高分子複合体の製造方法及び該製造方法によって得られる高分子複合体、並びに該高分子複合体を用いた動物細胞の培養方法
【課題】 反応性の高い複数の高分子化合物を用いて、これらの高分子化合物を均一に含み、任意の形状とすることができ、更には容易に多孔体とすることができる高分子複合体を製造する方法及び該製造方法によって得られる高分子複合体、更には、該高分子複合体を用いた動物細胞の培養方法を提供する。
【解決手段】 相互に反応する２種類の高分子化合物のうち、一つの高分子化合物Ａを溶媒に溶解した高分子化合物Ａ溶液を任意の形状に凍結し、この高分子化合物Ａ溶液の凍結物を、もう一つの高分子化合物Ｂを前記溶媒と相溶性のある溶媒に溶解した高分子化合物Ｂ溶液に浸漬することによりゲル化する。前記高分子化合物Ｂを溶解する溶媒として、前記溶媒と相溶性のある溶媒と凝固点降下作用を有する溶媒の混合溶媒を用いることが好ましい。このようにして得られた高分子複合体は、真空凍結乾燥することにより多孔体とすることができ、動物細胞培養用の担体として好適に用いることができる。
【解決手段】 相互に反応する２種類の高分子化合物のうち、一つの高分子化合物Ａを溶媒に溶解した高分子化合物Ａ溶液を任意の形状に凍結し、この高分子化合物Ａ溶液の凍結物を、もう一つの高分子化合物Ｂを前記溶媒と相溶性のある溶媒に溶解した高分子化合物Ｂ溶液に浸漬することによりゲル化する。前記高分子化合物Ｂを溶解する溶媒として、前記溶媒と相溶性のある溶媒と凝固点降下作用を有する溶媒の混合溶媒を用いることが好ましい。このようにして得られた高分子複合体は、真空凍結乾燥することにより多孔体とすることができ、動物細胞培養用の担体として好適に用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反応性の高い複数の高分子化合物を用いて均質な高分子複合体を製造する方法及び該製造方法によって得られる高分子複合体に関し、更には、該高分子複合体を用いた動物細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトや動物の再生的治療法として、生体外において患者もしくは同種・異種の細胞を人工的な担体上で培養することにより組織を構築し、その生体親和性、機械的強度、生理的機能を獲得した上で、欠損部に移植する方法が用いられるようになっている。
【０００３】
このような治療法においては、組織の生体外再構築をいかに行うかは移植以降の治療と同様大変重要であり、細胞を培養する担体の選択・創製は生体外再構築の成否に大きく関わってくるため、担体として、生体組織を模倣する多孔質の三次元担体の開発が進められている。
【０００４】
従来より、上記担体の材料として、ポリエチレン、ポリスチレンのような化学合成ポリマーのほか、より生体親和性が高く、様々な生理機能を持つとされるコラーゲン、アルギン酸、キチンやキトサン等の利用が提案されており、実際の生体組織のように複数の高分子成分による多孔質担体とすることができれば、より多くの機能を持たせることができ、有効な担体となると考えられている。
【０００５】
例えば、下記特許文献１には、酸性生体高分子と塩基性生体高分子との複合体を少なくともその表面に含む成形物よりなる軟骨細胞培養用の担体が開示されている。そして、酸性生体高分子として、アルギン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸等が例示されており、塩基性生体高分子として、キトサン、ポリリジン、ポリアルギニン等が例示されている。
【０００６】
下記特許文献２には、カチオン性高分子及びアニオン性高分子をそれぞれの濃度が０．１〜３０重量％となるように塩類を含む水系媒体に相溶させた高分子相溶溶液の塩類の濃度を低下させることにより、上記のカチオン性高分子及びアニオン性高分子の複合体を形成させる高分子複合体の製造方法について開示されている。
【０００７】
下記特許文献３には、キトサンを含む高分子含水ゲルを含む細胞培養担体であって、該高分子含水ゲルがコラーゲン及び／又はアルギン酸で被覆された細胞培養担体が開示されている。そして、キトサンのゲル化方法の一つとして、アルギン酸等のアニオン性高分子化合物を用いてイオン結合による架橋を行うことが記載されている。
【特許文献１】特開２００２−２９１４６１号公報
【特許文献２】特開２００４−２４９０号公報
【特許文献３】特開２００４−１４１０５３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記のような従来の方法では、反応性の高い複数の高分子化合物を均一に含む高分子複合体を得ることは困難であった。すなわち、キトサン等のカチオン性高分子化合物とアルギン酸等のアニオン性高分子化合物を混合すると、溶液中で瞬時にポリイオンコンプレックスを形成してゲル化してしまうため、混合溶液中に固まりが生じたり、複合化していないカチオン性高分子化合物やアニオン性高分子化合物が残りやすく、均質な高分子複合体を得ることが困難であった。
【０００９】
また、高分子複合体を多孔質体とするための方法として、高分子化合物溶液を発泡させながらゲル化させる方法や、高分子化合物溶液に孔源としてＮａＣｌ粒を添加してゲル化し、後からＮａＣｌを除去する方法等が知られているが、前者の方法では、ポリイオンコンプレックスが強固であるため、泡で均一に孔をあけることは難しく、後者の方法では、高分子複合体構築後にＮａＣｌ粒を取り除くことが困難である等の問題があった。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、反応性の高い複数の高分子化合物を用いて、これらの高分子化合物を均一に含み、任意の形状とすることができ、更には容易に多孔体とすることができる高分子複合体を製造する方法及び該製造方法によって得られる高分子複合体を提供することにあり、更には、該高分子複合体を用いた動物細胞の培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち、本発明の高分子複合体の製造方法は、相互に反応する２種類の高分子化合物のうち、一つの高分子化合物Ａを溶媒に溶解した高分子化合物Ａ溶液を任意の形状に凍結し、この高分子化合物Ａ溶液の凍結物を、もう一つの高分子化合物Ｂを前記溶媒と相溶性のある溶媒に溶解した高分子化合物Ｂ溶液に浸漬することによりゲル化することを特徴とする。
【００１２】
本発明の製造方法によれば、相互に反応する２種類の高分子化合物のうち、一つの高分子化合物Ａを溶媒に溶解した高分子化合物Ａ溶液を任意の形状に凍結することにより、使用目的に応じた様々な形状の高分子複合体を得ることができる。
【００１３】
そして、この高分子化合物Ａ溶液の凍結物を、もう一つの高分子化合物Ｂを前記溶媒と相溶性のある溶媒に溶解した高分子化合物Ｂ溶液に浸漬することにより、前記凍結物は、前記高分子化合物Ｂ溶液の界面から溶解して、その界面で高分子化合物Ａと高分子化合物Ｂが反応してゲル化する。そして、前記凍結物の内部に溶媒が浸透することにより、その界面が該凍結物内部に移動し、順次湿潤ゲル化する。その結果、複数の高分子化合物を均一に含有する任意の形状の高分子複合体を容易に得ることができる。
【００１４】
上記発明においては、前記高分子化合物Ｂを溶解する溶媒として、前記溶媒と相溶性のある溶媒と凝固点降下作用を有する溶媒の混合溶媒を用いることが好ましい。これによれば、前記高分子化合物Ｂ溶液を低温度に保つことができるので、前記高分子化合物Ａと前記高分子化合物Ｂの反応が、前記高分子化合物Ａ溶液の凍結物の表面から内部へと徐々に進行し、ゲル化を均一に行うことができる。
【００１５】
また、ゲル化した前記高分子複合体を真空凍結乾燥することにより多孔体とすることが好ましい。これによれば、ゲル化した高分子複合体に含まれる溶媒を除去し、簡単に多孔質の高分子複合体を得ることができる。
【００１６】
更に、前記相互に反応する２種類の高分子化合物として、アニオン性高分子化合物とカチオン性高分子化合物を用いることが好ましく、前記アニオン性高分子化合物としてアルギン酸を用い、前記カチオン性高分子化合物としてオリゴキトサンを用いることが好ましい。これらによれば、より生体親和性が高く、動物細胞培養用の担体、特に移植用組織再生基材の担体として好適に用いることができる高分子複合体を得ることができる。
【００１７】
また、本発明の動物細胞の培養方法は、前記高分子複合体を担体として用いて動物細胞の培養を行うことを特徴とし、前記動物細胞として、骨細胞、皮膚細胞、軟骨細胞、肝細胞、膵細胞、繊維芽細胞、幹細胞及び骨髄細胞からなる群より選ばれた１種が好ましく用いられる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、複数の高分子化合物を均一に含有する任意の形状の高分子複合体を容易に得ることができる。この高分子複合体は、容易に多孔体とすることができ、動物細胞培養用の担体、特に移植用組織再生基材の担体として好適に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明において用いられる相互に反応する２種類の高分子化合物の組み合わせとしては、アニオン性高分子化合物とカチオン性高分子化合物の組み合わせが好ましく用いられる。
