４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素およびそれを用いる４−Ｃ−メチルケトペントースの製造方法
【課題】ブランチ・イズモリングの構築とそれを利用した体系的な４位が分岐しＣメチル化されたペントースの製造法を確立すること。
【解決手段】
ケトペントースの４位にメチル基が結合した、４種存在する全ての４−Ｃ−メチルケトペントースに作用し３位をエピマー化することによって、対応するエピマーを生産する、シュードモナス属に属する細菌から得ることのできる４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素。シュードモナス チコリ ＳＴ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３６）由来の酵素である。上記の酵素を、４−Ｃ−メチルケトペントースに作用させ、遊離の分岐ケトースのままでエピマー化することによって、３位をエピマー化した対応する４−Ｃ−メチルケトペントースを生成することを特徴とする４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
【解決手段】
ケトペントースの４位にメチル基が結合した、４種存在する全ての４−Ｃ−メチルケトペントースに作用し３位をエピマー化することによって、対応するエピマーを生産する、シュードモナス属に属する細菌から得ることのできる４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素。シュードモナス チコリ ＳＴ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３６）由来の酵素である。上記の酵素を、４−Ｃ−メチルケトペントースに作用させ、遊離の分岐ケトースのままでエピマー化することによって、３位をエピマー化した対応する４−Ｃ−メチルケトペントースを生成することを特徴とする４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素および４−Ｃ−メチルペンチトールの２位を微生物酸化反応を用いる４−Ｃ−メチルケトペントースの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの複雑な炭水化物が、たとえば細胞−細胞認識、細胞増殖および細胞分化のような生物学的認識過程において中心的な役割を果たしている（非特許文献１）。それらは、血液型決定基を構成し（非特許文献２）、腫瘍関連抗原を形成する（非特許文献３）。植物界においては、それらはホルモンとして調整機能を発揮し（非特許文献４）、またレクチンに対する結合部位を形成する（非特許文献５）。
【０００３】
たとえばデオキシ− およびフルオロ糖のような修飾糖ならびに天然糖のエピマーは、これらの相互作用へ向けての研究の重要な手段を提供する。蛋白質−炭水化物相互作用の一般的な法則は、特異的な酵素−基質相互作用の場合と全く同様に、この関連での興味の中心である。すなわち、たとえば酵素の活性中心についての情報は、酵素基質の連続的な改変によって得ることができる。さらに、デオキシグリコシドはそれが多くの抗生物質中に存在するという事実からもとくに興味がもたれる（非特許文献６）。
【０００４】
２−デオキシグルコースはガン細胞における解糖およびガン細胞の増殖を阻害することが報告されており、いくつかの動物モデルでは腫瘍増殖を遅延させることも報告されている。また、他のサイトカインおよび抗ガン薬物との組み合わせも研究されている（特許文献１）。このようにデオキシヘキソースは特に代謝や生体信号に対する研究に対しての利用が期待される。
【０００５】
発明者の一人である何森健は、４炭糖、５炭糖、６炭糖についてのイズモリング（Izumoring）連携図を特許文献２で公表しその有用性を示している。すなわち、図６で示される生産過程と分子構造（D型、L型）により、炭素数４から６の単糖全てをつないだ連携図が、イズモリング（Izumoring）の全体図である。すなわち、図６から理解できることは、単糖は、炭素数４、５、６全てがつながっているということである。全体図は、イズモリングＣ６の中でのつながりと、イズモリングＣ５の中でのつながりと、イズモリングＣ４の中でのつながりと、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６が全てつながっていることである。この考え方は重要である。炭素数を減少させるには主に発酵法を用いる。炭素数の異なる単糖全てをつなぐという大きな連携図であることも特徴である。
【０００６】
炭素数が６つの単糖（ヘキソース）のイズモリングは、図６の下段および図７、さらに図１０に示すように、炭素数が６つの単糖（ヘキソース）は全部で３４種類あり、アルドースが１６種類、ケトースが８種類、糖アルコールが１０種類ある。希少糖とは自然界に希にしか存在しない単糖（アルドース、ケトース）およびその誘導体（糖アルコール）と定義づけることができる。この定義は糖の構造や性質による定義ではないため、あいまいである。すなわち、一定量以下の存在量を希少糖というなどの量の定義はなされていないためである。しかし、一般に自然界に多量に存在するアルドースとしてはＤ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノースの６種類あり、それ以外のアルドースは希少糖と定義される。ケトースとしては、Ｄ−ラクトースが存在しており、他のケトースは希少糖といえる。他のケトースとして、Ｄ−プシコース、Ｄ−タガトース、Ｄ−ソルボース、Ｌ−フラクトース、Ｌ−プシコース、Ｌ−タガトース、Ｌ−ソルボースが挙げられる。また糖アルコールは単糖を還元してできるが、自然界にはＤ- ソルビトールが比較的多いがそれ以外のものは量的には少ないので、これらも希少糖といえる。
これらの糖は、酸化還元酵素の反応、アルドース異性化酵素の反応、アルドース還元酵素の反応で変換できることは、本発明者らの研究を含めた研究で知られている。Ｄ−グルコース（ブドウ糖）やＤ− フラクトースは自然界に多量に存在する糖であり安価であるが、これらから希少糖を合成することができなかった。ところが、新規な酵素が発見された。それはガラクチトールからＤ−タガトースを合成する酵素を持つ菌の培養液中に、全く予期しなかったＤ−ソルボースが発見されたことに端を発する。その原因を調べた結果、この菌がＤ−タガトース３エピメラーゼ（ＤＴＥ）という酵素を産生していることを発見した（特許文献３）。このＤＴＥはこれまでつながらなかったＤ−タガトースとＤ−ソルボースの間をつなぐ酵素であることがわかる。そしてさらに驚くことに、このＤＴＥは全てのケトースの３位をエピ化する酵素であり、これまで合成接続できなかったＤ−フラクトースとＤ−プシコース、Ｌ−ソルボースとＬ−タガトース、Ｄ−タガトースとＤ−ソルボース、Ｌ−プシコースとＬ−フラクトース、に作用するという非常に幅広い基質特異性を有する、すなわち非常に幅広く基質を選択できるというユニークな酵素であることが分かった。このＤＴＥの発見によって、すべての単糖がリング状につながり、単糖の知識の構造化が完成し、イズモリング（Izumoring）と名付けた。
この図７をよく見てみると、左側にＬ型、右側にＤ型、真ん中にＤＬ型があり、しかもリングの中央（星印）を中心としてＬ型とＤ型が点対称になっていることもわかる。例えば、Ｄ−グルコースとＬ−グルコースは、中央の点を基準として点対称になっている。しかもイズモリング（Izumoring）の価値は、全ての単糖の生産の設計図にもなっていることである。先の例で、Ｄ- グルコースを出発点としてＬ−グルコースを生産しようと思えば、Ｄ−グルコースを異性化→エピ化→還元→酸化→エピ化→異性化するとＬ−グルコースが作れることを示している。
炭素数が６つの単糖（ヘキソース）のイズモリング（Izumoring）を使って、自然界に多量に存在する糖と微量にしか存在しない希少糖との関係が示されている。Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンノースと、牛乳中の乳糖から生産できるＤ−ガラクトースは、自然界に多く存在し、それ以外のものは微量にしか存在しない希少糖と分類される。ＤＴＥの発見によって、Ｄ−グルコースからＤ−フラクトース、Ｄ−プシコースを製造し、さらにＤ−アロース、アリトール、Ｄ−タリトールを製造することができるようになった。希少糖Ｄ−プシコースは、これまで入手自体が困難であったが、自然界に多量に存在する単糖から希少糖を大量生産する方法が開発されつつあり、その技術を利用して製造することができる。
炭素数が６つの単糖（ヘキソース）のイズモリング（Izumoring）の意義をまとめると、生産過程と分子構造（Ｄ型、Ｌ型）により、すべての単糖が構造的に整理され（知識の構造化）、単糖の全体像が把握できること、研究の効果的、効率的なアプローチが選択できること、最適な生産経路が設計できること、欠落部分について予見できること、が挙げられる。
【０００７】
炭素数が５つの単糖（ペントース）のイズモリングは、図６の中段および図８に示すように、炭素数６のイズモリングよりも小さいリングである。しかし、Ｃ６のイズモリングと同じようにアルドース８個、ケトース４個および糖アルコール４個全てを含むことに変わりは無く、全てが酵素反応で結ばれる。異なる点は、酸化還元反応、異性化反応のみでリング状に全てが連結できることである。一方、ＤＴＥを用いることによって、さらに効率のよい生産経路が設計できることがわかる。炭素数５のイズモリングの特徴は、特に図８から明らかなように、炭素数６のイズモリングが点対象に全単糖が配置されているのに対し、左右が対象に配置されていることが大きな特徴である。これら全ペントースは、酵素反応により連結されていることから、炭素数６のイズモリングの場合と全く同様に、すべてのペントースが構造的に整理され（知識の構造化）、全体像が把握できること、研究の効果的、効率的なアプローチが選択できること、最適な生産経路が設計できること、欠落部分について予見できる意義を持っている。
炭素数が４つの単糖（テトロース）のイズモリングは、図６の上段および図９に示すように、テトロースの構造上の特性のため、リングが完成しないという特徴がある。炭素数５のイズモリング上部半分の構造を持っている。このリングの場合も、炭素数５，６の場合と同様の酸化還元および異性化反応によって連結されている。ＤＴＥが炭素数４のケトースに反応しないため、ケトース間の反応は現在のところ存在しない。しかし、新規のエピメラーゼの存在が予測され、この研究は現在研究途上である。
全体の配置は、炭素数５と同様に左右対称であり、アルドース４個、ケトース２個および糖アルコール３個全てを含んでいる。すなわち炭素数５，６のイズモリングと同様の意義が存在する。
イズモリングＣ６のＤ- グルコースは、イズモリングＣ５のＤ−アラビトールおよびイズモリングＣ４のエリスリトールとつながっている。この線は、発酵法によってＤ−グルコースからＤ−アラビトールおよびエリスリトールを生産できることを示している。すなわち、イズモリングＣ６，イズモリングＣ５およびイズモリングＣ４は連結されている。この連結は、炭素数の減少という主に発酵法による反応であり、このＤ−アラビトールおよびエリスリトールへの転換反応の二つ以外の発酵法によるイズモリングＣ６とイズモリングＣ５，Ｃ４との連結は可能である。例えばＤ−グルコースからＤ−リボースの生産も可能である。
このように、３つのイズモリングにより全ての炭素数４，５，６の単糖（アルドース、ケトース、糖アルコール）が連結されたことで、それぞれの単糖が全単糖の中でその存在場所を明確に確認できる。最も有名なキシリトールは、未利用資源の木質から生産できるＤ−キシロースを還元することで容易に生産できることを明確に確認できる。
もしも特定の単糖が生物反応によって多量に得られた場合には、それを原料とした新たな単糖への変換の可能性が容易に見いだすことが可能である。すなわち、この全体像から全ての単糖の原料としての位置を確実につかむことができるため、有用な利用法を設計することができる。特に廃棄物や副産物から単糖が得られた場合の利用方法を容易に推定できるのである。
【０００８】
単糖類を還元すると、アルデヒド基およびケトン基はアルコール基となり、炭素原子と同数の多価アルコール、すなわち糖アルコールとなる。還元糖は食品等の分野で有用なものが多く、例えばＬ−アラビノースは、五炭糖で、蔗糖に近い味質を持ち、難吸収性のノンカロリーな糖質である。また蔗糖やマルトースなどの二糖が体内に吸収される際に作用する二糖水解酵素を阻害することが知られており、ダイエット用甘味料や糖尿病患者用甘味料としての利用が期待されている。また、Ｌ−アラビノースは医薬品の合成原料としても有用な糖である。
還元糖を取得する場合、その由来を天然物に求めることが行われている。例えば、Ｌ−アラビノースを取得する手段として、最近では、コーンファイバーやアラビアガム、ビートパルプなどに酵素や酸を作用させるＬ−アラビノースの製造法が開発されている。原料となるアラビナン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン等の粗繊維はペクチン質や不要な粗繊維等と混在して存在する場合が多く、これらを酵素分解や酸加水分解処理することによって得られる溶液の中にはＬ−アラビノース等の還元糖の他に、ペクチン質や粗繊維、またこれらの分解物が混在している。Ｌ−アラビノースを精製する方法に関しては、Ｌ−アラビノース含有糖液中のキシロースおよびオリゴ糖と目的のＬ−アラビノースをイオン交換樹脂によるクロマトグラフィーで分画する方法や、多糖、オリゴ糖や塩類との分離を目的としたイオン交換樹脂によるクロマトグラフィー、膜処理等が提案されている。
一方、単糖の中で炭素が直鎖状に結合していない分岐した単糖である、４−Ｃ−メチルペントースについては、有効な製造法および物質として認知されているものはほとんどなく、製造法についての確立が第一に要望されている。
【０００９】
【特許文献１】特表２００６- ５１５８８３号公報
【特許文献２】ＷＯ２００４／０６３３６９号公報
【特許文献２】特許３３３３９６９号公報
【非特許文献１】G.E.Edelman, Spektrum Wiss. １９６４(６)，６２
【非特許文献２】V.Ginsburg, Adv. Enzymol. ３６，(１９７２)，１３１
【非特許文献３】G.M.W.Cook, E.W. Stoddart,“Surface Carbohydratesof theEucaryotic Cell", Academic Press, London, １９７３
【非特許文献４】P.Albersheim, A.G. Darvill, Spektrum Wiss. １９８５(１１), ８６
【非特許文献５】T.W.Rademacher,R.B. Parekh, R.A. Dwek, Ann. Rev. Biochem., ５７，(１９８８), ７８５
