ＤＧＡＴ阻害剤
【課題】ＤＧＡＴ阻害剤又はＴＧ合成抑制剤の提供。
【解決手段】ラズベリー若しくはその抽出物を有効成分とするＤＧＡＴ阻害剤又はＴＧ合成抑制剤。
【解決手段】ラズベリー若しくはその抽出物を有効成分とするＤＧＡＴ阻害剤又はＴＧ合成抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高脂血症、肥満、インスリン抵抗性及び糖尿病の予防又は改善に有効なジアシルグリセロールアシル基転移酵素（以下、「ＤＧＡＴ」という。）阻害剤又はトリアシルグリセロール（以下、「ＴＧ」という。）合成抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の欧米化に伴う恒常的な脂肪の過剰摂取により、高脂血症や肥満の発症率が増加している。高脂血症や肥満は、さらにインスリン抵抗性や糖尿病といった生活習慣病を合併するため、国民の健康維持・増進の観点において大きな社会問題となっている。
【０００３】
高脂血症、とりわけ血中ＴＧ濃度上昇は、虚血性心疾患のリスクとしても問題視されている（非特許文献１〜３）。又、食後に血清脂質が異常な増加を示し、かつ、この増加が蔓延する状態は一般的に食後高脂血症と呼ばれるが、食後高脂血症者は、高血圧や、虚血性心疾患などの動脈硬化性疾患の発症につながる危険性が高いことが指摘されている（非特許文献４及び５）。
【０００４】
肥満、とりわけ内臓脂肪型肥満も、しばしば生活習慣病を合併し、動脈硬化性疾患の発症のリスクを高めることが示されている（非特許文献６及び７）。過剰に脂肪が蓄積した脂肪細胞では、インスリンの働きを高めるアディポネクチンの産生が低下し、動脈硬化性疾患の発症を促進するplasminogen activator inhibitor（ＰＡＩ−１）やtumor necrosis factor（ＴＮＦ−α）等の液性因子の産生が亢進し、このことが生活習慣病の合併や動脈硬化性疾患の発症と関連すると考えられている（非特許文献８）。
【０００５】
インスリン抵抗性は、代謝症候群の中心的存在でインスリンが血液中に十分あるにも関わらず十分効果を発揮できない状態である。
インスリン抵抗性は、糖尿病の原因の１つと考えられている。さらに、インスリン抵抗性及び糖尿病は、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、神経障害等を合併する原因となる上、高脂血症や高血圧を合併することにより、動脈硬化性疾患を発症するリスクが高まることが数多くの疫学的研究により示されている（非特許文献９及び１０）。
【０００６】
以上のことから、一般に高脂血症、肥満、インスリン抵抗性及び糖尿病を予防及び／又は改善をすることは、健康な生活にとって重要なことであると考えられている。
【０００７】
また、食事として摂取したＴＧは、小腸内でリパーゼの働きにより、２−モノアシルグリセロールと脂肪酸に分解された後、小腸上皮細胞に吸収されることが知られている。又、吸収された脂質は、小腸上皮細胞内で、モノアシルグリセロールアシル基質転移酵素（ＭＧＡＴ）やＤＧＡＴ等の酵素の働きにより、ＴＧに再合成される。さらに、合成されたＴＧは、小腸細胞が特異的に生成するアポ蛋白Ｂ４８と会合することにより、カイロミクロン（ＣＭ）として血中に放出される。この様にＤＧＡＴは小腸から体内へのＴＧの取り込みにおいて重要な役割を果たしているが、それに加え、ＤＧＡＴは肝臓における超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）の合成・分泌や脂肪組織のＴＧ蓄積においても必要とされる酵素であるため、ＤＧＡＴ活性の阻害は高脂血症及び肥満の予防・改善の有効な手段となるものと考えられている。
【０００８】
また、ノックアウトマウスを用いた研究により、ＤＧＡＴ欠損マウスでは、体重の減少が見られるのに加えて、血糖値の低下、インスリン感受性の向上、脂肪細胞におけるアディポネクチン発現増加等が認められることから、ＤＧＡＴ活性を阻害することは、インスリン抵抗性や糖尿病の予防・改善の良い手段ともなるものと考えられている（非特許文献
１１）。
【０００９】
以上のことから、ＤＧＡＴ活性を阻害することにより、ＴＧ合成抑制や高脂血症、肥満、インスリン抵抗性、及び糖尿病の予防・改善が可能となる。
【００１０】
また、インスリン抵抗性は、血中の遊離脂肪酸濃度により直接的に影響を受けることが知られている。血中遊離脂肪酸の増加は、糖尿病患者や非糖尿病者において、インスリン抵抗性の原因となることの報告がなされており（非特許文献１２及び１３）、また、遊離脂肪酸が、インスリンシグナル伝達系を阻害し、インスリンによる骨格筋の糖取り込みを抑制することが明らかとなっている（非特許文献１４）。従って、遊離脂肪酸濃度の上昇抑制作用もまた、インスリン抵抗性の改善に結果するものと期待される。
【００１１】
従来の高脂血症、肥満、インスリン抵抗性及び糖尿病の予防・改善を目的としたアプローチの代表例として、食事療法や食欲抑制剤（非特許文献１５及び１６）、脂質代謝改善薬（非特許文献１７及び１８）を用いる方法が挙げられる。しかし、食事療法は長期的に実行するには非常に困難であり、食欲抑制剤や脂質代謝改善薬を長期服用する場合においては副作用が懸念される。
【００１２】
一方、高脂血症、肥満、インスリン抵抗性及び糖尿病の予防・改善を目的としＤＧＡＴ活性を阻害する物質の探索が行われ、ＤＧＡＴ活性を阻害する食品素材として、これまでに柑橘類に多く含まれるフラボノイド、タンゲレチンがヒト肝臓由来ＨｅｐＧ２細胞のＤＧＡＴ活性を阻害することが報告されている（非特許文献１９）。
また、ミカン科の植物ゴシュユ（呉茱萸、Evodia rutaecarpa）の果実に含まれるキノロンアルカロイドにも、ＤＧＡＴ阻害作用があると報告されている（非特許文献２０）。しかしながら、これまでに見出されている食品素材は、その効果の面で十分満足のいくものではない。
【００１３】
また、食品素材以外にもＤＧＡＴ活性を阻害する化合物として、フェノキシアセトアミド誘導体やオキサジアゾール誘導体が開示されている（特許文献１及び２）。
【００１４】
ところで、ラズベリー熱水抽出物にはリパーゼ阻害作用があること（特許文献３）、ラズベリー果汁に消臭作用があること（特許文献４）、ラズベリーの水及び／又はエタノール抽出物に抗アレルギー作用があること（特許文献５）が知られているが、ラズベリー又はその抽出物にＤＧＡＴ活性阻害作用があることは知られていない。
また、ラズベリー等の植物には、エラジタンニンが含まれていることが知られているものの（非特許文献２１〜２３）、エラジタンニン又はその誘導体に、ＤＧＡＴ活性阻害作用があることもこれまでには知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第２００６／０８２０１０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００７／１３８３０４号パンフレット
【特許文献３】特開２００５−８５７２号公報
【特許文献４】特開２０００−２７９５０２号公報
【特許文献５】特開平１０−２３６９６５号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Carlson L. A. et al. Acta Med. Scand., 218, 207-211 (1985)
【非特許文献２】Castelli W. P. Am.Heart J., 112, 432-437 (1986)
【非特許文献３】多田紀夫 臨床医薬 21, 215-224 (2005)
【非特許文献４】中村治雄 医学のあゆみ 157, 771-775 (1991)
【非特許文献５】新・高トリグリセライド血症ハンドブック，秦葭哉，医薬ジャーナル社 (1998)
【非特許文献６】Peiris A. N. et al. Ann. Intern. Med., 110, 867-872 (1989)
【非特許文献７】Matsuzawa Y. et al. Obes. Res. 3 Suppl. 2, 187S-194S (1995)
【非特許文献８】Chan J. C. et al. I. Int. J. Obes. Relat. Metab .Disord., 26, 994-1008 (2002)
【非特許文献９】Lyon C. J. and Hsueh W. A. Am. J. Med. 115 Suppl. 8A, 62S-68S (2003)
【非特許文献１０】堀田喜久子 松澤佑次 日本臨床 59, 481-486 (2001)
【非特許文献１１】Chen H. C. et al. J. Clin. Invest., 11, 1715-1722 (2003)
【非特許文献１２】Boden, G. et al. J. Clin. Invest., 88, 960-966 (1991)
【非特許文献１３】Roden, M. et al. J. Clin. Invest., 97, 2859-2865 (1996)
【非特許文献１４】Dresner, A. et al. J. Clin. Invest., 103, 253-259 (1999)
【非特許文献１５】Inoue S. et al. Am. J. Clin. Nutr., 55, 199S-202S(1992)
【非特許文献１６】Ryan D. H. et al. Obes. Res., 3, 553S-559S(1995)
【非特許文献１７】Monk, J. P. and Todd P. A. Drugs, 33, 539-576 (1987)
【非特許文献１８】多田紀夫 Ther. Res., 21, 2320-2325 (2000). Carlson L. A. et al. Acta Med.Scand., 218, 207-211 (1985)
【非特許文献１９】Kurowska E. M. et al. Lipids, 39, 143-151 (2004)
【非特許文献２０】Ko J. S. et al. Planta Med., 68, 1131-1133 (2002)
【非特許文献２１】Kahkonen M. P. et al. J.Agric. Food Chem., 49(8), 4076 (2001)
【非特許文献２２】Yoshida T. et al. Chem. Pharm. Bull, 40(8), 1997 (1992)
【非特許文献２３】Tanaka T. et al. Chem Pharm. Bull., 41(7), 1214 (1993)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、高脂血症、肥満、インスリン抵抗性及び糖尿病の予防又は改善に有効なＤＧＡＴ阻害剤等を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、ＤＧＡＴ活性阻害作用を有し、かつ安全性の高い物質について探索を行なった結果、食の経験が豊富なラズベリー又はその抽出物が優れたＤＧＡＴ活性阻害作用及びＴＧ合成抑制作用を有していることを見出し、特にラズベリーに含まれる下記式（１）で表される部分構造を有するエラジタンニン又はその誘導体（以下、「ＧＯＤ型エラジタンニン又はその誘導体」とも云う）が薬理活性の主体であることを見出した。そして、本発明者らは、ラズベリー又はその抽出物を、ＤＧＡＴ活性阻害、ＴＧ合成抑制や高脂血症、肥満、インスリン抵抗性及び糖尿病の予防・改善を目的とした医薬品又は食品等として使用できることを見出した。
【００１９】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１１）に係るものである。
（１） ラズベリー又はその抽出物を有効成分とするＤＧＡＴ阻害剤。
（２） 抽出物が、有機溶剤抽出物である前記（１）記載のＤＧＡＴ阻害剤。
（３） 有機溶剤抽出物が、含水エタノール抽出物又は含水アセトン抽出物である前記（２）記載のＤＧＡＴ阻害剤。
【００２０】
（４） ラズベリー又はその抽出物を有効成分とするＴＧ合成抑制剤。
（５） 抽出物が、エラジタンニン又はその誘導体を主成分とする前記（４）記載のＴＧ合成抑制剤。
（６） 抽出物が、有機溶剤抽出物である前記（４）又は（５）記載のＴＧ合成抑制剤。
（７） 有機溶剤抽出物が、含水エタノール抽出物又は含水アセトン抽出物である前記（６）記載のＴＧ合成抑制剤。
【００２１】
（８） ラズベリー又はその抽出物を有効成分とするインスリン抵抗性予防又は改善剤。
（９） ラズベリー又はその抽出物を有効成分とする糖尿病予防又は改善剤。
【００２２】
（１０） 分子内に式（１）
【００２３】
【化１】
【００２４】
で表される部分構造及びグルコース残基を有し、当該グルコース残基の４位と６位に式（１）で表される部分構造のヘキサヒドロジフェノイル基部分が置換したエラジタンニン又はその誘導体を有効成分とする、高脂血症、肥満、インスリン抵抗性若しくは糖尿病の各症状の予防若しくは改善剤、又はＴＧ合成抑制剤。
（１１） エラジタンニン又はその誘導体は、サンギインＨ−６及びランベルチアニンＣから選ばれる１種以上である前記（１２）記載の高脂血症、肥満、インスリン抵抗性若しくは糖尿病の各症状の予防若しくは改善剤、又はＴＧ合成抑制剤。
【発明の効果】
【００２５】
