魚介類細菌性疾病の診断方法
【課題】
マイクロアレイを用いる魚介類細菌性疾病の診断方法の提供。
【解決手段】
特異的な塩基配列をプローブおよびターゲットＤＮＡとして用いたマイクロアレイを作製し、これを用いて魚介類細菌性疾病を診断する方法。ハイブリダイゼーション条件をホルムアミド濃度２０±３％（ｖ／ｖ）、ハイブリダイゼーション温度４２±２℃に設定することで検出感度及び再現性を高めることができる。
マイクロアレイを用いる魚介類細菌性疾病の診断方法の提供。
【解決手段】
特異的な塩基配列をプローブおよびターゲットＤＮＡとして用いたマイクロアレイを作製し、これを用いて魚介類細菌性疾病を診断する方法。ハイブリダイゼーション条件をホルムアミド濃度２０±３％（ｖ／ｖ）、ハイブリダイゼーション温度４２±２℃に設定することで検出感度及び再現性を高めることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚介類細菌性疾病の診断方法に関する。詳しくは、マイクロアレイを用いる魚介類細菌性疾病の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
魚介類養殖業の発展に伴う生産量の増加と養殖対象種の多様化から、魚介類疾病が頻発かつ多様化している。魚病被害の中でも、細菌性疾病は種類が多く、また、商品サイズの大型魚にも被害が及ぼされることから大きな問題となっている。
【０００３】
しかし、これらの魚介類細菌性疾病の診断法は、主に抗血清を用いた凝集試験、細菌用培地を用いた分離培養または各種性状試験等によるため診断精度や検出時間に問題がある（例えば、特許文献１参照）。また、一部の病原菌に対しては、迅速かつ精度の高い方法として、特異的な領域を増幅するＰＣＲ診断法が開発されてきた。しかし、ＰＣＲ診断法は個々の細菌種にしか対応できないため病原菌を網羅的に探索することができないという問題がある。
【０００４】
近年、細菌の検出方法の１つとして、マイクロアレイを用いる方法が注目されている。マイクロアレイを用いる方法とは、既知細菌の塩基配列をスポットしたアレイ基盤に、試料より抽出した塩基配列をハイブリダイゼーションさせて、試料中の細菌を検出する方法であり、主にヒト等の哺乳類の疾病の検出に利用されようとしている（例えば、非特許文献１参照）。このようなマイクロアレイによる細菌の検出は、高額であるうえに、プローブやハイブリダイゼーションの条件を細かく検討することで検出感度および再現性を高めるなどの技術的課題も多い。そのため、魚介類の病原菌の検出を対象としたマイクロアレイは未だ開発されておらず、魚介類細菌性疾病の診断を目的とする高検出感度、低運営費用および再現性の高いマイクロアレイは実用化されていない。
【特許文献１】特開２００３−９３０９４号公報
【非特許文献１】ＤＮＡマイクロアレイを用いた細菌の検出および同定 臨床検査 ４５巻 ７号 ２００１年７月１５日発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の状況に鑑み、本発明は、マイクロアレイを用いる魚介類細菌性疾病の診断方法の提供を第一の課題とする。さらに、本発明は、検出感度および再現性の高い魚介類細菌性疾病の診断方法の提供を第二の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、マイクロアレイの作製にあたり、種々の魚介類の病原菌から特異的な塩基配列をプローブとして選別し、さらにハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーション溶液に含まれるホルムアミド濃度を特定したハイブリダイゼーション条件を規定することで、魚介類の病原菌を短時間にかつ網羅的に検出することを可能とした。そして、この方法により検出感度および再現性の高い魚介類細菌性疾病の診断ができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は次の（１）〜（５）である。
（１）マイクロアレイを用いることを特徴とする魚介類細菌性疾病の診断方法。
（２）魚介類病原菌を検出することを特徴とする上記（１）に記載の魚介類細菌性疾病の 診断方法。
（３）プローブおよびターゲットＤＮＡの塩基配列において、１６ＳｒＲＮＡ領域を用い ることを特徴とする上記（１）または（２）に記載の魚介類細菌性疾病の診断方法。
（４）ハイブリダイゼーション溶液に含まれるホルムアミド濃度２０±３％（ｖ／ｖ）、 ハイブリダイゼーション温度が４２±２℃の条件下でターゲットＤＮＡとマイクロアレ イをハイブリダイゼーションさせることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに 記載の魚介類細菌性疾病の診断方法。
（５）魚介類細菌性疾病の診断方法に用いる上記（１）〜（４）のいずれかに記載のマイ クロアレイ。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のマイクロアレイを用いる魚介類細菌性疾病の診断方法は、迅速かつ網羅的に細菌性の魚介類疾病を診断することを可能とする。この方法を用いた魚介類疾病の診断により、新たな魚病の病原菌を検出することも可能となる。従って、本発明は、魚介類細菌性疾病の早期発見、早期治療による魚病の蔓延防止にきわめて有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明で「プローブ」とは、細菌を確認するためのＤＮＡ、ＲＮＡの塩基配列をいう。本発明においては、診断の対象となる病原菌の１６ＳｒＲＮＡ領域の全塩基配列またはその部分領域の塩基配列をプローブに用いることができるが、特に変異領域を含む１６ＳｒＲＮＡの部分領域を用いることが好ましい。さらに、近縁種の病原菌を判別する場合には、複数の変異領域におのおののプローブを設定することが望ましく、このようなプローブの設定によって病原菌の検出感度を高めることが可能となる。
【００１０】
本発明では、上記のとおり、プローブとしては、１６ＳｒＲＮＡ領域の全体の塩基配列またはその部分領域の塩基配列を用いることができるが、中でも１６ＳｒＲＮＡの変異領域中で、種特異性の高い塩基配列を用いることが特に好ましい。プローブとして用いるオリゴヌクレオチドは、塩基配列がわかれば分離培養が難しい特殊な細菌性疾病の病原菌についても使用することができ、このような塩基配列の情報をもとに、合成業者が合成したオリゴヌクレオチドを使用することもできる。プローブに用いるオリゴヌクレオチドの長さは特に規定はないが、５０ｍｅｒがハイブリダイゼーションにおいても扱いやすく好ましい。このようなオリゴヌクレオチドをプローブに用いる場合、アレイには１．５ｎｇ（０．１ｐｍｏｌ）を含むようにスポットすることで魚介類細菌性疾病の病原菌を十分に検出することができる。
【００１１】
本発明で「マイクロアレイ」とは、ＤＮＡチップとも呼ばれ、ナイロン、ガラスやシリコン等の支持体上に数百〜数万種類のＤＮＡ、ＲＮＡの塩基配列や、その断片をプローブとして結合させたものをいう。アレイ基板の形状は、平板状、円柱状等の任意のものを用いることができ、形状にはとらわれない。本発明においては、初期投資および運用費用の面から、ナイロン膜の上に、目的とする疾病のプローブを載せたものを魚介類細菌性疾病の診断のためのアレイとして作製した。なお、ナイロン膜は核酸検出用の市販品を用いることができる。
【００１２】
ナイロン膜を用いたマイクロアレイの作製においては、プローブのスポットにおいて中性液（ＴＥ緩衝液：ナカライテスク株式会社製等）またはアルカリ液を用いたスポット方法等を使用することができる。アルカリ液を用いた場合、希釈したオリゴヌクレオチド液とアルカリ溶液（０．４Ｎ 水酸化ナトリウム ＋１．５Ｍ 塩化ナトリウム）を混合させて利用するが、混合割合は任意に変化させてよい。この時アルカリ液に０．１％ ＢＰＢ（ｗ／ｖ ＤＷ：ブロモフェノールブルー 日本バイオラッドラボラトリー株式会社製等）溶液を青色がわかる程度に少量加えておくとスポットした場所がわかりやすくてよく、これは中性液（ＴＥ緩衝液）を用いた場合も同様である。スポットしたプローブは、ベーキングまたはＵＶ照射によって、ナイロン膜と結合させることができる。スポットに用いたナイロン膜がプラスチャージの場合には、ベーキングの方がより好ましいとするプロトコールもある。ベーキングの場合は、例えば１２０℃、２０−３０分ベーキングを行うことにより、ＵＶ照射の場合は例えばＵＶ（２５４ｎｍ、１２０ｍＪ／ｃｍ2）を照射することにより、プローブをナイロン膜に結合させることができる。このようにして作製されたマイクロアレイは、室温で長期保存が可能であるため、必要に応じて使用することができる。
【００１３】
本発明の説明において「抽出ＤＮＡ」とは、診断の対象となる病魚、もしくは分離菌等の試料より得られたＤＮＡを指す。これらのＤＮＡは、病魚の臓器からまたは病原菌と思われる菌体から、熱水抽出または「ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫおよびＰｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍを用いたフェノール・クロロホルム法」（フェノールによって試料中のたんぱく質を除去し、親水性のＤＮＡを分離する方法であり、クロロホルムはフェノールの除去のために用いられるＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．Ｅ．３−Ｅ．４．等の方法）もしくはＤＮｅａｓｙ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（登録商標、製品番号６９５０４：キアゲン社）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（登録商標、製品番号７４０９５２．５０：日本ジェネティクス社）等の市販のＤＮＡ抽出キットのいずれかによって得ることができる。腎臓や脾臓等の魚体組織からＤＮＡを得る場合は、フェノール・クロロホルム法または市販のキットによる抽出が好ましく、病原菌が分離培養されてコロニーを形成している場合は、特に簡易法として熱水抽出も有効である。
【００１４】