【非特許文献６】T.Reichstein, E. Weiss, Adv. Carbohydr. Chem. １７, (９１６２〔sic〕), ６５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
単糖は炭素が直鎖状に４，５、あるいは６個並んだ、テトロース、ペントースそしてヘキソースが一般的である。しかし工業的に単糖の直鎖状態ではなく分岐した構造をもつ単糖を製造することは極めて困難であり、容易な製造法の確立が強く望まれる。
そこで、ブランチ・イズモリングの構築とそれを利用した体系的な４位が分岐しＣメチル化されたペントースの製造法を確立することを目的とする。
すなわち、本発明は、２−あるいは４−位がメチル化されたペンチトール（２位あるいは４位がメチル化したペンチトールは命名法によっては同一のものでも別名で呼ばれることがある）のメチル基を４位とした場合に２位を微生物酸化することで、４−Ｃ−メチルケトペントースの製造。そして、４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素を作用させることによって全ての４位が分岐したケトペントースを生産することを目的とした。
４−Ｃ−メチルケトースの４種が生産できれば、それをアルドースイソメラーゼによって４−Ｃ−メチルアルドースへ、また、還元することで４−Ｃ−メチルペンチトールを得ることが可能となり、新しい構造を持つ糖の一群；４位がメチル化された分岐ペントースの全てを生産することが可能となる。（図１）
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素の製造法の確立に鋭意研究を行ってきた。その中で、シュードモナス チコリ ＳＴ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３６）由来のＤ- タガトース ３- エピメラーゼが、４−Ｃ−メチルケトペントース(例えば４―Ｃ−メチルＤ―キシルロース)を基質として対応する４―Ｃ−メチルケトペントース（例えば４―Ｃ−メチルＤ―リブロース）を生成することを発見した。
また４―Ｃ−メチルケトペントースは、４―Ｃ−メチルペンチトールを微生反応により２位を酸化することで得られることを見出した。
この発見によって全ての４種の、４−Ｃ−メチルケトペントース；４―Ｃ−メチルＤ―キシルロース、４―Ｃ−メチルＬ−キシルロース、４―Ｃ−メチルＤ―リブロースおよび４―Ｃ−メチルＬ−リブロースを生産することができた。これらの酸化・エピ化・異性化を関連する構造と反応をもとに配置することで、ブランチ・イズモリング（図１）を完成した。
【００１２】
本発明の４−Ｃ−メチルケトペントースの製造方法。本発明における４−Ｃ−メチルケトペントース製造法は、大きく二つの反応による。第一の反応は、４−Ｃ−メチルペンチトールを微生物酸化して、４−Ｃ−メチルケトペントースへ転換する方法。第二は、４−Ｃ−メチルケトペントースを４−Ｃ−メチルケトペントースの３位をエピ化する活性を有する、４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素による対応する４−Ｃ−メチルケトペントースの生産法である。
【００１３】
第一のポリオールからケトースへ酸化する方法
＜４−Ｃ−メチルポリオールから４−Ｃ−メチルケトペントースの生産＞
４−Ｃ−メチルポリオールを原料として用い、２位を特異的に微生物を用いて酸化することによって、４−Ｃ−メチルケトペントースを製造する方法。この場合には、これまでのイズモリングの経験から、ポリオールのケトースへの酸化は微生物反応を用いる必要がある。それはＮＡＤなどの補酵素の再生系を組み込んだバイオリアクターを構築することは、現在のところ効率が悪いことが分かっていること。各種のポリオールは効率よく、２位を酸化して対応するケトースを生産することが可能である。
そこでこの場合の基質であるポリオールは、４位にメチル基が結合した従来の通常のポリオールではない、枝分かれしたポリオールであるので酸化されるかどうかは、まず基質が微生物の体内に入る関門が第一、第二にそれがポリオール脱水素酵素の基質になるかどうかの関門であった。
実際に検討した結果、直鎖のポリオールと同様の酸化によるケトースへの転換活性が認められたので本研究は完成できた。
第一のポリオールからケトースへ酸化する方法は、微生物による酸化が、Gluconobacter thailandicus NBRC 3254を用いることを特徴とする。
＜Gluconobacter thailandicus NBRC 3254について＞
本微生物は工業的にＤ−ソルビトールからＬ−ソルボースを製造する時に用いられる酢酸菌である。われわれはこのポリオールの２位を酸化してケトール生産する能力を利用することで、各種希少糖ケトースを生産することに利用してきた。例えば、アリトールの２位を酸化することでＬ−プシコースを効率よく生産することに成功している。（参考文献；Journal of Fermentation and Boiengineering Vol. 81, 212-215 (1996)）
【００１４】
第二のケトースをエピ化する方法
〈４−Ｃ−メチルケトペントースを対応する３位のエピマーへのエピ化反応〉
４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素を用いて、４−Ｃ−メチルポリオールから生産した４−Ｃ−メチルケトペントースの３位をエピ化し、４−Ｃ−メチルＤ−キシルロース、４−Ｃ−メチルＬ−キシルロース、４−Ｃ−メチルＤ−リブロースおよび４−Ｃ−メチルＬ−リブロースを生産する方法である。
４位にメチル基が結合した分岐したケトースの３位をエピ化する酵素の存在は、全く知られていないし、そのような酵素を検索したこともないものであった。実際の実験を進める中で、イズモリングにおいてケトヘキソースおよびケトペントースの３位をエピ化する酵素として用いたＤ−タガトース３−エピメラーゼがこの活性を持っていることを発見した。そのため第二の方法が完成できた。
使用する酵素は以下の性質を持った酵素である。
４−Ｃ−メチルケトペントースに作用し、３位をエピマー化し対応する４−Ｃ−メチルケトペントースを生成する、４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素であると言える。この酵素はシュードモナス属に属する細菌から得ることのできるＤ−タガトース３−エピメラーゼと同一の酵素である。その性質は、
１）全４種の４−Ｃ−メチルケトペントース作用し、３位をエピマー化することで、対応する４−Ｃ−メチルケトペントースを生成する。
２）４−Ｃ−メチルケトペントース異性化活性の至適ｐＨおよびｐＨ安定性は、ｐＨ７〜１０に至適ｐＨを有し、ｐＨ５〜１０で安定。
３）４−Ｃ−メチルケトペントース異性化活性の至適温度および熱安定性６０℃付近に至適温度を有し、５０℃以下で安定。
４）紫外線吸収スペクトル２７５乃至２８０ｎｍに吸収帯を示す。
５）分子量４１，０００±３，０００（ゲル濾過クロマトグラフィーによる）。
６）本４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素は、シュードモナス チコリ ＳＴ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３６）由来の酵素である。
【００１５】
すなわち、本発明は、以下の（１）ないし（３）に記載の４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素を要旨とする。
（１）ケトペントースの４位にメチル基が結合した、４種存在する全ての４−Ｃ−メチルケトペントースに作用し３位をエピマー化することによって、対応するエピマーを生産する、シュードモナス属に属する細菌から得ることのできる４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素。
（２）下記の理化学的性質を有する（１）に記載の４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素。
１）全４種の４−Ｃ−メチルケトペントース作用し、３位をエピマー化することで、対応する４−Ｃ−メチルケトペントースを生成する。
２）４−Ｃ−メチルケトペントース異性化活性の至適ｐＨおよびｐＨ安定性は、ｐＨ７〜１０に至適ｐＨを有し、ｐＨ５〜１０で安定。
３）４−Ｃ−メチルケトペントース異性化活性の至適温度および熱安定性６０℃付近に至適温度を有し、５０℃以下で安定。
４）紫外線吸収スペクトル２７５乃至２８０ｎｍに吸収帯を示す。
５）分子量４１，０００±３，０００（ゲル濾過クロマトグラフィーによる）。
（３）シュードモナス チコリ ＳＴ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３６）由来の酵素である（１）または（２）に記載の４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素。
【００１６】
また、本発明は、以下の（４）ないし（９）に記載の４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法を要旨とする。
（４）（１）、（２）または（３）に記載の４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素を、４−Ｃ−メチルケトペントースに作用させ、遊離の分岐ケトースのままでエピマー化することによって、３位をエピマー化した対応する４−Ｃ−メチルケトペントースを生成することを特徴とする４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
（５）原料である４−Ｃ−メチルＤ−リブロースまたは、４−Ｃ−メチルＬ−リブロースの３位をエピ化し、対応する、４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースまたは、４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースを製造することである（４）に記載の４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
（６）４−Ｃ−メチルケトペントースが、２−Ｃ−メチルペンチトールあるいは４−Ｃ−メチルペンチトールを原料として、微生物による酸化で得られたものである（４）または（５）に記載の４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
（７）微生物による酸化が、Gluconobacter thailandicus NBRC 3254を用いることを特徴とする（６）に記載の４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
（８）２−Ｃ−メチルペンチトールあるいは４−Ｃ−メチルペンチトールを原料として、４種全ての４位にメチル基を有するケトペントースを製造することを特徴とする（６）または（７）に記載の４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
（９）２−Ｃ−メチルＤ−アラビニトールまたは２−Ｃ−メチルＤ−リビトールを微生物によって２位を酸化し、４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースまたは４−Ｃ−メチルＬ−リブロースをそれぞれ生産し、これを４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素を用いてエピ化し４−Ｃ−メチルＤ−リブロースまたは４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースを生産することによって、全ての４位で分岐した４種のケトペントース；４−Ｃ−メチルＤ−キシルロース、４−Ｃ−メチルＤ−リブロース、４−Ｃ−メチルＬ−リブロースおよび４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースを製造することを特徴とする（８）に記載の４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
【００１７】
さらにまた、本発明は、以下の（１０）に記載の新規化合物を要旨とする。
（１０）（９）に記載された方法で製造された以下の新規化合物。
４−Ｃ−メチルＤ−キシルロース、４−Ｃ−メチルＬ−キシルロース、４−Ｃ−メチルＤ−リブロースおよび４−Ｃ−メチルＬ−リブロース。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、遊離のケトペントースの４位をメチル化した、分岐ケトペントースに作用する４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素、それを用いる４位をメチル化した４種の分岐ケトペントースの製造方法、並びに、生産された４−Ｃ−メチルケトペントースを提供することができる。
【００１９】
また、自然界に希にしか存在しない単糖およびその誘導体（アルドース、ケトースおよび糖アルコール）である希少糖について、炭素数が６つの単糖およびその誘導体（ヘキソース）のイズモリング（Izumoring）は、自然界に多量に存在する糖と微量にしか存在しない希少糖との関係、それを得るための出発原料および経路が体系的に示されているが、本発明により、これまで全く研究されてされていない、４位で分岐したペントースに関する分野の研究開発に道を開き、新しい用途を開発できる可能性を明らかにしたといえる。
図１で示したように、ブランチ・イズモリングとして全体像を理解できることによって、分岐した全く新規な希少糖の研究への基盤を作ることを意味している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
上記のように、本発明者らは、４−Ｃ−メチルケトペントースを、遊離の４−Ｃ−メチルケトペントースの糖質のままで容易にエピマー化しうるエピメラーゼの検索を鋭意続けてきた。その結果、従来知られているＤ- ケトヘキソース ３- エピメラーゼであるＤ- タガトース ３- エピメラーゼ（特許第３３３３９６９号）が、ケトヘキソースおよびケトペントースのみならず、対応する４−Ｃ−メチルケトペントースにも作用し、３位をエピマー化したデオキシ体を得ることができることを発見し、該酵素を利用した全４−Ｃ−メチルケトペントースの製造方法を確立した。また４−Ｃ−メチルケトペントースを４−Ｃ−メチルペンチトールを酸化できる微生物反応を見出すことで、全４種の４−Ｃ−メチルケトペントースの生産法を完成した。
【００２１】
