ＤＡＰ−１０およびその使用
本発明は、癌および自己免疫の処置に有用であるインビボでのＤＡＰ１０の生物学的活性のモジュレーターを同定する方法、およびその因子を使用する方法に関する。被験体において腫瘍に対する細胞媒介性の応答を刺激するか、または増大するための方法であって、その必要がある被験体に、ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害するか、または抑制する因子を投与する工程を包含する方法が、本明細書中で特徴付けられる。１つの実施形態において、上記因子は、ＤＡＰ１０の発現を阻害するか、または抑制し得る。上記因子は、ＤＡＰ１０の細胞内シグナル伝達を妨害し得る。１つの実施形態において、上記因子は、ＤＡＰ１０によるＰＩ３キナーゼ経路の誘発を妨害し得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、免疫学および医薬の分野に関する。より具体的に、本発明は、インビボで抗腫瘍活性を増強し、そして自己免疫を減少させるＤＡＰ１０活性のモジュレーション、およびこのようなモジュレーションを媒介する化合物の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
免疫細胞の活性の閾値は、自己抗原および外来抗原の認識を介して受容される活性化シグナルおよび抑制性シグナルによって調節される。活性化レセプターまたは抑制性レセプターに影響する遺伝的欠損は、免疫系が自己と非自己との間で区別することを不可能にし、自己免疫または感染因子および形質転換細胞に対する異常な応答を引き起こす（１、２）。
【０００３】
多くの活性化レセプターは、マルチサブユニット複合体であり、この複合体において、膜貫通アダプタータンパク質が、細胞内部でのシグナルの伝達を担う。ＤＡＰ１０は、造血細胞において発現されるマルチサブユニットレセプター複合体中の活性化レセプターＮＫＧ２Ｄと結合する膜貫通アダプタータンパク質である（３）。ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０レセプター複合体は、ＮＫ，γδ Ｔ細胞およびＮＫＴ細胞において構成的に発現され、そして生得的な刺激は、その発現をさらにアップレギュレートし得る（３〜６）。活性化の際に、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびマクロファージは、適応性の免疫応答の調節に関与するＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０レセプターを発現する（７、８）。細胞表面におけるＮＫＧ２Ｄの発現は、ＤＡＰ１０タンパク質とのその結合を必要とする。これは、ＤＡＰ１０の膜貫通領域中の酸性アミノ酸と、ＮＫＧ２Ｄタンパク質の膜貫通ドメイン中の塩基性アミノ酸との間の相互作用を含む（３）。ＮＫＧ２ＤおよびＤＡＰ１０の発現パターンは、完全に重複しないので、ＤＡＰ１０が他の未だに同定されていないレセプターと結合する（特に、いくつかの骨髄性細胞の集団において）ことが、考えられる。ヒトにおいて、ＮＫＧ２Ｄが専らＤＡＰ１０と結合する（３，４）のに対して、マウスは、ＮＫＧ２Ｄについての２つの異なるアイソフォーム（ＤＡＰ１０にのみ結合する長い形態（ＮＫＧ２Ｄ−ｌ）、およびＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２の両方と対になることが示されている短い形態（ＮＫＧ２Ｄ−ｓ））を発現する（９、１０）。
【０００４】
免疫レセプター活性化チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｅｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＡＭ）を介してシグナルを与えるＤＡＰ１２および他のアダプタータンパク質とは異なり、ＤＡＰ１０は、ＩＴＡＭを有さないが、ＤＡＰ１０は、ＰＩ３−キナーゼ経路の活性化に関与するＹＸＸＭモチーフを含む（３）。ＮＫ細胞において、ＤＡＰ１０のシグナル伝達は、細胞傷害を直接誘導し、そしてＤＡＰ１２関連レセプターを介して開始されるサイトカイン産生を増強する（１１、１２）。Ｔ細胞において、ＤＡＰ１０のシグナル伝達は、主に、ＴＣＲ誘導性シグナルに対する共起刺激を提供する（５）。
【０００５】
ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０レセプター複合体に対する同定されたリガンドは、ヒトにおけるＭＩＣＡ、ＭＩＣＢおよびＵＬＢＰ、ならびにげっ歯類動物におけるＲａｅ−１、Ｈ６０およびＭＵＬＴ−１を含むクラスＩ ＭＨＣ様タンパク質である（４、１３、１４、１５）。一般に、それらは、成体の組織において最小限に発現され、そして腫瘍細胞および病原体感染細胞においてアップレギュレートされる。腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの異所性の発現は、宿主からの腫瘍の拒絶を生じる（１６、１７）。しかし、ＮＫＧ２Ｄリガンドは、正常組織においても同様に発現され得、それによってＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０複合体の正確な役割を不明確にする。
【０００６】
ＤＡＰ１０が、免疫応答の重要な役割を有するもの（ｐｌａｙｅｒ）であることが公知である多くの細胞型において発現され、そして特徴付けられるが、この分子によって果たされる生物学的役割の明確な証拠は、存在しない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、進行する免疫応答のダイナミクス（ｄｙｎａｍｉｃｓ）または一次免疫応答の開始を変化させるための、ＤＡＰ１０（造血細胞における細胞表面シグナル伝達分子）のモジュレーションに関する。代表的に、免疫応答は、体液性（抗体媒介性）または細胞性（Ｔ細胞媒介性）である。体液性免疫応答は、Ｔｈ２細胞の活性化ならびにＩＬ−４およびＩＬ−１０の産生によって特徴付けられ、そして最終的に、抗原特異的Ｂ細胞および抗体産生の活性化をもたらす。一方で、細胞性免疫応答は、Ｔｈ１細胞の活性化ならびにＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２の産生によって特徴付けられ、細胞傷害性Ｔ細胞（通常は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞）の増殖および活性化を生じる。これらの応答の各々は、特定の病原体から宿主を保護するように設計され、そしてこれらの応答の調節は、健全な免疫系を維持するのに重要である。調節されない免疫応答または異常な免疫応答は、自己免疫、種々の免疫病理、および抑制された抗腫瘍反応性または抗腫瘍反応性の非存在を生じる。免疫応答の１つの同定された調節因子は、調節性Ｔ細胞である。調節性Ｔ細胞は、宿主免疫応答を極度に抑制し、そして自己中毒回避を誘導する。例えば、Ｒｏｎｃａｒｏｌｏら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：６７６−６８３（２０００）；Ｓａｋａｇｕｃｈｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１８２：１８−３２（２００１）を参照のこと。調節性Ｔ細胞（「Ｔｒｅｇ」）は、種々の表現型を有するようであり、したがって調節性Ｔ細胞は、一貫して、それらの機能的活性によってのみ同定可能である。現在、その存在（または非存在）が、Ｔ細胞応答のこの調節に明確に寄与する単一分子は、同定されていない。本発明者らは、本明細書中で、その活性が細胞性免疫応答の調節に重要であり、したがってインビボの免疫応答をモジュレートするための有意な標的として、ＤＡＰ１０を開示する。
【０００８】
したがって、被験体において腫瘍に対する細胞媒介性の応答を刺激するか、または増大するための方法であって、その必要がある被験体に、ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害するか、または抑制する因子を投与する工程を包含する方法が、本明細書中で特徴付けられる。１つの実施形態において、上記因子は、ＤＡＰ１０の発現を阻害するか、または抑制し得る。上記因子は、ＤＡＰ１０の細胞内シグナル伝達を妨害し得る。１つの実施形態において、上記因子は、ＤＡＰ１０によるＰＩ３キナーゼ経路の誘発を妨害し得る。この方法において有用である因子は、ＤＡＰ１０膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１０特異的抗体もしくはその生物学的に活性なフラグメント、またはＤＡＰ１０のｓｉＲＮＡであり得る。上記腫瘍は、原発性腫瘍または転移性腫瘍であり得る。いくつかの実施形態において、上記腫瘍は、ＮＫＧ２ＤリガンドまたはＬＡＧＥ−１を発現する。１つの実施形態において、上記因子は、ＮＫ細胞の細胞傷害もしくはＮＫＴ細胞の細胞傷害を増強するか、または増大する。上記因子は、ＮＫ細胞の増加した増殖またはＮＫＴ細胞の増加した増殖を刺激し得る。いくつかの実施形態において、前記因子は、少なくとも特徴的なサイトカインのＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞からの増加したサイトカイン産生を刺激する。上記特徴的なサイトカインは、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−２であり得る。
【０００９】
ＤＡＰ１０活性をモジュレートする因子の有効量を細胞に投与する工程を包含する、標的に対する細胞傷害を増加する方法であって、上記ＤＡＰ１０活性は、減少されるか、または排除される方法もまた、本明細書中で特徴付けられる。上記標的は、腫瘍細胞であり得る。いくつかの実施形態において、上記細胞傷害のメディエーターは、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞である。上記細胞は、組織または生体にあり得る。
【００１０】
調節性Ｔ細胞を抑制するか、または阻害するための方法であって、その必要がある被験体に、ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害する因子を投与する工程を包含する方法が、本明細書中でさらに特徴付けられる。いくつかの実施形態において、上記因子は、ＤＡＰ１０の発現を阻害し得るか、または抑制し得る。上記因子は、ＤＡＰ１０の細胞内シグナル伝達を妨害し得る。１つの実施形態において、上記因子は、ＤＡＰ１０によるＰＩ３キナーゼ経路の誘発を妨害する。この方法において有用な因子は、ＤＡＰ１０の膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１０特異的抗体もしくはその生物学的に活性なフラグメント、またはＤＡＰ１０のｓｉＲＮＡである。１つの実施形態において、前記被験体は、癌を有する。
【００１１】
癌を予防するか、または処置する方法であって、その必要がある被験体に、ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害するか、または抑制する因子の有効量を投与する工程を包含する方法が、本明細書中で特徴付けられる。いくつかの実施形態において、上記癌は、皮膚癌である。特定の実施形態において、上記癌は、化学的に誘導される。
【００１２】
ａ）ＤＡＰ１０発現細胞と試験化合物とを接触させる工程；ｂ）ＤＡＰ１０の生物学的活性の阻害について上記細胞を評価する工程；およびｃ）ＤＡＰ１０の生物学的活性をダウンレギュレートする化合物を、発癌を弱めるか、または改善する化合物として、上記試験化合物を、同定する工程；を包含する、発癌を弱めるか、または改善する化合物を同定するための方法がまた、本明細書中で特徴付けられる。いくつかの実施形態において、上記発癌は、皮膚の発癌である。特定の実施形態において、上記発癌は、化学的に誘導される発癌である。いくつかの実施形態において、上記ＤＡＰ１０の生物学的活性は、ＰＩ３キナーゼシグナル伝達の誘導、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞の増加した細胞傷害、ＮＫ細胞もしくＮＫＴ細胞の増加した増殖、またはＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞による増加したサイトカイン産生によって評価される。
【００１３】
ａ）ＤＡＰ１０発現細胞と試験化合物とを接触させる工程；ｂ）ＤＡＰ１０の生物学的活性の阻害について上記細胞を評価する工程；およびｃ）ＤＡＰ１０の生物学的活性をダウンレギュレートする化合物を、腫瘍増殖を阻害する化合物として、上記試験化合物を、同定する工程；を包含する、腫瘍増殖を阻害する化合物を同定するための方法が、本明細書中でさらに特徴付けられる。上記腫瘍は、原発性腫瘍または転移性腫瘍であり得る。いくつかの実施形態において、上記腫瘍は、皮膚の腫瘍である。１つの実施形態において、上記腫瘍は、化学的に誘導される。上記ＤＡＰ１０生物学的活性は、ＰＩ３キナーゼシグナル伝達の誘導、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞の増加した細胞傷害、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞の増加した増殖、またはＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞による増加したサイトカイン産生によって評価され得る。
【００１４】
ａ）ＤＡＰ１０−／−マウスにおいて実験的自己免疫疾患を誘導する工程；ｂ）試験化合物を上記ＤＡＰ１０−／−に投与する工程；ｃ）少なくとも１つの自己免疫疾患の指標を評価する工程；およびｄ）試験化合物を、上記試験化合物が上記疾患の指標を減少させるか、または排除する場合に、上記自己免疫疾患を弱めるか、または改善する化合物として同定する工程；を包含する、自己免疫疾患を弱めるか、または改善する化合物を同定するための方法が、本明細書中で特徴付けられる。いくつかの実施形態において、上記実験的自己免疫疾患は、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、コラーゲン誘導性関節炎、実験的自己免疫心筋炎、実験的自己免疫卵巣炎、または実験的自己免疫精巣炎である。この方法によって同定された有効な化合物を投与する工程を包含する、自己免疫疾患を予防するか、または処置する方法もまた、本明細書中で特徴付けられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、免疫応答の重要な調節性のようなＤＡＰ１０についての生理学的な役割に関する。ＤＡＰ１０の欠如は、原発性の増殖（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）および転移性腫瘍の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）の両方に対する抗腫瘍免疫応答性の増大をもたらし、このことは、ＤＡＰ１０が免疫監視における重要な役割を有するものであることを意味する。ＤＡＰ１０の欠如はまた、自己免疫疾患に対する感受性の上昇をもたらし、このことも、ＤＡＰ１０がインビボの免疫応答の調節に関与することを意味する。したがって、本発明の目的は、特に、癌および自己免疫における免疫応答性を変化させるためのＤＡＰ１０のモジュレーションに関する。ＤＡＰ１０をモジュレートする因子を同定する能力は、免疫応答の外部からの調節を可能にし、発癌および腫瘍増殖を予防しない場合に、少なくともそれらを減少させるための腫瘍に対する免疫監視の増強を可能にし得る。
【００１６】
開示の明確性のために、そして限定としてではなく、本発明の詳細な説明は、以下のサブセクションに分けられる。
【００１７】
（Ａ．定義）
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。全ての特許、公開された特許出願および他の出版物、ならびにＧｅｎＢａｎｋおよび本明細書中に言及される他のデータベースからの配列は、その全体が参考として援用される。この節に示される定義が、本明細書中に参考として援用される特許、公開された特許出願、および他の出版物ならびにＧｅｎＢａｎｋおよび他のデータベースからの配列に示される定義に反するか、あるいはそれと矛盾する場合、この節に示される定義が、本明細書中に参考として援用される定義より優先する。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「因子（ａｇｅｎｔ）」は、本発明の分子の発現および／または活性をモジュレートする（例えば、上方調節（ｕｐ−ｍｏｄｕｌａｔｅ）するか、または刺激し、そして下方調節（ｄｏｗｎ−ｍｏｄｕｌａｔｅ）するか、または阻害する）化合物を含む。本明細書中で使用される場合、用語「インヒビター」または「阻害性因子」は、本発明の分子の発現および／または活性を阻害する因子を含む。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、抗原性エピトープを特異的に結合するのに必要な可変領域配列を含む、単離された結合因子または組換え結合因子をいう。したがって、抗体は、抗体の任意の形態または所望の生物学的活性（例えば、特異的標的抗原を結合すること）を示すそのフラグメントである。したがって、抗体は、その最も広い意味で使用され、そして具体的には、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、多重特異的抗体（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（例えば、二重特異的抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ））、および抗体フラグメント（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、およびＦａｂ２が挙げられるが、これらに限定されない）を網羅するが、但しそれらは、所望の生物学的活性を示す。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、用語「自己免疫」とは、被験体の免疫系（例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞）が被験体自身の組織に対して反応を始める状態をいう。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語「発癌」とは、悪性細胞もしくは新生物性細胞または腫瘍の発生をいう。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、用語「細胞媒介性の応答」とは、Ｔ細胞、および免疫系の非特異的な細胞（ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、および好塩基球が挙げられるが、これらに限定されない）によって媒介される、抗原、細胞、または生物体に対する宿主の応答をいう。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「ＤＡＰ１０」は、供給源（一般的に認められるＷＯ９９／０６５５７に開示されるようなＤＡＰ１０が挙げられるが、これに限定されない）にかかわらず、ＤＡＰ１０タンパク質の全ての形態を包含する。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「転移性腫瘍」とは、原発性腫瘍から離れた部位において増殖する腫瘍細胞をいう。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「ＮＫ細胞」または「ナチュラルキラー細胞」とは、Ｂ細胞またはＴ細胞と異なり、そして種々の機構（直接的な細胞溶解、抗体依存性細胞媒介性の溶解、および他の細胞を活性化するＩＦＮ−γ産生が挙げられる）によって、生得的な免疫応答において細胞（代表的には、病原体感染細胞または腫瘍細胞のいずれか）を殺すように機能する大きい顆粒リンパ球をいう。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「ＮＫＴ細胞」とは、ＮＫ細胞マーカーもまた発現するＴ細胞の小さいサブセットをいう。ＮＫＴ細胞は、ＮＫ１．１（ＣＤ１６１）＋細胞、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋／−細胞である。ＴＣＲ−α鎖は、代表的なＴ細胞と比較して制限された多様性を有し、そしてＮＫＴ細胞は、クラスＩ様分子（例えば、ＣＤ１）を認識する。ＮＫＴ細胞は、ＭＨＣに拘束されず、そしてそのＮＫＴ細胞は、抗原提示細胞によって提示されるペプチドを認識しない。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結されるアミノ酸の比較的短い鎖を含む。用語「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」は、ペプチドを模倣し得るか、またはペプチドに拮抗し得る非ペプチド性の構造エレメントを含む化合物を含む。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「原発性腫瘍」とは、原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）に留まる腫瘍をいう。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「調節性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ」とは、他の免疫細胞の機能の抑制を引き起こすＴ細胞をいう。例えば、ｖｏｎ Ｈｅｒｒａｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：２２３−３２（２００３）を参照のこと。Ｔｒｅｇは、細胞と細胞との接触によって直接的か、または抗炎症性メディエーター（例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、またはＩＬ−４）の分泌を介して間接的かのいずれかで、他の免疫機能を抑制し得る。Ｌｅｖｉｎｇｓら、Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９：２３−７６（２００２）；Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３８９−４００（２００２）を参照のこと。いくつかの実施形態において、Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞である。例えば、Ｗａｌｄｍａｎｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １４：３９９（２００１）を参照のこと。代表的に、Ｔｒｅｇは、能動的に、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、またはナイーブなＴ細胞の増殖およびサイトカイン産生を抑制し、このＴ細胞の増殖およびサイトカイン産生は、活性化シグナル（例えば、抗原および抗原提示細胞、またはＭＨＣの状況（ｃｏｎｔｅｘｔ）において抗原を模倣するシグナル（例えば、抗ＣＤ３抗体＋抗ＣＤ２８抗体）によって培養中に刺激されている。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「低分子干渉（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ」（「ｓｉＲＮＡ」）または「短鎖干渉（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ」）とは、干渉を指揮し得るか、またはＲＮＡ干渉を媒介し得る、約１０〜５０個の間のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）からなるＲＮＡ（またはＲＮＡアナログ）をいう。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「被験体」とは、免疫応答が誘発され得るあらゆる生きている生物体をいい、好ましくは、その被験体は、哺乳動物である。例示の被験体としては、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギおよびヒツジが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｔ細胞」、または「Ｔリンパ球」とは、哺乳動物（例えば、ヒト）由来のＴ細胞系統内のあらゆる細胞をいう。好ましくは、Ｔ細胞は、ＣＤ４またはＣＤ８のいずれか（しかし、それらの両方を発現しない）、およびＴ細胞レセプターを発現する成熟Ｔ細胞である。本明細書中に記載される種々のＴ細胞集団は、当該分野において公知であるそれらのサイトカインプロフィールおよびそれらの機能に基づいて定義され得る。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「処置する」とは、被験体に対する治療因子の適用もしくは投与、あるいは疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状または疾患もしくは障害についての素因を有する被験体由来の単離組織または単離細胞株に対する治療因子の適用もしくは投与をいい、これらの適用もしくは投与は、その疾患もしくは障害を治癒する（ｃｕｒｅ）か、治癒する（ｈｅａｌ）か、緩和するか、軽減するか、変化させるか、治療するか、改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）か、改善する（ｉｍｐｒｏｖｅ）か、またはその疾患もしくは障害に影響を与える目的を伴う。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「腫瘍」とは、任意の悪性細胞または新生物性細胞をいう。
【００３６】
（Ｂ．細胞の応答のモジュレーション）
被験体において腫瘍に対する細胞媒介性の応答を刺激するか、または増大させるための方法であって、その必要がある被験体に、ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害するか、または抑制する因子を投与する工程を包含する方法が、本明細書中で特徴付けられる。標的に対する細胞傷害を増加させる方法であって、細胞にＤＡＰ１０活性をモジュレートする因子の有効量を投与することを包含する方法もまた、本明細書中で特徴付けられ、ここでそのＤＡＰ１０活性は、減少するか、または排除される。
【００３７】
ＤＡＰ１０発現細胞が関与するあらゆる細胞媒介性の応答は、本開示の発明を使用して刺激され得るか、または増大され得る。このような細胞媒介性の応答は、ナイーブな細胞の応答、記憶細胞の応答、Ｔｈ１細胞の応答、Ｔｈ２細胞の応答、および調節性Ｔ細胞の応答を包含する。細胞媒介性応答は、当該分野において使用され得る慣用的な方法によって測定され得る。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、現行版）を参照のこと。
【００３８】
特に、ＤＡＰ１０活性の操作は、標的に対する細胞傷害の増加をもたらし得る。ＤＡＰ１０を発現し、ＤＡＰ１０媒介性の相互作用によってその標的と相互作用する任意の細胞傷害性細胞（または細胞傷害性細胞の先祖）、またはその細胞のＤＡＰ１０を含む細胞傷害性エフェクター細胞への分化および／もしくは刺激は、この方法によってモジュレートされ得る。このような細胞としては、ＮＫ細胞、Ｔｒｅｇ、ＮＫＴ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、および肥満細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細胞傷害は、任意の適切な方法によって評価され得る。例示の方法としては、標識された標的細胞からの放射標識の放出の試験（例えば、５１Ｃｒ）、比色定量アッセイ（例えば、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、グランザイム放出アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼアッセイ、および生物ルミネセンス細胞傷害アッセイ（例えば、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ））が挙げられる。
【００３９】
任意の適切な標的細胞は、細胞媒介性の応答（特に、本発明の細胞傷害性の応答）に対する標的であり得る。好ましくは、上記標的は、哺乳動物である。上記標的は、応答する細胞に対して同系、同種異系、または異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）であり得る。ほとんどの実施形態において、上記標的は、同系または同種異系である。好ましい実施形態において、上記標的は、応答するエフェクター細胞に対して同系である。上記標的細胞は、正常細胞または異常細胞であり得る。例示の細胞は、腫瘍細胞、ウイルスに感染した細胞、および組換え手段によってＤＡＰ１０リガンドを発現する細胞を含む。したがって、標的細胞としては、確立された細胞株（例えば、Ｋ５６２細胞）、短期の細胞株（ｓｈｏｒｔ ｔｅｒｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）、または被験体から採取されたサンプルから単離される細胞（例えば、解離した腫瘍細胞）が挙げられる。ＤＡＰ１０またはＤＡＰ１０リガンドを発現する細胞において、その発現は、天然に生じ得るか、当該分野において公知である方法を使用する組換え手段により得る。例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、最新版）を参照のこと。
【００４０】
いくつかの実施形態において、上記腫瘍標的または他の細胞性標的は、ＤＡＰ１０に対するリガンドを発現する。ときとして、上記ＤＡＰ１０リガンド（またはＤＡＰ１０関連リガンド）は、ＮＫＧ２ＤリガンドまたはＬＡＧＥ−１である。
【００４１】
調節性Ｔ細胞を抑制するか、または阻害するための方法であって、その必要がある被験体に、ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害する因子を投与する工程を包含する方法が、本明細書中でさらに特徴付けられる。Ｔｒｅｇ活性は、周知の方法を使用して評価され得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／００４９６９６号；同第２００４／０１７３７７８号；および同第２００３／０１４７８６５号を参照のこと。代表的に、エフェクターＴ細胞集団は、規定されたインビトロの標的に応じて、増殖、細胞傷害、またはサイトカイン産生について評価され得る。しかし、このような分析はまた、上記因子のインビボ投与後に、エキソビボで行われ得る。このような分析において、上記因子の有効量は、所望のエフェクター細胞集団の増殖および／もしくは細胞傷害を増加させるか、またはサイトカイン産生を、上記エフェクター細胞集団を補助するものへと変化させるのに必要な量である。１つの例において、上記因子は、ＮＫ細胞の増殖および／または細胞傷害を増加させる一方で、ＩＬ−４産生およびＩＬ−１０産生を減少させ、そして／またはＩＦＮ−γ産生を増加させる。インビボ分析は、減少した腫瘍増殖、減少した転移の発生数、および／または減少した死亡率によって評価されるような抗腫瘍応答の増大を含み得る。例えば、Ｔｅｉｃｈｅｒ、ＴＵＭＯＲ ＭＯＤＥＬＳ ＩＮ ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ２００１）を参照のこと。
【００４２】
本発明の因子は、ＤＡＰ１０の生物学的活性の阻害または抑制をもたらす、ＤＡＰ１０の発現もしくは機能の任意の局面を阻害し得るか、または抑制し得る。用語「生物学的活性」とは、リガンドとのＤＡＰ１０相互作用によって媒介される任意の即時効果または下流における効果をいう。上記効果は、ポジティブな効果（例えば、結合した場合にシグナル伝達カスケードを開始する）、またはネガティブな効果（例えば、細胞と細胞との相互作用が、ＤＡＰ１０の非存在下もしくは特定の事象の誘発に必要なシグナルの除去において起きる場合に生じる、新規のシグナル伝達カスケードまたは異なるシグナル伝達カスケードの存在）であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、上記因子は、ＤＡＰ１０細胞内シグナル伝達を妨害し得る。１つの実施形態において、上記因子は、ＤＡＰ１０によるホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）経路の誘発を妨害する。ＰＩ３−キナーゼ活性は、当該分野において公知である方法によって評価され得る。例示の方法としては、タンパク質のリン酸化、遺伝子の転写、細胞周期の進行、タンパク質とタンパク質との相互作用を試験するアッセイ（例えば、ｒａｓ、ｒａｆ、またはｆｙｎ）、タンパク質のトランスロケーション（例えば、ＮＦ−κＢの核へのトランスロケーション）、またはタンパク質産生アッセイ（例えば、サイトカインアッセイ）が挙げられる。例えば、Ａｕｓｅｂｅｌら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、最新版）を参照のこと。機能的アッセイ（例えば、増殖および細胞傷害）はまた、当該分野において周知の方法および本明細書によって開示される方法を使用して、上記因子の最終的な下流における効果を示すために使用され得る。増殖は、放射標識の取り込み、ルミネセンス、蛍光比色法などを使用して評価され得る。このような細胞媒介性の応答は、上記因子の投与後に、少なくとも約５％、１０％、または２０％刺激されるか、または増大されるべきであり、ときとして約３０％、４０％、または５０％刺激されるか、または増大されるべきであり、そして好ましくは約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％より大きく刺激されるか、または増大されるべきである。
【００４３】
１つの実施形態において、上記因子は、ＤＡＰ１０の発現を阻害するか、または抑制する。このような発現は、任意の機構によって生じ得、その機構としては、転写抑制因子の誘導、転写活性化因子の阻害などが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＡＰ１０発現は、任意の適切な手段によって決定され得る。代表的に、ＤＡＰ１０発現は、フローサイトメトリー分析によって評価され得る。いくつかの実施形態において、発現の完全な抑制は生物学的に関係する効果を達成するのに必要ではない可能性がある。このような効果は、標的化されている細胞媒介性の応答が、投与される因子の非存在下において生じる応答から検出可能に変化するものである。このような応答は、少なくとも約５％、１０％、または２０％刺激されるか、または増大されるべきであり、ときとして約３０％、４０％、または５０％刺激されるか、または増大されるべきであり、そして好ましくは約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％より大きく刺激されるか、または増大されるべきである。
【００４４】
１つの実施形態において、上記因子は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、もしくはＴ細胞の細胞傷害を増強するか、または増大する。いくつかの実施形態において、上記因子は、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞の増殖の増加を刺激し得、それによって、細胞性の細胞傷害性反応を刺激するか、または増大する。
【００４５】
本発明の因子はまた、細胞の１つ以上のサブセットからの増加したサイトカイン産生によって、細胞媒介性の応答を刺激し得るか、または増大し得る。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞が刺激されて、上記因子の非存在下において見られるサイトカイン発現と比較した場合に、少なくとも特徴的なサイトカインの増加した量を産生する。特徴的なサイトカインとしては、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−２が挙げられ得る。これらのサイトカインは、多くの方法および市販のキットによって定量的様式で容易に検出され、その方法としては、ＥＬＩＳＡ、マイクロＥＬＩＳＡ、および細胞内フローサイトメトリー分析が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、最新版）を参照のこと。
【００４６】
接触の時間、方法、および容器は、評価される機能に適した任意のものであり得る。
【００４７】
