ＤＮＡマイクロアレイ、その製造方法及びその使用方法
本発明は、正確な定量を行うことができるＤＮＡマイクロアレイに関する。 本発明は、第１のオリゴ核酸と第２のオリゴ核酸とを所定の比率で備えた複数のリファレンス部を有し、複数のリファレンス部における上記比率がそれぞれ異なるＤＮＡマイクロアレイに関する。ここで、第１のオリゴ核酸と第２のオリゴ核酸は、少なくとも一方が標識物質によりラベル化されていても良し、両方が異なる標識物質によりラベル化されていても良し、また、両方とも標識物質を有していなくても良い。これにより、リファレンス部から得られるシグナルに基づいて、試料に含まれる検出対象核酸の正確な定量が行える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、核酸断片が基板上に固定されたＤＮＡマイクロアレイに関する。
【背景技術】
ＤＮＡマイクロアレイとは、スライドガラスやシリコン等の基板上にプローブ（探索子）となるＤＮＡを数百〜数万スポット並べたもので、従来の方法では数百〜数万回の実験を必要としていた作業を、一括して並列的に処理できる技術である。医薬品などのライフサイエンス分野では、疾病関連遺伝子の探索などのハイスループットが要求されるＤＮＡ解析の分野で重要な技術となっている。このようなＤＮＡマイクロアレイ技術は、遺伝子の探索などのＤＮＡ解析分野以外で、医用遺伝子検査分野などでの使用も期待されている。
しかしながら、現状のＤＮＡマイクロアレイにおいては、検出対象のＤＮＡを正確に定量することができなかった。
【発明の開示】
本発明は、第１のオリゴ核酸と第２のオリゴ核酸とを所定の比率で備えた複数のリファレンス部を有し、複数のリファレンス部における上記比率がそれぞれ異なるＤＮＡマイクロアレイに関する。ここで、第１のオリゴ核酸と第２のオリゴ核酸は、少なくとも一方が標識物質によりラベル化されていても良し、両方が異なる標識物質によりラベル化されていても良し、また、両方とも標識物質を有していなくても良い。これにより、リファレンス部から得られるシグナルに基づいて、試料に含まれる検出対象核酸の正確な定量が行える。
また、本発明は、第１のオリゴ核酸と第２のオリゴ核酸とを含み、当該第１のオリゴ核酸と当該第２のオリゴ核酸との比率がそれぞれ異なるようにした複数のリファレンス用溶液を、それぞれ基板上の異なる位置にスポットし、上記リファレンス用溶液に含まれる第１のオリゴ核酸と上記第２のオリゴ核酸とを固定化するＤＮＡマイクロアレイに関する。これにより、試料に含まれる検出対象の核酸の正確な定量が行えるＤＮＡマイクロアレイを作製できる。
さらに、本発明は、第１のオリゴ核酸及び第２のオリゴ核酸を所定の比率で備え、当該比率がそれぞれ異なる複数のリファレンス部と、ＤＮＡプローブを備えるプローブ部とを有するＤＮＡマイクロアレイに対して、検出対象の核酸を含む溶液を作用させ、上記リファレンス部におけるシグナルから、シグナル強度とオリゴ核酸との相関関係を導き出すものである。第１のオリゴ核酸及び第２のオリゴ核酸のいずれか一方に相補的結合し、標識物質を有する第１のラベル化オリゴ核酸を、ＤＮＡマイクロアレイに作用させることにより、当該第１のラベル化オリゴ核酸に基づくシグナルを上記リファレンス部におけるシグナルとすることもできる。これにより、リファレンス部から得られるシグナルに基づいて、試料に含まれる検出対象の核酸の正確な定量を行うことができる。
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
図１（Ａ）は、本発明を適用したＤＮＡマイクロアレイを模式的に示す斜視図であり、（Ｂ）サンプル領域を拡大して示す平面図である。
図２は、リファレンス部を模式的に示す図である。
図３は、ＤＮＡマイクロアレイを用いる検出装置を示す概略構成図である。
図４は、リファレンス部のシグナルに基づいて得られた検量線を示す特性図である。
図５は、サンプル領域を拡大して示す平面図である。
図６は、サンプル領域を拡大して示す平面図である。
図７は、リファレンス部を模式的に示す図である。
図８は、図７に示したリファレンス部のシグナルに基づいて得られた検量線を示す特性図である。
図９は、リファレンス部を模式的に示す図である。
図１０は、実施例で用いたオリゴＤＮＡを示す図である。
図１１は、リファレンス部を模式的に示す図である。
図１２は、図１１に示したリファレンス部のシグナルに基づいて得られた検量線を示す特性図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明を適用したＤＮＡマイクロアレイは、図１（Ａ）に示すように、基板１と、基板１の一主面上に設定されたサンプル領域２に形成された複数のＤＮＡプローブ部３と、当該サンプル領域２に形成された複数のリファレンス部４と、当該サンプル領域に形成されたバックグラウンド・コントロール部５とを備える。
基板１は、特に限定されず、例えば、スライドガラス、金属、ナイロン又はニトロセルロースメンブレン等からなる。また、基板１は、表面の一部或いは全部に対して、表面処理が施されたものであっても良いし、アミノシランからなる被膜が形成されてものであってもよい。
サンプル領域２は、基板１の一主面上の所定の領域であって、例えば、基板１の一主面の略中央に設定される。
ＤＮＡプローブ部３は、核酸断片（ＤＮＡプローブ或いはオリゴＤＮＡとも称する場合もある）を所定の密度で基板１の一主面に固定化することで形成される。ここで、固定化とは、共有結合のみならず、イオン結合等の如何なる結合態様も含む意味であり、また、リンカーを介する結合及びリンカーを介しない結合の両方を含む意味である。固定化する核酸断片としては、特に限定されないが、検体から抽出され、増幅や精製などの過程により調製されたＤＮＡ断片や、合成されたオリゴＤＮＡを挙げることができる。また、核酸断片の固定化に際しては、いわゆるスポッター（アレイヤー）を用いることができる。
また、複数のＤＮＡプローブ部３においては、各ＤＮＡプローブ部３に固定化する核酸断片の種類（具体的には塩基配列）が異なっている。しかしながら、ＤＮＡマイクロアレイは、１種類の核酸断片を固定化した複数のＤＮＡプローブ部３を有するものであっても良い。
例えば、アミノシランからなる被膜が形成されたガラスからなる基板１に対して、核酸断片を固定化する際には、先ず、固定化対象の核酸断片を含む溶液を調製する。そして、アミノシランからなる被膜上に、当該溶液をスポットして、所定の温度に維持して所定の時間静置する。その後、洗浄液によって基板上の余剰の核酸断片等を除去し、乾燥させることによってＤＮＡプローブ部３を形成することができる。
リファレンス部４は、図１（Ｂ）に示すように、複数のリファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄからなる。リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄは、それぞれサンプル領域２の四隅に位置する。各リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄには、第１のオリゴＤＮＡと第２のオリゴＤＮＡとが所定の比率で固定化されている。ここで、オリゴＤＮＡとは、通常、ＤＮＡマイクロアレイに固定化することができる長さ（塩基数）のＤＮＡ断片を意味する。オリゴＤＮＡの長さとしては、例えば１０〜１０００塩基、好ましくは２０〜２００塩基、より好ましくは２０〜８０塩基である。
１０〜１０００塩基のオリゴＤＮＡを用いる場合、オリゴＤＮＡは合成されたものに限らず、例えばＰＣＲプライマーの片側を標識化合物により修飾して得られるＰＣＲ産物を用いることもできる。このとき、技遺伝子を増幅する可能性もあるが、１０００塩基あれば技遺伝子を排除するプライマーを設計し、既知の配列を持ったＰＣＲ産物をオリゴＤＮＡとして用いることができる。２０〜２００塩基のオリゴＤＮＡを用いる場合、一般的に化学合成しやすい塩基長であり、オリゴＤＮＡを安価に手軽に入手することができる。２０〜８０塩基のオリゴＤＮＡを用いる場合、長い塩基においては自己構造をとったり、余剰のＤＮＡとハイブリダイゼーションしたりとノイズが増える傾向があるため、この長さのものが使いやすい。
リファレンス部４において、第１のオリゴＤＮＡと第２のオリゴＤＮＡは、これらのうち一方又は両方が標識物質によりラベル化されていても良し、これらのうち両方がラベル化されていなくても良い。一方をラベル化した場合、ラベル化されたオリゴＤＮＡの希釈列を安価に作製することができる。また、両方をラベル化した場合、ＤＮＡマイクロアレイにおいては、２種のＤＮＡを比較するために２色の蛍光色素を使用することが多いため、オリゴＤＮＡを２種のＤＮＡに対応した希釈系列が同時に得られる。第１のオリゴＤＮＡと第２のオリゴＤＮの両方をラベル化する場合、それぞれ異なる標識物質でラベル化する。なお、異なる標識物質とは、検出波長が異なる標識物質や、異なる検出手段でそれぞれ検出可能な標識物質を意味する。標識物質としては、例えば、蛍光標識物質、同位体標識物質、電機検出型標識物質を挙げることができる。蛍光標識物質としては、特に限定されず、如何なる蛍光物質を用いても良い。例えば、蛍光物質としては、Ｃｙ３、Ｃｙ５等のＣｙｅ−Ｄｙｅ（アマシャム・ファルマシア社製）、Ａｌｅｘａ色素（モレキュラープローブ社製）を使用することができる。また、同位体標識物質としては、特に限定されず、如何なる放射性同位体元素を用いても良い。例えば、放射性同位元素としては、３２Ｐを使用することができる。
