魚類及び甲殻類における使用のための成長刺激ポリペプチド
本発明は、ティラピア成長ホルモンを超える活性を示すポリペプチドに関する。前記ポリペプチドは、魚類及び甲殻類の仔魚の成長、生存率及び品質を刺激することができる。また、前記ポリペプチドは病原体に対する生物の防御を亢進させ、水生生物の免疫系に関連するパラメーターを刺激する。前記ポリペプチドをコードする遺伝子を、細胞外タンパク質を得るために使用できるピキア・パストリス発現ベクターにクローニングした。前記ポリペプチドを含有する培養上清を浸漬浴を使用して又は飼料補充剤として水生生物に投与した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水生生物工学の分野に関し、より具体的にはティラピア成長ホルモンと比較してより高い活性を有するポリペプチド、並びに浸漬により又は飼料添加物として処置した仔魚の生存率及び品質を増大させるための前記ポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
水生生物の成長を促進する作用物質の探索は、いくつかの研究所において注目の的になっている。成長ホルモン（ＧＨ）は本研究の主題である。
【０００３】
哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類及び魚類におけるＧＨの存在が報告されている。ＧＨ又はソマトトロピンは視床下部ペプチドへの応答で脳下垂体前葉の成長ホルモン分泌細胞によって合成及び分泌されるポリペプチドである（Ｂａｒｉｎａｇａ Ｍ．ら（１９８５）成長ホルモン放出及び遺伝子転写への成長ホルモン放出因子の独立効果（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２７９−２８１）。ＧＨは、魚類の成長制御、発達、代謝、摂食及び浸透圧調整において必要である（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ Ｅ．Ｍ．ら、（１９７９）成長のホルモンによる増強（Ｈｏｒｍｏｎａｌ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ）Ｆｉｓｈ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８：４５５−５９７）。さらに、その新陳代謝効果は身体の出生後の成長にわたり、魚類においては免疫系細胞にも効果を有する。ＧＨはＴ細胞の増殖を促進する。その抗原受容体活性及びリンパ球の成熟における共刺激因子としての役割は十分に立証されている（Ｈａｒｒｉｓ Ｈ．及びＢｉｒｄ Ｄ．Ｊ．（１９９７）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのニジマス（オンコリンカス・マイキス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ））リンパ球の増殖へのα−ＭＳＨ及びＭＣＨの効果（Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ α−ＭＳＨ ａｎｄ ＭＣＨ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒａｉｎｂｏｗ ｔｒｏｕｔ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．）Ｉｎ：Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｓ．，Ｋｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．（編），Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．Ｍｏｎｄｕｚｚｉ Ｅｄｉｔｏｉｒｅ，Ｂｏｌｏｇｎ ｐｐ．１０２３−１０２６ａ）。
【０００４】
ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージ顆粒球刺激因子及びインターフェロンなどの多数のサイトカインとの構造的類似性は非常に興味深い（Ｓｐｒａｎｇ Ｓ．Ｒ．及びＢａｚａｎ Ｊ．Ｆ．（１９９３）サイトカインの構造分類学及び受容体結合機構（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｔａｘｏｎｏｍｙ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．３：８１５−８２７）。
【０００５】
哺乳類において、ＧＨは食作用、胸腺の成熟及び分化（Ｏｒｔｅｇａ Ｅ．ら、（１９９６）マクロファージのｉｎ ｖｉｔｒｏ食作用能におけるプロラクチンの効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｌａｃｔｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈｇｅｓ）Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．６１：３８９−３９３）及びＴ細胞産生細胞のアポトーシス（Ｍｕｒｐｈｙ Ｗ．Ｊ．及びＬｏｎｇｏ Ｄ．Ｌ．（２０００）免疫制御治療薬としての成長ホルモン（Ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ａｓ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １２１：２１１−２１３）を刺激する。同様に、ヨーロッパ・ヘダイ（Ｓｐａｒｕｓ ａｕｒａｔａ）及びヘダイ（Ｓｐａｒｕｓ ｓａｒｂａ）におけるリンパ球生成及び食作用刺激因子としてのＧＨの効果と共にサケ（Ｏ．ｋｅｔａ）における白血球の有糸分裂誘発（Ｓａｋａｉ Ｍ．ら、（１９９６）外因性成長ホルモンを注射投与したニジマス、オンコリンカス・マイキス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）由来血清の溶血活性の増大（Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｆｒｏｍ ｒａｉｎｂｏｗ ｔｒｏｕｔ Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｕｓ ｍｙｋｉｓｓ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）Ｆｉｓｈ Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：６１５−６１７）、食作用、ＮＫ細胞の活性化、抗体産生、オンコリンカス・マイキス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）における補体溶血活性（Ｙａｄａ Ｔ．ら、（１９９９）下垂体を切除したニジマス、オンコリンカス・マイキス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）の血漿免疫グロブリンＭレベルへのプロラクチン及び成長ホルモンの効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｌａｃｔｉｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｏｎ ｐｌａｓｍａ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｍ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｈｉｐｏｐｈｙｓｅｃｔｏｍｉｚｅｄ ｒａｉｎｂｏｗ ｔｒｏｕｔ，Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）Ｇｅｎ．Ｃｏｍｐ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：４６−５２）並びにニジマス（オンコリンカス・マイキス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ））及びディケントラルクス・ラブラクス（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ ｌａｂｒａｘ）における白血球呼吸性バースト（Ｍｕｎｏｚ Ｐ．ら、（１９９８）成長ホルモン及び寄生状態による地中海シーバス（ディケントラルクス・ラブラクスＬ（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ ｌａｂｒａｘ Ｌ．））食細胞の呼吸バースト活性の制御（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｂｕｒｓｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ ｓｅａ ｂａｓｓ（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ ｌａｂｒａｘ Ｌ．）ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｓｔａｔｕｓ）Ｆｉｓｈ Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：２５−３６）が研究されている。
【０００６】
頭部、腎臓の白血球の食作用活性の増大及び血漿リゾチーム濃度の増大と相関関係にある甲状腺ホルモンのレベルの減少を伴うブラウン・トラウト（Ｓａｌｍｏ ｔｒｕｔｔａ）の淡水から海水への移動の結果としての血漿ＧＨレベルの増大が示されている。いくつかの研究はリンパ球において特異的なＧＨ受容体及びＩＧＦ受容体の発現を示した（Ｔａｐｓｏｎ Ｖ．Ｆ．ら、（１９８８）インスリン様成長因子Ｉに対するヒトＴリンパ球受容体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの構造及び機能の性質決定（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｉ ｉｎ ｖｉｔｒｏ）Ｃｌｉｎ，Ｃ．Ｉｎｖｅｓｔ．８２：９５０−９５７）。Ｔ細胞増殖におけるＩＧＦ−Ｉのｉｎ ｖｉｔｒｏでの効果は示されている。Ｂ細胞、免疫グロブリン及び形質細胞についてのＩＧＦ−Ｉの誘導効果は十分に周知である。Ｂ細胞はＧＨ受容体の最も高いレベルの発現を示す（Ｂａｄｏｌａｔｏ Ｒ．ら、（１９９４）二重蛍光フローサイトメトリーで検出したヒト抹消血リンパ球における表面膜の成長ホルモン受容体の発現差異（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｄｕａｌ ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．７９：９８４−９９０）。
【０００７】
ＧＨは、そのマクロファージ及び単球への活性化効果を通じてリンパ球Ｂ及びＴに間接的に影響を与えることができる（Ｅｄｗａｒｄｓ Ｃ．Ｋ．ら、（１９８８）ソマトトロピンの新たに同定された特性：スーパーオキシドアニオン産生のためのマクロファージのプライミング（Ａ ｎｅｗｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｏｆ ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｉｎ：ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：７６９−７７１）。最後の作用は走化性も促進する。これらの細胞はサイトカインの分泌によりリンパ球にも作用する。ＧＨはＮＫ細胞欠乏を回復させる（Ｄａｖｉｌａ Ｄ．Ｒ．ら、（１９８７）老齢、ヌード及びトランスジェニックのげっ歯類におけるＴ依存性免疫事象の制御における成長ホルモンの役割（Ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｍｍｕｎｅ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ａｇｅｄ，ｎｕｄｅ，ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｏｄｅｎｔｓ）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．１８：１０８−１１６）。
【０００８】
いくつかの魚類成長ホルモンの相補ＤＮＡは、クローニング及び配列決定されている。注射投与による（Ｔｓａｉ Ｈ．Ｊ．ら、（１９９３）酵母でのニジマス成長ホルモンｃＤＮＡの発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒａｉｎｂｏｗ ｔｒｏｕｔ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｃＤＮＡ ｉｎ ｙｅａｓｔ）Ｂｕｌｌ．Ｉｎｓｔ．Ｚｏｏｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｎ．３２：１６２−１７０）又は浸漬による（Ｍｏｒｉｙａｍａ Ｓ．及びＫａｗａｕｃｈｉ Ｈ．（１９９０）組換えサケ成長ホルモンへの浸漬によるサケ科仔魚の成長刺激（Ｇｒｏｗｔｈ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｓａｌｍｏｎｉｄｓ ｂｙ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓａｌｍｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｕｉｓａｎ Ｇａｋｋａｉｓｈｉ ５６：３１−３４）魚類での成長における組換えＧＨの強力な効果が示されている。