本発明のＤＧＡＴ阻害剤、ＴＧ合成抑制剤、高脂血症予防・改善剤、肥満予防・改善剤、インスリン抵抗性予防・改善剤、又は糖尿病予防・改善剤は、優れたＤＧＡＴ阻害作用等を有するので、高脂血症、肥満、インスリン抵抗性及び糖尿病の予防・改善をするための医薬品又は食品等として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＨＰ−２０分画品、固液分画品、ランベルチアニンＣ精製品、サンギインＨ−６精製品のＨＰＬＣ分析を行なった。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
後記実施例に示すように、ラズベリー又はその抽出物は優れたＤＧＡＴ阻害作用、血中ＴＧ上昇抑制作用及び血中ＦＦＡ上昇抑制作用（以下、「ＤＧＡＴ阻害作用等」とする）を有する。しかも、ラズベリーは古くから食経験の豊富なものであるため、ラズベリー又はその抽出物を長期間摂取しても安全性は極めて高い。
ここで、ＤＧＡＴ活性の阻害は、ＴＧ合成抑制、高脂血症予防若しくは改善、肥満予防若しくは改善、またインスリン抵抗性予防若しくは改善、又は糖尿病予防若しくは改善の有効な手段である（非特許文献１１）。また、ＴＧ上昇の抑制は、高脂血症とりわけ食後高脂血症の抑制の有効な手段であり、血中ＦＦＡ上昇の抑制は、インスリン抵抗性及び糖尿病の予防又は改善の有効な手段である（非特許文献１２−１４）。
従って、本発明のラズベリー又はその抽出物は、ＤＧＡＴ阻害剤、ＴＧ合成抑制剤、高脂血症予防若しくは改善剤、肥満予防若しくは改善剤、またインスリン抵抗性予防若しくは改善剤、又は糖尿病予防若しくは改善剤（以下、「ＤＧＡＴ阻害剤等」と云う）として使用でき、さらにこれら製剤を製造するために使用することができる。このとき、当該ＤＧＡＴ阻害剤等では、当該ラズベリー又はその抽出物を単独で、又はこれ以外に、必要に応じて適宜選択した担体等の、配合すべき後述の対象物において許容されるものを使用してもよい。なお、当該製剤は配合すべき対象物に応じて常法により製造することができる。
【００２８】
ここで、本発明におけるラズベリーとは、バラ科のRubus idaeusを意味する。
本発明におけるラズベリーは、その植物の種子及び／又は果実等をそのままの状態で、又は圧搾や粉砕、乾燥等の処理をし、汁や粉末等として使用できる。このうち、果実を使用するのが好ましい。
【００２９】
本発明における抽出物は、上記ラズベリーを室温（例えば、４〜５０℃）又は加温（室温〜溶媒沸点）下にて抽出するか又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出すること等の公知の抽出手段により得られるものである。その形態は、特に限定されず、各種溶剤抽出液、その希釈液、その濃縮液、そのペースト又はその乾燥末等の何れの形態でもよい。
【００３０】
本発明のラズベリー抽出物を得るために用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤のいずれも使用することができる。
抽出溶剤の具体例としては、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等の脂肪族カルボン酸エステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；超臨界二酸化炭素；ピリジン類；油脂、ワックス等その他オイル類等の有機溶剤が挙げられ、これらは単独で又は２種以上組み合わせて用いることができる。
【００３１】
この抽出溶剤のうち、ラズベリー抽出物のＤＧＡＴ阻害作用等を向上させる点から、有機溶剤を用いるのが好ましい。
有機溶剤のうち、ラズベリー抽出物のＤＧＡＴ阻害作用等を向上させる点から、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等の脂肪族カルボン酸エステル類等から選ばれる１種以上のものを用いるのが好ましい。このうち、炭素数１〜４のアルコール類、よりエタノール、プロパノール、ブタノール等の炭素数２〜４の低級アルコール類；炭素数３〜５のケトン類、よりアセトン、メチルエチルケトン等のケトン類等の水溶性有機溶剤から選ばれる１種以上のものを用いるのが好ましく、エタノール及びアセトンから選ばれる１種以上のものを用いるのがより更に好ましい。
なお、これら有機溶剤には、水が含まれていても良い（以下、「水が含まれているもの」を「含水有機溶剤」と云う）。
更に、これら有機溶剤のうち、含水有機溶剤が好ましく、含水水溶性有機溶剤がより好ましく、含水エタノール及び含水アセトンが更に好ましい。
【００３２】
有機溶剤と水との配合割合（容量比）としては、０．００１〜１００：９９．９９９〜０が好ましく、５〜９５：９５〜５がより好ましく、２０〜８０：８０〜２０が更に好ましく、３０〜７０：７０〜３０がより更に好ましく、４０〜６０：６０〜４０がより好ましい。含水アルコール類の場合、アルコール類濃度が４０〜６０容量％であることが好ましく、また、含水アセトンの場合、アセトン濃度が４０〜８０容量％であることが好ましい。
【００３３】
溶剤の使用量としては、ラズベリー（乾燥質量換算）１ｇに対して１〜１００ｍＬが好ましく、抽出時間としては、１分間〜１００日間が好ましく、１分間〜１０日間がより好ましい。このときの抽出温度としては、０℃〜溶媒沸点、より５〜８０℃、更に５〜５０℃、より更に１０〜４０℃が好ましい。
【００３４】
ラズベリー抽出物を得る抽出手段は、具体的には、固液抽出、液液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等の手段を用いることができる。
例えば、浸漬の好適な一例として、４〜５０℃で、５時間〜１０日間の浸漬が挙げられる。
また、抽出時間を短縮する場合には、攪拌を伴う固液抽出が望ましい。この固液抽出の好適な条件の一例としては、１０〜１００℃（好ましくは１０〜５０℃）下、１０００〜５０００ｒｐｍで１〜３０分間の攪拌が挙げられる。
抽出物の酸化を防止するため、煮沸脱気や窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、いわゆる非酸化的雰囲気下で抽出する手段を併用してもよい。
更に、ラズベリー抽出物の薬理活性を向上させる点から、上記抽出物から不活性な夾雑物を除去するため、クロマトグラフィーや液々分配等の分離技術を用いてもよい。
【００３５】
また、ラズベリー又はその抽出物から水溶性の不活性な夾雑物を除去するため、ラズベリー又はその抽出物を水洗するのが好ましい。また、ラズベリーの新鮮果実より果汁を圧搾抽出した残渣を、上述の有機溶剤で抽出する方法も有効である。
水洗の一例として、ラズベリーを、ホモジナイズや粉砕し、適宜乾燥等の前処理を行なった後、水洗して、遠心分離やろ過等の分離手段により得られたラズベリー残査を予め調製し、次いで上述の有機溶剤で抽出する方法が挙げられる。
水洗の際に、浸漬、超音波、マイクロ波、攪拌、振とう等の物理的手段を用いることができる。このうち攪拌が好ましく、このときの回転数は、１０００〜５０００ｒｐｍ程度であればよい。
水洗の際の処理時間としては、１〜６０分間が好ましく、１〜３０分間がより好ましく、水洗の際の処理温度としては、４〜１００℃が好ましく、抽出物の変質を抑制する場合には、４〜５０℃が望ましい。
このときの水の使用量としては、ラズベリー又はその抽出物（乾燥質量換算）１ｇに対して、１〜１００ｍＬが好ましい。
なお、ラズベリー残査から上述の有機溶剤で抽出する方法としては、４〜８０℃下で、当該残渣と有機溶剤とを１〜３０分間混合攪拌（１０００〜５０００ｒｐｍ程度）して抽出する方法が好ましい。
【００３６】
また、ラズベリー又はその抽出物（好ましくは有機溶剤抽出物）をクロマトグラフィーに付すのが、ラズベリー抽出物のＤＧＡＴ阻害作用等を向上させる点から、好ましい。
クロマトグラフィーに用いる固定相としては、例えば、強・弱酸性イオン交換樹脂又は強・弱塩基性イオン交換樹脂；オクタデシル化シリカゲル、オクチル化シリカゲル、ブチル化シリカゲル、トリメチルシリル化シリカゲル等の逆相樹脂；シリカゲル、フロリジール、アルミナ等の順相樹脂；スチレン−ジビニルベンゼン系、メタクリル酸エステル系等の芳香族系合成樹脂；修飾デキストラン系（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標） ＬＨ−２０等）、親水性ビニルポリマー系（例えば、トヨパール ＨＷ−４０等）等のゲルろ過クロマトグラフィー用充填剤；活性炭等が挙げられるが、このうち、逆相樹脂及び芳香族系合成樹脂、ゲルろ過クロマトグラフィー用充填剤等好ましい。
【００３７】
ラズベリー又はその抽出物（好ましくはラズベリー有機溶剤抽出物）をクロマトグラフィーに付してＤＧＡＴ阻害作用を有する溶出画分（以下、「活性画分」又は「ＤＧＡＴ活性画分」とも云う）を得る方法の一例として、以下の方法が挙げられる。このとき、活性画分を検出する際の波長としては、２６０〜３００ｎｍ、より２７０〜２９０ｎｍが好ましい。
【００３８】
ラズベリー又はその抽出物を、逆相樹脂を用いた中・高圧クロマトグラフィーに付した後、溶出溶媒をグラジュエントして、活性画分を得る。
このときの溶出溶媒としては、ぎ酸：水：アセトニトリル＝０〜５：１００〜０：０〜１００、より０．０１〜２：９５〜１０：５〜９０のグラジュエントが好ましい。カラム温度としては、２０〜５０℃、より３０〜４０℃が好ましい。また、流速としては、１〜４０ｍＬ／分、より１５〜２５ｍＬ／分が好ましい。活性画分を分取する際の保持時間は、５〜１００分、より２０〜５０分が好ましい。
【００３９】
また、ラズベリー又はその抽出物を、芳香族系合成樹脂を用いた中・高圧クロマトグラフィーに付して吸着後、樹脂体積の１００〜１０００容量％（好ましくは３００〜６００容量％）の水で洗浄し、次いで樹脂体積の１００〜１０００容量％（好ましくは３００〜６００容量％）の有機溶剤又は含水有機溶剤で溶出させ、活性画分を得る。用いる有機溶剤又は含水有機溶剤は上述と同様のものを用いればよい。
【００４０】
更に、上述の逆相樹脂を用いたクロマトグラフィーと芳香族系合成樹脂を用いたクロマトグラフィーとを併用してもよく、ラズベリー又はその抽出物を付す際の順序としてはいずれが先でもよいが、ラズベリー又はその抽出物を芳香族系合成樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して活性画分を得、次いで得られた活性画分を逆相樹脂を用いたクラマトグラフィーに付して更に薬理活性が向上した活性画分を得るのが好ましい。
【００４１】
更に、後記実施例に示すように、ラズベリー又はその抽出物から、クロマトグラフィーによりＤＧＡＴ活性画分を分取し、更にＤＧＡＴ活性画分に下記に示すサンギインＨ−６及びランベルチアニンＣが含まれる。そして、このサンギインＨ−６及びランベルチアニンＣは、ラズベリー抽出物よりも更に優れたＤＧＡＴ阻害作用等を有する。斯様なことから、サンギインＨ−６及びランベルチアニンＣ、すなわちエラジタンニン又はその誘導体が、ラズベリー又はその抽出物におけるＤＧＡＴ阻害作用等の薬理活性の主成分と考えられる。
【００４２】
【化２】
【００４３】
従って、本願発明は、分子内に下記式（１）
【００４４】
【化３】
【００４５】
で表される部分構造及びグルコース残基を有し、当該グルコース残基の４位と６位に式（１）又は（２）で表される部分構造のヘキサヒドロジフェノイル基部分が置換したエラジタンニン又はその誘導体を有効成分とするＤＧＡＴ阻害剤を提供するものである。
【００４６】
このため、ラズベリー又はその抽出物を、上記抽出・分離技術及び適宜公知の精製技術により、ＧＯＤ型エラジタンニン又はその誘導体を含むラズベリー抽出物（画分）、更にＧＯＤ型エラジタンニン又はその誘導体を主成分とするラズベリー抽出物（画分）にするのが、薬理活性を向上させる点から、好ましい。
このときのラズベリー抽出物（画分）中のＧＯＤ型エラジタンニン又はその誘導体の含有量は、乾燥質量換算で、０．０１質量％以上、より０．５質量％以上、更に１５質量％以上、より更に９５質量％以上であるのが、薬理活性向上の点から、好ましい。
【００４７】
なお、ラズベリー又はその抽出物は、そのまま用いてもよく、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、あるいは濃縮エキスや乾燥粉末としたり、ペースト状に調製したものでもよい。また、凍結乾燥し、用時に、通常抽出に用いられる溶剤、例えば水、エタノール、水・エタノール混液等の溶剤で希釈して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
【００４８】
本発明において、エラジタンニンとは、ヘキサヒドロジフェノイル基を有し、かつ、加水分解して脱水環化することにより、エラグ酸を生成するタンニンの総称を意味する。
【００４９】
ここで、ラズベリー又はその抽出物に含まれているエラジタンニン又は誘導体とは、少なくとも下記式（１）
【００５０】
【化４】
【００５１】
で表される部分構造を有するエラジタンニン関連加水分解性タンニンをいう。
このうち、薬理活性の向上の点から、好適なエラジタンニン誘導体としては、上記式（１）で表される部分構造に、さらにグルコース残基を有し、当該グルコース残基の４位と６位に上記式（１）で表される部分構造のヘキサヒドロジフェノイル基部分が置換したものが挙げられる。
【００５２】
ＧＯＤ型エラジタンニン又はその誘導体のうち、下記式（２）で表されるものが好ましい。
【００５３】
【化５】
【００５４】
式（２）中、Ｒ1は、水素原子又はガロイル基を表す。式（２）中、「〜ＯＲ1」は、α型及び／又はβ型の存在を表す。
