ＡＢＬキナーゼのペプチド阻害剤
残基（１０）のチロシンがリン酸化されている配列番号１を含む精製された化合物が提供される。化合物のアミノ酸配列が４００未満のアミノ酸である、配列番号１を含む精製された化合物も提供される。その他に、ある薬剤がＡｂｌキナーゼの候補阻害剤であるかどうかを決定する方法も提供される。さらにＡｂｌキナーゼを阻害する方法も提供される。突然変異体Ａｂｌキナーゼによって特徴づけられる病気を有する患者を処置する方法も提供される。加えて、突然変異体Ａｂｌキナーゼによって特徴づけられる病気にかかるリスクのある患者を処置する方法も提供される。Ａｂｌキナーゼを標識化する方法も提供される。さらに、組織からＡｂｌキナーゼを単離する方法も提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００５年１２月１日に出願された、米国仮特許出願第６０／７４１，２０８号の利益を請求する。
【０００２】
（政府支援の研究または開発に関する陳述）
米国政府は、本発明における一括払いライセンスおよび特定の条件下における権利を有し、Ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｆｅｎｓｅにより与えられた助成金ＤＡＭＤ １７−０１−１−００９６１、ならびにＴｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅからの助成金Ｒ０１の条項によって規定されるように、特許権者が、適切な条件で第三者に許可を与えることを要求する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は一般にキナーゼ活性の調節に関する。とりわけ、本発明はＡｂｌキナーゼの阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００４】
（関連技術の記載）
非受容体チロシンキナーゼ類は、細胞外刺激の下流の細胞シグナリングの主要な調節物質である。遍在する非受容体チロシンキナーゼｃ−Ａｂｌは、増殖因子類、インテグリン、およびサイトカインシグナリングの下流の細胞増殖、アポトーシスにかかわっている（非特許文献１）。細胞増殖におけるｃ−Ａｂｌキナーゼの重要な役割は、ｃ−Ａｂｌのキナーゼ活性化突然変異型であるＢＣＲ−Ａｂｌの発現による慢性骨髄性白血球の発症によって説明される（Ｇｏｌｄｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｅｌｏ，２００３）。しかし、ＢＣＲ−Ａｂｌまたはｃ−Ａｂｌのキナーゼ活性が細胞において調節される仕組みは明らかでない。
【０００５】
ｃ−Ｓｒｃおよびｃ−Ａｂｌのような非受容体チロシンキナーゼ類の主要な調節機序として、自己阻害が明らかになってきた（非特許文献２；Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．２００３；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．２００３；Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｂｒｕｇｇｅ，１９９７；Ｗａｎｇ，２００４）。これらのキナーゼは高度に保存された構造ドメイン：ＳＨ３、ＳＨ２、および触媒ドメインの存在によって与えられる高い構造的相同性を共有する。ｃ−Ｓｒｃ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．１９９７；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．１９９９）およびｃ−Ａｂｌ（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．２００３；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．２００３）の結晶構造は、それらのＳＨ３およびＳＨ２ドメインが触媒ドメインに結合し、自己阻害コンフォメーションを誘起して、これらキナーゼの調節の基礎的機序となることを明らかにしている。一方で、これらキナーゼにはさらなる制約となる阻害を課する非相同配列があり、これによってｃ−Ｓｒｃおよびｃ−Ａｂｌの別の調節がもたらされる。この阻害はｃ−ＳｒｃにおいてＳＨ２ドメインと、同じ分子上のＣ−末端に位置するリン酸化チロシン５２７との分子内相互作用によって実現する（Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｂｒｕｇｇｅ，１９９７）。ｃ−Ａｂｌにおいては、この阻害機序以外には内部ホスホチロシン−ＳＨ２ドメイン相互作用はない。さらにｃ−Ｓｒｃとは対照的に、ｃ−Ａｂｌ上ではキナーゼドメインのＣ−末端部分に直接結合し、それによってその触媒ドメイン上のＳＨ３−ＳＨ２“クランプ”をさらにロックするミリストイル化キャップによってさらに制約となる阻害があらわれる。しかしこの“分子ロック”は、部分的キャップ領域だけを含むｃ−Ａｂｌ−１ａの非ミリストイル化形には存在しない。このキャップ領域のより包括的な役割はｃ−Ａｂｌの結晶構造からは認識できないが、このキャップ領域は接近しやすさ（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）の調節およびホスホチロシン含有ペプチドの結合に役割を果たすと考えられる（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．２００３）。
【０００６】
ｃ−Ａｂｌキナーゼに結合する種々のプロテインはｃ−Ａｂｌ共阻害剤であることが提起されている。プロテインＦ−アクチン、ＰａｇおよびＲｂはｃ−Ａｂｌの自己阻害されたコンフォメーションを安定化することによって受動的共阻害剤（ｐａｓｓｉｖｅ ｃｏ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）として作用すると仮定されている（Ｗａｎｇ，２００４）。候補ｃ−Ａｂｌ阻害剤の別のセット、Ａｂｉ１およびＡｂｉ２は、ｃ−Ａｂｌ−結合パートナーを同定する研究（Ｄａｉ ａｎｄ Ｐｅｎｄｅｒｇａｓｔ、１９９５；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．１９９５）並びに、ＥＳｂ１（ｅｐｓ８ＳＨ３結合プロテイン１−Ｂｉｏｓｏｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）およびＨｓｓｈ３ｂｐ１（ヒトスペクトリンＳｒｃ相同３ドメイン結合プロテイン１−Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．１９９８）と名付けられたその他のプロテインからＳＨ３ドメインの結合パートナーを同定する研究において単離された。ｃ−ＡｂｌキナーゼのシグナリングにおけるＡｂｉプロテインの阻害的役割は主として細胞増殖の調節におけるＡｂｉ１およびＡｂｉ２の阻害的役割に基づくことが提案されているが（Ｄａｉ ａｎｄ Ｐｅｎｄｅｒｇａｓｔ，１９９５；Ｍａｃｏｓｋａ ｅｔ ａｌ．２００１；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．１９９５）、それらの分子的機序は明らかでない。Ａｂｉ１およびＡｂｉ２は富プロリン−リンカーＰＲＬのｃ−ＡｂｌキナーゼＣ−末端ＰＸＸＰ配列（Ｄａｉ ａｎｄ Ｐｅｎｄｅｒｇａｓｔ，１９９５；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．１９９５）、およびｃ−Ａｂｌ ＳＨ３ドメイン（Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．１９９８）と相互作用する。こうして、このような機序の一つには、ＡｂｉのＰＸＸＰ配列およびＳＨ３ドメインと、ｃ−Ａｂｌ ＳＨ３ドメインおよびＰＲＬ領域との協力的結合による、ｃ−Ａｂｌキナーゼの自己阻害的コンフォメーションの強化が含まれると思われる。しかしｃ−ＡｂｌキナーゼおよびＡｂｉプロテインでは、ＳＨ２をベースとするキナーゼ調節機序は明らかにされていない。
【非特許文献１】Ｗｏｏｄｒｉｎｇ，Ｐ．Ｊ．， Ｈｕｎｔｅｒ，ＴおよびＷａｎｇｍ Ｊ．Ｙ．２００３年，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆ−ａｃｔｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｂｙ ｔｈｅ Ａｂｌ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１６，２６１３−２６１６
【非特許文献２】Ｃｏｕｒｔｎｅｉｄｇｅ，Ｓ．Ａ.，２００３，Ｃａｎｃｅｒ：Ｅｓｃａｐｅ ｆｒｏｍ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ４２２，８２７−８２８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の議論に基づき、ｃ−Ａｂｌ阻害におけるＡｂｉプロテインの役割を特徴づけることが必要である。本発明はこの要求に取り組むものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
よって、発明者はＡｂｌキナーゼを阻害するＡｂｉプロテインから誘導されるペプチドを同定した。実施例を参照されたい。
【０００９】
そこで本発明は残基１０のチロシンがリン酸化されている配列番号１を含む精製された化合物類に関するものである。
【００１０】
本発明は上記化合物のアミノ酸配列が４００未満のアミノ酸である配列番号１を含む精製化合物にも関わる。
【００１１】
本発明はさらに、ある薬剤がＡｂｌキナーゼの候補阻害剤であるかどうかを確認する方法にも関わる。これらの方法は上記化合物をＡｂｌキナーゼの存在下でこの薬剤と接触させ、上記化合物がＡｂｌキナーゼに結合するかどうかを評価することを含む。これらの方法において、上記化合物がＡｂｌキナーゼに結合しない場合はその薬剤はＡｂｌキナーゼの候補阻害剤であり、その化合物がＡｂｌキナーゼに結合する場合はその薬剤はＡｂｌキナーゼの候補阻害剤ではない。これらの方法によってＡｂｌキナーゼの阻害剤であると確認された薬剤、およびＡｂｌキナーゼをこれらの薬剤と接触させることによってＡｂｌキナーゼを阻害する方法も本発明の局面である。
【００１２】
本発明はさらにＡｂｌキナーゼを阻害する方法に関わる。これらの方法はＡｂｌキナーゼを上記化合物類の一つと接触させることを含む。
【００１３】
さらに、本発明は突然変異体Ａｂｌキナーゼによって特徴づけられる病気をもつ患者を処置する方法にも関わる。これらの方法は突然変異体Ａｂｌキナーゼを阻害する上記化合物のいずれかを上記患者に投与することを含む。
【００１４】
本発明は突然変異体Ａｂｌキナーゼによって特徴づけられる病気のリスクのある患者を処置する方法にも向けられる。これらの方法は突然変異体Ａｂｌキナーゼを阻害する上記化合物類のいずれかを上記患者に投与することを含む。
【００１５】
本発明はＡｂｌキナーゼを標識化する方法にも関わる。それらの方法はＡｂｌキナーゼと上記化合物類の一つとを、その化合物がＡｂｌキナーゼと相互作用する条件下で結合させることを含む。これらの方法に使用される化合物は検出可能部分も有する。
【００１６】
本発明は組織からＡｂｌキナーゼを単離する方法にも関わる。これらの方法は組織を均質化し、その均質化した組織と、結合部分も有する上記化合物類の一つとを結合させ、Ａｂｌキナーゼに結合した化合物を単離することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
よって発明者らはＡｂｌキナーゼを阻害するペプチド類を同定した。これらのペプチドはＡｂｉプロテインの富プロリン領域からのものである。実施例を参照されたい。
【００１８】
したがって本発明は、残基１０のチロシンがリン酸化されている配列番号１を含む精製化合物に関するものである。配列番号１は、Ａｂｉ１、Ａｂｉ２およびＡｂｉ３の、Ａｂｌキナーゼ相互作用領域のコンセンサス配列である。本出願の付録にはＡｂｉ１、Ａｂｉ２およびＡｂｉ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号２、配列番号３および配列番号４として記載されている。配列番号１の部分であるこれらプロテイン類の相互作用領域は、付録では下線が引かれており、ここには配列番号５（Ａｂｉ１）および配列番号６（Ａｂｉ２およびＡｂｉ３）としても記載されている。したがって発明の化合物は配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列も含むことができる。発明の化合物と相互作用するＡｂｌキナーゼのより長いバージョンは配列番号７（コンセンサス配列［図１０］）および配列番号８として提供されている。配列番号７または配列番号８を含む化合物が好ましい。なぜならばＰＸＸＰ Ａｂｌキナーゼ結合モチーフがそのなかに存在し、より効果的なＡｂｌキナーゼ阻害を可能にしているからである。その化合物が、効果的Ａｂｌキナーゼ阻害剤として実施例に記載のように用いられた配列番号８を含むのがより好ましい。
【００１９】
配列番号１によってあらわされる種々の１４マーペプチドは、小ペプチドそれ自体、または大きいＡｂｉプロテイン（配列番号２、配列番号３および配列番号４によってあらわされるヒト配列）として、Ａｂｌキナーゼ類の阻害物質である。さらに、配列番号１の１４マーペプチド類のいずれかを含む任意の化学物質または巨大分子はＡｂｌキナーゼを阻害すると予想される。このような化学物質類または巨大分子の非制限的例は、任意の蛋白（酵素またはサイトカインなど）、プロテイン−核酸ハイブリッド類、糖蛋白、プロテオグリカン類、リポ蛋白類、および、例えば蛍光分子または抗原などの機能的部分を含む。１４マーを含む任意の特定巨大分子のＡｂｌキナーゼ阻害特性は下記の実施例に記載される方法を含む任意の公知の方法によって試験できる。
【００２０】
好ましくは、化合物は配列番号２、配列番号３または配列番号４の少なくとも一部に、少なくとも８５％は相同であるアミノ酸配列を含む。その化合物が天然に存在するＡｂｉ１、Ａｂｉ２、またはＡｂｉ３の少なくとも一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含むのもより好ましい。このような天然に存在するＡｂｉ１、Ａｂｉ２またはＡｂｉ３は、配列番号２、配列番号３または配列番号４に少なくとも８５％相同であることが期待される。その化合物が配列番号２、配列番号３または配列番号４の少なくとも一部に完全に相同であるのがより好ましく、配列番号２の少なくとも一部に完全に相同であるのが最も好ましい。
【００２１】
その化合物は４００未満のアミノ酸残基、１００未満のアミノ酸残基、および２０未満のアミノ酸残基を含む任意の１４アミノ酸長さまたはより長いアミノ酸配列を含むことができる。そのアミノ酸配列は好ましくは１４アミノ酸残基である。その化合物のために予想される特定のアミノ酸配列は配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８である。化合物が、配列番号１内にはない野生型Ａｂｉ１、Ａｂｉ２またはＡｂｉ３のＰＸＸＰ結合モチーフを含むのも好ましい。
【００２２】
本発明の部分として予想される幾つかの化合物はペプチド模擬体によってあらわされる少なくとも１つのアミノ酸を有する。このような化合物は、すべて天然に存在するアミノ酸を有する対応する化合物に比べて、ｉｎ ｖｉｖｏ分解に対してより強く抵抗することが多いことは知られている。
【００２３】
上記化合物がＡｂｌキナーゼの活性を阻害できることが好ましい。このような化合物が哺乳動物に投与されるとき、特にその阻害されたＡｂｌキナーゼが疾患を起こす場合に（例えばＢＣＲ−Ａｂｌ）、このような化合物がＡｂｌキナーゼを阻害できることが最も好ましい。
【００２４】
上記化合物類は検出可能部分または結合部分も含むことができる。本発明は任意の特定の検出可能部分または結合部分を有する化合物に狭く制限されるものではないが、検出部分または結合部分は放射性部分、抗原、蛍光部分、またはＨｉｓ６部分であることが好ましい。多くの用途のために、検出可能部分または結合部分は蛍光部分であることが最も好ましい。これらの用途において、化合物がＡｂｌキナーゼと結合するとき、蛍光部分の検出可能蛍光は変化する。
【００２５】
治療的に応用する場合、本発明の化合物は薬学的に容認される組成物中に含まれなければならない。
【００２６】
本発明は配列番号１を含む精製された化合物にも向けられる。この際アミノ酸配列は４００未満のアミノ酸である。好ましい化合物としては配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８を含むものなどがある。上記化合物類は好ましくは配列番号２、配列番号３または配列番号４の少なくとも一部に少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を含む。より好ましくは、化合物は天然に存在するＡｂｉ１、Ａｂｉ２またはＡｂｉ３の少なくとも一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含む。配列番号２、配列番号３または配列番号４の少なくとも一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含む化合物も好ましく、配列番号２の一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含む化合物が最も好ましい。
【００２７】
化合物のアミノ酸配列は約４００未満のアミノ酸長さでよい、例えば１００未満のアミノ酸残基、または２００未満のアミノ酸残基など。好ましい長さは１４アミノ酸残基である。特に、化合物は配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８からなることができる。これまでに記載された化合物の場合のように、これらの化合物はペプチド模擬体をアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸として含むことができる。化合物は、配列番号１内にはない、野生型Ａｂｉ１、Ａｂｉ２またはＡｂｉ３のＰＸＸＰ結合モチーフ、一般にはＰＰＳＰＰ、を含むのが好ましい。化合物は配列番号１のチロシンの残基１０の位置がリン酸化されていてもよい。化合物がＡｂｌキナーゼの活性を阻害できることも好ましい。
【００２８】
これらの化合物は検出可能部分または結合部分も含むことができる。治療的に応用するためにはこれらの化合物は薬学的に容認される組成物中に含まれなければならない。
【００２９】
上記の化合物類はＡｂｌキナーゼ類を、これらの酵素類との相互作用によって阻害するから、その相互作用を阻害する薬剤がＡｂｌキナーゼの候補阻害剤である。上記化合物とＡｂｌキナーゼとの相互作用は上記化合物とＡｂｌキナーゼとの結合を評価することによって最も有効に測定される。そこで本発明はさらに、ある薬剤がＡｂｌキナーゼの候補阻害剤であるかどうかを確認する方法に向けられる。この方法はＡｂｌキナーゼの存在下で上記の化合物の一つを上記薬剤と接触させ、その化合物がＡｂｌキナーゼに結合するかどうかを確認することを含む。これらの方法において、もしも化合物がＡｂｌキナーゼに結合しないならば、その薬剤はＡｂｌキナーゼの候補阻害剤である。もしもその化合物がＡｂｌキナーゼに結合するならば、その薬剤はＡｂｌキナーゼの候補阻害剤ではない。
【００３０】
これらの方法に使用される化合物はさらに検出可能部分を含み、その化合物とＡｂｌキナーゼとの結合をより容易に評価することができる。別法としてＡｂｌキナーゼがこの目的のための検出可能部分を含むことができる。好ましい検出可能部分は放射性部分、抗原、または蛍光部分である。検出可能部分が蛍光部分であるのが最も好ましい。
【００３１】
これらの方法の幾つかの形において、蛍光部分の検出可能の蛍光は、化合物がＡｂｌキナーゼと結合すると強度が変化する。当業者は蛍光化合物、および上記化合物および／またはＡｂｌキナーゼ上のその結合位置を選択し、不当な実験を行わずにこの方法を実施できる。これらの方法において、化合物とＡｂｌキナーゼとの結合の評価は蛍光強度の測定による。その際、化合物のある場合の蛍光強度が、その化合物がない場合の蛍光強度より増加していれば、それは、その化合物がＡｂｌキナーゼに結合しないことを示す。
【００３２】
化合物とＡｂｌキナーゼとの結合は非変性条件下でペプチドまたはＡｂｌキナーゼの見かけ上のサイズをゲル電気泳動法またはカラムクロマトグラフィーなどによって測定することによっても評価できる。
【００３３】
候補阻害剤の同定にあたって、ある候補阻害剤の存在下でＡｂｌキナーゼのキナーゼ活性を評価することによって、その阻害剤をさらに試験することが好ましい。その際、あるＡｂｌキナーゼ阻害剤はそのＡｂｌキナーゼの活性を低下させる。
【００３４】
本発明は上記の方法によって同定された薬剤も包含する。さらに、本発明はＡｂｌキナーゼと上記の方法によって同定された阻害物質とを接触させる工程を含むＡｂｌキナーゼ阻害法も含む。
【００３５】
本発明はさらにＡｂｌキナーゼを阻害するその他の方法にも関係する。その方法はＡｂｌキナーゼを上記化合物類の一つと接触させることを含む。その化合物は配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８からなるのが好ましい。Ａｂｌキナーゼが哺乳動物細胞にあることも好ましい。その哺乳動物細胞が生きている哺乳動物の部分であることがより好ましい。上記哺乳動物が突然変異体Ａｂｌキナーゼによって特徴づけられる病気にかかっているか、またはそのリスクをもっているのがより好ましい。このような病気の一例は癌である。癌は好ましくは慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）または前立腺癌である。
【００３６】
さらに、本発明は突然変異体Ａｂｌキナーゼによって特徴づけられる病気を有する患者を治療する方法にも関わる。それらの方法は突然変異体Ａｂｌキナーゼを阻害する任意の上記化合物を患者に投与することを含む。その化合物は患者に非経口投与されるのが好ましい。これらの方法にとって、病気が慢性骨髄性白血病または前立腺癌であるのが好ましい。
【００３７】
本発明は突然変異体Ａｂｌキナーゼによって特徴づけられる病気にかかるリスクのある患者を処置する方法にも関わる。これらの方法は突然変異体Ａｂｌキナーゼを阻害する上記のある化合物を上記患者に投与することを含む。
【００３８】
本発明はさらに、Ａｂｌキナーゼを標識化する方法にも関わるものである。その方法はＡｂｌキナーゼと上記化合物類の一つとを、上記化合物が上記Ａｂｌキナーゼと相互作用する条件下で結合させることを含む。これらの方法に用いられる化合物も上記のような検出可能部分を有する。これらの方法において標識化されるＡｂｌキナーゼは哺乳動物組織の部分、例えば生検でよい。生検組織は標識化の前または後に均質化することができ、前記均質化組織から得た蛋白中に存在する検出可能標識の量を定量することによってＡｂｌキナーゼ量、すなわちＡｂｌキナーゼ／化合物の組合わせのサイズを定量することができる。例えば細胞および／または生検中のＡｂｌキナーゼを局所化または定量することが所望の場合は上記標識化組織を組織学的分析にかけることもできる。
【００３９】
本発明は組織からＡｂｌキナーゼを単離する方法にも関わる。これらの方法は、組織を均質化し、均質化した組織と、結合部分も有する上記化合物の一つと組合わせ、Ａｂｌキナーゼに結合した化合物を単離することを含む。当業者は公知の方法を用いて不当な実験を行うことなくこれらの方法を実施できる。Ａｂｌキナーゼをさらに特徴づけることが必要ならば、上記化合物を例えば塩処理などによってＡｂｌキナーゼから単離することができる。単離したＡｂｌキナーゼは当業者には公知の任意の方法によっても特徴づけられる。
【００４０】
Ａｂｌキナーゼを阻害する上記のペプチド類は、例えば慢性骨髄性白血病患者などにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでその目的に使用できる。
【００４１】
発明の好ましい実施形態は次の実施例に記載される。添付の請求項の範囲内のその他の実施形態は、本明細書に開示される本発明の詳細な説明または実施を考慮することにより、当業者には明らかである。詳細な説明は実施例と共に例示的であるに過ぎないものとする。発明の範囲および精神は実施例に続く請求項によって記載されている。
【実施例】
【００４２】
（実施例．Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１から誘導されるペプチドによるｃ−Ａｂｌキナーゼの阻害）
実施例の概要
ｃ−Ｓｒｃとは異なり、ｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ調節の自己阻害的機序には、ｃｉｓに位置する阻害的ホスホチロシンは含まれない。ここで我々は、Ａｂｉ／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１においてｔｒａｎｓに位置するホスホチロシンによるｃ−Ａｂｌキナーゼ阻害のアロステリック非−ＡＴＰ−競合的機序を確認したことを報告する。この機序は、ホスホチロシンのＡｂｌ ＳＨ２ドメインに対する、およびＰＸＸＰモチーフのＡｂｌ ＳＨ３ドメインに対する高い親和性結合を含み、したがってホスホ−Ａｂｌによる負のフィードバック阻害を意味する。ｉｎ ｖｉｖｏ ｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の調節におけるＡｂｉ１の決定的役割は、野生型の発現では細胞内キナーゼ活性が阻害されるが、Ａｂｉ１のＹないしＦ突然変異体によっては阻害されないという事実によって支持される。さらにデータは、細胞増殖がＡｂｉ１の調節的チロシンの存在によって制御されることを示唆する。しかし、細胞スプレディングはＡｂｉ１−依存性ｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ活性によって調節され、チロシンそれ自体によって調節されるものではない。分子模型は、ホスホチロシンとｃ−Ａｂｌとの結合がそのキナーゼの自己阻害コンフォメーションを安定化することを示唆する。これらの結合はＡｂｌキナーゼが細胞内で調節される新規の機序を示唆し、抗白血病薬開発のための新規の戦略をもたらす。
【００４３】
はじめに
遍在する非受容体チロシンキナーゼ、ｃ−Ａｂｌキナーゼは、血小板由来増殖因子受容体、インテグリン、またはサイトカインシグナリング、アポトーシスまたは細胞増殖増強を起こす平衡化事象の下流で作用する（Ｋｏｌｅｓｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｗｏｏｄｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）。細胞増殖におけるｃ−Ａｂｌキナーゼの決定的役割は、ｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼのキナーゼ活性化突然変異型であるＢＣＲ−Ａｂｌの発現による慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の劇的発症によって説明される（Ｄｒｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１ａ；Ｇｏｌｄｍａｎ ａｎｄ Ｍｅｌｏ，２００３）。ＢＣＲ−Ａｂｌは染色体転座およびＢＣＲとｃ−Ａｂｌとの融合から生ずる融合プロテインであり、それはキナーゼ活性の異常調節（ｄｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）を効果的に起こす。このキナーゼ活性を低減する合理的研究はＣＭＬ（Ｄｒｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１ｂ；Ｄｒｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６）およびその他の数種類の癌の成功的処置として、ＳＴＩ−５７１（イマニティブ メシレート（ｉｍａｎｉｔｉｂ ｍｅｓｙｌａｔｅ）またはグリーヴェク（Ｇｌｅｅｖｅｃ））（Ｂｕｃｈｄｕｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６）の開発に導いた。ＡＴＰとの競合により、および不活性キナーゼコンフォメーションの安定化によってキナーゼを阻害するＳＴＩ−５７１は（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）、癌治療のための抗キナーゼ薬開発のテンプレートを提供した。第二世代の抗−Ａｂｌ薬（Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｗｅｉｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００５）を含む多数の抗キナーゼ化合物が現在トライアル中であり（Ｇａｒｂｅｒ，２００６）、ＣＭＬ治療後の長期緩解の期待につながっている（Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。抗Ａｂｌ阻害剤の成功は薬剤耐性突然変異の出現によって取り消され（Ｇｏｒｒ ｅｔ ａｌ．，２００一；ｖｏｎ Ｂｕｂｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，２００２）、Ｂｃｒ−Ａｂｌ調節機序の再考につながった（Ａｌ−Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｋｈｏｒａｓｈａｄ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｍｉｅｔｈｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６）。これによりｃ−Ａｂｌが再び注目されるようになった、なぜならばＢｃｒ−Ａｂｌおよびｃ−Ａｂｌは大部分の調節ドメインを共有しているからである（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ａｎｄ Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ，２００４；Ｗｏｏｄｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【００４４】
自己阻害がｃ−Ｓｒｃおよびｃ−Ａｂｌ調節の主要機序として浮上した（Ｃｏｕｒｔｎｅｉｄｇｅ，２００３；Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｐｌｕｋ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｂｒｕｇｇｅ，１９９７；Ｗａｎｇ，２００４）。これらのキナーゼは高度に保存された構造ドメイン：ＳＨ３、ＳＨ２、および触媒ドメインの存在によって与えられる高度な構造相同性を共有する。ｃ−Ｓｒｃ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９）およびｃ−Ａｂｌ（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）の結晶構造は、ＳＨ３およびＳＨ２ドメインが触媒ドメイン（ＣＤ）に結合し、自己阻害コンフォメーションを誘起し、これらキナーゼ類の基礎的調節機序を提供する。この基礎的調節はＢＣＲ−Ａｂｌに保存される。なぜならばＢＣＲ−ＡｂｌはＳＨ３ドメインを含んでその下流のすべてのｃ−Ａｂｌドメインを含むからである。
【００４５】
ｃ−Ｓｒｃとｃ−Ａｂｌとは、これらキナーゼの活性を阻害する２つの機序において互いに異なる。ｃ−Ｓｒｃでは、阻害はＳＨ２ドメインと、同じ分子上のＣ−末端に位置するリン酸化チロシン５２７との分子内相互作用によって実現する（Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｂｒｕｇｇｅｒ，１９９７）。ｃ−Ａｂｌにおいては、内部ホスホチロシン−ＳＨ２ドメインの相互作用はなく、この阻害機序は除外される。さらにｃ−Ｓｒｃとは対照的に、キナーゼドメインのＣ−末端ローブへの直接的ミリストイル化キャップ結合によって、およびＳＨ２ドメインへのキナーゼ領域ホスホセリン６９結合によって、付加的阻害的束縛がｃ−Ａｂｌに課せられる（Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）。これらの相互作用はさらにＳＨ３−ＳＨ２“クランプ”を触媒ドメインにロックする。ミリストイル基（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）またはその作用を真似る小化合物（Ａｄｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）が触媒ドメインのＣ−末端らせん、αＩ、の位置を安定させ、その結果そのキナーゼの阻害的コンフォメーションが形成される。しかしミリストイル化キャップによって課せられる“分子ロック”は、部分的キャップ領域だけを含むｃ−Ａｂｌ−アイソホーム１ａの非ミリストイル化形、またはＢＣＲによって置換されたＢＣＲ−Ａｂｌには存在しない。したがってミリストイル化キャップはＢＣＲ−Ａｂｌ、またはｃ−Ａｂｌ−１ａのキナーゼ活性を調節しない、ただし後者にはホスホセリンが保存されており、それ（ホスホセリン６９）が自己阻害機序の一因となる可能性はある（Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）。キャップ領域の分子内相互作用は接近し易さも調節するらしく、Ａｂｌ活性化に役割を演ずるかも知れない増殖因子からのホスホチロシン含有ペプチド類を含むＡｂｌ ＳＨ３またはＳＨ２リガンドの結合を調節するらしい（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３）。Ａｂｌ調節の複雑さを考慮すると、キナーゼ活性の活性化は、触媒ドメインからのＳＨ３およびＳＨ２の単離、および阻害からのキナーゼ“開放”につながる複数の工程を含むらしい。
【００４６】