【０００９】
ヒトＧＨは、下垂体（Ｂａｕｍａｎｎ Ｇ．ら、（１９８３）健常者及び先端巨大症患者における循環している成長ホルモンの分子的特質：主要な及び微量の単量体形態についての証拠（Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ａｃｒｏｍｅｇａｌｉｃ ｍａｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ａｎｄ ｍｉｎｏｒ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍｓ）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．５６：９４６−９５２）、血漿（Ｂａｕｍａｎｎ Ｇ．ら、（１９８５）自発的分泌エピソード及び基礎状態において循環している成長ホルモンの分子形態（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｄｕｒｉｎｇ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｅｐｉｓｏｄｅｓ ａｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｓａｌ ｓｔａｔｅ）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．６０：１２１６−１２２０）及び尿（Ｂａｕｍａｎｎ Ｇ．及びＡｂｒａｍｓｏｎ Ｅ．Ｃ．（１９８３）ヒトにおける尿中成長ホルモン：多様な分子形態の証拠（Ｕｒｉｎａｒｙ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ ｍａｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｓ）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ５６：３０５−３１１）において検出できる構造的に関連したタンパク質の不均一な群として存在している。ヒトＧＨの主なバリアントは固有のポリペプチド鎖により構成されている２２ｋＤａのポリペプチドである。このポリペプチドは免疫反応性のヒトＧＨの８５％を構成している（Ｌｅｗｉｓ Ｕ．Ｊ．ら、（１９９４）血清中ヒト成長ホルモンのバリアントの形態及び断片（Ｖａｒｉａｎｔ ｆｏｒｍｓ ａｎｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ ｓｅｒｕｍ）Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｐｐｌ．３９９：２９−３１）。ヒトＧＨの他のバリアントは、分子量２０ｋＤａの１本鎖ポリペプチド（Ｌｅｗｉｓ Ｕ．Ｊ．ら、（１９７８）ヒト成長ホルモンの天然に存在する構造バリアント（Ａ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：２６７９−２６８７）、アセチル化及び脱アミド化した２２ｋＤａの形態（Ｌｅｗｉｓ Ｕ．Ｊ．ら、（１９８１）脱アミド化の結果としてのヒト成長ホルモンのタンパク質分解による切断の変化（Ａｌｔｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ａｓ ａ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１１６４５−１１６５０）並びにジスルフィド結合で連結した２本のポリペプチド鎖を有し、タンパク質分解の切断で生じる短縮バリアント（Ｓｉｎｇｈ Ｒ．Ｎ．ら、（１９７４）生物活性が増大したヒト成長ホルモンの修飾形態（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ９４：８８３−８９１）を含む。いくつかの研究は最後のバリアントが最も活性であることを示していた。この分子は２２ｋＤａのｈＧＨのアミノ酸１３４から１５０の間でのプロテイナーゼ消化の結果によるものである（Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ Ｖ．Ｊ．ら、（１９９１）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのラット組織によるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のタンパク質分解による切断：外因性に投与されたｈＧＨの動態についての影響（Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ（ｈＧＨ）ｂｙ ｒａｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｌｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｈＧＨ）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２９：４６５−４７４）。この短縮バリアントの増大した生物活性は、その安定性の増大及びそれが他よりも低い代謝クリアランス率を有するという事実によるものであることが示唆されている（Ｂａｕｍａｎｎ Ｇ（１９７９）ヒトにおけるヒト成長ホルモンのイソホルモンの代謝クリアランス率（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｉｓｏｈｏｒｍｏｎｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ ｍａｎ）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．４９：４９５−４９９）。
【００１０】
組換えＤＮＡ技術の発展により、比較的安価な過程で目的タンパク質を生成するための宿主系としての細菌及び酵母の使用が可能になっている。酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、異種タンパク質を生成するための宿主として広く使用されている。この生物は、高いレベルの発現、操作及び培養の容易さなどに関連する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの他の系の恩恵を提供し、さらにこれらとタンパク質分解プロセシング、リフォールディング、グリコシル化及びジスルフィド結合形成などの翻訳後修飾を実現する真核系の有利点とを組み合わせることができる（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｒ．及びＣｒｅｇｇ Ｊ．Ｍ．（１９９８）ピキア・パストリスの手引き（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｐｉｃｈｉａ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｗｏｔａ １−１５）。発現系として、このシステムは簡単な遺伝子的及び分子的操作を必要とし、それは増殖及び発現用の培地が特別な補充剤を必要としないことから昆虫細胞又は哺乳類組織の培養における発現よりも高価でない。この酵母は大規模発酵に容易に適応し、高密度での培養を容易にする生理的な特性である呼吸性増殖の選択性を有する。
【００１１】
成長ホルモンを発現している組換え酵母を使用する成長刺激のいくつかの研究が発表されている。ＧＨを発現している組換えピキア・パストリスを加えた餌の投与後でのニワトリの成長における効果が示されている（Ｃｈｅｎ Ｃ．Ｍ．ら、（２０００）成長ホルモンを豊富に含む組換え酵母培養液の食餌投与によるニワトリの成長増強（Ｇｒｏｗｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｆｏｗｌｓ ｂｙ ｄｉｅｔａｒｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｙｅａｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６７：２１０３−２１１５）。さらに、Ｔｓａｉ．ら、１９９３は、ＧＨを発現している組換えサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の食餌投与により成長を加速させ（Ｔｓａｉ Ｈ．Ｊ．ら、（１９９３）栄養補助剤としての組換え酵母溶解産物の食餌投与によるティラピアの成長の増強（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｉｌａｐｉａ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｄｉｅｔａｒｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｙｅａｓｔ ｌｙｓａｔｅｓ ａｓ ａ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）Ｊ．Ｆｉｓｈ．Ｓｏｃ．Ｔａｉｗａｎ ２０：３３９−３４５）。
【００１２】
魚類成長ホルモンに類似する活性を有するポリペプチド及び魚類において成長を促進し、仔魚の死亡率を減少させるためのその使用は米国特許第６２３９１００号において保護されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
成長を加速させ、生存率を増大させ、仔魚の品質を改善することはいまだに水産養殖における主な課題の１つである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、ティラピアＧＨと比較してより高い活性を示すアミノ酸配列、配列番号７又は８を有するポリペプチド並びに魚類及び甲殻類でのその応用における前記課題の解決法を提供する。主な結果として、我々は前記アミノ酸配列を含み、ピキア・パストリスで細胞外へ発現されるこれらのポリペプチドは、浸漬浴により又は食餌添加物として魚類及び甲殻類に投与されると成長速度、生存率及び仔魚の品質を増大させることを見出した。同様に、これらは免疫状態を改善する。ティラピア成長ホルモンと比較したポリペプチドの優位性が示された。
【００１５】
水産養殖におけるこれらのポリペプチドの使用はいくつかの有利点を有する、１）それらは魚類ＧＨより小さな分子であり、生物により吸収され血流に容易に達することができる、２）それらが魚類ＧＨの断片であることから、それらはヒトに生物活性を有さない、３）それらは魚類ＧＨよりも成長に強力な効果を有する、４）それらは広範な魚類種で成長、生存率及び仔魚の品質において著しい効果を有する。
【００１６】
米国特許第６，２３９，１００号は、成長を刺激し仔魚の死亡率を減少させる魚類ＧＨに関連する同様の活性を有するポリペプチドの使用を保護している。このポリペプチドについて報告されている配列は、ティラピアＧＨと比較して７３％のホモロジーを有し、Ｎ末端の５１ヌクレオチドが欠失している。本発明のポリペプチドはティラピア成長ホルモンから得た。ポリペプチド配列番号７はＣ末端に相当する４６アミノ酸の断片を欠失している。ポリペプチド配列番号８はＣ末端の同じ断片及びＮ末端の１７アミノ酸を欠失している。
【００１７】
ＧＨに類似する活性を有する米国特許第６，２３９，１００号に記載のポリペプチドと異なり、本発明のポリペプチドはＧＨと比較してより高い活性を有している。本活性は種特異的ではない。さらに、Ｃ末端の断片を欠失しているポリペプチド配列番号７はポリペプチド配列番号８に勝る成長促進活性を有している。
【００１８】
本発明の具体化において、アミノ酸配列、配列番号７及び８において定義されるポリペプチドのいずれかを含む組成物は魚類及び甲殻類において成長を刺激する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、前記ポリペプチドのコード配列のピキア・パストリス発現ベクターｐＰＳ１０へのクローニングを含んでいた。これらのポリペプチドのコード配列は、あらかじめｐＲ１７にクローニングされたｔｉＧＨのｃＤＮＡを鋳型として使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得た（Ｇｕｉｌｌｅｎ Ｉ．Ｉ．ら、（１９９８）大腸菌由来の相同成長ホルモンを注射投与された広塩性硬骨魚類の稚魚、ティラピア、オレオクロミス・ホルノラム（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｈｏｒｎｏｒｕｍ）における生理的変化（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｅｕｒｙｈａｌｉｎｅ ｔｅｌｅｏｓｔ，ｔｈｅ ｔｉｌａｐｉａ Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｈｏｒｎｏｒｕｍ，ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｅ．ｃｏｌｉ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）Ｊ Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：１４２−５１）。ティラピア成長ホルモンも同じベクター（ｐＲ１７）からのＰＣＲにより増幅した。
