ＨＩＶ−１感染末梢血単核球の刺激培養によるＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養方法、及びＨＩＶ−１の増殖阻害剤
（課題） ＣＣＲ５をコレセプターとして利用するＲ５ ＨＩＶ−１、ＣＸＣＲ４を利用するＸ４ ＨＩＶ−１、及びＣＣＲ５とＣＸＣＲ４の両方利用できるＲ５／Ｘ４ ＨＩＶ−１に感染したＡＩＤＳ患者から採取した、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を安定して培養、及び増殖させる方法を提供する。 （解決手段） 下記式１の化合物、又はその塩を含む、ＨＩＶ−１増殖阻害剤、及び該阻害剤を用いて、ＨＩＶ−１感染末梢血単核球を培養することを特徴とする、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養方法。
Ｖ−ＣＲ１Ｒ２−Ａｒ−ＣＲ３Ｒ４−Ｎ（Ｒ５）−（ＣＲ６Ｒ７）ｘ−Ｒ８ （Ｉ） 該式中、Ｖは、アミン窒素２個〜６個を有する９員〜２４員の環状ポリアミン部分であって、該アミン窒素は少なくとも２個の炭素原子により、互いに間隔を置いて配置されており；Ｒ１〜Ｒ７は、それぞれ独立に、水素原子、若しくは直鎖、分枝又は環状のＣ１−６アルキルからなる群から選ばれた基であり；かつＲ８は、単環、又は多環式の複素環基、若しくは単環又は多環式である。
Ｖ−ＣＲ１Ｒ２−Ａｒ−ＣＲ３Ｒ４−Ｎ（Ｒ５）−（ＣＲ６Ｒ７）ｘ−Ｒ８ （Ｉ） 該式中、Ｖは、アミン窒素２個〜６個を有する９員〜２４員の環状ポリアミン部分であって、該アミン窒素は少なくとも２個の炭素原子により、互いに間隔を置いて配置されており；Ｒ１〜Ｒ７は、それぞれ独立に、水素原子、若しくは直鎖、分枝又は環状のＣ１−６アルキルからなる群から選ばれた基であり；かつＲ８は、単環、又は多環式の複素環基、若しくは単環又は多環式である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶ−１感染末梢血単核球の刺激培養によるＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養方法に関する。特に、本発明は、新規ケモカインレセプター阻害剤を用いたＲ５／Ｘ４ ＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣ刺激培養によるＣＤ４陽性Ｔ細胞の大量培養に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在，ＨＩＶ感染症・ＡＩＤＳ治療は、主に逆転写酵素阻害薬とプロテアーゼ阻害薬を用いた多剤併用療法（Ｈｉｇｈｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＨＡＡＲＴ）によって行われ、米国など先進国ではＡＩＤＳ患者の死亡率は顕著に減少している。しかしながら、ＨＡＡＲＴによって血中ＨＩＶ−ＲＮＡレベルが減少しても、免疫力の回復が不十分なため日和見感染症に罹ったり、薬剤の副作用によってＨＡＡＲＴを中断せざるを得ない患者も少なくない。
【０００３】
最近、このような患者の免疫力の回復を目的に、ＡＩＤＳ患者から採取したＴ細胞を、体外で刺激培養した後、該ＡＩＤＳ患者自身に戻す養子免疫療法（活性化自己リンパ球療法）が試みられている。例えば、ケモカインレセプター（ＣＣＲ５）をコレセプターとして利用するＲ５ ＨＩＶ−１に感染したＡＩＤＳ患者（ＣＤ４カウント数：３５０−５００／ｍｌ）の末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ：ＰＢＭＣ）をＣＤ４陽性Ｔ細胞を分画した後に、ＩＬ−２の存在下で抗ＣＤ３＋ＣＤ２８ビーズで共刺激培養することによりＣＤ４陽性Ｔ細胞の拡大培養を行い、得られたＣＤ４陽性Ｔ細胞を繰り返し体内に輸注することにより、血中ウイルス濃度に変化を与えないで患者体内におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞の増加とＣＤ４陽性ＣＣＲ５陽性Ｔ細胞の割合が減少することが報告されている（非特許文献１）。この研究は、それ以前に報告されていた、インビトロでＣＤ４陽性Ｔ細胞を抗ＣＤ３＋ＣＤ２８抗体で共刺激培養することによる、ｂ−ケモカインの分泌レベルの上昇とＣＣＲ５発現量の低下を、現実にＡＩＤＳ患者体内で再現できることを示したものである（非特許文献２、３及び４）
しかしながら、感染したＨＩＶ−１のタイプによっては、ＡＩＤＳ患者から採取したＣＤ４陽性Ｔ細胞を増殖させることができないという問題がある。すなわち、ＨＩＶ−１には、ＣＣＲ５をコレセプターとして利用するＲ５ ＨＩＶ−１以外に、ＣＸＣＲ４を利用するＸ４ ＨＩＶ−１、及びＣＣＲ５とＣＸＣＲ４の両方利用できるＲ５／Ｘ４ ＨＩＶ−１があり、該Ｘ４ ＨＩＶ−１及びＲ５／Ｘ４ ＨＩＶ−１は、Ｒ５ ＨＩＶ−１よりも、ＡＩＤＳ発症に伴うＣＤ４陽性Ｔ細胞に強力に働き、ＡＩＤＳ患者から採取したＴ細胞を培養過程で殺してしまうという問題である。例えば、抗ＣＤ３＋ＣＤ２８ビーズで共刺激培養してもＸ４ ＨＩＶ−１の増殖には無効であることが報告されている（非特許文献６）。また、日本においても末期ＡＩＤＳ患者のＰＢＭＣをＩＬ−２存在下で固相化抗ＣＤ３抗体で刺激培養を行うことによって、ウイルス増殖を抑制した状態でＴ細胞の拡大培養に成功したという報告はあるが（非特許文献６）、前記Ｘ４ ＨＩＶ−１及びＲ５／Ｘ４ ＨＩＶ−１に感染したＡＩＤＳ患者のＣＤ４陽性Ｔ細胞を安定して培養する方法は知られていない。
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，８，４７−５３，２００２
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２，１９３９−１９４３，１９９６
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６，２７３−２７６，１９９７
【非特許文献４】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８，５５４５−５５５３，１９９７
【非特許文献５】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６，２７３−２７６，１９９７
【非特許文献６】ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１６，６１１−６１２，２０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＣＣＲ５をコレセプターとして利用するＲ５ ＨＩＶ−１のみならず、ＣＸＣＲ４を利用するＸ４ ＨＩＶ−１、及びＣＣＲ５とＣＸＣＲ４の両方利用できるＲ５／Ｘ４ ＨＩＶ−１に感染したＡＩＤＳ患者から採取した、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を安定して培養、及び増殖させる方法、及び該培養に使用するＨＩＶ−１増殖抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記課題を解決するために研究を行った結果、本発明者らはＳＤＦ−１α、及びＭＩＰ−１α結合阻害効果を有する特定の芳香族アミン化合物が、刺激・活性化ＰＢＭＣにおけるＲ５、Ｘ４、又はＲ５／Ｘ４のトロピズムを有するＨＩＶ−１の増殖や、感染細胞と非感染細胞間のＨＩＶ−１ Ｅｎｖによる細胞融合を抑制することを見出した。そして、本発明者らは、Ｒ５、Ｘ４、及びＲ５／Ｘ４ ＨＩＶ−１に感染したＰＢＭＣの刺激培養において、該芳香族アミン化合物がこれらＨＩＶ−１ウイルス増殖を抑制しＣＤ４陽性Ｔ細胞の大量培養を可能にするという知見を得て、本発明を完成したのである。
【０００６】
したがって、本発明は、下記式Ｉの化合物、又はその塩を含む、ＨＩＶ−１増殖阻害剤を提供する。
Ｖ−ＣＲ１Ｒ２−Ａｒ−ＣＲ３Ｒ４−Ｎ（Ｒ５）−（ＣＲ６Ｒ７）ｘ−Ｒ８ （Ｉ）
該式中、Ｖは、アミン窒素２個〜６個を有する９員〜２４員の環状ポリアミン部分であって、該アミン窒素は少なくとも２個の炭素原子により、互いに間隔を置いて配置されており；
Ｒ１〜Ｒ７は、それぞれ独立に、水素原子、若しくは直鎖、分枝又は環状のＣ１−６アルキルからなる群から選ばれた基であり；
Ｒ８は、単環、又は多環式の複素環基、若しくは単環又は多環式であり、かつ置換又は非置換の芳香族又はヘテロ芳香族基であり；
Ａｒは、芳香環又はヘテロ芳香環であって、各々は、少なくとも１の位置で、電子供与基又は電子吸引基で置換されていてもよく；かつｘは、０から２の整数である。
【０００７】
また、式１において、Ｖが、１４員〜２０員であり４個の窒素原子を含む、特にＶが、１，４，８，１１−テトラアザシクロデカンであるのが好ましい。
また、式１において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、水素原子であり、かつＲ５が、水素原子又はＣＨ３基であるのが好ましい。
また、式１において、Ａｒが、１，３、又は１，４非置換フェニレンである、特にＡｒが、１，３、又は１，４非置換フェニレンであるのが好ましい。
また、式１において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、水素原子であり、Ｒ５が水素原子又はＣＨ３基であり、かつｘが０であるのが好ましい。
また、式１において、特に、Ｖが１４員〜２０員であり４個の窒素原子を含む、又はＶが１，４，８，１１−テトラアザシクロデカンである場合、Ｒ８が、下記（１）〜（５）のいずれか１の基であるのが好ましい。
【０００８】
【化６】
【０００９】
さらに、前記Ｖに加え、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、水素原子であり、かつＲ５が、水素原子又はＣＨ３基である場合に、特に、Ｒ８が下記（１）〜（５）のいずれか１の基であるのが好ましい。
【００１０】
【化７】
【００１１】
さらに、本発明は、前記式１の化合物が、下記式２を有する化合物である前記ＨＩＶ−１増殖阻害剤が好ましい。
【００１２】
【化８】
【００１３】
該式中、Ａは、下記（１）〜（５）のいずれか１の基を表す。
【００１４】
【化９】
【００１５】
また、本発明は、前記ＨＩＶ−１増殖阻害剤、及び増殖刺激剤を含む培地でＨＩＶ−１感染末梢血単核球を培養することを特徴とする、ＨＩＶ−１感染末梢血単核球に含まれるＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養方法を提供する。特に、該末梢血単核球のＨＩＶ−１感染が、Ｒ５ ＨＩＶ−１、Ｘ４ ＨＩＶ−１、及びＲ５／Ｘ４ ＨＩＶ−１からなる群から選ばれるサブタイプＨＩＶ−１によるものである、前記培養方法を提供する。
【００１６】
さらに本発明では、前記ＨＩＶ−１増殖阻害剤を含む、ＨＩＶ−１感染末梢血単核球に含まれるＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養キットを提供する。
さらに本発明では、前記培養方法で得られた活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞を、採取した患者に戻すことを含む、ＨＩＶ−１感染症の治療方法を提供する。
さらに本発明は、ＨＩＶ−１感染症治療医薬組成物を製造するために、前記培養方法で得られた活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞を使用することを含むものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のＨＩＶ−１増殖抑制剤により、ＡＩＤＳ患者から採取した活性化ＰＢＭＣにおいて、Ｒ５、Ｘ４、又はＲ５／Ｘ４のトロピズムを有するすべてのＨＩＶ−１増殖が抑制された。また、本発明の該ＨＩＶ−１増殖抑制剤を用いた培養方法により、ＡＩＤＳ患者から採取したＣＤ４陽性Ｔ細胞の大量培養ができるようになり、Ｒ５、Ｘ４、又はＲ５／Ｘ４ ＨＩＶ−１に感染したＡＩＤＳ患者に対する養子免疫療法が可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明のＨＩＶ−１増殖阻害剤に用いる下記式２の化合物、又はその塩は、２００２年７月９日付けで出願された、本件出願人の特願２００２−１９９９３９号（２００２年７月９日）に記載されている新規な芳香族アミン化合物である：