式（２）中、Ｒ2及びＲ3は、同一又は異なって水素原子又はガロイル基を表すか、又は一緒になってヘキサヒドロキシジフェノイル基を表す。
式（２）中、Ｒ4は、
【００５５】
【化６】
【００５６】
〔式中、Ｒ5及びＲ6は、同一又は異なって水素原子又はガロイル基を表す。〕を表す。
式（２）中、ｍは０〜２（好ましくは０又は１）を表す。
【００５７】
【化７】
【００５８】
ＧＯＤ型エラジタンニン又はその誘導体としては、可食植物に存在し、安全性が高い点から、好適には、サンギインＨ−２、サンギインＨ−３、サンギインＨ−６、サンギインＨ−７、サンギインＨ−８、サンギインＨ−９、サンギインＨ−１０及びサンギインＨ−１１等のサンギイン；ランベルチアニンＡ，ランベルチアニンＢ、ランベルチアニンＣ、ランベルチアニンＤ等のランベルチアニン；ロシェニンＡ、ロシェニンＢ、ロシェニンＣ、ロシェニンＤ、ロシェニンＥ等のロシェニン等が例示できる。
この例示物のうち、ＤＧＡＴ阻害活性の点から、サンギインＨ−６及びランベルチアニンＣが好ましい。
【００５９】
【化８】
【００６０】
【化９】
【００６１】
【化１０】
【００６２】
本発明のエラジタンニン又はその誘導体には、公知の化学合成法により得られるものや、エラジタンニン又はその誘導体を主成分とする植物抽出物（例えば、非特許文献２１〜２３参照）又はその精製物等も包含される。このとき、薬理活性の向上の点から、エラジタンニン又はその誘導体を主成分とする植物抽出物中に、乾燥物換算で、エラジタンニン又はその誘導体が、０．５質量％以上、より１５質量％以上含まれていることが好ましい。
例えば、サンギイン及び／又はランベルチアニンとしては、ラズベリー（Rubus ideus）の果実から抽出、又はその抽出物を濃縮もしくは精製したものを使用することができる。
なお、本発明のエラジタンニン又はその誘導体を植物から抽出・分離・精製する際には、上述のラズベリーからの抽出・分離・精製手段を適用すればよい。
また、得られたエラジタンニン又はその誘導体が含まれる抽出物や画分は、上述のラズベリー抽出物や画分の形態と同じく好適な形態にして適宜用いてもよい。
【００６３】
本発明のエラジタンニン又はその誘導体は、ＤＧＡＴ阻害作用等を有することから、前述のとおり、ＤＧＡＴ阻害剤等として使用でき、さらにこれら製剤を製造するために使用することができる。このとき、当該ＤＧＡＴ阻害剤等では、当該エラジタンニン又はその誘導体を単独で、又はこれ以外に、必要に応じて適宜選択した担体等の、配合すべき後述の対象物において許容されるものを使用してもよい。なお、当該製剤は配合すべき対象物に応じて常法により製造することができる。
【００６４】
従って、本発明のラズベリー若しくはその抽出物、又はエラジタンニン若しくはその誘導体を有効成分とするＤＧＡＴ阻害剤等は、ＤＧＡＴ阻害活性；ＴＧ合成抑制；高脂血症、肥満、インスリン抵抗性若しくは糖尿病の各症状の予防、改善又は治療等の各効果を発揮する、ヒト若しくは動物（非ヒト）用の医薬品、医薬部外品、食品、機能性食品又は飼料等の有効成分として配合して使用可能である。また、当該ＤＧＡＴ阻害剤等は、ＤＧＡＴ阻害活性；ＴＧ合成抑制；高脂血症、肥満、インスリン抵抗性若しくは糖尿病の各症状の予防、改善又は治療等をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品に応用できる。
【００６５】
本発明のＤＧＡＴ阻害剤等を医薬品の有効成分として用いた場合、当該医薬品は任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、経口、経腸、経粘膜、注射等が挙げられる。経口投与のための製剤の剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等が挙げられる。非経口投与としては、静脈内注射、筋肉注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。
【００６６】
また、斯かる製剤では、本発明のＤＧＡＴ阻害剤等を単独で、又は他の薬学的に許容される担体とを組み合わせて使用してもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、光沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、矯味剤、矯臭剤、増量剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、香料、被膜剤等が挙げられる。
【００６７】
これらの投与形態のうち、経口投与が好ましく、経口投与用製剤の有効成分として用いる場合の該製剤中の、ラズベリー又はその抽出物の含有量は、乾燥物換算で、通常、製剤全質量の０．０４〜１００質量％であり、２．０〜８０質量％であるのが好ましい。また、有効成分エラジタンニン又はその誘導体の含有量は、通常、製剤全質量の０．０１〜８０質量％であり、０．５〜８０質量％であるのが好ましい。
【００６８】
上記製剤の投与量は、患者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与の場合の成人１人（６０ｋｇ）当たりの１日の投与量は、ラズベリー又はその抽出物（乾燥物換算）を有効成分として、通常、４〜８０００ｍｇ、より４０〜８０００ｍｇ、更に２００〜２０００ｍｇが好ましい。また、当該成人１人当たりの１日の投与量は、通常、エラジタンニン又はその誘導体を有効成分として１〜２０００ｍｇ、より１０〜２０００ｍｇ、更に１０〜１０００ｍｇ、より更に５０〜５００ｍｇが好ましい。
また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、１日１回〜数回に分けて投与することが好ましい。
【００６９】
本発明のＤＧＡＴ阻害剤等を食品の有効成分として用いた場合、当該食品の形態は、固形、半固形または液状であり得る。食品の例としては、パン類、麺類、菓子類、ゼリー類、乳製品、冷凍食品、インスタント食品、でんぷん加工製品、加工肉製品、その他加工食品、飲料、スープ類、調味料、栄養補助食品等、およびそれらの原料が挙げられる。また、上記の経口投与製剤と同様、錠剤形態、丸剤形態、カプセル形態、液剤形態、シロップ形態、粉末形態、顆粒形態等であってもよい。
種々の形態の食品を調製するには、ＤＧＡＴ阻害剤等を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００７０】
食品中におけるラズベリー又はその抽出物の含有量は、その使用形態により異なるが、通常、飲料の形態では、通常０．００４〜８質量％であり、０．００８〜４質量％、より０．０４〜２質量％であるのが好ましい。また、錠剤や加工食品などの固形食品形態では、通常０．０４〜８０質量％であり、０．０８〜４０質量％、より０．４〜２０質量％であるのが好ましい。
また、食品中における有効成分エラジタンニン又はその誘導体の含有量は、その使用形態により異なるが、通常、飲料の形態では、通常０．００１〜２質量％であり、０．００２〜１質量％、より０．０１〜０．５質量％であるのが好ましい。また、錠剤や加工食品などの固形食品形態では、通常０．０１〜２０質量％であり、０．０２〜１０質量％、より０．１〜５質量％であるのが好ましい。
【００７１】
また、本発明のＤＧＡＴ阻害剤等を飼料の有効成分として用いた場合には、当該飼料としては、例えば、牛、豚、鶏、羊、馬等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、マグロ、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、犬、猫、小鳥、リス等に用いるペットフード等が挙げられる。
尚、飼料を製造する場合には、ＤＧＡＴ阻害剤等を単独で、又はこの他に、牛、豚、羊等の肉類、蛋白質、穀物類、ぬか類、粕類、糖類、野菜、ビタミン類、ミネラル類等一般に用いられる飼料原料、更に一般的に飼料に使用されるゲル化剤、保型剤、ｐＨ調整剤、調味料、防腐剤、栄養補強剤等を必要に応じて配合し、常法により当該飼料を加工製造することがきできる。
【００７２】
飼料中におけるまた、ラズベリー又はその抽出物の含有量は、その使用形態により異なるが、乾燥物換算で、通常０．０４〜８０質量％であり、０．０８〜４０質量％、より０．４〜２０質量％であるのが好ましい。
また、飼料中における有効成分エラジタンニン又はその誘導体の含有量は、その使用形態により異なるが、通常０．０１〜２０質量％であり、０．０２〜１０質量％、より０．１〜５質量％であるのが好ましい。
【００７３】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【実施例】
【００７４】
製造例１：ラズベリー５０％エタノール抽出物の調製
ラズベリー（Rubus idaeus L.）果実の凍結乾燥粉末（FDラズベリーパウダー、協立物産より入手）１００ｇを、１０倍量（１Ｌ）の５０容量％（以下、「％」とする）エタノール水（エタノール濃度５０容量％）に室温（２０〜３０℃）で１５時間浸漬し、不溶物を濾別後、減圧濃縮し抽出物を得た（固形分５９ｇ）。
なお、ＧＯＤ型エラジタンニンの含有量及び同定を以下の方法にて求めた。
エラジタンニンの定量及び同定方法
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（オクタデシル化シリカゲル、ＧＬサイエンス社製、４．６ ｘ ２５０ｍｍ， ５mｍ）
カラム温度：４０℃
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
溶離液：Ａ液 １％ぎ酸水溶液、Ｂ液 アセトニトリル
Ａ／Ｂ＝（０分）９０／１０→９０／１０（１０分）→８０／２０（７０分）→９０／１０（７１分）→９０／１０（８０分）
【００７５】
ラズベリー５０％エタノール抽出物〔固形分〕（乾燥質量換算）中のＧＯＤ型エラジタンニンの総含有量は、１．０質量％であった。エラジタンニンとして、ＨＰＬＣ分析にてサンギインＨ−６，ランベルチアニンＣが同定された。
【００７６】
製造例２：ラズベリー７０％アセトン抽出物の調製
ラズベリー（Rubus idaeus L.）果実の凍結乾燥粉末（FDラズベリーパウダー、協立物産より入手）１ｇを、１０倍量（１０ｍＬ）の７０％アセトン水（アセトン濃度７０容量％）に室温（２０〜３０℃）で７日間浸漬し、不溶物を濾別後、減圧濃縮し抽出物を得た（固形分０．３ｇ）。
ラズベリー７０％アセトン抽出物〔固形分〕（乾燥質量換算）中のＧＯＤ型エラジタンニンの総含有量は、０．７質量％であった。また、エラジタンニンとして、ＨＰＬＣ分析にて、サンギインＨ−６，ランベルチアニンＣが同定された。
【００７７】
実施例１：ＤＧＡＴ活性阻害試験
５０μｇの肝臓ミクロソーム画分を、表中に示した被験物質をエラジタンニンが最終濃度０．１質量％で含む２００μＬのＤＧＡＴ活性測定バッファー（250mM Sucrose, 10mM Tris-HCl (pH7.5), 10 mM MgCl2, 0.8 mM EDTA, 0.1% Bovine Serum Albumin, 100μM Oleoyl-CoA (0.05μCi/200μＬ、55mCi/mmol), 1.2 mM 1,2-diolein)中で、37℃、20分間インキュベートした。
各被験物質の存在下でのＤＧＡＴ活性を、表１に示す。ＤＧＡＴ活性は、溶媒コントロールのＤＧＡＴ活性を１００とした相対値で表す。
【００７８】
【表１】
【００７９】
製造例３：ラズベリー固液（５０％エタノール）分画品の調製
ラズベリー（Rubus idaeus L.）果実の凍結乾燥粉末（FDラズベリーパウダー、協立物産より入手）４０ｇに、１０倍量（４００ｍＬ）のイオン交換水を加え、ＴＫオートホモミキサー（特殊機化工業社製）により、室温（２０〜３０℃）下３０００ｒｐｍで１０分間攪拌した。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、２０分）し、上澄を除去した。本操作の水洗を３回繰り返し、水溶性成分を除去した後、残渣を５０％エタノール水で抽出した。抽出は５０％エタノール水４００ｍＬを用い、ＴＫオートホモミキサー（特殊機化工業社製）により、室温下３０００ｒｐｍで１０分間攪拌、その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、２０分）により、上澄みを得るといった方法で行った。本抽出操作も３回繰り返し、得られる３回分の上澄を併せ、減圧濃縮し固液分画品を得た（１．３ｇ）。
固液分画（乾燥質量換算）中のＧＯＤ型エラジタンニンの総含有量は、２３．９質量％であった。エラジタンニンとして、ＨＰＬＣ分析にて、サンギインＨ−６，ランベルチアニンＣが同定された（図１参照）。
【００８０】
実施例２：高脂血症抑制試験
