【課題】骨の変調の分子機序を解明するため、候補新薬のスクリーニングおよび開発のため、そして骨の発達および骨量減少障害の治療のために、追加の研究用ツールの提供。
【解決手段】ＬＲＰ５、ＨＢＭ（ＬＲＰ５の変異体）、および／またはＬＲＰ６の細胞外ドメインとＤｋｋ−１を含むＤｋｋとの新規相互作用に関連する試薬、化合物、組成物および方法を提供する。特定の核酸、ポリペプチド、抗体、アッセイ方法、診断方法および治療方法はＤｋｋ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭおよびＷｎｔシグナル伝達に関連しており、それらに影響を及ぼす。Ｄｋｋ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭおよびＷｎｔは骨および脂質細胞シグナル伝達に関与している。したがって、脂質濃度および／または骨量を変調する試薬および方法は、骨粗鬆症のような異常な脂質濃度および骨量障害の治療および診断において有用である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検対象における低骨量もしくは高骨量および／または高脂質もしくは低脂質濃度を診断する方法であって、前記被検対象が（ａ）高骨量もしくは低骨量および／または（ｂ）高脂質もしくは低脂質濃度を有するかどうかを決定するために、前記被検対象におけるＤｋｋ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭおよび／またはＨＢＭ様変異体の発現を検査するステップと、Ｄｋｋ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＨＢＭ、またはＨＢＭ様変異体が過剰もしくは過小発現しているかどうかを決定するステップとを含む方法。
【請求項２】
ＬＲＰ５、ＬＲＰ６もしくはＨＢＭとＤｋｋとの相互作用、またはＬＲＰ５、ＬＲＰ６もしくはＨＢＭのＤｋｋ結合フラグメントとＤｋｋとの相互作用を変調する化合物をスクリーニングする方法であって
（ａ）ＤｋｋおよびそのＬＲＰ５、ＬＲＰ６および／またはＨＢＭ結合フラグメントを化合物に曝露させるステップと、
（ｂ）前記化合物がＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ結合フラグメントとのＤｋｋ相互作用を変調するかどうかを決定するステップと
を含む方法。
【請求項３】
前記変調が、前記化合物がＤｋｋまたはそのＬＲＰ５、ＬＲＰ６もしくはＨＢＭ結合フラグメントに結合するかどうかによって決定される請求項２の方法。
【請求項４】
ＤｋｋまたはそのＬＲＰ結合フラグメントが基質に付着される請求項２の方法。
【請求項５】
前記化合物がＤｋｋ相互作用タンパク質、またはそのＤｋｋ結合フラグメントからなる群から選択される１つ以上の化合物を含む請求項２の方法。
【請求項６】
ＤｋｋとＤｋｋ相互作用タンパク質との相互作用を変調する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）Ｄｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントを化合物に曝露させるステップと、
（ｂ）前記化合物がＤｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントに結合したかどうかを決定するステップと、
（ｃ）前記化合物がＤｋｋ相互作用タンパク質とＤｋｋとの相互作用を変調するかどうかをさらに決定するステップと
を含む方法。
【請求項７】
前記化合物がＤｋｋペプチドアプタマーを含む請求項２または６の方法。
【請求項８】
前記化合物がＤｋｋペプチドアプタマーの模倣物を含む請求項２または６の方法。
【請求項９】
前記化合物がＤｋｋ相互作用タンパク質ペプチドアプタマーを含む請求項２または６の方法。
【請求項１０】
前記化合物がＬＲＰ５ペプチドアプタマーを含む請求項２または６の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドアプタマーがＯＳＴ２６２（配列番号２０８）である請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記化合物がＬＲＰ５抗体を含む請求項２または６の方法。
【請求項１３】
前記化合物がＤｋｋ相互作用タンパク質ペプチドアプタマーの模倣物である請求項２または６の方法。
【請求項１４】
前記Ｄｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントが基質に付着される請求項１３の方法。
【請求項１５】
ＤｋｋとＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭとの相互作用を変調する化合物を同定するための方法であって、
（ａ）第１蛍光タグを使用してＬＲＰ５、ＬＲＰ６、もしくはＨＢＭ蛍光融合タンパク質を作製するステップと、
（ｂ）第２蛍光タグを含むＤｋｋ融合タンパク質を作製するステップと、
（ｃ）試験化合物を添加するステップと、