【００１９】
【化１０】
【００２０】
式中、Ａは、下記（１）〜（５）のいずれか１の基を表す；
【００２１】
【化１１】
【００２２】
本発明で特に好ましい化合物は、下記式（３）の化合物、又はその塩である：
【００２３】
【化１２】
【００２４】
次に該芳香族アミン化合物の具体的な名称を記す。
化合物１：Ｒが（１）の基である式１の化合物
Ｎ−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカニル−１，４−フェニレンビス（メチレン））−（２−ピペリジン−１−イル）アニリン
化合物２：Ｒが（２）の基である式１の化合物
Ｎ−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカニル−１，４−フェニレンビス（メチレン））−８−アミノキノリン
化合物３：Ｒが（３）の基である式１の化合物
Ｎ−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカニル−１，４−フェニレンビス（メチレン））−１−アミノナフタレン
化合物４：Ｒが（４）の基である式１の化合物
Ｎ−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカニル−１，４−フェニレンビス（メチレン））−１−アミノ−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン
化合物５：Ｒが（５）の基である式１の化合物
Ｎ−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカニル−１，４−フェニレンビス（メチレン））−３−アミノ−ビフェニル
本発明では化合物１〜５をＨＩＶ−１増殖阻害剤として用いることができるが、特に化合物２が好ましい。またこれらの化合物は単独で、又は組み合わせて使用することができる。本発明者らは化合物２に実験管理番号としてＴ−１１１３を付している。なお、これら化合物１〜５の具体的な製造方法を、実施例に続く製造例１〜５に記載した。
【００２５】
また、本発明の化合物１〜５は塩の形態でＨＩＶ−１増殖阻害剤として用いることができる。該塩は、培養したＣＤ４陽性Ｔ細胞を元の患者のＰＢＭＣに戻す際、その患者に対し無害であるならば特に制限はない。特に、本発明の化合物１〜５を医薬として許容し得る塩の形態で用いるのが好ましく、該塩は、有機酸又は無機酸の付加塩類とすることができる。
【００２６】
該無機酸付加塩には、例えば、フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素塩、硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸第一水素塩、リン酸第二水素塩、酢酸塩などがある。なお、塩基化合物、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウムなどを用いて塩形成をすることもできる。これらの塩のうち、例えば、塩酸塩、硝酸塩、リン酸第一水素塩、又はリン酸第二水素塩などが好ましい。
【００２７】
また、有機酸付加塩は、脂肪酸のモノカルボン酸、ジカルボン酸、ヒドロキシアルカン酸、ヒドロキシアルカン二酸、アミノ酸など、又は芳香族の酸、脂肪酸、芳香族のスルホン酸などの無毒な有機酸から誘導される塩、例えば、スルホン酸、メタンスルホン酸、スルファミン酸、酒石酸、フマル酸、臭化水素酸、グリコール酸、クエン酸、マレイン酸、リン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、アスコルビ酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタリンスルホン酸、プロピオン酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、ステアリン酸、ケイ皮酸、アスパラギン酸、サリチル酸、グルコン酸などがある。
【００２８】
このような酸付加塩は、通常、分散性、吸収性などが良く、ＰＢＭＣを培養する際、有利な特性を有する。該酸付加塩類は、本発明の技術分野で周知であり、適当な酸、又は塩基化合物との接触により常法で容易に調製することができる。
また、本発明のＨＩＶ−１増殖阻害剤は、Ｔ細胞培養に好ましい特性を付与し、また、取り扱いなどを容易にするため適当な製剤用成分などを加えることができる。例えば、汎用されている担体などの製剤用成分である、増量剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、分散剤、安定化剤、界面活性剤、吸収促進剤などを用いることができる。また、必要に応じて着色剤、保存剤などの添加剤を用いてもよい。
【００２９】
本発明の培養方法は、前記ＨＩＶ−１増殖阻害剤、及び増殖刺激剤を含む培地でＨＩＶ−１感染末梢血単核球を培養することを特徴とする、ＨＩＶ−１感染末梢血単核球に含まれるＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養方法である。
本発明では、患者から採取したＨＩＶ−１感染末梢血単核球を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞の免疫的活性化、及び増殖を行う。ここで培養するのは、主としてＴ細胞、マクロファージ及びＢ細胞などを含む末梢血単核球である。本明細書における末梢血単核球という用語は、本来の末梢血単核球のみならず、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を含む、上皮性リンパ球、腫瘍内浸潤リンパ球、癌性腹水胸水浸潤リンパ球などを含む概念である。なお、採血直後の新鮮末梢単核球を用いるのが、採血患者への身体的負担、リンパ球分離の簡便さ、分離後リンパ球の生存率の良さという点で好ましい。
【００３０】
なお、本発明の方法では、前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞の免疫学的活性化、及び増殖を行う際の採血の量、培養開始時のリンパ球の数は、特に、制限されないが、患者への負担、リンパ球分離などの処理の容易さなどを考慮し、まず、患者から約５〜５０ｍｌの少量の新鮮末梢血を採取し、そこから分離した末梢血単核球約１〜１００×１０６個を用いて開始することが好ましい。
【００３１】
また、本発明においては、培養開始時の細胞密度は１×１０５〜１×１０６個／ｍｌとするのが好ましい。そして、培養に伴い細胞数が増加した場合、必要に応じて適当な細胞密度となるよう継代培養することにより所望の量の活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞を得ることができる。また、なお、培養に伴い細胞数が増加した場合、細胞培養用のプラスチック製フラスコ、ＣＯ２ガス透過性のガス・パーミアブル・バッグなどを使用することができる。この段階ではリンパ球がＣＤ４陽性Ｔ細胞に大量に増殖してくるため、２〜４日毎に培養器の数を増やすことが好ましい。
【００３２】
また、本発明の方法では、該末梢血単核球のＨＩＶ−１感染が、Ｒ５ ＨＩＶ−１、Ｘ４ ＨＩＶ−１、及びＲ５／Ｘ４ ＨＩＶ−１からなる群から選ばれるサブタイプＨＩＶ−１によるものである場合、特に有効である。本発明のＨＩＶ−１増殖阻害剤が、末梢血単核球の培養時に、特にこれらのサブタイプウイルスの増殖を抑制するからである。
【００３３】
本発明では、血清等の生物由来の培養液、平衡塩類溶液にアミノ酸、ビタミン、核酸塩基などを加えた合成培地を用いることができる。例を挙げると、ＲＰＭＩ−１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭなどがあり、特にＲＰＭＩ−１６４０が好ましい。さらに必要に応じて、前記培地に、ウシ胎児血清、ウシ血清アルブミン、ヒト血清などを加える。特に培養液に正常ヒト血清を添加すると優れた増殖効果を得られることが多い。
【００３４】
また、前記増殖刺激剤の例を挙げると、抗ＣＤ３抗体、インターフェロン、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）などのサイトカイン類、ＰＳＫ、ＯＫ−４３２、レンチナンなどの免疫賦活物質がある。これらを単独で、又は組み合わせて使用することができる。本発明では、例えば、抗ＣＤ３抗体とインターロイキン２とを組み合わせて用いるのが好ましい。
【００３５】
なお、本発明で用いる増殖刺激剤としては、特に抗ＣＤ３抗体が好ましい。これは、ＣＤ３分子に対する特異的抗体である抗ＣＤ３抗体が、Ｔ細胞表面に存在するＣＤ３分子を刺激し、Ｔ細胞増殖を開始させるからである。該抗ＣＤ３抗体は、動物又は細胞に免疫して産生させることもできるが、安定性、コスト、品質等に優れた市販のＯＫＴ−３抗体（製造元：オーソファーマスーティカル）も入手することができる。なお、該増殖刺激剤の使用量は、その効果を得られる範囲であれば特に限定されないが、例えば、ＩＬ−２で５〜２０ユニット（Ｕ）／ｍｌ、好ましくは１５〜２０Ｕ／ｍｌ、抗ＣＤ３抗体で５〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは４０〜６０μｇ／ｍｌである。
【００３６】
該抗ＣＤ３抗体は不溶性担体の表面へ固定化して用いることが好ましい。固定化は、抗ＣＤ３抗体１〜５０μｇ／ｍｌを含むリン酸緩衝食塩水溶液（ＰＢＳ）等の希釈液中に不溶性担体を一定時間一定温度で静置することにより行うことができる。固定化の際の反応温度は、通常４〜４０℃とするのが好ましく、固定化時間は、３０分から２４時間とするのが好ましい。
【００３７】
本発明の培養で用いるＨＩＶ−１増殖阻害剤は、前記化合物１〜５、又はこれらの塩を含み、特に化合物２又はその塩を含むものが好ましい。また、該ＨＩＶ−１増殖阻害剤は、これらの化合物を単独で又は組み合わせで含んでいてもよい。なお、本発明の培地中の該化合物濃度は、適度な末梢血単核球の培養、及び増殖が得られれば特に制限されるものではないが、通常１０ｎＭｏｌ／ｌ〜１ｍＭｏｌ／ｌ、好ましくは１００ｎＭｏｌ／ｌ〜５００μＭｏｌ／ｌ、特に好ましくは１μＭｏｌ／ｌ〜１００μＭｏｌ／ｌである。
【００３８】
本発明の培養は、前記培地を用いて一般的な細胞培養の方法に従って行うことができる。例えば、湿潤環境を維持したＣＯ２インキュベータ内で行うことができる。該ＣＯ２濃度は１〜１０％、特に５％が好ましく、培養温度は３０〜４０℃、特に３７℃が好ましい。該培養の日数に特に制限はないが、抗ＣＤ３抗体などの増殖刺激剤の情報が細胞に伝達されることが前提となるため、通常２〜２０日、特に３〜７日行うことが好ましい。この培養の期間中は、顕微鏡下で細胞の状態を観察し、適宜細胞数を計測しながら、培養液を適宜追加、又は交換するのが好ましい。前記培養により必要量の末梢血単核球が得られたら、これらを遠心分離などの常法で回収し、また必要に応じて一部を継続培養する。
【００３９】
本発明の培養方法により得られた末梢血単核球、又は分離されたＣＤ４陽性Ｔ細胞を、該末梢血単核球を採取したＨＩＶ−１感染患者に投与し、その免疫力を強化することができる。それによりＨＩＶ−１の増殖を抑えＡＩＤＳの症状改善し及び進行を抑えるだけでなく、ＡＩＤＳに伴う、カポジ肉腫、日和見感染などを改善することができる。また、これにより多剤併用療法の効果を高めることができる。
【００４０】