ｃ−Ａｂｌキナーゼに結合する種々のプロテインはｃ−Ａｂｌ共阻害剤であることが提唱されている。プロテインＦ−アクチン、ＰａｇおよびＲｂは、ｃ−Ａｂｌの自己阻害コンフォメーションを安定化することによって受動的共阻害剤として作用すると仮定されている（Ｗａｎｇ，２００４）。候補ｃ−Ａｂｌ阻害剤の別のセット、Ａｂｉ１およびＡｂｉ２はｃ−Ａｂｌ結合パートナーを同定する研究（Ｄａｉ ａｎｄ Ｐｅｎｄｅｒｇａｓｔ，１９９５；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）並びにその他のプロテインからのＳＨ３ドメインの結合パートナー、名称Ｅ３ｂ１（Ｂｉｅｓｏｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、またはＨｓｓｈ３ｂｐ１（Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）を確定する研究において単離された。ｃ−ＡｂｌキナーゼシグナリングにおけるＡｂｉプロテインの阻害的役割は、主として細胞増殖の調節におけるＡｂｉ１およびＡｂｉ２の阻害的役割に基づくことが提唱されているが（Ｄａｉ ａｎｄ Ｐｅｎｄｅｒｇａｓｔ，１９９５；Ｍａｃｏｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、それらの作用の分子的機序は明らかでない。ＬｎＣＡＰ前立腺腫瘍細胞系はエクソン６の決失をおこすＡｂｉ１遺伝子の異型接合突然変異を含むから、これがＡｂｉ１の重要な増殖調節領域である可能性が指摘される（Ｍａｃｏｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。Ａｂｉ１およびＡｂｉ２は富プロリン−リンカー、ＰＲＬ、のｃ−ＡｂｌキナーゼＣ−末端ＰＸＸＰ配列（Ｄａｉ ａｎｄ Ｐｅｎｄｅｒｇａｓｔ，１９９５；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、およびｃ−Ａｂｌ ＳＨ３ドメイン（Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）と相互作用する。そこで増殖調節の一つの機序として、ＡｂｉのＰＸＸＰ配列およびＳＨ３ドメインをｃ−Ａｂｌ ＳＨ３ドメインおよびＰＲＬの領域に協同結合することによってｃ−Ａｂｌキナーゼ自己阻害コンフォメーションを強化することによるｃ−Ａｂｌキナーゼの調節が含まれるかも知れない。しかしＳＨ３またはＳＨ２を基礎とするキナーゼ調節機序は、ｃ−ＡｂｌキナーゼおよびＡｂｉプロテインについては証明されなかった。その上、ＳＴＩ−５７１耐性突然変異がＡｂｌ ＳＨ３およびＳＨ２ドメインに見いだされ（Ａｚａｍ ｅｔ ａｌ．，２００３）、もしＡｂｉプロテインがこれらのドメインへの結合によってＡｂｌ触媒活性が調節されるならば、それらはｉｎ ｖｉｖｏ ＳＴＩ−５７１耐性を調節する上で重要である可能性が示唆される。
【００４７】
Ａｂｉ１のＡｂｌ ＳＨ３およびＳＨ２結合領域から誘導されるホスホペプチドによるｃ−Ａｂｌキナーゼ阻害の新しいアロステリック機序の発見をここに報告する。分子模型化からは、ホスホペプチドがｃ−Ａｂｌキナーゼの自己阻害コンフォメーションを安定化し、Ａｂｌ触媒ドメインのＣ−ローブに結合したミリストイル基およびＳＨ２ドメインで観察されるものと同様のコンフォメーションに導くことが示唆される。ここに明らかにされたキナーゼ阻害機序が、ＡｂｌおよびＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼ類のアロステリック阻害剤を開発する新規の方法として利用できると考えられる。
【００４８】
結果
ｃ−Ａｂｌはｉｎ ｖｉｔｒｏでＡｂｉ１のＹ２１３をリン酸化する。Ａｂｉ１のチロシンリン酸化部位の探査において、以前Ａｂｌ ＳＨ３ドメインに結合することが証明されたＡｂｉ１の富プロリン−領域内に、候補チロシン残基、Ｙ１９８およびＹ２１３が位置することを我々は確認した（Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。上記プロテインのＮ−末端半分をコードする翻訳されたポリペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏで用い、Ｙ２１３がＡｂｌキナーゼによるｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化の好ましい位置であることを確認した（図１）。Ｙ２１３のリン酸化部位は、組換えＡｂｉ１および活性ｃ−Ａｂｌを含むキナーゼ反応後、トリプシンペプチドの質量分析によって確認された（表１）。
【００４９】
【表１】
トリプシン消化後に試料を分析した。記載されるチロシン２１３またはフェニルアラニン置換を含む特異的イオンの予測および実験的質量を列挙する。野生型（ＷＴ）トリプシンペプチドの配列はＴＬＥＰＶＫＰＰＴＶＰＮＤｐＹＭＴＳＰＡＲである；ホスホチロシン２１３は太字で書かれている。＊Ｆ２１３：ＷＴと同じだが太字のＹ２１３Ｆ置換有する：ＴＬＥＰＶＫＰＰＴＶＰＮＤＦＭＴＳＰＡＲ。Ｔ１５ＷＳはＡｂｉ１アイソホーム４の残基１４４−３０３を含み（Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ，１９９８）、ＷＴと同じトリプシンペプチドを含む。‡Ｍｅｔ−Ｏ：すべての試料に存在した酸化メチオニンである（上のトリプシンフラグメントでは下線が引かれている）；したがって２種類（非リン酸化試料）または４種類（リン酸化試料）の分子が認められた。方法。ニューイングランド ビオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）からのＡｂｌキナーゼ、Ｔ１５ＷＳ、またはバキュロウイルス精製Ａｂｌ、アイソホーム２によって試料をリン酸化した。キナーゼ反応を３０分間行った後に４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上でプロテイン類を分離した。特異的プロテインバンドを単離し、トリプシン分解にかけた（シグマ−アルドリッヒ社、セントルイス、ＭＯ）。それら試料を０．５％ＴＦＡで酸化した後、ＺＩＰ ＴＩＰ−１８（ミリポア コーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ベッドフォード、ＭＡ）を用いて試料を濃縮し、０．１％ＴＦＡおよび５０％アセトニトリルで溶出し、５０％アセトニトリルおよび０．５％ＴＦＡ中α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸基質（シグマ アルドリッヒ社、セントルイス、ＭＯ）を含むチューブに受け入れた。質量分析はアプライド ビオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（フォスターシティ、ＣＡ）のＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＭＡＬＤＩ質量分析計を用いて行われた。
【００５０】
Ａｂｉ１の最小Ａｂｌ ＳＨ３およびＳＨ２ドメイン結合部位の同定。最初に、ｃ−Ａｂｌ ＳＨ３ドメインの結合がＡｂｉ１の残基１４４−２６０に位置づけられた（Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。その後Ａｂｌ ＳＨ３結合を、チロシン２１３から上流に位置するＰＸＸＰ ＳＨ３結合モチーフを含むＡｂｉ１配列にマッピングした。ＰＸＸＰ配列、１８１ＰＰＳＰＰ１８５、を含むＡｂｉ１の残基１７３〜１８７の決失は、Ａｂｌ ＳＨ３ドメインへの結合を完全に破壊した（図２Ａ）。
【００５１】
Ａｂｌ ＳＨ３結合部位がチロシン２１３に接近していることは、リン酸化チロシンがＡｂｌ ＳＨ２ドメインと相互作用することを示唆する。この相互作用を、リン酸化チロシン２１３（ｐＹ２１３）およびＧＳＴ−Ａｂｌ ＳＨ２ドメイン融合プロテインを含むビオチニル化１４残基ペプチドを用いて分析した（図２Ｂ−Ｄ）。最初に、Ａｂｌ ＳＨ２ドメインはホスホペプチドｐＹ２１３とは相互作用するが非リン酸化ペプチド（ノンホスホペプチド）Ｙ２１３とは相互作用しないことが明らかになった（図２Ｂ）。我々は種々濃度のＡｂｌ ＳＨ２ドメインを用いて、ｐＹ２１３がＳＨ２ドメインと高度の親和性をもって相互作用することを確認した（会合常数、ＫＡ＝３．０１×１０７；解離常数、ＫＤ＝３．３２×１０−８；会合速度、Ｋｏｎ＝１．１３×１０５ｓ−１；解離速度、Ｋｏｆｆ＝３．７６×１０−３Ｍ−１ｓ−１）（図２Ｃ）。対照実験は、Ａｂｌ ＳＨ２Ｒ１７１Ｋ突然変異体がｐＹ２１３と相互作用しないことを示した（図２Ｄ）。この結果は、Ｒ１７１突然変異がＳＨ２ドメインとホスホペプチドとの相互作用を不可能にするという知見（Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２）と一致する。
【００５２】
ｐＹ２１３ホスホペプチドは非競合的機序によってｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を阻害する。ｃ−Ａｂｌキナーゼの結晶構造に基づくと、ＳＨ２ドメイン−ホスホペプチド相互作用はｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を調節するポテンシャルを有する（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３）。そこでチロシン２１３を含むＡｂｉの諸配列がｃ−Ａｂｌキナーゼ活性に影響を与えるかどうかを試験する実験が行われた。これらの実験には、活性ｃ−Ａｂｌ（Ｔａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）、モデル基質ペプチド（Ｂｒａｓｈｅｒ ａｎｄ Ｖａｎ Ｅｔｔｅｎ，２０００；Ｐｌｕｋ ｅｔ ａｌ．，２００２）および、ホスホチロシン、ｐＹ２１３、または位置２１３にチロシンのフェニルアラニン置換があるＦ２１３を含む１４残基ペプチドの形（ペプチド配列は図１Ａを参照）を用いた。ｐＹ２１３ホスホペプチドはＶｍａｘの３８％減少を示し、基質ペプチドのＫｍには有意な効果を与えなかった。これは非競合的阻害機序に一致する（図３Ａ−Ｂ、および表２）。ペプチドＦ２１３ではキナーゼ活性に対する影響は認められなかった。
【００５３】
【表２】
Ａｂｉ１ペプチドについて２ｍＭのＦ２１３およびｐＹ２１３のＶｍａｘおよびＫｍの概要（平均値±ｓ．ｄ．；ｎ＝３）。＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．００１；ＰＥＰ、基質ペプチド。ペプチドの記述は図１Ａを参照。
【００５４】
非リン酸化ペプチドＹ２１３は２ｍＭでｐＹ２１３に比べてキナーゼ活性の有意な減少を示す（表２）。上記Ｙ２１３は、ｐＹ２１３ペプチドより低濃度で有意なキナーゼ阻害を示した（図３Ｅおよび３Ｆ、および表２）。１４残基ペプチドＹ２１３はＡｂｌキナーゼ自体の基質として作用することができ、それはモデル基質ペプチドと競合した。しかしラインウェーバーバーク曲線は基質ペプチドのＫｍの減少を示し（Ｙ２１３ペプチド濃度０．１ｍＭおよび２．０ｍＭでは有意、表２）、したがってより低いＶｍａｘは基質ペプチドのターンオーバーの低下によるキナーゼ活性の阻害を示唆する。興味深いことに、ｐＹ２１３ホスホペプチドのＮ−末端にＳＨ３ドメイン結合配列が含まれると、ペプチド濃度２ｍＭでｃ−Ａｂｌキナーゼに対する阻害効果は高まった。しかしより低い濃度では阻害は観察されなかった（図３）。つまり、Ｙ２１３Ｆを除いて、試験したすべてのペプチド１４マー、すなわちｐＹ２１３およびＹ２１３、並びに４９マーであるＰｒｏＹｐ２１３はｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の阻害を示した。しかし阻害機序は、異なるペプチドでは異なる。
【００５５】
ＳＨ３ドメイン結合はｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の阻害において重要である。ｐＹ２１３ホスホペプチドのＮ−末端に、１８１ＰＰＳＰＰ１８５を含むＳＨ３ドメイン結合配列があると（ペプチドＰｒｏ−ｐＹ２１３）、ペプチド濃度２ｍＭでｃ−Ａｂｌキナーゼに対する阻害効果は高まるが、より低濃度では阻害は認められなかった（図３Ｃ）。実際、ｃ−Ａｂｌキナーゼは、０．５ないし１ｍＭの間で活性の若干の増加を示した。この効果についてより多くを学ぶために、ｐＹ２１３のＮ−末端に上記配列を含むＰｒｏ−ｐＹ２１３から誘導されるペプチドを用いてキナーゼ活性を測定した（図３Ｄ）。ペプチドＰｒｏ−Ｙ１９８はペプチド濃度の上昇につれて阻害が増加することを示した；この効果はＳＨ３結合モチーフ１８１ＰＰＳＰＰ１８５の１８１ＰＥＳＥＰ１８５（ペプチドＥＥ−Ｙ１９８）への突然変異で、またはＹ１９８のＦ１９８置換（ペプチドＰｒｏ−Ｆ１９８）で失われた。ペプチドＰｒｏ−ｐＹ２１３は０．７５から１．２５ｍＭまでの濃度でキナーゼ活性を高めた。その後は１．５ｍＭで活性は減少し、１．７５および２ｍＭで阻害が起きた。これらのデータは：（ａ）Ｐｒｏ−ｐＹ２１３が、濃度に応じてｃ−Ａｂｌ活性をアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションすることができ；（ｂ）Ａｂｉ１の配列１８１ＰＰＳＰＰ１８５、Ｙ１９８、およびｐＹ２１３が、Ｐｒｏ−ｐＹ２１３によるｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の調節に重要であることを示している。
【００５６】
Ａｂｉ１ Ｙ２１３はｃ−Ａｂｌに依存する様態でリン酸化される。チロシン２１３がｉｎ ｖｉｖｏでリン酸化されるかどうかを調べるために、培養細胞系をモデル系として用いた。リン特異的抗体を用いるＡｂｌ−／−Ａｒｇ−／−二重ノックアウト細胞における実験により、Ａｂｉ１がｃ−Ａｂｌキナーゼと共にトランスフェクトされる場合に限り、Ｙ２１３がリン酸化されることが示される（図４Ａ）。突然変異体Ｙ２１３Ｆは、ｃ−Ａｂｌと共にトランスフェクトされるたとき、Ａｂｉ１−Ｆ２１３の安定性を明らかに低下させた（図４Ａ）。ｃ−Ａｂｌとの共トランスフェクションでＡｂｉ１−△Ｅｘ６の安定性も明らかに低くなる。ただし組換えバンドはＩｇＧバンドとオーバーラップする。一過性トランスフェクション効率または組換え蛋白の局在性において、いずれのＡｂｉ１突然変異体でも変化は認められず、それらはすべて組換えｃ−Ａｂｌと共に局在した（データは示されず）。
【００５７】
Ａｂｉ１発現は、ｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の調節によってＬｎＣＡＰ細胞の細胞増殖および細胞スプレディングを調節する。Ａｂｉ１が細胞のｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ活性を調節するかどうかを確認するために、ＬｎＣＡＰ前立腺細胞系をモデル系として用いた。このＬｎＣＡＰ細胞系は異形接合、エクソン６−スキッピング突然変異を含み、Ｙ２１３を含むＡｂｉ１領域の消失を起こす（Ｍａｃｏｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。これはＬｎＣＡＰ細胞におけるＡｂｉ１の明白な低レベル発現につながる（図９を参照）。ｃ−Ａｂｌキナーゼの確立された機能と一致して、Ａｂｉ１−ｗｔを補充した安定な細胞系は増殖阻害（図５）および細胞スプレディング活性低下（図５Ｂ−Ｃ）を示した。我々は同じアッセイを用いて、ＳＴＩ−５７１がＡｂｉ１の発現として、ＬｎＣＡＰ細胞の細胞スプレディング活性に対して同様な阻害効果を有することを示した（図５Ｃ）。Ａｂｉ１をトランスフェクトしたＬｎＣＡＰ細胞においては、総Ａｂｉ１発現のわずかの増加が認められるという事実にもかかわらず（図６Ａ）、ｃ−Ａｂｌ活性は有意に減少した（図６）。ｃ−Ａｂｌは、外因性Ｃｒｋ基質または内因性Ｃｒｋのリン酸化減少（図６Ｂ）並びに８Ｅ９免疫反応性バンドのチロシンリン酸化の減少（図６Ｃ）によって示されるように活性の低下を示した。ｃ−Ａｂｌの活性化ループ チロシンＹ４１２のリン酸化も減少した。これらはＬｎＣＡＰ細胞内の蛋白リゼートのチロシンリン酸化の減少を伴った。これらのデータから、Ａｂｉ１をトランスフェクトした細胞ではｃ−Ａｂｌの活性が低くなることが、はっきりとわかった。こうしてＡｂｉ１（＋）細胞系におけるＡｂｉ１のレベル上昇は、ｃ−Ａｂｌ活性のダウンレギュレーションによる細胞増殖および細胞スプレディングの減少につながった。チロシン２１３がｃ−Ａｂｌの活性上昇によってより多くリン酸化されているＬｎＣＡＰ細胞では、Ａｂｉ１（＋）細胞に比べてＡｂｉ１がより効率的にｃ−Ａｂｌと共沈殿するという事実は（図６Ｄ）、ｃ−Ａｂｌの基質、すなわちＡｂｉ１によるｃ−Ａｂｌ阻害の負のフィードバック機序を裏付ける。
【００５８】
Ａｂｉ１のｐＹ２１３および１８１ＰＰＳＰＰ１８５配列はｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ活性を調節し、それを細胞増殖および細胞スプレディングの調節につなげる。一過性トランスフェクションにおけるＡｂｉ１−Ｆ２１３の明らかに低い安定性を回避するために、およびｃ−Ａｂｌキナーゼ活性および細胞増殖におけるＡｂｉ１のｐＹ２１３および１８１ＰＰＳＰＰ１８５の役割に、より詳細に取り組むために、野生型Ａｂｉ１−ｗｔ、またはＡｂｉ１の下記の突然変異体：Ｙ２１３Ｆ、Ａｂｉ１−Ｙ２１３Ｆ、および１８１ＰＰＳＰＰ１８５ないし１８１ＡＥＳＥＡ１８５およびＡｂｉ１−Ｐｒｏを安定的にトランスフェクトしたＬｎＣＡＰクローンを得た。Ａｂｉ１−Ｆ２１３の発現はｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を阻害しなかったし、Ａｂｌ−Ｐｒｏの発現もｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を阻害しなかった（図７Ａおよび７Ｂ）。これは活性化ループチロシンのリン酸化レベルによって（ｐＹ４１２）、または内因性Ｃｒｋリン酸化レベルによって測定したようにＡｂｉ１−ｗｔとは対照的である。例えば、Ａｂｉ１−Ｆ２１３細胞にはＡｂｉ１−ｗｔ細胞より高レベルの阻害物質が発現しているとはいえ、負のフィードバック機序によるｃ−Ａｂｌキナーゼの阻害はＡｂｉ１−Ｆ２１３細胞にはあらわれない。Ａｂｉ１クローンの増殖速度を分析した結果、最も遅い速度で増殖し、Ａｂｉ１（＋）およびＡｂｉ１−ｗｔクローンに類似しているが対照的に高ｃ−Ａｂｌ活性を有するＡｂｉ１−Ｙ２１３Ｆクローンを除いて、これらの速度はより高いｃ−Ａｂｌ活性を有する細胞ではより高いことが判明した（図７Ｃ）。コラーゲン上におけるＡｂｉ１クローンの細胞スプレディング活性も評価した。野生型Ａｂｉ１、すなわちクローンＡｂｉ１（＋）およびＡｂｉ１−ｗｔを発現する細胞だけが細胞スプレディングの減少を示した（図７Ｄ）。これらの細胞はより低いｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を有した。したがってＬｎＣＡＰ細胞の細胞スプレディング活性はＡｂｉ１依存性ｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ活性によって調節される。興味深いことに、細胞の高い細胞スプレディング活性はＡｂｉ１の増殖シグナルとは無関係であった、すなわちＡｂｉ１−Ｆ２１３クローンはＡｂｉ１−Ｐｒｏクローンに類似した細胞スプレディング活性を示した。しかしそれらは有意により緩徐に増殖した）。
【００５９】
検討
Ａｂｉ１がｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ活性を調節する際に考えられる機序が提供される。その機序は、Ａｂｉ１のＮ末端領域のＹ２１３をｃ−Ａｂｌキナーゼによってリン酸化し、それをＡｂｌ ＳＨ２ドメインに結合し、その後のキナーゼ阻害を起こすことを含む。これは、別のプロテイン、すなわちＡｂｉ１においてトランスに位置するホスホペプチドによってｃ−Ａｂｌキナーゼが阻害されるという最初の証明である。ｃ−ＡｂｌキナーゼによるＡｂｉ１のＹ２１３位置のリン酸化はこれまでは証明されていない。ただしＢＣＲ−ＡｂｌのＳＴＩ−５７１依存性基質標的を決定するためのショーグン（ｓｈｏｇｕｎ）法では、それがＢＣＲ−Ａｂｌのリン酸化部位であることが確認されている（Ｇｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
【００６０】
Ａｂｉ１ホスホペプチド類はアロステリック機序によってｃ−Ａｂｌキナーゼを阻害する。この機序はリン酸化Ｙ２１３のＡｂｌ ＳＨ２ドメインへの高親和性結合を含む。Ｋｍは変化せず、Ｖｍａｘの減少が観察されたのは、ｐＹ２１３を含むホスホペプチドによるキナーゼ活性阻害の非競合的機序と一致する。ｃ−Ａｂｌの構造研究（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）は、ＳＨ３−ＳＨ２−触媒ドメインアセンブリーを含む非ミリストイル化ｃ−Ａｂｌフラグメントの結晶構造においてホスホチロシン結合部位が一部妨害されていることを示す。得られたｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼデータは、このキナーゼのＩａおよびＩｂ両方の型によって共有された非ミリストイル化、アンキャップドｃ−Ａｂｌキナーゼに関係している。例えばＡｂｉ１ホスホペプチドｐＹ２１３との相互作用は、ｃ−Ａｂｌ分子の（特にＳＨ２およびキナーゼドメインの）顕著なコンフォメーション変化を含むはずである。
【００６１】
分子模型は、Ａｂｉ１が不活性キナーゼコンフォメーションを安定化することを示す。（図８Ａ参照）。このコンフォメーションはミリストイル化キナーゼで観察されるもの、またはミリストイル結合ポケットへのＧＮＦ−２結合によって安定化されると言われているものに類似している（Ａｄｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ミリスチン酸塩結合状態において、キナーゼドメインのＣ−末端αＩ’らせんの特異的位置によって不活性キナーゼコンフォメーションが得られる（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）。これはＳＨ３、ＳＨ２およびＣＤドメインの自己阻害アセンブリーをさらに強化する。Ａｂｉ１のｃ−Ａｂｌへの結合は、Ａｂｌ触媒ドメインのＣ−ローブにおけるＣ−末端らせんの位置に影響を与えることによって、Ａｂｌキナーゼの阻害コンフォメーションを強化できることが予想される。これは分子模型データによって裏付けられるように、ＳＨ２ドメイン−触媒ドメイン相互作用がＡｂｉ１ホスホペプチドによって安定化されることによる（図８Ａ）。曲がったαＩ’らせんコンフォメーションを安定化することによってミリストイル基のように作用すると仮定されているＧＮＦ−２のような小分子（図８Ｂ）が、なぜ細胞内でＢＣＲ−Ａｂｌを阻害するかは、Ａｂｉ１とＢＣＲ−Ａｂｌとの結合によって説明されるかも知れない（Ａｄｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
【００６２】
Ａｂｌ ＳＨ３ドメインへの結合はＡｂｉ１によるｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の調節において重要である。これはＡｂｉ１のＡｂｌ ＳＨ２およびＡｂｌ ＳＨ３ドメイン結合領域両方を含むホスホペプチドＰｒｏ−ｐＹ２１３によるキナーゼ活性の調節によって証明される。Ｐｒｏ−ｐＹ２１３はキナーゼ活性に対するアップレギュレーションおよびダウンレギュレーション効果の両方を引き出す。これらの効果はペプチド濃度に左右される。より低い濃度ではＰｒｏ−ｐＹ２１３はＡｂｌ活性をアップレギュレートする；これは十中八、九、ＳＨ３およびＳＨ２ドメインと触媒ドメイン（ＣＤ）およびＳＨ２触媒ドメインリンカーとの阻害的相互作用と競合し、これを緩和することによる（Ｂｒａｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）。これらのデータは、最近ｃ−Ｓｒｃで観察されたように（Ｃｏｗａｎ−Ｊａｃｏｂ ｅｔ ａｌ．，２００５）、または活性ｃ−ＡｂｌのＳＡＸＳ分析によって示唆されたように（Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）、ＣＤドメインからのＳＨ３およびＳＨ２ドメインの単離を含む、Ｐｒｏ−ｐＹ２１３のｃ−Ａｂｌ活性化の諸工程を示唆する。Ｐｒｏ−ｐＹ２１３のＮ−末端領域から誘導されるペプチド類のその後の分析は、ＳＨ３結合配列、１８１ＰＰＳＰＰ１８５、およびＹ１９８が、ｃ−Ａｂｌキナーゼの調節のために重要であることを示している；これは十中八、九、キナーゼの阻害されたコンフォメーションを安定化することによると考えられる。キナーゼ活性のアップレギュレーションは完全な長さのＰｒｏ−ｐＹ２１３でなければ観察されず、したがってこのペプチドＰＰＳＰＰ、Ｙ１９８、およびｐＹ２１３の３つの要素すべてがこの効果を引き出すのに必要である。より高濃度ではＰｒｏ−ｐＹ２１３は３つのすべてのｃ−Ａｂｌドメイン、すなわちＳＨ３、ＳＨ２およびＣＤとの相互作用に十分に関与するらしく、キナーゼの新しい、阻害されたコンフォメーションを安定化させるらしい（図８Ａ）。バイアコアを用いて、低ミリモル範囲ではＧＳＴ−ＳＨ３−ＳＨ２が、ＧＳＴ−ＳＨ２およびＰｒｏ−ｐＹ２１３で観察されるものに非常に近いＫｄでｐＹ２１３と相互作用することが確認された（データは示されず）。これらおよび、ホスホセリン６９の役割に関する構造データは、ＧＳＴ−ＳＨ３−ＳＨ２においてＳＨ３およびＳＨ２ドメインが全く無秩序であることを示唆する。そこで、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰｒｏ−ｐＹ２１３とＳＨ３−ＳＨ２ドメインとの相互作用を安定化するためには高濃度のＰｒｏ−ｐＹ２１３が必要である。これはｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいてｃ−Ａｂｌ活性に対する影響を引き出すために、なぜ極めて高い濃度のＰｒｏ−ｐＹ２１３ペプチドが必要であるかも説明できる。しかし最近のｃ−Ａｂｌ構造は、Ａｂｌ ＳＨ３およびＳＨ２ドメインの相互作用がホスホセリン６９によって安定化されることを示している。これは、これらのドメインが会合構造における１ユニットとして働くことを示唆する（Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ｃ−Ａｂｌに関する最近の構造情報を取り入れた、Ａｂｉ１によるｃ−Ａｂｉ１キナーゼ調節のこのモデルにおいて（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）、ＳＡＸＳ分析によって提起されるように、Ｐｒｏ−ｐＹ２１３が先ず最初に自己阻害された構造を開き、伸長した、より大きい活性を有するＡｂｌが生成することが考えられる（Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）；この後に、一部または完全に閉鎖した構造を有する、活性のより小さい、および不活性の中間体が生成する（図８Ｂ）。
【００６３】
以前、Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ら、２００３（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３）は短いホスホチロシン含有ペプチドがミリストイル化ｃ−Ａｂｌキナーゼを活性化できることを明らかにした。多分ｉｎ ｖｉｖｏ増殖因子受容体細胞質ドメインを代表するこのようなホスペプチド類は、阻害プロテインＡｂｉ１と競合してＡｂｌのホスホチロシン結合部位に結合することによってｃ−Ａｂｌキナーゼを活性化することができる。
【００６４】
基質チロシン２１３を含むペプチドＹ２１３は、Ａｂｌキナーゼ活性の最も強力な阻害を示した。この基質ペプチドのＫｍの減少並びにＶｍａｘの減少（０．１ｍＭおよび２ｍＭにおける）は、Ｙ２１３ペプチドがその他のＡｂｌ基質のターンオーバーを減らすことを示唆する。これは生理学的に意味をもつかも知れない、なぜならばＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１はＡｂｌキナーゼのその他の細胞基質を標的にするからである（Ｍａｒｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
【００６５】
ＬｎＣＡＰ細胞における実験は、Ａｂｉ１に対するＳＨ３およびＳＨ２結合によるｃ−Ａｂｌ調節機序を裏付ける。Ａｂｌ ＳＨ２ドメイン（Ｙ２１３Ｆ）またはＳＨ３ドメイン（１８１ＰＰＳＰＰ１８５）結合配列、１８１ＰＰＳＰＰ１８５、に突然変異を有するＡｂｉ１の発現は、Ａｂｉ１のｃ−Ａｂｌ阻害能力を低下させる。Ａｂｉ１突然変異体を安定的にトランスフェクトした細胞において、ｃ−Ａｂｌの活性化ループチロシンｐＹ４１２のリン酸化によって、並びにその基質であるＣｒｋの高められたチロシンリン酸化によって測定して、より高いｃ−Ａｂｌ活性が観察された。ＬｎＣＡＰ細胞における野生型Ａｂｉ１発現の際の負のフィードバック阻害の結果としてのより低いｃ−Ａｂｌキナーゼ活性は、ＰＤＧＦまたはインテグリンシグナリングのような増殖因子受容体から下流の細胞分裂促進効果におけるｃ−Ａｂｌの役割のダウンレギュレーションと一致する（Ｗａｎｇ，２００４；Ｗｏｏｄｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２）。したがって、より低いｃ−Ａｂｌキナーゼ活性は細胞増殖および細胞スプレディング活性の阻害につながる。以前、ｃ−Ａｂｌキナーゼ活性は、インテグリンシグナリング（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、ミクロスパイク形成（Ｗｏｏｄｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｓｔｕａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００６）、または細胞スプレディング（Ｌｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５）の増加と関連づけられた。しかしそのプロセスの明らかな機序はＡｂｉ１に対しては提起されなかった。
【００６６】
最も速い速度で増殖したＡｂｉ１−Ｐｒｏクローンは高いＡｂｌチロシンキナーゼ活性を有し、それらはＹ２１３を含む、という事実は、Ｙ２１３および／またはｐＹ２１３（後者の方がより確からしい）がｃ−Ａｂｌキナーゼの下流の増殖シグナルの伝達に役割を演じていることを示唆する。野生型Ａｂｉ１をトランスフェクトしたＬｎＣＡＰクローンは野生型ＬｎＣＡＰ細胞よりも高レベルのＹ２１３を含むが、基質Ｙ２１３のリン酸化産物であるｐＹ２１３による負のフィードバックによって、より低いｃ−Ａｂｌ活性を有する。Ａｂｉ１（＋）細胞は、ｐＹ２１３レベルが低いために、一貫して野生型ＬｎＣＡＰ細胞よりもゆっくり増殖する（図６Ｄを参照）。この考え方は、組換えＡｂｉ１−Ｆ２１３がＹ２１３上ではリン酸化されないのでＡｂｉ１−Ｆ２１３細胞も緩徐に増殖するという事実とも一致する。ｐＹ２１３が例えばダウンストリームエフェクターに結合することによって細胞増殖を促進し、その間ｃ−Ａｂｌキナーゼ活性阻害もするならば、これは、ｃ−Ａｂｌ依存性増殖シグナルがその基質であるＡｂｉ１によって非常にきっちりと調節されることを示唆するものである。基質Ａｂｉ１は負のフィードバックループによってｃ−Ａｂｌ阻害剤としても作用する。
【００６７】
興味深いことに、細胞スプレディング活性は細胞内の高Ａｂｌキナーゼ活性と対応する；これは増殖阻害をあらわすＡｂｉ１−Ｆ２１３細胞を含んでいた。そこでＡｂｉ１依存性増殖調節は細胞スプレディングのＡｂｉ１依存性調節とは切り離される。この調節はＷａｖｅ２のリン酸化の調節を含むらしい。ｃ−ＡｂｌによるＷａｖｅ２のリン酸化は、細胞スプレディングを調節するＡｒｐ２／３およびアクチン細胞骨格の再構成を促進することが示唆されている（Ｌｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｓｔｕａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００６）。野生型ＬｎＣＡＰ細胞におけるＡｂｉ１の比較的低い発現、またはＡｂｌキナーゼ活性に対するＡｂｉ１の阻害効果を完全になくす突然変異を有するＡｂｉ１の発現は、Ｗａｖｅ２の高リン酸化を起こし得る。そしてこれが細胞の細胞スプレディング増加につながるらしい。こうして増加した細胞スプレディング活性は高いｃ−Ａｂｌチロシン活性と一致し、Ｙ２１３の存在とは一致しない（細胞増殖とは対照的である）（図１０）。
【００６８】
これらのデータは、ｃ−ＡｂｌおよびＡｒｇのような非受容体Ａｂｌチロシンキナーゼ類がＡｂｉ／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１プロテインファミリーによって調節される一般的機序を示唆する。Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子は染色体１０ｐ１１．２上にある（Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、ジーンバンク受入れ番号Ｎｏ．Ｕ１８７６６；Ｈｓｓｈ３ｂｐ１はＡｂｉ１のヒト相同体である。Ａｂｉ１の部分的配列が最初に確定されたのはマウスであり（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、マウスＡｂｉ１の完全配列がより最近報告された（Ｉｋｅｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００１）。調節チロシン２１３を含む領域はヒトからツメガエルにいたるまでＡｂｉ１とＡｂｉ２との間に高度に保存されており、キイロショウジョウバエのＡｂｉに存在する（表３）。この保存された配列はＰＸＸＰモチーフ、１８１ＰＰＳＰＰ１８５も含む。これはｃ−Ａｂｌ−ＳＨ３ドメインおよびチロシン１９８に結合する。これまでに同定されたＡｂｉ１またはＡｂｉ２のすべてのアイソホーム（Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８、およびＬ．Ｋｏｔｕｌａ、未発表データ）はすべてのＡｂｉアイソホームにｃ−Ａｂｌ調節が保存されていることを示唆する調節配列を含む。Ａｂｉの保存された領域は明らかに細胞内のｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の調節にある役割を果たしている。ここで我々はＡｂｉ１のアイソホーム２におけるこの調節配列の役割を研究した。調節性Ｙ２１３のリン酸化後に、ＡｂｉがＡｂｌ ＳＨ２およびＳＨ３ドメインに結合する。これはｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の一過性のアップレギュレーションおよびその後のダウンレギュレーションにつながる。この分子調節は生理学的意味を有する。なぜならばＡｂｉ１に結合する多数のプロテインが、リン酸化の基質としてｃ−Ａｂｌキナーゼの標的とされているからである（Ｌｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｍａｒｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。そこでｃ−Ａｂｌキナーゼは、Ａｂｉプロテイン、ｃ−Ａｂｌおよびリン酸化サイクル後にターンオーバーする基質を含む複合体のためにきっちりと調節されなければならない。Ａｂｉ１もｃ−Ａｂｌの基質であるから、提案された調節は負のフィードバック機序を示唆する。Ａｂｉ１に対するｃ−Ａｂｌ ＳＨ３およびＳＨ２結合は細胞内のこの調節機序のために重要である。これらのドメインにおける突然変異が細胞の形質転換を起こすからである（Ｊａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９；Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。すべての調節ドメインをｃ−Ａｂｌと共有し、並びに同様なＳＴＩ−５７１阻害機序を有するＡｂｌファミリーの第二メンバーであるＡｒｇキナーゼ（Ｔａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）も、提起された機序によって調節されるらしい。
