鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５及びＨ５Ｎ１を検出するための診断用プライマー及び方法
本発明は、鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１のＨＡ及びＮＡ遺伝子の保存領域に対するプライマーを提供し、また、鳥インフルエンザサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
[0001] 本願は、２００４年６月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５７８，３５３号の利益及び優先権を主張するものであり、その内容は、参照されることにより本明細書に組み込まれる。
【発明の分野】
【０００２】
[0002] 本発明は、核酸に基づく検出方法、より詳しくは、鳥インフルエンザウイルスを検出するプライマー及び方法に関する。
【発明の背景】
【０００３】
[0003] ３種のインフルエンザウイルス、Ａ型、Ｂ型及びＣ型が知られており、それらはオルトミクソウイルス科と呼ばれる、エンベロープを有するネガティブセンスの一本鎖ＲＮＡウイルスのファミリーに属している（Ｓｗａｙｎｅ，Ｄ．Ｅ．及びＤ．Ｌ．Ｓｕａｒｅｚ（２０００）Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．１９、４６３〜４８２頁）。ウイルスゲノムは、約１２０００〜１５０００ヌクレオチドの長さであり、８つのＲＮＡセグメントを含む（Ｃ型では７つ）。
【０００４】
[0004] インフルエンザＡウイルスは、ヒト、ブタ、ウマ、海洋哺乳類、鳥類等の多数の動物に感染する（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｋ．Ｇ．ら（２００５）Ｌａｎｃｅｔ ３６２、１７３３〜１７４５頁)。その自然宿主は水鳥であり、鳥類種では、ほとんどのインフルエンザウイルス感染は、呼吸器及び腸管に局在化された軽い感染を引き起こす。しかし、このウイルスは、家禽では高病原性作用を有し、突発的に大流行して罹患した家禽集団において高い死亡率を引き起こすことがある。Ｈ５Ｎ１等の高病原性株は、死亡率が１００％に到達することもある系統感染を引き起こす（Ｚｅｉｔｌｉｎ，Ｇ．Ａ．及びＭ．Ｊ．Ｍａｓｌｏｗ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｒｅｐ．７、１９３〜１９９頁)。ヒトでは、インフルエンザウイルスは高伝染性の急性呼吸器疾患を引き起こし、これが、ヒトにおける流行性かつ汎発性の疾患をもたらしている（Ｃｏｘ，Ｎ．Ｊ．及びＫ．Ｓｕｂｂａｒａｏ（１９９９）Ｌａｎｃｅｔ ３５４、１２７７〜１２８２頁)。
【０００５】
[0005] インフルエンザＡウイルスは、ウイルスの付着及び細胞性放出に必要な表面糖タンパク質、すなわち、血球凝集素（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）をコードする２種の遺伝子の抗原性領域における対立遺伝子の差異に基づいて、サブタイプに分類することができる。その他の主要ウイルスタンパク質としては、核タンパク質、ヌクレオカプシド、構造タンパク質、膜タンパク質（Ｍ１及びＭ２）、ポリメラーゼ（ＰＡ、ＰＢ１及びＰＢ２）及び非構造タンパク質（ＮＳ１及びＮＳ２）が挙げられる。
【０００６】
[0006] インフルエンザＡウイルスでは、現在、ＨＡの１５種のサブタイプ（Ｈ１〜Ｈ１５）、及び９種のＮＡ（Ｎ１〜Ｎ９）抗原性変異体が知られている。サブタイプＨ５及びＨ７は、家禽において高病原性感染を引き起こす可能性があり、特定のサブタイプは、種の壁を乗り越えてヒトに感染することが判明している。これまでに、ヒトに蔓延するサブタイプとして知られているものは３種しかない（Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２及びＨ３Ｎ２）。しかし、１９９７年及び２００３年に香港において記録されたように、近年、鳥インフルエンザＡの病原性Ｈ５Ｎ１サブタイプが種の壁を乗り越えて、ヒトに感染することが報告され（Ｐｅｉｒｉｓ，Ｊ．Ｓ．Ｍ．ら（２００４）Ｌａｎｃｅｔ ３６３、６１７〜６１９頁、Ｙｕｅｎ，Ｋ．Ｙ．ら（１９９８）Ｌａｎｃｅｔ ３５１、４６７〜４７１頁）、死に至る患者も現れている。２００３年後半から、家禽ではＨ５Ｎ１鳥インフルエンザＡが蔓延し、ベトナム、タイ、韓国、ラオス、カンボジア、インドネシア、日本、マレーシア等、いくつかのアジア諸国で深刻な大流行が報告されている（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ）（２００４） Ｍｏｒｂ．Ｍｏｒｔａｌ．Ｗｋｌｙ．Ｒｅｐ．５３、１００〜３頁、Ｈｉｅｎ Ｔ．Ｔ．ら（２００４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０、１１７９〜１１８８頁)。それらは、何百万もの家禽の大量処分をもたらし、深刻な経済的な影響を及ぼしている。
【０００７】
[0007] ヒトでは、鳥インフルエンザウイルスは、気道、並びに腸管、肝臓、脾臓、腎臓及びその他の臓器の細胞に感染する。鳥インフルエンザ感染の症状としては、発熱、呼吸困難（息切れ及び咳を含む）、リンパ球減少、下痢及び血糖値調節困難が挙げられる。Ｈ５サブタイプ、特に、Ｈ５Ｎ１が高病原性を有し、また、既に実証されているように、種を越えてヒトに感染する能力を有することにより、これらのウイルス株に関連した、重大な経済上及び公衆衛生上の危険（極めて流行性で、汎発性の脅威を含む。）が存在している。
【０００８】
[0008] 従って、Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザＡウイルスは、アジアのみならず全世界のヒトの健康にとって潜在的に危険なものである。蔓延の可能性を下げ、流行に発展する危険を低減するためには、封じ込め手順に加えて、早期診断のための高感度な検出アッセイが不可欠である。
【０００９】
[0009] 現在、生体サンプル中の、鳥インフルエンザウイルスのＨ５及びＨ５Ｎ１サブタイプを検出するために利用可能な種々の技術があるが、そのような技術としては、ＲＮＡを増幅する核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）法、ウイルス培養、ウイルスＲＮＡゲノムから転写されたＤＮＡを増幅する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法、血球凝集阻害、並びに種々の蛍光及び酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。
【００１０】
[0010] 詳しくは、Ｓｏらによる国際公開第０２／２９１１８号パンフレットに、鳥インフルエンザウイルスのＨ５サブタイプを検出するためのＮＡＳＢＡアッセイ及びキットが記載されている。Ｈｅｉｎらは、種々の蛍光及び酵素結合免疫測定法を用いる抗原試験の使用について記載している（２００４，ＮｅｗＥｎｇ．Ｊ ｏｆ Ｍｅｄ．３５０（１２）、１１７９〜１１８８頁）。Ｌａｕらは、鳥インフルエンザウイルスのＨ５又はＨ７サブタイプを検出するためのＮＡＳＢＡ法について記載している（２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３１３、３３６〜３４２頁）。Ｌｅｅら（２００１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ９７、１３〜３２頁）及びＰａｙｕｎｇｐｏｒｎら（２００４，Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７、５８８〜５９３）は、鳥インフルエンザウイルスサブタイプを同定及び細分類又は検出するためのＲＴ−ＰＣＲアッセイについて記載している。しかし、これらの方法はいずれも、Ｈ５若しくはＨ５Ｎ１のいくつかの分離株又は変異体にのみ由来する遺伝情報を用いて、ウイルスの存在を確定するものである。更に、これらのアッセイは特異性及び感度が低いことが報告されている。臨床上は、これらの診断は、低感度であることにより、ヒトにおけるインフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）ウイルスの信頼性のある検出における有用性が制限される可能性がある。従って、迅速な早期の診断に有用な高感度の診断試験が強く求められている。
【発明の概要】
【００１１】
[0011] ２００種を超えるＨ５分離株、及び１００種を超えるＨ５Ｎ１分離株に由来するＨＡ遺伝子の配列比較に基づいて、また、約７０種のＨ５Ｎ１分離株に由来するＮＡ遺伝子の配列比較に基づいて、これらの遺伝子内の保存領域に対する一連のプライマーを開発した。これらのプライマーは、多種多様なＨ５及びＨ５Ｎ１分離株をスクリーニングするのに有用であり、迅速、特異的かつ高感度な検出方法を可能にする。
【００１２】
[0012] すなわち、一態様において、本発明は、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含むプライマーを提供する。別の態様において、本発明は、標的アニーリング配列と非インフルエンザＡウイルス配列とを含むプライマーであって、標的アニーリング配列が配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含むプライマーを提供する。
【００１３】
[0013] これらのプライマーは、サンプル、例えば、このようなウイルスを保持している疑いのある生物に由来するサンプル中の鳥インフルエンザウイルスＨ５又はＨ５Ｎ１の存在を検出するのに有用であり、サンプル中のウイルスの存在を検出するための逆転写ポリメラーゼ連鎖反応において使用することができる。
【００１４】
[0014] すなわち、更に別の態様において、本発明は、サンプル中のインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出する方法であって、サンプルから得たＲＮＡから逆転写されたＤＮＡを、各々が配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のプライマーを用いて増幅すること、及び増幅産物を検出することを含み、増幅産物の存在がサンプル中の鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１の存在を示す方法を提供する。
【００１５】
[0015] 本明細書に記載の方法を用いて、多種多様なＨ５及びＨ５Ｎ１インフルエンザＡウイルス分離株を検出することができる。単一の反応試験管においてＲＮＡが逆転写され、その産物が増幅される一ステップ法を用いることで、検出時間の短縮が可能になり、サンプル操作が最小化され、サンプルの相互汚染の危険性が低減される。従って、本明細書に記載のプライマーを用いる、本明細書に記載の方法は、Ｈ５及びＨ５Ｎ１インフルエンザＡ感染の早期検出及び／又は診断に有用である。更に、これらの方法を用いてサンプル中のおよそのウイルス量を調べることができ、その適用は臨床及び公衆衛生管理の場で有用である。
【００１６】
[0016] 本発明のプライマーは、サンプル中の鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１の存在を検出するためのその他の増幅方法、例えば、核酸配列に基づく増幅法において有用である。本発明のプライマーはまた、鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１のＨＡ又はＮＡ遺伝子に相当するＤＮＡを配列決定するのにも有用である。
【００１７】
[0017] 更に別の態様において、本発明は、サンプル中のインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出する方法であって、サンプルと、支持体上に固定されているプライマーとを、プライマーとサンプルとがハイズリダイズするのに適した条件下で接触させるステップと、プライマーとサンプルとのハイブリダイゼーションを検出するステップと、を含み、プライマーが、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む方法を提供する。
【００１８】
[0018] 更に別の態様において、本発明は、サンプル中のインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出する方法であって、サンプルと、１種又は複数のプライマーを含む核酸マイクロアレイとを、当該１種又は複数のプライマーとサンプルとがハイブリダイズするのに適した条件下で接触させるステップと、１種又は複数のプライマーとサンプルとのハイブリダイゼーションを検出するステップと、を含み、プライマーの各々が、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む方法を提供する。
【００１９】
[0019] 別の態様において、本発明は、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含むプライマーを含む核酸マイクロアレイを提供する。
【００２０】
[0020] 更に別の態様において、本発明は、サンプル中のインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出するためのキットであって、本明細書で規定されるプライマーと、使用説明書とを含むキットを提供する。
【００２１】
[0021] 本発明の他の態様及び特徴は、本発明の具体的な実施形態に関する以下の説明を添付の図面と共に検討すれば、当業者に明らかとなろう。
【詳細な説明】
【００２２】
[0069] インフルエンザＡウイルスを始めとするＲＮＡウイルスは、ＤＮＡ複製と比較した場合のＲＮＡ複製の低い忠実性のために、高い突然変異率を有する傾向がある。その結果、インフルエンザウイルスは急速に進化する傾向がある。更に、インフルエンザＡウイルスは、ウイルス株間の遺伝子再集合を受ける傾向があり、この機構が種々のＨＡ及びＮＡサブタイプの発達に寄与してきた。本発明者らは、２００種を超えるインフルエンザＡ Ｈ５分離株、及び１００種を超えるインフルエンザＡ Ｈ５Ｎ１分離株から得た血球凝集素（「ＨＡ」）遺伝子の配列を比較した。同様に、本発明者らは、約７０種のインフルエンザＡ Ｈ５Ｎ１分離株から得たノイラミニダーゼ（「ＮＡ」）遺伝子の配列を比較した。驚くべきことに、インフルエンザウイルス内の高い突然変異率にも関わらず、本発明者らは、特定のサブタイプに特有の、高度に保存された配列の短い領域を見出した。それらの領域は、サンプルにおいてそれらのサブタイプの存在を同定又は検出するのに適している。
【００２３】
[0070] 比較に用いた配列は、公的に利用可能なデータベースから得、種々の配列比較ソフトウェア（ソフトウェアＣｌｕｓｔａｌＷ等）を用いて比較した。
【００２４】
[0071] 本発明者らは、これらの配列比較により、検出アッセイ、例えば、逆転写とそれに続くポリメラーゼ連鎖反応増幅（「ＲＴ−ＰＣＲ」）で用いるための、鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１のＨＡ遺伝子又はＮＡ遺伝子の保存領域に対する、配列番号１〜配列番号１１４に示されるフォワード及びリバースプライマーを開発した。このような多数のウイルス分離株の比較によって、ＨＡ又はＮＡ遺伝子の十分に保存された領域に対するプライマー、ひいては突然変異による変化の影響を受ける可能性が低い領域を標的とするプライマーの設計が可能となり、それによって、現在利用可能なプライマーよりも、Ｈ５又はＨ５Ｎ１変異体の大きなプールを検出することができるプライマーを提供することが可能となった。
【００２５】
[0072] 本明細書において、用語「分離株」とは、特定の遺伝子配列を有する患者等の特定の生体供給源から単離された、特定のウイルス又はウイルス粒子のクローン集団を指す。異なる分離株は、１個又は数個のヌクレオチドのみが異なってもよく、依然として同一のウイルスサブタイプ内にあってもよい。ウイルスサブタイプとは、これらの糖タンパク質の抗原性に従って分類された、ＨＡのサブタイプ又はＮＡのサブタイプのいずれかを指す。
【００２６】
[0073] 本発明者らは、特定の保存領域において、特定の位置の１個又は複数個のヌクレオチドが分離株間で異なることを見出した。そして、それらの領域についてプライマーのファミリーを開発した。ファミリー内の各プライマーは、ＨＡ又はＮＡ遺伝子の保存配列に基づいたものであるが、保存配列内の１個又は複数個の特定の塩基が異なっている。
【００２７】
[0074] 従って、一態様において、本発明は、配列番号１〜配列番号１１４のいずれか１種に示される配列を含むプライマーを提供する。
【００２８】
[0075] 当業者には理解されることであるが、「プライマー」とは、相補配列を含む第２のＤＮＡ又はＲＮＡ分子（標的）と塩基対形成することができる、所定の配列の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。得られたハイブリッド分子の安定性は、生じる塩基対形成の長さに応じて異なり、プライマー及び標的分子間の相補性度、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシー度、等のパラメーターの影響を受ける。ハイブリダイゼーションストリンジェンシー度は、温度、塩濃度、及びホルムアミド等の有機分子の濃度といったパラメーターの影響を受け、当業者に公知の方法を用いて決定することができる。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションを含む方法、例えば、核酸配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応による核酸増幅、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、電気泳動移動度シフトアッセイ又はゲルシフト法（ＥＭＳＡ）、核酸マイクロアレイ、及び当業者に公知のその他の方法に用いられる。
【００２９】
[0076] 用語「ＲＮＡ」とは、２個以上の共有結合している、天然に存在しているか、修飾されたリボヌクレオチドの配列を指す。ＲＮＡは一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。用語「ＤＮＡ」とは、２個以上の共有結合している、天然に存在しているか、修飾されたデオキシリボヌクレオチドの配列を指し、ｃＤＮＡ及び合成（例えば化学合成）ＤＮＡを含み、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。「逆転写されたＤＮＡ」又は「から逆転写されたＤＮＡ」とは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）の作用によりＲＮＡ鋳型から生じた相補的ＤＮＡ又はコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を意味する。
【００３０】
[0077] 鳥インフルエンザウイルスは一本鎖ＲＮＡウイルスであり、いくつかの実施形態では、プライマーは、表１に示される、鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１のＨＡ遺伝子の保存領域のＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列（配列番号１〜配列番号３１及び配列番号１１２）を有する。このようなプライマーは、サブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１のＨＡ遺伝子から逆転写されたＤＮＡを配列決定するか増幅する場合に、フォワードプライマーとして使用することができる。
【００３１】
【表１】
【００３２】
[0078] いくつかの実施形態では、プライマーは、表２に示される、鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５ＮｌのＨＡ遺伝子の保存領域のＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列（配列番号３２〜７１、配列番号１１３及び配列番号１１４）を有する。このようなプライマーは、サブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１のＨＡ遺伝子から逆転写された１本鎖ＤＮＡを配列決定するか増幅する場合に、リバースプライマーとして使用することができる。
【００３３】
【表２−１】
【００３４】
【表２−２】
【００３５】
[0079] いくつかの実施形態では、プライマーは、配列番号７２〜配列番号９３に示される、鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５ＮｌのＮＡ遺伝子の保存領域のＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列を有する（表３参照）。このようなプライマーは、サブタイプＨ５Ｎ１のＮＡ遺伝子から逆転写されたＤＮＡを配列決定するか増幅する場合に、フォワードプライマーとして使用することができる。
【００３６】
【表３】
【００３７】
[0080] いくつかの実施形態では、プライマーは、配列番号９４〜配列番号１１１に示される、鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５ＮｌのＮＡ遺伝子の保存領域のＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列を有する（表４参照）。このようなプライマーは、サブタイプＨ５Ｎ１のＮＡ遺伝子から逆転写されたＤＮＡを配列決定するか増幅する場合に、リバースプライマーとして使用することができる。
【００３８】
【表４】
【００３９】
[0081] 検査したウイルス分離株のＨＡ又はＮＡ遺伝子の保存領域内で、特定の位置のヌクレオチドが異なる場合には、これらの遺伝子の保存領域に基づいてプライマーの「ファミリー」を開発した。この場合、プライマーのファミリー内の１個又は複数の残基がプライマー毎に異なる。例えば、配列番号１〜配列番号６は、このようなファミリーである。
【００４０】
[0082] 更に、当業者には理解されることであるが、プライマーは保存配列に基づいたものであるが、変異したプライマーが、元のプライマー配列と同一又は同程度のストリンジェンシーでサンプル中の標的配列と依然としてハイブリダイズするという条件で、保存配列内の１個又は複数の塩基が置換され、挿入され、又は欠失していてもよい。ハイブリダイゼーション条件は、目的の配列に応じて公知の方法により改変してもよい（Ｔｉｊｓｓｅｎ， １９９３、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、第１部、第２章、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。一般には、ストリンジェントな条件は、所与のイオン強度及びｐＨにおいて、所定の配列の熱融点よりも約５℃低いものであるように選択される。
【００４１】
[0083] 当業者には理解されることであるが、プライマーの短い配列中に複数の置換変異を有することで、元の変異していないプライマーの相補体とプライマーとのハイブリダイゼーションの強度が低下し、また、プライマー配列内の変異の間隔及び位置も、ハイブリダイゼーションの強度又はストリンジェンシーに影響を及ぼす。更に、当業者には理解されることであるが、短い配列中の１個又は複数個のヌクレオチドの挿入又は欠失によってもまた、元の変異していないプライマーの相補体とプライマーとのハイブリダイゼーションの強度が低下し、また、短い配列中の２以上の位置に１個又は複数個のヌクレオチドの挿入又は欠失を有することで、変異していないプライマーの相補体とプライマーとのハイブリダイゼーションが著しく変化する可能性がある。
【００４２】
[0084] 鳥インフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子に対する本発明の種々のプライマーのアラインメントを、従来知られているその他のサブタイプ５のＨＡ遺伝子に対するプライマーと共に図１に示す。プライマーＴＷ＿Ｈ５−１５５ｆ及びＴＷ＿Ｈ５−６９９ｒは、Leeら（２００１、Ｊ．Ｖｉｒｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ９７、１３〜２２頁）で開示されている。プライマーＶＭ＿Ｈ５／５１５、ＶＭ＿Ｈ５−１、ＶＭ＿Ｈ５／１２２０及びＶＭ＿Ｈ５−２はＨｅｉｎら（２００４、Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ． ｏｆ Ｍｅｄ．３５０（１２）、１１７９〜１１８８頁）で開示されている。プライマーＨＫ＿配列番号１〜ＨＫ＿配列番号３、ＨＫ＿配列番号５〜ＨＫ＿配列番号７及びＨＫ＿配列番号９〜ＨＫ配列番号１４は、国際公開第０２／２９１１８号パンフレットに開示されている。
【００４３】
[0085] いくつかの実施形態では、プライマーの検出、又はプライマーから合成されたか伸長されたＤＮＡ産物の検出が可能になるように、プライマーを標識で修飾してもよい。例えば、標識としては、蛍光標識、化学発光標識、有色色素標識、放射性標識、放射不透過性標識や、タンパク質（酵素を含む）、ペプチド、又はリガンド（例えば、ビオチン）が挙げられる。
【００４４】
[0086] 特定の実施形態では、プライマーは、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種に加えて、更に他の核酸配列を含んでもよい。このような他の配列は、ＨＡ又はＮＡ遺伝子の配列によってコードされるものであるか、それらの配列に相補的なものであり、配列番号１〜配列番号１１４のいずれか１種によって規定される配列のフランキング領域（隣接した非コード領域）となる。但し、本実施形態に係るプライマーは、完全インフルエンザＡゲノムではなく、また、プライマーＴＷ＿Ｈ５−１５５ｆ、プライマーＴＷ＿Ｈ５−６９９ｒ、プライマーＶＭ＿Ｈ５／５１５、プライマーＶＭ＿Ｈ５−１、プライマーＶＭ＿Ｈ５／１２２０、プライマーＶＭ＿Ｈ５−２、又は上述のＨＫ＿配列番号１〜ＨＫ＿配列番号３、ＨＫ＿配列番号５〜ＨＫ＿配列番号７及びＨＫ＿配列番号９〜ＨＫ＿配列番号１４ではない。
【００４５】
[0087] 或いは、更に含まれる他の配列はＨＡ又はＮＡ遺伝子に対するものでなくてもよく、例えば、タンパク質又は酵素（制限酵素等）によって認識される配列、或いは、標識されたプローブ等の検出に用いる核酸配列に相補的な配列が挙げられる。当業者には理解されることであるが、プライマーには、その用途に応じて最適な長さ及び配列があるので、上述のような他の配列の数及び種類は適当に制限される。例えば、ＰＣＲプライマーは、それより高い温度では鋳型ともはや特異的に結合しない温度が、ポリメラーゼによる伸長が生じる温度にほぼ等しいような長さ又は配列であってはならない。
【００４６】
[0088] 従って、１つの実施形態において、プライマーは本質的に配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種からなる。すなわち、プライマーは、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種の５'、３'又はその両側にフランキングする１個又は複数個の他のヌクレオチドを更に含んでもよいが、そのヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種と、その相補配列を含む核酸分子とのハイブリダイゼーションに大きな影響を及ぼしてはならない。例えば、大きな配列内に含まれる場合であっても、短いプライマー配列の両側にいくつかのヌクレオチドを加えることによって、短いプライマー配列の、その相補配列とのハイブリダイゼーションストリンジェンシーを、上記ヌクレオチドが存在しない場合と同一又は同程度のストリンジェンシーで短いプライマー配列がハイブリダイズすることができない程度に変更してはならない。すなわち、本明細書に記載の配列に隣接するインフルエンザＨＡ又はＮＡ遺伝子中の領域は分離株間で異なる可能性があるので、本質的に配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種からなるプライマーは、広範なＨ５又はＨ５Ｎ１分離株を検出する感度及び能力に影響を及ぼす程度に多量の、本明細書に記載の保存配列をフランキングするウイルス配列を含んではならない。他の特定の実施形態では、プライマーは、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種からなるか、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種である。
【００４７】
[0089] 特定の実施形態では、プライマーは、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む「標的アニーリング配列」と、非インフルエンザウイルスＡ配列と、を含む。
【００４８】
[0090] 標的アニーリング配列は、サンプル中の標的核酸の少なくとも一部とハイブリダイズし、標的核酸はインフルエンザＡ Ｈ５又はＨ５Ｎ１ウイルスサブタイプと相同であるか、相補的であるか、インフルエンザＡ Ｈ５又はＨ５Ｎ１ウイルスサブタイプから転写されるか逆転写されるか、或いはインフルエンザＡ Ｈ５又はＨ５Ｎ１ウイルスサブタイプに由来する。従って、標的アニーリング配列はまた、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種によって規定される配列をフランキングする、ＨＡ又はＮＡ遺伝子の配列によってコードされるか、それに相補的なフランキング配列を含んでもよい。或いは、標的アニーリング配列は、本質的に配列番号１〜配列番号１１４の配列からなるか、配列番号１〜配列番号１１４の配列からなる。
【００４９】
[0091] 非インフルエンザＡウイルス配列は、インフルエンザＡウイルスゲノム配列に由来しないか、対応しないか、相補的でない配列である。上述のように、非インフルエンザＡウイルス配列としては、例えば、タンパク質又は酵素（制限酵素等）によって認識される配列、或いは、検出に用いる核酸配列(例えば、標識されたプローブ、又は、当該プライマーを捕獲するのに用いる固定された核酸分子の捕獲配列）に相補的な配列が挙げられる。非インフルエンザＡウイルス配列は、標的アニーリング配列の５'又は３'側に位置していても、標的アニーリング配列の両側にフランキングしていてもよい。
【００５０】
[0092] プライマー又は本発明のプライマーの長さは、所望の用途又は適用に応じて異なる。例えば、理解されるであろうが、ＰＣＲプライマーの長さは通常、約１５〜約３５塩基の間となる。ＰＣＲプライマーの長さは、増幅しようとする配列、及びプライマー／鋳型ハイブリッドの所望の融解温度によって決定される。しかし、サザンハイブリダイゼーション等に適用する場合には、プライマーは、より長いもの、例えば、約１５塩基〜約１キロ塩基の長さ又はそれより長いものであってもよい。すなわち、プライマーの長さは、例えば、１５塩基〜約１キロ塩基、１５〜約５００塩基、１５〜約３００塩基、１５〜約１５０塩基、１５〜約１００塩基、又は１５〜約５０塩基である。
【００５１】
[0093] 本発明のプライマーは、当技術分野で公知の従来法を用いて調製することができる。例えば、自動核酸シンセサイザーを用いて、標準的なホスホロアミダイト法により、固体支持体上でプライマーを３'から５'方向に合成することができる。このような方法は当業者には公知であろう。
【００５２】
