ＨＰＶにより惹起される疾患の治療用組成物
本発明は、ヒトパピローマウイルスのＥ７タンパク質の免疫原性領域およびフィブロネクチンのＥＤＡ領域を含む免疫原性複合体、並びに前記複合体を含む組成物並びに前記複合体および組成物を用いる刺激により得られる樹状細胞に関する。さらに、本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）により惹起される疾患を治療するための、前記複合体、組成物および樹状細胞を使用する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）により惹起される疾患を治療するための治療用組成物、さらに具体的には少なくとも１種のＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチドを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸癌は、全世界中の女性における最も一般的な癌の一つであり、癌全体の中で５番目に多く、患者数は１４０万例と推定される。種々のタイプの粘膜指向性のヒトパピローマウイルスに基づく慢性生殖管感染が子宮頸癌を引き起こすという一貫した証拠がある。
【０００３】
子宮癌に対して現在使用されている米国メルク社のＧａｒｄａｓｉｌと称するワクチンは、全子宮癌症例の約７０パーセントの根源にある該ウイルスの１６および１８型系統に対して９５パーセントを防御することができる。それは、生殖器官において疣贅を起こす６および１１型系統に対しても防御となる。
【０００４】
ＨＰＶの発癌性のタンパク質Ｅ６およびＥ７の発現は、悪性の形質転換、並びにＨＰＶ誘発病変の臨床的および細胞学的解決と関連してきたＥ７に対する細胞性免疫の開始および維持に必要である。
【０００５】
パピローマウイルスは、多くの様々な種に感染するＤＮＡウイルスである。これらのウイルスの幾つかは、それらの天然宿主における疾患の発生に関連している。同定されているヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のタイプは６０を超える。
【０００６】
これらのウイルスは、身体の複数の領域でヒト生体に感染して、皮膚の普通の疣贅、喉頭のパピローマ、その他の原因である。
【０００７】
ＨＰＶ生殖器感染は比較的頻度が高く、男性および女性の生殖管に最もしばしば感染するＨＰＶのタイプは６、１１、１６および１８型である。
【０００８】
女性において、ＨＰＶは、子宮頸部を含む生殖管の種々な部分に感染する。肛門と性器に関わる領域の感染は最も頻度の高い性行為感染症の一つと考えられるので、生殖器ＨＰＶは臨床的な問題である。ＨＰＶは、以下の形態において示される生殖器感染を惹起する：
ｉ）生殖器疣贅が示される臨床的感染；
ｉｉ）病変は目に見えないが、パパニコラウ細胞診などの特別の技法を使用して検出できるウイルス性病変である無症状感染；および、
ｉｉｉ）感染の単独の徴候がＨＰＶ ＤＮＡの存在である潜伏期。
【０００９】
他方、パパニコラウ細胞診の２から４％がＨＰＶの証拠を示すと見積もられるので、無症状感染は比較的一般的である。潜在的感染は、さらに高頻度であり、大部分の成人は１つまたは複数のタイプのＨＰＶを有すると推定される。
【００１０】
子宮頸癌は女性によく見られる癌である。この癌の中で、最も普通に見出される扁平上皮細胞癌（観察された症例の約９０％）と分泌細胞癌である腺癌とが区別される。子宮頸癌には数段階がある。前癌段階は前立腺上皮内新生物（ＣＩＮ）と呼ばれ、侵襲的形態（癌）に発展し得る。その前癌形態およびその侵襲的形態にある両者とも、子宮頸癌は、比較的信頼性のある費用のかからない技法、すなわちパパニコラウ検査を使用して診断することができる数少ない癌の一つである。
【００１１】
近年集められた証拠により、ＨＰＶの幾つかのタイプが子宮頸癌の発生と関連しており、これらのタイプの幾つかは癌の発生の原因となる病因性因子であることが示唆される。
【００１２】
ＨＰＶは子宮頸部発癌開始剤として作用し、悪性の形質転換は他の因子との相互作用に依存すると仮定されてきた。特にＨＰＶ−１６、一般的にはパピローマウイルスの性質は、近年研究されてきた。ＨＰＶ−１６は７９０４ｂｐの二重螺旋ＤＮＡゲノムを含む（Ｓｅｅｄｏｒｆ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，１９８５， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４５：１８１−１８５）。カプシドは直径５０ｎｍであり７２個のカプソメアを含む（Ｋｌｕｇ，Ａ．Ｊ．， １９６５， Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：４０３−４２３）。米国特許第４，７７７，２３９号は、ＨＰＶ−１６に対する抗体を発生することができて、それ故診断目的にとって有用な一連の１７個の合成ペプチドを教示している。
【００１３】
ＨＰＶは、ＨＰＶに誘発される異常な細胞増殖の病原性に関与するように思われる２種のタンパク質、Ｅ６およびＥ７をコードする（Ｓｔｏｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３７：１６８−１７９参照）。ＨＰＶ１６のＥ６およびＥ７タンパク質のアミノ酸配列はＳｅｅｄｏｒｆら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９８５、１４５： １８１−１８５）により定義された。
【００１４】
Ｅ６およびＥ７タンパク質をコードする遺伝子は、ＨＰＶ感染を伴った子宮頸癌腫瘍細胞で必ず発現しているようであることが観察されている。
【００１５】
Ｅ６およびＥ７タンパク質は腫瘍退縮に有効な免疫学的標的であると思われる。それにも拘わらず、前記タンパク質をコードするＤＮＡに基づくワクチン開発の可能性として、患者の細胞における不可逆的細胞形質転換事象の発症が生じ得る。ＥＰ０７９６２７３には、Ｅ６およびＥ７タンパク質の変異および非変異区域との融合タンパク質を使用して、望ましくない細胞形質転換を発生させずに、患者中で免疫応答を生じさせ得る組成物が記載されている。
【００１６】
Ｐｒｅｖｉｌｌｅら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００５，６５：６４１−６４９）は、百日咳菌（ボルデテラ・パータシス）のアデニレートシクラーゼ（ＣｙａＡ）と完全なＥ７タンパク質またはそれらの種々の領域とを含む種々の融合タンパク質を記載している。アデニレートシクラーゼはＣＤ１１ｂ＋樹状細胞に、αＭβ２インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）との相互作用により結合することができ、それ故融合タンパク質の幾つかは、ＨＰＶ１６ Ｅ７を発現する腫瘍細胞に対する特異的免疫応答（ヘルパーＴおよび細胞傷害性Ｔ）を引き起こすことができる。
【００１７】
Ｂｅｒｒａｏｎｄｏ Ｐら（Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００７、６７：８８４７：８８５５）は、ＣｙａＡとアミノ酸３０から４２までを欠くＨＰＶ１６の切断型（ＣｙａＡ−Ｅ７Ｌｌ３０−４２）とを含む組換えタンパク質、カチオン性脂質と関連したＣｐＧおよびシクロホスファミドにより形成される組成物を記載している。この組成物はＥ７を発現する腫瘍に対する免疫応答を生じさせることができる。
【００１８】
しかしながら、望ましくない細胞形質転換を生じさせずに、ＨＰＶタンパク質を発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を患者中に生じさせることができるさらなる免疫原性組成物並びに免疫応答の発生に相乗的に作用して前記タンパク質の投与量を減少させることができるような前記タンパク質と追加成分とを含む組成物に対する必要性が未だ存在する。
【発明の概要】
【００１９】
第１の態様において、本発明は、
（ｉ）フィブロネクチンのＥＤＡ領域またはそれらの機能的に同等な変異体、および、
（ｉｉ）少なくとも１種のＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチド
を含み、成分（ｉ）と（ｉｉ）とが共有結合してなる複合体であって、
抗原性ペプチド(peptide or peptides)に対する細胞傷害性応答を助長する複合体に関する。
【００２０】
それに加わる態様において、本発明は、本発明の複合体をコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物と、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の遺伝子構築物を含むベクターと、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物または本発明のベクターを含む細胞とに関する。
【００２１】
他の態様において、本発明は、
（ｉ）本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明による宿主細胞、および、
（ｉｉ）ＴＬＲリガンド、
を一緒にまたは別々に含む第１組成物に関する。
【００２２】
他の態様において、本発明は、
（ｉ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体、請求項７に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞、
（ｉｉ）ＴＬＲリガンドおよび、
（ｉｉｉ）化学療法剤
を一緒にまたは別々に含む第２の組成物に関する。
【００２３】
他の態様において、本発明は、医薬組成物、すなわち、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の第１のまたは第２の組成物および少なくとも１種の薬理学的に許容されるアジュバントを含む本発明の医薬組成物に関する。
【００２４】
他の態様において、本発明は、医学において使用するための、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の第１のまたは第２の組成物または本発明の医薬組成物に関する。
【００２５】
他の態様において、本発明は、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の第１のまたは第２の組成物または本発明の医薬組成物の、ワクチンを製造するための使用に関する。
【００２６】
他の態様において、本発明は、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の第１のまたは第２の組成物または本発明の医薬組成物の、ヒトパピローマウイルスにより惹起される感染および／またはＨＰＶ感染と関連する子宮頸癌の予防および治療のための医薬を製造するための使用に関する。
【００２７】
他の態様において、本発明は、少なくとも１種のＨＰＶ Ｅ７抗原を表示する成熟樹状細胞を得るためのインビトロの方法すなわち、
（ｉ）樹状細胞を、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の第１のまたは第２の組成物と、樹状細胞の成熟が起こるのに適した条件で接触させ、かつ
（ｉｉ）成熟樹状細胞を回収すること
を含む本発明の方法に関する。
【００２８】
他の態様において、本発明は、本発明の方法により得られる細胞、または本発明の第２の細胞に関する。
他の態様において、本発明は、医学において使用するための本発明の第２の細胞に関する。
【００２９】
他の態様において、本発明は、ヒトパピローマウイルスにより惹起される感染および／またはＨＰＶ感染と関連する子宮頸癌を予防および治療するための医薬を製造するための本発明の第２の細胞の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】組替えＥＤＡ−ＨＰＶＥ７融合タンパク質の図式的表示である。Ｅ７タンパク質の最初の２９個のアミノ酸はＥＤＡのＮ端に位置したが、Ｅ７のアミノ酸４３〜９８はＥＤＡのＣ端に挿入されていた。融合タンパク質の配列は、アミノ酸についての単一のコードを使用して示す。Ｅ７タンパク質のアミノ酸は灰色で示すが、それに対してＥＤＡのアミノ酸は黒色で描いてある。ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７組替えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。５マイクログラムの精製タンパク質を１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離してクロマジーブルーで染色した。
【図２】ＥＤＡＨＰＶ−Ｅ７融合タンパク質による骨髄由来の樹状細胞成熟の活性化を示す図である。骨髄由来の樹状細胞を、ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７（５００ｎＭ）、ペプチドＥ７（４９−５７）（５００ｎＭ）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）（陽性対照）または培養培地（陰性対照）と共に４８時間インキュベートした。次に細胞を捕集して、フローサイトメトリーによりＨ−２ｂ分子または成熟マーカーＣＤ５４およびＣＤ８６（ＲＦＵ：相対蛍光単位）の発現について分析した。
【図３】ＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７融合タンパク質は、骨髄由来の樹状細胞によるＩＬ−１２の産生またはヒト単球細胞ラインＴＨＰ−１によるＴＮＦ−αの産生を誘発する。（Ａ）骨髄由来の樹状細胞を、ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７（５００ｎＭ）、ペプチドＥ７（４９−５７）（５００ｎＭ）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）（陽性対照）または培養培地（陰性対照）と共に４８時間インキュベートした。２４時間後に、培養上清を捕集して上清に放出されたＩＬ−１２をＥＬＩＳＡにより測定した。 （Ｂ）ＴＨＰ−１細胞を、ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７（５００ｎＭ）、ペプチドＥ７（４９−５７）（５００ｎＭ）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）または培養培地（陰性対照）と共に１５時間インキュベートした。培養後、上清を捕集して放出されたＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡにより測定した。
【図４】ＰＢＳ中におけるＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７タンパク質またはＤＴｃ／Ｅ７（４９−５７）ペプチドを用いた免疫によるＣＴＬのインビボ誘発を示す図である。（Ａ）マウスは、２ｎｍｏｌＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７またはＤＴｃ／Ｅ７（４９−５７）ペプチドを静脈注射して免疫した。免疫後７日にマウスを屠殺して、脾臓細胞をＤＴｃペプチドの存在または不在下に５日間培養した。ＣＴＬ活性は、タンパク質ＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７（黒丸印）、ペプチドＤＴｃ／Ｅ７（４９−５７）（白丸印）で免疫したマウスから得た脾臓細胞培養中で、放射性標識してＤＴｃペプチドをパルスで適用したＥＬ４細胞を標的細胞として使用する従来のクロム放出アッセイを使用して測定した（グラフでは絶対値を示し、前記の値はペプチドの存在下で得られた値からペプチド無添加で得られた細胞溶解の値を差し引くことにより計算した）。（Ｂ）ＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７またはＤＴｃ／Ｅ７（４９−５７）ペプチドで免疫したマウスからの脾臓細胞中で、ペプチドＥ７（４９−５７）に応答してＩＦＮ−γを産生する細胞または放射線照射したＴＣ１もしくはＥＬ−４細胞のＥＬＩＳＰＯＴによる測定。
【図５】ＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７タンパク質またはｐＩ：Ｃと混合したペプチドＤＴｃ／Ｅ７（４９−５７）を用いた免疫によるＣＴＬのインビボ誘発を示す図である。マウスを、ｐＩ：Ｃ（５０μｇ／マウス）の存在下で２ｎｍｏｌのＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７またはＤＴｃ／Ｅ７（４９−５７）ペプチドを静脈注射して免疫した。免疫後７日にマウスを屠殺して、脾臓細胞をＤＴｃ／Ｅ７（４９５７）ペプチドの存在または不在下で５日間培養した。ＣＴＬ活性は、ＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７＋ｐＩ：Ｃタンパク質またはＤＴｃ／Ｅ７（４９−５７）＋ｐＩ：Ｃペプチドで免疫したマウスから得た脾臓細胞培養中で、放射性標識してＤＴｃペプチドをパルスで適用したＥＬ４細胞（黒丸印）（Ａ）または放射線照射したＴＣ−１細胞（Ｂ）（白丸印を）を標的細胞として使用して、従来のクロム放出アッセイを使用して測定した。（Ｃ）ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７＋ｐＩ：ＣまたはＤＴｃ／Ｅ７（４９−５７）＋ｐＩ：Ｃで免疫したマウスからの脾臓細胞中における、Ｅ７（４９−５７）ペプチドまたは放射線照射したＴＣ１細胞もしくはＥＬ−４細胞に対して応答してＩＦＮ−γを産生する細胞の測定。