実験動物は、チャールスリバージャパンから購入したＣ５７ＢＬ／６マウス（７週齢）を約１週間馴化した後使用した。トリアシルグリセロール合成抑制剤としては、製造例３で調製したラズベリー抽出物（固液分画品）を用いた。試験群及び対照群につき、一群９匹のマウスを用いた。脂質負荷は、体重１ｇ当たり４０μＬの脂質エマルジョン（１０％トリアシルグリセロール油、１％卵黄レシチン、４％ウシ血清アルブミン）を、胃ゾンデを用いて経口投与することで行った。試験群に与える脂質エマルジョンにはさらにラズベリー抽出エキスを終濃度１％となる様に添加して用いた。投与１、２、４、６時間後に採血を行い、血漿中のトリアシルグリセロール濃度およびＦＦＡ濃度を測定した。ＴＧ濃度の測定は、トリグリセライドＥ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて、グリセリン消去法により行った。ＦＦＡ濃度の測定は、ＮＥＦＡ Ｃ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて、アシル−ＣｏＡシンターゼ・アシル−ＣｏＡオキシダーゼ法により行った。反応は、９６ウエルプレート中で行い、バイオラド社マイクロプレートリーダーＭＯＤＥＬ５５０を用いて、ＴＧ濃度はＯＤ５９５ｎｍ、ＦＦＡ濃度はＯＤ５５０ｎｍの吸光度を測定した。ＴＧ濃度は、キット付属のグリセリン標準液を用いて作製した検量線より、血漿に含まれるトリアシルグリセロール濃度を求めた。ＦＦＡ濃度は、キット付属のオレイン酸標準液を用いて作製した検量線より、血漿に含まれるＦＦＡ濃度を求めた。ＴＧ濃度の変化及び変化量（Δ）の結果を、それぞれ表２と表３に示す。ＦＦＡ濃度の変化及び変化量（Δ）の結果を、それぞれ表４と５示す。
【００８１】
【表２】
【００８２】
【表３】
【００８３】
【表４】
【００８４】
【表５】
【００８５】
表２に示す様に、脂質エマルジョンの経口投与を行ったところ、投与１〜２時間後をピークとした血漿ＴＧ濃度の上昇が認められたが、試験群では、脂質負荷後の血漿ＴＧ濃度の低下が確認された。投与２時間後のＴＧレベルにおいては、試験群において、対照群と比較して、血漿ＴＧ濃度が２３．８％低下していた。また、表３に示す様に、試験群では、脂質エマルジョン経口投与後の血漿ＴＧ濃度の変化量においても、対照群と比較して、ＴＧ濃度増加の抑制が確認された。血漿ＴＧ濃度の変化量は、試験群において、対照群と比較して、３７．１％の低下であった。従って、ラズベリー抽出物は高脂血症、とりわけ食後高脂血症の抑制に有効であると考えられる。
さらに、表４に示す様に、脂質エマルジョン投与後のＦＦＡレベルは、ＴＧレベルと同様、脂質エマルジョンの経口投与１〜２時間後をピークとして上昇が認められたが、試験群では、脂質負荷後の血漿ＦＦＡ濃度の低下が確認された。投与２時間後のＦＦＡレベルは、試験群において、対照群と比較して、血漿ＦＦＡ濃度が２３．０％低下していた。また、表５に示す様に、試験群では、脂質エマルジョン経口投与後の血漿ＦＦＡ濃度の変化量においても、対照群と比較して、ＦＦＡ濃度増加の抑制が確認された。血漿ＦＦＡ濃度の変化量は、試験群において、対照群と比較して、８１．９％の低下であった。従って、ラズベリー抽出物はＦＦＡ濃度の減少を介して、インスリン抵抗性および糖尿病の予防又は改善に有効であると考えられる。
【００８６】
製造例５：ラズベリーからの被験物質（サンギインＨ−６，ランベルチアニンＣ）の調製
（１）ラズベリー５０％エタノール抽出物の調製
製造例１の抽出物を用いた。
（２）ラズベリーＨＰ−２０分画品（以下、「分画物」とも云う）の調製
上記（１）の抽出物のうち２０ｇを水に再溶解した後、スチレン−ジビニルベンゼン系の芳香族合成吸着剤であるダイヤイオンＨＰ−２０（１０００ｍＬ）に吸着させた。ＨＰ−２０は水４Ｌで洗浄した後、５０％エタノール水４Ｌで溶出した。得られた溶出液は減圧にて濃縮し、ＨＰ−２０分画物１．２１ｇを得た。
ＨＰ−２０分画品（乾燥質量換算）中のＧＯＤ型エラジタンニンの総含有量は、１７．９質量％であった。
（３）サンギインＨ−６精製品、ランベルチアニンＣ精製品の調製
上記（２）で得られた分画物のうち４００ｍｇを用い、さらにＨＰＬＣで分画することにより、サンギインＨ−６（４３ｍｇ）、ランベルチアニンＣ（１６ｍｇ）を単離し、ピーク保持時間はそれぞれ、３８〜４１分、３６〜３８分であった（図１参照）。
＜分画条件＞
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（オクタデシル化シリカゲル、２０ｘ２５０ｍｍ、ＧＬサイエンス）
溶媒：Ａ液 １％ぎ酸水溶液、Ｂ液 アセトニトリル
Ａ／Ｂ＝（０分）９０／１０→９０／１０（１０分）→８０／２０（４０分）→９０／１０（４１分）→９０／１０（４５分）
温度：４０℃、流速：１８．９ｍＬ／分、検出：ＵＶ＝２８０ｎｍ
サンプル４００ｍｇを２０ｍＬの１０％エタノールに溶解後、1ｍＬづつ２３回チャージ
得られたサンギインＨ−６精製品およびランベルチアニンＣ精製品の1H および13C NMRスペクトルは、非特許文献２２および２３記載のサンギインＨ−６およびランベルチアニンＣの1H および13C NMRスペクトルのデータと一致した。
よって、ラズベリーから抽出された、製造例３の固液分画品及び製造例３のＨＰ−２０分画品を、少なくとも保持時間３１〜４６分で分取する（図１参照）と、薬理活性の主体であるＧＯＤ型エラジタンニン又はその誘導体を更に精製できると共に、得られた活性画分の薬理作用を高めることができる。
【００８７】
実施例３：ラズベリー抽出物より単離したサンギインＨ−６及びランベルチアニンＣのＤＧＡＴ活性阻害評価
被験物質として、上記製造例５でラズベリー抽出物より単離したサンギインＨ−６及びランベルチアニンＣと、ＥＧＣＧ（エピガロカテキンガレート：入手先：長良サイエンス）を用いた。
マウス肝臓より、ミクロソーム画分を下記の様に調製し、ＤＧＡＴ活性測定に使用した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄性、６週齢）の肝臓をＳｕｃｒｏｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ （250mM Sucrose, 1mM EDTA, 10mM Tris-HCl (pH7.5)）中でホモジナイズし、４℃、１２，５００ ｘ ｇ、１５分間遠心し上清を回収した。上清をさらに４℃、１００，０００ ｘ ｇ、６０分間遠心し、沈殿をＳｕｃｒｏｓｅ Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁し、肝臓ミクロソーム画分として使用した。
５０μｇの肝臓ミクロソーム画分を、表中に示した濃度の各被験物質を含む２００μＬのＤＧＡＴ活性測定バッファー（250mM Sucrose, 10mM Tris-HCl (pH7.5), 10 mM MgCl2, 0.8 mM EDTA, 0.1% Bovine Serum Albumin, 100μM Oleoyl-CoA (0.05μCi/200μＬ、55mCi/mmol), 1.2 mM 1,2-Diolein）中で、３７℃、２０分間インキュベートした。１．５ｍＬのクロロホルム／メタノール（１：１）を添加することで反応を止めた。次に、２５０μＬのＰＢＳを加えて攪拌し、遠心分離により水層と油層に分離（脂質抽出）した。下層であるクロロホルム層を回収し、窒素ガスで乾燥、クロロホルムに再溶解した。
クロロホルムに溶解した脂質の一部を液体シンチレーションカウンター（Perkin Elmer）に供し、放射活性を測定した。約２０００ｄｐｍの抽出脂質の一部をＨＰＴＬＣプレート（20 x 10 cm Silica gel 60, Merk）を用いて分画した。展開溶媒には、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（８０：２０：１）を使用した。ＢＡＳ２５００（富士フィルム）を用いてフルオログラフィー及び定量解析を行った。抽出脂質に取り込まれた総放射活性に対するＴＧに取り込まれた放射活性の割合をＤＧＡＴ活性とした。
各被験物質の存在下でのＤＧＡＴ活性を、表６に示す。ＤＧＡＴ活性は、溶媒コントロールのＤＧＡＴ活性を１００とした相対値で表す。
表６に示される様に、サンギインＨ-６、及びランベルチアニンＣは、ＤＧＡＴ活性に対し有意な阻害を示した。
この様に、ラズベリーより単離されたエラジタンニンはＤＧＡＴ活性について優れた阻害作用を示すことから、ＤＧＡＴ阻害の他、ＴＧ合成抑制剤、高脂血症予防・改善剤、肥満予防・改善剤、インスリン抵抗性予防・改善剤、及び糖尿病予防・改善剤として有用であると考えられる。
【００８８】
【表６】
【００８９】
実施例４：ラズベリー抽出物より単離したサンギインＨ−６及びランベルチアニンＣの他の酵素活性阻害評価
被験物質として、上記実施例３で用いたものを使用した。
上記実施例３で示した様に調製したマウス肝臓ミクロソーム画分を用いて、グルコース６リン酸脱リン酸化酵素（Ｇ６Ｐａｓｅ）活性測定、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素活性の測定を行った。
Ｇ６Ｐａｓｅ活性測定は、マウス肝臓ミクロソーム画分（５０μｇ）を、表中に示した濃度の被験物質の存在下で、１００μＬの反応液（50 mM HEPES buffer (pH7.2)、100 mM KCl、2.5 mM EDTA、2.5 mM MgCl2、1mMDTT、10 mM glucose-6-phosphate、2 mM EDTA）中で３７℃、３０分間インキュベートした。次に、４００μＬの反応停止液（0.42% ammononium molybdate tetrahydrate in 1N H2SO4、10%SDS、10% ascorbic acidの6:2:1 混合液）を添加し、５０℃、３０分間インキュベートした。生じた青色色素を吸光度測定（ＯＤ820）し、無機リン酸溶液を用いて作製した標準曲線より、生じたリン酸濃度を算出することによりＧ６Ｐａｓｅ活性を算出した。
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性は、マウス肝臓ミクロソーム画分（５０μｇ）を、表中に示した濃度の被験物質の存在下で、14Ｃ標識ＨＭＧ−ＣｏＡを含む反応液（0.128 mM HMG-CoA (14C-HMG-CoA, 72 MBq/mmol), 1mM NADPH、10mM DTT、10mM EDTA in 0.12mM phosphate buffer(pH7.2)）中で、３７℃、３０ 分間インキュベートした。次に、１０分の１容量（２０μＬ）の５Ｎ ＨＣｌを添加し、さらに３０分間インキュベート（酸性処理）した。内部標準として４−14Ｃ−ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ（０．０８ｎＣｉ）を加えた後、酸性処理によりＨＭＧ−ＣｏＡの反応産物メバロン酸から変換、生成するメバロノラクトンを等量の酢酸エチルで抽出した。抽出物の一部を展開溶媒には、ベンゼン−アセトン（１：１）を用いてＴＬＣ分画した。ＢＡＳ２５００（富士フィルム）を用いてフルオログラフィー及び定量解析を行い、メバロノラクトンに含まれる放射活性よりＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を算出した。
各被験物質の存在下でのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性、及びＧ６Ｐａｓｅ活性を、それぞれ、表７、及び表８に示す。これら酵素活性は、溶媒コントロールの酵素活性を１００とした相対値で表す。
【００９０】
表７、及び表８に示される様に、いずれのラズベリー由来のエラジタンニンもＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性、及びＧ６Ｐａｓｅ活性に対して阻害作用を示さなかった。
この様に、ラズベリー由来のエラジタンニンはＤＧＡＴ活性について優れた阻害作用を示す一方で、その他の酵素活性には阻害作用を示さないことから、ＤＧＡＴ活性に対する特異性が高い化合物であることが示された。このことは、ラズベリー由来のエラジタンニンが副作用の少ない化合物であることを意味するものと考えることができる。
【００９１】
【表７】
【００９２】
【表８】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高脂血症、肥満、インスリン抵抗性及び糖尿病の予防又は改善に有効なジアシルグリセロールアシル基転移酵素（以下、「ＤＧＡＴ」という。）阻害剤又はトリアシルグリセロール（以下、「ＴＧ」という。）合成抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の欧米化に伴う恒常的な脂肪の過剰摂取により、高脂血症や肥満の発症率が増加している。高脂血症や肥満は、さらにインスリン抵抗性や糖尿病といった生活習慣病を合併するため、国民の健康維持・増進の観点において大きな社会問題となっている。
【０００３】
高脂血症、とりわけ血中ＴＧ濃度上昇は、虚血性心疾患のリスクとしても問題視されている（非特許文献１〜３）。又、食後に血清脂質が異常な増加を示し、かつ、この増加が蔓延する状態は一般的に食後高脂血症と呼ばれるが、食後高脂血症者は、高血圧や、虚血性心疾患などの動脈硬化性疾患の発症につながる危険性が高いことが指摘されている（非特許文献４及び５）。
【０００４】
肥満、とりわけ内臓脂肪型肥満も、しばしば生活習慣病を合併し、動脈硬化性疾患の発症のリスクを高めることが示されている（非特許文献６及び７）。過剰に脂肪が蓄積した脂肪細胞では、インスリンの働きを高めるアディポネクチンの産生が低下し、動脈硬化性疾患の発症を促進するplasminogen activator inhibitor（ＰＡＩ−１）やtumor necrosis factor（ＴＮＦ−α）等の液性因子の産生が亢進し、このことが生活習慣病の合併や動脈硬化性疾患の発症と関連すると考えられている（非特許文献８）。
【０００５】