[0094] 本明細書において、用語「プライマー」は、鋳型配列と配列特異的にアニーリングさせ、新規鎖合成を開始するために用いられる一本鎖ヌクレオチドを表すために用いられる。但し、当業者には理解されることであるが、本発明のプライマーの使用はそれに制限されない。例えば、本発明のプライマーを、プローブがハイブリダイズする相補配列を検出するためのプローブとして使用してもよい。このような用途に用いる場合、プライマーは通常、検出のために、蛍光標識、化学発光標識、有色色素標識、放射性標識、タンパク質（酵素を含む）、ペプチド、又はリガンド（例えば、ビオチン）で標識される。プライマーは、プローブとして用いる場合には、核酸ハイブリダイゼーション法、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、核酸マイクロアレイ、及び当業者に公知のその他の方法において使用することができる。
【００５３】
[0095] 本発明のプライマーを用いれば、サンプル、例えば、ウイルスを保持している疑いのある生物に由来する生体サンプル中の鳥インフルエンザサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を診断又は検出することができる。
【００５４】
[0096] すなわち、本発明は、サンプル中の鳥インフルエンザサブタイプＨ５を検出する方法であって、サンプルから得たＲＮＡから逆転写されたＤＮＡを、配列番号３２〜配列番号５５の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のリバースプライマーと、配列番号１〜配列番号１８の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のフォワードプライマーと、を用いて増幅すること、及び増幅産物を検出することを含み、産物が、サンプル中の鳥インフルエンザウイルスＨ５サブタイプの存在を示す方法を提供する。また、サンプル中の鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５Ｎ１を検出する方法であって、サンプルから得たＲＮＡから逆転写されたＤＮＡを、配列番号５６〜配列番号７１、配列番号１１３及び配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のリバースプライマーと、配列番号１９〜配列番号３１及び配列番号１１２の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のフォワードプライマーと、を用いて、又は配列番号９４〜配列番号１１１の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のリバースプライマーと、配列番号７２〜配列番号９３の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のフォワードプライマーと、を用いて増幅すること、及び増幅産物を検出することを含み、産物が、サンプル中の鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１サブタイプの存在を示す方法を提供する。
【００５５】
[0097] 用語、増幅産物を「検出する」とは、鋳型、プライマー及び適当なポリメラーゼ酵素を用いた増幅反応から得られた産物の有無を調べること、又は産物の量を定量化することを含むものとする。
【００５６】
[0098] 通常、サンプルから得たＲＮＡを逆転写することにより、ＲＮＡのＨＡ遺伝子又はＮＡ遺伝子に相補的な一本鎖ＤＮＡを得る。逆転写には、ＲＮＡ鋳型を読み取ることができ、ＲＮＡ鋳型と結合するプライマーから、ＤＮＡヌクレオチドを重合して、ＲＮＡ鋳型の配列に相補的な相補的ＤＮＡ鎖を合成することができる逆転写酵素を用いる。逆転写酵素、例えば、Ｔ７逆転写酵素は市販されており、当業者には公知である。逆転写反応は通常、逆転写酵素活性を最適化するように設計された反応条件及び温度下で、バッファー中で実施する。市販の逆転写酵素は、適当なバッファー及びＤＮＡヌクレオチドと共に提供されている。
【００５７】
[0099] 逆転写反応に用いるプライマーとしては、ＲＮＡ鋳型に沿ったランダムな部位と結合するランダムヘキサマーの混合物が挙げられる。或いは、逆転写プライマーは、ＨＡ遺伝子又はＮＡ遺伝子内の特定の部位で結合するように設計された特異的プライマーであってもよい。従って、表２及び４に示される、配列番号３２〜配列番号７１、配列番号１１３及び配列番号１１４又は配列番号９４〜配列番号１１１のいずれか１種を含む１種又は複数のリバースプライマーは、逆転写反応においてプライマーとして使用することができる。これと同じ本発明のリバースプライマー又はプライマー類が増幅ステップにおいて使用可能であり、これは、特に、逆転写及び増幅が同一反応で実施される場合に有利である。２種以上の本発明のプライマーを用いる場合には、用いるプライマーの各々は異なる配列を有し、各プライマーの配列は、配列番号３２〜配列番号７１、配列番号１１３及び配列番号１１４又は配列番号９４〜配列番号１１１のいずれか１種を含む。
【００５８】
[00100] ＨＡ遺伝子又はＮＡ遺伝子の同一の保存領域に基づくが、プライマー配列内の１個又は複数個のヌクレオチドが異なるプライマーのファミリー、例えば、配列番号３２〜配列番号４３がある場合には、このようなファミリーに由来する１種又は複数のリバースプライマーを使用することができる。これによって鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１の多数のあり得る分離株又は変異体の逆転写、ひいてはその検出が可能となる。本明細書において、「変異体」とは、ＨＡ遺伝子配列が別のＨ５サブタイプのものとは異なっていてもよいＨ５サブタイプ、又はＨＡ遺伝子配列若しくはＮＡ遺伝子配列が別のＨ５Ｎ１サブタイプのものとは異なっていてもよいＨ５Ｎ１サブタイプを指す。
【００５９】
[00101] 逆転写反応の鋳型ＲＮＡは、当技術分野で公知のＲＮＡ抽出法を用いてサンプルから得ることができる。また、ＲＮＡ抽出キット、例えば、ＲＮｅａｓｙ（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）も市販されており、このようなキットが入手可能なこと及びその用途は、当業者には公知であり、理解されることである。
【００６０】
[00102] サンプルは、生体サンプル、例えば、鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を保持している疑いのある個体から採取したサンプルである。サンプルは、感染個体から得たウイルスを含むサンプルであればよく、そのようなサンプルとしては、組織及び体液サンプル、例えば、血液、血清、血漿、末梢血細胞（リンパ球、単核細胞等）、痰、粘膜、尿、糞便、咽頭スワブサンプル、真皮病変スワブサンプル、脳脊髄液、膿、並びに脾臓、腎臓、肝臓等の組織が挙げられる。
【００６１】
[00103] 逆転写反応が完了すると、一本鎖ＤＮＡ分子を増幅反応に使用することができる。用語「増幅する」又は「増幅」とは、鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１の存在を示すために検出しようとする核酸分子を大量に複製する反応を指す。適当なポリメラーゼ酵素を用いて、鋳型核酸、場合によってＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかの新しい鎖を合成してマルチプルコピーを作製する。
【００６２】
[00104] 増幅ステップは、逆転写の条件及び試薬が増幅反応と干渉しないならば、逆転写反応と同一の反応で実施することができる。或いは、逆転写産物を、増幅反応における鋳型として用いる前に精製してもよい。
【００６３】
[00105] 或いは、二本鎖ＤＮＡ分子、例えば、逆転写された一本鎖ＤＮＡ分子に由来する二本鎖ＤＮＡを増幅反応の鋳型として使用してもよい。特定のウイルス分離株のＤＮＡクローンが作製されている場合は、ＤＮＡクローンを増幅の鋳型として使用することができる。標準的な技術を用いてウイルス分離株から二本鎖ＤＮＡクローンを作製する方法は当業者には理解されるものである。サンプルの「ＲＮＡから逆転写されたＤＮＡ」とは、ＲＮＡから逆転写されたＤＮＡに由来するようなＤＮＡ全てを含むものとする。
【００６４】
[00106] 特定の実施形態では、ＰＣＲ増幅反応によって増幅を実施する。従って、増幅ステップは、当業者に公知の標準的な方法及び技術によって、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）を用いて実施することができる。ＤＮＡ分子の増幅に用いるＤＮＡポリメラーゼは市販されている。増幅反応は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の重合活性を最適化するような条件下で、デオキシヌクレオチド、バッファー、関連のフォワード及びリバースプライマー等の必要な試薬を用いて実施する。
【００６５】
[00107] ＰＣＲ増幅反応は、転写されたＤＮＡ鎖及び鋳型ＲＮＡ（存在する場合）を変性し、いずれかの鎖とのプライマーの結合を避けるのに十分な温度に反応物を加熱する変性セグメントを含む。変性セグメントに、プライマーがＤＮＡ鎖と結合可能な温度に反応温度を低下させるアニーリングセグメントが続く。最後のセグメントは、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長に最適な温度に反応物を加熱する伸長セグメントである。これら３つのセグメントを複数回繰り返し、これによって、逆転写されたＤＮＡと対を形成するＤＮＡの相補鎖の生成、並びにフォワード及びリバースプライマー又はプライマー類の各々からの伸長による逆転写鎖の生成が可能となる。増幅反応の各連続ラウンドでは、より多くの各ＤＮＡ鎖が生成され、次いで、それが次のサイクルの鋳型として使用され、その結果、ＤＮＡ産物が増幅される。増幅ステップの各セグメントにおける好適な温度、及び実施されるべき所望のサイクル数は、当業者ならば容易に決定することができる。
【００６６】
[00108] 一実施形態では、増幅反応は、「ホットスタート」を用いて開始することができる。その場合は、逆転写反応から得られた鋳型ＤＮＡと、フォワード及びリバースプライマーとを混合し、変性ステップの温度で一定時間の間保持し、プライマーと、逆転写されたＤＮＡ鎖との非特異的結合を減少させる。ホットスタートの間、反応に必要な１種の成分（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）を反応物から取り除き、次いで、増幅反応の最初のサイクルの直前に反応物に加えればよい。
【００６７】
[00109] 必要に応じて、増幅したＤＮＡ産物を、増幅サイクルの更なるラウンドの鋳型として用いて、増幅ステップを反復することができる。鋳型は反応混合物から精製してもよく、第２の反応は、増幅されたＤＮＡ産物、適当なプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、バッファー及びデオキシヌクレオチドを用いて実施することができる。増幅の第２のラウンドは第１の増幅反応と同一又は類似の条件下で実施することができる。また、次いで、以下に示す適当な検出方法を用いて、第２の増幅産物を検出することができる。
【００６８】
[00110] 本発明のプライマー又はプライマー類を逆転写反応に用いる場合には、増幅反応に同じリバースプライマー又はプライマー類を、適当なフォワードプライマー又はプライマー類と共に使用することができる。或いは、増幅反応に本発明の異なるリバースプライマー又はプライマー類を使用することもでき、各プライマーは、配列番号３２〜７１、配列番号１１３及び配列番号１１４又は配列番号９４〜配列番号１１１に示される配列のいずれか１種を含む。
【００６９】
[00111] 鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１のＨＡ遺伝子の保存領域に対するフォワードプライマーは表１に示し、Ｈ５Ｎ１サブタイプのＮＡ遺伝子の保存領域に対するフォワードプライマーは表３に示す。当業者には理解されることであるが、個々の増幅反応に用いるフォワード及びリバースプライマーは、サブタイプ及び遺伝子に関して対応している必要がある。従って、配列番号３２〜配列番号５５及び配列番号１１３のいずれか１種を含むリバースプライマーを用いる場合には、配列番号１〜配列番号１８のいずれか１種を含むフォワードプライマーを使用することができる。同様に、配列番号５６〜配列番号７１及び配列番号１１４のいずれか１種を含むリバースプライマーを用いる場合には、配列番号１９〜配列番号３１及び配列番号１１２のいずれか１種を含むフォワードプライマーを使用することができ、配列番号９４〜配列番号１１１のいずれか１種を含むリバースプライマーを用いる場合には、配列番号７２〜配列番号９３のいずれか１種を含むフォワードプライマーを使用することができる。
【００７０】
[00112] 当然のことであるが、増幅反応に用いるフォワード又はリバースプライマーの一方のみが、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む必要があり、このようなプライマーは、上記配列を含まないリバース又はフォワードプライマーと組み合わせて使用することができる。しかし、ＨＡ及びＮＡ遺伝子の配列は、ウイルス分離株間で大きく異なる可能性があるので、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含まないフォワード又はリバースプライマーを使用することは、増幅ステップの感度及び検出範囲に影響を及ぼす可能性がある。
【００７１】
[00113] リバースプライマーと同様に、本発明のフォワードプライマーのファミリーが利用可能な場合には、多数のサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１の分離株又は変異体のいずれかの同定を可能にするために、１種又は複数のそのようなプライマーを使用することができる。例えば、単一の増幅反応に、１種又は複数の、配列番号１〜配列番号６に記載の配列を有するプライマーを使用することができる。
【００７２】
[00114] プライマーがプライマーファミリー内に入らない場合であっても、配列番号３２〜７１、配列番号１１３及び配列番号１１４又は配列番号９４〜配列番号１１１を含むプライマーから、１種又は複数のリバースプライマーを選択することができ、配列番号１〜３１及び配列番号１１２又は配列番号７２〜配列番号９３を含むプライマーから１種又は複数のフォワードプライマーを選択することができる。しかし、これは種々の長さの一連の増幅産物をもたらす。複数のリバース及び／又はフォワードプライマーを注意深く選択すれば、増幅産物は互いに容易に区別することができる。この実施形態では、検出方法の感度が低下する場合があり、これが所与の量の鋳型からの特定の増幅産物の減少をもたらすということに留意しなければならない。逆転写反応におけるように、２種以上の本発明のプライマーを用いる場合には、用いるプライマーの各々は異なる配列を有し、各プライマーの配列は、リバースプライマーについては、配列番号３２〜７１、配列番号１１３及び配列番号１１４又は配列番号９４〜配列番号１１１及び配列番号１１２のいずれか１種を含み、フォワードプライマーについては、配列番号１〜３１又は配列番号７２〜配列番号９３のいずれか１種を含む。
【００７３】
[00115] フォワードプライマーは、用いるリバースプライマーと組み合わせて、検出可能な二本鎖ＤＮＡ増幅産物が生成されるように選択する。すなわち、増幅反応で生成される場合にどんな検出方法が選択されても検出可能なような十分な大きさの二本鎖ＤＮＡ分子を増幅するには、フォワードプライマーは、リバースプライマーに対してＨＡ又はＮＡ遺伝子において十分に上流に位置しなくてはならない。検出可能なＤＮＡ産物の大きさは、選択される具体的な検出方法によって異なる。例えば、増幅産物を検出するのにアガロースゲル電気泳動を用いる場合には、検出方法としてライトサイクリング（ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｉｎｇ）を用いるリアルタイムＰＣＲによる場合よりも最終産物が大きくなくてはならない可能性がある。用いるゲルの濃度に応じて、アガロースゲル電気泳動を用いて２５塩基対程度の小さい断片を検出することができる。しかし、ゲルベースの方法を用いると、例えば、１５０〜５００塩基対の間のより大きな断片がより容易に検出されるのに対して、例えば、１００塩基対未満のより小さな断片は、リアルタイムＰＣＲ法を用いて容易に検出される。
【００７４】
[00116] 増幅されたＤＮＡ産物は、当技術分野で公知の検出方法を用いて検出することができる。例えば、好適な検出方法としては、それだけには限らないが、増幅されたＤＮＡ産物への蛍光、化学発光又は放射性シグナルの組込み、又はポリアクリルアミド若しくはアガロースゲル電気泳動によるもの、又は電子移動部分を含有するプローブと増幅産物とをハイブリダイズさせ、電子検出法によってハイブリダイゼーションを検出することによるものが挙げられる。
【００７５】
[00117] 一実施形態では、増幅されたＤＮＡ産物をアガロースゲル電気泳動によって検出するが、これは当業者には公知であろう。増幅産物の一部を、色素マーカーを含む適当なゲルローディングバッファーと混合し、ゲルに電気的勾配をかけることによってアガロースゲルに流す。アガロースゲルは、エチジウムブロマイド又はＤＮＡと結合するかＤＮＡにインターカレートする別の適当な色素で染色することができ、例えば、紫外線に曝露することによって検出する。
【００７６】
[00118] 検出方法は、増幅反応の後に実施することができる。或いは、増幅反応と同時に検出方法を実施してもよい。一実施形態では、リアルタイムＰＣＲを用いて、例えば、ライトサイクリングによって（例えば、ＲｏｃｈｅのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）を用いて）、増幅されたＤＮＡ産物を検出する。リアルタイムＰＣＲ技術は、当業者には公知であり、２種の、各々特定の蛍光標識で標識され、増幅したＤＮＡ産物と結合するプローブの使用を包含する。プローブは、第１のプローブの蛍光標識が第２のプローブの蛍光標識と近接するような方法で各プローブがＤＮＡ産物と結合するように設計する。増幅反応は、関連蛍光シグナルが放射、検出されるように設計された装置で実施し、装置が第１のプローブ上の蛍光標識を励起するのに適した波長の光を放射し、次いで、これが第２のプローブ上の蛍光標識を励起するのに適した波長の光を放射する、更なる検出セグメントを含む。次いで、第２のプローブの蛍光標識によって放射され、それまでの発光とは波長が異なる光を装置で検出する。
【００７７】
[00119] 或いは、増幅反応に一本鎖鋳型を用いる場合には、二本鎖ＤＮＡと結合する蛍光分子を使用することができる。この方法により、増幅反応を通じて増幅されたＤＮＡ産物の検出及び既知の標準鋳型と比較してかなり正確な相対定量が可能となる。増幅産物の定量化により、元の生体サンプル中のウイルス量の測定が可能となる。その上、この方法によって、従来のＰＣＲ技術を用いる方法よりも少量の増幅産物、及びサイズの小さい増幅産物の検出が可能となる。
【００７８】
[00120] ＡＢＩ Ｓｙｓｔｅｍｓによって設計されたＴａｑｍａｎ（商標）法におけるように、５'末端がフルオロフォアで、３'末端が、フルオロフォアと近接している場合にフルオロフォアの発光をクエンチ（消光）するクエンチング分子で標識されている検出プローブを用いて、増幅及び検出を同時に実施することができる。検出プローブは、増幅鋳型のフォワード又はリバース鎖と結合する。５'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ又はその他（例えば、合成版はＲｏｃｈｅから入手可能）を増幅反応に用いる。検出プローブが結合している鋳型鎖が増幅される際に、５'エキソヌクレアーゼにより検出プローブが消化され、クエンチャーの近くからフルオロフォアが取り除かれ、フルオロフォアが発光可能となる。発光は、標準的な機器（例えば、上述のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標））で定量することができる。
【００７９】
[00121］或いは、Ｈ５Ｎ１変異体を検出するために、第１の増幅を、ＨＡ遺伝子に対するプライマーを用いて、例えば、配列番号３２〜７１、配列番号１１３及び配列番号１１４のいずれか１種を含むリバースプライマー又はプライマー類と、配列番号１〜配列番号３１及び配列番号１１２のいずれか１種を含むフォワードプライマー又はプライマー類と、を用いて実施してもよく、第２の増幅ステップを、ＮＡ遺伝子に対する、配列番号９４〜配列番号１１１のいずれか１種を含むリバースプライマー又はプライマー類と、配列番号７２〜配列番号９３のいずれか１種を含むフォワードプライマー又はプライマー類と、を用いて実施してもよい。Ｈ５Ｎ１の存在を検出するために、２種の増幅を、第１の増幅はＨ５又はＨ５Ｎ１サブタイプのＨＡ遺伝子に対するプライマーを用いて、また、第２の増幅はＮＡ遺伝子に対するプライマーを用いて、同一又は異なる反応で同時に実施することができる。ＮＡ遺伝子は発現量が少ないことが知られているので、ウイルス量が少ない場合は検出がより困難と思われる。
【００８０】
[00122] 本発明によって提供される多数のプライマーは、サブタイプＨ５及びＨ５Ｎ１の種々の変異体を検出する可能性を高めるように設計されており、いずれかの特定の変異体を検出する可能性を高めるために、単一のサンプルを、フォワード及びリバースプライマー又はプライマー類の種々の組合せを用いて試験することができる。
【００８１】
[00123］上述の実施形態はＰＣＲ増幅法との関連で記載したが、本発明の配列を用いて、生体サンプル中の鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出するためのその他の増幅方法に用いるプライマーが設計可能なことは、当業者には理解されることである。例えば、Ｌａｕら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｌｚｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２００３ ３１３、３３６〜３４２頁）に記載のように、例えば、配列番号１〜配列番号１１４に記載の配列を用いて、ＮＡＳＢＡ法による増幅及び検出のためのプライマーを設計することができ、これは当業者に一般に知られている。
【００８２】
[00124] 簡単には、ＮＡＳＢＡ技術では、プライマーを、目的の遺伝子（ここでは、ＨＡ又はＮＡ）の一部と結合し、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）のプロモーターを含むように設計する。ウイルス遺伝子を逆転写し、第２の相補ＤＮＡ鎖を合成して、無傷のＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む二本鎖ＤＮＡ分子を生成させる。関連ＲＮＡポリメラーゼを用いて、目的の遺伝子の増幅された部分に対応するＲＮＡ分子のコピーを作製する。次いで、増幅されたＲＮＡを検出分子（通常、増幅されたＲＮＡの一部に相補的であり、例えば、放射標識、化学発光標識、蛍光標識又は電子化学発光標識で標識されている核酸）と結合させる。次いで、検出分子と結合している増幅されたＲＮＡを、通常、捕獲分子（例えば、検出分子が結合する部分とは異なる増幅されたＲＮＡ産物の一部に相補的な、固定された核酸）によって捕獲する。次いで、検出分子が結合している捕獲されたＲＮＡ増幅産物を、検出分子上の標識及び捕獲方法に応じて決まる関連の検出方法によって検出する。
【００８３】
[00125] 従って、本発明は、生体サンプル中の鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１の存在を検出するためのＮＡＳＢＡ法において、配列番号１〜配列番号１１４のいずれか１種を含むプライマーを使用することを包含する。
【００８４】
[00126] 本発明のプライマーはまた、鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１のＨＡ又はＮＡ遺伝子に相当するＤＮＡ分子、又はＨＡ又はＮＡ遺伝子に相補的な逆転写されたＤＮＡ分子を配列決定するのに有用である。鋳型として、ＨＡ又はＮＡ遺伝子の一部に対応する核酸分子を用いて配列決定反応を開始するためには、それぞれ、配列番号３２〜７１、配列番号１１３及び配列番号１１４のいずれか１種、又は配列番号９４〜配列番号１１１のいずれか１種を含むリバースプライマーを使用することができる。鋳型として、ＨＡ又はＮＡ遺伝子の一部に相補的な核酸分子を用いて配列決定反応を開始するためには、それぞれ、配列番号１〜３１及び配列番号１１２のいずれか１種、又は配列番号７２〜配列番号９３のいずれか１種を含むフォワードプライマーを使用することができる。配列決定反応は、当技術分野で公知の標準法により実施しても、また、自動配列決定機器を用いて実施してもよい。
【００８５】
[00127] 本発明のプライマーはまた、Ｈ５又はＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス分離株に由来するＲＮＡを検出するためのプローブ又は捕獲分子として有用である。例えば、配列番号１〜配列番号１１４のいずれか１種を含む１種又は複数のプライマーを固体支持体上に固定し、これを、プライマー配列の一部又は全てに相補的な配列を有する核酸分子を単離するために使用することができる。
【００８６】
[00128] すなわち、サンプル中のインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出する方法であって、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む、１種又は複数の固定されたプライマーをサンプルと接触させることを含む方法が提供される。
【００８７】
[00129] プライマーは、核酸を固定するための標準的な方法により固相支持体上に固定することができ、そのような方法としては、化学架橋、光架橋、又は、プライマー上の官能基（プライマーに付加されているか組み込まれている官能基を含む。）（例えば、ビオチン）を介した特異的固定化が挙げられる。
【００８８】
[00130] 固相支持体は、検出アッセイに使用可能なものであればいずれの支持体であってもよく、そのような支持体としては、クロマトグラフィービーズ、組織培養プレート若しくはディッシュ、又はスライド等のガラス表面が挙げられる。
【００８９】
[00131］接触は、プライマー又はその一部に相補的な配列を含む、サンプル中のいずれかの核酸がハイブリダイズすることができるような、プライマー及びサンプル間のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で実施する。当業者ならば、サンプルとハイブリダイズさせようとするプライマー又はプライマー領域の配列に基づいて、好適なハイブリダイゼーション条件を決定することができ、また、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを高めるか低下させるように条件を変化させることができる。例えば、温度、塩又はバッファー濃度、及び界面活性剤濃度を変化させることで、所与の配列とその相補体との間のハイブリダイゼーションの条件のストリンジェンシーを変化させることができる。
【００９０】
[00132] このような用途では、プライマー若しくは核酸サンプル又はその双方を、蛍光標識、化学発光標識、有色色素標識、タンパク質、ペプチド、リガンド等の標識で修飾することができる。
【００９１】
[00133] 次いで、固定されたプライマーによって捕獲されている、サンプルに由来するいずれかのハイブリダイズされた核酸を検出する。検出方法は、サンプル及び／又は固定されたプライマー上の標識の性質に応じて異なる。更に、核酸分子を検出及び可視化するための標準法を使用することができ、そのような方法としては、クロマトグラフィー法及びゲル電気泳動・染色法が挙げられる。
【００９２】
[00134] 固定化及び捕獲用途の一例として、当技術分野で公知のように、ＤＮＡ又はヌクレオチドマイクロアレイへのプライマー又はプライマー類の取り込みがある。
【００９３】
[00135] 従って、サンプル中のインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出する方法であって、マイクロアレイの少なくとも１スポットに、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む、１種又は複数のプライマーを含有するマイクロアレイをサンプルと接触させること、及び、サンプルとプライマーとのハイブリダイゼーションを検出することを含む方法も提供される。核酸マイクロアレイ技術は、当技術分野で公知であり、マイクロアレイの製造、及びマイクロアレイ中の１又は複数のスポットにおけるサンプルの捕獲分子とのハイブリダイゼーションの検出が包含される。
【００９４】
[00136] 用いるサンプルは、例えば、インフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を含有する疑いのある生体サンプル、又はインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を含有する疑いのある生体サンプルから作製したか増幅した核酸を含んでいる生体サンプルである。核酸は、本明細書に記載のＲＴ−ＰＣＲ増幅、本明細書に記載のＮＡＳＢＡ法、プライマー伸長法等、上述の公知の増幅方法を用いて増幅することができる。サンプルは、公知のハイブリダイゼーション法を用いて、マイクロアレイに取り込まれたプライマー又はプライマー類とハイブリダイズすることができる。
【００９５】
[00137] ハイブリダイゼーションを検出するためには、通常、プローブとして機能するプライマーを標識するか、又はサンプルを標識する。例えば、サンプルは、増幅ステップの際に標識を組み込むことによって標識することができる。標識は、放射性標識、化学発光標識、蛍光標識等の検出可能な標識であれば、いずれでもよい。例えば、当技術分野で公知のように、容易に、Ｃｙ３又はＣｙ５標識ヌクレオチドを、増幅される核酸分子に組み込んで、標識サンプルを作製することができる。ハイブリダイゼーションは、通常、この方法を用いて、マイクロアレイ中の特定のスポットにおけるシグナル増大によって検出する。
【００９６】
[00138] 或いは、マイクロアレイに含まれる本明細書に記載のプライマーを標識してもよい。例えば、ＵＳ６，８１１，９７３（Ｒｅｉｃｈに付与されている。）（これは、参照されることにより本明細書に完全に組み込まれる。）には、マイクロアレイにおいて捕獲分子として用いられる核酸プローブ分子に蛍光マーカーを含め、それによって捕獲核酸分子とその標的核酸分子とのハイブリダイゼーションが、捕獲分子に組み込まれた蛍光標識によって発光される蛍光シグナルのクエンチングをもたらすことが記載されている。従って、ハイブリダイゼーションは、マイクロアレイ中の特定のスポットからのシグナルの低下によって測定される。
【００９７】
[00139] 本発明はまた、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む、１種又は複数のプライマーを、マイクロアレイ中の１又は複数のスポットに取り込んでいるマイクロアレイを包含する。マイクロアレイ（例えば、核酸マイクロアレイ）を製造する方法は公知である。例えば、ＵＳ６，７５３，１４４（Ｈｉｒｏｔａ）及びＵＳ６，５１１，８４９（Ｗａｎｇ）（いずれも、参照されることにより本明細書にそのまま組み込まれる。）には、マイクロアレイを作製する方法が記載されている。通常、マイクロアレイは、１種又は複数のプライマーをマイクロアレイ中の所定のアドレス又はスポットに固定することによって固体支持体上に形成する。