なお、該培養末梢血単核球、又は分離ＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いて、ＡＩＤＳ患者に対する養子免疫療法を行う場合、免疫治療剤としての該Ｔ細胞の投与量は、１回当りの細胞数を１０６〜１０１２個とするのが好ましい。該投与形態としては、注射剤、点滴剤などの液体、特に該Ｔ細胞をヒト血清アルブミン０．０１〜５％を含む生理食塩液に分散した注射剤又は点滴剤が好ましい。その投与方法としては、静脈への点滴、静脈、動脈、局所などへの注射があるが、特に静脈への点滴が好ましい。また投与する液量は、投与方法、投与する場所などにより異なるが、５０〜５００ｍｌとするのが好ましく、この液量に前記Ｔ細胞１０６〜１０１２個が含まれるようにする。この投与頻度は、１回／日〜１回／月とするのが好ましく、投与回数は、少なくとも１回、好ましくは５回以上である。
【実施例】
【００４１】
（実施例１）
ＡＩＤＳ患者から採取したＰＢＭＣの刺激・拡大培養モデル系として下記の実験を行った。
まず、ＨＩＶ血清的陰性健常者から採取した新鮮なＰＢＭＣ １×１０６／ｍｌを懸濁したＲＰＭＩ−１６４０培地を、固定化抗ＣＤ３抗体で被覆した１２ウエルプレート（３ｍｌ／ウエル）に撒き、湿潤な５％ＣＯ２環境下３７℃で刺激培養した。この培養に用いたＲＰＭＩ培地は、牛胎児血清（ＦＢＳ）１０％、ヒト組み換えＩＬ−２（塩野義製薬株式会社）５０Ｕ／ｍｌ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、及びストレプトマイシン１００μｇ／Ｕ／ｍｌを含む、ＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ社，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ：以下、ＲＰＭＩ−１６４０培地という）である。
【００４２】
次いで、培養開始から３日経過後、該ＰＢＭＣを、感染多重度（ＭＯＩ）０．００１のウイルス懸濁液にさらした。用いたウイルスは、リン酸カルシウム法によりＨＩＶ−１分子クローンプラスミドでトランスフェクションした２９３Ｔ細胞を用いて調製したＨＩＶ−１ ＮＬ４−３（１）及びＨＩＶ−１ ＪＲ−ＣＳＦ（２）ウイルスストックから得たものである。なお、固定された抗ＣＤ３抗体で活性化されたＰＢＭＣ培養物を用いた終末点アッセイにより、前記ウイルスの５０％組織培養感染投与量を決定した。
【００４３】
該ウイルス感染処理を行った後、３７℃で３時間、吸収させ、該細胞を無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄し、１０μＭ Ｔ−１１１３（化合物２）を含む、及び含まないＲＰＭＩ−１６４０培地に、前記ＰＢＭＣの初発細胞濃度が５×１０５／ｍｌとなるよう再懸濁し、６ウエルプレート（５ｍｌ／ウエル）に撒き、湿潤な５％ＣＯ２環境下３７℃で３日間培養した。
【００４４】
さらに３日毎に２回、前記手順で細胞を処理した。生存細胞数をエオシンＹ色素（Ｅｏｓｉｎ Ｙ ｄｙｅ）を用いた色素排除法により求めた。また、ＨＩＶ−１の感染を調べるため、培養上清中のＨＩＶ−１ｐ２４抗原の濃度を市販のＨＩＶ−１ｐ２４ ＥＬＩＳＡキット（Ｚｅｐｔｏ Ｍｅｔｒｉｘ社、米国、ニューヨーク）を用いて定量し、残りの細胞を同じ条件で培養した（初発細胞濃度：２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。
【００４５】
実験の結果、図１に示すようにＸ４ ＨＩＶ−１であるＮＬ４−３ウイルス株、及びＲ５ ＨＩＶ−１であるＪＲ−ＣＳＦ株に感染した９日後では、Ｔ−１１１３を含まない培地における生存Ｔ細胞数は、Ｔ−１１１３存在下の生存Ｔ細胞数の５０％以下になった。また、該生存Ｔ細胞中のＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞率を検討すると、図２（２）及び（４）に示すように、ＮＬ４−３株、及びＪＲ−ＣＳＦ株に感染した９日後では、Ｔ−１１１３を含まない培地におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞率は著しく低い。これに対し、図２（５）及び（６）に示すように、ＮＬ４−３株、及びＪＲ−ＣＳＦ株に感染した９日後でも、Ｔ−１１１３を含む培地ではＣＤ４陽性Ｔ細胞率は、図２（１）及び（２）のＨＩＶ−１感染を伴わないコントロールとほとんど差が見られない。したがって、本実験によりＴ−１１１３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＨＩＶ−１感染患者のＰＢＭＣの刺激培養の際に、Ｒ５及びＸ４両タイプのＨＩＶ−１ウイルスの増殖を強く抑制していることが判る。
【００４６】
次に、本発明で、ＨＩＶ−１増殖阻害剤に用いる化合物の製造方法を具体的に説明する。
（製造例１）
化合物１：Ｎ−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカニル−１，４−フェニレンビス（メチレン））−（２−ピペリジン−１−イル）アニリンの合成
製造例１−１：
中間体１：４，８，１１−トリス（ジエトキシホスホリル）−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカンの合成
１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン５．２０ｇ（２６．０ｍｍｏｌ）をクロロホルム３１２ｍｌに溶解し、氷冷、攪拌しながらトリエチルアミン５．７８ｇ（７．９６ｍｌ，５７．１ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、該反応系に、クロロリン酸ジエチル９．４１ｇ（７．８４ｍｌ，５４．５ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１５６ｍｌ）で希釈した溶液を９０分間かけて滴下した。さらに室温で２１時間攪拌した後、該反応液に飽和重曹水を加えクロロホルムを用いて分液抽出した。該有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（３５０ｇ、クロロホルム：メタノール＝１５：１）により精製することにより、無色シロップ状で標記化合物４．７９ｇ（収率３０．３％）が得られた。分析値は次のとおりであった。
【００４７】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００Ｍｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１．２７−１．３３（ｍ，１８Ｈ），１．７４（ｍ，２Ｈ），１．８８（ｍ，２Ｈ），２．７２（ｍ，２Ｈ），２．８０（ｍ，２Ｈ），３．００−３．２６（ｍ，１２Ｈ），３．９０−４．１０（ｍ，１２Ｈ）
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２２Ｈ５１Ｎ４Ｏ９Ｐ３ ６０８．５８，ｆｏｕｎｄ ６０９（ＭＨ＋）
製造例１−２：
中間体２：１−（１−メチレン−４−（ブロモメチレン）フェニレン）−４，８，１１−トリス（ジエトキシホスホリル）−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカンの合成
製造例１−１で得られた中間体１ １．２２ｇ（２．００ｍｍｏｌ）をアセトニトリル３０．５ｍｌに溶かし、炭酸カリウム０．３６０ｇ（２．６０ｍｍｏｌ）、ｐ−キシリレンジブロミド２．６５ｇ（１０．０ｍｍｏｌ）を加え、７０℃で１時間攪拌した。ＴＬＣを用いて反応終了を確認した後、該反応液に飽和食塩水を加え、クロロホルムで分液抽出を行った。該有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（フラッシュ６００ｇ、クロロホルム：メタノール＝３０：１）により精製することにより、無色シロップ状で標記化合物０．８９７ｇ（収率５６．４％）が得られた。分析値は次のとおりであった。
【００４８】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００Ｍｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１．２３−１．３６（ｍ，１８Ｈ），１．６６−１．７４（ｍ，２Ｈ），１．８２−１．９１（ｍ，２Ｈ），２．３０−２．３５（ｍ，２Ｈ），２．５８−２．６３（ｍ，２Ｈ），２．９９−３．１６（ｍ，１２Ｈ），３．４９（ｓ，２Ｈ），３．９５−４．０７，（ｍ，１２Ｈ），４．４９（ｓ，２Ｈ），７．２４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ５８ＢｒＮ４Ｏ９Ｐ，３７９１．６３，ｆｏｕｎｄ ７９２（ＭＨ＋）
製造例１−３：
化合物１：Ｎ−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカニル−１，４−フェニレンビス（メチレン））−（２−ピペリジン−１−イル）アニリンの合成
２−（ピペリジン−１−イル）アニリン８９７ｍｇ（５．０９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（８．０６ｍｌ）に溶かし、炭酸カリウム２１１ｍｇ（１．５３ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で撹拌した。該反応液中に製造例１−２で得た中間体２ ８０６ｍｇ（１．０２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル１６．１ｍｌに溶かした溶液をゆっくり滴下し、さらに同温度で時間撹拌した。ＴＬＣを用いて反応終了を確認後、該反応液に水を加え、クロロホルムにより分液抽出した。該有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（１００ｇ、クロロホルム：メタノール＝３０：１）により精製し、淡黄色シロップ状で化合物１ ６７８ｍｇを得た。該化合物１ ４２．９ｍｇを再び酢酸０．８５８ｍｌに溶かし、４Ｍ塩酸／ジオキサン溶液１．２９ｍｌを加え室温で１５時間撹拌した。該反応液にジエチルエーテルを加え、析出固体を遠沈させ、酢酸で洗浄し、さらにジエチルエーテルで洗浄した後、真空乾燥させ、標記化合物１の塩酸塩２５．２ｍｇ（収率５６％）を白色固体として得た。分析値は次のとおりであった。
【００４９】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ；２．７２−２．１８（１０Ｈ，ｍ），２．７９−３．４０（１８Ｈ，ｍ），３．４９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），３．８２−４．０２（２Ｈ，ｍ），４．５３（２Ｈ，ｓ），７．００−７．０８（２Ｈ，ｍ），７．３４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．３１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），７．４８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２９Ｈ４６Ｎ６ ４７８．７２，ｆｏｕｎｄ ４７９（ＭＨ＋）
（製造例２）
化合物２：Ｎ−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカニル−１，４−フェニレンビス（メチレン））−８−アミノキノリンの合成
製造例１−２で得た中間体２ １００ｍｇ（０．１２６ｍｍｏｌ）を出発物質とし、２−（ピペリジン−１−イル）アニリンに代わって、８−アミノキノリン９１．１ｍｇ（０．６３２ｍｍｏｌ）を用いて、製造例１−３とほぼ同様の方法で反応を行った。その結果、橙色固体状の標記化合物２の塩酸塩６０．１ｍｇ（収率７１％）を得ることができた。分析値は次のとおりであった。