本発明でいう「ターゲットＤＮＡ」とは、得られた抽出ＤＮＡを鋳型として、ほぼ全種類の真正細菌の１６ＳｒＲＮＡ領域の塩基配列を増幅することが可能なユニバーサルプライマーを用いたＰＣＲによって、１６ＳｒＲＮＡのほぼ全領域またはその部分領域を増幅することで得られたＤＮＡを指す。本発明では、診断の検出感度および再現性を高めるために、得られた１６ＳｒＲＮＡのほぼ全領域またはその部分領域の塩基配列を鋳型として、さらにユニバーサルプライマー用いたＰＣＲを行い、部分領域を増幅することで、調製したターゲットＤＮＡを使用してもよい。
【００１５】
ＰＣＲにおいて用いるユニバーサルプライマーは、ＥｕｂＢ、ＥｕｂＡ、１５００Ｒなどであり、以下の２つの文献に紹介されている。Ｍａｕｅｌ，Ｍ．Ｊ．，Ｓ．Ｊ．Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ ａｎｄ Ｊ．Ｌ．Ｆｒｙｅｒ（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｉｓｃｉｒｉｋｅｔｔｓｉａ Ｓａｌｍｏｎｉｓ.Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅｒｃｈ．Ｎｏ．２６．ｐ１８９−１９５、Ｓｈｏｔａｒｏ Ｉｚｕｍｉ ａｎｄ Ｈｉｓａｔｓｕｇｕ Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ（１９９７）Ｕｓｅ ｏｆ ＰＣＲ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ ｆｒｏｍ Ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｊｕｖｅｎｉｌｅ Ａｙｕ ａｎｄ Ｃｏｈｏ Ｓａｌｍｏｎ Ｅｇｇｓ.Ｆｉｓｈ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｎｏ．３２（３）．ｐ１６９−１７３．さらに、Ｅ３６０ｒなどの独自に設計したユニバーサルプライマーを用いることができ、この場合には、なるべく多くの菌種の１６ＳｒＲＮＡ領域のアライメントを作成し、できる限り共通である塩基配列を選択することが望ましい。これらは合成業者（プロリゴジャパン株式会社など）によって合成したユニバーサルプライマーを使用してもよい。ユニバーサルプライマーは、魚介類細菌性疾病の診断にあたり、目的とする病原菌を検出するために、その塩基配列を増幅できればよく、特に真正細菌１６ＳｒＲＮＡユニバーサルであることが、網羅的な検索において望ましい。
【００１６】
得られたターゲットＤＮＡは、標識することで検出が可能となる。本発明でいう「標識」とは、分光光度的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の組成物を用いてターゲットＤＮＡをラベル化することを指す。本発明では、ターゲットＤＮＡの標識にあたり、有用な標識物質としてジゴキシゲニン（以下、ＤＩＧと略す）を用いることができる。さらに、蛍光色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、緑色蛍光タンパク質等）、放射性物質（例えば、3Ｈ、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃまたは32Ｐ）、酵素（例えば、西洋わさびパーオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）等の標識物質を用いることができる。
【００１７】
「ハイブリダイゼーション」とは、アレイ上のプローブが、ターゲットＤＮＡまたはその一部分と相補的に結合し、二本鎖を形成することを指す。本発明では、結合の条件は、魚介類細菌性疾病の種類や、プローブに含まれる塩基配列等によって調整できるが、一度に複数の魚介類細菌性疾病の病原菌について網羅的に検索するためには検出感度、再現性がともに高い特異的な条件を設定することが好ましい。例えば、プローブまたはターゲットとしてＤＮＡを用いた場合に、複数の病原菌を一度に検出するためには、プローブに用いるオリゴヌクレオチドＤＮＡの多様なＴm値（任意のオリゴヌクレオチドの５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度）を考慮することが好ましい。この場合、ハイブリダイゼーション温度と室温の差が少なく、さらに市販の多くのインキュベーターで処理できる３０〜７０℃がよく、特に４２℃±２℃が好ましい。温度の調整にあたっては、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミド濃度を用いることができ、その濃度はこの場合０〜５０％がよく、特に２０％±３％（ｖ／ｖ）が好ましい。
【００１８】
さらに検出感度、再現性を高めるために、ハイブリダイゼーションの前にプレハイブリダイゼーションを行い、マイクロアレイとハイブリダイゼーション溶液をなじませ、非特異的なハイブリダイゼーションの防止を行うことが望ましい。プレハイブリダイゼーションの時間は、１０分間以上、マイクロアレイにハイブリダイゼーション溶液がよくなじむまで行うことが好ましく、時間の長さにはとらわれない。プレハイブリダイゼーション後のハイブリダイゼーションに用いるターゲットＤＮＡの濃度は、バックグランドが高くなりすぎない程度に、特異的なハイブリダイゼーションが行われる濃度であればよく、ＤＮＡ濃度としては５０〜１００ｎｇ／１ｍｌ（ハイブリダイゼーション溶液）を目安にすることができるが、この濃度から１桁ほど前後してもよい。また、ハイブリダイゼーションを行う時間は、３０分ないし一晩の間行うことができるが、発光したスポットを十分に検出できる時間であればよく、概ね２時間を目安にするとよい。
【００１９】
本発明の細菌性疾病診断の対象となる魚介類としては、コイ、ウナギ、アユ、および、ヤマメ、アマゴ、ヒメマス、ニジマス、ギンザケなどのサケ科魚類等の淡水魚類や、ブリ、ヒラマサ、カンパチなどのブリ類およびマダイ、ヒラメ、マコガレイ、シマアジ、イサキ、アワビ等の海産魚介類を挙げることができる。本発明で診断可能な魚介類細菌性疾病の一例を表１に示すが、本発明はこれに限定されず、診断の対象に応じて疾病の病原菌由来のプローブをマイクロアレイに追加して組み合わせることで、どのような魚介類細菌性疾病も診断することができる。
【００２０】
表１は、本発明者らが２年間にわたって、本発明の実施例１の方法を用いて試験した結果をまとめたものである。
【表１】
【００２１】
以下、本発明の試験例および実施例を示すが、本発明はこれらによって制限されない。
【実施例１】
【００２２】
＜マイクロアレイの作製方法＞
（１）プローブとして用いるオリゴヌクレオチドＤＮＡの調製
魚介類の各種細菌性疾病における既知病原菌について、ＤＮＡシークエンサー（製品型式 ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７７：アプライドバイオシステム社）を用いて１６ＳｒＲＮＡ領域の塩基配列を解読するかまたは遺伝子データーベース（ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋ）より集め、得られた真正細菌の１６ＳｒＲＮＡをアライメントし、特異的な塩基配列を示す変異領域を探索し、プローブとして用いる塩基配列を設定した。塩基配列は、得られた様々な真生細菌の１６ＳｒＲＮＡをアライメントし、変異領域を探索することで設定した。設定にあたり、１６ＳｒＲＮＡのアライメントによって、少しでも多くの変異領域を含むように塩基配列を選択した。そして、これらの１６ＳｒＲＮＡ変異領域に相補的な合成オリゴヌクレオチドＤＮＡ（５０ｍｅｒ）を合成業者（プロリゴジャパン株式会社）に依頼して合成し、プローブとして用いた。
【００２３】
（２）プローブのナイロン膜へのスポット
合成業者にて調製済みの１００μＭ（１００ｐｍｏｌ／μｌ、１．５ｐｇ／μｌ）オリゴＤＮＡ溶液を１／１，０００にＴＥ緩衝液で希釈した希釈オリゴヌクレオチド液１μｌとアルカリ溶液（０．４Ｎ 水酸化ナトリウム＋１．５Ｍ 塩化ナトリウム）または中性液（ＴＥ）４μｌを混ぜてプローブ溶液とした。スポットに用いるプローブごとにプローブ溶液を調製し、１μｌずつナイロン膜（プラスチャージ膜）（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、登録商標：アマシャムバイオサイエンス株式会社）にスポットした。この時それぞれのプローブが１６ＳｒＲＮＡの変異領域に相補的なオリゴヌクレオチドを１．５ｎｇ含むようにナイロン膜上にスポットした。スポット後ナイロン膜を１２０℃、２０−３０分でドライングオーブン（製品型式 ＭＯＶ−２１２Ｓ ：サンヨー電気株式会社）を用いてベーキングを行い、または１２０ｍＪ／ｃｍ3でクロスリンカー（製造型式ＣＬ−１０００ ：ＵＶＰ社）を用いてＵＶクロスリンクを行い、ナイロン膜にプローブを結合させて、魚介類細菌性疾病の診断に利用可能なマイクロアレイを作製した。作製されたマイクロアレイは室温で長期保存可能であり、必要に応じて使用できた。
【実施例２】
【００２４】
＜マイクロアレイを用いた魚介類細菌性疾病の診断方法＞
（１）ターゲットＤＮＡの調製
Ａ．ＤＮＡ抽出
診断に供する魚介類の腎臓を試料としてフェノール・クロロホルム法を行った。試料１００ｍｇを５５℃で２時間静置した後、フェノール・クロロホルムを加え、１０分間穏やかに攪拌した。攪拌後、室温にて遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分間）を行い、水層を新たなチューブへ移し、これと等量のエタノールを加えて軽く攪拌した後、室温にて遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分間）を行って上清を取り除き、ペレットのみにした。ペレットに７０％エタノールを入れて攪拌した後、室温にて遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分間）を行って上清を取り除き、残ったペレットを中性液（ＴＥ緩衝液）２００μｌに溶解することで抽出ＤＮＡを得た。また、診断に供する魚介類の病原菌の分離菌を試料として熱水抽出を行った。分離菌のコロニーをピペットで突いて、１００μｌのＴＥ緩衝液に懸濁させた後、１００℃で１０分間温めて菌体を壊した。室温にて遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分間）して、得られた上清を新たなチューブへ移し、抽出ＤＮＡとして用いた。
【００２５】
Ｂ．ＰＣＲ（１回目）