【００９８】
[00140] 増幅と同様に、プライマーのファミリーの１又は複数のメンバーを単一スポットに含めることができ、これによって、マイクロアレイ中の単一のスポットを用いて、いくつかの異なる変異体又は分離株を検出することが可能となる。
【００９９】
[00141］上述の方法は、インフルエンザＡウイルスＨ５又はＨ５Ｎ１分離株を検出するｉｎ ｖｉｔｒｏ法に関するものであるが、本明細書に記載のプライマーはまた、インフルエンザＡウイルスＨ５又はＨ５Ｎ１サブタイプ感染を検出又はイメージングするためのｉｎ ｖｉｖｏ法にも使用することができる。
【０１００】
[00142] また、サンプル中のインフルエンザＡ Ｈ５又はＨ５Ｎ１サブタイプを検出するための、上述のプライマーと使用説明書とを含むキット又は市販のパッケージも、本発明に包含される。検出は、本明細書に記載の方法のいずれによるものであってもよい。
【０１０１】
[00143] 本明細書に記載の全ての文献は、参照されることによりそのまま組み込まれる。
【０１０２】
[00144] 本発明の種々の実施形態が本明細書に開示されているが、当業者によく知られている一般的な知識に従って、本発明の範囲内で多数の修飾及び改変を行うことができる。そのような改変としては、実質的に同様の方法で同様の結果を達成するために、公知の等価物を本発明のいずれかの態様と置き換えることが挙げられる。本明細書に用いた全ての技術用語及び科学用語は、特に断りのない限り、本発明の技術分野の当業者に一般に理解されているものと同一の意味を有する。
【実施例】
【０１０３】
[00145] 卵から抽出したＲＮＡ、並びに、尿膜腔液、総排泄腔スワブ及び気管スワブ、ホモジナイズした組織、プールした臓器、血液、痰、糞便、尿及び鼻咽頭吸引物を含むヒト臨床サンプルから抽出したＲＮＡを用いて実験を行った。
【０１０４】
[00146]実施例１：ゲルベースの検出プラットフォームを用いる鳥インフルエンザウイルスＨ５及びＨ５Ｎ１の検出
【０１０５】
[00147] 以下は、鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出するための一般的なプロトコールである。
【０１０６】
[00148] 一般的には、ＴＲＩｚｏｌ（商標）又はＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）のいずれかを用いて、製造業者の使用説明書に従ってＲＮＡをサンプルから抽出する。
【０１０７】
[00149] 第１鎖ｃＤＮＡ合成は、抽出したＲＮＡ上で、２０μＬの反応容量中、関連のリバースプライマー（類）（１０μＭ保存液２μＬ）を用いて実施する。第１ラウンドＰＣＲ反応は、鋳型であるｃＤＮＡ産物と、関連のフォワード及びリバープライマー（類）（フォワード及びリバース各々の総容量は１．２５μＬ）とを含有するｃＤＮＡ反応物２．５μＬを、２５μＬの反応容量中で用いて実施する。ＰＣＲ条件は以下の通りに設定する。９４℃で２分間インキュベーション；９４℃で１０秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分間の３５サイクル；続いて、７２℃で７分間のインキュベーション。第２ラウンドのＰＣＲは、鋳型として第１ラウンドＰＣＲの産物（２．５μＬ）を用いて実施する。全ての他の条件及び試薬は、第１ラウンドＰＣＲと同様である。
【０１０８】
[00150] 第２ラウンドＰＣＲの産物を、１．５〜２％アガロースゲルでエチジウムブロマイドを用いて染色することによって分析する。
【０１０９】
[00151］しかし、１ラウンドのＰＣＲで十分検出可能という知見が、繰り返しの検証を経て確立されている。
【０１１０】
[00152] タイ由来のＨ５Ｎ１ウイルス分離株（２００４）から抽出したＲＮＡを用いて、上述のＲＴ−ＰＣＲプロトコールを実施した。以下のＨＡ遺伝子に対する８種のプライマーセットを用いた。（１）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ１Ｆ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ４Ｒ、（２）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ２ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ４Ｒ、（３）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ１Ｆ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ５ｂＲ、（４）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ２ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ５ｂＲ、（５）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ３Ｆ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ８ａＲ、（６）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ６ｂＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ８ａＲ、（７）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ６ｂＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ１０Ｒ、（８）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ７ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ１１ｃＲ。予想される断片の大きさはそれぞれ、１８９ｂｐ、１４８ｂｐ、３０６ｂｐ、２６５ｂｐ、５７４ｂｐ、４５６ｂｐ、４８９ｂｐ及び１６３ｂｐであった。図２に示されるように、増幅産物は、１．５％アガロースゲルに流し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。
【０１１１】
[00153] このアッセイの感度を調べるために、１０倍に段階希釈された鋳型と、プライマーセット３（図３）、５（図４）、６及び８（図５）と、を用いる反応を実施した。結果（図３〜５。レーン１〜７はそれぞれ、５０ｎｇ、０．５ｎｇ、５０ｐｇ、０．５ｐｇ、０．０５ｐｇ、５ｆｇ及び０．５ｆｇの鋳型を用いて実施した反応である。）は、本発明のプライマーを用いるＰＣＲ反応は高感度であるが、用いるプライマーに応じて感度が変化することを示している。プライマーセット３及び６はより高感度であり、プライマーセット６からは、５ｆｇ程度の低い鋳型濃度でも相当な量の増幅産物が生じた（図５、レーン６参照）。
【０１１２】
[00154]実施例２：リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出プラットフォームを用いる鳥インフルエンザウイルスＨ５及びＨ５ＮＩの検出
【０１１３】
[00155] ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）装置を用いて、以下の反応を実施する。
【０１１４】
[00156] 反応基本混合物（マスターミックス）は、以下の試薬を順に氷上で混合し、２０μＬの容量になるように調製した。水（必要に応じて調節される容量）、５０ｍＭ酢酸マンガン（１．３μＬ）、０．２〜１μＭという最終濃度のフォワードプライマーと、リバースプライマー及び蛍光標識プローブ（２．６μＬ）と、を含有するプローブＮプライマーミックス（ＰｒｏｂｅＮＰｒｉｍｅｒ ｍｉｘ）、バッファーとヌクレオチドと酵素とを含むＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＲＮＡマスターハイブリダイゼーションプローブ（ＲＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｈｙｂｌｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ)（７．５μＬ）。
【０１１５】
[00157] 反応物を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）において用いるのに適したガラスキャピラリーチューブに移す。５μＬの抽出したＲＮＡ鋳型を各反応物に加え、短時間遠心分離する。ＲＴ−ＰＣＲ反応を、以下のプログラムに従って実施する（表５〜８）。
【０１１６】
【表５】
【０１１７】
【表６】
【０１１８】
【表７】
【０１１９】
【表８】
【０１２０】
[00158]実施例３：種々のプライマーセットを用いるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎｌの検出
【０１２１】
[00159] リアルタイムＰＣＲ反応は、実施例２に記載の８種のプライマーセットを用いて実施した。反応は、標準プロトコールに従って、ＳＹＢＲグリーン蛍光検出キットを用いて、また市販の試薬キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて実施した。図６は、８種のプライマーセットの各々を用いて実施した反応によって得られた増幅産物を示す。８種のプライマーセットは、１．５％アガロースゲルにおいてエチジウムブロマイドで染色して可視化されている。
【０１２２】
[00160] プライマーの感度を確認するために、リアルタイムＰＣＲプロトコールに従って増幅曲線を作製し、増幅産物の生成をモニターした。プライマーセット１〜８の各々に関する結果を、それぞれ図７〜１４に示す。増幅反応終了時に、増幅産物の融解曲線を求めた。一般に、特異的増幅産物は、非特異的産物よりも高い融解温度を有し、融解曲線プロフィールを用いて反応の特異性を確認することができる。図１５〜１８に示される融解曲線は、別個の予想される増幅産物を示す。このように、セット１〜８のプライマーは、リアルタイムＰＣＲ反応に用いる場合には、より感度が高く、Ｈ５Ｎ１分離株に特異的である。
【０１２３】
[00161]実施例４：一ステップＲＴ−ＰＣＲ反応を用いる、フィールドサンプルからのＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスの検出
【０１２４】
[00162] Ｔ７ ＲｉｂｏＭａｘ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写系（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）によって作製した、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡを用いるゲルベースのアッセイにおいて、プライマーセット６（実施例１に記載）を用いて、プライマーの性能を評価した。精製した転写されたＲＮＡの濃度は、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ定量試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて測定し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡの段階希釈物は２つずつ調製した。
【０１２５】
[00163] Ｈ５Ｎ１特異的プライマー（セット６）を含む一ステップ逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲシステム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、以下のＰＣＲサイクルに従って、反応混合物２５μＬ中でＲＮＡ２μＬを用いた。９４℃で１０秒、続いて、９４℃で１０秒、５０℃で３０秒、及び７２℃で１分の３５サイクル；続いて最後に、７２℃で７分間。このＰＣＲ産物の大きさは４５６ｂｐであり、１％アガロースゲルで分離した。ＰＣＲ産物を直接配列決定して、産物の同一性を確認した。アッセイの感度は１０００コピー未満であることがわかり、Ｈ５Ｎ１ ＲＮＡを特異的に検出できた（図１９Ａ）。
【０１２６】
[00164] 二ステップＲＴ−ＰＣＲ法（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）も上述のように行い、一ステップＲＴ−ＰＣＲ法と比較した。結果から、両方の系がうまく働いたことが示された（図２０Ａ（二ステップ）及び図２０Ｂ（一ステップ）を比較のこと）。次いで、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ライトサイクラー）リアルタイム系（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてプライマーを試験したところ、同程度の結果が得られ（図２０Ｃ）、このことは、検出の点で２種のアッセイの感度が同等であることを示す。
【０１２７】
[00165] 図２０Ｃに関しては、ＲＮＡ標品の増幅（ａ〜ｅで示す。）が示されている。ｘ軸は定量的ＰＣＲアッセイのサイクル数を表し、ｙ軸はバックグラウンドレベルを上回る蛍光強度（Ｆ２）を表す。鋳型を含まない対照（ＮＴＣ）が示されている。ＲＮＡ標品は以下の通りとした。（ａ）反応当たり１×１０９コピー、（ｂ）反応当たり１×１０８コピー、（ｃ）反応当たり１×１０７コピー、（ｄ）反応当たり１×１０６コピー及び（ｅ）反応当たり１×１０５コピー。挿入グラフは、ＰＣＲ産物の融解曲線分析を示す。ＲＮＡ標品（ａ〜ｅ）と鋳型を含まない対照からのシグナルが示されている。ｘ軸は温度（℃）を表し、ｙ軸はバックグラウンドレベルを上回る蛍光強度を表す。
【０１２８】
[00166] Ｈ５Ｎ１サブタイプ検出のためのアッセイの特異性を立証するために、本発明者らは、次いで、対照として、インフルエンザＡウイルスの異なるサブタイプのいくつかの参照株（Ｈ３Ｎ８、Ｈ５Ｎ３、Ｈ７Ｎ３及びＨ９Ｎ２）と、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）とを用いて、フィールドサンプルでプライマーを調べた。結果から、検出はＨ５Ｎ１のみに特異的であることが示された（図１９Ｂ）。サンプルは、製造業者の使用説明書に従って、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）とＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）とを用いて抽出した。
【０１２９】
[00167] 図１９Ａは、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ定量化試薬によって測定し段階希釈したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写された一本鎖ＲＮＡ（レーン２〜８）、及び、感染卵の尿膜腔液から抽出したＨ５Ｎ１ ＲＮＡの増幅結果を表す。鋳型を含まない対照（滅菌水）は「ＮＴＣ」と示されている。ウイルス量は反応当たりのコピー数によって示されている。（レーン２）反応当たり１×１０９コピー、（レーン３）反応当たり１×１０８コピー、（レーン４）反応当たり１×１０７コピー、（レーン５）反応当たり１×１０６コピー、（レーン６）反応当たり１×１０５コピー、（レーン７）反応当たり１×１０４コピー及び（レーン８）反応当たり１×１０３コピー。Ｈ５Ｎ１ ＲＮＡは、反応当たり約１×１０６コピーであると推定される
【０１３０】
[00168] 図１９Ｂは、異なるサブタイプの鳥インフルエンザＡウイルスの参照株（レーン１２〜１５）、及びニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ、レーン１６）を用いた、Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスの特異的検出を表す。Ｈ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ８、Ｈ９Ｎ２及びＮＤＶ分離株は、獣医学研究所、マレーシア（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｍａｌａｙｓｉａ）によってフィールドサンプルから単離され、Ｈ５Ｎ３及びＨ７Ｎ５分離株は鳥取大学家畜病理学教室（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｏｔｔｏｒｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊａｐａｎ）から提供された。非Ｈ５Ｎ１分離株及び鋳型を含まない対照（水）からの陰性シグナルが示されている。
【０１３１】
[00169] ２００４年から２００５年の大流行の際にベトナム及びマレーシアから単離されたニワトリ、アヒル及びタイワンアヒル由来の既知の事例及び疑わしい事例からなる全部で１４５種のフィールドサンプルを、Ｈ５Ｎ１ ＲＮＡについて試験した（表９）。プールされた臓器組織、尿膜腔液、総排泄腔スワブ及び気管スワブのサンプルから、尿膜腔液、及びプールされた臓器については１００％陽性の陽性結果が得られ（表９）、このＲＴ−ＰＣＲアッセイの感度が実証された。全ての陽性サンプルについて、確認試験としてウイルス培養単離法を用いた（表９）。ホモジナイズした組織の検出率が４０％と最低であったのに対し、総排泄腔スワブ及び気管スワブからは６６．７％の陽性Ｈ５Ｎ１サンプルが検出された。検出におけるこの差異は、種々のサンプルからのウイルスＲＮＡ回収における異なる効率によるものであると思われる。Ｈ５Ｎ１ ＲＮＡ回収及び検出については、サンプルの中で尿膜腔液画分の効率が最高であった（表９）。
【０１３２】
【表９】
【０１３３】
[00170] プライマーの有用性を更に確認する目的で、次いで、ベトナム由来の５種の陽性サンプルを、既存の社内Ｈ５プライマーセットと並行して試験したところ、結果から、本明細書に記載のＨ５Ｎ１プライマー（プライマーセット６）は、５種の陽性Ｈ５Ｎ１サンプルのうち５種を検出したのに対し、その他のプライマーセットは、５種のうち３種を検出したのみであった（図２１Ｃ）ことが示された。このことは、本明細書に記載のＨ５Ｎ１プライマーはより高感度であり、ウイルス量の少ない弱い陽性サンプルも検出できることを示す。
【０１３４】
[00171］図２１Ａは、ニワトリ、アヒル及びタイワンアヒルの尿膜腔液からのＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスの検出を示す（レーン１〜１１）。図２１Ｂは、ホモジナイズした組織からのＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスの検出を示す（レーン１〜４）。３種のサンプルのうち２種しか検出されなかったが（レーン３及び４）、これは非効率的なＲＮＡ抽出によるものであろう。Ｈ５Ｎ１陽性対照が示されている（レーン５）。図２１Ｃは、社内Ｈ５プライマーセットと新規Ｈ５Ｎ１プライマーとの比較を示す。社内Ｈ５プライマーセットは、ウイルス培養単離によって確認されている５種の陽性サンプルのうち３種を検出したのに対し（レーン１〜５）、Ｈ５Ｎ１プライマーセットは５種のサンプル全てを検出した（レーン７〜１１）。両プライマーセットに関しては同一バッチの抽出ＲＮＡを用いた。
【０１３５】
[00172]実施例５：リアルタイムＰＣＲ及び一ステップＲＴ−ＰＣＲ反応を用いるＨ５Ｎ１及びＨ５インフルエンザＡウイルスの検出
【０１３６】
[00173] リアルタイムＰＣＲプロトコール及び一ステップ若しくは二ステップＲＴ−ＰＣＲプロトコールの双方を用いて、ＲＴ−ＰＣＲ実験を上述のように実施した。実験にはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡを用いた。
【０１３７】
[00174] Ｈ５Ｎ１を検出する実験では、以下のＨ５Ｎ１サブタイプのＮＡ遺伝子に対するプライマーセットを用いた。（９）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ１ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ３ａＲ、（１０）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ１ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ６ｇＲ、（１１）ｇｉｓＡＦＨ５ＮｌＮｌａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ７ｂＲ、（１２）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ２ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ３ａＲ、（１３）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ２ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ６ｇＲ、（１４）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ２ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ７ｂＲ、（１５）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ４ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ６ｇＲ、（１６）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ４ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ７ｂＲ、（１７）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ５ｇＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ７ｂＲ、（１８）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ８ｂＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ９ａＲ、（１９）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ８ｂＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ１１ｂＲ、（２０）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ１０ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ１１ｂＲ。予測される断片の大きさはそれぞれ、１２０ｂｐ、３１５ｂｐ、４５２ｐ、１１１ｂｐ、３０６ｂｐ、４４３ｂｐ、２１７ｂｐ、３５４ｂｐ、１５８ｂｐ、１１９ｂｐ、２７１ｂｐ及び１７２ｂｐであった。増幅産物は１．０％又は１．５％アガロースゲルに流し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。全ての反応について、それぞれ、ＱＳ１＝１０００ｎｇ／μＬ、ＱＳ２＝１００ｎｇ／μＬ、ＱＳ３＝１０ｎｇ／μＬ、ＱＳ４＝１ｎｇ／μＬ、ＱＳ５＝０．１ｎｇ／μＬ、ＱＳ６＝０．００１ｎｇ／μＬ、及び、ＮＴＣ＝鋳型を含まない対照。
【０１３８】
[00175] 図２２〜３３はそれぞれ、プライマーセット９〜２０を用いるリアルタイムＰＣＲ実験の結果を示す。図２２〜３３の各々について、図Ａ（図２２Ａ〜３３Ａ）は、種々の濃度のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡ鋳型の増幅曲線及びＲＮＡ標準曲線を示し、図Ｂ（図２２Ｂ〜３３Ｂ）は融解曲線を示し、図Ｃ（図２２Ｃ〜３３Ｃ）はＰＣＲ産物のアガロースゲル可視化を示す。
【０１３９】
[00176] 同様のリアルタイムＰＣＲ実験を、以下のＨ５Ｎ１サブタイプのＨＡ遺伝子に対するプライマーセットを用いて実施した。（２１）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ９Ｆ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ１１ｃＲ、（２２）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ１３Ｆ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ１６ｃＲ、並びにＨ５サブタイプ（Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２及びＨ５Ｎ３）のＨＡ遺伝子、（２３）ｇｉｓＡＦＨ５Ｈ１ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｈ２ａＲ。セット２１及び２２を用いて得られた結果を、それぞれ図３４Ａ〜３４Ｄ及び図３５Ａ〜３５Ｄに示し、セット２３を用いて得られた結果を図３６Ａ〜３６Ｄに示す。図中、ａ及びｂはそれぞれ、Ｈ５Ｎ２及びＨ５Ｎ３ ＲＮＡ分離株の結果である。これらの図において、図Ａ（図３４Ａ、３５Ａ、３６Ａ）は種々の濃度の鋳型の増殖曲線を示す。用いた鋳型は、Ｈ５Ｎ１及びＨ５サブタイプのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡ、並びにＨ５Ｎ２及びＨ５Ｎ３のフィールドサンプルから抽出したＲＮＡであった。図Ｂ（図３４Ｂ、３５Ｂ、３６Ｂ）はＲＮＡ標準曲線を示し、図Ｃ（図３４Ｃ、３５Ｃ、３６Ｃ）は融解曲線を示し、図Ｄ（図３４Ｄ、３５Ｄ、３６Ｄ）はＰＣＲ産物のアガロースゲル可視化を示す。標準曲線は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡ標品の定量化された量であるＱＳ１〜ＱＳ５に基づいて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒソフトウェアを用いて作製した。
【０１４０】
[00177] 次いで、上述のように、選択したＨ５Ｎ１ ＮＡプライマーセット（一ステップ法にはセット１０、１１、１３及び１６を、二ステップ法にはセット１２及び１５を用いる。）を用いて一ステップ又は二ステップＲＴ−ＰＣＲ反応を実施し（それぞれ図３７〜４２）、また、Ｈ５ ＨＡプライマーセット２３を用いて一ステップ又は二ステップＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した（それぞれ、図４３Ａ及び４３Ｂ）。図３７〜４２、４３Ａ及び４３Ｂに示されるように、結果は、エチジウムブロマイドで染色した１．５％アガロースゲルを用いて可視化した。
【０１４１】
[00178]実施例６：Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブ系を用いるリアルタイムＰＣＲ法
【０１４２】
[00179] 基本混合物（マスターミックス）は、氷上で１．５ｍｌ反応試験管中に、以下を順に加えることによって調製した。１．３μＬの５０ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２、８μＬの１μＬプローブ、１μＬのＦプライマー、１μＬのＲプライマー及び７．５μＬのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＲＮＡ マスターハイブリダイゼーションプローブ。この基本混合物を穏やかに混合し、１８μＬを予冷したガラスキャピラリーに移した。２μＬのＲＮＡ鋳型を加え、キャピラリーを７００×ｇで５秒間遠心分離した。このキャピラリーをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）装置のローターに入れ、表５〜８に示されるプログラムに従って、プログラム７については４５サイクルを回した。
【０１４３】
[00180] Ｔａｑｍａｎ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）検出系を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施した。サブタイプＨ５のＨＡ遺伝子を検出するために、以下の増幅プライマー対を用いた。（２４）ｇｉｓＡＦＨ５Ｈ１ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５ＨＴｑＲ、加えてＴａｑｍａｎ（商標）プローブｇｉｓＡＦＨ５ＨＴＭＰ。Ｈ５Ｎ１サブタイプのＨＡ遺伝子を検出するために、以下の増幅プライマー対を用いた。（２５）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１ＨＴｑＦ１及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ１１ｃＲ、（２６）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ９Ｆ及びｇｉｓＡＦＨ５ＮｌＨＴｑＲｌ。これらはそれぞれ、Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１ＨＴＭＰ２及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１ＨＴＭＰ１と共に用いた。Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブは、５’末端でリポーターフルオロフォア６−カルボキシフルオレセインアミダイト（６−Ｆａｍ）を用いて、また、３’末端でクエンチャーテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）を用いて標識した。Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブの配列は表１０に示されている。増幅曲線結果は、Ｈ５プライマーセット２４については図４４に、Ｈ５Ｎ１プライマーセット２５及び２６については図４５及び４６に示す。
【０１４４】
【表１０】
【０１４５】
[00181］実施例７：プライマーを用いるＤＮＡマイクロアレイ
【０１４６】
[00182] 本発明の特定のプライマーをＤＮＡマイクロアレイ（Ａｔｔｏｇｅｎｉｘ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）に用いて、Ｈ５及びＨ５Ｎ１分離株由来のＲＮＡを検出した。簡単には、種々のＨＡ及びＮＡプライマー、具体的にはＨ５（ｇｉｓＡＦＨ５ＨｌａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｈ２ａＲ）、Ｈ５Ｎ１（ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ２ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ４Ｒ）、並びにＮＡ Ｈ５Ｎ１（ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ２ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５ＮｌＮ３ａＲ）を固体表面上に固定した（ＲＴ−ＰＣＲの陽性対照としてＧＡＰＤＨを用いた）。次いで、マイクロアレイを、サンプルＮＡ若しくはＨＡ転写物ＲＮＡ又はその双方でプローブし、マイクロアレイの各スポットにおけるプローブのプライマーとの結合を、二本鎖核酸を検出するためのＳＹＢＲグリーン蛍光プローブを用いて検出した。結果を表１１に示す。これから明らかなように、ＮＡ転写物はＨＡ転写物よりも低濃度で検出可能であり、このことは、用いたＮＡプライマーが、用いた特定のＨＡプライマーよりも高感度であることを示す。