【００５０】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ；２．００−２．１８（４Ｈ，ｍ），２．６２−３．３３（１６Ｈ，ｍ），３．７５（２Ｈ，ｓ），４．７２（２Ｈ，ｓ），７．２５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．７，６．８Ｈｚ），７．２８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．５４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．５８−７．６３（２Ｈ，ｍ），７．８３−７．９１（１Ｈ，ｍ），８．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），８．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．５，４．９Ｈｚ）
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２７Ｈ３８Ｎ６ ４４６．６３，ｆｏｕｎｄ ４４７（ＭＨ＋）
（製造例３）
化合物３：Ｎ−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカニル−１，４−フェニレンビス（メチレン））−１−アミノナフタレンの合成
製造例１−２で得た中間体２ １００ｍｇ（０．１２６ｍｍｏｌ）を出発物質とし、２−（ピペリジン−１−イル）アニリンに代わって１−ナフチルアミン９０．４ｍｇ（０．６３２ｍｍｏｌ）を用いて、製造例１−３とほぼ同様の方法で反応を行った。その結果、白緑色固体状の標記化合物３の塩酸塩２０．０ｍｇ（収率２６％）を得ることができた。分析値は次のとおりであった。
【００５１】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ；１．４９（２Ｈ，ｂｒｓ），２．０１（２Ｈ，ｂｒｓ），２．６４−２．７４（１６Ｈ，ｍ），２．８９（２Ｈ，ｂｒｓ），３．０４−３．０６（２Ｈ，ｍ），３．１６（２Ｈ，ｂｒｓ），４．８２（２Ｈ，ｓ），７．２０−７．２２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．３６−７．４０（１Ｈ，ｍ），７．４４−７．４５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．５０−７．６１（４Ｈ，ｍ），７．９１−７．９３（１Ｈ，ｍ），８．０１−８．０４（１Ｈ，ｍ）
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２８Ｈ３９Ｎ５ ４４５．６４，ｆｏｕｎｄ ４４６（ＭＨ＋）
（製造例４）
化合物４：Ｎ−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカニル−１，４−フェニレンビス（メチレン））−１−アミノ−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレンの合成
製造例１−２で得た中間体２ １００ｍｇ（０．１２６ｍｍｏｌ）を出発物質とし、２−（ピペリジン−１−イル）アニリンに代わって５，６，７，８−テトラヒドロ−１−ナフチルアミン８７．７μｌ（０．６３２ｍｍｏｌ）を用いて、製造例１−３とほぼ同様の方法で反応を行った。その結果、薄白褐色固体状の標記化合物４の塩酸塩３０．９ｍｇ（収率４０％）を得ることができた。分析値は次のとおりであった。
【００５２】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ；１．６４−１．６６（４Ｈ，ｍ），１．９２（２Ｈ，ｂｒｓ），２．０７−２．０１（４Ｈ，ｍ），２．４１−２．４２（２Ｈ，ｍ），２．７４−２．８４（２Ｈ，ｍ），３．０２−３．０３（１２Ｈ，ｍ），３．８９（２Ｈ，ｂｒｓ），４．６２（２Ｈ，ｓ），７．００−７．０２（１Ｈ，ｍ），７．１９−７．２２（２Ｈ，ｍ），７．２４−７．３０（４Ｈ，ｍ）
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２８Ｈ４３Ｎ５ ４４９．６７，ｆｏｕｎｄ ４５０（ＭＨ＋）
（製造例５）
化合物５：Ｎ−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカニル−１，４−フェニレンビス（メチレン））−３−アミノ−ビフェニルの合成
製造例１−２で得た中間体２ １００ｍｇ（０．１２６ｍｍｏｌ）を出発物質とし、２−（ピペリジン−１−イル）アニリンに代わって、３−アミノ−ビフェニル１０６．９ｍｇ（０．６３２ｍｍｏｌ）を用いて、製造例１−３とほぼ同様の方法で反応を行った。その結果、白色固体状の標記化合物５の塩酸塩３０．９ｍｇ（収率４２％）を得ることができた。分析値は次のとおりであった。
【００５３】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ；１．７６（２Ｈ，ｂｒｓ），１．８９−１．９７（２Ｈ，ｂｒｓ），２．０８（４Ｈ，ｓ），２．４９−２．５０（４Ｈ，ｍ），２．８５−２．９４（８Ｈ，ｍ），３．１３−３．１８（４Ｈ，ｍ），３．７５−３．７６（２Ｈ，ｍ），７．１０−７．１１（１Ｈ，ｍ），７．２２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．３１−７．３３（３Ｈ，ｍ），７．４３−７．４６（３Ｈ，ｍ），７．４９−７．５９（３Ｈ，ｍ），７．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ４１Ｎ５ ４７１．６８，ｆｏｕｎｄ ４７２（ＭＨ＋）
（参考文献）
（１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，５９，２８４−２９１，１９８６
（２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３６，８１９−８２２，１９８７
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、ＩＬ−２及び抗ＣＤ３抗体で刺激培養を行ったＨＩＶ−１感染及び非感染Ｔ細胞の増殖に及ぼすＴ−１１１３の影響を示すグラフである。
【図２】図２は、ＩＬ−２で刺激培養を行ったＨＩＶ−１感染及び非感染Ｔ細胞におけるＣＤ４及びＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合と、Ｔ−１１１３の影響を示す分布図である。図２において、（１）はコントロールを、（２）は正常Ｔ細胞を含む培地にＴ−１１１３を加えた場合、（３）はＮＬ４−３ ＨＩＶ−１に感染した細胞を培養した場合、（４）はＪＲ−ＣＳＦ ＨＩＶ−１に感染した細胞を培養した場合、（５）はＮＬ４−３ ＨＩＶ−１に感染した細胞を含む培地にＴ−１１１３（１０ｕｍ）を加えて培養した場合、及び（６）はＪＲ−ＣＳＦ ＨＩＶ−１に感染した細胞を含む培地にＴ−１１１３（１０ｕｍ）を加えて培養した場合のデータを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶ−１感染末梢血単核球の刺激培養によるＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養方法に関する。特に、本発明は、新規ケモカインレセプター阻害剤を用いたＲ５／Ｘ４ ＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣ刺激培養によるＣＤ４陽性Ｔ細胞の大量培養に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在，ＨＩＶ感染症・ＡＩＤＳ治療は、主に逆転写酵素阻害薬とプロテアーゼ阻害薬を用いた多剤併用療法（Ｈｉｇｈｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＨＡＡＲＴ）によって行われ、米国など先進国ではＡＩＤＳ患者の死亡率は顕著に減少している。しかしながら、ＨＡＡＲＴによって血中ＨＩＶ−ＲＮＡレベルが減少しても、免疫力の回復が不十分なため日和見感染症に罹ったり、薬剤の副作用によってＨＡＡＲＴを中断せざるを得ない患者も少なくない。
【０００３】
最近、このような患者の免疫力の回復を目的に、ＡＩＤＳ患者から採取したＴ細胞を、体外で刺激培養した後、該ＡＩＤＳ患者自身に戻す養子免疫療法（活性化自己リンパ球療法）が試みられている。例えば、ケモカインレセプター（ＣＣＲ５）をコレセプターとして利用するＲ５ ＨＩＶ−１に感染したＡＩＤＳ患者（ＣＤ４カウント数：３５０−５００／ｍｌ）の末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ：ＰＢＭＣ）をＣＤ４陽性Ｔ細胞を分画した後に、ＩＬ−２の存在下で抗ＣＤ３＋ＣＤ２８ビーズで共刺激培養することによりＣＤ４陽性Ｔ細胞の拡大培養を行い、得られたＣＤ４陽性Ｔ細胞を繰り返し体内に輸注することにより、血中ウイルス濃度に変化を与えないで患者体内におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞の増加とＣＤ４陽性ＣＣＲ５陽性Ｔ細胞の割合が減少することが報告されている（非特許文献１）。この研究は、それ以前に報告されていた、インビトロでＣＤ４陽性Ｔ細胞を抗ＣＤ３＋ＣＤ２８抗体で共刺激培養することによる、ｂ−ケモカインの分泌レベルの上昇とＣＣＲ５発現量の低下を、現実にＡＩＤＳ患者体内で再現できることを示したものである（非特許文献２、３及び４）
しかしながら、感染したＨＩＶ−１のタイプによっては、ＡＩＤＳ患者から採取したＣＤ４陽性Ｔ細胞を増殖させることができないという問題がある。すなわち、ＨＩＶ−１には、ＣＣＲ５をコレセプターとして利用するＲ５ ＨＩＶ−１以外に、ＣＸＣＲ４を利用するＸ４ ＨＩＶ−１、及びＣＣＲ５とＣＸＣＲ４の両方利用できるＲ５／Ｘ４ ＨＩＶ−１があり、該Ｘ４ ＨＩＶ−１及びＲ５／Ｘ４ ＨＩＶ−１は、Ｒ５ ＨＩＶ−１よりも、ＡＩＤＳ発症に伴うＣＤ４陽性Ｔ細胞に強力に働き、ＡＩＤＳ患者から採取したＴ細胞を培養過程で殺してしまうという問題である。例えば、抗ＣＤ３＋ＣＤ２８ビーズで共刺激培養してもＸ４ ＨＩＶ−１の増殖には無効であることが報告されている（非特許文献６）。また、日本においても末期ＡＩＤＳ患者のＰＢＭＣをＩＬ−２存在下で固相化抗ＣＤ３抗体で刺激培養を行うことによって、ウイルス増殖を抑制した状態でＴ細胞の拡大培養に成功したという報告はあるが（非特許文献６）、前記Ｘ４ ＨＩＶ−１及びＲ５／Ｘ４ ＨＩＶ−１に感染したＡＩＤＳ患者のＣＤ４陽性Ｔ細胞を安定して培養する方法は知られていない。
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，８，４７−５３，２００２
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２，１９３９−１９４３，１９９６
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６，２７３−２７６，１９９７
【非特許文献４】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８，５５４５−５５５３，１９９７
【非特許文献５】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６，２７３−２７６，１９９７