上記Ａの方法により得た抽出ＤＮＡを鋳型として、配列表配列番号１（ＥｕｂＢ）および配列表配列番号２（ＥｕｂＡ）または配列表配列番号３（１５００Ｒ）に記載のユニバーサルプライマーを用いて、ｉ−ｃｙｃｌｅｒ（登録商標：バイオラッド社）にてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液（Ｔａｋａｒａ Ｔａｑ、登録商標：タカラバイオ株式会社）の組成およびＰＣＲ反応条件を表２に示す。１回目のＰＣＲで１６ＳｒＲＮＡのほぼ全領域について増幅を行った。
【００２６】
【表２】
【００２７】
Ｃ．ＰＣＲ（２回目）およびターゲットＤＮＡの標識
１回目のＰＣＲ後、検出感度および再現性を高めるために、さらに２回目のＰＣＲを行い、同時に標識を行った。２回目のＰＣＲは得られた１６ＳｒＲＮＡ領域を鋳型として配列表配列番号１および配列表配列番号４（Ｅ３６０ｒ）に記載のユニバーサルプライマーを用いて１回目と同じＰＣＲ反応条件で行った。この時ＰＣＲ ＤＩＧラベリングミックス（登録商標、製品番号１５８５５５０：ロシュダイアグノスティクス株式会社）を用いて５’領域の約３００ｂｐの増幅と同時にＤＩＧ標識も行った。ＰＣＲ反応液の組成を表３に示す。こうして増幅および標識された１６ＳｒＲＮＡの部分領域（５’領域の約３００ｂｐ）をターゲットＤＮＡとして病原菌の検出に用いた。
【００２８】
【表３】
【００２９】
（２）病原菌の検出
実施例１で作製したマイクロアレイと、上記（１）で調製したターゲットＤＮＡをプレハイブリダイゼーションした後、ハイブリダイゼーションさせ、ＤＩＧ検出法により、病原菌の検出を行った。
【００３０】
Ａ．プレハイブリダイゼーション
実施例１で作製したマイクロアレイをプラスチックバッグ（製品番号．Ｓ−１０２１：コスモバイオ社）に入れ、マイクロアレイに十分に行き渡る量のハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＣ （０．０２％（ｗ／ｖ）ＳＳＣ：ナカライテスク株式会会社）、０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム（ナカライテクス株式会社）、１％（ｗ／ｖ）ブロック試薬（製造番号１０９６１７６：ロッシュダイアグノスティックス株式会社）、２０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド（ナカライテクス株式会社）を入れてヒートシーラー（製造型式 ＮＬ２０１Ｊ：石崎電気製作所）にてシールをし、インキュベーター（製造型式 ＭＭＳ−１：東京理科器械株式会社）にて４２℃で１０分間以上、マイクロアレイにハイブリダイゼーション溶液がよくなじむまでプレハイブリダイゼーションを行った。
【００３１】
Ｂ．ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションに用いるターゲットＤＮＡの濃度がハイブリダイゼーション溶液１ｍｌあたり１μｌ（５０〜１００ｎｇ）となるように調製を行った。調製したハイブリダイゼーション溶液がプレハイブリダイゼーション後のマイクロアレイに十分に行き渡るように加えて、ヒートシーラーにてシールをし、インキュベーターにて４２℃、２時間のハイブリダイゼーション条件でハイブリダイゼーションを行った。この「ハイブリダイゼーション溶液に含まれるホルムアミドの濃度が２０％（ｖ／ｖ）であって、ハイブリダイゼーション温度が４２℃、反応時間は２時間」というハイブリダイゼーション条件によって、バックグランドが少なく、一度のハイブリダイゼーションにおいて、様々な病原菌を検出することが可能な、適度なハイブリダイゼーションを行うことができた。
【００３２】
Ｃ．マイクロアレイの洗浄
ハイブリダイゼーション終了後のマイクロアレイをプラスチックバッグから取り出し、洗浄を行った。マイクロアレイを洗浄溶液Ａ（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（ナカライテクス株式会社）に入れて１０分間洗浄を行った後、新しい洗浄溶液Ａに取り替えて繰り返し洗浄を行った。洗浄溶液Ａによる洗浄は合計３回行った。さらにマイクロアレイを洗浄溶液Ｂ（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）に入れて１０分間洗浄を行った後、新しい洗浄溶液Ｂに取り替えて繰り返し洗浄を行った。洗浄溶液Ｂによる洗浄は合計２回行った。
【００３３】
Ｄ．検出反応
洗浄後のマイクロアレイをさらに０．３％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０添加ｂｕｆｆｅｒ１（０．１Ｍ マレイン酸（ナカライテクス株式会社、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．５、２０℃））で５分間洗浄し、さらにｂｕｆｆｅｒ２（１％（Ｗ／Ｖ）ブロック試薬／ｂｕｆｆｅｒ１）に３０分間浸した後、検出反応を行った。検出反応はｂｕｆｆｅｒ２に抗ＤＩＧ抗体（製品番号．Ｎｏ．１３３３０８９：ロシュダイアグノスティックス株式会社）を１／５，０００濃度になるように添加した検出反応溶液抗にマイクロアレイを３０分間浸して行った。検出反応終了後、マイクロアレイを取り出し、ｂｕｆｆｅｒ１で１０分間洗浄を行った後、新しいｂｕｆｆｅｒ１に取り替えて繰り返し洗浄を行った。ｂｕｆｆｅｒ１による洗浄は合計３回行った。さらに、マイクロアレイをｂｕｆｆｅｒ３（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、５０ｍＭ 塩化マグネシウム（ｐＨ９．５、２０℃））に入れて５分間洗浄を行った。
【００３４】
Ｅ．病原菌の検出
検出用試薬としてＣＤＰ−ｓｔａｒ（登録商標、製造番号ＲＰＮ３６８２：アマシャムバイオサイエンス株式会社）をマイクロアレイに行き渡る量（約１０μｌ／ｃｍ2）をラップに滴下し、そのＣＤＰ−ｓｔａｒ液上にプローブがスポットされている面を下にしてマイクロアレイを載せた。マイクロアレイを上下に移動して、マイクロアレイ全体に検出用試薬を十分に行き渡らせた後、乾かないようにして数分間放置した。その後、マイクロアレイをプローブがスポットされている面を上にしてポラロイドのホルダーに載せ、ラップでくるみ、ポラロイドフィルム（ポラベン３２００Ｂ、登録商標：日本ポラロイド株式会社）に２０分間露光した。露光が不十分である場合は、さらに数分間露光を行い、マイクロアレイ上で発光したスポットの位置を検出した。
【００３５】
（３）疾病診断
実施例２で検出したマイクロアレイ上の発光したスポットの位置より、プローブとしてスポットされている病原菌を調べ、魚介類細菌性疾病を診断した。
【００３６】
（４）疾病診断の補足
複数の位置に発光したスポットが検出された場合は、発光強度の強いスポットの方が該当する菌であるかまたはその近縁の菌であると考え診断を行った。なお、診断結果の補足としてプローブに含まれる塩基配列のアライメントを行った。また、ターゲットＤＮＡの１６ＳｒＲＮＡ領域の塩基配列を決定し、系統解析を行った。
【実施例３】
【００３７】
＜ヒラメのエドワジエラ症の診断＞
（１）マイクロアレイの作製
マイクロアレイの作製において、表１の魚介類の各種疾病における既知病原菌を検出するため、実施例１の方法により調製したプローブより、ヒラメのエドワジエラ症の診断に用いるプローブを選択した。そして、これらのプローブを実施例２の方法でナイロン膜にスポットし、ヒラメのエドワジエラ症の診断に利用可能なマイクロアレイを作製した。選択したプローブの違いにより、マイクロアレイＡおよびマイクロアレイＢの２種類のマイクロアレイを作製した。これらのマイクロアレイＡおよびマイクロアレイＢにおけるプローブの由来となる病原菌およびスポット位置をそれぞれ図１および図２に示す。
【００３８】
（２）ターゲットＤＮＡの調製
ヒラメのエドワジエラ症原因細菌であるＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａに感染したヒラメの腎臓を試料としてフェノール・クロロホルム法を用いてＤＮＡを抽出し、この抽出ＤＮＡを鋳型として配列表配列番号１、配列表配列番号２に記載のプライマーを用いて実施例２に記載のＰＣＲ反応条件にて１６ＳｒＲＮＡのほぼ全領域を増幅した。得られた１６ＳｒＲＮＡ領域を鋳型として配列表配列番号１、配列表配列番号４に記載のプライマーを用いて実施例２に記載のＰＣＲ反応条件にて２回目のＰＣＲを行い、５’領域の約３００ｂｐの増幅と同時にＤＩＧ標識も行った。こうして増幅および標識されたＤＮＡはターゲットＤＮＡとして病原菌の検出に用いた。
【００３９】
（３）病原菌の検出
上記（１）で作製したマイクロアレイＡおよびＢと、上記（２）で調製したターゲットＤＮＡをそれぞれ実施例２のハイブリダイゼーション方法およびハイブリダイゼーション条件でハイブリダイゼーションさせ、ＤＩＧ検出法により、病原菌の検出を行った。ターゲットＤＮＡは５０〜１００ｎｇ／ｍｌとなるようにハイブリダイゼーション溶液に加え、ハイブリダイゼーション溶液におけるホルムアミド濃度２０％（ｖ／ｖ）として、４２℃で２時間ハイブリダイゼーションを行うことで、アレイ上に発光したスポットを確認した。マイクロアレイＡ・Ｂ上における発光したスポットの位置を図１および図２に示す。
【００４０】
（４）疾病診断
アレイ上の発光したスポットは、マイクロアレイＡではスポット位置１のＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ Ｅ２２ ２５０ｒ由来のプローブに強い発光が確認された。また、マイクロアレイＢではスポット位置５のＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ Ｅ２２ ２５０ｒ由来のプローブに強く発光したが、これはマイクロアレイＡで発光が確認されたプローブと同じプローブであった。さらに、マイクロアレイＢでは、スポット位置２８のＹｅｒｓｉｎｉａ ｒｕｃｋｅｒｉ由来のプローブにも弱い発光が確認されたが、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ Ｅ２２ ２５０ｒ由来のプローブに対する発光が明らかに強いことから、エドワジエラ症の病原菌を特異的に検出していると考えられる。
【００４１】
（５）結果
上記（４）より、本実施例で作製したマイクロアレイＢによって、実験感染魚の疾病がヒラメのエドワジエラ症であることが診断された。従って、本発明の診断方法は、魚介類細菌性疾病の診断において検出感度、再現性ともに十分であることが確認された。