さらに、第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡがラベル化されていないとは、蛍光或いは放射能といったシグナルを発していない、或いは、いわゆる蛍光検出器及び放射線検出器における検出限界以下の蛍光量及び放射線量を発するものを意味する。したがって、第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡがラベル化されていないとは、標識物質が第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡに付されていない場合、及び、検出限界以下の蛍光量及び放射線量となるようにクエンチャー（消光剤）等の物質が付されたものであっても良い。
複数のリファレンス部４に第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡを固定化する場合、リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄにおいて、第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡがそれぞれ異なる比率で固定化される。具体的には、リファレンス部４を作製する際には、先ず、第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡを所定の比率で含む溶液を調製する。すなわち、リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄそれぞれに対応するように、第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡを、４種類の異なる比率で混合した混合溶液を調製する。
次に、上述したＤＮＡプローブ部３を作製した場合と同様にして、混合溶液をスポットした後、混合溶液に含まれる第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡを基板１表面に固定化することで、リファレンス部４を作製することができる。このとき、リファレンス部４においては、混合溶液中の第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡの比率を反映して、第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡが所定の比率で固定化されることとなる。すなわち、リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄにおいては、第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡの合計の固定化量は一定であるが、固定化されたもののうち第１のオリゴＤＮＡが占める割合が混合溶液における比率に依存して異なることとなる。
例えば、第１のオリゴＤＮＡのみに標識物質を付した場合のリファレンス部４を、図２（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に模式的に示す。図２（ａ）は、第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡの比率を１００：０として混合溶液を調製し、リファレンス部４を作製した場合である。図２（ｂ）は、第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡの比率を５０：５０として混合溶液を調製し、リファレンス部４を作製した場合である。図２（ｃ）は、第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡの比率を０：１００として混合溶液を調製し、リファレンス部４を作製した場合である。
なお、標識物質を付した第１のオリゴＤＮＡをリファレンスとして固定する場合、標識物質を付した第１のオリゴＤＮＡを所定の濃度にした溶液をスポットし、固定化しても、固定化する第１のオリゴＤＮＡの密度（固定化量）は、必ずしも第１のオリゴＤＮＡの濃度に依存するものではない。すなわち、第１のオリゴＤＮＡの濃度が異なる複数の溶液を用いて第１のラベル化担体を固定化しても、第１のラベル化担体の密度（固定化量）は、溶液における第１のオリゴＤＮＡ濃度を反映することなく、ほぼ一定になってしまう。
これに対して、図２（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に示すように、混合溶液中の第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡの比率を調節することで、リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄにおける第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡの固定化比率、換言すると、標識物質を付した第１のオリゴＤＮＡの固定化量を正確に規定することができる。
なお、バックグラウンド・コントロール部５は、基板１及び核酸断片に起因するシグナルを検出するためのものであるため、核酸断片のみを固定化した部位である。
以上のように構成されたＤＮＡマイクロアレイは、例えば、図３に示すような、検出装置に適用され、溶液サンプルに含まれる検出対象のＤＮＡの検出及び／又は定量を行うことができる。図３に示す検出装置は、いわゆるフローセル方式のＤＮＡマイクロアレイシステムである。
この検出装置は、ＤＮＡマイクロアレイを載置するフローセル１０と、フローセル１０に供給するハイブリダイゼーション溶液を蓄えた第１ボトル１１と、フローセル１０に供給する洗浄液を蓄えた第２ボトル１２と、第１ボトル１１及び第２ボトル１２とフローセル１０とを連結する流路上に配設されたバルブ１３と、バルブ１３を介して溶液サンプル等を流路に供給するための分注器１４と、フローセル１０から排出される液体の流路上に配設されたポンプ１５と、フローセル１０内から排出された液体を廃棄するための廃液ボトル１６とを備えている。また、検出装置は、フローセル１０に載置されたＤＮＡマイクロアレイにおけるシグナルを検出する検出部１７を備えている。なお、検出装置は、信号入力部、データ処理回路及びモニターを有するデータ処理装置（図示せず）と接続されており、検出部１７で検出したシグナルを当該データ処理装置に出力することができる。
このように構成された検出装置は、フローセル１０内に載置したＤＮＡマイクロアレイを用いて、以下のようにして、溶液サンプルに含まれる検出対象のＤＮＡの検出及び／又は定量を行う。先ず、ポンプ１５を駆動して第２ボトルからフローセル１０内に洗浄液を導入する。これにより、フローセル１０内部及びＤＮＡマイクロアレイを洗浄することができる。次に、ポンプ１５を駆動して第１ボトル１１からフローセル１０内にハイブリダイゼーション溶液を導入する。これにより、フローセル１０内部及びＤＮＡマイクロアレイ上に残存する洗浄液をハイブリダイゼーション溶液に置換することができる。
次に、フローセル１０内にハイブリダイゼーション溶液を導入しながら、分注器１４からバルブ１３を介して溶液サンプルをフローセル１０に導入する。これにより、ＤＮＡマイクロアレイに対して溶液サンプルを作用させることができる。次に、ＤＮＡマイクロアレイに溶液サンプルが接触している状態で、フローセル１０内部を所定の温度に制御する。これにより、フローセル１０内部において、充填された溶液がハイブリダイゼーションに適した温度となり、溶液サンプルに含まれるＤＮＡと、ＤＮＡプローブ部３に固定化された核酸断片とをハイブリダイズさせることができる。
所定時間経過後、次に、ポンプ１５を駆動してフローセル１０内部の溶液を廃棄ボトル１６に排出するとともに、第１ボトル１１からフローセル１０内にハイブリダイゼーション溶液を導入する。これにより、フローセル１０内部及びＤＮＡマイクロアレイ上に残存する、未反応のＤＮＡ等を含む溶液サンプルを除去することができる。
次に、検出部１７によってＤＮＡマイクロアレイにおけるシグナルを検出する。このとき、各ＤＮＡプローブ部３における蛍光シグナルと、リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄにおける蛍光シグナルと、バックグラウンド・コントロール部５における蛍光シグナルとを検出する。
リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄにおける蛍光シグナル強度は、標識物質が付された第１のオリゴＤＮＡの濃度（固定化量）に依存している。本発明に係るＤＮＡマイクロアレイにおいては、図２に示したように、リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄにおける標識物質が付された第１のオリゴＤＮＡの濃度（固定化量）が正確に規定されている。このため、リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄにおける蛍光シグナル強度を検出することによって、図４に示すように、各リファレンス部４の蛍光シグナル強度と第１のラベル化担体の比率との関係を示す検量線を得ることができる。例えば、リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄにおける標識物質が付された第１のオリゴＤＮＡの濃度（固定化量）を直線的な勾配をもって規定した場合、得られる検量線は直線を示すこととなる。