【００６９】
【表３】
Ａｂｉプロテインファミリーのｃ−Ａｂｌキナーゼ調節領域の種間比較。コアＰＸＸＰコンセンサスを含むＡｂｌ ＳＨ３ドメイン結合部位、ＰＰＳＰＰ、Ｙ１９８、およびＳＨ２ドメイン結合部位（下線を引いてある、調節ホスホチロシン、ｐＹを有する）を含むＡｂｉ１の領域は、Ａｂｉプロテインファミリーの進化の際に高度に保存される。重要な残基は太線で書かれている。配列のジーンバンク受入れ番号は次の通りである：Ａｂｉ１：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｕ８７１６６およびＮＭ＿００５４７０；Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ、ＸＰ＿８８１０７４．１；Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、ＸＰ＿８５８２３１．１；Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｑ８ＣＢＷ３；Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ、ＡＡＨ８１１７８．１；Ａｂｉ２：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、ＮＰ＿００５７５０．３；Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、ＡＡＨ７９６４６．１；Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ、ＸＰ＿４２１９６２．１；Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、ＮＰ＿００１００７４８８．１；Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ、ＸＰ＿６８５４３１．１、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、ＡＡＤ３８３８２．１。＊＊は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおける配列ＲＡＧＮＴＧＴＬＧＫＳＶＳＮＴの挿入を示す。
【００７０】
要するに、抗−Ａｂｌキナーゼ薬の新しい開発戦略として利用できるＡｂｌキナーゼの調節機序が確認された。ｃ−Ａｂｌキナーゼの突然変異型はある種の癌に関係している、例えばＢＣＲ Ａｂｌは慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）に関係しており、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の幾つかの型にも関係している（Ｄｒｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１ａ；Ｇｏｌｄｍａｎ ａｎｄ Ｍｅｌｏ，２００３）。ＳＴＩ−５７１の使用がこれら疾患を処置するために大きい希望をもたらすとはいえ、若干の患者は長期処置後にこの薬剤に対する耐性をもつようになる。ＳＴＩ−５７１耐性−突然変異がＡｂｌ ＳＨ３およびＳＨ２ドメインに見いだされ（Ａｚａｍ ｅｔ ａｌ．，２００３）、これらの症例においてＢＣＲ−ＡｂｌがＡｂｉ１による調節を逃れる可能性につながる（これはＮ−末端におけるＢＣＲの存在および調節性キャップ領域の欠如によってすでに影響を受けている）。ここに記載される機序はＢＣＲ−Ａｂｌの将来の研究に直接強い影響を与え、ＣＭＬを処置するための新規のアロステリック化合物の開発を助けるはずである。
【００７１】
実験法
Ａｂｌキナーゼ。Ｈｉｓタグ付、アンキャップド活性ｃ−Ａｂｌ、Ｅ４６からＣ−末端まで（アイソホーム１ｂ）（Ｔｏｎｙ Ｋｏｌｅｓｋｅ（エール大学、ニューヘブン、ＣＴ）のご好意により寄贈された）は、昆虫細胞を、細胞溶解前に３０μＭのＳＴＩ−５７１（ノバルティス ファーマ社（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＡＧ）、バーゼル、スイス）で４８時間処理した後、記載のようにバクロウイルスから作製、精製された（Ｔａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）。発現したプロテインはニッケル−ニトリロ酢酸アガロース上でアフィニティ精製し、洗浄して阻害物質を除去し、その後Ｍｏｎｏ Ｓカラム（アマーシャムビオサイエンシス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ピスカタウエイ、ＮＪ）を用いてイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。ｃ−Ａｂｌ ＳＨ２ドメイン野生型とＲ１７１Ｋ突然変異を含むＳＨ２ドメインとのＧＳＴ融合物、およびｃ−Ａｂｌ−ＧＳＴを含む哺乳動物発現プラスミド（アイソホーム１ｂ、Ｃ−末端にＧＳＴを有する）をＢｒｕｃｅ Ｍａｙｅｒ（Ｕｎｉｂｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｅｎｔｅｒ、ファーミントン、ＣＴ）から入手した。
【００７２】
Ａｂｉ１（ジーンバンク受入れ番号ＮＭ００５４７０およびＵ８７１６６）。野生型または突然変異体Ａｂｉ１アイソホーム２（残基番号はＺｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８による）はプラスミドから発現した。Ａｂｉ１のエクソン６が欠如している突然変異体Ａｂｉ１−△Ｅｘ６（Ｍａｃｏｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２００１）はＬｎＣＡＰ細胞からサブクローニングされた。突然変異体Ａｂｉ１−Ｆ２１３はＹ２１３Ｆ置換を含む。突然変異体Ａｂｉ１−Ｐｒｏは、Ａｂｉ１の残基１８１−１８５であるＰＰＳＰＰの代わりに配列ＡＥＳＥＡを含み、その結果ＰＸＸＰ ＳＨ３結合モチーフを喪失している。ＧＦＰをコードする配列を除去し、Ｃ−末端にＨＡタグを導入した後、すべてのＡｂｉ１ ｃＤＮＡｓをｐＥＧＦＰ−Ｎ２プラスミドにサブクローンニングした（クロンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、マウンテンビュー、ＣＡ）。質量分析（表１）、またはＳＨ３結合アッセイ（図２Ａ）のためにＡｂｉ１のＧＳＴ融合プロテインをｐＧＥＸ−２Ｔプラスミド（アマーシャム ビオサイエンシス社、ピスカタウエイ、ＮＪ）から発現させた。すべての発現プラスミドをシーケンシングによって確定した。Ａｂｉ１のＮ−末端のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を記載のように実施した（Ｍａｃｏｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【００７３】
キナーゼアッセイ。キナーゼ活性の測定は、ビオチニル化モデル基質ペプチドＧＧＥＡＩＹＡＡＰＦＫＫ（Ｂｒａｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｖａｎ Ｅｔｔｅｎ，２０００；Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５）および３２Ｐ−γ−ＡＴＰを用いて、実質上記載のように行われた（Ｔａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＳＡＭ２ストレプトアビジン塗布膜（プロメガ コーポレーション（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、マジソン ＷＩ）を用いて基質を捕獲した。キナーゼアッセイ混合物は、記載のように５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのジチオスレイトール、０．０１％Ｂｒｉｊ３５、および１００μＭのＡＴＰ、２ｎＭのＡｂｌキナーゼ、基質ペプチド、およびＡｂｉ１リガンドペプチドを含んでいた。反応は３０℃で５分間行われた。ＬｎＣＡＰ細胞系のｃ−Ａｂｌキナーゼを評価するために、細胞溶解前に細胞を１０分間ペルバナデートで処理した。溶解した細胞からの免疫沈降物を、基質としてＧＳＴ−Ｃｒｋを用いて試験した。
【００７４】
ペプチドおよび抗体。すべてのペプチドは、ゲネムド シンテシス社（Ｇｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．）（サンフランシスコ、ＣＡ）で合成された。抗−ｐＹ２１３ポリクローナル抗体をペプチドｐＹ２１３に対して作製し、ホスホペプチド特異的カラムを用いてアフィニティ精製し、その後非ホスホペプチド（Ｙ２１３）カラム上で精製した。ＰＹ９９抗体はサンタクルス バイオテクノロジー社（サンタクルス、ＣＡ）からのもであった。ポリクローナルおよびモノクローナルＨＡ抗体はコバンス社（バークレー、ＣＡ）およびロッシュ ディアグノスティック コーポレーション（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（インディアナポリス、ＩＮ）から入手した。ここで使用したｃ−Ａｂｌに対する抗体は８Ｅ９（ＢＤ ビオサイエンシス、サンホゼ、ＣＡ）、Ｋ１２（サンタクルス バイオテクノロジー、サンタクルス、ＣＡ）、ｐＹ４１２（ビオソース インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、カマリロ、ＣＡ）から入手した；Ｃｒｋ抗体はＢＤビオサイエンシス社、サンホセ、ＣＡ（マウスモノクローナル）；サンタクルス バイオテクノロジー社、サンタクルス、ＣＡ（ウサギポリクローナル）；およびセル シグナリング テクノロジー社（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ホスホ−Ｃｒｋ ｐＹ２２１）から得たものである。Ａｂｉ１に対するポリクローナル抗体Ａｂ−２が記載されている（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０００）。Ａｂｉ１に対するモノクローナル抗体７Ｂ６が組換えＡｂｉ１に対して作製された；この抗体のエピトープはＭａｂ ４Ｅ２と一致した（Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）はイムゲネックス コーポレーション（Ｉｍｇｅｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（サンジエゴ、ＣＡ）から；ＧＳＴ抗体はチムド社（Ｚｙｍｅｄ）（サンフランシスコ、ＣＡ）から入手した。ホスホチロシンに対するジェネリック抗体、ＰＹ９９およびｐＹ３５０、はサンタクルス バイオテクノロジー社、サンタクルス、ＣＡから入手した。
【００７５】
細胞培養およびトランスフェクション。Ｃｏｓ７およびＬｎＣＡＰ細胞（ＡＴＣＣ、ロックヴィル、ＭＤ）はＡＴＣＣのインストラクションによって維持された。シングルＡｂｌ（−／−）ノックアウト線維芽細胞（Ｋｏｌｅｓｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８）はウシ胎児血清を用いて維持された。リポフェクタミン プラス試薬（Ｌｉｐｏｅｆｅｔａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ）（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバド、ＣＡ）を用いてすべての細胞に発現プラスミドをトランスフェクトした。ｃ−Ａｂｌのアイソホーム１ｂ、およびＡｂｉ１のアイソホーム２（野生型または突然変異体）で、Ａｂｉ１とｃ−Ａｂｌとによるすべての共トランスフェクションを行った。トランスフェクションの２２時間後に、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）が報告したように、細胞を間接的免疫沈降または免疫蛍光法のために処理した。Ａｂｉ１アイソホーム２の野生型またはＨＡタグ付または突然変異体を発現する安定な細胞系をＧ４１８選択を用いて得た（インヴィトロジェン社、カールスバド、ＣＡ）；サブクローン化細胞系、Ａｂｉ１（＋）クローン１、およびＡｂｉ１（＋）、クローン１０における組み換え遺伝子の発現は、特異的プライマーを用いて得られたＲＴ−ＰＣＲ生成物のシーケンシングによって確定された。ＨＡ−タグ付Ａｂｉ１の選択後、上記組換え蛋白の同レベルの発現を有する二重クローンが選択され、分析された。安定クローンの選択後、ＬｎＣＡＰ細胞またはそのＡｂｉ１（＋）サブクローンにおけるすべての実験はＧ４１８を添加せずに行われた。細胞増殖速度の測定は、標準としてＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭフローサイトメーターおよびＦｌｏｗ−ＣｏｕｎｔＴＭフルオロスフェアーズＣａｔ．Ｎｏ ７５４７０５３−２００を用いて細胞数を数えることによって行われた（ＢＤビオサイエンシス社、サンホセ、ＣＡ）。
【００７６】
免疫沈降およびウエスタンブロッティング。細胞を、細胞溶解前に０．１ｍＭ過バナジウム酸ナトリウムで処理し、ホスファターゼを阻害した。免疫沈降を記載のように行った（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０００）。Ａｂｌ ＳＨ３ドメイン結合を定量するためのウエスタンブロッティングおよび結合アッセイを記載のように行った（Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）；ブロットはスーパーシグナル・ウエスト・ピコ化学ルミネッセンス基質（ピアス バイオテクノロジー社、ロックフォード、ＩＬ）を用いて展開した。コダックＧＬ４４０画像化装置を用いて画像化し、コダック１Ｄ画像分析ソフトウエア（バージョン３．６．４）を用いて直接定量するかまたはあらかじめフィルムに露出させてから定量した。
【００７７】
共焦点顕微鏡。ＬｎＣＡＰおよびＡｂｉ１−トランスフェクテド細胞系における細胞スプレディング活性を評価するために、８−チェンバ培養スライド（ＢＤビオサイエンシス社、サンホセ、ＣＡ）を用いて生細胞の観察を行った。細胞スプレディング活性は次のように評価した：細胞が何らかの伸長を示した場合スプレディング活性を有すると評価し（陽性）、または細胞が丸い場合はスプレディング活性はない（陰性）と評価した。対照実験において、ＳＴＩ−５７１を３μＭで２４時間培地に加え、その後この化合物を加えずに再培養した。指示された時点に対象の４つのランダム領域の細胞を評価した。それは各時点にまたはｎ＞１００細胞の群で１６時間続けられた。観察は、Ｚｅｉｓｓ５１０ＭＥＴＡ共焦点顕微鏡を用いて培養後１６時間行われた。ＬｎＣＡＰの細胞のスプレディングを確認するために、コラーゲンセル上のクローンをコラーゲンで覆った皿（マトテック・コーポレーション（ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎアシュランド、ＭＡ）上に培養し、再培養後６時間の各クローンについて平均細胞面積（ｎ＝２０）を評価した（ＩｍａｇｅＪ，ｖｅｒｓｉｏｎ１．３６ｂ、ナショナルインスティチュート・オブ・ヘルス、ＵＳＡ）。
【００７８】
表面プラスモン共鳴アッセイ。表面プラスモン共鳴アッセイはバイアコア３０００インスツルメント（ＢＩＡコア社（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）、ピスカタウエイ、ＮＪ）を用いて行われた。ビオチニル化１４残基ペプチド、ｐＹ２１３またはＹ２１３、をストレプトアビジン−コーテド（ＳＡ）バイオセンサーチップ（ＢＩＡコア社，ピスカタウエイ、ＮＪ）の表面に結合させた。結合反応は１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０５％（ｖ／ｖ）表面活性剤Ｐ２０を含むＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で行われた。新たな各注入の前に５０ｍＭのＮａＯＨおよび１ＭのＮａＣｌを用いて表面を再生した。バイアコア機器は、同じ再生された表面上でＧＳＴ Ａｂｌ ＳＨ２ポリペプチドの濃度を高めながら一連の結合アッセイを行うようにプログラムされた。誘導されたセンソグラム（表面上の反応単位の変化を時間の関数としてプロットする）をソフトウエアＢＩＡｅｖａｌ３．０を用いて分析した。アフィニティ常数は１：１結合モデルを用いてフィットする曲線によって推定された。
【００７９】
分子模型化。Ａｂｉ１（Ｐ２０６−Ｐ２１７）からのペプチドを含む１２残基のホスホチロシンをｃ−Ｓｒｃプロテイン（ｐｄｂエントリー２ｓｒｃ）のＣ−末端領域（Ｆ５２０−Ｅ５３１）のｘ線結晶構造に基づいて模型化した。ｃ−Ａｂｌおよびｃ−Ｓｒｃキナーゼ類は高度の相同性を有し、ｃ−Ｓｒｃのホスホチロシン残基（ｐＹ）５２７はＳＨ２ドメインに結合するから、２つの構造をＱｕａｎｔａ２０００ソフトウエア（アクセルリーズ社、サンジエゴ、ＣＡ）でペプチド（Ｆ５２０−Ｅ５３１）を整列させ、ｃ−ＳＲＣプロテインからの上記ｃ−Ａｂｌおよびペプチドを合流させることによって、ペプチド（Ｆ５２０−Ｅ５３１）をｃ−Ａｂｌのｘ−線構造（ｐｄｂエントリー１ｏｐｌ）上に置いた。このペプチドをその後トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）ソフトウエアの突然変異誘発フィーチャーを用いてＡｂｉ１（Ｐ２０６−Ｐ２１７）ペプチドに突然変異させた。上記フィーチャーはプロテイン突然変異体のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ構造のために設計されたものである（Ｄａｍｂｏｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２００１）。トリトンは外部プログラム、Ｍｏｄｅｌｌｅｒ、を用いて突然変異体の三次元構造を作り出す（Ｆｉｓｈｅｒ ａｎｄ Ｓａｌｉ、２００３）。ＴＲＩＴＯＮはホスホチロシン残基を確認しないから、最初はその代わりにチロシンを置いた。チロシン残基を、ＴＲＩＴＯＮ突然変異誘発工程後に、Ｑｕａｎｔａ２０００で突然変異させてホスホチロシン残基に戻した。その残基をＱｕａｎｔａの蛋白設計オプション（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｐｔｉｏｎ）内の“模型側鎖”を用いてさらに模型化した。ｃ−Ａｂｌ構造上に入っている突然変異ペプチドのプロテイン・ヘルス・チェックにより、密な接触は少なく、Ｃｈａｒｍｍエネルギーが高いことが明らかになった。その構造をＳｔｅｅｐｅｓｔ Ｄｅｓｃｅｎｔの５０工程、および１００工程のＣｏｎｊｕｇａｔｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ法によって最小化し、これらの密な接触を除去した。
【００８０】
統計分析。細胞増殖および細胞スプレディング活性の評価以外のすべての分析はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２００４ ｆｏｒ Ｍａｃ Ｖｅｒｓｉｏｎ１１．０を用いて行われた。表２（ＫｍおよびＶｍａｘの評価）および図７Ｂおよび７Ｄ（ＬｎＣＡＰクローンのＡｂｌキナーゼ活性、およびコアーゲン上の細胞スプレディング）では両側対ｔ検定が用いられた。細胞スプレディング活性の評価、図５Ｃ、では、χ２検定が用いられた；細胞増殖の評価、図７Ｃ、では、二元配置ＡＮＯＶＡを用いた（ＳｉｇｍａＳｔａｔバージョン２、シスタト ソフトウエア社（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．ポイントリッチモンド、ＣＡ）。図６Ａでは、両側等分散性ｔ−検定が用いられた。
【００８１】
（参考文献）
【００８２】
【表４】
【００８３】
【表５】
【００８４】
【表６】
【００８５】
【表７】
【００８６】
【表８】
上記から、本発明の幾つかの有益性が実現し、その他の有益性も得られることがわかる。
【００８７】
上記方法および組成物には本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更がなされ得るから、上記の記載に含まれ、添付の図面に示されるすべての事柄は例証的なものであり、制限するものではない。
【００８８】
本明細書に記載されるすべての参考文献は参照としてここに組み込まれる。本明細書中の参考文献の検討は単に著者によってなされる主張をまとめたものに過ぎず、任意の参照が先行技術を構成することの承認はなされていない。出願人は記載の参考文献の正確さおよび適切性を吟味する権利を保有するものである。
【００８９】
（付録−配列番号）
【００９０】
【表９】
【００９１】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１は、ｃ−Ａｂｌキナーゼリン酸化部位として同定されたＡｂｉ１Ｙ２１３を示すウエスタンブロットの図および写真である。パネルＡはＡｂｉ１の調節領域を示す。最上部は本研究に用いたペプチドの図である。その図の下は調節因子チロシン２１３を含むＡｂｉ１の配列（残基１６９から２１７まで、ジーンバンク受入れ番号Ｕ８７１６６）である。実施例に記載される実験に用いたペプチド類の名称は特異的ペプチドを描くライン上にある。ＰｒｏはＰＸＸＰモチーフ、ＰＰＳＰＰが含まれることをあらわす；Ｙはチロシンを示す；ｐＹはホスホチロシンを示す、Ｆはチロシンのフェニルアラニン置換を示す。キナーゼアッセイに用いられるペプチドＰｒｏ−ｐＹ２１３、ｐＹ２１３、およびＦ２１３ペプチドのＮ−末端は配列上にかぎ付矢印でマークされる。ペプチドＰｒｏ−Ｙ１９８およびＰｒｏ−Ｆ１９８は残基１６９−２０３に及ぶ；これらのペプチドにはｐＹ２１３配列はない。ペプチドＥＥ−Ｙ１９８はＰＰＳＰＰの代わりに配列ＰＥＳＥＰを含み、その結果ＰＸＸＰ ＳＨ３結合モチーフは喪失する。パネルＡの最下部はＡｂｉ１のＮ−末端のチロシンリン酸化を最初に特徴づけるために用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳ポリペプチド類を描いた図である。特徴的チロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）置換を含むポリペプチド類（矩形）が野生型ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｈプロテインの下に図式的に描かれる。突然変異により、対象領域におけるチロシン残基Ｙ１９８、およびＹ２１３のどちらかまたは両方が置換される。各ポリペプチドのキナーゼアッセイ結果は右側に示される。黒色領域はＬｎＣＡＰ細胞中に欠如しているＡｂｉ１のエクソン６を示す。パネルＢはＡｂｉ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳Ｎ−末端のチロシンリン酸化を示すウエスタンブロットである。このプロテインのＮ−末端の半分およびチロシン残基の指示された突然変異を含むＡｂｉ１ポリペプチド類はｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼとのｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼ反応を受けた。ポリペプチド類はＳＤＳトリシン ポリアクリルアミドゲル（７％）で分離され、その後ＰＶＤＦ膜上にブロットされた。左のブロットはａｎｔｉ−ＨＡ抗体でブロットした膜を示す。ＨＡエピトープは各ポリペプチドのＣ−末端に挿入された。右のブロットはａｎｔｉ−ホスホチロシン抗体ＰＹ−９９でブロットした同じポリペプチドを示す。ＷＴ、野生型ポリペプチド；Ｆ２１３、チロシン２１３のフェニルアラニン置換を含むポリペプチド（Ｙ２１３Ｆ）；Ｆ１９８、チロシンのフェニルアラニン置換を含むポリペプチド（Ｙ１９８Ｆ）；ＦＦ、Ｙ２１３ＦおよびＹ１９８Ｆを含むポリペプチド；リゼート、Ａｂｉ１ｃＤＮＡをもたない溶解物。
【図２−１】図２は、Ａｂｉ１のＮ−末端における、ｃ−Ａｂｌ ＳＨ３およびＳＨ２ドメインの最小結合領域の確定を示すウエスタンブロットのグラフおよび写真である。パネルＡはこのｃ−Ａｂｌ ＳＨ３ドメインへの結合を示す。Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈｂ３ｐｌのＮ−末端領域を含む組換えＧＳＴ融合ポリペプチド類をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に移した。次に示すＡｂｉ１ポリペプチドを分析した：残基１−１８７をコードするＮｌ−１８７；残基１−１７２をコードするＮｌ−１７２；残基１−２５３をコードするＮｌ−２５３；残基１−２５３をコードするが、Ａｂｉ１のエクソン６配列が欠如しているＮｌ−２５３△Ｅｘ６（Ｍａｃｏｓｋａ ｅｔ ａｌ，２００１）；ＧＳＴはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼである。左のウエスタンブロットの一番下の写真は、プロテイン発現レベルを示すために抗ＧＳＴモノクローナル抗体（抗ＧＳＴ）で試験した際の結果を示す。最上部の写真はビオチニル化ＧＳＴ−Ａｂｌ−ＳＨ３ドメイン（ＧＳＴ−Ａｂｌ−ＳＨ３−Ｂ）で得られた。ビオチニル化ＧＳＴ（ＧＳＴ−Ｂ）への結合は認められなかった（真中のパネル）。グラフは、独立的３実験から定量されたポリペプチドの相対的結合（ｎ＝３、±ｓ．ｄ．）をＮｌ−２５３のパーセントとして示す。パネルＢ−Ｄはｃ−Ａｂｌ ＳＨ２ドメインへの結合を示す。表面プラズモン共鳴分析を用いて、ＧＳＴ標識Ａｂｌ ＳＨ２ドメインに対する、リン酸化チロシン２１３（ｐＹ２１３）または非リン酸化チロシン２１３（Ｙ２１３）を含むビオチニル化１４−残基ペプチド類の相互作用を決定した。パネルＢは、ｐＹ２１３またはＹ２１３ペプチド類と結合したバイオセンサーチップスをＡｂｌ ＳＨ２ドメイン（１μＭ）と共に注入した際の結果を示す；パネルＣはｐＹ２１３結合バイオセンサーチップを指示された種々濃度のＡｂｌ ＳＨ２ドメインと共に注入した際の結果を示す。パネルＤはｐＹ２１３結合バイオセンサーチップを０．５μＭのＡｂｌ ＳＨ２ドメインまたはＡｂｌ ＳＨ２ドメインＲ１７１Ｋ突然変異体と共に注入した際の結果を示す。ＧＳＴプロテインだけに対する結合は認められなかった（図示されず）。ＲＵは反応単位。
【図２−２】図２は、Ａｂｉ１のＮ−末端における、ｃ−Ａｂｌ ＳＨ３およびＳＨ２ドメインの最小結合領域の確定を示すウエスタンブロットのグラフおよび写真である。パネルＡはこのｃ−Ａｂｌ ＳＨ３ドメインへの結合を示す。Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈｂ３ｐｌのＮ−末端領域を含む組換えＧＳＴ融合ポリペプチド類をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に移した。次に示すＡｂｉ１ポリペプチドを分析した：残基１−１８７をコードするＮｌ−１８７；残基１−１７２をコードするＮｌ−１７２；残基１−２５３をコードするＮｌ−２５３；残基１−２５３をコードするが、Ａｂｉ１のエクソン６配列が欠如しているＮｌ−２５３△Ｅｘ６（Ｍａｃｏｓｋａ ｅｔ ａｌ，２００１）；ＧＳＴはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼである。左のウエスタンブロットの一番下の写真は、プロテイン発現レベルを示すために抗ＧＳＴモノクローナル抗体（抗ＧＳＴ）で試験した際の結果を示す。最上部の写真はビオチニル化ＧＳＴ−Ａｂｌ−ＳＨ３ドメイン（ＧＳＴ−Ａｂｌ−ＳＨ３−Ｂ）で得られた。ビオチニル化ＧＳＴ（ＧＳＴ−Ｂ）への結合は認められなかった（真中のパネル）。グラフは、独立的３実験から定量されたポリペプチドの相対的結合（ｎ＝３、±ｓ．ｄ．）をＮｌ−２５３のパーセントとして示す。パネルＢ−Ｄはｃ−Ａｂｌ ＳＨ２ドメインへの結合を示す。表面プラズモン共鳴分析を用いて、ＧＳＴ標識Ａｂｌ ＳＨ２ドメインに対する、リン酸化チロシン２１３（ｐＹ２１３）または非リン酸化チロシン２１３（Ｙ２１３）を含むビオチニル化１４−残基ペプチド類の相互作用を決定した。パネルＢは、ｐＹ２１３またはＹ２１３ペプチド類と結合したバイオセンサーチップスをＡｂｌ ＳＨ２ドメイン（１μＭ）と共に注入した際の結果を示す；パネルＣはｐＹ２１３結合バイオセンサーチップを指示された種々濃度のＡｂｌ ＳＨ２ドメインと共に注入した際の結果を示す。パネルＤはｐＹ２１３結合バイオセンサーチップを０．５μＭのＡｂｌ ＳＨ２ドメインまたはＡｂｌ ＳＨ２ドメインＲ１７１Ｋ突然変異体と共に注入した際の結果を示す。ＧＳＴプロテインだけに対する結合は認められなかった（図示されず）。ＲＵは反応単位。
【図３−１】図３はＡｂｉ１からのホスホペプチド類がｉｎ ｖｉｔｒｏでｃ−Ａｂｌ−キナーゼ活性を調節することを示す結果である。パネルＡは指示されたペプチド類を２ｍＭで添加した後のｃ−Ａｂｌ−のキナーゼ活性を示す。垂直棒は±ｓ．ｄ．を示す；ｎ＝３。基質ペプチド濃度を高めながら、活性を５分間キナーゼアッセイで測定した。パネルＢはパネルＡのデータの二重逆数ラインウェーバーバーク・プロットを示す。垂直棒は±ｓ．ｄ．を示す（ｎ＝３）。パネルＥは指示された濃度のＹ２１３（非リン酸化）ペプチドを添加した後のｃ−Ａｂｌのキナーゼ活性（平均値±ｓｅｍ；ｎ＝３）を示す。パネルＦは２ｍＭ濃度を除いて、パネルＥのデータの二重逆数ラインウェーバーバーク・プロットを示す。これらの実験からのＶｍａｘおよびＫｍデータについては表２を参照されたい。パネルＣ、ＤおよびＧは、基質ペプチド、ＰＥＰ、１００μＭで、指示されたＡｂｉ１ペプチド濃度で、Ａｂｉ１からのペプチド類（図１Ａ）の添加後のｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を示す；垂直棒はｓ．ｅ．ｍ．をあらわす（ｎ＝３）。パネルＧはＣと同じであるが、Ｙ２１３実験からの追加的データを含む。ここに使用したペプチド類の配列情報については図１Ａを参照されたい。
【図３−２】図３はＡｂｉ１からのホスホペプチド類がｉｎ ｖｉｔｒｏでｃ−Ａｂｌ−キナーゼ活性を調節することを示す結果である。パネルＡは指示されたペプチド類を２ｍＭで添加した後のｃ−Ａｂｌ−のキナーゼ活性を示す。垂直棒は±ｓ．ｄ．を示す；ｎ＝３。基質ペプチド濃度を高めながら、活性を５分間キナーゼアッセイで測定した。パネルＢはパネルＡのデータの二重逆数ラインウェーバーバーク・プロットを示す。垂直棒は±ｓ．ｄ．を示す（ｎ＝３）。パネルＥは指示された濃度のＹ２１３（非リン酸化）ペプチドを添加した後のｃ−Ａｂｌのキナーゼ活性（平均値±ｓｅｍ；ｎ＝３）を示す。パネルＦは２ｍＭ濃度を除いて、パネルＥのデータの二重逆数ラインウェーバーバーク・プロットを示す。これらの実験からのＶｍａｘおよびＫｍデータについては表２を参照されたい。パネルＣ、ＤおよびＧは、基質ペプチド、ＰＥＰ、１００μＭで、指示されたＡｂｉ１ペプチド濃度で、Ａｂｉ１からのペプチド類（図１Ａ）の添加後のｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を示す；垂直棒はｓ．ｅ．ｍ．をあらわす（ｎ＝３）。パネルＧはＣと同じであるが、Ｙ２１３実験からの追加的データを含む。ここに使用したペプチド類の配列情報については図１Ａを参照されたい。
【図３−３】図３はＡｂｉ１からのホスホペプチド類がｉｎ ｖｉｔｒｏでｃ−Ａｂｌ−キナーゼ活性を調節することを示す結果である。パネルＡは指示されたペプチド類を２ｍＭで添加した後のｃ−Ａｂｌ−のキナーゼ活性を示す。垂直棒は±ｓ．ｄ．を示す；ｎ＝３。基質ペプチド濃度を高めながら、活性を５分間キナーゼアッセイで測定した。パネルＢはパネルＡのデータの二重逆数ラインウェーバーバーク・プロットを示す。垂直棒は±ｓ．ｄ．を示す（ｎ＝３）。パネルＥは指示された濃度のＹ２１３（非リン酸化）ペプチドを添加した後のｃ−Ａｂｌのキナーゼ活性（平均値±ｓｅｍ；ｎ＝３）を示す。パネルＦは２ｍＭ濃度を除いて、パネルＥのデータの二重逆数ラインウェーバーバーク・プロットを示す。これらの実験からのＶｍａｘおよびＫｍデータについては表２を参照されたい。パネルＣ、ＤおよびＧは、基質ペプチド、ＰＥＰ、１００μＭで、指示されたＡｂｉ１ペプチド濃度で、Ａｂｉ１からのペプチド類（図１Ａ）の添加後のｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を示す；垂直棒はｓ．ｅ．ｍ．をあらわす（ｎ＝３）。パネルＧはＣと同じであるが、Ｙ２１３実験からの追加的データを含む。ここに使用したペプチド類の配列情報については図１Ａを参照されたい。
【図３−４】図３はＡｂｉ１からのホスホペプチド類がｉｎ ｖｉｔｒｏでｃ−Ａｂｌ−キナーゼ活性を調節することを示す結果である。パネルＡは指示されたペプチド類を２ｍＭで添加した後のｃ−Ａｂｌ−のキナーゼ活性を示す。垂直棒は±ｓ．ｄ．を示す；ｎ＝３。基質ペプチド濃度を高めながら、活性を５分間キナーゼアッセイで測定した。パネルＢはパネルＡのデータの二重逆数ラインウェーバーバーク・プロットを示す。垂直棒は±ｓ．ｄ．を示す（ｎ＝３）。パネルＥは指示された濃度のＹ２１３（非リン酸化）ペプチドを添加した後のｃ−Ａｂｌのキナーゼ活性（平均値±ｓｅｍ；ｎ＝３）を示す。パネルＦは２ｍＭ濃度を除いて、パネルＥのデータの二重逆数ラインウェーバーバーク・プロットを示す。これらの実験からのＶｍａｘおよびＫｍデータについては表２を参照されたい。パネルＣ、ＤおよびＧは、基質ペプチド、ＰＥＰ、１００μＭで、指示されたＡｂｉ１ペプチド濃度で、Ａｂｉ１からのペプチド類（図１Ａ）の添加後のｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を示す；垂直棒はｓ．ｅ．ｍ．をあらわす（ｎ＝３）。パネルＧはＣと同じであるが、Ｙ２１３実験からの追加的データを含む。ここに使用したペプチド類の配列情報については図１Ａを参照されたい。