【実施例４】
【００４２】
＜イサキの不明病の診断＞
（１）診断対象の概要
長崎県での原因不明で死亡したイサキを試料とした。イサキの外部には腹部体表の出血と腹鰭を基点とした潰瘍、鰓の出血が観察された。解剖により体表出血部の腹腔内の出血、肝臓の中心性脂肪変性、脾臓の結節（一部膿瘍状）が観察された。ＢＨＩ（ブレインハーインフュージョン）培地（ディフコ社）と７Ｈ１１（ミドルブルック７Ｈ１１）寒天培地（ＢＢＬ社）で、外部潰瘍部と脳、腎臓、脾臓から病原菌の分離を試みたところ、外部潰瘍部からビブリオ様の菌が分離された。
【００４３】
（２）マイクロアレイの作製
マイクロアレイの作製において、表１の魚介類の各種疾病における既知病原菌を検出するため、実施例１の方法により調製したプローブより、イサキ不明病の診断に用いるプローブを選択した。そして、これらのプローブを実施例２の方法でナイロン膜にスポットし、イサキの不明病の診断に利用可能なマイクロアレイＣを作製した。これらのマイクロアレイＣにおけるプローブの由来となる病原菌およびスポット位置を図３に示す。
【００４４】
（３）ターゲットＤＮＡの調製
不明病で死亡したイサキの腎臓からフェノール・クロロホルム法を用いてＤＮＡを抽出し、この抽出ＤＮＡを鋳型として配列表配列番号１、配列表配列番号２に記載のプライマーを用いて実施例２に記載のＰＣＲ反応条件にて１６ＳｒＲＮＡのほぼ全領域を増幅した。得られた１６ＳｒＲＮＡ領域を鋳型として配列表配列番号１、配列表配列番号４に記載のプライマーを用いて実施例２に記載のＰＣＲ反応条件にて２回目のＰＣＲを行い、５’領域の約３００ｂｐの増幅と同時にＤＩＧ標識も行った。こうして増幅および標識されたＤＮＡは、ターゲットＤＮＡとして病原菌の検出に用いた。
【００４５】
（４）病原菌の検出
上記（１）で作製したマイクロアレイＣと、上記（２）で調製したターゲットＤＮＡを実施例２のハイブリダイゼーション方法およびハイブリダイゼーション条件でハイブリダイゼーションさせ、ＤＩＧ検出法により、病原菌の検出を行った。ターゲットＤＮＡは５０〜１００ｎｇ／ｍｌとなるようにハイブリダイゼーション溶液に加え、ハイブリダイゼーション溶液におけるホルムアミド濃度２０％（ｖ／ｖ）として、４２℃で２時間ハイブリダイゼーションを行うことで、アレイ上に発光したスポットを確認した。マイクロアレイＣ上における発光したスポットの位置を図３に示す。
【００４６】
（５）疾病診断
マイクロアレイＣ上の発光したスポットは、スポット位置１５のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａ ２５０ｒ由来のプローブに強い発光が確認された。さらに、スポット位置１のＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ Ｅ２２ ２５０ｒ由来のプローブ、スポット位置１４のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ ２５０ｒ由来のプローブおよびスポット位置２３のＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｍｓｅｌａｅ ２５０ｒ由来のプローブにも弱い発光が確認されたが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａ ２５０ｒ由来のプローブに対する発光が明らかに強いことから、病原菌はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａに近縁と推定された。
【００４７】
（６）診断結果からの所見
上記（５）より、本実施例で作製したマイクロアレイＣによって、イサキの病原菌がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａに類縁であることが推定された。そして、近接隣接法によって得られたブートストラップ確率（％）よりイサキの病原菌はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａであることが推定された。さらに長崎県でシマアジから分離した分離菌について、マイクロアレイＣを用いてハイブリダイゼーションを行ったところ、図４に示すように、イサキの不明病と同様のスポットパターンが見られたことから、この分離菌より決定した塩基配列と、マイクロアレイＣで確認されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａ ２５０ｒ由来のプローブについて近接隣接法を行ったところ、得られたブートストラップ確率（％）よりシマアジの分離菌もＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａであることが推定された。これらの系統樹を図５に示す。
【試験例１】
【００４８】
＜ハイブリダイゼーション条件の検討＞
（１）ハイブリダイゼーション温度の検討
目的とする病原菌を網羅的に検出するために、マイクロアレイにスポットしたプローブのＴｍ値のばらつきによるプローブごとの検出感度の差をなくすために、ハイブリダイゼーション温度を検討した。一般にハイブリダイゼーション温度は６０℃前後と高温であるが、ハイブリダイゼーション温度と室温との差を少なくし、ハイブリダイゼーション条件の一定性を維持することが望ましいと考えた。そこで、ハイブリダイゼーション溶液にホルムアミドを添加することによりハイブリダイゼーション温度を下げ、最適なハイブリダイゼーション条件を検討した。
【００４９】
ハイブリダイゼーションにおいて、ハイブリダイゼーション温度を４２℃として、ホルムアミド濃度０％、２０％、３０％、５０％（ｖ／ｖ）におけるハイブリダイゼーション条件を検討した。ハイブリダイゼーションにあたりオリゴヌクレオチド１（Ｔｍ値８８℃）、オリゴヌクレオチド２（Ｔｍ値８９℃）、オリゴヌクレオチド３（Ｔｍ値６８℃）、オリゴヌクレオチド４（Ｔｍ値７２℃）の４つのオリゴヌクレオチドからなるプローブがスポットされたマイクロアレイを用い、オリゴヌクレオチド１およびオリゴヌクレオチド２に相補的な配列を有するターゲットＤＮＡを用いた。ハイブリダイゼーションによって発光したスポットの位置を図６に示した。
【００５０】
図６に示すように、ハイブリダイゼーション温度が４２℃の場合、２０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド濃度の時にＴｍ値８８℃のオリゴヌクレオチド１とＴｍ値６８℃のオリゴヌクレオチド３の両方が検出でき、非特異反応も見られなかった。従って、ハイブリダイゼーション温度が４２℃で、ハイブリダイゼーション溶液に含まれるホルムアミド濃度が２０
％（ｖ／ｖ）の場合が、マイクロアレイによる魚介類の細菌性疾病を診断するためのハイブリダイゼーション条件として最も適していることが確認された。
【００５１】
（２）ハイブリダイゼーション時間の検討
ハイブリダイゼーションは一昼夜反応させるのが最も一般的であるが、検出するターゲットＤＮＡとアレイ上のＤＮＡの濃度は任意に設定できることから、反応時間の短縮が可能であると考えられた。そこでハイブリダイゼーションにおいて、ハイブリダイゼーション時間を、一晩、２時間、１時間、３０分として検討した。ハイブリダイゼーションにあたり検査の対象となる病原菌のオリゴヌクレオチド１、オリゴヌクレオチド２、オリゴヌクレオチド３、オリゴヌクレオチド４、オリゴヌクレオチド５、オリゴヌクレオチド６の６つのオリゴヌクレオチドからなるプローブがスポットされたマイクロアレイを用い、オリゴヌクレオチド１に相補的な領域を有するターゲットＤＮＡを用いた。ハイブリダイゼーションによって発光したスポットの位置を図７に示す。
【００５２】
図７に示すように、反応時間が１時間から２時間で十分な検出シグナルが得られることが確認された。従って、ハイブリダイゼーションは２時間でよいと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
以上、詳しく説明したとおり、本発明の魚介類細菌性疾病の診断方法は、迅速かつ網羅的に魚介類細菌性疾病を診断することを可能とする。また、本発明の方法を用い、作製したマイクロアレイは、キットとして利用することができ、より簡便な魚介類細菌性疾病の診断を可能とする。従って、本発明によって、魚介類細菌性疾病の早期発見、早期治療による魚病の蔓延防止が可能となり、消費者への安全・安心な養殖生産物の提供に役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ヒラメのエドワジエラ症診断用マイクロアレイＡ上のスポット位置および検出結果を示す（実施例３）。
【図２】ヒラメのエドワジエラ症診断用マイクロアレイＢ上のスポット位置および検出結果を示す（実施例３）。
【図３】イサキ不明病診断用マイクロアレイＣ上のスポット位置および検出結果を示す（実施例４）。
【図４】イサキ不明病診断用マイクロアレイＣ上のクロスハイブリダイゼーションにおけるスポット位置および検出結果を示す（実施例４）。
【図５】イサキ不明病病原菌とシマアジ分離菌の系統関係を示した系統樹である（実施例４）。
【図６】ハイブリダイゼーション温度（４２℃）におけるハイブリダイゼーションの結果を示す（試験例１）。
【図７】ハイブリダイゼーション時間の違いにおけるハイブリダイゼーションの結果を示す（試験例１）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚介類細菌性疾病の診断方法に関する。詳しくは、マイクロアレイを用いる魚介類細菌性疾病の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
魚介類養殖業の発展に伴う生産量の増加と養殖対象種の多様化から、魚介類疾病が頻発かつ多様化している。魚病被害の中でも、細菌性疾病は種類が多く、また、商品サイズの大型魚にも被害が及ぼされることから大きな問題となっている。
【０００３】
しかし、これらの魚介類細菌性疾病の診断法は、主に抗血清を用いた凝集試験、細菌用培地を用いた分離培養または各種性状試験等によるため診断精度や検出時間に問題がある（例えば、特許文献１参照）。また、一部の病原菌に対しては、迅速かつ精度の高い方法として、特異的な領域を増幅するＰＣＲ診断法が開発されてきた。しかし、ＰＣＲ診断法は個々の細菌種にしか対応できないため病原菌を網羅的に探索することができないという問題がある。