得られた検量線に、ＤＮＡプローブ部３における蛍光シグナル強度を外挿することによって、溶液サンプルに含まれる検出対象のＤＮＡを定量することができる。また、検量線が、標識物質が付された第１のオリゴＤＮＡの濃度（固定化量）に基づいて予測されるプロファイルを示さない場合、或いは、リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄのいずれかの蛍光シグナルが検出されない場合には、リファレンス部４に固定した第１のオリゴＤＮＡのみならず、ＤＮＡプローブ部３に固定化したＤＮＡプローブも剥離或いは分解等の不具合が生じていると判断することができる。すなわち、リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄにおける蛍光シグナルを検出することによって、ＤＮＡマイクロアレイの使用可否判断や実験工程の不具合を確認することができる。
溶液サンプルに含まれる検出対象のＤＮＡを検出及び／又は定量した後、フローセル１０内の溶液を、例えば９５℃に昇温する。これによって、ＤＮＡプローブ部３におけるＤＮＡプローブとハイブリダイズした核酸断片を、ＤＮＡプローブから解離させることができる。次に、ＤＮＡプローブと核酸断片とを解離させた状態で、ポンプ１５を駆動して第２ボトルからフローセル１０内に洗浄液を導入する。これにより、フローセル１０内部及びＤＮＡマイクロアレイに残存する核酸断片等を除去することができる。
測定終了後、上記各工程を繰り返すことによって、複数の溶液サンプルに対して連続測定を行うことができる。この連続測定に際して、各測定において、リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄにおける蛍光シグナルを検出することによって、ＤＮＡマイクロアレイの使用可否判断や実験工程の不具合を確認することができる。これによって、ＤＮＡマイクロアレイの繰り返し使用に伴うＤＮＡプローブの剥離や、実験工程の不具合を連続測定における各測定で検出することができる。
なお、ＤＮＡマイクロアレイにおいては、ＤＮＡプローブ部３、リファレンス部４及びバックグラウンド・コントロール部５が図１（Ｂ）に示したような位置に限定されず、例えば、図５或いは図６に示すような位置に配されていても良い。
特に、本発明に係るＤＮＡマイクロアレイにおいては、リファレンス部４に固定化される第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡは標識物質を付していないものであってもよい。この場合においても、ＤＮＡマイクロアレイは、図３に示した検出装置に適用され、溶液サンプルに含まれる検出対象のＤＮＡの検出及び／又は定量を行うことができる。
この場合、ＤＮＡマイクロアレイに対して溶液サンプルを作用させる際に、第１のオリゴＤＮＡ又は第２のオリゴＤＮＡに相補的な塩基配列を有し、標識物質が付されたラベル化オリゴ核酸を溶液サンプルに混合する。これにより、図７に模式的に示すように、溶液サンプルに含まれたラベル化オリゴ核酸と第１のオリゴＤＮＡ又は第２のオリゴＤＮＡとが特異的に結合する。これにより、リファレンス部４は標識物質に起因する蛍光シグナルを生ずることとなり、上述した場合と同様に、図８に示すような検量線を得ることができる。そして、この検量線に基づいて、上述した場合と同様にして溶液サンプルに含まれる検出対象のＤＮＡを定量することができる。
特に、本例のＤＮＡマイクロアレイは、溶液サンプルの解析時にリファレンス部４に固定化された第１のオリゴＤＮＡをラベル化することとなる。すなわち、本例のＤＮＡマイクロアレイは、溶液サンプルの解析までリファレンス部４に蛍光標識物質を有しないこととなる。蛍光標識物質は、光の曝露や湿度等の影響により蛍光強度が減少することがある。しかしながら、本例のＤＮＡマイクロアレイは、溶液サンプルの解析まで長期間保管した場合でも、溶液サンプルの解析時におけるリファレンス部４の蛍光シグナル強度を一定に維持することができる。したがって、本例のＤＮＡマイクロアレイは、長期間の保存に適し、更に、繰り返し使用に適したものであるといえる。
なお、本例のＤＮＡマイクロアレイを用いる場合、第１のオリゴＤＮＡに対して相補的な塩基配列及び蛍光標識物質を有する第１のラベル化オリゴ核酸並びに第２のオリゴＤＮＡに対して相補的な塩基配列及び蛍光標識物質を有する第２のラベル化オリゴ核酸を用いても良い。すなわち、ＤＮＡマイクロアレイに対して溶液サンプルを作用させる際に、第１のラベル化オリゴ核酸及び第２のラベル化オリゴ核酸を溶液サンプルに混合する。
これにより、図９に模式的に示すように、第１のラベル化オリゴ核酸と第１のオリゴＤＮＡとが特異的に結合し、第２のラベル化オリゴ核酸と第２のオリゴＤＮＡとが特異的に結合する。これにより、リファレンス部４は２種類の標識物質に起因する２種類の蛍光シグナルを生ずることとなり、２種類の蛍光標識物質の蛍光シグナル強度に基づいて検量線を得ることができる。そして、この検量線に基づいて、上述した場合と同様にして溶液サンプルに含まれる検出対象のＤＮＡを定量することができる。
以下実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
ＤＮＡマイクロアレイの作製
本例では、アミノシランでコートしたガラススライドを基板１として用いた。ガラススライドにアミノシランコートする方法を以下に記す。
先ず、ガラススライドをアセトン中で超音波洗浄した。その後、ガラススライドを１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム中に浸漬し、２５℃の恒温槽中に１時間、静置した。その後、ガラススライドを超純水で２度濯いだ後、１％アミノシラン（アミノエチルアミノプロピルトリメトキシシラン等）溶液中に浸漬し１時間、室温で静置した。再び超純水で２度すすぎ、１２０℃のホットプレート上で５分間乾燥させた。アミノシランとＤＮＡの架橋剤として、ＰＤＣ（１，４−ｐ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ ｄｉｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）を用いた。アミノシラン化したガラススライドにＰＤＣを反応させるために、ＰＤＣ ０．１５ｇをピリジン１５ｍｌ、ＤＭＦ １３５ｍｌに溶解した溶液を調製した。ガラススライドをこの溶液に浸漬し、２時間静置した。次に、メタノール、アセトンでそれぞれ５分ずつ洗浄し、１２０℃のホットプレート上で５分間乾燥させた。
続いて、得られたガラススライドの一主面上に、ＤＮＡプローブ部３及びリファレンス部４を作製した。具体的に、本例では、図１０に示すオリゴＤＮＡを用いた。本例では、リファレンス部４に固定化する第１のオリゴＤＮＡのみをラベル化した例である。すなわち、第１のオリゴＤＮＡは、所定の塩基配列からなるオリゴＤＮＡに、ガラススライドに固定するためのアミノ基と検出のためのＣＹ３とが修飾されたもの（以下、オリゴＡ）である。第２のオリゴＤＮＡとしては、オリゴＡと同じ塩基配列からなり、ガラススライドに固定するためのアミノ基を有するもの（以下、オリゴＢ）を使用した。
また、本例において、バックグラウンド・コントロール５としては、図１０に示すように、リファレンス部４に用いたオリゴＤＮＡと同配列で、ＣＹ３修飾されていないオリゴＤＮＡを用いた。また、本例において、ＤＮＡプローブとしては、ＳＮＰ Ａを検出するためのオリゴＤＮＡと、ＳＮＰ Ｂを検出するためのオリゴＤＮＡとを用いた。そして、以下のようにして、これらオリゴＤＮＡを含む溶液をそれぞれ調製し、アミノシランコートガラスへオリゴＤＮＡを固定化した。
オリゴＤＮＡを１０％グリセロール水溶液に溶解し、アミノシランをコートしたガラススライド上にスポットした。これを５５℃のインキュベーター中に一晩静置し、アミノシランをコートしたガラススライドとオリゴＤＮＡを結合させた。その後、２×ＳＳＣバッファーに０．１％となるようＳＤＳ溶液を加えた洗浄液で、ガラススライド上に残存する余剰のオリゴＤＮＡを洗い流し、乾燥させた。
このとき、本例では、４種類のリファレンス部４に対応するように、オリゴＡ：オリゴＢの濃度比を１００：０、７５：２５、５０：５０、７５：２５、０：１００と変化させた４種類の溶液を調製してリファレンス部４を作製した。
以上のようにして、ＤＮＡマイクロアレイを得た。
溶液サンプルの解析
上記で得られたＤＮＡマイクロアレイを用いて、ヒトゲノムのＳＮＰ解析を行った。解析する試料は、ヒト静脈血から精製したゲノムＤＮＡである。ゲノムＤＮＡは、全血をＤＮＡ抽出カラム（ＱＩＡＧＥＮ社 ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ ＭＩＮＩ Ｋｉｔ）を用いて精製した。このゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下のＰＣＲ反応液を用い、温度サイクル（９４℃×１分、９４℃・５５℃・７２℃それぞれ１分ずつ３０サイクル、７２℃×５分）をかけた。プライマーには、ＣＹ３標識した合成オリゴを用い、ＰＣＲ産物が蛍光を発するようにした。これにより、蛍光標識された目的ＤＮＡが増幅された。
（ＰＣＲ反応液の組成）
１０×ＰＣＲ溶液 １０μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液 ６μｌ
ｄＮＴＰ ８μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ ０．５μｌ（以上Ｔａｋａｒａ社製ＰＣＲ ｋｉｔ）
超純水 ６３．５μｌ
プライマー 各１μｌ