【図６Ａ】ポリＩ：Ｃ（ｐＩ：Ｃ）と組み合わせたＥＤＡ−ＨＰＶＥ７融合タンパク質の治療有効性を示す図である。マウスに５×１０５個のＴＣ−１細胞を注射して２５日後に、腫瘍の平均直径が約８ｍｍになったときに、マウスにＥＤＡを主成分とする種々のワクチンの組合せを静脈内に注射した。（Ａ）垂直な２箇所の直径の平均（ミリメートル）として表示する腫瘍サイズを、規則的な間隔で測定した。第１００日における実験に含まれたマウスの数の合計に対する腫瘍のないマウスの数、および第１００日における生存率（％）を各組の実験について示す。ＥＤＡ−Ｅ７／ｐＩ：Ｃで処置した群における腫瘍の成長とｐＩ：Ｃで処置した群における腫瘍の成長とを比較する尤度比検定により決定したｐ−値（＊ｐ＜０．０５）を示す。マウスを、腫瘍直径が２０ｍｍに達したときまたは動物の衛生状態に基づいて必要なときに屠殺した。
【図６Ｂ】（Ｂ）免疫原を示して、免疫したマウスの生存曲線を示す（ｐ値を示す（（＊ｐ＜０．０５））。２つの独立の実験をプールしたデータを示す。
【図７Ａ】大きい腫瘍モデルにおけるＥＤＡ−ＨＰＶＥ７融合タンパク質の治療的有効性を示す図である。（Ａ）ＣＳ７ＢＬ／６マウスに５×１０５個のＴＣ−１細胞を注射して３５日後に、腫瘍の平均直径が約１２〜１５ｍｍになったとき、マウスは治療せずにおくかまたは特効薬として１７５ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド（ＣＰＡ）を単回投与で与えられた。第３６日に、対照マウス群にＰＢＳまたは３０μｇのＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰを静脈注射した。ワクチン接種したマウスに５０μｇのＥＤＡ−Ｅ７および３０μｇのＣｐＧＢ／ＤＯＴＡＰを静脈注射した。ＣｐＧＢ／ＤＯＴＡＰで処置した対照群は、第５０日にシクロホスファミド、および第５１日にＣｐＧＢ／ＤＯＴＡＰの２回目の投与を受けた。治療したマウスは、第５０日にシクロホスファミドおよび第５１日にＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７／ＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰの注射により２回目のワクチン投与を受けた。
【図７Ｂ】（Ｂ）垂直な２箇所の直径の平均（ミリメートル）として表示する腫瘍サイズを、定期的間隔で測定した。第１５０日における、実験に含まれた動物の合計数に対する腫瘍のないマウスの数および第１５０日における生存率（％）を実験の各組について示す。マウスは、腫瘍直径が２２ｍｍに達したときまたは動物の衛生状態に基づいて必要なときに屠殺した。
【図７Ｃ】（Ｃ）免疫原を示して、免疫したマウスの生存曲線を示す（ｐ値を示す（（＊ｐ＜０．０５））。２つの独立の実験をプールしたデータを示す。
【発明の具体的説明】
【００３１】
本発明の複合体
本発明らは、フィブロネクチンのＥＤＡ領域とＨＰＶ−Ｅ７すなわちＥ７タンパク質の免疫原領域とを含む組替えタンパク質が、インビトロで樹状細胞の成熟を誘発し得ることに加えて、前記タンパク質を発現する腫瘍に対してＣＤ８＋Ｔ細胞により媒介される強力な抗腫瘍活性を生じ得ることを観察した。したがって、本発明の実施例１で観察されるように、前に言及した融合タンパク質と骨髄由来の樹状細胞との接触により、種々の樹状細胞成熟マーカーの発現レベルの定量から推論されるように、前記細胞の成熟が惹起される。それに加えて、本発明の実施例２で観察されるように、前記融合タンパク質の動物モデルへの投与により、Ｅ７タンパク質を発現する腫瘍細胞に対する、細胞傷害性Ｔ細胞により媒介される免疫応答を生じさせることができる。
【００３２】
したがって、第１の態様において、本発明は：
（ｉ）フィブロネクチンのＥＤＡ領域または機能的に同等なそれらの変異体、および
（ｉｉ）少なくとも１種のＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチド
を含み、
成分（ｉ）と（ｉｉ）とが共有結合してなる複合体であって、抗原性ペプチド（単数または複数）に対する細胞傷害性応答を助長する複合体（以後、本発明の複合体）に関する。
【００３３】
複合体の第１の構成要素は、フィブロネクチンのＥＤＡ領域または機能的に同等なそれらの変異体である。
【００３４】
用語「ＥＤＡ領域」または「エキストラタイプＩＩＩ」は本明細書において区別せずに使用され、フィブロネクチン遺伝子のエクソン転写／翻訳により生じて、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）に対する特異的親和性を示すフィブロネクチン分子の領域を指す。このドメインは、Ｍｕｒｏ Ａ．Ｆ．ら（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２００３，１６２：１４９−１６０）により最初に記載された。ＥＤＡ領域は、マウスフィブロネクチン（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＤ１２２５０．１）またはラットフィブロネクチン（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＢ４０８６５．１）などの異なる種から得られるフィブロネクチンから誘導することができる。
【００３５】
本明細書において使用する、「フィブロネクチン」は、血液中および組織の細胞間質中に存在する多官能性高分子量糖タンパク質として理解されている。フィブロネクチンは、Ｃ末端のジスルフィド結合により結合した２つの同一のポリペプチド鎖により形成される二量体である。各モノマーは、およその分子量が２３０〜２５０ｋＤａである。各モノマーは、３タイプの構造単位：タイプＩ、タイプＩＩおよびタイプＩＩＩを含む。これらの構造単位の各々は、２本の逆平行のβヘリックスにより形成される。
【００３６】
「機能的に同等な変異体」は、ＥＤＡ配列からの改変、１つもしくは複数のアミノ酸の挿入および／または欠失により誘導されるが、但し、ＴＬＲ４受容体への結合機能および樹状細胞を活性化する機能は実質的に保たれるこれら全てのペプチドとして理解される。機能的に同等な変異体は、フィブロネクチンＥＤＡドメインに関して、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を超える同一性を示す変異体である。２種のアミノ酸配列間の同一性の程度は、従来の方法により、例えば、例えばＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９０ Ｏｃｔ ５；２１５（３）：４０３−１０）などの当技術分野において知られた標準的配列アラインメントアルゴリズムにより決定することができる。当業者は、この記載で参照されたアミノ酸配列は、例えば、リン酸化、アセチル化などの生理学的に関連する化学的改変により、化学的に改変することができることを理解するであろう。したがって、本明細書において使用する「機能的に同等な変異体」という表現は、問題のポリペプチドまたはタンパク質が、フィブロネクチンのＥＤＡ領域の少なくとも１つの機能、好ましくは免疫応答に関する少なくとも１つの機能、特に、ＴＬＲ４と相互作用して樹状細胞の成熟を促進する能力を維持する機能を保つことを意味する。機能的に同等な変異体のＴＬＲ４と相互作用する能力は、当業者により知られた従来の方法を使用することにより決定することができる。例えば、簡単な実例として、フィブロネクチンのＥＤＡ領域の変異体がＴＬＲ４に結合する能力は、関心のあるタンパク質（例えばＥＤＡ変異体）が特異的抗体を用いて単離される共免疫沈殿実験を使用して決定することができ、該タンパク質と相互作用する分子（例えばＴＬＲ４）がそれに続いてウェスタンブロットにより同定される。自然の条件における酵母ツーハイブリッドアッセイまたは電気泳動アッセイも、使用することができる。後者の方法は、タンパク質錯体のポリアクリルアミドゲル中におけるそれらの分子量に基づく移動に基づく。移動が電
荷によっても規定されるなら、タンパク質に、変性せずにまたは他のタンパク質とそれらとの相互作用を破壊せずに正味の負の電荷を付与するクーマジーブルーを含有する溶液が陰極緩衝剤として使用される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中の第２の変性範囲により、スポットを分離して、それに続きコンプレックスを形成するサブユニットの同一性を質量分析法により同定することが可能になる。ＥＤＡの機能的と同等な変異体の樹状細胞の成熟を促進する能力を決定するアッセイは、当業者により知られており、例えば、ＩＡｂ、ＣＤ５４、ＣＤ８６およびＩＬ−１２などの種々の成熟樹状細胞マーカーの発現レベルを決定することに基づく、本出願の実施例１に記載したアッセイなどがある。
【００３７】
当業者は、ＥＤＡドメインの配列をコードするヌクレオチド配列における、タンパク質の機能性にとって決定的ではない位置においてアミノ酸の保存的置換を起こす変異は、その構造または機能性全体に影響しない進化に中性の変異であることを理解している。
【００３８】
好ましい態様において、本発明の複合体のフィブロネクチンＥＤＡ領域は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース中の受入番号ＦＩＮＣ＿ヒトで示されたヒトフィブロネクチンのアミノ酸１，６３１から１，７２１までに対応し、それは配列番号１の配列のポリペプチドに相当する。
【００３９】
本発明の複合体の成分（ｉｉ）は、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質に由来する１種または複数種の抗原性ペプチドである。Ｅ７タンパク質は、種々のＨＰＶ血清型に由来し得る。したがって、本発明の関係で使用することができるＥ７タンパク質には、ヒトＨＰＶ血清型８０（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ７５４７１．１）のタンパク質Ｅ７、ヒトＨＰＶ血清型６８（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＬ１２３５２．１）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型１１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＬ１２３４３）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型５９（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＬ１２３３５）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型３３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＬ１２３２７）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型７２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ６３８７４）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型１６（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＬ１２３１１）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型１３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＣ７９０５８）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型７３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ６３８８３）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型９６（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＱ８８２９０）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型３１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＲ１３０１５）のタンパク質Ｅ７の形質転換変異体、ヒトＨＰＶ血清型２５（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ０９１１７）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型２１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ０９１１６）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型２０（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ０９１１５）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型１４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ０９１１４）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型１２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ０９１１３）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型２７ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＥ１６２６４）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型７７（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ７５４５７）ヒトＨＰＶ血清型７６（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ７５４５７）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型７５（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ７５４５０）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿０７７１１７）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型３８（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＱ１６１１５、ＣＡＱ１６１１４、ＣＡＱ１６１１３、ＣＡＱ１６１１２、ＣＡＱ１６１１１、ＣＡＱ１６１１０、ＣＡＱ１６１０９、ＣＡＱ１６１０８、ＣＡＱ１６１０７、ＣＡＱ１６１０６、ＣＡＱ１６１０５、ＣＡＱ１６１０４、ＣＡＱ１６１０３、ＣＡＱ１６１０２、ＣＡＱ１６１０１、ＣＡＱ１６１００）の発癌性のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型９４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＦ０５７１０
）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型９５（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＦ０５７０３）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型４３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＦ０５７８４）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型５ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ４２８１８）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型１０３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＹＰ＿６５６４９３）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型１０１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＺ３９５０７）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型１０３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＺ３９４８５）のＥ７が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