【００２０】
ここで、アニオン性高分子化合物とは、官能基としてアニオン性を発揮する官能基を有する高分子をいう。アニオン性高分子化合物としては、例えば、アルギン酸、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルキチン、ポリアクリル酸、ポリスチレンスルホン酸等を用いることができ、中でもアルギン酸が好ましく用いられる。
【００２１】
アルギン酸は、コンブやワカメ等に代表される褐藻類に含まれている天然多糖類であり、Ｄ−マンヌロン酸とＬ−グルコン酸で構成されている。本発明では、上記褐藻類から常法にしたがって抽出したものを用いてもよく、市販のアルギン酸を使用することもできる。また、アルギン酸のＭ／Ｇ比（Ｄ−マンヌロン酸とＬ−グルコン酸の比率）は、特に限定されることなく用いる事が出来るが、例えば０．３〜２．５のものを用いる事が出来る。
【００２２】
また、上記カチオン性高分子とは、官能基としてカチオン性を発揮する官能基を有する高分子をいう。カチオン性高分子化合物としては、例えば、オリゴキトサン、ポリリシン、ポリビニルアミン、アミノ化セルロース等を用いることができ、中でもオリゴキトサンが好ましく用いられる。
【００２３】
本発明でいうオリゴキトサンとは、Ｄ−グルコサミンがβ‐１、４結合したカチオン性高分子であるキトサンについて、特に分子量が数百〜数万と比較的小さいものを意味する。その入手経路については特に限定されないが、例えば、カニやエビ等の甲殻類の殻を脱灰、脱タンパク処理して得られるキチンに対して、更に脱アセチル処理をして得られるキトサンを酵素、酸、アルカリ等を用いて低分子化させることにより得る事が出来る。また、上記オリゴキトサンは市販されているものを用いてもよく、「ＣＯＳ−ＹＳ（商品名；焼津水産化学工業株式会社製）」等が挙げられる。
【００２４】
本発明において好ましく用いられるオリゴキトサンは分子量１，０００〜１００，０００、脱アセチル化度７０〜１００％であり、より好ましくは分子量５，０００〜５０，０００、脱アセチル化度８０〜１００％である。
【００２５】
また、本発明の高分子複合体は、上記の基本的成分の他に、シリカ（Si）、チタニア（Ti）等の無機化合物を含む材料や、糖鎖等を含むことができる。
【００２６】
例えば、シリカを含む材料としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、トリメトキシシラン（ＴＭＯＳ）、ヘキシルトリメトキシシラン（ＨＴＭＯＳ）、ジメチルジメトキシシラン（ＤＭＤＯＳ）等を用いることができ、その場合、シランカップリング剤として、メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＴＭＯＳ）、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、ビニルメトキシシラン、アクリロキシプロピルトリメトキシシラン等を使用することができる。シリカを含む材料の表面にはハイドロキシアパタイトの析出が誘導されることが報告されており、シリカを含む有機−無機ハイブリッド構造からなる高分子複合体とすることにより、骨近傍軟骨組織培養担体等として好適な高分子複合体とすることができる。
【００２７】
上記の高分子化合物を溶解する溶媒は、使用する高分子化合物に応じて適宜選択すればよく、各高分子化合物を溶解でき、かつ相溶性のある溶媒であれば特に制限なく用いることができる。具体的には、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、ジメチルアセトアミド、ジオキサン、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロキシフラン、ジメチルホルムアミド等が例示できる。
【００２８】
以下、本発明の高分子複合体の製造方法について、アルギン酸とオリゴキトサンを用いた例を挙げて説明する。
【００２９】
１）高分子化合物Ａ溶液の調製
アルギン酸を溶媒中に濃度が０．１〜１０.０ｗｔ％、好ましくは２．０〜５．０ｗｔ％となるように溶解してアルギン酸溶液を調製する。上記溶媒としては水が好ましく用いられる。このアルギン酸溶液を、任意の形状の型に入れて−５〜−１９６℃で凍結する。上記溶媒としては水が好ましく用いられる。
【００３０】
アルギン酸溶液を凍結する際に用いる型の形状は、高分子複合体の使用目的に応じて適宜選択することができ、例えば移植用組織再生基材の担体として用いる場合は、移植する部位の形状に合わせた型を作製して用いればよい。
【００３１】
なお、シリカを含む材料を配合する場合は、シリカ濃度として、０．１〜１０．０ｗｔ％、好ましくは１．０〜４．０ｗｔ％となるように配合すればよい。
【００３２】
２）高分子化合物Ｂ溶液の調製
オリゴキトサンを、ＤＭＳＯ、ジメチルアセトアミド等の溶媒、好ましくはＤＭＳＯに、濃度が０．１〜２０．０ｗｔ％、好ましくは０．５〜４．０ｗｔ％となるように溶解してオリゴキトサン溶液を調製する。
【００３３】
本発明においては、オリゴキトサンを溶解する溶媒として、上記の溶媒に加えて、凝固点降下作用を有する溶媒を含む溶媒を用いることが好ましい。この凝固点降下作用を有する溶媒としては、エタノール、クロロホルム、メタノール、アセトン等が例示でき、その添加量は、１０．０〜８０．０ｖｏｌ％が好ましく、２０．０〜６０．０ｖｏｌ％がより好ましい。このような溶媒を添加することにより、オリゴキトサン溶液を低温度に保つことができるので、アルギン酸とオリゴキトサンの反応が、アルギン酸溶液の凍結物の表面から内部へと徐々に進行し、ゲル化を均一に行うことができる。
【００３４】
なお、上記のアルギン酸溶液にシリカを配合した場合は、オリゴキトサン溶液に、必要に応じてシランカップリング剤を０．１〜１０．０ｗｔ％、好ましくは０．５〜５．０ｗｔ％配合すればよい。
【００３５】
３）ゲル化
上記アルギン酸溶液の凍結物を、上記オリゴキトサン溶液に浸漬してゲル化する。反応時間はアルギン酸溶液の凍結物の形状等によって変わるため一概には決定できないが、通常、−１０〜−３０℃で１８〜３６時間行うことが好ましい。ゲル化する際の温度が高すぎると凍結物が融解し、任意の形状が得られない。
【００３６】
４）高分子複合体の乾燥
上記のようにして得られた高分子複合体は、真空凍結乾燥することにより多孔体とすることができる。真空凍結乾燥は、得られた高分子複合体を凍結し、真空条件下（０．０２〜０．５Torr）、−１９６〜６０℃で１〜１６８時間乾燥すればよい。
【００３７】
上記のようにして得られた高分子複合体は、動物細胞培養用の担体、特に移植用組織再生基材の担体として好適に用いることができる。
【００３８】
上記高分子複合体を担体として用いて動物細胞の培養を行う場合は、例えば以下のようにして行うことができる。
【００３９】
まず、真空凍結乾燥して得られた高分子複合体の洗浄、及び該高分子複合体中の未反応のアルギン酸を完全に反応させるために、エタノール、水、アセトン及びそれらの混合液等に、−３０〜２０℃で５〜３０分間浸漬し、真空凍結乾燥を行う。次に、１００ｍＭ塩化カルシウム−７０％エタノール水溶液に５分〜２４時間浸漬し、再度真空凍結乾燥を行った後、蒸留水に浸漬して再度真空凍結乾燥を行う。
【００４０】
このようにして得られた高分子複合体は、７０ｖｏｌ％エタノール溶液に浸漬して滅菌した後、培地に浸漬してエタノールを除去・置換した後、動物細胞を播種し、常法にしたがって培養すればよい。
【００４１】
培養に用いることができる動物細胞としては、哺乳動物の細胞が好ましく、具体的には、骨細胞、皮膚細胞、軟骨細胞、肝細胞、膵細胞、繊維芽細胞、幹細胞、骨髄細胞等が例示できる。
【００４２】
なお、上記の例では、アニオン性高分子化合物であるアルギン酸の溶液を凍結し、これをカチオン性高分子化合物であるオリゴキトサンの溶液に浸漬してゲル化しているが、カチオン性高分子化合物であるオリゴキトサンの溶液を凍結し、これをアニオン性高分子化合物であるアルギン酸の溶液に浸漬してゲル化させることも可能である。
【実施例１】
【００４３】
以下の高分子化合物溶液を調製して用いた。
【００４４】
高分子化合物Ａ溶液：２ｗｔ％アルギン酸水溶液
高分子化合物Ｂ溶液：エタノールとＤＭＳＯを等量で混合した溶媒に、濃度が２ｗｔ％になるようにオリゴキトサンを溶解したもの
【００４５】