（ｄ）前記化合物がＤｋｋとＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭとの相互作用を変調するかどうかを決定するために蛍光共鳴エネルギー転移法（ＦＲＥＴ）または生物蛍光共鳴エネルギー転移法（ＢＲＥＴ）を使用して蛍光タグ発光の比率における変化を評価するステップと
を含む方法。
【請求項１６】
Ｄｋｋタンパク質に対する結合パートナーを同定する方法であって、
（ａ）１つ以上のＤｋｋタンパク質またはそのＬＲＰ５／ＬＲＰ６結合フラグメントを潜在的結合パートナーへ曝露させるステップと、
（ｂ）前記潜在的結合パートナーがＤｋｋタンパク質またはそのＬＲＰ５／ＬＲＰ６結合フラグメントへ結合するかどうかを決定するステップと
を含む方法。
【請求項１７】
Ｄｋｋ相互作用タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸とインフレームであるＧａｌ４もしくはＬｅｘＡの活性化ドメインとインフレームである足場タンパク質をコードする核酸を含むＤｋｋ相互作用タンパク質ペプチドアプタマーをコードする核酸。
【請求項１８】
請求項１７の核酸を含むベクター。
【請求項１９】
前記足場タンパク質がｔｒｘＡである請求項１７の核酸。
【請求項２０】
その自然環境における細胞外相互作用を通して結合するペプチド結合対の第１のペプチドと第２のペプチドとの結合相互作用に及ぼす化合物の変調活性を検出する方法であって、
（ｉ）
ａ）転写活性化タンパク質ＤＮＡ結合ドメインへ結合した第１のペプチドまたはそのセグメントを含む第１の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）転写活性化タンパク質転写活性化ドメインへ結合した第２のペプチドまたはそのセグメントを含む第２の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（このとき第１のペプチドまたはそのセグメントと第２のペプチドまたはそのセグメントとの結合は転写活性化タンパク質を再構成する）、
ｃ）再構成された転写活性化タンパク質の陽性転写制御下で活性化されたレポーターエレメントと（このとき前記レポーターエレメントの発現は選択された表現型を生じる）、
を含む少なくとも１つの真核細胞を培養するステップと、
（ｉｉ）前記真核細胞を化合物の存在下で前記選択された表現型を検出するために適合する条件下で培養するステップと、
（ｉｉｉ）前記化合物が前記選択された表現型を生成する前記レポーターエレメントの発現に影響を及ぼすかどうかを決定することによって前記化合物が前記ペプチド結合対の結合相互作用に影響を及ぼす能力を検出するステップと（このとき、（１）前記第１のペプチドはＤｋｋペプチドであり、第２のペプチドはＬＲＰ５、ＨＢＭ、ＬＲＰ６およびＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭのＤｋｋ結合部分から選択されたペプチドである、または（２）前記第１のペプチドはＤｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントであり、前記第２のペプチドはＤｋｋペプチドである）、
を含む方法。
【請求項２１】
前記真核細胞が酵母細胞である請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記酵母細胞がサッカロミセスである請求項２１の方法。
【請求項２３】
サッカロミセス細胞がサッカロミセス・セレヴィシエである請求項２２の方法。
【請求項２４】
ＤｋｋがＤｋｋ−１であり、前記化合物が１つ以上のＤｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントを含む請求項２０の方法。
【請求項２５】
前記化合物がアッセイに直接的に添加される請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記化合物が前記第１および第２のペプチドに加えて前記真核細胞によって組換え的に発現させられる請求項２４の方法。
【請求項２７】
前記化合物がＤｋｋペプチドアプタマーを含む請求項２０の方法。
【請求項２８】
前記化合物がＤｋｋペプチドアプタマーの模倣物を含む請求項２０の方法。
【請求項２９】
前記化合物がＤｋｋ相互作用タンパク質ペプチドアプタマーを含む請求項２０の方法。
【請求項３０】
前記化合物がＤｋｋ相互作用タンパク質ペプチドアプタマーの模倣物を含む請求項２０の方法。
【請求項３１】
真核細胞がさらに、転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド配列、転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインをコードするヌクレオチド配列、およびレポーターエレメントをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択された少なくとも１つの内因性ヌクレオチド配列を含んでおり、前記内因性ヌクレオチド配列の少なくとも１つが突然変異もしくは欠失によって不活化されている請求項２０の方法。
【請求項３２】