なお、エピメラーゼは、エンザイム ノメンクレイチャー（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）（アメリカ合衆国、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．１９９２年）によると、各種の糖質に作用することが知られている。しかしながら、これまでに知られているエピメラーゼは、例えば、リブロースリン酸塩 ３- エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．３．１）やＵＤＰ−グルコース ４−エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．３．２）などのように主としてリン酸化された糖質やＵＤＰなどと結合した糖質に作用するものであり、遊離の中性の糖質を製造する工業用途には、使えないものであった。
一方、遊離の糖質に作用するエピメラーゼについては、アルドースに作用する二例、アルドース １- エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．３．３）およびセロピオース エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．３．１１）または、ケトースに作用するＤ- ケトヘキソース ３- エピメラーゼが知られているのみである。アルドース １- エピメラーゼは、アルドースの１位のα、βアノマー間のエピマー化を触媒し、セロビオース エピメラーゼは、同様に、セロビオースのα、βアノマー間を触媒する酵素である。また、Ｄ- ケトヘキソース ３- エピメラーゼはケトヘキソースの3位を触媒する酵素であるが、デオキシ体に作用するかどうかは知られていなかった。
【００２２】
すなわち、本酵素（シュードモナス属に属する細菌から得ることのできるデオキシケトヘキソース異性化酵素、Ｄ- ケトヘキソース ３- エピメラーゼ）は、以下の化合物間の反応を触媒することを発見した。
（ｉ）４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースの４−Ｃ−メチルＤ−リブロースへのエピマー化反応もしくはその逆反応、
（ii）４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースの４−Ｃ−メチルＬ−リブロースへのエピマー化反応もしくはその逆反応、
【００２３】
また、これまでのアルドースイソメラーゼの研究の成果から考えると、４−Ｃ−メチルケトペントースと４−Ｃ−メチルアルドペントースを、遊離の４−Ｃ−メチルケトペントースへ容易に異性化することができる。
よって、本発明は、製造した４−Ｃ−メチルケトペントースを対応する４−Ｃ−メチルアルドペントースへと変換し製造することが可能となったと言える。
【００２４】
また４−Ｃ−メチルアルドペントースは、アルドースの特性としてラネーニッケルなどの触媒存在下において対応する４−Ｃ−メチルペンチトールを生産可能であることは容易である。
【００２５】
本発明は、４種全ての４−Ｃ−メチルケトペントースを製造する製造方法を確立し、提供する。
【００２６】
本発明の４−Ｃ−メチルケトペントースの製造方法は、Ｄ- ケトヘキソース ３- エピメラーゼが、４−Ｃ−メチルケトペントースの３位をエピマー化し、対応する４−Ｃ−メチルケトペントースを生成する活性を有することを新たに発見し、全ての４−Ｃ−メチルケトペントースを製造できる手段を提供する。
用いるＤ- ケトース ３- エピメラーゼは、４−Ｃ−メチルケトペントースの３位をエピマー化するものが選ばれるが、特許３３３３９６９号に記載のものが、反応活性が高く好ましい。
【００２７】
本発明に用いられるＤ- タガトース３- エピメラーゼの主な理化学的性質は、特許第３３３３９６９号明細書に記載されているが、４−Ｃ−メチルケトペントースに対する性質を下記に示す。
（１） 作用および基質特異性４−Ｃ−メチルケトペントースの３位をエピマー化し、対応する４−Ｃ−メチルケトペントースを生成する。
（２） 至適ｐＨおよびｐＨ安定性ｐＨ７〜１０に至適ｐＨを有し、ｐＨ５〜１０で安定。
（３） 至適温度および熱安定性６０℃付近に至適温度を有し、５０℃以下で安定。
【００２８】
本発明のＤ- タガトース ３- エピメラーゼすなわちＤ- ケトヘキソース ３- エピメラーゼは、通常、特許第３３３３９６９号明細書で開示されている方法でシュードモナス チコリ ＳＴ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３６）およびその変異種などを用いることにより生産できる。
【００２９】
すなわちシュードモナス チコリ ＳＴ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３６）を、常法に従って、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンなどを含有する栄養培地に１〜５日間程度培養、望ましくは、液体培地に通気撹拌などにより好気的条件下で培養し、得られる菌体または培養液上清などの培養物からＤ- タガトース ３- エピメラーゼを抽出する。通常、培養物を粗Ｄ- ケトヘキソース ３- エピメラーゼとして利用することができる。必要ならば、培養物を濾過、遠心分離、塩析、透析、濃縮、凍結乾燥など公知の方法で部分精製して利用することができる。さらにイオン交換体への吸着溶出、ゲル濾過、等電点分画、電気泳動、高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体への吸着溶出などを組合せて高度に精製したものも利用することも可能である。このようにして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に、単一にバンドを示すまで精製したＤ- タガトース３ エピメラーゼは、Ｄ- ケトヘキソースの３位のＯＨ基をエピマー化する。また、驚くことに、本酵素は、４−Ｃ−メチルケトペントースに対しても、エピメラーゼ活性を示すことがわかった。
【００３０】
この変換反応は、通常、次の条件で行なわれる。基質濃度は１〜６０ｗ／ｖ％、望ましくは約５〜５０ｗ／ｖ％、反応温度は１０〜７０℃、望ましくは約３０〜６０℃、反応ｐＨは５〜１０、望ましくは約７〜１０、酵素活性は基質グラム当り１単位以上、望ましくは、５０〜５，０００単位の範囲から選ばれる。反応時間は、適宜選択できるが、経済性との関係で、バッチ反応の場合には、通常、５〜５０時間の範囲が選ばれる。
なお上記の酵素活性単位は、タガトース ３−エピメラーゼ活性に対する酵素単位とし、次のようにして測定される。
すなわち、５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７ ．５ ）１００ μｌ 、４０ｍＭＤ- タガトースを５０μｌ および酵素液５０ μｌ含む溶液（または懸濁液）を３０ ℃で６０分間インキュベートし、生成物であるＤ−ソルボースをＨＰＬＣにより測定した。酵素活性１単位は１分間に１μｍｏｌ のＤ−タガトースをエピマー化し、Ｄ− ソルボースを生成する酵素量とした。
【００３１】
このようにして変換させた反応溶液は、原料の４−Ｃ−メチルケトペントースと新たに生成した４−Ｃ−メチルケトペントース（原料のエピマー）とを含有しており、必要ならば、この濃縮液を、例えば、アルカリ金属型またはアルカリ土類金属型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、新たに生成したデオキシケトースと原料デオキシケトースとを分離精製し、新たに生成したデオキシケトース高含有画分を濃縮し、シラップ状製品を得ることができる。また、結晶化が可能である場合には、晶出させて結晶状製品を得ることも有利に実施できる。また、この分離された原料の４−Ｃ−メチルケトペントースを、再度、変換反応の原料に用いることもできる。
【００３２】
以下、幾つかの実施例により本発明の詳細を述べるが、これらの実施例により、本発明が限定されることはない。
【実施例１】
【００３３】
第一の方法のポリオールからの生産法の実施例である。
［２−Ｃ−メチルＤ−アラビニトールから４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースの生産］
２−Ｃ−メチルＤ−アラビニトールの２位を酸化して、４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースを生産する微生物を検索した。その結果Gluconobacter thailandicus NBRC 3254に強い活性が存在することを見出した。
＜Gluconobacter thailandicus NBRC 3254 の培養条件＞
菌株の保存培地は２％寒天を含む、０．５％ポリペプトン、０．５％酵母エキスに０．５％の食塩と１％Ｄ−グルコースを加えｐＨ７に調整したものを用いた。反応に用いる微生物の生育培地は0.5% Polypepton, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl and 1% glucose in
water pH adjusted to 7を用いた。微生物の培養条件は、５００ｍｌ容三角フラスコに上記培地２００ｍｌを入れて一分間２００回転の速度で回転し、反応は２４時間、反応温度は３０℃で行った。
【００３４】
＜微生物を用いた酸化反応条件＞
反応条件は０．０５ＭのトリスＨＣｌ緩衝液ｐＨ８を用い、菌体濃度はＡ６００nmの吸光度が３０となるように調整して用いた。反応は２０時間行い１００rpmの撹拌条件で行った。２−Ｃ−メチルＤ−アラビニトールの酸化反応は、基質濃度は１〜１０％で転換は１００％の転換率で進んだ。
【００３５】
＜生産物の精製と純度の検定＞
脱イオンはSKIB (H+; Mitsubishi Chemical, Tokyo)Amberlite IRA-41 I(Co3 2- ; Organo, Tokyo)の混合樹脂を用いて行なった。他の不純物からの分離は、カラムクロマトグラフィーを用い、分離樹脂は Dowex 5OW-X2 (The Dow Chemical, MI, USA) の Ca 2+
型を用いて行い、溶出液としては水を用いた。 純度の検定はＨＰＬＣを用いて行なった。ＨＰＬＣ分析条件は、検出器にはShimadzu RID-6A を用い、移動相１０−４ＮａＯＨＭ、流速１．０ｍｌ／min、カラムはHITACHI GL-C611 を用いた。カラム温度は６０℃で分析を行った。分析試料はDiaionSK-1B, AmberliteIRA-411 で脱塩したものを0.45μm の面ブランフィルターでろ過したものを用いた。ＨＰＬＣの結果は、図２（ｂ）４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースのＨＰＬＣ分析結果に示すようにほぼ純粋であった。
【００３６】
＜生産物の同定＞
生産物の精製標品を得るまでの収率は７０％であった。その旋光度は-７．１５[oil, [a]D20-7.15 (c, 1.0 in water)]であった。ＮＭＲを用いたを行なった。分析条件は、１０〜１５mg の４−Ｃ−メチルＤ−リブロースをエッペンドルフチューブに入れ、６００μL の重水を添加した。チューブの口をパラフィルムで覆い、爪楊枝で３箇所ほど開け、ディープフリーザーで凍結させた。これを凍結乾燥し、再び６００μLの重水を添加し、凍結乾燥した。乾燥後、予めＴＳＰ（３- methylsilyl propionic 2,2,3,３- d4 acid）を１％になるように調製した６００μLの重水を添加して溶解した。これをＮＭＲのガラス管に入れて測定を行った。
測定結果は、図２（ｂ）４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースのＨＰＬＣ分析結果に示した。表２に示すような結果を得ており、本物質の構造を確認できた。水溶液中におけるアノマーの存在比も明らかにできた。
【実施例２】
【００３７】
第一の方法のポリオールからの生産法の実施例である。
［２−Ｃ−メチルＤ−リビトールから４−Ｃ−メチルＬ−リブロースの生産］
２−Ｃ−メチルＤ−アラビニトールから４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースの生産と同様にまず、２−Ｃ−メチルＤ−リビトールから４−Ｃ−メチルＬ−リブロースする微生物の検索を行なった。その結果、２−Ｃ−メチルＤ−アラビニトールから４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースに用いた同一の微生物が強い酸化活性を持つことを見出した。２−Ｃ−メチルＤ−リビトールと２−Ｃ−メチルＤ−アラビニトールの構造を比較すると、炭素２および３のＯＨの配位が同一のＬ−リブロ型であることから、同一の微生物が両者に活性を持っていると考えられた。
【００３８】
＜微生物の培養、酸化反応、精製、同定の条件＞
これらの条件は、２−Ｃ−メチルＤ−アラビニトールから４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースの生産の場合と全く同一である。
なお、純度をＨＰＬＣで検定した結果は 図３（ａ）４−Ｃ−メチルＬ−リブロースのＨＰＬＣ分析結果に示したとおり、ほぼ純粋であった。収率は６５％であり旋光度は-1.4 [oil, [a]D20 -1.4 (c, 1.0 in water)]であった。ＮＭＲの結果は 表２の４−Ｃ−メチルＬ−リブロースの欄と図４の下の４−Ｃ−メチルＬ−リブロースの1H NMRスペクトルに示した。構造を確認することができた。
【実施例３】
【００３９】
第二の方法のケトースの３位のエピ化酵素を用いた生産法の実施例である。
［４−Ｃ−メチルＤ−リブロースの４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースからの生産］
２−Ｃ−メチルＤ−アラビニトールから微生物反応で生産した４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースをＤ- タガトース３- エピメラーゼを用いてエピマー化することによって、４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースを生産した。
【００４０】
［Ｄ- タガトース ３- エピメラーゼの調製］
Pseudomonas cichorrii ST24株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３６）由来Ｄ- タガトース ３- エピメラーゼの遺伝子を大腸菌に形質転換し、組み換え大腸菌を培養して、Ｄ- タガトース ３- エピメラーゼを得た。