【０１４７】
【表１１】
【０１４８】
[00183] 当業者には理解されることであるが、本明細書に記載の典型的実施形態に対しては多数の改変が可能である。本発明は、そのような改変の全てを、請求の範囲によって定義されるその範囲内に包含するものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】ＨＡ遺伝子を示し、本発明の典型的なフォワード及びリバースプライマー（「ｇｉｓＡＦ」で始まる）の位置、並びに当技術分野で公知のプライマー（「ＴＷ」、「ＶＭ」又は「ＨＫ」で始まる）の位置を示す模式図である。
【図２】Ｈ５Ｎ１分離株のＲＮＡから逆転写された鋳型ＤＮＡを増幅するために、本発明の典型的なプライマー（セット１〜８）を用いて、ゲルベースのＰＣＲアプローチによって調製されたＰＣＲ増幅産物を示すアガロースゲルの写真である。
【図３】種々の量の鋳型及び図２で用いたプライマーセット３を用いて得た増幅産物の相対量を示すアガロースゲルの写真である。
【図４】種々の量の鋳型及び図２で用いたプライマーセット５を用いて得た増幅産物の相対量を示すアガロースゲルの写真である。
【図５】種々の量の鋳型及び図２で用いたプライマーセット８（上側のバンド）及び６（下側のバンド）を用いて得た増幅産物の相対量を示すアガロースゲルの写真である。
【図６】Ｈ５Ｎ１分離株のＲＮＡから逆転写された鋳型ＤＮＡを増幅するために、本発明の典型的なプライマー（セット１〜８）を用いて、ＳＹＢＲ緑色色素を用いるリアルタイムＰＣＲアプローチによって調製したＰＣＲ増幅産物を示すアガロースゲルの写真である。
【図７】図６のプライマーセット１を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図８】図６のプライマーセット２を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図９】図６のプライマーセット３を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図１０】図６のプライマーセット４を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図１１】図６のプライマーセット５を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図１２】図６のプライマーセット６を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図１３】図６のプライマーセット７を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図１４】図６のプライマーセット８を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図１５】図６のプライマーセット１及び２を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図１６】図６のプライマーセット３、４及び５を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図１７】図６のプライマーセット５及び６を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図１８】図６のプライマーセット７及び８を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図１９Ａ】ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写された一本鎖ＲＮＡを段階希釈したものを用いた一ステップＲＴ−ＰＣＲによるＨ５Ｎ１鳥インフルエンザＡウイルスの検出を示すアガロースゲルの写真である。
【図１９Ｂ】一ステップＲＴ−ＰＣＲによる、フィールドサンプルからのＨ５Ｎ１鳥インフルエンザＡウイルスの特異的検出を示すアガロースゲルの写真である。
【図２０Ａ】二ステップＲＴ−ＰＣＲ反応を用いて得たＰＣＲ産物のアガロースゲルの写真である。
【図２０Ｂ】一ステップＲＴ−ＰＣＲ反応を用いて得たＰＣＲ産物のアガロースゲルの写真である。
【図２０Ｃ】プライマーセット６を用いたリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。
【図２１Ａ】本発明の典型的なプライマーを用いて、尿膜腔液のサンプルにおけるＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスを検出した結果を示すアガロースゲルの写真である。
【図２１Ｂ】本発明の典型的なプライマーを用いて、ホモジナイズした組織のサンプルにおけるＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスを検出した結果を示すアガロースゲルの写真である。
【図２１Ｃ】社内Ｈ５プライマーを用いた場合とＨ５Ｎ１プライマーセットを用いた場合の、フィールドサンプルにおけるＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスを検出した結果を比較するアガロースゲルの写真である。
【図２２Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット９）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図２２Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット９）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図２２Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット９）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図２３Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１０）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図２３Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１０）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図２３Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１０）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図２４Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１１）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図２４Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１１）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図２４Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１１）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図２５Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１２）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図２５Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１２）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図２５Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１２）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図２６Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１３）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図２６Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１３）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図２６Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１３）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図２７Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１４）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図２７Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１４）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図２７Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１４）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図２８Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１５）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図２８Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１５）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図２８Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１５）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図２９Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１６）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図２９Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１６）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図２９Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１６）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図３０Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１７）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図３０Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１７）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図３０Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１７）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図３１Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１８）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図３１Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１８）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図３１Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１８）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図３２Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１９）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図３２Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１９）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図３２Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１９）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図３３Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２０）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図３３Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２０）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図３３Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２０）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図３４Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２１）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図３４Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２１）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応におけるＲＮＡ標準曲線である。
【図３４Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２１）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図３４Ｄ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２１）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図３５Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２２）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図３５Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２２）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応におけるＲＮＡ標準曲線である。
【図３５Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２２）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図３５Ｄ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２２）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図３６Ａ】Ｈ５インフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１（ＱＳ１〜ＱＳ５）、Ｈ５Ｎ２（ａ）及びＨ５Ｎ３（ｂ））のＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２３）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図３６Ｂ】Ｈ５インフルエンザＡのＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２３）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応におけるＲＮＡ標準曲線である。
【図３６Ｃ】Ｈ５インフルエンザＡのＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２３）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図３６Ｄ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１（ＱＳ１〜ＱＳ５）、Ｈ５Ｎ２及びＨ５Ｎ３）のＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２３）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図３７】種々の量の鋳型及びプライマーセット１０を用いて、一ステップＲＴ−ＰＣＲ法によって得られた増幅産物の相対量を示すアガロースゲルの写真である。
【図３８】種々の量の鋳型及びプライマーセット１１を用いて、一ステップＲＴ−ＰＣＲ法によって得られた増幅産物の相対量を示すアガロースゲルの写真である。
【図３９】種々の量の鋳型及びプライマーセット１３を用いて、一ステップＲＴ−ＰＣＲ法によって得られた増幅産物の相対量を示すアガロースゲルの写真である。
【図４０】種々の量の鋳型及びプライマーセット１６を用いて、一ステップＲＴ−ＰＣＲ法によって得られた増幅産物の相対量を示すアガロースゲルの写真である。
【図４１】種々の量の鋳型及びプライマーセット１２を用いて、二ステップＲＴ−ＰＣＲ法によって得られた増幅産物の相対量を示すアガロースゲルの写真である。
【図４２】種々の量の鋳型及びプライマーセット１５を用いて、二ステップＲＴ−ＰＣＲ法によって得られた増幅産物の相対量を示すアガロースゲルの写真である。
【図４３Ａ】種々の量の鋳型及びプライマーセット２３を用いて、一ステップＲＴ−ＰＣＲ法によって得られた増幅産物の相対量を示すアガロースゲルの写真である。
【図４３Ｂ】種々の量の鋳型及びプライマーセット２３を用いて、二ステップＲＴ−ＰＣＲ法によって得られた増幅産物の相対量を示すアガロースゲルの写真である。
【図４４】Ｔａｑｍａｎ（商標）リアルタイムＰＣＲ法及びサブタイプＨ５のＨＡ遺伝子に対するプライマーセット２４を用いて得られた増幅曲線である。
【図４５】Ｔａｑｍａｎ（商標）リアルタイムＰＣＲ法及びサブタイプＨ５Ｎ１のＨＡ遺伝子に対するプライマーセット２５を用いて得られた増幅曲線である。
【図４６】Ｔａｑｍａｎ（商標）リアルタイムＰＣＲ法及びサブタイプＨ５Ｎ１のＨＡ遺伝子に対するプライマーセット２６を用いて得られた増幅曲線である。
【関連出願の相互参照】
【０００１】
[0001] 本願は、２００４年６月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５７８，３５３号の利益及び優先権を主張するものであり、その内容は、参照されることにより本明細書に組み込まれる。
【発明の分野】
【０００２】
[0002] 本発明は、核酸に基づく検出方法、より詳しくは、鳥インフルエンザウイルスを検出するプライマー及び方法に関する。
【発明の背景】
【０００３】
[0003] ３種のインフルエンザウイルス、Ａ型、Ｂ型及びＣ型が知られており、それらはオルトミクソウイルス科と呼ばれる、エンベロープを有するネガティブセンスの一本鎖ＲＮＡウイルスのファミリーに属している（Ｓｗａｙｎｅ，Ｄ．Ｅ．及びＤ．Ｌ．Ｓｕａｒｅｚ（２０００）Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．１９、４６３〜４８２頁）。ウイルスゲノムは、約１２０００〜１５０００ヌクレオチドの長さであり、８つのＲＮＡセグメントを含む（Ｃ型では７つ）。
【０００４】
[0004] インフルエンザＡウイルスは、ヒト、ブタ、ウマ、海洋哺乳類、鳥類等の多数の動物に感染する（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｋ．Ｇ．ら（２００５）Ｌａｎｃｅｔ ３６２、１７３３〜１７４５頁)。その自然宿主は水鳥であり、鳥類種では、ほとんどのインフルエンザウイルス感染は、呼吸器及び腸管に局在化された軽い感染を引き起こす。しかし、このウイルスは、家禽では高病原性作用を有し、突発的に大流行して罹患した家禽集団において高い死亡率を引き起こすことがある。Ｈ５Ｎ１等の高病原性株は、死亡率が１００％に到達することもある系統感染を引き起こす（Ｚｅｉｔｌｉｎ，Ｇ．Ａ．及びＭ．Ｊ．Ｍａｓｌｏｗ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｒｅｐ．７、１９３〜１９９頁)。ヒトでは、インフルエンザウイルスは高伝染性の急性呼吸器疾患を引き起こし、これが、ヒトにおける流行性かつ汎発性の疾患をもたらしている（Ｃｏｘ，Ｎ．Ｊ．及びＫ．Ｓｕｂｂａｒａｏ（１９９９）Ｌａｎｃｅｔ ３５４、１２７７〜１２８２頁)。
【０００５】
[0005] インフルエンザＡウイルスは、ウイルスの付着及び細胞性放出に必要な表面糖タンパク質、すなわち、血球凝集素（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）をコードする２種の遺伝子の抗原性領域における対立遺伝子の差異に基づいて、サブタイプに分類することができる。その他の主要ウイルスタンパク質としては、核タンパク質、ヌクレオカプシド、構造タンパク質、膜タンパク質（Ｍ１及びＭ２）、ポリメラーゼ（ＰＡ、ＰＢ１及びＰＢ２）及び非構造タンパク質（ＮＳ１及びＮＳ２）が挙げられる。
【０００６】
[0006] インフルエンザＡウイルスでは、現在、ＨＡの１５種のサブタイプ（Ｈ１〜Ｈ１５）、及び９種のＮＡ（Ｎ１〜Ｎ９）抗原性変異体が知られている。サブタイプＨ５及びＨ７は、家禽において高病原性感染を引き起こす可能性があり、特定のサブタイプは、種の壁を乗り越えてヒトに感染することが判明している。これまでに、ヒトに蔓延するサブタイプとして知られているものは３種しかない（Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２及びＨ３Ｎ２）。しかし、１９９７年及び２００３年に香港において記録されたように、近年、鳥インフルエンザＡの病原性Ｈ５Ｎ１サブタイプが種の壁を乗り越えて、ヒトに感染することが報告され（Ｐｅｉｒｉｓ，Ｊ．Ｓ．Ｍ．ら（２００４）Ｌａｎｃｅｔ ３６３、６１７〜６１９頁、Ｙｕｅｎ，Ｋ．Ｙ．ら（１９９８）Ｌａｎｃｅｔ ３５１、４６７〜４７１頁）、死に至る患者も現れている。２００３年後半から、家禽ではＨ５Ｎ１鳥インフルエンザＡが蔓延し、ベトナム、タイ、韓国、ラオス、カンボジア、インドネシア、日本、マレーシア等、いくつかのアジア諸国で深刻な大流行が報告されている（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ）（２００４） Ｍｏｒｂ．Ｍｏｒｔａｌ．Ｗｋｌｙ．Ｒｅｐ．５３、１００〜３頁、Ｈｉｅｎ Ｔ．Ｔ．ら（２００４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０、１１７９〜１１８８頁)。それらは、何百万もの家禽の大量処分をもたらし、深刻な経済的な影響を及ぼしている。
【０００７】
[0007] ヒトでは、鳥インフルエンザウイルスは、気道、並びに腸管、肝臓、脾臓、腎臓及びその他の臓器の細胞に感染する。鳥インフルエンザ感染の症状としては、発熱、呼吸困難（息切れ及び咳を含む）、リンパ球減少、下痢及び血糖値調節困難が挙げられる。Ｈ５サブタイプ、特に、Ｈ５Ｎ１が高病原性を有し、また、既に実証されているように、種を越えてヒトに感染する能力を有することにより、これらのウイルス株に関連した、重大な経済上及び公衆衛生上の危険（極めて流行性で、汎発性の脅威を含む。）が存在している。
【０００８】
[0008] 従って、Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザＡウイルスは、アジアのみならず全世界のヒトの健康にとって潜在的に危険なものである。蔓延の可能性を下げ、流行に発展する危険を低減するためには、封じ込め手順に加えて、早期診断のための高感度な検出アッセイが不可欠である。
【０００９】
[0009] 現在、生体サンプル中の、鳥インフルエンザウイルスのＨ５及びＨ５Ｎ１サブタイプを検出するために利用可能な種々の技術があるが、そのような技術としては、ＲＮＡを増幅する核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）法、ウイルス培養、ウイルスＲＮＡゲノムから転写されたＤＮＡを増幅する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法、血球凝集阻害、並びに種々の蛍光及び酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。
【００１０】
[0010] 詳しくは、Ｓｏらによる国際公開第０２／２９１１８号パンフレットに、鳥インフルエンザウイルスのＨ５サブタイプを検出するためのＮＡＳＢＡアッセイ及びキットが記載されている。Ｈｅｉｎらは、種々の蛍光及び酵素結合免疫測定法を用いる抗原試験の使用について記載している（２００４，ＮｅｗＥｎｇ．Ｊ ｏｆ Ｍｅｄ．３５０（１２）、１１７９〜１１８８頁）。Ｌａｕらは、鳥インフルエンザウイルスのＨ５又はＨ７サブタイプを検出するためのＮＡＳＢＡ法について記載している（２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３１３、３３６〜３４２頁）。Ｌｅｅら（２００１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ９７、１３〜３２頁）及びＰａｙｕｎｇｐｏｒｎら（２００４，Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７、５８８〜５９３）は、鳥インフルエンザウイルスサブタイプを同定及び細分類又は検出するためのＲＴ−ＰＣＲアッセイについて記載している。しかし、これらの方法はいずれも、Ｈ５若しくはＨ５Ｎ１のいくつかの分離株又は変異体にのみ由来する遺伝情報を用いて、ウイルスの存在を確定するものである。更に、これらのアッセイは特異性及び感度が低いことが報告されている。臨床上は、これらの診断は、低感度であることにより、ヒトにおけるインフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）ウイルスの信頼性のある検出における有用性が制限される可能性がある。従って、迅速な早期の診断に有用な高感度の診断試験が強く求められている。
【発明の概要】
【００１１】
[0011] ２００種を超えるＨ５分離株、及び１００種を超えるＨ５Ｎ１分離株に由来するＨＡ遺伝子の配列比較に基づいて、また、約７０種のＨ５Ｎ１分離株に由来するＮＡ遺伝子の配列比較に基づいて、これらの遺伝子内の保存領域に対する一連のプライマーを開発した。これらのプライマーは、多種多様なＨ５及びＨ５Ｎ１分離株をスクリーニングするのに有用であり、迅速、特異的かつ高感度な検出方法を可能にする。
【００１２】
[0012] すなわち、一態様において、本発明は、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含むプライマーを提供する。別の態様において、本発明は、標的アニーリング配列と非インフルエンザＡウイルス配列とを含むプライマーであって、標的アニーリング配列が配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含むプライマーを提供する。
【００１３】
[0013] これらのプライマーは、サンプル、例えば、このようなウイルスを保持している疑いのある生物に由来するサンプル中の鳥インフルエンザウイルスＨ５又はＨ５Ｎ１の存在を検出するのに有用であり、サンプル中のウイルスの存在を検出するための逆転写ポリメラーゼ連鎖反応において使用することができる。
【００１４】
[0014] すなわち、更に別の態様において、本発明は、サンプル中のインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出する方法であって、サンプルから得たＲＮＡから逆転写されたＤＮＡを、各々が配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のプライマーを用いて増幅すること、及び増幅産物を検出することを含み、増幅産物の存在がサンプル中の鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１の存在を示す方法を提供する。
【００１５】
[0015] 本明細書に記載の方法を用いて、多種多様なＨ５及びＨ５Ｎ１インフルエンザＡウイルス分離株を検出することができる。単一の反応試験管においてＲＮＡが逆転写され、その産物が増幅される一ステップ法を用いることで、検出時間の短縮が可能になり、サンプル操作が最小化され、サンプルの相互汚染の危険性が低減される。従って、本明細書に記載のプライマーを用いる、本明細書に記載の方法は、Ｈ５及びＨ５Ｎ１インフルエンザＡ感染の早期検出及び／又は診断に有用である。更に、これらの方法を用いてサンプル中のおよそのウイルス量を調べることができ、その適用は臨床及び公衆衛生管理の場で有用である。
【００１６】
[0016] 本発明のプライマーは、サンプル中の鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１の存在を検出するためのその他の増幅方法、例えば、核酸配列に基づく増幅法において有用である。本発明のプライマーはまた、鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１のＨＡ又はＮＡ遺伝子に相当するＤＮＡを配列決定するのにも有用である。
【００１７】
[0017] 更に別の態様において、本発明は、サンプル中のインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出する方法であって、サンプルと、支持体上に固定されているプライマーとを、プライマーとサンプルとがハイズリダイズするのに適した条件下で接触させるステップと、プライマーとサンプルとのハイブリダイゼーションを検出するステップと、を含み、プライマーが、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む方法を提供する。
【００１８】