【図４】図４は、Ｙ２１３がｃ−Ａｂｌキナーゼによってリン酸化されていることを示すウエスタンブロットである。パネルＡは、組換えＡｂｉ１のＹ２１３リン酸化がｃ−Ａｂｌキナーゼの発現に依存することを示している。二重Ａｂｌ（−／−）Ａｒｇ（−／−）ノックアウト細胞に野生型または突然変異体Ａｂｉ１プラスミドを単独でトランスフェクトし、または示されるようにＡｂｉ１とｃ−Ａｂｌとを一緒にトランスフェクトした：野生型Ａｂｉ１（Ａｂｉ１−Ｗｔ）；Ｙ２１３Ｆ突然変異を有するＡｂｉ１（Ａｂｉ１−Ｆ２１３）；Ｙ２１３を含む、エクソン６が欠如しているＡｂｉ１突然変異体（Ａｂｉ１−△ｅｘ６）；ＰＸＸＰ１８１ＡＥＳＥＡ１８５突然変異を含むＡｂｉ１突然変異体（Ａｂｉ１−Ｐｒｏ）。細胞溶解物の部分を、モノクローナル抗ＨＡ抗体、またはｃ−Ａｂｌに対するＫ１２ポリクローナル抗体で免疫沈降させた。免疫沈降サンプルを４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜上に移した。その膜を最初にｐＹ２１３（Ａ）またはＰＹ９９（Ｂ）に対するリン特異的抗体でブロットし（パネルＢも参照）、その後ストリッピングし、ＨＡに対するポリクローナル抗体（Ａｂｉ１−ＨＡ）でブロットし、それからストリッピングし、ｐＹ２１３（Ａ）およびＰＹ９９（Ｂ）に対するリン特異的抗体でブロットした。“ｃ−Ａｂｌ”は、８Ｅ９でブロットして得られたｃ−Ａｂｌ発現（アイソホーム１ｂ）のレベルを示す。パネルＢは、ペプチドｐＹ２１３を含むホスホチロシンに対するポリクローナル抗体が、ｃ−Ａｂｌによってリン酸化されたＡｂｉ１に高度に特異的であることを示す。漸増量の全長ＧＳＴ−Ａｂｉ１をバキュロウイルス精製ｃ−Ａｂｌと共に（＋ｃ−Ａｂｌ）、またはこれなしで（−ｃ−Ａｂｌ）、実施例の実験法の部、キナーゼアッセイの部分に記載のようにインキュベートした。一致する量の反応混合物（漸増する相対的量１．０ｘ、１．５ｘ、２．０ｘ）をＳＤＳ ＰＡＧＥ上で分離し、その後ホスホペプチドｐＹ２１３（ｐＹ２１３）に対するアフィニティ精製抗体でブロットするかまたはホスホチロシンｐＹ３５０（ｐＹ３５０）に対するジェネリック抗体でブロットした；“Ａｂｉ１”はＧＳＴに対するポリクローナル抗体を用いて測定したＧＳＴ融合プロテインのレベルを示す。
【図５−１】図５はＡｂｉ１を強化したＬｎＣＡＰ細胞の増殖阻害および細胞スプレディング活性阻害を示す細胞のグラフおよび顕微鏡写真である。パネルＡはＡｂｉ１による増殖阻害を示すグラフである。増殖速度は最初の培養後の指示された時点における細胞数を数えることによって評価した。組換えＡｂｉ１を安定的に発現するＬｎＣＡＰクローン：Ａｂｉ（＋）クローン１、クローン１；Ａｂｉ１（＋）クローン１０、クローン１０；ＬｎＣＡＰ、野生型ＬｎＣＡＰ細胞。垂直誤差棒は±ｓ．ｄ．（ｎ＝４）。パネルＢおよびＣはＬｎＣＡＰ細胞のスプレディング活性を示す。パネルＢは生きている細胞の観察からの代表的画像である。各画像の下部に記載された数は培養後経過した時間（ｈｏｕｒｓ）を示す。パネルＣは、Ａｂｉ１移入細胞系およびＬｎＣＡＰ細胞、またはＳＴＩ−５７１で処理したＬｎＣＡＰ細胞においてスプレディング活性を有する細胞のパーセントを示す。各群におけるスプレディング活性を有する細胞を指示された時点に評価した；ＬｎＣＡＰ対Ａｂｉ１（＋）細胞系：２時間、ｐ＝０．４６；４時間−１６時間 ｐ＜０．００１（χ２）；未処理ＬｎＣＡＰ対ＳＴＩ−５７１−処理ＬｎＣＡＰ細胞 ２時間、ｐ＝０．４０；４時間−１０時間 ｐ＜０．００１（χ２）；１２−１６時間 ｐ＞０．０５；各時点における細胞数ｎ＞１００。ＬｎＣＡＰ、野生型ＬｎＣＡＰ細胞；Ａｂｉ１（＋）、クローン１０；ＳＴＩ−５７１、ＳＴＩ−５７１で処理したＬｎＣＡＰ細胞。ＬｎＣＡＰ細胞を、薬剤なしで再培養する前に２４時間ＳＴＩ−５７１（３μＭ）で処理した。時間量が増すにつれて細胞スプレディング活性に対する薬剤の阻害効果は減少することに注目されたい。
【図５−２】図５はＡｂｉ１を強化したＬｎＣＡＰ細胞の増殖阻害および細胞スプレディング活性阻害を示す細胞のグラフおよび顕微鏡写真である。パネルＡはＡｂｉ１による増殖阻害を示すグラフである。増殖速度は最初の培養後の指示された時点における細胞数を数えることによって評価した。組換えＡｂｉ１を安定的に発現するＬｎＣＡＰクローン：Ａｂｉ（＋）クローン１、クローン１；Ａｂｉ１（＋）クローン１０、クローン１０；ＬｎＣＡＰ、野生型ＬｎＣＡＰ細胞。垂直誤差棒は±ｓ．ｄ．（ｎ＝４）。パネルＢおよびＣはＬｎＣＡＰ細胞のスプレディング活性を示す。パネルＢは生きている細胞の観察からの代表的画像である。各画像の下部に記載された数は培養後経過した時間（ｈｏｕｒｓ）を示す。パネルＣは、Ａｂｉ１移入細胞系およびＬｎＣＡＰ細胞、またはＳＴＩ−５７１で処理したＬｎＣＡＰ細胞においてスプレディング活性を有する細胞のパーセントを示す。各群におけるスプレディング活性を有する細胞を指示された時点に評価した；ＬｎＣＡＰ対Ａｂｉ１（＋）細胞系：２時間、ｐ＝０．４６；４時間−１６時間 ｐ＜０．００１（χ２）；未処理ＬｎＣＡＰ対ＳＴＩ−５７１−処理ＬｎＣＡＰ細胞 ２時間、ｐ＝０．４０；４時間−１０時間 ｐ＜０．００１（χ２）；１２−１６時間 ｐ＞０．０５；各時点における細胞数ｎ＞１００。ＬｎＣＡＰ、野生型ＬｎＣＡＰ細胞；Ａｂｉ１（＋）、クローン１０；ＳＴＩ−５７１、ＳＴＩ−５７１で処理したＬｎＣＡＰ細胞。ＬｎＣＡＰ細胞を、薬剤なしで再培養する前に２４時間ＳＴＩ−５７１（３μＭ）で処理した。時間量が増すにつれて細胞スプレディング活性に対する薬剤の阻害効果は減少することに注目されたい。
【図６−１】図６は、Ａｂｉ１の発現がＬｎＣＡＰ細胞のｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を阻害することを示す、ウエスタンブロットおよび染色されたゲルのグラフおよび写真である。ｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を、野生型細胞系（ＬｎＣＡＰ）およびＡｂｉ（Ａｂｉ１＋）を安定的にトランスフェクトした細胞系（クローン１０）において評価した。パネルＡはｃ−ＡｂｌキナーゼおよびＡｂｉ１の発現レベルを示す。左側は、ｃ−Ａｂｌ（８Ｅ９）およびＡｂｉ１（Ａｂ−２）がそれぞれＫ１２および７Ｂ６で免疫沈降し、指示された抗体でブロットした場合のウエスタンブロットを示す。右のグラフは細胞系におけるＡｂｉ１の発現レベルを示す（ｎ＝３；±ｓ．ｄ．；ｐ＝０．２８６１）。パネルＢはＬｎＣＡＰ細胞系から免疫沈降したｃ−Ａｂｌキナーゼの活性を示す。左側はｃ−Ａｂｌキナーゼアッセイが基質としてＧＳＴ−Ｃｒｋを用いて行われ；反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ９９）または抗ＧＳＴ抗体（抗ＧＳＴ）でブロットするウエスタンブロットを示す。“抗ＧＳＴ”は各反応にＧＳＴ基質が入れられることを示唆する。“ＬｎＣＡＰ”は、ＬｎＣＡＰにおけるＣｒｋリン酸化を示す。“対照”はＬｎＣＡＰ細胞系からの対照ＩｇＧ免疫沈降に加えられた反応混合物である。グラフは細胞系におけるＣｒｋリン酸化レベルを示す（±ｓ．ｄ．；ｎ＝３；ｐ＝０．０１２４）。パネルＣはＡｂｉ１を補充したＬｎＣＡＰ細胞系におけるチロシンリン酸化を示す。左側は、ｃ−Ａｂｌキナーゼを細胞系から免疫沈降させ（Ｋ１２抗体）、８Ｅ９（ｃ−Ａｂｌプロテインレベル）またはＰＹ９９（ｃ−Ａｂｌ上のチロシンリン酸化を示す）抗体でブロットするウエスタンブロットを示す。“ＧＡＰＤＨ”は免疫沈降のために用いるリゼート投入レベルを示す。右側は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離され、その後クーマッシー染色（“クーマッシー”）されるか、またはブロッティングされ、抗ホスホチロシン抗体ＰＹ９９で染色される指示された細胞系からの総細胞リゼート類を示す。グラフは細胞系の総リン酸化レベルを示す（±ｓ．ｄ．；ｎ＝３；ｐ＝０．０１０１）。パネルＤは、Ａｂｉ１がｃ−Ａｂｌキナーゼと相互作用することを示す。Ａｂｉ１を指示された細胞系から免疫沈降させ、免疫沈降した蛋白類は、特異的抗体：Ａｂ−２（Ａｂｉ１）；Ｋ−１２（ｃ−Ａｂｌ−ｃｏＩＰ）を用いてウエスタンブロッティングによって分析した。“ｃ−Ａｂｌ−ＩＰ”は、Ｋ１２抗体で免疫沈降させ、８Ｅ９と共にブロッティングした後の細胞系のｃ−Ａｂｌキナーゼのレベルをあらわす。“ｐＹ２１３”はＹ２１３におけるリン酸化Ａｂｉ１の免疫反応性をあらわす。免疫沈降したＡｂｉ１は比較のために等レベルで担持された。実施例の実験法の部に記載されているように、全ての細胞系は溶解および免疫沈降の前にプレバナデートで処理された。
【図６−２】図６は、Ａｂｉ１の発現がＬｎＣＡＰ細胞のｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を阻害することを示す、ウエスタンブロットおよび染色されたゲルのグラフおよび写真である。ｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を、野生型細胞系（ＬｎＣＡＰ）およびＡｂｉ（Ａｂｉ１＋）を安定的にトランスフェクトした細胞系（クローン１０）において評価した。パネルＡはｃ−ＡｂｌキナーゼおよびＡｂｉ１の発現レベルを示す。左側は、ｃ−Ａｂｌ（８Ｅ９）およびＡｂｉ１（Ａｂ−２）がそれぞれＫ１２および７Ｂ６で免疫沈降し、指示された抗体でブロットした場合のウエスタンブロットを示す。右のグラフは細胞系におけるＡｂｉ１の発現レベルを示す（ｎ＝３；±ｓ．ｄ．；ｐ＝０．２８６１）。パネルＢはＬｎＣＡＰ細胞系から免疫沈降したｃ−Ａｂｌキナーゼの活性を示す。左側はｃ−Ａｂｌキナーゼアッセイが基質としてＧＳＴ−Ｃｒｋを用いて行われ；反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ９９）または抗ＧＳＴ抗体（抗ＧＳＴ）でブロットするウエスタンブロットを示す。“抗ＧＳＴ”は各反応にＧＳＴ基質が入れられることを示唆する。“ＬｎＣＡＰ”は、ＬｎＣＡＰにおけるＣｒｋリン酸化を示す。“対照”はＬｎＣＡＰ細胞系からの対照ＩｇＧ免疫沈降に加えられた反応混合物である。グラフは細胞系におけるＣｒｋリン酸化レベルを示す（±ｓ．ｄ．；ｎ＝３；ｐ＝０．０１２４）。パネルＣはＡｂｉ１を補充したＬｎＣＡＰ細胞系におけるチロシンリン酸化を示す。左側は、ｃ−Ａｂｌキナーゼを細胞系から免疫沈降させ（Ｋ１２抗体）、８Ｅ９（ｃ−Ａｂｌプロテインレベル）またはＰＹ９９（ｃ−Ａｂｌ上のチロシンリン酸化を示す）抗体でブロットするウエスタンブロットを示す。“ＧＡＰＤＨ”は免疫沈降のために用いるリゼート投入レベルを示す。右側は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離され、その後クーマッシー染色（“クーマッシー”）されるか、またはブロッティングされ、抗ホスホチロシン抗体ＰＹ９９で染色される指示された細胞系からの総細胞リゼート類を示す。グラフは細胞系の総リン酸化レベルを示す（±ｓ．ｄ．；ｎ＝３；ｐ＝０．０１０１）。パネルＤは、Ａｂｉ１がｃ−Ａｂｌキナーゼと相互作用することを示す。Ａｂｉ１を指示された細胞系から免疫沈降させ、免疫沈降した蛋白類は、特異的抗体：Ａｂ−２（Ａｂｉ１）；Ｋ−１２（ｃ−Ａｂｌ−ｃｏＩＰ）を用いてウエスタンブロッティングによって分析した。“ｃ−Ａｂｌ−ＩＰ”は、Ｋ１２抗体で免疫沈降させ、８Ｅ９と共にブロッティングした後の細胞系のｃ−Ａｂｌキナーゼのレベルをあらわす。“ｐＹ２１３”はＹ２１３におけるリン酸化Ａｂｉ１の免疫反応性をあらわす。免疫沈降したＡｂｉ１は比較のために等レベルで担持された。実施例の実験法の部に記載されているように、全ての細胞系は溶解および免疫沈降の前にプレバナデートで処理された。
【図７−１】図７は、Ａｂｉ１がｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の調節によって細胞増殖および細胞スプレディングを調節することを示すウエスタンブロットのグラフおよび写真である。パネルＡにより、Ａｂｉ１のＹ２１３Ｆ以外の野生型または１８１ＡＥＳＥＡ１８５突然変異体の発現は、ＬｎＣＡＰ細胞においてｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ活性を阻害することが示される。Ａｂｉ１の野生型または突然変異体を安定的に発現する細胞系について、ｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を試験した。そのキナーゼ活性は、内因性Ａｂｌ基質Ｃｒｋ（ｐＹ−Ｃｒｋ）のリン酸化レベル；ｃ−Ａｂｌ活性化ループホスホチロシンｐＹ４１２（ｐＹ４１２）のレベルの試験によって評価した。ｃ−Ａｂｌ（ＰＹ９９）の総チロシンリン酸化も記載のように試験した。プロテイン類は指示された安定細胞系から免疫沈降させた：ｃ−Ａｂｌは抗Ｋ−１２で、Ｃｒｋは抗−Ｃｒｋで、Ａｂｉ１は抗７Ｂ６で免疫沈降させた。細胞リゼート中の組換えＡｂｉ１の発現を、抗−ＨＡ抗体（Ａｂｉ１−ＨＡ Ｌｙｓ）で評価した；Ａｂｉ１（＋）およびＬｎＣＡＰ細胞系における総Ａｂｉ１の発現は免疫沈降したＡｂｉ１をポリクローナル抗体Ａｂ−２（Ａｂｉ１−ＩＰ）でブロットすることによって評価した。右のグラフはそれら細胞系のｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の定量を示す（ｎ＝３；±ｓ．ｄ．）。Ｃｒｋリン酸化はＡｂｉ１（＋）ではＬｎＣＡＰ細胞系より低い（ｐ＜０．００１）。それは、Ｗｔ．ＨＡにおいてもＦ２１３．ＨａまたはＰｒｏ．Ｈａより低い（ｐ＜０．００１）。群内におけるｐＹ４１２またはＰＹ９９リン酸化の差も有意である（ｐ＜０．０１）。パネルＢは、Ａｂｉ１のＹ２１３および１８１ＰＰＳＰＰ１８５配列が、安定的にトランスフェクトされたＬｎＣＡＰ細胞系の増殖速度を調節することを示す。ＬｎＣＡＰクローンの増殖速度を、最初の培養から経過した指示された時点の細胞数を数えることによって評価した（ｎ＝３；棒はｓ．ｅ．ｍ．を示す）。観察４日間すべてを考慮した二元配置ＡＮＯＶＡ分析は、Ａｂｉ−Ｐｒｏ細胞系がＡｂｉ１−ｗｔ、Ａｂｉ１（＋）、またはＡｂｉ１−Ｆ２１３細胞系より速い速度で増殖することを示した（ｐ＜０．０５）；Ａｂｉ１−ｗｔ、Ａｂｉ１（＋）およびＡｂｉ１−Ｆ２１３は互いに差はなかった（ｐ＞０．０５）；ＬｎＣＡＰおよびＭｏｃｋはＡｂｉ１−Ｐｒｏとは異ならなかった（ｐ＞０．０５）。パネルＣは、Ａｂｉ１によって細胞スプレディングが調節されることを示す。ＬｎＣＡＰ細胞はコラーゲン上に培養された。培養後６時間目に観察した。平均面積を各クローンで評価した（ｎ＝２０；棒はｓ．ｅ．ｍ．を示す）；細胞系を発現するＨＡ−タグ付Ａｂｉ１の複製クローンを評価した。野生型Ａｂｉ１を発現するクローンは、ＬｎＣＡＰ細胞単独に対して有意な平均細胞面積の減少を示した：Ａｂｉ１（＋）、ｐ＜０．０００１；Ｗｔ．Ｈａ−１、ｐ＝０．０００２；Ｗｔ．Ｈａ−２、ｐ＝０．００７。その他のＡｂｉ１クローンは、ＬｎＣＡＰと比較して細胞スプレディングの有意差を示さなかった。下記のＬｎＣＡＰ細胞系を分析した：野生型タグなしＡｂｉ１、Ａｂｉ１（＋）、またはＨａ−タグ付Ａｂｉ１（Ｗｔ．Ｈａ−１およびＷｔ．Ｈａ−２）を安定的に発現する細胞系；Ｈａ−タグ付Ａｂｉ１突然変異体Ａｂｉ１ Ｙ２１３Ｆ（Ｆ２１３．Ｈａ−１およびＦ２１３．Ｈａ−２）およびＡｂｉ１−１８１ＡＥＳＥＡ１８５（Ｐｒｏ．Ｈａ−１およびＰｒｏ．Ｈａ−２）；野生型ＬｎＣＡＰ細胞系（ＬｎＣＡＰ）；および未改変プラスミドをトランスフェクトしたＬｎＣＡＰ細胞系（Ｍｏｃｋ）。細胞増殖および細胞スプレディングアッセイのために、ＨＡ−タグ付Ａｂｉ１を発現する複製クローンを評価した；Ａｂｌキナーゼ活性のためには（図７ＡおよびＢ）Ｗｔ．Ｈａ−１（Ｗｔ．Ｈａ）、Ｆ２１３．Ｈａ−１（Ｆ２１３．Ｈａ）、およびＰｒｏ．Ｈａ−１（Ｐｒｏ．Ｈａ）を評価した。“ＧＡＰＤＨ”は細胞リゼート中のプロテイン類のレベルを示す。
【図７−２】図７は、Ａｂｉ１がｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の調節によって細胞増殖および細胞スプレディングを調節することを示すウエスタンブロットのグラフおよび写真である。パネルＡにより、Ａｂｉ１のＹ２１３Ｆ以外の野生型または１８１ＡＥＳＥＡ１８５突然変異体の発現は、ＬｎＣＡＰ細胞においてｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ活性を阻害することが示される。Ａｂｉ１の野生型または突然変異体を安定的に発現する細胞系について、ｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を試験した。そのキナーゼ活性は、内因性Ａｂｌ基質Ｃｒｋ（ｐＹ−Ｃｒｋ）のリン酸化レベル；ｃ−Ａｂｌ活性化ループホスホチロシンｐＹ４１２（ｐＹ４１２）のレベルの試験によって評価した。ｃ−Ａｂｌ（ＰＹ９９）の総チロシンリン酸化も記載のように試験した。プロテイン類は指示された安定細胞系から免疫沈降させた：ｃ−Ａｂｌは抗Ｋ−１２で、Ｃｒｋは抗−Ｃｒｋで、Ａｂｉ１は抗７Ｂ６で免疫沈降させた。細胞リゼート中の組換えＡｂｉ１の発現を、抗−ＨＡ抗体（Ａｂｉ１−ＨＡ Ｌｙｓ）で評価した；Ａｂｉ１（＋）およびＬｎＣＡＰ細胞系における総Ａｂｉ１の発現は免疫沈降したＡｂｉ１をポリクローナル抗体Ａｂ−２（Ａｂｉ１−ＩＰ）でブロットすることによって評価した。右のグラフはそれら細胞系のｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の定量を示す（ｎ＝３；±ｓ．ｄ．）。Ｃｒｋリン酸化はＡｂｉ１（＋）ではＬｎＣＡＰ細胞系より低い（ｐ＜０．００１）。それは、Ｗｔ．ＨＡにおいてもＦ２１３．ＨａまたはＰｒｏ．Ｈａより低い（ｐ＜０．００１）。群内におけるｐＹ４１２またはＰＹ９９リン酸化の差も有意である（ｐ＜０．０１）。パネルＢは、Ａｂｉ１のＹ２１３および１８１ＰＰＳＰＰ１８５配列が、安定的にトランスフェクトされたＬｎＣＡＰ細胞系の増殖速度を調節することを示す。ＬｎＣＡＰクローンの増殖速度を、最初の培養から経過した指示された時点の細胞数を数えることによって評価した（ｎ＝３；棒はｓ．ｅ．ｍ．を示す）。観察４日間すべてを考慮した二元配置ＡＮＯＶＡ分析は、Ａｂｉ−Ｐｒｏ細胞系がＡｂｉ１−ｗｔ、Ａｂｉ１（＋）、またはＡｂｉ１−Ｆ２１３細胞系より速い速度で増殖することを示した（ｐ＜０．０５）；Ａｂｉ１−ｗｔ、Ａｂｉ１（＋）およびＡｂｉ１−Ｆ２１３は互いに差はなかった（ｐ＞０．０５）；ＬｎＣＡＰおよびＭｏｃｋはＡｂｉ１−Ｐｒｏとは異ならなかった（ｐ＞０．０５）。パネルＣは、Ａｂｉ１によって細胞スプレディングが調節されることを示す。ＬｎＣＡＰ細胞はコラーゲン上に培養された。培養後６時間目に観察した。平均面積を各クローンで評価した（ｎ＝２０；棒はｓ．ｅ．ｍ．を示す）；細胞系を発現するＨＡ−タグ付Ａｂｉ１の複製クローンを評価した。野生型Ａｂｉ１を発現するクローンは、ＬｎＣＡＰ細胞単独に対して有意な平均細胞面積の減少を示した：Ａｂｉ１（＋）、ｐ＜０．０００１；Ｗｔ．Ｈａ−１、ｐ＝０．０００２；Ｗｔ．Ｈａ−２、ｐ＝０．００７。その他のＡｂｉ１クローンは、ＬｎＣＡＰと比較して細胞スプレディングの有意差を示さなかった。下記のＬｎＣＡＰ細胞系を分析した：野生型タグなしＡｂｉ１、Ａｂｉ１（＋）、またはＨａ−タグ付Ａｂｉ１（Ｗｔ．Ｈａ−１およびＷｔ．Ｈａ−２）を安定的に発現する細胞系；Ｈａ−タグ付Ａｂｉ１突然変異体Ａｂｉ１ Ｙ２１３Ｆ（Ｆ２１３．Ｈａ−１およびＦ２１３．Ｈａ−２）およびＡｂｉ１−１８１ＡＥＳＥＡ１８５（Ｐｒｏ．Ｈａ−１およびＰｒｏ．Ｈａ−２）；野生型ＬｎＣＡＰ細胞系（ＬｎＣＡＰ）；および未改変プラスミドをトランスフェクトしたＬｎＣＡＰ細胞系（Ｍｏｃｋ）。細胞増殖および細胞スプレディングアッセイのために、ＨＡ−タグ付Ａｂｉ１を発現する複製クローンを評価した；Ａｂｌキナーゼ活性のためには（図７ＡおよびＢ）Ｗｔ．Ｈａ−１（Ｗｔ．Ｈａ）、Ｆ２１３．Ｈａ−１（Ｆ２１３．Ｈａ）、およびＰｒｏ．Ｈａ−１（Ｐｒｏ．Ｈａ）を評価した。“ＧＡＰＤＨ”は細胞リゼート中のプロテイン類のレベルを示す。
【図８】図８はＡｂｉ１ホスホペプチドによるｃ−Ａｂｌ調節の模型を示す。パネルＡはｃ−ＡｂｌキナーゼのＳＨドメインに結合する模型化されたリン酸化ペプチドを示す。模型化されたペプチドのホスホチロシン残基２１３（ｐＹ２１３）はＳＨ２ドメインの結合ポケットに示される。ｃ−ＡｂｌキナーゼのＳＨ２ドメインの３種類のアルギニン、Ｒ１５３、Ｒ１７１およびＲ１９４（緑）はリン・ペプチドのｐＹ２１３残基に極めて近く、相互作用が可能である。すべてのらせんはシリンダー形（トルコ玉）に示されている。不活性ｃ−ＡｂｌキナーゼのαＩ’らせんは標識されている。点線のついたシリンダーは活性形における同じらせん（αＩらせん）の位置を示し（Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．２００３）、それはＳＨ２ドメインと衝突する可能性を示す。残基Ｓ１７３−Ｑ１７９をあらわすｃ−Ａｂｌキナーゼ構造のループは明確ではない。図はＰｙＭＯＬソフトウエアを用いて作られた（Ｄｅｌａｎｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＬＣ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）。パネルＢはｐＹ２１３およびＰｒｏ−ｐＹ２１３によるｃ−Ａｂｌキナーゼの調節を説明する図式的模型である。上方の図は結晶構造によって測定した際の、自己阻害の主要要素を有する調節された構造を示す（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）：ＳＨ３ドメインはＳＨ２−ＣＤリンカーおよびＣＤと相互作用する；ＳＨ２ドメインはＣＤと相互作用する。キナーゼのミリストイル化片において、ＣＤのＣ−末端らせん、αＩ’はミリステートのための結合ポケットを形成する。ミリステートの分解を含む幾つかの作用機序によるｃ−Ａｂｌの活性化は（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）、ＳＨ２−ＣＤリンカーのリン酸化および活性化ループにつながる。これらのできごとはＳＨ２およびＳＨ３をＣＤから分離させ、そのＣ−末端らせんはαＩとなり、ＳＨ２ホスホチロシン結合部位を部分的に塞ぐ。ｐＹ２１３がＡｂｌ ＳＨ２ドメインに結合すると、多分新しいαＩ’様コンフォメーションのＣ−末端らせんが安定化することによって、このキナーゼは阻害される（これは分子模型化データによって裏付けられる、パネルＡ）。下方の図は、Ｐｒｏ−ｐＹ２１３の結合が、ＳＨ３およびＳＨ２ドメインのＣＤドメインからの転置によって、キナーゼの最初の一過性活性化を起こすことを示す。これはＮａｇａｒらが示唆したように（２００６）、ＣＤドメインのＮ−ローブ上にドッキングしたＳＨ２ドメインを有する細長くなった活性化Ａｂｌを含むＰｒｏ−ｐＹ２１３−Ａｂｌ複合体の形成に導く。これに続いて、より活性の低い、および不活性のＰｒｏ−ｐＹ２１３−Ａｂ複合体が形成される。αＩ’様らせんの位置はｐＹ２１３模型に基づいて仮定される。小さい化合物、ＧＮＦ−２、は、ミリストイル結合ポケットに結合し（Ａｄｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）、それによってミリストイル基のように作用することによって、αＩ’様らせんと同様なコンフォメーションを強化する。ＳＨ３、Ｓｒｃ相同性３ドメイン；ＳＨ２、Ｓｒｃ相同性２ドメイン；ＣＤ、触媒ドメイン。ｃ−Ａｂｌ分子のＮ−末端キャップ領域およびＣ−末端半分は、簡明化するために省略した。
【図９】図９は、Ａｂｉ１の発現レベルが一次前立腺細胞およびＡｂｌ（−／−）Ａｒｇ（−／−）二重ノックアウト細胞系に比較して、ＬｎＣＡＰ細胞では低いことを示すウエスタンブロットの写真である。Ａｂｉ１は指示された細胞系のリゼートからモノクローナル抗体７Ｂ６で免疫沈降させ、Ａｂｉ１に対するポリクローナル抗体Ａｂ−２でブロットした；ｃ−ＡｂｌキナーゼはＫ１２で免疫沈降させ、モノクローナル抗体８Ｅ９でブロットした。ＬｎＣＡＰはＬｎＣＡＰ細胞系を示し；ＰｒＰＥＣは前立腺細胞系を示し；ＤＫＯはＡｂｌ（−／−）Ａｒｇ（−／−）二重ノックアウト細胞系を示す。ＩｇＧは交差反応性ＩｇＧバンドを示す。
【図１０】図１０はｃＡｂｌおよびＡｂｉ１による増殖および細胞スプレディングの調節を説明する図である。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００５年１２月１日に出願された、米国仮特許出願第６０／７４１，２０８号の利益を請求する。
【０００２】
（政府支援の研究または開発に関する陳述）
米国政府は、本発明における一括払いライセンスおよび特定の条件下における権利を有し、Ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｆｅｎｓｅにより与えられた助成金ＤＡＭＤ １７−０１−１−００９６１、ならびにＴｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅからの助成金Ｒ０１の条項によって規定されるように、特許権者が、適切な条件で第三者に許可を与えることを要求する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は一般にキナーゼ活性の調節に関する。とりわけ、本発明はＡｂｌキナーゼの阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００４】
（関連技術の記載）
非受容体チロシンキナーゼ類は、細胞外刺激の下流の細胞シグナリングの主要な調節物質である。遍在する非受容体チロシンキナーゼｃ−Ａｂｌは、増殖因子類、インテグリン、およびサイトカインシグナリングの下流の細胞増殖、アポトーシスにかかわっている（非特許文献１）。細胞増殖におけるｃ−Ａｂｌキナーゼの重要な役割は、ｃ−Ａｂｌのキナーゼ活性化突然変異型であるＢＣＲ−Ａｂｌの発現による慢性骨髄性白血球の発症によって説明される（Ｇｏｌｄｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｅｌｏ，２００３）。しかし、ＢＣＲ−Ａｂｌまたはｃ−Ａｂｌのキナーゼ活性が細胞において調節される仕組みは明らかでない。
【０００５】
ｃ−Ｓｒｃおよびｃ−Ａｂｌのような非受容体チロシンキナーゼ類の主要な調節機序として、自己阻害が明らかになってきた（非特許文献２；Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．２００３；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．２００３；Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｂｒｕｇｇｅ，１９９７；Ｗａｎｇ，２００４）。これらのキナーゼは高度に保存された構造ドメイン：ＳＨ３、ＳＨ２、および触媒ドメインの存在によって与えられる高い構造的相同性を共有する。ｃ−Ｓｒｃ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．１９９７；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．１９９９）およびｃ−Ａｂｌ（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．２００３；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．２００３）の結晶構造は、それらのＳＨ３およびＳＨ２ドメインが触媒ドメインに結合し、自己阻害コンフォメーションを誘起して、これらキナーゼの調節の基礎的機序となることを明らかにしている。一方で、これらキナーゼにはさらなる制約となる阻害を課する非相同配列があり、これによってｃ−Ｓｒｃおよびｃ−Ａｂｌの別の調節がもたらされる。この阻害はｃ−ＳｒｃにおいてＳＨ２ドメインと、同じ分子上のＣ−末端に位置するリン酸化チロシン５２７との分子内相互作用によって実現する（Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｂｒｕｇｇｅ，１９９７）。ｃ−Ａｂｌにおいては、この阻害機序以外には内部ホスホチロシン−ＳＨ２ドメイン相互作用はない。さらにｃ−Ｓｒｃとは対照的に、ｃ−Ａｂｌ上ではキナーゼドメインのＣ−末端部分に直接結合し、それによってその触媒ドメイン上のＳＨ３−ＳＨ２“クランプ”をさらにロックするミリストイル化キャップによってさらに制約となる阻害があらわれる。しかしこの“分子ロック”は、部分的キャップ領域だけを含むｃ−Ａｂｌ−１ａの非ミリストイル化形には存在しない。このキャップ領域のより包括的な役割はｃ−Ａｂｌの結晶構造からは認識できないが、このキャップ領域は接近しやすさ（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）の調節およびホスホチロシン含有ペプチドの結合に役割を果たすと考えられる（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．２００３）。
【０００６】
ｃ−Ａｂｌキナーゼに結合する種々のプロテインはｃ−Ａｂｌ共阻害剤であることが提起されている。プロテインＦ−アクチン、ＰａｇおよびＲｂはｃ−Ａｂｌの自己阻害されたコンフォメーションを安定化することによって受動的共阻害剤（ｐａｓｓｉｖｅ ｃｏ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）として作用すると仮定されている（Ｗａｎｇ，２００４）。候補ｃ−Ａｂｌ阻害剤の別のセット、Ａｂｉ１およびＡｂｉ２は、ｃ−Ａｂｌ−結合パートナーを同定する研究（Ｄａｉ ａｎｄ Ｐｅｎｄｅｒｇａｓｔ、１９９５；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．１９９５）並びに、ＥＳｂ１（ｅｐｓ８ＳＨ３結合プロテイン１−Ｂｉｏｓｏｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）およびＨｓｓｈ３ｂｐ１（ヒトスペクトリンＳｒｃ相同３ドメイン結合プロテイン１−Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．１９９８）と名付けられたその他のプロテインからＳＨ３ドメインの結合パートナーを同定する研究において単離された。ｃ−ＡｂｌキナーゼのシグナリングにおけるＡｂｉプロテインの阻害的役割は主として細胞増殖の調節におけるＡｂｉ１およびＡｂｉ２の阻害的役割に基づくことが提案されているが（Ｄａｉ ａｎｄ Ｐｅｎｄｅｒｇａｓｔ，１９９５；Ｍａｃｏｓｋａ ｅｔ ａｌ．２００１；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．１９９５）、それらの分子的機序は明らかでない。Ａｂｉ１およびＡｂｉ２は富プロリン−リンカーＰＲＬのｃ−ＡｂｌキナーゼＣ−末端ＰＸＸＰ配列（Ｄａｉ ａｎｄ Ｐｅｎｄｅｒｇａｓｔ，１９９５；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．１９９５）、およびｃ−Ａｂｌ ＳＨ３ドメイン（Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．１９９８）と相互作用する。こうして、このような機序の一つには、ＡｂｉのＰＸＸＰ配列およびＳＨ３ドメインと、ｃ−Ａｂｌ ＳＨ３ドメインおよびＰＲＬ領域との協力的結合による、ｃ−Ａｂｌキナーゼの自己阻害的コンフォメーションの強化が含まれると思われる。しかしｃ−ＡｂｌキナーゼおよびＡｂｉプロテインでは、ＳＨ２をベースとするキナーゼ調節機序は明らかにされていない。
【非特許文献１】Ｗｏｏｄｒｉｎｇ，Ｐ．Ｊ．， Ｈｕｎｔｅｒ，ＴおよびＷａｎｇｍ Ｊ．Ｙ．２００３年，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆ−ａｃｔｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｂｙ ｔｈｅ Ａｂｌ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１６，２６１３−２６１６
【非特許文献２】Ｃｏｕｒｔｎｅｉｄｇｅ，Ｓ．Ａ.，２００３，Ｃａｎｃｅｒ：Ｅｓｃａｐｅ ｆｒｏｍ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ４２２，８２７−８２８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の議論に基づき、ｃ−Ａｂｌ阻害におけるＡｂｉプロテインの役割を特徴づけることが必要である。本発明はこの要求に取り組むものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
よって、発明者はＡｂｌキナーゼを阻害するＡｂｉプロテインから誘導されるペプチドを同定した。実施例を参照されたい。
【０００９】
そこで本発明は残基１０のチロシンがリン酸化されている配列番号１を含む精製された化合物類に関するものである。
【００１０】
本発明は上記化合物のアミノ酸配列が４００未満のアミノ酸である配列番号１を含む精製化合物にも関わる。
【００１１】
本発明はさらに、ある薬剤がＡｂｌキナーゼの候補阻害剤であるかどうかを確認する方法にも関わる。これらの方法は上記化合物をＡｂｌキナーゼの存在下でこの薬剤と接触させ、上記化合物がＡｂｌキナーゼに結合するかどうかを評価することを含む。これらの方法において、上記化合物がＡｂｌキナーゼに結合しない場合はその薬剤はＡｂｌキナーゼの候補阻害剤であり、その化合物がＡｂｌキナーゼに結合する場合はその薬剤はＡｂｌキナーゼの候補阻害剤ではない。これらの方法によってＡｂｌキナーゼの阻害剤であると確認された薬剤、およびＡｂｌキナーゼをこれらの薬剤と接触させることによってＡｂｌキナーゼを阻害する方法も本発明の局面である。
【００１２】
本発明はさらにＡｂｌキナーゼを阻害する方法に関わる。これらの方法はＡｂｌキナーゼを上記化合物類の一つと接触させることを含む。
【００１３】
さらに、本発明は突然変異体Ａｂｌキナーゼによって特徴づけられる病気をもつ患者を処置する方法にも関わる。これらの方法は突然変異体Ａｂｌキナーゼを阻害する上記化合物のいずれかを上記患者に投与することを含む。
【００１４】
本発明は突然変異体Ａｂｌキナーゼによって特徴づけられる病気のリスクのある患者を処置する方法にも向けられる。これらの方法は突然変異体Ａｂｌキナーゼを阻害する上記化合物類のいずれかを上記患者に投与することを含む。
【００１５】
本発明はＡｂｌキナーゼを標識化する方法にも関わる。それらの方法はＡｂｌキナーゼと上記化合物類の一つとを、その化合物がＡｂｌキナーゼと相互作用する条件下で結合させることを含む。これらの方法に使用される化合物は検出可能部分も有する。
【００１６】
本発明は組織からＡｂｌキナーゼを単離する方法にも関わる。これらの方法は組織を均質化し、その均質化した組織と、結合部分も有する上記化合物類の一つとを結合させ、Ａｂｌキナーゼに結合した化合物を単離することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
よって発明者らはＡｂｌキナーゼを阻害するペプチド類を同定した。これらのペプチドはＡｂｉプロテインの富プロリン領域からのものである。実施例を参照されたい。
【００１８】