組換え大腸菌の大量培養後、得られた菌体を−８０℃で冷凍保存した。冷凍保存された菌体を氷中に３０分間放置し表面を解凍し、５０mMトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を用いて懸濁した。懸濁液２００mLを超音波ホモジナイザー SONIFIER２５０（ブランソン株式会社）を用い、４℃に保ちながら６分間破砕した。これを２度繰り返した。この液を４℃、１１５００rpmで２０分間遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。粉砕したポリエチレングリコール♯６０００を粗酵素液に重量に対して５％を、氷水浴中でマグネチックスターラーを用いて撹拌しながら徐々に添加し、添加後から１時間撹拌した。これを４℃、１１５００rpmで1時間遠心分離して上清を回収した。再びポリエチレングリコール♯６０００を上清の重量に対して２５％を、同様の操作で添加し、添加後から1時間撹拌した。これを４℃、１１５００rpmで1時間遠心分離して沈殿を回収した。この沈殿物に少量（菌体重量のおよそ５倍）の５０mMトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を加えて懸濁した。（これを、部分精製Ｄ- タガトース ３- エピメラーゼとした。）
【００４１】
［Ｄ- タガトース ３- エピメラーゼの活性測定］
Ｄ- タガトース ３- エピメラーゼの活性測定はＤ- タガトースを基質として反応を行い、生じたＤ- ソルボースの量をHPLC分析によって定量した。酵素反応は表１に示した組成で３０℃、１０、２０、３０分間反応させ、熱湯で２分間加熱することにより反応を停止し生じたＤ- ソルボース量を求め、１分間で１μmolのＤ- ソルボースを生産するＤ- タガトース ３- エピメラーゼ量を１Ｕ（単位）とした。
【００４２】
【表１】
【００４３】
得られた部分精製Ｄ- タガトース ３- エピメラーゼの性質は以下の通りであった。
（１） 作用および基質特異性は、１- または６- デオキシまたはＤ- またはＬ- ケトヘキソースの３位をエピマー化し、対応する１- または６- デオキシまたはＤ- またはＬ- ケトヘキソースを生成する。
（２） 至適ｐＨおよびｐＨ安定性ｐＨ７〜１０に至適ｐＨを有し、ｐＨ５〜１０で安定。
（３） 至適温度および熱安定性６０℃付近に至適温度を有し、５０℃以下で安定。
【００４４】
［Ｄ- タガトース ３- エピメラーゼの固定化］
Ｄ- タガトース ３- エピメラーゼの固定化をキトパールBCW２５１０を用いて行った。まず、５０mMトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を用いてキトパール樹脂を洗浄し、冷蔵庫内で一晩放置して平衡化を行った。次に上述の部分精製したＤ- タガトース ３- エピメラーゼ２００Ｕを１mL(湿重量約１g)のキトパール樹脂と混合し、時々撹拌しながら冷蔵庫内で２日間放置して酵素を固定化させた。同緩衝液にてキトパールを洗浄し、これを固定化酵素とした。
【００４５】
以下の実施例には、この固定化酵素を使って、デオキシケトヘキソースのエピマー化反応を実施した。
【実施例４】
【００４６】
第二の方法のケトースの３位のエピ化酵素を用いた生産法の実施例である。
［Ｄ- タガトース ３- エピメラーゼによる４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースの異性化（エピマー化）］
４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースをＢｒｉ×５％、２５mLになるように調製し、５００mL容量の三角フラスコに移した。そこに固定化Ｄ- タガトース ３- エピメラーゼ２５mL（５０００Ｕ相当）と１M トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を４０mL（終濃度約５０mM）添加し、４２℃、１２０rpmの条件で撹拌しながら反応させた。
１時間毎に反応液１０μL採取し、２９０μLの水で希釈（３０倍希釈）した。熱湯で２分間加熱した後、１２０００rpmで5分間遠心して上清を別のエッペンドルフチューブに移す。それに少量の脱塩樹脂（ＩＲＡ４１１：ＳＫＩＢ＝２：１の割合で混合し乾燥させたもの）を添加して転倒混和した。１時間後、この液を０．４５μmのフィルターを用いてろ過し、ＨＰＬＣに供試した。４−Ｃ−メチルＤ−リブロースと４−Ｃ−メチルＤ−キシルロース平衡比は、７０：３０であった。
【００４７】
［４−Ｃ−メチルＤ−リブロースの分離］
異性化反応後、ろ過により固定化酵素を除去した。脱塩樹脂（ＩＲＡ４１１（４０mL）とＳＫＩＢ（２０mL））を混合してオープンカラムに充填し、少しずつ糖液を流し込んで脱塩を行った。脱塩後、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。その後、０．２２μmのフィルターを用いてろ過し、ろ液をＢｒｉ×３０％に調製した。クロマト分離装置を用いて４−Ｃ−メチルＤ−リブロースを分離した。分離後、のＨＰＬＣ分析による純度は図２（ａ）４−Ｃ−メチルＤ−リブロースのＨＰＬＣ分析結果に示したとおりであった。
【００４８】
＜４−Ｃ−メチルＤ−リブロースの純度と構造の確認＞
精製した４−Ｃ−メチルＤ−リブロースの純度や、ＮＭＲによる構造決定を行なった。純度はＨＰＬＣでの分析結果は 図２（ａ）の４−Ｃ−メチルＤ−リブロースのＨＰＬＣ分析結果に示したとおりでありほぼ純粋であった。収率は５０％であり、旋光度は+2.7 [a]D20 +2.7 (c, 1.0 in water)] であった。ＮＭＲの結果は、表２の４−Ｃ−メチルＤ−リブロースの欄および図４の上の４−Ｃ−メチルＤ−リブロースの1H NMRスペクトルに示すとおりであり、構造を確認した。
【実施例５】
【００４９】
［４−Ｃ−メチルＬ−リブロースから４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースの生産］
ＤＴＥが４−Ｃ−メチルＤ−リブロースの４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースからの生産に利用できたこと同様に、ＤＴＥは４−Ｃ−メチルＬ−リブロースから４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースの生産の生産にも有効に利用できることが明らかになった。
【００５０】
＜４−Ｃ−メチルＬ−リブロースから４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースの生産＞
４−Ｃ−メチルＤ−リブロースの４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースからの生産に用いたと同じ酵素ＤＴＥを用いて、４−Ｃ−メチルＬ−リブロースから４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースの生産の生産を行なった。
【００５１】
＜反応、分離精製、構造確認＞
これらは、４−Ｃ−メチルＤ−リブロースの４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースからの生産の場合と同一の方法で行なうことが可能であった。
分離精製した４−Ｃ−メチルＬ−リブロースのＨＰＬＣの図３（ａ）が示すようにほぼ純粋であった。その収率は２５％であり、旋光度は+5.15[a]D20 +5.15 (c, 1.0 in water)]であった。ＮＭＲ分析の結果は、表２の４−Ｃ−メチルＬ−リブロースの欄と図４の下に示しており、構造を確認できた。４−Ｃ−メチルＬ−リブロースと４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースとの平衡比は６８：３２であった。
【００５２】
［４−Ｃ−メチルＤ−リブロースと４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースの構造解析］
ＮＭＲによる解析結果は表２と図３、図４のとおりである。図３は、４−Ｃ−メチル−リブロースの1H NMRスペクトルを測定して光学的対掌体を比較した結果を示す。上はD−体、下がL−体の1H NMRスペクトルである。図４は、４−Ｃ−メチル−キシルロースの1H NMRスペクトルを測定して光学的対掌体を比較した結果を示す。上はD−体、下がL−体の1H NMRスペクトルである。
【００５３】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の４−Ｃ−メチルケトペントースの製造方法は、４−Ｃ−メチルケペンチトールを微生物酸化することで、対応する４−Ｃ−メチルケトペントースを生産する。そしてＤ- ケトヘキソース３- エピメラーゼ（ＤＴＥ）が図１に示すように反応を順次進めていくことによって、全４種の４位がメチル基となった分岐ケトペントースを生産することができる。これらは化学的手法では生産が非常に困難である、新規物質である。この反応系は、従来、製造困難であった４種全ての４−Ｃ−メチルケトペントースの大量生産の道を拓くものである。従って、本発明のＤ- ケトヘキソース３- エピメラーゼであるＤ- タガトース３- エピメラーゼを用いた４−Ｃ−メチルケトペントースの製造方法並びに用途の確立は、食品産業のみならず、これに関連する食品、化粧品、医薬品産業における工業的意義が極めて大きい。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】４−メチル−ペントース イズモリングを製造する経路を示す。
【図２】精製した生産物である (a)４−Ｃ−メチルＤ−リブロース、(b) ４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースのＨＰＬＣ分析結果を示した。
【図３】精製した生産物である (a)４−Ｃ−メチルL−リブロース、(b) ４−Ｃ−メチルL−キシルロースのＨＰＬＣ分析結果を示した。
【図４】４−Ｃ−メチル−リブロースの1H NMRスペクトルを測定して光学的対掌体を比較した結果を示す。上はD−体、下がL−体の1H NMRスペクトルである。
【図５】４−Ｃ−メチル−キシルロースの1H NMRスペクトルを測定して光学的対掌体を比較した結果を示す。上はD−体、下がL−体の1H NMRスペクトルである。
【図６】４糖、５糖、６糖が連携したのイズモリングを製造する経路を示す。
【図７】６糖が連携したのイズモリングを製造する経路を示す。
【図８】５糖が連携したのイズモリングを製造する経路を示す。
【図９】４糖が連携したのイズモリングを製造する経路を示す。
【図１０】構造式とセットのイズモリングＣ６の説明図を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素および４−Ｃ−メチルペンチトールの２位を微生物酸化反応を用いる４−Ｃ−メチルケトペントースの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの複雑な炭水化物が、たとえば細胞−細胞認識、細胞増殖および細胞分化のような生物学的認識過程において中心的な役割を果たしている（非特許文献１）。それらは、血液型決定基を構成し（非特許文献２）、腫瘍関連抗原を形成する（非特許文献３）。植物界においては、それらはホルモンとして調整機能を発揮し（非特許文献４）、またレクチンに対する結合部位を形成する（非特許文献５）。
【０００３】
たとえばデオキシ− およびフルオロ糖のような修飾糖ならびに天然糖のエピマーは、これらの相互作用へ向けての研究の重要な手段を提供する。蛋白質−炭水化物相互作用の一般的な法則は、特異的な酵素−基質相互作用の場合と全く同様に、この関連での興味の中心である。すなわち、たとえば酵素の活性中心についての情報は、酵素基質の連続的な改変によって得ることができる。さらに、デオキシグリコシドはそれが多くの抗生物質中に存在するという事実からもとくに興味がもたれる（非特許文献６）。
【０００４】
２−デオキシグルコースはガン細胞における解糖およびガン細胞の増殖を阻害することが報告されており、いくつかの動物モデルでは腫瘍増殖を遅延させることも報告されている。また、他のサイトカインおよび抗ガン薬物との組み合わせも研究されている（特許文献１）。このようにデオキシヘキソースは特に代謝や生体信号に対する研究に対しての利用が期待される。
【０００５】
発明者の一人である何森健は、４炭糖、５炭糖、６炭糖についてのイズモリング（Izumoring）連携図を特許文献２で公表しその有用性を示している。すなわち、図６で示される生産過程と分子構造（D型、L型）により、炭素数４から６の単糖全てをつないだ連携図が、イズモリング（Izumoring）の全体図である。すなわち、図６から理解できることは、単糖は、炭素数４、５、６全てがつながっているということである。全体図は、イズモリングＣ６の中でのつながりと、イズモリングＣ５の中でのつながりと、イズモリングＣ４の中でのつながりと、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６が全てつながっていることである。この考え方は重要である。炭素数を減少させるには主に発酵法を用いる。炭素数の異なる単糖全てをつなぐという大きな連携図であることも特徴である。
【０００６】
炭素数が６つの単糖（ヘキソース）のイズモリングは、図６の下段および図７、さらに図１０に示すように、炭素数が６つの単糖（ヘキソース）は全部で３４種類あり、アルドースが１６種類、ケトースが８種類、糖アルコールが１０種類ある。希少糖とは自然界に希にしか存在しない単糖（アルドース、ケトース）およびその誘導体（糖アルコール）と定義づけることができる。この定義は糖の構造や性質による定義ではないため、あいまいである。すなわち、一定量以下の存在量を希少糖というなどの量の定義はなされていないためである。しかし、一般に自然界に多量に存在するアルドースとしてはＤ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノースの６種類あり、それ以外のアルドースは希少糖と定義される。ケトースとしては、Ｄ−ラクトースが存在しており、他のケトースは希少糖といえる。他のケトースとして、Ｄ−プシコース、Ｄ−タガトース、Ｄ−ソルボース、Ｌ−フラクトース、Ｌ−プシコース、Ｌ−タガトース、Ｌ−ソルボースが挙げられる。また糖アルコールは単糖を還元してできるが、自然界にはＤ- ソルビトールが比較的多いがそれ以外のものは量的には少ないので、これらも希少糖といえる。