ＰＣＲの後、ＰＣＲ反応液を上記ＤＮＡマイクロアレイ上に導入した。ＤＮＡマイクロアレイ上に固定されたプローブＤＮＡと、ＰＣＲ反応液に含まれる増幅産物のハイブリダイゼーション反応のために、１０μｌのＰＣＲ反応液をスポット領域２にそそぎ、水を飽和量加えた容器に密閉し、３０℃で２時間、静置した。その後、３０℃に保温された、０．１％ＳＤＳを添加した０．２×ＳＳＣ溶液を注ぎ、ハイブリダイズしていない反応産物を洗い流し、超純水で軽く濯いだ後、蛍光測定した。
蛍光計測は、蛍光顕微鏡により基板上の蛍光を計測する方法にて行った。ＤＮＡマイクロアレイをスライドガラスに載せ、蛍光顕微鏡（ＩＸ−７０、Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）の視野中心で焦点を合わせ、水銀ランプとＷＩＧキューブ（広帯域ＩＧ励起）の組み合わせで得られた像をＣＣＤカメラ（アンドール製）で取り込んだ。この組み合わせにより増幅産物に結合した蛍光体ＣＹ３Ｒ及びリファレンス部４の蛍光を測定することができる。本例では、対物レンズは１０倍を使用し、露光時間１秒とした。なお、ＤＮＡマイクロアレイにおけるオリゴＤＮＡが乗っていない部分を別個に測定し、背景蛍光強度とした。測定値は、プローブＤＮＡ部分の蛍光強度から背景蛍光強度を差し引いたものとした。
この時、４点のリファレンススポット４の蛍光強度を同時に測定した。この測定値に基準値以上のばらつきが見られた場合、フォーカスの合わせ方やマイクロアレイ上の汚れなと、測定上のエラーがあったものと判断し、この測定全体を無効とした。また、複数のＤＮＡマイクロアレイを用いて上述したように溶液サンプルの解析を行う場合、４点のリファレンススポット４の蛍光測定値を用いることによって、測定値が環境条件などによって異なる値を示した場合であってもＤＮＡマイクロアレイ間の測定値の誤差を補正することができた。
また、本例では、オリゴＡとオリゴＢの混合比を変えて固定化したリファレンス部４を備えるＤＮＡマイクロアレイを用いているため、これらリファレンス部４の蛍光測定量から図４に示したような検量線を得ることができた。この検量線を用いることによって、試料に含まれるＤＮＡを定量することもできた。
【実施例２】
本例では、例えば、遺伝子の発現量を異なる条件下において比較する際に使用することができるＤＮＡマイクロアレイについて説明する。遺伝子の発現量を異なる条件下において比較する際には、異なる条件下における細胞からそれぞれｍＲＮＡを抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行い、それぞれｃＤＮＡを調製する。そして、各ＲＴ−ＰＣＲの際に、互いに異なる標識物質（例えばＣＹ３とＣＹ５を使用することができる）でラベル化したプライマーを用いることによって、異なる標識物質でラベル化されたｃＤＮＡ（ＣＹ３でラベル化したｃＤＮＡとＣＹ５でラベル化したｃＤＮＡ）を含む溶液を調製することができる。
本例で用いるＤＮＡマイクロアレイは、ＣＹ３でラベル化した第１のオリゴＤＮＡ（以下、オリゴＡ）及びＣＹ５でラベル化した第２のオリゴＤＮＡ（以下、オリゴＣ）とを固定化したリファレンス部４を有するものである。
具体的には、オリゴＡ：オリゴＣの濃度比を１００：０、７５：２５、５０：５０、７５：２５、０：１００とした５種類の溶液（オリゴＡ及びオリゴＣを合わせた最終濃度１μｌ）を調製してリファレンス部４を作製した（図１１参照）。なお、本例で使用したＤＮＡマイクロアレイは実施例１に記載した方法に準じて作製した。
このＤＮＡマイクロアレイにおける４つのリファレンス部４における、２種類の蛍光強度を測定したところ、図１２に示すような検量線を得ることができた。図１２に示した検量線を用い、実施例１と同様にして溶液に含まれるｃＤＮＡを定量することができる。これにより、異なる条件下の細胞において、解析対象の遺伝子の発現量変化を測定することができた。
【産業上の利用の可能性】
本発明によれば、試料に含まれる検出対象の核酸の正確な定量を行うことができる。
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【技術分野】
本発明は、核酸断片が基板上に固定されたＤＮＡマイクロアレイに関する。
【背景技術】
ＤＮＡマイクロアレイとは、スライドガラスやシリコン等の基板上にプローブ（探索子）となるＤＮＡを数百〜数万スポット並べたもので、従来の方法では数百〜数万回の実験を必要としていた作業を、一括して並列的に処理できる技術である。医薬品などのライフサイエンス分野では、疾病関連遺伝子の探索などのハイスループットが要求されるＤＮＡ解析の分野で重要な技術となっている。このようなＤＮＡマイクロアレイ技術は、遺伝子の探索などのＤＮＡ解析分野以外で、医用遺伝子検査分野などでの使用も期待されている。
しかしながら、現状のＤＮＡマイクロアレイにおいては、検出対象のＤＮＡを正確に定量することができなかった。
【発明の開示】
本発明は、第１のオリゴ核酸と第２のオリゴ核酸とを所定の比率で備えた複数のリファレンス部を有し、複数のリファレンス部における上記比率がそれぞれ異なるＤＮＡマイクロアレイに関する。ここで、第１のオリゴ核酸と第２のオリゴ核酸は、少なくとも一方が標識物質によりラベル化されていても良し、両方が異なる標識物質によりラベル化されていても良し、また、両方とも標識物質を有していなくても良い。これにより、リファレンス部から得られるシグナルに基づいて、試料に含まれる検出対象核酸の正確な定量が行える。
また、本発明は、第１のオリゴ核酸と第２のオリゴ核酸とを含み、当該第１のオリゴ核酸と当該第２のオリゴ核酸との比率がそれぞれ異なるようにした複数のリファレンス用溶液を、それぞれ基板上の異なる位置にスポットし、上記リファレンス用溶液に含まれる第１のオリゴ核酸と上記第２のオリゴ核酸とを固定化するＤＮＡマイクロアレイに関する。これにより、試料に含まれる検出対象の核酸の正確な定量が行えるＤＮＡマイクロアレイを作製できる。
さらに、本発明は、第１のオリゴ核酸及び第２のオリゴ核酸を所定の比率で備え、当該比率がそれぞれ異なる複数のリファレンス部と、ＤＮＡプローブを備えるプローブ部とを有するＤＮＡマイクロアレイに対して、検出対象の核酸を含む溶液を作用させ、上記リファレンス部におけるシグナルから、シグナル強度とオリゴ核酸との相関関係を導き出すものである。第１のオリゴ核酸及び第２のオリゴ核酸のいずれか一方に相補的結合し、標識物質を有する第１のラベル化オリゴ核酸を、ＤＮＡマイクロアレイに作用させることにより、当該第１のラベル化オリゴ核酸に基づくシグナルを上記リファレンス部におけるシグナルとすることもできる。これにより、リファレンス部から得られるシグナルに基づいて、試料に含まれる検出対象の核酸の正確な定量を行うことができる。
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
図１（Ａ）は、本発明を適用したＤＮＡマイクロアレイを模式的に示す斜視図であり、（Ｂ）サンプル領域を拡大して示す平面図である。
図２は、リファレンス部を模式的に示す図である。
図３は、ＤＮＡマイクロアレイを用いる検出装置を示す概略構成図である。
図４は、リファレンス部のシグナルに基づいて得られた検量線を示す特性図である。
図５は、サンプル領域を拡大して示す平面図である。
図６は、サンプル領域を拡大して示す平面図である。
図７は、リファレンス部を模式的に示す図である。
図８は、図７に示したリファレンス部のシグナルに基づいて得られた検量線を示す特性図である。
図９は、リファレンス部を模式的に示す図である。
図１０は、実施例で用いたオリゴＤＮＡを示す図である。
図１１は、リファレンス部を模式的に示す図である。
図１２は、図１１に示したリファレンス部のシグナルに基づいて得られた検量線を示す特性図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明を適用したＤＮＡマイクロアレイは、図１（Ａ）に示すように、基板１と、基板１の一主面上に設定されたサンプル領域２に形成された複数のＤＮＡプローブ部３と、当該サンプル領域２に形成された複数のリファレンス部４と、当該サンプル領域に形成されたバックグラウンド・コントロール部５とを備える。
基板１は、特に限定されず、例えば、スライドガラス、金属、ナイロン又はニトロセルロースメンブレン等からなる。また、基板１は、表面の一部或いは全部に対して、表面処理が施されたものであっても良いし、アミノシランからなる被膜が形成されてものであってもよい。
サンプル領域２は、基板１の一主面上の所定の領域であって、例えば、基板１の一主面の略中央に設定される。
ＤＮＡプローブ部３は、核酸断片（ＤＮＡプローブ或いはオリゴＤＮＡとも称する場合もある）を所定の密度で基板１の一主面に固定化することで形成される。ここで、固定化とは、共有結合のみならず、イオン結合等の如何なる結合態様も含む意味であり、また、リンカーを介する結合及びリンカーを介しない結合の両方を含む意味である。固定化する核酸断片としては、特に限定されないが、検体から抽出され、増幅や精製などの過程により調製されたＤＮＡ断片や、合成されたオリゴＤＮＡを挙げることができる。また、核酸断片の固定化に際しては、いわゆるスポッター（アレイヤー）を用いることができる。
また、複数のＤＮＡプローブ部３においては、各ＤＮＡプローブ部３に固定化する核酸断片の種類（具体的には塩基配列）が異なっている。しかしながら、ＤＮＡマイクロアレイは、１種類の核酸断片を固定化した複数のＤＮＡプローブ部３を有するものであっても良い。