[0018] 更に別の態様において、本発明は、サンプル中のインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出する方法であって、サンプルと、１種又は複数のプライマーを含む核酸マイクロアレイとを、当該１種又は複数のプライマーとサンプルとがハイブリダイズするのに適した条件下で接触させるステップと、１種又は複数のプライマーとサンプルとのハイブリダイゼーションを検出するステップと、を含み、プライマーの各々が、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む方法を提供する。
【００１９】
[0019] 別の態様において、本発明は、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含むプライマーを含む核酸マイクロアレイを提供する。
【００２０】
[0020] 更に別の態様において、本発明は、サンプル中のインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出するためのキットであって、本明細書で規定されるプライマーと、使用説明書とを含むキットを提供する。
【００２１】
[0021] 本発明の他の態様及び特徴は、本発明の具体的な実施形態に関する以下の説明を添付の図面と共に検討すれば、当業者に明らかとなろう。
【詳細な説明】
【００２２】
[0069] インフルエンザＡウイルスを始めとするＲＮＡウイルスは、ＤＮＡ複製と比較した場合のＲＮＡ複製の低い忠実性のために、高い突然変異率を有する傾向がある。その結果、インフルエンザウイルスは急速に進化する傾向がある。更に、インフルエンザＡウイルスは、ウイルス株間の遺伝子再集合を受ける傾向があり、この機構が種々のＨＡ及びＮＡサブタイプの発達に寄与してきた。本発明者らは、２００種を超えるインフルエンザＡ Ｈ５分離株、及び１００種を超えるインフルエンザＡ Ｈ５Ｎ１分離株から得た血球凝集素（「ＨＡ」）遺伝子の配列を比較した。同様に、本発明者らは、約７０種のインフルエンザＡ Ｈ５Ｎ１分離株から得たノイラミニダーゼ（「ＮＡ」）遺伝子の配列を比較した。驚くべきことに、インフルエンザウイルス内の高い突然変異率にも関わらず、本発明者らは、特定のサブタイプに特有の、高度に保存された配列の短い領域を見出した。それらの領域は、サンプルにおいてそれらのサブタイプの存在を同定又は検出するのに適している。
【００２３】
[0070] 比較に用いた配列は、公的に利用可能なデータベースから得、種々の配列比較ソフトウェア（ソフトウェアＣｌｕｓｔａｌＷ等）を用いて比較した。
【００２４】
[0071] 本発明者らは、これらの配列比較により、検出アッセイ、例えば、逆転写とそれに続くポリメラーゼ連鎖反応増幅（「ＲＴ−ＰＣＲ」）で用いるための、鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１のＨＡ遺伝子又はＮＡ遺伝子の保存領域に対する、配列番号１〜配列番号１１４に示されるフォワード及びリバースプライマーを開発した。このような多数のウイルス分離株の比較によって、ＨＡ又はＮＡ遺伝子の十分に保存された領域に対するプライマー、ひいては突然変異による変化の影響を受ける可能性が低い領域を標的とするプライマーの設計が可能となり、それによって、現在利用可能なプライマーよりも、Ｈ５又はＨ５Ｎ１変異体の大きなプールを検出することができるプライマーを提供することが可能となった。
【００２５】
[0072] 本明細書において、用語「分離株」とは、特定の遺伝子配列を有する患者等の特定の生体供給源から単離された、特定のウイルス又はウイルス粒子のクローン集団を指す。異なる分離株は、１個又は数個のヌクレオチドのみが異なってもよく、依然として同一のウイルスサブタイプ内にあってもよい。ウイルスサブタイプとは、これらの糖タンパク質の抗原性に従って分類された、ＨＡのサブタイプ又はＮＡのサブタイプのいずれかを指す。
【００２６】
[0073] 本発明者らは、特定の保存領域において、特定の位置の１個又は複数個のヌクレオチドが分離株間で異なることを見出した。そして、それらの領域についてプライマーのファミリーを開発した。ファミリー内の各プライマーは、ＨＡ又はＮＡ遺伝子の保存配列に基づいたものであるが、保存配列内の１個又は複数個の特定の塩基が異なっている。
【００２７】
[0074] 従って、一態様において、本発明は、配列番号１〜配列番号１１４のいずれか１種に示される配列を含むプライマーを提供する。
【００２８】
[0075] 当業者には理解されることであるが、「プライマー」とは、相補配列を含む第２のＤＮＡ又はＲＮＡ分子（標的）と塩基対形成することができる、所定の配列の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。得られたハイブリッド分子の安定性は、生じる塩基対形成の長さに応じて異なり、プライマー及び標的分子間の相補性度、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシー度、等のパラメーターの影響を受ける。ハイブリダイゼーションストリンジェンシー度は、温度、塩濃度、及びホルムアミド等の有機分子の濃度といったパラメーターの影響を受け、当業者に公知の方法を用いて決定することができる。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションを含む方法、例えば、核酸配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応による核酸増幅、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、電気泳動移動度シフトアッセイ又はゲルシフト法（ＥＭＳＡ）、核酸マイクロアレイ、及び当業者に公知のその他の方法に用いられる。
【００２９】
[0076] 用語「ＲＮＡ」とは、２個以上の共有結合している、天然に存在しているか、修飾されたリボヌクレオチドの配列を指す。ＲＮＡは一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。用語「ＤＮＡ」とは、２個以上の共有結合している、天然に存在しているか、修飾されたデオキシリボヌクレオチドの配列を指し、ｃＤＮＡ及び合成（例えば化学合成）ＤＮＡを含み、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。「逆転写されたＤＮＡ」又は「から逆転写されたＤＮＡ」とは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）の作用によりＲＮＡ鋳型から生じた相補的ＤＮＡ又はコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を意味する。
【００３０】
[0077] 鳥インフルエンザウイルスは一本鎖ＲＮＡウイルスであり、いくつかの実施形態では、プライマーは、表１に示される、鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１のＨＡ遺伝子の保存領域のＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列（配列番号１〜配列番号３１及び配列番号１１２）を有する。このようなプライマーは、サブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１のＨＡ遺伝子から逆転写されたＤＮＡを配列決定するか増幅する場合に、フォワードプライマーとして使用することができる。
【００３１】
【表１】
【００３２】
[0078] いくつかの実施形態では、プライマーは、表２に示される、鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５ＮｌのＨＡ遺伝子の保存領域のＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列（配列番号３２〜７１、配列番号１１３及び配列番号１１４）を有する。このようなプライマーは、サブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１のＨＡ遺伝子から逆転写された１本鎖ＤＮＡを配列決定するか増幅する場合に、リバースプライマーとして使用することができる。
【００３３】
【表２−１】
【００３４】
【表２−２】
【００３５】
[0079] いくつかの実施形態では、プライマーは、配列番号７２〜配列番号９３に示される、鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５ＮｌのＮＡ遺伝子の保存領域のＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列を有する（表３参照）。このようなプライマーは、サブタイプＨ５Ｎ１のＮＡ遺伝子から逆転写されたＤＮＡを配列決定するか増幅する場合に、フォワードプライマーとして使用することができる。
【００３６】
【表３】
【００３７】
[0080] いくつかの実施形態では、プライマーは、配列番号９４〜配列番号１１１に示される、鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５ＮｌのＮＡ遺伝子の保存領域のＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列を有する（表４参照）。このようなプライマーは、サブタイプＨ５Ｎ１のＮＡ遺伝子から逆転写されたＤＮＡを配列決定するか増幅する場合に、リバースプライマーとして使用することができる。
【００３８】
【表４】
【００３９】
[0081] 検査したウイルス分離株のＨＡ又はＮＡ遺伝子の保存領域内で、特定の位置のヌクレオチドが異なる場合には、これらの遺伝子の保存領域に基づいてプライマーの「ファミリー」を開発した。この場合、プライマーのファミリー内の１個又は複数の残基がプライマー毎に異なる。例えば、配列番号１〜配列番号６は、このようなファミリーである。
【００４０】
[0082] 更に、当業者には理解されることであるが、プライマーは保存配列に基づいたものであるが、変異したプライマーが、元のプライマー配列と同一又は同程度のストリンジェンシーでサンプル中の標的配列と依然としてハイブリダイズするという条件で、保存配列内の１個又は複数の塩基が置換され、挿入され、又は欠失していてもよい。ハイブリダイゼーション条件は、目的の配列に応じて公知の方法により改変してもよい（Ｔｉｊｓｓｅｎ， １９９３、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、第１部、第２章、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。一般には、ストリンジェントな条件は、所与のイオン強度及びｐＨにおいて、所定の配列の熱融点よりも約５℃低いものであるように選択される。
【００４１】
[0083] 当業者には理解されることであるが、プライマーの短い配列中に複数の置換変異を有することで、元の変異していないプライマーの相補体とプライマーとのハイブリダイゼーションの強度が低下し、また、プライマー配列内の変異の間隔及び位置も、ハイブリダイゼーションの強度又はストリンジェンシーに影響を及ぼす。更に、当業者には理解されることであるが、短い配列中の１個又は複数個のヌクレオチドの挿入又は欠失によってもまた、元の変異していないプライマーの相補体とプライマーとのハイブリダイゼーションの強度が低下し、また、短い配列中の２以上の位置に１個又は複数個のヌクレオチドの挿入又は欠失を有することで、変異していないプライマーの相補体とプライマーとのハイブリダイゼーションが著しく変化する可能性がある。
【００４２】
[0084] 鳥インフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子に対する本発明の種々のプライマーのアラインメントを、従来知られているその他のサブタイプ５のＨＡ遺伝子に対するプライマーと共に図１に示す。プライマーＴＷ＿Ｈ５−１５５ｆ及びＴＷ＿Ｈ５−６９９ｒは、Leeら（２００１、Ｊ．Ｖｉｒｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ９７、１３〜２２頁）で開示されている。プライマーＶＭ＿Ｈ５／５１５、ＶＭ＿Ｈ５−１、ＶＭ＿Ｈ５／１２２０及びＶＭ＿Ｈ５−２はＨｅｉｎら（２００４、Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ． ｏｆ Ｍｅｄ．３５０（１２）、１１７９〜１１８８頁）で開示されている。プライマーＨＫ＿配列番号１〜ＨＫ＿配列番号３、ＨＫ＿配列番号５〜ＨＫ＿配列番号７及びＨＫ＿配列番号９〜ＨＫ配列番号１４は、国際公開第０２／２９１１８号パンフレットに開示されている。
【００４３】
[0085] いくつかの実施形態では、プライマーの検出、又はプライマーから合成されたか伸長されたＤＮＡ産物の検出が可能になるように、プライマーを標識で修飾してもよい。例えば、標識としては、蛍光標識、化学発光標識、有色色素標識、放射性標識、放射不透過性標識や、タンパク質（酵素を含む）、ペプチド、又はリガンド（例えば、ビオチン）が挙げられる。
【００４４】
[0086] 特定の実施形態では、プライマーは、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種に加えて、更に他の核酸配列を含んでもよい。このような他の配列は、ＨＡ又はＮＡ遺伝子の配列によってコードされるものであるか、それらの配列に相補的なものであり、配列番号１〜配列番号１１４のいずれか１種によって規定される配列のフランキング領域（隣接した非コード領域）となる。但し、本実施形態に係るプライマーは、完全インフルエンザＡゲノムではなく、また、プライマーＴＷ＿Ｈ５−１５５ｆ、プライマーＴＷ＿Ｈ５−６９９ｒ、プライマーＶＭ＿Ｈ５／５１５、プライマーＶＭ＿Ｈ５−１、プライマーＶＭ＿Ｈ５／１２２０、プライマーＶＭ＿Ｈ５−２、又は上述のＨＫ＿配列番号１〜ＨＫ＿配列番号３、ＨＫ＿配列番号５〜ＨＫ＿配列番号７及びＨＫ＿配列番号９〜ＨＫ＿配列番号１４ではない。
【００４５】
[0087] 或いは、更に含まれる他の配列はＨＡ又はＮＡ遺伝子に対するものでなくてもよく、例えば、タンパク質又は酵素（制限酵素等）によって認識される配列、或いは、標識されたプローブ等の検出に用いる核酸配列に相補的な配列が挙げられる。当業者には理解されることであるが、プライマーには、その用途に応じて最適な長さ及び配列があるので、上述のような他の配列の数及び種類は適当に制限される。例えば、ＰＣＲプライマーは、それより高い温度では鋳型ともはや特異的に結合しない温度が、ポリメラーゼによる伸長が生じる温度にほぼ等しいような長さ又は配列であってはならない。
【００４６】
[0088] 従って、１つの実施形態において、プライマーは本質的に配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種からなる。すなわち、プライマーは、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種の５'、３'又はその両側にフランキングする１個又は複数個の他のヌクレオチドを更に含んでもよいが、そのヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種と、その相補配列を含む核酸分子とのハイブリダイゼーションに大きな影響を及ぼしてはならない。例えば、大きな配列内に含まれる場合であっても、短いプライマー配列の両側にいくつかのヌクレオチドを加えることによって、短いプライマー配列の、その相補配列とのハイブリダイゼーションストリンジェンシーを、上記ヌクレオチドが存在しない場合と同一又は同程度のストリンジェンシーで短いプライマー配列がハイブリダイズすることができない程度に変更してはならない。すなわち、本明細書に記載の配列に隣接するインフルエンザＨＡ又はＮＡ遺伝子中の領域は分離株間で異なる可能性があるので、本質的に配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種からなるプライマーは、広範なＨ５又はＨ５Ｎ１分離株を検出する感度及び能力に影響を及ぼす程度に多量の、本明細書に記載の保存配列をフランキングするウイルス配列を含んではならない。他の特定の実施形態では、プライマーは、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種からなるか、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種である。
【００４７】
[0089] 特定の実施形態では、プライマーは、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む「標的アニーリング配列」と、非インフルエンザウイルスＡ配列と、を含む。
【００４８】
[0090] 標的アニーリング配列は、サンプル中の標的核酸の少なくとも一部とハイブリダイズし、標的核酸はインフルエンザＡ Ｈ５又はＨ５Ｎ１ウイルスサブタイプと相同であるか、相補的であるか、インフルエンザＡ Ｈ５又はＨ５Ｎ１ウイルスサブタイプから転写されるか逆転写されるか、或いはインフルエンザＡ Ｈ５又はＨ５Ｎ１ウイルスサブタイプに由来する。従って、標的アニーリング配列はまた、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種によって規定される配列をフランキングする、ＨＡ又はＮＡ遺伝子の配列によってコードされるか、それに相補的なフランキング配列を含んでもよい。或いは、標的アニーリング配列は、本質的に配列番号１〜配列番号１１４の配列からなるか、配列番号１〜配列番号１１４の配列からなる。
【００４９】
[0091] 非インフルエンザＡウイルス配列は、インフルエンザＡウイルスゲノム配列に由来しないか、対応しないか、相補的でない配列である。上述のように、非インフルエンザＡウイルス配列としては、例えば、タンパク質又は酵素（制限酵素等）によって認識される配列、或いは、検出に用いる核酸配列(例えば、標識されたプローブ、又は、当該プライマーを捕獲するのに用いる固定された核酸分子の捕獲配列）に相補的な配列が挙げられる。非インフルエンザＡウイルス配列は、標的アニーリング配列の５'又は３'側に位置していても、標的アニーリング配列の両側にフランキングしていてもよい。
【００５０】
[0092] プライマー又は本発明のプライマーの長さは、所望の用途又は適用に応じて異なる。例えば、理解されるであろうが、ＰＣＲプライマーの長さは通常、約１５〜約３５塩基の間となる。ＰＣＲプライマーの長さは、増幅しようとする配列、及びプライマー／鋳型ハイブリッドの所望の融解温度によって決定される。しかし、サザンハイブリダイゼーション等に適用する場合には、プライマーは、より長いもの、例えば、約１５塩基〜約１キロ塩基の長さ又はそれより長いものであってもよい。すなわち、プライマーの長さは、例えば、１５塩基〜約１キロ塩基、１５〜約５００塩基、１５〜約３００塩基、１５〜約１５０塩基、１５〜約１００塩基、又は１５〜約５０塩基である。
【００５１】
[0093] 本発明のプライマーは、当技術分野で公知の従来法を用いて調製することができる。例えば、自動核酸シンセサイザーを用いて、標準的なホスホロアミダイト法により、固体支持体上でプライマーを３'から５'方向に合成することができる。このような方法は当業者には公知であろう。
【００５２】
[0094] 本明細書において、用語「プライマー」は、鋳型配列と配列特異的にアニーリングさせ、新規鎖合成を開始するために用いられる一本鎖ヌクレオチドを表すために用いられる。但し、当業者には理解されることであるが、本発明のプライマーの使用はそれに制限されない。例えば、本発明のプライマーを、プローブがハイブリダイズする相補配列を検出するためのプローブとして使用してもよい。このような用途に用いる場合、プライマーは通常、検出のために、蛍光標識、化学発光標識、有色色素標識、放射性標識、タンパク質（酵素を含む）、ペプチド、又はリガンド（例えば、ビオチン）で標識される。プライマーは、プローブとして用いる場合には、核酸ハイブリダイゼーション法、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、核酸マイクロアレイ、及び当業者に公知のその他の方法において使用することができる。
【００５３】
[0095] 本発明のプライマーを用いれば、サンプル、例えば、ウイルスを保持している疑いのある生物に由来する生体サンプル中の鳥インフルエンザサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を診断又は検出することができる。
【００５４】
[0096] すなわち、本発明は、サンプル中の鳥インフルエンザサブタイプＨ５を検出する方法であって、サンプルから得たＲＮＡから逆転写されたＤＮＡを、配列番号３２〜配列番号５５の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のリバースプライマーと、配列番号１〜配列番号１８の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のフォワードプライマーと、を用いて増幅すること、及び増幅産物を検出することを含み、産物が、サンプル中の鳥インフルエンザウイルスＨ５サブタイプの存在を示す方法を提供する。また、サンプル中の鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５Ｎ１を検出する方法であって、サンプルから得たＲＮＡから逆転写されたＤＮＡを、配列番号５６〜配列番号７１、配列番号１１３及び配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のリバースプライマーと、配列番号１９〜配列番号３１及び配列番号１１２の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のフォワードプライマーと、を用いて、又は配列番号９４〜配列番号１１１の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のリバースプライマーと、配列番号７２〜配列番号９３の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のフォワードプライマーと、を用いて増幅すること、及び増幅産物を検出することを含み、産物が、サンプル中の鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１サブタイプの存在を示す方法を提供する。
【００５５】
[0097] 用語、増幅産物を「検出する」とは、鋳型、プライマー及び適当なポリメラーゼ酵素を用いた増幅反応から得られた産物の有無を調べること、又は産物の量を定量化することを含むものとする。
【００５６】
[0098] 通常、サンプルから得たＲＮＡを逆転写することにより、ＲＮＡのＨＡ遺伝子又はＮＡ遺伝子に相補的な一本鎖ＤＮＡを得る。逆転写には、ＲＮＡ鋳型を読み取ることができ、ＲＮＡ鋳型と結合するプライマーから、ＤＮＡヌクレオチドを重合して、ＲＮＡ鋳型の配列に相補的な相補的ＤＮＡ鎖を合成することができる逆転写酵素を用いる。逆転写酵素、例えば、Ｔ７逆転写酵素は市販されており、当業者には公知である。逆転写反応は通常、逆転写酵素活性を最適化するように設計された反応条件及び温度下で、バッファー中で実施する。市販の逆転写酵素は、適当なバッファー及びＤＮＡヌクレオチドと共に提供されている。
【００５７】
[0099] 逆転写反応に用いるプライマーとしては、ＲＮＡ鋳型に沿ったランダムな部位と結合するランダムヘキサマーの混合物が挙げられる。或いは、逆転写プライマーは、ＨＡ遺伝子又はＮＡ遺伝子内の特定の部位で結合するように設計された特異的プライマーであってもよい。従って、表２及び４に示される、配列番号３２〜配列番号７１、配列番号１１３及び配列番号１１４又は配列番号９４〜配列番号１１１のいずれか１種を含む１種又は複数のリバースプライマーは、逆転写反応においてプライマーとして使用することができる。これと同じ本発明のリバースプライマー又はプライマー類が増幅ステップにおいて使用可能であり、これは、特に、逆転写及び増幅が同一反応で実施される場合に有利である。２種以上の本発明のプライマーを用いる場合には、用いるプライマーの各々は異なる配列を有し、各プライマーの配列は、配列番号３２〜配列番号７１、配列番号１１３及び配列番号１１４又は配列番号９４〜配列番号１１１のいずれか１種を含む。
【００５８】
[00100] ＨＡ遺伝子又はＮＡ遺伝子の同一の保存領域に基づくが、プライマー配列内の１個又は複数個のヌクレオチドが異なるプライマーのファミリー、例えば、配列番号３２〜配列番号４３がある場合には、このようなファミリーに由来する１種又は複数のリバースプライマーを使用することができる。これによって鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１の多数のあり得る分離株又は変異体の逆転写、ひいてはその検出が可能となる。本明細書において、「変異体」とは、ＨＡ遺伝子配列が別のＨ５サブタイプのものとは異なっていてもよいＨ５サブタイプ、又はＨＡ遺伝子配列若しくはＮＡ遺伝子配列が別のＨ５Ｎ１サブタイプのものとは異なっていてもよいＨ５Ｎ１サブタイプを指す。
【００５９】
[00101] 逆転写反応の鋳型ＲＮＡは、当技術分野で公知のＲＮＡ抽出法を用いてサンプルから得ることができる。また、ＲＮＡ抽出キット、例えば、ＲＮｅａｓｙ（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）も市販されており、このようなキットが入手可能なこと及びその用途は、当業者には公知であり、理解されることである。
【００６０】
[00102] サンプルは、生体サンプル、例えば、鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を保持している疑いのある個体から採取したサンプルである。サンプルは、感染個体から得たウイルスを含むサンプルであればよく、そのようなサンプルとしては、組織及び体液サンプル、例えば、血液、血清、血漿、末梢血細胞（リンパ球、単核細胞等）、痰、粘膜、尿、糞便、咽頭スワブサンプル、真皮病変スワブサンプル、脳脊髄液、膿、並びに脾臓、腎臓、肝臓等の組織が挙げられる。
【００６１】
[00103] 逆転写反応が完了すると、一本鎖ＤＮＡ分子を増幅反応に使用することができる。用語「増幅する」又は「増幅」とは、鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１の存在を示すために検出しようとする核酸分子を大量に複製する反応を指す。適当なポリメラーゼ酵素を用いて、鋳型核酸、場合によってＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかの新しい鎖を合成してマルチプルコピーを作製する。
【００６２】
[00104] 増幅ステップは、逆転写の条件及び試薬が増幅反応と干渉しないならば、逆転写反応と同一の反応で実施することができる。或いは、逆転写産物を、増幅反応における鋳型として用いる前に精製してもよい。
【００６３】
[00105] 或いは、二本鎖ＤＮＡ分子、例えば、逆転写された一本鎖ＤＮＡ分子に由来する二本鎖ＤＮＡを増幅反応の鋳型として使用してもよい。特定のウイルス分離株のＤＮＡクローンが作製されている場合は、ＤＮＡクローンを増幅の鋳型として使用することができる。標準的な技術を用いてウイルス分離株から二本鎖ＤＮＡクローンを作製する方法は当業者には理解されるものである。サンプルの「ＲＮＡから逆転写されたＤＮＡ」とは、ＲＮＡから逆転写されたＤＮＡに由来するようなＤＮＡ全てを含むものとする。
【００６４】
[00106] 特定の実施形態では、ＰＣＲ増幅反応によって増幅を実施する。従って、増幅ステップは、当業者に公知の標準的な方法及び技術によって、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）を用いて実施することができる。ＤＮＡ分子の増幅に用いるＤＮＡポリメラーゼは市販されている。増幅反応は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の重合活性を最適化するような条件下で、デオキシヌクレオチド、バッファー、関連のフォワード及びリバースプライマー等の必要な試薬を用いて実施する。
【００６５】
[00107] ＰＣＲ増幅反応は、転写されたＤＮＡ鎖及び鋳型ＲＮＡ（存在する場合）を変性し、いずれかの鎖とのプライマーの結合を避けるのに十分な温度に反応物を加熱する変性セグメントを含む。変性セグメントに、プライマーがＤＮＡ鎖と結合可能な温度に反応温度を低下させるアニーリングセグメントが続く。最後のセグメントは、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長に最適な温度に反応物を加熱する伸長セグメントである。これら３つのセグメントを複数回繰り返し、これによって、逆転写されたＤＮＡと対を形成するＤＮＡの相補鎖の生成、並びにフォワード及びリバースプライマー又はプライマー類の各々からの伸長による逆転写鎖の生成が可能となる。増幅反応の各連続ラウンドでは、より多くの各ＤＮＡ鎖が生成され、次いで、それが次のサイクルの鋳型として使用され、その結果、ＤＮＡ産物が増幅される。増幅ステップの各セグメントにおける好適な温度、及び実施されるべき所望のサイクル数は、当業者ならば容易に決定することができる。
【００６６】
[00108] 一実施形態では、増幅反応は、「ホットスタート」を用いて開始することができる。その場合は、逆転写反応から得られた鋳型ＤＮＡと、フォワード及びリバースプライマーとを混合し、変性ステップの温度で一定時間の間保持し、プライマーと、逆転写されたＤＮＡ鎖との非特異的結合を減少させる。ホットスタートの間、反応に必要な１種の成分（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）を反応物から取り除き、次いで、増幅反応の最初のサイクルの直前に反応物に加えればよい。
【００６７】
[00109] 必要に応じて、増幅したＤＮＡ産物を、増幅サイクルの更なるラウンドの鋳型として用いて、増幅ステップを反復することができる。鋳型は反応混合物から精製してもよく、第２の反応は、増幅されたＤＮＡ産物、適当なプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、バッファー及びデオキシヌクレオチドを用いて実施することができる。増幅の第２のラウンドは第１の増幅反応と同一又は類似の条件下で実施することができる。また、次いで、以下に示す適当な検出方法を用いて、第２の増幅産物を検出することができる。
【００６８】
[00110] 本発明のプライマー又はプライマー類を逆転写反応に用いる場合には、増幅反応に同じリバースプライマー又はプライマー類を、適当なフォワードプライマー又はプライマー類と共に使用することができる。或いは、増幅反応に本発明の異なるリバースプライマー又はプライマー類を使用することもでき、各プライマーは、配列番号３２〜７１、配列番号１１３及び配列番号１１４又は配列番号９４〜配列番号１１１に示される配列のいずれか１種を含む。
【００６９】
[00111] 鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１のＨＡ遺伝子の保存領域に対するフォワードプライマーは表１に示し、Ｈ５Ｎ１サブタイプのＮＡ遺伝子の保存領域に対するフォワードプライマーは表３に示す。当業者には理解されることであるが、個々の増幅反応に用いるフォワード及びリバースプライマーは、サブタイプ及び遺伝子に関して対応している必要がある。従って、配列番号３２〜配列番号５５及び配列番号１１３のいずれか１種を含むリバースプライマーを用いる場合には、配列番号１〜配列番号１８のいずれか１種を含むフォワードプライマーを使用することができる。同様に、配列番号５６〜配列番号７１及び配列番号１１４のいずれか１種を含むリバースプライマーを用いる場合には、配列番号１９〜配列番号３１及び配列番号１１２のいずれか１種を含むフォワードプライマーを使用することができ、配列番号９４〜配列番号１１１のいずれか１種を含むリバースプライマーを用いる場合には、配列番号７２〜配列番号９３のいずれか１種を含むフォワードプライマーを使用することができる。