【００２０】
ピキア・パストリスにおける標的タンパク質の発現のための遺伝子構築において使用するベクターは、ピキア・パストリスＡＯＸ１プロモーター（ｐＡＯＸ１）、Ｓ．セレビシアスクロースインベルターゼ２（ｓｐＳＵＣ２）のシグナルペプチド及びＳ．セレビシアの酵素グリセルアルデヒド−３Ｐ−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰｔ）の終止コドンを含む。それは、酵母の選択マーカーであるＳ．セレビシアのＨＩＳ３遺伝子と前記酵母との間の相同組換えに必要な３’ＡＯＸ領域に相当する染色体ＤＮＡの断片も含む。ベクターは、大腸菌で機能する複製起点及び細菌の選択マーカーとしてのアンピシリン耐性遺伝子を有する。組換えピキア・パストリス株を作製するために使用するベクターは一般に組込み型である。形質転換に先立ちプラスミドはＡＯＸ１遺伝子による相同組換えを容易にするために直鎖化されるべきである。ピキア・パストリスＭＰ３６株を、組換えタンパク質の細胞外産生に使用した。この株は、発現ベクターでの形質転換後にＨｉｓ＋表現型を獲得したピキア・パストリスＢＫＭ−９０株（ＥＰ００４３８２００）から得たｈｉｓ３栄養要求変異株である（Ｙｏｎｇ Ｖ．ら、（１９９２）サッカロミセス・セレビシアのＨＩＳ−３遺伝子が相補する酵母ピキア・パストリスのｈｉｓ変異（ＨＩＳ−３ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｈｉｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ Ａｐｌｉｃａｄａ ９：５５−６１）。
【００２１】
いくつかの研究は、種々の魚類種において組換えＧＨの浸漬での投与による成長刺激効果を示している。しかし本発明は、標的タンパク質の事前精製を行わずに、ＧＨと比較してより高い活性を有するポリペプチドを含むピキア・パストリス培養上清への浸漬による魚類での成長刺激についての最初の報告である。成長、病原体抵抗性及び免疫系パラメーターにわたる本発明に記載のポリペプチドの効果は、ティラピアの仔魚で試験し、ティラピア成長ホルモンと比較した。
【００２２】
処置は浸漬によって施した。実験群は、以下の通りである。
前記ポリペプチドを含む組換えピキア・パストリスＭＰ３６株の培養上清
ティラピアＧＨを含む組換えピキア・パストリスＭＰ３６株の培養上清
非形質転換ピキア・パストリスＭＰ３６株の培養上清を含むネガティブコントロール
未処置群
【００２３】
結果は、ポリペプチドで処置した群はその重量がｔｉＧＨ群、ネガティブコントロール群及び未処置群と比較して有意に増大していることを示した。免疫系に対する効果を分析するために、２０匹をホモジナイズした。リゾチーム及びレクチンなどの種々の非特異的体液性因子の存在並びに酸化ストレスの以下のパラメーターを測定した。
還元グルタチオン：ＧＳＨは酵素グルタチオンペルオキシダーゼの補因子である。これは酸化ストレスに対する防御機構のうちの１つである。我々は、群の間に統計的差異を認めなかった。しかしポリペプチド１及び２で処置した群において増大する傾向がある。
スーパーオキシドジスムターゼ：ＳＯＤは抗酸化防御に属する酵素である。これはスーパーオキシド遊離ラジカルを捕捉する。我々は、群の間に統計的差異を認めなかった。ポリペプチド１及び２で処置した群において増大する傾向がある。
総オルガノペルオキシド：これは酸化促進系の要素の１つであり、ヒドロキシルラジカル前駆体の１つである。これは遺伝子発現の誘導物質、細胞機構の活性化物質並びにホスファターゼ及びキナーゼの調節物質でもあり得る。それは、生体異物の解毒に必要なグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの補因子でもある。群の間に統計的差異はない。
カタラーゼ：これは、生分子の酸化をもたらす酸化ストレスの指標である。カタラーゼのレベルが増大することは、グルタチオンペルオキシダーゼによって代謝され得ない遊離ラジカルが存在することを示唆する。実験開始から２１日目において群の間に統計的差異はなかった。４５日目で、対照と比較してポリペプチドで処置した群においてカタラーゼレベルが低下していた。
過酸化能：これは脂質酸化の指標である。我々は、ポリペプチド１及び２で処置した群において増大している傾向として、未処置群と比較して処置群において統計的有意差を得た。
タンパク質酸化：これはタンパク質酸化の指標である。我々は群の間に統計的差異を認めなかった。
【００２４】
過酸化能は生物における酸化ストレスの指標であることから、我々はアッセイしたポリペプチドが未処置群と比較していくらかの酸化ストレスをもたらしていると推定できる。酸化ストレスは重要な制御事象である。実験開始から４５日目において、脂質酸化に影響する酸化ストレスがある場合であっても、未処置群と比較して処置群においてはカタラーゼレベルが有意に低下している。この事象は遊離ラジカル及び酸化ストレスのレベルの低下を示唆している。
【００２５】
エネルギーを貯蔵する他の生分子と比較して脂質は大きなエネルギー／質量比を有する。ＧＨが脂質の生合成を阻害し、脂質分解を活性化し、生成された脂肪酸が理想的な酸化基質であることが示されている。結果として、アミノ酸は酸化プロセスから成長へ移動する。我々の実験において観察された脂質の酸化はこのプロセスと関連付けることができた。
【００２６】
免疫系と関連する他のパラメーターはリゾチーム及びレクチンである。
【００２７】
リゾチームはウイスル及び細菌の感染に対する非特異的免疫機能の構成要素の１つである。魚類でリゾチームレベルとＧＨとの間に相関が観察されている（Ｙａｄａ Ｔ．ら、（２００２）ティラピア（カワスズメ（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｍｏｓｓａｍｂｉｃｕｓ））におけるプロラクチン及び成長ホルモンの免疫調節効果（Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｌａｃｔｉｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｉｌａｐｉａ，Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｍｏｓｓａｍｂｉｃｕｓ）Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１７３：４８３−４９２）。
【００２８】
レクチンは多様な病原体と反応し、生物に自然免疫を与える（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ．Ｂ．及びＩｎｇｒａｍ Ｇ．Ａ．（１９９２）魚類の非細胞性非特異的防御機構（Ｎｏｎｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｆｅｎｃｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｆｉｓｈ）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｆｉｓｈ．Ｄｉｓ．２：２４９−２７９）。
【００２９】
我々は未処置群と比較してポリペプチド１及び２での処置群において両方のパラメーターについて統計的有意差を観察した。
【００３０】
これらのポリペプチドの効果を観賞用仔魚においても試験した。これらは対照と比較してポリペプチド処置群において成長及び生存率を刺激することができた。これらは魚の色素形成も改善する。このパラメーターは観賞用魚類の商品化において重要である。これらのポリペプチドによってもたらされる効果が処置停止の１５日後に明らかであったことが示された。
【実施例】
【００３１】
（実施例１）
本発明の主題であるポリペプチド及びティラピア成長ホルモンのコード配列を含有するピキア・パストリス発現ベクターの構築、ＭＰ３６株への形質転換並びに該タンパク質の発現
前記ポリペプチドのコード配列は、あらかじめｐＲ１７ベクターにクローニングしたティラピアｃＤＮＡを鋳型として使用する特異的オリゴヌクレオチドでのＰＣＲにより得た。ポリペプチド配列番号７のコード配列を増幅するために、我々は配列番号１及び配列番号２の配列に対応するオリゴヌクレオチドを使用した。ポリペプチド配列番号８のコード配列を増幅するためには、我々は配列番号３及び配列番号４の配列に対応するオリゴヌクレオチドを使用した。
【００３２】
ｔｉＧＨのコード配列を、配列番号５及び配列番号６の配列に対応するオリゴヌクレオチドを使用してベクターｐＲ１７からＰＣＲにより増幅した。遺伝子の末端をリン酸化し、発現ベクターへのクローニングを容易にするためにＰＣＲ産物をポリヌクレオチドキナーゼ酵素で処理した。ピキア・パストリス発現ベクターｐＰＳ１０を制限酵素ＮａｅＩで酵素消化し、末端を脱リン酸化するためにアルカリホスファターゼ処理した。該ポリペプチド及びｔｉＧＨをコードする遺伝子をＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用して発現ベクターに連結した（図１）。
【００３３】
形質転換の前に、プラスミドを酵素ＳｐｈＩで直鎖化した。ピキア・パストリスＭＰ３６株を組換え発現ベクターでのエレクトロポレーションにより形質転換した。この株は形質転換後にＨｉｓ＋表現型を獲得したｈｉｓ３栄養要求変異株である。
【００３４】
ドットブロットで同定した形質転換体を、組換えプラスミドの発現カセットでのＰ．パストリスのＡＯＸ１遺伝子の置換による組込みがどれに生じたかを判定するためにサザンブロットによっても分析した。この組込み事象はＭｕｔｓ（低レベルのメタノールの利用）及びＨｉｓ＋表現型をもたらす。ＡＯＸ１の遺伝子の置換は、ベクター及びゲノム中のプロモーター領域ＡＯＸ１から３’ＡＯＸ１の間の組換えにより生じる。組換えの結果として、ＡＯＸ１のコード領域に欠失が生じる。Ｍｕｔｓ表現型を有する組換え株は、ＡＯＸ２遺伝子でのアルコールオキシダーゼ産生を保持し、これらはメタノール中で低い増殖速度を有する。
【００３５】
該ポリペプチド及びティラピア成長ホルモンをコードする遺伝子は、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあり、メタノールで誘導可能であり、これらはシグナルペプチドを有する。ピキア・パストリスの自己タンパク質の分泌は低レベルであり、その培養培地は添加物としてタンパク質を必要としない。したがって、分泌される異種タンパク質が培地中の総タンパク質で高い割合（８０％を超える）を占めることが期待できる（Ｔｓｃｈｏｐｐ ｙ ｃｏｌ．；Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９８７，５：１３０５−１３０８；Ｂａｒｒら、；Ｐｈａｒｍ．Ｅｎｇ．１９９２，１２：４８−５１）。本発明の組換えタンパク質の生成は５Ｌのバイオリアクターで培地にメタノールを添加して実施した。図２に示すように、ティラピアＧＨに特異的なモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロットを培地上清中のタンパク質の発現を調べるために使用した。
【００３６】
（実施例２）
該ポリペプチドを含有するＰ．パストリス培養上清での浸漬によるティラピアでの生育実験、免疫系への効果
実験は、１週間に３回９０分間の浸漬により実施した。投与量は水１リットル当たり標的タンパク質０．１ｍｇとした。実験群は以下の通りとした。：
１．ポリペプチド１を含有するＰ．パストリス培養上清で処置した群（処置１）
２．ポリペプチド２を含有するＰ．パストリス培養上清で処置した群（処置２）
３．ティラピアＧＨを含有するＰ．パストリス培養上清で処置した群（処置３）
４．非形質転換Ｐ．パストリス培養上清で処理したネガティブコントロール群（ネガティブコントロール）
５．未処置群
【００３７】
実験開始から４５日目において、ポリペプチド配列番号７で処理した仔魚は、未処置群、ネガティブコントロール及びｔｉＧＨ処置群と比較してそれぞれ３．６、２．１及び１．６倍高い重量の増大があった。一方、ポリペプチド配列番号８で処理した仔魚は未処置群と比較して３．２倍、ネガティブコントロールと比較して１．９倍及びｔｉＧＨ処置群と比較して１．４倍高い重量の増大があった（表１、表１．１、図３）。
【表１】
【表２】
【００３８】
経済的に重要な魚類の発育の初期段階における成長を加速させると、養殖の生産性を増大させるために決定的である生存率が増大するので、これらは、非常に重要な結果である。
【００３９】
免疫系への効果を分析するために、１群当たり２０匹を実験開始から２１日目及び４５日目に採取した。仔魚をホモジナイズし、酸化ストレスの種々のパラメーター、ＧＳＨ、ＳＯＤ、総オルガノペルオキシド、カタラーゼ、過酸化能及びタンパク質酸化を測定した。