例えば、アミノシランからなる被膜が形成されたガラスからなる基板１に対して、核酸断片を固定化する際には、先ず、固定化対象の核酸断片を含む溶液を調製する。そして、アミノシランからなる被膜上に、当該溶液をスポットして、所定の温度に維持して所定の時間静置する。その後、洗浄液によって基板上の余剰の核酸断片等を除去し、乾燥させることによってＤＮＡプローブ部３を形成することができる。
リファレンス部４は、図１（Ｂ）に示すように、複数のリファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄからなる。リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄは、それぞれサンプル領域２の四隅に位置する。各リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄには、第１のオリゴＤＮＡと第２のオリゴＤＮＡとが所定の比率で固定化されている。ここで、オリゴＤＮＡとは、通常、ＤＮＡマイクロアレイに固定化することができる長さ（塩基数）のＤＮＡ断片を意味する。オリゴＤＮＡの長さとしては、例えば１０〜１０００塩基、好ましくは２０〜２００塩基、より好ましくは２０〜８０塩基である。
１０〜１０００塩基のオリゴＤＮＡを用いる場合、オリゴＤＮＡは合成されたものに限らず、例えばＰＣＲプライマーの片側を標識化合物により修飾して得られるＰＣＲ産物を用いることもできる。このとき、技遺伝子を増幅する可能性もあるが、１０００塩基あれば技遺伝子を排除するプライマーを設計し、既知の配列を持ったＰＣＲ産物をオリゴＤＮＡとして用いることができる。２０〜２００塩基のオリゴＤＮＡを用いる場合、一般的に化学合成しやすい塩基長であり、オリゴＤＮＡを安価に手軽に入手することができる。２０〜８０塩基のオリゴＤＮＡを用いる場合、長い塩基においては自己構造をとったり、余剰のＤＮＡとハイブリダイゼーションしたりとノイズが増える傾向があるため、この長さのものが使いやすい。
リファレンス部４において、第１のオリゴＤＮＡと第２のオリゴＤＮＡは、これらのうち一方又は両方が標識物質によりラベル化されていても良し、これらのうち両方がラベル化されていなくても良い。一方をラベル化した場合、ラベル化されたオリゴＤＮＡの希釈列を安価に作製することができる。また、両方をラベル化した場合、ＤＮＡマイクロアレイにおいては、２種のＤＮＡを比較するために２色の蛍光色素を使用することが多いため、オリゴＤＮＡを２種のＤＮＡに対応した希釈系列が同時に得られる。第１のオリゴＤＮＡと第２のオリゴＤＮの両方をラベル化する場合、それぞれ異なる標識物質でラベル化する。なお、異なる標識物質とは、検出波長が異なる標識物質や、異なる検出手段でそれぞれ検出可能な標識物質を意味する。標識物質としては、例えば、蛍光標識物質、同位体標識物質、電機検出型標識物質を挙げることができる。蛍光標識物質としては、特に限定されず、如何なる蛍光物質を用いても良い。例えば、蛍光物質としては、Ｃｙ３、Ｃｙ５等のＣｙｅ−Ｄｙｅ（アマシャム・ファルマシア社製）、Ａｌｅｘａ色素（モレキュラープローブ社製）を使用することができる。また、同位体標識物質としては、特に限定されず、如何なる放射性同位体元素を用いても良い。例えば、放射性同位元素としては、３２Ｐを使用することができる。
さらに、第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡがラベル化されていないとは、蛍光或いは放射能といったシグナルを発していない、或いは、いわゆる蛍光検出器及び放射線検出器における検出限界以下の蛍光量及び放射線量を発するものを意味する。したがって、第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡがラベル化されていないとは、標識物質が第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡに付されていない場合、及び、検出限界以下の蛍光量及び放射線量となるようにクエンチャー（消光剤）等の物質が付されたものであっても良い。
複数のリファレンス部４に第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡを固定化する場合、リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄにおいて、第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡがそれぞれ異なる比率で固定化される。具体的には、リファレンス部４を作製する際には、先ず、第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡを所定の比率で含む溶液を調製する。すなわち、リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄそれぞれに対応するように、第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡを、４種類の異なる比率で混合した混合溶液を調製する。
次に、上述したＤＮＡプローブ部３を作製した場合と同様にして、混合溶液をスポットした後、混合溶液に含まれる第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡを基板１表面に固定化することで、リファレンス部４を作製することができる。このとき、リファレンス部４においては、混合溶液中の第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡの比率を反映して、第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡが所定の比率で固定化されることとなる。すなわち、リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄにおいては、第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡの合計の固定化量は一定であるが、固定化されたもののうち第１のオリゴＤＮＡが占める割合が混合溶液における比率に依存して異なることとなる。
例えば、第１のオリゴＤＮＡのみに標識物質を付した場合のリファレンス部４を、図２（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に模式的に示す。図２（ａ）は、第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡの比率を１００：０として混合溶液を調製し、リファレンス部４を作製した場合である。図２（ｂ）は、第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡの比率を５０：５０として混合溶液を調製し、リファレンス部４を作製した場合である。図２（ｃ）は、第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡの比率を０：１００として混合溶液を調製し、リファレンス部４を作製した場合である。
なお、標識物質を付した第１のオリゴＤＮＡをリファレンスとして固定する場合、標識物質を付した第１のオリゴＤＮＡを所定の濃度にした溶液をスポットし、固定化しても、固定化する第１のオリゴＤＮＡの密度（固定化量）は、必ずしも第１のオリゴＤＮＡの濃度に依存するものではない。すなわち、第１のオリゴＤＮＡの濃度が異なる複数の溶液を用いて第１のラベル化担体を固定化しても、第１のラベル化担体の密度（固定化量）は、溶液における第１のオリゴＤＮＡ濃度を反映することなく、ほぼ一定になってしまう。
これに対して、図２（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に示すように、混合溶液中の第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡの比率を調節することで、リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄにおける第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡの固定化比率、換言すると、標識物質を付した第１のオリゴＤＮＡの固定化量を正確に規定することができる。
なお、バックグラウンド・コントロール部５は、基板１及び核酸断片に起因するシグナルを検出するためのものであるため、核酸断片のみを固定化した部位である。
以上のように構成されたＤＮＡマイクロアレイは、例えば、図３に示すような、検出装置に適用され、溶液サンプルに含まれる検出対象のＤＮＡの検出及び／又は定量を行うことができる。図３に示す検出装置は、いわゆるフローセル方式のＤＮＡマイクロアレイシステムである。
この検出装置は、ＤＮＡマイクロアレイを載置するフローセル１０と、フローセル１０に供給するハイブリダイゼーション溶液を蓄えた第１ボトル１１と、フローセル１０に供給する洗浄液を蓄えた第２ボトル１２と、第１ボトル１１及び第２ボトル１２とフローセル１０とを連結する流路上に配設されたバルブ１３と、バルブ１３を介して溶液サンプル等を流路に供給するための分注器１４と、フローセル１０から排出される液体の流路上に配設されたポンプ１５と、フローセル１０内から排出された液体を廃棄するための廃液ボトル１６とを備えている。また、検出装置は、フローセル１０に載置されたＤＮＡマイクロアレイにおけるシグナルを検出する検出部１７を備えている。なお、検出装置は、信号入力部、データ処理回路及びモニターを有するデータ処理装置（図示せず）と接続されており、検出部１７で検出したシグナルを当該データ処理装置に出力することができる。