ＤＡＰ１０を阻害し得るか、または抑制し得る例示の因子としては、抗体、ＲＮＡｉ、ＲＮＡｉを媒介する化合物（例えば、ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、本発明の分子の優性／ネガティブな変異体、ＤＡＰ１０膜貫通ドメインなどのペプチド、および／またはペプチド模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
１つの実施形態において、本発明の方法の因子は、ＤＡＰ１０特異的抗体またはその生物学的に活性なフラグメントである。例示の抗体としては、ＷＯ９９／０６５５７に開示される抗体が挙げられる。上記抗体は、細胞培養物、ファージ、または種々の動物において産出され得、その動物としては、ウシ、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、類人猿が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本発明の方法において有用な抗体は、代表的に、哺乳動物の抗体である。ファージ技術は、最初の抗体を単離するためか、または変更された特異性またはアビディティー特性を有する改変体を産出するために使用され得る。このような技術は、当該分野において慣用的であり、かつ周知である。１つの実施形態において、上記抗体は、当該分野において公知である組換え手段によって産生される。例えば、組換え抗体は、上記抗体をコードするＤＮＡ配列を含むベクターによって宿主細胞をトランスフェクトすることによって産生され得る。１つ以上のベクターが、宿主細胞において少なくとも１つのＶＬ領域および少なくとも１つのＶＨ領域を発現するＤＮＡ配列をトランスフェクトするために使用され得る。抗体の産出および産生についての組換え手段の例示の記載としては、Ｄｅｌｖｅｓ、ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ：ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（Ｗｉｌｅｙ、１９９７）；Ｓｈｅｐｈａｒｄら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；およびＧｏｄｉｎｇ、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９３）が挙げられる。
【００４９】
本発明の方法において有用な抗体は、所望の機能（例えば、上昇した半減期）を媒介することおいてその抗体のより大きい効力を増加させるために、組換え手段によって改変され得る。例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（編）ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）を参照のこと。例えば、抗体は、組換え手段を使用する置換によって改変され得る。代表的に、その置換は、保存的置換である。例えば、上記抗体の定常領域中の少なくとも１つのアミノ酸が、異なる残基によって置換され得る。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号、米国特許第６，１９４，５５１号、出願番号ＷＯ９９／５８５７２；およびＡｎｇａｌら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−０８（１９９３）を参照のこと。アミノ酸の改変は、アミノ酸の欠失、付加、および置換を含む。上記抗体はまた、融合タンパク質であり、この抗体またはその生物学的に活性なフラグメントは、別の生物学的に関連する因子（例えば、サイトカイン、接着分子、共起刺激分子など）、およびこのような分子の生物学的に関連する部分に結合される。
【００５０】
「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」とは、ＲＮＡの選択的な細胞内分解をいう。ＲＮＡｉは、細胞内で天然に起こって、外来ＲＮＡ（例えば、ウイルスＲＮＡ）を除去する。天然のＲＮＡｉは、他の類似するＲＮＡ配列に対する分解機構を指揮する遊離のｄｓＲＮＡから切断されたフラグメントを介して始まる。あるいは、ＲＮＡｉは、人の手によって（例えば、標的遺伝子の発現をサイレンシングすることによって）開始され得る。例えば、米国特許出願第２００４０２０３１４５号を参照のこと。したがって、ＤＡＰ１０自体の発現に対するＲＮＡｉ、あるいはＤＡＰ１０の発現もしくは機能に対する任意の重要な上流のエフェクターまたは下流のエフェクターが、企図される。いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡｉは、ＤＡＰ１０によって使用されるＰＩ３−Ｋシグナル伝達経路の１種以上の成分をモジュレートするために使用され得る。
【００５１】
公知の配列に基づいてペプチド模倣物を作製する方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第５，６３１，２８０号；同第５，６１２，８９５号；および同第５，５７９，２５０号を参照のこと。ペプチド模倣物の使用は、所定の位置における非アミド結合による、非アミノ酸残基の組み込みを包含し得る。本発明の１つの実施形態は、ペプチド模倣物であり、その化合物は、適切な模倣体（ｍｉｍｉｃ）によって置換される結合、ペプチド骨格、またはアミノ酸成分を有する。適切なアミノ酸模倣体であり得る非天然のアミノ酸の例としては、β−アラニン、Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｌ−γ−アミノ酪酸、Ｌ−α−アミノイソ酪酸、Ｌ−ε−アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−ε−Ｂｏｃ−Ｎ−．アルファ．−ＣＢＺ−Ｌ−リジン、Ｎ−ε−Ｂｏｃ−Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニンスルホン、Ｌ−ノルロイシン、Ｌ−ノルバリン、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｎ−δ−ＣＢＺ−Ｌ−オルニチン、Ｎ−δ−Ｂｏｃ−Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｌ−オルニチン、Ｂｏｃ−ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｂｏｃ−ヒドロキシプロリン、およびＢｏｃ−Ｌ−チオプロリンが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＡＰ１０の生物学的に関連する部分の適切なペプチド模倣物、上流および下流のシグナル伝達成分などを含むＤＡＰ１０の生物学的活性に重要な任意のタンパク質。
【００５２】
いくつかの実施形態において、この方法において有用な因子は、ＤＡＰ１０膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１０特異的抗体もしくはそれらの生物学的に活性なフラグメント、またはＤＡＰ１０のｓｉＲＮＡである。ＤＡＰ１０またはその生物学的に活性なフラグメント、および宿主細胞におけるＤＡＰ１０の輸送、発現、生物学的活性などを容易にする少なくとも１つのタンパク質ドメインまたはタグを含むＤＡＰ１０融合タンパク質の使用もまた、企図される。このようなタンパク質およびタグとしては、転写活性化伝達（Ｔｒａｎｓ−Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）（ＴＡＴ）タンパク質、または他のタンパク質の細胞への進入を促進する他のタグおよび輸送ペプチドタグが挙げられ得るが、これらに限定されない。例えば、Ｖｏｃｅｒｏ−Ａｋａｂａｎｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２２：５０８−２１（２０００）を参照のこと。
【００５３】
いくつかの実施形態において、上記被験体は、癌を有し、そして下に記載されるような本発明の因子によって処置され得る。
【００５４】
（Ｃ．ＤＡＰ活性をモジュレートする因子を同定する方法）
ａ）ＤＡＰ１０発現細胞と試験化合物とを接触させる工程；ｂ）ＤＡＰ１０の生物学的活性の阻害について上記細胞を評価する工程；およびｃ）ＤＡＰ１０の生物学的活性をダウンレギュレートする化合物を、発癌を弱めるか、または改善する化合物として、上記試験化合物を、同定する工程；を包含する、発癌を弱めるか、または改善する化合物を同定するための方法がまた、本明細書中で特徴付けられる。いくつかの実施形態において、上記発癌は、皮膚の発癌である。特定の実施形態において、上記発癌は、化学的に誘導される発癌である。いくつかの実施形態において、ＤＡＰ１０の生物学的活性は、ＰＩ３キナーゼシグナル伝達の誘導、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞の増加した細胞傷害、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞の増加した増殖、またはＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞による増加したサイトカイン産生によって評価される。
【００５５】
ａ）ＤＡＰ１０発現細胞と試験化合物とを接触させる工程；ｂ）ＤＡＰ１０の生物学的活性の阻害について上記細胞を評価する工程；およびｃ）ＤＡＰ１０の生物学的活性をダウンレギュレートする化合物を、腫瘍増殖を阻害する化合物として、上記試験化合物を、同定する工程；を包含する、腫瘍増殖を阻害する化合物を同定するための方法が、本明細書中でさらに特徴付けられる。上記腫瘍は、原発性腫瘍または転移性腫瘍であり得る。いくつかの実施形態において、上記腫瘍は、皮膚の腫瘍であり得る。１つの実施形態において、上記腫瘍は、化学的に誘導される。ＤＡＰ１０の生物学的活性は、ＰＢキナーゼシグナル伝達の誘導、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞の増加した細胞傷害、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞の増加した増殖、またはＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞による増加したサイトカイン産生によって評価され得る。
【００５６】
任意の適切なＤＡＰ１０発現細胞は、本発明の方法のうちの同定する方法において使用され得る。ＤＡＰ１０発現は、内因性または外因性であり得る。ＤＡＰ１０発現細胞としては、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、マクロファージ、および肥満細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ＤＡＰ１０の組換え発現のために、任意の適切な宿主細胞が、利用され得る。宿主細胞は、その宿主細胞に対して適切な作動可能に連結した制御領域を有するベクターを使用するＤＡＰ１０発現構築物によって、遺伝的に操作（形質導入または形質転換またはトランスフェクト）される。ＤＡＰ１０についての例示の配列は、ＷＯ９９／０６５５７に開示される。ＤＡＰ１０の外因性の発現は、一過性であっても、安定であっても、それらのある程度の組み合わせであってもよい。外因性の発現は、１種以上のさらなるタンパク質（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）との同時発現によって、増強されても、最大化されてもよい。外因性の発現は、構成的プロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶなど）および当該分野において公知である適切な誘導プロモーターを使用して達成され得る。適切なプロモーターは、目的の細胞において機能するプロモーターである。上記ベクターは、例えば、プラスミド、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択または本発明の遺伝子の増幅に適するように改変された従来の栄養培地において培養され得る。その培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選択された宿主細胞に関して先に使用された条件であり、そしてその条件は、当業者に明らかである。代表的な宿主細胞としては、ＢａＦ細胞、２９３Ｔ細胞、およびマウス肥満細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
ＤＡＰ１０またはその生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸を含むベクターまたはプラスミドもまた、本明細書中に提供される。真核生物細胞および原核生物細胞において使用するのに適したベクターは、当該分野において公知であり、そしてそのベクターは、市販されているか、または当業者によって容易に調製される。さらなるベクターはまた、例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、２０００）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、（１９８９）に見出され得る。
【００５８】
ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害する化合物は、ＤＡＰ１０の少なくとも１つの生物学的活性を減少させるか、または排除する化合物である。このような阻害は、ＤＡＰ１０の１つ以上の重要な結合残基の直接的な結合によってか、または立体障害、ＤＡＰ１０の酵素的改変などを含む間接的な妨害によって生じ得る。本明細書中で使用される場合、用語「化合物」は、タンパク質部分および非タンパク質部分の両方を含む。１つの実施形態において、上記化合物は、低分子である。別の実施形態において、上記化合物は、タンパク質である。
【００５９】
種々の異なる化合物が、本明細書中に提供されるような方法を使用して同定され得る。化合物は、多くの化学的分類を包含し得る。特定の実施形態において、それらの化合物は、有機分子であり、好ましくは、５０ダルトンより大きく、かつ約２，５００ダルトン未満の分子量を有する有機低分子化合物である。これらの化合物は、タンパク質との構造的相互作用（特に、水素結合）に必要な官能基を含み得、そして少なくとも１つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボニル基を含み得、好ましくは、その化学的官能基の少なくとも２つを含み得る。上記化合物は、上記官能基の１つ以上によって置換される、環状炭素（ｃｙｃｌｉｃａｌ ｃａｒｂｏｎ）構造もしくは複素環式構造および／または芳香族構造もしくは多環芳香族（ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｉｃ）構造を含み得る。化合物はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造アナログまたはその組み合わせのような生体分子を含む。目的の化合物はまた、抗体もしくは結合フラグメントまたはそれらの模倣体（例えば、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ）などのペプチド因子およびタンパク質因子を含み得る。
【００６０】
同定アッセイのための化合物はまた、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む広範な種々の供給源から得られ得る。例えば、多くの手段は、無作為化されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、広範な種々の有機化合物および生体分子のランダムかつ指向型の合成のために利用可能である。あるいは、細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物、および動物抽出物の形態にある天然化合物のライブラリーは、利用可能であるか、または容易に生成される。さらに、天然に生成されるか、または合成で生成されるライブラリーおよび化合物は、従来の化学的手段、物理学的手段および生化学的手段によって容易に改変され、そしてコンビナトリアルライブラリーを生成するために使用され得る。公知の薬理学的因子は、構造アナログを生成するために、指向型またはランダムの化学的改変（例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）など）に供され得る。
【００６１】
１つの実施形態において、低分子は、同定アッセイにおける化合物として使用され得る。低分子化合物は、分子量が約１０００未満であるか、または分子量が約５００未満である化合物を含む。１つの実施形態において、低分子は、専らペプチド結合のみを含むことはない。別の実施形態において、低分子は、オリゴマーではない。活性についてスクリーニングされ得る例示の低分子化合物としては、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、有機低分子（例えば、ポリケチド）、および天然産物の抽出物のライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、上記化合物は、小さい、非ペプチド性の有機化合物である。さらなる実施形態において、低分子は、生合成のものではない。
【００６２】
本明細書中に提供されるようなＤＡＰ１０発現細胞は、任意の都合のよいプロトコルを使用して、化合物（または因子）と接触される。いくつかの実施形態において、ＤＡＰ１０発現細胞に対する化合物の効果は、他の細胞の１種以上の型（例えば、標識された標的、増殖するＴ細胞など）の存在下において評価される。１つの実施形態において、上記細胞は、流体培地の容積を保持し得る容器または類似の構造物（例えば、９６ウェルプレートのウェルまたは３８４ウェルプレートのウェル）中におかれる。上記細胞および上記化合物は、ＤＡＰ１０に媒介される事象の正確な検出を可能にする任意の細胞数を含む任意の容積において接触され得る。１つの実施形態において、存在する細胞の総数は、約１，０００個の細胞〜約１００，０００個の細胞の範囲である。１つの実施形態において、反応容積は、約２０マイクロリットル〜２００マイクロリットルの範囲である。上記細胞は、任意の時間にわたって、上記化合物および／または他の細胞型と接触され得る。１つの実施形態において、上記接触の時間は、１時間〜８時間の範囲であり、好ましい時間は、４時間である。上記細胞および上記化合物は、ＤＡＰ１０の生物学的活性のモジュレーションのために許容される任意のｐＨにて、培地中で接触され得る。上記細胞は、種々の温度にて上記化合物と接触され得る。１つの実施形態において、上記細胞の接触のための温度は、しばしば、２５℃〜３８℃の範囲であり、代表的には、３７℃の温度が、使用される。所望の場合、上記細胞は、種々の細胞集団の適当な混合および相互作用を確保するために撹拌され得る。
【００６３】
上記接触混合物に存在する化合物の量は、特に、その化合物の性質に依存して変動し得る。１つの実施形態において、上記因子が、有機低分子である場合、反応混合物に存在する化合物の量は、約１フェムトモル〜１０ミリモルの範囲であり得る。別の実施形態において、上記因子が、抗体またはその結合フラグメントである場合、上記化合物の量は、約１フェムトモル〜１０ミリモルの範囲であり得る。所定の接触容積に含める任意の特定の化合物の量は、当業者に公知の方法を使用して経験的に容易に決定され得る。
【００６４】
ＤＡＰ１０の生物学的活性の阻害の存在または非存在は、ＤＡＰ１０の表面における発現、ＤＡＰ１０シグナル伝達（特に、ＰＩ３−Ｋ経路）、腫瘍標的または他の異常な細胞標的に対する増加した細胞傷害、または増加したサイトカイン産生の評価によって決定される。利用される特定の評価プロトコルは、直接的に評価可能なアッセイの性質に依存して、必然的に変わり、そして当該分野で公知のアッセイ、およびセクションＢにおいて本明細書中に開示されるアッセイを利用し得る。例えば、評価される読み出しが、ＤＡＰ１０発現である場合、化合物によって処置されるか、または処置されないかのいずれかであるＤＡＰ１０発現細胞が、ＤＡＰ１０特異的抗体によって染色され得、そしてＤＡＰ１０発現の変化が、標準的なフローサイトメトリー分析によって評価される。
【００６５】
任意の都合のよい手段が、ＤＡＰ１０の生物学的活性に対する上記化合物の効果を評価するために使用され得、その手段としては、単独か、または他の関連する細胞型の存在下のいずれかにおいて化合物と接触した場合の増殖、細胞傷害、およびインビトロ発現の定量化された測定ならびにインビボでの評価が挙げられるが、これらに限定されない。このような評価は、発癌および腫瘍増殖および転移を阻害する能力における評価を含む。このような分析に適した動物モデルは、当該分野において周知であり、そして下に開示される実施例において開示されるものによって例示される。化合物が、腫瘍発生の範囲を、その化合物の非存在下において観察されるものと比較して減少させる場合、その化合物は、ＤＡＰ１０の生物学的活性のインヒビターである。１つの実施形態において、上記化合物は、発癌物質に対する曝露後の腫瘍発生の範囲を０％まで減少させ、完全な保護を提供する。同様に、化合物が、腫瘍増殖の速度および／または転移の範囲を、その化合物の非存在下において観察されるものと比較して減少させる場合、その化合物は、ＤＡＰ１０の生物学的活性のインヒビターである。１つの実施形態において、上記腫瘍の増殖速度は、腫瘍の大きさの測定によって決定される。代表的に、上記腫瘍のサイズは、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上減少する。転移の範囲は、相対的な播種（例えば、病変した器官系の数）およびこれらの部位における相対的な腫瘍組織量を試験することによって評価され得る。腫瘍転移は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上減少し得る。いくつかの実施形態において、上記化合物は、ＤＡＰ１０の生物学的活性に影響しない他の化合物と比較して評価され得る。
【００６６】
１つの実施形態において、ＲＮＡｉを媒介する化合物は、ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害するために使用され得る。上で考察されるように、ＲＮＡ干渉は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用してｄｓＲＮＡと同じ配列を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解する転写後の、標的性の遺伝子サイレンシング技術である。上記プロセスは、内因性リボヌクレアーゼが、より長いｄｓＲＮＡをより短い２１ヌクレオチド長または２２ヌクレオチド長のＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡと称される）へと切断する場合に生じる。次いで、より小さいＲＮＡセグメントは、標的ｍＲＮＡの分解を媒介する。ＲＮＡｉの合成のためのキットは、市販されている。
【００６７】
別の実施形態において、ＤＡＰ１０の阻害または抑制を媒介する化合物は、ＤＡＰ１０特異的抗体または上に記載されるようなその生物学的に活性なフラグメントである。なお別の実施形態において、上記化合物は、上に記載されるようなＤＡＰ１０膜貫通フラグメントである。
【００６８】
ａ）ＤＡＰ１０−／−マウスにおいて実験的自己免疫疾患を誘導する工程、ｂ）試験化合物を上記ＤＡＰ１０−／−に投与する工程；ｃ）少なくとも１つの自己免疫疾患の指標を評価する工程、およびｄ）試験化合物を、上記試験化合物が上記疾患の指標を減少させるか、または排除する場合に、上記自己免疫疾患を弱めるか、または改善する化合物として同定する工程を包含する、自己免疫疾患を弱めるか、または改善する化合物を同定するための方法が、本明細書中で特徴付けられる。
【００６９】
実施例の節において下に記載される通り、上記ＤＡＰ１０−／−マウスは、自己抗原を用いてチャレンジされる場合、自己免疫疾患に対する著しい感受性を提示する。他の実験的な自己免疫系がまた、上記ＤＡＰ１０−／−マウスを用いて利用され得る。いくつかの実施形態において、上記実験的自己免疫疾患は、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、コラーゲン誘導性関節炎、実験的自己免疫心筋炎、実験的自己免疫卵巣炎、または実験的自己免疫精巣炎である。例えば、種々の実験的疾患モデルの概説については、Ｌａｈｉｔａら（編）、ＴＥＸＴＢＯＯＫ ＯＦ ＴＨＥ ＡＵＴＯＩＭＭＵＮＥ ＤＩＳＥＡＳＥＳ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、およびＷｉｌｋｉｎｓ ２０００）の７５３〜８４１ページを参照のこと。これらの動物モデルの各々は、少なくとも１つの臨床的に関連のある自己免疫疾患を例示し、それによって、自己免疫疾患の１つ以上の症状を緩和し得るか、または改善し得るスクリーニング化合物に適したモデルを提供する。
【００７０】
実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、ヒトの多発性硬化症（ＭＳ）に対する動物モデルである。ＥＡＥは、ＭＳと同じ臨床症状および病理学的症状の多くを共有する、実験的に誘導された疾患である。例えば、Ｍａｒｔｉｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１５３−８７（１９９２）を参照のこと。ＥＡＥは、アジュバント中のミエリンを用いた免疫によって、マウスの特定の系統において誘導され得る。上記免疫は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびプロテオリピド（ＰＬＰ）に特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞を活性化する。次いで、活性化されたＴ細胞は、中枢神経系に進入し、そして上記疾患の特徴的な解剖病理学、および顕性の「臨床的」徴候（例えば、完全麻痺を生じる後足の上行性不全麻痺）をもたらす。ＥＡＥの臨床的徴候は、症状の上行性の重症度の０〜５の尺度に基づいて評価され得る。例えば、Ｋｏｒｎｇｏｌｄら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４：３０９−１５（１９８６）；Ｃｕａら、Ｎａｔｕｒｅ ４２１：７４４（２００３）を参照のこと。
【００７１】
したがって、化合物が、少なくとも１つの自己免疫症状の範囲を、その化合物の非存在下において観察されるものと比較して減少させる場合、その化合物は、ＤＡＰ１０の生物学的活性のインヒビターである。１つの実施形態において、上記化合物は、少なくとも１つの自己免疫症状の範囲を０％まで減少させ、完全な保護を提供する。同様に、化合物が、観察される自己免疫症状の重症度を、その化合物の非存在下（または、ＤＡＰ１０をモジュレートしない化合物の存在下）において観察されるものと比較して減少させる場合、その化合物は、ＤＡＰ１０の生物学的活性のインヒビターである。代表的に、上記症状の重症度は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上減少する。
【００７２】
（Ｄ．ＤＡＰ１０抑制因子を使用する処置の方法）
癌を予防するか、または処置する方法であって、その必要がある被験体に、ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害するか、または抑制する因子の有効量を投与する工程を包含する方法が、本明細書中で特徴付けられる。いくつかの実施形態において、上記癌は、皮膚癌である。特定の実施形態において、上記癌は、化学的に誘導される。
【００７３】
本発明の方法によって処置される被験体としては、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、肉腫、または奇形癌を有する被験体が挙げられる。上記腫瘍は、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚、胆嚢、神経節、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌であり得る。このような腫瘍としては、以下が挙げられる：中枢神経系の新生物：多形グリア芽細胞腫、星状細胞腫、乏突起神経膠細胞の腫瘍、上衣および脈絡叢の腫瘍、松果体の腫瘍、神経の腫瘍、髄芽細胞腫、神経鞘腫、髄膜腫、髄膜の肉腫：眼の新生物： 基底細胞癌、有棘細胞癌、黒色腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫；内分泌腺の新生物：下垂体の新生物、甲状腺の新生物、副腎皮質の新生物、神経内分泌系の新生物、胃腸膵臓（ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｐａｎｃｒｅａｔｉｃ）の内分泌系の新生物、性腺の新生物；頭および首の新生物：頭および首の癌、口腔の腫瘍、咽頭の腫瘍、喉頭の腫瘍、歯原性腫瘍：胸郭の新生物：大細胞肺癌、小細胞肺癌、非小細胞細胞肺癌、胸郭の新生物、悪性中皮腫、胸腺腫、胸郭の原発性生殖細胞腫瘍；消化管の新生物：食道の新生物、胃の新生物、肝臓の新生物、胆嚢の新生物、膵臓外分泌部の新生物、小腸、虫垂および腹膜の新生物、結腸および直腸の腺癌、肛門の新生物；尿生殖器路（ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎａｒｙ ｔｒａｃｔ）の新生物：腎細胞癌、腎盂および尿管の新生物、膀胱の新生物、尿道の新生物、前立腺の新生物、陰茎の新生物、精巣の新生物；女性の生殖器官の新生物：外陰および膣の新生物、子宮頚の新生物、子宮体の腺癌、卵巣癌、婦人科学的な肉腫；乳房の新生物；皮膚の新生物：基底細胞癌、扁平上皮癌、皮膚線維肉腫、メルケル細胞腫；悪性黒色腫；骨および軟部組織の新生物：骨原性肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、血管肉腫；造血系の新生物：骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、ＨＴＬＶ−１、およびＴ−細胞白血病／リンパ腫、慢性リンパ性白血病、へアリーセル白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、肥満細胞性白血病；小児の新生物：急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄球性白血病、神経芽細胞腫、骨腫瘍、横紋筋肉腫、リンパ腫、腎腫瘍および肝腫瘍。
【００７４】
本方法によって同定される有効な化合物を投与する工程を包含する、自己免疫疾患を予防するか、または処置する方法が、本明細書中でさらに特徴付けられる。本発明に従って処置され得る自己免疫成分を有する自己免疫疾患および自己免疫障害の非限定的な例としては、以下が挙げられる：１型糖尿病、関節炎（慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群（シェーグレン症候群に対する二次的な乾性角結膜炎を含む）、円形脱毛症、虫刺され（ａｒｔｈｒｏｐｏｄ ｂｉｔｅ）の反応に起因するに起因するアレルギー応答、クローン病、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸結腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、薬疹、らい病の反転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳障害、特発性両側性の進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーヴンズ−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーブス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、および間質性肺線維症（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｌｕｎｇ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）。
【００７５】
任意の被験体が、本明細書中に提供される方法および組成物によって処置され得る。このような被験体は、このような処置の必要がある哺乳動物（好ましくは、ヒト）である。本開示の方法および組成物の獣医学的使用がまた、企図される。このような使用は、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）、家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）および純血種の馬（ｔｈｏｒｏｕｇｈｂｒｅｄ ｈｏｒｓｅ）における発癌の予防、癌の処置、ならびに自己免疫疾患の予防および処置を含む。
【００７６】
薬学的組成物および薬学的技術の調製ならびに使用のための種々の薬学的組成物および薬学的技術は、本開示を鑑みて当業者に公知である。適切な薬理学的組成物および関連した投与上の技術の詳細な記載については、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ、第２０版（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ ２００３）などの教科書によってさらに補足され得る本明細書中の詳細な教示を参照し得る。
【００７７】
処方物および送達方法は、一般に、処置されるべき部位および疾患に従って適合される。例示の処方物としては、ミセル、リポソームまたは薬物放出カプセル中に封入される処方物（徐放用に設計された生体適合性コーティング内に組み込まれる活性因子）を含む、非経口投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、または皮下投与）に適した処方物、；経口摂取用処方物；局所使用のための処方物（例えばクリーム、軟膏およびゲル）；および他の処方物（例えば、吸入剤、エアロゾルまたはスプレー）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の化合物の投薬量は、処置についての必要性の程度および重症度、投与される組成物の活性、被験体の健康全般、ならびに当業者にとって周知である他の考慮事項によって変動する。
【００７８】
このような化合物の毒性および治療的効力は、細胞培養物または実験動物において、標準的な薬学的手順によって決定され得る（例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するため）。毒性効果と治療効果との間の用量比が、治療指数であり、そしてその治療指数は、ＬＤ５０とＥＤ５０との間の比として表され得る。高い治療指数を示す化合物が、好ましい。これらの細胞培養物アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための投薬量の範囲を処方するのに使用され得る。このような化合物の投薬量は、好ましくは、ほとんどもしくは全く毒性を伴わずに、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。上記投薬量は、使用される投薬形態および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変動し得る。的確な処方、投与経路および投薬量は、患者の状態、年齢、体重、および治療に対する反応性を考慮して個々の医師によって選択され得る。投薬の量および間隔は、所望の治療効果、または最小有効濃度（ＭＥＣ）を維持するのに十分な活性部分の血漿レベルを提供するために、個別に調整され得る。ＭＥＣは、各化合物に対して変動するが、それは、インビトロのデータから概算され得る；例えば、本明細書中に記載されるアッセイを使用してＤＡＰ１０の生物学的活性の５０％〜９０％の阻害を達成するのに必要な濃度。
【００７９】
投与の様式は、特に重要ではない。１つの実施形態において、投与の様式は、Ｉ．Ｖ．ボーラスである。別の実施形態において、投与は、局所的である。あるいは、上記化合物を、全身的な様式よりもむしろ、局所において投与し得る（例えば、しばしば、デポー処方物または持続放出処方物で上記化合物を腫瘍または自己免疫病変に直接注射することによって）。
【００８０】