したがって本発明は、残基１０のチロシンがリン酸化されている配列番号１を含む精製化合物に関するものである。配列番号１は、Ａｂｉ１、Ａｂｉ２およびＡｂｉ３の、Ａｂｌキナーゼ相互作用領域のコンセンサス配列である。本出願の付録にはＡｂｉ１、Ａｂｉ２およびＡｂｉ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号２、配列番号３および配列番号４として記載されている。配列番号１の部分であるこれらプロテイン類の相互作用領域は、付録では下線が引かれており、ここには配列番号５（Ａｂｉ１）および配列番号６（Ａｂｉ２およびＡｂｉ３）としても記載されている。したがって発明の化合物は配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列も含むことができる。発明の化合物と相互作用するＡｂｌキナーゼのより長いバージョンは配列番号７（コンセンサス配列［図１０］）および配列番号８として提供されている。配列番号７または配列番号８を含む化合物が好ましい。なぜならばＰＸＸＰ Ａｂｌキナーゼ結合モチーフがそのなかに存在し、より効果的なＡｂｌキナーゼ阻害を可能にしているからである。その化合物が、効果的Ａｂｌキナーゼ阻害剤として実施例に記載のように用いられた配列番号８を含むのがより好ましい。
【００１９】
配列番号１によってあらわされる種々の１４マーペプチドは、小ペプチドそれ自体、または大きいＡｂｉプロテイン（配列番号２、配列番号３および配列番号４によってあらわされるヒト配列）として、Ａｂｌキナーゼ類の阻害物質である。さらに、配列番号１の１４マーペプチド類のいずれかを含む任意の化学物質または巨大分子はＡｂｌキナーゼを阻害すると予想される。このような化学物質類または巨大分子の非制限的例は、任意の蛋白（酵素またはサイトカインなど）、プロテイン−核酸ハイブリッド類、糖蛋白、プロテオグリカン類、リポ蛋白類、および、例えば蛍光分子または抗原などの機能的部分を含む。１４マーを含む任意の特定巨大分子のＡｂｌキナーゼ阻害特性は下記の実施例に記載される方法を含む任意の公知の方法によって試験できる。
【００２０】
好ましくは、化合物は配列番号２、配列番号３または配列番号４の少なくとも一部に、少なくとも８５％は相同であるアミノ酸配列を含む。その化合物が天然に存在するＡｂｉ１、Ａｂｉ２、またはＡｂｉ３の少なくとも一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含むのもより好ましい。このような天然に存在するＡｂｉ１、Ａｂｉ２またはＡｂｉ３は、配列番号２、配列番号３または配列番号４に少なくとも８５％相同であることが期待される。その化合物が配列番号２、配列番号３または配列番号４の少なくとも一部に完全に相同であるのがより好ましく、配列番号２の少なくとも一部に完全に相同であるのが最も好ましい。
【００２１】
その化合物は４００未満のアミノ酸残基、１００未満のアミノ酸残基、および２０未満のアミノ酸残基を含む任意の１４アミノ酸長さまたはより長いアミノ酸配列を含むことができる。そのアミノ酸配列は好ましくは１４アミノ酸残基である。その化合物のために予想される特定のアミノ酸配列は配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８である。化合物が、配列番号１内にはない野生型Ａｂｉ１、Ａｂｉ２またはＡｂｉ３のＰＸＸＰ結合モチーフを含むのも好ましい。
【００２２】
本発明の部分として予想される幾つかの化合物はペプチド模擬体によってあらわされる少なくとも１つのアミノ酸を有する。このような化合物は、すべて天然に存在するアミノ酸を有する対応する化合物に比べて、ｉｎ ｖｉｖｏ分解に対してより強く抵抗することが多いことは知られている。
【００２３】
上記化合物がＡｂｌキナーゼの活性を阻害できることが好ましい。このような化合物が哺乳動物に投与されるとき、特にその阻害されたＡｂｌキナーゼが疾患を起こす場合に（例えばＢＣＲ−Ａｂｌ）、このような化合物がＡｂｌキナーゼを阻害できることが最も好ましい。
【００２４】
上記化合物類は検出可能部分または結合部分も含むことができる。本発明は任意の特定の検出可能部分または結合部分を有する化合物に狭く制限されるものではないが、検出部分または結合部分は放射性部分、抗原、蛍光部分、またはＨｉｓ６部分であることが好ましい。多くの用途のために、検出可能部分または結合部分は蛍光部分であることが最も好ましい。これらの用途において、化合物がＡｂｌキナーゼと結合するとき、蛍光部分の検出可能蛍光は変化する。
【００２５】
治療的に応用する場合、本発明の化合物は薬学的に容認される組成物中に含まれなければならない。
【００２６】
本発明は配列番号１を含む精製された化合物にも向けられる。この際アミノ酸配列は４００未満のアミノ酸である。好ましい化合物としては配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８を含むものなどがある。上記化合物類は好ましくは配列番号２、配列番号３または配列番号４の少なくとも一部に少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を含む。より好ましくは、化合物は天然に存在するＡｂｉ１、Ａｂｉ２またはＡｂｉ３の少なくとも一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含む。配列番号２、配列番号３または配列番号４の少なくとも一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含む化合物も好ましく、配列番号２の一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含む化合物が最も好ましい。
【００２７】
化合物のアミノ酸配列は約４００未満のアミノ酸長さでよい、例えば１００未満のアミノ酸残基、または２００未満のアミノ酸残基など。好ましい長さは１４アミノ酸残基である。特に、化合物は配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８からなることができる。これまでに記載された化合物の場合のように、これらの化合物はペプチド模擬体をアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸として含むことができる。化合物は、配列番号１内にはない、野生型Ａｂｉ１、Ａｂｉ２またはＡｂｉ３のＰＸＸＰ結合モチーフ、一般にはＰＰＳＰＰ、を含むのが好ましい。化合物は配列番号１のチロシンの残基１０の位置がリン酸化されていてもよい。化合物がＡｂｌキナーゼの活性を阻害できることも好ましい。
【００２８】
これらの化合物は検出可能部分または結合部分も含むことができる。治療的に応用するためにはこれらの化合物は薬学的に容認される組成物中に含まれなければならない。
【００２９】
上記の化合物類はＡｂｌキナーゼ類を、これらの酵素類との相互作用によって阻害するから、その相互作用を阻害する薬剤がＡｂｌキナーゼの候補阻害剤である。上記化合物とＡｂｌキナーゼとの相互作用は上記化合物とＡｂｌキナーゼとの結合を評価することによって最も有効に測定される。そこで本発明はさらに、ある薬剤がＡｂｌキナーゼの候補阻害剤であるかどうかを確認する方法に向けられる。この方法はＡｂｌキナーゼの存在下で上記の化合物の一つを上記薬剤と接触させ、その化合物がＡｂｌキナーゼに結合するかどうかを確認することを含む。これらの方法において、もしも化合物がＡｂｌキナーゼに結合しないならば、その薬剤はＡｂｌキナーゼの候補阻害剤である。もしもその化合物がＡｂｌキナーゼに結合するならば、その薬剤はＡｂｌキナーゼの候補阻害剤ではない。
【００３０】
これらの方法に使用される化合物はさらに検出可能部分を含み、その化合物とＡｂｌキナーゼとの結合をより容易に評価することができる。別法としてＡｂｌキナーゼがこの目的のための検出可能部分を含むことができる。好ましい検出可能部分は放射性部分、抗原、または蛍光部分である。検出可能部分が蛍光部分であるのが最も好ましい。
【００３１】
これらの方法の幾つかの形において、蛍光部分の検出可能の蛍光は、化合物がＡｂｌキナーゼと結合すると強度が変化する。当業者は蛍光化合物、および上記化合物および／またはＡｂｌキナーゼ上のその結合位置を選択し、不当な実験を行わずにこの方法を実施できる。これらの方法において、化合物とＡｂｌキナーゼとの結合の評価は蛍光強度の測定による。その際、化合物のある場合の蛍光強度が、その化合物がない場合の蛍光強度より増加していれば、それは、その化合物がＡｂｌキナーゼに結合しないことを示す。
【００３２】
化合物とＡｂｌキナーゼとの結合は非変性条件下でペプチドまたはＡｂｌキナーゼの見かけ上のサイズをゲル電気泳動法またはカラムクロマトグラフィーなどによって測定することによっても評価できる。
【００３３】
候補阻害剤の同定にあたって、ある候補阻害剤の存在下でＡｂｌキナーゼのキナーゼ活性を評価することによって、その阻害剤をさらに試験することが好ましい。その際、あるＡｂｌキナーゼ阻害剤はそのＡｂｌキナーゼの活性を低下させる。
【００３４】
本発明は上記の方法によって同定された薬剤も包含する。さらに、本発明はＡｂｌキナーゼと上記の方法によって同定された阻害物質とを接触させる工程を含むＡｂｌキナーゼ阻害法も含む。
【００３５】
本発明はさらにＡｂｌキナーゼを阻害するその他の方法にも関係する。その方法はＡｂｌキナーゼを上記化合物類の一つと接触させることを含む。その化合物は配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８からなるのが好ましい。Ａｂｌキナーゼが哺乳動物細胞にあることも好ましい。その哺乳動物細胞が生きている哺乳動物の部分であることがより好ましい。上記哺乳動物が突然変異体Ａｂｌキナーゼによって特徴づけられる病気にかかっているか、またはそのリスクをもっているのがより好ましい。このような病気の一例は癌である。癌は好ましくは慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）または前立腺癌である。
【００３６】
さらに、本発明は突然変異体Ａｂｌキナーゼによって特徴づけられる病気を有する患者を治療する方法にも関わる。それらの方法は突然変異体Ａｂｌキナーゼを阻害する任意の上記化合物を患者に投与することを含む。その化合物は患者に非経口投与されるのが好ましい。これらの方法にとって、病気が慢性骨髄性白血病または前立腺癌であるのが好ましい。
【００３７】
本発明は突然変異体Ａｂｌキナーゼによって特徴づけられる病気にかかるリスクのある患者を処置する方法にも関わる。これらの方法は突然変異体Ａｂｌキナーゼを阻害する上記のある化合物を上記患者に投与することを含む。
【００３８】
本発明はさらに、Ａｂｌキナーゼを標識化する方法にも関わるものである。その方法はＡｂｌキナーゼと上記化合物類の一つとを、上記化合物が上記Ａｂｌキナーゼと相互作用する条件下で結合させることを含む。これらの方法に用いられる化合物も上記のような検出可能部分を有する。これらの方法において標識化されるＡｂｌキナーゼは哺乳動物組織の部分、例えば生検でよい。生検組織は標識化の前または後に均質化することができ、前記均質化組織から得た蛋白中に存在する検出可能標識の量を定量することによってＡｂｌキナーゼ量、すなわちＡｂｌキナーゼ／化合物の組合わせのサイズを定量することができる。例えば細胞および／または生検中のＡｂｌキナーゼを局所化または定量することが所望の場合は上記標識化組織を組織学的分析にかけることもできる。
【００３９】
本発明は組織からＡｂｌキナーゼを単離する方法にも関わる。これらの方法は、組織を均質化し、均質化した組織と、結合部分も有する上記化合物の一つと組合わせ、Ａｂｌキナーゼに結合した化合物を単離することを含む。当業者は公知の方法を用いて不当な実験を行うことなくこれらの方法を実施できる。Ａｂｌキナーゼをさらに特徴づけることが必要ならば、上記化合物を例えば塩処理などによってＡｂｌキナーゼから単離することができる。単離したＡｂｌキナーゼは当業者には公知の任意の方法によっても特徴づけられる。
【００４０】
Ａｂｌキナーゼを阻害する上記のペプチド類は、例えば慢性骨髄性白血病患者などにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでその目的に使用できる。
【００４１】
発明の好ましい実施形態は次の実施例に記載される。添付の請求項の範囲内のその他の実施形態は、本明細書に開示される本発明の詳細な説明または実施を考慮することにより、当業者には明らかである。詳細な説明は実施例と共に例示的であるに過ぎないものとする。発明の範囲および精神は実施例に続く請求項によって記載されている。
【実施例】
【００４２】
（実施例．Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１から誘導されるペプチドによるｃ−Ａｂｌキナーゼの阻害）
実施例の概要
ｃ−Ｓｒｃとは異なり、ｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ調節の自己阻害的機序には、ｃｉｓに位置する阻害的ホスホチロシンは含まれない。ここで我々は、Ａｂｉ／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１においてｔｒａｎｓに位置するホスホチロシンによるｃ−Ａｂｌキナーゼ阻害のアロステリック非−ＡＴＰ−競合的機序を確認したことを報告する。この機序は、ホスホチロシンのＡｂｌ ＳＨ２ドメインに対する、およびＰＸＸＰモチーフのＡｂｌ ＳＨ３ドメインに対する高い親和性結合を含み、したがってホスホ−Ａｂｌによる負のフィードバック阻害を意味する。ｉｎ ｖｉｖｏ ｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の調節におけるＡｂｉ１の決定的役割は、野生型の発現では細胞内キナーゼ活性が阻害されるが、Ａｂｉ１のＹないしＦ突然変異体によっては阻害されないという事実によって支持される。さらにデータは、細胞増殖がＡｂｉ１の調節的チロシンの存在によって制御されることを示唆する。しかし、細胞スプレディングはＡｂｉ１−依存性ｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ活性によって調節され、チロシンそれ自体によって調節されるものではない。分子模型は、ホスホチロシンとｃ−Ａｂｌとの結合がそのキナーゼの自己阻害コンフォメーションを安定化することを示唆する。これらの結合はＡｂｌキナーゼが細胞内で調節される新規の機序を示唆し、抗白血病薬開発のための新規の戦略をもたらす。
【００４３】
はじめに
遍在する非受容体チロシンキナーゼ、ｃ−Ａｂｌキナーゼは、血小板由来増殖因子受容体、インテグリン、またはサイトカインシグナリング、アポトーシスまたは細胞増殖増強を起こす平衡化事象の下流で作用する（Ｋｏｌｅｓｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｗｏｏｄｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）。細胞増殖におけるｃ−Ａｂｌキナーゼの決定的役割は、ｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼのキナーゼ活性化突然変異型であるＢＣＲ−Ａｂｌの発現による慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の劇的発症によって説明される（Ｄｒｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１ａ；Ｇｏｌｄｍａｎ ａｎｄ Ｍｅｌｏ，２００３）。ＢＣＲ−Ａｂｌは染色体転座およびＢＣＲとｃ−Ａｂｌとの融合から生ずる融合プロテインであり、それはキナーゼ活性の異常調節（ｄｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）を効果的に起こす。このキナーゼ活性を低減する合理的研究はＣＭＬ（Ｄｒｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１ｂ；Ｄｒｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６）およびその他の数種類の癌の成功的処置として、ＳＴＩ−５７１（イマニティブ メシレート（ｉｍａｎｉｔｉｂ ｍｅｓｙｌａｔｅ）またはグリーヴェク（Ｇｌｅｅｖｅｃ））（Ｂｕｃｈｄｕｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６）の開発に導いた。ＡＴＰとの競合により、および不活性キナーゼコンフォメーションの安定化によってキナーゼを阻害するＳＴＩ−５７１は（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）、癌治療のための抗キナーゼ薬開発のテンプレートを提供した。第二世代の抗−Ａｂｌ薬（Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｗｅｉｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００５）を含む多数の抗キナーゼ化合物が現在トライアル中であり（Ｇａｒｂｅｒ，２００６）、ＣＭＬ治療後の長期緩解の期待につながっている（Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。抗Ａｂｌ阻害剤の成功は薬剤耐性突然変異の出現によって取り消され（Ｇｏｒｒ ｅｔ ａｌ．，２００一；ｖｏｎ Ｂｕｂｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，２００２）、Ｂｃｒ−Ａｂｌ調節機序の再考につながった（Ａｌ−Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｋｈｏｒａｓｈａｄ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｍｉｅｔｈｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６）。これによりｃ−Ａｂｌが再び注目されるようになった、なぜならばＢｃｒ−Ａｂｌおよびｃ−Ａｂｌは大部分の調節ドメインを共有しているからである（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ａｎｄ Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ，２００４；Ｗｏｏｄｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【００４４】
自己阻害がｃ−Ｓｒｃおよびｃ−Ａｂｌ調節の主要機序として浮上した（Ｃｏｕｒｔｎｅｉｄｇｅ，２００３；Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｐｌｕｋ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｂｒｕｇｇｅ，１９９７；Ｗａｎｇ，２００４）。これらのキナーゼは高度に保存された構造ドメイン：ＳＨ３、ＳＨ２、および触媒ドメインの存在によって与えられる高度な構造相同性を共有する。ｃ−Ｓｒｃ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９）およびｃ−Ａｂｌ（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）の結晶構造は、ＳＨ３およびＳＨ２ドメインが触媒ドメイン（ＣＤ）に結合し、自己阻害コンフォメーションを誘起し、これらキナーゼ類の基礎的調節機序を提供する。この基礎的調節はＢＣＲ−Ａｂｌに保存される。なぜならばＢＣＲ−ＡｂｌはＳＨ３ドメインを含んでその下流のすべてのｃ−Ａｂｌドメインを含むからである。
【００４５】
ｃ−Ｓｒｃとｃ−Ａｂｌとは、これらキナーゼの活性を阻害する２つの機序において互いに異なる。ｃ−Ｓｒｃでは、阻害はＳＨ２ドメインと、同じ分子上のＣ−末端に位置するリン酸化チロシン５２７との分子内相互作用によって実現する（Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｂｒｕｇｇｅｒ，１９９７）。ｃ−Ａｂｌにおいては、内部ホスホチロシン−ＳＨ２ドメインの相互作用はなく、この阻害機序は除外される。さらにｃ−Ｓｒｃとは対照的に、キナーゼドメインのＣ−末端ローブへの直接的ミリストイル化キャップ結合によって、およびＳＨ２ドメインへのキナーゼ領域ホスホセリン６９結合によって、付加的阻害的束縛がｃ−Ａｂｌに課せられる（Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）。これらの相互作用はさらにＳＨ３−ＳＨ２“クランプ”を触媒ドメインにロックする。ミリストイル基（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）またはその作用を真似る小化合物（Ａｄｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）が触媒ドメインのＣ−末端らせん、αＩ、の位置を安定させ、その結果そのキナーゼの阻害的コンフォメーションが形成される。しかしミリストイル化キャップによって課せられる“分子ロック”は、部分的キャップ領域だけを含むｃ−Ａｂｌ−アイソホーム１ａの非ミリストイル化形、またはＢＣＲによって置換されたＢＣＲ−Ａｂｌには存在しない。したがってミリストイル化キャップはＢＣＲ−Ａｂｌ、またはｃ−Ａｂｌ−１ａのキナーゼ活性を調節しない、ただし後者にはホスホセリンが保存されており、それ（ホスホセリン６９）が自己阻害機序の一因となる可能性はある（Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）。キャップ領域の分子内相互作用は接近し易さも調節するらしく、Ａｂｌ活性化に役割を演ずるかも知れない増殖因子からのホスホチロシン含有ペプチド類を含むＡｂｌ ＳＨ３またはＳＨ２リガンドの結合を調節するらしい（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３）。Ａｂｌ調節の複雑さを考慮すると、キナーゼ活性の活性化は、触媒ドメインからのＳＨ３およびＳＨ２の単離、および阻害からのキナーゼ“開放”につながる複数の工程を含むらしい。
【００４６】
ｃ−Ａｂｌキナーゼに結合する種々のプロテインはｃ−Ａｂｌ共阻害剤であることが提唱されている。プロテインＦ−アクチン、ＰａｇおよびＲｂは、ｃ−Ａｂｌの自己阻害コンフォメーションを安定化することによって受動的共阻害剤として作用すると仮定されている（Ｗａｎｇ，２００４）。候補ｃ−Ａｂｌ阻害剤の別のセット、Ａｂｉ１およびＡｂｉ２はｃ−Ａｂｌ結合パートナーを同定する研究（Ｄａｉ ａｎｄ Ｐｅｎｄｅｒｇａｓｔ，１９９５；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）並びにその他のプロテインからのＳＨ３ドメインの結合パートナー、名称Ｅ３ｂ１（Ｂｉｅｓｏｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、またはＨｓｓｈ３ｂｐ１（Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）を確定する研究において単離された。ｃ−ＡｂｌキナーゼシグナリングにおけるＡｂｉプロテインの阻害的役割は、主として細胞増殖の調節におけるＡｂｉ１およびＡｂｉ２の阻害的役割に基づくことが提唱されているが（Ｄａｉ ａｎｄ Ｐｅｎｄｅｒｇａｓｔ，１９９５；Ｍａｃｏｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、それらの作用の分子的機序は明らかでない。ＬｎＣＡＰ前立腺腫瘍細胞系はエクソン６の決失をおこすＡｂｉ１遺伝子の異型接合突然変異を含むから、これがＡｂｉ１の重要な増殖調節領域である可能性が指摘される（Ｍａｃｏｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。Ａｂｉ１およびＡｂｉ２は富プロリン−リンカー、ＰＲＬ、のｃ−ＡｂｌキナーゼＣ−末端ＰＸＸＰ配列（Ｄａｉ ａｎｄ Ｐｅｎｄｅｒｇａｓｔ，１９９５；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、およびｃ−Ａｂｌ ＳＨ３ドメイン（Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）と相互作用する。そこで増殖調節の一つの機序として、ＡｂｉのＰＸＸＰ配列およびＳＨ３ドメインをｃ−Ａｂｌ ＳＨ３ドメインおよびＰＲＬの領域に協同結合することによってｃ−Ａｂｌキナーゼ自己阻害コンフォメーションを強化することによるｃ−Ａｂｌキナーゼの調節が含まれるかも知れない。しかしＳＨ３またはＳＨ２を基礎とするキナーゼ調節機序は、ｃ−ＡｂｌキナーゼおよびＡｂｉプロテインについては証明されなかった。その上、ＳＴＩ−５７１耐性突然変異がＡｂｌ ＳＨ３およびＳＨ２ドメインに見いだされ（Ａｚａｍ ｅｔ ａｌ．，２００３）、もしＡｂｉプロテインがこれらのドメインへの結合によってＡｂｌ触媒活性が調節されるならば、それらはｉｎ ｖｉｖｏ ＳＴＩ−５７１耐性を調節する上で重要である可能性が示唆される。
【００４７】
Ａｂｉ１のＡｂｌ ＳＨ３およびＳＨ２結合領域から誘導されるホスホペプチドによるｃ−Ａｂｌキナーゼ阻害の新しいアロステリック機序の発見をここに報告する。分子模型化からは、ホスホペプチドがｃ−Ａｂｌキナーゼの自己阻害コンフォメーションを安定化し、Ａｂｌ触媒ドメインのＣ−ローブに結合したミリストイル基およびＳＨ２ドメインで観察されるものと同様のコンフォメーションに導くことが示唆される。ここに明らかにされたキナーゼ阻害機序が、ＡｂｌおよびＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼ類のアロステリック阻害剤を開発する新規の方法として利用できると考えられる。
【００４８】
結果
ｃ−Ａｂｌはｉｎ ｖｉｔｒｏでＡｂｉ１のＹ２１３をリン酸化する。Ａｂｉ１のチロシンリン酸化部位の探査において、以前Ａｂｌ ＳＨ３ドメインに結合することが証明されたＡｂｉ１の富プロリン−領域内に、候補チロシン残基、Ｙ１９８およびＹ２１３が位置することを我々は確認した（Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。上記プロテインのＮ−末端半分をコードする翻訳されたポリペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏで用い、Ｙ２１３がＡｂｌキナーゼによるｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化の好ましい位置であることを確認した（図１）。Ｙ２１３のリン酸化部位は、組換えＡｂｉ１および活性ｃ−Ａｂｌを含むキナーゼ反応後、トリプシンペプチドの質量分析によって確認された（表１）。
【００４９】
【表１】
トリプシン消化後に試料を分析した。記載されるチロシン２１３またはフェニルアラニン置換を含む特異的イオンの予測および実験的質量を列挙する。野生型（ＷＴ）トリプシンペプチドの配列はＴＬＥＰＶＫＰＰＴＶＰＮＤｐＹＭＴＳＰＡＲである；ホスホチロシン２１３は太字で書かれている。＊Ｆ２１３：ＷＴと同じだが太字のＹ２１３Ｆ置換有する：ＴＬＥＰＶＫＰＰＴＶＰＮＤＦＭＴＳＰＡＲ。Ｔ１５ＷＳはＡｂｉ１アイソホーム４の残基１４４−３０３を含み（Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ，１９９８）、ＷＴと同じトリプシンペプチドを含む。‡Ｍｅｔ−Ｏ：すべての試料に存在した酸化メチオニンである（上のトリプシンフラグメントでは下線が引かれている）；したがって２種類（非リン酸化試料）または４種類（リン酸化試料）の分子が認められた。方法。ニューイングランド ビオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）からのＡｂｌキナーゼ、Ｔ１５ＷＳ、またはバキュロウイルス精製Ａｂｌ、アイソホーム２によって試料をリン酸化した。キナーゼ反応を３０分間行った後に４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上でプロテイン類を分離した。特異的プロテインバンドを単離し、トリプシン分解にかけた（シグマ−アルドリッヒ社、セントルイス、ＭＯ）。それら試料を０．５％ＴＦＡで酸化した後、ＺＩＰ ＴＩＰ−１８（ミリポア コーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ベッドフォード、ＭＡ）を用いて試料を濃縮し、０．１％ＴＦＡおよび５０％アセトニトリルで溶出し、５０％アセトニトリルおよび０．５％ＴＦＡ中α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸基質（シグマ アルドリッヒ社、セントルイス、ＭＯ）を含むチューブに受け入れた。質量分析はアプライド ビオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（フォスターシティ、ＣＡ）のＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＭＡＬＤＩ質量分析計を用いて行われた。
【００５０】
Ａｂｉ１の最小Ａｂｌ ＳＨ３およびＳＨ２ドメイン結合部位の同定。最初に、ｃ−Ａｂｌ ＳＨ３ドメインの結合がＡｂｉ１の残基１４４−２６０に位置づけられた（Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。その後Ａｂｌ ＳＨ３結合を、チロシン２１３から上流に位置するＰＸＸＰ ＳＨ３結合モチーフを含むＡｂｉ１配列にマッピングした。ＰＸＸＰ配列、１８１ＰＰＳＰＰ１８５、を含むＡｂｉ１の残基１７３〜１８７の決失は、Ａｂｌ ＳＨ３ドメインへの結合を完全に破壊した（図２Ａ）。
【００５１】
Ａｂｌ ＳＨ３結合部位がチロシン２１３に接近していることは、リン酸化チロシンがＡｂｌ ＳＨ２ドメインと相互作用することを示唆する。この相互作用を、リン酸化チロシン２１３（ｐＹ２１３）およびＧＳＴ−Ａｂｌ ＳＨ２ドメイン融合プロテインを含むビオチニル化１４残基ペプチドを用いて分析した（図２Ｂ−Ｄ）。最初に、Ａｂｌ ＳＨ２ドメインはホスホペプチドｐＹ２１３とは相互作用するが非リン酸化ペプチド（ノンホスホペプチド）Ｙ２１３とは相互作用しないことが明らかになった（図２Ｂ）。我々は種々濃度のＡｂｌ ＳＨ２ドメインを用いて、ｐＹ２１３がＳＨ２ドメインと高度の親和性をもって相互作用することを確認した（会合常数、ＫＡ＝３．０１×１０７；解離常数、ＫＤ＝３．３２×１０−８；会合速度、Ｋｏｎ＝１．１３×１０５ｓ−１；解離速度、Ｋｏｆｆ＝３．７６×１０−３Ｍ−１ｓ−１）（図２Ｃ）。対照実験は、Ａｂｌ ＳＨ２Ｒ１７１Ｋ突然変異体がｐＹ２１３と相互作用しないことを示した（図２Ｄ）。この結果は、Ｒ１７１突然変異がＳＨ２ドメインとホスホペプチドとの相互作用を不可能にするという知見（Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２）と一致する。
【００５２】
ｐＹ２１３ホスホペプチドは非競合的機序によってｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を阻害する。ｃ−Ａｂｌキナーゼの結晶構造に基づくと、ＳＨ２ドメイン−ホスホペプチド相互作用はｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を調節するポテンシャルを有する（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３）。そこでチロシン２１３を含むＡｂｉの諸配列がｃ−Ａｂｌキナーゼ活性に影響を与えるかどうかを試験する実験が行われた。これらの実験には、活性ｃ−Ａｂｌ（Ｔａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）、モデル基質ペプチド（Ｂｒａｓｈｅｒ ａｎｄ Ｖａｎ Ｅｔｔｅｎ，２０００；Ｐｌｕｋ ｅｔ ａｌ．，２００２）および、ホスホチロシン、ｐＹ２１３、または位置２１３にチロシンのフェニルアラニン置換があるＦ２１３を含む１４残基ペプチドの形（ペプチド配列は図１Ａを参照）を用いた。ｐＹ２１３ホスホペプチドはＶｍａｘの３８％減少を示し、基質ペプチドのＫｍには有意な効果を与えなかった。これは非競合的阻害機序に一致する（図３Ａ−Ｂ、および表２）。ペプチドＦ２１３ではキナーゼ活性に対する影響は認められなかった。
【００５３】
【表２】
Ａｂｉ１ペプチドについて２ｍＭのＦ２１３およびｐＹ２１３のＶｍａｘおよびＫｍの概要（平均値±ｓ．ｄ．；ｎ＝３）。＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．００１；ＰＥＰ、基質ペプチド。ペプチドの記述は図１Ａを参照。
【００５４】
非リン酸化ペプチドＹ２１３は２ｍＭでｐＹ２１３に比べてキナーゼ活性の有意な減少を示す（表２）。上記Ｙ２１３は、ｐＹ２１３ペプチドより低濃度で有意なキナーゼ阻害を示した（図３Ｅおよび３Ｆ、および表２）。１４残基ペプチドＹ２１３はＡｂｌキナーゼ自体の基質として作用することができ、それはモデル基質ペプチドと競合した。しかしラインウェーバーバーク曲線は基質ペプチドのＫｍの減少を示し（Ｙ２１３ペプチド濃度０．１ｍＭおよび２．０ｍＭでは有意、表２）、したがってより低いＶｍａｘは基質ペプチドのターンオーバーの低下によるキナーゼ活性の阻害を示唆する。興味深いことに、ｐＹ２１３ホスホペプチドのＮ−末端にＳＨ３ドメイン結合配列が含まれると、ペプチド濃度２ｍＭでｃ−Ａｂｌキナーゼに対する阻害効果は高まった。しかしより低い濃度では阻害は観察されなかった（図３）。つまり、Ｙ２１３Ｆを除いて、試験したすべてのペプチド１４マー、すなわちｐＹ２１３およびＹ２１３、並びに４９マーであるＰｒｏＹｐ２１３はｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の阻害を示した。しかし阻害機序は、異なるペプチドでは異なる。
【００５５】
ＳＨ３ドメイン結合はｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の阻害において重要である。ｐＹ２１３ホスホペプチドのＮ−末端に、１８１ＰＰＳＰＰ１８５を含むＳＨ３ドメイン結合配列があると（ペプチドＰｒｏ−ｐＹ２１３）、ペプチド濃度２ｍＭでｃ−Ａｂｌキナーゼに対する阻害効果は高まるが、より低濃度では阻害は認められなかった（図３Ｃ）。実際、ｃ−Ａｂｌキナーゼは、０．５ないし１ｍＭの間で活性の若干の増加を示した。この効果についてより多くを学ぶために、ｐＹ２１３のＮ−末端に上記配列を含むＰｒｏ−ｐＹ２１３から誘導されるペプチドを用いてキナーゼ活性を測定した（図３Ｄ）。ペプチドＰｒｏ−Ｙ１９８はペプチド濃度の上昇につれて阻害が増加することを示した；この効果はＳＨ３結合モチーフ１８１ＰＰＳＰＰ１８５の１８１ＰＥＳＥＰ１８５（ペプチドＥＥ−Ｙ１９８）への突然変異で、またはＹ１９８のＦ１９８置換（ペプチドＰｒｏ−Ｆ１９８）で失われた。ペプチドＰｒｏ−ｐＹ２１３は０．７５から１．２５ｍＭまでの濃度でキナーゼ活性を高めた。その後は１．５ｍＭで活性は減少し、１．７５および２ｍＭで阻害が起きた。これらのデータは：（ａ）Ｐｒｏ−ｐＹ２１３が、濃度に応じてｃ−Ａｂｌ活性をアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションすることができ；（ｂ）Ａｂｉ１の配列１８１ＰＰＳＰＰ１８５、Ｙ１９８、およびｐＹ２１３が、Ｐｒｏ−ｐＹ２１３によるｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の調節に重要であることを示している。