インスリン抵抗性は、代謝症候群の中心的存在でインスリンが血液中に十分あるにも関わらず十分効果を発揮できない状態である。
インスリン抵抗性は、糖尿病の原因の１つと考えられている。さらに、インスリン抵抗性及び糖尿病は、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、神経障害等を合併する原因となる上、高脂血症や高血圧を合併することにより、動脈硬化性疾患を発症するリスクが高まることが数多くの疫学的研究により示されている（非特許文献９及び１０）。
【０００６】
以上のことから、一般に高脂血症、肥満、インスリン抵抗性及び糖尿病を予防及び／又は改善をすることは、健康な生活にとって重要なことであると考えられている。
【０００７】
また、食事として摂取したＴＧは、小腸内でリパーゼの働きにより、２−モノアシルグリセロールと脂肪酸に分解された後、小腸上皮細胞に吸収されることが知られている。又、吸収された脂質は、小腸上皮細胞内で、モノアシルグリセロールアシル基質転移酵素（ＭＧＡＴ）やＤＧＡＴ等の酵素の働きにより、ＴＧに再合成される。さらに、合成されたＴＧは、小腸細胞が特異的に生成するアポ蛋白Ｂ４８と会合することにより、カイロミクロン（ＣＭ）として血中に放出される。この様にＤＧＡＴは小腸から体内へのＴＧの取り込みにおいて重要な役割を果たしているが、それに加え、ＤＧＡＴは肝臓における超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）の合成・分泌や脂肪組織のＴＧ蓄積においても必要とされる酵素であるため、ＤＧＡＴ活性の阻害は高脂血症及び肥満の予防・改善の有効な手段となるものと考えられている。
【０００８】
また、ノックアウトマウスを用いた研究により、ＤＧＡＴ欠損マウスでは、体重の減少が見られるのに加えて、血糖値の低下、インスリン感受性の向上、脂肪細胞におけるアディポネクチン発現増加等が認められることから、ＤＧＡＴ活性を阻害することは、インスリン抵抗性や糖尿病の予防・改善の良い手段ともなるものと考えられている（非特許文献
１１）。
【０００９】
以上のことから、ＤＧＡＴ活性を阻害することにより、ＴＧ合成抑制や高脂血症、肥満、インスリン抵抗性、及び糖尿病の予防・改善が可能となる。
【００１０】
また、インスリン抵抗性は、血中の遊離脂肪酸濃度により直接的に影響を受けることが知られている。血中遊離脂肪酸の増加は、糖尿病患者や非糖尿病者において、インスリン抵抗性の原因となることの報告がなされており（非特許文献１２及び１３）、また、遊離脂肪酸が、インスリンシグナル伝達系を阻害し、インスリンによる骨格筋の糖取り込みを抑制することが明らかとなっている（非特許文献１４）。従って、遊離脂肪酸濃度の上昇抑制作用もまた、インスリン抵抗性の改善に結果するものと期待される。
【００１１】
従来の高脂血症、肥満、インスリン抵抗性及び糖尿病の予防・改善を目的としたアプローチの代表例として、食事療法や食欲抑制剤（非特許文献１５及び１６）、脂質代謝改善薬（非特許文献１７及び１８）を用いる方法が挙げられる。しかし、食事療法は長期的に実行するには非常に困難であり、食欲抑制剤や脂質代謝改善薬を長期服用する場合においては副作用が懸念される。
【００１２】
一方、高脂血症、肥満、インスリン抵抗性及び糖尿病の予防・改善を目的としＤＧＡＴ活性を阻害する物質の探索が行われ、ＤＧＡＴ活性を阻害する食品素材として、これまでに柑橘類に多く含まれるフラボノイド、タンゲレチンがヒト肝臓由来ＨｅｐＧ２細胞のＤＧＡＴ活性を阻害することが報告されている（非特許文献１９）。
また、ミカン科の植物ゴシュユ（呉茱萸、Evodia rutaecarpa）の果実に含まれるキノロンアルカロイドにも、ＤＧＡＴ阻害作用があると報告されている（非特許文献２０）。しかしながら、これまでに見出されている食品素材は、その効果の面で十分満足のいくものではない。
【００１３】
また、食品素材以外にもＤＧＡＴ活性を阻害する化合物として、フェノキシアセトアミド誘導体やオキサジアゾール誘導体が開示されている（特許文献１及び２）。
【００１４】
ところで、ラズベリー熱水抽出物にはリパーゼ阻害作用があること（特許文献３）、ラズベリー果汁に消臭作用があること（特許文献４）、ラズベリーの水及び／又はエタノール抽出物に抗アレルギー作用があること（特許文献５）が知られているが、ラズベリー又はその抽出物にＤＧＡＴ活性阻害作用があることは知られていない。
また、ラズベリー等の植物には、エラジタンニンが含まれていることが知られているものの（非特許文献２１〜２３）、エラジタンニン又はその誘導体に、ＤＧＡＴ活性阻害作用があることもこれまでには知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第２００６／０８２０１０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００７／１３８３０４号パンフレット
【特許文献３】特開２００５−８５７２号公報
【特許文献４】特開２０００−２７９５０２号公報
【特許文献５】特開平１０−２３６９６５号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Carlson L. A. et al. Acta Med. Scand., 218, 207-211 (1985)
【非特許文献２】Castelli W. P. Am.Heart J., 112, 432-437 (1986)
【非特許文献３】多田紀夫 臨床医薬 21, 215-224 (2005)
【非特許文献４】中村治雄 医学のあゆみ 157, 771-775 (1991)
【非特許文献５】新・高トリグリセライド血症ハンドブック，秦葭哉，医薬ジャーナル社 (1998)
【非特許文献６】Peiris A. N. et al. Ann. Intern. Med., 110, 867-872 (1989)
【非特許文献７】Matsuzawa Y. et al. Obes. Res. 3 Suppl. 2, 187S-194S (1995)
【非特許文献８】Chan J. C. et al. I. Int. J. Obes. Relat. Metab .Disord., 26, 994-1008 (2002)
【非特許文献９】Lyon C. J. and Hsueh W. A. Am. J. Med. 115 Suppl. 8A, 62S-68S (2003)
【非特許文献１０】堀田喜久子 松澤佑次 日本臨床 59, 481-486 (2001)
【非特許文献１１】Chen H. C. et al. J. Clin. Invest., 11, 1715-1722 (2003)
【非特許文献１２】Boden, G. et al. J. Clin. Invest., 88, 960-966 (1991)
【非特許文献１３】Roden, M. et al. J. Clin. Invest., 97, 2859-2865 (1996)
【非特許文献１４】Dresner, A. et al. J. Clin. Invest., 103, 253-259 (1999)
【非特許文献１５】Inoue S. et al. Am. J. Clin. Nutr., 55, 199S-202S(1992)
【非特許文献１６】Ryan D. H. et al. Obes. Res., 3, 553S-559S(1995)
【非特許文献１７】Monk, J. P. and Todd P. A. Drugs, 33, 539-576 (1987)
【非特許文献１８】多田紀夫 Ther. Res., 21, 2320-2325 (2000). Carlson L. A. et al. Acta Med.Scand., 218, 207-211 (1985)
【非特許文献１９】Kurowska E. M. et al. Lipids, 39, 143-151 (2004)
【非特許文献２０】Ko J. S. et al. Planta Med., 68, 1131-1133 (2002)
【非特許文献２１】Kahkonen M. P. et al. J.Agric. Food Chem., 49(8), 4076 (2001)
【非特許文献２２】Yoshida T. et al. Chem. Pharm. Bull, 40(8), 1997 (1992)
【非特許文献２３】Tanaka T. et al. Chem Pharm. Bull., 41(7), 1214 (1993)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、高脂血症、肥満、インスリン抵抗性及び糖尿病の予防又は改善に有効なＤＧＡＴ阻害剤等を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、ＤＧＡＴ活性阻害作用を有し、かつ安全性の高い物質について探索を行なった結果、食の経験が豊富なラズベリー又はその抽出物が優れたＤＧＡＴ活性阻害作用及びＴＧ合成抑制作用を有していることを見出し、特にラズベリーに含まれる下記式（１）で表される部分構造を有するエラジタンニン又はその誘導体（以下、「ＧＯＤ型エラジタンニン又はその誘導体」とも云う）が薬理活性の主体であることを見出した。そして、本発明者らは、ラズベリー又はその抽出物を、ＤＧＡＴ活性阻害、ＴＧ合成抑制や高脂血症、肥満、インスリン抵抗性及び糖尿病の予防・改善を目的とした医薬品又は食品等として使用できることを見出した。
【００１９】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１１）に係るものである。
（１） ラズベリー又はその抽出物を有効成分とするＤＧＡＴ阻害剤。
（２） 抽出物が、有機溶剤抽出物である前記（１）記載のＤＧＡＴ阻害剤。
（３） 有機溶剤抽出物が、含水エタノール抽出物又は含水アセトン抽出物である前記（２）記載のＤＧＡＴ阻害剤。
【００２０】
（４） ラズベリー又はその抽出物を有効成分とするＴＧ合成抑制剤。
（５） 抽出物が、エラジタンニン又はその誘導体を主成分とする前記（４）記載のＴＧ合成抑制剤。
（６） 抽出物が、有機溶剤抽出物である前記（４）又は（５）記載のＴＧ合成抑制剤。
（７） 有機溶剤抽出物が、含水エタノール抽出物又は含水アセトン抽出物である前記（６）記載のＴＧ合成抑制剤。
【００２１】
（８） ラズベリー又はその抽出物を有効成分とするインスリン抵抗性予防又は改善剤。
（９） ラズベリー又はその抽出物を有効成分とする糖尿病予防又は改善剤。
【００２２】
（１０） 分子内に式（１）
【００２３】
【化１】
【００２４】
で表される部分構造及びグルコース残基を有し、当該グルコース残基の４位と６位に式（１）で表される部分構造のヘキサヒドロジフェノイル基部分が置換したエラジタンニン又はその誘導体を有効成分とする、高脂血症、肥満、インスリン抵抗性若しくは糖尿病の各症状の予防若しくは改善剤、又はＴＧ合成抑制剤。
（１１） エラジタンニン又はその誘導体は、サンギインＨ−６及びランベルチアニンＣから選ばれる１種以上である前記（１２）記載の高脂血症、肥満、インスリン抵抗性若しくは糖尿病の各症状の予防若しくは改善剤、又はＴＧ合成抑制剤。
【発明の効果】
【００２５】
本発明のＤＧＡＴ阻害剤、ＴＧ合成抑制剤、高脂血症予防・改善剤、肥満予防・改善剤、インスリン抵抗性予防・改善剤、又は糖尿病予防・改善剤は、優れたＤＧＡＴ阻害作用等を有するので、高脂血症、肥満、インスリン抵抗性及び糖尿病の予防・改善をするための医薬品又は食品等として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＨＰ−２０分画品、固液分画品、ランベルチアニンＣ精製品、サンギインＨ−６精製品のＨＰＬＣ分析を行なった。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
後記実施例に示すように、ラズベリー又はその抽出物は優れたＤＧＡＴ阻害作用、血中ＴＧ上昇抑制作用及び血中ＦＦＡ上昇抑制作用（以下、「ＤＧＡＴ阻害作用等」とする）を有する。しかも、ラズベリーは古くから食経験の豊富なものであるため、ラズベリー又はその抽出物を長期間摂取しても安全性は極めて高い。
ここで、ＤＧＡＴ活性の阻害は、ＴＧ合成抑制、高脂血症予防若しくは改善、肥満予防若しくは改善、またインスリン抵抗性予防若しくは改善、又は糖尿病予防若しくは改善の有効な手段である（非特許文献１１）。また、ＴＧ上昇の抑制は、高脂血症とりわけ食後高脂血症の抑制の有効な手段であり、血中ＦＦＡ上昇の抑制は、インスリン抵抗性及び糖尿病の予防又は改善の有効な手段である（非特許文献１２−１４）。
従って、本発明のラズベリー又はその抽出物は、ＤＧＡＴ阻害剤、ＴＧ合成抑制剤、高脂血症予防若しくは改善剤、肥満予防若しくは改善剤、またインスリン抵抗性予防若しくは改善剤、又は糖尿病予防若しくは改善剤（以下、「ＤＧＡＴ阻害剤等」と云う）として使用でき、さらにこれら製剤を製造するために使用することができる。このとき、当該ＤＧＡＴ阻害剤等では、当該ラズベリー又はその抽出物を単独で、又はこれ以外に、必要に応じて適宜選択した担体等の、配合すべき後述の対象物において許容されるものを使用してもよい。なお、当該製剤は配合すべき対象物に応じて常法により製造することができる。
【００２８】
ここで、本発明におけるラズベリーとは、バラ科のRubus idaeusを意味する。