上記高分子化合物Ａ溶液０．６６ｇを直径１８ｍｍの円盤状の鋳型に入れて−２０℃で凍結させた。これを鋳型から取り出し、−２０℃に冷却した上記高分子化合物Ｂ溶液に一晩浸してゲル化した後、真空凍結乾燥を行い、高分子複合体（オリゴキトサン−アルギン酸複合体）を得た。
【００４６】
得られた高分子複合体を、洗浄及び未反応のアルギン酸を完全に反応させる目的で、エタノールに浸漬して真空凍結乾燥を行った。次に、１００ｍＭ塩化カルシウム−７０％エタノール水溶液に３時間浸漬した後、再度真空凍結乾燥を行い、更に蒸留水に浸漬して再度真空凍結乾燥を行った。
【００４７】
このようにして得られた多孔質の高分子複合体を滅菌した後、動物細胞培養用の担体として用いて以下の方法で細胞毒性試験による評価を行った。
【００４８】
前培養しておいたチャイニーズハムスター卵巣由来細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１，ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）を、Ｈａｍ's Ｆ−１２培地に１０ｖｏｌ％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、７５ｍｇ／Ｌのペニシリン、５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを加えｐＨ７．４に調整した培地に、細胞密度が５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３となるように懸濁し、細胞懸濁液を調整した。
【００４９】
高分子複合体を入れた１２穴細胞培養プレート（ファルコン製）に、上記細胞懸濁液を１ｍｌずつ播種（５×１０４ ｃｅｌｌｓ／穴）して、５％炭酸ガス、飽和水蒸気下、３７℃で培養した。
【００５０】
そして、トリプシン処理により剥離した細胞をトリパンブルー染色し、血球計算盤により細胞数を測定し、細胞密度を求めた。また、培養前後の担体の様子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。それらの結果を合わせて図１に示す。
【００５１】
図１に示すように、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞密度は培養開始７日後に４×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３にまで達し、その後培養開始１４日後まで安定に推移した。これにより、本実施例で得られた高分子複合体は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する細胞毒性がないことが判明した。
【００５２】
また、培養開始前及び培養開始１４日後の高分子複合体をＳＥＭで観察したところ、この高分子複合体は約５０μｍの細孔を有する多孔体であり、細胞が十分に接着していることも判明した（図１参照）。
【００５３】
以上の結果から、本実施例で得られた高分子複合体（オリゴキトサン−アルギン酸複合体）は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養用担体として適していることが示された。
【実施例２】
【００５４】
実施例１と同様にして製造した高分子複合体（オリゴキトサン−アルギン酸複合体）を用いて、以下のようにして軟骨細胞の培養試験を行った。
【００５５】
牛の前肢先端５０ｃｍの部位を切断してよく洗浄した後、さらに骨に沿って血管を絞ることでサンプルから血を抜き、７０ｖｏｌ％エタノール水溶液で洗浄及び滅菌した。次に、くるぶし周辺の皮膚及び筋肉を剥ぎ取り、冠関節の関節包を関節腔に沿って切開し、腱を切断することで関節を外した。周囲の組織を削ぎ落とし、基節骨及び中節骨先端の軟骨を露出させた。軟骨を薄く削り、ディッシュに入れたＫＲＨ緩衝溶液（ＨＥＰＥＳ ４．７６ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ７．９５ｇ／Ｌ，ＫＣｌ ０．３５３ｇ／Ｌ，ＣａＣｌ２ ０．３７ｇ／Ｌ，ｐＨ７．４ オートクレーブ滅菌済）に浸して細断した。
【００５６】
軟骨を遠沈管に入れ、プロナーゼ（２００ｕｎｉｔ／ｍｌ−培地、濾過滅菌済）１５ｍｌを加えて３時間振とう培養を行った。さらに上澄みを除去し、コラゲナーゼ（３００ｕｎｉｔ／ｍｌ−培地、濾過滅菌済）３０ｍｌを加え、２０時間振とう培養を行った。
【００５７】
なお、上記培地は、１ＬのＤＭＥＭに１ｇのグルコース、４．７６ｇの２−（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル）エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、０．１５ｇのＬ−アスコルビン酸、０．２９８ｇのＬ−グルタミン、３．７ｇの炭酸水素ナトリウム、７５ｍｇのペニシリン、５０ｍｇのストレプトマイシンを加え、ｐＨ７．４に調整し濾過滅菌したものにＦＢＳを２００ｍｌ加えたものを用いた。
【００５８】
次に、未消化組織をセルストレーナ（口径７０ｍｍ）でろ過し、２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。
【００５９】
上澄みを除去し、培地を１５ｍｌ加えて強くピペッティングし、２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。この作業を計２回行った。
【００６０】
上澄みを除去した後、上記培地を適量加えて、上記高分子複合体を浸して常法にしたがって培養を行い、実施例１と同様の方法で細胞数を測定して細胞密度及び生存率を求めた。それらの結果を図２に示す。
【００６１】
図２に示すように、軟骨細胞は培養開始２４時間後及び７２時間後ともに９０％以上の細胞が生存しており、オリゴキトサン−アルギン酸複合体は、軟骨細胞の培養にも適していることが示された。
【実施例３】
【００６２】
骨近傍の軟骨組織の再構築においては、培養担体の表面にハイドロキシアパタイトの存在が重要であるとされている。一方、シリカを含む材料の表面にはそのハイドロキシアパタイトの析出が誘導されることが報告されている。
【００６３】
そこで、骨近傍軟骨組織培養担体として、シリカを含む有機−無機ハイブリッド構造からなる多孔質高分子複合体を作製し、その機能を評価した。
【００６４】
本実施例においては、シリカとしてポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、シランカップリング剤としてメタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＴＭＯＳ）を用い、以下の高分子化合物溶液を調製した。
【００６５】
高分子化合物Ａ溶液：２ｗｔ％アルギン酸−３ｗｔ％ＰＤＭＳ水溶液
高分子化合物Ｂ溶液：エタノールとジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を等量で混合した溶媒に、それぞれの濃度が２ｗｔ％になるようにオリゴキトサンとＭＰＴＭＯＳを溶解したもの
【００６６】
上記の各高分子化合物溶液を用いて実施例１と同様に、凍結、ゲル化、真空凍結乾燥を行い、直径１８ｍｍの円盤状の高分子複合体（オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体）を得た。
【００６７】
得られた高分子複合体は、洗浄及び未反応のアルギン酸を完全に反応させるために、実施例１と同様の処理を行った。
【００６８】
このようにして得られた高分子複合体について、（Ｉ）蛍光Ｘ線分析（ＥＤＸ）及び赤外分光光度（ＦＴ−ＩＲ）を用いた高分子複合体中に含まれる元素及び結合状態の解析、（ＩＩ）擬似体液中における挙動試験、（ＩＩＩ）細胞毒性試験による評価を行った。
【００６９】
（Ｉ）蛍光Ｘ線分析（ＥＤＸ）及び赤外分光光度（ＦＴ−ＩＲ）を用いた高分子複合体中に含まれる元素及び結合状態の解析
ＥＤＸの結果を図３、ＦＴ−ＩＲの結果を図４に示す。
【００７０】
図３に示すように、ＥＤＸ分析の結果、炭素、酸素、ケイ素、金、パラジウム、カルシウムの５元素が主として含有していることが判明した。また、図４に示すように、ＦＴ−ＩＲ分析の結果、「−酸素−ケイ素-酸素−」結合が含有していることも判明した。
【００７１】
以上の結果から、本実施例で得られた本実施例で得られた高分子複合体（オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体）にはＭＰＴＭＯＳ及びＰＤＭＳが組み込まれていることが示された。
【００７２】
（ＩＩ）擬似体液中における挙動試験