本明細書において使用する表現「抗原性ペプチド」は、生体の免疫系を刺激して抗原特異的細胞または液性応答を発生させることができる１つまたは複数のエピトープを含むペプチド分子を指す。抗原性ペプチドと被験者の適当な細胞とを接触させた結果として、抗原は前記被験者に免疫応答の感度または能力を生じさせ、その結果、前記被験者から得られる抗体および免疫細胞は両方とも抗原と特異的に反応することができる。
【００４１】
本明細書において使用する表現「ＨＰＶ Ｅ７タンパク質由来の抗原性ペプチド」は、Ｅ７の発現により惹起される腫瘍の成長を阻害またはＨＰＶの増殖を阻害することができる、前記タンパク質に対する免疫応答が生ずるように哺乳動物の免疫系を刺激することができるＨＰＶ Ｅ７タンパク質フラグメントを意味する。
【００４２】
抗原（単数または複数）は、完全なＥ７タンパク質だけでなく、前記タンパク質の単離されたドメイン、Ｅ７タンパク質のペプチド断片または複数のエピトープ（例えば５から１００の異なったエピトープ）を含むポリエピトープ融合タンパク質であってよいことが観察されるであろう。該ポリペプチドは、場合により追加の区域を含むことができ、例えば、少なくとも４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、９０またはさらに１００以上の区域を含むことができて、各々は病原性物質の天然に生ずるＥ７タンパク質および／または他の区域が由来するタンパク質（単数または複数）と同じであっても異なっていてもよい天然に生ずる腫瘍抗原の一部分である。これらの区域の各々は、少なくとも８アミノ酸の長さを有することができて、各々、他の区域のエピトープと異なる少なくとも１つのエピトープ（好ましくは２つ以上）を含む。ハイブリッドポリペプチド中の少なくとも１つの（好ましくは少なくとも２または３）区域は、例えば、３、４、５、６、７またはさらに１０以上のエピトープ、特にＭＢＣクラスＩまたはクラスＩＩに結合するエピトープを含むことができる。２または３以上の区域は、ハイブリッドポリペプチドに近接することができる；すなわち、それらは、それらの間にスペーサなしで端末間で結合することができる。あるいは、任意の２つの隣接する区域は、アミノ酸のスペーサまたはペプチドのスペーサにより結合することができる。
【００４３】
表ＩはＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチドの例である。
【００４４】
【表１】
【００４５】
当業者は、ＨＰＶ Ｅ７ペプチドが抗原性であるかどうかを決定する種々の方法、例えば、実施例２で使用する方法（ＥＬＩＳＰＯＴ）またはＴリンパ球により媒介される標的抗原性ペプチドの活性を検出するインビトロのプロセスを記載する特許ＥＰ１３３４１７７−Ｂ１に記載された方法について知っている。
【００４６】
好ましい態様において、本発明の複合体の一部を形成する抗原性ペプチドは、ＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質から誘導される。
【００４７】
本発明の複合体の特定の態様において、後者は、Ｅ７のアミノ酸の第１〜２９番まで（配列番号５１）に対応するまたはそれを含むＨＰＶ Ｅ７タンパク質由来の抗原性ペプチド、Ｅ７のアミノ酸第４３〜９８番まで（配列番号５２）に対応するまたはそれを含む抗原性ペプチドまたはそれら両方を含む。
【００４８】
本発明の複合体の特定の態様において、ＥＤＡ領域には、２つのＨＰＶ Ｅ７抗原性ペプチドが並んで配置されている。さらにより好ましい態様において、融合タンパク質の配列は配列番号５３または配列番号７２である。
【００４９】
特定の態様において、成分ｉｉ）は、単独のポリペプチド鎖をまたは成分ｉ）とともに融合タンパク質を形成する。
【００５０】
本発明の融合タンパク質の単離および精製を容易にする目的で、前記融合タンパク質は、所望であれば、融合タンパク質を単離または精製する目的のために使用することができるタグペプチドなどの追加のペプチドを含有することができる。前記タグペプチドは、ポリペプチド（ｉ）および（ｉｉ）のいずれの機能性も変化させない、融合タンパク質の任意の位置に所在することができる。限定するものではない例示として、前記タグペプチドは、タグペプチドのＣ末端が本発明の複合体のＮ末端に結合するように、本発明の複合体のＮ末端位に所在することができる。あるいは、タグペプチドは、タグペプチドのＮ末端が本発明の複合体のＣ末端に結合するように、本発明の複合体のＣ末端位に所在することができる。実質的には、融合タンパク質の単離または精製を可能にする任意のペプチドまたはペプチド配列を使用することができる、例えば、ポリヒスチジン配列、生じた融合タンパク質を免疫アフィニティクロマトグラフィーにより精製するのに役立ち得る抗体により認識され得るペプチド配列、例えばタグペプチドなど、例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＲＡ）由来のエピトープ（Ｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． ＢｉｏＩ．，８：２１５９−２１６５）、Ｃ−ｍｙｃおよびそれに対する抗体８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０（Ｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５：３６１０−３６１６）；単純ヘルペスウイルスＤ（ｇＤ）タグタンパク質およびそれらの抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ３：５４７−５５３）などである。他のタグペプチドには、フラッグペプチド（Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．， １９８８， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６：１２０４−１２１０）およびＫＴ３エピトープ（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５５： １９２−１９４）が含まれる。タグペプチドは、一般的に、アミノまたはカルボキシ末端に配列される。
【００５１】
当業者は、フィブロネクチンのＥＤＡ領域がその樹状細胞を活性化する性質を保ち、且つＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチドの領域（単数または複数）が抗原性の性質を保つ限り、本発明の複合体の異なった構成要素は任意の順で置かれてよいことを認識するであろう。
【００５２】
したがって、常にＮ末端からＣ末端方向へと構成要素の配置を示す、本発明の複合体の構成要素の配列の例は、とりわけ：
・ＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチド−フィブロネクチンＥＤＡ、
・フィブロネクチンＥＤＡ−ＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチド、
・フィブロネクチンＥＤＡ−ＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチド−フィブロネクチンＥＤＡ、
・ＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチド−フィブロネクチンＥＤＡ−ＨＰＶ３５Ｅ７由来の抗原性ペプチド、
・最後の２つの反復
である。
【００５３】
当業者は、本発明の複合体を形成する構成要素、すなわち、ＥＤＡペプチドと少なくとも１種のＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチドとが、直接複合体化し得るかまたは、あるいは、それらが前記成分間のリンカーとしてはたらく追加のアミノ酸配列を含有し得ることを理解するであろう。本発明により、前記中間アミノ酸配列は、前記ドメイン間の蝶番部としてはたらき、それらが個々のドメインの３次元形態を保ちながら互いに独立に動くことを可能にする。
この意味で、本発明による好ましい中間アミノ酸配列は、この運動を可能にする構造的延性により特徴づけられる蝶番部であろう。特定の態様において、前記中間アミノ酸配列は柔軟性リンカーである。好ましい態様において、前記柔軟性リンカーは、２０アミノ酸以下の長さの柔軟性リンカーペプチドである。
【００５４】
リンカー領域の効果は、ＥＤＡペプチドと成分（ｉｉ）との間にスペースを提供することである。したがって、ＥＤＡペプチドの二次構造は成分（ｉｉ）の存在により影響されずおよび逆も成り立つことが保証される。スペーサは、好ましくはポリペプチドの性質のものである。リンカーペプチドは、好ましくは、少なくとも２アミノ酸、少なくとも３アミノ酸、少なくとも５アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも７０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも９０アミノ酸または約１００アミノ酸を含む。
【００５５】
より好ましい態様において、リンカーペプチドは、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群から選択される２つ以上のアミノ酸を含む。本発明の好ましい態様において、前記柔軟性リンカーは、ポリグリシンリンカーである。リンカー／スペーサの可能な例には、ＡＧＳＳＴＧＳＳＴＧＰＧＳＴＴ（配列番号：５５）またはＧＧＳＧＧＡＰ（配列番号５６）が含まれる。これらの配列は、設計して巻いたコイルを他のタンパク質ドメインに結合するために使用されてきた（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｋ．Ｍ．，Ａｒｎｄｔ，Ｋ．Ｍ．ａｎｄ Ａｌｂｅｒ，Ｔ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｉｍｏｌｏｇｙ， ２０００， ３２８：２６１−２８１）。好ましくは、前記リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＶＥＧＧＧ（配列番号５７）を含むかまたはそれからなる。
【００５６】
リンカーは、本発明の複合体の２つの成分の上下流に隣接する成分に共有結合により結合することができる。スペーサは、本質的に非免疫原性であり、および／またはタンパク分解されやすくなく、および／またはシステイン残基を全く含まないことが好ましい。同様に、スペーサの３次元構造は、好ましくは線状または実質的に線状である。
【００５７】
スペーサまたはリンカーペプチドの好ましい例として、結合したタンパク質の機能を実質的に損なわずにまたは結合したタンパク質の少なくとも一方の機能を実質的に損なわずに、タンパク質を結合するために使用されてきたものが挙げられる。スペーサまたはリンカーは巻かれたコイル構造を含むタンパク質を結合するためにより好ましく使用されてきた。
【００５８】
リンカーは、テトラネクチン中でβ−シートを形成するテトラネクチン残基５３〜５６、およびテトラネクチン中で折り返しを形成する残基５７〜５９を含むことができる（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｂ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１２：３８８−３９６，１９９７）。セグメントの配列はＧＴＫＶＨＭＫ（配列番号５８）である。このリンカーは、天然テトラネクチン中に存在するとき、３量化ドメインがＣＲＤドメインと結合しており、それ故それは、一般的に３量化ドメインを他のドメインに接続するのに適するという利点を有する。さらに、生じる構築物は、リンカーのない構築物より免疫原性が強くないと期待される。
【００５９】
あるいは、適当なリンカーペプチドは、マウスＩｇＧ３の上方蝶番部の１０アミノ酸残基の配列を基礎に形成することができる。このペプチド（ＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳ、配列番号５９）は、巻かれたコイルによる２量化した抗体の産生のために使用されたことがあり（Ｐａｃｋ Ｐ． ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．， １９９２， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：１５７９−１５８４）、本発明によるスペーサペプチドとして有用であり得る。さらにより好ましくは、それは、ヒトＩｇＧ３の上方蝶番部の対応する配列であり得る。ヒトＩｇＧ３の配列は、ヒトにおいて免疫原性ではないと期待される。本発明の複合体で使用することができるさらなるリンカーペプチドには、配列ＡＰＡＥＴＫＡＥＰＭＴ（配列番号６０）のペプチドおよび配列ＧＡＰのペプチドが含まれる。
【００６０】
あるいは、本発明の複合体の２つの成分は、配列がプロテアーゼの切断標的を含むペプチドにより接続することができ、したがって成分（ｉｉ）のＥＤＡペプチドの分離が可能になる。本発明のポリペプチドに組み込むのに適したプロテアーゼ切断部位には、エンテロキナーゼ標的部位（配列ＤＤＤＤＫ配列番号６１）、Ｘａ因子標的部位（切断部位ＩＥＤＧＲ、配列番号６２）、トロンビン標的部位（切断部位ＬＶＰＲＧＳ、配列番号６３）、プロテアーゼＴＥＶ標的部位（切断部位ＥＮＬＹＦＱＧ、配列番号６４）、切断用プロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ）標的部位（切断部位ＬＥＶＬＦＱＧＰ、配列番号６５）およびインテイン標的部位等が含まれる。
【００６１】
本発明の複合体を得る方法
本発明の複合体は、当業者に知られた任意の方法を使用して得ることができる。したがって、ＥＤＡペプチドまたは前記タンパク質の変異体を任意の標準的方法により得ることは可能である。例えば、ＥＤＡペプチドは、ｃＤＮＡから、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、出芽酵母（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、メタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの異種生体中における発現により得ることができる。
【００６２】
十分な量の精製されたＥＤＡペプチドが利用可能になれば、後者をＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチド（単数または複数）と複合体化しなければならない。成分（ｉｉ）とＥＤＡ分子との複合体化は、種々の方法で実施することができる。一つの可能性は、官能基を治療的有効成分に、前記成分の活性を妨げない位置で直接結合することである。本発明において理解される官能基とは、前記分子の特徴的化学的反応に寄与する、分子中の特別の原子団のことである。官能基の例として、ヒドロキシ、アルデヒド、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、カルボキサミド、第一級、第二級、第三級および第四級アミン、アミノキシ、アジド、アゾ（ジイミド）ベンジル、カーボネート、エステル、エーテル、グルオキシリル、ハロアルキル、ハロホルミル、イミン、イミド、ケトン、マレイミド、イソシアニド、イソシアネート、カルボニル、ナイトレート、ナイトライト、ニトロ、ニトロソ、ペルオキシド、フェニル、ホスフィン、ホスフェート、ホスホノ、ピリジル、スルフィド、スルホニル、スルフィニル、チオエステル、チオールおよび酸化された３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）基が挙げられるが、これらに限定されない。前記基の例は、ＡｐｏＡ分子中でチオール基と特異的に反応するマレイミドまたはグリオキシリル基、およびＥＤＡ分子および成分（ｉｉ）中の第一級アミノ基と反応する、酸化された３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）基である。
【００６３】
もう一つの可能性は、成分（ｉｉ）とＥＤＡ分子とを、ホモまたはヘテロの二官能性基により複合体化することである。二官能性基は、最初に治療的有効化合物に結合し、次に、ＥＤＡペプチドと複合化することができ、または、別の方法で、二官能性基をＥＤＡペプチドに結合させて、次に、後者を成分（ｉｉ）と複合体化することが可能である。このタイプの複合体の実例には、ケトン−オキシムとして知られる複合体が含まれ（ＵＳ２００５０２５５０４２中に記載されている）、その場合、複合体の第１成分は、ヘテロの二官能性基中に存在するケトン基に結合しているアミノキシ基を含み、ヘテロの二官能性基は、順送りで複合体の第２成分中のアミノ基と結合している。