本発明の調節性因子は、単独か、または１種以上のさらなる因子と組み合わせて投与され得る。例えば、１つの実施形態において、本明細書中に記載される２種以上の因子が、被験体に投与され得る。別の実施形態において、本明細書中に記載される因子は、他の免疫調節因子と組み合わせて投与され得る。他の免疫調節試薬の例としては、共起刺激シグナルをブロックする抗体（例えば、ＣＤ２８、ＩＣＯＳに対する抗体）、ＣＴＬＡ４を介して抑制性シグナルを活性化する抗体、および／または他の免疫細胞マーカーに対する抗体（例えば、ＣＤ４０に対する抗体、ＣＤ４０リガンドに対する抗体、またはサイトカインに対する抗体）、融合タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ、ＰＤ−Ｉ−Ｆｃ）、および免疫抑制薬（例えば、ラパマイシン、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６）が挙げられる。特定の場合において、免疫応答を誘発するか、または増大するために、免疫応答をアップレギュレートする他の因子（例えば、Ｔ細胞活性化シグナルを送達する因子）をさらに投与することが、望まれ得る。このような因子としては、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）の同時投与が挙げられるが、これに限定されない。
【００８１】
本明細書中に記載される因子は、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、代表的に、上記因子、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、専門語「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤など（これらは、薬学的投与に適合性である）を含むことを意図する。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および因子の使用は、当該分野において周知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ 第２０版（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ ２００３）を参照のこと。任意の従来の媒体および因子が、活性化合物と不適合性である場合を除いて、上記組成物におけるその使用が、企図される。追加の活性化合物がまた、上記組成物に組み込まれ得る。
【実施例】
【００８２】
ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０レセプター複合体およびそのリガンドの発現パターンは、それらが生理学的条件および病理学的条件下で異なる役割を果たし得ることを示唆する。この研究において、ＤＡＰ１０ＫＯマウスの産出を、腫瘍免疫におけるＤＡＰ１０の重要性を調査するために使用する。ＤＡＰ１０欠損が、Ｔｒｅｇの調節性機能およびＮＫ１．１＋細胞の抗腫瘍エフェクター機能に影響を与えることによって抗腫瘍免疫を増強することが、予想外にも、観察された。
【００８３】
同系の腫瘍に対する効率的な免疫監視は、しばしば、Ｔ調節性（Ｔｒｅｇ）細胞の損なわれた機能に起因して、自己に対する反応性の増加と関連する。本明細書中に含まれるデータは、構成的なＤＡＰ１０共起刺激シグナル伝達が、腫瘍に対する免疫を制御する調節機構の一部であることを示した。ＤＡＰ１０を欠くマウス（ＤＡＰ１０ＫＯ）は、化学的に誘導された皮膚の癌腫および黒色腫の肺への転移に対して増強された免疫応答を示し、それは、遅延した腫瘍増殖および減少した腫瘍の範囲、およびマウスの、腫瘍悪性度からの長期の保護をもたらした。ＤＡＰ１０ＫＯナチュラルキラーＴリンパ球（ＮＫＴ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、この抗腫瘍表現型を担うエフェクターであった。ＤＡＰ１０欠損は、Ｔｒｅｇの抑制的な能力を弱め、そして増加したＮＫＴ機能（サイトカイン産生および細胞傷害を含む）をもたらし、腫瘍の効率的な殺傷を生じた。ＤＡＰ１０ＫＯマウスにおける野生型Ｔｒｅｇの養子移植は、同系の腫瘍に対する耐性を回復させ、このことは、ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇがインビボで機能不全性であることを示した。さらに、ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔ細胞は、増加した自己反応性を示し、それによってＤＡＰ１０ＫＯマウスを、誘導された自己免疫応答に対して、より感受性にした。このデータは、ＤＡＰ１０構成的シグナル伝達が自己反応性を回避するためのＴｒｅｇおよびＮＫＴの活性化の閾値の調整に重要であるが、また、抗腫瘍機構をモジュレートすることを示した
（材料および方法）
ＤＡＰ１０欠損マウスの産出。マウスＤＡＰ１０ゲノムの遺伝子座を、１２９／ＳＶ肝臓ＤＮＡから作製したＬａｍｂｄａライブラリーに対する放射標識型のハイブリダイゼーションによって同定した。１つのＬａｍｂｄａクローンを、単離し、次いでサブクローニングし、そしてその遺伝子座のさらなる特徴付けのために配列決定した。エキソン３およびエキソン４は、シグナル伝達および細胞表面におけるＤＡＰ１０タンパク質の発現に重要である。エキソン３は、膜貫通領域をコードし、そしてエキソン４は、ＤＡＰ１０の細胞質ドメインをコードする。従来の置換型標的化ベクターを、５．４ｋｂの相同性配列を組み込みつつ、両方のエキソンについての配列を除去するように設計した。胚性幹（ＥＳ）細胞を、直線化したＤＡＰ１０標的化ベクターと一緒にエレクトロポレーションした。適切にトランスフェクトされたＥＳクローンを、ネオマイシンカセットの除去後の注射のために使用した。上記ＥＳクローンを、サザンブロット分析によってスクリーニングした。使用したプローブは、以下のものである：５’フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）センス−ＤＡＰ１０プローブ、５’−ＣＣＡＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＡＡＣＴＡＴＧＴＡＧ−３’；５’フランキングアンチセンス−ＤＡＰ１０プローブ、５−ＣＴＧＴＧＡＧＴＴＣＡＡＧＧＣＴＡＧＣＣＴＧＧ−３’；３’フランキングセンス−ＤＡＰ１０プローブ、５’−ＣＴＡＧＡＧＧＡＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＣ−３’；フランキングアンチセンス−ＤＡＰ１０プローブ、５’−ＧＣＴＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＣＣＴＧＧＴ−３’。全ての実験マウス（ＤＡＰ１０ＫＯマウスおよびコントロールＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｘｏｎ））を、６〜１０週齢にて使用し、かつ性別および歳を対応させた。マウスを、病原体を含まない動物施設において飼育した。この研究において使用される全ての動物手順は、ＤＮＡＸ ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【００８４】
インビボ腫瘍モデル。先に記載されるように（２０）、皮膚の腫瘍形成を誘導するために、ｗｔ Ｃ５７ＢＬ６マウスおよびＤＡＰ１０ＫＯ Ｃ５７ＢＬ６マウスを、７，１２ジメチルベンズアントラセン（ＤＭＢＡ、Ｓｉｇｍａ）の単一局所用量によって処置し、２００μｌアセトン中の５０μｇのＤＭＢＡを、各マウスの剃毛（ｓｈａｖｅ）した皮膚に塗布した。発癌のイニシエーションの１週間後、２００μｌアセトン中の３０μｇの１２−Ｏ−テトラデカノイル−ホルボールアセテート（ＴＰＡ、Ｓｉｇｍａ）を、各マウスの上記皮膚に塗布した。次いで上記ＴＰＡを、２０週間にわたって週に２回塗布した。腫瘍を、癌腫の病期に進行させ、そしてマウスの成育率を、１年間分析した。乳頭腫または癌腫の腫瘍を、臨床的判定基準および組織学的特徴に基づいて評点した。移植実験のために、化学的に誘導した皮膚の腫瘍細胞（ＤＭＢＡ−Ｔ）を、組織培養条件に適応し、次いでマウスに種々の濃度にてｓ．ｃ．に注射した。皮下の腫瘍の寸法を、キャリパーを使用して２〜３日毎に測定した。上記腫瘍の体積を、以下の式を使用して決定した：長さ×幅×幅／２。群間の統計学的な差を、２つの群を分析する場合に、対応のないスチューデント両側ｔ検定を使用することによって評価し、そして２つより多い群に対しては、二元配置ＡＮＯＶＡを使用することによって評価した。
【００８５】
Ｂ１６の肺への転移の誘導のために、Ｂ１６黒色腫細胞（ＡＴＣＣ）を、対数増殖期（≦５０％の密集度）のときに、注射のために回収した。単一細胞懸濁物を、細胞解離溶液（Ｇｉｂｃｏ）を使用して調製し、次いで使い捨てのセルストレーナー（ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）によって可能な集塊の除去を行なった。ｗｔ Ｃ５７ＢＬ６マウスおよびＤＡＰ１０ＫＯ Ｃ５７ＢＬ６マウスに、１×１０５個のＢ１６細胞をｉ．ｖ．に注射したか、または図面の簡単な説明において示される通りに注射し、次いで肺を、腫瘍の接種の２週間後に取り出し、そして転移を、解剖顕微鏡を使用して計測した。ＮＫ１．１＋細胞のインビボでの枯渇のために、マウスに、−１日目においてマウス１匹あたり０．５ｍｇにて、抗ＮＫ１．１ ｍＡｂクローンＰＫ１３６（ＡＴＣＣ）をｉ．ｖ．に注射し、その後、３日毎にそれを注射した。マウスＩｇＧ１κアイソタイプコントロール抗体を、コントロール群に注射するために使用した。Ｔｒｅｇ細胞のインビボでの枯渇のために、抗ＣＤ２５ ｍＡｂクローンＰＣ−６１（ＡＴＣＣ）を、示した日において、マウス１匹あたり０．５ｍｇにてｉ．ｖ．に注射した（図面の簡単な説明を参照のこと）。ＮＫ細胞のインビボでの枯渇のために、マウスに、−２日目にて３０μｌの抗アシアロＧＭ１ Ａｂ（Ｃｅｄｅｒｌａｎｅ）をｉ．ｖ．に注射し、その後、４日毎にそれを注射した。インビボ研究のために使用した全ての抗体は、内毒素を含まなかった。インビボでの枯渇の効率を、脾臓の白血球のＦＡＣ分析によって検証した。
【００８６】
骨髄キメラの産出。レシピエントマウスを、１０００ｒａｄの１種の線量のγ線照射に曝した。ドナーマウスから単離した１．５×１０７個の骨髄細胞を、レシピエントマウスの尾静脈にｉ．ｖ．に送達した。再形成の６週間後および８週間後において、レシピエントマウスの末梢血細胞および脾臓細胞をフローサイトメトリーによって分析して、再形成のレベルを評価した。この実験に使用したｗｔマウスは、再形成の評価を容易にするＧＦＰポジティブであった（Ｄｒ．Ｂｒｉａｎ Ｓｃｈａｅｆｅｒによる寄贈品）。８週間において、９５％〜９８％のレシピエント細胞は、ドナーに由来した。骨髄キメラの成育率は、１００％であった。
【００８７】
Ｔａｑｍａｎ分析。ナイーブｗｔ Ｂ１／６マウスおよびＤＡＰ１０ＫＯマウスのリンパ節、脾臓ならびに胸腺を、Ｐｏｌｙｔｒｏｎを使用してＳＴＡＴ ６０試薬（Ｔｅｌ−ｔｅｓｔ Ｉｎｃ．）中でホモジネートした。全ＲＮＡを、クロロホルム抽出を行ない、次いでイソプロパノール沈殿を行うことによって単離した。５μｇの全ＲＮＡを、ＤＮＡｓｅミックス（５×ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、ＲＮＡｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＤＮＡｓｅ Ｉ、Ｒｎａｓｅ ｆｒｅｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））によって処理した。ｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによって調製した。リアルタイムの転写物の定量化のために、そのｃＤＮＡを、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）５７００配列検出器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）においてＴａｑＭａｎシステムの化学を使用する蛍光５’ヌクレアーゼアッセイに使用した。遺伝子特異的なＴａｑｍａｎ（登録商標）プライマー（Ｆ、Ｒ）を、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ．１．５．（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、以下に関して作製した（コントロールとしてユビキチンおよび１８Ｓ ｒＲＮＡ）：ｍｕＤＡＰ１０−ＣＣＧＧＡＴＧＴＧＧＧＡＣＴＣＴＧＴＣＴ；ＴＧＧＧＣＧＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＡＡＣＡＣ；ｍｕＤＡＰ１２−ＣＣＴＧＧＴＣＴＣＣＣＧＡＧＧＴＣＡＡ；ＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＧＣＡＡＴＧ，ｍｕＮＫＧ２Ｄ−ＴＴＣＧＴＴＧＴＴＣＧＡＧＴＣＣＴＴＧＣＴ；ＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＡＣＧＴＣＴＣＴＴＴＧＡＡ。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）反応は、２００ｎＭの各プライマー、１×ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）および１０ｎｇのｃＤＮＡを含んだ。ＩＦＮγおよびＦｏｘｐ３に対するプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＡＢＩ）を使用し、そして他のファミリーメンバーとの交差反応性を有さない配列を選択して設計した。リアルタイムＰＣＲは、それぞれ５０℃で２分間および９５℃で１０分間の１サイクル、その後の９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の５０サイクルから構成された。データ分析は、限界サイクルおよびＣｔを決定するために配列検出器ソフトウェア利用した。
【００８８】
インビトロ機能分析。ＮＫＴ細胞を、ＣＤ１９ ＭＡＣビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して先にＢ細胞を枯渇させた脾細胞から取り出した。取り出したＮＫＴ細胞の純度は、≧９５％であった。サイトカインアッセイのために、ＮＫＴ細胞を、１０％のＦＣＳ、１００ｍＭのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００μＭの非必須アミノ酸、５．５×１０５Ｍの２−ＭＥ、および２５ｍＭのＨｅｐｅｓを補充したＩｓｃｏｖｅｓ培地において、血小板結合性抗ＣＤ３ Ａｂ（１０μｇ／ｍｌ）またはラットＩｇＧ２ａアイソタイプコントロールによって活性化した。全ての培養試薬を、Ｇｉｂｃｏ製であった。上清を、４８時間後に回収し、そしてサイトカインを、測定した。
【００８９】
ＮＫ細胞を、抗ＮＫ細胞（ＤＸ５）ＭＡＣＳマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、Ｂ細胞枯渇脾細胞から単離した。使用する取り出した細胞の純度は、＞９５％であった。上記細胞傷害アッセイのために、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含む完全Ｉｓｃｏｖｅｓ培地中で拡大培養（ｅｘｐａｎｄ）した。標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを、先に記載されるように（１２）、種々のエフェクター対標的の比（Ｅ：Ｔ）にて行なった。
【００９０】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇを、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（＞９６％の純度）のＴｒｅｇ単離キットを使用して脾細胞から単離した。サイトカインアッセイのために、Ｔｒｅｇを、ＩＬ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、またはＩＬ−２および可溶性ＣＤ３ Ａｂ（１０ｕｇ／ｍｌ）の存在下で、ウェル１つあたり２×１０５個の細胞にて、４８時間にわたって培養した。上清を、回収し、そしてサイトカインを、測定した。
【００９１】
フローサイトメトリーおよびサイトカイン分析。フローサイトメトリー表現型分析（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）のために、マウス細胞を、最初に、抗ＣＤ １６／ＣＤ３２ Ａｂ（クローン２．４Ｇ２）と一緒にインキュベートして、Ｆｃの非特異的結合をブロックした。次いで、２色または３色の染色を、以下の染色試薬を使用して行なった：抗ＣＤ３ ＦＩＴＣ、抗ＣＤ３ Ｃｙ（クローン１７ Ａ２）、抗ＣＤ４ ＦＩＴＣ（クローンＧＫ１．５）、抗ＣＤ２５ ＰＥまたは抗ＣＤ２５ビオチンＡｂ（クローンＰＣ６１）、抗ＮＫ１．１ ＰＥ、抗ＮＫ１．１ビオチン、抗ＮＫ１．１ ＦＩＴＣ（クローンＰＫ１３６）およびストレプトアビジン−サイクローム（ｃｙｃｈｒｏｍｅ）（Ｃｙ）。全ての上記試薬は、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製であった。抗ＮＫＧ２Ｄ ＰＥ（クローンＣＸ５）は、Ｄｒ．Ｌｅｗｉｓ Ｌａｎｉｅｒの寛大な寄贈品であった。腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を、ＮＫＧ２Ｄ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ）によって細胞を染色し、次いで抗ヒト二次抗体によって染色することによって染色した。ＢＤマウスＴｈｌ／Ｔｈ２キットまたは炎症性キットを使用して、ＮＫＴ細胞またはＴｒｅｇ細胞によって産生されるサイトカインのレベルを測定した。サンプルを、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターにおいて分析した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＴＭおよびＢＤ ＣＢＡソフトウェアを使用して、獲得したデータを分析した。
【００９２】
ＤＴＨ応答の誘導。ＤＴＨ応答を誘導するために、マウスに、０日目において、１ｍｇの熱失活したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ａ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ）を含むＣＦＡ中に乳化した５０μｇのマウスのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ｍｙｅｌｉｎ ｏｌｉｇｏｄｅｎｔｒｏｃｙｔｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＯＧ）３５−５５ペプチドをｓ．ｃ．に注射した。１０日目において、マウスに、２５μｇのＭＯＧ３５−５５ペプチドを仰臥で左側の足蹠に対してｓ．ｃ．に注射し、そしてＰＢＳを右側の足蹠にｓ．ｃ．に注射した。右側および左側のフッドパッドの厚さを、キャリパー型の技術者用マイクロメータ（ｅｎｇｉｎｅｅｒ ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ）を使用して４８時間後に測定した。足蹠の腫脹を、左側の足蹠の厚さから右側の足蹠の厚さを減算することによって産出した。動物を、毎日観察し、そして神経学的効果を、任意の臨床スコアにおいて定量化した。ＥＡＥスコアリングを、以下の通りに行った：０．無し；１．完全にしなやかな尾；２．後足の脱力；３．右側の不能／片方の後足の不全麻痺（脱力）；４．右側の不能／片方の後足の完全麻痺；５．両側の後足の完全麻痺；６．瀕死。
【００９３】
増殖アッセイ。マウスに、ＣＦＡ Ｈ３７Ａ中に乳化した５０μｇのＭＯＧ３５−５５をｓ．ｃ．で免疫した。リンパ節（上腕、腋窩、鼡径）を、９日後に回収し、そして単一細胞懸濁物を、調製した。リンパ節細胞を、ＭＯＧ３５−５５ペプチドの異なる濃度を用いて、９６ウェルプレート中で５×１０５個の細胞／ウェルにて７２時間にわたって培養した。培養上清中のＩＦＮ−γの量を、捕捉用の抗ＩＦＮ−γ Ｒ４６Ａ２ ｍＡｂおよび検出用のＡＮ１８−ビオチン ｍＡｂを使用したＥＬＩＳＡによって測定した。Ｔ細胞増殖性の応答を評価するために、培養物を、４８時間にて、１μＣｉ／ウェル［３Ｈ］−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてパルスし、そしてその２４時間後に回収した。チミジンの取り込みを、β−シンチレーションカウンターにおいて測定した。
【００９４】
（結果）
ＤＡＰ１０ＫＯマウスの産出。マウスＤＡＰ１０遺伝子は、染色体７Ａ３に位置する（ＤＡＰ１２遺伝子に隣接し、かつＤＡＰ１２遺伝子と反対の転写方向）。ＤＡＰ１０−欠損マウスを産出するために、ＤＡＰ１０ゲノムの遺伝子座を、１２９／Ｓｖ肝臓ＤＮＡから作製されたラムダライブラリーに放射標識したハイブリダイゼーションによって同定した。ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２の両方に対する遺伝子座を含む１つのラムダクローンを、単離した。ＤＡＰ１０遺伝子を破壊するために、機能性ＤＡＰ１０タンパク質に重要であるエキソン３およびエキソン４を、Ｂｒｕｃｅ ４ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ胚性幹細胞（図１Ａ）において、除去し、そしてネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏｒ）によって置換した。次いで適切に標的化したＥＳクローンを、ＣＲＥリコンビナーゼ発現ベクターによってトランスフェクトして、ｎｅｏｒカセットを除去した。サザンブロット分析により、ＤＡＰ１０遺伝子の正しい標的化を確認した（図１Ｂ）。ＥＳ細胞を、マウス未分化胚芽細胞に注射して、次いでホモ接合動物を得るために異種交配されるキメラマウスを産出した。ＤＡＰ１０ＫＯマウスは、組織学によって評価したところ、一般的に正常な器官形成を有するようであった。しかし、ＤＡＰ１０ＫＯ脾臓がｗｔの脾臓に対して増加した重量を有し、そしてこの差が、アジュバントおよび自己ペプチド（データは示さず）によって免疫されたマウスにおいてさらに顕著であることが、観察された。これは、ＤＡＰ１０ＫＯマウスが超免疫であり得ることを示唆する、最初の徴候であった。ＤＡＰ１０欠損は、ナイーブなマウスから単離したリンパ組織のＴａｑｍａｎ分析によって評価したところ、ｍＲＮＡレベルにてＤＡＰ１２遺伝子またはＮＫＧ２Ｄ遺伝子の基本的な発現に影響を及ぼさなかった（図１Ｃ）。次に、通常、ＤＡＰ１０との関連を必要とする細胞表面におけるＮＫＧ２Ｄタンパク質の発現を、分析した。図１Ｄは、ＮＫＧ２Ｄタンパク質の構成的な発現がＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫ１．１＋脾細胞において損なわれたことを示す。しかし、ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫ１．１＋脾細胞は、３日間にわたってＩＬ−２を用いる活性化の際に、ＮＫＧ２Ｄの有意なレベルを表し得る（図１Ｄ）。最近報告されたように（１０）、ＤＡＰ１２と対になる短いＮＫＧ２Ｄアイソフォームは、活性化されたＤＡＰ１０ＫＯ脾細胞において、機能的な表面レセプターとして発現され得る。
【００９５】
ＤＡＰ１０欠損は、化学的に誘導された皮膚の腫瘍形成に対する保護を提供し、そしてＮＫ１．１＋細胞は、抗腫瘍効果を担う。腫瘍形成の間の免疫監視におけるＤＡＰ１０の役割を研究するために、本発明者らは、化学的に誘導された皮膚の腫瘍モデルを使用した。マウスを、発癌をイニシエートするために、ＤＭＢＡの単一用量を用いて局所的に処置し、次いで異常な皮膚細胞の増殖を促進するためにＴＰＡを用いて処置した。ＴＰＡ処置を４ヶ月間行なって腫瘍を乳頭腫から癌腫まで進行させた。予想通り、ｗｔマウスは、大きさが成長し、そして進行性に悪性の癌腫になった多数の乳頭腫を発症した（図２）。それとは反対に、ＤＡＰ１０ＫＯマウスは、癌腫の病期に進行しなかった、有意に少ない乳頭腫型の腫瘍を発症した（図２）。発癌のイニシエーションの１年後、６５％のｗｔマウスが、皮膚の悪性の癌腫によって死亡したのに対して、ＤＡＰ１０ＫＯマウスは健康であり、そして皮膚の悪性の変態から保護された。したがって、予想外にも、ＤＡＰ１０欠損は、化学的に誘導された皮膚の悪性疾患に対して保護を与えた。
【００９６】
化学的に誘導された皮膚の腫瘍モデルは、長期のインビボ枯渇研究において取り扱うことが困難なので、インビトロで安定に適応されるＤＭＢＡ誘導性の癌腫細胞株（ＤＭＢＡ−Ｔ）を使用する皮膚の腫瘍移植モデルを、ＤＡＰ１０ＫＯの抗腫瘍応答に関与する細胞機構の分析を可能にするために利用した。腫瘍形成データと一致して、ＤＡＰ１０ＫＯマウスに対するｗｔ癌腫細胞の皮下接種は、ｗｔマウスへの移植と比較した場合に、顕著に遅延した腫瘍増殖を生じた（図３Ａ）。ＮＫ１．１＋細胞がＤＡＰ１０ＫＯマウスの抗腫瘍活性に関与したか否かを決定するために、マウスを抗ＮＫ１．１ Ａｂ（ＰＫ１３６）によって処置して、マウスにおいて、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の両方を含むＮＫ１．１＋細胞を枯渇させた。ＮＫ１．１＋細胞を枯渇させたマウスに対するＤＭＢＡ−Ｔ細胞の皮下移植は、ｗｔ動物およびＤＡＰ１０ＫＯ動物において、同様の腫瘍増殖を生じた（図３Ｂ）。これらのインビボでの枯渇の結果は、ＮＫ１．１＋細胞がＤＡＰ１０ＫＯの抗腫瘍効果において主要な役割を果たすことを明確に示唆した。ＮＫ１．１の枯渇が、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の両方を取り除いたので、次いで、抗アシアロＧＭ１ Ａｂを用いた処置によってＮＫ細胞のみが枯渇したマウスにおける腫瘍発生を、分析した。図３Ｃに示すように、抗アシアロＧＭ１ ＡｂによるＤＡＰ１０ＫＯマウスの処置は、癌腫の腫瘍に対するそれらの感受性を回復させた。これらの知見は、ＮＫ細胞が、ＤＡＰ１０ＫＯマウスにおいて移植された皮膚の癌腫の遅延した増殖を担う、一次エフェクターであることを示した。
【００９７】
ＤＭＢＡ−Ｔ癌腫細胞は、低レベルのＮＫＧ２Ｄリガンドを発現したが、ｗｔマウスにおいて有効な抗腫瘍応答を誘発できなかった（図４Ａ）。枯渇実験によって得られたデータを確認するために、ｗｔ細胞ならびにＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫ細胞およびＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫ１．１＋細胞の、インビトロでＤＭＢＡ−Ｔ癌腫細胞を殺す能力を試験した。興味深いことに、活性化されたＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫ１．１＋細胞は、ｗｔ細胞よりＤＭＢＡ−Ｔ癌腫細胞に対して、実質的に細胞溶解活性を示し、そしてこの活性は、主にＮＫＧ２Ｄ非依存性であった（図４Ｂ）。ｗｔ細胞およびＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫ細胞は、同様の効率でＤＭＢＡ−Ｔ癌腫細胞を殺すようであり、そしてそれらの細胞傷害は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体によって部分的に損なわれた（図４Ｃ）。上記インビボ実験は、ＤＡＰ１０ＫＯにおいてＮＫ細胞が抗腫瘍活性を主に担うことを、強力に示唆したが、強力な抗ＤＭＢＡ−Ｔ細胞細胞傷害のインビトロでの発生は、明確に、ＮＫＴ細胞も伴う。
【００９８】
ＤＡＰ１０欠損は、皮膚の転移に対する保護を与え、そしてＮＫＴ細胞は、抗腫瘍表現型を担う最終的なエフェクターであった。ＤＡＰ１０ＫＯマウスの抗腫瘍活性をさらに細かく区別するために、上記Ｂ１６黒色腫転移モデルを、利用した。肺への転移を誘導するために、Ｂ１６細胞を、ｗｔマウスおよびＤＡＰ１０ＫＯマウスに、種々の濃度にてｉ．ｖ．に注射し、２週間後に、肺を取り出し、そして転移性のコロニーについて分析した。図５に示すように、１×１０５個のＢ１６細胞を注射したＤＡＰ１０ＫＯマウスは、動物より３〜５倍低い肺への転移を発症した。１×１０４個のＢ１６細胞を注射したＤＡＰ１０ＫＯマウスは、黒色腫の転移から完全に保護された。ＤＡＰ１０ＫＯマウスにおける抗腫瘍活性の造血の起源を調査するために、骨髄キメラを、確立した。ｗｔ骨髄細胞によって再構成したＤＡＰ１０ＫＯマウスは、ｗｔ動物と同様の頻度で、Ｂ１６の転移を発症した（図６Ａ）。対照的に、ＤＡＰ１０ＫＯ骨髄細胞によるｗｔマウスの再構成は、ＤＡＰ１０ＫＯ動物において観察された抵抗性に匹敵する、転移に対する抵抗性をもたらした（図６Ａ）。これらの結果は、造血細胞がＤＡＰ１０ＫＯの抗腫瘍活性を担うことを、明確に示した。
【００９９】
インビボ枯渇研究を、Ｂ１６の転移に対するＤＡＰ１０ＫＯの増強した抗腫瘍活性におけるこれらの細胞の関与を示すために行った。ｗｔ動物からのＮＫ１．１＋細胞（ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞）の枯渇は、未処置のｗｔ動物と比較した場合、肺へのＢ１６の転移の、小さいが有意な増加を生じた（図６Ｂ）。さらに、抗ＮＫ１．１ Ａｂによって処置したｗｔマウスは、肺以外の器官（例えば、肝臓、皮膚、腹部、および胸腔）に、Ｂ１６の転移を与え、このことは、ｗｔ動物中のＮＫ１．１＋細胞が、Ｂ１６黒色腫の転移からの小さい程度の保護を提供したことを示した。興味深いことに、ＤＡＰ１０ＫＯマウスからのＮＫ１．１＋細胞の枯渇は、ｗｔ動物と等しいＢ１６の転移を示す肺と共に、抗腫瘍活性の完全な喪失を生じた。
【０１００】
インビボでのＮＫ細胞の機能とＮＫＴ細胞の機能とを区別するために、マウスを、選択的にＮＫ細胞を枯渇させるために抗アシアロＧＭ１抗体によって処置した。ＮＫ１．１の枯渇とは対照的に、ＤＡＰ１０ＫＯマウスからのＮＫ細胞のみの除去は、本質的に、ＤＡＰ１０ＫＯマウスの抗腫瘍活性に対して効果を有さなかった（図６Ｃ）。これらの結果は、ＮＫＴ細胞が、ＤＡＰ１０ＫＯマウスにおけるＢ１６黒色腫の転移に対する防御を担う主要なエフェクター集団であること示唆した。
【０１０１】
ＤＡＰ１０欠損は、ＮＫＴ細胞の機能亢進をもたらした。フローサイトメトリー分析は、脾臓のＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞の減少した頻度を示した（図７Ａ）。ＮＫＴのインビボでの活性化は、末梢リンパ器官からのそれらの迅速な枯渇、その後の骨髄由来細胞からの増殖および再生（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に関連することが報告されている（２３）。この知見に基づいて、本発明者らは、ＢｒｄＵ取り込みを測定することによって、ｗｔマウスおよびＤＡＰ１０ＫＯマウスにおける脾臓のＮＫＴ細胞ならびに骨髄のＮＫＴ細胞における増殖速度を分析した。図７Ｂに示すように、ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞は、ｗｔ細胞と比較して、有意に増加した増殖の％を有し、このことは、それらが構成的に機能亢進性であることを示唆した。ＤＡＰ１０欠損が、ＮＫＴ細胞の機能に影響したか否かを決定するために、ｗｔ細胞およびＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞の、サイトカインを産生する能力および腫瘍細胞を殺す能力を、試験した。ＮＫＴ細胞を、わずかにＮＫＴ細胞を活性化し得る抗ＣＤ３ Ａｂを使用して精製したので、休止ＮＫＴ細胞の機能を、正確に評価することができなかった。図７Ｃに示すように、ＩｇＧアイソタイプコントロール抗体（「休止」）と一緒に培養されたＮＫＴ細胞は、低レベルのサイトカインを産生し、したがって活性化されなかったと見なされた。血小板結合性抗ＣＤ３ Ａｂを有するＮＫＴ細胞は、ＩＬ−４、ＩＦＮγ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２を含む全てのＮＫＴ特徴的なサイトカインの産生を誘導した（図７Ｃ）。興味深いことに、活性化されなかったＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞および活性化されたＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞の両方は、ｗｔ細胞と比較した場合、有意により高い量のサイトカインを産生した。
【０１０２】
ＩＬ−２に活性化されたＮＫＴ細胞の、ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する腫瘍またはＮＫＧ２Ｄリガンドを発現しない腫瘍を殺す細胞傷害能力もまた、試験した。ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞は、ｗｔ ＮＫＴ細胞と比較した場合、ＮＫＧ２Ｄ リガンド発現ＹＡＣ−１腫瘍細胞をより低い効率で殺し、そして抗ＮＫＧ２Ｄ Ａｂは、部分的に、両方の場合において、その殺傷を阻害した（図８Ａ）。これらの結果は、活性化されたＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞が、部分的に機能性のＮＫＧ２Ｄレセプターを発現するが、ＮＫＧ２Ｄについての発現レベルは、ｗｔ細胞と比較して非常に低かったことを示唆した（図８Ｂ）。興味深いことに、Ｂ１６黒色腫細胞は、ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞によって効率的に殺されたが、ｗｔ細胞によっては効率的に殺されず、そしてこの細胞傷害は、抗ＮＫＧ２Ｄ Ａｂによって著しく影響されなかった（図８Ａ）。これらの結果は、インビボのデータと一致し、そしてＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞が、これらの同系の腫瘍細胞を効率的に殺すようにプログラムされたことを示した。
【０１０３】
ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇは、機能不全性であった。ＤＡＰ１０欠損マウスがより良好な抗腫瘍応答を開始することを可能にする機構的な経路を理解するために、ＮＫ１．１＋細胞の内在性の特性に対するＤＡＰ１０欠損の効果、またはそれらの機能を制御する免疫環境を、決定した。ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇ細胞が枯渇したマウスにおける皮下のＤＭＢＡ−Ｔ腫瘍増殖を、分析した。インビボ抗ＣＤ２５ Ａｂ処置によってＴｒｅｇが枯渇したｗｔマウスは、顕著に、遅延しかつ減少した皮膚の癌腫増殖を示し、さらに、未処置のＤＡＰ１０ＫＯマウスにおいて観察されたものに類似した（図９Ａ、図９Ｂ）。ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇ細胞が枯渇したＤＡＰ１０ＫＯマウスは、完全に腫瘍を有さず、このことは、ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇが、ある程度抑制性の活性を有することを示した。これらの増強した抗腫瘍活性はまた、Ｂ１６黒色腫の転移モデルにおいて観察され、Ｔｒｅｇの枯渇が、肺への転移をブロックした（図９Ｂ）。興味深いことに、Ｔｒｅｇ枯渇マウスから単離したｗｔ ＮＫＴ細胞は、ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞によって媒介される細胞傷害に匹敵する、Ｂ１６黒色腫細胞およびＤＭＢＡ−Ｔ癌腫細胞の強力なインビトロでの細胞溶解が可能であった（図９Ｃ）。
【０１０４】
マウスおよびＤＡＰ１０ＫＯマウスに由来する脾細胞の表現型の分析は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇの等しい％を示した（図１０Ａ）。しかし、ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇは、低い表面密度のＣＤ２５を有する、より高い比率のＴｒｅｇを示した。ＣＤ２５は、ＩＬ−２レセプターの重要な成分であり、そしてＩＬ−２の活性化は、Ｔｒｅｇの分化および増殖に不可欠であるので、ＩＬ−２または可溶性抗ＣＤ３ Ａｂを加えたＩＬ−２によって活性化したＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇが、ｗｔ細胞と比較した場合に、より低い量のＩＬ−１０およびＩＦＮ−γを産生したことは、顕著であった（図１０Ｂ）。次いでＴｒｅｇにおけるＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０ レセプター複合体の発現を、決定した。図１０Ｃに示すように、本発明者らは、ＤＡＰ１０がＴｒｅｇの機能に直接影響することを示唆する、休止ｗｔ ＴｒｅｇにおけるＤＡＰ１０転写物およびＮＫＧ２Ｄ転写物の存在を観察した。ＮＫＧ２Ｄレセプターの表面における発現は、脾臓のＴ細胞において検出されなかった（図示せず）。
【０１０５】
ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇがインビボで機能不全性であったか否かを決定するために、ｗｔ Ｔｒｅｇを、ＤＡＰ１０ＫＯマウスに移植し、そしてＢ１６黒色腫の転移の発生に対するｗｔ Ｔｒｅｇの影響を分析した。１×１０６個のｗｔ Ｔｒｅｇ細胞を、ＤＡＰ１０ＫＯマウスに対してｉ．ｖ．に移植し、そして４日後に、マウスは、Ｂ１６黒色腫腫瘍細胞を受容した。コントロールマウス（ｗｔおよびＤＡＰ１０ＫＯの両方）は、Ｂ１６細胞のみを受容した。図１０Ｃは、ＤＡＰ１０ＫＯマウスにおけるｗｔ Ｔｒｅｇの移植が、ＤＡＰ１０ＫＯマウスを、ｗｔマウスに匹敵して、黒色腫の転移に対して感受性にしたこと示す。
【０１０６】
ＤＡＰ１０ＫＯマウスは、誘導された自己免疫に対して、より感受性であった。ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇの損なわれた機能が自己に対する増加した反応性をもたらすか否かを決定するために、自己抗原（ＭＯＧ３５−５５）に対するＤＡＰ１０ＫＯ Ｔ細胞のインビトロおよびインビボでの応答を、分析した。図１１Ａは、ＭＯＧ３５−５５ペプチドに対するリコール反応（ｒｅｃａｌｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ）において、ＭＯＧ３５−５５免疫マウスのリンパ節から単離したＤＡＰ１０ＫＯ Ｔ細胞は、より良好に増殖し、そしてｗｔ細胞と比較してＩＦＮγのより高いレベルをもたらした。遅延型の過敏性反応（ＤＴＨ）の誘導は、ｗｔマウスおよびＤＡＰ１０ＫＯマウスにおいて、足蹠の同様の腫脹を生じた（図１１Ｂ）。興味深いことに、ＭＯＧ３５−５５に対するＤＴＨ応答は、ＤＡＰ１０ＫＯ ＢＬ／６マウスの４０％に実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘発したが、ＢＬ／６マウスにおいてはＥＡＥを誘発しなかった。ＥＡＥに関連した神経学的効果を、ＤＴＨ応答の誘導の、ちょうど４８時間後に観察した。数匹のＤＡＰ１０ＫＯマウスは、迅速な寛解を伴う穏やかなＥＡＥを発症したのに対して、他のＤＡＰ１０ＫＯマウスは、寛解前に１ヶ月間持続する重症かつ持続性のＥＡＥを有した。合わせて、このデータは、ＤＡＰ１０ＫＯマウスがＭＯＧ３５−５５誘導性自己免疫応答に対する増加した感受性を有することを示唆した。
【０１０７】
（考察）
予想外にも、発癌物質の刺激に曝されたＤＡＰ１０ＫＯマウス、またはＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する同系の腫瘍もしくはＮＫＧ２Ｄリガンドを発現しない同系の腫瘍を移植されたＤＡＰ１０ＫＯマウスは、腫瘍の悪性度に対して増強された抵抗性を示した。ＤＡＰ１０ＫＯマウスの抗腫瘍表現型は、マウスにおいてＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の両方を枯渇させることによって逆転された。Ｂ１６黒色腫モデルにおいて、ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞は、Ｂ１６腫瘍の排除を媒介するエフェクター細胞であることを証明した。一貫して、インビトロ細胞傷害アッセイは、ＤＡＰ１０ＫＯが、ＮＫＧ２Ｄ依存性の様式でＢ１６黒色腫の腫瘍を効率的に殺し得たが、ｗｔ ＮＫＴ細胞は、そうでなかったことを示した。それとは反対に、ＤＭＢＡ−Ｔ癌腫移植モデルにおいて、ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫ細胞は、腫瘍の拒絶を担う最終的なエフェクターであった。しかし、この腫瘍モデルにおいても、ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞は、ＮＫ細胞の活性化を媒介するようであった。実際に、インビトロで活性化されたｗｔ細胞またはＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫ細胞が、ＤＭＢＡ−Ｔ腫瘍を同様の効率で殺したのに対して、ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫ１．１＋細胞は、ＤＭＢＡ−Ｔ標的を、ｗｔ ＮＫ１．１＋細胞よりずっと効率的に殺した。さらに、ＴＣＲによる刺激の際に、ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞は、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α（両方とも殺腫瘍活性を有する）の、より高いレベルをもたらした。インビボにおいて、ＮＫＴ細胞によるＩＦＮ−γの、早期のより高い産生の後に、通常、ＮＫ細胞の迅速な活性化および効率的な腫瘍の殺傷が続く（３１−３５）。
【０１０８】
ＤＡＰ１０欠損は、構成的に機能亢進したＮＫＴ細胞に関連した。ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞は、ナイーブなマウスの脾臓および骨髄の両方における増加した増殖速度を示した。さらに、「休止」ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞および活性化されたＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞は、ｗｔ ＮＫＴ細胞と比較して、有意により高いレベルのサイトカインを産生した。ＮＫＴ細胞のような自己反応性のＴ細胞の活性を阻害することによって自己の破壊を防ぐこと（３６）が公知であるＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇの機能的特性を、ＤＡＰ１０が、細胞傷害機能を抑制状態に保つ機構に関与するか否かを決定するために、分析した。ＤＡＰ１０ＫＯマウスの分析は、ＤＡＰ１０の基礎的な発現が、Ｔｒｅｇが正常に機能するために必要とされたことを示した。ＤＡＰ１０シグナル伝達の欠如は、Ｔｒｅｇの分化の状態を変化させるようであり、Ｔｒｅｇの抑制性の活性の欠損を生じた。ＤＡＰ１０欠損マウスにおけるｗｔ Ｔｒｅｇの養子移植は、上記抑制を回復させ、このことは、実際に、ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇがインビボで機能不全であったことを示した。
【０１０９】
Ｔｒｅｇは、特に、高レベルのＣＤ２５抗原（ＩＬ−２レセプターの成分）を発現する、高度に分化した細胞である。ＩＬ−２は、Ｔｒｅｇに対する重要な増殖因子であるだけでなく、Ｔｒｅｇの機能をも調節し得る（２７、２９）。ナイーブなＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇ集団は、ｗｔ細胞と比較した場合、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｌｏｗ細胞の増加した％を示した。結果的に、ＴＣＲを介する活性化に関連するか、またはそれに関連しないＩＬ−２刺激は、ＤＡＰ１０ＫＯ ＴｒｅｇによるＩＬ−１０の有意に減少した産生をもたらした。Ｔｒｅｇは、自己反応性を抑制する２つの主要な機構を利用する：ＩＬ−１０、ＴＧＦβおよびＩＬ−４のような免役抑制性サイトカインの産生およびＣＴＬＡ−４またはＧＩＴＲのような細胞表面抗原を含む、細胞と細胞との接触性相互作用（３７）。したがって、ＤＡＰ１０ＫＯ ＴｒｅｇによるＩＬ−１０の損なわれた産生は、インビボにおけるそれらの細胞の減少した抑制性の活性を担うようである。
【０１１０】
ＤＡＰ１０シグナル伝達が、いかにしてＴｒｅｇの分化プロセスに寄与するのか？１つの可能性は、ＤＡＰ１０が胸腺におけるＴｒｅｇの成熟に影響することである。Ｔｒｅｇの胸腺における発達は、ＴＣＲ媒介性シグナルおよび最大の共起刺激を必要とする。ＣＤ２８共起刺激分子、Ｂ７共起刺激分子およびＣＤ４０共起刺激分子を欠如するマウスは、Ｔｒｅｇの損なわれた発達を有する（３６、３７）。ＤＡＰ１０ＫＯマウスは、正常なＴｒｅｇ数を有したが、Ｔｒｅｇの抑制性の機能を損ない、これは、ＤＡＰ１０がＴｒｅｇの完全な成熟に必要とされ得ることを示唆した。ＤＡＰ１０転写物およびＮＫＧ２Ｄ転写物は、胸腺において良好に発現され、そしてＮＫＧ２Ｄ−リガンド転写物は、胚において高度に発現されることが見出され（３０）、これらのことは、ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０レセプター複合体が、実際に、自己反応性のＴ細胞集団の初期の発達に関与し得ることを示唆する。あるいは、ＤＡＰ１０シグナル伝達は、直接的かまたは間接的かのいずれかで、末梢におけるＴｒｅｇの抑制性の機能を維持するために必要とされ得る。本発明者らは、天然のｗｔ Ｔｒｅｇにおいて、表面でのＮＫＧ２Ｄの発現を検出できなかったが、ｍＲＮＡ分析は、Ｔｒｅｇの調節におけるＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０レセプター複合体の直接的な関与を示唆する、ＮＫＧ２ＤおよびＤＡＰ１０の両方の発現を明確に示した。ＤＡＰ１０シグナル伝達が、末梢におけるＴｒｅｇの分化に重要である抗原提示細胞によって提供される共起刺激レセプターおよびサイトカインをモジュレートすることによって、Ｔｒｅｇの機能に間接的に影響することも、可能である（３２）。
【０１１１】
ＤＡＰ１０ＫＯマウスの分析は、ＤＡＰ１０が、腫瘍認識の免疫寛容機構に関与し、そうして腫瘍に対する免疫療法のための強力な薬物標的を示したことを示唆する。したがって、ＤＡＰ１０シグナル伝達のブロックは、Ｔｒｅｇの抑制性の機能を損なうことによって同系の腫瘍に対して、保護的であり得た。当然に、ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０レセプター複合体のブロックは、腫瘍細胞がＮＫＧ２Ｄリガンドを発現するか、またはＮＫＧ２Ｄリガンドしないかに依存して、異なる帰結を有するようである。興味深いことに、ｗｔマウスは、それらが、予めＴｒｅｇを枯渇した場合にのみ、低レベルのＮＫＧ２Ｄリガンドを発現するＤＭＢＡ−Ｔ腫瘍を拒絶し得た。ＮＫＧ２Ｄリガンドのほかに、ＤＭＢＡ−Ｔ腫瘍細胞が、Ｔｒｅｇによって認識され得る腫瘍関連抗原を発現し、そしてそれらの活性化、およびその後の免疫反応の阻害を誘発することが、可能である。この可能性は、腫瘍特異的な、変異していない自己抗原（ＬＡＧＥ−１と称される）の、Ｔｒｅｇ細胞に対する生理学的リガンドとしての最近の同定によって支持された（３８）。したがって、外来または自己の状況における腫瘍特異的抗原の認識は、腫瘍に対する免疫応答の性質において重要な影響を有し得た。
【０１１２】
ＤＡＰ１０は免疫調節機能を有するので、ＤＡＰ１０のブロックは、好ましい自己免疫であり得る。しかし、ナイーブなＤＡＰ１０ＫＯマウスは、自発の自己免疫反応を発生せず、自己免疫表現型に関連するマウスにおける腫瘍の拒絶でもなかった。興味深いことに、ＭＯＧ自己ペプチドに対するＤＴＨ反応の誘導は、ＤＡＰ１０ＫＯマウスにおいてＥＡＥを生じたが、ｗｔマウスにおいてはＥＡＥを生じず、このことは、ＤＡＰ１０ＫＯマウスが、実験的に誘導された自己免疫疾患に対して、より感受性であることを示した。ＢＬ／６マウスにおけるＥＡＥの誘導が、ＣＦＡ中に乳化されたＭＯＧ３５−５５および百日咳毒素（ＰＴＸ）による免疫を必要とすることが、良好に確立される（３９）。ＰＴＸの非存在下において、ｗｔ ＢＬ／６マウスは、代表的に、ＥＡＥを発症しないが、しかし、４０％のＤＡＰ１０ＫＯマウスは、ＰＴＸ処置無しでＥＡＥを発症した。おそらく、ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇの損なわれた調節機能が、増強したＴ細胞媒介性の自己反応性をもたらし、したがってＰＴＸに対する必要性を除去した。ＤＡＰ１０シグナル伝達はまた、自己免疫応答に関与する他の免疫細胞の活性に影響し得る。２つの研究は、自己反応性のＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０レセプター複合体の発現を示している（７、８）。後者は、自己免疫疾患に対して遺伝的に感受性であり、不完全なＴｒｅｇおよびＮＫＴ細胞の活性を有する他のマウス系統のようなＮＯＤマウスの使用を、行なった（２８）。ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達のブロックは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖および活性を阻害することによって自己免疫性糖尿病を予防する（８）。したがって、ＤＡＰ１０機能のブロックは、免疫応答において異なる影響を有するようである。
【０１１３】
ＤＡＰ１０は、リンパ系細胞および骨髄性細胞において広く発現され、したがってＤＡＰ１０の生物学は、複合体であることが予想される。上記研究は、同系の腫瘍に対する応答を制御する免疫調節機構におけるＤＡＰ１０の重要な役割を示し、そしてＤＡＰ１０共起刺激の１つの生理学的役割が、自己抗原に対する寛容を維持するためにＴｒｅｇを活性化することであることを示唆する。
【０１１４】
（参考文献）
【０１１５】
【表１】
【０１１６】
【表２】
【０１１７】
【表３】
【０１１８】
【表４】
。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１は、ＤＡＰ１０遺伝子の標的化を示す。（Ａ）エキソン３およびエキソン４が、ＥＳ細胞中の１．４ｋｂのｎｅｏｒカセットによって置換されたＤＡＰ１０ ｗｔ対立遺伝子の概略図。ｅｒｅリコンビナーゼ遺伝子を含むプラスミドを導入することによって、ｌｏｘ Ｐフランク（ｆｌａｎｋｅｄ）ｎｅｏｒ遺伝子が除去される。（Ｂ）サザンブロット分析。ＥＳクローンを、未分化胚芽細胞のマイクロインジェクションの前に、ｎｅｏｒ遺伝子の切り出しを確認するためにサザンブロットによって分析した。サザンスクリーニングは、ＤＡＰ１０標的化ベクターにフランキングする５’プローブおよび３プローブの両方を利用する。ゲノムＤＮＡを、コントロール、または変異体ＥＳ細胞から単離し、ＮｃｏＩによって消化し、そして５’プローブおよび３プローブによってハイブリダイズさせた。ｗｔ対立遺伝子（ｗｔ）は、６ｋｂのバンドによって表され、標的化された対立遺伝子（ＨＲ）は、４．０ｋｂのバンドであり、そしてＣＲＥフリップ対立遺伝子（ｆｌｉｐｐｅｄ ａｌｌｅｌｅ）（ＣＦ）は、５．１ｋｂのバンドである。（Ｃ）ＤＡＰ１０ＫＯリンパ組織のＲＴ ＰＣＲ分析。全ＲＮＡは、ｗｔマウスまたはＤＡＰ１０ＫＯマウスの脾臓、リンパ節および胸腺から単離され、そしてＤＡＰ１０遺伝子、ＮＫＧ２Ｄ遺伝子およびＤＡＰ１２遺伝子に対する特異的プライマーを使用したリアルタイムＲＴ ＰＣＲ分析に供された。ｍＲＮＡレベルを、ユビキチンレベルに対して正規化した。（Ｄ）ＮＫ１．１＋細胞上のＮＫＧ２Ｄレセプターの発現。ｗｔまたはＤＡＰ１０ＫＯ 脾細胞（上のパネル）またはＩＬ−２によって３日間活性化されたＮＫ細胞（下のパネル）を、抗ＮＫ１．１ ＦＩＴＣと抗ＮＫＧ２Ｄ ＰＥ ｍＡｂとのカクテルによって染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。
【図２】図２は、ＤＡＰ１０欠損マウスが化学的に誘導された皮膚の癌腫に対して保護されることを示す。発癌のイニシエーションの４ヶ月後、皮膚の腫瘍を計測し、そしてそれらの発達の段階（乳頭腫および癌腫）を、臨床的かつ組織学的な判定基準に基づいて決定した。ｗｔ腫瘍は、癌腫と乳頭腫との混合であったのに対して、ＤＡＰ１０ＫＯ腫瘍は、乳頭腫のみであった。写真は、代表的なｗｔマウスまたはＤＡＰ１０ＫＯマウスにおける化学的に誘導された皮膚の腫瘍の外観を示す。その差は、対応のないスチューデントｔ検定によって決定したところ、統計学的に有意であった（ｐ＞０．０５）。
【図３】図３は、ＮＫ１．１＋細胞がＤＡＰ１０ＫＯマウスにおいて癌の腫瘍の効率的な拒絶を担う、最終のエフェクター細胞であることを示す。（Ａ）ｗｔ癌腫細胞の移植。マウス（１群あたりｎ＝１０）に、５ｘ１０４個のｗｔ癌腫細胞をｓ．ｃ．に注射し、そして１ヶ月間２〜３日毎に腫瘍増殖についてモニタリングした。（Ｂ）ＮＫ１．１＋細胞が枯渇したマウスにおける腫瘍増殖。抗ＮＫ１．１ ｍＡｂ（ＰＫ１３６）またはアイソタイプコントロール（マウスＩｇＧ１κ）を、−２日目から開始して５日毎にｉ．ｖ．に与えた。マウス（１群あたりｎ＝５）に、０日目において５×１０４個のｗｔ癌腫細胞を与えた。（Ｃ）ＮＫ細胞が枯渇したマウスにおける腫瘍増殖。抗アシアロＧＭ１ポリクローナル抗体またはＰＢＳを、−２日目、２日目、６日目、１０日目においてｉ．ｖ．に与えられた。マウス（１群あたりｎ＝５）に、５×１０４個のｗｔ癌腫細胞を０日目に与えた。Ｐ値（ｐ＞０．０５）を、対応のないスチューデントｔ検定によって決定した。データは、与えられた時点における腫瘍容積の平均±ＳＥＭとして示される。
【図４】図４は、ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫ１．１＋細胞が効率的に癌の皮膚の腫瘍を殺すことを示す。（Ａ）ＤＭＢＡ−Ｔ癌腫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ−リガンドの発現。ＮＫＧ２Ｄ−Ｉｇ融合タンパク質またはＩｇコントロールと、ＰＥ結合体化二次Ａｂとによって染色されたｗｔ癌腫細胞のフローサイトメトリー分析。（Ｂ）ＮＫ１．１＋細胞による癌の皮膚の腫瘍のインビトロでの殺傷。ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはＮＫ１．１＋細胞を、ｗｔ脾細胞またはＤＡＰ１０ＫＯ脾細胞から単離し、そしてＩＬ−２と一緒に７日間培養した。それらは、異なるエフェクター：標的比でのＤＭＢＡ−Ｔ細胞に対する細胞傷害アッセイにおいてエフェクターとして使用した。そのアッセイは、抗ＮＫＧ２ＤブロックｍＡｂまたはラットＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（両方とも１０μｇ／ｍｌにて使用される）の存在下において行なった。
【図５】図５は、ＤＡＰ１０欠損がＢ１６黒色腫の転移に対する免疫の増強と関連することを示す。（Ａ）黒色腫の肺への転移の発症。１×１０５個または１×１０４個のＢ１６細胞を、マウスにｉ．ｖ．注射し、そして肺への転移を、２週後に計測した（ｐ＞０．０５）。（Ｂ）１ｘ１０５個のＢ１６黒色腫細胞の注射の２週間後でのｗｔマウスおよびＤＡＰ１０ＫＯマウスにおけるＢ１６転移の外観。
【図６】図６は、ＮＫＴ細胞がＤＡＰ１０ＫＯマウスにおいてＢ１６黒色腫の転移に対する保護を担うエフェクターであることを示す。（Ａ）骨髄キメラの産生。骨髄キメラマウスの４つの群を産生し、そして抗転移効果におけるＤＡＰ１０ＫＯ免疫細胞の役割を評価するために使用した。使用したドナー−＞レシピエントキメラは、以下の通りであった：１．ｗｔ ＧＦＰ＋−＞ｗｔ；２．ＤＡＰ１０ＫＯ−＞ＤＡＰ１０ＫＯ；３．ｗｔ ＧＦＰ＋−＞ＤＡＰ１０ＫＯ；４．ＤＡＰ１０ＫＯ−＞ｗｔ ＧＦＰ＋。１×１０５個のＢ１６細胞を、キメラに注射し、そして２週間後、その転移を計測した。２つの異なる実験からの代表的な結果。（Ｂ）マウスにおけるＮＫ１．１＋細胞の枯渇。マウスに、２×１０４個のＢ１６細胞をｉ．ｖ．に注射した。抗ＮＫ１．１ Ａｂ（ＰＫ１３６）またはアイソタイプコントロール（マウスＩｇＧ１κ）に、−２日目から開始して５日毎にｉ．ｖ．に与えた。肺への転移を、２週間後に計測した。（Ｃ）マウスにおけるＮＫ細胞の枯渇。抗アシアロＧＭ１ポリクローナル抗体またはＰＢＳを、−２日目、２日目、６日目、１０日目においてｉ．ｖ．に与えた。１×１０５個のＢ１６細胞を、０日目においてｉ．ｖ．に注射し、そして肺への転移を、１４日目に計測した。
【図７】図７は、ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞が超活動性であることを示す。（Ａ）ｗｔマウスおよびＤＡＰ１０ＫＯマウスにおけるＮＫＴ細胞集団のフローサイトメトリー分析。ナイーブなマウスから単離された脾細胞を、抗ＮＫ１．１ ＰＥ抗体と抗ＣＤ３ ＦＩＴＣ抗体とによって染色した。ＮＫＧ２Ｄ発現を、抗ＮＫＧ２Ｄ ＰＥ Ａｂによって染色し、取り出されたＮＫＴ細胞において評価した。（Ｂ）ＮＫＴ細胞の交代速度。マウスに、ＢｒｄＵ（マウス１匹あたり１ｍｇ）をｉ．ｖ．に注射した。２４時間後、白血球を、脾臓および骨髄から単離し、そしてＢｒｄＵキットを使用してＢｒｄＵの取り込みを検出するために染色した。染色された細胞は、フローサイトメトリーによって分析した。（Ｃ）ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞は、ｗｔ細胞と比較して、より高い量のサイトカインを産生する。ｗｔ細胞またはＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞を、ナイーブなマウスの脾細胞から単離し、そして血小板結合性抗ＣＤ３ ｍＡｂまたはアイソタイプコントロール（「休止」）によってインビトロで活性化させた。細胞を４８時間培養し、そしてサイトカイン産生をマウスＴｈｌ／Ｔｈ２ ＣＢＡキットを使用して上清において測定した。
【図８】図８は、ＤＡＰ１０ ＮＫＴＫＯ細胞がＢ１６黒色腫細胞を効率的に殺すことを示す。（Ａ）活性化されたＮＫＴのフローサイトメトリー分析。取り出されたＮＫＴを、ＩＬ−２と一緒に５日間培養した。細胞を、抗ＮＫ１．１ ＦＩＴＣと、抗ＣＤ３ Ｃｙと、抗ＮＫＧ２Ｄ ＰＥ Ａｂとのカクテルによって染色した。（Ｂ）ＮＫＴ細胞傷害能力の分析。ＩＬ−２活性化ＮＫＴ細胞を、ＹＡＣ−１細胞およびＢ１６黒色腫標的細胞に対する細胞傷害アッセイにおいてエフェクター細胞として使用した。ＹＡＣ−１が、高レベルのＮＫＧ２Ｄリガンドを発現するのに対して、Ｂ１６は、高レベルのＮＫＧ２Ｄリガンドを発現しない。そのアッセイは、抗ＮＫＧ２ＤブロックＡｂまたはそのアイソタイプコントロール（両方とも、１０μｇ／ｍｌである）の存在下において行なわれた。
【図９】図９は、ｗｔマウスおよびＤＡＰ１０ＫＯマウスにおけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇの枯渇を示す。（Ａ）Ｔｒｅｇが枯渇したマウスにおけるＤＭＢＡ−Ｔ癌腫細胞の移植。Ｔｒｅｇを枯渇させるために、マウスに、−２日目において単一用量の抗ＣＤ２５ Ａｂを与え、次いで０日目においてＤＭＢＡ−Ｔ細胞を注射した。腫瘍増殖を、３日毎にモニタリングした。（Ｂ）Ｔｒｅｇが枯渇したマウスにおける転移の発生。枯渇のために、マウスに、−３日目、２日目および７日目において抗ＣＤ２５ Ａｂを与えた。コントロールマウスに、ＰＢＳを与えた。１×１０５個のＢ１６細胞を、０日目においてｉ．ｖ．に与え、そして転移を、２週間目において計測した。（Ｃ）Ｔｒｅｇが枯渇したマウスから単離されたＮＫＴ細胞の細胞傷害能力。ｗｔマウスまたはＤＡＰ１０ＫＯマウスは、−３日目における抗ＣＤ２５ Ａｂ（クローンＰＣ６１、マウス１匹あたり０．５ｍｇ）の静脈内注射によってＣＤ２５＋細胞が枯渇した。０日目において、ＮＫＴ細胞を、脾臓から単離し、そしてマウスＩＬ−２と一緒に５日間培養した。次いで、ＮＫＴを、Ｂ１６黒色腫細胞に対する細胞傷害アッセイにおいてエフェクターとして使用した。そのデータは、平均±ＳＤとして示される。
【図１０】図１０は、ＤＡＰ１０欠損がＴｒｅｇ媒介性の抑制の減損と関連することを示す。（Ａ）Ｔｒｅｇのフローサイトメトリー分析。脾細胞を、ｗｔマウスまたはＤＡＰ１０ＫＯマウスから単離し、そして抗ＣＤ４ ＦＩＴＣ Ａｂ、抗ＣＤ２５ビオチンＡｂによって染色し、次いでストレプトアビジン−Ｃｙによって染色した。（Ｂ）ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇによるサイトカイン産生の減損。ｗｔ ＴｒｅｇまたはＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇは、ナイーブなマウスの脾細胞から単離し、そしてＩＬ−２、またはＩＬ−２および可溶性抗ＣＤ３ ｍＡｂを用いて４８時間活性化した。サイトカインの産生を、マウス炎症性ＣＢＡキットを使用して上清において測定した。その上清において検出された他のサイトカインは、ＭＣＰ−Ｉ（ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇにおいてダウンレギュレートされた）、およびＴＮＦ−α（ｗｔ細胞およびＤＡＰ１０ＫＯ細胞によって同様に産生）であった。（Ｃ）ｗｔ ＴｒｅｇおよびＤＡＰ１０ＫＯ ＴｒｅｇのＴａｑｍａｎ分析。Ｔｒｅｇを、マウスＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇ単離キットを使用して、ｗｔマウスおよびＤＡＰ１０ＫＯマウスの脾臓から単離した。全ＲＮＡを、３．５×１０６個のＴｒｅｇから単離し、そしてＦｏｘｐ３遺伝子、ＮＫＧ２Ｄ遺伝子、ＤＡＰ１０遺伝子、ＤＡＰ１２遺伝子およびＩＦＮγ遺伝子に対する特異的プライマーを使用するリアルタイムＲＴ ＰＣＲ分析に供した。ｍＲＮＡレベルを、ユビキチンレベルに対して正規化した。（Ｄ）ＤＡＰ１０ＫＯマウスにおけるｗｔ Ｔｒｅｇの養子移植。１×１０６個のｗｔ ＴｒｅｇまたはＰＢＳを、−３日目においてＤＡＰ１０ＫＯマウスにｉ．ｖ．注射した。マウスに、０日目において、Ｂ１６黒色腫をｉ．ｖ．に注射し、そして肺への転移を、１４日目に分析した。（Ｄ）ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴに対するＴｒｅｇの抑制効果。ＮＫＴを、ナイーブなマウスから単離し、そしてマウスＩＬ−２と一緒に５日間培養した。細胞傷害アッセイの１２時間前に、ＮＫＴ細胞を洗浄し、計測し、そしてＩＬ−２を含む培地において、単独か、またはｗｔ ＴｒｅｇもしくはＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇと一緒（１：１の比）のいずれかで、培養した。ＮＫＴ±Ｔｒｅｇを、Ｂ１６黒色腫細胞またはｗｔ癌腫細胞に対する細胞傷害アッセイにおいてエフェクターとして使用した。そのデータは、平均±ＳＤとして示される。
【図１１】図１１は、ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔ細胞が自己ペプチドＭＯＧに対する増加した反応性を提示することを示す。（Ａ）ＭＯＧ３５−５５で免疫されたリンパ節細胞のインビトロ増殖アッセイ。ｗｔリンパ節細胞およびＤＡＰ１０ＫＯリンパ節細胞を、ＭＯＧ３５−５５で免疫されたマウスから単離し、そして異なる濃度にて、ＭＯＧ３５−５５ペプチドと一緒に７２時間培養した。その増殖性の応答を、［３Ｈ］−チミジン取り込みアッセイによって測定した（左のグラフ）。未標識の培養物を使用して、ＩＦＮ−γの量を決定した（右のグラフ）。データは、三連の平均±ＳＥＭである。３つのうちの１つの代表的な実験が示される。（Ｂ）ＤＴＨ応答の誘導。マウスを、０日目において、ＣＦＡ中に乳化されたＭＯＧによって免疫し、次いで１０日目においてＭＯＧを足蹠に注射した。足蹠の腫脹を、４８時間後に測定した（左のグラフ）。ＥＡＥ臨床スコアを、方法に記載されるように決定した。３つの異なる実験の組み合わせたデータ。
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、免疫学および医薬の分野に関する。より具体的に、本発明は、インビボで抗腫瘍活性を増強し、そして自己免疫を減少させるＤＡＰ１０活性のモジュレーション、およびこのようなモジュレーションを媒介する化合物の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
免疫細胞の活性の閾値は、自己抗原および外来抗原の認識を介して受容される活性化シグナルおよび抑制性シグナルによって調節される。活性化レセプターまたは抑制性レセプターに影響する遺伝的欠損は、免疫系が自己と非自己との間で区別することを不可能にし、自己免疫または感染因子および形質転換細胞に対する異常な応答を引き起こす（１、２）。
【０００３】
多くの活性化レセプターは、マルチサブユニット複合体であり、この複合体において、膜貫通アダプタータンパク質が、細胞内部でのシグナルの伝達を担う。ＤＡＰ１０は、造血細胞において発現されるマルチサブユニットレセプター複合体中の活性化レセプターＮＫＧ２Ｄと結合する膜貫通アダプタータンパク質である（３）。ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０レセプター複合体は、ＮＫ，γδ Ｔ細胞およびＮＫＴ細胞において構成的に発現され、そして生得的な刺激は、その発現をさらにアップレギュレートし得る（３〜６）。活性化の際に、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびマクロファージは、適応性の免疫応答の調節に関与するＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０レセプターを発現する（７、８）。細胞表面におけるＮＫＧ２Ｄの発現は、ＤＡＰ１０タンパク質とのその結合を必要とする。これは、ＤＡＰ１０の膜貫通領域中の酸性アミノ酸と、ＮＫＧ２Ｄタンパク質の膜貫通ドメイン中の塩基性アミノ酸との間の相互作用を含む（３）。ＮＫＧ２ＤおよびＤＡＰ１０の発現パターンは、完全に重複しないので、ＤＡＰ１０が他の未だに同定されていないレセプターと結合する（特に、いくつかの骨髄性細胞の集団において）ことが、考えられる。ヒトにおいて、ＮＫＧ２Ｄが専らＤＡＰ１０と結合する（３，４）のに対して、マウスは、ＮＫＧ２Ｄについての２つの異なるアイソフォーム（ＤＡＰ１０にのみ結合する長い形態（ＮＫＧ２Ｄ−ｌ）、およびＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２の両方と対になることが示されている短い形態（ＮＫＧ２Ｄ−ｓ））を発現する（９、１０）。
【０００４】
免疫レセプター活性化チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｅｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＡＭ）を介してシグナルを与えるＤＡＰ１２および他のアダプタータンパク質とは異なり、ＤＡＰ１０は、ＩＴＡＭを有さないが、ＤＡＰ１０は、ＰＩ３−キナーゼ経路の活性化に関与するＹＸＸＭモチーフを含む（３）。ＮＫ細胞において、ＤＡＰ１０のシグナル伝達は、細胞傷害を直接誘導し、そしてＤＡＰ１２関連レセプターを介して開始されるサイトカイン産生を増強する（１１、１２）。Ｔ細胞において、ＤＡＰ１０のシグナル伝達は、主に、ＴＣＲ誘導性シグナルに対する共起刺激を提供する（５）。
【０００５】
ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０レセプター複合体に対する同定されたリガンドは、ヒトにおけるＭＩＣＡ、ＭＩＣＢおよびＵＬＢＰ、ならびにげっ歯類動物におけるＲａｅ−１、Ｈ６０およびＭＵＬＴ−１を含むクラスＩ ＭＨＣ様タンパク質である（４、１３、１４、１５）。一般に、それらは、成体の組織において最小限に発現され、そして腫瘍細胞および病原体感染細胞においてアップレギュレートされる。腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの異所性の発現は、宿主からの腫瘍の拒絶を生じる（１６、１７）。しかし、ＮＫＧ２Ｄリガンドは、正常組織においても同様に発現され得、それによってＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０複合体の正確な役割を不明確にする。
【０００６】
ＤＡＰ１０が、免疫応答の重要な役割を有するもの（ｐｌａｙｅｒ）であることが公知である多くの細胞型において発現され、そして特徴付けられるが、この分子によって果たされる生物学的役割の明確な証拠は、存在しない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、進行する免疫応答のダイナミクス（ｄｙｎａｍｉｃｓ）または一次免疫応答の開始を変化させるための、ＤＡＰ１０（造血細胞における細胞表面シグナル伝達分子）のモジュレーションに関する。代表的に、免疫応答は、体液性（抗体媒介性）または細胞性（Ｔ細胞媒介性）である。体液性免疫応答は、Ｔｈ２細胞の活性化ならびにＩＬ−４およびＩＬ−１０の産生によって特徴付けられ、そして最終的に、抗原特異的Ｂ細胞および抗体産生の活性化をもたらす。一方で、細胞性免疫応答は、Ｔｈ１細胞の活性化ならびにＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２の産生によって特徴付けられ、細胞傷害性Ｔ細胞（通常は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞）の増殖および活性化を生じる。これらの応答の各々は、特定の病原体から宿主を保護するように設計され、そしてこれらの応答の調節は、健全な免疫系を維持するのに重要である。調節されない免疫応答または異常な免疫応答は、自己免疫、種々の免疫病理、および抑制された抗腫瘍反応性または抗腫瘍反応性の非存在を生じる。免疫応答の１つの同定された調節因子は、調節性Ｔ細胞である。調節性Ｔ細胞は、宿主免疫応答を極度に抑制し、そして自己中毒回避を誘導する。例えば、Ｒｏｎｃａｒｏｌｏら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：６７６−６８３（２０００）；Ｓａｋａｇｕｃｈｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１８２：１８−３２（２００１）を参照のこと。調節性Ｔ細胞（「Ｔｒｅｇ」）は、種々の表現型を有するようであり、したがって調節性Ｔ細胞は、一貫して、それらの機能的活性によってのみ同定可能である。現在、その存在（または非存在）が、Ｔ細胞応答のこの調節に明確に寄与する単一分子は、同定されていない。本発明者らは、本明細書中で、その活性が細胞性免疫応答の調節に重要であり、したがってインビボの免疫応答をモジュレートするための有意な標的として、ＤＡＰ１０を開示する。
【０００８】
したがって、被験体において腫瘍に対する細胞媒介性の応答を刺激するか、または増大するための方法であって、その必要がある被験体に、ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害するか、または抑制する因子を投与する工程を包含する方法が、本明細書中で特徴付けられる。１つの実施形態において、上記因子は、ＤＡＰ１０の発現を阻害するか、または抑制し得る。上記因子は、ＤＡＰ１０の細胞内シグナル伝達を妨害し得る。１つの実施形態において、上記因子は、ＤＡＰ１０によるＰＩ３キナーゼ経路の誘発を妨害し得る。この方法において有用である因子は、ＤＡＰ１０膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１０特異的抗体もしくはその生物学的に活性なフラグメント、またはＤＡＰ１０のｓｉＲＮＡであり得る。上記腫瘍は、原発性腫瘍または転移性腫瘍であり得る。いくつかの実施形態において、上記腫瘍は、ＮＫＧ２ＤリガンドまたはＬＡＧＥ−１を発現する。１つの実施形態において、上記因子は、ＮＫ細胞の細胞傷害もしくはＮＫＴ細胞の細胞傷害を増強するか、または増大する。上記因子は、ＮＫ細胞の増加した増殖またはＮＫＴ細胞の増加した増殖を刺激し得る。いくつかの実施形態において、前記因子は、少なくとも特徴的なサイトカインのＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞からの増加したサイトカイン産生を刺激する。上記特徴的なサイトカインは、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−２であり得る。
【０００９】
ＤＡＰ１０活性をモジュレートする因子の有効量を細胞に投与する工程を包含する、標的に対する細胞傷害を増加する方法であって、上記ＤＡＰ１０活性は、減少されるか、または排除される方法もまた、本明細書中で特徴付けられる。上記標的は、腫瘍細胞であり得る。いくつかの実施形態において、上記細胞傷害のメディエーターは、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞である。上記細胞は、組織または生体にあり得る。
【００１０】
調節性Ｔ細胞を抑制するか、または阻害するための方法であって、その必要がある被験体に、ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害する因子を投与する工程を包含する方法が、本明細書中でさらに特徴付けられる。いくつかの実施形態において、上記因子は、ＤＡＰ１０の発現を阻害し得るか、または抑制し得る。上記因子は、ＤＡＰ１０の細胞内シグナル伝達を妨害し得る。１つの実施形態において、上記因子は、ＤＡＰ１０によるＰＩ３キナーゼ経路の誘発を妨害する。この方法において有用な因子は、ＤＡＰ１０の膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１０特異的抗体もしくはその生物学的に活性なフラグメント、またはＤＡＰ１０のｓｉＲＮＡである。１つの実施形態において、前記被験体は、癌を有する。
【００１１】
癌を予防するか、または処置する方法であって、その必要がある被験体に、ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害するか、または抑制する因子の有効量を投与する工程を包含する方法が、本明細書中で特徴付けられる。いくつかの実施形態において、上記癌は、皮膚癌である。特定の実施形態において、上記癌は、化学的に誘導される。