【００４０】
我々は、実験開始から２１日目でネガティブコントロールと比較した処置群の過酸化能においてのみ差異を観察した。我々は、実験開始から４５日目の仔魚抽出物中のリゾチーム活性を測定した。試料（仔魚ホモジェネート）のリゾチーム活性は、細菌ミクロコッカス・リソデイクチカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）を溶菌するリゾチームの能力に基づく方法を使用して測定した。９６穴マイクロトレイにおいて、リン酸緩衝液（０．０５Ｍ，ｐＨ６．２）中での４つの２倍系列希釈の試料１００μｌを３ｍｇ／ｍｌミクロコッカス・リソデイクチカス（Ｓｉｇｍａ）の懸濁液１００μｌと混合した。マイクロトレイを２２℃でインキュベートし、０、１５、３０及び６０分に４５０ｎｍでＯ．Ｄ．を読み取った。ポジティブコントロールとしては、仔魚ホモジェネートをニワトリ卵白リゾチーム（８μｇ／ｍｌからの系列希釈）に置き換え、ネガティブコントロールとしては、仔魚ホモジェネートを緩衝液に置き換えた。リゾチーム活性の１単位は、Ｏ．Ｄ．読み値の０．００１ｍｉｎ−１での減少を生じさせる仔魚ホモジェネートの量と定義した。我々は、未処置群と比較してポリペプチド配列番号７及び配列番号８での処置群において統計的有意差を観察した（表２）。
【００４１】
仔魚ホモジェネート中のレクチンを測定するために血球凝集アッセイも実施した。仔魚抽出物の２倍系列希釈を、同容量の新鮮調製２％赤血球懸濁液（ウサギ、ＰＢＳ中）を入れたＵ底型（９６穴、Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｍｉｃｒｏｌｏｎ）マイクロタイターウェルでＰＢＳ ｐＨ７．２を使用して実施した。ウェルを１時間室温でインキュベートし、力価を目視で読み取り、凝集を示した（ウェル底全体に均等に分散した細胞の層で明らかになる）最後のウェルでの希釈に相当するとした。試料の血球凝集活性を検討し、各々の力価の値を得た。活性は力価、すなわち完全な凝集を示す最も高い希釈率の逆数で表した。
【００４２】
我々は、未処置群と比較してポリペプチド配列番号７及び配列番号８での処置群において統計的有意差を観察した（表３）。
【表３】
【表４】
【００４３】
（実施例３）
該ポリペプチドを含むピキア・パストリス培養上清での浸漬浴による金魚における生育刺激実験及び仔魚の品質の改善
４つの実験群を設計した。処置は、浸漬浴、１週間に３回９０分間から成る。投与量は水１リットル当たり標的タンパク質０．１ｍｇとした。実験群は、以下の通りとした。
１．ポリペプチド１を含むＰ．パストリス培養上清で処置した群（処置１）
２．ポリペプチド２を含むＰ．パストリス培養上清で処置した群（処置２）
３．ティラピアＧＨを含むＰ．パストリス培養上清で処置した群（処置３）
４．非形質転換Ｐ．パストリス培養上清で処置したネガティブコントロール群（ネガティブコントロール）
【００４４】
実験開始から４５日目に処置３及び４と比較して処置１及び２は有意な重量の増大を示した。
【００４５】
７５日目に、ポリペプチド配列番号７及び配列番号８で処置した仔魚は、ネガティブコントロールと比較して２倍、ｔｉＧＨ処置群と比較して１．５倍高い重量の増大があった（表４；表４．１；図４）。さらに、処置１、２及び３はネガティブコントロールと比較して生存率の増大を示した（図５）。
【００４６】
観賞用魚の色はその商業化のために非常に重要なパラメーターである。本実験において我々は、ネガティブコントロールと比較して処置１及び２での仔魚が初期の発育段階において色を呈したことを観察した。実験開始から７５日目にこれらはより鮮やかな色を有した（図６）。
【００４７】
我々は他の観賞用魚種でも同様の結果を得た。
【表５】
【表６】
【００４８】
（実施例４）
ポリペプチド１の種々の投与量での浸漬浴によるコイにおける生育実験
我々は、コイ仔魚の成長におけるポリペプチド１の種々の投与量での効果を検討した。４つの実験群を以下通り設計した。
１．ポリペプチド配列番号７を水１リットル当たりポリペプチド０．０２ｍｇの投与量で含むＰ．パストリス培養上清で処置した群（処置１）
２．ポリペプチド配列番号７を水１リットル当たりポリペプチド０．１ｍｇの投与量で含むＰ．パストリス培養上清で処置した群（処置２）
３．ポリペプチド配列番号７を水１リットル当たりポリペプチド０．５ｍｇの投与量で含むＰ．パストリス培養上清で処置した群（処置３）
４．未処置群
【００４９】
実験開始から３０日目において、水１リットル当たりポリペプチド配列番号７を０．５ｍｇの投与量で処置した仔魚は未処置群と比較して２．７５倍高い重量の増大があった。一方、水１リットル当たりポリペプチド配列番号７を０．１ｍｇの投与量で処置した仔魚は未処置群と比較して１．８倍高い重量の増大があった。未処置群と最小投与量での処置群の間には統計的差異はなかった（表５；表５．１；図７）。
【表７】
【表８】
【００５０】
（実施例５）
該ポリペプチドを含有するＰ．パストリス培養上清への浸漬による仔エビ、リトペナエウス・シュミッティ（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ ｓｃｈｍｉｔｔｉ）における生育実験
３つの実験群を設計した。処置は、浸漬浴、１週間に３回１時間３０分から成る。投与量は水１リットル当たり該タンパク質０．１ｍｇとした。実験群は、以下の通りとした。
１．ポリペプチド配列番号７を含むＰ．パストリス培養上清で処置した群（処置１）
２．ポリペプチド配列番号８を含むＰ．パストリス培養上清で処置した群（処置２）
３．非形質転換Ｐ．パストリス培養上清で処理したネガティブコントロール群（ネガティブコントロール）
【００５１】
実験の結果として、我々は該ポリペプチドで処置したエビの仔エビの品質における改善を得た。ポリペプチド配列番号７及び配列番号８で処置した仔エビはネガティブコントロールと比較して２．３倍高い体重増加があり、エラ、体肢、吻がより形成していた。各パラメーターについて対応する統計的試験を行い、統計的有意差が全ての場合において認められた。
【００５２】
（実施例６）
ポリペプチド配列番号７の種々の投与量での食餌投与によるティラピアにおける生育実験
我々は、開始時重量７２．９９±３．２５ｇのティラピア稚魚の成長についてのポリペプチド配列番号７の２つの投与量での効果を測定した。試験を行った投与量は、餌１ｋｇ当たりポリペプチド配列番号７を４．８ｍｇ及び餌１ｋｇ当たりポリペプチド配列番号７を３８．４ｍｇとした。経口製剤は該ポリペプチドを含有するピキア・パストリス培養上清を基礎餌に混合することにより作製した。ネガティブコントロールは、非形質転換Ｐ．パストリス培養上清を加えた基礎餌を与えたティラピアとした。実験中、魚には１日２回、体重の５％に相当する量の餌を６週間与えた。
【００５３】
餌１ｋｇ当たりポリペプチド配列番号７を４．８ｍｇの投与量で食餌に含まれるポリペプチド配列番号７は対照群と比較して、高度に有意な統計的差異で（ｐ＜０．００１）２２％成長を増大させた。餌１ｋｇ当たりポリペプチド配列番号７を３８．４ｍｇの投与量では、ネガティブコントロールとの比較で差異は示さなかった（表６；表６．１；図８）。
【表９】
【表１０】
【００５４】
現在、水生生物は重要な蛋白源であるが、自然環境での捕獲物は完全に利用されている。このため、生産を増大させるためにはこれらの水生種の養殖が必要である。広範囲に生息する生物の多くにおいてホルモン類の投与、遺伝的改変などにより成長を操作できることが示されている（Ｐｕｌｌｉｎ ｙ ｃｏｌ．；Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ７，４３２ｐ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｌｉｖｉｎｇ Ａｑｕａｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｍｏｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｍａｎｉｌａ，Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ．１９８２，ＩＳＳＮ ０１１５−４３８９）。
【００５５】
本明細書に記載のポリペプチドは、それらが種特異的でなく、したがってこのペプチドが成長、生存率及び仔魚の品質を増大すること並びに免疫応答に含まれる種々のパラメーターを改善することなどの多数の作用のために種々の水生生物について応用可能であるという有利点を有する。さらに、これらが成長ホルモンと比較して有意に高い成長への効果を有することが示された。一方、これらのポリペプチドはヒトに生物活性を有さず、ヒトが消費するための生物に前記生成物を応用することが有する不都合を減少させる。さらに、これらのポリペプチドの観賞用魚類における使用は、このポリペプチドが、生育を加速させた結果、養殖期間を短縮するだけでなく、この魚類において色についての効果も有することから非常に魅力的である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ピキア・パストリス発現ベクターにおけるクローニング戦略の図である。
【図２】Ｍｕｔｓ表現型を示す形質転換体の発現分析の図であり、ピキア・パストリス培養上清に発現した標的タンパク質のウエスタンブロットの図である。ライン１：非形質転換ＭＰ３６、ライン２：ポリペプチド１、ライン３：ポリペプチド２、ライン４：ティラピア成長ホルモン
【図３】水１リットル当たり０．１ｍｇの投与量で該タンパク質を含有するピキア・パストリス培養上清への浸漬によるティラピア仔魚における生育実験の図であり、ネガティブコントロールと比較した処置群の平均体重を示す図である。
【図４】水１リットル当たり０．１ｍｇの投与量で該タンパク質を含有するピキア・パストリス培養上清への浸漬による金魚仔魚における生育実験の図であり、ネガティブコントロールと比較した処置群の平均体重を示す図である。
【図５】水１リットル当たり０．１ｍｇの投与量で該タンパク質を含有するピキア・パストリス培養上清への浸漬による金魚仔魚における生育実験の図であり、実験開始から４５日目の実験群の生存率を示す図である。
【図６】水１リットル当たり０．１ｍｇの投与量で該タンパク質を含有するピキア・パストリス培養上清への浸漬による金魚仔魚における生育実験の図であり、処置した魚はネガティブコントロールよりもさらに鮮やかな色を呈していることを示す図である。
【図７】ポリペプチド１を３つの異なる投与量（水１リットル当たり０．０２、０．１及び０．５ｍｇ）で含有するピキア・パストリス培養上清への浸漬によるコイ仔魚における生育実験の図であり、ネガティブコントロールと比較した処置群の平均体重を示す図である。
【図８】ポリペプチド１を２つの異なる投与量（餌１ｋｇ当たりポリペプチド４．８ｍｇ及び餌１ｋｇ当たりポリペプチド３８．４ｍｇ）で含有するピキア・パストリス培養上清を食餌投与することによるティラピアにおける生育実験の図であり、ネガティブコントロールと比較した処置群の平均体重を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水生生物工学の分野に関し、より具体的にはティラピア成長ホルモンと比較してより高い活性を有するポリペプチド、並びに浸漬により又は飼料添加物として処置した仔魚の生存率及び品質を増大させるための前記ポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
水生生物の成長を促進する作用物質の探索は、いくつかの研究所において注目の的になっている。成長ホルモン（ＧＨ）は本研究の主題である。
【０００３】
哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類及び魚類におけるＧＨの存在が報告されている。ＧＨ又はソマトトロピンは視床下部ペプチドへの応答で脳下垂体前葉の成長ホルモン分泌細胞によって合成及び分泌されるポリペプチドである（Ｂａｒｉｎａｇａ Ｍ．ら（１９８５）成長ホルモン放出及び遺伝子転写への成長ホルモン放出因子の独立効果（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２７９−２８１）。ＧＨは、魚類の成長制御、発達、代謝、摂食及び浸透圧調整において必要である（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ Ｅ．Ｍ．ら、（１９７９）成長のホルモンによる増強（Ｈｏｒｍｏｎａｌ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ）Ｆｉｓｈ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８：４５５−５９７）。さらに、その新陳代謝効果は身体の出生後の成長にわたり、魚類においては免疫系細胞にも効果を有する。ＧＨはＴ細胞の増殖を促進する。その抗原受容体活性及びリンパ球の成熟における共刺激因子としての役割は十分に立証されている（Ｈａｒｒｉｓ Ｈ．及びＢｉｒｄ Ｄ．Ｊ．（１９９７）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのニジマス（オンコリンカス・マイキス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ））リンパ球の増殖へのα−ＭＳＨ及びＭＣＨの効果（Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ α−ＭＳＨ ａｎｄ ＭＣＨ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒａｉｎｂｏｗ ｔｒｏｕｔ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．）Ｉｎ：Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｓ．，Ｋｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．（編），Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．Ｍｏｎｄｕｚｚｉ Ｅｄｉｔｏｉｒｅ，Ｂｏｌｏｇｎ ｐｐ．１０２３−１０２６ａ）。