【０００４】
近年、細菌の検出方法の１つとして、マイクロアレイを用いる方法が注目されている。マイクロアレイを用いる方法とは、既知細菌の塩基配列をスポットしたアレイ基盤に、試料より抽出した塩基配列をハイブリダイゼーションさせて、試料中の細菌を検出する方法であり、主にヒト等の哺乳類の疾病の検出に利用されようとしている（例えば、非特許文献１参照）。このようなマイクロアレイによる細菌の検出は、高額であるうえに、プローブやハイブリダイゼーションの条件を細かく検討することで検出感度および再現性を高めるなどの技術的課題も多い。そのため、魚介類の病原菌の検出を対象としたマイクロアレイは未だ開発されておらず、魚介類細菌性疾病の診断を目的とする高検出感度、低運営費用および再現性の高いマイクロアレイは実用化されていない。
【特許文献１】特開２００３−９３０９４号公報
【非特許文献１】ＤＮＡマイクロアレイを用いた細菌の検出および同定 臨床検査 ４５巻 ７号 ２００１年７月１５日発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の状況に鑑み、本発明は、マイクロアレイを用いる魚介類細菌性疾病の診断方法の提供を第一の課題とする。さらに、本発明は、検出感度および再現性の高い魚介類細菌性疾病の診断方法の提供を第二の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、マイクロアレイの作製にあたり、種々の魚介類の病原菌から特異的な塩基配列をプローブとして選別し、さらにハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーション溶液に含まれるホルムアミド濃度を特定したハイブリダイゼーション条件を規定することで、魚介類の病原菌を短時間にかつ網羅的に検出することを可能とした。そして、この方法により検出感度および再現性の高い魚介類細菌性疾病の診断ができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は次の（１）〜（５）である。
（１）マイクロアレイを用いることを特徴とする魚介類細菌性疾病の診断方法。
（２）魚介類病原菌を検出することを特徴とする上記（１）に記載の魚介類細菌性疾病の 診断方法。
（３）プローブおよびターゲットＤＮＡの塩基配列において、１６ＳｒＲＮＡ領域を用い ることを特徴とする上記（１）または（２）に記載の魚介類細菌性疾病の診断方法。
（４）ハイブリダイゼーション溶液に含まれるホルムアミド濃度２０±３％（ｖ／ｖ）、 ハイブリダイゼーション温度が４２±２℃の条件下でターゲットＤＮＡとマイクロアレ イをハイブリダイゼーションさせることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに 記載の魚介類細菌性疾病の診断方法。
（５）魚介類細菌性疾病の診断方法に用いる上記（１）〜（４）のいずれかに記載のマイ クロアレイ。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のマイクロアレイを用いる魚介類細菌性疾病の診断方法は、迅速かつ網羅的に細菌性の魚介類疾病を診断することを可能とする。この方法を用いた魚介類疾病の診断により、新たな魚病の病原菌を検出することも可能となる。従って、本発明は、魚介類細菌性疾病の早期発見、早期治療による魚病の蔓延防止にきわめて有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明で「プローブ」とは、細菌を確認するためのＤＮＡ、ＲＮＡの塩基配列をいう。本発明においては、診断の対象となる病原菌の１６ＳｒＲＮＡ領域の全塩基配列またはその部分領域の塩基配列をプローブに用いることができるが、特に変異領域を含む１６ＳｒＲＮＡの部分領域を用いることが好ましい。さらに、近縁種の病原菌を判別する場合には、複数の変異領域におのおののプローブを設定することが望ましく、このようなプローブの設定によって病原菌の検出感度を高めることが可能となる。
【００１０】
本発明では、上記のとおり、プローブとしては、１６ＳｒＲＮＡ領域の全体の塩基配列またはその部分領域の塩基配列を用いることができるが、中でも１６ＳｒＲＮＡの変異領域中で、種特異性の高い塩基配列を用いることが特に好ましい。プローブとして用いるオリゴヌクレオチドは、塩基配列がわかれば分離培養が難しい特殊な細菌性疾病の病原菌についても使用することができ、このような塩基配列の情報をもとに、合成業者が合成したオリゴヌクレオチドを使用することもできる。プローブに用いるオリゴヌクレオチドの長さは特に規定はないが、５０ｍｅｒがハイブリダイゼーションにおいても扱いやすく好ましい。このようなオリゴヌクレオチドをプローブに用いる場合、アレイには１．５ｎｇ（０．１ｐｍｏｌ）を含むようにスポットすることで魚介類細菌性疾病の病原菌を十分に検出することができる。
【００１１】
本発明で「マイクロアレイ」とは、ＤＮＡチップとも呼ばれ、ナイロン、ガラスやシリコン等の支持体上に数百〜数万種類のＤＮＡ、ＲＮＡの塩基配列や、その断片をプローブとして結合させたものをいう。アレイ基板の形状は、平板状、円柱状等の任意のものを用いることができ、形状にはとらわれない。本発明においては、初期投資および運用費用の面から、ナイロン膜の上に、目的とする疾病のプローブを載せたものを魚介類細菌性疾病の診断のためのアレイとして作製した。なお、ナイロン膜は核酸検出用の市販品を用いることができる。
【００１２】
ナイロン膜を用いたマイクロアレイの作製においては、プローブのスポットにおいて中性液（ＴＥ緩衝液：ナカライテスク株式会社製等）またはアルカリ液を用いたスポット方法等を使用することができる。アルカリ液を用いた場合、希釈したオリゴヌクレオチド液とアルカリ溶液（０．４Ｎ 水酸化ナトリウム ＋１．５Ｍ 塩化ナトリウム）を混合させて利用するが、混合割合は任意に変化させてよい。この時アルカリ液に０．１％ ＢＰＢ（ｗ／ｖ ＤＷ：ブロモフェノールブルー 日本バイオラッドラボラトリー株式会社製等）溶液を青色がわかる程度に少量加えておくとスポットした場所がわかりやすくてよく、これは中性液（ＴＥ緩衝液）を用いた場合も同様である。スポットしたプローブは、ベーキングまたはＵＶ照射によって、ナイロン膜と結合させることができる。スポットに用いたナイロン膜がプラスチャージの場合には、ベーキングの方がより好ましいとするプロトコールもある。ベーキングの場合は、例えば１２０℃、２０−３０分ベーキングを行うことにより、ＵＶ照射の場合は例えばＵＶ（２５４ｎｍ、１２０ｍＪ／ｃｍ2）を照射することにより、プローブをナイロン膜に結合させることができる。このようにして作製されたマイクロアレイは、室温で長期保存が可能であるため、必要に応じて使用することができる。
【００１３】
本発明の説明において「抽出ＤＮＡ」とは、診断の対象となる病魚、もしくは分離菌等の試料より得られたＤＮＡを指す。これらのＤＮＡは、病魚の臓器からまたは病原菌と思われる菌体から、熱水抽出または「ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫおよびＰｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍを用いたフェノール・クロロホルム法」（フェノールによって試料中のたんぱく質を除去し、親水性のＤＮＡを分離する方法であり、クロロホルムはフェノールの除去のために用いられるＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．Ｅ．３−Ｅ．４．等の方法）もしくはＤＮｅａｓｙ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（登録商標、製品番号６９５０４：キアゲン社）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（登録商標、製品番号７４０９５２．５０：日本ジェネティクス社）等の市販のＤＮＡ抽出キットのいずれかによって得ることができる。腎臓や脾臓等の魚体組織からＤＮＡを得る場合は、フェノール・クロロホルム法または市販のキットによる抽出が好ましく、病原菌が分離培養されてコロニーを形成している場合は、特に簡易法として熱水抽出も有効である。
【００１４】
本発明でいう「ターゲットＤＮＡ」とは、得られた抽出ＤＮＡを鋳型として、ほぼ全種類の真正細菌の１６ＳｒＲＮＡ領域の塩基配列を増幅することが可能なユニバーサルプライマーを用いたＰＣＲによって、１６ＳｒＲＮＡのほぼ全領域またはその部分領域を増幅することで得られたＤＮＡを指す。本発明では、診断の検出感度および再現性を高めるために、得られた１６ＳｒＲＮＡのほぼ全領域またはその部分領域の塩基配列を鋳型として、さらにユニバーサルプライマー用いたＰＣＲを行い、部分領域を増幅することで、調製したターゲットＤＮＡを使用してもよい。
【００１５】
ＰＣＲにおいて用いるユニバーサルプライマーは、ＥｕｂＢ、ＥｕｂＡ、１５００Ｒなどであり、以下の２つの文献に紹介されている。Ｍａｕｅｌ，Ｍ．Ｊ．，Ｓ．Ｊ．Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ ａｎｄ Ｊ．Ｌ．Ｆｒｙｅｒ（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｉｓｃｉｒｉｋｅｔｔｓｉａ Ｓａｌｍｏｎｉｓ.Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅｒｃｈ．Ｎｏ．２６．ｐ１８９−１９５、Ｓｈｏｔａｒｏ Ｉｚｕｍｉ ａｎｄ Ｈｉｓａｔｓｕｇｕ Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ（１９９７）Ｕｓｅ ｏｆ ＰＣＲ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ ｆｒｏｍ Ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｊｕｖｅｎｉｌｅ Ａｙｕ ａｎｄ Ｃｏｈｏ Ｓａｌｍｏｎ Ｅｇｇｓ.Ｆｉｓｈ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｎｏ．３２（３）．ｐ１６９−１７３．さらに、Ｅ３６０ｒなどの独自に設計したユニバーサルプライマーを用いることができ、この場合には、なるべく多くの菌種の１６ＳｒＲＮＡ領域のアライメントを作成し、できる限り共通である塩基配列を選択することが望ましい。これらは合成業者（プロリゴジャパン株式会社など）によって合成したユニバーサルプライマーを使用してもよい。ユニバーサルプライマーは、魚介類細菌性疾病の診断にあたり、目的とする病原菌を検出するために、その塩基配列を増幅できればよく、特に真正細菌１６ＳｒＲＮＡユニバーサルであることが、網羅的な検索において望ましい。