【００６４】
他の態様において、本発明の複合体の成分（ｉ）と（ｉｉ）とを複合体化するために使用される作用剤は、光分解で、化学的に、熱的にまたは酵素的に処理することができる。特に、治療的に有効な化合物だけが細胞中に放出されるように、標的細胞中にある酵素により加水分解され得る連結剤の使用は、興味がある。細胞内で処理され得る連結剤のタイプの例は、ＷＯ０４０５４６２２、ＷＯ０６１０７６１７、ＷＯ０７０４６８９３およびＷＯ０７１１２１９３に記載されている。
【００６５】
好ましい態様において、本発明の複合体の成分（ｉｉ）は、オリゴペプチドおよびペプチドの両方を含むペプチド性の化合物であるから、当業者にとって周知であり、システイン部分に存在するチオール基による複合化に基づく方法、リシン部分に存在する第一級アミノ基による複合化に基づく方法（ＵＳ６８０９１８６）、Ｎ−末端部分とＣ末端部分とによる複合化に基づく方法を含む、ポリペプチド鎖を化学的に改質する方法を使用することができる。ポリペプチドを改質してそれらの他の化合物とのカップリングを可能にするために適した試薬には：グルタルアルデヒド（ポリペプチドのＮ末端に化合物を結合することを可能にする）、カルボジイミド（ポリペプチドのＣ末端に化合物を結合することを可能にする）、Ｎ末端およびシステイン部分の活性化を可能にするスクシンイミドエステル（例えばＭＢＳ、ＳＭＣＣ）、チロシン部分の活性化を可能にするベンジジン（ＢＤＢ）、これらのグリコシル化されたタンパク質中の炭水化物部分の活性化を可能にする過ヨウ素酸塩が含まれる。
【００６６】
本発明のポリヌクレオチド、遺伝子構築物、ベクターおよび宿主細胞
ＥＤＡ成分およびＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチド（単数または複数）が単一のペプチド鎖を形成する特定の事象において、前記複合体をコードするポリヌクレオチドを使用する単一ステップでの複合体の発現は可能である。したがって、他の態様において、本発明は、本発明の複合体をコードするポリヌクレオチドに関する。当業者は、本発明のポリヌクレオチドが、成分（ｉｉ）とＥＤＡポリペプチドまたはその機能的に同等な変異体とが単一のペプチド鎖を形成するこれらの複合体だけを、相対的位置関係とは独立に且つ両成分が直接連結しているかまたはスペーサ領域により分離しているかという事実とは独立にコードすることを理解するであろう。
【００６７】
本発明において使用する用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さで、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドにより形成されたヌクレオチドのポリマー形態を指す。該用語は、一本鎖および二重螺旋ポリヌクレオチド、並びに改変ポリヌクレオチド（メチル化された、保護された等）を含む。
【００６８】
他の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物（本明細書においては今後本発明の遺伝子構築物と称する）に関する。構築物は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する配列に機能的に結合した本発明のポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドが発現する細胞と適合性であれば、原則として、任意のプロモーターを本発明の遺伝子構築物のために使用することができる。したがって、本発明を実施するのに適したプロモーターには、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ＣＭＶ、トリ肉腫ウイルス、肝炎Ｂウイルスなど真核生物のウイルスのゲノムに由来するものなどの構成型プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、レトロウイルスＬＴＲ領域、免疫グロブリン遺伝子プロモーター、アクチン遺伝子プロモーター、ＥＦ−１α遺伝子プロモーター、並びにタンパク質発現が分子またはテトラサイクリン系、ＮＦＫＢ／ＵＶ光系、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系などの外因性シグナルの添加に依存する誘発性プロモーターおよびヒートショック遺伝子プロモーター、ＷＯ／２００６／１３５４３６に記載された調節性ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター並びに組織特異的プロモーターが含まれるが、これらに必ずしも限定されない。
【００６９】
組織特異的なプロモーターの他の例として、アルブミン遺伝子プロモーター（Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ， ７１：５１２４−３２）、肝炎ウイルスコアプロモーター（Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ３：１００２−９）；α−フェトプロテイン遺伝子プロモーター（Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３−１４）およびチロキシン結合グロブリン結合タンパク質遺伝子プロモーター（Ｗａｎｇ，Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１１５６３−１１５６６）が挙げられる。本発明の構築物は、好ましくは、ＣＤ１１ｃプロモーター（Ｍａｓｏｏｄ，Ｒ．， ｅｔ ａｌ． ２００１． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ８：３３５−３４３； Ｓｏｍｉａ，Ｎ．Ｖ．， ｅｔ ａｌ． １９９５． Ｐｒｏｃ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：７５７０−７５７４）、ファシンプロモーター （Ｓｕｄｏｗｅ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， ２００６． Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：１９６−２０３）、ＣＤ８３遺伝子プロモーター、ＣＤ３６遺伝子プロモーターまたはデクチン−２プロモーター（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ２００１， ８：１７２９−１７３７）などの樹状細胞特異的プロモーターを含有する。
【００７０】
本発明のポリヌクレオチドまたはそれを形成する遺伝子構築物は、ベクターの一部を形成することができる。したがって、他の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物を含むベクターに関する。当業者は、前記ベクターは、適当なポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築物を増殖して得るのに適したクローニングベクターまたは複合体の精製に適した種々の異種の生物体における発現ベクターであることができるので、使用することができるベクターのタイプに関して限定はないことを理解するであろう。したがって、本発明による適当なベクターには、ＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏＩＥＩ、ｐＣＲＩ、ＲＰ４、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのファージおよびシャトルベクターなどの原核細胞における発現ベクター、２−ミクロンプラスミドタイプベクター、統合プラスミド、ＹＥＰベクター、セントロメアプラスミドなどの酵母における発現ベクター、ｐＡＣシリーズおよびｐＶＬシリーズのベクターなどの昆虫細胞における発現ベクター、ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥシリーズのベクターなどの植物における発現ベクター、およびウイルスベクター（アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス並びにレトロウイルスおよびレンチウイルス）並びにｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦＩ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅ０２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸＩ、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴＩなどの非ウイルスベクターのいずれかに基づく上位真核細胞（ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌ）における発現ベクターが含まれる。
【００７１】
本発明のベクターは、前記ベクターにより形質転換、形質移入または感染され得る細胞に、形質転換、形質移入または感染するために使用することができる。前記細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。例として、前記ＤＮＡ配列を導入することができるベクターは、プラスミドまたはＤＮＡ配列が宿主細胞中に導入されたとき、それが前記細胞のゲノム中に組み込まれて染色体（またはクロモソ−ム）と一緒に複製されるベクターであってよい。前記ベクターは、当業者により知られた従来の方法により得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ２００１， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， ｔｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． Ｖｏｌ １−３ａ）。
【００７２】
それ故、他の態様において、本発明は、本発明により提供される構築物またはベクターにより形質転換、形質移入または感染することができた、本発明のポリヌクレオチド、遺伝子構築物またはベクターを含む細胞に関する。形質転換、形質移入または感染した細胞は、当業者により知られた従来の方法により得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１、前出）。特定の態様において、前記宿主細胞は、適当なベクターで形質移入または感染した動物細胞である。
【００７３】
本発明の複合体の発現に適した宿主細胞には、哺乳動物、植物、昆虫、真菌および細菌の細胞が含まれるが、これらに限定されない。細菌の細胞には、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の種などのグラム陽性細菌の細胞、並びにエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属などのグラム陰性細菌の細胞が含まれるが、これらに限定されない。真菌細胞は、好ましくはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）などの酵母細胞を含む。昆虫細胞には、ショウジョウバエ細胞およびＳｆ９細胞が含まれるが、これらに限定されない。植物細胞には、とりわけ、穀類、薬用、観賞用または球根状植物などの作物植物細胞が含まれる。本発明に適した哺乳動物細胞には、上皮細胞ライン（ブタその他）、骨肉腫細胞ライン（ヒトその他）神経芽細胞腫の細胞ライン（ヒトその他）、上皮癌（ヒトその他）、グリア細胞（マウスその他）、肝細胞ライン（サルその他）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１細胞、ＡＴ１０８０細胞、Ａ５４９細胞、２９３細胞またはＰＥＲ．Ｃ６細胞、ヒトＥＣＣ ＮＴＥＲＡ−２細胞、ｍＥＳＣラインのＤ３細胞、ＨＳ２９３およびＢＧＶ０１、ＳＨＥＦ１、ＳＨＥＦ２およびＨＳ１８１などのヒト胚幹細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、２９３Ｔ細胞、ＲＥＨ細胞およびＭＣＦ−７細胞およびｈＭＳＣ細胞が含まれる。
【００７４】
本発明の免疫原性組成物
本発明者らは、本発明の複合体とＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストとの組合せにより、前記成分の各々が別々に投与されたときに得られるよりも大きい免疫応答が生ずることが可能になることを観察した。したがって、実施例３で観察されるように、ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７融合タンパク質およびポリＩ：Ｃにより形成した組成物は、融合タンパク質だけが投与されるときには治療可能ではない腫瘍を根絶することができる。
【００７５】
したがって、他の態様において、本発明は：
（ｉ）本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明による宿主細胞、および
（ｉｉ）ＴＬＲリガンド
を一緒にまたは別々に含む組成物（本明細書において以後、本発明の組成物１または本発明の第１組成物と称する）に関する。
【００７６】
本発明の第１組成物の一部を形成する成分のモル濃度は変えることができるが、２成分のモル濃度の比は、好ましくは、５０：１と１：５０との間、より好ましくは２０：１と１：２０との間、１：１０と１０：１との間、５：１と１：５との間に含まれる。
【００７７】
組成物の第１成分ｉ）は、本発明のペプチドに関連して詳細に記載した。好ましい特定の態様において、前記第１成分は、ヒト由来のフィブロネクチンのＥＤＡ領域を含む。他の態様において、本発明の組成物の第１成分は、Ｅ７タンパク質のアミノ酸１から２９までおよび／またはＥ７タンパク質のアミノ酸４３から９８までを含む。さらにより好ましい態様において、本発明の組成物を形成する複合体の第１成分は、配列番号５３または配列番号７２で記載される２種のＨＰＶ Ｅ７抗原性ペプチドが側面に接するＥＤＡ領域を含む（それに加えて６ヒスチジンタグを含む）。
【００７８】
本発明において、「ＴＬＲ受容体リガンド」は、少なくとも１種のＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）受容体に特異的に結合して、結合すると前記受容体とその天然リガンドとの結合に特徴的な副刺激シグナルまたは前記受容体とＴＬＲアゴニストとの結合の結果生ずる他のシグナルのあるものを刺激することができる分子と理解される。
【００７９】
Ｔｏｌｌ様受容体（またはＴＬＲ）は、生来の免疫系の一部を形成するＩ型膜貫通タンパク質のファミリーである。脊椎動物において、それらは免疫系の適応も可能にする。ＴＬＲはインターロイキン受容体と一緒になって、インターロイキン−１／Ｔｏｌｌ様受容体スーパーファミリーとして知られるスーパーファミリーを形成する。このファミリーの全ての構成員は、Ｔｏｌｌ−ＩＬ−１受容体（ＴＩＬ）ドメインと呼ばれるドメインを共通して有する。
【００８０】
大部分の哺乳動物は、１０ないし１５タイプのＴＬＲを有すると見積もられている。今までに１３タイプのＴＬＲが、ヒトおよびマウスにおいて同定された（Ｄｕ Ｘ， ｅｔ ａｌ． ２０００， Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ． １１：３６２−７１； Ｃｈｕａｎｇ ＴＨ． ｅｔ ａｌ．， ２０００． Ｅｕｒ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．１１：３７２−３７８； Ｔａｂｅｔａ Ｋ， ｅｔ ａｌ．； ２００４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １０１：３５１６−３５２１）。
【００８１】
ＴＬＲリガンドは、ＴＬＲが発現した細胞に依存して、並びにＴＬＲリガンドの起源に依存して幾つかの免疫応答を誘発する。例えば、微生物のリガンドの場合に、免疫細胞は、炎症を惹起するサイトカインを産生し得る。ウイルス因子の場合には、細胞はアポトーシスを起こし得る。
【００８２】
特定の態様において、リガンドは、アゴニストリガンドである。ＴＬＲ受容体のアゴニストリガンドは、（ｉ）実際のＴＬＲ受容体の天然リガンド、もしくはＴＬＲ受容体に結合してそれらで副刺激シグナルを誘発する能力を保存する機能的に同等なそれらの変異体、または（ｉｉ）ＴＬＲ受容体に対するアゴニスト抗体、またはＴＬＲ受容体に、より特定すれば、前記受容体の細胞外ドメインに特異的に結合して、この受容体により制御される免疫シグナルのあるものおよび関連するタンパク質を誘発することができる機能的に同等なそれらの変異体である。結合特異性は、ヒトＴＬＲ受容体またはヒトに相同の異種のＴＬＲ受容体に対するものであってよい。
【００８３】
種々のＴＬＲのリガンドの例を表２に体系的に示す。
【００８４】
【表２】
【００８５】