本発明におけるラズベリーは、その植物の種子及び／又は果実等をそのままの状態で、又は圧搾や粉砕、乾燥等の処理をし、汁や粉末等として使用できる。このうち、果実を使用するのが好ましい。
【００２９】
本発明における抽出物は、上記ラズベリーを室温（例えば、４〜５０℃）又は加温（室温〜溶媒沸点）下にて抽出するか又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出すること等の公知の抽出手段により得られるものである。その形態は、特に限定されず、各種溶剤抽出液、その希釈液、その濃縮液、そのペースト又はその乾燥末等の何れの形態でもよい。
【００３０】
本発明のラズベリー抽出物を得るために用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤のいずれも使用することができる。
抽出溶剤の具体例としては、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等の脂肪族カルボン酸エステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；超臨界二酸化炭素；ピリジン類；油脂、ワックス等その他オイル類等の有機溶剤が挙げられ、これらは単独で又は２種以上組み合わせて用いることができる。
【００３１】
この抽出溶剤のうち、ラズベリー抽出物のＤＧＡＴ阻害作用等を向上させる点から、有機溶剤を用いるのが好ましい。
有機溶剤のうち、ラズベリー抽出物のＤＧＡＴ阻害作用等を向上させる点から、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等の脂肪族カルボン酸エステル類等から選ばれる１種以上のものを用いるのが好ましい。このうち、炭素数１〜４のアルコール類、よりエタノール、プロパノール、ブタノール等の炭素数２〜４の低級アルコール類；炭素数３〜５のケトン類、よりアセトン、メチルエチルケトン等のケトン類等の水溶性有機溶剤から選ばれる１種以上のものを用いるのが好ましく、エタノール及びアセトンから選ばれる１種以上のものを用いるのがより更に好ましい。
なお、これら有機溶剤には、水が含まれていても良い（以下、「水が含まれているもの」を「含水有機溶剤」と云う）。
更に、これら有機溶剤のうち、含水有機溶剤が好ましく、含水水溶性有機溶剤がより好ましく、含水エタノール及び含水アセトンが更に好ましい。
【００３２】
有機溶剤と水との配合割合（容量比）としては、０．００１〜１００：９９．９９９〜０が好ましく、５〜９５：９５〜５がより好ましく、２０〜８０：８０〜２０が更に好ましく、３０〜７０：７０〜３０がより更に好ましく、４０〜６０：６０〜４０がより好ましい。含水アルコール類の場合、アルコール類濃度が４０〜６０容量％であることが好ましく、また、含水アセトンの場合、アセトン濃度が４０〜８０容量％であることが好ましい。
【００３３】
溶剤の使用量としては、ラズベリー（乾燥質量換算）１ｇに対して１〜１００ｍＬが好ましく、抽出時間としては、１分間〜１００日間が好ましく、１分間〜１０日間がより好ましい。このときの抽出温度としては、０℃〜溶媒沸点、より５〜８０℃、更に５〜５０℃、より更に１０〜４０℃が好ましい。
【００３４】
ラズベリー抽出物を得る抽出手段は、具体的には、固液抽出、液液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等の手段を用いることができる。
例えば、浸漬の好適な一例として、４〜５０℃で、５時間〜１０日間の浸漬が挙げられる。
また、抽出時間を短縮する場合には、攪拌を伴う固液抽出が望ましい。この固液抽出の好適な条件の一例としては、１０〜１００℃（好ましくは１０〜５０℃）下、１０００〜５０００ｒｐｍで１〜３０分間の攪拌が挙げられる。
抽出物の酸化を防止するため、煮沸脱気や窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、いわゆる非酸化的雰囲気下で抽出する手段を併用してもよい。
更に、ラズベリー抽出物の薬理活性を向上させる点から、上記抽出物から不活性な夾雑物を除去するため、クロマトグラフィーや液々分配等の分離技術を用いてもよい。
【００３５】
また、ラズベリー又はその抽出物から水溶性の不活性な夾雑物を除去するため、ラズベリー又はその抽出物を水洗するのが好ましい。また、ラズベリーの新鮮果実より果汁を圧搾抽出した残渣を、上述の有機溶剤で抽出する方法も有効である。
水洗の一例として、ラズベリーを、ホモジナイズや粉砕し、適宜乾燥等の前処理を行なった後、水洗して、遠心分離やろ過等の分離手段により得られたラズベリー残査を予め調製し、次いで上述の有機溶剤で抽出する方法が挙げられる。
水洗の際に、浸漬、超音波、マイクロ波、攪拌、振とう等の物理的手段を用いることができる。このうち攪拌が好ましく、このときの回転数は、１０００〜５０００ｒｐｍ程度であればよい。
水洗の際の処理時間としては、１〜６０分間が好ましく、１〜３０分間がより好ましく、水洗の際の処理温度としては、４〜１００℃が好ましく、抽出物の変質を抑制する場合には、４〜５０℃が望ましい。
このときの水の使用量としては、ラズベリー又はその抽出物（乾燥質量換算）１ｇに対して、１〜１００ｍＬが好ましい。
なお、ラズベリー残査から上述の有機溶剤で抽出する方法としては、４〜８０℃下で、当該残渣と有機溶剤とを１〜３０分間混合攪拌（１０００〜５０００ｒｐｍ程度）して抽出する方法が好ましい。
【００３６】
また、ラズベリー又はその抽出物（好ましくは有機溶剤抽出物）をクロマトグラフィーに付すのが、ラズベリー抽出物のＤＧＡＴ阻害作用等を向上させる点から、好ましい。
クロマトグラフィーに用いる固定相としては、例えば、強・弱酸性イオン交換樹脂又は強・弱塩基性イオン交換樹脂；オクタデシル化シリカゲル、オクチル化シリカゲル、ブチル化シリカゲル、トリメチルシリル化シリカゲル等の逆相樹脂；シリカゲル、フロリジール、アルミナ等の順相樹脂；スチレン−ジビニルベンゼン系、メタクリル酸エステル系等の芳香族系合成樹脂；修飾デキストラン系（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標） ＬＨ−２０等）、親水性ビニルポリマー系（例えば、トヨパール ＨＷ−４０等）等のゲルろ過クロマトグラフィー用充填剤；活性炭等が挙げられるが、このうち、逆相樹脂及び芳香族系合成樹脂、ゲルろ過クロマトグラフィー用充填剤等好ましい。
【００３７】
ラズベリー又はその抽出物（好ましくはラズベリー有機溶剤抽出物）をクロマトグラフィーに付してＤＧＡＴ阻害作用を有する溶出画分（以下、「活性画分」又は「ＤＧＡＴ活性画分」とも云う）を得る方法の一例として、以下の方法が挙げられる。このとき、活性画分を検出する際の波長としては、２６０〜３００ｎｍ、より２７０〜２９０ｎｍが好ましい。
【００３８】
ラズベリー又はその抽出物を、逆相樹脂を用いた中・高圧クロマトグラフィーに付した後、溶出溶媒をグラジュエントして、活性画分を得る。
このときの溶出溶媒としては、ぎ酸：水：アセトニトリル＝０〜５：１００〜０：０〜１００、より０．０１〜２：９５〜１０：５〜９０のグラジュエントが好ましい。カラム温度としては、２０〜５０℃、より３０〜４０℃が好ましい。また、流速としては、１〜４０ｍＬ／分、より１５〜２５ｍＬ／分が好ましい。活性画分を分取する際の保持時間は、５〜１００分、より２０〜５０分が好ましい。
【００３９】
また、ラズベリー又はその抽出物を、芳香族系合成樹脂を用いた中・高圧クロマトグラフィーに付して吸着後、樹脂体積の１００〜１０００容量％（好ましくは３００〜６００容量％）の水で洗浄し、次いで樹脂体積の１００〜１０００容量％（好ましくは３００〜６００容量％）の有機溶剤又は含水有機溶剤で溶出させ、活性画分を得る。用いる有機溶剤又は含水有機溶剤は上述と同様のものを用いればよい。
【００４０】
更に、上述の逆相樹脂を用いたクロマトグラフィーと芳香族系合成樹脂を用いたクロマトグラフィーとを併用してもよく、ラズベリー又はその抽出物を付す際の順序としてはいずれが先でもよいが、ラズベリー又はその抽出物を芳香族系合成樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して活性画分を得、次いで得られた活性画分を逆相樹脂を用いたクラマトグラフィーに付して更に薬理活性が向上した活性画分を得るのが好ましい。
【００４１】
更に、後記実施例に示すように、ラズベリー又はその抽出物から、クロマトグラフィーによりＤＧＡＴ活性画分を分取し、更にＤＧＡＴ活性画分に下記に示すサンギインＨ−６及びランベルチアニンＣが含まれる。そして、このサンギインＨ−６及びランベルチアニンＣは、ラズベリー抽出物よりも更に優れたＤＧＡＴ阻害作用等を有する。斯様なことから、サンギインＨ−６及びランベルチアニンＣ、すなわちエラジタンニン又はその誘導体が、ラズベリー又はその抽出物におけるＤＧＡＴ阻害作用等の薬理活性の主成分と考えられる。
【００４２】
【化２】
【００４３】
従って、本願発明は、分子内に下記式（１）
【００４４】
【化３】
【００４５】
で表される部分構造及びグルコース残基を有し、当該グルコース残基の４位と６位に式（１）又は（２）で表される部分構造のヘキサヒドロジフェノイル基部分が置換したエラジタンニン又はその誘導体を有効成分とするＤＧＡＴ阻害剤を提供するものである。
【００４６】
このため、ラズベリー又はその抽出物を、上記抽出・分離技術及び適宜公知の精製技術により、ＧＯＤ型エラジタンニン又はその誘導体を含むラズベリー抽出物（画分）、更にＧＯＤ型エラジタンニン又はその誘導体を主成分とするラズベリー抽出物（画分）にするのが、薬理活性を向上させる点から、好ましい。
このときのラズベリー抽出物（画分）中のＧＯＤ型エラジタンニン又はその誘導体の含有量は、乾燥質量換算で、０．０１質量％以上、より０．５質量％以上、更に１５質量％以上、より更に９５質量％以上であるのが、薬理活性向上の点から、好ましい。
【００４７】
なお、ラズベリー又はその抽出物は、そのまま用いてもよく、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、あるいは濃縮エキスや乾燥粉末としたり、ペースト状に調製したものでもよい。また、凍結乾燥し、用時に、通常抽出に用いられる溶剤、例えば水、エタノール、水・エタノール混液等の溶剤で希釈して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
【００４８】
本発明において、エラジタンニンとは、ヘキサヒドロジフェノイル基を有し、かつ、加水分解して脱水環化することにより、エラグ酸を生成するタンニンの総称を意味する。
【００４９】
ここで、ラズベリー又はその抽出物に含まれているエラジタンニン又は誘導体とは、少なくとも下記式（１）
【００５０】
【化４】
【００５１】
で表される部分構造を有するエラジタンニン関連加水分解性タンニンをいう。
このうち、薬理活性の向上の点から、好適なエラジタンニン誘導体としては、上記式（１）で表される部分構造に、さらにグルコース残基を有し、当該グルコース残基の４位と６位に上記式（１）で表される部分構造のヘキサヒドロジフェノイル基部分が置換したものが挙げられる。
【００５２】
ＧＯＤ型エラジタンニン又はその誘導体のうち、下記式（２）で表されるものが好ましい。
【００５３】
【化５】
【００５４】
式（２）中、Ｒ1は、水素原子又はガロイル基を表す。式（２）中、「〜ＯＲ1」は、α型及び／又はβ型の存在を表す。
式（２）中、Ｒ2及びＲ3は、同一又は異なって水素原子又はガロイル基を表すか、又は一緒になってヘキサヒドロキシジフェノイル基を表す。
式（２）中、Ｒ4は、
【００５５】
【化６】
【００５６】
〔式中、Ｒ5及びＲ6は、同一又は異なって水素原子又はガロイル基を表す。〕を表す。
式（２）中、ｍは０〜２（好ましくは０又は１）を表す。
【００５７】
【化７】
【００５８】
ＧＯＤ型エラジタンニン又はその誘導体としては、可食植物に存在し、安全性が高い点から、好適には、サンギインＨ−２、サンギインＨ−３、サンギインＨ−６、サンギインＨ−７、サンギインＨ−８、サンギインＨ−９、サンギインＨ−１０及びサンギインＨ−１１等のサンギイン；ランベルチアニンＡ，ランベルチアニンＢ、ランベルチアニンＣ、ランベルチアニンＤ等のランベルチアニン；ロシェニンＡ、ロシェニンＢ、ロシェニンＣ、ロシェニンＤ、ロシェニンＥ等のロシェニン等が例示できる。
この例示物のうち、ＤＧＡＴ阻害活性の点から、サンギインＨ−６及びランベルチアニンＣが好ましい。
【００５９】
【化８】
【００６０】
【化９】
【００６１】
【化１０】
【００６２】
本発明のエラジタンニン又はその誘導体には、公知の化学合成法により得られるものや、エラジタンニン又はその誘導体を主成分とする植物抽出物（例えば、非特許文献２１〜２３参照）又はその精製物等も包含される。このとき、薬理活性の向上の点から、エラジタンニン又はその誘導体を主成分とする植物抽出物中に、乾燥物換算で、エラジタンニン又はその誘導体が、０．５質量％以上、より１５質量％以上含まれていることが好ましい。
例えば、サンギイン及び／又はランベルチアニンとしては、ラズベリー（Rubus ideus）の果実から抽出、又はその抽出物を濃縮もしくは精製したものを使用することができる。
なお、本発明のエラジタンニン又はその誘導体を植物から抽出・分離・精製する際には、上述のラズベリーからの抽出・分離・精製手段を適用すればよい。