【００７０】
[00112] 当然のことであるが、増幅反応に用いるフォワード又はリバースプライマーの一方のみが、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む必要があり、このようなプライマーは、上記配列を含まないリバース又はフォワードプライマーと組み合わせて使用することができる。しかし、ＨＡ及びＮＡ遺伝子の配列は、ウイルス分離株間で大きく異なる可能性があるので、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含まないフォワード又はリバースプライマーを使用することは、増幅ステップの感度及び検出範囲に影響を及ぼす可能性がある。
【００７１】
[00113] リバースプライマーと同様に、本発明のフォワードプライマーのファミリーが利用可能な場合には、多数のサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１の分離株又は変異体のいずれかの同定を可能にするために、１種又は複数のそのようなプライマーを使用することができる。例えば、単一の増幅反応に、１種又は複数の、配列番号１〜配列番号６に記載の配列を有するプライマーを使用することができる。
【００７２】
[00114] プライマーがプライマーファミリー内に入らない場合であっても、配列番号３２〜７１、配列番号１１３及び配列番号１１４又は配列番号９４〜配列番号１１１を含むプライマーから、１種又は複数のリバースプライマーを選択することができ、配列番号１〜３１及び配列番号１１２又は配列番号７２〜配列番号９３を含むプライマーから１種又は複数のフォワードプライマーを選択することができる。しかし、これは種々の長さの一連の増幅産物をもたらす。複数のリバース及び／又はフォワードプライマーを注意深く選択すれば、増幅産物は互いに容易に区別することができる。この実施形態では、検出方法の感度が低下する場合があり、これが所与の量の鋳型からの特定の増幅産物の減少をもたらすということに留意しなければならない。逆転写反応におけるように、２種以上の本発明のプライマーを用いる場合には、用いるプライマーの各々は異なる配列を有し、各プライマーの配列は、リバースプライマーについては、配列番号３２〜７１、配列番号１１３及び配列番号１１４又は配列番号９４〜配列番号１１１及び配列番号１１２のいずれか１種を含み、フォワードプライマーについては、配列番号１〜３１又は配列番号７２〜配列番号９３のいずれか１種を含む。
【００７３】
[00115] フォワードプライマーは、用いるリバースプライマーと組み合わせて、検出可能な二本鎖ＤＮＡ増幅産物が生成されるように選択する。すなわち、増幅反応で生成される場合にどんな検出方法が選択されても検出可能なような十分な大きさの二本鎖ＤＮＡ分子を増幅するには、フォワードプライマーは、リバースプライマーに対してＨＡ又はＮＡ遺伝子において十分に上流に位置しなくてはならない。検出可能なＤＮＡ産物の大きさは、選択される具体的な検出方法によって異なる。例えば、増幅産物を検出するのにアガロースゲル電気泳動を用いる場合には、検出方法としてライトサイクリング（ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｉｎｇ）を用いるリアルタイムＰＣＲによる場合よりも最終産物が大きくなくてはならない可能性がある。用いるゲルの濃度に応じて、アガロースゲル電気泳動を用いて２５塩基対程度の小さい断片を検出することができる。しかし、ゲルベースの方法を用いると、例えば、１５０〜５００塩基対の間のより大きな断片がより容易に検出されるのに対して、例えば、１００塩基対未満のより小さな断片は、リアルタイムＰＣＲ法を用いて容易に検出される。
【００７４】
[00116] 増幅されたＤＮＡ産物は、当技術分野で公知の検出方法を用いて検出することができる。例えば、好適な検出方法としては、それだけには限らないが、増幅されたＤＮＡ産物への蛍光、化学発光又は放射性シグナルの組込み、又はポリアクリルアミド若しくはアガロースゲル電気泳動によるもの、又は電子移動部分を含有するプローブと増幅産物とをハイブリダイズさせ、電子検出法によってハイブリダイゼーションを検出することによるものが挙げられる。
【００７５】
[00117] 一実施形態では、増幅されたＤＮＡ産物をアガロースゲル電気泳動によって検出するが、これは当業者には公知であろう。増幅産物の一部を、色素マーカーを含む適当なゲルローディングバッファーと混合し、ゲルに電気的勾配をかけることによってアガロースゲルに流す。アガロースゲルは、エチジウムブロマイド又はＤＮＡと結合するかＤＮＡにインターカレートする別の適当な色素で染色することができ、例えば、紫外線に曝露することによって検出する。
【００７６】
[00118] 検出方法は、増幅反応の後に実施することができる。或いは、増幅反応と同時に検出方法を実施してもよい。一実施形態では、リアルタイムＰＣＲを用いて、例えば、ライトサイクリングによって（例えば、ＲｏｃｈｅのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）を用いて）、増幅されたＤＮＡ産物を検出する。リアルタイムＰＣＲ技術は、当業者には公知であり、２種の、各々特定の蛍光標識で標識され、増幅したＤＮＡ産物と結合するプローブの使用を包含する。プローブは、第１のプローブの蛍光標識が第２のプローブの蛍光標識と近接するような方法で各プローブがＤＮＡ産物と結合するように設計する。増幅反応は、関連蛍光シグナルが放射、検出されるように設計された装置で実施し、装置が第１のプローブ上の蛍光標識を励起するのに適した波長の光を放射し、次いで、これが第２のプローブ上の蛍光標識を励起するのに適した波長の光を放射する、更なる検出セグメントを含む。次いで、第２のプローブの蛍光標識によって放射され、それまでの発光とは波長が異なる光を装置で検出する。
【００７７】
[00119] 或いは、増幅反応に一本鎖鋳型を用いる場合には、二本鎖ＤＮＡと結合する蛍光分子を使用することができる。この方法により、増幅反応を通じて増幅されたＤＮＡ産物の検出及び既知の標準鋳型と比較してかなり正確な相対定量が可能となる。増幅産物の定量化により、元の生体サンプル中のウイルス量の測定が可能となる。その上、この方法によって、従来のＰＣＲ技術を用いる方法よりも少量の増幅産物、及びサイズの小さい増幅産物の検出が可能となる。
【００７８】
[00120] ＡＢＩ Ｓｙｓｔｅｍｓによって設計されたＴａｑｍａｎ（商標）法におけるように、５'末端がフルオロフォアで、３'末端が、フルオロフォアと近接している場合にフルオロフォアの発光をクエンチ（消光）するクエンチング分子で標識されている検出プローブを用いて、増幅及び検出を同時に実施することができる。検出プローブは、増幅鋳型のフォワード又はリバース鎖と結合する。５'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ又はその他（例えば、合成版はＲｏｃｈｅから入手可能）を増幅反応に用いる。検出プローブが結合している鋳型鎖が増幅される際に、５'エキソヌクレアーゼにより検出プローブが消化され、クエンチャーの近くからフルオロフォアが取り除かれ、フルオロフォアが発光可能となる。発光は、標準的な機器（例えば、上述のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標））で定量することができる。
【００７９】
[00121］或いは、Ｈ５Ｎ１変異体を検出するために、第１の増幅を、ＨＡ遺伝子に対するプライマーを用いて、例えば、配列番号３２〜７１、配列番号１１３及び配列番号１１４のいずれか１種を含むリバースプライマー又はプライマー類と、配列番号１〜配列番号３１及び配列番号１１２のいずれか１種を含むフォワードプライマー又はプライマー類と、を用いて実施してもよく、第２の増幅ステップを、ＮＡ遺伝子に対する、配列番号９４〜配列番号１１１のいずれか１種を含むリバースプライマー又はプライマー類と、配列番号７２〜配列番号９３のいずれか１種を含むフォワードプライマー又はプライマー類と、を用いて実施してもよい。Ｈ５Ｎ１の存在を検出するために、２種の増幅を、第１の増幅はＨ５又はＨ５Ｎ１サブタイプのＨＡ遺伝子に対するプライマーを用いて、また、第２の増幅はＮＡ遺伝子に対するプライマーを用いて、同一又は異なる反応で同時に実施することができる。ＮＡ遺伝子は発現量が少ないことが知られているので、ウイルス量が少ない場合は検出がより困難と思われる。
【００８０】
[00122] 本発明によって提供される多数のプライマーは、サブタイプＨ５及びＨ５Ｎ１の種々の変異体を検出する可能性を高めるように設計されており、いずれかの特定の変異体を検出する可能性を高めるために、単一のサンプルを、フォワード及びリバースプライマー又はプライマー類の種々の組合せを用いて試験することができる。
【００８１】
[00123］上述の実施形態はＰＣＲ増幅法との関連で記載したが、本発明の配列を用いて、生体サンプル中の鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出するためのその他の増幅方法に用いるプライマーが設計可能なことは、当業者には理解されることである。例えば、Ｌａｕら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｌｚｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２００３ ３１３、３３６〜３４２頁）に記載のように、例えば、配列番号１〜配列番号１１４に記載の配列を用いて、ＮＡＳＢＡ法による増幅及び検出のためのプライマーを設計することができ、これは当業者に一般に知られている。
【００８２】
[00124] 簡単には、ＮＡＳＢＡ技術では、プライマーを、目的の遺伝子（ここでは、ＨＡ又はＮＡ）の一部と結合し、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）のプロモーターを含むように設計する。ウイルス遺伝子を逆転写し、第２の相補ＤＮＡ鎖を合成して、無傷のＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む二本鎖ＤＮＡ分子を生成させる。関連ＲＮＡポリメラーゼを用いて、目的の遺伝子の増幅された部分に対応するＲＮＡ分子のコピーを作製する。次いで、増幅されたＲＮＡを検出分子（通常、増幅されたＲＮＡの一部に相補的であり、例えば、放射標識、化学発光標識、蛍光標識又は電子化学発光標識で標識されている核酸）と結合させる。次いで、検出分子と結合している増幅されたＲＮＡを、通常、捕獲分子（例えば、検出分子が結合する部分とは異なる増幅されたＲＮＡ産物の一部に相補的な、固定された核酸）によって捕獲する。次いで、検出分子が結合している捕獲されたＲＮＡ増幅産物を、検出分子上の標識及び捕獲方法に応じて決まる関連の検出方法によって検出する。
【００８３】
[00125] 従って、本発明は、生体サンプル中の鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１の存在を検出するためのＮＡＳＢＡ法において、配列番号１〜配列番号１１４のいずれか１種を含むプライマーを使用することを包含する。
【００８４】
[00126] 本発明のプライマーはまた、鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１のＨＡ又はＮＡ遺伝子に相当するＤＮＡ分子、又はＨＡ又はＮＡ遺伝子に相補的な逆転写されたＤＮＡ分子を配列決定するのに有用である。鋳型として、ＨＡ又はＮＡ遺伝子の一部に対応する核酸分子を用いて配列決定反応を開始するためには、それぞれ、配列番号３２〜７１、配列番号１１３及び配列番号１１４のいずれか１種、又は配列番号９４〜配列番号１１１のいずれか１種を含むリバースプライマーを使用することができる。鋳型として、ＨＡ又はＮＡ遺伝子の一部に相補的な核酸分子を用いて配列決定反応を開始するためには、それぞれ、配列番号１〜３１及び配列番号１１２のいずれか１種、又は配列番号７２〜配列番号９３のいずれか１種を含むフォワードプライマーを使用することができる。配列決定反応は、当技術分野で公知の標準法により実施しても、また、自動配列決定機器を用いて実施してもよい。
【００８５】
[00127] 本発明のプライマーはまた、Ｈ５又はＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス分離株に由来するＲＮＡを検出するためのプローブ又は捕獲分子として有用である。例えば、配列番号１〜配列番号１１４のいずれか１種を含む１種又は複数のプライマーを固体支持体上に固定し、これを、プライマー配列の一部又は全てに相補的な配列を有する核酸分子を単離するために使用することができる。
【００８６】
[00128] すなわち、サンプル中のインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出する方法であって、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む、１種又は複数の固定されたプライマーをサンプルと接触させることを含む方法が提供される。
【００８７】
[00129] プライマーは、核酸を固定するための標準的な方法により固相支持体上に固定することができ、そのような方法としては、化学架橋、光架橋、又は、プライマー上の官能基（プライマーに付加されているか組み込まれている官能基を含む。）（例えば、ビオチン）を介した特異的固定化が挙げられる。
【００８８】
[00130] 固相支持体は、検出アッセイに使用可能なものであればいずれの支持体であってもよく、そのような支持体としては、クロマトグラフィービーズ、組織培養プレート若しくはディッシュ、又はスライド等のガラス表面が挙げられる。
【００８９】
[00131］接触は、プライマー又はその一部に相補的な配列を含む、サンプル中のいずれかの核酸がハイブリダイズすることができるような、プライマー及びサンプル間のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で実施する。当業者ならば、サンプルとハイブリダイズさせようとするプライマー又はプライマー領域の配列に基づいて、好適なハイブリダイゼーション条件を決定することができ、また、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを高めるか低下させるように条件を変化させることができる。例えば、温度、塩又はバッファー濃度、及び界面活性剤濃度を変化させることで、所与の配列とその相補体との間のハイブリダイゼーションの条件のストリンジェンシーを変化させることができる。
【００９０】
[00132] このような用途では、プライマー若しくは核酸サンプル又はその双方を、蛍光標識、化学発光標識、有色色素標識、タンパク質、ペプチド、リガンド等の標識で修飾することができる。
【００９１】
[00133] 次いで、固定されたプライマーによって捕獲されている、サンプルに由来するいずれかのハイブリダイズされた核酸を検出する。検出方法は、サンプル及び／又は固定されたプライマー上の標識の性質に応じて異なる。更に、核酸分子を検出及び可視化するための標準法を使用することができ、そのような方法としては、クロマトグラフィー法及びゲル電気泳動・染色法が挙げられる。
【００９２】
[00134] 固定化及び捕獲用途の一例として、当技術分野で公知のように、ＤＮＡ又はヌクレオチドマイクロアレイへのプライマー又はプライマー類の取り込みがある。
【００９３】
[00135] 従って、サンプル中のインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出する方法であって、マイクロアレイの少なくとも１スポットに、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む、１種又は複数のプライマーを含有するマイクロアレイをサンプルと接触させること、及び、サンプルとプライマーとのハイブリダイゼーションを検出することを含む方法も提供される。核酸マイクロアレイ技術は、当技術分野で公知であり、マイクロアレイの製造、及びマイクロアレイ中の１又は複数のスポットにおけるサンプルの捕獲分子とのハイブリダイゼーションの検出が包含される。
【００９４】
[00136] 用いるサンプルは、例えば、インフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を含有する疑いのある生体サンプル、又はインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を含有する疑いのある生体サンプルから作製したか増幅した核酸を含んでいる生体サンプルである。核酸は、本明細書に記載のＲＴ−ＰＣＲ増幅、本明細書に記載のＮＡＳＢＡ法、プライマー伸長法等、上述の公知の増幅方法を用いて増幅することができる。サンプルは、公知のハイブリダイゼーション法を用いて、マイクロアレイに取り込まれたプライマー又はプライマー類とハイブリダイズすることができる。
【００９５】
[00137] ハイブリダイゼーションを検出するためには、通常、プローブとして機能するプライマーを標識するか、又はサンプルを標識する。例えば、サンプルは、増幅ステップの際に標識を組み込むことによって標識することができる。標識は、放射性標識、化学発光標識、蛍光標識等の検出可能な標識であれば、いずれでもよい。例えば、当技術分野で公知のように、容易に、Ｃｙ３又はＣｙ５標識ヌクレオチドを、増幅される核酸分子に組み込んで、標識サンプルを作製することができる。ハイブリダイゼーションは、通常、この方法を用いて、マイクロアレイ中の特定のスポットにおけるシグナル増大によって検出する。
【００９６】
[00138] 或いは、マイクロアレイに含まれる本明細書に記載のプライマーを標識してもよい。例えば、ＵＳ６，８１１，９７３（Ｒｅｉｃｈに付与されている。）（これは、参照されることにより本明細書に完全に組み込まれる。）には、マイクロアレイにおいて捕獲分子として用いられる核酸プローブ分子に蛍光マーカーを含め、それによって捕獲核酸分子とその標的核酸分子とのハイブリダイゼーションが、捕獲分子に組み込まれた蛍光標識によって発光される蛍光シグナルのクエンチングをもたらすことが記載されている。従って、ハイブリダイゼーションは、マイクロアレイ中の特定のスポットからのシグナルの低下によって測定される。
【００９７】
[00139] 本発明はまた、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む、１種又は複数のプライマーを、マイクロアレイ中の１又は複数のスポットに取り込んでいるマイクロアレイを包含する。マイクロアレイ（例えば、核酸マイクロアレイ）を製造する方法は公知である。例えば、ＵＳ６，７５３，１４４（Ｈｉｒｏｔａ）及びＵＳ６，５１１，８４９（Ｗａｎｇ）（いずれも、参照されることにより本明細書にそのまま組み込まれる。）には、マイクロアレイを作製する方法が記載されている。通常、マイクロアレイは、１種又は複数のプライマーをマイクロアレイ中の所定のアドレス又はスポットに固定することによって固体支持体上に形成する。
【００９８】
[00140] 増幅と同様に、プライマーのファミリーの１又は複数のメンバーを単一スポットに含めることができ、これによって、マイクロアレイ中の単一のスポットを用いて、いくつかの異なる変異体又は分離株を検出することが可能となる。
【００９９】
[00141］上述の方法は、インフルエンザＡウイルスＨ５又はＨ５Ｎ１分離株を検出するｉｎ ｖｉｔｒｏ法に関するものであるが、本明細書に記載のプライマーはまた、インフルエンザＡウイルスＨ５又はＨ５Ｎ１サブタイプ感染を検出又はイメージングするためのｉｎ ｖｉｖｏ法にも使用することができる。
【０１００】
[00142] また、サンプル中のインフルエンザＡ Ｈ５又はＨ５Ｎ１サブタイプを検出するための、上述のプライマーと使用説明書とを含むキット又は市販のパッケージも、本発明に包含される。検出は、本明細書に記載の方法のいずれによるものであってもよい。
【０１０１】
[00143] 本明細書に記載の全ての文献は、参照されることによりそのまま組み込まれる。
【０１０２】
[00144] 本発明の種々の実施形態が本明細書に開示されているが、当業者によく知られている一般的な知識に従って、本発明の範囲内で多数の修飾及び改変を行うことができる。そのような改変としては、実質的に同様の方法で同様の結果を達成するために、公知の等価物を本発明のいずれかの態様と置き換えることが挙げられる。本明細書に用いた全ての技術用語及び科学用語は、特に断りのない限り、本発明の技術分野の当業者に一般に理解されているものと同一の意味を有する。
【実施例】
【０１０３】
[00145] 卵から抽出したＲＮＡ、並びに、尿膜腔液、総排泄腔スワブ及び気管スワブ、ホモジナイズした組織、プールした臓器、血液、痰、糞便、尿及び鼻咽頭吸引物を含むヒト臨床サンプルから抽出したＲＮＡを用いて実験を行った。
【０１０４】
[00146]実施例１：ゲルベースの検出プラットフォームを用いる鳥インフルエンザウイルスＨ５及びＨ５Ｎ１の検出
【０１０５】
[00147] 以下は、鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出するための一般的なプロトコールである。
【０１０６】
[00148] 一般的には、ＴＲＩｚｏｌ（商標）又はＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）のいずれかを用いて、製造業者の使用説明書に従ってＲＮＡをサンプルから抽出する。
【０１０７】
[00149] 第１鎖ｃＤＮＡ合成は、抽出したＲＮＡ上で、２０μＬの反応容量中、関連のリバースプライマー（類）（１０μＭ保存液２μＬ）を用いて実施する。第１ラウンドＰＣＲ反応は、鋳型であるｃＤＮＡ産物と、関連のフォワード及びリバープライマー（類）（フォワード及びリバース各々の総容量は１．２５μＬ）とを含有するｃＤＮＡ反応物２．５μＬを、２５μＬの反応容量中で用いて実施する。ＰＣＲ条件は以下の通りに設定する。９４℃で２分間インキュベーション；９４℃で１０秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分間の３５サイクル；続いて、７２℃で７分間のインキュベーション。第２ラウンドのＰＣＲは、鋳型として第１ラウンドＰＣＲの産物（２．５μＬ）を用いて実施する。全ての他の条件及び試薬は、第１ラウンドＰＣＲと同様である。
【０１０８】
[00150] 第２ラウンドＰＣＲの産物を、１．５〜２％アガロースゲルでエチジウムブロマイドを用いて染色することによって分析する。
【０１０９】
[00151］しかし、１ラウンドのＰＣＲで十分検出可能という知見が、繰り返しの検証を経て確立されている。
【０１１０】
[00152] タイ由来のＨ５Ｎ１ウイルス分離株（２００４）から抽出したＲＮＡを用いて、上述のＲＴ−ＰＣＲプロトコールを実施した。以下のＨＡ遺伝子に対する８種のプライマーセットを用いた。（１）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ１Ｆ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ４Ｒ、（２）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ２ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ４Ｒ、（３）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ１Ｆ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ５ｂＲ、（４）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ２ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ５ｂＲ、（５）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ３Ｆ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ８ａＲ、（６）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ６ｂＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ８ａＲ、（７）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ６ｂＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ１０Ｒ、（８）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ７ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ１１ｃＲ。予想される断片の大きさはそれぞれ、１８９ｂｐ、１４８ｂｐ、３０６ｂｐ、２６５ｂｐ、５７４ｂｐ、４５６ｂｐ、４８９ｂｐ及び１６３ｂｐであった。図２に示されるように、増幅産物は、１．５％アガロースゲルに流し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。
【０１１１】
[00153] このアッセイの感度を調べるために、１０倍に段階希釈された鋳型と、プライマーセット３（図３）、５（図４）、６及び８（図５）と、を用いる反応を実施した。結果（図３〜５。レーン１〜７はそれぞれ、５０ｎｇ、０．５ｎｇ、５０ｐｇ、０．５ｐｇ、０．０５ｐｇ、５ｆｇ及び０．５ｆｇの鋳型を用いて実施した反応である。）は、本発明のプライマーを用いるＰＣＲ反応は高感度であるが、用いるプライマーに応じて感度が変化することを示している。プライマーセット３及び６はより高感度であり、プライマーセット６からは、５ｆｇ程度の低い鋳型濃度でも相当な量の増幅産物が生じた（図５、レーン６参照）。
【０１１２】
[00154]実施例２：リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出プラットフォームを用いる鳥インフルエンザウイルスＨ５及びＨ５ＮＩの検出
【０１１３】
[00155] ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）装置を用いて、以下の反応を実施する。
【０１１４】
[00156] 反応基本混合物（マスターミックス）は、以下の試薬を順に氷上で混合し、２０μＬの容量になるように調製した。水（必要に応じて調節される容量）、５０ｍＭ酢酸マンガン（１．３μＬ）、０．２〜１μＭという最終濃度のフォワードプライマーと、リバースプライマー及び蛍光標識プローブ（２．６μＬ）と、を含有するプローブＮプライマーミックス（ＰｒｏｂｅＮＰｒｉｍｅｒ ｍｉｘ）、バッファーとヌクレオチドと酵素とを含むＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＲＮＡマスターハイブリダイゼーションプローブ（ＲＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｈｙｂｌｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ)（７．５μＬ）。
【０１１５】
[00157] 反応物を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）において用いるのに適したガラスキャピラリーチューブに移す。５μＬの抽出したＲＮＡ鋳型を各反応物に加え、短時間遠心分離する。ＲＴ−ＰＣＲ反応を、以下のプログラムに従って実施する（表５〜８）。
【０１１６】
【表５】
【０１１７】
【表６】
【０１１８】
【表７】
【０１１９】
【表８】
【０１２０】
[00158]実施例３：種々のプライマーセットを用いるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎｌの検出
【０１２１】
[00159] リアルタイムＰＣＲ反応は、実施例２に記載の８種のプライマーセットを用いて実施した。反応は、標準プロトコールに従って、ＳＹＢＲグリーン蛍光検出キットを用いて、また市販の試薬キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて実施した。図６は、８種のプライマーセットの各々を用いて実施した反応によって得られた増幅産物を示す。８種のプライマーセットは、１．５％アガロースゲルにおいてエチジウムブロマイドで染色して可視化されている。
【０１２２】
[00160] プライマーの感度を確認するために、リアルタイムＰＣＲプロトコールに従って増幅曲線を作製し、増幅産物の生成をモニターした。プライマーセット１〜８の各々に関する結果を、それぞれ図７〜１４に示す。増幅反応終了時に、増幅産物の融解曲線を求めた。一般に、特異的増幅産物は、非特異的産物よりも高い融解温度を有し、融解曲線プロフィールを用いて反応の特異性を確認することができる。図１５〜１８に示される融解曲線は、別個の予想される増幅産物を示す。このように、セット１〜８のプライマーは、リアルタイムＰＣＲ反応に用いる場合には、より感度が高く、Ｈ５Ｎ１分離株に特異的である。
【０１２３】
[00161]実施例４：一ステップＲＴ−ＰＣＲ反応を用いる、フィールドサンプルからのＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスの検出
【０１２４】
[00162] Ｔ７ ＲｉｂｏＭａｘ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写系（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）によって作製した、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡを用いるゲルベースのアッセイにおいて、プライマーセット６（実施例１に記載）を用いて、プライマーの性能を評価した。精製した転写されたＲＮＡの濃度は、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ定量試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて測定し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡの段階希釈物は２つずつ調製した。
【０１２５】
[00163] Ｈ５Ｎ１特異的プライマー（セット６）を含む一ステップ逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲシステム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、以下のＰＣＲサイクルに従って、反応混合物２５μＬ中でＲＮＡ２μＬを用いた。９４℃で１０秒、続いて、９４℃で１０秒、５０℃で３０秒、及び７２℃で１分の３５サイクル；続いて最後に、７２℃で７分間。このＰＣＲ産物の大きさは４５６ｂｐであり、１％アガロースゲルで分離した。ＰＣＲ産物を直接配列決定して、産物の同一性を確認した。アッセイの感度は１０００コピー未満であることがわかり、Ｈ５Ｎ１ ＲＮＡを特異的に検出できた（図１９Ａ）。
【０１２６】