【０００４】
ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージ顆粒球刺激因子及びインターフェロンなどの多数のサイトカインとの構造的類似性は非常に興味深い（Ｓｐｒａｎｇ Ｓ．Ｒ．及びＢａｚａｎ Ｊ．Ｆ．（１９９３）サイトカインの構造分類学及び受容体結合機構（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｔａｘｏｎｏｍｙ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．３：８１５−８２７）。
【０００５】
哺乳類において、ＧＨは食作用、胸腺の成熟及び分化（Ｏｒｔｅｇａ Ｅ．ら、（１９９６）マクロファージのｉｎ ｖｉｔｒｏ食作用能におけるプロラクチンの効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｌａｃｔｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈｇｅｓ）Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．６１：３８９−３９３）及びＴ細胞産生細胞のアポトーシス（Ｍｕｒｐｈｙ Ｗ．Ｊ．及びＬｏｎｇｏ Ｄ．Ｌ．（２０００）免疫制御治療薬としての成長ホルモン（Ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ａｓ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １２１：２１１−２１３）を刺激する。同様に、ヨーロッパ・ヘダイ（Ｓｐａｒｕｓ ａｕｒａｔａ）及びヘダイ（Ｓｐａｒｕｓ ｓａｒｂａ）におけるリンパ球生成及び食作用刺激因子としてのＧＨの効果と共にサケ（Ｏ．ｋｅｔａ）における白血球の有糸分裂誘発（Ｓａｋａｉ Ｍ．ら、（１９９６）外因性成長ホルモンを注射投与したニジマス、オンコリンカス・マイキス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）由来血清の溶血活性の増大（Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｆｒｏｍ ｒａｉｎｂｏｗ ｔｒｏｕｔ Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｕｓ ｍｙｋｉｓｓ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）Ｆｉｓｈ Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：６１５−６１７）、食作用、ＮＫ細胞の活性化、抗体産生、オンコリンカス・マイキス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）における補体溶血活性（Ｙａｄａ Ｔ．ら、（１９９９）下垂体を切除したニジマス、オンコリンカス・マイキス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）の血漿免疫グロブリンＭレベルへのプロラクチン及び成長ホルモンの効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｌａｃｔｉｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｏｎ ｐｌａｓｍａ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｍ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｈｉｐｏｐｈｙｓｅｃｔｏｍｉｚｅｄ ｒａｉｎｂｏｗ ｔｒｏｕｔ，Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）Ｇｅｎ．Ｃｏｍｐ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：４６−５２）並びにニジマス（オンコリンカス・マイキス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ））及びディケントラルクス・ラブラクス（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ ｌａｂｒａｘ）における白血球呼吸性バースト（Ｍｕｎｏｚ Ｐ．ら、（１９９８）成長ホルモン及び寄生状態による地中海シーバス（ディケントラルクス・ラブラクスＬ（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ ｌａｂｒａｘ Ｌ．））食細胞の呼吸バースト活性の制御（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｂｕｒｓｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ ｓｅａ ｂａｓｓ（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ ｌａｂｒａｘ Ｌ．）ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｓｔａｔｕｓ）Ｆｉｓｈ Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：２５−３６）が研究されている。
【０００６】
頭部、腎臓の白血球の食作用活性の増大及び血漿リゾチーム濃度の増大と相関関係にある甲状腺ホルモンのレベルの減少を伴うブラウン・トラウト（Ｓａｌｍｏ ｔｒｕｔｔａ）の淡水から海水への移動の結果としての血漿ＧＨレベルの増大が示されている。いくつかの研究はリンパ球において特異的なＧＨ受容体及びＩＧＦ受容体の発現を示した（Ｔａｐｓｏｎ Ｖ．Ｆ．ら、（１９８８）インスリン様成長因子Ｉに対するヒトＴリンパ球受容体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの構造及び機能の性質決定（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｉ ｉｎ ｖｉｔｒｏ）Ｃｌｉｎ，Ｃ．Ｉｎｖｅｓｔ．８２：９５０−９５７）。Ｔ細胞増殖におけるＩＧＦ−Ｉのｉｎ ｖｉｔｒｏでの効果は示されている。Ｂ細胞、免疫グロブリン及び形質細胞についてのＩＧＦ−Ｉの誘導効果は十分に周知である。Ｂ細胞はＧＨ受容体の最も高いレベルの発現を示す（Ｂａｄｏｌａｔｏ Ｒ．ら、（１９９４）二重蛍光フローサイトメトリーで検出したヒト抹消血リンパ球における表面膜の成長ホルモン受容体の発現差異（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｄｕａｌ ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．７９：９８４−９９０）。
【０００７】
ＧＨは、そのマクロファージ及び単球への活性化効果を通じてリンパ球Ｂ及びＴに間接的に影響を与えることができる（Ｅｄｗａｒｄｓ Ｃ．Ｋ．ら、（１９８８）ソマトトロピンの新たに同定された特性：スーパーオキシドアニオン産生のためのマクロファージのプライミング（Ａ ｎｅｗｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｏｆ ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｉｎ：ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：７６９−７７１）。最後の作用は走化性も促進する。これらの細胞はサイトカインの分泌によりリンパ球にも作用する。ＧＨはＮＫ細胞欠乏を回復させる（Ｄａｖｉｌａ Ｄ．Ｒ．ら、（１９８７）老齢、ヌード及びトランスジェニックのげっ歯類におけるＴ依存性免疫事象の制御における成長ホルモンの役割（Ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｍｍｕｎｅ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ａｇｅｄ，ｎｕｄｅ，ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｏｄｅｎｔｓ）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．１８：１０８−１１６）。
【０００８】
いくつかの魚類成長ホルモンの相補ＤＮＡは、クローニング及び配列決定されている。注射投与による（Ｔｓａｉ Ｈ．Ｊ．ら、（１９９３）酵母でのニジマス成長ホルモンｃＤＮＡの発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒａｉｎｂｏｗ ｔｒｏｕｔ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｃＤＮＡ ｉｎ ｙｅａｓｔ）Ｂｕｌｌ．Ｉｎｓｔ．Ｚｏｏｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｎ．３２：１６２−１７０）又は浸漬による（Ｍｏｒｉｙａｍａ Ｓ．及びＫａｗａｕｃｈｉ Ｈ．（１９９０）組換えサケ成長ホルモンへの浸漬によるサケ科仔魚の成長刺激（Ｇｒｏｗｔｈ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｓａｌｍｏｎｉｄｓ ｂｙ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓａｌｍｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｕｉｓａｎ Ｇａｋｋａｉｓｈｉ ５６：３１−３４）魚類での成長における組換えＧＨの強力な効果が示されている。
【０００９】
ヒトＧＨは、下垂体（Ｂａｕｍａｎｎ Ｇ．ら、（１９８３）健常者及び先端巨大症患者における循環している成長ホルモンの分子的特質：主要な及び微量の単量体形態についての証拠（Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ａｃｒｏｍｅｇａｌｉｃ ｍａｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ａｎｄ ｍｉｎｏｒ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍｓ）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．５６：９４６−９５２）、血漿（Ｂａｕｍａｎｎ Ｇ．ら、（１９８５）自発的分泌エピソード及び基礎状態において循環している成長ホルモンの分子形態（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｄｕｒｉｎｇ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｅｐｉｓｏｄｅｓ ａｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｓａｌ ｓｔａｔｅ）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．６０：１２１６−１２２０）及び尿（Ｂａｕｍａｎｎ Ｇ．及びＡｂｒａｍｓｏｎ Ｅ．Ｃ．（１９８３）ヒトにおける尿中成長ホルモン：多様な分子形態の証拠（Ｕｒｉｎａｒｙ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ ｍａｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｓ）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ５６：３０５−３１１）において検出できる構造的に関連したタンパク質の不均一な群として存在している。ヒトＧＨの主なバリアントは固有のポリペプチド鎖により構成されている２２ｋＤａのポリペプチドである。