当業者が理解するように、ＴＬＲ受容体のアゴニストリガンドおよび一般的にはリガンドの活性を検出するのに利用できる、樹状細胞のインビトロ同時刺激などの非常に種々の免疫アッセイがある。簡単に説明すると、前記アッセイは、培養した樹状細胞とＴＬＲアゴニストリガンドとを接触させて、前記細胞の活性化を測定することからなる。前記活性化は、受容体がＴＬＲ３である場合に、何らかのマーカー、例えばポリ（Ｉ：Ｃ）の検出により決定することができる。活性化された樹状細胞は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）およびＣＤ４０などの種々のタンパク質を発現する。したがって、例えばＣｈｅｎ Ｘ．Ｚ．ら（Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ． ２００９ Ｊｕｌ ４、印刷前の電子出版）により記載されているように、前記リガンドに曝した後の樹状細胞における前記タンパク質の発現レベルの変化を検出することにより、ＴＬＲアゴニストリガンドのアゴニスト活性を検出することが可能である。
【００８６】
他の好ましい特定の態様において、ＴＬＲリガンドは、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ９リガンドおよび両者の組合せの群から選択される。より好ましい方法において、ＴＬＲ３リガンドはポリ（Ｉ：Ｃ）（ポリイノシン酸−ポリシチジル酸またはポリイノシン酸−ポリシチジル酸ナトリウム塩）である。
【００８７】
他の好ましい態様において、ＴＬＲ９リガンドは、少なくとも１種のＣｐＧモチーフ、より好ましくはタイプＢＣｐＧ−ホスホロチオエート（ＣｐＧ１８２６：５’ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’配列番号６６）を含むオリゴヌクレオチドである。
【００８８】
本発明者らは、本発明の複合体が、ＴＬＲリガンドおよび化学療法剤の使用により得られる抗腫瘍応答を改善し得ることを観察した。具体的に、本発明の図７は、ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７融合タンパク質、ＴＬＲ９リガンドＣｐＧおよびシクロホスファミドを含む組成物の投与が、如何にシクロホスファミドおよびＴＬＲ９リガンドの投与を超える腫瘍サイズ縮小を生ずるかを示す。
【００８９】
したがって、他の態様において、本発明は：
（ｉ）本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明による宿主細胞、
（ｉｉ）ＴＬＲリガンド、および
（ｉｉｉ）化学療法剤
を含む、本発明の組成物（本明細書において以後、本発明の組成物２または本発明の第２組成物と称する）に関する。
【００９０】
本発明の第２組成物の成分（ｉ）（本発明の複合体）および（ｉｉ）（ＴＬＲリガンド）は、前節で詳細に説明した。
【００９１】
「化学療法剤」は、細胞を必ずしも殺さずに細胞増殖を阻害し得る任意の物質または細胞死を誘発し得る任意の物質と理解される。細胞死を惹起せずに細胞増殖を阻害することができる作用剤は、細胞分裂抑制剤と総称され、それに対してアポトーシスを活性化することにより細胞死を正常に誘発することができるものは、細胞傷害性薬物と総称される。本発明の組成物における使用に適した化学療法剤の例として、（ｉ）タキサン、パクリタキセルム、ドセタキセル、エポチロンおよびラウリマリドなどの微小管安定剤、（ｉｉ）イレッサ（登録商標）、グリベック、Ｔａｒｃｅｖａ（商標）、（エルロチニブＨＣＩ）、ＢＡＹ−４３−９００６などのキナーゼ阻害剤、（ｉｉｉ）トラツツマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎｍ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｓａｎ（登録商標））、ペルツツマブ（Ｏｍｎｉｔａｒｇ（商標）を含むが、これらに限定されないキナーゼ活性を有する受容体特異的抗体；（ｉｖ）ラパマイシンおよびＣＣＩ−７７８などのｍＴＯＲ経路阻害剤；（ｖ）Ａｐｏ２Ｌ／Ｔｒａｉｌ、（ｖｉ）エンドスタチン、コンブレタスタチン、アンジオスタチン、トロンボスポンジンなどの抗血管形成剤および血管内皮成長阻害剤（ＶＥＧＩ）；（ｖｉｉ）活性化Ｔ細胞、非特異的免疫刺激剤（例えばインターフェロン、インターロイキン）を含む抗新生物ワクチン；（ｖｉｉｉ）ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ミトマイシンおよびミトザントロンなどの抗生物質細胞傷害性薬物；（ｉｘ）メルファラン、カルムスチン、ロムスチン、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、ホテムスチン、ブスルファン、テモゾロミドおよびチオテパなどのアルキル化剤；（ｘ）ニルタミド、酢酸シプロテロン、アナストロゾール、エキセメスタン、タモキシフェン、ラロキシフェン、ビカルタミド、アミノグルテチミド、酢酸リュープロレリン、クエン酸トレミフェン、レトロゾール、フルタミド、酢酸メゲストロールおよび酢酸ゴセレリンなどの抗新生物ホルモン剤；（ｘｉ）酢酸シプロテロンおよび酢酸メドロキシプロゲステロンなどの生殖腺ホルモン；（ｘｉｉ）シタラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、トポテカン、ヒドロキシウレア、チオグア
ニン、メトトレキセート、コラスパーゼ（Ｃｏｌａｓｐａｓｅ）、ラルチトレキセドおよびカペシタビンなどの抗代謝物；（ｘｉｉｉ）ナンドロロンなどのタンパク質同化剤；（ｘｉｖ）酢酸メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ヒドロコーチゾン、プレドニゾロンおよびプレドニゾンなどの副腎ステロイドホルモン；（ｘｖ）カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、エトポシドおよびデカルバジンなどの抗新生物薬、および（ｘｖｉ）トポテカンおよびイリノテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
如何なる理論にも拘束されることは望まず、化学療法剤は、適当な用量で投与されるとき、調節性Ｔ細胞の不活性化により間接的に免疫刺激剤として作用することができると思われる。
【００９３】
好ましい態様において、化学療法剤は、細胞分裂抑制剤であり、より好ましくは、それは、シクロホスファミドまたはシクロホスファミドアナログである。シクロホスファミドアナログは、文献で周知である（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ， Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，１１ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ ４２９−４３０；文書ＵＳ５１９０９２９）。
【００９４】
本明細書において今後、用語「本発明の組成物」は、場合により、本発明の第１組成物および本発明の第２組成物の両方を指す。当業者が理解するように、本発明の組成物は、単一成分として剤形化するか、あるいは組み合わせてそれらを続けて投与できる別々の剤形として提供することができる。本発明の組成物は、キットの一部として提供することもでき、キット中の成分は個別に剤形化されるが、単一の容れ物の中に梱包される。
【００９５】
本発明の複合体および組成物の医学的使用
本研究者達は、本発明の複合体が、樹状細胞の成熟を誘発し、ペプチドに対するインビボの抗腫瘍免疫応答の活性化を誘発して、ＨＰＶＥ７タンパク質を発現している十分発育した大きい腫瘍を根絶することができることを観察した（本発明の実施例１から３を参照されたい）。
【００９６】
それ故、他の態様において、本発明は、医学において使用するための本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクターまたは本発明の組成物に関する。
【００９７】
他の態様において、本発明は、医薬組成物、すなわち、本発明の融合タンパク質、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の組成物および少なくとも１種の薬学的に許容し得る担体またはアジュバントを含む本発明の医薬組成物に関する。
【００９８】
「アジュバント」は、本発明の医薬組成物の効能を強化する任意の物質と理解される。
【００９９】
アジュバントの例として、水酸化アルミニウム、アルミニウムホスフェート、アルミニウム硫酸塩などのアルミニウム塩（ミョウバン）により形成されるアジュバント、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）並びに不完全なフロイントアジュバント（ＩＦＡ）などの水中油または油中水エマルションの剤形；鉱物ゲル；ブロックコポリマー、アブリジン（商標）、ＳＥＡＭ６２；細菌細胞壁の成分により形成されたアジュバント、例えば、リポ多糖（例えば、リピドＡもしくはモノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ））、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）の成分などを含むアジュバントなど、熱ショックタンパク質もしくはそれらの誘導体をを含むアジュバント；ジフテリア毒素（ＤＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、コレラ毒素（ＣＴ）大腸菌の熱に不安定な毒素（ＬＴ１およびＬＴ２）、シュードモナス・内毒素Ａおよび外毒素、Ｂ．セレウス（ｃｅｒｅｕｓ）細胞外酵素Ｂ、Ｂ．スファエリクス（ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）毒素、Ｃ．ボツリヌス毒素Ｃ２およびＣ３、Ｃ．リモスム（ｌｉｍｏｓｕｍ）、Ｃ．ペルフリンゲンス（ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、Ｃ．スピリフォルマ（ｓｐｉｒｉｆｏｒｍａ）およびＣ．ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細胞外酵素並びに毒素、ＥＤＩＭおよび、ジフテリア毒素の無毒性変異体であるＣＲＭ−１９７変異体などの変異体毒素を含む細菌毒素のＡＤＰ−リボシル化から誘導されたアジュバント；ＩＳＣＯＭ（免疫刺激錯体）などサポニン；ケモカイン、キモカインおよびサイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ−ＩＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、その他）、インターフェロン（インターフェロンγなど）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；デフェンシン（ｄｅｆｅｎｓｉｎ）１または２、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、ＭＩＰ１−α、およびＭＥＰ−２、ムラミルペプチド、例えば、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓ−ｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）など；ＣｐＧ分子、ＣｐＧジヌクレオチドおよびＣｐＧモチーフを含む合成オリゴヌクレオチドのファミリーから誘導されるアジュバント；Ｃ．リモスム（Ｃ．ｌｉｍｏｓｕｍ）細胞外酵素および合成アジュバント例えばＰＣＰＰなど、コレラ毒素、サルモネラ毒素、ミョウバン等、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、ＭＴＰ−ＰＥおよび；細菌から抽出された３成分、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％／ツイーン８０添加スクワレンエマルション中に含むＲＩＢＩが挙げられるが、これらに限定されない。アジュバントの他の例として、ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物）、完全および不完全フロイントアジュバントおよびクイル（Ｑｕｉｌ）Ａが挙げられる。
【０１００】
用語「担体」は、有効成分がそれとともに投与される希釈剤または賦形剤を指す。そのような薬学的担体は、滅菌液体、例えば、水および石油、動物、植物または合成起源の油を含む油、例えば、ピーナツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など油であってよい。水または食塩の水溶液並びにデキストロ−スおよびグリセリンの水溶液は、特に注射用溶液のために担体として好ましく使用される。適当な薬学的担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（１９９５）に記載されている。本発明の担体は、連邦または州政府の規制当局により承認されたかまたは米国薬局方または動物、より特定すればヒトで使用するために一般的に認められた他の薬局方にリストされていることが好ましい。
【０１０１】
本発明の医薬組成物の所望の薬学的投与形態を製造するために必要な担体および補助物質は、とりわけ、選択された薬学的投与形態に依存するであろう。医薬組成物の前記薬学的投与形態は、当業者により知られた従来の方法にしたがって製造される。有効成分の種々の投与方法、使用すべき賦形剤およびそれらを製造するための工程の総説は、「Ｔｒａｔａｄｏ ｄｅ Ｆａｒｍａｃｉａ Ｇａｌｅｎｉｃａ」、Ｃ．Ｆａｕｌｉ ｉ Ｔｒｉｌｌｏ、Ｌｕｚａｎ ５、Ｓ．Ａ．ｄｅ Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ、１９９３に見出すことができる。医薬組成物の例として、経口、局所または非経口的投与のための任意の固体（錠剤、ピル、カプセル、顆粒、その他）または液体（溶液、懸濁液またはエマルション）組成物が挙げられる。さらに、医薬組成物は、適当な安定剤、懸濁液、防腐剤、界面活性剤等を含有することができる。
【０１０２】
医薬中で使用するために、本発明の複合体は、プロドラッグ、塩、溶媒和物またはクラスレートの、単離されているかまたは追加の活性な作用剤との組合せのいずれかの形態で見出すことができる。本発明による化合物の組合せは、薬学的観点から許容される賦形剤と一緒に剤形化することができる。本発明において使用するために好ましい賦形剤には、糖類、デンプン、セルロース、ガムおよびタンパク質が含まれる。特定の態様において、本発明の医薬組成物は、固体（例えば錠剤、カプセル、コートされた錠剤、顆粒、坐剤、再構成して液体形態を提供することができる滅菌された結晶性または非晶質の固体、その他）、液体（例えば溶液、懸濁液、エマルション、エリキシル、ローション、軟膏その他）または半固体（ゲル、ポマード、クリーム剤等）の薬学的投与形態に剤形化することができる。本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸経路を含むが、これらに限定されない任意の経路により投与することができる。有効成分、使用すべき賦形剤の投与およびそれらを製造するための工程の種々の形態の総説は、Ｔｒａｔａｄｏ ｄｅ Ｆａｒｍａｃｉａ ＧａｌＥｍｉｃａ， Ｃ． Ｆａｕｌｉ ｉ Ｔｒｉｌｌｏ， Ｌｕｚａｎ ５， Ｓ．Ａ． ｄｅ Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ， １９９３ ａｎｄ ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．），２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ＰＡ，ＵＳＡ（２０００）に見出すことができる。薬学的に許容し得る担体の例は、当技術分野において知られており、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水エマルションなどのエマルション、種々のタイプの湿潤剤、滅菌溶液、その他が挙げられる。前記担体を含む組成物は、当技術分野において知られた従来の方法により剤形化することができる。
【０１０３】