【００１６】
得られたターゲットＤＮＡは、標識することで検出が可能となる。本発明でいう「標識」とは、分光光度的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の組成物を用いてターゲットＤＮＡをラベル化することを指す。本発明では、ターゲットＤＮＡの標識にあたり、有用な標識物質としてジゴキシゲニン（以下、ＤＩＧと略す）を用いることができる。さらに、蛍光色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、緑色蛍光タンパク質等）、放射性物質（例えば、3Ｈ、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃまたは32Ｐ）、酵素（例えば、西洋わさびパーオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）等の標識物質を用いることができる。
【００１７】
「ハイブリダイゼーション」とは、アレイ上のプローブが、ターゲットＤＮＡまたはその一部分と相補的に結合し、二本鎖を形成することを指す。本発明では、結合の条件は、魚介類細菌性疾病の種類や、プローブに含まれる塩基配列等によって調整できるが、一度に複数の魚介類細菌性疾病の病原菌について網羅的に検索するためには検出感度、再現性がともに高い特異的な条件を設定することが好ましい。例えば、プローブまたはターゲットとしてＤＮＡを用いた場合に、複数の病原菌を一度に検出するためには、プローブに用いるオリゴヌクレオチドＤＮＡの多様なＴm値（任意のオリゴヌクレオチドの５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度）を考慮することが好ましい。この場合、ハイブリダイゼーション温度と室温の差が少なく、さらに市販の多くのインキュベーターで処理できる３０〜７０℃がよく、特に４２℃±２℃が好ましい。温度の調整にあたっては、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミド濃度を用いることができ、その濃度はこの場合０〜５０％がよく、特に２０％±３％（ｖ／ｖ）が好ましい。
【００１８】
さらに検出感度、再現性を高めるために、ハイブリダイゼーションの前にプレハイブリダイゼーションを行い、マイクロアレイとハイブリダイゼーション溶液をなじませ、非特異的なハイブリダイゼーションの防止を行うことが望ましい。プレハイブリダイゼーションの時間は、１０分間以上、マイクロアレイにハイブリダイゼーション溶液がよくなじむまで行うことが好ましく、時間の長さにはとらわれない。プレハイブリダイゼーション後のハイブリダイゼーションに用いるターゲットＤＮＡの濃度は、バックグランドが高くなりすぎない程度に、特異的なハイブリダイゼーションが行われる濃度であればよく、ＤＮＡ濃度としては５０〜１００ｎｇ／１ｍｌ（ハイブリダイゼーション溶液）を目安にすることができるが、この濃度から１桁ほど前後してもよい。また、ハイブリダイゼーションを行う時間は、３０分ないし一晩の間行うことができるが、発光したスポットを十分に検出できる時間であればよく、概ね２時間を目安にするとよい。
【００１９】
本発明の細菌性疾病診断の対象となる魚介類としては、コイ、ウナギ、アユ、および、ヤマメ、アマゴ、ヒメマス、ニジマス、ギンザケなどのサケ科魚類等の淡水魚類や、ブリ、ヒラマサ、カンパチなどのブリ類およびマダイ、ヒラメ、マコガレイ、シマアジ、イサキ、アワビ等の海産魚介類を挙げることができる。本発明で診断可能な魚介類細菌性疾病の一例を表１に示すが、本発明はこれに限定されず、診断の対象に応じて疾病の病原菌由来のプローブをマイクロアレイに追加して組み合わせることで、どのような魚介類細菌性疾病も診断することができる。
【００２０】
表１は、本発明者らが２年間にわたって、本発明の実施例１の方法を用いて試験した結果をまとめたものである。
【表１】
【００２１】
以下、本発明の試験例および実施例を示すが、本発明はこれらによって制限されない。
【実施例１】
【００２２】
＜マイクロアレイの作製方法＞
（１）プローブとして用いるオリゴヌクレオチドＤＮＡの調製
魚介類の各種細菌性疾病における既知病原菌について、ＤＮＡシークエンサー（製品型式 ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７７：アプライドバイオシステム社）を用いて１６ＳｒＲＮＡ領域の塩基配列を解読するかまたは遺伝子データーベース（ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋ）より集め、得られた真正細菌の１６ＳｒＲＮＡをアライメントし、特異的な塩基配列を示す変異領域を探索し、プローブとして用いる塩基配列を設定した。塩基配列は、得られた様々な真生細菌の１６ＳｒＲＮＡをアライメントし、変異領域を探索することで設定した。設定にあたり、１６ＳｒＲＮＡのアライメントによって、少しでも多くの変異領域を含むように塩基配列を選択した。そして、これらの１６ＳｒＲＮＡ変異領域に相補的な合成オリゴヌクレオチドＤＮＡ（５０ｍｅｒ）を合成業者（プロリゴジャパン株式会社）に依頼して合成し、プローブとして用いた。
【００２３】
（２）プローブのナイロン膜へのスポット
合成業者にて調製済みの１００μＭ（１００ｐｍｏｌ／μｌ、１．５ｐｇ／μｌ）オリゴＤＮＡ溶液を１／１，０００にＴＥ緩衝液で希釈した希釈オリゴヌクレオチド液１μｌとアルカリ溶液（０．４Ｎ 水酸化ナトリウム＋１．５Ｍ 塩化ナトリウム）または中性液（ＴＥ）４μｌを混ぜてプローブ溶液とした。スポットに用いるプローブごとにプローブ溶液を調製し、１μｌずつナイロン膜（プラスチャージ膜）（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、登録商標：アマシャムバイオサイエンス株式会社）にスポットした。この時それぞれのプローブが１６ＳｒＲＮＡの変異領域に相補的なオリゴヌクレオチドを１．５ｎｇ含むようにナイロン膜上にスポットした。スポット後ナイロン膜を１２０℃、２０−３０分でドライングオーブン（製品型式 ＭＯＶ−２１２Ｓ ：サンヨー電気株式会社）を用いてベーキングを行い、または１２０ｍＪ／ｃｍ3でクロスリンカー（製造型式ＣＬ−１０００ ：ＵＶＰ社）を用いてＵＶクロスリンクを行い、ナイロン膜にプローブを結合させて、魚介類細菌性疾病の診断に利用可能なマイクロアレイを作製した。作製されたマイクロアレイは室温で長期保存可能であり、必要に応じて使用できた。
【実施例２】
【００２４】
＜マイクロアレイを用いた魚介類細菌性疾病の診断方法＞
（１）ターゲットＤＮＡの調製
Ａ．ＤＮＡ抽出
診断に供する魚介類の腎臓を試料としてフェノール・クロロホルム法を行った。試料１００ｍｇを５５℃で２時間静置した後、フェノール・クロロホルムを加え、１０分間穏やかに攪拌した。攪拌後、室温にて遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分間）を行い、水層を新たなチューブへ移し、これと等量のエタノールを加えて軽く攪拌した後、室温にて遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分間）を行って上清を取り除き、ペレットのみにした。ペレットに７０％エタノールを入れて攪拌した後、室温にて遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分間）を行って上清を取り除き、残ったペレットを中性液（ＴＥ緩衝液）２００μｌに溶解することで抽出ＤＮＡを得た。また、診断に供する魚介類の病原菌の分離菌を試料として熱水抽出を行った。分離菌のコロニーをピペットで突いて、１００μｌのＴＥ緩衝液に懸濁させた後、１００℃で１０分間温めて菌体を壊した。室温にて遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分間）して、得られた上清を新たなチューブへ移し、抽出ＤＮＡとして用いた。
【００２５】
Ｂ．ＰＣＲ（１回目）
上記Ａの方法により得た抽出ＤＮＡを鋳型として、配列表配列番号１（ＥｕｂＢ）および配列表配列番号２（ＥｕｂＡ）または配列表配列番号３（１５００Ｒ）に記載のユニバーサルプライマーを用いて、ｉ−ｃｙｃｌｅｒ（登録商標：バイオラッド社）にてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液（Ｔａｋａｒａ Ｔａｑ、登録商標：タカラバイオ株式会社）の組成およびＰＣＲ反応条件を表２に示す。１回目のＰＣＲで１６ＳｒＲＮＡのほぼ全領域について増幅を行った。
【００２６】
【表２】
【００２７】
Ｃ．ＰＣＲ（２回目）およびターゲットＤＮＡの標識
１回目のＰＣＲ後、検出感度および再現性を高めるために、さらに２回目のＰＣＲを行い、同時に標識を行った。２回目のＰＣＲは得られた１６ＳｒＲＮＡ領域を鋳型として配列表配列番号１および配列表配列番号４（Ｅ３６０ｒ）に記載のユニバーサルプライマーを用いて１回目と同じＰＣＲ反応条件で行った。この時ＰＣＲ ＤＩＧラベリングミックス（登録商標、製品番号１５８５５５０：ロシュダイアグノスティクス株式会社）を用いて５’領域の約３００ｂｐの増幅と同時にＤＩＧ標識も行った。ＰＣＲ反応液の組成を表３に示す。こうして増幅および標識された１６ＳｒＲＮＡの部分領域（５’領域の約３００ｂｐ）をターゲットＤＮＡとして病原菌の検出に用いた。
【００２８】
【表３】
【００２９】
（２）病原菌の検出
実施例１で作製したマイクロアレイと、上記（１）で調製したターゲットＤＮＡをプレハイブリダイゼーションした後、ハイブリダイゼーションさせ、ＤＩＧ検出法により、病原菌の検出を行った。
【００３０】
Ａ．プレハイブリダイゼーション