これらの糖は、酸化還元酵素の反応、アルドース異性化酵素の反応、アルドース還元酵素の反応で変換できることは、本発明者らの研究を含めた研究で知られている。Ｄ−グルコース（ブドウ糖）やＤ− フラクトースは自然界に多量に存在する糖であり安価であるが、これらから希少糖を合成することができなかった。ところが、新規な酵素が発見された。それはガラクチトールからＤ−タガトースを合成する酵素を持つ菌の培養液中に、全く予期しなかったＤ−ソルボースが発見されたことに端を発する。その原因を調べた結果、この菌がＤ−タガトース３エピメラーゼ（ＤＴＥ）という酵素を産生していることを発見した（特許文献３）。このＤＴＥはこれまでつながらなかったＤ−タガトースとＤ−ソルボースの間をつなぐ酵素であることがわかる。そしてさらに驚くことに、このＤＴＥは全てのケトースの３位をエピ化する酵素であり、これまで合成接続できなかったＤ−フラクトースとＤ−プシコース、Ｌ−ソルボースとＬ−タガトース、Ｄ−タガトースとＤ−ソルボース、Ｌ−プシコースとＬ−フラクトース、に作用するという非常に幅広い基質特異性を有する、すなわち非常に幅広く基質を選択できるというユニークな酵素であることが分かった。このＤＴＥの発見によって、すべての単糖がリング状につながり、単糖の知識の構造化が完成し、イズモリング（Izumoring）と名付けた。
この図７をよく見てみると、左側にＬ型、右側にＤ型、真ん中にＤＬ型があり、しかもリングの中央（星印）を中心としてＬ型とＤ型が点対称になっていることもわかる。例えば、Ｄ−グルコースとＬ−グルコースは、中央の点を基準として点対称になっている。しかもイズモリング（Izumoring）の価値は、全ての単糖の生産の設計図にもなっていることである。先の例で、Ｄ- グルコースを出発点としてＬ−グルコースを生産しようと思えば、Ｄ−グルコースを異性化→エピ化→還元→酸化→エピ化→異性化するとＬ−グルコースが作れることを示している。
炭素数が６つの単糖（ヘキソース）のイズモリング（Izumoring）を使って、自然界に多量に存在する糖と微量にしか存在しない希少糖との関係が示されている。Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンノースと、牛乳中の乳糖から生産できるＤ−ガラクトースは、自然界に多く存在し、それ以外のものは微量にしか存在しない希少糖と分類される。ＤＴＥの発見によって、Ｄ−グルコースからＤ−フラクトース、Ｄ−プシコースを製造し、さらにＤ−アロース、アリトール、Ｄ−タリトールを製造することができるようになった。希少糖Ｄ−プシコースは、これまで入手自体が困難であったが、自然界に多量に存在する単糖から希少糖を大量生産する方法が開発されつつあり、その技術を利用して製造することができる。
炭素数が６つの単糖（ヘキソース）のイズモリング（Izumoring）の意義をまとめると、生産過程と分子構造（Ｄ型、Ｌ型）により、すべての単糖が構造的に整理され（知識の構造化）、単糖の全体像が把握できること、研究の効果的、効率的なアプローチが選択できること、最適な生産経路が設計できること、欠落部分について予見できること、が挙げられる。
【０００７】
炭素数が５つの単糖（ペントース）のイズモリングは、図６の中段および図８に示すように、炭素数６のイズモリングよりも小さいリングである。しかし、Ｃ６のイズモリングと同じようにアルドース８個、ケトース４個および糖アルコール４個全てを含むことに変わりは無く、全てが酵素反応で結ばれる。異なる点は、酸化還元反応、異性化反応のみでリング状に全てが連結できることである。一方、ＤＴＥを用いることによって、さらに効率のよい生産経路が設計できることがわかる。炭素数５のイズモリングの特徴は、特に図８から明らかなように、炭素数６のイズモリングが点対象に全単糖が配置されているのに対し、左右が対象に配置されていることが大きな特徴である。これら全ペントースは、酵素反応により連結されていることから、炭素数６のイズモリングの場合と全く同様に、すべてのペントースが構造的に整理され（知識の構造化）、全体像が把握できること、研究の効果的、効率的なアプローチが選択できること、最適な生産経路が設計できること、欠落部分について予見できる意義を持っている。
炭素数が４つの単糖（テトロース）のイズモリングは、図６の上段および図９に示すように、テトロースの構造上の特性のため、リングが完成しないという特徴がある。炭素数５のイズモリング上部半分の構造を持っている。このリングの場合も、炭素数５，６の場合と同様の酸化還元および異性化反応によって連結されている。ＤＴＥが炭素数４のケトースに反応しないため、ケトース間の反応は現在のところ存在しない。しかし、新規のエピメラーゼの存在が予測され、この研究は現在研究途上である。
全体の配置は、炭素数５と同様に左右対称であり、アルドース４個、ケトース２個および糖アルコール３個全てを含んでいる。すなわち炭素数５，６のイズモリングと同様の意義が存在する。
イズモリングＣ６のＤ- グルコースは、イズモリングＣ５のＤ−アラビトールおよびイズモリングＣ４のエリスリトールとつながっている。この線は、発酵法によってＤ−グルコースからＤ−アラビトールおよびエリスリトールを生産できることを示している。すなわち、イズモリングＣ６，イズモリングＣ５およびイズモリングＣ４は連結されている。この連結は、炭素数の減少という主に発酵法による反応であり、このＤ−アラビトールおよびエリスリトールへの転換反応の二つ以外の発酵法によるイズモリングＣ６とイズモリングＣ５，Ｃ４との連結は可能である。例えばＤ−グルコースからＤ−リボースの生産も可能である。
このように、３つのイズモリングにより全ての炭素数４，５，６の単糖（アルドース、ケトース、糖アルコール）が連結されたことで、それぞれの単糖が全単糖の中でその存在場所を明確に確認できる。最も有名なキシリトールは、未利用資源の木質から生産できるＤ−キシロースを還元することで容易に生産できることを明確に確認できる。
もしも特定の単糖が生物反応によって多量に得られた場合には、それを原料とした新たな単糖への変換の可能性が容易に見いだすことが可能である。すなわち、この全体像から全ての単糖の原料としての位置を確実につかむことができるため、有用な利用法を設計することができる。特に廃棄物や副産物から単糖が得られた場合の利用方法を容易に推定できるのである。
【０００８】
単糖類を還元すると、アルデヒド基およびケトン基はアルコール基となり、炭素原子と同数の多価アルコール、すなわち糖アルコールとなる。還元糖は食品等の分野で有用なものが多く、例えばＬ−アラビノースは、五炭糖で、蔗糖に近い味質を持ち、難吸収性のノンカロリーな糖質である。また蔗糖やマルトースなどの二糖が体内に吸収される際に作用する二糖水解酵素を阻害することが知られており、ダイエット用甘味料や糖尿病患者用甘味料としての利用が期待されている。また、Ｌ−アラビノースは医薬品の合成原料としても有用な糖である。
還元糖を取得する場合、その由来を天然物に求めることが行われている。例えば、Ｌ−アラビノースを取得する手段として、最近では、コーンファイバーやアラビアガム、ビートパルプなどに酵素や酸を作用させるＬ−アラビノースの製造法が開発されている。原料となるアラビナン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン等の粗繊維はペクチン質や不要な粗繊維等と混在して存在する場合が多く、これらを酵素分解や酸加水分解処理することによって得られる溶液の中にはＬ−アラビノース等の還元糖の他に、ペクチン質や粗繊維、またこれらの分解物が混在している。Ｌ−アラビノースを精製する方法に関しては、Ｌ−アラビノース含有糖液中のキシロースおよびオリゴ糖と目的のＬ−アラビノースをイオン交換樹脂によるクロマトグラフィーで分画する方法や、多糖、オリゴ糖や塩類との分離を目的としたイオン交換樹脂によるクロマトグラフィー、膜処理等が提案されている。
一方、単糖の中で炭素が直鎖状に結合していない分岐した単糖である、４−Ｃ−メチルペントースについては、有効な製造法および物質として認知されているものはほとんどなく、製造法についての確立が第一に要望されている。
【０００９】
【特許文献１】特表２００６- ５１５８８３号公報
【特許文献２】ＷＯ２００４／０６３３６９号公報
【特許文献２】特許３３３３９６９号公報
【非特許文献１】G.E.Edelman, Spektrum Wiss. １９６４(６)，６２
【非特許文献２】V.Ginsburg, Adv. Enzymol. ３６，(１９７２)，１３１
【非特許文献３】G.M.W.Cook, E.W. Stoddart,“Surface Carbohydratesof theEucaryotic Cell", Academic Press, London, １９７３
【非特許文献４】P.Albersheim, A.G. Darvill, Spektrum Wiss. １９８５(１１), ８６
【非特許文献５】T.W.Rademacher,R.B. Parekh, R.A. Dwek, Ann. Rev. Biochem., ５７，(１９８８), ７８５
【非特許文献６】T.Reichstein, E. Weiss, Adv. Carbohydr. Chem. １７, (９１６２〔sic〕), ６５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
単糖は炭素が直鎖状に４，５、あるいは６個並んだ、テトロース、ペントースそしてヘキソースが一般的である。しかし工業的に単糖の直鎖状態ではなく分岐した構造をもつ単糖を製造することは極めて困難であり、容易な製造法の確立が強く望まれる。
そこで、ブランチ・イズモリングの構築とそれを利用した体系的な４位が分岐しＣメチル化されたペントースの製造法を確立することを目的とする。
すなわち、本発明は、２−あるいは４−位がメチル化されたペンチトール（２位あるいは４位がメチル化したペンチトールは命名法によっては同一のものでも別名で呼ばれることがある）のメチル基を４位とした場合に２位を微生物酸化することで、４−Ｃ−メチルケトペントースの製造。そして、４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素を作用させることによって全ての４位が分岐したケトペントースを生産することを目的とした。
４−Ｃ−メチルケトースの４種が生産できれば、それをアルドースイソメラーゼによって４−Ｃ−メチルアルドースへ、また、還元することで４−Ｃ−メチルペンチトールを得ることが可能となり、新しい構造を持つ糖の一群；４位がメチル化された分岐ペントースの全てを生産することが可能となる。（図１）
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素の製造法の確立に鋭意研究を行ってきた。その中で、シュードモナス チコリ ＳＴ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３６）由来のＤ- タガトース ３- エピメラーゼが、４−Ｃ−メチルケトペントース(例えば４―Ｃ−メチルＤ―キシルロース)を基質として対応する４―Ｃ−メチルケトペントース（例えば４―Ｃ−メチルＤ―リブロース）を生成することを発見した。
また４―Ｃ−メチルケトペントースは、４―Ｃ−メチルペンチトールを微生反応により２位を酸化することで得られることを見出した。
この発見によって全ての４種の、４−Ｃ−メチルケトペントース；４―Ｃ−メチルＤ―キシルロース、４―Ｃ−メチルＬ−キシルロース、４―Ｃ−メチルＤ―リブロースおよび４―Ｃ−メチルＬ−リブロースを生産することができた。これらの酸化・エピ化・異性化を関連する構造と反応をもとに配置することで、ブランチ・イズモリング（図１）を完成した。
【００１２】
本発明の４−Ｃ−メチルケトペントースの製造方法。本発明における４−Ｃ−メチルケトペントース製造法は、大きく二つの反応による。第一の反応は、４−Ｃ−メチルペンチトールを微生物酸化して、４−Ｃ−メチルケトペントースへ転換する方法。第二は、４−Ｃ−メチルケトペントースを４−Ｃ−メチルケトペントースの３位をエピ化する活性を有する、４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素による対応する４−Ｃ−メチルケトペントースの生産法である。
【００１３】
第一のポリオールからケトースへ酸化する方法
＜４−Ｃ−メチルポリオールから４−Ｃ−メチルケトペントースの生産＞
４−Ｃ−メチルポリオールを原料として用い、２位を特異的に微生物を用いて酸化することによって、４−Ｃ−メチルケトペントースを製造する方法。この場合には、これまでのイズモリングの経験から、ポリオールのケトースへの酸化は微生物反応を用いる必要がある。それはＮＡＤなどの補酵素の再生系を組み込んだバイオリアクターを構築することは、現在のところ効率が悪いことが分かっていること。各種のポリオールは効率よく、２位を酸化して対応するケトースを生産することが可能である。
そこでこの場合の基質であるポリオールは、４位にメチル基が結合した従来の通常のポリオールではない、枝分かれしたポリオールであるので酸化されるかどうかは、まず基質が微生物の体内に入る関門が第一、第二にそれがポリオール脱水素酵素の基質になるかどうかの関門であった。
実際に検討した結果、直鎖のポリオールと同様の酸化によるケトースへの転換活性が認められたので本研究は完成できた。
第一のポリオールからケトースへ酸化する方法は、微生物による酸化が、Gluconobacter thailandicus NBRC 3254を用いることを特徴とする。
＜Gluconobacter thailandicus NBRC 3254について＞
本微生物は工業的にＤ−ソルビトールからＬ−ソルボースを製造する時に用いられる酢酸菌である。われわれはこのポリオールの２位を酸化してケトール生産する能力を利用することで、各種希少糖ケトースを生産することに利用してきた。例えば、アリトールの２位を酸化することでＬ−プシコースを効率よく生産することに成功している。（参考文献；Journal of Fermentation and Boiengineering Vol. 81, 212-215 (1996)）
【００１４】
第二のケトースをエピ化する方法
〈４−Ｃ−メチルケトペントースを対応する３位のエピマーへのエピ化反応〉
４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素を用いて、４−Ｃ−メチルポリオールから生産した４−Ｃ−メチルケトペントースの３位をエピ化し、４−Ｃ−メチルＤ−キシルロース、４−Ｃ−メチルＬ−キシルロース、４−Ｃ−メチルＤ−リブロースおよび４−Ｃ−メチルＬ−リブロースを生産する方法である。
４位にメチル基が結合した分岐したケトースの３位をエピ化する酵素の存在は、全く知られていないし、そのような酵素を検索したこともないものであった。実際の実験を進める中で、イズモリングにおいてケトヘキソースおよびケトペントースの３位をエピ化する酵素として用いたＤ−タガトース３−エピメラーゼがこの活性を持っていることを発見した。そのため第二の方法が完成できた。
使用する酵素は以下の性質を持った酵素である。