核酸（本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは遺伝子構築物）が投与される事象において、本発明は、特に前記核酸の投与のために調製された医薬組成物を想定する。医薬組成物は、前記核酸を無防備の形態で、すなわち、核酸を生体のヌクレアーゼによるそれらの分解から保護する化合物の不在で含むことができ、形質移入のために使用した試薬に関連する毒性を排除する利点を含む。無防備の化合物に適した投与経路には、静脈内、腫瘍内部、脳内、腹腔内、脾臓内、筋肉内、網膜下、皮下、粘膜、局所および経口経路が含まれる（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，２００２，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２１：８５７−８６７）。あるいは、核酸は、リポソームの一部を形成し、コレステロールに複合体化して、または細胞膜を通る転座を促進することができる化合物、例えば、ＨＩＶ １ ＴＡＴタンパク質から誘導されるＴａｔペプチドなど、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質のホメオドメインの第３ヘリックス、単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２タンパク質、アルギニンオリゴマーおよびペプチド、例えば、ＷＯ０７０６９０９０（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ，２１：９９−１０３，Ｓｃｈｗａｒｚｅ，Ｓ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２１：４５−４８，Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１４３−１５０およびＳｎｙｄｅｒ，Ｅ．Ｌ．ａｎｄ Ｄｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．，２００４，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１：３８９−３９３）に記載されたペプチドなどのペプチドと複合体化して投与することができる。あるいは、ポリヌクレオチドは、プラスミドベクターまたはウイルスベクター、好ましくは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスまたはマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）もしくはレンチウイルス（ＨＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶ）などのレトロウイルスに基づくベクターの一部を形成して、投与することができる。
【０１０４】
本発明の組成物は、体重１キログラム当たり１０ｍｇ未満、好ましくは体重１ｋｇ当たり５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５または０．００００１ｍｇ未満の用量で投与することができる。単位用量は、注射、吸入または局所投与により投与することができる。
【０１０５】
用量は、治療すべき状態の重症度および応答に依存し、数日と数ヶ月または状態が寛解したことを観察するまでの間で変えることができる。最適用量は、患者の生体中の薬剤濃度の定期的測定を実施して決定することができる。最適用量は、前もってインビトロまたは動物モデルにおけるインビボアッセイにより得られたＥＣ５０値により決定することができる。単位用量は、１日１回または１日１回未満、好ましくは、２、４、８または３０日毎に１日１回未満で投与することができる。あるいは、初期用量を投与し、続いて１回または数回の、一般的に初期用量より少ない量の維持量を投与することが可能である。維持投与計画は、１日当たり０．０１μｇと１．４ｍｇ／ｋｇ体重との間で変化する用量、例えば１日に体重１ｋｇ当たり１０、１、０．１、０．０１、０．００１、または０．００００１ｍｇを用いて患者を治療することを含むことができる。維持量は、５、１０または３０日毎に最大１日１回で投与することが好ましい。治療継続期間は、患者が罹患する障害のタイプ、その重症度および患者の状態により変えなければならない。治療後は、患者の展開を監視して、疾患が治療に応答しない事象においては用量を増加べきかどうか、疾患の改善が観察されればまたは望ましくない副作用が観察されれば、用量を減少すべきかどうかを決定しなければならない。
【０１０６】
特定の態様において、本発明の組成物の成分は、同時に、逐次にまたは別々に投与することができる。好ましい態様において、化学療法剤（好ましくはシクロホスファミド）を最初に投与して、それに続いて、可変時間の後、本発明の組成物の残余の成分、すなわち、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、本発明のベクターまたは本発明による宿主細胞およびＴＬＲリガンドを投与する。本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、本発明のベクターまたは本発明による宿主細胞およびＴＬＲの投与は、同時に、別々にまたは逐次に行うことができる。好ましい態様においては、ＴＬＲリガンド（好ましくはｐＩ：ＣまたはＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰ）および複合体化したポリヌクレオチド、遺伝子構築物、ベクターまたは本発明による宿主細胞（好ましくは融合タンパク質）を、同時に投与する。本発明の組成物が、化学療法剤、好ましい態様においては具体的にシクロホスファミド（ＣＰＡ）を含む場合には、ＣＰＡは、制御性Ｔ細胞を選択的に殺すことができる「少量を頻繁に連続投与する用量（ｍｅｔｒｏｎｏｍｉｃ ｄｏｓｅ）」と呼ばれる最適未満の濃度で使用される（Ｇｈｉｒｉｎｇｈｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００７，５６：６４１−８）。
【０１０７】
本発明の組成物は、一体の用量として、あるいは、最初の用量および１回または複数回のブースター投与量として投与することができる。したがって、好ましい態様において、本発明の組成物は、第１の用量および第２のブースター用量として投与される。本発明の組成物が別々の時間に投与されるときは、本発明の第１成分の第１の用量、本発明の第２成分の第２の用量、本発明の第１成分からの第２のブースター用量、本発明の第２成分からの第２のブースター用量と期間中そのように次々に投与されると理解される。より好ましい態様において、療法には、化学療法剤（好ましくはシクロホスファミド）が投与される第１の投与、本発明による複合体、ポリヌクレオチド、遺伝的構築物、ベクターまたは宿主細胞およびＴＬＲリガンドが投与される第２の投与；化学療法剤（好ましくはシクロホスファミド）を含む第３の投与および本発明による複合体、ポリヌクレオチド、遺伝的構築物、ベクターまたは宿主細胞が、ＴＬＲリガンド（好ましくはｐＩ：ＣまたはＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰ）と一緒に再度投与される第４の投与が含まれる。第２のおよび第４の投与においては、ＴＬＲリガンド（好ましくは、ｐＩ：ＣまたはＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰ）および本発明による複合体、ポリヌクレオチド、遺伝的構築物、ベクターまたは宿主細胞、（好ましくは融合タンパク質）が、同時に、別々にまたは逐次に投与される。
【０１０８】
好ましい態様においては、ＴＲＬリガンド（好ましくはｐＩ：ＣまたはＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰ）および本発明による複合体、ポリヌクレオチド、遺伝的構築物、ベクターまたは宿主細胞（好ましくは融合タンパク質）が、同時に投与される。
【０１０９】
毎日の用量は、単一の用量でまたは特定の状況によっては２回以上の用量で投与することができる。繰り返し投与または頻回投与が所望であれば、ポンプ、半永続性カテーテル（静脈内、腹腔内、クモ膜下槽内または嚢内）またはリザーバーなどの投与デバイスの埋め込みが薦められる。
【０１１０】
他の態様において、本発明は、ワクチン製造のための、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の組成物または本発明の医薬組成物の使用に関する。換言すれば、本発明は、ワクチンとして使用するための、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の組成物または本発明の医薬組成物に関する。あるいは、本発明は、対象者への本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の組成物または本発明の医薬組成物の投与を含む、対象者にワクチン接種する方法に関する。
【０１１１】
「ワクチン」は、一旦生体内に入ると、抗体と呼ばれる攻撃に対する応答を生じさせる抗原製剤として理解される。この応答は、大部分の症例において、永続的免疫の原因となる免疫学的記憶を生じさせる。
【０１１２】
ワクチンは、全身的または局所的に投与される。ワクチンは、単回投与により、または本発明の組成物の投与について以前記載したような複数回の投与によるブーストを用いて、投与することができる。
【０１１３】
他の態様において、本発明は、ヒトパピローマウイルスにより惹起される感染および／またはＨＰＶ感染と関連する子宮頸癌の予防および治療のための医薬を製造するための、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の組成物または本発明の医薬組成物の使用に関する。あるいは、本発明は、ヒトパピローマウイルスにより惹起される感染および／またはＨＰＶ感染と関連する子宮頸癌の予防および治療において使用するための、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の組成物または本発明の医薬組成物に関する。あるいは、本発明は、対象者におけるヒトパピローマウイルスにより惹起される感染および／またはＨＰＶ感染と関連する子宮頸癌予防および治療のための、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の組成物または本発明の医薬組成物の前記対象者への投与を含む方法に関する。
【０１１４】
ヒトパピローマウイルスにより惹起される感染および疾患には、疣贅（足の疣贅など）、生殖器疣贅、反復性呼吸器乳頭腫（喉頭のパピローマなど）およびパピローマ感染と関連する癌が含まれる。パピローマウイルスと関連した癌には、肛門生殖器癌（例えば子宮頸部、肛門周囲、外陰部、膣内、陰茎癌、その他）、頭部および頸部癌（例えば口腔咽頭腔癌、食道癌、その他）および皮膚癌（例えば、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌）が含まれる。
【０１１５】
本発明の樹状細胞を用いるワクチン接種方法
他の癌療法の取り組みは、免疫教育者としての正常樹状細胞の役割の利点を利用することである。前に言及したように、樹状細胞は数ある中でウイルス抗原を捉えてそれらをＴ細胞に提示し、初期のＴ細胞性免疫応答におけるそれらの助勢を募ることである。これは身体に侵入した外来細胞に対してよく機能するが、癌細胞は、しばしば「自己」／「外来」物質検出系を逃れる。研究者達は、樹状細胞を改変することにより、癌細胞に対するＴ細胞の攻撃を含む特別なタイプの自己免疫応答を活性化することができる。腫瘍作用剤は単独では免疫応答を生じさせるには十分でないという事実に基づき、未成熟樹状細胞と本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の細胞、本発明の組成物または本発明の医薬組成物とを接触させることが可能であり、その結果、樹状細胞の活性化、ＨＰＶ Ｅ７由来の抗原（単数または複数）の捕捉、および主要組織適合抗原に関連する表面におけるそれらの提示が生ずる。したがって、これらの活性化した細胞を患者に投与することができ、それで腫瘍抗原が患者の免疫系に提示され、その結果最終的に、Ｔ細胞により媒介された、患者の癌細胞に対する免疫応答が生ずる。
【０１１６】
したがって、他の態様において、本発明は、少なくとも１種のＨＰＶ Ｅ７抗原を提示する成熟樹状細胞を得るインビトロの方法であって：
（ｉ）樹状細胞と、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の組成物または本発明の医薬組成物とを、樹状細胞の成熟が起こるのに適した条件で接触させるステップ、および
（ｉｉ）成熟樹状細胞を回収するステップ
を含む方法に関する。
【０１１７】
樹状細胞（ＤＣ）は、最も強力な抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、活性化されていないＴリンパ球（ナイーブＴリンパ球）と相互作用する独特の能力を有し、最初の免疫応答を開始して、ＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化する。
【０１１８】
炎症および免疫応答が不在であると、樹状細胞は、血液、末梢組織、リンパ液および二次リンパ器官を通って巡視する。末梢組織において、樹状細胞は自己および外来抗原を捕捉する。捕捉された抗原は処理されてそれらの断片を生じ、それらはクラスＩおよびＩＩＭＨＣ分子に渡される（それぞれＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔリンパ球を活性化するために）。抗原捕捉、分解および負荷のこの過程は抗原提示と称される。
しかしながら、刺激がないと、末梢樹状細胞の抗原提示は効果的でない。外因性シグナルすなわち病原体から来るシグナル（単数または複数）または内因性シグナル（単数または複数）は、樹状細胞を、それらが成熟と称される過程を開始するように誘導し、それにより樹状細胞はＡＰＣおよびＴリンパ球活性化因子に形質転換する。
【０１１９】
本発明において使用することができる種々のタイプの樹状細胞がある。それに対して、単球に類似の骨髄腫樹状細胞（ｍＤＣ）があり、それはさらに２つのサブタイプ：最も普通でＴ細胞の主要な刺激因子であるｍＤＣ−１、およびそれより少なくて主な機能は創傷感染と戦うことであるｍＤＣ−２に分かれる。
【０１２０】
一方、プラズマ細胞に類似しているが、骨髄腫樹状細胞に典型的なある特徴を有する形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）がある。
【０１２１】
未成熟樹状細胞は、骨髄造血性幹細胞から誘導される。これらの幹細胞は、エンドサイトーシス能力が高くＴ細胞活性化能力は低い未成熟細胞に分化する。これらの細胞は、それらの膜中にＴＬＲなどの種々の膜受容体を有する。
【０１２２】
細菌およびウイルスの産生物、並びに炎症性サイトカインおよび他の典型的な分子は、樹状細胞の成熟を生来の樹状細胞の表面受容体との直接相互作用により誘導する。Ｔリンパ球はＣＤ４０依存性および独立の経路により、内皮細胞は細胞と細胞との直接接触およびサイトカイン分泌により、樹状細胞の最終的成熟に寄与する。危険シグナルが発生すると直後に、抗原捕捉、細胞内輸送および分解、および細胞内ＭＨＣ分子の往来の効率が改善される。ペプチド負荷、並びに分子ＭＨＣの半減期および細胞表面への移動は増大する。Ｔ細胞副刺激分子の表面における発現も増大する。このようにして樹状細胞は、最も強力なＡＰＣ、および活性化されていないＴリンパ球を活性化して免疫応答を開始することができる唯一のものになる。抗原提示におけるそれらの能力の改善と一緒に、成熟は樹状細胞の末梢組織からの大量移動も誘発する。ケモカイン受容体および接着分子の発現における改変、並びに細胞骨格構成における重要な変化が、樹状細胞のリンパ液を通る二次リンパ器官への移動に寄与する。
【０１２３】
樹状細胞は、２タイプのシグナル、すなわち：病原体の直接認識（特異的認識パターンを有する受容体により）、および感染の間接的認識（炎症性サイトカイン、内部細胞化合物（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｅｌｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）および特異的免疫応答による）に応答する。これらのシグナルに応答して、樹状細胞は活性化されてそれらの成熟過程を開始し、それにより有効なＴ細胞刺激因子に形質転換する。ＤＣの成熟にとって最も有効なシグナルの一つは、ｔｏｌｌ様受容体ＴＬＲ、（ＴＬＲｌ〜９）とそれらのそれぞれのリガンドとの相互作用により媒介される（ＫａｉｓｈｏおよびＡｋｉｒａによる総説 Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，２００２，１５８９：１−１３）。
【０１２４】
本発明において使用する未成熟樹状細胞は、初代培養細胞であってよい。したがって、本発明の方法において使用する樹状細胞は、自家細胞でも異種細胞でもよい。
【０１２５】
本明細書において使用する、用語「自家」は、細胞が同一個体からのものであることを意味する。
【０１２６】
本明細書において使用する、用語「異種」は、細胞が異なった個体からのものであることを意味する。
【０１２７】
樹状細胞は、基本的には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、前記細胞の接着が可能になるように培養瓶中に蒔くことからなるプロトコルを使用して、インビトロでＰＢＭＣから発生させることができる。その後、細胞をインターロイキン４（ＩＬ４）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）で処理すると、約１週間で細胞は未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）へと分化するに至る。場合により、細胞は、それらを腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）で処理して成熟させることができる。