擬似体液中における挙動試験には、炭酸水素ナトリウム、塩化マグネシウム６水和物、炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸水素カリウム３水和物、塩化カルシウム、塩化カリウム、ＨＥＰＥＳで構成されるｐＨ７．４の水溶液を擬似体液として用い、３７℃で３週間担体を浸漬した。
【００７３】
そして、浸漬前後の高分子複合体の様子をＳＥＭ、高分子複合体に含まれる元素をＥＤＸ、結晶構造をＸ線解析（ＸＲＤ）でそれぞれ分析を行った。それらの結果を図５、６に示す。
【００７４】
図５には、擬似体液に２週間浸した高分子複合体のＳＥＭとＥＤＸによる分析結果が合わせて示されており、図５（ａ）は、対照として用いたオリゴキトサン−アルギン酸複合体（実施例１で得られたもの）、（ｂ）は本実施例で得られたオリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体の結果である。
【００７５】
図５に示すように、擬似体液に２週間浸したオリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体（図５（ｂ）参照）には表面に付着物が観察されたが、対照のオリゴキトサン−アルギン酸複合体の表面には何ら付着物が観察されなかった（図５（ａ）参照）。そして、オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体の付着物をＥＤＸで分析したところ、浸す前には検出されなかったリンが検出された。
【００７６】
また、図６にはＸＲＤの分析結果が示されており、図６（ａ）は、対照として用いたオリゴキトサン−アルギン酸複合体（実施例１で得られたもの）、（ｂ）は本実施例で得られたオリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体の結果である。
【００７７】
図６に示すように、オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体では、ハイドロキシアパタイト（ＨＡｐ）を含むピークが検出された。
【００７８】
以上の結果から、本実施例で得られた高分子複合体（オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体）は、体液中におくことによりハイドロキシアパタイトが析出することが判明した。
【００７９】
（ＩＩＩ）細胞毒性試験
細胞毒性試験は実施例１と同様の方法で行った。その結果を図７、８に示す。
【００８０】
図７には、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いた場合の結果が示されている。図７に示すように、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞密度は培養開始７日後に４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３にまで達し、その後培養開始１４日後まで安定に推移した。
【００８１】
この結果から、本実施例で得られた高分子複合体（オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体）は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する細胞毒性が皆無で培養に適していることが示された。
【００８２】
図８には、実施例１と同様の方法で牛前肢の冠関節から採取した軟骨細胞を用いた場合の結果が示されている。図８に示すように、培養開始２４時間後及び７２時間後ともに９０％以上の細胞が生存しており、オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体は、軟骨細胞の培養に適していることが示された。
【００８３】
なお、本実施例（ＩＩＩ）における結果と、実施例１、２における結果との間に有意な差は見られず、シリカを含んでいても軟骨細胞の培養に悪影響を与えることはないことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の製造方法は、複数の高分子化合物を均一に含有する任意の形状を有する高分子複合体の製造に好適に用いることができる。また、得られた高分子複合体は、容易に多孔体とすることができ、動物細胞培養用の担体、特に移植用組織再生基材の担体として好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】オリゴキトサン−アルギン酸複合体を培養担体として用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞を培養した場合における細胞密度の測定結果、及び培養前後の該複合体の様子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した結果を示す図である。
【図２】オリゴキトサン−アルギン酸複合体を培養担体として用いて軟骨細胞を培養した場合における細胞密度及び生存率を測定した結果を示す図である。
【図３】オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体中に含まれる元素を蛍光Ｘ線分析（ＥＤＸ）した結果を示す図である。
【図４】オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体中に含まれる元素の結合状態を赤外分光光度（ＦＴ−ＩＲ）を用いて解析した結果を示す図である。
【図５】オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体とオリゴキトサン−アルギン酸複合体を擬似体液に２週間浸した場合における各複合体の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）と蛍光Ｘ線分析（ＥＤＸ）による分析結果を示す図である。
【図６】擬似体液浸漬前後におけるオリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体とオリゴキトサン−アルギン酸複合体の結晶構造をＸ線解析（ＸＲＤ）した結果を示す図である。
【図７】オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体を培養担体として用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞を培養した場合における細胞密度を測定した結果を示す図である。
【図８】オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体を培養担体として用いて軟骨細胞を培養した場合における細胞密度及び生存率を測定した結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反応性の高い複数の高分子化合物を用いて均質な高分子複合体を製造する方法及び該製造方法によって得られる高分子複合体に関し、更には、該高分子複合体を用いた動物細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトや動物の再生的治療法として、生体外において患者もしくは同種・異種の細胞を人工的な担体上で培養することにより組織を構築し、その生体親和性、機械的強度、生理的機能を獲得した上で、欠損部に移植する方法が用いられるようになっている。
【０００３】
このような治療法においては、組織の生体外再構築をいかに行うかは移植以降の治療と同様大変重要であり、細胞を培養する担体の選択・創製は生体外再構築の成否に大きく関わってくるため、担体として、生体組織を模倣する多孔質の三次元担体の開発が進められている。
【０００４】
従来より、上記担体の材料として、ポリエチレン、ポリスチレンのような化学合成ポリマーのほか、より生体親和性が高く、様々な生理機能を持つとされるコラーゲン、アルギン酸、キチンやキトサン等の利用が提案されており、実際の生体組織のように複数の高分子成分による多孔質担体とすることができれば、より多くの機能を持たせることができ、有効な担体となると考えられている。
【０００５】
例えば、下記特許文献１には、酸性生体高分子と塩基性生体高分子との複合体を少なくともその表面に含む成形物よりなる軟骨細胞培養用の担体が開示されている。そして、酸性生体高分子として、アルギン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸等が例示されており、塩基性生体高分子として、キトサン、ポリリジン、ポリアルギニン等が例示されている。
【０００６】
下記特許文献２には、カチオン性高分子及びアニオン性高分子をそれぞれの濃度が０．１〜３０重量％となるように塩類を含む水系媒体に相溶させた高分子相溶溶液の塩類の濃度を低下させることにより、上記のカチオン性高分子及びアニオン性高分子の複合体を形成させる高分子複合体の製造方法について開示されている。