４−Ｃ−メチルケトペントースに作用し、３位をエピマー化し対応する４−Ｃ−メチルケトペントースを生成する、４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素であると言える。この酵素はシュードモナス属に属する細菌から得ることのできるＤ−タガトース３−エピメラーゼと同一の酵素である。その性質は、
１）全４種の４−Ｃ−メチルケトペントース作用し、３位をエピマー化することで、対応する４−Ｃ−メチルケトペントースを生成する。
２）４−Ｃ−メチルケトペントース異性化活性の至適ｐＨおよびｐＨ安定性は、ｐＨ７〜１０に至適ｐＨを有し、ｐＨ５〜１０で安定。
３）４−Ｃ−メチルケトペントース異性化活性の至適温度および熱安定性６０℃付近に至適温度を有し、５０℃以下で安定。
４）紫外線吸収スペクトル２７５乃至２８０ｎｍに吸収帯を示す。
５）分子量４１，０００±３，０００（ゲル濾過クロマトグラフィーによる）。
６）本４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素は、シュードモナス チコリ ＳＴ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３６）由来の酵素である。
【００１５】
すなわち、本発明は、以下の（１）ないし（３）に記載の４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素を要旨とする。
（１）ケトペントースの４位にメチル基が結合した、４種存在する全ての４−Ｃ−メチルケトペントースに作用し３位をエピマー化することによって、対応するエピマーを生産する、シュードモナス属に属する細菌から得ることのできる４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素。
（２）下記の理化学的性質を有する（１）に記載の４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素。
１）全４種の４−Ｃ−メチルケトペントース作用し、３位をエピマー化することで、対応する４−Ｃ−メチルケトペントースを生成する。
２）４−Ｃ−メチルケトペントース異性化活性の至適ｐＨおよびｐＨ安定性は、ｐＨ７〜１０に至適ｐＨを有し、ｐＨ５〜１０で安定。
３）４−Ｃ−メチルケトペントース異性化活性の至適温度および熱安定性６０℃付近に至適温度を有し、５０℃以下で安定。
４）紫外線吸収スペクトル２７５乃至２８０ｎｍに吸収帯を示す。
５）分子量４１，０００±３，０００（ゲル濾過クロマトグラフィーによる）。
（３）シュードモナス チコリ ＳＴ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３６）由来の酵素である（１）または（２）に記載の４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素。
【００１６】
また、本発明は、以下の（４）ないし（９）に記載の４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法を要旨とする。
（４）（１）、（２）または（３）に記載の４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素を、４−Ｃ−メチルケトペントースに作用させ、遊離の分岐ケトースのままでエピマー化することによって、３位をエピマー化した対応する４−Ｃ−メチルケトペントースを生成することを特徴とする４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
（５）原料である４−Ｃ−メチルＤ−リブロースまたは、４−Ｃ−メチルＬ−リブロースの３位をエピ化し、対応する、４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースまたは、４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースを製造することである（４）に記載の４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
（６）４−Ｃ−メチルケトペントースが、２−Ｃ−メチルペンチトールあるいは４−Ｃ−メチルペンチトールを原料として、微生物による酸化で得られたものである（４）または（５）に記載の４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
（７）微生物による酸化が、Gluconobacter thailandicus NBRC 3254を用いることを特徴とする（６）に記載の４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
（８）２−Ｃ−メチルペンチトールあるいは４−Ｃ−メチルペンチトールを原料として、４種全ての４位にメチル基を有するケトペントースを製造することを特徴とする（６）または（７）に記載の４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
（９）２−Ｃ−メチルＤ−アラビニトールまたは２−Ｃ−メチルＤ−リビトールを微生物によって２位を酸化し、４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースまたは４−Ｃ−メチルＬ−リブロースをそれぞれ生産し、これを４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素を用いてエピ化し４−Ｃ−メチルＤ−リブロースまたは４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースを生産することによって、全ての４位で分岐した４種のケトペントース；４−Ｃ−メチルＤ−キシルロース、４−Ｃ−メチルＤ−リブロース、４−Ｃ−メチルＬ−リブロースおよび４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースを製造することを特徴とする（８）に記載の４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
【００１７】
さらにまた、本発明は、以下の（１０）に記載の新規化合物を要旨とする。
（１０）（９）に記載された方法で製造された以下の新規化合物。
４−Ｃ−メチルＤ−キシルロース、４−Ｃ−メチルＬ−キシルロース、４−Ｃ−メチルＤ−リブロースおよび４−Ｃ−メチルＬ−リブロース。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、遊離のケトペントースの４位をメチル化した、分岐ケトペントースに作用する４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素、それを用いる４位をメチル化した４種の分岐ケトペントースの製造方法、並びに、生産された４−Ｃ−メチルケトペントースを提供することができる。
【００１９】
また、自然界に希にしか存在しない単糖およびその誘導体（アルドース、ケトースおよび糖アルコール）である希少糖について、炭素数が６つの単糖およびその誘導体（ヘキソース）のイズモリング（Izumoring）は、自然界に多量に存在する糖と微量にしか存在しない希少糖との関係、それを得るための出発原料および経路が体系的に示されているが、本発明により、これまで全く研究されてされていない、４位で分岐したペントースに関する分野の研究開発に道を開き、新しい用途を開発できる可能性を明らかにしたといえる。
図１で示したように、ブランチ・イズモリングとして全体像を理解できることによって、分岐した全く新規な希少糖の研究への基盤を作ることを意味している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
上記のように、本発明者らは、４−Ｃ−メチルケトペントースを、遊離の４−Ｃ−メチルケトペントースの糖質のままで容易にエピマー化しうるエピメラーゼの検索を鋭意続けてきた。その結果、従来知られているＤ- ケトヘキソース ３- エピメラーゼであるＤ- タガトース ３- エピメラーゼ（特許第３３３３９６９号）が、ケトヘキソースおよびケトペントースのみならず、対応する４−Ｃ−メチルケトペントースにも作用し、３位をエピマー化したデオキシ体を得ることができることを発見し、該酵素を利用した全４−Ｃ−メチルケトペントースの製造方法を確立した。また４−Ｃ−メチルケトペントースを４−Ｃ−メチルペンチトールを酸化できる微生物反応を見出すことで、全４種の４−Ｃ−メチルケトペントースの生産法を完成した。
【００２１】
なお、エピメラーゼは、エンザイム ノメンクレイチャー（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）（アメリカ合衆国、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．１９９２年）によると、各種の糖質に作用することが知られている。しかしながら、これまでに知られているエピメラーゼは、例えば、リブロースリン酸塩 ３- エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．３．１）やＵＤＰ−グルコース ４−エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．３．２）などのように主としてリン酸化された糖質やＵＤＰなどと結合した糖質に作用するものであり、遊離の中性の糖質を製造する工業用途には、使えないものであった。
一方、遊離の糖質に作用するエピメラーゼについては、アルドースに作用する二例、アルドース １- エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．３．３）およびセロピオース エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．３．１１）または、ケトースに作用するＤ- ケトヘキソース ３- エピメラーゼが知られているのみである。アルドース １- エピメラーゼは、アルドースの１位のα、βアノマー間のエピマー化を触媒し、セロビオース エピメラーゼは、同様に、セロビオースのα、βアノマー間を触媒する酵素である。また、Ｄ- ケトヘキソース ３- エピメラーゼはケトヘキソースの3位を触媒する酵素であるが、デオキシ体に作用するかどうかは知られていなかった。
【００２２】
すなわち、本酵素（シュードモナス属に属する細菌から得ることのできるデオキシケトヘキソース異性化酵素、Ｄ- ケトヘキソース ３- エピメラーゼ）は、以下の化合物間の反応を触媒することを発見した。
（ｉ）４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースの４−Ｃ−メチルＤ−リブロースへのエピマー化反応もしくはその逆反応、
（ii）４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースの４−Ｃ−メチルＬ−リブロースへのエピマー化反応もしくはその逆反応、
【００２３】
また、これまでのアルドースイソメラーゼの研究の成果から考えると、４−Ｃ−メチルケトペントースと４−Ｃ−メチルアルドペントースを、遊離の４−Ｃ−メチルケトペントースへ容易に異性化することができる。
よって、本発明は、製造した４−Ｃ−メチルケトペントースを対応する４−Ｃ−メチルアルドペントースへと変換し製造することが可能となったと言える。
【００２４】
また４−Ｃ−メチルアルドペントースは、アルドースの特性としてラネーニッケルなどの触媒存在下において対応する４−Ｃ−メチルペンチトールを生産可能であることは容易である。
【００２５】
本発明は、４種全ての４−Ｃ−メチルケトペントースを製造する製造方法を確立し、提供する。
【００２６】
本発明の４−Ｃ−メチルケトペントースの製造方法は、Ｄ- ケトヘキソース ３- エピメラーゼが、４−Ｃ−メチルケトペントースの３位をエピマー化し、対応する４−Ｃ−メチルケトペントースを生成する活性を有することを新たに発見し、全ての４−Ｃ−メチルケトペントースを製造できる手段を提供する。
用いるＤ- ケトース ３- エピメラーゼは、４−Ｃ−メチルケトペントースの３位をエピマー化するものが選ばれるが、特許３３３３９６９号に記載のものが、反応活性が高く好ましい。
【００２７】
本発明に用いられるＤ- タガトース３- エピメラーゼの主な理化学的性質は、特許第３３３３９６９号明細書に記載されているが、４−Ｃ−メチルケトペントースに対する性質を下記に示す。
（１） 作用および基質特異性４−Ｃ−メチルケトペントースの３位をエピマー化し、対応する４−Ｃ−メチルケトペントースを生成する。
（２） 至適ｐＨおよびｐＨ安定性ｐＨ７〜１０に至適ｐＨを有し、ｐＨ５〜１０で安定。
（３） 至適温度および熱安定性６０℃付近に至適温度を有し、５０℃以下で安定。
【００２８】
本発明のＤ- タガトース ３- エピメラーゼすなわちＤ- ケトヘキソース ３- エピメラーゼは、通常、特許第３３３３９６９号明細書で開示されている方法でシュードモナス チコリ ＳＴ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３６）およびその変異種などを用いることにより生産できる。
【００２９】
すなわちシュードモナス チコリ ＳＴ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３６）を、常法に従って、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンなどを含有する栄養培地に１〜５日間程度培養、望ましくは、液体培地に通気撹拌などにより好気的条件下で培養し、得られる菌体または培養液上清などの培養物からＤ- タガトース ３- エピメラーゼを抽出する。通常、培養物を粗Ｄ- ケトヘキソース ３- エピメラーゼとして利用することができる。必要ならば、培養物を濾過、遠心分離、塩析、透析、濃縮、凍結乾燥など公知の方法で部分精製して利用することができる。さらにイオン交換体への吸着溶出、ゲル濾過、等電点分画、電気泳動、高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体への吸着溶出などを組合せて高度に精製したものも利用することも可能である。このようにして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に、単一にバンドを示すまで精製したＤ- タガトース３ エピメラーゼは、Ｄ- ケトヘキソースの３位のＯＨ基をエピマー化する。また、驚くことに、本酵素は、４−Ｃ−メチルケトペントースに対しても、エピメラーゼ活性を示すことがわかった。
【００３０】