実施例１で作製したマイクロアレイをプラスチックバッグ（製品番号．Ｓ−１０２１：コスモバイオ社）に入れ、マイクロアレイに十分に行き渡る量のハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＣ （０．０２％（ｗ／ｖ）ＳＳＣ：ナカライテスク株式会会社）、０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム（ナカライテクス株式会社）、１％（ｗ／ｖ）ブロック試薬（製造番号１０９６１７６：ロッシュダイアグノスティックス株式会社）、２０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド（ナカライテクス株式会社）を入れてヒートシーラー（製造型式 ＮＬ２０１Ｊ：石崎電気製作所）にてシールをし、インキュベーター（製造型式 ＭＭＳ−１：東京理科器械株式会社）にて４２℃で１０分間以上、マイクロアレイにハイブリダイゼーション溶液がよくなじむまでプレハイブリダイゼーションを行った。
【００３１】
Ｂ．ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションに用いるターゲットＤＮＡの濃度がハイブリダイゼーション溶液１ｍｌあたり１μｌ（５０〜１００ｎｇ）となるように調製を行った。調製したハイブリダイゼーション溶液がプレハイブリダイゼーション後のマイクロアレイに十分に行き渡るように加えて、ヒートシーラーにてシールをし、インキュベーターにて４２℃、２時間のハイブリダイゼーション条件でハイブリダイゼーションを行った。この「ハイブリダイゼーション溶液に含まれるホルムアミドの濃度が２０％（ｖ／ｖ）であって、ハイブリダイゼーション温度が４２℃、反応時間は２時間」というハイブリダイゼーション条件によって、バックグランドが少なく、一度のハイブリダイゼーションにおいて、様々な病原菌を検出することが可能な、適度なハイブリダイゼーションを行うことができた。
【００３２】
Ｃ．マイクロアレイの洗浄
ハイブリダイゼーション終了後のマイクロアレイをプラスチックバッグから取り出し、洗浄を行った。マイクロアレイを洗浄溶液Ａ（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（ナカライテクス株式会社）に入れて１０分間洗浄を行った後、新しい洗浄溶液Ａに取り替えて繰り返し洗浄を行った。洗浄溶液Ａによる洗浄は合計３回行った。さらにマイクロアレイを洗浄溶液Ｂ（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）に入れて１０分間洗浄を行った後、新しい洗浄溶液Ｂに取り替えて繰り返し洗浄を行った。洗浄溶液Ｂによる洗浄は合計２回行った。
【００３３】
Ｄ．検出反応
洗浄後のマイクロアレイをさらに０．３％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０添加ｂｕｆｆｅｒ１（０．１Ｍ マレイン酸（ナカライテクス株式会社、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．５、２０℃））で５分間洗浄し、さらにｂｕｆｆｅｒ２（１％（Ｗ／Ｖ）ブロック試薬／ｂｕｆｆｅｒ１）に３０分間浸した後、検出反応を行った。検出反応はｂｕｆｆｅｒ２に抗ＤＩＧ抗体（製品番号．Ｎｏ．１３３３０８９：ロシュダイアグノスティックス株式会社）を１／５，０００濃度になるように添加した検出反応溶液抗にマイクロアレイを３０分間浸して行った。検出反応終了後、マイクロアレイを取り出し、ｂｕｆｆｅｒ１で１０分間洗浄を行った後、新しいｂｕｆｆｅｒ１に取り替えて繰り返し洗浄を行った。ｂｕｆｆｅｒ１による洗浄は合計３回行った。さらに、マイクロアレイをｂｕｆｆｅｒ３（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、５０ｍＭ 塩化マグネシウム（ｐＨ９．５、２０℃））に入れて５分間洗浄を行った。
【００３４】
Ｅ．病原菌の検出
検出用試薬としてＣＤＰ−ｓｔａｒ（登録商標、製造番号ＲＰＮ３６８２：アマシャムバイオサイエンス株式会社）をマイクロアレイに行き渡る量（約１０μｌ／ｃｍ2）をラップに滴下し、そのＣＤＰ−ｓｔａｒ液上にプローブがスポットされている面を下にしてマイクロアレイを載せた。マイクロアレイを上下に移動して、マイクロアレイ全体に検出用試薬を十分に行き渡らせた後、乾かないようにして数分間放置した。その後、マイクロアレイをプローブがスポットされている面を上にしてポラロイドのホルダーに載せ、ラップでくるみ、ポラロイドフィルム（ポラベン３２００Ｂ、登録商標：日本ポラロイド株式会社）に２０分間露光した。露光が不十分である場合は、さらに数分間露光を行い、マイクロアレイ上で発光したスポットの位置を検出した。
【００３５】
（３）疾病診断
実施例２で検出したマイクロアレイ上の発光したスポットの位置より、プローブとしてスポットされている病原菌を調べ、魚介類細菌性疾病を診断した。
【００３６】
（４）疾病診断の補足
複数の位置に発光したスポットが検出された場合は、発光強度の強いスポットの方が該当する菌であるかまたはその近縁の菌であると考え診断を行った。なお、診断結果の補足としてプローブに含まれる塩基配列のアライメントを行った。また、ターゲットＤＮＡの１６ＳｒＲＮＡ領域の塩基配列を決定し、系統解析を行った。
【実施例３】
【００３７】
＜ヒラメのエドワジエラ症の診断＞
（１）マイクロアレイの作製
マイクロアレイの作製において、表１の魚介類の各種疾病における既知病原菌を検出するため、実施例１の方法により調製したプローブより、ヒラメのエドワジエラ症の診断に用いるプローブを選択した。そして、これらのプローブを実施例２の方法でナイロン膜にスポットし、ヒラメのエドワジエラ症の診断に利用可能なマイクロアレイを作製した。選択したプローブの違いにより、マイクロアレイＡおよびマイクロアレイＢの２種類のマイクロアレイを作製した。これらのマイクロアレイＡおよびマイクロアレイＢにおけるプローブの由来となる病原菌およびスポット位置をそれぞれ図１および図２に示す。
【００３８】
（２）ターゲットＤＮＡの調製
ヒラメのエドワジエラ症原因細菌であるＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａに感染したヒラメの腎臓を試料としてフェノール・クロロホルム法を用いてＤＮＡを抽出し、この抽出ＤＮＡを鋳型として配列表配列番号１、配列表配列番号２に記載のプライマーを用いて実施例２に記載のＰＣＲ反応条件にて１６ＳｒＲＮＡのほぼ全領域を増幅した。得られた１６ＳｒＲＮＡ領域を鋳型として配列表配列番号１、配列表配列番号４に記載のプライマーを用いて実施例２に記載のＰＣＲ反応条件にて２回目のＰＣＲを行い、５’領域の約３００ｂｐの増幅と同時にＤＩＧ標識も行った。こうして増幅および標識されたＤＮＡはターゲットＤＮＡとして病原菌の検出に用いた。
【００３９】
（３）病原菌の検出
上記（１）で作製したマイクロアレイＡおよびＢと、上記（２）で調製したターゲットＤＮＡをそれぞれ実施例２のハイブリダイゼーション方法およびハイブリダイゼーション条件でハイブリダイゼーションさせ、ＤＩＧ検出法により、病原菌の検出を行った。ターゲットＤＮＡは５０〜１００ｎｇ／ｍｌとなるようにハイブリダイゼーション溶液に加え、ハイブリダイゼーション溶液におけるホルムアミド濃度２０％（ｖ／ｖ）として、４２℃で２時間ハイブリダイゼーションを行うことで、アレイ上に発光したスポットを確認した。マイクロアレイＡ・Ｂ上における発光したスポットの位置を図１および図２に示す。
【００４０】
（４）疾病診断
アレイ上の発光したスポットは、マイクロアレイＡではスポット位置１のＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ Ｅ２２ ２５０ｒ由来のプローブに強い発光が確認された。また、マイクロアレイＢではスポット位置５のＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ Ｅ２２ ２５０ｒ由来のプローブに強く発光したが、これはマイクロアレイＡで発光が確認されたプローブと同じプローブであった。さらに、マイクロアレイＢでは、スポット位置２８のＹｅｒｓｉｎｉａ ｒｕｃｋｅｒｉ由来のプローブにも弱い発光が確認されたが、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ Ｅ２２ ２５０ｒ由来のプローブに対する発光が明らかに強いことから、エドワジエラ症の病原菌を特異的に検出していると考えられる。
【００４１】
（５）結果
上記（４）より、本実施例で作製したマイクロアレイＢによって、実験感染魚の疾病がヒラメのエドワジエラ症であることが診断された。従って、本発明の診断方法は、魚介類細菌性疾病の診断において検出感度、再現性ともに十分であることが確認された。
【実施例４】
【００４２】
＜イサキの不明病の診断＞
（１）診断対象の概要
長崎県での原因不明で死亡したイサキを試料とした。イサキの外部には腹部体表の出血と腹鰭を基点とした潰瘍、鰓の出血が観察された。解剖により体表出血部の腹腔内の出血、肝臓の中心性脂肪変性、脾臓の結節（一部膿瘍状）が観察された。ＢＨＩ（ブレインハーインフュージョン）培地（ディフコ社）と７Ｈ１１（ミドルブルック７Ｈ１１）寒天培地（ＢＢＬ社）で、外部潰瘍部と脳、腎臓、脾臓から病原菌の分離を試みたところ、外部潰瘍部からビブリオ様の菌が分離された。
【００４３】
（２）マイクロアレイの作製
マイクロアレイの作製において、表１の魚介類の各種疾病における既知病原菌を検出するため、実施例１の方法により調製したプローブより、イサキ不明病の診断に用いるプローブを選択した。そして、これらのプローブを実施例２の方法でナイロン膜にスポットし、イサキの不明病の診断に利用可能なマイクロアレイＣを作製した。これらのマイクロアレイＣにおけるプローブの由来となる病原菌およびスポット位置を図３に示す。
【００４４】
（３）ターゲットＤＮＡの調製
不明病で死亡したイサキの腎臓からフェノール・クロロホルム法を用いてＤＮＡを抽出し、この抽出ＤＮＡを鋳型として配列表配列番号１、配列表配列番号２に記載のプライマーを用いて実施例２に記載のＰＣＲ反応条件にて１６ＳｒＲＮＡのほぼ全領域を増幅した。得られた１６ＳｒＲＮＡ領域を鋳型として配列表配列番号１、配列表配列番号４に記載のプライマーを用いて実施例２に記載のＰＣＲ反応条件にて２回目のＰＣＲを行い、５’領域の約３００ｂｐの増幅と同時にＤＩＧ標識も行った。こうして増幅および標識されたＤＮＡは、ターゲットＤＮＡとして病原菌の検出に用いた。
【００４５】
（４）病原菌の検出