【０００７】
下記特許文献３には、キトサンを含む高分子含水ゲルを含む細胞培養担体であって、該高分子含水ゲルがコラーゲン及び／又はアルギン酸で被覆された細胞培養担体が開示されている。そして、キトサンのゲル化方法の一つとして、アルギン酸等のアニオン性高分子化合物を用いてイオン結合による架橋を行うことが記載されている。
【特許文献１】特開２００２−２９１４６１号公報
【特許文献２】特開２００４−２４９０号公報
【特許文献３】特開２００４−１４１０５３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記のような従来の方法では、反応性の高い複数の高分子化合物を均一に含む高分子複合体を得ることは困難であった。すなわち、キトサン等のカチオン性高分子化合物とアルギン酸等のアニオン性高分子化合物を混合すると、溶液中で瞬時にポリイオンコンプレックスを形成してゲル化してしまうため、混合溶液中に固まりが生じたり、複合化していないカチオン性高分子化合物やアニオン性高分子化合物が残りやすく、均質な高分子複合体を得ることが困難であった。
【０００９】
また、高分子複合体を多孔質体とするための方法として、高分子化合物溶液を発泡させながらゲル化させる方法や、高分子化合物溶液に孔源としてＮａＣｌ粒を添加してゲル化し、後からＮａＣｌを除去する方法等が知られているが、前者の方法では、ポリイオンコンプレックスが強固であるため、泡で均一に孔をあけることは難しく、後者の方法では、高分子複合体構築後にＮａＣｌ粒を取り除くことが困難である等の問題があった。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、反応性の高い複数の高分子化合物を用いて、これらの高分子化合物を均一に含み、任意の形状とすることができ、更には容易に多孔体とすることができる高分子複合体を製造する方法及び該製造方法によって得られる高分子複合体を提供することにあり、更には、該高分子複合体を用いた動物細胞の培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち、本発明の高分子複合体の製造方法は、相互に反応する２種類の高分子化合物のうち、一つの高分子化合物Ａを溶媒に溶解した高分子化合物Ａ溶液を任意の形状に凍結し、この高分子化合物Ａ溶液の凍結物を、もう一つの高分子化合物Ｂを前記溶媒と相溶性のある溶媒に溶解した高分子化合物Ｂ溶液に浸漬することによりゲル化することを特徴とする。
【００１２】
本発明の製造方法によれば、相互に反応する２種類の高分子化合物のうち、一つの高分子化合物Ａを溶媒に溶解した高分子化合物Ａ溶液を任意の形状に凍結することにより、使用目的に応じた様々な形状の高分子複合体を得ることができる。
【００１３】
そして、この高分子化合物Ａ溶液の凍結物を、もう一つの高分子化合物Ｂを前記溶媒と相溶性のある溶媒に溶解した高分子化合物Ｂ溶液に浸漬することにより、前記凍結物は、前記高分子化合物Ｂ溶液の界面から溶解して、その界面で高分子化合物Ａと高分子化合物Ｂが反応してゲル化する。そして、前記凍結物の内部に溶媒が浸透することにより、その界面が該凍結物内部に移動し、順次湿潤ゲル化する。その結果、複数の高分子化合物を均一に含有する任意の形状の高分子複合体を容易に得ることができる。
【００１４】
上記発明においては、前記高分子化合物Ｂを溶解する溶媒として、前記溶媒と相溶性のある溶媒と凝固点降下作用を有する溶媒の混合溶媒を用いることが好ましい。これによれば、前記高分子化合物Ｂ溶液を低温度に保つことができるので、前記高分子化合物Ａと前記高分子化合物Ｂの反応が、前記高分子化合物Ａ溶液の凍結物の表面から内部へと徐々に進行し、ゲル化を均一に行うことができる。
【００１５】
また、ゲル化した前記高分子複合体を真空凍結乾燥することにより多孔体とすることが好ましい。これによれば、ゲル化した高分子複合体に含まれる溶媒を除去し、簡単に多孔質の高分子複合体を得ることができる。
【００１６】
更に、前記相互に反応する２種類の高分子化合物として、アニオン性高分子化合物とカチオン性高分子化合物を用いることが好ましく、前記アニオン性高分子化合物としてアルギン酸を用い、前記カチオン性高分子化合物としてオリゴキトサンを用いることが好ましい。これらによれば、より生体親和性が高く、動物細胞培養用の担体、特に移植用組織再生基材の担体として好適に用いることができる高分子複合体を得ることができる。
【００１７】
また、本発明の動物細胞の培養方法は、前記高分子複合体を担体として用いて動物細胞の培養を行うことを特徴とし、前記動物細胞として、骨細胞、皮膚細胞、軟骨細胞、肝細胞、膵細胞、繊維芽細胞、幹細胞及び骨髄細胞からなる群より選ばれた１種が好ましく用いられる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、複数の高分子化合物を均一に含有する任意の形状の高分子複合体を容易に得ることができる。この高分子複合体は、容易に多孔体とすることができ、動物細胞培養用の担体、特に移植用組織再生基材の担体として好適に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明において用いられる相互に反応する２種類の高分子化合物の組み合わせとしては、アニオン性高分子化合物とカチオン性高分子化合物の組み合わせが好ましく用いられる。
【００２０】
ここで、アニオン性高分子化合物とは、官能基としてアニオン性を発揮する官能基を有する高分子をいう。アニオン性高分子化合物としては、例えば、アルギン酸、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルキチン、ポリアクリル酸、ポリスチレンスルホン酸等を用いることができ、中でもアルギン酸が好ましく用いられる。
【００２１】
アルギン酸は、コンブやワカメ等に代表される褐藻類に含まれている天然多糖類であり、Ｄ−マンヌロン酸とＬ−グルコン酸で構成されている。本発明では、上記褐藻類から常法にしたがって抽出したものを用いてもよく、市販のアルギン酸を使用することもできる。また、アルギン酸のＭ／Ｇ比（Ｄ−マンヌロン酸とＬ−グルコン酸の比率）は、特に限定されることなく用いる事が出来るが、例えば０．３〜２．５のものを用いる事が出来る。
【００２２】
また、上記カチオン性高分子とは、官能基としてカチオン性を発揮する官能基を有する高分子をいう。カチオン性高分子化合物としては、例えば、オリゴキトサン、ポリリシン、ポリビニルアミン、アミノ化セルロース等を用いることができ、中でもオリゴキトサンが好ましく用いられる。
【００２３】
本発明でいうオリゴキトサンとは、Ｄ−グルコサミンがβ‐１、４結合したカチオン性高分子であるキトサンについて、特に分子量が数百〜数万と比較的小さいものを意味する。その入手経路については特に限定されないが、例えば、カニやエビ等の甲殻類の殻を脱灰、脱タンパク処理して得られるキチンに対して、更に脱アセチル処理をして得られるキトサンを酵素、酸、アルカリ等を用いて低分子化させることにより得る事が出来る。また、上記オリゴキトサンは市販されているものを用いてもよく、「ＣＯＳ−ＹＳ（商品名；焼津水産化学工業株式会社製）」等が挙げられる。
【００２４】
本発明において好ましく用いられるオリゴキトサンは分子量１，０００〜１００，０００、脱アセチル化度７０〜１００％であり、より好ましくは分子量５，０００〜５０，０００、脱アセチル化度８０〜１００％である。
【００２５】
また、本発明の高分子複合体は、上記の基本的成分の他に、シリカ（Si）、チタニア（Ti）等の無機化合物を含む材料や、糖鎖等を含むことができる。
【００２６】
例えば、シリカを含む材料としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、トリメトキシシラン（ＴＭＯＳ）、ヘキシルトリメトキシシラン（ＨＴＭＯＳ）、ジメチルジメトキシシラン（ＤＭＤＯＳ）等を用いることができ、その場合、シランカップリング剤として、メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＴＭＯＳ）、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、ビニルメトキシシラン、アクリロキシプロピルトリメトキシシラン等を使用することができる。シリカを含む材料の表面にはハイドロキシアパタイトの析出が誘導されることが報告されており、シリカを含む有機−無機ハイブリッド構造からなる高分子複合体とすることにより、骨近傍軟骨組織培養担体等として好適な高分子複合体とすることができる。
【００２７】