【００１２】
ａ）ＤＡＰ１０発現細胞と試験化合物とを接触させる工程；ｂ）ＤＡＰ１０の生物学的活性の阻害について上記細胞を評価する工程；およびｃ）ＤＡＰ１０の生物学的活性をダウンレギュレートする化合物を、発癌を弱めるか、または改善する化合物として、上記試験化合物を、同定する工程；を包含する、発癌を弱めるか、または改善する化合物を同定するための方法がまた、本明細書中で特徴付けられる。いくつかの実施形態において、上記発癌は、皮膚の発癌である。特定の実施形態において、上記発癌は、化学的に誘導される発癌である。いくつかの実施形態において、上記ＤＡＰ１０の生物学的活性は、ＰＩ３キナーゼシグナル伝達の誘導、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞の増加した細胞傷害、ＮＫ細胞もしくＮＫＴ細胞の増加した増殖、またはＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞による増加したサイトカイン産生によって評価される。
【００１３】
ａ）ＤＡＰ１０発現細胞と試験化合物とを接触させる工程；ｂ）ＤＡＰ１０の生物学的活性の阻害について上記細胞を評価する工程；およびｃ）ＤＡＰ１０の生物学的活性をダウンレギュレートする化合物を、腫瘍増殖を阻害する化合物として、上記試験化合物を、同定する工程；を包含する、腫瘍増殖を阻害する化合物を同定するための方法が、本明細書中でさらに特徴付けられる。上記腫瘍は、原発性腫瘍または転移性腫瘍であり得る。いくつかの実施形態において、上記腫瘍は、皮膚の腫瘍である。１つの実施形態において、上記腫瘍は、化学的に誘導される。上記ＤＡＰ１０生物学的活性は、ＰＩ３キナーゼシグナル伝達の誘導、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞の増加した細胞傷害、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞の増加した増殖、またはＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞による増加したサイトカイン産生によって評価され得る。
【００１４】
ａ）ＤＡＰ１０−／−マウスにおいて実験的自己免疫疾患を誘導する工程；ｂ）試験化合物を上記ＤＡＰ１０−／−に投与する工程；ｃ）少なくとも１つの自己免疫疾患の指標を評価する工程；およびｄ）試験化合物を、上記試験化合物が上記疾患の指標を減少させるか、または排除する場合に、上記自己免疫疾患を弱めるか、または改善する化合物として同定する工程；を包含する、自己免疫疾患を弱めるか、または改善する化合物を同定するための方法が、本明細書中で特徴付けられる。いくつかの実施形態において、上記実験的自己免疫疾患は、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、コラーゲン誘導性関節炎、実験的自己免疫心筋炎、実験的自己免疫卵巣炎、または実験的自己免疫精巣炎である。この方法によって同定された有効な化合物を投与する工程を包含する、自己免疫疾患を予防するか、または処置する方法もまた、本明細書中で特徴付けられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、免疫応答の重要な調節性のようなＤＡＰ１０についての生理学的な役割に関する。ＤＡＰ１０の欠如は、原発性の増殖（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）および転移性腫瘍の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）の両方に対する抗腫瘍免疫応答性の増大をもたらし、このことは、ＤＡＰ１０が免疫監視における重要な役割を有するものであることを意味する。ＤＡＰ１０の欠如はまた、自己免疫疾患に対する感受性の上昇をもたらし、このことも、ＤＡＰ１０がインビボの免疫応答の調節に関与することを意味する。したがって、本発明の目的は、特に、癌および自己免疫における免疫応答性を変化させるためのＤＡＰ１０のモジュレーションに関する。ＤＡＰ１０をモジュレートする因子を同定する能力は、免疫応答の外部からの調節を可能にし、発癌および腫瘍増殖を予防しない場合に、少なくともそれらを減少させるための腫瘍に対する免疫監視の増強を可能にし得る。
【００１６】
開示の明確性のために、そして限定としてではなく、本発明の詳細な説明は、以下のサブセクションに分けられる。
【００１７】
（Ａ．定義）
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。全ての特許、公開された特許出願および他の出版物、ならびにＧｅｎＢａｎｋおよび本明細書中に言及される他のデータベースからの配列は、その全体が参考として援用される。この節に示される定義が、本明細書中に参考として援用される特許、公開された特許出願、および他の出版物ならびにＧｅｎＢａｎｋおよび他のデータベースからの配列に示される定義に反するか、あるいはそれと矛盾する場合、この節に示される定義が、本明細書中に参考として援用される定義より優先する。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「因子（ａｇｅｎｔ）」は、本発明の分子の発現および／または活性をモジュレートする（例えば、上方調節（ｕｐ−ｍｏｄｕｌａｔｅ）するか、または刺激し、そして下方調節（ｄｏｗｎ−ｍｏｄｕｌａｔｅ）するか、または阻害する）化合物を含む。本明細書中で使用される場合、用語「インヒビター」または「阻害性因子」は、本発明の分子の発現および／または活性を阻害する因子を含む。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、抗原性エピトープを特異的に結合するのに必要な可変領域配列を含む、単離された結合因子または組換え結合因子をいう。したがって、抗体は、抗体の任意の形態または所望の生物学的活性（例えば、特異的標的抗原を結合すること）を示すそのフラグメントである。したがって、抗体は、その最も広い意味で使用され、そして具体的には、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、多重特異的抗体（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（例えば、二重特異的抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ））、および抗体フラグメント（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、およびＦａｂ２が挙げられるが、これらに限定されない）を網羅するが、但しそれらは、所望の生物学的活性を示す。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、用語「自己免疫」とは、被験体の免疫系（例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞）が被験体自身の組織に対して反応を始める状態をいう。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語「発癌」とは、悪性細胞もしくは新生物性細胞または腫瘍の発生をいう。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、用語「細胞媒介性の応答」とは、Ｔ細胞、および免疫系の非特異的な細胞（ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、および好塩基球が挙げられるが、これらに限定されない）によって媒介される、抗原、細胞、または生物体に対する宿主の応答をいう。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「ＤＡＰ１０」は、供給源（一般的に認められるＷＯ９９／０６５５７に開示されるようなＤＡＰ１０が挙げられるが、これに限定されない）にかかわらず、ＤＡＰ１０タンパク質の全ての形態を包含する。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「転移性腫瘍」とは、原発性腫瘍から離れた部位において増殖する腫瘍細胞をいう。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「ＮＫ細胞」または「ナチュラルキラー細胞」とは、Ｂ細胞またはＴ細胞と異なり、そして種々の機構（直接的な細胞溶解、抗体依存性細胞媒介性の溶解、および他の細胞を活性化するＩＦＮ−γ産生が挙げられる）によって、生得的な免疫応答において細胞（代表的には、病原体感染細胞または腫瘍細胞のいずれか）を殺すように機能する大きい顆粒リンパ球をいう。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「ＮＫＴ細胞」とは、ＮＫ細胞マーカーもまた発現するＴ細胞の小さいサブセットをいう。ＮＫＴ細胞は、ＮＫ１．１（ＣＤ１６１）＋細胞、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋／−細胞である。ＴＣＲ−α鎖は、代表的なＴ細胞と比較して制限された多様性を有し、そしてＮＫＴ細胞は、クラスＩ様分子（例えば、ＣＤ１）を認識する。ＮＫＴ細胞は、ＭＨＣに拘束されず、そしてそのＮＫＴ細胞は、抗原提示細胞によって提示されるペプチドを認識しない。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結されるアミノ酸の比較的短い鎖を含む。用語「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」は、ペプチドを模倣し得るか、またはペプチドに拮抗し得る非ペプチド性の構造エレメントを含む化合物を含む。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「原発性腫瘍」とは、原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）に留まる腫瘍をいう。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「調節性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ」とは、他の免疫細胞の機能の抑制を引き起こすＴ細胞をいう。例えば、ｖｏｎ Ｈｅｒｒａｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：２２３−３２（２００３）を参照のこと。Ｔｒｅｇは、細胞と細胞との接触によって直接的か、または抗炎症性メディエーター（例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、またはＩＬ−４）の分泌を介して間接的かのいずれかで、他の免疫機能を抑制し得る。Ｌｅｖｉｎｇｓら、Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９：２３−７６（２００２）；Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３８９−４００（２００２）を参照のこと。いくつかの実施形態において、Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞である。例えば、Ｗａｌｄｍａｎｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １４：３９９（２００１）を参照のこと。代表的に、Ｔｒｅｇは、能動的に、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、またはナイーブなＴ細胞の増殖およびサイトカイン産生を抑制し、このＴ細胞の増殖およびサイトカイン産生は、活性化シグナル（例えば、抗原および抗原提示細胞、またはＭＨＣの状況（ｃｏｎｔｅｘｔ）において抗原を模倣するシグナル（例えば、抗ＣＤ３抗体＋抗ＣＤ２８抗体）によって培養中に刺激されている。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「低分子干渉（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ」（「ｓｉＲＮＡ」）または「短鎖干渉（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ」）とは、干渉を指揮し得るか、またはＲＮＡ干渉を媒介し得る、約１０〜５０個の間のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）からなるＲＮＡ（またはＲＮＡアナログ）をいう。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「被験体」とは、免疫応答が誘発され得るあらゆる生きている生物体をいい、好ましくは、その被験体は、哺乳動物である。例示の被験体としては、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギおよびヒツジが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｔ細胞」、または「Ｔリンパ球」とは、哺乳動物（例えば、ヒト）由来のＴ細胞系統内のあらゆる細胞をいう。好ましくは、Ｔ細胞は、ＣＤ４またはＣＤ８のいずれか（しかし、それらの両方を発現しない）、およびＴ細胞レセプターを発現する成熟Ｔ細胞である。本明細書中に記載される種々のＴ細胞集団は、当該分野において公知であるそれらのサイトカインプロフィールおよびそれらの機能に基づいて定義され得る。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「処置する」とは、被験体に対する治療因子の適用もしくは投与、あるいは疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状または疾患もしくは障害についての素因を有する被験体由来の単離組織または単離細胞株に対する治療因子の適用もしくは投与をいい、これらの適用もしくは投与は、その疾患もしくは障害を治癒する（ｃｕｒｅ）か、治癒する（ｈｅａｌ）か、緩和するか、軽減するか、変化させるか、治療するか、改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）か、改善する（ｉｍｐｒｏｖｅ）か、またはその疾患もしくは障害に影響を与える目的を伴う。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「腫瘍」とは、任意の悪性細胞または新生物性細胞をいう。
【００３６】
（Ｂ．細胞の応答のモジュレーション）
被験体において腫瘍に対する細胞媒介性の応答を刺激するか、または増大させるための方法であって、その必要がある被験体に、ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害するか、または抑制する因子を投与する工程を包含する方法が、本明細書中で特徴付けられる。標的に対する細胞傷害を増加させる方法であって、細胞にＤＡＰ１０活性をモジュレートする因子の有効量を投与することを包含する方法もまた、本明細書中で特徴付けられ、ここでそのＤＡＰ１０活性は、減少するか、または排除される。
【００３７】
ＤＡＰ１０発現細胞が関与するあらゆる細胞媒介性の応答は、本開示の発明を使用して刺激され得るか、または増大され得る。このような細胞媒介性の応答は、ナイーブな細胞の応答、記憶細胞の応答、Ｔｈ１細胞の応答、Ｔｈ２細胞の応答、および調節性Ｔ細胞の応答を包含する。細胞媒介性応答は、当該分野において使用され得る慣用的な方法によって測定され得る。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、現行版）を参照のこと。
【００３８】
特に、ＤＡＰ１０活性の操作は、標的に対する細胞傷害の増加をもたらし得る。ＤＡＰ１０を発現し、ＤＡＰ１０媒介性の相互作用によってその標的と相互作用する任意の細胞傷害性細胞（または細胞傷害性細胞の先祖）、またはその細胞のＤＡＰ１０を含む細胞傷害性エフェクター細胞への分化および／もしくは刺激は、この方法によってモジュレートされ得る。このような細胞としては、ＮＫ細胞、Ｔｒｅｇ、ＮＫＴ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、および肥満細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細胞傷害は、任意の適切な方法によって評価され得る。例示の方法としては、標識された標的細胞からの放射標識の放出の試験（例えば、５１Ｃｒ）、比色定量アッセイ（例えば、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、グランザイム放出アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼアッセイ、および生物ルミネセンス細胞傷害アッセイ（例えば、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ））が挙げられる。
【００３９】
任意の適切な標的細胞は、細胞媒介性の応答（特に、本発明の細胞傷害性の応答）に対する標的であり得る。好ましくは、上記標的は、哺乳動物である。上記標的は、応答する細胞に対して同系、同種異系、または異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）であり得る。ほとんどの実施形態において、上記標的は、同系または同種異系である。好ましい実施形態において、上記標的は、応答するエフェクター細胞に対して同系である。上記標的細胞は、正常細胞または異常細胞であり得る。例示の細胞は、腫瘍細胞、ウイルスに感染した細胞、および組換え手段によってＤＡＰ１０リガンドを発現する細胞を含む。したがって、標的細胞としては、確立された細胞株（例えば、Ｋ５６２細胞）、短期の細胞株（ｓｈｏｒｔ ｔｅｒｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）、または被験体から採取されたサンプルから単離される細胞（例えば、解離した腫瘍細胞）が挙げられる。ＤＡＰ１０またはＤＡＰ１０リガンドを発現する細胞において、その発現は、天然に生じ得るか、当該分野において公知である方法を使用する組換え手段により得る。例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、最新版）を参照のこと。
【００４０】
いくつかの実施形態において、上記腫瘍標的または他の細胞性標的は、ＤＡＰ１０に対するリガンドを発現する。ときとして、上記ＤＡＰ１０リガンド（またはＤＡＰ１０関連リガンド）は、ＮＫＧ２ＤリガンドまたはＬＡＧＥ−１である。
【００４１】
調節性Ｔ細胞を抑制するか、または阻害するための方法であって、その必要がある被験体に、ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害する因子を投与する工程を包含する方法が、本明細書中でさらに特徴付けられる。Ｔｒｅｇ活性は、周知の方法を使用して評価され得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／００４９６９６号；同第２００４／０１７３７７８号；および同第２００３／０１４７８６５号を参照のこと。代表的に、エフェクターＴ細胞集団は、規定されたインビトロの標的に応じて、増殖、細胞傷害、またはサイトカイン産生について評価され得る。しかし、このような分析はまた、上記因子のインビボ投与後に、エキソビボで行われ得る。このような分析において、上記因子の有効量は、所望のエフェクター細胞集団の増殖および／もしくは細胞傷害を増加させるか、またはサイトカイン産生を、上記エフェクター細胞集団を補助するものへと変化させるのに必要な量である。１つの例において、上記因子は、ＮＫ細胞の増殖および／または細胞傷害を増加させる一方で、ＩＬ−４産生およびＩＬ−１０産生を減少させ、そして／またはＩＦＮ−γ産生を増加させる。インビボ分析は、減少した腫瘍増殖、減少した転移の発生数、および／または減少した死亡率によって評価されるような抗腫瘍応答の増大を含み得る。例えば、Ｔｅｉｃｈｅｒ、ＴＵＭＯＲ ＭＯＤＥＬＳ ＩＮ ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ２００１）を参照のこと。
【００４２】
本発明の因子は、ＤＡＰ１０の生物学的活性の阻害または抑制をもたらす、ＤＡＰ１０の発現もしくは機能の任意の局面を阻害し得るか、または抑制し得る。用語「生物学的活性」とは、リガンドとのＤＡＰ１０相互作用によって媒介される任意の即時効果または下流における効果をいう。上記効果は、ポジティブな効果（例えば、結合した場合にシグナル伝達カスケードを開始する）、またはネガティブな効果（例えば、細胞と細胞との相互作用が、ＤＡＰ１０の非存在下もしくは特定の事象の誘発に必要なシグナルの除去において起きる場合に生じる、新規のシグナル伝達カスケードまたは異なるシグナル伝達カスケードの存在）であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、上記因子は、ＤＡＰ１０細胞内シグナル伝達を妨害し得る。１つの実施形態において、上記因子は、ＤＡＰ１０によるホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）経路の誘発を妨害する。ＰＩ３−キナーゼ活性は、当該分野において公知である方法によって評価され得る。例示の方法としては、タンパク質のリン酸化、遺伝子の転写、細胞周期の進行、タンパク質とタンパク質との相互作用を試験するアッセイ（例えば、ｒａｓ、ｒａｆ、またはｆｙｎ）、タンパク質のトランスロケーション（例えば、ＮＦ−κＢの核へのトランスロケーション）、またはタンパク質産生アッセイ（例えば、サイトカインアッセイ）が挙げられる。例えば、Ａｕｓｅｂｅｌら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、最新版）を参照のこと。機能的アッセイ（例えば、増殖および細胞傷害）はまた、当該分野において周知の方法および本明細書によって開示される方法を使用して、上記因子の最終的な下流における効果を示すために使用され得る。増殖は、放射標識の取り込み、ルミネセンス、蛍光比色法などを使用して評価され得る。このような細胞媒介性の応答は、上記因子の投与後に、少なくとも約５％、１０％、または２０％刺激されるか、または増大されるべきであり、ときとして約３０％、４０％、または５０％刺激されるか、または増大されるべきであり、そして好ましくは約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％より大きく刺激されるか、または増大されるべきである。
【００４３】
１つの実施形態において、上記因子は、ＤＡＰ１０の発現を阻害するか、または抑制する。このような発現は、任意の機構によって生じ得、その機構としては、転写抑制因子の誘導、転写活性化因子の阻害などが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＡＰ１０発現は、任意の適切な手段によって決定され得る。代表的に、ＤＡＰ１０発現は、フローサイトメトリー分析によって評価され得る。いくつかの実施形態において、発現の完全な抑制は生物学的に関係する効果を達成するのに必要ではない可能性がある。このような効果は、標的化されている細胞媒介性の応答が、投与される因子の非存在下において生じる応答から検出可能に変化するものである。このような応答は、少なくとも約５％、１０％、または２０％刺激されるか、または増大されるべきであり、ときとして約３０％、４０％、または５０％刺激されるか、または増大されるべきであり、そして好ましくは約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％より大きく刺激されるか、または増大されるべきである。
【００４４】
１つの実施形態において、上記因子は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、もしくはＴ細胞の細胞傷害を増強するか、または増大する。いくつかの実施形態において、上記因子は、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞の増殖の増加を刺激し得、それによって、細胞性の細胞傷害性反応を刺激するか、または増大する。
【００４５】
本発明の因子はまた、細胞の１つ以上のサブセットからの増加したサイトカイン産生によって、細胞媒介性の応答を刺激し得るか、または増大し得る。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞が刺激されて、上記因子の非存在下において見られるサイトカイン発現と比較した場合に、少なくとも特徴的なサイトカインの増加した量を産生する。特徴的なサイトカインとしては、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−２が挙げられ得る。これらのサイトカインは、多くの方法および市販のキットによって定量的様式で容易に検出され、その方法としては、ＥＬＩＳＡ、マイクロＥＬＩＳＡ、および細胞内フローサイトメトリー分析が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、最新版）を参照のこと。
【００４６】
接触の時間、方法、および容器は、評価される機能に適した任意のものであり得る。
【００４７】
ＤＡＰ１０を阻害し得るか、または抑制し得る例示の因子としては、抗体、ＲＮＡｉ、ＲＮＡｉを媒介する化合物（例えば、ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、本発明の分子の優性／ネガティブな変異体、ＤＡＰ１０膜貫通ドメインなどのペプチド、および／またはペプチド模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
１つの実施形態において、本発明の方法の因子は、ＤＡＰ１０特異的抗体またはその生物学的に活性なフラグメントである。例示の抗体としては、ＷＯ９９／０６５５７に開示される抗体が挙げられる。上記抗体は、細胞培養物、ファージ、または種々の動物において産出され得、その動物としては、ウシ、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、類人猿が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本発明の方法において有用な抗体は、代表的に、哺乳動物の抗体である。ファージ技術は、最初の抗体を単離するためか、または変更された特異性またはアビディティー特性を有する改変体を産出するために使用され得る。このような技術は、当該分野において慣用的であり、かつ周知である。１つの実施形態において、上記抗体は、当該分野において公知である組換え手段によって産生される。例えば、組換え抗体は、上記抗体をコードするＤＮＡ配列を含むベクターによって宿主細胞をトランスフェクトすることによって産生され得る。１つ以上のベクターが、宿主細胞において少なくとも１つのＶＬ領域および少なくとも１つのＶＨ領域を発現するＤＮＡ配列をトランスフェクトするために使用され得る。抗体の産出および産生についての組換え手段の例示の記載としては、Ｄｅｌｖｅｓ、ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ：ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（Ｗｉｌｅｙ、１９９７）；Ｓｈｅｐｈａｒｄら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；およびＧｏｄｉｎｇ、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９３）が挙げられる。
【００４９】
本発明の方法において有用な抗体は、所望の機能（例えば、上昇した半減期）を媒介することおいてその抗体のより大きい効力を増加させるために、組換え手段によって改変され得る。例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（編）ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）を参照のこと。例えば、抗体は、組換え手段を使用する置換によって改変され得る。代表的に、その置換は、保存的置換である。例えば、上記抗体の定常領域中の少なくとも１つのアミノ酸が、異なる残基によって置換され得る。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号、米国特許第６，１９４，５５１号、出願番号ＷＯ９９／５８５７２；およびＡｎｇａｌら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−０８（１９９３）を参照のこと。アミノ酸の改変は、アミノ酸の欠失、付加、および置換を含む。上記抗体はまた、融合タンパク質であり、この抗体またはその生物学的に活性なフラグメントは、別の生物学的に関連する因子（例えば、サイトカイン、接着分子、共起刺激分子など）、およびこのような分子の生物学的に関連する部分に結合される。
【００５０】
「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」とは、ＲＮＡの選択的な細胞内分解をいう。ＲＮＡｉは、細胞内で天然に起こって、外来ＲＮＡ（例えば、ウイルスＲＮＡ）を除去する。天然のＲＮＡｉは、他の類似するＲＮＡ配列に対する分解機構を指揮する遊離のｄｓＲＮＡから切断されたフラグメントを介して始まる。あるいは、ＲＮＡｉは、人の手によって（例えば、標的遺伝子の発現をサイレンシングすることによって）開始され得る。例えば、米国特許出願第２００４０２０３１４５号を参照のこと。したがって、ＤＡＰ１０自体の発現に対するＲＮＡｉ、あるいはＤＡＰ１０の発現もしくは機能に対する任意の重要な上流のエフェクターまたは下流のエフェクターが、企図される。いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡｉは、ＤＡＰ１０によって使用されるＰＩ３−Ｋシグナル伝達経路の１種以上の成分をモジュレートするために使用され得る。
【００５１】
公知の配列に基づいてペプチド模倣物を作製する方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第５，６３１，２８０号；同第５，６１２，８９５号；および同第５，５７９，２５０号を参照のこと。ペプチド模倣物の使用は、所定の位置における非アミド結合による、非アミノ酸残基の組み込みを包含し得る。本発明の１つの実施形態は、ペプチド模倣物であり、その化合物は、適切な模倣体（ｍｉｍｉｃ）によって置換される結合、ペプチド骨格、またはアミノ酸成分を有する。適切なアミノ酸模倣体であり得る非天然のアミノ酸の例としては、β−アラニン、Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｌ−γ−アミノ酪酸、Ｌ−α−アミノイソ酪酸、Ｌ−ε−アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−ε−Ｂｏｃ−Ｎ−．アルファ．−ＣＢＺ−Ｌ−リジン、Ｎ−ε−Ｂｏｃ−Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニンスルホン、Ｌ−ノルロイシン、Ｌ−ノルバリン、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｎ−δ−ＣＢＺ−Ｌ−オルニチン、Ｎ−δ−Ｂｏｃ−Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｌ−オルニチン、Ｂｏｃ−ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｂｏｃ−ヒドロキシプロリン、およびＢｏｃ−Ｌ−チオプロリンが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＡＰ１０の生物学的に関連する部分の適切なペプチド模倣物、上流および下流のシグナル伝達成分などを含むＤＡＰ１０の生物学的活性に重要な任意のタンパク質。
【００５２】
いくつかの実施形態において、この方法において有用な因子は、ＤＡＰ１０膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１０特異的抗体もしくはそれらの生物学的に活性なフラグメント、またはＤＡＰ１０のｓｉＲＮＡである。ＤＡＰ１０またはその生物学的に活性なフラグメント、および宿主細胞におけるＤＡＰ１０の輸送、発現、生物学的活性などを容易にする少なくとも１つのタンパク質ドメインまたはタグを含むＤＡＰ１０融合タンパク質の使用もまた、企図される。このようなタンパク質およびタグとしては、転写活性化伝達（Ｔｒａｎｓ−Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）（ＴＡＴ）タンパク質、または他のタンパク質の細胞への進入を促進する他のタグおよび輸送ペプチドタグが挙げられ得るが、これらに限定されない。例えば、Ｖｏｃｅｒｏ−Ａｋａｂａｎｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２２：５０８−２１（２０００）を参照のこと。
【００５３】
いくつかの実施形態において、上記被験体は、癌を有し、そして下に記載されるような本発明の因子によって処置され得る。
【００５４】
（Ｃ．ＤＡＰ活性をモジュレートする因子を同定する方法）
ａ）ＤＡＰ１０発現細胞と試験化合物とを接触させる工程；ｂ）ＤＡＰ１０の生物学的活性の阻害について上記細胞を評価する工程；およびｃ）ＤＡＰ１０の生物学的活性をダウンレギュレートする化合物を、発癌を弱めるか、または改善する化合物として、上記試験化合物を、同定する工程；を包含する、発癌を弱めるか、または改善する化合物を同定するための方法がまた、本明細書中で特徴付けられる。いくつかの実施形態において、上記発癌は、皮膚の発癌である。特定の実施形態において、上記発癌は、化学的に誘導される発癌である。いくつかの実施形態において、ＤＡＰ１０の生物学的活性は、ＰＩ３キナーゼシグナル伝達の誘導、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞の増加した細胞傷害、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞の増加した増殖、またはＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞による増加したサイトカイン産生によって評価される。
【００５５】
ａ）ＤＡＰ１０発現細胞と試験化合物とを接触させる工程；ｂ）ＤＡＰ１０の生物学的活性の阻害について上記細胞を評価する工程；およびｃ）ＤＡＰ１０の生物学的活性をダウンレギュレートする化合物を、腫瘍増殖を阻害する化合物として、上記試験化合物を、同定する工程；を包含する、腫瘍増殖を阻害する化合物を同定するための方法が、本明細書中でさらに特徴付けられる。上記腫瘍は、原発性腫瘍または転移性腫瘍であり得る。いくつかの実施形態において、上記腫瘍は、皮膚の腫瘍であり得る。１つの実施形態において、上記腫瘍は、化学的に誘導される。ＤＡＰ１０の生物学的活性は、ＰＢキナーゼシグナル伝達の誘導、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞の増加した細胞傷害、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞の増加した増殖、またはＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞による増加したサイトカイン産生によって評価され得る。
【００５６】