[00164] 二ステップＲＴ−ＰＣＲ法（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）も上述のように行い、一ステップＲＴ−ＰＣＲ法と比較した。結果から、両方の系がうまく働いたことが示された（図２０Ａ（二ステップ）及び図２０Ｂ（一ステップ）を比較のこと）。次いで、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ライトサイクラー）リアルタイム系（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてプライマーを試験したところ、同程度の結果が得られ（図２０Ｃ）、このことは、検出の点で２種のアッセイの感度が同等であることを示す。
【０１２７】
[00165] 図２０Ｃに関しては、ＲＮＡ標品の増幅（ａ〜ｅで示す。）が示されている。ｘ軸は定量的ＰＣＲアッセイのサイクル数を表し、ｙ軸はバックグラウンドレベルを上回る蛍光強度（Ｆ２）を表す。鋳型を含まない対照（ＮＴＣ）が示されている。ＲＮＡ標品は以下の通りとした。（ａ）反応当たり１×１０９コピー、（ｂ）反応当たり１×１０８コピー、（ｃ）反応当たり１×１０７コピー、（ｄ）反応当たり１×１０６コピー及び（ｅ）反応当たり１×１０５コピー。挿入グラフは、ＰＣＲ産物の融解曲線分析を示す。ＲＮＡ標品（ａ〜ｅ）と鋳型を含まない対照からのシグナルが示されている。ｘ軸は温度（℃）を表し、ｙ軸はバックグラウンドレベルを上回る蛍光強度を表す。
【０１２８】
[00166] Ｈ５Ｎ１サブタイプ検出のためのアッセイの特異性を立証するために、本発明者らは、次いで、対照として、インフルエンザＡウイルスの異なるサブタイプのいくつかの参照株（Ｈ３Ｎ８、Ｈ５Ｎ３、Ｈ７Ｎ３及びＨ９Ｎ２）と、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）とを用いて、フィールドサンプルでプライマーを調べた。結果から、検出はＨ５Ｎ１のみに特異的であることが示された（図１９Ｂ）。サンプルは、製造業者の使用説明書に従って、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）とＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）とを用いて抽出した。
【０１２９】
[00167] 図１９Ａは、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ定量化試薬によって測定し段階希釈したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写された一本鎖ＲＮＡ（レーン２〜８）、及び、感染卵の尿膜腔液から抽出したＨ５Ｎ１ ＲＮＡの増幅結果を表す。鋳型を含まない対照（滅菌水）は「ＮＴＣ」と示されている。ウイルス量は反応当たりのコピー数によって示されている。（レーン２）反応当たり１×１０９コピー、（レーン３）反応当たり１×１０８コピー、（レーン４）反応当たり１×１０７コピー、（レーン５）反応当たり１×１０６コピー、（レーン６）反応当たり１×１０５コピー、（レーン７）反応当たり１×１０４コピー及び（レーン８）反応当たり１×１０３コピー。Ｈ５Ｎ１ ＲＮＡは、反応当たり約１×１０６コピーであると推定される
【０１３０】
[00168] 図１９Ｂは、異なるサブタイプの鳥インフルエンザＡウイルスの参照株（レーン１２〜１５）、及びニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ、レーン１６）を用いた、Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスの特異的検出を表す。Ｈ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ８、Ｈ９Ｎ２及びＮＤＶ分離株は、獣医学研究所、マレーシア（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｍａｌａｙｓｉａ）によってフィールドサンプルから単離され、Ｈ５Ｎ３及びＨ７Ｎ５分離株は鳥取大学家畜病理学教室（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｏｔｔｏｒｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊａｐａｎ）から提供された。非Ｈ５Ｎ１分離株及び鋳型を含まない対照（水）からの陰性シグナルが示されている。
【０１３１】
[00169] ２００４年から２００５年の大流行の際にベトナム及びマレーシアから単離されたニワトリ、アヒル及びタイワンアヒル由来の既知の事例及び疑わしい事例からなる全部で１４５種のフィールドサンプルを、Ｈ５Ｎ１ ＲＮＡについて試験した（表９）。プールされた臓器組織、尿膜腔液、総排泄腔スワブ及び気管スワブのサンプルから、尿膜腔液、及びプールされた臓器については１００％陽性の陽性結果が得られ（表９）、このＲＴ−ＰＣＲアッセイの感度が実証された。全ての陽性サンプルについて、確認試験としてウイルス培養単離法を用いた（表９）。ホモジナイズした組織の検出率が４０％と最低であったのに対し、総排泄腔スワブ及び気管スワブからは６６．７％の陽性Ｈ５Ｎ１サンプルが検出された。検出におけるこの差異は、種々のサンプルからのウイルスＲＮＡ回収における異なる効率によるものであると思われる。Ｈ５Ｎ１ ＲＮＡ回収及び検出については、サンプルの中で尿膜腔液画分の効率が最高であった（表９）。
【０１３２】
【表９】
【０１３３】
[00170] プライマーの有用性を更に確認する目的で、次いで、ベトナム由来の５種の陽性サンプルを、既存の社内Ｈ５プライマーセットと並行して試験したところ、結果から、本明細書に記載のＨ５Ｎ１プライマー（プライマーセット６）は、５種の陽性Ｈ５Ｎ１サンプルのうち５種を検出したのに対し、その他のプライマーセットは、５種のうち３種を検出したのみであった（図２１Ｃ）ことが示された。このことは、本明細書に記載のＨ５Ｎ１プライマーはより高感度であり、ウイルス量の少ない弱い陽性サンプルも検出できることを示す。
【０１３４】
[00171］図２１Ａは、ニワトリ、アヒル及びタイワンアヒルの尿膜腔液からのＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスの検出を示す（レーン１〜１１）。図２１Ｂは、ホモジナイズした組織からのＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスの検出を示す（レーン１〜４）。３種のサンプルのうち２種しか検出されなかったが（レーン３及び４）、これは非効率的なＲＮＡ抽出によるものであろう。Ｈ５Ｎ１陽性対照が示されている（レーン５）。図２１Ｃは、社内Ｈ５プライマーセットと新規Ｈ５Ｎ１プライマーとの比較を示す。社内Ｈ５プライマーセットは、ウイルス培養単離によって確認されている５種の陽性サンプルのうち３種を検出したのに対し（レーン１〜５）、Ｈ５Ｎ１プライマーセットは５種のサンプル全てを検出した（レーン７〜１１）。両プライマーセットに関しては同一バッチの抽出ＲＮＡを用いた。
【０１３５】
[00172]実施例５：リアルタイムＰＣＲ及び一ステップＲＴ−ＰＣＲ反応を用いるＨ５Ｎ１及びＨ５インフルエンザＡウイルスの検出
【０１３６】
[00173] リアルタイムＰＣＲプロトコール及び一ステップ若しくは二ステップＲＴ−ＰＣＲプロトコールの双方を用いて、ＲＴ−ＰＣＲ実験を上述のように実施した。実験にはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡを用いた。
【０１３７】
[00174] Ｈ５Ｎ１を検出する実験では、以下のＨ５Ｎ１サブタイプのＮＡ遺伝子に対するプライマーセットを用いた。（９）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ１ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ３ａＲ、（１０）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ１ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ６ｇＲ、（１１）ｇｉｓＡＦＨ５ＮｌＮｌａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ７ｂＲ、（１２）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ２ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ３ａＲ、（１３）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ２ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ６ｇＲ、（１４）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ２ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ７ｂＲ、（１５）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ４ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ６ｇＲ、（１６）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ４ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ７ｂＲ、（１７）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ５ｇＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ７ｂＲ、（１８）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ８ｂＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ９ａＲ、（１９）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ８ｂＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ１１ｂＲ、（２０）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ１０ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ１１ｂＲ。予測される断片の大きさはそれぞれ、１２０ｂｐ、３１５ｂｐ、４５２ｐ、１１１ｂｐ、３０６ｂｐ、４４３ｂｐ、２１７ｂｐ、３５４ｂｐ、１５８ｂｐ、１１９ｂｐ、２７１ｂｐ及び１７２ｂｐであった。増幅産物は１．０％又は１．５％アガロースゲルに流し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。全ての反応について、それぞれ、ＱＳ１＝１０００ｎｇ／μＬ、ＱＳ２＝１００ｎｇ／μＬ、ＱＳ３＝１０ｎｇ／μＬ、ＱＳ４＝１ｎｇ／μＬ、ＱＳ５＝０．１ｎｇ／μＬ、ＱＳ６＝０．００１ｎｇ／μＬ、及び、ＮＴＣ＝鋳型を含まない対照。
【０１３８】
[00175] 図２２〜３３はそれぞれ、プライマーセット９〜２０を用いるリアルタイムＰＣＲ実験の結果を示す。図２２〜３３の各々について、図Ａ（図２２Ａ〜３３Ａ）は、種々の濃度のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡ鋳型の増幅曲線及びＲＮＡ標準曲線を示し、図Ｂ（図２２Ｂ〜３３Ｂ）は融解曲線を示し、図Ｃ（図２２Ｃ〜３３Ｃ）はＰＣＲ産物のアガロースゲル可視化を示す。
【０１３９】
[00176] 同様のリアルタイムＰＣＲ実験を、以下のＨ５Ｎ１サブタイプのＨＡ遺伝子に対するプライマーセットを用いて実施した。（２１）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ９Ｆ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ１１ｃＲ、（２２）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ１３Ｆ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ１６ｃＲ、並びにＨ５サブタイプ（Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２及びＨ５Ｎ３）のＨＡ遺伝子、（２３）ｇｉｓＡＦＨ５Ｈ１ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｈ２ａＲ。セット２１及び２２を用いて得られた結果を、それぞれ図３４Ａ〜３４Ｄ及び図３５Ａ〜３５Ｄに示し、セット２３を用いて得られた結果を図３６Ａ〜３６Ｄに示す。図中、ａ及びｂはそれぞれ、Ｈ５Ｎ２及びＨ５Ｎ３ ＲＮＡ分離株の結果である。これらの図において、図Ａ（図３４Ａ、３５Ａ、３６Ａ）は種々の濃度の鋳型の増殖曲線を示す。用いた鋳型は、Ｈ５Ｎ１及びＨ５サブタイプのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡ、並びにＨ５Ｎ２及びＨ５Ｎ３のフィールドサンプルから抽出したＲＮＡであった。図Ｂ（図３４Ｂ、３５Ｂ、３６Ｂ）はＲＮＡ標準曲線を示し、図Ｃ（図３４Ｃ、３５Ｃ、３６Ｃ）は融解曲線を示し、図Ｄ（図３４Ｄ、３５Ｄ、３６Ｄ）はＰＣＲ産物のアガロースゲル可視化を示す。標準曲線は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡ標品の定量化された量であるＱＳ１〜ＱＳ５に基づいて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒソフトウェアを用いて作製した。
【０１４０】
[00177] 次いで、上述のように、選択したＨ５Ｎ１ ＮＡプライマーセット（一ステップ法にはセット１０、１１、１３及び１６を、二ステップ法にはセット１２及び１５を用いる。）を用いて一ステップ又は二ステップＲＴ−ＰＣＲ反応を実施し（それぞれ図３７〜４２）、また、Ｈ５ ＨＡプライマーセット２３を用いて一ステップ又は二ステップＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した（それぞれ、図４３Ａ及び４３Ｂ）。図３７〜４２、４３Ａ及び４３Ｂに示されるように、結果は、エチジウムブロマイドで染色した１．５％アガロースゲルを用いて可視化した。
【０１４１】
[00178]実施例６：Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブ系を用いるリアルタイムＰＣＲ法
【０１４２】
[00179] 基本混合物（マスターミックス）は、氷上で１．５ｍｌ反応試験管中に、以下を順に加えることによって調製した。１．３μＬの５０ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２、８μＬの１μＬプローブ、１μＬのＦプライマー、１μＬのＲプライマー及び７．５μＬのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＲＮＡ マスターハイブリダイゼーションプローブ。この基本混合物を穏やかに混合し、１８μＬを予冷したガラスキャピラリーに移した。２μＬのＲＮＡ鋳型を加え、キャピラリーを７００×ｇで５秒間遠心分離した。このキャピラリーをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）装置のローターに入れ、表５〜８に示されるプログラムに従って、プログラム７については４５サイクルを回した。
【０１４３】
[00180] Ｔａｑｍａｎ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）検出系を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施した。サブタイプＨ５のＨＡ遺伝子を検出するために、以下の増幅プライマー対を用いた。（２４）ｇｉｓＡＦＨ５Ｈ１ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５ＨＴｑＲ、加えてＴａｑｍａｎ（商標）プローブｇｉｓＡＦＨ５ＨＴＭＰ。Ｈ５Ｎ１サブタイプのＨＡ遺伝子を検出するために、以下の増幅プライマー対を用いた。（２５）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１ＨＴｑＦ１及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ１１ｃＲ、（２６）ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ９Ｆ及びｇｉｓＡＦＨ５ＮｌＨＴｑＲｌ。これらはそれぞれ、Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１ＨＴＭＰ２及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１ＨＴＭＰ１と共に用いた。Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブは、５’末端でリポーターフルオロフォア６−カルボキシフルオレセインアミダイト（６−Ｆａｍ）を用いて、また、３’末端でクエンチャーテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）を用いて標識した。Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブの配列は表１０に示されている。増幅曲線結果は、Ｈ５プライマーセット２４については図４４に、Ｈ５Ｎ１プライマーセット２５及び２６については図４５及び４６に示す。
【０１４４】
【表１０】
【０１４５】
[00181］実施例７：プライマーを用いるＤＮＡマイクロアレイ
【０１４６】
[00182] 本発明の特定のプライマーをＤＮＡマイクロアレイ（Ａｔｔｏｇｅｎｉｘ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）に用いて、Ｈ５及びＨ５Ｎ１分離株由来のＲＮＡを検出した。簡単には、種々のＨＡ及びＮＡプライマー、具体的にはＨ５（ｇｉｓＡＦＨ５ＨｌａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｈ２ａＲ）、Ｈ５Ｎ１（ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ２ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｈ４Ｒ）、並びにＮＡ Ｈ５Ｎ１（ｇｉｓＡＦＨ５Ｎ１Ｎ２ａＦ及びｇｉｓＡＦＨ５ＮｌＮ３ａＲ）を固体表面上に固定した（ＲＴ−ＰＣＲの陽性対照としてＧＡＰＤＨを用いた）。次いで、マイクロアレイを、サンプルＮＡ若しくはＨＡ転写物ＲＮＡ又はその双方でプローブし、マイクロアレイの各スポットにおけるプローブのプライマーとの結合を、二本鎖核酸を検出するためのＳＹＢＲグリーン蛍光プローブを用いて検出した。結果を表１１に示す。これから明らかなように、ＮＡ転写物はＨＡ転写物よりも低濃度で検出可能であり、このことは、用いたＮＡプライマーが、用いた特定のＨＡプライマーよりも高感度であることを示す。
【０１４７】
【表１１】
【０１４８】
[00183] 当業者には理解されることであるが、本明細書に記載の典型的実施形態に対しては多数の改変が可能である。本発明は、そのような改変の全てを、請求の範囲によって定義されるその範囲内に包含するものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】ＨＡ遺伝子を示し、本発明の典型的なフォワード及びリバースプライマー（「ｇｉｓＡＦ」で始まる）の位置、並びに当技術分野で公知のプライマー（「ＴＷ」、「ＶＭ」又は「ＨＫ」で始まる）の位置を示す模式図である。
【図２】Ｈ５Ｎ１分離株のＲＮＡから逆転写された鋳型ＤＮＡを増幅するために、本発明の典型的なプライマー（セット１〜８）を用いて、ゲルベースのＰＣＲアプローチによって調製されたＰＣＲ増幅産物を示すアガロースゲルの写真である。
【図３】種々の量の鋳型及び図２で用いたプライマーセット３を用いて得た増幅産物の相対量を示すアガロースゲルの写真である。
【図４】種々の量の鋳型及び図２で用いたプライマーセット５を用いて得た増幅産物の相対量を示すアガロースゲルの写真である。
【図５】種々の量の鋳型及び図２で用いたプライマーセット８（上側のバンド）及び６（下側のバンド）を用いて得た増幅産物の相対量を示すアガロースゲルの写真である。
【図６】Ｈ５Ｎ１分離株のＲＮＡから逆転写された鋳型ＤＮＡを増幅するために、本発明の典型的なプライマー（セット１〜８）を用いて、ＳＹＢＲ緑色色素を用いるリアルタイムＰＣＲアプローチによって調製したＰＣＲ増幅産物を示すアガロースゲルの写真である。
【図７】図６のプライマーセット１を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図８】図６のプライマーセット２を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図９】図６のプライマーセット３を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図１０】図６のプライマーセット４を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図１１】図６のプライマーセット５を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図１２】図６のプライマーセット６を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図１３】図６のプライマーセット７を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図１４】図６のプライマーセット８を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図１５】図６のプライマーセット１及び２を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図１６】図６のプライマーセット３、４及び５を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図１７】図６のプライマーセット５及び６を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図１８】図６のプライマーセット７及び８を用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図１９Ａ】ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写された一本鎖ＲＮＡを段階希釈したものを用いた一ステップＲＴ−ＰＣＲによるＨ５Ｎ１鳥インフルエンザＡウイルスの検出を示すアガロースゲルの写真である。
【図１９Ｂ】一ステップＲＴ−ＰＣＲによる、フィールドサンプルからのＨ５Ｎ１鳥インフルエンザＡウイルスの特異的検出を示すアガロースゲルの写真である。
【図２０Ａ】二ステップＲＴ−ＰＣＲ反応を用いて得たＰＣＲ産物のアガロースゲルの写真である。
【図２０Ｂ】一ステップＲＴ−ＰＣＲ反応を用いて得たＰＣＲ産物のアガロースゲルの写真である。
【図２０Ｃ】プライマーセット６を用いたリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。
【図２１Ａ】本発明の典型的なプライマーを用いて、尿膜腔液のサンプルにおけるＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスを検出した結果を示すアガロースゲルの写真である。
【図２１Ｂ】本発明の典型的なプライマーを用いて、ホモジナイズした組織のサンプルにおけるＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスを検出した結果を示すアガロースゲルの写真である。
【図２１Ｃ】社内Ｈ５プライマーを用いた場合とＨ５Ｎ１プライマーセットを用いた場合の、フィールドサンプルにおけるＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスを検出した結果を比較するアガロースゲルの写真である。
【図２２Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット９）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図２２Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット９）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図２２Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット９）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図２３Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１０）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図２３Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１０）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図２３Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１０）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図２４Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１１）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図２４Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１１）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図２４Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１１）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図２５Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１２）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図２５Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１２）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図２５Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１２）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図２６Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１３）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図２６Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１３）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図２６Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１３）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図２７Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１４）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図２７Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１４）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図２７Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１４）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図２８Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１５）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図２８Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１５）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図２８Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１５）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図２９Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１６）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図２９Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１６）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図２９Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１６）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図３０Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１７）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図３０Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１７）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図３０Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１７）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図３１Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１８）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図３１Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１８）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図３１Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１８）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図３２Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１９）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図３２Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１９）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図３２Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット１９）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図３３Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２０）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図３３Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２０）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図３３Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＮＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２０）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図３４Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２１）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図３４Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２１）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応におけるＲＮＡ標準曲線である。