【０１２８】
樹状細胞は、標準的方法を使用して適当な供給源から得ることができる。樹状細胞の単離に適したこれらの組織には、末梢血、脊髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周囲の組織に浸潤している細胞、リンパ節の生検、胸腺、脾臓、皮膚、臍帯血液、末梢血から得た単球、末梢血から得たＣＤ３４−またはＣＤ１４陽性細胞、並びに任意の他の適当な組織または体液が含まれる。
【０１２９】
場合により、安定な細胞培養を使用することができる。文書ＷＯ９６３００３０には、樹状細胞様細胞／腫瘍細胞ハイブリドーマおよび複数種の樹状細胞様細胞／腫瘍細胞ハイブリッドを得る方法が記載されている。これらのハイブリッドおよびハイブリドーマは、腫瘍細胞と樹状細胞様細胞との融合により生成する。例えば、自家腫瘍細胞ラインからの不死の腫瘍細胞と自家ＨＬＡに適合した同種の樹状細胞様細胞とを融合することができる。自家腫瘍細胞ラインは、原発腫瘍およびそれらの転移から得ることができる。あるいは、自家のまたは同種のＨＬＡに適合した樹状細胞様細胞ラインの不死の樹状細胞様細胞を、自家腫瘍細胞と融合することができる。文書ＷＯ／２００２／０４８１６７には、安定な樹状細胞ラインを発生させる方法も記載されている。使用することができる他の細胞ラインは、ＣＢＩである（Ｐａｇｌｉａ Ｐ． ｅｔ ａｌ．１９９３．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ １７８，１８９３−１９０１）。
【０１３０】
本発明の方法の第１のステップは、樹状細胞と、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の遺伝子構築物、本発明の細胞、本発明の組成物または本発明の医薬組成物とを、樹状細胞の成熟が起こるのに適した条件で接触させることからなる。
【０１３１】
本発明は、樹状細胞と本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の遺伝子構築物、本発明の細胞、本発明の組成物または本発明の医薬組成物とを接触させる任意の可能な方法を考慮している。当業者は、化合物のタイプに応じて、接触の実施が異なることを理解するであろう。したがって、それが、本発明の複合体または本発明のペプチドである場合、これらは、樹状細胞が触れるプラスチック、ガラス、その他の表面に、細胞が位置しまたは結合することができる培養培地に直接添加することができる。本発明の複合体並びに本発明のペプチドの成分を固体表面に結合する形態は、当業者により知られている。
【０１３２】
それが本発明の遺伝子構築物または本発明のベクターである場合、前記成分を細胞（本発明の細胞）に導入するために使用する技法は、本発明の遺伝子構築物の節で前に記載した。特定の態様において、本発明の細胞は、それらの膜中に本発明の複合体の成分を有するので、それらは樹状細胞に接触可能である。
【０１３３】
「成熟が起こるのに適した条件」は、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の組成物または本発明の医薬組成物が接触して、その結果少なくとも１種のＨＰＶ Ｅ７由来の抗原が提示された後、樹状細胞の活性化が可能になるこれら全ての培養条件（酸素、温度、湿度、栄養分その他）と理解される。この活性化は、未成熟樹状細胞が何らかの提示された抗原を貪食して、前記抗原を小片に分解し、組織適合系分子（ＭＣＨ）を使用することにより前記部分をそれらの表面に提示したときに起こる。成熟樹状細胞は、同時に、Ｔ細胞の活性化において共受容体として作用するＣＤ８０（Ｂ７．１）ＣＤ８６（Ｂ７．２）およびＣＤ４０などの膜受容体を上方制御して、したがってその結果、それらの前記Ｔ細胞を活性化する能力は増大する。成熟樹状細胞は、樹状細胞の血流全体を通って脾臓に至る移動、およびそこからリンパ系へのそれらの移動を誘発する受容体ＣＣＲ７の発現も上方制御する。成熟樹状細胞は、それらが処理した抗原を提示するヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞およびＢリンパ球を活性化することができる。
【０１３４】
したがって、少なくとも１種のＨＰＶ Ｅ７抗原を提示する成熟樹状細胞は、ＨＰＶ Ｅ７抗原を捕捉した後、前記抗原を処理した後、それを主要組織適合性複合体（ＭＢＣ）に結合した膜の表面に提示することができる樹状細胞として理解される。
それに加えて、成熟樹状細胞は、上で示した上方発現した膜受容体を提示することができる。
【０１３５】
他のステップにおいて、細胞は、本発明の複合体の誘導体の１種または複数種のペプチドの内部移行、処理および提示に適した条件下で維持される。本発明の複合体から誘導された少なくとも１種の抗原性ペプチドの内部移行、処理および提示に適した条件は、樹状細胞の活性化を定量するための標準的アッセイを使用して決定することができる。
【０１３６】
ＤＣの成熟は、細胞表面の多数の分子マーカーおよび表現型の変化を使用して追跡することができる。これらの変化は、例えば、フローサイトメトリー技法を使用して分析することができる。成熟マーカーは、典型的には特異的抗体を使用してマークされ、マーカーまたは一群のマーカーを発現するＤＣは、例えば、ＦＡＣＳによる細胞選別を使用してＤＣ全体から分離することができる。ＤＣ成熟マーカーは、未成熟ＤＣに比較して成熟ＤＣにおいて高レベルで発現されて出現する遺伝子を含む。これらのマーカーには、細胞表面のＭＢＣクラスＩＩ抗原（特にＨＬＡ−ＤＲ）、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３などの副刺激分子、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１８などの細胞輸送分子が含まれるが、これらに限定されない。さらに、ＤＣの成熟は、ある種のＮｏｔｃｈリガンド例えばデルタ様リガンド（ＤＬＬ４）など、Ｔｈ１応答の誘発と関連するＪａｇｇｅｄ１およびＪａｇｇｅｄ２の発現を測定して決定することができる。一方、成熟樹状細胞は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で同種のＴ細胞の増殖を刺激するそれらの能力を使用して確認することができる。さらに、未成熟ＤＣは抗原の内部移行に非常に有効であるが抗原提示が低いのに対して、成熟ＤＣ細胞は抗原の内部移行は低いが抗原提示に非常に有効であることが一般的に見られている。
【０１３７】
樹状細胞の抗原提示機能は、ＭＨＣ限定、抗原依存性のＴ細胞活性化アッセイ並びに当業者にとって周知の他のアッセイ、例えば末梢血液リンパ球におけるインビトロ刺激の能力など、例えば、ＤＣの存在におけるＣＤ８＋リンパ球によるＩＦＮ−γ産生量の定量などを使用して、測定することができる。この定量は、ＥＬＩＳＰＯＴと称する技法を使用して実施することができる。Ｔ細胞の活性化は、それに加えて、例えば刺激された樹状細胞によるサイトカイン産生の誘発を測定して定量することができる。サイトカイン産生の刺激は、ＥＬＩＳＡなどの、当業者により周知の非常に種々の標準的技法を使用して定量することができる。
【０１３８】
標的細胞にトリチル化チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）を結合するなどの他の細胞傷害性アッセイも使用することができる。３Ｈ−ＴｄＲは、細胞核に組み込まれる。・Ｈ−ＴｄＲの遊離は、ＤＮＡ断片化に基づく細胞死の尺度である。
【０１３９】
本発明の方法の第２のステップにおいて、ステップ（ａ）で得られた成熟樹状細胞が回収される。
【０１４０】
本発明の方法のステップａ）で得た成熟細胞を回収するために種々の戦略を使用することができる。例えば、成熟細胞により発現された、および前に記載した、例えばＣＤ８０などの膜マーカーを使用することができる。
【０１４１】
細胞表面マーカーの発現は、従来の方法および装置を使用して例えば、フローサイトメトリーにより定量することができる。例えば、市販の抗体および当技術分野において知られた通常のプロトコルを使用して、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＣａｌｉｂｕｒのＦＡＣＳ（蛍光性活性化細胞選別）システムを使用することができる。したがって、フローサイトメトリーにおいて、特異的な細胞表面マーカーについてバックグラウンドシグナルより上のシグナルを提示する細胞を選択することができる。バックグラウンドシグナルは、従来のＦＡＣＳ分析において各表面マーカーを検出するために使用した特異的抗体と同じイソタイプの非特異的抗体により生ずるシグナル強度として定義される。マーカーが陽性とみなされるためには、観察された特異的シグナルが、従来の方法および装置（例えば、市販の抗体および当技術分野において知られた通常のプロトコルを用いて使用したＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃａｌｉｂｕｒ ＦＡＣＳシステム）を使用したバックグラウンドシグナルの強度に対して、２０％を超え、好ましくは、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、５００％、１０００％、５０００％、１００００％またはそれを超えて強くなければならない。
【０１４２】
本発明による方法により得た樹状細胞は、Ｅ７抗原に対する免疫応答の発生に応答する疾患の治療に有用であることが証明された。前記方法を使用して、本発明の複合体からの少なくとも１種の抗原を提示する成熟細胞が得られる。したがって、他の態様において、本発明は、本発明の方法または本発明の樹状細胞により得られる、本発明の複合体からの少なくとも１種の抗原を提示し且つＣＤ４０陽性である抗原提示樹状細胞に関する。
【０１４３】
他の態様において、本発明は、医学においてそれらを使用するための本発明の樹状細胞に関する。前記本発明の樹状細胞は、それをＤＣワクチン接種として使用して、すなわち前記患者に対する前記細胞の投与により、患者における免疫応答を惹起するために使用することができる。したがって他の態様において、本発明は、患者における免疫応答の発生にための本発明の樹状細胞に関する。換言すれば、本発明は、対象者に対する抗原提示細胞の投与を含む、対象者における免疫反応を惹起する方法に関する。
【０１４４】
ＤＣを用いるワクチン接種は、抗原提示ＤＣを対象者（例えば、ヒト患者）に投与することにより実施され、対象者に免疫応答が誘発される。免疫応答は、典型的には、抗原性ペプチド（例えば、本発明の複合体の成分）でマークされた標的細胞に対するＣＴＬ応答を含む。これらの標的細胞は、典型的には癌細胞である。改変されたＤＣを患者に投与すべきとき、これらの細胞は、同じ患者の幹細胞から単離することが好ましい（すなわち、ＤＣは自家患者に投与される）。しかしながら、ＨＬＡに関して適合性の同種の患者または一致がない同種の患者に、細胞を投与することができる。この後者の場合は、細胞を受ける患者に免疫抑制薬を投与しなければならない。
【０１４５】
細胞は、任意の適当な形態で、好ましくは担体（例えば食塩水溶液）とともに投与することができる。投与は、通常は静脈内であるが、動脈内、筋肉内、皮内、腹腔内または皮下投与も許容される。投与または免疫は種々の時間間隔で繰り返すことができる。
【０１４６】
ＤＣ注射は、サイトカインの投与と組合せることができ、それはＤＣの数およびそれらの活性が、ＧＭ、ＣＳＦ、ＩＬ−１２と同じように維持されるように作用する。
【０１４７】
患者に投与する用量は、免疫応答を誘発するために有効でなければならなず、免疫応答は、Ｔ細胞の増殖、Ｔリンパ球の細胞傷害性および／または患者の応答の経時的に有益な治療効果を測定するアッセイを使用して検出することができる。利用できる場合には、通常１０６から１０９個のＤＣ細胞が注射される。ワクチンは、１回または複数回患者に投与して、有益な結果を達成することができる。ワクチンの１回目の投与と続く投与（単数または複数）との間の時間は、患者の健康、年齢、体重その他を含むがそれらに限定されない種々の要因に依存する。ワクチンは、例えば、週に１回、２週間毎に１日１回、３週間毎に１日１回、１ヵ月に１回を含むが、これらに限定されない任意の適当な時間間隔で投与することができる。特定の態様において、ワクチンは、無期限で投与することができる。他の特定の態様において、ワクチンは、２週間間隔で３回投与される。ワクチンの用量は、患者の健康、安定性、年齢、体重、その他を含むが、これらに限定されない種々の要因にも依存する。臨床的利益を含む十分な免疫レベルが一旦達成されたら、一般的に頻度を落として投与する（例えば、毎月または半年毎の投与）ブースター用量を使用することができる。
【０１４８】
免疫応答を惹起する方法で使用するＤＣは、それらを在庫品の薬剤として使用することができるようにまたは製剤の細胞と治療される患者の細胞との間に組織適合性がある場合に、それらを使用する用意があるように製剤化することが好ましい。治療目的の対象者と樹状細胞との間の適合性が欠如すると、細胞の早発排除（特に複数回の投与後）があるのでまたは意図された標的の免疫系を混乱させる強い抗異種応答の発生に基づくかのいずれかにより、ワクチンの効果の減少が生じ得る。この関係で、本発明の樹状細胞中のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子の少なくとも幾つか（特に遺伝子座Ａおよびさらに特定すればＡ２対立遺伝子における）が患者と共有されるワクチンの使用が有利である。したがって腫瘍抗原の少なくとも幾つかが自家のクラスＩの分子中に提示され、それにより抗腫瘍応答が増大すれば、抗アロタイプ応答が減少するであろう。
【０１４９】
部分的一致は、最もありふれたＨＬＡ−Ａアロタイプ（ＨＬＡ−Ａ２、Ａ１、Ａ１９、Ａ３、Ａ９、およびＡ２４）の２つ以上を有する細胞を用いて作製されたＤＣによるワクチンを使用して得ることができる。大部分の患者に対する全体的一致は、遺伝子座ＨＬＡ−Ａにただ１つのアロタイプを有する種々の可能性を選択することができる一連の種々のＤＣを医師に提供するとこにより達成することができる。
治療は、標準的組織適合試験方法を使用する患者における１種または複数種のＨＬＡアロタイプ同定、およびＨＬＡアロタイプ（単数または複数）が患者と一致するＤＣによる患者の治療を含むであろう。例えば、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ１９の患者は、ＨＬＡ−Ａ２もしくはＨＬＡ−Ａ１９についてホモ接合体の細胞のいずれかまたは両者の混合物を用いて治療することができる。
【０１５０】
ＨＬＡの一致の欠如の潜在的な負の効果は、外来性アロタイプに対する免疫寛容を生じさせて治療することができる。ワクチンの調製中にＤＣ細胞は、２群：免疫寛容を生じる未成熟細胞を生ずる群、および抗原提示のための成熟ＤＣを生ずる他の群に分割される。免疫寛容を生じる細胞は、それらが成熟細胞の受容を生ずるように設計される。免疫寛容を生じる細胞は、十分な程度の免疫応答不在（例えば、混合リンパ球反応で測定される）が生ずるように、患者に１回または複数回投与されるであろう。患者が免疫寛容になれば（１週間または１ヵ月後に）、標的腫瘍抗原に対する免疫応答に必要な量および頻度で、成熟抗原提示細胞を対象者に投与する。
【０１５１】
特定の態様において、本発明の抗原提示樹状細胞は、治療すべき象者にとって自己である。ワクチンの組成物はアジュバントを含むことができる。アジュバントは、任意の利用可能なアジュバントまたはそれらの組合せであってよい。アジュバントの例は、本発明の複合体および組成物に医学的使用の節で挙げた。
【０１５２】
他の態様において、本発明は、ヒトパピローマウイルスにより惹起される感染および／またはＨＰＶ感染と関連する子宮頸癌の予防および治療のための医薬を製造するための本発明の樹状細胞の使用に関する。あるいは、本発明は、ヒトパピローマウイルスにより惹起される感染および／またはＨＰＶ感染と関連する子宮頸癌の予防および治療のための本発明の樹状細胞に関する。最後に、本発明は、前記対象者に対する本発明による樹状細胞の投与を含む、対象者におけるヒトパピローマウイルスにより惹起される感染および／またはＨＰＶ感染と関連する子宮頸癌の治療方法に関する。
【０１５３】
本発明を、以下の例により説明するが、それらは単に例示であり、発明の限定とみなしてはならない。
【実施例】
【０１５４】
材料および方法
マウスおよび細胞ライン
特定の病原体のいない５週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、スペイン）から購入し、ＣＩＭＡ動物施設で無菌条件下に水および食物が自由な状態に保った。動物を使用する実験は動物管理のための指示指針にしたがって実施した。
【０１５５】
