＩＫ９：ＩＥＩＫＩＥＩＫＩ（配列番号：４）
ＲＡＤ１６−ＩＩ：ＲＡＲＡＤＡＤＡＲＡＲＡＤＡＤＡ（配列番号：５）
ＥＡＫ１６−Ｉ：ＡＥＡＫＡＥＡＫＡＥＡＫＡＥＡＫ（配列番号：６）
ＲＡＥ−１６−Ｉ：ＲＡＥＡＲＡＥＡＲＡＥＡＲＡＥＡ（配列番号：７）
ＫＡＤ１６−Ｉ：ＫＡＤＡＫＡＤＡＫＡＤＡＫＡＤＡ（配列番号：８）
ＥＡＨ１６−Ｉ：ＡＥＡＥＡＨＡＨＡＥＡＥＡＨＡＨ（配列番号：９）
ＥＦＫ−１６−ＩＩ：ＦＥＦＥＦＫＦＫＦＥＦＥＦＫＦＫ（配列番号：１０）
ＥＦＫ８−Ｉ：ＦＥＦＫＦＥＦＫ（配列番号：１１）
ＥＬＫ１６−ＩＩ：ＬＥＬＥＬＫＬＫＬＥＬＥＬＫＬＫ（配列番号：１２）
ＥＡＫ１６−ＩＩ：ＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫ（配列番号：１３）
ＥＡＫ１２：ＡＥＡＥＡＥＡＥＡＫＡＫ（配列番号：１４）
ＫＡＥ１６−ＩＶ：ＫＡＫＡＫＡＫＡＥＡＥＡＥＡＥＡ（配列番号：１５）
ＥＡＫ１６−ＩＶ：ＥＡＥＡＥＡＥＡＫＡＫＡＫＡＫＡ（配列番号：１６）
ＲＡＤ１６−ＩＶ：ＲＡＲＡＲＡＲＡＤＡＤＡＤＡＤＡ（配列番号：１７）
ＤＡＲ１６−ＩＶ：ＡＤＡＤＡＤＡＤＡＲＡＲＡＲＡＲ（配列番号：１８）
ＤＡＲ１６−ＩＶ＊：ＤＡＤＡＤＡＤＡＲＡＲＡＲＡＲＡ（配列番号：１９）
ＤＡＲ３２−ＩＶ：ＡＤＡＤＡＤＡＤＡＲＡＲＡＲＡＲＡＤＡＤＡＤＡＤＡＲＡＲＡＲＡＲ（配列番号：２０）
【００３１】
好ましい自己組織化ペプチドは、配列番号：１〜２０、より好ましくは、配列番号：１〜３のアミノ酸配列を有するペプチドから選択される少なくとも1つである。
【００３２】
本発明において、自己組織化ペプチドハイドロゲルは、前記ペプチドが自己組織化によりナノファイバーを形成した結果として得らるものである。この自己組織化ペプチドハイドロゲルは、骨形成のスカフォールド（足場）として機能しうる。前記ナノファイバーとは、前記自己組織化ペプチドが、例えば、らせん状のβ−シート構造をとったものである。前記ナノファイバーの直径は、例えば、５００ｎｍ以下、１００ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、１０ｎｍ〜２０ｎｍ、５ｎｍ〜１０ｎｍ、５ｎｍ未満である。
【００３３】
本発明に用いる自己組織化ペプチドの自己組織化条件には、生理的条件のｐＨおよび陽イオンがあげられる。
【００３４】
本発明において、生理的ｐHは、ｐH６からｐH８、好ましくは、ｐH６．５からｐH７．５、さらに好ましくは、ｐH７．３からｐH７．５である。また、本発明において陽イオンとは、たとえば、５ｍＭ〜５Ｍのナトリウムイオンまたはカリウムイオンである。特に１価のアルカリ金属イオンの存在が重要である。つまり、生体内に多量に存在するナトリウムイオンおよびカリウムイオンがゲル化の促進に寄与する。一度ゲル化すると通常のタンパク質の変性条件、例えば高温、酸、アルカリ、タンパク質分解酵素、尿素、グアニジン塩酸塩等の変性剤を用いても、ゲルは分解しない。
【００３５】
前記自己組織化ペプチドハイドロゲルを形成する方法としては、例えば、最終濃度を、０．５ｗｔ％〜５．０ｗｔ％、好ましくは、０．５ｗｔ％〜３．０％、より好ましくは、０．５ｗｔ％〜１．０ｗｔ％の前記自己組織化ペプチドの水溶液とし、前記水溶液の塩濃度（例えば、ＮａＣｌ）を、５ｍＭ〜５Ｍとする方法があげられる。よって、自己組織化ペプチドは、生理食塩水、ＰＢＳ等でハイドロゲル化する。
【００３６】
本発明の、ＢＭＰおよび自己組織化ペプチドを含む骨形成促進組成物は、溶液、ゲルまたは固体（粉末も含む）であっても良い。骨形成促進組成物が溶液の場合、自己組織化ペプチドとＢＭＰを含む溶液を調製し、該溶液を目的の部位に充填しin situでゲル化させる。自己組織化ペプチドは、生体と接触させることによりゲル化する。
【００３７】
骨形成促進組成物がゲルの場合、ＢＭＰを含む自己組織化ペプチドハイドロゲルを目的の部位に充填する。ＢＭＰを含む自己組織化ペプチドハイドロゲルを調製方法は限定されない。例えば、自己組織化ペプチドとＢＭＰを含む溶液を調製しゲル化させてもよい。また、自己組織化ペプチドハイドロゲルを作成後に、該ゲルにＢＭＰを含ませることによって調製してもよい。自己組織化ペプチドハイドロゲルにＢＭＰを含ませることは、該ゲルをＢＭＰの溶液に浸漬したり、該ゲルにＢＭＰの溶液を注入することによっても良い。さらに、自己組織化ペプチドハイドロゲルを目的の部位に充填後、該ゲルにＢＭＰを注入しても良い。