【００５６】
Ａｂｉ１ Ｙ２１３はｃ−Ａｂｌに依存する様態でリン酸化される。チロシン２１３がｉｎ ｖｉｖｏでリン酸化されるかどうかを調べるために、培養細胞系をモデル系として用いた。リン特異的抗体を用いるＡｂｌ−／−Ａｒｇ−／−二重ノックアウト細胞における実験により、Ａｂｉ１がｃ−Ａｂｌキナーゼと共にトランスフェクトされる場合に限り、Ｙ２１３がリン酸化されることが示される（図４Ａ）。突然変異体Ｙ２１３Ｆは、ｃ−Ａｂｌと共にトランスフェクトされるたとき、Ａｂｉ１−Ｆ２１３の安定性を明らかに低下させた（図４Ａ）。ｃ−Ａｂｌとの共トランスフェクションでＡｂｉ１−△Ｅｘ６の安定性も明らかに低くなる。ただし組換えバンドはＩｇＧバンドとオーバーラップする。一過性トランスフェクション効率または組換え蛋白の局在性において、いずれのＡｂｉ１突然変異体でも変化は認められず、それらはすべて組換えｃ−Ａｂｌと共に局在した（データは示されず）。
【００５７】
Ａｂｉ１発現は、ｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の調節によってＬｎＣＡＰ細胞の細胞増殖および細胞スプレディングを調節する。Ａｂｉ１が細胞のｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ活性を調節するかどうかを確認するために、ＬｎＣＡＰ前立腺細胞系をモデル系として用いた。このＬｎＣＡＰ細胞系は異形接合、エクソン６−スキッピング突然変異を含み、Ｙ２１３を含むＡｂｉ１領域の消失を起こす（Ｍａｃｏｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。これはＬｎＣＡＰ細胞におけるＡｂｉ１の明白な低レベル発現につながる（図９を参照）。ｃ−Ａｂｌキナーゼの確立された機能と一致して、Ａｂｉ１−ｗｔを補充した安定な細胞系は増殖阻害（図５）および細胞スプレディング活性低下（図５Ｂ−Ｃ）を示した。我々は同じアッセイを用いて、ＳＴＩ−５７１がＡｂｉ１の発現として、ＬｎＣＡＰ細胞の細胞スプレディング活性に対して同様な阻害効果を有することを示した（図５Ｃ）。Ａｂｉ１をトランスフェクトしたＬｎＣＡＰ細胞においては、総Ａｂｉ１発現のわずかの増加が認められるという事実にもかかわらず（図６Ａ）、ｃ−Ａｂｌ活性は有意に減少した（図６）。ｃ−Ａｂｌは、外因性Ｃｒｋ基質または内因性Ｃｒｋのリン酸化減少（図６Ｂ）並びに８Ｅ９免疫反応性バンドのチロシンリン酸化の減少（図６Ｃ）によって示されるように活性の低下を示した。ｃ−Ａｂｌの活性化ループ チロシンＹ４１２のリン酸化も減少した。これらはＬｎＣＡＰ細胞内の蛋白リゼートのチロシンリン酸化の減少を伴った。これらのデータから、Ａｂｉ１をトランスフェクトした細胞ではｃ−Ａｂｌの活性が低くなることが、はっきりとわかった。こうしてＡｂｉ１（＋）細胞系におけるＡｂｉ１のレベル上昇は、ｃ−Ａｂｌ活性のダウンレギュレーションによる細胞増殖および細胞スプレディングの減少につながった。チロシン２１３がｃ−Ａｂｌの活性上昇によってより多くリン酸化されているＬｎＣＡＰ細胞では、Ａｂｉ１（＋）細胞に比べてＡｂｉ１がより効率的にｃ−Ａｂｌと共沈殿するという事実は（図６Ｄ）、ｃ−Ａｂｌの基質、すなわちＡｂｉ１によるｃ−Ａｂｌ阻害の負のフィードバック機序を裏付ける。
【００５８】
Ａｂｉ１のｐＹ２１３および１８１ＰＰＳＰＰ１８５配列はｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ活性を調節し、それを細胞増殖および細胞スプレディングの調節につなげる。一過性トランスフェクションにおけるＡｂｉ１−Ｆ２１３の明らかに低い安定性を回避するために、およびｃ−Ａｂｌキナーゼ活性および細胞増殖におけるＡｂｉ１のｐＹ２１３および１８１ＰＰＳＰＰ１８５の役割に、より詳細に取り組むために、野生型Ａｂｉ１−ｗｔ、またはＡｂｉ１の下記の突然変異体：Ｙ２１３Ｆ、Ａｂｉ１−Ｙ２１３Ｆ、および１８１ＰＰＳＰＰ１８５ないし１８１ＡＥＳＥＡ１８５およびＡｂｉ１−Ｐｒｏを安定的にトランスフェクトしたＬｎＣＡＰクローンを得た。Ａｂｉ１−Ｆ２１３の発現はｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を阻害しなかったし、Ａｂｌ−Ｐｒｏの発現もｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を阻害しなかった（図７Ａおよび７Ｂ）。これは活性化ループチロシンのリン酸化レベルによって（ｐＹ４１２）、または内因性Ｃｒｋリン酸化レベルによって測定したようにＡｂｉ１−ｗｔとは対照的である。例えば、Ａｂｉ１−Ｆ２１３細胞にはＡｂｉ１−ｗｔ細胞より高レベルの阻害物質が発現しているとはいえ、負のフィードバック機序によるｃ−Ａｂｌキナーゼの阻害はＡｂｉ１−Ｆ２１３細胞にはあらわれない。Ａｂｉ１クローンの増殖速度を分析した結果、最も遅い速度で増殖し、Ａｂｉ１（＋）およびＡｂｉ１−ｗｔクローンに類似しているが対照的に高ｃ−Ａｂｌ活性を有するＡｂｉ１−Ｙ２１３Ｆクローンを除いて、これらの速度はより高いｃ−Ａｂｌ活性を有する細胞ではより高いことが判明した（図７Ｃ）。コラーゲン上におけるＡｂｉ１クローンの細胞スプレディング活性も評価した。野生型Ａｂｉ１、すなわちクローンＡｂｉ１（＋）およびＡｂｉ１−ｗｔを発現する細胞だけが細胞スプレディングの減少を示した（図７Ｄ）。これらの細胞はより低いｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を有した。したがってＬｎＣＡＰ細胞の細胞スプレディング活性はＡｂｉ１依存性ｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ活性によって調節される。興味深いことに、細胞の高い細胞スプレディング活性はＡｂｉ１の増殖シグナルとは無関係であった、すなわちＡｂｉ１−Ｆ２１３クローンはＡｂｉ１−Ｐｒｏクローンに類似した細胞スプレディング活性を示した。しかしそれらは有意により緩徐に増殖した）。
【００５９】
検討
Ａｂｉ１がｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ活性を調節する際に考えられる機序が提供される。その機序は、Ａｂｉ１のＮ末端領域のＹ２１３をｃ−Ａｂｌキナーゼによってリン酸化し、それをＡｂｌ ＳＨ２ドメインに結合し、その後のキナーゼ阻害を起こすことを含む。これは、別のプロテイン、すなわちＡｂｉ１においてトランスに位置するホスホペプチドによってｃ−Ａｂｌキナーゼが阻害されるという最初の証明である。ｃ−ＡｂｌキナーゼによるＡｂｉ１のＹ２１３位置のリン酸化はこれまでは証明されていない。ただしＢＣＲ−ＡｂｌのＳＴＩ−５７１依存性基質標的を決定するためのショーグン（ｓｈｏｇｕｎ）法では、それがＢＣＲ−Ａｂｌのリン酸化部位であることが確認されている（Ｇｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
【００６０】
Ａｂｉ１ホスホペプチド類はアロステリック機序によってｃ−Ａｂｌキナーゼを阻害する。この機序はリン酸化Ｙ２１３のＡｂｌ ＳＨ２ドメインへの高親和性結合を含む。Ｋｍは変化せず、Ｖｍａｘの減少が観察されたのは、ｐＹ２１３を含むホスホペプチドによるキナーゼ活性阻害の非競合的機序と一致する。ｃ−Ａｂｌの構造研究（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）は、ＳＨ３−ＳＨ２−触媒ドメインアセンブリーを含む非ミリストイル化ｃ−Ａｂｌフラグメントの結晶構造においてホスホチロシン結合部位が一部妨害されていることを示す。得られたｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼデータは、このキナーゼのＩａおよびＩｂ両方の型によって共有された非ミリストイル化、アンキャップドｃ−Ａｂｌキナーゼに関係している。例えばＡｂｉ１ホスホペプチドｐＹ２１３との相互作用は、ｃ−Ａｂｌ分子の（特にＳＨ２およびキナーゼドメインの）顕著なコンフォメーション変化を含むはずである。
【００６１】
分子模型は、Ａｂｉ１が不活性キナーゼコンフォメーションを安定化することを示す。（図８Ａ参照）。このコンフォメーションはミリストイル化キナーゼで観察されるもの、またはミリストイル結合ポケットへのＧＮＦ−２結合によって安定化されると言われているものに類似している（Ａｄｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ミリスチン酸塩結合状態において、キナーゼドメインのＣ−末端αＩ’らせんの特異的位置によって不活性キナーゼコンフォメーションが得られる（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）。これはＳＨ３、ＳＨ２およびＣＤドメインの自己阻害アセンブリーをさらに強化する。Ａｂｉ１のｃ−Ａｂｌへの結合は、Ａｂｌ触媒ドメインのＣ−ローブにおけるＣ−末端らせんの位置に影響を与えることによって、Ａｂｌキナーゼの阻害コンフォメーションを強化できることが予想される。これは分子模型データによって裏付けられるように、ＳＨ２ドメイン−触媒ドメイン相互作用がＡｂｉ１ホスホペプチドによって安定化されることによる（図８Ａ）。曲がったαＩ’らせんコンフォメーションを安定化することによってミリストイル基のように作用すると仮定されているＧＮＦ−２のような小分子（図８Ｂ）が、なぜ細胞内でＢＣＲ−Ａｂｌを阻害するかは、Ａｂｉ１とＢＣＲ−Ａｂｌとの結合によって説明されるかも知れない（Ａｄｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
【００６２】
Ａｂｌ ＳＨ３ドメインへの結合はＡｂｉ１によるｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の調節において重要である。これはＡｂｉ１のＡｂｌ ＳＨ２およびＡｂｌ ＳＨ３ドメイン結合領域両方を含むホスホペプチドＰｒｏ−ｐＹ２１３によるキナーゼ活性の調節によって証明される。Ｐｒｏ−ｐＹ２１３はキナーゼ活性に対するアップレギュレーションおよびダウンレギュレーション効果の両方を引き出す。これらの効果はペプチド濃度に左右される。より低い濃度ではＰｒｏ−ｐＹ２１３はＡｂｌ活性をアップレギュレートする；これは十中八、九、ＳＨ３およびＳＨ２ドメインと触媒ドメイン（ＣＤ）およびＳＨ２触媒ドメインリンカーとの阻害的相互作用と競合し、これを緩和することによる（Ｂｒａｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）。これらのデータは、最近ｃ−Ｓｒｃで観察されたように（Ｃｏｗａｎ−Ｊａｃｏｂ ｅｔ ａｌ．，２００５）、または活性ｃ−ＡｂｌのＳＡＸＳ分析によって示唆されたように（Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）、ＣＤドメインからのＳＨ３およびＳＨ２ドメインの単離を含む、Ｐｒｏ−ｐＹ２１３のｃ−Ａｂｌ活性化の諸工程を示唆する。Ｐｒｏ−ｐＹ２１３のＮ−末端領域から誘導されるペプチド類のその後の分析は、ＳＨ３結合配列、１８１ＰＰＳＰＰ１８５、およびＹ１９８が、ｃ−Ａｂｌキナーゼの調節のために重要であることを示している；これは十中八、九、キナーゼの阻害されたコンフォメーションを安定化することによると考えられる。キナーゼ活性のアップレギュレーションは完全な長さのＰｒｏ−ｐＹ２１３でなければ観察されず、したがってこのペプチドＰＰＳＰＰ、Ｙ１９８、およびｐＹ２１３の３つの要素すべてがこの効果を引き出すのに必要である。より高濃度ではＰｒｏ−ｐＹ２１３は３つのすべてのｃ−Ａｂｌドメイン、すなわちＳＨ３、ＳＨ２およびＣＤとの相互作用に十分に関与するらしく、キナーゼの新しい、阻害されたコンフォメーションを安定化させるらしい（図８Ａ）。バイアコアを用いて、低ミリモル範囲ではＧＳＴ−ＳＨ３−ＳＨ２が、ＧＳＴ−ＳＨ２およびＰｒｏ−ｐＹ２１３で観察されるものに非常に近いＫｄでｐＹ２１３と相互作用することが確認された（データは示されず）。これらおよび、ホスホセリン６９の役割に関する構造データは、ＧＳＴ−ＳＨ３−ＳＨ２においてＳＨ３およびＳＨ２ドメインが全く無秩序であることを示唆する。そこで、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰｒｏ−ｐＹ２１３とＳＨ３−ＳＨ２ドメインとの相互作用を安定化するためには高濃度のＰｒｏ−ｐＹ２１３が必要である。これはｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいてｃ−Ａｂｌ活性に対する影響を引き出すために、なぜ極めて高い濃度のＰｒｏ−ｐＹ２１３ペプチドが必要であるかも説明できる。しかし最近のｃ−Ａｂｌ構造は、Ａｂｌ ＳＨ３およびＳＨ２ドメインの相互作用がホスホセリン６９によって安定化されることを示している。これは、これらのドメインが会合構造における１ユニットとして働くことを示唆する（Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ｃ−Ａｂｌに関する最近の構造情報を取り入れた、Ａｂｉ１によるｃ−Ａｂｉ１キナーゼ調節のこのモデルにおいて（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）、ＳＡＸＳ分析によって提起されるように、Ｐｒｏ−ｐＹ２１３が先ず最初に自己阻害された構造を開き、伸長した、より大きい活性を有するＡｂｌが生成することが考えられる（Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）；この後に、一部または完全に閉鎖した構造を有する、活性のより小さい、および不活性の中間体が生成する（図８Ｂ）。
【００６３】
以前、Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ら、２００３（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３）は短いホスホチロシン含有ペプチドがミリストイル化ｃ−Ａｂｌキナーゼを活性化できることを明らかにした。多分ｉｎ ｖｉｖｏ増殖因子受容体細胞質ドメインを代表するこのようなホスペプチド類は、阻害プロテインＡｂｉ１と競合してＡｂｌのホスホチロシン結合部位に結合することによってｃ−Ａｂｌキナーゼを活性化することができる。
【００６４】
基質チロシン２１３を含むペプチドＹ２１３は、Ａｂｌキナーゼ活性の最も強力な阻害を示した。この基質ペプチドのＫｍの減少並びにＶｍａｘの減少（０．１ｍＭおよび２ｍＭにおける）は、Ｙ２１３ペプチドがその他のＡｂｌ基質のターンオーバーを減らすことを示唆する。これは生理学的に意味をもつかも知れない、なぜならばＡｂｉ１／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１はＡｂｌキナーゼのその他の細胞基質を標的にするからである（Ｍａｒｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
【００６５】
ＬｎＣＡＰ細胞における実験は、Ａｂｉ１に対するＳＨ３およびＳＨ２結合によるｃ−Ａｂｌ調節機序を裏付ける。Ａｂｌ ＳＨ２ドメイン（Ｙ２１３Ｆ）またはＳＨ３ドメイン（１８１ＰＰＳＰＰ１８５）結合配列、１８１ＰＰＳＰＰ１８５、に突然変異を有するＡｂｉ１の発現は、Ａｂｉ１のｃ−Ａｂｌ阻害能力を低下させる。Ａｂｉ１突然変異体を安定的にトランスフェクトした細胞において、ｃ−Ａｂｌの活性化ループチロシンｐＹ４１２のリン酸化によって、並びにその基質であるＣｒｋの高められたチロシンリン酸化によって測定して、より高いｃ−Ａｂｌ活性が観察された。ＬｎＣＡＰ細胞における野生型Ａｂｉ１発現の際の負のフィードバック阻害の結果としてのより低いｃ−Ａｂｌキナーゼ活性は、ＰＤＧＦまたはインテグリンシグナリングのような増殖因子受容体から下流の細胞分裂促進効果におけるｃ−Ａｂｌの役割のダウンレギュレーションと一致する（Ｗａｎｇ，２００４；Ｗｏｏｄｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２）。したがって、より低いｃ−Ａｂｌキナーゼ活性は細胞増殖および細胞スプレディング活性の阻害につながる。以前、ｃ−Ａｂｌキナーゼ活性は、インテグリンシグナリング（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、ミクロスパイク形成（Ｗｏｏｄｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｓｔｕａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００６）、または細胞スプレディング（Ｌｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５）の増加と関連づけられた。しかしそのプロセスの明らかな機序はＡｂｉ１に対しては提起されなかった。
【００６６】
最も速い速度で増殖したＡｂｉ１−Ｐｒｏクローンは高いＡｂｌチロシンキナーゼ活性を有し、それらはＹ２１３を含む、という事実は、Ｙ２１３および／またはｐＹ２１３（後者の方がより確からしい）がｃ−Ａｂｌキナーゼの下流の増殖シグナルの伝達に役割を演じていることを示唆する。野生型Ａｂｉ１をトランスフェクトしたＬｎＣＡＰクローンは野生型ＬｎＣＡＰ細胞よりも高レベルのＹ２１３を含むが、基質Ｙ２１３のリン酸化産物であるｐＹ２１３による負のフィードバックによって、より低いｃ−Ａｂｌ活性を有する。Ａｂｉ１（＋）細胞は、ｐＹ２１３レベルが低いために、一貫して野生型ＬｎＣＡＰ細胞よりもゆっくり増殖する（図６Ｄを参照）。この考え方は、組換えＡｂｉ１−Ｆ２１３がＹ２１３上ではリン酸化されないのでＡｂｉ１−Ｆ２１３細胞も緩徐に増殖するという事実とも一致する。ｐＹ２１３が例えばダウンストリームエフェクターに結合することによって細胞増殖を促進し、その間ｃ−Ａｂｌキナーゼ活性阻害もするならば、これは、ｃ−Ａｂｌ依存性増殖シグナルがその基質であるＡｂｉ１によって非常にきっちりと調節されることを示唆するものである。基質Ａｂｉ１は負のフィードバックループによってｃ−Ａｂｌ阻害剤としても作用する。
【００６７】
興味深いことに、細胞スプレディング活性は細胞内の高Ａｂｌキナーゼ活性と対応する；これは増殖阻害をあらわすＡｂｉ１−Ｆ２１３細胞を含んでいた。そこでＡｂｉ１依存性増殖調節は細胞スプレディングのＡｂｉ１依存性調節とは切り離される。この調節はＷａｖｅ２のリン酸化の調節を含むらしい。ｃ−ＡｂｌによるＷａｖｅ２のリン酸化は、細胞スプレディングを調節するＡｒｐ２／３およびアクチン細胞骨格の再構成を促進することが示唆されている（Ｌｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｓｔｕａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００６）。野生型ＬｎＣＡＰ細胞におけるＡｂｉ１の比較的低い発現、またはＡｂｌキナーゼ活性に対するＡｂｉ１の阻害効果を完全になくす突然変異を有するＡｂｉ１の発現は、Ｗａｖｅ２の高リン酸化を起こし得る。そしてこれが細胞の細胞スプレディング増加につながるらしい。こうして増加した細胞スプレディング活性は高いｃ−Ａｂｌチロシン活性と一致し、Ｙ２１３の存在とは一致しない（細胞増殖とは対照的である）（図１０）。
【００６８】
これらのデータは、ｃ−ＡｂｌおよびＡｒｇのような非受容体Ａｂｌチロシンキナーゼ類がＡｂｉ／Ｈｓｓｈ３ｂｐ１プロテインファミリーによって調節される一般的機序を示唆する。Ｈｓｓｈ３ｂｐ１遺伝子は染色体１０ｐ１１．２上にある（Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、ジーンバンク受入れ番号Ｎｏ．Ｕ１８７６６；Ｈｓｓｈ３ｂｐ１はＡｂｉ１のヒト相同体である。Ａｂｉ１の部分的配列が最初に確定されたのはマウスであり（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、マウスＡｂｉ１の完全配列がより最近報告された（Ｉｋｅｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００１）。調節チロシン２１３を含む領域はヒトからツメガエルにいたるまでＡｂｉ１とＡｂｉ２との間に高度に保存されており、キイロショウジョウバエのＡｂｉに存在する（表３）。この保存された配列はＰＸＸＰモチーフ、１８１ＰＰＳＰＰ１８５も含む。これはｃ−Ａｂｌ−ＳＨ３ドメインおよびチロシン１９８に結合する。これまでに同定されたＡｂｉ１またはＡｂｉ２のすべてのアイソホーム（Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８、およびＬ．Ｋｏｔｕｌａ、未発表データ）はすべてのＡｂｉアイソホームにｃ−Ａｂｌ調節が保存されていることを示唆する調節配列を含む。Ａｂｉの保存された領域は明らかに細胞内のｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の調節にある役割を果たしている。ここで我々はＡｂｉ１のアイソホーム２におけるこの調節配列の役割を研究した。調節性Ｙ２１３のリン酸化後に、ＡｂｉがＡｂｌ ＳＨ２およびＳＨ３ドメインに結合する。これはｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の一過性のアップレギュレーションおよびその後のダウンレギュレーションにつながる。この分子調節は生理学的意味を有する。なぜならばＡｂｉ１に結合する多数のプロテインが、リン酸化の基質としてｃ−Ａｂｌキナーゼの標的とされているからである（Ｌｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｍａｒｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。そこでｃ−Ａｂｌキナーゼは、Ａｂｉプロテイン、ｃ−Ａｂｌおよびリン酸化サイクル後にターンオーバーする基質を含む複合体のためにきっちりと調節されなければならない。Ａｂｉ１もｃ−Ａｂｌの基質であるから、提案された調節は負のフィードバック機序を示唆する。Ａｂｉ１に対するｃ−Ａｂｌ ＳＨ３およびＳＨ２結合は細胞内のこの調節機序のために重要である。これらのドメインにおける突然変異が細胞の形質転換を起こすからである（Ｊａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９；Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。すべての調節ドメインをｃ−Ａｂｌと共有し、並びに同様なＳＴＩ−５７１阻害機序を有するＡｂｌファミリーの第二メンバーであるＡｒｇキナーゼ（Ｔａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）も、提起された機序によって調節されるらしい。
【００６９】
【表３】
Ａｂｉプロテインファミリーのｃ−Ａｂｌキナーゼ調節領域の種間比較。コアＰＸＸＰコンセンサスを含むＡｂｌ ＳＨ３ドメイン結合部位、ＰＰＳＰＰ、Ｙ１９８、およびＳＨ２ドメイン結合部位（下線を引いてある、調節ホスホチロシン、ｐＹを有する）を含むＡｂｉ１の領域は、Ａｂｉプロテインファミリーの進化の際に高度に保存される。重要な残基は太線で書かれている。配列のジーンバンク受入れ番号は次の通りである：Ａｂｉ１：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｕ８７１６６およびＮＭ＿００５４７０；Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ、ＸＰ＿８８１０７４．１；Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、ＸＰ＿８５８２３１．１；Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｑ８ＣＢＷ３；Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ、ＡＡＨ８１１７８．１；Ａｂｉ２：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、ＮＰ＿００５７５０．３；Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、ＡＡＨ７９６４６．１；Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ、ＸＰ＿４２１９６２．１；Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、ＮＰ＿００１００７４８８．１；Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ、ＸＰ＿６８５４３１．１、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、ＡＡＤ３８３８２．１。＊＊は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおける配列ＲＡＧＮＴＧＴＬＧＫＳＶＳＮＴの挿入を示す。
【００７０】
要するに、抗−Ａｂｌキナーゼ薬の新しい開発戦略として利用できるＡｂｌキナーゼの調節機序が確認された。ｃ−Ａｂｌキナーゼの突然変異型はある種の癌に関係している、例えばＢＣＲ Ａｂｌは慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）に関係しており、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の幾つかの型にも関係している（Ｄｒｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１ａ；Ｇｏｌｄｍａｎ ａｎｄ Ｍｅｌｏ，２００３）。ＳＴＩ−５７１の使用がこれら疾患を処置するために大きい希望をもたらすとはいえ、若干の患者は長期処置後にこの薬剤に対する耐性をもつようになる。ＳＴＩ−５７１耐性−突然変異がＡｂｌ ＳＨ３およびＳＨ２ドメインに見いだされ（Ａｚａｍ ｅｔ ａｌ．，２００３）、これらの症例においてＢＣＲ−ＡｂｌがＡｂｉ１による調節を逃れる可能性につながる（これはＮ−末端におけるＢＣＲの存在および調節性キャップ領域の欠如によってすでに影響を受けている）。ここに記載される機序はＢＣＲ−Ａｂｌの将来の研究に直接強い影響を与え、ＣＭＬを処置するための新規のアロステリック化合物の開発を助けるはずである。
【００７１】
実験法
Ａｂｌキナーゼ。Ｈｉｓタグ付、アンキャップド活性ｃ−Ａｂｌ、Ｅ４６からＣ−末端まで（アイソホーム１ｂ）（Ｔｏｎｙ Ｋｏｌｅｓｋｅ（エール大学、ニューヘブン、ＣＴ）のご好意により寄贈された）は、昆虫細胞を、細胞溶解前に３０μＭのＳＴＩ−５７１（ノバルティス ファーマ社（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＡＧ）、バーゼル、スイス）で４８時間処理した後、記載のようにバクロウイルスから作製、精製された（Ｔａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）。発現したプロテインはニッケル−ニトリロ酢酸アガロース上でアフィニティ精製し、洗浄して阻害物質を除去し、その後Ｍｏｎｏ Ｓカラム（アマーシャムビオサイエンシス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ピスカタウエイ、ＮＪ）を用いてイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。ｃ−Ａｂｌ ＳＨ２ドメイン野生型とＲ１７１Ｋ突然変異を含むＳＨ２ドメインとのＧＳＴ融合物、およびｃ−Ａｂｌ−ＧＳＴを含む哺乳動物発現プラスミド（アイソホーム１ｂ、Ｃ−末端にＧＳＴを有する）をＢｒｕｃｅ Ｍａｙｅｒ（Ｕｎｉｂｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｅｎｔｅｒ、ファーミントン、ＣＴ）から入手した。
【００７２】
Ａｂｉ１（ジーンバンク受入れ番号ＮＭ００５４７０およびＵ８７１６６）。野生型または突然変異体Ａｂｉ１アイソホーム２（残基番号はＺｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８による）はプラスミドから発現した。Ａｂｉ１のエクソン６が欠如している突然変異体Ａｂｉ１−△Ｅｘ６（Ｍａｃｏｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２００１）はＬｎＣＡＰ細胞からサブクローニングされた。突然変異体Ａｂｉ１−Ｆ２１３はＹ２１３Ｆ置換を含む。突然変異体Ａｂｉ１−Ｐｒｏは、Ａｂｉ１の残基１８１−１８５であるＰＰＳＰＰの代わりに配列ＡＥＳＥＡを含み、その結果ＰＸＸＰ ＳＨ３結合モチーフを喪失している。ＧＦＰをコードする配列を除去し、Ｃ−末端にＨＡタグを導入した後、すべてのＡｂｉ１ ｃＤＮＡｓをｐＥＧＦＰ−Ｎ２プラスミドにサブクローンニングした（クロンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、マウンテンビュー、ＣＡ）。質量分析（表１）、またはＳＨ３結合アッセイ（図２Ａ）のためにＡｂｉ１のＧＳＴ融合プロテインをｐＧＥＸ−２Ｔプラスミド（アマーシャム ビオサイエンシス社、ピスカタウエイ、ＮＪ）から発現させた。すべての発現プラスミドをシーケンシングによって確定した。Ａｂｉ１のＮ−末端のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を記載のように実施した（Ｍａｃｏｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【００７３】
キナーゼアッセイ。キナーゼ活性の測定は、ビオチニル化モデル基質ペプチドＧＧＥＡＩＹＡＡＰＦＫＫ（Ｂｒａｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｖａｎ Ｅｔｔｅｎ，２０００；Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５）および３２Ｐ−γ−ＡＴＰを用いて、実質上記載のように行われた（Ｔａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＳＡＭ２ストレプトアビジン塗布膜（プロメガ コーポレーション（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、マジソン ＷＩ）を用いて基質を捕獲した。キナーゼアッセイ混合物は、記載のように５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのジチオスレイトール、０．０１％Ｂｒｉｊ３５、および１００μＭのＡＴＰ、２ｎＭのＡｂｌキナーゼ、基質ペプチド、およびＡｂｉ１リガンドペプチドを含んでいた。反応は３０℃で５分間行われた。ＬｎＣＡＰ細胞系のｃ−Ａｂｌキナーゼを評価するために、細胞溶解前に細胞を１０分間ペルバナデートで処理した。溶解した細胞からの免疫沈降物を、基質としてＧＳＴ−Ｃｒｋを用いて試験した。
【００７４】
ペプチドおよび抗体。すべてのペプチドは、ゲネムド シンテシス社（Ｇｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．）（サンフランシスコ、ＣＡ）で合成された。抗−ｐＹ２１３ポリクローナル抗体をペプチドｐＹ２１３に対して作製し、ホスホペプチド特異的カラムを用いてアフィニティ精製し、その後非ホスホペプチド（Ｙ２１３）カラム上で精製した。ＰＹ９９抗体はサンタクルス バイオテクノロジー社（サンタクルス、ＣＡ）からのもであった。ポリクローナルおよびモノクローナルＨＡ抗体はコバンス社（バークレー、ＣＡ）およびロッシュ ディアグノスティック コーポレーション（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（インディアナポリス、ＩＮ）から入手した。ここで使用したｃ−Ａｂｌに対する抗体は８Ｅ９（ＢＤ ビオサイエンシス、サンホゼ、ＣＡ）、Ｋ１２（サンタクルス バイオテクノロジー、サンタクルス、ＣＡ）、ｐＹ４１２（ビオソース インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、カマリロ、ＣＡ）から入手した；Ｃｒｋ抗体はＢＤビオサイエンシス社、サンホセ、ＣＡ（マウスモノクローナル）；サンタクルス バイオテクノロジー社、サンタクルス、ＣＡ（ウサギポリクローナル）；およびセル シグナリング テクノロジー社（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ホスホ−Ｃｒｋ ｐＹ２２１）から得たものである。Ａｂｉ１に対するポリクローナル抗体Ａｂ−２が記載されている（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０００）。Ａｂｉ１に対するモノクローナル抗体７Ｂ６が組換えＡｂｉ１に対して作製された；この抗体のエピトープはＭａｂ ４Ｅ２と一致した（Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）はイムゲネックス コーポレーション（Ｉｍｇｅｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（サンジエゴ、ＣＡ）から；ＧＳＴ抗体はチムド社（Ｚｙｍｅｄ）（サンフランシスコ、ＣＡ）から入手した。ホスホチロシンに対するジェネリック抗体、ＰＹ９９およびｐＹ３５０、はサンタクルス バイオテクノロジー社、サンタクルス、ＣＡから入手した。
【００７５】