任意の適切なＤＡＰ１０発現細胞は、本発明の方法のうちの同定する方法において使用され得る。ＤＡＰ１０発現は、内因性または外因性であり得る。ＤＡＰ１０発現細胞としては、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、マクロファージ、および肥満細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ＤＡＰ１０の組換え発現のために、任意の適切な宿主細胞が、利用され得る。宿主細胞は、その宿主細胞に対して適切な作動可能に連結した制御領域を有するベクターを使用するＤＡＰ１０発現構築物によって、遺伝的に操作（形質導入または形質転換またはトランスフェクト）される。ＤＡＰ１０についての例示の配列は、ＷＯ９９／０６５５７に開示される。ＤＡＰ１０の外因性の発現は、一過性であっても、安定であっても、それらのある程度の組み合わせであってもよい。外因性の発現は、１種以上のさらなるタンパク質（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）との同時発現によって、増強されても、最大化されてもよい。外因性の発現は、構成的プロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶなど）および当該分野において公知である適切な誘導プロモーターを使用して達成され得る。適切なプロモーターは、目的の細胞において機能するプロモーターである。上記ベクターは、例えば、プラスミド、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択または本発明の遺伝子の増幅に適するように改変された従来の栄養培地において培養され得る。その培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選択された宿主細胞に関して先に使用された条件であり、そしてその条件は、当業者に明らかである。代表的な宿主細胞としては、ＢａＦ細胞、２９３Ｔ細胞、およびマウス肥満細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
ＤＡＰ１０またはその生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸を含むベクターまたはプラスミドもまた、本明細書中に提供される。真核生物細胞および原核生物細胞において使用するのに適したベクターは、当該分野において公知であり、そしてそのベクターは、市販されているか、または当業者によって容易に調製される。さらなるベクターはまた、例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、２０００）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、（１９８９）に見出され得る。
【００５８】
ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害する化合物は、ＤＡＰ１０の少なくとも１つの生物学的活性を減少させるか、または排除する化合物である。このような阻害は、ＤＡＰ１０の１つ以上の重要な結合残基の直接的な結合によってか、または立体障害、ＤＡＰ１０の酵素的改変などを含む間接的な妨害によって生じ得る。本明細書中で使用される場合、用語「化合物」は、タンパク質部分および非タンパク質部分の両方を含む。１つの実施形態において、上記化合物は、低分子である。別の実施形態において、上記化合物は、タンパク質である。
【００５９】
種々の異なる化合物が、本明細書中に提供されるような方法を使用して同定され得る。化合物は、多くの化学的分類を包含し得る。特定の実施形態において、それらの化合物は、有機分子であり、好ましくは、５０ダルトンより大きく、かつ約２，５００ダルトン未満の分子量を有する有機低分子化合物である。これらの化合物は、タンパク質との構造的相互作用（特に、水素結合）に必要な官能基を含み得、そして少なくとも１つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボニル基を含み得、好ましくは、その化学的官能基の少なくとも２つを含み得る。上記化合物は、上記官能基の１つ以上によって置換される、環状炭素（ｃｙｃｌｉｃａｌ ｃａｒｂｏｎ）構造もしくは複素環式構造および／または芳香族構造もしくは多環芳香族（ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｉｃ）構造を含み得る。化合物はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造アナログまたはその組み合わせのような生体分子を含む。目的の化合物はまた、抗体もしくは結合フラグメントまたはそれらの模倣体（例えば、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ）などのペプチド因子およびタンパク質因子を含み得る。
【００６０】
同定アッセイのための化合物はまた、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む広範な種々の供給源から得られ得る。例えば、多くの手段は、無作為化されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、広範な種々の有機化合物および生体分子のランダムかつ指向型の合成のために利用可能である。あるいは、細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物、および動物抽出物の形態にある天然化合物のライブラリーは、利用可能であるか、または容易に生成される。さらに、天然に生成されるか、または合成で生成されるライブラリーおよび化合物は、従来の化学的手段、物理学的手段および生化学的手段によって容易に改変され、そしてコンビナトリアルライブラリーを生成するために使用され得る。公知の薬理学的因子は、構造アナログを生成するために、指向型またはランダムの化学的改変（例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）など）に供され得る。
【００６１】
１つの実施形態において、低分子は、同定アッセイにおける化合物として使用され得る。低分子化合物は、分子量が約１０００未満であるか、または分子量が約５００未満である化合物を含む。１つの実施形態において、低分子は、専らペプチド結合のみを含むことはない。別の実施形態において、低分子は、オリゴマーではない。活性についてスクリーニングされ得る例示の低分子化合物としては、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、有機低分子（例えば、ポリケチド）、および天然産物の抽出物のライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、上記化合物は、小さい、非ペプチド性の有機化合物である。さらなる実施形態において、低分子は、生合成のものではない。
【００６２】
本明細書中に提供されるようなＤＡＰ１０発現細胞は、任意の都合のよいプロトコルを使用して、化合物（または因子）と接触される。いくつかの実施形態において、ＤＡＰ１０発現細胞に対する化合物の効果は、他の細胞の１種以上の型（例えば、標識された標的、増殖するＴ細胞など）の存在下において評価される。１つの実施形態において、上記細胞は、流体培地の容積を保持し得る容器または類似の構造物（例えば、９６ウェルプレートのウェルまたは３８４ウェルプレートのウェル）中におかれる。上記細胞および上記化合物は、ＤＡＰ１０に媒介される事象の正確な検出を可能にする任意の細胞数を含む任意の容積において接触され得る。１つの実施形態において、存在する細胞の総数は、約１，０００個の細胞〜約１００，０００個の細胞の範囲である。１つの実施形態において、反応容積は、約２０マイクロリットル〜２００マイクロリットルの範囲である。上記細胞は、任意の時間にわたって、上記化合物および／または他の細胞型と接触され得る。１つの実施形態において、上記接触の時間は、１時間〜８時間の範囲であり、好ましい時間は、４時間である。上記細胞および上記化合物は、ＤＡＰ１０の生物学的活性のモジュレーションのために許容される任意のｐＨにて、培地中で接触され得る。上記細胞は、種々の温度にて上記化合物と接触され得る。１つの実施形態において、上記細胞の接触のための温度は、しばしば、２５℃〜３８℃の範囲であり、代表的には、３７℃の温度が、使用される。所望の場合、上記細胞は、種々の細胞集団の適当な混合および相互作用を確保するために撹拌され得る。
【００６３】
上記接触混合物に存在する化合物の量は、特に、その化合物の性質に依存して変動し得る。１つの実施形態において、上記因子が、有機低分子である場合、反応混合物に存在する化合物の量は、約１フェムトモル〜１０ミリモルの範囲であり得る。別の実施形態において、上記因子が、抗体またはその結合フラグメントである場合、上記化合物の量は、約１フェムトモル〜１０ミリモルの範囲であり得る。所定の接触容積に含める任意の特定の化合物の量は、当業者に公知の方法を使用して経験的に容易に決定され得る。
【００６４】
ＤＡＰ１０の生物学的活性の阻害の存在または非存在は、ＤＡＰ１０の表面における発現、ＤＡＰ１０シグナル伝達（特に、ＰＩ３−Ｋ経路）、腫瘍標的または他の異常な細胞標的に対する増加した細胞傷害、または増加したサイトカイン産生の評価によって決定される。利用される特定の評価プロトコルは、直接的に評価可能なアッセイの性質に依存して、必然的に変わり、そして当該分野で公知のアッセイ、およびセクションＢにおいて本明細書中に開示されるアッセイを利用し得る。例えば、評価される読み出しが、ＤＡＰ１０発現である場合、化合物によって処置されるか、または処置されないかのいずれかであるＤＡＰ１０発現細胞が、ＤＡＰ１０特異的抗体によって染色され得、そしてＤＡＰ１０発現の変化が、標準的なフローサイトメトリー分析によって評価される。
【００６５】
任意の都合のよい手段が、ＤＡＰ１０の生物学的活性に対する上記化合物の効果を評価するために使用され得、その手段としては、単独か、または他の関連する細胞型の存在下のいずれかにおいて化合物と接触した場合の増殖、細胞傷害、およびインビトロ発現の定量化された測定ならびにインビボでの評価が挙げられるが、これらに限定されない。このような評価は、発癌および腫瘍増殖および転移を阻害する能力における評価を含む。このような分析に適した動物モデルは、当該分野において周知であり、そして下に開示される実施例において開示されるものによって例示される。化合物が、腫瘍発生の範囲を、その化合物の非存在下において観察されるものと比較して減少させる場合、その化合物は、ＤＡＰ１０の生物学的活性のインヒビターである。１つの実施形態において、上記化合物は、発癌物質に対する曝露後の腫瘍発生の範囲を０％まで減少させ、完全な保護を提供する。同様に、化合物が、腫瘍増殖の速度および／または転移の範囲を、その化合物の非存在下において観察されるものと比較して減少させる場合、その化合物は、ＤＡＰ１０の生物学的活性のインヒビターである。１つの実施形態において、上記腫瘍の増殖速度は、腫瘍の大きさの測定によって決定される。代表的に、上記腫瘍のサイズは、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上減少する。転移の範囲は、相対的な播種（例えば、病変した器官系の数）およびこれらの部位における相対的な腫瘍組織量を試験することによって評価され得る。腫瘍転移は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上減少し得る。いくつかの実施形態において、上記化合物は、ＤＡＰ１０の生物学的活性に影響しない他の化合物と比較して評価され得る。
【００６６】
１つの実施形態において、ＲＮＡｉを媒介する化合物は、ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害するために使用され得る。上で考察されるように、ＲＮＡ干渉は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用してｄｓＲＮＡと同じ配列を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解する転写後の、標的性の遺伝子サイレンシング技術である。上記プロセスは、内因性リボヌクレアーゼが、より長いｄｓＲＮＡをより短い２１ヌクレオチド長または２２ヌクレオチド長のＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡと称される）へと切断する場合に生じる。次いで、より小さいＲＮＡセグメントは、標的ｍＲＮＡの分解を媒介する。ＲＮＡｉの合成のためのキットは、市販されている。
【００６７】
別の実施形態において、ＤＡＰ１０の阻害または抑制を媒介する化合物は、ＤＡＰ１０特異的抗体または上に記載されるようなその生物学的に活性なフラグメントである。なお別の実施形態において、上記化合物は、上に記載されるようなＤＡＰ１０膜貫通フラグメントである。
【００６８】
ａ）ＤＡＰ１０−／−マウスにおいて実験的自己免疫疾患を誘導する工程、ｂ）試験化合物を上記ＤＡＰ１０−／−に投与する工程；ｃ）少なくとも１つの自己免疫疾患の指標を評価する工程、およびｄ）試験化合物を、上記試験化合物が上記疾患の指標を減少させるか、または排除する場合に、上記自己免疫疾患を弱めるか、または改善する化合物として同定する工程を包含する、自己免疫疾患を弱めるか、または改善する化合物を同定するための方法が、本明細書中で特徴付けられる。
【００６９】
実施例の節において下に記載される通り、上記ＤＡＰ１０−／−マウスは、自己抗原を用いてチャレンジされる場合、自己免疫疾患に対する著しい感受性を提示する。他の実験的な自己免疫系がまた、上記ＤＡＰ１０−／−マウスを用いて利用され得る。いくつかの実施形態において、上記実験的自己免疫疾患は、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、コラーゲン誘導性関節炎、実験的自己免疫心筋炎、実験的自己免疫卵巣炎、または実験的自己免疫精巣炎である。例えば、種々の実験的疾患モデルの概説については、Ｌａｈｉｔａら（編）、ＴＥＸＴＢＯＯＫ ＯＦ ＴＨＥ ＡＵＴＯＩＭＭＵＮＥ ＤＩＳＥＡＳＥＳ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、およびＷｉｌｋｉｎｓ ２０００）の７５３〜８４１ページを参照のこと。これらの動物モデルの各々は、少なくとも１つの臨床的に関連のある自己免疫疾患を例示し、それによって、自己免疫疾患の１つ以上の症状を緩和し得るか、または改善し得るスクリーニング化合物に適したモデルを提供する。
【００７０】
実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、ヒトの多発性硬化症（ＭＳ）に対する動物モデルである。ＥＡＥは、ＭＳと同じ臨床症状および病理学的症状の多くを共有する、実験的に誘導された疾患である。例えば、Ｍａｒｔｉｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１５３−８７（１９９２）を参照のこと。ＥＡＥは、アジュバント中のミエリンを用いた免疫によって、マウスの特定の系統において誘導され得る。上記免疫は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびプロテオリピド（ＰＬＰ）に特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞を活性化する。次いで、活性化されたＴ細胞は、中枢神経系に進入し、そして上記疾患の特徴的な解剖病理学、および顕性の「臨床的」徴候（例えば、完全麻痺を生じる後足の上行性不全麻痺）をもたらす。ＥＡＥの臨床的徴候は、症状の上行性の重症度の０〜５の尺度に基づいて評価され得る。例えば、Ｋｏｒｎｇｏｌｄら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４：３０９−１５（１９８６）；Ｃｕａら、Ｎａｔｕｒｅ ４２１：７４４（２００３）を参照のこと。
【００７１】
したがって、化合物が、少なくとも１つの自己免疫症状の範囲を、その化合物の非存在下において観察されるものと比較して減少させる場合、その化合物は、ＤＡＰ１０の生物学的活性のインヒビターである。１つの実施形態において、上記化合物は、少なくとも１つの自己免疫症状の範囲を０％まで減少させ、完全な保護を提供する。同様に、化合物が、観察される自己免疫症状の重症度を、その化合物の非存在下（または、ＤＡＰ１０をモジュレートしない化合物の存在下）において観察されるものと比較して減少させる場合、その化合物は、ＤＡＰ１０の生物学的活性のインヒビターである。代表的に、上記症状の重症度は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上減少する。
【００７２】
（Ｄ．ＤＡＰ１０抑制因子を使用する処置の方法）
癌を予防するか、または処置する方法であって、その必要がある被験体に、ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害するか、または抑制する因子の有効量を投与する工程を包含する方法が、本明細書中で特徴付けられる。いくつかの実施形態において、上記癌は、皮膚癌である。特定の実施形態において、上記癌は、化学的に誘導される。
【００７３】
本発明の方法によって処置される被験体としては、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、肉腫、または奇形癌を有する被験体が挙げられる。上記腫瘍は、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚、胆嚢、神経節、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌であり得る。このような腫瘍としては、以下が挙げられる：中枢神経系の新生物：多形グリア芽細胞腫、星状細胞腫、乏突起神経膠細胞の腫瘍、上衣および脈絡叢の腫瘍、松果体の腫瘍、神経の腫瘍、髄芽細胞腫、神経鞘腫、髄膜腫、髄膜の肉腫：眼の新生物： 基底細胞癌、有棘細胞癌、黒色腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫；内分泌腺の新生物：下垂体の新生物、甲状腺の新生物、副腎皮質の新生物、神経内分泌系の新生物、胃腸膵臓（ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｐａｎｃｒｅａｔｉｃ）の内分泌系の新生物、性腺の新生物；頭および首の新生物：頭および首の癌、口腔の腫瘍、咽頭の腫瘍、喉頭の腫瘍、歯原性腫瘍：胸郭の新生物：大細胞肺癌、小細胞肺癌、非小細胞細胞肺癌、胸郭の新生物、悪性中皮腫、胸腺腫、胸郭の原発性生殖細胞腫瘍；消化管の新生物：食道の新生物、胃の新生物、肝臓の新生物、胆嚢の新生物、膵臓外分泌部の新生物、小腸、虫垂および腹膜の新生物、結腸および直腸の腺癌、肛門の新生物；尿生殖器路（ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎａｒｙ ｔｒａｃｔ）の新生物：腎細胞癌、腎盂および尿管の新生物、膀胱の新生物、尿道の新生物、前立腺の新生物、陰茎の新生物、精巣の新生物；女性の生殖器官の新生物：外陰および膣の新生物、子宮頚の新生物、子宮体の腺癌、卵巣癌、婦人科学的な肉腫；乳房の新生物；皮膚の新生物：基底細胞癌、扁平上皮癌、皮膚線維肉腫、メルケル細胞腫；悪性黒色腫；骨および軟部組織の新生物：骨原性肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、血管肉腫；造血系の新生物：骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、ＨＴＬＶ−１、およびＴ−細胞白血病／リンパ腫、慢性リンパ性白血病、へアリーセル白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、肥満細胞性白血病；小児の新生物：急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄球性白血病、神経芽細胞腫、骨腫瘍、横紋筋肉腫、リンパ腫、腎腫瘍および肝腫瘍。
【００７４】
本方法によって同定される有効な化合物を投与する工程を包含する、自己免疫疾患を予防するか、または処置する方法が、本明細書中でさらに特徴付けられる。本発明に従って処置され得る自己免疫成分を有する自己免疫疾患および自己免疫障害の非限定的な例としては、以下が挙げられる：１型糖尿病、関節炎（慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群（シェーグレン症候群に対する二次的な乾性角結膜炎を含む）、円形脱毛症、虫刺され（ａｒｔｈｒｏｐｏｄ ｂｉｔｅ）の反応に起因するに起因するアレルギー応答、クローン病、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸結腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、薬疹、らい病の反転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳障害、特発性両側性の進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーヴンズ−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーブス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、および間質性肺線維症（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｌｕｎｇ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）。
【００７５】
任意の被験体が、本明細書中に提供される方法および組成物によって処置され得る。このような被験体は、このような処置の必要がある哺乳動物（好ましくは、ヒト）である。本開示の方法および組成物の獣医学的使用がまた、企図される。このような使用は、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）、家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）および純血種の馬（ｔｈｏｒｏｕｇｈｂｒｅｄ ｈｏｒｓｅ）における発癌の予防、癌の処置、ならびに自己免疫疾患の予防および処置を含む。
【００７６】
薬学的組成物および薬学的技術の調製ならびに使用のための種々の薬学的組成物および薬学的技術は、本開示を鑑みて当業者に公知である。適切な薬理学的組成物および関連した投与上の技術の詳細な記載については、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ、第２０版（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ ２００３）などの教科書によってさらに補足され得る本明細書中の詳細な教示を参照し得る。
【００７７】
処方物および送達方法は、一般に、処置されるべき部位および疾患に従って適合される。例示の処方物としては、ミセル、リポソームまたは薬物放出カプセル中に封入される処方物（徐放用に設計された生体適合性コーティング内に組み込まれる活性因子）を含む、非経口投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、または皮下投与）に適した処方物、；経口摂取用処方物；局所使用のための処方物（例えばクリーム、軟膏およびゲル）；および他の処方物（例えば、吸入剤、エアロゾルまたはスプレー）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の化合物の投薬量は、処置についての必要性の程度および重症度、投与される組成物の活性、被験体の健康全般、ならびに当業者にとって周知である他の考慮事項によって変動する。
【００７８】
このような化合物の毒性および治療的効力は、細胞培養物または実験動物において、標準的な薬学的手順によって決定され得る（例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するため）。毒性効果と治療効果との間の用量比が、治療指数であり、そしてその治療指数は、ＬＤ５０とＥＤ５０との間の比として表され得る。高い治療指数を示す化合物が、好ましい。これらの細胞培養物アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための投薬量の範囲を処方するのに使用され得る。このような化合物の投薬量は、好ましくは、ほとんどもしくは全く毒性を伴わずに、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。上記投薬量は、使用される投薬形態および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変動し得る。的確な処方、投与経路および投薬量は、患者の状態、年齢、体重、および治療に対する反応性を考慮して個々の医師によって選択され得る。投薬の量および間隔は、所望の治療効果、または最小有効濃度（ＭＥＣ）を維持するのに十分な活性部分の血漿レベルを提供するために、個別に調整され得る。ＭＥＣは、各化合物に対して変動するが、それは、インビトロのデータから概算され得る；例えば、本明細書中に記載されるアッセイを使用してＤＡＰ１０の生物学的活性の５０％〜９０％の阻害を達成するのに必要な濃度。
【００７９】
投与の様式は、特に重要ではない。１つの実施形態において、投与の様式は、Ｉ．Ｖ．ボーラスである。別の実施形態において、投与は、局所的である。あるいは、上記化合物を、全身的な様式よりもむしろ、局所において投与し得る（例えば、しばしば、デポー処方物または持続放出処方物で上記化合物を腫瘍または自己免疫病変に直接注射することによって）。
【００８０】
本発明の調節性因子は、単独か、または１種以上のさらなる因子と組み合わせて投与され得る。例えば、１つの実施形態において、本明細書中に記載される２種以上の因子が、被験体に投与され得る。別の実施形態において、本明細書中に記載される因子は、他の免疫調節因子と組み合わせて投与され得る。他の免疫調節試薬の例としては、共起刺激シグナルをブロックする抗体（例えば、ＣＤ２８、ＩＣＯＳに対する抗体）、ＣＴＬＡ４を介して抑制性シグナルを活性化する抗体、および／または他の免疫細胞マーカーに対する抗体（例えば、ＣＤ４０に対する抗体、ＣＤ４０リガンドに対する抗体、またはサイトカインに対する抗体）、融合タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ、ＰＤ−Ｉ−Ｆｃ）、および免疫抑制薬（例えば、ラパマイシン、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６）が挙げられる。特定の場合において、免疫応答を誘発するか、または増大するために、免疫応答をアップレギュレートする他の因子（例えば、Ｔ細胞活性化シグナルを送達する因子）をさらに投与することが、望まれ得る。このような因子としては、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）の同時投与が挙げられるが、これに限定されない。
【００８１】
本明細書中に記載される因子は、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、代表的に、上記因子、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、専門語「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤など（これらは、薬学的投与に適合性である）を含むことを意図する。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および因子の使用は、当該分野において周知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ 第２０版（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ ２００３）を参照のこと。任意の従来の媒体および因子が、活性化合物と不適合性である場合を除いて、上記組成物におけるその使用が、企図される。追加の活性化合物がまた、上記組成物に組み込まれ得る。
【実施例】
【００８２】
ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０レセプター複合体およびそのリガンドの発現パターンは、それらが生理学的条件および病理学的条件下で異なる役割を果たし得ることを示唆する。この研究において、ＤＡＰ１０ＫＯマウスの産出を、腫瘍免疫におけるＤＡＰ１０の重要性を調査するために使用する。ＤＡＰ１０欠損が、Ｔｒｅｇの調節性機能およびＮＫ１．１＋細胞の抗腫瘍エフェクター機能に影響を与えることによって抗腫瘍免疫を増強することが、予想外にも、観察された。
【００８３】
同系の腫瘍に対する効率的な免疫監視は、しばしば、Ｔ調節性（Ｔｒｅｇ）細胞の損なわれた機能に起因して、自己に対する反応性の増加と関連する。本明細書中に含まれるデータは、構成的なＤＡＰ１０共起刺激シグナル伝達が、腫瘍に対する免疫を制御する調節機構の一部であることを示した。ＤＡＰ１０を欠くマウス（ＤＡＰ１０ＫＯ）は、化学的に誘導された皮膚の癌腫および黒色腫の肺への転移に対して増強された免疫応答を示し、それは、遅延した腫瘍増殖および減少した腫瘍の範囲、およびマウスの、腫瘍悪性度からの長期の保護をもたらした。ＤＡＰ１０ＫＯナチュラルキラーＴリンパ球（ＮＫＴ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、この抗腫瘍表現型を担うエフェクターであった。ＤＡＰ１０欠損は、Ｔｒｅｇの抑制的な能力を弱め、そして増加したＮＫＴ機能（サイトカイン産生および細胞傷害を含む）をもたらし、腫瘍の効率的な殺傷を生じた。ＤＡＰ１０ＫＯマウスにおける野生型Ｔｒｅｇの養子移植は、同系の腫瘍に対する耐性を回復させ、このことは、ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇがインビボで機能不全性であることを示した。さらに、ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔ細胞は、増加した自己反応性を示し、それによってＤＡＰ１０ＫＯマウスを、誘導された自己免疫応答に対して、より感受性にした。このデータは、ＤＡＰ１０構成的シグナル伝達が自己反応性を回避するためのＴｒｅｇおよびＮＫＴの活性化の閾値の調整に重要であるが、また、抗腫瘍機構をモジュレートすることを示した
（材料および方法）
ＤＡＰ１０欠損マウスの産出。マウスＤＡＰ１０ゲノムの遺伝子座を、１２９／ＳＶ肝臓ＤＮＡから作製したＬａｍｂｄａライブラリーに対する放射標識型のハイブリダイゼーションによって同定した。１つのＬａｍｂｄａクローンを、単離し、次いでサブクローニングし、そしてその遺伝子座のさらなる特徴付けのために配列決定した。エキソン３およびエキソン４は、シグナル伝達および細胞表面におけるＤＡＰ１０タンパク質の発現に重要である。エキソン３は、膜貫通領域をコードし、そしてエキソン４は、ＤＡＰ１０の細胞質ドメインをコードする。従来の置換型標的化ベクターを、５．４ｋｂの相同性配列を組み込みつつ、両方のエキソンについての配列を除去するように設計した。胚性幹（ＥＳ）細胞を、直線化したＤＡＰ１０標的化ベクターと一緒にエレクトロポレーションした。適切にトランスフェクトされたＥＳクローンを、ネオマイシンカセットの除去後の注射のために使用した。上記ＥＳクローンを、サザンブロット分析によってスクリーニングした。使用したプローブは、以下のものである：５’フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）センス−ＤＡＰ１０プローブ、５’−ＣＣＡＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＡＡＣＴＡＴＧＴＡＧ−３’；５’フランキングアンチセンス−ＤＡＰ１０プローブ、５−ＣＴＧＴＧＡＧＴＴＣＡＡＧＧＣＴＡＧＣＣＴＧＧ−３’；３’フランキングセンス−ＤＡＰ１０プローブ、５’−ＣＴＡＧＡＧＧＡＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＣ−３’；フランキングアンチセンス−ＤＡＰ１０プローブ、５’−ＧＣＴＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＣＣＴＧＧＴ−３’。全ての実験マウス（ＤＡＰ１０ＫＯマウスおよびコントロールＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｘｏｎ））を、６〜１０週齢にて使用し、かつ性別および歳を対応させた。マウスを、病原体を含まない動物施設において飼育した。この研究において使用される全ての動物手順は、ＤＮＡＸ ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【００８４】
インビボ腫瘍モデル。先に記載されるように（２０）、皮膚の腫瘍形成を誘導するために、ｗｔ Ｃ５７ＢＬ６マウスおよびＤＡＰ１０ＫＯ Ｃ５７ＢＬ６マウスを、７，１２ジメチルベンズアントラセン（ＤＭＢＡ、Ｓｉｇｍａ）の単一局所用量によって処置し、２００μｌアセトン中の５０μｇのＤＭＢＡを、各マウスの剃毛（ｓｈａｖｅ）した皮膚に塗布した。発癌のイニシエーションの１週間後、２００μｌアセトン中の３０μｇの１２−Ｏ−テトラデカノイル−ホルボールアセテート（ＴＰＡ、Ｓｉｇｍａ）を、各マウスの上記皮膚に塗布した。次いで上記ＴＰＡを、２０週間にわたって週に２回塗布した。腫瘍を、癌腫の病期に進行させ、そしてマウスの成育率を、１年間分析した。乳頭腫または癌腫の腫瘍を、臨床的判定基準および組織学的特徴に基づいて評点した。移植実験のために、化学的に誘導した皮膚の腫瘍細胞（ＤＭＢＡ−Ｔ）を、組織培養条件に適応し、次いでマウスに種々の濃度にてｓ．ｃ．に注射した。皮下の腫瘍の寸法を、キャリパーを使用して２〜３日毎に測定した。上記腫瘍の体積を、以下の式を使用して決定した：長さ×幅×幅／２。群間の統計学的な差を、２つの群を分析する場合に、対応のないスチューデント両側ｔ検定を使用することによって評価し、そして２つより多い群に対しては、二元配置ＡＮＯＶＡを使用することによって評価した。
【００８５】
Ｂ１６の肺への転移の誘導のために、Ｂ１６黒色腫細胞（ＡＴＣＣ）を、対数増殖期（≦５０％の密集度）のときに、注射のために回収した。単一細胞懸濁物を、細胞解離溶液（Ｇｉｂｃｏ）を使用して調製し、次いで使い捨てのセルストレーナー（ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）によって可能な集塊の除去を行なった。ｗｔ Ｃ５７ＢＬ６マウスおよびＤＡＰ１０ＫＯ Ｃ５７ＢＬ６マウスに、１×１０５個のＢ１６細胞をｉ．ｖ．に注射したか、または図面の簡単な説明において示される通りに注射し、次いで肺を、腫瘍の接種の２週間後に取り出し、そして転移を、解剖顕微鏡を使用して計測した。ＮＫ１．１＋細胞のインビボでの枯渇のために、マウスに、−１日目においてマウス１匹あたり０．５ｍｇにて、抗ＮＫ１．１ ｍＡｂクローンＰＫ１３６（ＡＴＣＣ）をｉ．ｖ．に注射し、その後、３日毎にそれを注射した。マウスＩｇＧ１κアイソタイプコントロール抗体を、コントロール群に注射するために使用した。Ｔｒｅｇ細胞のインビボでの枯渇のために、抗ＣＤ２５ ｍＡｂクローンＰＣ−６１（ＡＴＣＣ）を、示した日において、マウス１匹あたり０．５ｍｇにてｉ．ｖ．に注射した（図面の簡単な説明を参照のこと）。ＮＫ細胞のインビボでの枯渇のために、マウスに、−２日目にて３０μｌの抗アシアロＧＭ１ Ａｂ（Ｃｅｄｅｒｌａｎｅ）をｉ．ｖ．に注射し、その後、４日毎にそれを注射した。インビボ研究のために使用した全ての抗体は、内毒素を含まなかった。インビボでの枯渇の効率を、脾臓の白血球のＦＡＣ分析によって検証した。
【００８６】
骨髄キメラの産出。レシピエントマウスを、１０００ｒａｄの１種の線量のγ線照射に曝した。ドナーマウスから単離した１．５×１０７個の骨髄細胞を、レシピエントマウスの尾静脈にｉ．ｖ．に送達した。再形成の６週間後および８週間後において、レシピエントマウスの末梢血細胞および脾臓細胞をフローサイトメトリーによって分析して、再形成のレベルを評価した。この実験に使用したｗｔマウスは、再形成の評価を容易にするＧＦＰポジティブであった（Ｄｒ．Ｂｒｉａｎ Ｓｃｈａｅｆｅｒによる寄贈品）。８週間において、９５％〜９８％のレシピエント細胞は、ドナーに由来した。骨髄キメラの成育率は、１００％であった。
【００８７】