【００３８】
固体の骨形成促進組成物は、ＢＭＰを含む自己組織化ペプチドハイドロゲルを凍結乾燥することによって調製できる。骨形成促進組成物が固体の場合、該凍結乾燥物を目的の部位に充填する。また、自己組織化ペプチドハイドロゲルの凍結乾燥物にＢＭＰの溶液を注入後、目的の部位に充填しても良い。また、自己組織化ペプチドハイドロゲルの凍結乾燥物を目的の部位に充填後、該凍結乾燥物にＢＭＰの溶液を注入しても良い。
【００３９】
使用の態様としては、ＢＭＰと自己組織化ペプチドを含む溶液を注射器、カテーテルやピペットで目的部位に適用する。注射器、カテーテルやピペットは２つ以上から構成されていてもよい。
【００４０】
また、注入可能な程度の流動性を備えている骨形成促進組成物を注射器、カテーテルやピペットで目的部位に注入してもよい。
【００４１】
また、この分野で通常用いられるガーゼ、包帯、インプラントなどの支持体や裏打ちの上に骨形成促進組成物を固定することも可能である。
【００４２】
その他、骨形成促進組成物の粉末もしくは溶液を充填した噴霧式スプレーを作製することができる。
【００４３】
骨形成促進組成物は、さらに、等浸透圧性溶質を含むことが好ましい。前記等浸透圧性溶質とは、前記水溶液中に溶解された非イオン性化合物をいう。前記等浸透圧性溶質としては、例えば、単糖類や二糖類等の糖類があげられ、そのなかでも、スクロース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、リボース、マンノース、アラビノース、キシロース等が好ましい。前記等浸透圧性溶質の濃度は、例えば、５０ｍＭ、１５０ｍＭ、３００ｍＭ、２００〜２５０ｍＭ、２５０〜２７０ｍＭ、２７０〜３００ｍＭ、３００〜４００ｍＭ、４００〜５００ｍＭ、５００〜６００ｍＭ、６００〜７００ｍＭ、７００〜８００ｍＭ、８００〜９００ｍＭである。その他の等浸透圧性溶質としては、例えば、５〜２０％（ｖ／ｖ）のグリセロールがあげられる。
【００４４】
前記自己組織化ペプチドハイドロゲルの水分含有量は、例えば、９９％を超え、好ましくは、９９．５％〜９９．９％である。前記ペプチドハイドロゲルの孔サイズは、例えば、５０ｎｍ〜４００ｎｍである。前記ペプチドハイドロゲルは、生体内分解性があり、骨形成とともに吸収される。その分解期間は、例えば、２〜８週間である。前記分解期間は、前記自己組織化ペプチドに、例えば、プロテアーゼによる切断部位を導入するなどして調整可能である。また、完全人工合成が可能であるから、他の動物由来材料と異なり病原菌の感染のおそれを排除できる。
【００４５】
本発明の骨形成促進組成物は、コラーゲンやフィブリン糊等の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質を含んでもよい。また、ゲル化材料を含んでも良い。例えば、トロンビンや塩化カルシウムを含んでもよい。トロンビンは血漿中のフィブリノーゲンに作用し、フィブリンが生ずる。そして、フィブリンの凝集作用により粘性が増加する。また、増粘剤を含んでも良い。例えば、アルギン酸ナトリウム等の増粘多糖類、グリセリン、ワセリン等があげられる。粘度が増すことにより適用部位における定着性が向上し、骨形成が効果的となる。
【００４６】
本発明の骨形成促進組成物は、骨組織又は歯周組織における欠損部位や損傷部位の、修復、復元又は再生の用途に使用できる。また、デンタルインプラント治療においても、デンタルインプラントを挿入するための骨移植が必要になる場合あり、そのような場合にも、本発明の骨形成促進組成物を使用して、骨移植の治癒時間の短縮をすることができる。なお、本発明の骨形成促進組成物の適用分野は、特に制限されず、例えば、頭蓋、顎、顔面の復元外科、美容外科、形成外科、整形外科、口腔外科、耳鼻咽喉科、歯科等の分野に適用できる。
【００４７】