また、得られたエラジタンニン又はその誘導体が含まれる抽出物や画分は、上述のラズベリー抽出物や画分の形態と同じく好適な形態にして適宜用いてもよい。
【００６３】
本発明のエラジタンニン又はその誘導体は、ＤＧＡＴ阻害作用等を有することから、前述のとおり、ＤＧＡＴ阻害剤等として使用でき、さらにこれら製剤を製造するために使用することができる。このとき、当該ＤＧＡＴ阻害剤等では、当該エラジタンニン又はその誘導体を単独で、又はこれ以外に、必要に応じて適宜選択した担体等の、配合すべき後述の対象物において許容されるものを使用してもよい。なお、当該製剤は配合すべき対象物に応じて常法により製造することができる。
【００６４】
従って、本発明のラズベリー若しくはその抽出物、又はエラジタンニン若しくはその誘導体を有効成分とするＤＧＡＴ阻害剤等は、ＤＧＡＴ阻害活性；ＴＧ合成抑制；高脂血症、肥満、インスリン抵抗性若しくは糖尿病の各症状の予防、改善又は治療等の各効果を発揮する、ヒト若しくは動物（非ヒト）用の医薬品、医薬部外品、食品、機能性食品又は飼料等の有効成分として配合して使用可能である。また、当該ＤＧＡＴ阻害剤等は、ＤＧＡＴ阻害活性；ＴＧ合成抑制；高脂血症、肥満、インスリン抵抗性若しくは糖尿病の各症状の予防、改善又は治療等をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品に応用できる。
【００６５】
本発明のＤＧＡＴ阻害剤等を医薬品の有効成分として用いた場合、当該医薬品は任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、経口、経腸、経粘膜、注射等が挙げられる。経口投与のための製剤の剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等が挙げられる。非経口投与としては、静脈内注射、筋肉注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。
【００６６】
また、斯かる製剤では、本発明のＤＧＡＴ阻害剤等を単独で、又は他の薬学的に許容される担体とを組み合わせて使用してもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、光沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、矯味剤、矯臭剤、増量剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、香料、被膜剤等が挙げられる。
【００６７】
これらの投与形態のうち、経口投与が好ましく、経口投与用製剤の有効成分として用いる場合の該製剤中の、ラズベリー又はその抽出物の含有量は、乾燥物換算で、通常、製剤全質量の０．０４〜１００質量％であり、２．０〜８０質量％であるのが好ましい。また、有効成分エラジタンニン又はその誘導体の含有量は、通常、製剤全質量の０．０１〜８０質量％であり、０．５〜８０質量％であるのが好ましい。
【００６８】
上記製剤の投与量は、患者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与の場合の成人１人（６０ｋｇ）当たりの１日の投与量は、ラズベリー又はその抽出物（乾燥物換算）を有効成分として、通常、４〜８０００ｍｇ、より４０〜８０００ｍｇ、更に２００〜２０００ｍｇが好ましい。また、当該成人１人当たりの１日の投与量は、通常、エラジタンニン又はその誘導体を有効成分として１〜２０００ｍｇ、より１０〜２０００ｍｇ、更に１０〜１０００ｍｇ、より更に５０〜５００ｍｇが好ましい。
また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、１日１回〜数回に分けて投与することが好ましい。
【００６９】
本発明のＤＧＡＴ阻害剤等を食品の有効成分として用いた場合、当該食品の形態は、固形、半固形または液状であり得る。食品の例としては、パン類、麺類、菓子類、ゼリー類、乳製品、冷凍食品、インスタント食品、でんぷん加工製品、加工肉製品、その他加工食品、飲料、スープ類、調味料、栄養補助食品等、およびそれらの原料が挙げられる。また、上記の経口投与製剤と同様、錠剤形態、丸剤形態、カプセル形態、液剤形態、シロップ形態、粉末形態、顆粒形態等であってもよい。
種々の形態の食品を調製するには、ＤＧＡＴ阻害剤等を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００７０】
食品中におけるラズベリー又はその抽出物の含有量は、その使用形態により異なるが、通常、飲料の形態では、通常０．００４〜８質量％であり、０．００８〜４質量％、より０．０４〜２質量％であるのが好ましい。また、錠剤や加工食品などの固形食品形態では、通常０．０４〜８０質量％であり、０．０８〜４０質量％、より０．４〜２０質量％であるのが好ましい。
また、食品中における有効成分エラジタンニン又はその誘導体の含有量は、その使用形態により異なるが、通常、飲料の形態では、通常０．００１〜２質量％であり、０．００２〜１質量％、より０．０１〜０．５質量％であるのが好ましい。また、錠剤や加工食品などの固形食品形態では、通常０．０１〜２０質量％であり、０．０２〜１０質量％、より０．１〜５質量％であるのが好ましい。
【００７１】
また、本発明のＤＧＡＴ阻害剤等を飼料の有効成分として用いた場合には、当該飼料としては、例えば、牛、豚、鶏、羊、馬等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、マグロ、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、犬、猫、小鳥、リス等に用いるペットフード等が挙げられる。
尚、飼料を製造する場合には、ＤＧＡＴ阻害剤等を単独で、又はこの他に、牛、豚、羊等の肉類、蛋白質、穀物類、ぬか類、粕類、糖類、野菜、ビタミン類、ミネラル類等一般に用いられる飼料原料、更に一般的に飼料に使用されるゲル化剤、保型剤、ｐＨ調整剤、調味料、防腐剤、栄養補強剤等を必要に応じて配合し、常法により当該飼料を加工製造することがきできる。
【００７２】
飼料中におけるまた、ラズベリー又はその抽出物の含有量は、その使用形態により異なるが、乾燥物換算で、通常０．０４〜８０質量％であり、０．０８〜４０質量％、より０．４〜２０質量％であるのが好ましい。
また、飼料中における有効成分エラジタンニン又はその誘導体の含有量は、その使用形態により異なるが、通常０．０１〜２０質量％であり、０．０２〜１０質量％、より０．１〜５質量％であるのが好ましい。
【００７３】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【実施例】
【００７４】
製造例１：ラズベリー５０％エタノール抽出物の調製
ラズベリー（Rubus idaeus L.）果実の凍結乾燥粉末（FDラズベリーパウダー、協立物産より入手）１００ｇを、１０倍量（１Ｌ）の５０容量％（以下、「％」とする）エタノール水（エタノール濃度５０容量％）に室温（２０〜３０℃）で１５時間浸漬し、不溶物を濾別後、減圧濃縮し抽出物を得た（固形分５９ｇ）。
なお、ＧＯＤ型エラジタンニンの含有量及び同定を以下の方法にて求めた。
エラジタンニンの定量及び同定方法
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（オクタデシル化シリカゲル、ＧＬサイエンス社製、４．６ ｘ ２５０ｍｍ， ５mｍ）
カラム温度：４０℃
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
溶離液：Ａ液 １％ぎ酸水溶液、Ｂ液 アセトニトリル
Ａ／Ｂ＝（０分）９０／１０→９０／１０（１０分）→８０／２０（７０分）→９０／１０（７１分）→９０／１０（８０分）
【００７５】
ラズベリー５０％エタノール抽出物〔固形分〕（乾燥質量換算）中のＧＯＤ型エラジタンニンの総含有量は、１．０質量％であった。エラジタンニンとして、ＨＰＬＣ分析にてサンギインＨ−６，ランベルチアニンＣが同定された。
【００７６】
製造例２：ラズベリー７０％アセトン抽出物の調製
ラズベリー（Rubus idaeus L.）果実の凍結乾燥粉末（FDラズベリーパウダー、協立物産より入手）１ｇを、１０倍量（１０ｍＬ）の７０％アセトン水（アセトン濃度７０容量％）に室温（２０〜３０℃）で７日間浸漬し、不溶物を濾別後、減圧濃縮し抽出物を得た（固形分０．３ｇ）。
ラズベリー７０％アセトン抽出物〔固形分〕（乾燥質量換算）中のＧＯＤ型エラジタンニンの総含有量は、０．７質量％であった。また、エラジタンニンとして、ＨＰＬＣ分析にて、サンギインＨ−６，ランベルチアニンＣが同定された。
【００７７】
実施例１：ＤＧＡＴ活性阻害試験
５０μｇの肝臓ミクロソーム画分を、表中に示した被験物質をエラジタンニンが最終濃度０．１質量％で含む２００μＬのＤＧＡＴ活性測定バッファー（250mM Sucrose, 10mM Tris-HCl (pH7.5), 10 mM MgCl2, 0.8 mM EDTA, 0.1% Bovine Serum Albumin, 100μM Oleoyl-CoA (0.05μCi/200μＬ、55mCi/mmol), 1.2 mM 1,2-diolein)中で、37℃、20分間インキュベートした。
各被験物質の存在下でのＤＧＡＴ活性を、表１に示す。ＤＧＡＴ活性は、溶媒コントロールのＤＧＡＴ活性を１００とした相対値で表す。
【００７８】
【表１】
【００７９】
製造例３：ラズベリー固液（５０％エタノール）分画品の調製
ラズベリー（Rubus idaeus L.）果実の凍結乾燥粉末（FDラズベリーパウダー、協立物産より入手）４０ｇに、１０倍量（４００ｍＬ）のイオン交換水を加え、ＴＫオートホモミキサー（特殊機化工業社製）により、室温（２０〜３０℃）下３０００ｒｐｍで１０分間攪拌した。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、２０分）し、上澄を除去した。本操作の水洗を３回繰り返し、水溶性成分を除去した後、残渣を５０％エタノール水で抽出した。抽出は５０％エタノール水４００ｍＬを用い、ＴＫオートホモミキサー（特殊機化工業社製）により、室温下３０００ｒｐｍで１０分間攪拌、その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、２０分）により、上澄みを得るといった方法で行った。本抽出操作も３回繰り返し、得られる３回分の上澄を併せ、減圧濃縮し固液分画品を得た（１．３ｇ）。
固液分画（乾燥質量換算）中のＧＯＤ型エラジタンニンの総含有量は、２３．９質量％であった。エラジタンニンとして、ＨＰＬＣ分析にて、サンギインＨ−６，ランベルチアニンＣが同定された（図１参照）。
【００８０】
実施例２：高脂血症抑制試験
実験動物は、チャールスリバージャパンから購入したＣ５７ＢＬ／６マウス（７週齢）を約１週間馴化した後使用した。トリアシルグリセロール合成抑制剤としては、製造例３で調製したラズベリー抽出物（固液分画品）を用いた。試験群及び対照群につき、一群９匹のマウスを用いた。脂質負荷は、体重１ｇ当たり４０μＬの脂質エマルジョン（１０％トリアシルグリセロール油、１％卵黄レシチン、４％ウシ血清アルブミン）を、胃ゾンデを用いて経口投与することで行った。試験群に与える脂質エマルジョンにはさらにラズベリー抽出エキスを終濃度１％となる様に添加して用いた。投与１、２、４、６時間後に採血を行い、血漿中のトリアシルグリセロール濃度およびＦＦＡ濃度を測定した。ＴＧ濃度の測定は、トリグリセライドＥ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて、グリセリン消去法により行った。ＦＦＡ濃度の測定は、ＮＥＦＡ Ｃ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて、アシル−ＣｏＡシンターゼ・アシル−ＣｏＡオキシダーゼ法により行った。反応は、９６ウエルプレート中で行い、バイオラド社マイクロプレートリーダーＭＯＤＥＬ５５０を用いて、ＴＧ濃度はＯＤ５９５ｎｍ、ＦＦＡ濃度はＯＤ５５０ｎｍの吸光度を測定した。ＴＧ濃度は、キット付属のグリセリン標準液を用いて作製した検量線より、血漿に含まれるトリアシルグリセロール濃度を求めた。ＦＦＡ濃度は、キット付属のオレイン酸標準液を用いて作製した検量線より、血漿に含まれるＦＦＡ濃度を求めた。ＴＧ濃度の変化及び変化量（Δ）の結果を、それぞれ表２と表３に示す。ＦＦＡ濃度の変化及び変化量（Δ）の結果を、それぞれ表４と５示す。
【００８１】
【表２】
【００８２】
【表３】
【００８３】
【表４】
【００８４】
【表５】
【００８５】
表２に示す様に、脂質エマルジョンの経口投与を行ったところ、投与１〜２時間後をピークとした血漿ＴＧ濃度の上昇が認められたが、試験群では、脂質負荷後の血漿ＴＧ濃度の低下が確認された。投与２時間後のＴＧレベルにおいては、試験群において、対照群と比較して、血漿ＴＧ濃度が２３．８％低下していた。また、表３に示す様に、試験群では、脂質エマルジョン経口投与後の血漿ＴＧ濃度の変化量においても、対照群と比較して、ＴＧ濃度増加の抑制が確認された。血漿ＴＧ濃度の変化量は、試験群において、対照群と比較して、３７．１％の低下であった。従って、ラズベリー抽出物は高脂血症、とりわけ食後高脂血症の抑制に有効であると考えられる。