細胞培養およびトランスフェクション。Ｃｏｓ７およびＬｎＣＡＰ細胞（ＡＴＣＣ、ロックヴィル、ＭＤ）はＡＴＣＣのインストラクションによって維持された。シングルＡｂｌ（−／−）ノックアウト線維芽細胞（Ｋｏｌｅｓｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８）はウシ胎児血清を用いて維持された。リポフェクタミン プラス試薬（Ｌｉｐｏｅｆｅｔａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ）（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバド、ＣＡ）を用いてすべての細胞に発現プラスミドをトランスフェクトした。ｃ−Ａｂｌのアイソホーム１ｂ、およびＡｂｉ１のアイソホーム２（野生型または突然変異体）で、Ａｂｉ１とｃ−Ａｂｌとによるすべての共トランスフェクションを行った。トランスフェクションの２２時間後に、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）が報告したように、細胞を間接的免疫沈降または免疫蛍光法のために処理した。Ａｂｉ１アイソホーム２の野生型またはＨＡタグ付または突然変異体を発現する安定な細胞系をＧ４１８選択を用いて得た（インヴィトロジェン社、カールスバド、ＣＡ）；サブクローン化細胞系、Ａｂｉ１（＋）クローン１、およびＡｂｉ１（＋）、クローン１０における組み換え遺伝子の発現は、特異的プライマーを用いて得られたＲＴ−ＰＣＲ生成物のシーケンシングによって確定された。ＨＡ−タグ付Ａｂｉ１の選択後、上記組換え蛋白の同レベルの発現を有する二重クローンが選択され、分析された。安定クローンの選択後、ＬｎＣＡＰ細胞またはそのＡｂｉ１（＋）サブクローンにおけるすべての実験はＧ４１８を添加せずに行われた。細胞増殖速度の測定は、標準としてＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭフローサイトメーターおよびＦｌｏｗ−ＣｏｕｎｔＴＭフルオロスフェアーズＣａｔ．Ｎｏ ７５４７０５３−２００を用いて細胞数を数えることによって行われた（ＢＤビオサイエンシス社、サンホセ、ＣＡ）。
【００７６】
免疫沈降およびウエスタンブロッティング。細胞を、細胞溶解前に０．１ｍＭ過バナジウム酸ナトリウムで処理し、ホスファターゼを阻害した。免疫沈降を記載のように行った（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０００）。Ａｂｌ ＳＨ３ドメイン結合を定量するためのウエスタンブロッティングおよび結合アッセイを記載のように行った（Ｚｉｅｍｎｉｃｋａ−Ｋｏｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）；ブロットはスーパーシグナル・ウエスト・ピコ化学ルミネッセンス基質（ピアス バイオテクノロジー社、ロックフォード、ＩＬ）を用いて展開した。コダックＧＬ４４０画像化装置を用いて画像化し、コダック１Ｄ画像分析ソフトウエア（バージョン３．６．４）を用いて直接定量するかまたはあらかじめフィルムに露出させてから定量した。
【００７７】
共焦点顕微鏡。ＬｎＣＡＰおよびＡｂｉ１−トランスフェクテド細胞系における細胞スプレディング活性を評価するために、８−チェンバ培養スライド（ＢＤビオサイエンシス社、サンホセ、ＣＡ）を用いて生細胞の観察を行った。細胞スプレディング活性は次のように評価した：細胞が何らかの伸長を示した場合スプレディング活性を有すると評価し（陽性）、または細胞が丸い場合はスプレディング活性はない（陰性）と評価した。対照実験において、ＳＴＩ−５７１を３μＭで２４時間培地に加え、その後この化合物を加えずに再培養した。指示された時点に対象の４つのランダム領域の細胞を評価した。それは各時点にまたはｎ＞１００細胞の群で１６時間続けられた。観察は、Ｚｅｉｓｓ５１０ＭＥＴＡ共焦点顕微鏡を用いて培養後１６時間行われた。ＬｎＣＡＰの細胞のスプレディングを確認するために、コラーゲンセル上のクローンをコラーゲンで覆った皿（マトテック・コーポレーション（ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎアシュランド、ＭＡ）上に培養し、再培養後６時間の各クローンについて平均細胞面積（ｎ＝２０）を評価した（ＩｍａｇｅＪ，ｖｅｒｓｉｏｎ１．３６ｂ、ナショナルインスティチュート・オブ・ヘルス、ＵＳＡ）。
【００７８】
表面プラスモン共鳴アッセイ。表面プラスモン共鳴アッセイはバイアコア３０００インスツルメント（ＢＩＡコア社（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）、ピスカタウエイ、ＮＪ）を用いて行われた。ビオチニル化１４残基ペプチド、ｐＹ２１３またはＹ２１３、をストレプトアビジン−コーテド（ＳＡ）バイオセンサーチップ（ＢＩＡコア社，ピスカタウエイ、ＮＪ）の表面に結合させた。結合反応は１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０５％（ｖ／ｖ）表面活性剤Ｐ２０を含むＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で行われた。新たな各注入の前に５０ｍＭのＮａＯＨおよび１ＭのＮａＣｌを用いて表面を再生した。バイアコア機器は、同じ再生された表面上でＧＳＴ Ａｂｌ ＳＨ２ポリペプチドの濃度を高めながら一連の結合アッセイを行うようにプログラムされた。誘導されたセンソグラム（表面上の反応単位の変化を時間の関数としてプロットする）をソフトウエアＢＩＡｅｖａｌ３．０を用いて分析した。アフィニティ常数は１：１結合モデルを用いてフィットする曲線によって推定された。
【００７９】
分子模型化。Ａｂｉ１（Ｐ２０６−Ｐ２１７）からのペプチドを含む１２残基のホスホチロシンをｃ−Ｓｒｃプロテイン（ｐｄｂエントリー２ｓｒｃ）のＣ−末端領域（Ｆ５２０−Ｅ５３１）のｘ線結晶構造に基づいて模型化した。ｃ−Ａｂｌおよびｃ−Ｓｒｃキナーゼ類は高度の相同性を有し、ｃ−Ｓｒｃのホスホチロシン残基（ｐＹ）５２７はＳＨ２ドメインに結合するから、２つの構造をＱｕａｎｔａ２０００ソフトウエア（アクセルリーズ社、サンジエゴ、ＣＡ）でペプチド（Ｆ５２０−Ｅ５３１）を整列させ、ｃ−ＳＲＣプロテインからの上記ｃ−Ａｂｌおよびペプチドを合流させることによって、ペプチド（Ｆ５２０−Ｅ５３１）をｃ−Ａｂｌのｘ−線構造（ｐｄｂエントリー１ｏｐｌ）上に置いた。このペプチドをその後トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）ソフトウエアの突然変異誘発フィーチャーを用いてＡｂｉ１（Ｐ２０６−Ｐ２１７）ペプチドに突然変異させた。上記フィーチャーはプロテイン突然変異体のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ構造のために設計されたものである（Ｄａｍｂｏｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２００１）。トリトンは外部プログラム、Ｍｏｄｅｌｌｅｒ、を用いて突然変異体の三次元構造を作り出す（Ｆｉｓｈｅｒ ａｎｄ Ｓａｌｉ、２００３）。ＴＲＩＴＯＮはホスホチロシン残基を確認しないから、最初はその代わりにチロシンを置いた。チロシン残基を、ＴＲＩＴＯＮ突然変異誘発工程後に、Ｑｕａｎｔａ２０００で突然変異させてホスホチロシン残基に戻した。その残基をＱｕａｎｔａの蛋白設計オプション（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｐｔｉｏｎ）内の“模型側鎖”を用いてさらに模型化した。ｃ−Ａｂｌ構造上に入っている突然変異ペプチドのプロテイン・ヘルス・チェックにより、密な接触は少なく、Ｃｈａｒｍｍエネルギーが高いことが明らかになった。その構造をＳｔｅｅｐｅｓｔ Ｄｅｓｃｅｎｔの５０工程、および１００工程のＣｏｎｊｕｇａｔｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ法によって最小化し、これらの密な接触を除去した。
【００８０】
統計分析。細胞増殖および細胞スプレディング活性の評価以外のすべての分析はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２００４ ｆｏｒ Ｍａｃ Ｖｅｒｓｉｏｎ１１．０を用いて行われた。表２（ＫｍおよびＶｍａｘの評価）および図７Ｂおよび７Ｄ（ＬｎＣＡＰクローンのＡｂｌキナーゼ活性、およびコアーゲン上の細胞スプレディング）では両側対ｔ検定が用いられた。細胞スプレディング活性の評価、図５Ｃ、では、χ２検定が用いられた；細胞増殖の評価、図７Ｃ、では、二元配置ＡＮＯＶＡを用いた（ＳｉｇｍａＳｔａｔバージョン２、シスタト ソフトウエア社（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．ポイントリッチモンド、ＣＡ）。図６Ａでは、両側等分散性ｔ−検定が用いられた。
【００８１】
（参考文献）
【００８２】
【表４】
【００８３】
【表５】
【００８４】
【表６】
【００８５】
【表７】
【００８６】
【表８】
上記から、本発明の幾つかの有益性が実現し、その他の有益性も得られることがわかる。
【００８７】
上記方法および組成物には本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更がなされ得るから、上記の記載に含まれ、添付の図面に示されるすべての事柄は例証的なものであり、制限するものではない。
【００８８】
本明細書に記載されるすべての参考文献は参照としてここに組み込まれる。本明細書中の参考文献の検討は単に著者によってなされる主張をまとめたものに過ぎず、任意の参照が先行技術を構成することの承認はなされていない。出願人は記載の参考文献の正確さおよび適切性を吟味する権利を保有するものである。
【００８９】
（付録−配列番号）
【００９０】
【表９】
【００９１】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１は、ｃ−Ａｂｌキナーゼリン酸化部位として同定されたＡｂｉ１Ｙ２１３を示すウエスタンブロットの図および写真である。パネルＡはＡｂｉ１の調節領域を示す。最上部は本研究に用いたペプチドの図である。その図の下は調節因子チロシン２１３を含むＡｂｉ１の配列（残基１６９から２１７まで、ジーンバンク受入れ番号Ｕ８７１６６）である。実施例に記載される実験に用いたペプチド類の名称は特異的ペプチドを描くライン上にある。ＰｒｏはＰＸＸＰモチーフ、ＰＰＳＰＰが含まれることをあらわす；Ｙはチロシンを示す；ｐＹはホスホチロシンを示す、Ｆはチロシンのフェニルアラニン置換を示す。キナーゼアッセイに用いられるペプチドＰｒｏ−ｐＹ２１３、ｐＹ２１３、およびＦ２１３ペプチドのＮ−末端は配列上にかぎ付矢印でマークされる。ペプチドＰｒｏ−Ｙ１９８およびＰｒｏ−Ｆ１９８は残基１６９−２０３に及ぶ；これらのペプチドにはｐＹ２１３配列はない。ペプチドＥＥ−Ｙ１９８はＰＰＳＰＰの代わりに配列ＰＥＳＥＰを含み、その結果ＰＸＸＰ ＳＨ３結合モチーフは喪失する。パネルＡの最下部はＡｂｉ１のＮ−末端のチロシンリン酸化を最初に特徴づけるために用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳ポリペプチド類を描いた図である。特徴的チロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）置換を含むポリペプチド類（矩形）が野生型ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｈプロテインの下に図式的に描かれる。突然変異により、対象領域におけるチロシン残基Ｙ１９８、およびＹ２１３のどちらかまたは両方が置換される。各ポリペプチドのキナーゼアッセイ結果は右側に示される。黒色領域はＬｎＣＡＰ細胞中に欠如しているＡｂｉ１のエクソン６を示す。パネルＢはＡｂｉ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳Ｎ−末端のチロシンリン酸化を示すウエスタンブロットである。このプロテインのＮ−末端の半分およびチロシン残基の指示された突然変異を含むＡｂｉ１ポリペプチド類はｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼとのｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼ反応を受けた。ポリペプチド類はＳＤＳトリシン ポリアクリルアミドゲル（７％）で分離され、その後ＰＶＤＦ膜上にブロットされた。左のブロットはａｎｔｉ−ＨＡ抗体でブロットした膜を示す。ＨＡエピトープは各ポリペプチドのＣ−末端に挿入された。右のブロットはａｎｔｉ−ホスホチロシン抗体ＰＹ−９９でブロットした同じポリペプチドを示す。ＷＴ、野生型ポリペプチド；Ｆ２１３、チロシン２１３のフェニルアラニン置換を含むポリペプチド（Ｙ２１３Ｆ）；Ｆ１９８、チロシンのフェニルアラニン置換を含むポリペプチド（Ｙ１９８Ｆ）；ＦＦ、Ｙ２１３ＦおよびＹ１９８Ｆを含むポリペプチド；リゼート、Ａｂｉ１ｃＤＮＡをもたない溶解物。
【図２−１】図２は、Ａｂｉ１のＮ−末端における、ｃ−Ａｂｌ ＳＨ３およびＳＨ２ドメインの最小結合領域の確定を示すウエスタンブロットのグラフおよび写真である。パネルＡはこのｃ−Ａｂｌ ＳＨ３ドメインへの結合を示す。Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈｂ３ｐｌのＮ−末端領域を含む組換えＧＳＴ融合ポリペプチド類をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に移した。次に示すＡｂｉ１ポリペプチドを分析した：残基１−１８７をコードするＮｌ−１８７；残基１−１７２をコードするＮｌ−１７２；残基１−２５３をコードするＮｌ−２５３；残基１−２５３をコードするが、Ａｂｉ１のエクソン６配列が欠如しているＮｌ−２５３△Ｅｘ６（Ｍａｃｏｓｋａ ｅｔ ａｌ，２００１）；ＧＳＴはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼである。左のウエスタンブロットの一番下の写真は、プロテイン発現レベルを示すために抗ＧＳＴモノクローナル抗体（抗ＧＳＴ）で試験した際の結果を示す。最上部の写真はビオチニル化ＧＳＴ−Ａｂｌ−ＳＨ３ドメイン（ＧＳＴ−Ａｂｌ−ＳＨ３−Ｂ）で得られた。ビオチニル化ＧＳＴ（ＧＳＴ−Ｂ）への結合は認められなかった（真中のパネル）。グラフは、独立的３実験から定量されたポリペプチドの相対的結合（ｎ＝３、±ｓ．ｄ．）をＮｌ−２５３のパーセントとして示す。パネルＢ−Ｄはｃ−Ａｂｌ ＳＨ２ドメインへの結合を示す。表面プラズモン共鳴分析を用いて、ＧＳＴ標識Ａｂｌ ＳＨ２ドメインに対する、リン酸化チロシン２１３（ｐＹ２１３）または非リン酸化チロシン２１３（Ｙ２１３）を含むビオチニル化１４−残基ペプチド類の相互作用を決定した。パネルＢは、ｐＹ２１３またはＹ２１３ペプチド類と結合したバイオセンサーチップスをＡｂｌ ＳＨ２ドメイン（１μＭ）と共に注入した際の結果を示す；パネルＣはｐＹ２１３結合バイオセンサーチップを指示された種々濃度のＡｂｌ ＳＨ２ドメインと共に注入した際の結果を示す。パネルＤはｐＹ２１３結合バイオセンサーチップを０．５μＭのＡｂｌ ＳＨ２ドメインまたはＡｂｌ ＳＨ２ドメインＲ１７１Ｋ突然変異体と共に注入した際の結果を示す。ＧＳＴプロテインだけに対する結合は認められなかった（図示されず）。ＲＵは反応単位。
【図２−２】図２は、Ａｂｉ１のＮ−末端における、ｃ−Ａｂｌ ＳＨ３およびＳＨ２ドメインの最小結合領域の確定を示すウエスタンブロットのグラフおよび写真である。パネルＡはこのｃ−Ａｂｌ ＳＨ３ドメインへの結合を示す。Ａｂｉ１／Ｈｓｓｈｂ３ｐｌのＮ−末端領域を含む組換えＧＳＴ融合ポリペプチド類をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に移した。次に示すＡｂｉ１ポリペプチドを分析した：残基１−１８７をコードするＮｌ−１８７；残基１−１７２をコードするＮｌ−１７２；残基１−２５３をコードするＮｌ−２５３；残基１−２５３をコードするが、Ａｂｉ１のエクソン６配列が欠如しているＮｌ−２５３△Ｅｘ６（Ｍａｃｏｓｋａ ｅｔ ａｌ，２００１）；ＧＳＴはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼである。左のウエスタンブロットの一番下の写真は、プロテイン発現レベルを示すために抗ＧＳＴモノクローナル抗体（抗ＧＳＴ）で試験した際の結果を示す。最上部の写真はビオチニル化ＧＳＴ−Ａｂｌ−ＳＨ３ドメイン（ＧＳＴ−Ａｂｌ−ＳＨ３−Ｂ）で得られた。ビオチニル化ＧＳＴ（ＧＳＴ−Ｂ）への結合は認められなかった（真中のパネル）。グラフは、独立的３実験から定量されたポリペプチドの相対的結合（ｎ＝３、±ｓ．ｄ．）をＮｌ−２５３のパーセントとして示す。パネルＢ−Ｄはｃ−Ａｂｌ ＳＨ２ドメインへの結合を示す。表面プラズモン共鳴分析を用いて、ＧＳＴ標識Ａｂｌ ＳＨ２ドメインに対する、リン酸化チロシン２１３（ｐＹ２１３）または非リン酸化チロシン２１３（Ｙ２１３）を含むビオチニル化１４−残基ペプチド類の相互作用を決定した。パネルＢは、ｐＹ２１３またはＹ２１３ペプチド類と結合したバイオセンサーチップスをＡｂｌ ＳＨ２ドメイン（１μＭ）と共に注入した際の結果を示す；パネルＣはｐＹ２１３結合バイオセンサーチップを指示された種々濃度のＡｂｌ ＳＨ２ドメインと共に注入した際の結果を示す。パネルＤはｐＹ２１３結合バイオセンサーチップを０．５μＭのＡｂｌ ＳＨ２ドメインまたはＡｂｌ ＳＨ２ドメインＲ１７１Ｋ突然変異体と共に注入した際の結果を示す。ＧＳＴプロテインだけに対する結合は認められなかった（図示されず）。ＲＵは反応単位。
【図３−１】図３はＡｂｉ１からのホスホペプチド類がｉｎ ｖｉｔｒｏでｃ−Ａｂｌ−キナーゼ活性を調節することを示す結果である。パネルＡは指示されたペプチド類を２ｍＭで添加した後のｃ−Ａｂｌ−のキナーゼ活性を示す。垂直棒は±ｓ．ｄ．を示す；ｎ＝３。基質ペプチド濃度を高めながら、活性を５分間キナーゼアッセイで測定した。パネルＢはパネルＡのデータの二重逆数ラインウェーバーバーク・プロットを示す。垂直棒は±ｓ．ｄ．を示す（ｎ＝３）。パネルＥは指示された濃度のＹ２１３（非リン酸化）ペプチドを添加した後のｃ−Ａｂｌのキナーゼ活性（平均値±ｓｅｍ；ｎ＝３）を示す。パネルＦは２ｍＭ濃度を除いて、パネルＥのデータの二重逆数ラインウェーバーバーク・プロットを示す。これらの実験からのＶｍａｘおよびＫｍデータについては表２を参照されたい。パネルＣ、ＤおよびＧは、基質ペプチド、ＰＥＰ、１００μＭで、指示されたＡｂｉ１ペプチド濃度で、Ａｂｉ１からのペプチド類（図１Ａ）の添加後のｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を示す；垂直棒はｓ．ｅ．ｍ．をあらわす（ｎ＝３）。パネルＧはＣと同じであるが、Ｙ２１３実験からの追加的データを含む。ここに使用したペプチド類の配列情報については図１Ａを参照されたい。
【図３−２】図３はＡｂｉ１からのホスホペプチド類がｉｎ ｖｉｔｒｏでｃ−Ａｂｌ−キナーゼ活性を調節することを示す結果である。パネルＡは指示されたペプチド類を２ｍＭで添加した後のｃ−Ａｂｌ−のキナーゼ活性を示す。垂直棒は±ｓ．ｄ．を示す；ｎ＝３。基質ペプチド濃度を高めながら、活性を５分間キナーゼアッセイで測定した。パネルＢはパネルＡのデータの二重逆数ラインウェーバーバーク・プロットを示す。垂直棒は±ｓ．ｄ．を示す（ｎ＝３）。パネルＥは指示された濃度のＹ２１３（非リン酸化）ペプチドを添加した後のｃ−Ａｂｌのキナーゼ活性（平均値±ｓｅｍ；ｎ＝３）を示す。パネルＦは２ｍＭ濃度を除いて、パネルＥのデータの二重逆数ラインウェーバーバーク・プロットを示す。これらの実験からのＶｍａｘおよびＫｍデータについては表２を参照されたい。パネルＣ、ＤおよびＧは、基質ペプチド、ＰＥＰ、１００μＭで、指示されたＡｂｉ１ペプチド濃度で、Ａｂｉ１からのペプチド類（図１Ａ）の添加後のｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を示す；垂直棒はｓ．ｅ．ｍ．をあらわす（ｎ＝３）。パネルＧはＣと同じであるが、Ｙ２１３実験からの追加的データを含む。ここに使用したペプチド類の配列情報については図１Ａを参照されたい。
【図３−３】図３はＡｂｉ１からのホスホペプチド類がｉｎ ｖｉｔｒｏでｃ−Ａｂｌ−キナーゼ活性を調節することを示す結果である。パネルＡは指示されたペプチド類を２ｍＭで添加した後のｃ−Ａｂｌ−のキナーゼ活性を示す。垂直棒は±ｓ．ｄ．を示す；ｎ＝３。基質ペプチド濃度を高めながら、活性を５分間キナーゼアッセイで測定した。パネルＢはパネルＡのデータの二重逆数ラインウェーバーバーク・プロットを示す。垂直棒は±ｓ．ｄ．を示す（ｎ＝３）。パネルＥは指示された濃度のＹ２１３（非リン酸化）ペプチドを添加した後のｃ−Ａｂｌのキナーゼ活性（平均値±ｓｅｍ；ｎ＝３）を示す。パネルＦは２ｍＭ濃度を除いて、パネルＥのデータの二重逆数ラインウェーバーバーク・プロットを示す。これらの実験からのＶｍａｘおよびＫｍデータについては表２を参照されたい。パネルＣ、ＤおよびＧは、基質ペプチド、ＰＥＰ、１００μＭで、指示されたＡｂｉ１ペプチド濃度で、Ａｂｉ１からのペプチド類（図１Ａ）の添加後のｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を示す；垂直棒はｓ．ｅ．ｍ．をあらわす（ｎ＝３）。パネルＧはＣと同じであるが、Ｙ２１３実験からの追加的データを含む。ここに使用したペプチド類の配列情報については図１Ａを参照されたい。
【図３−４】図３はＡｂｉ１からのホスホペプチド類がｉｎ ｖｉｔｒｏでｃ−Ａｂｌ−キナーゼ活性を調節することを示す結果である。パネルＡは指示されたペプチド類を２ｍＭで添加した後のｃ−Ａｂｌ−のキナーゼ活性を示す。垂直棒は±ｓ．ｄ．を示す；ｎ＝３。基質ペプチド濃度を高めながら、活性を５分間キナーゼアッセイで測定した。パネルＢはパネルＡのデータの二重逆数ラインウェーバーバーク・プロットを示す。垂直棒は±ｓ．ｄ．を示す（ｎ＝３）。パネルＥは指示された濃度のＹ２１３（非リン酸化）ペプチドを添加した後のｃ−Ａｂｌのキナーゼ活性（平均値±ｓｅｍ；ｎ＝３）を示す。パネルＦは２ｍＭ濃度を除いて、パネルＥのデータの二重逆数ラインウェーバーバーク・プロットを示す。これらの実験からのＶｍａｘおよびＫｍデータについては表２を参照されたい。パネルＣ、ＤおよびＧは、基質ペプチド、ＰＥＰ、１００μＭで、指示されたＡｂｉ１ペプチド濃度で、Ａｂｉ１からのペプチド類（図１Ａ）の添加後のｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を示す；垂直棒はｓ．ｅ．ｍ．をあらわす（ｎ＝３）。パネルＧはＣと同じであるが、Ｙ２１３実験からの追加的データを含む。ここに使用したペプチド類の配列情報については図１Ａを参照されたい。
【図４】図４は、Ｙ２１３がｃ−Ａｂｌキナーゼによってリン酸化されていることを示すウエスタンブロットである。パネルＡは、組換えＡｂｉ１のＹ２１３リン酸化がｃ−Ａｂｌキナーゼの発現に依存することを示している。二重Ａｂｌ（−／−）Ａｒｇ（−／−）ノックアウト細胞に野生型または突然変異体Ａｂｉ１プラスミドを単独でトランスフェクトし、または示されるようにＡｂｉ１とｃ−Ａｂｌとを一緒にトランスフェクトした：野生型Ａｂｉ１（Ａｂｉ１−Ｗｔ）；Ｙ２１３Ｆ突然変異を有するＡｂｉ１（Ａｂｉ１−Ｆ２１３）；Ｙ２１３を含む、エクソン６が欠如しているＡｂｉ１突然変異体（Ａｂｉ１−△ｅｘ６）；ＰＸＸＰ１８１ＡＥＳＥＡ１８５突然変異を含むＡｂｉ１突然変異体（Ａｂｉ１−Ｐｒｏ）。細胞溶解物の部分を、モノクローナル抗ＨＡ抗体、またはｃ−Ａｂｌに対するＫ１２ポリクローナル抗体で免疫沈降させた。免疫沈降サンプルを４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜上に移した。その膜を最初にｐＹ２１３（Ａ）またはＰＹ９９（Ｂ）に対するリン特異的抗体でブロットし（パネルＢも参照）、その後ストリッピングし、ＨＡに対するポリクローナル抗体（Ａｂｉ１−ＨＡ）でブロットし、それからストリッピングし、ｐＹ２１３（Ａ）およびＰＹ９９（Ｂ）に対するリン特異的抗体でブロットした。“ｃ−Ａｂｌ”は、８Ｅ９でブロットして得られたｃ−Ａｂｌ発現（アイソホーム１ｂ）のレベルを示す。パネルＢは、ペプチドｐＹ２１３を含むホスホチロシンに対するポリクローナル抗体が、ｃ−Ａｂｌによってリン酸化されたＡｂｉ１に高度に特異的であることを示す。漸増量の全長ＧＳＴ−Ａｂｉ１をバキュロウイルス精製ｃ−Ａｂｌと共に（＋ｃ−Ａｂｌ）、またはこれなしで（−ｃ−Ａｂｌ）、実施例の実験法の部、キナーゼアッセイの部分に記載のようにインキュベートした。一致する量の反応混合物（漸増する相対的量１．０ｘ、１．５ｘ、２．０ｘ）をＳＤＳ ＰＡＧＥ上で分離し、その後ホスホペプチドｐＹ２１３（ｐＹ２１３）に対するアフィニティ精製抗体でブロットするかまたはホスホチロシンｐＹ３５０（ｐＹ３５０）に対するジェネリック抗体でブロットした；“Ａｂｉ１”はＧＳＴに対するポリクローナル抗体を用いて測定したＧＳＴ融合プロテインのレベルを示す。
【図５−１】図５はＡｂｉ１を強化したＬｎＣＡＰ細胞の増殖阻害および細胞スプレディング活性阻害を示す細胞のグラフおよび顕微鏡写真である。パネルＡはＡｂｉ１による増殖阻害を示すグラフである。増殖速度は最初の培養後の指示された時点における細胞数を数えることによって評価した。組換えＡｂｉ１を安定的に発現するＬｎＣＡＰクローン：Ａｂｉ（＋）クローン１、クローン１；Ａｂｉ１（＋）クローン１０、クローン１０；ＬｎＣＡＰ、野生型ＬｎＣＡＰ細胞。垂直誤差棒は±ｓ．ｄ．（ｎ＝４）。パネルＢおよびＣはＬｎＣＡＰ細胞のスプレディング活性を示す。パネルＢは生きている細胞の観察からの代表的画像である。各画像の下部に記載された数は培養後経過した時間（ｈｏｕｒｓ）を示す。パネルＣは、Ａｂｉ１移入細胞系およびＬｎＣＡＰ細胞、またはＳＴＩ−５７１で処理したＬｎＣＡＰ細胞においてスプレディング活性を有する細胞のパーセントを示す。各群におけるスプレディング活性を有する細胞を指示された時点に評価した；ＬｎＣＡＰ対Ａｂｉ１（＋）細胞系：２時間、ｐ＝０．４６；４時間−１６時間 ｐ＜０．００１（χ２）；未処理ＬｎＣＡＰ対ＳＴＩ−５７１−処理ＬｎＣＡＰ細胞 ２時間、ｐ＝０．４０；４時間−１０時間 ｐ＜０．００１（χ２）；１２−１６時間 ｐ＞０．０５；各時点における細胞数ｎ＞１００。ＬｎＣＡＰ、野生型ＬｎＣＡＰ細胞；Ａｂｉ１（＋）、クローン１０；ＳＴＩ−５７１、ＳＴＩ−５７１で処理したＬｎＣＡＰ細胞。ＬｎＣＡＰ細胞を、薬剤なしで再培養する前に２４時間ＳＴＩ−５７１（３μＭ）で処理した。時間量が増すにつれて細胞スプレディング活性に対する薬剤の阻害効果は減少することに注目されたい。
【図５−２】図５はＡｂｉ１を強化したＬｎＣＡＰ細胞の増殖阻害および細胞スプレディング活性阻害を示す細胞のグラフおよび顕微鏡写真である。パネルＡはＡｂｉ１による増殖阻害を示すグラフである。増殖速度は最初の培養後の指示された時点における細胞数を数えることによって評価した。組換えＡｂｉ１を安定的に発現するＬｎＣＡＰクローン：Ａｂｉ（＋）クローン１、クローン１；Ａｂｉ１（＋）クローン１０、クローン１０；ＬｎＣＡＰ、野生型ＬｎＣＡＰ細胞。垂直誤差棒は±ｓ．ｄ．（ｎ＝４）。パネルＢおよびＣはＬｎＣＡＰ細胞のスプレディング活性を示す。パネルＢは生きている細胞の観察からの代表的画像である。各画像の下部に記載された数は培養後経過した時間（ｈｏｕｒｓ）を示す。パネルＣは、Ａｂｉ１移入細胞系およびＬｎＣＡＰ細胞、またはＳＴＩ−５７１で処理したＬｎＣＡＰ細胞においてスプレディング活性を有する細胞のパーセントを示す。各群におけるスプレディング活性を有する細胞を指示された時点に評価した；ＬｎＣＡＰ対Ａｂｉ１（＋）細胞系：２時間、ｐ＝０．４６；４時間−１６時間 ｐ＜０．００１（χ２）；未処理ＬｎＣＡＰ対ＳＴＩ−５７１−処理ＬｎＣＡＰ細胞 ２時間、ｐ＝０．４０；４時間−１０時間 ｐ＜０．００１（χ２）；１２−１６時間 ｐ＞０．０５；各時点における細胞数ｎ＞１００。ＬｎＣＡＰ、野生型ＬｎＣＡＰ細胞；Ａｂｉ１（＋）、クローン１０；ＳＴＩ−５７１、ＳＴＩ−５７１で処理したＬｎＣＡＰ細胞。ＬｎＣＡＰ細胞を、薬剤なしで再培養する前に２４時間ＳＴＩ−５７１（３μＭ）で処理した。時間量が増すにつれて細胞スプレディング活性に対する薬剤の阻害効果は減少することに注目されたい。
【図６−１】図６は、Ａｂｉ１の発現がＬｎＣＡＰ細胞のｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を阻害することを示す、ウエスタンブロットおよび染色されたゲルのグラフおよび写真である。ｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を、野生型細胞系（ＬｎＣＡＰ）およびＡｂｉ（Ａｂｉ１＋）を安定的にトランスフェクトした細胞系（クローン１０）において評価した。パネルＡはｃ−ＡｂｌキナーゼおよびＡｂｉ１の発現レベルを示す。左側は、ｃ−Ａｂｌ（８Ｅ９）およびＡｂｉ１（Ａｂ−２）がそれぞれＫ１２および７Ｂ６で免疫沈降し、指示された抗体でブロットした場合のウエスタンブロットを示す。右のグラフは細胞系におけるＡｂｉ１の発現レベルを示す（ｎ＝３；±ｓ．ｄ．；ｐ＝０．２８６１）。パネルＢはＬｎＣＡＰ細胞系から免疫沈降したｃ−Ａｂｌキナーゼの活性を示す。左側はｃ−Ａｂｌキナーゼアッセイが基質としてＧＳＴ−Ｃｒｋを用いて行われ；反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ９９）または抗ＧＳＴ抗体（抗ＧＳＴ）でブロットするウエスタンブロットを示す。“抗ＧＳＴ”は各反応にＧＳＴ基質が入れられることを示唆する。“ＬｎＣＡＰ”は、ＬｎＣＡＰにおけるＣｒｋリン酸化を示す。“対照”はＬｎＣＡＰ細胞系からの対照ＩｇＧ免疫沈降に加えられた反応混合物である。グラフは細胞系におけるＣｒｋリン酸化レベルを示す（±ｓ．ｄ．；ｎ＝３；ｐ＝０．０１２４）。パネルＣはＡｂｉ１を補充したＬｎＣＡＰ細胞系におけるチロシンリン酸化を示す。左側は、ｃ−Ａｂｌキナーゼを細胞系から免疫沈降させ（Ｋ１２抗体）、８Ｅ９（ｃ−Ａｂｌプロテインレベル）またはＰＹ９９（ｃ−Ａｂｌ上のチロシンリン酸化を示す）抗体でブロットするウエスタンブロットを示す。“ＧＡＰＤＨ”は免疫沈降のために用いるリゼート投入レベルを示す。右側は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離され、その後クーマッシー染色（“クーマッシー”）されるか、またはブロッティングされ、抗ホスホチロシン抗体ＰＹ９９で染色される指示された細胞系からの総細胞リゼート類を示す。グラフは細胞系の総リン酸化レベルを示す（±ｓ．ｄ．；ｎ＝３；ｐ＝０．０１０１）。パネルＤは、Ａｂｉ１がｃ−Ａｂｌキナーゼと相互作用することを示す。Ａｂｉ１を指示された細胞系から免疫沈降させ、免疫沈降した蛋白類は、特異的抗体：Ａｂ−２（Ａｂｉ１）；Ｋ−１２（ｃ−Ａｂｌ−ｃｏＩＰ）を用いてウエスタンブロッティングによって分析した。“ｃ−Ａｂｌ−ＩＰ”は、Ｋ１２抗体で免疫沈降させ、８Ｅ９と共にブロッティングした後の細胞系のｃ−Ａｂｌキナーゼのレベルをあらわす。“ｐＹ２１３”はＹ２１３におけるリン酸化Ａｂｉ１の免疫反応性をあらわす。免疫沈降したＡｂｉ１は比較のために等レベルで担持された。実施例の実験法の部に記載されているように、全ての細胞系は溶解および免疫沈降の前にプレバナデートで処理された。
【図６−２】図６は、Ａｂｉ１の発現がＬｎＣＡＰ細胞のｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を阻害することを示す、ウエスタンブロットおよび染色されたゲルのグラフおよび写真である。ｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を、野生型細胞系（ＬｎＣＡＰ）およびＡｂｉ（Ａｂｉ１＋）を安定的にトランスフェクトした細胞系（クローン１０）において評価した。パネルＡはｃ−ＡｂｌキナーゼおよびＡｂｉ１の発現レベルを示す。左側は、ｃ−Ａｂｌ（８Ｅ９）およびＡｂｉ１（Ａｂ−２）がそれぞれＫ１２および７Ｂ６で免疫沈降し、指示された抗体でブロットした場合のウエスタンブロットを示す。右のグラフは細胞系におけるＡｂｉ１の発現レベルを示す（ｎ＝３；±ｓ．ｄ．；ｐ＝０．２８６１）。パネルＢはＬｎＣＡＰ細胞系から免疫沈降したｃ−Ａｂｌキナーゼの活性を示す。左側はｃ−Ａｂｌキナーゼアッセイが基質としてＧＳＴ−Ｃｒｋを用いて行われ；反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ９９）または抗ＧＳＴ抗体（抗ＧＳＴ）でブロットするウエスタンブロットを示す。“抗ＧＳＴ”は各反応にＧＳＴ基質が入れられることを示唆する。“ＬｎＣＡＰ”は、ＬｎＣＡＰにおけるＣｒｋリン酸化を示す。“対照”はＬｎＣＡＰ細胞系からの対照ＩｇＧ免疫沈降に加えられた反応混合物である。グラフは細胞系におけるＣｒｋリン酸化レベルを示す（±ｓ．ｄ．；ｎ＝３；ｐ＝０．０１２４）。パネルＣはＡｂｉ１を補充したＬｎＣＡＰ細胞系におけるチロシンリン酸化を示す。左側は、ｃ−Ａｂｌキナーゼを細胞系から免疫沈降させ（Ｋ１２抗体）、８Ｅ９（ｃ−Ａｂｌプロテインレベル）またはＰＹ９９（ｃ−Ａｂｌ上のチロシンリン酸化を示す）抗体でブロットするウエスタンブロットを示す。“ＧＡＰＤＨ”は免疫沈降のために用いるリゼート投入レベルを示す。右側は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離され、その後クーマッシー染色（“クーマッシー”）されるか、またはブロッティングされ、抗ホスホチロシン抗体ＰＹ９９で染色される指示された細胞系からの総細胞リゼート類を示す。グラフは細胞系の総リン酸化レベルを示す（±ｓ．ｄ．；ｎ＝３；ｐ＝０．０１０１）。パネルＤは、Ａｂｉ１がｃ−Ａｂｌキナーゼと相互作用することを示す。Ａｂｉ１を指示された細胞系から免疫沈降させ、免疫沈降した蛋白類は、特異的抗体：Ａｂ−２（Ａｂｉ１）；Ｋ−１２（ｃ−Ａｂｌ−ｃｏＩＰ）を用いてウエスタンブロッティングによって分析した。“ｃ−Ａｂｌ−ＩＰ”は、Ｋ１２抗体で免疫沈降させ、８Ｅ９と共にブロッティングした後の細胞系のｃ−Ａｂｌキナーゼのレベルをあらわす。“ｐＹ２１３”はＹ２１３におけるリン酸化Ａｂｉ１の免疫反応性をあらわす。免疫沈降したＡｂｉ１は比較のために等レベルで担持された。実施例の実験法の部に記載されているように、全ての細胞系は溶解および免疫沈降の前にプレバナデートで処理された。