このように構成された検出装置は、フローセル１０内に載置したＤＮＡマイクロアレイを用いて、以下のようにして、溶液サンプルに含まれる検出対象のＤＮＡの検出及び／又は定量を行う。先ず、ポンプ１５を駆動して第２ボトルからフローセル１０内に洗浄液を導入する。これにより、フローセル１０内部及びＤＮＡマイクロアレイを洗浄することができる。次に、ポンプ１５を駆動して第１ボトル１１からフローセル１０内にハイブリダイゼーション溶液を導入する。これにより、フローセル１０内部及びＤＮＡマイクロアレイ上に残存する洗浄液をハイブリダイゼーション溶液に置換することができる。
次に、フローセル１０内にハイブリダイゼーション溶液を導入しながら、分注器１４からバルブ１３を介して溶液サンプルをフローセル１０に導入する。これにより、ＤＮＡマイクロアレイに対して溶液サンプルを作用させることができる。次に、ＤＮＡマイクロアレイに溶液サンプルが接触している状態で、フローセル１０内部を所定の温度に制御する。これにより、フローセル１０内部において、充填された溶液がハイブリダイゼーションに適した温度となり、溶液サンプルに含まれるＤＮＡと、ＤＮＡプローブ部３に固定化された核酸断片とをハイブリダイズさせることができる。
所定時間経過後、次に、ポンプ１５を駆動してフローセル１０内部の溶液を廃棄ボトル１６に排出するとともに、第１ボトル１１からフローセル１０内にハイブリダイゼーション溶液を導入する。これにより、フローセル１０内部及びＤＮＡマイクロアレイ上に残存する、未反応のＤＮＡ等を含む溶液サンプルを除去することができる。
次に、検出部１７によってＤＮＡマイクロアレイにおけるシグナルを検出する。このとき、各ＤＮＡプローブ部３における蛍光シグナルと、リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄにおける蛍光シグナルと、バックグラウンド・コントロール部５における蛍光シグナルとを検出する。
リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄにおける蛍光シグナル強度は、標識物質が付された第１のオリゴＤＮＡの濃度（固定化量）に依存している。本発明に係るＤＮＡマイクロアレイにおいては、図２に示したように、リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄにおける標識物質が付された第１のオリゴＤＮＡの濃度（固定化量）が正確に規定されている。このため、リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄにおける蛍光シグナル強度を検出することによって、図４に示すように、各リファレンス部４の蛍光シグナル強度と第１のラベル化担体の比率との関係を示す検量線を得ることができる。例えば、リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄにおける標識物質が付された第１のオリゴＤＮＡの濃度（固定化量）を直線的な勾配をもって規定した場合、得られる検量線は直線を示すこととなる。
得られた検量線に、ＤＮＡプローブ部３における蛍光シグナル強度を外挿することによって、溶液サンプルに含まれる検出対象のＤＮＡを定量することができる。また、検量線が、標識物質が付された第１のオリゴＤＮＡの濃度（固定化量）に基づいて予測されるプロファイルを示さない場合、或いは、リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄのいずれかの蛍光シグナルが検出されない場合には、リファレンス部４に固定した第１のオリゴＤＮＡのみならず、ＤＮＡプローブ部３に固定化したＤＮＡプローブも剥離或いは分解等の不具合が生じていると判断することができる。すなわち、リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄにおける蛍光シグナルを検出することによって、ＤＮＡマイクロアレイの使用可否判断や実験工程の不具合を確認することができる。
溶液サンプルに含まれる検出対象のＤＮＡを検出及び／又は定量した後、フローセル１０内の溶液を、例えば９５℃に昇温する。これによって、ＤＮＡプローブ部３におけるＤＮＡプローブとハイブリダイズした核酸断片を、ＤＮＡプローブから解離させることができる。次に、ＤＮＡプローブと核酸断片とを解離させた状態で、ポンプ１５を駆動して第２ボトルからフローセル１０内に洗浄液を導入する。これにより、フローセル１０内部及びＤＮＡマイクロアレイに残存する核酸断片等を除去することができる。
測定終了後、上記各工程を繰り返すことによって、複数の溶液サンプルに対して連続測定を行うことができる。この連続測定に際して、各測定において、リファレンス部４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄにおける蛍光シグナルを検出することによって、ＤＮＡマイクロアレイの使用可否判断や実験工程の不具合を確認することができる。これによって、ＤＮＡマイクロアレイの繰り返し使用に伴うＤＮＡプローブの剥離や、実験工程の不具合を連続測定における各測定で検出することができる。
なお、ＤＮＡマイクロアレイにおいては、ＤＮＡプローブ部３、リファレンス部４及びバックグラウンド・コントロール部５が図１（Ｂ）に示したような位置に限定されず、例えば、図５或いは図６に示すような位置に配されていても良い。
特に、本発明に係るＤＮＡマイクロアレイにおいては、リファレンス部４に固定化される第１のオリゴＤＮＡ及び第２のオリゴＤＮＡは標識物質を付していないものであってもよい。この場合においても、ＤＮＡマイクロアレイは、図３に示した検出装置に適用され、溶液サンプルに含まれる検出対象のＤＮＡの検出及び／又は定量を行うことができる。
この場合、ＤＮＡマイクロアレイに対して溶液サンプルを作用させる際に、第１のオリゴＤＮＡ又は第２のオリゴＤＮＡに相補的な塩基配列を有し、標識物質が付されたラベル化オリゴ核酸を溶液サンプルに混合する。これにより、図７に模式的に示すように、溶液サンプルに含まれたラベル化オリゴ核酸と第１のオリゴＤＮＡ又は第２のオリゴＤＮＡとが特異的に結合する。これにより、リファレンス部４は標識物質に起因する蛍光シグナルを生ずることとなり、上述した場合と同様に、図８に示すような検量線を得ることができる。そして、この検量線に基づいて、上述した場合と同様にして溶液サンプルに含まれる検出対象のＤＮＡを定量することができる。
特に、本例のＤＮＡマイクロアレイは、溶液サンプルの解析時にリファレンス部４に固定化された第１のオリゴＤＮＡをラベル化することとなる。すなわち、本例のＤＮＡマイクロアレイは、溶液サンプルの解析までリファレンス部４に蛍光標識物質を有しないこととなる。蛍光標識物質は、光の曝露や湿度等の影響により蛍光強度が減少することがある。しかしながら、本例のＤＮＡマイクロアレイは、溶液サンプルの解析まで長期間保管した場合でも、溶液サンプルの解析時におけるリファレンス部４の蛍光シグナル強度を一定に維持することができる。したがって、本例のＤＮＡマイクロアレイは、長期間の保存に適し、更に、繰り返し使用に適したものであるといえる。
なお、本例のＤＮＡマイクロアレイを用いる場合、第１のオリゴＤＮＡに対して相補的な塩基配列及び蛍光標識物質を有する第１のラベル化オリゴ核酸並びに第２のオリゴＤＮＡに対して相補的な塩基配列及び蛍光標識物質を有する第２のラベル化オリゴ核酸を用いても良い。すなわち、ＤＮＡマイクロアレイに対して溶液サンプルを作用させる際に、第１のラベル化オリゴ核酸及び第２のラベル化オリゴ核酸を溶液サンプルに混合する。
これにより、図９に模式的に示すように、第１のラベル化オリゴ核酸と第１のオリゴＤＮＡとが特異的に結合し、第２のラベル化オリゴ核酸と第２のオリゴＤＮＡとが特異的に結合する。これにより、リファレンス部４は２種類の標識物質に起因する２種類の蛍光シグナルを生ずることとなり、２種類の蛍光標識物質の蛍光シグナル強度に基づいて検量線を得ることができる。そして、この検量線に基づいて、上述した場合と同様にして溶液サンプルに含まれる検出対象のＤＮＡを定量することができる。
以下実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
ＤＮＡマイクロアレイの作製
本例では、アミノシランでコートしたガラススライドを基板１として用いた。ガラススライドにアミノシランコートする方法を以下に記す。
先ず、ガラススライドをアセトン中で超音波洗浄した。その後、ガラススライドを１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム中に浸漬し、２５℃の恒温槽中に１時間、静置した。その後、ガラススライドを超純水で２度濯いだ後、１％アミノシラン（アミノエチルアミノプロピルトリメトキシシラン等）溶液中に浸漬し１時間、室温で静置した。再び超純水で２度すすぎ、１２０℃のホットプレート上で５分間乾燥させた。アミノシランとＤＮＡの架橋剤として、ＰＤＣ（１，４−ｐ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ ｄｉｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）を用いた。アミノシラン化したガラススライドにＰＤＣを反応させるために、ＰＤＣ ０．１５ｇをピリジン１５ｍｌ、ＤＭＦ １３５ｍｌに溶解した溶液を調製した。ガラススライドをこの溶液に浸漬し、２時間静置した。次に、メタノール、アセトンでそれぞれ５分ずつ洗浄し、１２０℃のホットプレート上で５分間乾燥させた。