上記の高分子化合物を溶解する溶媒は、使用する高分子化合物に応じて適宜選択すればよく、各高分子化合物を溶解でき、かつ相溶性のある溶媒であれば特に制限なく用いることができる。具体的には、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、ジメチルアセトアミド、ジオキサン、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロキシフラン、ジメチルホルムアミド等が例示できる。
【００２８】
以下、本発明の高分子複合体の製造方法について、アルギン酸とオリゴキトサンを用いた例を挙げて説明する。
【００２９】
１）高分子化合物Ａ溶液の調製
アルギン酸を溶媒中に濃度が０．１〜１０.０ｗｔ％、好ましくは２．０〜５．０ｗｔ％となるように溶解してアルギン酸溶液を調製する。上記溶媒としては水が好ましく用いられる。このアルギン酸溶液を、任意の形状の型に入れて−５〜−１９６℃で凍結する。上記溶媒としては水が好ましく用いられる。
【００３０】
アルギン酸溶液を凍結する際に用いる型の形状は、高分子複合体の使用目的に応じて適宜選択することができ、例えば移植用組織再生基材の担体として用いる場合は、移植する部位の形状に合わせた型を作製して用いればよい。
【００３１】
なお、シリカを含む材料を配合する場合は、シリカ濃度として、０．１〜１０．０ｗｔ％、好ましくは１．０〜４．０ｗｔ％となるように配合すればよい。
【００３２】
２）高分子化合物Ｂ溶液の調製
オリゴキトサンを、ＤＭＳＯ、ジメチルアセトアミド等の溶媒、好ましくはＤＭＳＯに、濃度が０．１〜２０．０ｗｔ％、好ましくは０．５〜４．０ｗｔ％となるように溶解してオリゴキトサン溶液を調製する。
【００３３】
本発明においては、オリゴキトサンを溶解する溶媒として、上記の溶媒に加えて、凝固点降下作用を有する溶媒を含む溶媒を用いることが好ましい。この凝固点降下作用を有する溶媒としては、エタノール、クロロホルム、メタノール、アセトン等が例示でき、その添加量は、１０．０〜８０．０ｖｏｌ％が好ましく、２０．０〜６０．０ｖｏｌ％がより好ましい。このような溶媒を添加することにより、オリゴキトサン溶液を低温度に保つことができるので、アルギン酸とオリゴキトサンの反応が、アルギン酸溶液の凍結物の表面から内部へと徐々に進行し、ゲル化を均一に行うことができる。
【００３４】
なお、上記のアルギン酸溶液にシリカを配合した場合は、オリゴキトサン溶液に、必要に応じてシランカップリング剤を０．１〜１０．０ｗｔ％、好ましくは０．５〜５．０ｗｔ％配合すればよい。
【００３５】
３）ゲル化
上記アルギン酸溶液の凍結物を、上記オリゴキトサン溶液に浸漬してゲル化する。反応時間はアルギン酸溶液の凍結物の形状等によって変わるため一概には決定できないが、通常、−１０〜−３０℃で１８〜３６時間行うことが好ましい。ゲル化する際の温度が高すぎると凍結物が融解し、任意の形状が得られない。
【００３６】
４）高分子複合体の乾燥
上記のようにして得られた高分子複合体は、真空凍結乾燥することにより多孔体とすることができる。真空凍結乾燥は、得られた高分子複合体を凍結し、真空条件下（０．０２〜０．５Torr）、−１９６〜６０℃で１〜１６８時間乾燥すればよい。
【００３７】
上記のようにして得られた高分子複合体は、動物細胞培養用の担体、特に移植用組織再生基材の担体として好適に用いることができる。
【００３８】
上記高分子複合体を担体として用いて動物細胞の培養を行う場合は、例えば以下のようにして行うことができる。
【００３９】
まず、真空凍結乾燥して得られた高分子複合体の洗浄、及び該高分子複合体中の未反応のアルギン酸を完全に反応させるために、エタノール、水、アセトン及びそれらの混合液等に、−３０〜２０℃で５〜３０分間浸漬し、真空凍結乾燥を行う。次に、１００ｍＭ塩化カルシウム−７０％エタノール水溶液に５分〜２４時間浸漬し、再度真空凍結乾燥を行った後、蒸留水に浸漬して再度真空凍結乾燥を行う。
【００４０】
このようにして得られた高分子複合体は、７０ｖｏｌ％エタノール溶液に浸漬して滅菌した後、培地に浸漬してエタノールを除去・置換した後、動物細胞を播種し、常法にしたがって培養すればよい。
【００４１】
培養に用いることができる動物細胞としては、哺乳動物の細胞が好ましく、具体的には、骨細胞、皮膚細胞、軟骨細胞、肝細胞、膵細胞、繊維芽細胞、幹細胞、骨髄細胞等が例示できる。
【００４２】
なお、上記の例では、アニオン性高分子化合物であるアルギン酸の溶液を凍結し、これをカチオン性高分子化合物であるオリゴキトサンの溶液に浸漬してゲル化しているが、カチオン性高分子化合物であるオリゴキトサンの溶液を凍結し、これをアニオン性高分子化合物であるアルギン酸の溶液に浸漬してゲル化させることも可能である。
【実施例１】
【００４３】
以下の高分子化合物溶液を調製して用いた。
【００４４】
高分子化合物Ａ溶液：２ｗｔ％アルギン酸水溶液
高分子化合物Ｂ溶液：エタノールとＤＭＳＯを等量で混合した溶媒に、濃度が２ｗｔ％になるようにオリゴキトサンを溶解したもの
【００４５】
上記高分子化合物Ａ溶液０．６６ｇを直径１８ｍｍの円盤状の鋳型に入れて−２０℃で凍結させた。これを鋳型から取り出し、−２０℃に冷却した上記高分子化合物Ｂ溶液に一晩浸してゲル化した後、真空凍結乾燥を行い、高分子複合体（オリゴキトサン−アルギン酸複合体）を得た。
【００４６】
得られた高分子複合体を、洗浄及び未反応のアルギン酸を完全に反応させる目的で、エタノールに浸漬して真空凍結乾燥を行った。次に、１００ｍＭ塩化カルシウム−７０％エタノール水溶液に３時間浸漬した後、再度真空凍結乾燥を行い、更に蒸留水に浸漬して再度真空凍結乾燥を行った。
【００４７】
このようにして得られた多孔質の高分子複合体を滅菌した後、動物細胞培養用の担体として用いて以下の方法で細胞毒性試験による評価を行った。
【００４８】
前培養しておいたチャイニーズハムスター卵巣由来細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１，ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）を、Ｈａｍ's Ｆ−１２培地に１０ｖｏｌ％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、７５ｍｇ／Ｌのペニシリン、５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを加えｐＨ７．４に調整した培地に、細胞密度が５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３となるように懸濁し、細胞懸濁液を調整した。
【００４９】
高分子複合体を入れた１２穴細胞培養プレート（ファルコン製）に、上記細胞懸濁液を１ｍｌずつ播種（５×１０４ ｃｅｌｌｓ／穴）して、５％炭酸ガス、飽和水蒸気下、３７℃で培養した。
【００５０】
そして、トリプシン処理により剥離した細胞をトリパンブルー染色し、血球計算盤により細胞数を測定し、細胞密度を求めた。また、培養前後の担体の様子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。それらの結果を合わせて図１に示す。
【００５１】
図１に示すように、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞密度は培養開始７日後に４×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３にまで達し、その後培養開始１４日後まで安定に推移した。これにより、本実施例で得られた高分子複合体は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する細胞毒性がないことが判明した。
【００５２】
また、培養開始前及び培養開始１４日後の高分子複合体をＳＥＭで観察したところ、この高分子複合体は約５０μｍの細孔を有する多孔体であり、細胞が十分に接着していることも判明した（図１参照）。
【００５３】
以上の結果から、本実施例で得られた高分子複合体（オリゴキトサン−アルギン酸複合体）は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養用担体として適していることが示された。
【実施例２】
【００５４】
実施例１と同様にして製造した高分子複合体（オリゴキトサン−アルギン酸複合体）を用いて、以下のようにして軟骨細胞の培養試験を行った。
【００５５】