前記ペプチド結合対がリガンドと前記リガンドが結合する受容体とを含む請求項２０の方法。
【請求項３３】
前記転写活性化タンパク質がＧａｌ４、Ｇｃｎ４、Ｈａｐ１、Ａｄｒ１、Ｓｗｉ５、Ｓｔｅ１２、Ｍｃｍ１、Ｙａｐ１、Ａｃｅ１、Ｐｐｒ１、Ａｒｇ８１、Ｌａｃ９、Ｑａ１Ｆ、ＶＰ１６、または哺乳動物核受容体である請求項２０の方法。
【請求項３４】
前記異種融合タンパク質の少なくとも１つが自己複製プラスミドから発現させられる請求項２０の方法。
【請求項３５】
前記ＤＮＡ結合ドメインが転写活性化タンパク質の異種ＤＮＡ結合ドメインである請求項２０の方法。
【請求項３６】
前記ＤＮＡ結合タンパク質が哺乳動物ステロイド受容体および細菌ＬｅｘＡタンパク質からなる群から選択される請求項３５の方法。
【請求項３７】
前記レポーターエレメントがｌａｃＺ、ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするポリヌクレオチド、およびクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される請求項２０の方法。
【請求項３８】
前記レポーターエレメントがｌａｃＺである請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記試験サンプルがＬＲＰ５ペプチドアプタマーを含む請求項２０の方法。
【請求項４０】
前記ペプチドアプタマーがＯＳＴ２６２（配列番号２０８）である請求項３９の方法。
【請求項４１】
前記試験サンプルがＬＲＰ５抗体を含む請求項２０の方法。
【請求項４２】
Ｄｋｋ−１が組織特異的な方法でノックアウトされているトランスジェニック動物。
【請求項４３】
前記組織特異性が骨組織、癌組織、または肝組織である請求項４２のトランスジェニック動物。
【請求項４４】
Ｄｋｋ活性を変調する潜在的化合物を同定するための方法であって、
ａ）化合物の存在下および不在下において、１つ以上のＤｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントと、Ｄｋｋまたはそのフラグメントとの結合に及ぼす影響を測定するステップと、
ｂ）１つ以上のＤｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントとＤｋｋまたはそのフラグメントとの間の結合を変調する化合物を、潜在的Ｄｋｋを変調する化合物であると同定するステップと
を含む方法。
【請求項４５】
ＤｋｋとＷｎｔシグナル伝達経路との相互作用を変調するＤｋｋ相互作用タンパク質を同定する方法であって、
（ａ）Ｄｋｋおよび潜在的Ｄｋｋ相互作用タンパク質ｍＲＮＡをアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）割球内へ注入するステップと、
（ｂ）体軸重複を評価する、またはマーカー遺伝子発現を解析するステップと、
（ｃ）体軸重複またはマーカー遺伝子発現における変化を引き出す組成物を、ＤｋｋとＷｎｔシグナル伝達経路との相互作用を変調するＤｋｋ相互作用タンパク質であると同定するステップと
を含む方法。
【請求項４６】
ＨＢＭ、ＬＲＰ５／６、いずれかのＷｎｔ、Ｗｎｔアンタゴニスト、Ｗｎｔ経路変調剤、またはこれらの組み合わせのｍＲＮＡが、アフリカツメガエル割球内に共注入される請求項４５の方法。
【請求項４７】
解析されるマーカー遺伝子がＳｉａｍｏｉｓ、Ｘｎｒ３、ｓｌｕｇ、Ｘｂｒａ、ＨＮＫ−１、ｅｎｄｏｄｅｒｍｉｎ、Ｘｌｈｂｏｘ８、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＸＬＲＰ６、ＥＦ−１またはＯＤＣである請求項４５の方法。
【請求項４８】
ＤｋｋとＷｎｔシグナル伝達経路との相互作用を変調するＤｋｋ相互作用タンパク質を同定するための方法であって、
（ａ）Ｄｋｋおよび潜在的Ｄｋｋ相互作用タンパク質を含有する構築物を用いて細胞をトランスフェクトするステップと、
（ｂ）Ｗｎｔ反応性プロモーターへ連結したレポーター遺伝子の発現における変化を評価するステップと、
（ｃ）Ｄｋｋ構築物単独を用いてトランスフェクトされた細胞と比較してレポーター遺伝子発現を変化させるいずれかのタンパク質をＤｋｋ相互作用タンパク質であると同定するステップと
を含む方法。
【請求項４９】
前記細胞が、ＨＯＢ−０３−ＣＥ６、ＨＥＫ２９３、またはＵ２ＯＳ細胞である請求項４８の方法。
【請求項５０】
前記Ｗｎｔ反応性プロモーターがＴＣＦまたはＬＥＦである請求項４８の方法。
【請求項５１】
前記細胞が、ＣＭＶ β−ガラクトシダーゼを用いて共トランスフェクトされる請求項４８の方法。
【請求項５２】
ＤｋｋとＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭとの相互作用を変調する化合物を同定するための方法であって、
（ａ）ＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭを固体表面へ固定化するステップと、
（ｂ）分泌Ｄｋｋタンパク質もしくは分泌エピトープタグＤｋｋおよび試験化合物を用いて固体表面を処理するステップと、