上記（１）で作製したマイクロアレイＣと、上記（２）で調製したターゲットＤＮＡを実施例２のハイブリダイゼーション方法およびハイブリダイゼーション条件でハイブリダイゼーションさせ、ＤＩＧ検出法により、病原菌の検出を行った。ターゲットＤＮＡは５０〜１００ｎｇ／ｍｌとなるようにハイブリダイゼーション溶液に加え、ハイブリダイゼーション溶液におけるホルムアミド濃度２０％（ｖ／ｖ）として、４２℃で２時間ハイブリダイゼーションを行うことで、アレイ上に発光したスポットを確認した。マイクロアレイＣ上における発光したスポットの位置を図３に示す。
【００４６】
（５）疾病診断
マイクロアレイＣ上の発光したスポットは、スポット位置１５のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａ ２５０ｒ由来のプローブに強い発光が確認された。さらに、スポット位置１のＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ Ｅ２２ ２５０ｒ由来のプローブ、スポット位置１４のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ ２５０ｒ由来のプローブおよびスポット位置２３のＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｍｓｅｌａｅ ２５０ｒ由来のプローブにも弱い発光が確認されたが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａ ２５０ｒ由来のプローブに対する発光が明らかに強いことから、病原菌はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａに近縁と推定された。
【００４７】
（６）診断結果からの所見
上記（５）より、本実施例で作製したマイクロアレイＣによって、イサキの病原菌がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａに類縁であることが推定された。そして、近接隣接法によって得られたブートストラップ確率（％）よりイサキの病原菌はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａであることが推定された。さらに長崎県でシマアジから分離した分離菌について、マイクロアレイＣを用いてハイブリダイゼーションを行ったところ、図４に示すように、イサキの不明病と同様のスポットパターンが見られたことから、この分離菌より決定した塩基配列と、マイクロアレイＣで確認されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａ ２５０ｒ由来のプローブについて近接隣接法を行ったところ、得られたブートストラップ確率（％）よりシマアジの分離菌もＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａであることが推定された。これらの系統樹を図５に示す。
【試験例１】
【００４８】
＜ハイブリダイゼーション条件の検討＞
（１）ハイブリダイゼーション温度の検討
目的とする病原菌を網羅的に検出するために、マイクロアレイにスポットしたプローブのＴｍ値のばらつきによるプローブごとの検出感度の差をなくすために、ハイブリダイゼーション温度を検討した。一般にハイブリダイゼーション温度は６０℃前後と高温であるが、ハイブリダイゼーション温度と室温との差を少なくし、ハイブリダイゼーション条件の一定性を維持することが望ましいと考えた。そこで、ハイブリダイゼーション溶液にホルムアミドを添加することによりハイブリダイゼーション温度を下げ、最適なハイブリダイゼーション条件を検討した。
【００４９】
ハイブリダイゼーションにおいて、ハイブリダイゼーション温度を４２℃として、ホルムアミド濃度０％、２０％、３０％、５０％（ｖ／ｖ）におけるハイブリダイゼーション条件を検討した。ハイブリダイゼーションにあたりオリゴヌクレオチド１（Ｔｍ値８８℃）、オリゴヌクレオチド２（Ｔｍ値８９℃）、オリゴヌクレオチド３（Ｔｍ値６８℃）、オリゴヌクレオチド４（Ｔｍ値７２℃）の４つのオリゴヌクレオチドからなるプローブがスポットされたマイクロアレイを用い、オリゴヌクレオチド１およびオリゴヌクレオチド２に相補的な配列を有するターゲットＤＮＡを用いた。ハイブリダイゼーションによって発光したスポットの位置を図６に示した。
【００５０】
図６に示すように、ハイブリダイゼーション温度が４２℃の場合、２０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド濃度の時にＴｍ値８８℃のオリゴヌクレオチド１とＴｍ値６８℃のオリゴヌクレオチド３の両方が検出でき、非特異反応も見られなかった。従って、ハイブリダイゼーション温度が４２℃で、ハイブリダイゼーション溶液に含まれるホルムアミド濃度が２０
％（ｖ／ｖ）の場合が、マイクロアレイによる魚介類の細菌性疾病を診断するためのハイブリダイゼーション条件として最も適していることが確認された。
【００５１】
（２）ハイブリダイゼーション時間の検討
ハイブリダイゼーションは一昼夜反応させるのが最も一般的であるが、検出するターゲットＤＮＡとアレイ上のＤＮＡの濃度は任意に設定できることから、反応時間の短縮が可能であると考えられた。そこでハイブリダイゼーションにおいて、ハイブリダイゼーション時間を、一晩、２時間、１時間、３０分として検討した。ハイブリダイゼーションにあたり検査の対象となる病原菌のオリゴヌクレオチド１、オリゴヌクレオチド２、オリゴヌクレオチド３、オリゴヌクレオチド４、オリゴヌクレオチド５、オリゴヌクレオチド６の６つのオリゴヌクレオチドからなるプローブがスポットされたマイクロアレイを用い、オリゴヌクレオチド１に相補的な領域を有するターゲットＤＮＡを用いた。ハイブリダイゼーションによって発光したスポットの位置を図７に示す。
【００５２】
図７に示すように、反応時間が１時間から２時間で十分な検出シグナルが得られることが確認された。従って、ハイブリダイゼーションは２時間でよいと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
以上、詳しく説明したとおり、本発明の魚介類細菌性疾病の診断方法は、迅速かつ網羅的に魚介類細菌性疾病を診断することを可能とする。また、本発明の方法を用い、作製したマイクロアレイは、キットとして利用することができ、より簡便な魚介類細菌性疾病の診断を可能とする。従って、本発明によって、魚介類細菌性疾病の早期発見、早期治療による魚病の蔓延防止が可能となり、消費者への安全・安心な養殖生産物の提供に役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ヒラメのエドワジエラ症診断用マイクロアレイＡ上のスポット位置および検出結果を示す（実施例３）。
【図２】ヒラメのエドワジエラ症診断用マイクロアレイＢ上のスポット位置および検出結果を示す（実施例３）。
【図３】イサキ不明病診断用マイクロアレイＣ上のスポット位置および検出結果を示す（実施例４）。
【図４】イサキ不明病診断用マイクロアレイＣ上のクロスハイブリダイゼーションにおけるスポット位置および検出結果を示す（実施例４）。
【図５】イサキ不明病病原菌とシマアジ分離菌の系統関係を示した系統樹である（実施例４）。
【図６】ハイブリダイゼーション温度（４２℃）におけるハイブリダイゼーションの結果を示す（試験例１）。
【図７】ハイブリダイゼーション時間の違いにおけるハイブリダイゼーションの結果を示す（試験例１）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロアレイを用いることを特徴とする魚介類細菌性疾病の診断方法。
【請求項２】
魚介類病原菌を検出することを特徴とする請求項１に記載の魚介類細菌性疾病の診断方法。
【請求項３】
プローブおよびターゲットＤＮＡの塩基配列において、１６ＳｒＲＮＡ領域を用いることを特徴とする請求項１または２に記載の魚介類細菌性疾病の診断方法。
【請求項４】
ハイブリダイゼーション溶液に含まれるホルムアミド濃度が２０±３％（ｖ／ｖ）、ハイブリダイゼーション温度が４２±２℃の条件下でターゲットＤＮＡとマイクロアレイをハイブリダイゼーションさせることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の魚介類細菌性疾病の診断方法。
【請求項５】
魚介類細菌性疾病の診断方法に用いる請求項１〜４のいずれかに記載のマイクロアレイ。
【請求項１】
マイクロアレイを用いることを特徴とする魚介類細菌性疾病の診断方法。
【請求項２】
魚介類病原菌を検出することを特徴とする請求項１に記載の魚介類細菌性疾病の診断方法。
【請求項３】
プローブおよびターゲットＤＮＡの塩基配列において、１６ＳｒＲＮＡ領域を用いることを特徴とする請求項１または２に記載の魚介類細菌性疾病の診断方法。
【請求項４】
ハイブリダイゼーション溶液に含まれるホルムアミド濃度が２０±３％（ｖ／ｖ）、ハイブリダイゼーション温度が４２±２℃の条件下でターゲットＤＮＡとマイクロアレイをハイブリダイゼーションさせることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の魚介類細菌性疾病の診断方法。
【請求項５】
魚介類細菌性疾病の診断方法に用いる請求項１〜４のいずれかに記載のマイクロアレイ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００６−１０１７９２（Ｐ２００６−１０１７９２Ａ）
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２９４４２０（Ｐ２００４−２９４４２０）
【出願日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年９月１９日に平成１６年度「日本魚病学会」大会にて発表
【出願人】（５０１１６８８１４）独立行政法人水産総合研究センター (103)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年９月１９日に平成１６年度「日本魚病学会」大会にて発表
【出願人】（５０１１６８８１４）独立行政法人水産総合研究センター (103)
【Ｆターム（参考）】
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