牛の前肢先端５０ｃｍの部位を切断してよく洗浄した後、さらに骨に沿って血管を絞ることでサンプルから血を抜き、７０ｖｏｌ％エタノール水溶液で洗浄及び滅菌した。次に、くるぶし周辺の皮膚及び筋肉を剥ぎ取り、冠関節の関節包を関節腔に沿って切開し、腱を切断することで関節を外した。周囲の組織を削ぎ落とし、基節骨及び中節骨先端の軟骨を露出させた。軟骨を薄く削り、ディッシュに入れたＫＲＨ緩衝溶液（ＨＥＰＥＳ ４．７６ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ７．９５ｇ／Ｌ，ＫＣｌ ０．３５３ｇ／Ｌ，ＣａＣｌ２ ０．３７ｇ／Ｌ，ｐＨ７．４ オートクレーブ滅菌済）に浸して細断した。
【００５６】
軟骨を遠沈管に入れ、プロナーゼ（２００ｕｎｉｔ／ｍｌ−培地、濾過滅菌済）１５ｍｌを加えて３時間振とう培養を行った。さらに上澄みを除去し、コラゲナーゼ（３００ｕｎｉｔ／ｍｌ−培地、濾過滅菌済）３０ｍｌを加え、２０時間振とう培養を行った。
【００５７】
なお、上記培地は、１ＬのＤＭＥＭに１ｇのグルコース、４．７６ｇの２−（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル）エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、０．１５ｇのＬ−アスコルビン酸、０．２９８ｇのＬ−グルタミン、３．７ｇの炭酸水素ナトリウム、７５ｍｇのペニシリン、５０ｍｇのストレプトマイシンを加え、ｐＨ７．４に調整し濾過滅菌したものにＦＢＳを２００ｍｌ加えたものを用いた。
【００５８】
次に、未消化組織をセルストレーナ（口径７０ｍｍ）でろ過し、２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。
【００５９】
上澄みを除去し、培地を１５ｍｌ加えて強くピペッティングし、２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。この作業を計２回行った。
【００６０】
上澄みを除去した後、上記培地を適量加えて、上記高分子複合体を浸して常法にしたがって培養を行い、実施例１と同様の方法で細胞数を測定して細胞密度及び生存率を求めた。それらの結果を図２に示す。
【００６１】
図２に示すように、軟骨細胞は培養開始２４時間後及び７２時間後ともに９０％以上の細胞が生存しており、オリゴキトサン−アルギン酸複合体は、軟骨細胞の培養にも適していることが示された。
【実施例３】
【００６２】
骨近傍の軟骨組織の再構築においては、培養担体の表面にハイドロキシアパタイトの存在が重要であるとされている。一方、シリカを含む材料の表面にはそのハイドロキシアパタイトの析出が誘導されることが報告されている。
【００６３】
そこで、骨近傍軟骨組織培養担体として、シリカを含む有機−無機ハイブリッド構造からなる多孔質高分子複合体を作製し、その機能を評価した。
【００６４】
本実施例においては、シリカとしてポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、シランカップリング剤としてメタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＴＭＯＳ）を用い、以下の高分子化合物溶液を調製した。
【００６５】
高分子化合物Ａ溶液：２ｗｔ％アルギン酸−３ｗｔ％ＰＤＭＳ水溶液
高分子化合物Ｂ溶液：エタノールとジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を等量で混合した溶媒に、それぞれの濃度が２ｗｔ％になるようにオリゴキトサンとＭＰＴＭＯＳを溶解したもの
【００６６】
上記の各高分子化合物溶液を用いて実施例１と同様に、凍結、ゲル化、真空凍結乾燥を行い、直径１８ｍｍの円盤状の高分子複合体（オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体）を得た。
【００６７】
得られた高分子複合体は、洗浄及び未反応のアルギン酸を完全に反応させるために、実施例１と同様の処理を行った。
【００６８】
このようにして得られた高分子複合体について、（Ｉ）蛍光Ｘ線分析（ＥＤＸ）及び赤外分光光度（ＦＴ−ＩＲ）を用いた高分子複合体中に含まれる元素及び結合状態の解析、（ＩＩ）擬似体液中における挙動試験、（ＩＩＩ）細胞毒性試験による評価を行った。
【００６９】
（Ｉ）蛍光Ｘ線分析（ＥＤＸ）及び赤外分光光度（ＦＴ−ＩＲ）を用いた高分子複合体中に含まれる元素及び結合状態の解析
ＥＤＸの結果を図３、ＦＴ−ＩＲの結果を図４に示す。
【００７０】
図３に示すように、ＥＤＸ分析の結果、炭素、酸素、ケイ素、金、パラジウム、カルシウムの５元素が主として含有していることが判明した。また、図４に示すように、ＦＴ−ＩＲ分析の結果、「−酸素−ケイ素-酸素−」結合が含有していることも判明した。
【００７１】
以上の結果から、本実施例で得られた本実施例で得られた高分子複合体（オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体）にはＭＰＴＭＯＳ及びＰＤＭＳが組み込まれていることが示された。
【００７２】
（ＩＩ）擬似体液中における挙動試験
擬似体液中における挙動試験には、炭酸水素ナトリウム、塩化マグネシウム６水和物、炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸水素カリウム３水和物、塩化カルシウム、塩化カリウム、ＨＥＰＥＳで構成されるｐＨ７．４の水溶液を擬似体液として用い、３７℃で３週間担体を浸漬した。
【００７３】
そして、浸漬前後の高分子複合体の様子をＳＥＭ、高分子複合体に含まれる元素をＥＤＸ、結晶構造をＸ線解析（ＸＲＤ）でそれぞれ分析を行った。それらの結果を図５、６に示す。
【００７４】
図５には、擬似体液に２週間浸した高分子複合体のＳＥＭとＥＤＸによる分析結果が合わせて示されており、図５（ａ）は、対照として用いたオリゴキトサン−アルギン酸複合体（実施例１で得られたもの）、（ｂ）は本実施例で得られたオリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体の結果である。
【００７５】
図５に示すように、擬似体液に２週間浸したオリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体（図５（ｂ）参照）には表面に付着物が観察されたが、対照のオリゴキトサン−アルギン酸複合体の表面には何ら付着物が観察されなかった（図５（ａ）参照）。そして、オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体の付着物をＥＤＸで分析したところ、浸す前には検出されなかったリンが検出された。
【００７６】
また、図６にはＸＲＤの分析結果が示されており、図６（ａ）は、対照として用いたオリゴキトサン−アルギン酸複合体（実施例１で得られたもの）、（ｂ）は本実施例で得られたオリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体の結果である。
【００７７】
図６に示すように、オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体では、ハイドロキシアパタイト（ＨＡｐ）を含むピークが検出された。
【００７８】
以上の結果から、本実施例で得られた高分子複合体（オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体）は、体液中におくことによりハイドロキシアパタイトが析出することが判明した。
【００７９】
（ＩＩＩ）細胞毒性試験
細胞毒性試験は実施例１と同様の方法で行った。その結果を図７、８に示す。
【００８０】
図７には、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いた場合の結果が示されている。図７に示すように、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞密度は培養開始７日後に４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３にまで達し、その後培養開始１４日後まで安定に推移した。
【００８１】
この結果から、本実施例で得られた高分子複合体（オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体）は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する細胞毒性が皆無で培養に適していることが示された。
【００８２】
図８には、実施例１と同様の方法で牛前肢の冠関節から採取した軟骨細胞を用いた場合の結果が示されている。図８に示すように、培養開始２４時間後及び７２時間後ともに９０％以上の細胞が生存しており、オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体は、軟骨細胞の培養に適していることが示された。
【００８３】