したがって、本発明は、骨組織又は歯周組織の再生医療方法若しくは再生法であって、本発明の骨形成促進組成物を使用して、例えば、ヒト及び非ヒト動物の骨形成する工程を含む方法を含む。さらに、本発明は、デンタルインプラント治療方法であって、本発明の骨形成促進組成物を使用して、例えば、ヒト及び非ヒト動物の骨組織又は歯周組織の形成又は再生をする工程を含む治療方法を含む。また、本発明は、骨組織又は歯周組織の再生医療方法若しくは再生法、又は、デンタルインプラント治療方法における本発明の骨形成促進組成物の使用を含む。
【００４８】
さらに、本発明は、骨組織又は歯周組織の再生医療方法若しくは再生法、又は、デンタルインプラント治療方法のためのキットであって、前記自己組織化ペプチド、凍結乾燥又は凍結した前記ＢＭＰや、試薬等を含むキットを含む。
【００４９】
以下、実施例によって、本発明の骨形成促進組成物をさらに詳細に説明するが、本発明はその趣旨と適用範囲に逸脱しない限りこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５０】
［材料および方法］
（ウサギ動物実験モデル）
New Zealand White rabbit（8カ月齢、3〜4kg、日本エスエルシー株式会社）5匹を用いた。頭頂部皮膚を切開し、頭頂骨部の骨膜を除去した後、頭頂骨面にトレフィンバー（株式会社デンテック、ボーントレフィン６．０）を用いて、直径6mm、深さ1mmの溝を1匹につき4個形成し、溝の内部骨面に骨孔を各5個作製した（図１（１））後、内径6mm、外径7mm、高さ7mmの純チタン製円筒（株式会社ＳＰＦ、特注品、チタン＞９９．５％）を溝にはめ込み固定した（図１（２））。円筒は1匹につき各4個設置し、下記（１）〜（４）の各移植材料を円筒内に移植した。
【００５１】
（移植材料の処理）
rhBMP-2（ペプロテック社、Ｒｅｃｏｎｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＢＭＰ−２）は20%スクロース水溶液に溶解した（rhBMP-2の20% スクロース水溶液）。1%ピュアマトリックス（登録商標）（株式会社スリー・ディー・マトリックス）は超音波処理（ヤマト科学株式会社、８５１０Ｊ−ＤＴＨ、37℃、30分間）した後、0.22μmフィルターを通し、20%スクロース水溶液またはrhBMP-2の20% スクロース水溶液に溶解した。移植直前に、PBSを添加することでペプチドハイドロゲル化した。
【００５２】
（移植材料の移植）
（１）コントロール（Ｅｍｐｔｙ、移植物なし）
（２）rhBMP-2のみ（ＢＭＰ）
rhBMP-2（円筒内最終濃度25μg/ml）の20% スクロース水溶液：50μl
生理食塩水：50μl
リン酸バッファー(PBS)：100μl、
（合計200μl）
（３）ピュアマトリックスのみ（ＰＭ）
1% ピュアマトリックス（登録商標）：50μl
20% スクロース水溶液：50μl
リン酸バッファー(PBS)：100μl、
（合計200μl）
（４）ピュアマトリックスおよびrhBMP-2（ＰＭ＋ＢＭＰ）
1% ピュアマトリックス（登録商標）：50μl
rhBMP-2（円筒内最終濃度25μg/ml）の20% スクロース水溶液：50μl
リン酸バッファー(PBS)：100μl
（合計200μl）
【００５３】
rhBMP-2の溶液、ピュアマトリックスのゲル、またはrhBMP-2含有ピュアマトリックスゲル各２００μｌを頭頂骨部に予め設置してある各純チタン製円筒に、１ｍｌ注射用シリンジ（テルモ株式会社、テルモ１ｍｌシリンジ）と１８ゲージ針（テルモ株式会社、テルモ注射針１８Ｇ）を用いて注入した（図１（３））。
【００５４】
注入後は直径7mm、厚さ0.3mmの純チタン板（株式会社東京チタニウム、チタン薄板）で円筒上部を閉鎖（図１（４））し、頭頂部皮膚のフラップを閉じて手術終了とした。注入後8週において屠殺し、非脱灰研磨切片を作製し、0.1%トルイジンブルー染色にて円筒内部の組織量、最大骨高さ、骨量について顕微鏡（株式会社キーエンス、ＢＺ−８０００）、画像解析ソフト（アメリカ国立衛生研究所、Image J）を用いて計測し、実験群間で比較評価した。
【００５５】
［結果］