続いて、得られたガラススライドの一主面上に、ＤＮＡプローブ部３及びリファレンス部４を作製した。具体的に、本例では、図１０に示すオリゴＤＮＡを用いた。本例では、リファレンス部４に固定化する第１のオリゴＤＮＡのみをラベル化した例である。すなわち、第１のオリゴＤＮＡは、所定の塩基配列からなるオリゴＤＮＡに、ガラススライドに固定するためのアミノ基と検出のためのＣＹ３とが修飾されたもの（以下、オリゴＡ）である。第２のオリゴＤＮＡとしては、オリゴＡと同じ塩基配列からなり、ガラススライドに固定するためのアミノ基を有するもの（以下、オリゴＢ）を使用した。
また、本例において、バックグラウンド・コントロール５としては、図１０に示すように、リファレンス部４に用いたオリゴＤＮＡと同配列で、ＣＹ３修飾されていないオリゴＤＮＡを用いた。また、本例において、ＤＮＡプローブとしては、ＳＮＰ Ａを検出するためのオリゴＤＮＡと、ＳＮＰ Ｂを検出するためのオリゴＤＮＡとを用いた。そして、以下のようにして、これらオリゴＤＮＡを含む溶液をそれぞれ調製し、アミノシランコートガラスへオリゴＤＮＡを固定化した。
オリゴＤＮＡを１０％グリセロール水溶液に溶解し、アミノシランをコートしたガラススライド上にスポットした。これを５５℃のインキュベーター中に一晩静置し、アミノシランをコートしたガラススライドとオリゴＤＮＡを結合させた。その後、２×ＳＳＣバッファーに０．１％となるようＳＤＳ溶液を加えた洗浄液で、ガラススライド上に残存する余剰のオリゴＤＮＡを洗い流し、乾燥させた。
このとき、本例では、４種類のリファレンス部４に対応するように、オリゴＡ：オリゴＢの濃度比を１００：０、７５：２５、５０：５０、７５：２５、０：１００と変化させた４種類の溶液を調製してリファレンス部４を作製した。
以上のようにして、ＤＮＡマイクロアレイを得た。
溶液サンプルの解析
上記で得られたＤＮＡマイクロアレイを用いて、ヒトゲノムのＳＮＰ解析を行った。解析する試料は、ヒト静脈血から精製したゲノムＤＮＡである。ゲノムＤＮＡは、全血をＤＮＡ抽出カラム（ＱＩＡＧＥＮ社 ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ ＭＩＮＩ Ｋｉｔ）を用いて精製した。このゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下のＰＣＲ反応液を用い、温度サイクル（９４℃×１分、９４℃・５５℃・７２℃それぞれ１分ずつ３０サイクル、７２℃×５分）をかけた。プライマーには、ＣＹ３標識した合成オリゴを用い、ＰＣＲ産物が蛍光を発するようにした。これにより、蛍光標識された目的ＤＮＡが増幅された。
（ＰＣＲ反応液の組成）
１０×ＰＣＲ溶液 １０μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液 ６μｌ
ｄＮＴＰ ８μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ ０．５μｌ（以上Ｔａｋａｒａ社製ＰＣＲ ｋｉｔ）
超純水 ６３．５μｌ
プライマー 各１μｌ
ＰＣＲの後、ＰＣＲ反応液を上記ＤＮＡマイクロアレイ上に導入した。ＤＮＡマイクロアレイ上に固定されたプローブＤＮＡと、ＰＣＲ反応液に含まれる増幅産物のハイブリダイゼーション反応のために、１０μｌのＰＣＲ反応液をスポット領域２にそそぎ、水を飽和量加えた容器に密閉し、３０℃で２時間、静置した。その後、３０℃に保温された、０．１％ＳＤＳを添加した０．２×ＳＳＣ溶液を注ぎ、ハイブリダイズしていない反応産物を洗い流し、超純水で軽く濯いだ後、蛍光測定した。
蛍光計測は、蛍光顕微鏡により基板上の蛍光を計測する方法にて行った。ＤＮＡマイクロアレイをスライドガラスに載せ、蛍光顕微鏡（ＩＸ−７０、Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）の視野中心で焦点を合わせ、水銀ランプとＷＩＧキューブ（広帯域ＩＧ励起）の組み合わせで得られた像をＣＣＤカメラ（アンドール製）で取り込んだ。この組み合わせにより増幅産物に結合した蛍光体ＣＹ３Ｒ及びリファレンス部４の蛍光を測定することができる。本例では、対物レンズは１０倍を使用し、露光時間１秒とした。なお、ＤＮＡマイクロアレイにおけるオリゴＤＮＡが乗っていない部分を別個に測定し、背景蛍光強度とした。測定値は、プローブＤＮＡ部分の蛍光強度から背景蛍光強度を差し引いたものとした。
この時、４点のリファレンススポット４の蛍光強度を同時に測定した。この測定値に基準値以上のばらつきが見られた場合、フォーカスの合わせ方やマイクロアレイ上の汚れなと、測定上のエラーがあったものと判断し、この測定全体を無効とした。また、複数のＤＮＡマイクロアレイを用いて上述したように溶液サンプルの解析を行う場合、４点のリファレンススポット４の蛍光測定値を用いることによって、測定値が環境条件などによって異なる値を示した場合であってもＤＮＡマイクロアレイ間の測定値の誤差を補正することができた。
また、本例では、オリゴＡとオリゴＢの混合比を変えて固定化したリファレンス部４を備えるＤＮＡマイクロアレイを用いているため、これらリファレンス部４の蛍光測定量から図４に示したような検量線を得ることができた。この検量線を用いることによって、試料に含まれるＤＮＡを定量することもできた。
【実施例２】
本例では、例えば、遺伝子の発現量を異なる条件下において比較する際に使用することができるＤＮＡマイクロアレイについて説明する。遺伝子の発現量を異なる条件下において比較する際には、異なる条件下における細胞からそれぞれｍＲＮＡを抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行い、それぞれｃＤＮＡを調製する。そして、各ＲＴ−ＰＣＲの際に、互いに異なる標識物質（例えばＣＹ３とＣＹ５を使用することができる）でラベル化したプライマーを用いることによって、異なる標識物質でラベル化されたｃＤＮＡ（ＣＹ３でラベル化したｃＤＮＡとＣＹ５でラベル化したｃＤＮＡ）を含む溶液を調製することができる。
本例で用いるＤＮＡマイクロアレイは、ＣＹ３でラベル化した第１のオリゴＤＮＡ（以下、オリゴＡ）及びＣＹ５でラベル化した第２のオリゴＤＮＡ（以下、オリゴＣ）とを固定化したリファレンス部４を有するものである。
具体的には、オリゴＡ：オリゴＣの濃度比を１００：０、７５：２５、５０：５０、７５：２５、０：１００とした５種類の溶液（オリゴＡ及びオリゴＣを合わせた最終濃度１μｌ）を調製してリファレンス部４を作製した（図１１参照）。なお、本例で使用したＤＮＡマイクロアレイは実施例１に記載した方法に準じて作製した。
このＤＮＡマイクロアレイにおける４つのリファレンス部４における、２種類の蛍光強度を測定したところ、図１２に示すような検量線を得ることができた。図１２に示した検量線を用い、実施例１と同様にして溶液に含まれるｃＤＮＡを定量することができる。これにより、異なる条件下の細胞において、解析対象の遺伝子の発現量変化を測定することができた。
【産業上の利用の可能性】
本発明によれば、試料に含まれる検出対象の核酸の正確な定量を行うことができる。
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、
第１のオリゴ核酸と第２のオリゴ核酸とが所定の比率で、上記基板に固定化された複数のリファレンス部とを有し、
上記複数のリファレンス部における上記比率がそれぞれ異なるＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項２】
請求の範囲１項記載のＤＮＡマイクロアレイであって、
上記第１のオリゴ核酸は標識物質でラベル化されており、上記第２のオリゴ核酸はラベル化されていないＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項３】
請求の範囲１項記載のＤＮＡマイクロアレイであって、
上記第１のオリゴ核酸は標識物質でラベル化されており、上記第２のオリゴ核酸は上記第１のオリゴ核酸とは異なる標識物質によりラベル化されたＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項４】
請求の範囲１項記載のＤＮＡマイクロアレイであって、
上記第１のオリゴ核酸及び上記第２のオリゴ核酸は、それぞれ異なる蛍光物質を結合したものであるＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項５】
請求の範囲１項記載のＤＮＡマイクロアレイであって、
上記第１のオリゴ及び上記第２のオリゴのうち少なくとも一方は、標識物質を有するラベル化オリゴ核酸と相補的な配列を有することを特徴とする請求の範囲１記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項６】
第１のオリゴ核酸と第２のオリゴ核酸とを含み、当該第１のオリゴ核酸と当該第２のオリゴ核酸との比率がそれぞれ異なる複数のリファレンス用溶液を、それぞれ基板上の異なる位置に配置し、
上記リファレンス用溶液に含まれる第１のオリゴ核酸と、上記第２のオリゴ核酸とを固定化するＤＮＡマイクロアレイの作製方法。
【請求項７】
請求の範囲６項記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法であって、
上記複数のリファレンス用溶液は、第１のオリゴ核酸及び第２のオリゴ核酸を合わせた濃度を一定とする方法。
【請求項８】