なお、本実施例（ＩＩＩ）における結果と、実施例１、２における結果との間に有意な差は見られず、シリカを含んでいても軟骨細胞の培養に悪影響を与えることはないことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の製造方法は、複数の高分子化合物を均一に含有する任意の形状を有する高分子複合体の製造に好適に用いることができる。また、得られた高分子複合体は、容易に多孔体とすることができ、動物細胞培養用の担体、特に移植用組織再生基材の担体として好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】オリゴキトサン−アルギン酸複合体を培養担体として用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞を培養した場合における細胞密度の測定結果、及び培養前後の該複合体の様子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した結果を示す図である。
【図２】オリゴキトサン−アルギン酸複合体を培養担体として用いて軟骨細胞を培養した場合における細胞密度及び生存率を測定した結果を示す図である。
【図３】オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体中に含まれる元素を蛍光Ｘ線分析（ＥＤＸ）した結果を示す図である。
【図４】オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体中に含まれる元素の結合状態を赤外分光光度（ＦＴ−ＩＲ）を用いて解析した結果を示す図である。
【図５】オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体とオリゴキトサン−アルギン酸複合体を擬似体液に２週間浸した場合における各複合体の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）と蛍光Ｘ線分析（ＥＤＸ）による分析結果を示す図である。
【図６】擬似体液浸漬前後におけるオリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体とオリゴキトサン−アルギン酸複合体の結晶構造をＸ線解析（ＸＲＤ）した結果を示す図である。
【図７】オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体を培養担体として用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞を培養した場合における細胞密度を測定した結果を示す図である。
【図８】オリゴキトサン−アルギン酸−ＭＰＴＭＳ−ＰＤＭＳ複合体を培養担体として用いて軟骨細胞を培養した場合における細胞密度及び生存率を測定した結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
相互に反応する２種類の高分子化合物のうち、一つの高分子化合物Ａを溶媒に溶解した高分子化合物Ａ溶液を任意の形状に凍結し、この高分子化合物Ａ溶液の凍結物を、もう一つの高分子化合物Ｂを前記溶媒と相溶性のある溶媒に溶解した高分子化合物Ｂ溶液に浸漬することによりゲル化することを特徴とする高分子複合体の製造方法。
【請求項２】
前記高分子化合物Ｂを溶解する溶媒として、前記溶媒と相溶性のある溶媒と凝固点降下作用を有する溶媒の混合溶媒を用いる請求項１に記載の高分子複合体の製造方法。
【請求項３】
ゲル化した前記高分子複合体を真空凍結乾燥することにより多孔体とする請求項１又は２に記載の高分子複合体の製造方法。
【請求項４】
前記相互に反応する２種類の高分子化合物として、アニオン性高分子化合物とカチオン性高分子化合物を用いる請求項１〜３のいずれか一つに記載の高分子複合体の製造方法。
【請求項５】
前記アニオン性高分子化合物としてアルギン酸を用い、前記カチオン性高分子化合物としてオリゴキトサンを用いる請求項１〜４のいずれか一つに記載の高分子複合体の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一つに記載の方法により製造された高分子複合体。
【請求項７】
移植用組織再生基材の担体として用いられるものである請求項６に記載の高分子複合体。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の高分子複合体を担体として用いて動物細胞の培養を行うことを特徴とする動物細胞の培養方法。
【請求項９】
前記動物細胞は、骨細胞、皮膚細胞、軟骨細胞、肝細胞、膵細胞、繊維芽細胞、幹細胞及び骨髄細胞からなる群より選ばれた１種である請求項８に記載の動物細胞の培養方法。
【請求項１】
相互に反応する２種類の高分子化合物のうち、一つの高分子化合物Ａを溶媒に溶解した高分子化合物Ａ溶液を任意の形状に凍結し、この高分子化合物Ａ溶液の凍結物を、もう一つの高分子化合物Ｂを前記溶媒と相溶性のある溶媒に溶解した高分子化合物Ｂ溶液に浸漬することによりゲル化することを特徴とする高分子複合体の製造方法。
【請求項２】
前記高分子化合物Ｂを溶解する溶媒として、前記溶媒と相溶性のある溶媒と凝固点降下作用を有する溶媒の混合溶媒を用いる請求項１に記載の高分子複合体の製造方法。
【請求項３】
ゲル化した前記高分子複合体を真空凍結乾燥することにより多孔体とする請求項１又は２に記載の高分子複合体の製造方法。
【請求項４】
前記相互に反応する２種類の高分子化合物として、アニオン性高分子化合物とカチオン性高分子化合物を用いる請求項１〜３のいずれか一つに記載の高分子複合体の製造方法。
【請求項５】
前記アニオン性高分子化合物としてアルギン酸を用い、前記カチオン性高分子化合物としてオリゴキトサンを用いる請求項１〜４のいずれか一つに記載の高分子複合体の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一つに記載の方法により製造された高分子複合体。
【請求項７】
移植用組織再生基材の担体として用いられるものである請求項６に記載の高分子複合体。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の高分子複合体を担体として用いて動物細胞の培養を行うことを特徴とする動物細胞の培養方法。
【請求項９】
前記動物細胞は、骨細胞、皮膚細胞、軟骨細胞、肝細胞、膵細胞、繊維芽細胞、幹細胞及び骨髄細胞からなる群より選ばれた１種である請求項８に記載の動物細胞の培養方法。
【図２】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【図３】
【図５】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【図３】
【図５】
【公開番号】特開２００６−７００５５（Ｐ２００６−７００５５Ａ）
【公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２５１２８６（Ｐ２００４−２５１２８６）
【出願日】平成１６年８月３１日（２００４．８．３１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年３月６日 化学工学会人材育成センター主催の「第６回 化学工学会学生発表会（西日本地区）」において文書をもって発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年７月３０日 化学工学会九州支部若手の会、Ｑ−ＮＥＴ（化学工学会九州支部若手エンジニア連絡会）、西九州化学工学懇話会主催の「第１５回 九州地区若手ケミカルエンジニア討論会」において文書をもって発表
【出願人】（３９００３３１４５）焼津水産化学工業株式会社 (80)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月３１日（２００４．８．３１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年３月６日 化学工学会人材育成センター主催の「第６回 化学工学会学生発表会（西日本地区）」において文書をもって発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年７月３０日 化学工学会九州支部若手の会、Ｑ−ＮＥＴ（化学工学会九州支部若手エンジニア連絡会）、西九州化学工学懇話会主催の「第１５回 九州地区若手ケミカルエンジニア討論会」において文書をもって発表
【出願人】（３９００３３１４５）焼津水産化学工業株式会社 (80)
【Ｆターム（参考）】
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