【非特許文献６】ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１６，６１１−６１２，２０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＣＣＲ５をコレセプターとして利用するＲ５ ＨＩＶ−１のみならず、ＣＸＣＲ４を利用するＸ４ ＨＩＶ−１、及びＣＣＲ５とＣＸＣＲ４の両方利用できるＲ５／Ｘ４ ＨＩＶ−１に感染したＡＩＤＳ患者から採取した、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を安定して培養、及び増殖させる方法、及び該培養に使用するＨＩＶ−１増殖抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記課題を解決するために研究を行った結果、本発明者らはＳＤＦ−１α、及びＭＩＰ−１α結合阻害効果を有する特定の芳香族アミン化合物が、刺激・活性化ＰＢＭＣにおけるＲ５、Ｘ４、又はＲ５／Ｘ４のトロピズムを有するＨＩＶ−１の増殖や、感染細胞と非感染細胞間のＨＩＶ−１ Ｅｎｖによる細胞融合を抑制することを見出した。そして、本発明者らは、Ｒ５、Ｘ４、及びＲ５／Ｘ４ ＨＩＶ−１に感染したＰＢＭＣの刺激培養において、該芳香族アミン化合物がこれらＨＩＶ−１ウイルス増殖を抑制しＣＤ４陽性Ｔ細胞の大量培養を可能にするという知見を得て、本発明を完成したのである。
【０００６】
したがって、本発明は、下記式Ｉの化合物、又はその塩を含む、ＨＩＶ−１増殖阻害剤を提供する。
Ｖ−ＣＲ１Ｒ２−Ａｒ−ＣＲ３Ｒ４−Ｎ（Ｒ５）−（ＣＲ６Ｒ７）ｘ−Ｒ８ （Ｉ）
該式中、Ｖは、アミン窒素２個〜６個を有する９員〜２４員の環状ポリアミン部分であって、該アミン窒素は少なくとも２個の炭素原子により、互いに間隔を置いて配置されており；
Ｒ１〜Ｒ７は、それぞれ独立に、水素原子、若しくは直鎖、分枝又は環状のＣ１−６アルキルからなる群から選ばれた基であり；
Ｒ８は、単環、又は多環式の複素環基、若しくは単環又は多環式であり、かつ置換又は非置換の芳香族又はヘテロ芳香族基であり；
Ａｒは、芳香環又はヘテロ芳香環であって、各々は、少なくとも１の位置で、電子供与基又は電子吸引基で置換されていてもよく；かつｘは、０から２の整数である。
【０００７】
また、式１において、Ｖが、１４員〜２０員であり４個の窒素原子を含む、特にＶが、１，４，８，１１−テトラアザシクロデカンであるのが好ましい。
また、式１において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、水素原子であり、かつＲ５が、水素原子又はＣＨ３基であるのが好ましい。
また、式１において、Ａｒが、１，３、又は１，４非置換フェニレンである、特にＡｒが、１，３、又は１，４非置換フェニレンであるのが好ましい。
また、式１において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、水素原子であり、Ｒ５が水素原子又はＣＨ３基であり、かつｘが０であるのが好ましい。
また、式１において、特に、Ｖが１４員〜２０員であり４個の窒素原子を含む、又はＶが１，４，８，１１−テトラアザシクロデカンである場合、Ｒ８が、下記（１）〜（５）のいずれか１の基であるのが好ましい。
【０００８】
【化６】
【０００９】
さらに、前記Ｖに加え、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、水素原子であり、かつＲ５が、水素原子又はＣＨ３基である場合に、特に、Ｒ８が下記（１）〜（５）のいずれか１の基であるのが好ましい。
【００１０】
【化７】
【００１１】
さらに、本発明は、前記式１の化合物が、下記式２を有する化合物である前記ＨＩＶ−１増殖阻害剤が好ましい。
【００１２】
【化８】
【００１３】
該式中、Ａは、下記（１）〜（５）のいずれか１の基を表す。
【００１４】
【化９】
【００１５】
また、本発明は、前記ＨＩＶ−１増殖阻害剤、及び増殖刺激剤を含む培地でＨＩＶ−１感染末梢血単核球を培養することを特徴とする、ＨＩＶ−１感染末梢血単核球に含まれるＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養方法を提供する。特に、該末梢血単核球のＨＩＶ−１感染が、Ｒ５ ＨＩＶ−１、Ｘ４ ＨＩＶ−１、及びＲ５／Ｘ４ ＨＩＶ−１からなる群から選ばれるサブタイプＨＩＶ−１によるものである、前記培養方法を提供する。
【００１６】
さらに本発明では、前記ＨＩＶ−１増殖阻害剤を含む、ＨＩＶ−１感染末梢血単核球に含まれるＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養キットを提供する。
さらに本発明では、前記培養方法で得られた活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞を、採取した患者に戻すことを含む、ＨＩＶ−１感染症の治療方法を提供する。
さらに本発明は、ＨＩＶ−１感染症治療医薬組成物を製造するために、前記培養方法で得られた活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞を使用することを含むものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のＨＩＶ−１増殖抑制剤により、ＡＩＤＳ患者から採取した活性化ＰＢＭＣにおいて、Ｒ５、Ｘ４、又はＲ５／Ｘ４のトロピズムを有するすべてのＨＩＶ−１増殖が抑制された。また、本発明の該ＨＩＶ−１増殖抑制剤を用いた培養方法により、ＡＩＤＳ患者から採取したＣＤ４陽性Ｔ細胞の大量培養ができるようになり、Ｒ５、Ｘ４、又はＲ５／Ｘ４ ＨＩＶ−１に感染したＡＩＤＳ患者に対する養子免疫療法が可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明のＨＩＶ−１増殖阻害剤に用いる下記式２の化合物、又はその塩は、２００２年７月９日付けで出願された、本件出願人の特願２００２−１９９９３９号（２００２年７月９日）に記載されている新規な芳香族アミン化合物である：
【００１９】
【化１０】
【００２０】
式中、Ａは、下記（１）〜（５）のいずれか１の基を表す；
【００２１】
【化１１】
【００２２】
本発明で特に好ましい化合物は、下記式（３）の化合物、又はその塩である：
【００２３】
【化１２】
【００２４】
次に該芳香族アミン化合物の具体的な名称を記す。
化合物１：Ｒが（１）の基である式１の化合物
Ｎ−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカニル−１，４−フェニレンビス（メチレン））−（２−ピペリジン−１−イル）アニリン
化合物２：Ｒが（２）の基である式１の化合物
Ｎ−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカニル−１，４−フェニレンビス（メチレン））−８−アミノキノリン
化合物３：Ｒが（３）の基である式１の化合物
Ｎ−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカニル−１，４−フェニレンビス（メチレン））−１−アミノナフタレン
化合物４：Ｒが（４）の基である式１の化合物
Ｎ−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカニル−１，４−フェニレンビス（メチレン））−１−アミノ−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン
化合物５：Ｒが（５）の基である式１の化合物
Ｎ−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカニル−１，４−フェニレンビス（メチレン））−３−アミノ−ビフェニル
本発明では化合物１〜５をＨＩＶ−１増殖阻害剤として用いることができるが、特に化合物２が好ましい。またこれらの化合物は単独で、又は組み合わせて使用することができる。本発明者らは化合物２に実験管理番号としてＴ−１１１３を付している。なお、これら化合物１〜５の具体的な製造方法を、実施例に続く製造例１〜５に記載した。
【００２５】
また、本発明の化合物１〜５は塩の形態でＨＩＶ−１増殖阻害剤として用いることができる。該塩は、培養したＣＤ４陽性Ｔ細胞を元の患者のＰＢＭＣに戻す際、その患者に対し無害であるならば特に制限はない。特に、本発明の化合物１〜５を医薬として許容し得る塩の形態で用いるのが好ましく、該塩は、有機酸又は無機酸の付加塩類とすることができる。
【００２６】
該無機酸付加塩には、例えば、フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素塩、硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸第一水素塩、リン酸第二水素塩、酢酸塩などがある。なお、塩基化合物、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウムなどを用いて塩形成をすることもできる。これらの塩のうち、例えば、塩酸塩、硝酸塩、リン酸第一水素塩、又はリン酸第二水素塩などが好ましい。
【００２７】
また、有機酸付加塩は、脂肪酸のモノカルボン酸、ジカルボン酸、ヒドロキシアルカン酸、ヒドロキシアルカン二酸、アミノ酸など、又は芳香族の酸、脂肪酸、芳香族のスルホン酸などの無毒な有機酸から誘導される塩、例えば、スルホン酸、メタンスルホン酸、スルファミン酸、酒石酸、フマル酸、臭化水素酸、グリコール酸、クエン酸、マレイン酸、リン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、アスコルビ酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタリンスルホン酸、プロピオン酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、ステアリン酸、ケイ皮酸、アスパラギン酸、サリチル酸、グルコン酸などがある。
【００２８】
このような酸付加塩は、通常、分散性、吸収性などが良く、ＰＢＭＣを培養する際、有利な特性を有する。該酸付加塩類は、本発明の技術分野で周知であり、適当な酸、又は塩基化合物との接触により常法で容易に調製することができる。
また、本発明のＨＩＶ−１増殖阻害剤は、Ｔ細胞培養に好ましい特性を付与し、また、取り扱いなどを容易にするため適当な製剤用成分などを加えることができる。例えば、汎用されている担体などの製剤用成分である、増量剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、分散剤、安定化剤、界面活性剤、吸収促進剤などを用いることができる。また、必要に応じて着色剤、保存剤などの添加剤を用いてもよい。
【００２９】
本発明の培養方法は、前記ＨＩＶ−１増殖阻害剤、及び増殖刺激剤を含む培地でＨＩＶ−１感染末梢血単核球を培養することを特徴とする、ＨＩＶ−１感染末梢血単核球に含まれるＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養方法である。
本発明では、患者から採取したＨＩＶ−１感染末梢血単核球を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞の免疫的活性化、及び増殖を行う。ここで培養するのは、主としてＴ細胞、マクロファージ及びＢ細胞などを含む末梢血単核球である。本明細書における末梢血単核球という用語は、本来の末梢血単核球のみならず、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を含む、上皮性リンパ球、腫瘍内浸潤リンパ球、癌性腹水胸水浸潤リンパ球などを含む概念である。なお、採血直後の新鮮末梢単核球を用いるのが、採血患者への身体的負担、リンパ球分離の簡便さ、分離後リンパ球の生存率の良さという点で好ましい。
【００３０】
なお、本発明の方法では、前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞の免疫学的活性化、及び増殖を行う際の採血の量、培養開始時のリンパ球の数は、特に、制限されないが、患者への負担、リンパ球分離などの処理の容易さなどを考慮し、まず、患者から約５〜５０ｍｌの少量の新鮮末梢血を採取し、そこから分離した末梢血単核球約１〜１００×１０６個を用いて開始することが好ましい。
【００３１】