全ての実験群の円筒内増生組織中に新生骨および結合組織の増生が認められ、組織中には血管構造や骨芽細胞様細胞の存在が認められた（図３）。組織像（図４）に示す通り、4群の中ではピュアマトリックスとBMP併用群で最も多くの増生組織が認められた。
【００５６】
画像解析ソフトで定量化したグラフでは、ピュアマトリックスとBMPの併用群は円筒内増生組織量で、コントロール群に比べ有意に増加が認められた(図５Ａ、Ｂ)。次に、円筒内最大骨高さでは、ピュアマトリックスとBMP併用群は他のすべての群に比べて有意に増加が認められた(図５Ａ、Ｃ)。同様に円筒内骨量においても、ピュアマトリックスとBMP併用群は、コントロール群に比べ有意に増加が認められた(図５Ａ、Ｄ)。
【００５７】
［考察］
本実験において、ピュアマトリックスとBMPの併用は、コントロールまたはピュアマトリックスやBMPの単独使用群と比べて、骨形成に有用であることが認められた。
【００５８】
ピュアマトリックスによる骨形成作用のみでは、骨誘導効果が小さく、骨増生量としては不十分であった。また、ＢＭＰ単独では空間内での維持が困難なため骨増生量が得られにくかった。そこで、ピュアマトリックスとＢＭＰを混合することで、ピュアマトリックス内にＢＭＰが蓄積・保持されることで、空間内全体の適切な濃度維持が可能になり骨誘導効果が発揮されたため、骨形成作用が増加したと考えられる。
【００５９】
ピュアマトリックスは骨形成における細胞の足場や、BMPのキャリアーとして機能しうることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の骨形成促進組成物は、例えば、頭蓋、顎、顔面の復元外科、美容外科、形成外科、整形外科、口腔外科、耳鼻咽喉科、歯科等の分野において、骨組織や歯周組織の欠損・損傷部位の修復、復元、再生のための使用に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成因子（ＢＭＰ）および配列番号１〜２０からなる群から選択される自己組織化ペプチドを含む、骨形成促進組成物。
【請求項２】
該自己組織化ペプチドの濃度が、０．５〜５．０％（ｗ／ｖ）である、請求項１記載の骨形成促進組成物。
【請求項３】
骨形成因子が、組換え型の骨形成因子である、請求項１〜２のいずれか一に記載の骨形成促進組成物。
【請求項４】
骨形成因子の最終濃度が、２．５〜５００μｇ／ｍｌである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の骨形成促進組成物。
【請求項１】
骨形成因子（ＢＭＰ）および配列番号１〜２０からなる群から選択される自己組織化ペプチドを含む、骨形成促進組成物。
【請求項２】
該自己組織化ペプチドの濃度が、０．５〜５．０％（ｗ／ｖ）である、請求項１記載の骨形成促進組成物。
【請求項３】
骨形成因子が、組換え型の骨形成因子である、請求項１〜２のいずれか一に記載の骨形成促進組成物。
【請求項４】
骨形成因子の最終濃度が、２．５〜５００μｇ／ｍｌである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の骨形成促進組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【公開番号】特開２０１２−８２１８０（Ｐ２０１２−８２１８０Ａ）
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２３１５５４（Ｐ２０１０−２３１５５４）
【出願日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２０１０年９月２０日 日本口腔外科学会雑誌 第５６巻 総会特別号に発表
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２０１０年９月２０日 日本口腔外科学会雑誌 第５６巻 総会特別号に発表
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
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