（ｃ）Ｄｋｋもしくはエピトープタグに対する抗体を使用して、またはエピトープタグの活性を直接に測定するステップによって、前記化合物がＤｋｋとＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭとの間の結合を変調するかどうかを決定するステップと
を含む方法。
【請求項５３】
エピトープタグが、アルカリホスファターゼ、ヒスチジンまたはＶ５タグである請求項５２の方法。
【請求項５４】
ＤｋｋとＷｎｔシグナル伝達経路との相互作用を変調する化合物を同定するための方法であって、
（ａ）ＤｋｋおよびＷｎｔタンパク質を含有する構築物を用いて細胞をトランスフェクトするステップと、
（ｂ）Ｗｎｔ反応性プロモーターへ連結したレポーターエレメントの発現における変化を評価するステップと、
（ｃ）Ｄｋｋ構築物単独を用いてトランスフェクトされた細胞と比較してレポーター遺伝子発現を変化させるいずれかの化合物をＤｋｋ／Ｗｎｔ相互作用を変調する化合物であると同定するステップと
を含む方法。
【請求項５５】
ＷＮｔ３ａおよびＷｎｔ１構築物が、前記細胞内へ共トランスフェクトされる請求項５４の方法。
【請求項５６】
前記細胞が、Ｕ２ＯＳ、ＨＯＢ−０３−ＣＥ６、またはＨＥＫ２９３細胞である請求項５４の方法。
【請求項５７】
使用されるレポーターエレメントが、ＴＣＦ−ルシフェラーゼ、ｔｋ−Ｒｅｎｉｌｌａ、またはその組み合わせである請求項５４の方法。
【請求項５８】
哺乳動物におけるＤｋｋ−媒介性活性を変調する化合物を試験する方法であって、
（ａ）（１）調節可能な１つ以上のＤｋｋ遺伝子、（２）Ｄｋｋ遺伝子のノックアウト、もしくは（３）１つ以上のＤｋｋ遺伝子のノックインを有する１群のトランスジェニック動物を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）におけるトランスジェニック動物群に対して各々第２群のコントロール動物を提供するステップと、
（ｃ）骨量または脂質濃度を変調する潜在的Ｄｋｋ変調化合物へトランスジェニック動物群および対照動物群を曝露させるステップと、
（ｄ）トランスジェニック動物群と対照動物群とを比較し、そして前記化合物が対照動物群に比してトランスジェニック動物における骨量または脂質濃度に及ぼす作用を決定するステップと
を含む方法。
【請求項５９】
ＤｋｋとＤｋｋ相互作用タンパク質との相互作用を変調する化合物または組成物をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）Ｄｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントを化合物へ曝露させるステップと、
（ｂ）前記化合物がＤｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントへ結合するかどうかを決定するステップと
を含む方法。
【請求項６０】
前記変調が、前記化合物が前記Ｄｋｋ相互作用タンパク質またはそのＤｋｋ結合フラグメントに結合するかどうかによって決定される請求項５９の方法。
【請求項６１】
ＤｋｋがＤｋｋ−１である請求項１、２、６、１５、１６、４４、４５、４８、５２、５４、５８、または５９のいずれかの方法。
【請求項６２】
Ｗｎｔが１つ以上のＷｎｔ１〜Ｗｎｔ１９である請求項４８又は５４の方法。
【請求項６３】
前記被検対象が、骨の発達障害、骨折、年齢関連性骨量減少、軟骨形成異常、薬物誘発性骨障害、骨の高度の代謝回転、高カルシウム血症、骨化過剰症、骨形成不全症、骨軟化症、骨髄炎、骨粗鬆症、ぺージェット病、変形性関節症、およびくる病からなる群から選択される骨量障害を有する請求項１の方法。
【請求項６４】
前記被検対象が脂質変調障害を有し、前記脂質変調障害が心臓状態、アテローム性動脈硬化症、家族性リポタンパク質リパーゼ欠損症、家族性アポタンパク質ＣＩＩ欠損症、家族性３型高リポタンパク血症、家族性高コレステロール血症、家族性高トリグリセリド血症、多種リポタンパク型高脂血症、透析および／または糖尿病を原因とする脂質濃度上昇、および病因不明の脂質濃度上昇からなる群から選択される請求項１の方法。

【図１】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図２Ｃ】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【公開番号】特開２００９−１４２２７４（Ｐ２００９−１４２２７４Ａ）
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３０２８４９（Ｐ２００８−３０２８４９）
【出願日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【分割の表示】特願２００２−５８８９３４（Ｐ２００２−５８８９３４）の分割
【原出願日】平成１４年５月１７日（２００２．５．１７）
【出願人】（５０１４１９７０５）オシエント　ファーマシューティカルズ　コーポレイション (2)
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【Ｆターム（参考）】