この変換反応は、通常、次の条件で行なわれる。基質濃度は１〜６０ｗ／ｖ％、望ましくは約５〜５０ｗ／ｖ％、反応温度は１０〜７０℃、望ましくは約３０〜６０℃、反応ｐＨは５〜１０、望ましくは約７〜１０、酵素活性は基質グラム当り１単位以上、望ましくは、５０〜５，０００単位の範囲から選ばれる。反応時間は、適宜選択できるが、経済性との関係で、バッチ反応の場合には、通常、５〜５０時間の範囲が選ばれる。
なお上記の酵素活性単位は、タガトース ３−エピメラーゼ活性に対する酵素単位とし、次のようにして測定される。
すなわち、５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７ ．５ ）１００ μｌ 、４０ｍＭＤ- タガトースを５０μｌ および酵素液５０ μｌ含む溶液（または懸濁液）を３０ ℃で６０分間インキュベートし、生成物であるＤ−ソルボースをＨＰＬＣにより測定した。酵素活性１単位は１分間に１μｍｏｌ のＤ−タガトースをエピマー化し、Ｄ− ソルボースを生成する酵素量とした。
【００３１】
このようにして変換させた反応溶液は、原料の４−Ｃ−メチルケトペントースと新たに生成した４−Ｃ−メチルケトペントース（原料のエピマー）とを含有しており、必要ならば、この濃縮液を、例えば、アルカリ金属型またはアルカリ土類金属型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、新たに生成したデオキシケトースと原料デオキシケトースとを分離精製し、新たに生成したデオキシケトース高含有画分を濃縮し、シラップ状製品を得ることができる。また、結晶化が可能である場合には、晶出させて結晶状製品を得ることも有利に実施できる。また、この分離された原料の４−Ｃ−メチルケトペントースを、再度、変換反応の原料に用いることもできる。
【００３２】
以下、幾つかの実施例により本発明の詳細を述べるが、これらの実施例により、本発明が限定されることはない。
【実施例１】
【００３３】
第一の方法のポリオールからの生産法の実施例である。
［２−Ｃ−メチルＤ−アラビニトールから４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースの生産］
２−Ｃ−メチルＤ−アラビニトールの２位を酸化して、４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースを生産する微生物を検索した。その結果Gluconobacter thailandicus NBRC 3254に強い活性が存在することを見出した。
＜Gluconobacter thailandicus NBRC 3254 の培養条件＞
菌株の保存培地は２％寒天を含む、０．５％ポリペプトン、０．５％酵母エキスに０．５％の食塩と１％Ｄ−グルコースを加えｐＨ７に調整したものを用いた。反応に用いる微生物の生育培地は0.5% Polypepton, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl and 1% glucose in
water pH adjusted to 7を用いた。微生物の培養条件は、５００ｍｌ容三角フラスコに上記培地２００ｍｌを入れて一分間２００回転の速度で回転し、反応は２４時間、反応温度は３０℃で行った。
【００３４】
＜微生物を用いた酸化反応条件＞
反応条件は０．０５ＭのトリスＨＣｌ緩衝液ｐＨ８を用い、菌体濃度はＡ６００nmの吸光度が３０となるように調整して用いた。反応は２０時間行い１００rpmの撹拌条件で行った。２−Ｃ−メチルＤ−アラビニトールの酸化反応は、基質濃度は１〜１０％で転換は１００％の転換率で進んだ。
【００３５】
＜生産物の精製と純度の検定＞
脱イオンはSKIB (H+; Mitsubishi Chemical, Tokyo)Amberlite IRA-41 I(Co3 2- ; Organo, Tokyo)の混合樹脂を用いて行なった。他の不純物からの分離は、カラムクロマトグラフィーを用い、分離樹脂は Dowex 5OW-X2 (The Dow Chemical, MI, USA) の Ca 2+
型を用いて行い、溶出液としては水を用いた。 純度の検定はＨＰＬＣを用いて行なった。ＨＰＬＣ分析条件は、検出器にはShimadzu RID-6A を用い、移動相１０−４ＮａＯＨＭ、流速１．０ｍｌ／min、カラムはHITACHI GL-C611 を用いた。カラム温度は６０℃で分析を行った。分析試料はDiaionSK-1B, AmberliteIRA-411 で脱塩したものを0.45μm の面ブランフィルターでろ過したものを用いた。ＨＰＬＣの結果は、図２（ｂ）４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースのＨＰＬＣ分析結果に示すようにほぼ純粋であった。
【００３６】
＜生産物の同定＞
生産物の精製標品を得るまでの収率は７０％であった。その旋光度は-７．１５[oil, [a]D20-7.15 (c, 1.0 in water)]であった。ＮＭＲを用いたを行なった。分析条件は、１０〜１５mg の４−Ｃ−メチルＤ−リブロースをエッペンドルフチューブに入れ、６００μL の重水を添加した。チューブの口をパラフィルムで覆い、爪楊枝で３箇所ほど開け、ディープフリーザーで凍結させた。これを凍結乾燥し、再び６００μLの重水を添加し、凍結乾燥した。乾燥後、予めＴＳＰ（３- methylsilyl propionic 2,2,3,３- d4 acid）を１％になるように調製した６００μLの重水を添加して溶解した。これをＮＭＲのガラス管に入れて測定を行った。
測定結果は、図２（ｂ）４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースのＨＰＬＣ分析結果に示した。表２に示すような結果を得ており、本物質の構造を確認できた。水溶液中におけるアノマーの存在比も明らかにできた。
【実施例２】
【００３７】
第一の方法のポリオールからの生産法の実施例である。
［２−Ｃ−メチルＤ−リビトールから４−Ｃ−メチルＬ−リブロースの生産］
２−Ｃ−メチルＤ−アラビニトールから４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースの生産と同様にまず、２−Ｃ−メチルＤ−リビトールから４−Ｃ−メチルＬ−リブロースする微生物の検索を行なった。その結果、２−Ｃ−メチルＤ−アラビニトールから４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースに用いた同一の微生物が強い酸化活性を持つことを見出した。２−Ｃ−メチルＤ−リビトールと２−Ｃ−メチルＤ−アラビニトールの構造を比較すると、炭素２および３のＯＨの配位が同一のＬ−リブロ型であることから、同一の微生物が両者に活性を持っていると考えられた。
【００３８】
＜微生物の培養、酸化反応、精製、同定の条件＞
これらの条件は、２−Ｃ−メチルＤ−アラビニトールから４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースの生産の場合と全く同一である。
なお、純度をＨＰＬＣで検定した結果は 図３（ａ）４−Ｃ−メチルＬ−リブロースのＨＰＬＣ分析結果に示したとおり、ほぼ純粋であった。収率は６５％であり旋光度は-1.4 [oil, [a]D20 -1.4 (c, 1.0 in water)]であった。ＮＭＲの結果は 表２の４−Ｃ−メチルＬ−リブロースの欄と図４の下の４−Ｃ−メチルＬ−リブロースの1H NMRスペクトルに示した。構造を確認することができた。
【実施例３】
【００３９】
第二の方法のケトースの３位のエピ化酵素を用いた生産法の実施例である。
［４−Ｃ−メチルＤ−リブロースの４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースからの生産］
２−Ｃ−メチルＤ−アラビニトールから微生物反応で生産した４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースをＤ- タガトース３- エピメラーゼを用いてエピマー化することによって、４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースを生産した。
【００４０】
［Ｄ- タガトース ３- エピメラーゼの調製］
Pseudomonas cichorrii ST24株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３６）由来Ｄ- タガトース ３- エピメラーゼの遺伝子を大腸菌に形質転換し、組み換え大腸菌を培養して、Ｄ- タガトース ３- エピメラーゼを得た。
組換え大腸菌の大量培養後、得られた菌体を−８０℃で冷凍保存した。冷凍保存された菌体を氷中に３０分間放置し表面を解凍し、５０mMトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を用いて懸濁した。懸濁液２００mLを超音波ホモジナイザー SONIFIER２５０（ブランソン株式会社）を用い、４℃に保ちながら６分間破砕した。これを２度繰り返した。この液を４℃、１１５００rpmで２０分間遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。粉砕したポリエチレングリコール♯６０００を粗酵素液に重量に対して５％を、氷水浴中でマグネチックスターラーを用いて撹拌しながら徐々に添加し、添加後から１時間撹拌した。これを４℃、１１５００rpmで1時間遠心分離して上清を回収した。再びポリエチレングリコール♯６０００を上清の重量に対して２５％を、同様の操作で添加し、添加後から1時間撹拌した。これを４℃、１１５００rpmで1時間遠心分離して沈殿を回収した。この沈殿物に少量（菌体重量のおよそ５倍）の５０mMトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を加えて懸濁した。（これを、部分精製Ｄ- タガトース ３- エピメラーゼとした。）
【００４１】
［Ｄ- タガトース ３- エピメラーゼの活性測定］
Ｄ- タガトース ３- エピメラーゼの活性測定はＤ- タガトースを基質として反応を行い、生じたＤ- ソルボースの量をHPLC分析によって定量した。酵素反応は表１に示した組成で３０℃、１０、２０、３０分間反応させ、熱湯で２分間加熱することにより反応を停止し生じたＤ- ソルボース量を求め、１分間で１μmolのＤ- ソルボースを生産するＤ- タガトース ３- エピメラーゼ量を１Ｕ（単位）とした。
【００４２】
【表１】
【００４３】
得られた部分精製Ｄ- タガトース ３- エピメラーゼの性質は以下の通りであった。
（１） 作用および基質特異性は、１- または６- デオキシまたはＤ- またはＬ- ケトヘキソースの３位をエピマー化し、対応する１- または６- デオキシまたはＤ- またはＬ- ケトヘキソースを生成する。
（２） 至適ｐＨおよびｐＨ安定性ｐＨ７〜１０に至適ｐＨを有し、ｐＨ５〜１０で安定。
（３） 至適温度および熱安定性６０℃付近に至適温度を有し、５０℃以下で安定。
【００４４】
［Ｄ- タガトース ３- エピメラーゼの固定化］
Ｄ- タガトース ３- エピメラーゼの固定化をキトパールBCW２５１０を用いて行った。まず、５０mMトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を用いてキトパール樹脂を洗浄し、冷蔵庫内で一晩放置して平衡化を行った。次に上述の部分精製したＤ- タガトース ３- エピメラーゼ２００Ｕを１mL(湿重量約１g)のキトパール樹脂と混合し、時々撹拌しながら冷蔵庫内で２日間放置して酵素を固定化させた。同緩衝液にてキトパールを洗浄し、これを固定化酵素とした。
【００４５】
以下の実施例には、この固定化酵素を使って、デオキシケトヘキソースのエピマー化反応を実施した。
【実施例４】
【００４６】
第二の方法のケトースの３位のエピ化酵素を用いた生産法の実施例である。
［Ｄ- タガトース ３- エピメラーゼによる４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースの異性化（エピマー化）］
４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースをＢｒｉ×５％、２５mLになるように調製し、５００mL容量の三角フラスコに移した。そこに固定化Ｄ- タガトース ３- エピメラーゼ２５mL（５０００Ｕ相当）と１M トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を４０mL（終濃度約５０mM）添加し、４２℃、１２０rpmの条件で撹拌しながら反応させた。
１時間毎に反応液１０μL採取し、２９０μLの水で希釈（３０倍希釈）した。熱湯で２分間加熱した後、１２０００rpmで5分間遠心して上清を別のエッペンドルフチューブに移す。それに少量の脱塩樹脂（ＩＲＡ４１１：ＳＫＩＢ＝２：１の割合で混合し乾燥させたもの）を添加して転倒混和した。１時間後、この液を０．４５μmのフィルターを用いてろ過し、ＨＰＬＣに供試した。４−Ｃ−メチルＤ−リブロースと４−Ｃ−メチルＤ−キシルロース平衡比は、７０：３０であった。
【００４７】
［４−Ｃ−メチルＤ−リブロースの分離］
異性化反応後、ろ過により固定化酵素を除去した。脱塩樹脂（ＩＲＡ４１１（４０mL）とＳＫＩＢ（２０mL））を混合してオープンカラムに充填し、少しずつ糖液を流し込んで脱塩を行った。脱塩後、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。その後、０．２２μmのフィルターを用いてろ過し、ろ液をＢｒｉ×３０％に調製した。クロマト分離装置を用いて４−Ｃ−メチルＤ−リブロースを分離した。分離後、のＨＰＬＣ分析による純度は図２（ａ）４−Ｃ−メチルＤ−リブロースのＨＰＬＣ分析結果に示したとおりであった。
【００４８】
＜４−Ｃ−メチルＤ−リブロースの純度と構造の確認＞
精製した４−Ｃ−メチルＤ−リブロースの純度や、ＮＭＲによる構造決定を行なった。純度はＨＰＬＣでの分析結果は 図２（ａ）の４−Ｃ−メチルＤ−リブロースのＨＰＬＣ分析結果に示したとおりでありほぼ純粋であった。収率は５０％であり、旋光度は+2.7 [a]D20 +2.7 (c, 1.0 in water)] であった。ＮＭＲの結果は、表２の４−Ｃ−メチルＤ−リブロースの欄および図４の上の４−Ｃ−メチルＤ−リブロースの1H NMRスペクトルに示すとおりであり、構造を確認した。
【実施例５】
【００４９】
［４−Ｃ−メチルＬ−リブロースから４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースの生産］