Ｔａｑｍａｎ分析。ナイーブｗｔ Ｂ１／６マウスおよびＤＡＰ１０ＫＯマウスのリンパ節、脾臓ならびに胸腺を、Ｐｏｌｙｔｒｏｎを使用してＳＴＡＴ ６０試薬（Ｔｅｌ−ｔｅｓｔ Ｉｎｃ．）中でホモジネートした。全ＲＮＡを、クロロホルム抽出を行ない、次いでイソプロパノール沈殿を行うことによって単離した。５μｇの全ＲＮＡを、ＤＮＡｓｅミックス（５×ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、ＲＮＡｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＤＮＡｓｅ Ｉ、Ｒｎａｓｅ ｆｒｅｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））によって処理した。ｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによって調製した。リアルタイムの転写物の定量化のために、そのｃＤＮＡを、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）５７００配列検出器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）においてＴａｑＭａｎシステムの化学を使用する蛍光５’ヌクレアーゼアッセイに使用した。遺伝子特異的なＴａｑｍａｎ（登録商標）プライマー（Ｆ、Ｒ）を、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ．１．５．（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、以下に関して作製した（コントロールとしてユビキチンおよび１８Ｓ ｒＲＮＡ）：ｍｕＤＡＰ１０−ＣＣＧＧＡＴＧＴＧＧＧＡＣＴＣＴＧＴＣＴ；ＴＧＧＧＣＧＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＡＡＣＡＣ；ｍｕＤＡＰ１２−ＣＣＴＧＧＴＣＴＣＣＣＧＡＧＧＴＣＡＡ；ＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＧＣＡＡＴＧ，ｍｕＮＫＧ２Ｄ−ＴＴＣＧＴＴＧＴＴＣＧＡＧＴＣＣＴＴＧＣＴ；ＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＡＣＧＴＣＴＣＴＴＴＧＡＡ。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）反応は、２００ｎＭの各プライマー、１×ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）および１０ｎｇのｃＤＮＡを含んだ。ＩＦＮγおよびＦｏｘｐ３に対するプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＡＢＩ）を使用し、そして他のファミリーメンバーとの交差反応性を有さない配列を選択して設計した。リアルタイムＰＣＲは、それぞれ５０℃で２分間および９５℃で１０分間の１サイクル、その後の９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の５０サイクルから構成された。データ分析は、限界サイクルおよびＣｔを決定するために配列検出器ソフトウェア利用した。
【００８８】
インビトロ機能分析。ＮＫＴ細胞を、ＣＤ１９ ＭＡＣビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して先にＢ細胞を枯渇させた脾細胞から取り出した。取り出したＮＫＴ細胞の純度は、≧９５％であった。サイトカインアッセイのために、ＮＫＴ細胞を、１０％のＦＣＳ、１００ｍＭのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００μＭの非必須アミノ酸、５．５×１０５Ｍの２−ＭＥ、および２５ｍＭのＨｅｐｅｓを補充したＩｓｃｏｖｅｓ培地において、血小板結合性抗ＣＤ３ Ａｂ（１０μｇ／ｍｌ）またはラットＩｇＧ２ａアイソタイプコントロールによって活性化した。全ての培養試薬を、Ｇｉｂｃｏ製であった。上清を、４８時間後に回収し、そしてサイトカインを、測定した。
【００８９】
ＮＫ細胞を、抗ＮＫ細胞（ＤＸ５）ＭＡＣＳマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、Ｂ細胞枯渇脾細胞から単離した。使用する取り出した細胞の純度は、＞９５％であった。上記細胞傷害アッセイのために、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含む完全Ｉｓｃｏｖｅｓ培地中で拡大培養（ｅｘｐａｎｄ）した。標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを、先に記載されるように（１２）、種々のエフェクター対標的の比（Ｅ：Ｔ）にて行なった。
【００９０】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇを、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（＞９６％の純度）のＴｒｅｇ単離キットを使用して脾細胞から単離した。サイトカインアッセイのために、Ｔｒｅｇを、ＩＬ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、またはＩＬ−２および可溶性ＣＤ３ Ａｂ（１０ｕｇ／ｍｌ）の存在下で、ウェル１つあたり２×１０５個の細胞にて、４８時間にわたって培養した。上清を、回収し、そしてサイトカインを、測定した。
【００９１】
フローサイトメトリーおよびサイトカイン分析。フローサイトメトリー表現型分析（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）のために、マウス細胞を、最初に、抗ＣＤ １６／ＣＤ３２ Ａｂ（クローン２．４Ｇ２）と一緒にインキュベートして、Ｆｃの非特異的結合をブロックした。次いで、２色または３色の染色を、以下の染色試薬を使用して行なった：抗ＣＤ３ ＦＩＴＣ、抗ＣＤ３ Ｃｙ（クローン１７ Ａ２）、抗ＣＤ４ ＦＩＴＣ（クローンＧＫ１．５）、抗ＣＤ２５ ＰＥまたは抗ＣＤ２５ビオチンＡｂ（クローンＰＣ６１）、抗ＮＫ１．１ ＰＥ、抗ＮＫ１．１ビオチン、抗ＮＫ１．１ ＦＩＴＣ（クローンＰＫ１３６）およびストレプトアビジン−サイクローム（ｃｙｃｈｒｏｍｅ）（Ｃｙ）。全ての上記試薬は、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製であった。抗ＮＫＧ２Ｄ ＰＥ（クローンＣＸ５）は、Ｄｒ．Ｌｅｗｉｓ Ｌａｎｉｅｒの寛大な寄贈品であった。腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を、ＮＫＧ２Ｄ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ）によって細胞を染色し、次いで抗ヒト二次抗体によって染色することによって染色した。ＢＤマウスＴｈｌ／Ｔｈ２キットまたは炎症性キットを使用して、ＮＫＴ細胞またはＴｒｅｇ細胞によって産生されるサイトカインのレベルを測定した。サンプルを、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターにおいて分析した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＴＭおよびＢＤ ＣＢＡソフトウェアを使用して、獲得したデータを分析した。
【００９２】
ＤＴＨ応答の誘導。ＤＴＨ応答を誘導するために、マウスに、０日目において、１ｍｇの熱失活したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ａ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ）を含むＣＦＡ中に乳化した５０μｇのマウスのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ｍｙｅｌｉｎ ｏｌｉｇｏｄｅｎｔｒｏｃｙｔｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＯＧ）３５−５５ペプチドをｓ．ｃ．に注射した。１０日目において、マウスに、２５μｇのＭＯＧ３５−５５ペプチドを仰臥で左側の足蹠に対してｓ．ｃ．に注射し、そしてＰＢＳを右側の足蹠にｓ．ｃ．に注射した。右側および左側のフッドパッドの厚さを、キャリパー型の技術者用マイクロメータ（ｅｎｇｉｎｅｅｒ ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ）を使用して４８時間後に測定した。足蹠の腫脹を、左側の足蹠の厚さから右側の足蹠の厚さを減算することによって産出した。動物を、毎日観察し、そして神経学的効果を、任意の臨床スコアにおいて定量化した。ＥＡＥスコアリングを、以下の通りに行った：０．無し；１．完全にしなやかな尾；２．後足の脱力；３．右側の不能／片方の後足の不全麻痺（脱力）；４．右側の不能／片方の後足の完全麻痺；５．両側の後足の完全麻痺；６．瀕死。
【００９３】
増殖アッセイ。マウスに、ＣＦＡ Ｈ３７Ａ中に乳化した５０μｇのＭＯＧ３５−５５をｓ．ｃ．で免疫した。リンパ節（上腕、腋窩、鼡径）を、９日後に回収し、そして単一細胞懸濁物を、調製した。リンパ節細胞を、ＭＯＧ３５−５５ペプチドの異なる濃度を用いて、９６ウェルプレート中で５×１０５個の細胞／ウェルにて７２時間にわたって培養した。培養上清中のＩＦＮ−γの量を、捕捉用の抗ＩＦＮ−γ Ｒ４６Ａ２ ｍＡｂおよび検出用のＡＮ１８−ビオチン ｍＡｂを使用したＥＬＩＳＡによって測定した。Ｔ細胞増殖性の応答を評価するために、培養物を、４８時間にて、１μＣｉ／ウェル［３Ｈ］−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてパルスし、そしてその２４時間後に回収した。チミジンの取り込みを、β−シンチレーションカウンターにおいて測定した。
【００９４】
（結果）
ＤＡＰ１０ＫＯマウスの産出。マウスＤＡＰ１０遺伝子は、染色体７Ａ３に位置する（ＤＡＰ１２遺伝子に隣接し、かつＤＡＰ１２遺伝子と反対の転写方向）。ＤＡＰ１０−欠損マウスを産出するために、ＤＡＰ１０ゲノムの遺伝子座を、１２９／Ｓｖ肝臓ＤＮＡから作製されたラムダライブラリーに放射標識したハイブリダイゼーションによって同定した。ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２の両方に対する遺伝子座を含む１つのラムダクローンを、単離した。ＤＡＰ１０遺伝子を破壊するために、機能性ＤＡＰ１０タンパク質に重要であるエキソン３およびエキソン４を、Ｂｒｕｃｅ ４ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ胚性幹細胞（図１Ａ）において、除去し、そしてネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏｒ）によって置換した。次いで適切に標的化したＥＳクローンを、ＣＲＥリコンビナーゼ発現ベクターによってトランスフェクトして、ｎｅｏｒカセットを除去した。サザンブロット分析により、ＤＡＰ１０遺伝子の正しい標的化を確認した（図１Ｂ）。ＥＳ細胞を、マウス未分化胚芽細胞に注射して、次いでホモ接合動物を得るために異種交配されるキメラマウスを産出した。ＤＡＰ１０ＫＯマウスは、組織学によって評価したところ、一般的に正常な器官形成を有するようであった。しかし、ＤＡＰ１０ＫＯ脾臓がｗｔの脾臓に対して増加した重量を有し、そしてこの差が、アジュバントおよび自己ペプチド（データは示さず）によって免疫されたマウスにおいてさらに顕著であることが、観察された。これは、ＤＡＰ１０ＫＯマウスが超免疫であり得ることを示唆する、最初の徴候であった。ＤＡＰ１０欠損は、ナイーブなマウスから単離したリンパ組織のＴａｑｍａｎ分析によって評価したところ、ｍＲＮＡレベルにてＤＡＰ１２遺伝子またはＮＫＧ２Ｄ遺伝子の基本的な発現に影響を及ぼさなかった（図１Ｃ）。次に、通常、ＤＡＰ１０との関連を必要とする細胞表面におけるＮＫＧ２Ｄタンパク質の発現を、分析した。図１Ｄは、ＮＫＧ２Ｄタンパク質の構成的な発現がＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫ１．１＋脾細胞において損なわれたことを示す。しかし、ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫ１．１＋脾細胞は、３日間にわたってＩＬ−２を用いる活性化の際に、ＮＫＧ２Ｄの有意なレベルを表し得る（図１Ｄ）。最近報告されたように（１０）、ＤＡＰ１２と対になる短いＮＫＧ２Ｄアイソフォームは、活性化されたＤＡＰ１０ＫＯ脾細胞において、機能的な表面レセプターとして発現され得る。
【００９５】
ＤＡＰ１０欠損は、化学的に誘導された皮膚の腫瘍形成に対する保護を提供し、そしてＮＫ１．１＋細胞は、抗腫瘍効果を担う。腫瘍形成の間の免疫監視におけるＤＡＰ１０の役割を研究するために、本発明者らは、化学的に誘導された皮膚の腫瘍モデルを使用した。マウスを、発癌をイニシエートするために、ＤＭＢＡの単一用量を用いて局所的に処置し、次いで異常な皮膚細胞の増殖を促進するためにＴＰＡを用いて処置した。ＴＰＡ処置を４ヶ月間行なって腫瘍を乳頭腫から癌腫まで進行させた。予想通り、ｗｔマウスは、大きさが成長し、そして進行性に悪性の癌腫になった多数の乳頭腫を発症した（図２）。それとは反対に、ＤＡＰ１０ＫＯマウスは、癌腫の病期に進行しなかった、有意に少ない乳頭腫型の腫瘍を発症した（図２）。発癌のイニシエーションの１年後、６５％のｗｔマウスが、皮膚の悪性の癌腫によって死亡したのに対して、ＤＡＰ１０ＫＯマウスは健康であり、そして皮膚の悪性の変態から保護された。したがって、予想外にも、ＤＡＰ１０欠損は、化学的に誘導された皮膚の悪性疾患に対して保護を与えた。
【００９６】
化学的に誘導された皮膚の腫瘍モデルは、長期のインビボ枯渇研究において取り扱うことが困難なので、インビトロで安定に適応されるＤＭＢＡ誘導性の癌腫細胞株（ＤＭＢＡ−Ｔ）を使用する皮膚の腫瘍移植モデルを、ＤＡＰ１０ＫＯの抗腫瘍応答に関与する細胞機構の分析を可能にするために利用した。腫瘍形成データと一致して、ＤＡＰ１０ＫＯマウスに対するｗｔ癌腫細胞の皮下接種は、ｗｔマウスへの移植と比較した場合に、顕著に遅延した腫瘍増殖を生じた（図３Ａ）。ＮＫ１．１＋細胞がＤＡＰ１０ＫＯマウスの抗腫瘍活性に関与したか否かを決定するために、マウスを抗ＮＫ１．１ Ａｂ（ＰＫ１３６）によって処置して、マウスにおいて、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の両方を含むＮＫ１．１＋細胞を枯渇させた。ＮＫ１．１＋細胞を枯渇させたマウスに対するＤＭＢＡ−Ｔ細胞の皮下移植は、ｗｔ動物およびＤＡＰ１０ＫＯ動物において、同様の腫瘍増殖を生じた（図３Ｂ）。これらのインビボでの枯渇の結果は、ＮＫ１．１＋細胞がＤＡＰ１０ＫＯの抗腫瘍効果において主要な役割を果たすことを明確に示唆した。ＮＫ１．１の枯渇が、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の両方を取り除いたので、次いで、抗アシアロＧＭ１ Ａｂを用いた処置によってＮＫ細胞のみが枯渇したマウスにおける腫瘍発生を、分析した。図３Ｃに示すように、抗アシアロＧＭ１ ＡｂによるＤＡＰ１０ＫＯマウスの処置は、癌腫の腫瘍に対するそれらの感受性を回復させた。これらの知見は、ＮＫ細胞が、ＤＡＰ１０ＫＯマウスにおいて移植された皮膚の癌腫の遅延した増殖を担う、一次エフェクターであることを示した。
【００９７】
ＤＭＢＡ−Ｔ癌腫細胞は、低レベルのＮＫＧ２Ｄリガンドを発現したが、ｗｔマウスにおいて有効な抗腫瘍応答を誘発できなかった（図４Ａ）。枯渇実験によって得られたデータを確認するために、ｗｔ細胞ならびにＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫ細胞およびＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫ１．１＋細胞の、インビトロでＤＭＢＡ−Ｔ癌腫細胞を殺す能力を試験した。興味深いことに、活性化されたＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫ１．１＋細胞は、ｗｔ細胞よりＤＭＢＡ−Ｔ癌腫細胞に対して、実質的に細胞溶解活性を示し、そしてこの活性は、主にＮＫＧ２Ｄ非依存性であった（図４Ｂ）。ｗｔ細胞およびＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫ細胞は、同様の効率でＤＭＢＡ−Ｔ癌腫細胞を殺すようであり、そしてそれらの細胞傷害は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体によって部分的に損なわれた（図４Ｃ）。上記インビボ実験は、ＤＡＰ１０ＫＯにおいてＮＫ細胞が抗腫瘍活性を主に担うことを、強力に示唆したが、強力な抗ＤＭＢＡ−Ｔ細胞細胞傷害のインビトロでの発生は、明確に、ＮＫＴ細胞も伴う。
【００９８】
ＤＡＰ１０欠損は、皮膚の転移に対する保護を与え、そしてＮＫＴ細胞は、抗腫瘍表現型を担う最終的なエフェクターであった。ＤＡＰ１０ＫＯマウスの抗腫瘍活性をさらに細かく区別するために、上記Ｂ１６黒色腫転移モデルを、利用した。肺への転移を誘導するために、Ｂ１６細胞を、ｗｔマウスおよびＤＡＰ１０ＫＯマウスに、種々の濃度にてｉ．ｖ．に注射し、２週間後に、肺を取り出し、そして転移性のコロニーについて分析した。図５に示すように、１×１０５個のＢ１６細胞を注射したＤＡＰ１０ＫＯマウスは、動物より３〜５倍低い肺への転移を発症した。１×１０４個のＢ１６細胞を注射したＤＡＰ１０ＫＯマウスは、黒色腫の転移から完全に保護された。ＤＡＰ１０ＫＯマウスにおける抗腫瘍活性の造血の起源を調査するために、骨髄キメラを、確立した。ｗｔ骨髄細胞によって再構成したＤＡＰ１０ＫＯマウスは、ｗｔ動物と同様の頻度で、Ｂ１６の転移を発症した（図６Ａ）。対照的に、ＤＡＰ１０ＫＯ骨髄細胞によるｗｔマウスの再構成は、ＤＡＰ１０ＫＯ動物において観察された抵抗性に匹敵する、転移に対する抵抗性をもたらした（図６Ａ）。これらの結果は、造血細胞がＤＡＰ１０ＫＯの抗腫瘍活性を担うことを、明確に示した。
【００９９】
インビボ枯渇研究を、Ｂ１６の転移に対するＤＡＰ１０ＫＯの増強した抗腫瘍活性におけるこれらの細胞の関与を示すために行った。ｗｔ動物からのＮＫ１．１＋細胞（ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞）の枯渇は、未処置のｗｔ動物と比較した場合、肺へのＢ１６の転移の、小さいが有意な増加を生じた（図６Ｂ）。さらに、抗ＮＫ１．１ Ａｂによって処置したｗｔマウスは、肺以外の器官（例えば、肝臓、皮膚、腹部、および胸腔）に、Ｂ１６の転移を与え、このことは、ｗｔ動物中のＮＫ１．１＋細胞が、Ｂ１６黒色腫の転移からの小さい程度の保護を提供したことを示した。興味深いことに、ＤＡＰ１０ＫＯマウスからのＮＫ１．１＋細胞の枯渇は、ｗｔ動物と等しいＢ１６の転移を示す肺と共に、抗腫瘍活性の完全な喪失を生じた。
【０１００】
インビボでのＮＫ細胞の機能とＮＫＴ細胞の機能とを区別するために、マウスを、選択的にＮＫ細胞を枯渇させるために抗アシアロＧＭ１抗体によって処置した。ＮＫ１．１の枯渇とは対照的に、ＤＡＰ１０ＫＯマウスからのＮＫ細胞のみの除去は、本質的に、ＤＡＰ１０ＫＯマウスの抗腫瘍活性に対して効果を有さなかった（図６Ｃ）。これらの結果は、ＮＫＴ細胞が、ＤＡＰ１０ＫＯマウスにおけるＢ１６黒色腫の転移に対する防御を担う主要なエフェクター集団であること示唆した。
【０１０１】
ＤＡＰ１０欠損は、ＮＫＴ細胞の機能亢進をもたらした。フローサイトメトリー分析は、脾臓のＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞の減少した頻度を示した（図７Ａ）。ＮＫＴのインビボでの活性化は、末梢リンパ器官からのそれらの迅速な枯渇、その後の骨髄由来細胞からの増殖および再生（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に関連することが報告されている（２３）。この知見に基づいて、本発明者らは、ＢｒｄＵ取り込みを測定することによって、ｗｔマウスおよびＤＡＰ１０ＫＯマウスにおける脾臓のＮＫＴ細胞ならびに骨髄のＮＫＴ細胞における増殖速度を分析した。図７Ｂに示すように、ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞は、ｗｔ細胞と比較して、有意に増加した増殖の％を有し、このことは、それらが構成的に機能亢進性であることを示唆した。ＤＡＰ１０欠損が、ＮＫＴ細胞の機能に影響したか否かを決定するために、ｗｔ細胞およびＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞の、サイトカインを産生する能力および腫瘍細胞を殺す能力を、試験した。ＮＫＴ細胞を、わずかにＮＫＴ細胞を活性化し得る抗ＣＤ３ Ａｂを使用して精製したので、休止ＮＫＴ細胞の機能を、正確に評価することができなかった。図７Ｃに示すように、ＩｇＧアイソタイプコントロール抗体（「休止」）と一緒に培養されたＮＫＴ細胞は、低レベルのサイトカインを産生し、したがって活性化されなかったと見なされた。血小板結合性抗ＣＤ３ Ａｂを有するＮＫＴ細胞は、ＩＬ−４、ＩＦＮγ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２を含む全てのＮＫＴ特徴的なサイトカインの産生を誘導した（図７Ｃ）。興味深いことに、活性化されなかったＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞および活性化されたＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞の両方は、ｗｔ細胞と比較した場合、有意により高い量のサイトカインを産生した。
【０１０２】
ＩＬ−２に活性化されたＮＫＴ細胞の、ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する腫瘍またはＮＫＧ２Ｄリガンドを発現しない腫瘍を殺す細胞傷害能力もまた、試験した。ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞は、ｗｔ ＮＫＴ細胞と比較した場合、ＮＫＧ２Ｄ リガンド発現ＹＡＣ−１腫瘍細胞をより低い効率で殺し、そして抗ＮＫＧ２Ｄ Ａｂは、部分的に、両方の場合において、その殺傷を阻害した（図８Ａ）。これらの結果は、活性化されたＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞が、部分的に機能性のＮＫＧ２Ｄレセプターを発現するが、ＮＫＧ２Ｄについての発現レベルは、ｗｔ細胞と比較して非常に低かったことを示唆した（図８Ｂ）。興味深いことに、Ｂ１６黒色腫細胞は、ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞によって効率的に殺されたが、ｗｔ細胞によっては効率的に殺されず、そしてこの細胞傷害は、抗ＮＫＧ２Ｄ Ａｂによって著しく影響されなかった（図８Ａ）。これらの結果は、インビボのデータと一致し、そしてＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞が、これらの同系の腫瘍細胞を効率的に殺すようにプログラムされたことを示した。
【０１０３】
ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇは、機能不全性であった。ＤＡＰ１０欠損マウスがより良好な抗腫瘍応答を開始することを可能にする機構的な経路を理解するために、ＮＫ１．１＋細胞の内在性の特性に対するＤＡＰ１０欠損の効果、またはそれらの機能を制御する免疫環境を、決定した。ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇ細胞が枯渇したマウスにおける皮下のＤＭＢＡ−Ｔ腫瘍増殖を、分析した。インビボ抗ＣＤ２５ Ａｂ処置によってＴｒｅｇが枯渇したｗｔマウスは、顕著に、遅延しかつ減少した皮膚の癌腫増殖を示し、さらに、未処置のＤＡＰ１０ＫＯマウスにおいて観察されたものに類似した（図９Ａ、図９Ｂ）。ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇ細胞が枯渇したＤＡＰ１０ＫＯマウスは、完全に腫瘍を有さず、このことは、ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇが、ある程度抑制性の活性を有することを示した。これらの増強した抗腫瘍活性はまた、Ｂ１６黒色腫の転移モデルにおいて観察され、Ｔｒｅｇの枯渇が、肺への転移をブロックした（図９Ｂ）。興味深いことに、Ｔｒｅｇ枯渇マウスから単離したｗｔ ＮＫＴ細胞は、ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞によって媒介される細胞傷害に匹敵する、Ｂ１６黒色腫細胞およびＤＭＢＡ−Ｔ癌腫細胞の強力なインビトロでの細胞溶解が可能であった（図９Ｃ）。
【０１０４】
マウスおよびＤＡＰ１０ＫＯマウスに由来する脾細胞の表現型の分析は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇの等しい％を示した（図１０Ａ）。しかし、ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇは、低い表面密度のＣＤ２５を有する、より高い比率のＴｒｅｇを示した。ＣＤ２５は、ＩＬ−２レセプターの重要な成分であり、そしてＩＬ−２の活性化は、Ｔｒｅｇの分化および増殖に不可欠であるので、ＩＬ−２または可溶性抗ＣＤ３ Ａｂを加えたＩＬ−２によって活性化したＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇが、ｗｔ細胞と比較した場合に、より低い量のＩＬ−１０およびＩＦＮ−γを産生したことは、顕著であった（図１０Ｂ）。次いでＴｒｅｇにおけるＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０ レセプター複合体の発現を、決定した。図１０Ｃに示すように、本発明者らは、ＤＡＰ１０がＴｒｅｇの機能に直接影響することを示唆する、休止ｗｔ ＴｒｅｇにおけるＤＡＰ１０転写物およびＮＫＧ２Ｄ転写物の存在を観察した。ＮＫＧ２Ｄレセプターの表面における発現は、脾臓のＴ細胞において検出されなかった（図示せず）。
【０１０５】
ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇがインビボで機能不全性であったか否かを決定するために、ｗｔ Ｔｒｅｇを、ＤＡＰ１０ＫＯマウスに移植し、そしてＢ１６黒色腫の転移の発生に対するｗｔ Ｔｒｅｇの影響を分析した。１×１０６個のｗｔ Ｔｒｅｇ細胞を、ＤＡＰ１０ＫＯマウスに対してｉ．ｖ．に移植し、そして４日後に、マウスは、Ｂ１６黒色腫腫瘍細胞を受容した。コントロールマウス（ｗｔおよびＤＡＰ１０ＫＯの両方）は、Ｂ１６細胞のみを受容した。図１０Ｃは、ＤＡＰ１０ＫＯマウスにおけるｗｔ Ｔｒｅｇの移植が、ＤＡＰ１０ＫＯマウスを、ｗｔマウスに匹敵して、黒色腫の転移に対して感受性にしたこと示す。
【０１０６】
ＤＡＰ１０ＫＯマウスは、誘導された自己免疫に対して、より感受性であった。ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇの損なわれた機能が自己に対する増加した反応性をもたらすか否かを決定するために、自己抗原（ＭＯＧ３５−５５）に対するＤＡＰ１０ＫＯ Ｔ細胞のインビトロおよびインビボでの応答を、分析した。図１１Ａは、ＭＯＧ３５−５５ペプチドに対するリコール反応（ｒｅｃａｌｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ）において、ＭＯＧ３５−５５免疫マウスのリンパ節から単離したＤＡＰ１０ＫＯ Ｔ細胞は、より良好に増殖し、そしてｗｔ細胞と比較してＩＦＮγのより高いレベルをもたらした。遅延型の過敏性反応（ＤＴＨ）の誘導は、ｗｔマウスおよびＤＡＰ１０ＫＯマウスにおいて、足蹠の同様の腫脹を生じた（図１１Ｂ）。興味深いことに、ＭＯＧ３５−５５に対するＤＴＨ応答は、ＤＡＰ１０ＫＯ ＢＬ／６マウスの４０％に実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘発したが、ＢＬ／６マウスにおいてはＥＡＥを誘発しなかった。ＥＡＥに関連した神経学的効果を、ＤＴＨ応答の誘導の、ちょうど４８時間後に観察した。数匹のＤＡＰ１０ＫＯマウスは、迅速な寛解を伴う穏やかなＥＡＥを発症したのに対して、他のＤＡＰ１０ＫＯマウスは、寛解前に１ヶ月間持続する重症かつ持続性のＥＡＥを有した。合わせて、このデータは、ＤＡＰ１０ＫＯマウスがＭＯＧ３５−５５誘導性自己免疫応答に対する増加した感受性を有することを示唆した。
【０１０７】
（考察）
予想外にも、発癌物質の刺激に曝されたＤＡＰ１０ＫＯマウス、またはＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する同系の腫瘍もしくはＮＫＧ２Ｄリガンドを発現しない同系の腫瘍を移植されたＤＡＰ１０ＫＯマウスは、腫瘍の悪性度に対して増強された抵抗性を示した。ＤＡＰ１０ＫＯマウスの抗腫瘍表現型は、マウスにおいてＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の両方を枯渇させることによって逆転された。Ｂ１６黒色腫モデルにおいて、ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞は、Ｂ１６腫瘍の排除を媒介するエフェクター細胞であることを証明した。一貫して、インビトロ細胞傷害アッセイは、ＤＡＰ１０ＫＯが、ＮＫＧ２Ｄ依存性の様式でＢ１６黒色腫の腫瘍を効率的に殺し得たが、ｗｔ ＮＫＴ細胞は、そうでなかったことを示した。それとは反対に、ＤＭＢＡ−Ｔ癌腫移植モデルにおいて、ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫ細胞は、腫瘍の拒絶を担う最終的なエフェクターであった。しかし、この腫瘍モデルにおいても、ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞は、ＮＫ細胞の活性化を媒介するようであった。実際に、インビトロで活性化されたｗｔ細胞またはＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫ細胞が、ＤＭＢＡ−Ｔ腫瘍を同様の効率で殺したのに対して、ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫ１．１＋細胞は、ＤＭＢＡ−Ｔ標的を、ｗｔ ＮＫ１．１＋細胞よりずっと効率的に殺した。さらに、ＴＣＲによる刺激の際に、ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞は、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α（両方とも殺腫瘍活性を有する）の、より高いレベルをもたらした。インビボにおいて、ＮＫＴ細胞によるＩＦＮ−γの、早期のより高い産生の後に、通常、ＮＫ細胞の迅速な活性化および効率的な腫瘍の殺傷が続く（３１−３５）。
【０１０８】
ＤＡＰ１０欠損は、構成的に機能亢進したＮＫＴ細胞に関連した。ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞は、ナイーブなマウスの脾臓および骨髄の両方における増加した増殖速度を示した。さらに、「休止」ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞および活性化されたＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞は、ｗｔ ＮＫＴ細胞と比較して、有意により高いレベルのサイトカインを産生した。ＮＫＴ細胞のような自己反応性のＴ細胞の活性を阻害することによって自己の破壊を防ぐこと（３６）が公知であるＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇの機能的特性を、ＤＡＰ１０が、細胞傷害機能を抑制状態に保つ機構に関与するか否かを決定するために、分析した。ＤＡＰ１０ＫＯマウスの分析は、ＤＡＰ１０の基礎的な発現が、Ｔｒｅｇが正常に機能するために必要とされたことを示した。ＤＡＰ１０シグナル伝達の欠如は、Ｔｒｅｇの分化の状態を変化させるようであり、Ｔｒｅｇの抑制性の活性の欠損を生じた。ＤＡＰ１０欠損マウスにおけるｗｔ Ｔｒｅｇの養子移植は、上記抑制を回復させ、このことは、実際に、ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇがインビボで機能不全であったことを示した。
【０１０９】
Ｔｒｅｇは、特に、高レベルのＣＤ２５抗原（ＩＬ−２レセプターの成分）を発現する、高度に分化した細胞である。ＩＬ−２は、Ｔｒｅｇに対する重要な増殖因子であるだけでなく、Ｔｒｅｇの機能をも調節し得る（２７、２９）。ナイーブなＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇ集団は、ｗｔ細胞と比較した場合、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｌｏｗ細胞の増加した％を示した。結果的に、ＴＣＲを介する活性化に関連するか、またはそれに関連しないＩＬ−２刺激は、ＤＡＰ１０ＫＯ ＴｒｅｇによるＩＬ−１０の有意に減少した産生をもたらした。Ｔｒｅｇは、自己反応性を抑制する２つの主要な機構を利用する：ＩＬ−１０、ＴＧＦβおよびＩＬ−４のような免役抑制性サイトカインの産生およびＣＴＬＡ−４またはＧＩＴＲのような細胞表面抗原を含む、細胞と細胞との接触性相互作用（３７）。したがって、ＤＡＰ１０ＫＯ ＴｒｅｇによるＩＬ−１０の損なわれた産生は、インビボにおけるそれらの細胞の減少した抑制性の活性を担うようである。
【０１１０】
ＤＡＰ１０シグナル伝達が、いかにしてＴｒｅｇの分化プロセスに寄与するのか？１つの可能性は、ＤＡＰ１０が胸腺におけるＴｒｅｇの成熟に影響することである。Ｔｒｅｇの胸腺における発達は、ＴＣＲ媒介性シグナルおよび最大の共起刺激を必要とする。ＣＤ２８共起刺激分子、Ｂ７共起刺激分子およびＣＤ４０共起刺激分子を欠如するマウスは、Ｔｒｅｇの損なわれた発達を有する（３６、３７）。ＤＡＰ１０ＫＯマウスは、正常なＴｒｅｇ数を有したが、Ｔｒｅｇの抑制性の機能を損ない、これは、ＤＡＰ１０がＴｒｅｇの完全な成熟に必要とされ得ることを示唆した。ＤＡＰ１０転写物およびＮＫＧ２Ｄ転写物は、胸腺において良好に発現され、そしてＮＫＧ２Ｄ−リガンド転写物は、胚において高度に発現されることが見出され（３０）、これらのことは、ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０レセプター複合体が、実際に、自己反応性のＴ細胞集団の初期の発達に関与し得ることを示唆する。あるいは、ＤＡＰ１０シグナル伝達は、直接的かまたは間接的かのいずれかで、末梢におけるＴｒｅｇの抑制性の機能を維持するために必要とされ得る。本発明者らは、天然のｗｔ Ｔｒｅｇにおいて、表面でのＮＫＧ２Ｄの発現を検出できなかったが、ｍＲＮＡ分析は、Ｔｒｅｇの調節におけるＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０レセプター複合体の直接的な関与を示唆する、ＮＫＧ２ＤおよびＤＡＰ１０の両方の発現を明確に示した。ＤＡＰ１０シグナル伝達が、末梢におけるＴｒｅｇの分化に重要である抗原提示細胞によって提供される共起刺激レセプターおよびサイトカインをモジュレートすることによって、Ｔｒｅｇの機能に間接的に影響することも、可能である（３２）。
【０１１１】
ＤＡＰ１０ＫＯマウスの分析は、ＤＡＰ１０が、腫瘍認識の免疫寛容機構に関与し、そうして腫瘍に対する免疫療法のための強力な薬物標的を示したことを示唆する。したがって、ＤＡＰ１０シグナル伝達のブロックは、Ｔｒｅｇの抑制性の機能を損なうことによって同系の腫瘍に対して、保護的であり得た。当然に、ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０レセプター複合体のブロックは、腫瘍細胞がＮＫＧ２Ｄリガンドを発現するか、またはＮＫＧ２Ｄリガンドしないかに依存して、異なる帰結を有するようである。興味深いことに、ｗｔマウスは、それらが、予めＴｒｅｇを枯渇した場合にのみ、低レベルのＮＫＧ２Ｄリガンドを発現するＤＭＢＡ−Ｔ腫瘍を拒絶し得た。ＮＫＧ２Ｄリガンドのほかに、ＤＭＢＡ−Ｔ腫瘍細胞が、Ｔｒｅｇによって認識され得る腫瘍関連抗原を発現し、そしてそれらの活性化、およびその後の免疫反応の阻害を誘発することが、可能である。この可能性は、腫瘍特異的な、変異していない自己抗原（ＬＡＧＥ−１と称される）の、Ｔｒｅｇ細胞に対する生理学的リガンドとしての最近の同定によって支持された（３８）。したがって、外来または自己の状況における腫瘍特異的抗原の認識は、腫瘍に対する免疫応答の性質において重要な影響を有し得た。
【０１１２】