このポリペプチドは免疫反応性のヒトＧＨの８５％を構成している（Ｌｅｗｉｓ Ｕ．Ｊ．ら、（１９９４）血清中ヒト成長ホルモンのバリアントの形態及び断片（Ｖａｒｉａｎｔ ｆｏｒｍｓ ａｎｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ ｓｅｒｕｍ）Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｐｐｌ．３９９：２９−３１）。ヒトＧＨの他のバリアントは、分子量２０ｋＤａの１本鎖ポリペプチド（Ｌｅｗｉｓ Ｕ．Ｊ．ら、（１９７８）ヒト成長ホルモンの天然に存在する構造バリアント（Ａ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：２６７９−２６８７）、アセチル化及び脱アミド化した２２ｋＤａの形態（Ｌｅｗｉｓ Ｕ．Ｊ．ら、（１９８１）脱アミド化の結果としてのヒト成長ホルモンのタンパク質分解による切断の変化（Ａｌｔｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ａｓ ａ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１１６４５−１１６５０）並びにジスルフィド結合で連結した２本のポリペプチド鎖を有し、タンパク質分解の切断で生じる短縮バリアント（Ｓｉｎｇｈ Ｒ．Ｎ．ら、（１９７４）生物活性が増大したヒト成長ホルモンの修飾形態（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ９４：８８３−８９１）を含む。いくつかの研究は最後のバリアントが最も活性であることを示していた。この分子は２２ｋＤａのｈＧＨのアミノ酸１３４から１５０の間でのプロテイナーゼ消化の結果によるものである（Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ Ｖ．Ｊ．ら、（１９９１）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのラット組織によるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のタンパク質分解による切断：外因性に投与されたｈＧＨの動態についての影響（Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ（ｈＧＨ）ｂｙ ｒａｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｌｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｈＧＨ）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２９：４６５−４７４）。この短縮バリアントの増大した生物活性は、その安定性の増大及びそれが他よりも低い代謝クリアランス率を有するという事実によるものであることが示唆されている（Ｂａｕｍａｎｎ Ｇ（１９７９）ヒトにおけるヒト成長ホルモンのイソホルモンの代謝クリアランス率（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｉｓｏｈｏｒｍｏｎｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ ｍａｎ）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．４９：４９５−４９９）。
【００１０】
組換えＤＮＡ技術の発展により、比較的安価な過程で目的タンパク質を生成するための宿主系としての細菌及び酵母の使用が可能になっている。酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、異種タンパク質を生成するための宿主として広く使用されている。この生物は、高いレベルの発現、操作及び培養の容易さなどに関連する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの他の系の恩恵を提供し、さらにこれらとタンパク質分解プロセシング、リフォールディング、グリコシル化及びジスルフィド結合形成などの翻訳後修飾を実現する真核系の有利点とを組み合わせることができる（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｒ．及びＣｒｅｇｇ Ｊ．Ｍ．（１９９８）ピキア・パストリスの手引き（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｐｉｃｈｉａ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｗｏｔａ １−１５）。発現系として、このシステムは簡単な遺伝子的及び分子的操作を必要とし、それは増殖及び発現用の培地が特別な補充剤を必要としないことから昆虫細胞又は哺乳類組織の培養における発現よりも高価でない。この酵母は大規模発酵に容易に適応し、高密度での培養を容易にする生理的な特性である呼吸性増殖の選択性を有する。
【００１１】
成長ホルモンを発現している組換え酵母を使用する成長刺激のいくつかの研究が発表されている。ＧＨを発現している組換えピキア・パストリスを加えた餌の投与後でのニワトリの成長における効果が示されている（Ｃｈｅｎ Ｃ．Ｍ．ら、（２０００）成長ホルモンを豊富に含む組換え酵母培養液の食餌投与によるニワトリの成長増強（Ｇｒｏｗｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｆｏｗｌｓ ｂｙ ｄｉｅｔａｒｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｙｅａｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６７：２１０３−２１１５）。さらに、Ｔｓａｉ．ら、１９９３は、ＧＨを発現している組換えサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の食餌投与により成長を加速させ（Ｔｓａｉ Ｈ．Ｊ．ら、（１９９３）栄養補助剤としての組換え酵母溶解産物の食餌投与によるティラピアの成長の増強（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｉｌａｐｉａ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｄｉｅｔａｒｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｙｅａｓｔ ｌｙｓａｔｅｓ ａｓ ａ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）Ｊ．Ｆｉｓｈ．Ｓｏｃ．Ｔａｉｗａｎ ２０：３３９−３４５）。
【００１２】
魚類成長ホルモンに類似する活性を有するポリペプチド及び魚類において成長を促進し、仔魚の死亡率を減少させるためのその使用は米国特許第６２３９１００号において保護されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
成長を加速させ、生存率を増大させ、仔魚の品質を改善することはいまだに水産養殖における主な課題の１つである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、ティラピアＧＨと比較してより高い活性を示すアミノ酸配列、配列番号７又は８を有するポリペプチド並びに魚類及び甲殻類でのその応用における前記課題の解決法を提供する。主な結果として、我々は前記アミノ酸配列を含み、ピキア・パストリスで細胞外へ発現されるこれらのポリペプチドは、浸漬浴により又は食餌添加物として魚類及び甲殻類に投与されると成長速度、生存率及び仔魚の品質を増大させることを見出した。同様に、これらは免疫状態を改善する。ティラピア成長ホルモンと比較したポリペプチドの優位性が示された。
【００１５】
水産養殖におけるこれらのポリペプチドの使用はいくつかの有利点を有する、１）それらは魚類ＧＨより小さな分子であり、生物により吸収され血流に容易に達することができる、２）それらが魚類ＧＨの断片であることから、それらはヒトに生物活性を有さない、３）それらは魚類ＧＨよりも成長に強力な効果を有する、４）それらは広範な魚類種で成長、生存率及び仔魚の品質において著しい効果を有する。
【００１６】
米国特許第６，２３９，１００号は、成長を刺激し仔魚の死亡率を減少させる魚類ＧＨに関連する同様の活性を有するポリペプチドの使用を保護している。このポリペプチドについて報告されている配列は、ティラピアＧＨと比較して７３％のホモロジーを有し、Ｎ末端の５１ヌクレオチドが欠失している。本発明のポリペプチドはティラピア成長ホルモンから得た。ポリペプチド配列番号７はＣ末端に相当する４６アミノ酸の断片を欠失している。ポリペプチド配列番号８はＣ末端の同じ断片及びＮ末端の１７アミノ酸を欠失している。
【００１７】
ＧＨに類似する活性を有する米国特許第６，２３９，１００号に記載のポリペプチドと異なり、本発明のポリペプチドはＧＨと比較してより高い活性を有している。本活性は種特異的ではない。さらに、Ｃ末端の断片を欠失しているポリペプチド配列番号７はポリペプチド配列番号８に勝る成長促進活性を有している。
【００１８】
本発明の具体化において、アミノ酸配列、配列番号７及び８において定義されるポリペプチドのいずれかを含む組成物は魚類及び甲殻類において成長を刺激する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、前記ポリペプチドのコード配列のピキア・パストリス発現ベクターｐＰＳ１０へのクローニングを含んでいた。これらのポリペプチドのコード配列は、あらかじめｐＲ１７にクローニングされたｔｉＧＨのｃＤＮＡを鋳型として使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得た（Ｇｕｉｌｌｅｎ Ｉ．Ｉ．ら、（１９９８）大腸菌由来の相同成長ホルモンを注射投与された広塩性硬骨魚類の稚魚、ティラピア、オレオクロミス・ホルノラム（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｈｏｒｎｏｒｕｍ）における生理的変化（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｅｕｒｙｈａｌｉｎｅ ｔｅｌｅｏｓｔ，ｔｈｅ ｔｉｌａｐｉａ Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｈｏｒｎｏｒｕｍ，ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｅ．ｃｏｌｉ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）Ｊ Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：１４２−５１）。ティラピア成長ホルモンも同じベクター（ｐＲ１７）からのＰＣＲにより増幅した。
【００２０】
ピキア・パストリスにおける標的タンパク質の発現のための遺伝子構築において使用するベクターは、ピキア・パストリスＡＯＸ１プロモーター（ｐＡＯＸ１）、Ｓ．セレビシアスクロースインベルターゼ２（ｓｐＳＵＣ２）のシグナルペプチド及びＳ．セレビシアの酵素グリセルアルデヒド−３Ｐ−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰｔ）の終止コドンを含む。それは、酵母の選択マーカーであるＳ．セレビシアのＨＩＳ３遺伝子と前記酵母との間の相同組換えに必要な３’ＡＯＸ領域に相当する染色体ＤＮＡの断片も含む。ベクターは、大腸菌で機能する複製起点及び細菌の選択マーカーとしてのアンピシリン耐性遺伝子を有する。組換えピキア・パストリス株を作製するために使用するベクターは一般に組込み型である。形質転換に先立ちプラスミドはＡＯＸ１遺伝子による相同組換えを容易にするために直鎖化されるべきである。ピキア・パストリスＭＰ３６株を、組換えタンパク質の細胞外産生に使用した。この株は、発現ベクターでの形質転換後にＨｉｓ＋表現型を獲得したピキア・パストリスＢＫＭ−９０株（ＥＰ００４３８２００）から得たｈｉｓ３栄養要求変異株である（Ｙｏｎｇ Ｖ．ら、（１９９２）サッカロミセス・セレビシアのＨＩＳ−３遺伝子が相補する酵母ピキア・パストリスのｈｉｓ変異（ＨＩＳ−３ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｈｉｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ Ａｐｌｉｃａｄａ ９：５５−６１）。
【００２１】
いくつかの研究は、種々の魚類種において組換えＧＨの浸漬での投与による成長刺激効果を示している。しかし本発明は、標的タンパク質の事前精製を行わずに、ＧＨと比較してより高い活性を有するポリペプチドを含むピキア・パストリス培養上清への浸漬による魚類での成長刺激についての最初の報告である。成長、病原体抵抗性及び免疫系パラメーターにわたる本発明に記載のポリペプチドの効果は、ティラピアの仔魚で試験し、ティラピア成長ホルモンと比較した。