また、本発明においては、培養開始時の細胞密度は１×１０５〜１×１０６個／ｍｌとするのが好ましい。そして、培養に伴い細胞数が増加した場合、必要に応じて適当な細胞密度となるよう継代培養することにより所望の量の活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞を得ることができる。また、なお、培養に伴い細胞数が増加した場合、細胞培養用のプラスチック製フラスコ、ＣＯ２ガス透過性のガス・パーミアブル・バッグなどを使用することができる。この段階ではリンパ球がＣＤ４陽性Ｔ細胞に大量に増殖してくるため、２〜４日毎に培養器の数を増やすことが好ましい。
【００３２】
また、本発明の方法では、該末梢血単核球のＨＩＶ−１感染が、Ｒ５ ＨＩＶ−１、Ｘ４ ＨＩＶ−１、及びＲ５／Ｘ４ ＨＩＶ−１からなる群から選ばれるサブタイプＨＩＶ−１によるものである場合、特に有効である。本発明のＨＩＶ−１増殖阻害剤が、末梢血単核球の培養時に、特にこれらのサブタイプウイルスの増殖を抑制するからである。
【００３３】
本発明では、血清等の生物由来の培養液、平衡塩類溶液にアミノ酸、ビタミン、核酸塩基などを加えた合成培地を用いることができる。例を挙げると、ＲＰＭＩ−１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭなどがあり、特にＲＰＭＩ−１６４０が好ましい。さらに必要に応じて、前記培地に、ウシ胎児血清、ウシ血清アルブミン、ヒト血清などを加える。特に培養液に正常ヒト血清を添加すると優れた増殖効果を得られることが多い。
【００３４】
また、前記増殖刺激剤の例を挙げると、抗ＣＤ３抗体、インターフェロン、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）などのサイトカイン類、ＰＳＫ、ＯＫ−４３２、レンチナンなどの免疫賦活物質がある。これらを単独で、又は組み合わせて使用することができる。本発明では、例えば、抗ＣＤ３抗体とインターロイキン２とを組み合わせて用いるのが好ましい。
【００３５】
なお、本発明で用いる増殖刺激剤としては、特に抗ＣＤ３抗体が好ましい。これは、ＣＤ３分子に対する特異的抗体である抗ＣＤ３抗体が、Ｔ細胞表面に存在するＣＤ３分子を刺激し、Ｔ細胞増殖を開始させるからである。該抗ＣＤ３抗体は、動物又は細胞に免疫して産生させることもできるが、安定性、コスト、品質等に優れた市販のＯＫＴ−３抗体（製造元：オーソファーマスーティカル）も入手することができる。なお、該増殖刺激剤の使用量は、その効果を得られる範囲であれば特に限定されないが、例えば、ＩＬ−２で５〜２０ユニット（Ｕ）／ｍｌ、好ましくは１５〜２０Ｕ／ｍｌ、抗ＣＤ３抗体で５〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは４０〜６０μｇ／ｍｌである。
【００３６】
該抗ＣＤ３抗体は不溶性担体の表面へ固定化して用いることが好ましい。固定化は、抗ＣＤ３抗体１〜５０μｇ／ｍｌを含むリン酸緩衝食塩水溶液（ＰＢＳ）等の希釈液中に不溶性担体を一定時間一定温度で静置することにより行うことができる。固定化の際の反応温度は、通常４〜４０℃とするのが好ましく、固定化時間は、３０分から２４時間とするのが好ましい。
【００３７】
本発明の培養で用いるＨＩＶ−１増殖阻害剤は、前記化合物１〜５、又はこれらの塩を含み、特に化合物２又はその塩を含むものが好ましい。また、該ＨＩＶ−１増殖阻害剤は、これらの化合物を単独で又は組み合わせで含んでいてもよい。なお、本発明の培地中の該化合物濃度は、適度な末梢血単核球の培養、及び増殖が得られれば特に制限されるものではないが、通常１０ｎＭｏｌ／ｌ〜１ｍＭｏｌ／ｌ、好ましくは１００ｎＭｏｌ／ｌ〜５００μＭｏｌ／ｌ、特に好ましくは１μＭｏｌ／ｌ〜１００μＭｏｌ／ｌである。
【００３８】
本発明の培養は、前記培地を用いて一般的な細胞培養の方法に従って行うことができる。例えば、湿潤環境を維持したＣＯ２インキュベータ内で行うことができる。該ＣＯ２濃度は１〜１０％、特に５％が好ましく、培養温度は３０〜４０℃、特に３７℃が好ましい。該培養の日数に特に制限はないが、抗ＣＤ３抗体などの増殖刺激剤の情報が細胞に伝達されることが前提となるため、通常２〜２０日、特に３〜７日行うことが好ましい。この培養の期間中は、顕微鏡下で細胞の状態を観察し、適宜細胞数を計測しながら、培養液を適宜追加、又は交換するのが好ましい。前記培養により必要量の末梢血単核球が得られたら、これらを遠心分離などの常法で回収し、また必要に応じて一部を継続培養する。
【００３９】
本発明の培養方法により得られた末梢血単核球、又は分離されたＣＤ４陽性Ｔ細胞を、該末梢血単核球を採取したＨＩＶ−１感染患者に投与し、その免疫力を強化することができる。それによりＨＩＶ−１の増殖を抑えＡＩＤＳの症状改善し及び進行を抑えるだけでなく、ＡＩＤＳに伴う、カポジ肉腫、日和見感染などを改善することができる。また、これにより多剤併用療法の効果を高めることができる。
【００４０】
なお、該培養末梢血単核球、又は分離ＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いて、ＡＩＤＳ患者に対する養子免疫療法を行う場合、免疫治療剤としての該Ｔ細胞の投与量は、１回当りの細胞数を１０６〜１０１２個とするのが好ましい。該投与形態としては、注射剤、点滴剤などの液体、特に該Ｔ細胞をヒト血清アルブミン０．０１〜５％を含む生理食塩液に分散した注射剤又は点滴剤が好ましい。その投与方法としては、静脈への点滴、静脈、動脈、局所などへの注射があるが、特に静脈への点滴が好ましい。また投与する液量は、投与方法、投与する場所などにより異なるが、５０〜５００ｍｌとするのが好ましく、この液量に前記Ｔ細胞１０６〜１０１２個が含まれるようにする。この投与頻度は、１回／日〜１回／月とするのが好ましく、投与回数は、少なくとも１回、好ましくは５回以上である。
【実施例】
【００４１】
（実施例１）
ＡＩＤＳ患者から採取したＰＢＭＣの刺激・拡大培養モデル系として下記の実験を行った。
まず、ＨＩＶ血清的陰性健常者から採取した新鮮なＰＢＭＣ １×１０６／ｍｌを懸濁したＲＰＭＩ−１６４０培地を、固定化抗ＣＤ３抗体で被覆した１２ウエルプレート（３ｍｌ／ウエル）に撒き、湿潤な５％ＣＯ２環境下３７℃で刺激培養した。この培養に用いたＲＰＭＩ培地は、牛胎児血清（ＦＢＳ）１０％、ヒト組み換えＩＬ−２（塩野義製薬株式会社）５０Ｕ／ｍｌ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、及びストレプトマイシン１００μｇ／Ｕ／ｍｌを含む、ＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ社，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ：以下、ＲＰＭＩ−１６４０培地という）である。
【００４２】
次いで、培養開始から３日経過後、該ＰＢＭＣを、感染多重度（ＭＯＩ）０．００１のウイルス懸濁液にさらした。用いたウイルスは、リン酸カルシウム法によりＨＩＶ−１分子クローンプラスミドでトランスフェクションした２９３Ｔ細胞を用いて調製したＨＩＶ−１ ＮＬ４−３（１）及びＨＩＶ−１ ＪＲ−ＣＳＦ（２）ウイルスストックから得たものである。なお、固定された抗ＣＤ３抗体で活性化されたＰＢＭＣ培養物を用いた終末点アッセイにより、前記ウイルスの５０％組織培養感染投与量を決定した。
【００４３】
該ウイルス感染処理を行った後、３７℃で３時間、吸収させ、該細胞を無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄し、１０μＭ Ｔ−１１１３（化合物２）を含む、及び含まないＲＰＭＩ−１６４０培地に、前記ＰＢＭＣの初発細胞濃度が５×１０５／ｍｌとなるよう再懸濁し、６ウエルプレート（５ｍｌ／ウエル）に撒き、湿潤な５％ＣＯ２環境下３７℃で３日間培養した。
【００４４】
さらに３日毎に２回、前記手順で細胞を処理した。生存細胞数をエオシンＹ色素（Ｅｏｓｉｎ Ｙ ｄｙｅ）を用いた色素排除法により求めた。また、ＨＩＶ−１の感染を調べるため、培養上清中のＨＩＶ−１ｐ２４抗原の濃度を市販のＨＩＶ−１ｐ２４ ＥＬＩＳＡキット（Ｚｅｐｔｏ Ｍｅｔｒｉｘ社、米国、ニューヨーク）を用いて定量し、残りの細胞を同じ条件で培養した（初発細胞濃度：２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。
【００４５】
実験の結果、図１に示すようにＸ４ ＨＩＶ−１であるＮＬ４−３ウイルス株、及びＲ５ ＨＩＶ−１であるＪＲ−ＣＳＦ株に感染した９日後では、Ｔ−１１１３を含まない培地における生存Ｔ細胞数は、Ｔ−１１１３存在下の生存Ｔ細胞数の５０％以下になった。また、該生存Ｔ細胞中のＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞率を検討すると、図２（２）及び（４）に示すように、ＮＬ４−３株、及びＪＲ−ＣＳＦ株に感染した９日後では、Ｔ−１１１３を含まない培地におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞率は著しく低い。これに対し、図２（５）及び（６）に示すように、ＮＬ４−３株、及びＪＲ−ＣＳＦ株に感染した９日後でも、Ｔ−１１１３を含む培地ではＣＤ４陽性Ｔ細胞率は、図２（１）及び（２）のＨＩＶ−１感染を伴わないコントロールとほとんど差が見られない。したがって、本実験によりＴ−１１１３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＨＩＶ−１感染患者のＰＢＭＣの刺激培養の際に、Ｒ５及びＸ４両タイプのＨＩＶ−１ウイルスの増殖を強く抑制していることが判る。
【００４６】
次に、本発明で、ＨＩＶ−１増殖阻害剤に用いる化合物の製造方法を具体的に説明する。
（製造例１）
化合物１：Ｎ−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカニル−１，４−フェニレンビス（メチレン））−（２−ピペリジン−１−イル）アニリンの合成
製造例１−１：
中間体１：４，８，１１−トリス（ジエトキシホスホリル）−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカンの合成
１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン５．２０ｇ（２６．０ｍｍｏｌ）をクロロホルム３１２ｍｌに溶解し、氷冷、攪拌しながらトリエチルアミン５．７８ｇ（７．９６ｍｌ，５７．１ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、該反応系に、クロロリン酸ジエチル９．４１ｇ（７．８４ｍｌ，５４．５ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１５６ｍｌ）で希釈した溶液を９０分間かけて滴下した。さらに室温で２１時間攪拌した後、該反応液に飽和重曹水を加えクロロホルムを用いて分液抽出した。該有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（３５０ｇ、クロロホルム：メタノール＝１５：１）により精製することにより、無色シロップ状で標記化合物４．７９ｇ（収率３０．３％）が得られた。分析値は次のとおりであった。
【００４７】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００Ｍｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１．２７−１．３３（ｍ，１８Ｈ），１．７４（ｍ，２Ｈ），１．８８（ｍ，２Ｈ），２．７２（ｍ，２Ｈ），２．８０（ｍ，２Ｈ），３．００−３．２６（ｍ，１２Ｈ），３．９０−４．１０（ｍ，１２Ｈ）
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２２Ｈ５１Ｎ４Ｏ９Ｐ３ ６０８．５８，ｆｏｕｎｄ ６０９（ＭＨ＋）
製造例１−２：
中間体２：１−（１−メチレン−４−（ブロモメチレン）フェニレン）−４，８，１１−トリス（ジエトキシホスホリル）−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカンの合成