【図３４Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２１）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図３４Ｄ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２１）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図３５Ａ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２２）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図３５Ｂ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２２）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応におけるＲＮＡ標準曲線である。
【図３５Ｃ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２２）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図３５Ｄ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡのＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２２）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図３６Ａ】Ｈ５インフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１（ＱＳ１〜ＱＳ５）、Ｈ５Ｎ２（ａ）及びＨ５Ｎ３（ｂ））のＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２３）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の際に得られた増幅曲線である。
【図３６Ｂ】Ｈ５インフルエンザＡのＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２３）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応におけるＲＮＡ標準曲線である。
【図３６Ｃ】Ｈ５インフルエンザＡのＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２３）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅反応の終了時に得られた融解曲線である。
【図３６Ｄ】Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１（ＱＳ１〜ＱＳ５）、Ｈ５Ｎ２及びＨ５Ｎ３）のＨＡ遺伝子に対する典型的なプライマー（セット２３）及びＳＹＢＲグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲ増幅の増幅産物を示す１．５%アガロースゲルの写真である。
【図３７】種々の量の鋳型及びプライマーセット１０を用いて、一ステップＲＴ−ＰＣＲ法によって得られた増幅産物の相対量を示すアガロースゲルの写真である。
【図３８】種々の量の鋳型及びプライマーセット１１を用いて、一ステップＲＴ−ＰＣＲ法によって得られた増幅産物の相対量を示すアガロースゲルの写真である。
【図３９】種々の量の鋳型及びプライマーセット１３を用いて、一ステップＲＴ−ＰＣＲ法によって得られた増幅産物の相対量を示すアガロースゲルの写真である。
【図４０】種々の量の鋳型及びプライマーセット１６を用いて、一ステップＲＴ−ＰＣＲ法によって得られた増幅産物の相対量を示すアガロースゲルの写真である。
【図４１】種々の量の鋳型及びプライマーセット１２を用いて、二ステップＲＴ−ＰＣＲ法によって得られた増幅産物の相対量を示すアガロースゲルの写真である。
【図４２】種々の量の鋳型及びプライマーセット１５を用いて、二ステップＲＴ−ＰＣＲ法によって得られた増幅産物の相対量を示すアガロースゲルの写真である。
【図４３Ａ】種々の量の鋳型及びプライマーセット２３を用いて、一ステップＲＴ−ＰＣＲ法によって得られた増幅産物の相対量を示すアガロースゲルの写真である。
【図４３Ｂ】種々の量の鋳型及びプライマーセット２３を用いて、二ステップＲＴ−ＰＣＲ法によって得られた増幅産物の相対量を示すアガロースゲルの写真である。
【図４４】Ｔａｑｍａｎ（商標）リアルタイムＰＣＲ法及びサブタイプＨ５のＨＡ遺伝子に対するプライマーセット２４を用いて得られた増幅曲線である。
【図４５】Ｔａｑｍａｎ（商標）リアルタイムＰＣＲ法及びサブタイプＨ５Ｎ１のＨＡ遺伝子に対するプライマーセット２５を用いて得られた増幅曲線である。
【図４６】Ｔａｑｍａｎ（商標）リアルタイムＰＣＲ法及びサブタイプＨ５Ｎ１のＨＡ遺伝子に対するプライマーセット２６を用いて得られた増幅曲線である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含むプライマー。
【請求項２】
本質的に配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種からなる、請求項１に記載のプライマー。
【請求項３】
配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種である、請求項１に記載のプライマー。
【請求項４】
標的アニーリング配列と非インフルエンザＡウイルス配列とを含むプライマーであって、標的アニーリング配列が、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含むプライマー。
【請求項５】
標的アニーリング配列が、本質的に配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種からなる、請求項４に記載のプライマー。
【請求項６】
標的アニーリング配列が、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種である、請求項４に記載のプライマー。
【請求項７】
標識を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプライマー。
【請求項８】
標識が、蛍光標識、化学発光標識、有色色素標識、放射性標識、放射不透過性標識、タンパク質（酵素を含む）、ペプチド又はリガンドである、請求項７に記載のプライマー。
【請求項９】
サンプル中のインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出する方法であって、
サンプルから得たＲＮＡから逆転写されたＤＮＡを、各々が配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のプライマーを用いて増幅するステップと、
増幅産物を検出するステップと、を含み、
増幅産物の存在が、サンプル中の鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１の存在を示す方法。
【請求項１０】
各プライマーが、本質的に配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種からなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
各プライマーが、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種である、請求項９に記載のプライマー。
【請求項１２】
増幅ステップにおいてプライマーセットを使用し、当該プライマーセットが、
（ａ）各々が配列番号３２〜配列番号５５及び配列番号１１３の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のリバースプライマー、及び、各々が配列番号１〜配列番号１８の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のフォワードプライマー、又は、
（ｂ）各々が配列番号５６〜配列番号７１及び配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のリバースプライマー、及び、各々が配列番号１９〜配列番号３１及び配列番号１１２の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のフォワードプライマー、又は、
（ｃ）各々が配列番号９４〜配列番号１１１の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のリバースプライマー、及び、各々が配列番号７２〜配列番号９３の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のフォワードプライマー、を含み、
前記プライマーセットが（ａ）を含む場合には、増幅産物の存在が、サンプル中の鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５の存在を示し、
前記プライマーセットが（ｂ）又は（ｃ）を含む場合には、増幅産物の存在が、サンプル中の鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５Ｎ１の存在を示す、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
生体サンプルから得たＲＮＡを、各々が配列番号３２〜配列番号７１、配列番号９４〜配列番号１１１、配列番号１１３及び配列番号１１４の配列のいずれかを含む１種又は複数のリバースプライマーを用いて逆転写するステップを更に含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
増幅ステップ及び逆転写ステップを単一の反応混合物中で実施する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１種又は複数のリバースプライマーが各々、配列番号３２〜配列番号５５及び配列番号１１３；配列番号５６〜配列番号７１及び配列番号１１４；又は配列番号９４〜配列番号１１１の配列を有する、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
１種又は複数のフォワードプライマーが各々、配列番号１〜配列番号１８；配列番号１９〜配列番号３１及び配列番号１１２；又は配列番号７２〜配列番号９３の配列を有する、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
増幅ステップにおいてＰＣＲ増幅による増幅を行う、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
増幅ステップにおいてホットスタートを行う、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
検出ステップにおいてアガロースゲル又はアクリルアミドゲルによる検出を行う、請求項１７又は１６に記載の方法。
【請求項２０】
検出ステップにおいてリアルタイムＰＣＲによる検出を行う、請求項９〜１３、１５及び１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
リアルタイムＰＣＲによる検出が、５'末端にフルオロフォアを、３'末端にクエンチング分子を有する検出プローブによる検出を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
サンプル中のインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出する方法であって、
サンプルと、支持体上に固定されているプライマーとを、プライマーとサンプルとがハイズリダイズするのに適した条件下で接触させるステップと、
プライマーとサンプルとのハイブリダイゼーションを検出するステップと、を含み、
プライマーが、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む方法。
【請求項２３】
プライマーが、本質的に配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種からなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
プライマーが、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
サンプル中のインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出する方法であって、
サンプルと、１種又は複数のプライマーを含む核酸マイクロアレイとを、当該１種又は複数のプライマーとサンプルとがハイブリダイズするのに適した条件下で接触させるステップと、
１種又は複数のプライマーとサンプルとのハイブリダイゼーションを検出するステップと、を含み、
プライマーの各々が、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む方法。
【請求項２６】
１種又は複数のプライマーの各々が、本質的に配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種からなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
１種又は複数のプライマーの各々が、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
プライマーを含む核酸マイクロアレイであって、プライマーが、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む核酸マイクロアレイ。
【請求項２９】
プライマーが、本質的に配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種からなる、請求項２８に記載の核酸マイクロアレイ。
【請求項３０】
プライマーが、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種である、請求項２８に記載の核酸マイクロアレイ。
【請求項３１】
サンプル中のインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出するためのキットであって、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプライマーと、使用説明書とを含むキット。
【請求項１】
配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含むプライマー。
【請求項２】
本質的に配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種からなる、請求項１に記載のプライマー。
【請求項３】
配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種である、請求項１に記載のプライマー。
【請求項４】
標的アニーリング配列と非インフルエンザＡウイルス配列とを含むプライマーであって、標的アニーリング配列が、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含むプライマー。
【請求項５】
標的アニーリング配列が、本質的に配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種からなる、請求項４に記載のプライマー。
【請求項６】
標的アニーリング配列が、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種である、請求項４に記載のプライマー。
【請求項７】
標識を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプライマー。
【請求項８】
標識が、蛍光標識、化学発光標識、有色色素標識、放射性標識、放射不透過性標識、タンパク質（酵素を含む）、ペプチド又はリガンドである、請求項７に記載のプライマー。
【請求項９】
サンプル中のインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出する方法であって、
サンプルから得たＲＮＡから逆転写されたＤＮＡを、各々が配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のプライマーを用いて増幅するステップと、
増幅産物を検出するステップと、を含み、
増幅産物の存在が、サンプル中の鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１の存在を示す方法。
【請求項１０】
各プライマーが、本質的に配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種からなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
各プライマーが、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種である、請求項９に記載のプライマー。
【請求項１２】
増幅ステップにおいてプライマーセットを使用し、当該プライマーセットが、
（ａ）各々が配列番号３２〜配列番号５５及び配列番号１１３の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のリバースプライマー、及び、各々が配列番号１〜配列番号１８の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のフォワードプライマー、又は、
（ｂ）各々が配列番号５６〜配列番号７１及び配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のリバースプライマー、及び、各々が配列番号１９〜配列番号３１及び配列番号１１２の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のフォワードプライマー、又は、
（ｃ）各々が配列番号９４〜配列番号１１１の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のリバースプライマー、及び、各々が配列番号７２〜配列番号９３の配列のいずれか１種を含む１種又は複数のフォワードプライマー、を含み、
前記プライマーセットが（ａ）を含む場合には、増幅産物の存在が、サンプル中の鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５の存在を示し、
前記プライマーセットが（ｂ）又は（ｃ）を含む場合には、増幅産物の存在が、サンプル中の鳥インフルエンザウイルスサブタイプＨ５Ｎ１の存在を示す、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
生体サンプルから得たＲＮＡを、各々が配列番号３２〜配列番号７１、配列番号９４〜配列番号１１１、配列番号１１３及び配列番号１１４の配列のいずれかを含む１種又は複数のリバースプライマーを用いて逆転写するステップを更に含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
増幅ステップ及び逆転写ステップを単一の反応混合物中で実施する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１種又は複数のリバースプライマーが各々、配列番号３２〜配列番号５５及び配列番号１１３；配列番号５６〜配列番号７１及び配列番号１１４；又は配列番号９４〜配列番号１１１の配列を有する、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
１種又は複数のフォワードプライマーが各々、配列番号１〜配列番号１８；配列番号１９〜配列番号３１及び配列番号１１２；又は配列番号７２〜配列番号９３の配列を有する、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
増幅ステップにおいてＰＣＲ増幅による増幅を行う、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
増幅ステップにおいてホットスタートを行う、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
検出ステップにおいてアガロースゲル又はアクリルアミドゲルによる検出を行う、請求項１７又は１６に記載の方法。
【請求項２０】
検出ステップにおいてリアルタイムＰＣＲによる検出を行う、請求項９〜１３、１５及び１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
リアルタイムＰＣＲによる検出が、５'末端にフルオロフォアを、３'末端にクエンチング分子を有する検出プローブによる検出を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
サンプル中のインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出する方法であって、
サンプルと、支持体上に固定されているプライマーとを、プライマーとサンプルとがハイズリダイズするのに適した条件下で接触させるステップと、
プライマーとサンプルとのハイブリダイゼーションを検出するステップと、を含み、
プライマーが、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む方法。
【請求項２３】
プライマーが、本質的に配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種からなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
プライマーが、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
サンプル中のインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出する方法であって、
サンプルと、１種又は複数のプライマーを含む核酸マイクロアレイとを、当該１種又は複数のプライマーとサンプルとがハイブリダイズするのに適した条件下で接触させるステップと、
１種又は複数のプライマーとサンプルとのハイブリダイゼーションを検出するステップと、を含み、
プライマーの各々が、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む方法。
【請求項２６】
１種又は複数のプライマーの各々が、本質的に配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種からなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
１種又は複数のプライマーの各々が、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
プライマーを含む核酸マイクロアレイであって、プライマーが、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種を含む核酸マイクロアレイ。
【請求項２９】
プライマーが、本質的に配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種からなる、請求項２８に記載の核酸マイクロアレイ。
【請求項３０】
プライマーが、配列番号１〜配列番号１１４の配列のいずれか１種である、請求項２８に記載の核酸マイクロアレイ。
【請求項３１】
サンプル中のインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５又はＨ５Ｎ１を検出するためのキットであって、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプライマーと、使用説明書とを含むキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２０Ｃ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２２Ｃ】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２３Ｃ】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２４Ｃ】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図２５Ｃ】
【図２６Ａ】
【図２６Ｂ】
【図２６Ｃ】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２７Ｃ】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２８Ｃ】
【図２９Ａ】
【図２９Ｂ】
【図２９Ｃ】
【図３０Ａ】
【図３０Ｂ】
【図３０Ｃ】
【図３１Ａ】
【図３１Ｂ】
【図３１Ｃ】
【図３２Ａ】
【図３２Ｂ】
【図３２Ｃ】
【図３３Ａ】
【図３３Ｂ】
【図３３Ｃ】
【図３４Ａ】
【図３４Ｂ】
【図３４Ｃ】
【図３４Ｄ】
【図３５Ａ】
【図３５Ｂ】
【図３５Ｃ】
【図３５Ｄ】
【図３６Ａ】
【図３６Ｂ】
【図３６Ｃ】
【図３６Ｄ】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３Ａ】
【図４３Ｂ】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２０Ｃ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２２Ｃ】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２３Ｃ】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２４Ｃ】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図２５Ｃ】
【図２６Ａ】
【図２６Ｂ】
【図２６Ｃ】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２７Ｃ】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２８Ｃ】
【図２９Ａ】
【図２９Ｂ】
【図２９Ｃ】
【図３０Ａ】
【図３０Ｂ】
【図３０Ｃ】
【図３１Ａ】
【図３１Ｂ】
【図３１Ｃ】
【図３２Ａ】
【図３２Ｂ】
【図３２Ｃ】
【図３３Ａ】
【図３３Ｂ】
【図３３Ｃ】
【図３４Ａ】
【図３４Ｂ】
【図３４Ｃ】
【図３４Ｄ】
【図３５Ａ】
【図３５Ｂ】
【図３５Ｃ】
【図３５Ｄ】
【図３６Ａ】
【図３６Ｂ】
【図３６Ｃ】
【図３６Ｄ】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３Ａ】
【図４３Ｂ】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【公表番号】特表２００８−５０２３６２（Ｐ２００８−５０２３６２Ａ）
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２７１４９（Ｐ２００７−５２７１４９）
【出願日】平成１７年６月１０日（２００５．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００５／０００１８７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１２１３６７
【国際公開日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【出願人】（５０３２３１８８２）エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ (179)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月１０日（２００５．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００５／０００１８７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１２１３６７
【国際公開日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【出願人】（５０３２３１８８２）エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ (179)
【Ｆターム（参考）】
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