請求の範囲６項記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法であって、
上記第１のオリゴ核酸は標識物質でラベル化されており、上記第２のオリゴ核酸はラベル化されていない方法。
【請求項９】
請求の範囲６項記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法であって、
上記第１のオリゴ核酸は標識物質でラベル化されており、上記第２のオリゴ核酸は上記第１のオリゴ核酸とは異なる標識物質によりラベル化されている方法。
【請求項１０】
請求の範囲６項記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法であって、
上記第１のオリゴ核酸及び上記第２のオリゴ核酸は、それぞれ異なる蛍光物質を結合したものである方法。
【請求項１１】
請求の範囲６項記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法であって、
上記第１のオリゴ及び上記第２のオリゴのうち少なくとも一方は、標識物質を有するラベル化オリゴ核酸と相補的な配列を有する方法。
【請求項１２】
基板と、第１のオリゴ核酸及び第２のオリゴ核酸が所定の比率で上記基板に固定化され、上記比率がそれぞれ異なる複数のリファレンス部と、ＤＮＡプローブが上記基板上に固定化されたプローブ部とを有するＤＮＡマイクロアレイに対して、検出対象のＤＮＡを含む溶液を接触させる工程と、
上記溶液に含まれるＤＮＡと上記ＤＮＡプローブとのハイブリダイズに基づくシグナルを検出する工程と、
上記リファレンス部におけるシグナルから、シグナル強度と基板に固定化されたオリゴ核酸との相関関係を導き出す工程を含む核酸分析方法。
【請求項１３】
請求の範囲１２項記載の核酸分析方法であって、
シグナル強度と基板に固定化されたオリゴ核酸との相関関係に基づいて、シグナル強度と基板に固定化されたオリゴ核酸量との関係を示す検量線を求める工程を含む方法。
【請求項１４】
請求の範囲１３項記載の核酸分析方法であって、
上記検量線を用い、上記ＤＮＡプローブにハイブリダイズした核酸を定量する方法。
【請求項１５】
請求の範囲１２項記載の核酸分析方法であって、
上記第１のオリゴ核酸又は上記第２のオリゴ核酸の少なくとも一部に相補的な塩基配列と、標識物質とを有するラベル化オリゴ核酸を、ＤＮＡマイクロアレイに接触させ、当該ラベル化オリゴ核酸に基づくシグナルを上記リファレンス部におけるシグナルとする方法。
【請求項１６】
請求の範囲１２項記載の核酸分析方法であって、
上記第１のオリゴ核酸の少なくとも一部に相補的な塩基配列と標識物質とを有する第１のラベル化オリゴ核酸と、上記第２のオリゴ核酸の少なくとも一部に相補的な塩基配列と上記第１のラベル化オリゴ核酸が有する標識物質とは異なる標識物質とを有する第２のラベル化オリゴ核酸との一方又は両方を、ＤＮＡマイクロアレイに接触させ、当該第１のラベル化オリゴ核酸及び当該第２のラベル化オリゴ核酸に基づくシグナルを上記リファレンス部におけるシグナルとする方法。
【請求項１】
基板と、
第１のオリゴ核酸と第２のオリゴ核酸とが所定の比率で、上記基板に固定化された複数のリファレンス部とを有し、
上記複数のリファレンス部における上記比率がそれぞれ異なるＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項２】
請求の範囲１項記載のＤＮＡマイクロアレイであって、
上記第１のオリゴ核酸は標識物質でラベル化されており、上記第２のオリゴ核酸はラベル化されていないＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項３】
請求の範囲１項記載のＤＮＡマイクロアレイであって、
上記第１のオリゴ核酸は標識物質でラベル化されており、上記第２のオリゴ核酸は上記第１のオリゴ核酸とは異なる標識物質によりラベル化されたＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項４】
請求の範囲１項記載のＤＮＡマイクロアレイであって、
上記第１のオリゴ核酸及び上記第２のオリゴ核酸は、それぞれ異なる蛍光物質を結合したものであるＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項５】
請求の範囲１項記載のＤＮＡマイクロアレイであって、
上記第１のオリゴ及び上記第２のオリゴのうち少なくとも一方は、標識物質を有するラベル化オリゴ核酸と相補的な配列を有することを特徴とする請求の範囲１記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項６】
第１のオリゴ核酸と第２のオリゴ核酸とを含み、当該第１のオリゴ核酸と当該第２のオリゴ核酸との比率がそれぞれ異なる複数のリファレンス用溶液を、それぞれ基板上の異なる位置に配置し、
上記リファレンス用溶液に含まれる第１のオリゴ核酸と、上記第２のオリゴ核酸とを固定化するＤＮＡマイクロアレイの作製方法。
【請求項７】
請求の範囲６項記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法であって、
上記複数のリファレンス用溶液は、第１のオリゴ核酸及び第２のオリゴ核酸を合わせた濃度を一定とする方法。
【請求項８】
請求の範囲６項記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法であって、
上記第１のオリゴ核酸は標識物質でラベル化されており、上記第２のオリゴ核酸はラベル化されていない方法。
【請求項９】
請求の範囲６項記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法であって、
上記第１のオリゴ核酸は標識物質でラベル化されており、上記第２のオリゴ核酸は上記第１のオリゴ核酸とは異なる標識物質によりラベル化されている方法。
【請求項１０】
請求の範囲６項記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法であって、
上記第１のオリゴ核酸及び上記第２のオリゴ核酸は、それぞれ異なる蛍光物質を結合したものである方法。
【請求項１１】
請求の範囲６項記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法であって、
上記第１のオリゴ及び上記第２のオリゴのうち少なくとも一方は、標識物質を有するラベル化オリゴ核酸と相補的な配列を有する方法。
【請求項１２】
基板と、第１のオリゴ核酸及び第２のオリゴ核酸が所定の比率で上記基板に固定化され、上記比率がそれぞれ異なる複数のリファレンス部と、ＤＮＡプローブが上記基板上に固定化されたプローブ部とを有するＤＮＡマイクロアレイに対して、検出対象のＤＮＡを含む溶液を接触させる工程と、
上記溶液に含まれるＤＮＡと上記ＤＮＡプローブとのハイブリダイズに基づくシグナルを検出する工程と、
上記リファレンス部におけるシグナルから、シグナル強度と基板に固定化されたオリゴ核酸との相関関係を導き出す工程を含む核酸分析方法。
【請求項１３】
請求の範囲１２項記載の核酸分析方法であって、
シグナル強度と基板に固定化されたオリゴ核酸との相関関係に基づいて、シグナル強度と基板に固定化されたオリゴ核酸量との関係を示す検量線を求める工程を含む方法。
【請求項１４】
請求の範囲１３項記載の核酸分析方法であって、
上記検量線を用い、上記ＤＮＡプローブにハイブリダイズした核酸を定量する方法。
【請求項１５】
請求の範囲１２項記載の核酸分析方法であって、
上記第１のオリゴ核酸又は上記第２のオリゴ核酸の少なくとも一部に相補的な塩基配列と、標識物質とを有するラベル化オリゴ核酸を、ＤＮＡマイクロアレイに接触させ、当該ラベル化オリゴ核酸に基づくシグナルを上記リファレンス部におけるシグナルとする方法。
【請求項１６】
請求の範囲１２項記載の核酸分析方法であって、
上記第１のオリゴ核酸の少なくとも一部に相補的な塩基配列と標識物質とを有する第１のラベル化オリゴ核酸と、上記第２のオリゴ核酸の少なくとも一部に相補的な塩基配列と上記第１のラベル化オリゴ核酸が有する標識物質とは異なる標識物質とを有する第２のラベル化オリゴ核酸との一方又は両方を、ＤＮＡマイクロアレイに接触させ、当該第１のラベル化オリゴ核酸及び当該第２のラベル化オリゴ核酸に基づくシグナルを上記リファレンス部におけるシグナルとする方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９０１２９
【国際公開日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【発行日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５７０５４２（Ｐ２００４−５７０５４２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／００４２２８
【国際出願日】平成１５年４月２日（２００３．４．２）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【発行日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／００４２２８
【国際出願日】平成１５年４月２日（２００３．４．２）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
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