製造例１−１で得られた中間体１ １．２２ｇ（２．００ｍｍｏｌ）をアセトニトリル３０．５ｍｌに溶かし、炭酸カリウム０．３６０ｇ（２．６０ｍｍｏｌ）、ｐ−キシリレンジブロミド２．６５ｇ（１０．０ｍｍｏｌ）を加え、７０℃で１時間攪拌した。ＴＬＣを用いて反応終了を確認した後、該反応液に飽和食塩水を加え、クロロホルムで分液抽出を行った。該有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（フラッシュ６００ｇ、クロロホルム：メタノール＝３０：１）により精製することにより、無色シロップ状で標記化合物０．８９７ｇ（収率５６．４％）が得られた。分析値は次のとおりであった。
【００４８】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００Ｍｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１．２３−１．３６（ｍ，１８Ｈ），１．６６−１．７４（ｍ，２Ｈ），１．８２−１．９１（ｍ，２Ｈ），２．３０−２．３５（ｍ，２Ｈ），２．５８−２．６３（ｍ，２Ｈ），２．９９−３．１６（ｍ，１２Ｈ），３．４９（ｓ，２Ｈ），３．９５−４．０７，（ｍ，１２Ｈ），４．４９（ｓ，２Ｈ），７．２４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ５８ＢｒＮ４Ｏ９Ｐ，３７９１．６３，ｆｏｕｎｄ ７９２（ＭＨ＋）
製造例１−３：
化合物１：Ｎ−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカニル−１，４−フェニレンビス（メチレン））−（２−ピペリジン−１−イル）アニリンの合成
２−（ピペリジン−１−イル）アニリン８９７ｍｇ（５．０９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（８．０６ｍｌ）に溶かし、炭酸カリウム２１１ｍｇ（１．５３ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で撹拌した。該反応液中に製造例１−２で得た中間体２ ８０６ｍｇ（１．０２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル１６．１ｍｌに溶かした溶液をゆっくり滴下し、さらに同温度で時間撹拌した。ＴＬＣを用いて反応終了を確認後、該反応液に水を加え、クロロホルムにより分液抽出した。該有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（１００ｇ、クロロホルム：メタノール＝３０：１）により精製し、淡黄色シロップ状で化合物１ ６７８ｍｇを得た。該化合物１ ４２．９ｍｇを再び酢酸０．８５８ｍｌに溶かし、４Ｍ塩酸／ジオキサン溶液１．２９ｍｌを加え室温で１５時間撹拌した。該反応液にジエチルエーテルを加え、析出固体を遠沈させ、酢酸で洗浄し、さらにジエチルエーテルで洗浄した後、真空乾燥させ、標記化合物１の塩酸塩２５．２ｍｇ（収率５６％）を白色固体として得た。分析値は次のとおりであった。
【００４９】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ；２．７２−２．１８（１０Ｈ，ｍ），２．７９−３．４０（１８Ｈ，ｍ），３．４９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），３．８２−４．０２（２Ｈ，ｍ），４．５３（２Ｈ，ｓ），７．００−７．０８（２Ｈ，ｍ），７．３４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．３１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），７．４８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２９Ｈ４６Ｎ６ ４７８．７２，ｆｏｕｎｄ ４７９（ＭＨ＋）
（製造例２）
化合物２：Ｎ−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカニル−１，４−フェニレンビス（メチレン））−８−アミノキノリンの合成
製造例１−２で得た中間体２ １００ｍｇ（０．１２６ｍｍｏｌ）を出発物質とし、２−（ピペリジン−１−イル）アニリンに代わって、８−アミノキノリン９１．１ｍｇ（０．６３２ｍｍｏｌ）を用いて、製造例１−３とほぼ同様の方法で反応を行った。その結果、橙色固体状の標記化合物２の塩酸塩６０．１ｍｇ（収率７１％）を得ることができた。分析値は次のとおりであった。
【００５０】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ；２．００−２．１８（４Ｈ，ｍ），２．６２−３．３３（１６Ｈ，ｍ），３．７５（２Ｈ，ｓ），４．７２（２Ｈ，ｓ），７．２５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．７，６．８Ｈｚ），７．２８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．５４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．５８−７．６３（２Ｈ，ｍ），７．８３−７．９１（１Ｈ，ｍ），８．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），８．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．５，４．９Ｈｚ）
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２７Ｈ３８Ｎ６ ４４６．６３，ｆｏｕｎｄ ４４７（ＭＨ＋）
（製造例３）
化合物３：Ｎ−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカニル−１，４−フェニレンビス（メチレン））−１−アミノナフタレンの合成
製造例１−２で得た中間体２ １００ｍｇ（０．１２６ｍｍｏｌ）を出発物質とし、２−（ピペリジン−１−イル）アニリンに代わって１−ナフチルアミン９０．４ｍｇ（０．６３２ｍｍｏｌ）を用いて、製造例１−３とほぼ同様の方法で反応を行った。その結果、白緑色固体状の標記化合物３の塩酸塩２０．０ｍｇ（収率２６％）を得ることができた。分析値は次のとおりであった。
【００５１】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ；１．４９（２Ｈ，ｂｒｓ），２．０１（２Ｈ，ｂｒｓ），２．６４−２．７４（１６Ｈ，ｍ），２．８９（２Ｈ，ｂｒｓ），３．０４−３．０６（２Ｈ，ｍ），３．１６（２Ｈ，ｂｒｓ），４．８２（２Ｈ，ｓ），７．２０−７．２２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．３６−７．４０（１Ｈ，ｍ），７．４４−７．４５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．５０−７．６１（４Ｈ，ｍ），７．９１−７．９３（１Ｈ，ｍ），８．０１−８．０４（１Ｈ，ｍ）
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２８Ｈ３９Ｎ５ ４４５．６４，ｆｏｕｎｄ ４４６（ＭＨ＋）
（製造例４）
化合物４：Ｎ−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカニル−１，４−フェニレンビス（メチレン））−１−アミノ−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレンの合成
製造例１−２で得た中間体２ １００ｍｇ（０．１２６ｍｍｏｌ）を出発物質とし、２−（ピペリジン−１−イル）アニリンに代わって５，６，７，８−テトラヒドロ−１−ナフチルアミン８７．７μｌ（０．６３２ｍｍｏｌ）を用いて、製造例１−３とほぼ同様の方法で反応を行った。その結果、薄白褐色固体状の標記化合物４の塩酸塩３０．９ｍｇ（収率４０％）を得ることができた。分析値は次のとおりであった。
【００５２】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ；１．６４−１．６６（４Ｈ，ｍ），１．９２（２Ｈ，ｂｒｓ），２．０７−２．０１（４Ｈ，ｍ），２．４１−２．４２（２Ｈ，ｍ），２．７４−２．８４（２Ｈ，ｍ），３．０２−３．０３（１２Ｈ，ｍ），３．８９（２Ｈ，ｂｒｓ），４．６２（２Ｈ，ｓ），７．００−７．０２（１Ｈ，ｍ），７．１９−７．２２（２Ｈ，ｍ），７．２４−７．３０（４Ｈ，ｍ）
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２８Ｈ４３Ｎ５ ４４９．６７，ｆｏｕｎｄ ４５０（ＭＨ＋）
（製造例５）
化合物５：Ｎ−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカニル−１，４−フェニレンビス（メチレン））−３−アミノ−ビフェニルの合成
製造例１−２で得た中間体２ １００ｍｇ（０．１２６ｍｍｏｌ）を出発物質とし、２−（ピペリジン−１−イル）アニリンに代わって、３−アミノ−ビフェニル１０６．９ｍｇ（０．６３２ｍｍｏｌ）を用いて、製造例１−３とほぼ同様の方法で反応を行った。その結果、白色固体状の標記化合物５の塩酸塩３０．９ｍｇ（収率４２％）を得ることができた。分析値は次のとおりであった。
【００５３】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ；１．７６（２Ｈ，ｂｒｓ），１．８９−１．９７（２Ｈ，ｂｒｓ），２．０８（４Ｈ，ｓ），２．４９−２．５０（４Ｈ，ｍ），２．８５−２．９４（８Ｈ，ｍ），３．１３−３．１８（４Ｈ，ｍ），３．７５−３．７６（２Ｈ，ｍ），７．１０−７．１１（１Ｈ，ｍ），７．２２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．３１−７．３３（３Ｈ，ｍ），７．４３−７．４６（３Ｈ，ｍ），７．４９−７．５９（３Ｈ，ｍ），７．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ４１Ｎ５ ４７１．６８，ｆｏｕｎｄ ４７２（ＭＨ＋）
（参考文献）
（１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，５９，２８４−２９１，１９８６
（２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３６，８１９−８２２，１９８７
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、ＩＬ−２及び抗ＣＤ３抗体で刺激培養を行ったＨＩＶ−１感染及び非感染Ｔ細胞の増殖に及ぼすＴ−１１１３の影響を示すグラフである。
【図２】図２は、ＩＬ−２で刺激培養を行ったＨＩＶ−１感染及び非感染Ｔ細胞におけるＣＤ４及びＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合と、Ｔ−１１１３の影響を示す分布図である。図２において、（１）はコントロールを、（２）は正常Ｔ細胞を含む培地にＴ−１１１３を加えた場合、（３）はＮＬ４−３ ＨＩＶ−１に感染した細胞を培養した場合、（４）はＪＲ−ＣＳＦ ＨＩＶ−１に感染した細胞を培養した場合、（５）はＮＬ４−３ ＨＩＶ−１に感染した細胞を含む培地にＴ−１１１３（１０ｕｍ）を加えて培養した場合、及び（６）はＪＲ−ＣＳＦ ＨＩＶ−１に感染した細胞を含む培地にＴ−１１１３（１０ｕｍ）を加えて培養した場合のデータを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式１の化合物、又はその塩を含む、ＨＩＶ−１増殖阻害剤：