ＤＴＥが４−Ｃ−メチルＤ−リブロースの４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースからの生産に利用できたこと同様に、ＤＴＥは４−Ｃ−メチルＬ−リブロースから４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースの生産の生産にも有効に利用できることが明らかになった。
【００５０】
＜４−Ｃ−メチルＬ−リブロースから４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースの生産＞
４−Ｃ−メチルＤ−リブロースの４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースからの生産に用いたと同じ酵素ＤＴＥを用いて、４−Ｃ−メチルＬ−リブロースから４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースの生産の生産を行なった。
【００５１】
＜反応、分離精製、構造確認＞
これらは、４−Ｃ−メチルＤ−リブロースの４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースからの生産の場合と同一の方法で行なうことが可能であった。
分離精製した４−Ｃ−メチルＬ−リブロースのＨＰＬＣの図３（ａ）が示すようにほぼ純粋であった。その収率は２５％であり、旋光度は+5.15[a]D20 +5.15 (c, 1.0 in water)]であった。ＮＭＲ分析の結果は、表２の４−Ｃ−メチルＬ−リブロースの欄と図４の下に示しており、構造を確認できた。４−Ｃ−メチルＬ−リブロースと４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースとの平衡比は６８：３２であった。
【００５２】
［４−Ｃ−メチルＤ−リブロースと４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースの構造解析］
ＮＭＲによる解析結果は表２と図３、図４のとおりである。図３は、４−Ｃ−メチル−リブロースの1H NMRスペクトルを測定して光学的対掌体を比較した結果を示す。上はD−体、下がL−体の1H NMRスペクトルである。図４は、４−Ｃ−メチル−キシルロースの1H NMRスペクトルを測定して光学的対掌体を比較した結果を示す。上はD−体、下がL−体の1H NMRスペクトルである。
【００５３】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の４−Ｃ−メチルケトペントースの製造方法は、４−Ｃ−メチルケペンチトールを微生物酸化することで、対応する４−Ｃ−メチルケトペントースを生産する。そしてＤ- ケトヘキソース３- エピメラーゼ（ＤＴＥ）が図１に示すように反応を順次進めていくことによって、全４種の４位がメチル基となった分岐ケトペントースを生産することができる。これらは化学的手法では生産が非常に困難である、新規物質である。この反応系は、従来、製造困難であった４種全ての４−Ｃ−メチルケトペントースの大量生産の道を拓くものである。従って、本発明のＤ- ケトヘキソース３- エピメラーゼであるＤ- タガトース３- エピメラーゼを用いた４−Ｃ−メチルケトペントースの製造方法並びに用途の確立は、食品産業のみならず、これに関連する食品、化粧品、医薬品産業における工業的意義が極めて大きい。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】４−メチル−ペントース イズモリングを製造する経路を示す。
【図２】精製した生産物である (a)４−Ｃ−メチルＤ−リブロース、(b) ４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースのＨＰＬＣ分析結果を示した。
【図３】精製した生産物である (a)４−Ｃ−メチルL−リブロース、(b) ４−Ｃ−メチルL−キシルロースのＨＰＬＣ分析結果を示した。
【図４】４−Ｃ−メチル−リブロースの1H NMRスペクトルを測定して光学的対掌体を比較した結果を示す。上はD−体、下がL−体の1H NMRスペクトルである。
【図５】４−Ｃ−メチル−キシルロースの1H NMRスペクトルを測定して光学的対掌体を比較した結果を示す。上はD−体、下がL−体の1H NMRスペクトルである。
【図６】４糖、５糖、６糖が連携したのイズモリングを製造する経路を示す。
【図７】６糖が連携したのイズモリングを製造する経路を示す。
【図８】５糖が連携したのイズモリングを製造する経路を示す。
【図９】４糖が連携したのイズモリングを製造する経路を示す。
【図１０】構造式とセットのイズモリングＣ６の説明図を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケトペントースの４位にメチル基が結合した、４種存在する全ての４−Ｃ−メチルケトペントースに作用し３位をエピマー化することによって、対応するエピマーを生産する、シュードモナス属に属する細菌から得ることのできる４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素。
【請求項２】
下記の理化学的性質を有する請求項１に記載の４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素。
（１）全４種の４−Ｃ−メチルケトペントース作用し、３位をエピマー化することで、対応する４−Ｃ−メチルケトペントースを生成する。
（２）４−Ｃ−メチルケトペントース異性化活性の至適ｐＨおよびｐＨ安定性は、ｐＨ７〜１０に至適ｐＨを有し、ｐＨ５〜１０で安定。
（３）４−Ｃ−メチルケトペントース異性化活性の至適温度および熱安定性６０℃付近に至適温度を有し、５０℃以下で安定。
（４）紫外線吸収スペクトル２７５乃至２８０ｎｍに吸収帯を示す。
（５）分子量４１，０００±３，０００（ゲル濾過クロマトグラフィーによる）。
【請求項３】
シュードモナス チコリ ＳＴ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３６）由来の酵素である請求項１または２に記載の４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素。
【請求項４】
請求項１、２または３に記載の４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素を、４−Ｃ−メチルケトペントースに作用させ、遊離の分岐ケトースのままでエピマー化することによって、３位をエピマー化した対応する４−Ｃ−メチルケトペントースを生成することを特徴とする４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
【請求項５】
原料である４−Ｃ−メチルＤ−リブロースまたは、４−Ｃ−メチルＬ−リブロースの３位をエピ化し、対応する、４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースまたは、４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースを製造することである請求項４に記載の４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
【請求項６】
４−Ｃ−メチルケトペントースが、２−Ｃ−メチルペンチトールあるいは４−Ｃ−メチルペンチトールを原料として、微生物による酸化で得られたものである請求項４または５に記載の４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
【請求項７】
微生物による酸化が、Gluconobacter thailandicus NBRC 3254を用いることを特徴とする請求項６に記載の４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
【請求項８】
２−Ｃ−メチルペンチトールあるいは４−Ｃ−メチルペンチトールを原料として、４種全ての４位にメチル基を有するケトペントースを製造することを特徴とする請求項６または７に記載の４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
【請求項９】
２−Ｃ−メチルＤ−アラビニトールまたは２−Ｃ−メチルＤ−リビトールを微生物によって２位を酸化し、４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースまたは４−Ｃ−メチルＬ−リブロースをそれぞれ生産し、これを４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素を用いてエピ化し４−Ｃ−メチルＤ−リブロースまたは４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースを生産することによって、全ての４位で分岐した４種のケトペントース；４−Ｃ−メチルＤ−キシルロース、４−Ｃ−メチルＤ−リブロース、４−Ｃ−メチルＬ−リブロースおよび４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースを製造することを特徴とする請求項８に記載の４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
【請求項１０】
請求項９に記載された方法で製造された以下の新規化合物。
４−Ｃ−メチルＤ−キシルロース、４−Ｃ−メチルＬ−キシルロース、４−Ｃ−メチルＤ−リブロースおよび４−Ｃ−メチルＬ−リブロース。
【請求項１】
ケトペントースの４位にメチル基が結合した、４種存在する全ての４−Ｃ−メチルケトペントースに作用し３位をエピマー化することによって、対応するエピマーを生産する、シュードモナス属に属する細菌から得ることのできる４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素。
【請求項２】
下記の理化学的性質を有する請求項１に記載の４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素。
（１）全４種の４−Ｃ−メチルケトペントース作用し、３位をエピマー化することで、対応する４−Ｃ−メチルケトペントースを生成する。
（２）４−Ｃ−メチルケトペントース異性化活性の至適ｐＨおよびｐＨ安定性は、ｐＨ７〜１０に至適ｐＨを有し、ｐＨ５〜１０で安定。
（３）４−Ｃ−メチルケトペントース異性化活性の至適温度および熱安定性６０℃付近に至適温度を有し、５０℃以下で安定。
（４）紫外線吸収スペクトル２７５乃至２８０ｎｍに吸収帯を示す。
（５）分子量４１，０００±３，０００（ゲル濾過クロマトグラフィーによる）。
【請求項３】
シュードモナス チコリ ＳＴ−２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７３６）由来の酵素である請求項１または２に記載の４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素。
【請求項４】
請求項１、２または３に記載の４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素を、４−Ｃ−メチルケトペントースに作用させ、遊離の分岐ケトースのままでエピマー化することによって、３位をエピマー化した対応する４−Ｃ−メチルケトペントースを生成することを特徴とする４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
【請求項５】
原料である４−Ｃ−メチルＤ−リブロースまたは、４−Ｃ−メチルＬ−リブロースの３位をエピ化し、対応する、４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースまたは、４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースを製造することである請求項４に記載の４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
【請求項６】
４−Ｃ−メチルケトペントースが、２−Ｃ−メチルペンチトールあるいは４−Ｃ−メチルペンチトールを原料として、微生物による酸化で得られたものである請求項４または５に記載の４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
【請求項７】
微生物による酸化が、Gluconobacter thailandicus NBRC 3254を用いることを特徴とする請求項６に記載の４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
【請求項８】
２−Ｃ−メチルペンチトールあるいは４−Ｃ−メチルペンチトールを原料として、４種全ての４位にメチル基を有するケトペントースを製造することを特徴とする請求項６または７に記載の４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
【請求項９】
２−Ｃ−メチルＤ−アラビニトールまたは２−Ｃ−メチルＤ−リビトールを微生物によって２位を酸化し、４−Ｃ−メチルＤ−キシルロースまたは４−Ｃ−メチルＬ−リブロースをそれぞれ生産し、これを４−Ｃ−メチルケトペントース異性化酵素を用いてエピ化し４−Ｃ−メチルＤ−リブロースまたは４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースを生産することによって、全ての４位で分岐した４種のケトペントース；４−Ｃ−メチルＤ−キシルロース、４−Ｃ−メチルＤ−リブロース、４−Ｃ−メチルＬ−リブロースおよび４−Ｃ−メチルＬ−キシルロースを製造することを特徴とする請求項８に記載の４位にメチル基を有するケトペントースの製造方法。
【請求項１０】
請求項９に記載された方法で製造された以下の新規化合物。
４−Ｃ−メチルＤ−キシルロース、４−Ｃ−メチルＬ−キシルロース、４−Ｃ−メチルＤ−リブロースおよび４−Ｃ−メチルＬ−リブロース。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００９−２５４２３８（Ｐ２００９−２５４２３８Ａ）
【公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１０３９１７（Ｐ２００８−１０３９１７）
【出願日】平成２０年４月１１日（２００８．４．１１）
【出願人】（５０６３８８０６０）合同会社希少糖生産技術研究所 (18)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月１１日（２００８．４．１１）
【出願人】（５０６３８８０６０）合同会社希少糖生産技術研究所 (18)
【Ｆターム（参考）】
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