ＤＡＰ１０は免疫調節機能を有するので、ＤＡＰ１０のブロックは、好ましい自己免疫であり得る。しかし、ナイーブなＤＡＰ１０ＫＯマウスは、自発の自己免疫反応を発生せず、自己免疫表現型に関連するマウスにおける腫瘍の拒絶でもなかった。興味深いことに、ＭＯＧ自己ペプチドに対するＤＴＨ反応の誘導は、ＤＡＰ１０ＫＯマウスにおいてＥＡＥを生じたが、ｗｔマウスにおいてはＥＡＥを生じず、このことは、ＤＡＰ１０ＫＯマウスが、実験的に誘導された自己免疫疾患に対して、より感受性であることを示した。ＢＬ／６マウスにおけるＥＡＥの誘導が、ＣＦＡ中に乳化されたＭＯＧ３５−５５および百日咳毒素（ＰＴＸ）による免疫を必要とすることが、良好に確立される（３９）。ＰＴＸの非存在下において、ｗｔ ＢＬ／６マウスは、代表的に、ＥＡＥを発症しないが、しかし、４０％のＤＡＰ１０ＫＯマウスは、ＰＴＸ処置無しでＥＡＥを発症した。おそらく、ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇの損なわれた調節機能が、増強したＴ細胞媒介性の自己反応性をもたらし、したがってＰＴＸに対する必要性を除去した。ＤＡＰ１０シグナル伝達はまた、自己免疫応答に関与する他の免疫細胞の活性に影響し得る。２つの研究は、自己反応性のＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０レセプター複合体の発現を示している（７、８）。後者は、自己免疫疾患に対して遺伝的に感受性であり、不完全なＴｒｅｇおよびＮＫＴ細胞の活性を有する他のマウス系統のようなＮＯＤマウスの使用を、行なった（２８）。ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達のブロックは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖および活性を阻害することによって自己免疫性糖尿病を予防する（８）。したがって、ＤＡＰ１０機能のブロックは、免疫応答において異なる影響を有するようである。
【０１１３】
ＤＡＰ１０は、リンパ系細胞および骨髄性細胞において広く発現され、したがってＤＡＰ１０の生物学は、複合体であることが予想される。上記研究は、同系の腫瘍に対する応答を制御する免疫調節機構におけるＤＡＰ１０の重要な役割を示し、そしてＤＡＰ１０共起刺激の１つの生理学的役割が、自己抗原に対する寛容を維持するためにＴｒｅｇを活性化することであることを示唆する。
【０１１４】
（参考文献）
【０１１５】
【表１】
【０１１６】
【表２】
【０１１７】
【表３】
【０１１８】
【表４】
。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１は、ＤＡＰ１０遺伝子の標的化を示す。（Ａ）エキソン３およびエキソン４が、ＥＳ細胞中の１．４ｋｂのｎｅｏｒカセットによって置換されたＤＡＰ１０ ｗｔ対立遺伝子の概略図。ｅｒｅリコンビナーゼ遺伝子を含むプラスミドを導入することによって、ｌｏｘ Ｐフランク（ｆｌａｎｋｅｄ）ｎｅｏｒ遺伝子が除去される。（Ｂ）サザンブロット分析。ＥＳクローンを、未分化胚芽細胞のマイクロインジェクションの前に、ｎｅｏｒ遺伝子の切り出しを確認するためにサザンブロットによって分析した。サザンスクリーニングは、ＤＡＰ１０標的化ベクターにフランキングする５’プローブおよび３プローブの両方を利用する。ゲノムＤＮＡを、コントロール、または変異体ＥＳ細胞から単離し、ＮｃｏＩによって消化し、そして５’プローブおよび３プローブによってハイブリダイズさせた。ｗｔ対立遺伝子（ｗｔ）は、６ｋｂのバンドによって表され、標的化された対立遺伝子（ＨＲ）は、４．０ｋｂのバンドであり、そしてＣＲＥフリップ対立遺伝子（ｆｌｉｐｐｅｄ ａｌｌｅｌｅ）（ＣＦ）は、５．１ｋｂのバンドである。（Ｃ）ＤＡＰ１０ＫＯリンパ組織のＲＴ ＰＣＲ分析。全ＲＮＡは、ｗｔマウスまたはＤＡＰ１０ＫＯマウスの脾臓、リンパ節および胸腺から単離され、そしてＤＡＰ１０遺伝子、ＮＫＧ２Ｄ遺伝子およびＤＡＰ１２遺伝子に対する特異的プライマーを使用したリアルタイムＲＴ ＰＣＲ分析に供された。ｍＲＮＡレベルを、ユビキチンレベルに対して正規化した。（Ｄ）ＮＫ１．１＋細胞上のＮＫＧ２Ｄレセプターの発現。ｗｔまたはＤＡＰ１０ＫＯ 脾細胞（上のパネル）またはＩＬ−２によって３日間活性化されたＮＫ細胞（下のパネル）を、抗ＮＫ１．１ ＦＩＴＣと抗ＮＫＧ２Ｄ ＰＥ ｍＡｂとのカクテルによって染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。
【図２】図２は、ＤＡＰ１０欠損マウスが化学的に誘導された皮膚の癌腫に対して保護されることを示す。発癌のイニシエーションの４ヶ月後、皮膚の腫瘍を計測し、そしてそれらの発達の段階（乳頭腫および癌腫）を、臨床的かつ組織学的な判定基準に基づいて決定した。ｗｔ腫瘍は、癌腫と乳頭腫との混合であったのに対して、ＤＡＰ１０ＫＯ腫瘍は、乳頭腫のみであった。写真は、代表的なｗｔマウスまたはＤＡＰ１０ＫＯマウスにおける化学的に誘導された皮膚の腫瘍の外観を示す。その差は、対応のないスチューデントｔ検定によって決定したところ、統計学的に有意であった（ｐ＞０．０５）。
【図３】図３は、ＮＫ１．１＋細胞がＤＡＰ１０ＫＯマウスにおいて癌の腫瘍の効率的な拒絶を担う、最終のエフェクター細胞であることを示す。（Ａ）ｗｔ癌腫細胞の移植。マウス（１群あたりｎ＝１０）に、５ｘ１０４個のｗｔ癌腫細胞をｓ．ｃ．に注射し、そして１ヶ月間２〜３日毎に腫瘍増殖についてモニタリングした。（Ｂ）ＮＫ１．１＋細胞が枯渇したマウスにおける腫瘍増殖。抗ＮＫ１．１ ｍＡｂ（ＰＫ１３６）またはアイソタイプコントロール（マウスＩｇＧ１κ）を、−２日目から開始して５日毎にｉ．ｖ．に与えた。マウス（１群あたりｎ＝５）に、０日目において５×１０４個のｗｔ癌腫細胞を与えた。（Ｃ）ＮＫ細胞が枯渇したマウスにおける腫瘍増殖。抗アシアロＧＭ１ポリクローナル抗体またはＰＢＳを、−２日目、２日目、６日目、１０日目においてｉ．ｖ．に与えられた。マウス（１群あたりｎ＝５）に、５×１０４個のｗｔ癌腫細胞を０日目に与えた。Ｐ値（ｐ＞０．０５）を、対応のないスチューデントｔ検定によって決定した。データは、与えられた時点における腫瘍容積の平均±ＳＥＭとして示される。
【図４】図４は、ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫ１．１＋細胞が効率的に癌の皮膚の腫瘍を殺すことを示す。（Ａ）ＤＭＢＡ−Ｔ癌腫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ−リガンドの発現。ＮＫＧ２Ｄ−Ｉｇ融合タンパク質またはＩｇコントロールと、ＰＥ結合体化二次Ａｂとによって染色されたｗｔ癌腫細胞のフローサイトメトリー分析。（Ｂ）ＮＫ１．１＋細胞による癌の皮膚の腫瘍のインビトロでの殺傷。ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはＮＫ１．１＋細胞を、ｗｔ脾細胞またはＤＡＰ１０ＫＯ脾細胞から単離し、そしてＩＬ−２と一緒に７日間培養した。それらは、異なるエフェクター：標的比でのＤＭＢＡ−Ｔ細胞に対する細胞傷害アッセイにおいてエフェクターとして使用した。そのアッセイは、抗ＮＫＧ２ＤブロックｍＡｂまたはラットＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（両方とも１０μｇ／ｍｌにて使用される）の存在下において行なった。
【図５】図５は、ＤＡＰ１０欠損がＢ１６黒色腫の転移に対する免疫の増強と関連することを示す。（Ａ）黒色腫の肺への転移の発症。１×１０５個または１×１０４個のＢ１６細胞を、マウスにｉ．ｖ．注射し、そして肺への転移を、２週後に計測した（ｐ＞０．０５）。（Ｂ）１ｘ１０５個のＢ１６黒色腫細胞の注射の２週間後でのｗｔマウスおよびＤＡＰ１０ＫＯマウスにおけるＢ１６転移の外観。
【図６】図６は、ＮＫＴ細胞がＤＡＰ１０ＫＯマウスにおいてＢ１６黒色腫の転移に対する保護を担うエフェクターであることを示す。（Ａ）骨髄キメラの産生。骨髄キメラマウスの４つの群を産生し、そして抗転移効果におけるＤＡＰ１０ＫＯ免疫細胞の役割を評価するために使用した。使用したドナー−＞レシピエントキメラは、以下の通りであった：１．ｗｔ ＧＦＰ＋−＞ｗｔ；２．ＤＡＰ１０ＫＯ−＞ＤＡＰ１０ＫＯ；３．ｗｔ ＧＦＰ＋−＞ＤＡＰ１０ＫＯ；４．ＤＡＰ１０ＫＯ−＞ｗｔ ＧＦＰ＋。１×１０５個のＢ１６細胞を、キメラに注射し、そして２週間後、その転移を計測した。２つの異なる実験からの代表的な結果。（Ｂ）マウスにおけるＮＫ１．１＋細胞の枯渇。マウスに、２×１０４個のＢ１６細胞をｉ．ｖ．に注射した。抗ＮＫ１．１ Ａｂ（ＰＫ１３６）またはアイソタイプコントロール（マウスＩｇＧ１κ）に、−２日目から開始して５日毎にｉ．ｖ．に与えた。肺への転移を、２週間後に計測した。（Ｃ）マウスにおけるＮＫ細胞の枯渇。抗アシアロＧＭ１ポリクローナル抗体またはＰＢＳを、−２日目、２日目、６日目、１０日目においてｉ．ｖ．に与えた。１×１０５個のＢ１６細胞を、０日目においてｉ．ｖ．に注射し、そして肺への転移を、１４日目に計測した。
【図７】図７は、ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞が超活動性であることを示す。（Ａ）ｗｔマウスおよびＤＡＰ１０ＫＯマウスにおけるＮＫＴ細胞集団のフローサイトメトリー分析。ナイーブなマウスから単離された脾細胞を、抗ＮＫ１．１ ＰＥ抗体と抗ＣＤ３ ＦＩＴＣ抗体とによって染色した。ＮＫＧ２Ｄ発現を、抗ＮＫＧ２Ｄ ＰＥ Ａｂによって染色し、取り出されたＮＫＴ細胞において評価した。（Ｂ）ＮＫＴ細胞の交代速度。マウスに、ＢｒｄＵ（マウス１匹あたり１ｍｇ）をｉ．ｖ．に注射した。２４時間後、白血球を、脾臓および骨髄から単離し、そしてＢｒｄＵキットを使用してＢｒｄＵの取り込みを検出するために染色した。染色された細胞は、フローサイトメトリーによって分析した。（Ｃ）ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞は、ｗｔ細胞と比較して、より高い量のサイトカインを産生する。ｗｔ細胞またはＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴ細胞を、ナイーブなマウスの脾細胞から単離し、そして血小板結合性抗ＣＤ３ ｍＡｂまたはアイソタイプコントロール（「休止」）によってインビトロで活性化させた。細胞を４８時間培養し、そしてサイトカイン産生をマウスＴｈｌ／Ｔｈ２ ＣＢＡキットを使用して上清において測定した。
【図８】図８は、ＤＡＰ１０ ＮＫＴＫＯ細胞がＢ１６黒色腫細胞を効率的に殺すことを示す。（Ａ）活性化されたＮＫＴのフローサイトメトリー分析。取り出されたＮＫＴを、ＩＬ−２と一緒に５日間培養した。細胞を、抗ＮＫ１．１ ＦＩＴＣと、抗ＣＤ３ Ｃｙと、抗ＮＫＧ２Ｄ ＰＥ Ａｂとのカクテルによって染色した。（Ｂ）ＮＫＴ細胞傷害能力の分析。ＩＬ−２活性化ＮＫＴ細胞を、ＹＡＣ−１細胞およびＢ１６黒色腫標的細胞に対する細胞傷害アッセイにおいてエフェクター細胞として使用した。ＹＡＣ−１が、高レベルのＮＫＧ２Ｄリガンドを発現するのに対して、Ｂ１６は、高レベルのＮＫＧ２Ｄリガンドを発現しない。そのアッセイは、抗ＮＫＧ２ＤブロックＡｂまたはそのアイソタイプコントロール（両方とも、１０μｇ／ｍｌである）の存在下において行なわれた。
【図９】図９は、ｗｔマウスおよびＤＡＰ１０ＫＯマウスにおけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇの枯渇を示す。（Ａ）Ｔｒｅｇが枯渇したマウスにおけるＤＭＢＡ−Ｔ癌腫細胞の移植。Ｔｒｅｇを枯渇させるために、マウスに、−２日目において単一用量の抗ＣＤ２５ Ａｂを与え、次いで０日目においてＤＭＢＡ−Ｔ細胞を注射した。腫瘍増殖を、３日毎にモニタリングした。（Ｂ）Ｔｒｅｇが枯渇したマウスにおける転移の発生。枯渇のために、マウスに、−３日目、２日目および７日目において抗ＣＤ２５ Ａｂを与えた。コントロールマウスに、ＰＢＳを与えた。１×１０５個のＢ１６細胞を、０日目においてｉ．ｖ．に与え、そして転移を、２週間目において計測した。（Ｃ）Ｔｒｅｇが枯渇したマウスから単離されたＮＫＴ細胞の細胞傷害能力。ｗｔマウスまたはＤＡＰ１０ＫＯマウスは、−３日目における抗ＣＤ２５ Ａｂ（クローンＰＣ６１、マウス１匹あたり０．５ｍｇ）の静脈内注射によってＣＤ２５＋細胞が枯渇した。０日目において、ＮＫＴ細胞を、脾臓から単離し、そしてマウスＩＬ−２と一緒に５日間培養した。次いで、ＮＫＴを、Ｂ１６黒色腫細胞に対する細胞傷害アッセイにおいてエフェクターとして使用した。そのデータは、平均±ＳＤとして示される。
【図１０】図１０は、ＤＡＰ１０欠損がＴｒｅｇ媒介性の抑制の減損と関連することを示す。（Ａ）Ｔｒｅｇのフローサイトメトリー分析。脾細胞を、ｗｔマウスまたはＤＡＰ１０ＫＯマウスから単離し、そして抗ＣＤ４ ＦＩＴＣ Ａｂ、抗ＣＤ２５ビオチンＡｂによって染色し、次いでストレプトアビジン−Ｃｙによって染色した。（Ｂ）ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇによるサイトカイン産生の減損。ｗｔ ＴｒｅｇまたはＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇは、ナイーブなマウスの脾細胞から単離し、そしてＩＬ−２、またはＩＬ−２および可溶性抗ＣＤ３ ｍＡｂを用いて４８時間活性化した。サイトカインの産生を、マウス炎症性ＣＢＡキットを使用して上清において測定した。その上清において検出された他のサイトカインは、ＭＣＰ−Ｉ（ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇにおいてダウンレギュレートされた）、およびＴＮＦ−α（ｗｔ細胞およびＤＡＰ１０ＫＯ細胞によって同様に産生）であった。（Ｃ）ｗｔ ＴｒｅｇおよびＤＡＰ１０ＫＯ ＴｒｅｇのＴａｑｍａｎ分析。Ｔｒｅｇを、マウスＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇ単離キットを使用して、ｗｔマウスおよびＤＡＰ１０ＫＯマウスの脾臓から単離した。全ＲＮＡを、３．５×１０６個のＴｒｅｇから単離し、そしてＦｏｘｐ３遺伝子、ＮＫＧ２Ｄ遺伝子、ＤＡＰ１０遺伝子、ＤＡＰ１２遺伝子およびＩＦＮγ遺伝子に対する特異的プライマーを使用するリアルタイムＲＴ ＰＣＲ分析に供した。ｍＲＮＡレベルを、ユビキチンレベルに対して正規化した。（Ｄ）ＤＡＰ１０ＫＯマウスにおけるｗｔ Ｔｒｅｇの養子移植。１×１０６個のｗｔ ＴｒｅｇまたはＰＢＳを、−３日目においてＤＡＰ１０ＫＯマウスにｉ．ｖ．注射した。マウスに、０日目において、Ｂ１６黒色腫をｉ．ｖ．に注射し、そして肺への転移を、１４日目に分析した。（Ｄ）ＤＡＰ１０ＫＯ ＮＫＴに対するＴｒｅｇの抑制効果。ＮＫＴを、ナイーブなマウスから単離し、そしてマウスＩＬ−２と一緒に５日間培養した。細胞傷害アッセイの１２時間前に、ＮＫＴ細胞を洗浄し、計測し、そしてＩＬ−２を含む培地において、単独か、またはｗｔ ＴｒｅｇもしくはＤＡＰ１０ＫＯ Ｔｒｅｇと一緒（１：１の比）のいずれかで、培養した。ＮＫＴ±Ｔｒｅｇを、Ｂ１６黒色腫細胞またはｗｔ癌腫細胞に対する細胞傷害アッセイにおいてエフェクターとして使用した。そのデータは、平均±ＳＤとして示される。
【図１１】図１１は、ＤＡＰ１０ＫＯ Ｔ細胞が自己ペプチドＭＯＧに対する増加した反応性を提示することを示す。（Ａ）ＭＯＧ３５−５５で免疫されたリンパ節細胞のインビトロ増殖アッセイ。ｗｔリンパ節細胞およびＤＡＰ１０ＫＯリンパ節細胞を、ＭＯＧ３５−５５で免疫されたマウスから単離し、そして異なる濃度にて、ＭＯＧ３５−５５ペプチドと一緒に７２時間培養した。その増殖性の応答を、［３Ｈ］−チミジン取り込みアッセイによって測定した（左のグラフ）。未標識の培養物を使用して、ＩＦＮ−γの量を決定した（右のグラフ）。データは、三連の平均±ＳＥＭである。３つのうちの１つの代表的な実験が示される。（Ｂ）ＤＴＨ応答の誘導。マウスを、０日目において、ＣＦＡ中に乳化されたＭＯＧによって免疫し、次いで１０日目においてＭＯＧを足蹠に注射した。足蹠の腫脹を、４８時間後に測定した（左のグラフ）。ＥＡＥ臨床スコアを、方法に記載されるように決定した。３つの異なる実験の組み合わせたデータ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において腫瘍に対する細胞媒介性の応答を刺激するか、または増大するための方法であって、その必要がある被験体に、ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害するか、または抑制する因子を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記因子は、ＤＡＰ１０の発現を阻害するか、または抑制する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記因子は、ＤＡＰ１０の細胞内シグナル伝達を妨害する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記因子は、ＤＡＰ１０によるＰＩ３キナーゼ経路の誘発を妨害する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記因子は、ＤＡＰ１０膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１０特異的抗体もしくはその生物学的に活性なフラグメント、またはＤＡＰ１０のｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍は、原発性腫瘍または転移性腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記腫瘍は、ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記腫瘍は、ＬＡＧＥ−１を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記因子は、ＮＫ細胞の細胞傷害もしくはＮＫＴ細胞の細胞傷害を増強するか、または増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記因子は、ＮＫ細胞の増加した増殖またはＮＫＴ細胞の増加した増殖を刺激する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記因子は、少なくとも特徴的なサイトカインのＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞からの増加したサイトカイン産生を刺激する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記特徴的なサイトカインは、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−２である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＡＰ１０活性をモジュレートする因子の有効量を細胞に投与する工程を包含する、標的に対する細胞傷害を増加する方法であって、該ＤＡＰ１０活性は、減少されるか、または排除される、方法。
【請求項１４】
前記標的は、腫瘍細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞傷害のメディエーターは、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞は、組織または生体にある、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
調節性Ｔ細胞を抑制するか、または阻害するための方法であって、その必要がある被験体に、ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害する因子を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
前記因子は、ＤＡＰ１０の発現を阻害するか、または抑制する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記因子は、ＤＡＰ１０の細胞内シグナル伝達を妨害する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記因子は、ＤＡＰ１０によるＰＩ３キナーゼ経路の誘発を妨害する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記因子は、ＤＡＰ１０の膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１０特異的抗体もしくはその生物学的に活性なフラグメント、またはＤＡＰ１０のｓｉＲＮＡである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験体は、癌を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
癌を予防するか、または処置する方法であって、その必要がある被験体に、ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害するか、または抑制する因子の有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２４】
前記癌は、皮膚癌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌は、化学的に誘導される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ａ）ＤＡＰ１０発現細胞と試験化合物とを接触させる工程；
ｂ）ＤＡＰ１０の生物学的活性の阻害について該細胞を評価する工程；および
ｃ）ＤＡＰ１０の生物学的活性をダウンレギュレートする化合物を発癌を弱めるか、または改善する化合物として、該試験化合物を同定する工程；
を包含する、発癌を弱めるか、または改善する化合物を同定するための方法。
【請求項２７】
前記発癌は、皮膚の発癌である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記発癌は、化学的に誘導される発癌である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＤＡＰ１０の生物学的活性は、ＰＩ３キナーゼシグナル伝達の誘導、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞の増加した細胞傷害、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞の増加した増殖、またはＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞による増加したサイトカイン産生によって評価される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
ａ）ＤＡＰ１０発現細胞と試験化合物とを接触させる工程；
ｂ）ＤＡＰ１０の生物学的活性の阻害について該細胞を評価する工程；および
ｃ）ＤＡＰ１０の生物学的活性をダウンレギュレートする化合物を、腫瘍増殖を阻害する化合物として、該試験化合物を同定する工程；
を包含する、腫瘍増殖を阻害する化合物を同定するための方法。
【請求項３１】
前記腫瘍は、原発性腫瘍または転移性腫瘍である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記腫瘍は、皮膚の腫瘍である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記腫瘍は、化学的に誘導される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＤＡＰ１０生物学的活性は、ＰＩ３キナーゼシグナル伝達の誘導、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞の増加した細胞傷害、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞の増加した増殖、またはＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞による増加したサイトカイン産生によって評価される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
ａ）ＤＡＰ１０−／−マウスにおいて実験的自己免疫疾患を誘導する工程；
ｂ）試験化合物を該ＤＡＰ１０−／−に投与する工程；
ｃ）少なくとも１つの自己免疫疾患の指標を評価する工程；および
ｄ）試験化合物を、該試験化合物が該疾患の指標を減少させるか、または排除する場合に、該自己免疫疾患を弱めるか、または改善する化合物として同定する工程；
を包含する、自己免疫疾患を弱めるか、または改善する化合物を同定するための方法。
【請求項３６】
前記実験的自己免疫疾患は、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、コラーゲン誘導性関節炎、実験的自己免疫心筋炎、実験的自己免疫卵巣炎、または実験的自己免疫精巣炎である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載の方法によって同定された有効な化合物を投与する工程を包含する、自己免疫疾患を予防するか、または処置する方法。
【請求項３８】
自己免疫疾患を予防するか、または処置する方法であって、その必要がある被験体に、ＤＡＰ１０発現細胞においてＤＡＰ１０の生物学的活性を維持するか、増強するか、または回復させる化合物の有効量を、投与する工程を包含する、方法。
【請求項３９】
ａ）ＤＡＰ１０発現細胞と試験化合物とを接触させる工程；
ｂ）ＤＡＰ１０活性またはＤＡＰ１０発現のモジュレーションについて該ＤＡＰ１０発現細胞を評価する工程；および
ｃ）ＤＡＰ１０発現細胞においてＤＡＰ１０の生物学的活性を維持し、増強し、または回復させる化合物を、自己免疫疾患を予防するか、または処置する化合物として、該試験化合物を同定する工程；
を包含する、自己免疫疾患を予防するか、または処置する化合物を同定する方法。
【請求項１】
被験体において腫瘍に対する細胞媒介性の応答を刺激するか、または増大するための方法であって、その必要がある被験体に、ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害するか、または抑制する因子を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記因子は、ＤＡＰ１０の発現を阻害するか、または抑制する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記因子は、ＤＡＰ１０の細胞内シグナル伝達を妨害する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記因子は、ＤＡＰ１０によるＰＩ３キナーゼ経路の誘発を妨害する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記因子は、ＤＡＰ１０膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１０特異的抗体もしくはその生物学的に活性なフラグメント、またはＤＡＰ１０のｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍は、原発性腫瘍または転移性腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記腫瘍は、ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記腫瘍は、ＬＡＧＥ−１を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記因子は、ＮＫ細胞の細胞傷害もしくはＮＫＴ細胞の細胞傷害を増強するか、または増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記因子は、ＮＫ細胞の増加した増殖またはＮＫＴ細胞の増加した増殖を刺激する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記因子は、少なくとも特徴的なサイトカインのＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞からの増加したサイトカイン産生を刺激する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記特徴的なサイトカインは、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−２である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＡＰ１０活性をモジュレートする因子の有効量を細胞に投与する工程を包含する、標的に対する細胞傷害を増加する方法であって、該ＤＡＰ１０活性は、減少されるか、または排除される、方法。
【請求項１４】
前記標的は、腫瘍細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞傷害のメディエーターは、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞は、組織または生体にある、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
調節性Ｔ細胞を抑制するか、または阻害するための方法であって、その必要がある被験体に、ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害する因子を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
前記因子は、ＤＡＰ１０の発現を阻害するか、または抑制する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記因子は、ＤＡＰ１０の細胞内シグナル伝達を妨害する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記因子は、ＤＡＰ１０によるＰＩ３キナーゼ経路の誘発を妨害する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記因子は、ＤＡＰ１０の膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１０特異的抗体もしくはその生物学的に活性なフラグメント、またはＤＡＰ１０のｓｉＲＮＡである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験体は、癌を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
癌を予防するか、または処置する方法であって、その必要がある被験体に、ＤＡＰ１０の生物学的活性を阻害するか、または抑制する因子の有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２４】
前記癌は、皮膚癌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌は、化学的に誘導される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ａ）ＤＡＰ１０発現細胞と試験化合物とを接触させる工程；
ｂ）ＤＡＰ１０の生物学的活性の阻害について該細胞を評価する工程；および
ｃ）ＤＡＰ１０の生物学的活性をダウンレギュレートする化合物を発癌を弱めるか、または改善する化合物として、該試験化合物を同定する工程；
を包含する、発癌を弱めるか、または改善する化合物を同定するための方法。
【請求項２７】
前記発癌は、皮膚の発癌である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記発癌は、化学的に誘導される発癌である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＤＡＰ１０の生物学的活性は、ＰＩ３キナーゼシグナル伝達の誘導、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞の増加した細胞傷害、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞の増加した増殖、またはＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞による増加したサイトカイン産生によって評価される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
ａ）ＤＡＰ１０発現細胞と試験化合物とを接触させる工程；
ｂ）ＤＡＰ１０の生物学的活性の阻害について該細胞を評価する工程；および
ｃ）ＤＡＰ１０の生物学的活性をダウンレギュレートする化合物を、腫瘍増殖を阻害する化合物として、該試験化合物を同定する工程；
を包含する、腫瘍増殖を阻害する化合物を同定するための方法。
【請求項３１】
前記腫瘍は、原発性腫瘍または転移性腫瘍である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記腫瘍は、皮膚の腫瘍である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記腫瘍は、化学的に誘導される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＤＡＰ１０生物学的活性は、ＰＩ３キナーゼシグナル伝達の誘導、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞の増加した細胞傷害、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞の増加した増殖、またはＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞による増加したサイトカイン産生によって評価される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
ａ）ＤＡＰ１０−／−マウスにおいて実験的自己免疫疾患を誘導する工程；
ｂ）試験化合物を該ＤＡＰ１０−／−に投与する工程；
ｃ）少なくとも１つの自己免疫疾患の指標を評価する工程；および
ｄ）試験化合物を、該試験化合物が該疾患の指標を減少させるか、または排除する場合に、該自己免疫疾患を弱めるか、または改善する化合物として同定する工程；
を包含する、自己免疫疾患を弱めるか、または改善する化合物を同定するための方法。
【請求項３６】
前記実験的自己免疫疾患は、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、コラーゲン誘導性関節炎、実験的自己免疫心筋炎、実験的自己免疫卵巣炎、または実験的自己免疫精巣炎である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載の方法によって同定された有効な化合物を投与する工程を包含する、自己免疫疾患を予防するか、または処置する方法。
【請求項３８】
自己免疫疾患を予防するか、または処置する方法であって、その必要がある被験体に、ＤＡＰ１０発現細胞においてＤＡＰ１０の生物学的活性を維持するか、増強するか、または回復させる化合物の有効量を、投与する工程を包含する、方法。
【請求項３９】
ａ）ＤＡＰ１０発現細胞と試験化合物とを接触させる工程；
ｂ）ＤＡＰ１０活性またはＤＡＰ１０発現のモジュレーションについて該ＤＡＰ１０発現細胞を評価する工程；および
ｃ）ＤＡＰ１０発現細胞においてＤＡＰ１０の生物学的活性を維持し、増強し、または回復させる化合物を、自己免疫疾患を予防するか、または処置する化合物として、該試験化合物を同定する工程；
を包含する、自己免疫疾患を予防するか、または処置する化合物を同定する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００８−５２１８１４（Ｐ２００８−５２１８１４Ａ）
【公表日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４３４４３（Ｐ２００７−５４３４４３）
【出願日】平成１７年１１月２２日（２００５．１１．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４２４５９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５８０７７
【国際公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【出願人】（５９６１２９２１５）シェーリング コーポレイション (785)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月２２日（２００５．１１．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４２４５９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５８０７７
【国際公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【出願人】（５９６１２９２１５）シェーリング コーポレイション (785)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
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