さらに、表４に示す様に、脂質エマルジョン投与後のＦＦＡレベルは、ＴＧレベルと同様、脂質エマルジョンの経口投与１〜２時間後をピークとして上昇が認められたが、試験群では、脂質負荷後の血漿ＦＦＡ濃度の低下が確認された。投与２時間後のＦＦＡレベルは、試験群において、対照群と比較して、血漿ＦＦＡ濃度が２３．０％低下していた。また、表５に示す様に、試験群では、脂質エマルジョン経口投与後の血漿ＦＦＡ濃度の変化量においても、対照群と比較して、ＦＦＡ濃度増加の抑制が確認された。血漿ＦＦＡ濃度の変化量は、試験群において、対照群と比較して、８１．９％の低下であった。従って、ラズベリー抽出物はＦＦＡ濃度の減少を介して、インスリン抵抗性および糖尿病の予防又は改善に有効であると考えられる。
【００８６】
製造例５：ラズベリーからの被験物質（サンギインＨ−６，ランベルチアニンＣ）の調製
（１）ラズベリー５０％エタノール抽出物の調製
製造例１の抽出物を用いた。
（２）ラズベリーＨＰ−２０分画品（以下、「分画物」とも云う）の調製
上記（１）の抽出物のうち２０ｇを水に再溶解した後、スチレン−ジビニルベンゼン系の芳香族合成吸着剤であるダイヤイオンＨＰ−２０（１０００ｍＬ）に吸着させた。ＨＰ−２０は水４Ｌで洗浄した後、５０％エタノール水４Ｌで溶出した。得られた溶出液は減圧にて濃縮し、ＨＰ−２０分画物１．２１ｇを得た。
ＨＰ−２０分画品（乾燥質量換算）中のＧＯＤ型エラジタンニンの総含有量は、１７．９質量％であった。
（３）サンギインＨ−６精製品、ランベルチアニンＣ精製品の調製
上記（２）で得られた分画物のうち４００ｍｇを用い、さらにＨＰＬＣで分画することにより、サンギインＨ−６（４３ｍｇ）、ランベルチアニンＣ（１６ｍｇ）を単離し、ピーク保持時間はそれぞれ、３８〜４１分、３６〜３８分であった（図１参照）。
＜分画条件＞
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（オクタデシル化シリカゲル、２０ｘ２５０ｍｍ、ＧＬサイエンス）
溶媒：Ａ液 １％ぎ酸水溶液、Ｂ液 アセトニトリル
Ａ／Ｂ＝（０分）９０／１０→９０／１０（１０分）→８０／２０（４０分）→９０／１０（４１分）→９０／１０（４５分）
温度：４０℃、流速：１８．９ｍＬ／分、検出：ＵＶ＝２８０ｎｍ
サンプル４００ｍｇを２０ｍＬの１０％エタノールに溶解後、1ｍＬづつ２３回チャージ
得られたサンギインＨ−６精製品およびランベルチアニンＣ精製品の1H および13C NMRスペクトルは、非特許文献２２および２３記載のサンギインＨ−６およびランベルチアニンＣの1H および13C NMRスペクトルのデータと一致した。
よって、ラズベリーから抽出された、製造例３の固液分画品及び製造例３のＨＰ−２０分画品を、少なくとも保持時間３１〜４６分で分取する（図１参照）と、薬理活性の主体であるＧＯＤ型エラジタンニン又はその誘導体を更に精製できると共に、得られた活性画分の薬理作用を高めることができる。
【００８７】
実施例３：ラズベリー抽出物より単離したサンギインＨ−６及びランベルチアニンＣのＤＧＡＴ活性阻害評価
被験物質として、上記製造例５でラズベリー抽出物より単離したサンギインＨ−６及びランベルチアニンＣと、ＥＧＣＧ（エピガロカテキンガレート：入手先：長良サイエンス）を用いた。
マウス肝臓より、ミクロソーム画分を下記の様に調製し、ＤＧＡＴ活性測定に使用した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄性、６週齢）の肝臓をＳｕｃｒｏｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ （250mM Sucrose, 1mM EDTA, 10mM Tris-HCl (pH7.5)）中でホモジナイズし、４℃、１２，５００ ｘ ｇ、１５分間遠心し上清を回収した。上清をさらに４℃、１００，０００ ｘ ｇ、６０分間遠心し、沈殿をＳｕｃｒｏｓｅ Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁し、肝臓ミクロソーム画分として使用した。
５０μｇの肝臓ミクロソーム画分を、表中に示した濃度の各被験物質を含む２００μＬのＤＧＡＴ活性測定バッファー（250mM Sucrose, 10mM Tris-HCl (pH7.5), 10 mM MgCl2, 0.8 mM EDTA, 0.1% Bovine Serum Albumin, 100μM Oleoyl-CoA (0.05μCi/200μＬ、55mCi/mmol), 1.2 mM 1,2-Diolein）中で、３７℃、２０分間インキュベートした。１．５ｍＬのクロロホルム／メタノール（１：１）を添加することで反応を止めた。次に、２５０μＬのＰＢＳを加えて攪拌し、遠心分離により水層と油層に分離（脂質抽出）した。下層であるクロロホルム層を回収し、窒素ガスで乾燥、クロロホルムに再溶解した。
クロロホルムに溶解した脂質の一部を液体シンチレーションカウンター（Perkin Elmer）に供し、放射活性を測定した。約２０００ｄｐｍの抽出脂質の一部をＨＰＴＬＣプレート（20 x 10 cm Silica gel 60, Merk）を用いて分画した。展開溶媒には、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（８０：２０：１）を使用した。ＢＡＳ２５００（富士フィルム）を用いてフルオログラフィー及び定量解析を行った。抽出脂質に取り込まれた総放射活性に対するＴＧに取り込まれた放射活性の割合をＤＧＡＴ活性とした。
各被験物質の存在下でのＤＧＡＴ活性を、表６に示す。ＤＧＡＴ活性は、溶媒コントロールのＤＧＡＴ活性を１００とした相対値で表す。
表６に示される様に、サンギインＨ-６、及びランベルチアニンＣは、ＤＧＡＴ活性に対し有意な阻害を示した。
この様に、ラズベリーより単離されたエラジタンニンはＤＧＡＴ活性について優れた阻害作用を示すことから、ＤＧＡＴ阻害の他、ＴＧ合成抑制剤、高脂血症予防・改善剤、肥満予防・改善剤、インスリン抵抗性予防・改善剤、及び糖尿病予防・改善剤として有用であると考えられる。
【００８８】
【表６】
【００８９】
実施例４：ラズベリー抽出物より単離したサンギインＨ−６及びランベルチアニンＣの他の酵素活性阻害評価
被験物質として、上記実施例３で用いたものを使用した。
上記実施例３で示した様に調製したマウス肝臓ミクロソーム画分を用いて、グルコース６リン酸脱リン酸化酵素（Ｇ６Ｐａｓｅ）活性測定、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素活性の測定を行った。
Ｇ６Ｐａｓｅ活性測定は、マウス肝臓ミクロソーム画分（５０μｇ）を、表中に示した濃度の被験物質の存在下で、１００μＬの反応液（50 mM HEPES buffer (pH7.2)、100 mM KCl、2.5 mM EDTA、2.5 mM MgCl2、1mMDTT、10 mM glucose-6-phosphate、2 mM EDTA）中で３７℃、３０分間インキュベートした。次に、４００μＬの反応停止液（0.42% ammononium molybdate tetrahydrate in 1N H2SO4、10%SDS、10% ascorbic acidの6:2:1 混合液）を添加し、５０℃、３０分間インキュベートした。生じた青色色素を吸光度測定（ＯＤ820）し、無機リン酸溶液を用いて作製した標準曲線より、生じたリン酸濃度を算出することによりＧ６Ｐａｓｅ活性を算出した。
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性は、マウス肝臓ミクロソーム画分（５０μｇ）を、表中に示した濃度の被験物質の存在下で、14Ｃ標識ＨＭＧ−ＣｏＡを含む反応液（0.128 mM HMG-CoA (14C-HMG-CoA, 72 MBq/mmol), 1mM NADPH、10mM DTT、10mM EDTA in 0.12mM phosphate buffer(pH7.2)）中で、３７℃、３０ 分間インキュベートした。次に、１０分の１容量（２０μＬ）の５Ｎ ＨＣｌを添加し、さらに３０分間インキュベート（酸性処理）した。内部標準として４−14Ｃ−ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ（０．０８ｎＣｉ）を加えた後、酸性処理によりＨＭＧ−ＣｏＡの反応産物メバロン酸から変換、生成するメバロノラクトンを等量の酢酸エチルで抽出した。抽出物の一部を展開溶媒には、ベンゼン−アセトン（１：１）を用いてＴＬＣ分画した。ＢＡＳ２５００（富士フィルム）を用いてフルオログラフィー及び定量解析を行い、メバロノラクトンに含まれる放射活性よりＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を算出した。
各被験物質の存在下でのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性、及びＧ６Ｐａｓｅ活性を、それぞれ、表７、及び表８に示す。これら酵素活性は、溶媒コントロールの酵素活性を１００とした相対値で表す。
【００９０】
表７、及び表８に示される様に、いずれのラズベリー由来のエラジタンニンもＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性、及びＧ６Ｐａｓｅ活性に対して阻害作用を示さなかった。
この様に、ラズベリー由来のエラジタンニンはＤＧＡＴ活性について優れた阻害作用を示す一方で、その他の酵素活性には阻害作用を示さないことから、ＤＧＡＴ活性に対する特異性が高い化合物であることが示された。このことは、ラズベリー由来のエラジタンニンが副作用の少ない化合物であることを意味するものと考えることができる。
【００９１】
【表７】
【００９２】
【表８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラズベリー又はその抽出物を有効成分とするＤＧＡＴ阻害剤。
【請求項２】
抽出物が、有機溶剤抽出物である請求項１記載のＤＧＡＴ阻害剤。
【請求項３】
有機溶剤抽出物が、含水エタノール抽出物又は含水アセトン抽出物である請求項２記載のＤＧＡＴ阻害剤。
【請求項４】
ラズベリー又はその抽出物を有効成分とするＴＧ合成抑制剤。
【請求項５】
抽出物が、エラジタンニン又はその誘導体を主成分とする請求項４記載のＴＧ合成抑制剤。
【請求項６】
抽出物が、有機溶剤抽出物である請求項４又は５記載のＴＧ合成抑制剤。
【請求項７】
有機溶剤抽出物が、含水エタノール抽出物又は含水アセトン抽出物である請求項６記載のＴＧ合成抑制剤。
【請求項８】
ラズベリー又はその抽出物を有効成分とするインスリン抵抗性予防又は改善剤。
【請求項９】
ラズベリー又はその抽出物を有効成分とする糖尿病予防又は改善剤。
【請求項１０】
分子内に式（１）
【化１】
で表される部分構造及びグルコース残基を有し、当該グルコース残基の４位と６位に式（１）で表される部分構造のヘキサヒドロジフェノイル基部分が置換したエラジタンニン又はその誘導体を有効成分とする、高脂血症、肥満、インスリン抵抗性若しくは糖尿病の各症状の予防若しくは改善剤、又はＴＧ合成抑制剤。
【請求項１１】
エラジタンニン又はその誘導体は、サンギインＨ−６及びランベルチアニンＣから選ばれる１種以上である請求項１２記載の高脂血症、肥満、インスリン抵抗性若しくは糖尿病の各症状の予防若しくは改善剤、又はＴＧ合成抑制剤。
【請求項１】
ラズベリー又はその抽出物を有効成分とするＤＧＡＴ阻害剤。
【請求項２】
抽出物が、有機溶剤抽出物である請求項１記載のＤＧＡＴ阻害剤。
【請求項３】
有機溶剤抽出物が、含水エタノール抽出物又は含水アセトン抽出物である請求項２記載のＤＧＡＴ阻害剤。
【請求項４】
ラズベリー又はその抽出物を有効成分とするＴＧ合成抑制剤。
【請求項５】
抽出物が、エラジタンニン又はその誘導体を主成分とする請求項４記載のＴＧ合成抑制剤。
【請求項６】
抽出物が、有機溶剤抽出物である請求項４又は５記載のＴＧ合成抑制剤。
【請求項７】
有機溶剤抽出物が、含水エタノール抽出物又は含水アセトン抽出物である請求項６記載のＴＧ合成抑制剤。
【請求項８】
ラズベリー又はその抽出物を有効成分とするインスリン抵抗性予防又は改善剤。
【請求項９】
ラズベリー又はその抽出物を有効成分とする糖尿病予防又は改善剤。
【請求項１０】
分子内に式（１）
【化１】
で表される部分構造及びグルコース残基を有し、当該グルコース残基の４位と６位に式（１）で表される部分構造のヘキサヒドロジフェノイル基部分が置換したエラジタンニン又はその誘導体を有効成分とする、高脂血症、肥満、インスリン抵抗性若しくは糖尿病の各症状の予防若しくは改善剤、又はＴＧ合成抑制剤。
【請求項１１】
エラジタンニン又はその誘導体は、サンギインＨ−６及びランベルチアニンＣから選ばれる１種以上である請求項１２記載の高脂血症、肥満、インスリン抵抗性若しくは糖尿病の各症状の予防若しくは改善剤、又はＴＧ合成抑制剤。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−３７７２０（Ｐ２０１１−３７７２０Ａ）
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８３６４４（Ｐ２００９−１８３６４４）
【出願日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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