Ｖ−ＣＲ１Ｒ２−Ａｒ−ＣＲ３Ｒ４−Ｎ（Ｒ５）−（ＣＲ６Ｒ７）ｘ−Ｒ８ （Ｉ）
式中、Ｖは、アミン窒素２個〜６個を有する９員〜２４員の環状ポリアミン部分であって、該アミン窒素は少なくとも２個の炭素原子により、互いに間隔を置いて配置されており；
Ｒ１〜Ｒ７は、それぞれ独立に、水素原子、若しくは直鎖、分枝又は環状のＣ１−６アルキルからなる群から選ばれた基であり；
Ｒ８は、単環、又は多環式の複素環基、若しくは単環又は多環式であり、かつ置換又は非置換の芳香族又はヘテロ芳香族基であり；
Ａｒは、芳香環又はヘテロ芳香環であって、各々は、少なくとも１の位置で、電子供与基又は電子吸引基で置換されていてもよく；かつｘは、０から２の整数である。
【請求項２】
Ｖが、１４員〜２０員であり４個の窒素原子を含む、請求項１記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤。
【請求項３】
Ｖが、１，４，８，１１−テトラアザシクロデカンである、請求項１記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤。
【請求項４】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、水素原子であり、かつＲ５が、水素原子又はＣＨ３基である、請求項１〜３のいずれか１項記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤。
【請求項５】
Ａｒが、１，３、又は１，４非置換フェニレンである、請求項１〜３のいずれか１項記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤。
【請求項６】
Ａｒが、１，３、又は１，４非置換フェニレンである、請求項４記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤。
【請求項７】
ｘが０である、請求項４記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤。
【請求項８】
Ｒ８が、下記（１）〜（５）のいずれか１の基である、請求項１〜３のいずれか１項記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤。
【化１】
【請求項９】
Ｒ８が、下記（１）〜（５）のいずれか１の基である、請求項４記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤。
【化２】
【請求項１０】
前記式Ｉの化合物が、下記式２の化合物である、請求項１記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤：
【化３】
式中、Ａは、下記（１）〜（５）のいずれか１の基を表す。
【化４】
【請求項１１】
前記式Ｉの化合物が、下記式３の化合物である、請求項１記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤：
【化５】
【請求項１２】
前記式２又は式３の化合物の塩酸塩を含む、請求項１記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤。
【請求項１３】
請求項１記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤、及び増殖刺激剤を含む培地でＨＩＶ−１感染末梢血単核球を培養することを特徴とする、ＨＩＶ−１感染末梢血単核球に含まれるＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養方法。
【請求項１４】
該ＨＩＶ−１感染末梢血単核球の培養培地が、請求項１のＨＩＶ−１増殖阻害剤を含む、請求項１３記載の培養方法。
【請求項１５】
該末梢血単核球のＨＩＶ−１感染が、Ｒ５ ＨＩＶ−１、Ｘ４ ＨＩＶ−１、及びＲ５／Ｘ４ ＨＩＶ−１からなる群から選ばれるサブタイプＨＩＶ−１によるものである、請求項１３記載の培養方法。
【請求項１６】
該培地中に含まれる、請求項１記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤の該式１の化合物、又はその塩の濃度が、１０〜１００Ｍｏｌ／ｍｌである、請求項１３記載の培養方法。
【請求項１７】
該培地中に含まれる、請求項１記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤の該式１の化合物、又はその塩の濃度が、１０〜１００Ｍｏｌ／ｍｌである、請求項１６記載の培養方法。
【請求項１８】
該増殖刺激剤が、抗ＣＤ３抗体、インターフェロン、インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１５、ＰＳＫ、ＯＫ−４３２、レンチナンからなる群から選ばれた少なくとも１種である、請求項１３記載の培養方法。
【請求項１９】
請求項１記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤を含む、ＨＩＶ−１感染末梢血単核球に含まれるＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養キット。
【請求項１】
下記式１の化合物、又はその塩を含む、ＨＩＶ−１増殖阻害剤：
Ｖ−ＣＲ１Ｒ２−Ａｒ−ＣＲ３Ｒ４−Ｎ（Ｒ５）−（ＣＲ６Ｒ７）ｘ−Ｒ８ （Ｉ）
式中、Ｖは、アミン窒素２個〜６個を有する９員〜２４員の環状ポリアミン部分であって、該アミン窒素は少なくとも２個の炭素原子により、互いに間隔を置いて配置されており；
Ｒ１〜Ｒ７は、それぞれ独立に、水素原子、若しくは直鎖、分枝又は環状のＣ１−６アルキルからなる群から選ばれた基であり；
Ｒ８は、単環、又は多環式の複素環基、若しくは単環又は多環式であり、かつ置換又は非置換の芳香族又はヘテロ芳香族基であり；
Ａｒは、芳香環又はヘテロ芳香環であって、各々は、少なくとも１の位置で、電子供与基又は電子吸引基で置換されていてもよく；かつｘは、０から２の整数である。
【請求項２】
Ｖが、１４員〜２０員であり４個の窒素原子を含む、請求項１記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤。
【請求項３】
Ｖが、１，４，８，１１−テトラアザシクロデカンである、請求項１記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤。
【請求項４】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、水素原子であり、かつＲ５が、水素原子又はＣＨ３基である、請求項１〜３のいずれか１項記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤。
【請求項５】
Ａｒが、１，３、又は１，４非置換フェニレンである、請求項１〜３のいずれか１項記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤。
【請求項６】
Ａｒが、１，３、又は１，４非置換フェニレンである、請求項４記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤。
【請求項７】
ｘが０である、請求項４記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤。
【請求項８】
Ｒ８が、下記（１）〜（５）のいずれか１の基である、請求項１〜３のいずれか１項記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤。
【化１】
【請求項９】
Ｒ８が、下記（１）〜（５）のいずれか１の基である、請求項４記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤。
【化２】
【請求項１０】
前記式Ｉの化合物が、下記式２の化合物である、請求項１記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤：
【化３】
式中、Ａは、下記（１）〜（５）のいずれか１の基を表す。
【化４】
【請求項１１】
前記式Ｉの化合物が、下記式３の化合物である、請求項１記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤：
【化５】
【請求項１２】
前記式２又は式３の化合物の塩酸塩を含む、請求項１記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤。
【請求項１３】
請求項１記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤、及び増殖刺激剤を含む培地でＨＩＶ−１感染末梢血単核球を培養することを特徴とする、ＨＩＶ−１感染末梢血単核球に含まれるＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養方法。
【請求項１４】
該ＨＩＶ−１感染末梢血単核球の培養培地が、請求項１のＨＩＶ−１増殖阻害剤を含む、請求項１３記載の培養方法。
【請求項１５】
該末梢血単核球のＨＩＶ−１感染が、Ｒ５ ＨＩＶ−１、Ｘ４ ＨＩＶ−１、及びＲ５／Ｘ４ ＨＩＶ−１からなる群から選ばれるサブタイプＨＩＶ−１によるものである、請求項１３記載の培養方法。
【請求項１６】
該培地中に含まれる、請求項１記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤の該式１の化合物、又はその塩の濃度が、１０〜１００Ｍｏｌ／ｍｌである、請求項１３記載の培養方法。
【請求項１７】
該培地中に含まれる、請求項１記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤の該式１の化合物、又はその塩の濃度が、１０〜１００Ｍｏｌ／ｍｌである、請求項１６記載の培養方法。
【請求項１８】
該増殖刺激剤が、抗ＣＤ３抗体、インターフェロン、インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１５、ＰＳＫ、ＯＫ−４３２、レンチナンからなる群から選ばれた少なくとも１種である、請求項１３記載の培養方法。
【請求項１９】
請求項１記載のＨＩＶ−１増殖阻害剤を含む、ＨＩＶ−１感染末梢血単核球に含まれるＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養キット。
【図１】
【図２】
【図２】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５１９２７
【国際公開日】平成１７年６月９日（２００５．６．９）
【発行日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１５８０８（Ｐ２００５−５１５８０８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１７５５８
【国際出願日】平成１６年１１月２６日（２００４．１１．２６）
【出願人】（０００００１１００）株式会社クレハ (477)
【出願人】（５９８００２１２１）
【出願人】（５０３４３４９１１）
【出願人】（５０３４３４９００）
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年６月９日（２００５．６．９）
【発行日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１７５５８
【国際出願日】平成１６年１１月２６日（２００４．１１．２６）
【出願人】（０００００１１００）株式会社クレハ (477)
【出願人】（５９８００２１２１）
【出願人】（５０３４３４９１１）
【出願人】（５０３４３４９００）
【Ｆターム（参考）】
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