【００２２】
処置は浸漬によって施した。実験群は、以下の通りである。
前記ポリペプチドを含む組換えピキア・パストリスＭＰ３６株の培養上清
ティラピアＧＨを含む組換えピキア・パストリスＭＰ３６株の培養上清
非形質転換ピキア・パストリスＭＰ３６株の培養上清を含むネガティブコントロール
未処置群
【００２３】
結果は、ポリペプチドで処置した群はその重量がｔｉＧＨ群、ネガティブコントロール群及び未処置群と比較して有意に増大していることを示した。免疫系に対する効果を分析するために、２０匹をホモジナイズした。リゾチーム及びレクチンなどの種々の非特異的体液性因子の存在並びに酸化ストレスの以下のパラメーターを測定した。
還元グルタチオン：ＧＳＨは酵素グルタチオンペルオキシダーゼの補因子である。これは酸化ストレスに対する防御機構のうちの１つである。我々は、群の間に統計的差異を認めなかった。しかしポリペプチド１及び２で処置した群において増大する傾向がある。
スーパーオキシドジスムターゼ：ＳＯＤは抗酸化防御に属する酵素である。これはスーパーオキシド遊離ラジカルを捕捉する。我々は、群の間に統計的差異を認めなかった。ポリペプチド１及び２で処置した群において増大する傾向がある。
総オルガノペルオキシド：これは酸化促進系の要素の１つであり、ヒドロキシルラジカル前駆体の１つである。これは遺伝子発現の誘導物質、細胞機構の活性化物質並びにホスファターゼ及びキナーゼの調節物質でもあり得る。それは、生体異物の解毒に必要なグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの補因子でもある。群の間に統計的差異はない。
カタラーゼ：これは、生分子の酸化をもたらす酸化ストレスの指標である。カタラーゼのレベルが増大することは、グルタチオンペルオキシダーゼによって代謝され得ない遊離ラジカルが存在することを示唆する。実験開始から２１日目において群の間に統計的差異はなかった。４５日目で、対照と比較してポリペプチドで処置した群においてカタラーゼレベルが低下していた。
過酸化能：これは脂質酸化の指標である。我々は、ポリペプチド１及び２で処置した群において増大している傾向として、未処置群と比較して処置群において統計的有意差を得た。
タンパク質酸化：これはタンパク質酸化の指標である。我々は群の間に統計的差異を認めなかった。
【００２４】
過酸化能は生物における酸化ストレスの指標であることから、我々はアッセイしたポリペプチドが未処置群と比較していくらかの酸化ストレスをもたらしていると推定できる。酸化ストレスは重要な制御事象である。実験開始から４５日目において、脂質酸化に影響する酸化ストレスがある場合であっても、未処置群と比較して処置群においてはカタラーゼレベルが有意に低下している。この事象は遊離ラジカル及び酸化ストレスのレベルの低下を示唆している。
【００２５】
エネルギーを貯蔵する他の生分子と比較して脂質は大きなエネルギー／質量比を有する。ＧＨが脂質の生合成を阻害し、脂質分解を活性化し、生成された脂肪酸が理想的な酸化基質であることが示されている。結果として、アミノ酸は酸化プロセスから成長へ移動する。我々の実験において観察された脂質の酸化はこのプロセスと関連付けることができた。
【００２６】
免疫系と関連する他のパラメーターはリゾチーム及びレクチンである。
【００２７】
リゾチームはウイスル及び細菌の感染に対する非特異的免疫機能の構成要素の１つである。魚類でリゾチームレベルとＧＨとの間に相関が観察されている（Ｙａｄａ Ｔ．ら、（２００２）ティラピア（カワスズメ（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｍｏｓｓａｍｂｉｃｕｓ））におけるプロラクチン及び成長ホルモンの免疫調節効果（Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｌａｃｔｉｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｉｌａｐｉａ，Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｍｏｓｓａｍｂｉｃｕｓ）Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１７３：４８３−４９２）。
【００２８】
レクチンは多様な病原体と反応し、生物に自然免疫を与える（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ．Ｂ．及びＩｎｇｒａｍ Ｇ．Ａ．（１９９２）魚類の非細胞性非特異的防御機構（Ｎｏｎｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｆｅｎｃｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｆｉｓｈ）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｆｉｓｈ．Ｄｉｓ．２：２４９−２７９）。
【００２９】
我々は未処置群と比較してポリペプチド１及び２での処置群において両方のパラメーターについて統計的有意差を観察した。
【００３０】
これらのポリペプチドの効果を観賞用仔魚においても試験した。これらは対照と比較してポリペプチド処置群において成長及び生存率を刺激することができた。これらは魚の色素形成も改善する。このパラメーターは観賞用魚類の商品化において重要である。これらのポリペプチドによってもたらされる効果が処置停止の１５日後に明らかであったことが示された。
【実施例】
【００３１】
（実施例１）
本発明の主題であるポリペプチド及びティラピア成長ホルモンのコード配列を含有するピキア・パストリス発現ベクターの構築、ＭＰ３６株への形質転換並びに該タンパク質の発現
前記ポリペプチドのコード配列は、あらかじめｐＲ１７ベクターにクローニングしたティラピアｃＤＮＡを鋳型として使用する特異的オリゴヌクレオチドでのＰＣＲにより得た。ポリペプチド配列番号７のコード配列を増幅するために、我々は配列番号１及び配列番号２の配列に対応するオリゴヌクレオチドを使用した。ポリペプチド配列番号８のコード配列を増幅するためには、我々は配列番号３及び配列番号４の配列に対応するオリゴヌクレオチドを使用した。
【００３２】
ｔｉＧＨのコード配列を、配列番号５及び配列番号６の配列に対応するオリゴヌクレオチドを使用してベクターｐＲ１７からＰＣＲにより増幅した。遺伝子の末端をリン酸化し、発現ベクターへのクローニングを容易にするためにＰＣＲ産物をポリヌクレオチドキナーゼ酵素で処理した。ピキア・パストリス発現ベクターｐＰＳ１０を制限酵素ＮａｅＩで酵素消化し、末端を脱リン酸化するためにアルカリホスファターゼ処理した。該ポリペプチド及びｔｉＧＨをコードする遺伝子をＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用して発現ベクターに連結した（図１）。
【００３３】
形質転換の前に、プラスミドを酵素ＳｐｈＩで直鎖化した。ピキア・パストリスＭＰ３６株を組換え発現ベクターでのエレクトロポレーションにより形質転換した。この株は形質転換後にＨｉｓ＋表現型を獲得したｈｉｓ３栄養要求変異株である。
【００３４】
ドットブロットで同定した形質転換体を、組換えプラスミドの発現カセットでのＰ．パストリスのＡＯＸ１遺伝子の置換による組込みがどれに生じたかを判定するためにサザンブロットによっても分析した。この組込み事象はＭｕｔｓ（低レベルのメタノールの利用）及びＨｉｓ＋表現型をもたらす。ＡＯＸ１の遺伝子の置換は、ベクター及びゲノム中のプロモーター領域ＡＯＸ１から３’ＡＯＸ１の間の組換えにより生じる。組換えの結果として、ＡＯＸ１のコード領域に欠失が生じる。Ｍｕｔｓ表現型を有する組換え株は、ＡＯＸ２遺伝子でのアルコールオキシダーゼ産生を保持し、これらはメタノール中で低い増殖速度を有する。
【００３５】
該ポリペプチド及びティラピア成長ホルモンをコードする遺伝子は、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあり、メタノールで誘導可能であり、これらはシグナルペプチドを有する。ピキア・パストリスの自己タンパク質の分泌は低レベルであり、その培養培地は添加物としてタンパク質を必要としない。したがって、分泌される異種タンパク質が培地中の総タンパク質で高い割合（８０％を超える）を占めることが期待できる（Ｔｓｃｈｏｐｐ ｙ ｃｏｌ．；Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９８７，５：１３０５−１３０８；Ｂａｒｒら、；Ｐｈａｒｍ．Ｅｎｇ．１９９２，１２：４８−５１）。本発明の組換えタンパク質の生成は５Ｌのバイオリアクターで培地にメタノールを添加して実施した。図２に示すように、ティラピアＧＨに特異的なモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロットを培地上清中のタンパク質の発現を調べるために使用した。
【００３６】
（実施例２）
該ポリペプチドを含有するＰ．パストリス培養上清での浸漬によるティラピアでの生育実験、免疫系への効果
実験は、１週間に３回９０分間の浸漬により実施した。投与量は水１リットル当たり標的タンパク質０．１ｍｇとした。実験群は以下の通りとした。：
１．ポリペプチド１を含有するＰ．パストリス培養上清で処置した群（処置１）
２．ポリペプチド２を含有するＰ．パストリス培養上清で処置した群（処置２）
３．ティラピアＧＨを含有するＰ．パストリス培養上清で処置した群（処置３）
４．非形質転換Ｐ．パストリス培養上清で処理したネガティブコントロール群（ネガティブコントロール）
５．未処置群
【００３７】
実験開始から４５日目において、ポリペプチド配列番号７で処理した仔魚は、未処置群、ネガティブコントロール及びｔｉＧＨ処置群と比較してそれぞれ３．６、２．１及び１．６倍高い重量の増大があった。一方、ポリペプチド配列番号８で処理した仔魚は未処置群と比較して３．２倍、ネガティブコントロールと比較して１．９倍及びｔｉＧＨ処置群と比較して１．４倍高い重量の増大があった（表１、表１．１、図３）。
【表１】
【表２】
【００３８】
経済的に重要な魚類の発育の初期段階における成長を加速させると、養殖の生産性を増大させるために決定的である生存率が増大するので、これらは、非常に重要な結果である。
【００３９】
免疫系への効果を分析するために、１群当たり２０匹を実験開始から２１日目及び４５日目に採取した。仔魚をホモジナイズし、酸化ストレスの種々のパラメーター、ＧＳＨ、ＳＯＤ、総オルガノペルオキシド、カタラーゼ、過酸化能及びタンパク質酸化を測定した。
【００４０】
我々は、実験開始から２１日目でネガティブコントロールと比較した処置群の過酸化能においてのみ差異を観察した。我々は、実験開始から４５日目の仔魚抽出物中のリゾチーム活性を測定した。試料（仔魚ホモジェネート）のリゾチーム活性は、細菌ミクロコッカス・リソデイクチカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）を溶菌するリゾチームの能力に基づく方法を使用して測定した。９６穴マイクロトレイにおいて、リン酸緩衝液（０．０５Ｍ，ｐＨ６．２）中での４つの２倍系列希釈の試料１００μｌを３ｍｇ／ｍｌミクロコッカス・リソデイクチカス（Ｓｉｇｍａ）の懸濁液１００μｌと混合した。マイクロトレイを２２℃でインキュベートし、０、１５、３０及び６０分に４５０ｎｍでＯ．Ｄ．を読み取った。ポジティブコントロールとしては、仔魚ホモジェネートをニワトリ卵白リゾチーム（８μｇ／ｍｌからの系列希釈）に置き換え、ネガティブコントロールとしては、仔魚ホモジェネートを緩衝液に置き換えた。リゾチーム活性の１単位は、Ｏ．Ｄ．読み値の０．００１ｍｉｎ−１での減少を生じさせる仔魚ホモジェネートの量と定義した。我々は、未処置群と比較してポリペプチド配列番号７及び配列番号８での処置群において統計的有意差を観察した（表２）。
【００４１】
仔魚ホモジェネート中のレクチンを測定するために血球凝集アッセイも実施した。仔魚抽出物の２倍系列希釈を、同容量の新鮮調製２％赤血球懸濁液（ウサギ、ＰＢＳ中）を入れたＵ底型（９６穴、Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｍｉｃｒｏｌｏｎ）マイクロタイターウェルでＰＢＳ ｐＨ７．２を使用して実施した。ウェルを１時間室温でインキュベートし、力価を目視で読み取り、凝集を示した（ウェル底全体に均等に分散した細胞の層で明らかになる）最後のウェルでの希釈に相当するとした。試料の血球凝集活性を検討し、各々の力価の値を得た。活性は力価、すなわち完全な凝集を示す最も高い希釈率の逆数で表した。
【００４２】
我々は、未処置群と比較してポリペプチド配列番号７及び配列番号８での処置群において統計的有意差を観察した（表３）。
【表３】
【表４】
【００４３】
（実施例３）
該ポリペプチドを含むピキア・パストリス培養上清での浸漬浴による金魚における生育刺激実験及び仔魚の品質の改善
４つの実験群を設計した。処置は、浸漬浴、１週間に３回９０分間から成る。投与量は水１リットル当たり標的タンパク質０．１ｍｇとした。実験群は、以下の通りとした。
１．ポリペプチド１を含むＰ．パストリス培養上清で処置した群（処置１）