【図７−１】図７は、Ａｂｉ１がｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の調節によって細胞増殖および細胞スプレディングを調節することを示すウエスタンブロットのグラフおよび写真である。パネルＡにより、Ａｂｉ１のＹ２１３Ｆ以外の野生型または１８１ＡＥＳＥＡ１８５突然変異体の発現は、ＬｎＣＡＰ細胞においてｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ活性を阻害することが示される。Ａｂｉ１の野生型または突然変異体を安定的に発現する細胞系について、ｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を試験した。そのキナーゼ活性は、内因性Ａｂｌ基質Ｃｒｋ（ｐＹ−Ｃｒｋ）のリン酸化レベル；ｃ−Ａｂｌ活性化ループホスホチロシンｐＹ４１２（ｐＹ４１２）のレベルの試験によって評価した。ｃ−Ａｂｌ（ＰＹ９９）の総チロシンリン酸化も記載のように試験した。プロテイン類は指示された安定細胞系から免疫沈降させた：ｃ−Ａｂｌは抗Ｋ−１２で、Ｃｒｋは抗−Ｃｒｋで、Ａｂｉ１は抗７Ｂ６で免疫沈降させた。細胞リゼート中の組換えＡｂｉ１の発現を、抗−ＨＡ抗体（Ａｂｉ１−ＨＡ Ｌｙｓ）で評価した；Ａｂｉ１（＋）およびＬｎＣＡＰ細胞系における総Ａｂｉ１の発現は免疫沈降したＡｂｉ１をポリクローナル抗体Ａｂ−２（Ａｂｉ１−ＩＰ）でブロットすることによって評価した。右のグラフはそれら細胞系のｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の定量を示す（ｎ＝３；±ｓ．ｄ．）。Ｃｒｋリン酸化はＡｂｉ１（＋）ではＬｎＣＡＰ細胞系より低い（ｐ＜０．００１）。それは、Ｗｔ．ＨＡにおいてもＦ２１３．ＨａまたはＰｒｏ．Ｈａより低い（ｐ＜０．００１）。群内におけるｐＹ４１２またはＰＹ９９リン酸化の差も有意である（ｐ＜０．０１）。パネルＢは、Ａｂｉ１のＹ２１３および１８１ＰＰＳＰＰ１８５配列が、安定的にトランスフェクトされたＬｎＣＡＰ細胞系の増殖速度を調節することを示す。ＬｎＣＡＰクローンの増殖速度を、最初の培養から経過した指示された時点の細胞数を数えることによって評価した（ｎ＝３；棒はｓ．ｅ．ｍ．を示す）。観察４日間すべてを考慮した二元配置ＡＮＯＶＡ分析は、Ａｂｉ−Ｐｒｏ細胞系がＡｂｉ１−ｗｔ、Ａｂｉ１（＋）、またはＡｂｉ１−Ｆ２１３細胞系より速い速度で増殖することを示した（ｐ＜０．０５）；Ａｂｉ１−ｗｔ、Ａｂｉ１（＋）およびＡｂｉ１−Ｆ２１３は互いに差はなかった（ｐ＞０．０５）；ＬｎＣＡＰおよびＭｏｃｋはＡｂｉ１−Ｐｒｏとは異ならなかった（ｐ＞０．０５）。パネルＣは、Ａｂｉ１によって細胞スプレディングが調節されることを示す。ＬｎＣＡＰ細胞はコラーゲン上に培養された。培養後６時間目に観察した。平均面積を各クローンで評価した（ｎ＝２０；棒はｓ．ｅ．ｍ．を示す）；細胞系を発現するＨＡ−タグ付Ａｂｉ１の複製クローンを評価した。野生型Ａｂｉ１を発現するクローンは、ＬｎＣＡＰ細胞単独に対して有意な平均細胞面積の減少を示した：Ａｂｉ１（＋）、ｐ＜０．０００１；Ｗｔ．Ｈａ−１、ｐ＝０．０００２；Ｗｔ．Ｈａ−２、ｐ＝０．００７。その他のＡｂｉ１クローンは、ＬｎＣＡＰと比較して細胞スプレディングの有意差を示さなかった。下記のＬｎＣＡＰ細胞系を分析した：野生型タグなしＡｂｉ１、Ａｂｉ１（＋）、またはＨａ−タグ付Ａｂｉ１（Ｗｔ．Ｈａ−１およびＷｔ．Ｈａ−２）を安定的に発現する細胞系；Ｈａ−タグ付Ａｂｉ１突然変異体Ａｂｉ１ Ｙ２１３Ｆ（Ｆ２１３．Ｈａ−１およびＦ２１３．Ｈａ−２）およびＡｂｉ１−１８１ＡＥＳＥＡ１８５（Ｐｒｏ．Ｈａ−１およびＰｒｏ．Ｈａ−２）；野生型ＬｎＣＡＰ細胞系（ＬｎＣＡＰ）；および未改変プラスミドをトランスフェクトしたＬｎＣＡＰ細胞系（Ｍｏｃｋ）。細胞増殖および細胞スプレディングアッセイのために、ＨＡ−タグ付Ａｂｉ１を発現する複製クローンを評価した；Ａｂｌキナーゼ活性のためには（図７ＡおよびＢ）Ｗｔ．Ｈａ−１（Ｗｔ．Ｈａ）、Ｆ２１３．Ｈａ−１（Ｆ２１３．Ｈａ）、およびＰｒｏ．Ｈａ−１（Ｐｒｏ．Ｈａ）を評価した。“ＧＡＰＤＨ”は細胞リゼート中のプロテイン類のレベルを示す。
【図７−２】図７は、Ａｂｉ１がｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の調節によって細胞増殖および細胞スプレディングを調節することを示すウエスタンブロットのグラフおよび写真である。パネルＡにより、Ａｂｉ１のＹ２１３Ｆ以外の野生型または１８１ＡＥＳＥＡ１８５突然変異体の発現は、ＬｎＣＡＰ細胞においてｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ活性を阻害することが示される。Ａｂｉ１の野生型または突然変異体を安定的に発現する細胞系について、ｃ−Ａｂｌキナーゼ活性を試験した。そのキナーゼ活性は、内因性Ａｂｌ基質Ｃｒｋ（ｐＹ−Ｃｒｋ）のリン酸化レベル；ｃ−Ａｂｌ活性化ループホスホチロシンｐＹ４１２（ｐＹ４１２）のレベルの試験によって評価した。ｃ−Ａｂｌ（ＰＹ９９）の総チロシンリン酸化も記載のように試験した。プロテイン類は指示された安定細胞系から免疫沈降させた：ｃ−Ａｂｌは抗Ｋ−１２で、Ｃｒｋは抗−Ｃｒｋで、Ａｂｉ１は抗７Ｂ６で免疫沈降させた。細胞リゼート中の組換えＡｂｉ１の発現を、抗−ＨＡ抗体（Ａｂｉ１−ＨＡ Ｌｙｓ）で評価した；Ａｂｉ１（＋）およびＬｎＣＡＰ細胞系における総Ａｂｉ１の発現は免疫沈降したＡｂｉ１をポリクローナル抗体Ａｂ−２（Ａｂｉ１−ＩＰ）でブロットすることによって評価した。右のグラフはそれら細胞系のｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の定量を示す（ｎ＝３；±ｓ．ｄ．）。Ｃｒｋリン酸化はＡｂｉ１（＋）ではＬｎＣＡＰ細胞系より低い（ｐ＜０．００１）。それは、Ｗｔ．ＨＡにおいてもＦ２１３．ＨａまたはＰｒｏ．Ｈａより低い（ｐ＜０．００１）。群内におけるｐＹ４１２またはＰＹ９９リン酸化の差も有意である（ｐ＜０．０１）。パネルＢは、Ａｂｉ１のＹ２１３および１８１ＰＰＳＰＰ１８５配列が、安定的にトランスフェクトされたＬｎＣＡＰ細胞系の増殖速度を調節することを示す。ＬｎＣＡＰクローンの増殖速度を、最初の培養から経過した指示された時点の細胞数を数えることによって評価した（ｎ＝３；棒はｓ．ｅ．ｍ．を示す）。観察４日間すべてを考慮した二元配置ＡＮＯＶＡ分析は、Ａｂｉ−Ｐｒｏ細胞系がＡｂｉ１−ｗｔ、Ａｂｉ１（＋）、またはＡｂｉ１−Ｆ２１３細胞系より速い速度で増殖することを示した（ｐ＜０．０５）；Ａｂｉ１−ｗｔ、Ａｂｉ１（＋）およびＡｂｉ１−Ｆ２１３は互いに差はなかった（ｐ＞０．０５）；ＬｎＣＡＰおよびＭｏｃｋはＡｂｉ１−Ｐｒｏとは異ならなかった（ｐ＞０．０５）。パネルＣは、Ａｂｉ１によって細胞スプレディングが調節されることを示す。ＬｎＣＡＰ細胞はコラーゲン上に培養された。培養後６時間目に観察した。平均面積を各クローンで評価した（ｎ＝２０；棒はｓ．ｅ．ｍ．を示す）；細胞系を発現するＨＡ−タグ付Ａｂｉ１の複製クローンを評価した。野生型Ａｂｉ１を発現するクローンは、ＬｎＣＡＰ細胞単独に対して有意な平均細胞面積の減少を示した：Ａｂｉ１（＋）、ｐ＜０．０００１；Ｗｔ．Ｈａ−１、ｐ＝０．０００２；Ｗｔ．Ｈａ−２、ｐ＝０．００７。その他のＡｂｉ１クローンは、ＬｎＣＡＰと比較して細胞スプレディングの有意差を示さなかった。下記のＬｎＣＡＰ細胞系を分析した：野生型タグなしＡｂｉ１、Ａｂｉ１（＋）、またはＨａ−タグ付Ａｂｉ１（Ｗｔ．Ｈａ−１およびＷｔ．Ｈａ−２）を安定的に発現する細胞系；Ｈａ−タグ付Ａｂｉ１突然変異体Ａｂｉ１ Ｙ２１３Ｆ（Ｆ２１３．Ｈａ−１およびＦ２１３．Ｈａ−２）およびＡｂｉ１−１８１ＡＥＳＥＡ１８５（Ｐｒｏ．Ｈａ−１およびＰｒｏ．Ｈａ−２）；野生型ＬｎＣＡＰ細胞系（ＬｎＣＡＰ）；および未改変プラスミドをトランスフェクトしたＬｎＣＡＰ細胞系（Ｍｏｃｋ）。細胞増殖および細胞スプレディングアッセイのために、ＨＡ−タグ付Ａｂｉ１を発現する複製クローンを評価した；Ａｂｌキナーゼ活性のためには（図７ＡおよびＢ）Ｗｔ．Ｈａ−１（Ｗｔ．Ｈａ）、Ｆ２１３．Ｈａ−１（Ｆ２１３．Ｈａ）、およびＰｒｏ．Ｈａ−１（Ｐｒｏ．Ｈａ）を評価した。“ＧＡＰＤＨ”は細胞リゼート中のプロテイン類のレベルを示す。
【図８】図８はＡｂｉ１ホスホペプチドによるｃ−Ａｂｌ調節の模型を示す。パネルＡはｃ−ＡｂｌキナーゼのＳＨドメインに結合する模型化されたリン酸化ペプチドを示す。模型化されたペプチドのホスホチロシン残基２１３（ｐＹ２１３）はＳＨ２ドメインの結合ポケットに示される。ｃ−ＡｂｌキナーゼのＳＨ２ドメインの３種類のアルギニン、Ｒ１５３、Ｒ１７１およびＲ１９４（緑）はリン・ペプチドのｐＹ２１３残基に極めて近く、相互作用が可能である。すべてのらせんはシリンダー形（トルコ玉）に示されている。不活性ｃ−ＡｂｌキナーゼのαＩ’らせんは標識されている。点線のついたシリンダーは活性形における同じらせん（αＩらせん）の位置を示し（Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．２００３）、それはＳＨ２ドメインと衝突する可能性を示す。残基Ｓ１７３−Ｑ１７９をあらわすｃ−Ａｂｌキナーゼ構造のループは明確ではない。図はＰｙＭＯＬソフトウエアを用いて作られた（Ｄｅｌａｎｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＬＣ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）。パネルＢはｐＹ２１３およびＰｒｏ−ｐＹ２１３によるｃ−Ａｂｌキナーゼの調節を説明する図式的模型である。上方の図は結晶構造によって測定した際の、自己阻害の主要要素を有する調節された構造を示す（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）：ＳＨ３ドメインはＳＨ２−ＣＤリンカーおよびＣＤと相互作用する；ＳＨ２ドメインはＣＤと相互作用する。キナーゼのミリストイル化片において、ＣＤのＣ−末端らせん、αＩ’はミリステートのための結合ポケットを形成する。ミリステートの分解を含む幾つかの作用機序によるｃ−Ａｂｌの活性化は（Ｈａｎｔｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）、ＳＨ２−ＣＤリンカーのリン酸化および活性化ループにつながる。これらのできごとはＳＨ２およびＳＨ３をＣＤから分離させ、そのＣ−末端らせんはαＩとなり、ＳＨ２ホスホチロシン結合部位を部分的に塞ぐ。ｐＹ２１３がＡｂｌ ＳＨ２ドメインに結合すると、多分新しいαＩ’様コンフォメーションのＣ−末端らせんが安定化することによって、このキナーゼは阻害される（これは分子模型化データによって裏付けられる、パネルＡ）。下方の図は、Ｐｒｏ−ｐＹ２１３の結合が、ＳＨ３およびＳＨ２ドメインのＣＤドメインからの転置によって、キナーゼの最初の一過性活性化を起こすことを示す。これはＮａｇａｒらが示唆したように（２００６）、ＣＤドメインのＮ−ローブ上にドッキングしたＳＨ２ドメインを有する細長くなった活性化Ａｂｌを含むＰｒｏ−ｐＹ２１３−Ａｂｌ複合体の形成に導く。これに続いて、より活性の低い、および不活性のＰｒｏ−ｐＹ２１３−Ａｂ複合体が形成される。αＩ’様らせんの位置はｐＹ２１３模型に基づいて仮定される。小さい化合物、ＧＮＦ−２、は、ミリストイル結合ポケットに結合し（Ａｄｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）、それによってミリストイル基のように作用することによって、αＩ’様らせんと同様なコンフォメーションを強化する。ＳＨ３、Ｓｒｃ相同性３ドメイン；ＳＨ２、Ｓｒｃ相同性２ドメイン；ＣＤ、触媒ドメイン。ｃ−Ａｂｌ分子のＮ−末端キャップ領域およびＣ−末端半分は、簡明化するために省略した。
【図９】図９は、Ａｂｉ１の発現レベルが一次前立腺細胞およびＡｂｌ（−／−）Ａｒｇ（−／−）二重ノックアウト細胞系に比較して、ＬｎＣＡＰ細胞では低いことを示すウエスタンブロットの写真である。Ａｂｉ１は指示された細胞系のリゼートからモノクローナル抗体７Ｂ６で免疫沈降させ、Ａｂｉ１に対するポリクローナル抗体Ａｂ−２でブロットした；ｃ−ＡｂｌキナーゼはＫ１２で免疫沈降させ、モノクローナル抗体８Ｅ９でブロットした。ＬｎＣＡＰはＬｎＣＡＰ細胞系を示し；ＰｒＰＥＣは前立腺細胞系を示し；ＤＫＯはＡｂｌ（−／−）Ａｒｇ（−／−）二重ノックアウト細胞系を示す。ＩｇＧは交差反応性ＩｇＧバンドを示す。
【図１０】図１０はｃＡｂｌおよびＡｂｉ１による増殖および細胞スプレディングの調節を説明する図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
残基１０のチロシンがリン酸化されている配列番号１を含む、精製された化合物。
【請求項２】
前記化合物が配列番号５を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
前記化合物が配列番号６を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物が配列番号７を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項５】
前記化合物が配列番号８を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項６】
化合物が配列番号２、配列番号３または配列番号４の少なくとも一部に少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項７】
前記化合物が天然に存在するＡｂｉ１、Ａｂｉ２、またはＡｂｉ３の少なくとも一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含み、該天然に存在するＡｂｉ１、Ａｂｉ２またはＡｂｉ３が配列番号２、配列番号３または配列番号４に少なくとも８５％は相同である、請求項１記載の化合物。
【請求項８】
前記化合物が配列番号２、配列番号３または配列番号４の少なくとも一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項９】
前記化合物が配列番号２の少なくとも一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項１０】
前記化合物が、４００未満のアミノ酸残基であるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項１１】
前記アミノ酸配列が１００未満のアミノ酸残基である、請求項１０記載の化合物。
【請求項１２】
前記アミノ酸配列が２０未満のアミノ酸残基である、請求項１０記載の化合物。
【請求項１３】
前記アミノ酸配列が１４アミノ酸残基である、請求項１０記載の化合物。
【請求項１４】
配列番号１からなる請求項１記載の化合物。
【請求項１５】
配列番号５からなる請求項１記載の化合物。
【請求項１６】
配列番号６からなる請求項１記載の化合物。
【請求項１７】
配列番号７からなる請求項１記載の化合物。
【請求項１８】
配列番号８からなる請求項１記載の化合物。
【請求項１９】
配列番号１内にはない野生型Ａｂｉ１、Ａｂｉ２またはＡｂｉ３のＰＸＸＰ結合モチーフを含む、請求項１記載の化合物。
【請求項２０】
前記化合物の少なくとも１つのアミノ酸がペプチド模倣物によって表される、請求項１記載の化合物。
【請求項２１】
前記化合物がＡｂｌキナーゼの活性を阻害できる、請求項１記載の化合物。
【請求項２２】
検出可能部分または結合部分をさらに含む、請求項１記載の化合物。
【請求項２３】
前記検出可能部分または結合部分が放射性部分、抗原、蛍光部分またはＨｉｓ６部分である、請求項１記載の化合物。
【請求項２４】
前記検出可能部分または結合部分が蛍光部分である、請求項２２記載の化合物。
【請求項２５】
前記化合物がＡｂｌキナーゼと結合するとき、前記蛍光部分の検出可能蛍光が強度を変える、請求項２４記載の化合物。
【請求項２６】
薬学的に容認される組成物中の、請求項１記載の化合物。
【請求項２７】
配列番号１を含む精製された化合物であって、該化合物のアミノ酸配列が４００未満のアミノ酸である、精製された化合物。
【請求項２８】
配列番号５を含む請求項２７記載の化合物。
【請求項２９】
配列番号６を含む請求項２７記載の化合物。
【請求項３０】
配列番号７を含む請求項２７記載の化合物。
【請求項３１】
配列番号８を含む請求項２７記載の化合物。
【請求項３２】
配列番号２、配列番号３または配列番号４の少なくとも一部に少なくとも８５％は相同であるアミノ酸配列を含む、請求項２７記載の化合物。
【請求項３３】
天然に存在するＡｂｉ１、Ａｂｉ２またはＡｂｉ３の少なくとも一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含む、請求項２７記載の化合物。
【請求項３４】
配列番号２、配列番号３または配列番号４の少なくとも一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含む、請求項２７記載の化合物。
【請求項３５】
配列番号２の少なくとも一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含む、請求項２７記載の化合物。
【請求項３６】
１００未満のアミノ酸残基であるアミノ酸配列を含む、請求項２７記載の化合物。
【請求項３７】
２０未満のアミノ酸残基であるアミノ酸配列を含む、請求項２７記載の化合物。
【請求項３８】
前記アミノ酸配列が１４アミノ酸残基である、請求項２７記載の化合物。
【請求項３９】
配列番号１からなる請求項２７記載の化合物。
【請求項４０】
配列番号５からなる請求項２７記載の化合物。
【請求項４１】
配列番号６からなる請求項２７記載の化合物。
【請求項４２】
配列番号７からなる請求項２７記載の化合物。
【請求項４３】
配列番号８からなる請求項２７記載の化合物。
【請求項４４】
前記アミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸がペプチド模倣物である、請求項２７記載の化合物。
【請求項４５】
配列番号１内にはない野生型Ａｂｉ１、Ａｂｉ２またはＡｂｉ３のＰＸＸＰ結合モチーフを含む、請求項２７記載の化合物。
【請求項４６】
配列番号１の残基１０の前記チロシンがリン酸化されている、請求項２７記載の化合物。
【請求項４７】
前記化合物がＡｂｌキナーゼの活性を阻害できる、請求項２７記載の化合物。
【請求項４８】
検出可能部分または結合部分をさらに含む請求項２７記載の化合物。
【請求項４９】
薬学的に容認される組成物中の、請求項２７記載の化合物。
【請求項５０】
薬剤がＡｂｌキナーゼの候補阻害剤であるかどうかを決定する方法であって、
請求項１〜４９のいずれか一項に記載の化合物を該Ａｂｌキナーゼの存在下で該薬剤と接触させる工程と；
該化合物が該Ａｂｌキナーゼに結合するかどうかを評価する工程、
とを含み、ここで、該化合物が該Ａｂｌキナーゼに結合しない場合は、該薬剤は該Ａｂｌキナーゼの候補阻害剤であり、該化合物が該Ａｂｌキナーゼに結合する場合は、該薬剤は該Ａｂｌキナーゼの候補阻害剤ではない、
方法。
【請求項５１】
前記化合物がさらに検出可能部分を含む、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記Ａｂｌキナーゼがさらに検出可能部分を含む、請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
Ａｂｌキナーゼに結合する化合物の評価が、非変性条件下において該ペプチドまたはＡｂｌキナーゼの見かけサイズの測定によって行われる、請求項５０記載の方法。
【請求項５４】
候補阻害剤の存在下で前記Ａｂｌキナーゼのキナーゼ活性を評価する工程をさらに含む、請求項５０記載の方法。
【請求項５５】
Ａｂｌキナーゼを阻害する方法であって、該Ａｂｌキナーゼを請求項２１または請求項４７のいずれか一項に記載の化合物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項５６】
前記化合物が配列番号１からなる、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記化合物が配列番号５からなる、請求項５５記載の方法。
【請求項５８】
前記化合物が配列番号６からなる、請求項５５記載の方法。
【請求項５９】
前記化合物が配列番号７からなる、請求項５５記載の方法。
【請求項６０】
前記化合物が配列番号８からなる、請求項５５記載の方法。
【請求項６１】
前記Ａｂｌキナーゼが哺乳動物細胞にある、請求項５５記載の方法。
【請求項６２】
前記Ａｂｌキナーゼが生きている哺乳動物の一部である、請求項５５記載の方法。
【請求項６３】
前記Ａｂｌキナーゼが、突然変異体Ａｂｌキナーゼによって特徴づけられる病気にかかっているかまたはそのリスクを有する生きている哺乳動物の一部である、請求項５５記載の方法。
【請求項６４】
前記病気が慢性骨髄性白血病である、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
前記病気が前立腺癌である、請求項６３記載の方法。
【請求項６６】
突然変異体Ａｂｌキナーゼによって特徴づけられる病気にかかっている患者を処置する方法であって、該方法は請求項２６記載の化合物を該患者に投与する工程を含み、該化合物は該突然変異体Ａｂｌキナーゼの活性を阻害できる、方法。
【請求項６７】
前記化合物が前記患者に非経口投与される、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
前記病気が慢性骨髄性白血病である、請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
前記病気が前立腺癌である、請求項６６記載の方法。
【請求項７０】
突然変異体Ａｂｌキナーゼによって特徴づけられる病気のリスクを有する患者を処置する方法であって、該方法は請求項２６記載の化合物を該患者に投与することを含み、該化合物は該突然変異体Ａｂｌキナーゼの活性を阻害できる、方法。
【請求項７１】
Ａｂｌキナーゼを標識化する方法であって、前記Ａｂｌキナーゼと請求項２２または請求項４８記載の化合物とを、該化合物が該Ａｂｌキナーゼと相互作用するような条件下で結合させることを含む、方法。
【請求項７２】
前記Ａｂｌキナーゼが哺乳動物組織の一部である、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
Ａｂｌキナーゼを組織から単離する方法であって、
該組織を均質化する工程と；
該均質化した組織と請求項２２または請求項４８の化合物とを結合させる工程であって、前記検出可能部分または結合部分が結合部分である工程と；
該Ａｂｌキナーゼに結合した化合物を単離する工程
とを含む、方法。
【請求項７４】
前記Ａｂｌキナーゼから前記化合物を分離する工程をさらに含む、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
前記Ａｂｌキナーゼを定量する工程をさらに含む、請求項７３記載の方法。
【請求項７６】
請求項４５〜５４のいずれか一項に記載の方法によって同定される薬剤。
【請求項７７】
Ａｂｌキナーゼを阻害する方法であって、前記Ａｂｌキナーゼと請求項７６記載の薬剤とを接触させる工程を含む、方法。
【請求項１】
残基１０のチロシンがリン酸化されている配列番号１を含む、精製された化合物。
【請求項２】
前記化合物が配列番号５を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
前記化合物が配列番号６を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物が配列番号７を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項５】
前記化合物が配列番号８を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項６】
化合物が配列番号２、配列番号３または配列番号４の少なくとも一部に少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項７】
前記化合物が天然に存在するＡｂｉ１、Ａｂｉ２、またはＡｂｉ３の少なくとも一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含み、該天然に存在するＡｂｉ１、Ａｂｉ２またはＡｂｉ３が配列番号２、配列番号３または配列番号４に少なくとも８５％は相同である、請求項１記載の化合物。
【請求項８】
前記化合物が配列番号２、配列番号３または配列番号４の少なくとも一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項９】
前記化合物が配列番号２の少なくとも一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項１０】
前記化合物が、４００未満のアミノ酸残基であるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項１１】
前記アミノ酸配列が１００未満のアミノ酸残基である、請求項１０記載の化合物。
【請求項１２】
前記アミノ酸配列が２０未満のアミノ酸残基である、請求項１０記載の化合物。
【請求項１３】
前記アミノ酸配列が１４アミノ酸残基である、請求項１０記載の化合物。
【請求項１４】
配列番号１からなる請求項１記載の化合物。
【請求項１５】
配列番号５からなる請求項１記載の化合物。
【請求項１６】
配列番号６からなる請求項１記載の化合物。
【請求項１７】
配列番号７からなる請求項１記載の化合物。
【請求項１８】
配列番号８からなる請求項１記載の化合物。
【請求項１９】
配列番号１内にはない野生型Ａｂｉ１、Ａｂｉ２またはＡｂｉ３のＰＸＸＰ結合モチーフを含む、請求項１記載の化合物。
【請求項２０】
前記化合物の少なくとも１つのアミノ酸がペプチド模倣物によって表される、請求項１記載の化合物。
【請求項２１】
前記化合物がＡｂｌキナーゼの活性を阻害できる、請求項１記載の化合物。
【請求項２２】
検出可能部分または結合部分をさらに含む、請求項１記載の化合物。
【請求項２３】
前記検出可能部分または結合部分が放射性部分、抗原、蛍光部分またはＨｉｓ６部分である、請求項１記載の化合物。
【請求項２４】
前記検出可能部分または結合部分が蛍光部分である、請求項２２記載の化合物。
【請求項２５】
前記化合物がＡｂｌキナーゼと結合するとき、前記蛍光部分の検出可能蛍光が強度を変える、請求項２４記載の化合物。
【請求項２６】
薬学的に容認される組成物中の、請求項１記載の化合物。
【請求項２７】
配列番号１を含む精製された化合物であって、該化合物のアミノ酸配列が４００未満のアミノ酸である、精製された化合物。
【請求項２８】
配列番号５を含む請求項２７記載の化合物。
【請求項２９】
配列番号６を含む請求項２７記載の化合物。
【請求項３０】
配列番号７を含む請求項２７記載の化合物。
【請求項３１】
配列番号８を含む請求項２７記載の化合物。
【請求項３２】
配列番号２、配列番号３または配列番号４の少なくとも一部に少なくとも８５％は相同であるアミノ酸配列を含む、請求項２７記載の化合物。
【請求項３３】
天然に存在するＡｂｉ１、Ａｂｉ２またはＡｂｉ３の少なくとも一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含む、請求項２７記載の化合物。
【請求項３４】
配列番号２、配列番号３または配列番号４の少なくとも一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含む、請求項２７記載の化合物。
【請求項３５】
配列番号２の少なくとも一部に完全に相同であるアミノ酸配列を含む、請求項２７記載の化合物。
【請求項３６】
１００未満のアミノ酸残基であるアミノ酸配列を含む、請求項２７記載の化合物。
【請求項３７】
２０未満のアミノ酸残基であるアミノ酸配列を含む、請求項２７記載の化合物。
【請求項３８】
前記アミノ酸配列が１４アミノ酸残基である、請求項２７記載の化合物。
【請求項３９】
配列番号１からなる請求項２７記載の化合物。
【請求項４０】
配列番号５からなる請求項２７記載の化合物。
【請求項４１】
配列番号６からなる請求項２７記載の化合物。
【請求項４２】
配列番号７からなる請求項２７記載の化合物。
【請求項４３】
配列番号８からなる請求項２７記載の化合物。
【請求項４４】
前記アミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸がペプチド模倣物である、請求項２７記載の化合物。
【請求項４５】
配列番号１内にはない野生型Ａｂｉ１、Ａｂｉ２またはＡｂｉ３のＰＸＸＰ結合モチーフを含む、請求項２７記載の化合物。
【請求項４６】
配列番号１の残基１０の前記チロシンがリン酸化されている、請求項２７記載の化合物。
【請求項４７】
前記化合物がＡｂｌキナーゼの活性を阻害できる、請求項２７記載の化合物。
【請求項４８】
検出可能部分または結合部分をさらに含む請求項２７記載の化合物。
【請求項４９】
薬学的に容認される組成物中の、請求項２７記載の化合物。
【請求項５０】
薬剤がＡｂｌキナーゼの候補阻害剤であるかどうかを決定する方法であって、
請求項１〜４９のいずれか一項に記載の化合物を該Ａｂｌキナーゼの存在下で該薬剤と接触させる工程と；
該化合物が該Ａｂｌキナーゼに結合するかどうかを評価する工程、
とを含み、ここで、該化合物が該Ａｂｌキナーゼに結合しない場合は、該薬剤は該Ａｂｌキナーゼの候補阻害剤であり、該化合物が該Ａｂｌキナーゼに結合する場合は、該薬剤は該Ａｂｌキナーゼの候補阻害剤ではない、
方法。
【請求項５１】
前記化合物がさらに検出可能部分を含む、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記Ａｂｌキナーゼがさらに検出可能部分を含む、請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
Ａｂｌキナーゼに結合する化合物の評価が、非変性条件下において該ペプチドまたはＡｂｌキナーゼの見かけサイズの測定によって行われる、請求項５０記載の方法。
【請求項５４】
候補阻害剤の存在下で前記Ａｂｌキナーゼのキナーゼ活性を評価する工程をさらに含む、請求項５０記載の方法。
【請求項５５】
Ａｂｌキナーゼを阻害する方法であって、該Ａｂｌキナーゼを請求項２１または請求項４７のいずれか一項に記載の化合物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項５６】
前記化合物が配列番号１からなる、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記化合物が配列番号５からなる、請求項５５記載の方法。
【請求項５８】
前記化合物が配列番号６からなる、請求項５５記載の方法。
【請求項５９】
前記化合物が配列番号７からなる、請求項５５記載の方法。
【請求項６０】
前記化合物が配列番号８からなる、請求項５５記載の方法。
【請求項６１】
前記Ａｂｌキナーゼが哺乳動物細胞にある、請求項５５記載の方法。
【請求項６２】
前記Ａｂｌキナーゼが生きている哺乳動物の一部である、請求項５５記載の方法。
【請求項６３】
前記Ａｂｌキナーゼが、突然変異体Ａｂｌキナーゼによって特徴づけられる病気にかかっているかまたはそのリスクを有する生きている哺乳動物の一部である、請求項５５記載の方法。
【請求項６４】
前記病気が慢性骨髄性白血病である、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
前記病気が前立腺癌である、請求項６３記載の方法。
【請求項６６】
突然変異体Ａｂｌキナーゼによって特徴づけられる病気にかかっている患者を処置する方法であって、該方法は請求項２６記載の化合物を該患者に投与する工程を含み、該化合物は該突然変異体Ａｂｌキナーゼの活性を阻害できる、方法。
【請求項６７】
前記化合物が前記患者に非経口投与される、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
前記病気が慢性骨髄性白血病である、請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
前記病気が前立腺癌である、請求項６６記載の方法。
【請求項７０】
突然変異体Ａｂｌキナーゼによって特徴づけられる病気のリスクを有する患者を処置する方法であって、該方法は請求項２６記載の化合物を該患者に投与することを含み、該化合物は該突然変異体Ａｂｌキナーゼの活性を阻害できる、方法。
【請求項７１】
Ａｂｌキナーゼを標識化する方法であって、前記Ａｂｌキナーゼと請求項２２または請求項４８記載の化合物とを、該化合物が該Ａｂｌキナーゼと相互作用するような条件下で結合させることを含む、方法。
【請求項７２】
前記Ａｂｌキナーゼが哺乳動物組織の一部である、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
Ａｂｌキナーゼを組織から単離する方法であって、
該組織を均質化する工程と；
該均質化した組織と請求項２２または請求項４８の化合物とを結合させる工程であって、前記検出可能部分または結合部分が結合部分である工程と；
該Ａｂｌキナーゼに結合した化合物を単離する工程
とを含む、方法。
【請求項７４】
前記Ａｂｌキナーゼから前記化合物を分離する工程をさらに含む、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
前記Ａｂｌキナーゼを定量する工程をさらに含む、請求項７３記載の方法。
【請求項７６】
請求項４５〜５４のいずれか一項に記載の方法によって同定される薬剤。
【請求項７７】
Ａｂｌキナーゼを阻害する方法であって、前記Ａｂｌキナーゼと請求項７６記載の薬剤とを接触させる工程を含む、方法。
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図６−１】
【図６−２】
【図７−１】
【図７−２】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２−１】
【図２−２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図６−１】
【図６−２】
【図７−１】
【図７−２】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００９−５１９２３７（Ｐ２００９−５１９２３７Ａ）
【公表日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４３３９４（Ｐ２００８−５４３３９４）
【出願日】平成１８年１１月２９日（２００６．１１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４５５７０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６４６４７
【国際公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【出願人】（５９２２３９８３３）ニューヨーク・ブラッド・センター・インコーポレーテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＮＥＷ ＹＯＲＫ ＢＬＯＯＤ ＣＥＮＴＥＲ ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月２９日（２００６．１１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４５５７０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６４６４７
【国際公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【出願人】（５９２２３９８３３）ニューヨーク・ブラッド・センター・インコーポレーテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＮＥＷ ＹＯＲＫ ＢＬＯＯＤ ＣＥＮＴＥＲ ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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