２．ポリペプチド２を含むＰ．パストリス培養上清で処置した群（処置２）
３．ティラピアＧＨを含むＰ．パストリス培養上清で処置した群（処置３）
４．非形質転換Ｐ．パストリス培養上清で処置したネガティブコントロール群（ネガティブコントロール）
【００４４】
実験開始から４５日目に処置３及び４と比較して処置１及び２は有意な重量の増大を示した。
【００４５】
７５日目に、ポリペプチド配列番号７及び配列番号８で処置した仔魚は、ネガティブコントロールと比較して２倍、ｔｉＧＨ処置群と比較して１．５倍高い重量の増大があった（表４；表４．１；図４）。さらに、処置１、２及び３はネガティブコントロールと比較して生存率の増大を示した（図５）。
【００４６】
観賞用魚の色はその商業化のために非常に重要なパラメーターである。本実験において我々は、ネガティブコントロールと比較して処置１及び２での仔魚が初期の発育段階において色を呈したことを観察した。実験開始から７５日目にこれらはより鮮やかな色を有した（図６）。
【００４７】
我々は他の観賞用魚種でも同様の結果を得た。
【表５】
【表６】
【００４８】
（実施例４）
ポリペプチド１の種々の投与量での浸漬浴によるコイにおける生育実験
我々は、コイ仔魚の成長におけるポリペプチド１の種々の投与量での効果を検討した。４つの実験群を以下通り設計した。
１．ポリペプチド配列番号７を水１リットル当たりポリペプチド０．０２ｍｇの投与量で含むＰ．パストリス培養上清で処置した群（処置１）
２．ポリペプチド配列番号７を水１リットル当たりポリペプチド０．１ｍｇの投与量で含むＰ．パストリス培養上清で処置した群（処置２）
３．ポリペプチド配列番号７を水１リットル当たりポリペプチド０．５ｍｇの投与量で含むＰ．パストリス培養上清で処置した群（処置３）
４．未処置群
【００４９】
実験開始から３０日目において、水１リットル当たりポリペプチド配列番号７を０．５ｍｇの投与量で処置した仔魚は未処置群と比較して２．７５倍高い重量の増大があった。一方、水１リットル当たりポリペプチド配列番号７を０．１ｍｇの投与量で処置した仔魚は未処置群と比較して１．８倍高い重量の増大があった。未処置群と最小投与量での処置群の間には統計的差異はなかった（表５；表５．１；図７）。
【表７】
【表８】
【００５０】
（実施例５）
該ポリペプチドを含有するＰ．パストリス培養上清への浸漬による仔エビ、リトペナエウス・シュミッティ（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ ｓｃｈｍｉｔｔｉ）における生育実験
３つの実験群を設計した。処置は、浸漬浴、１週間に３回１時間３０分から成る。投与量は水１リットル当たり該タンパク質０．１ｍｇとした。実験群は、以下の通りとした。
１．ポリペプチド配列番号７を含むＰ．パストリス培養上清で処置した群（処置１）
２．ポリペプチド配列番号８を含むＰ．パストリス培養上清で処置した群（処置２）
３．非形質転換Ｐ．パストリス培養上清で処理したネガティブコントロール群（ネガティブコントロール）
【００５１】
実験の結果として、我々は該ポリペプチドで処置したエビの仔エビの品質における改善を得た。ポリペプチド配列番号７及び配列番号８で処置した仔エビはネガティブコントロールと比較して２．３倍高い体重増加があり、エラ、体肢、吻がより形成していた。各パラメーターについて対応する統計的試験を行い、統計的有意差が全ての場合において認められた。
【００５２】
（実施例６）
ポリペプチド配列番号７の種々の投与量での食餌投与によるティラピアにおける生育実験
我々は、開始時重量７２．９９±３．２５ｇのティラピア稚魚の成長についてのポリペプチド配列番号７の２つの投与量での効果を測定した。試験を行った投与量は、餌１ｋｇ当たりポリペプチド配列番号７を４．８ｍｇ及び餌１ｋｇ当たりポリペプチド配列番号７を３８．４ｍｇとした。経口製剤は該ポリペプチドを含有するピキア・パストリス培養上清を基礎餌に混合することにより作製した。ネガティブコントロールは、非形質転換Ｐ．パストリス培養上清を加えた基礎餌を与えたティラピアとした。実験中、魚には１日２回、体重の５％に相当する量の餌を６週間与えた。
【００５３】
餌１ｋｇ当たりポリペプチド配列番号７を４．８ｍｇの投与量で食餌に含まれるポリペプチド配列番号７は対照群と比較して、高度に有意な統計的差異で（ｐ＜０．００１）２２％成長を増大させた。餌１ｋｇ当たりポリペプチド配列番号７を３８．４ｍｇの投与量では、ネガティブコントロールとの比較で差異は示さなかった（表６；表６．１；図８）。
【表９】
【表１０】
【００５４】
現在、水生生物は重要な蛋白源であるが、自然環境での捕獲物は完全に利用されている。このため、生産を増大させるためにはこれらの水生種の養殖が必要である。広範囲に生息する生物の多くにおいてホルモン類の投与、遺伝的改変などにより成長を操作できることが示されている（Ｐｕｌｌｉｎ ｙ ｃｏｌ．；Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ７，４３２ｐ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｌｉｖｉｎｇ Ａｑｕａｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｍｏｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｍａｎｉｌａ，Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ．１９８２，ＩＳＳＮ ０１１５−４３８９）。
【００５５】
本明細書に記載のポリペプチドは、それらが種特異的でなく、したがってこのペプチドが成長、生存率及び仔魚の品質を増大すること並びに免疫応答に含まれる種々のパラメーターを改善することなどの多数の作用のために種々の水生生物について応用可能であるという有利点を有する。さらに、これらが成長ホルモンと比較して有意に高い成長への効果を有することが示された。一方、これらのポリペプチドはヒトに生物活性を有さず、ヒトが消費するための生物に前記生成物を応用することが有する不都合を減少させる。さらに、これらのポリペプチドの観賞用魚類における使用は、このポリペプチドが、生育を加速させた結果、養殖期間を短縮するだけでなく、この魚類において色についての効果も有することから非常に魅力的である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ピキア・パストリス発現ベクターにおけるクローニング戦略の図である。
【図２】Ｍｕｔｓ表現型を示す形質転換体の発現分析の図であり、ピキア・パストリス培養上清に発現した標的タンパク質のウエスタンブロットの図である。ライン１：非形質転換ＭＰ３６、ライン２：ポリペプチド１、ライン３：ポリペプチド２、ライン４：ティラピア成長ホルモン
【図３】水１リットル当たり０．１ｍｇの投与量で該タンパク質を含有するピキア・パストリス培養上清への浸漬によるティラピア仔魚における生育実験の図であり、ネガティブコントロールと比較した処置群の平均体重を示す図である。
【図４】水１リットル当たり０．１ｍｇの投与量で該タンパク質を含有するピキア・パストリス培養上清への浸漬による金魚仔魚における生育実験の図であり、ネガティブコントロールと比較した処置群の平均体重を示す図である。
【図５】水１リットル当たり０．１ｍｇの投与量で該タンパク質を含有するピキア・パストリス培養上清への浸漬による金魚仔魚における生育実験の図であり、実験開始から４５日目の実験群の生存率を示す図である。
【図６】水１リットル当たり０．１ｍｇの投与量で該タンパク質を含有するピキア・パストリス培養上清への浸漬による金魚仔魚における生育実験の図であり、処置した魚はネガティブコントロールよりもさらに鮮やかな色を呈していることを示す図である。
【図７】ポリペプチド１を３つの異なる投与量（水１リットル当たり０．０２、０．１及び０．５ｍｇ）で含有するピキア・パストリス培養上清への浸漬によるコイ仔魚における生育実験の図であり、ネガティブコントロールと比較した処置群の平均体重を示す図である。
【図８】ポリペプチド１を２つの異なる投与量（餌１ｋｇ当たりポリペプチド４．８ｍｇ及び餌１ｋｇ当たりポリペプチド３８．４ｍｇ）で含有するピキア・パストリス培養上清を食餌投与することによるティラピアにおける生育実験の図であり、ネガティブコントロールと比較した処置群の平均体重を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列、配列番号７及び配列番号８のうちの１つに含まれるアミノ酸配列をポリペプチド鎖中に含む、ポリペプチド。
【請求項２】
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）において得られたことを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
魚類及び甲殻類における成長を刺激するための、請求項１に記載のポリペプチドのいずれかを含む、組成物。
【請求項４】
餌１ｋｇ当たり前記ポリペプチド４．８ｍｇと同効率の投与量で魚類及び甲殻類における成長及び／又は疾病抵抗性を刺激するための飼料用製剤中における、請求項１に記載のポリペプチドを含むピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）培養上清の使用。
【請求項５】
水１リットル当たり前記ポリペプチド０．０５から０．５ｍｇの間の濃度において成長、生存率及び仔魚の品質を刺激するための魚類及び甲殻類での浸漬処置のための、請求項１に記載のポリペプチドを含むピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）培養上清の使用。
【請求項６】
魚類及び甲殻類の体液性自然免疫系を刺激するための、請求項１のポリペプチドのいずれかを含む、組成物。
【請求項７】
観賞用魚類の処置のための、請求項１に記載のポリペプチドのいずれかを含む、組成物。
【請求項１】
以下の配列、配列番号７及び配列番号８のうちの１つに含まれるアミノ酸配列をポリペプチド鎖中に含む、ポリペプチド。
【請求項２】
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）において得られたことを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
魚類及び甲殻類における成長を刺激するための、請求項１に記載のポリペプチドのいずれかを含む、組成物。
【請求項４】
餌１ｋｇ当たり前記ポリペプチド４．８ｍｇと同効率の投与量で魚類及び甲殻類における成長及び／又は疾病抵抗性を刺激するための飼料用製剤中における、請求項１に記載のポリペプチドを含むピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）培養上清の使用。
【請求項５】
水１リットル当たり前記ポリペプチド０．０５から０．５ｍｇの間の濃度において成長、生存率及び仔魚の品質を刺激するための魚類及び甲殻類での浸漬処置のための、請求項１に記載のポリペプチドを含むピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）培養上清の使用。
【請求項６】
魚類及び甲殻類の体液性自然免疫系を刺激するための、請求項１のポリペプチドのいずれかを含む、組成物。
【請求項７】
観賞用魚類の処置のための、請求項１に記載のポリペプチドのいずれかを含む、組成物。
【図２】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５０１７３５（Ｐ２００９−５０１７３５Ａ）
【公表日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２１７８０（Ｐ２００８−５２１７８０）
【出願日】平成１８年６月２３日（２００６．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００６／０００００６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００９４０３
【国際公開日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【出願人】（３０４０１２８９５）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (46)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月２３日（２００６．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００６／０００００６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００９４０３
【国際公開日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【出願人】（３０４０１２８９５）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (46)
【Ｆターム（参考）】
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