ＴＨＰ１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、ＥＤＡから誘導した融合タンパク質による単球活性化のインビトロアッセイのために使用した。ＴＣ−１、ＨＰＶ１６−Ｅ６を発現する腫瘍細胞および始原マウス肺上皮細胞由来のＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＬＧＣ Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ，Ｍｏｌｓｈｅｉｍ，Ｆｒａｎｃｅ）から得た。細胞は、１０％熱不活化胎児仔牛血清、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．４ｍｇ／ｍｌゲネチシンおよび５×１０−５ｍｏｌ／ｌの２−メルカプトエタノールで補完したＧｌｕｔａＭＡＸ添加ＲＰＭＩ １６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）中で維持した。５×１０５のＴＣ−１細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの剃毛した背中（左側）に２００μＬ ＰＢＳ中で注射した。２方向に垂直の直径（ミリメートル）の平均として表した腫瘍サイズを、一定間隔で測定した。ＥＬ−４（マウス胸腺腫）腫瘍細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＬＧＣ Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ、Ｍｏｌｓｈｅｉｍ、フランス）から得て細胞傷害性検討のための標的細胞として使用し（ＤＴｃペプチド添加または無添加で培養した）、それらが如何なるＨＰＶタンパク質も発現しないので腫瘍の陰性対照として使用した。
【０１５６】
試薬
ＨＰＶ１６−Ｅ７Ｈ２−Ｄｂ制限エピトープに対応する合成Ｅ７４９−５７ペプチド［ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号６７）：アミノ酸に対する一字コード］は、Ｐｒｏｉｒｎｒｎｕｎｅ（Ｏｘｆｏｒｄ、英国）から購入した。ポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ＰｌＣ、ポリＩ：Ｃ、ｐｌＣまたはｐＩ：Ｃ）はＩｎｖｉｖｏｇｅｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入して、注射前にＰＢＳ中に希釈した。ＣｐＧホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドタイプＢ（ＣｐＧ１８２６：５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’）はＰｒｏｌｉｇｏ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）により合成された。３０μｇのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを、５０μＬのＯｐｔｉｍｅｎ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，米国）中に希釈して、６０μｇのＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）と混合し、１００μＬのＯｐｔｉｍｅｎで希釈した。シクロホスファミド（ＣＰＡ）（Ｓｉｇｒｎａ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，ドイツ）を注射前にＰＢＳで希釈してワクチン接種の２４時間前に投与した。種々の抗原性剤形およびアジュバントを同時に注射した。静脈内投与は眼窩後部注射により２００μＬの体積で実施した。
【０１５７】
組替えＥＤＡ−ＨＰＶＥ７融合タンパク質の調製
フィブロネクチンからのエキストラドメインＡを発現するプラスミドｐＥＴ２０ｂ−ＥＤＡを、前に記載したようにして調製して（Ｌａｓａｒｔｅ，Ｃａｓａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．２００７）、ＥＤＡタンパク質のＮ端に連結したＨＰＶ−Ｅ７タンパク質の最初の１〜２９アミノ酸およびＥＤＡのＣ末端に連結したＨＰＶ−Ｅ７の４３〜９８アミノ酸を含有する融合タンパク質を発現するための発現プラスミドｐＥＴ２０ｂ−ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７を構築するために使用した。この発現プラスミドは、下記のように２ステップで構築した。ＴＣ−１細胞からのＲＮＡは、１×１０７個の細胞からＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ １９８７）の方法により、Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ（Ｂｉｏｔｅｃｘ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、米国）をメーカーの指示にしたがって使用して単離した。全ＲＮＡを逆転写して、ＨＰＶ−Ｅ７タンパク質をコードする遺伝子を、前に記載したように（Ｌａｓａｒｔｅ，Ｃａｓａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．２００７）上流で最初のＵＰ−１ ＣＡＴＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣ［配列番号６８］（下線を引いたＮｄｅＩ制限部位を含む）および下流で最初のＤＷ−１ ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴ［配列番号６９］（ＮｏｔＩ制限部位を含有する）を使用して、ＰＣＲにより増幅した。生ずるＰＣＲ生成物は、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，米国）を使用して、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローニングし、プラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＨＰＶ−Ｅ７に導いた。発現プラスミドｐＥＴ２０ｂ−ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７の構築についての最初のステップについては、プラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯＨＰＶ−Ｅ７テンプレートとして、プライマーＵＰ−１（配列番号６８）およびＤＷ−２（ＣＡＴＡＴＧＡＴＴＴＡＡＴＴＧＣＴＣＡＴＡＡＣＡ、配列番号７０）を使用するＰＣＲ反応。生じたフラグメントをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯでサブクローニングするとプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−（１〜２９）Ｅ７が生ずる。このプラスミドをＮｄｅＩ制限酵素で消化して、生じたフラグメントをＮｄｅＩで消化したｐＥＴ２０ｂ−ＥＤＡプラスミドでサブクローニングするとプラスミドｐＥＴ２０ｂ−ＥＤＡ−（１〜２９）Ｅ７が生ず
る。第２のステップにおいては、プラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＨＰＶ−Ｅ７テンプレートとしてプラスミドＵＰ−２（ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＣＣＧＧＡ、配列番号７１）およびＤＷ−１（配列番号６９）を使用するＰＣＲ反応を実施した。生じたＰＣＲ生成物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯでサブクローニングするとプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（４３〜９８）Ｅ７が生じ、それをＮｏｔＩで消化してＥ７タンパク質のこの部分をコードするフラグメントを精製した。この生成物を前にＮｏｔＩで消化したプラスミドｐＥＴ２０ｂＥＤＡ−（１〜２９）Ｅ７でサブクローニングした。この過程の後、本発明者らは、プラスミドｐＥＴ２０ｂ−ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７を得てその配列を決定し、カルボキシ端に６つのヒスチジン残基（６×Ｈｉｓタグ）を担持する融合タンパク質（１〜２９）Ｅ７−ＥＤＡ−（４３〜９８）Ｅ７の正しい発現を確認した。このプラスミドｐＥＴ２０ｂ２−２６をＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中に形質移入して、組替えタンパク質を発現し、それを、細胞抽出物の可溶性分画から、ＦＰＬＣプラットホーム（ＡＫＴＡ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して親和性クロマトグラフィー（Ｈｉｓｔｒａｐ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により精製した。溶出したタンパク質を、Ｈｉｔｒａｐ脱塩カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して脱塩し、ＡｍｉｃｏｎのＵｌｔｒａ４−５０００ＭＷＣＯ遠心濾過デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃａｒｒｉｇｈｗａｈｉｌｌ、アイルランド）を使用して濃縮した。この組替えタンパク質を、Ｅｎｄｏｔｒａｐカラム（Ｐｒｏｆｏｓ Ａｇ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）を使用することにより、内毒素レベルが、リムルス試験法の定量的発色（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国）により試験して０．２ＥＵ／μｇタンパク質未満になるまで内毒素を除いて精製した。精製した組替えタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用し、メーカーの指示にしたがってクーマジーブルーで染色した（図１）。
【０１５８】
ウェスタンブロットおよび質量分析法によるタンパク質のキャラクタリゼーション
【０１５９】
ウェスタンブロット分析：精製したタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷し、続いてニトロセルロース膜に電気泳動で移した。ヒスチジンタグ付タンパク質を抗Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）および抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して検出した。タンパク質のバンドは、増強化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）により検出した。トリプシン消化物から、ＷａｔｅｒｓのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＧＬ−ＲＥＦ質量分光計を使用して、ペプチドのマスフィンガープリント（ＰＭＦ）を得た。簡単に説明すると、１．２μＬのトリプシン消化物を０．１％ＴＦＡ添加５０％アセトニトリル中の等量のα−シアノ−４−ヒドロキシ−トランス−ケイヒ酸と混合して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的プレート上にスポットした。データ処理は、Ｍａｓｓｌｙｎｘ ４．０（Ｗａｔｅｒｓ）でＡＣＴＨを内部ロック質量標準として使用して実施した。
【０１６０】
微細毛細管逆相ＬＣをＣａｐＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）毛細管系で実施した。トリプシン消化物の逆相分離は、５％アセトニトリル、０．２％ギ酸で平衡化したＡｔｌａｎｔｉｓ、Ｃ１８、３μｍ、７５μｍ×１０ｃｍのＮａｎｏ Ｅａｓｅ溶融シリカ毛細管カラム（Ｗａｔｅｒｓ）で実施した。６μＬの試料を注入した後、カラムを５分間同じ緩衝液で洗浄し、ペプチドを、３０分で５〜５０％のアセトニトリルの線形グラジエントを使用して、一定の流速０．２μＬ／分で溶出した。カラムを、Ｐｉｃｏ Ｔｉｐナノスプレーイオン化供給源（Ｗａｔｅｒｓ）を使用するＱ−ＴＯＦ Ｍｉｃｒｏ（Ｗａｔｅｒｓ）に連結した。加熱した毛細管温度は８０°Ｃであり、スプレー電圧は１．８〜２．２ｋＶであった。ＭＳ／ＭＳデータは自動化されたデータ依存様式で収集した。各概略走査における３つの非常に強いイオンを２．５の単離幅および３５％の相対衝突エネルギーを使用して衝突誘起解離（ＣＩＤ）により順次に断片化した。データ処理は、Ｍａｓｓｌｙｎｘ ４．０を用いて実施した。ＰＭＦに基づくタンパク質同定は、Ｍａｓｓｌｙｎｘスコアが少なくとも７であり、且つ合致したペプチドが指名したタンパク質配列の少なくとも３０％を提示するときにのみ受け入れた。ＭＳ／ＭＳデータによるタンパク質同定は、７を超えるスコア値について、および少なくとも３つの独立のペプチドの配列に基づくときのみ考慮した。
【０１６１】
単球活性化のインビトロ分析。ＴＨＰ−１
ＴＨＰ−１細胞を１×１０６細胞／ウェルで入れて、培養の安定化のための完全培地中で、３７°Ｃおよび５％ＣＯ２で終夜培養した。種々の濃度の指示した抗原を培養液に加えて、１５時間のインキュベーション後に、培養上清を収穫した。ＴＨＰ−１細胞ラインにより培地に放出されたヒトＴＮＦ−αの濃度を、市販のＥＬＩＳＡアッセイ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してメーカーの指示にしたがって定量した。
【０１６２】
ＤＣ成熟のインビトロ分析
骨髄（ＢＭ）由来の樹状細胞を、マウス大腿骨骨髄細胞の培養により発生させた。赤血球をＡＣＫ細胞溶解緩衝液で溶解した後、骨髄細胞を洗浄し、続いてＣＤ４（ＧＫ１；ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）、ＣＤ８（５３．６．７２；ＡＴＣＣ）Ｌｙ−６Ｇ／Ｇｒ１（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）およびＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に対する抗体の混合物と続いてウサギ補体とのインキュベーションによりリンパ球をおよび顆粒球完全に除去した。残存する細胞を、１２ウェルのプレート中１０６細胞／ｍｌで、２０ｎｇ／ｍｌのｍＧＭ−ＣＳＦおよび２０ｎｇ／ｍｌのｍＩＬ−４（両方ともＰｅｐｒｏｔｅｃｈ；Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫから）で補完したＣＭ（１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノールで補完したＲＰＭＩ１６４０）中で増殖させた。２日毎に、培地の３分の２をサイトカインを含有する新鮮培地で置換した。付着しない樹状細胞を第７日に収穫して、種々の刺激剤の存在または不在下に３７°Ｃおよび５％ＣＯ２で培養した、２４時間の培養後、上清を収穫してＩＬ−１２（ｐ７０）、ＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡ（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）によりメーカーの指示にしたがって測定した。ＤＣ成熟マーカーの発現はフローサイトメトリーにより測定した。細胞をラット抗ＣＤ１６／３２ｍＡｂ（２．４Ｇ２クローン、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とともに１５分間、前培養して、一次抗体の非特異的結合を阻止した。この初期インキュベーションの後、細胞を一次抗体により４°Ｃで１５分間染色して洗浄し、ＦＡＣＳ走査サイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で捕捉して、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。使用した抗体は：抗ＩＡβｂ（２５−９−１７クローン）、抗Ｈ−２Ｋｂ（ＡＦ６−８８．５クローン）、抗ＣＤ４０（３／２３クローン）、抗ＣＤ５４（３Ｅ２クローン）、抗ＣＤ８０（１６−１０Ａ１クローン）、抗ＣＤ８６（ＧＬ１クローン）、抗ＣＤ１１ｃ（ＨＬ−３クローン）であり、全てＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎからのものである。
【０１６３】
統計分析
非線形混合効果モデルで腫瘍成長データを分析するために、Ｍｏｎｏｌｉｘソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｎｏｌｉｘ．ｏｒｇ／）を使用した。経時的な腫瘍の平均直径を、方程式１．１で記述されるモデルを使用して適合させ、治療を尤度比検定を使用して比較した。
【数１】
式中、Ｙｉｊはマウスｉの時間ｔｉｊにおける腫瘍直径であり、Ｙｏ、ｋｃ、ｋａおよびｋｅは、それぞれ、初期腫瘍直径、腫瘍成長速度、エフェクター細胞固有の致死活性およびエフェクター細胞の排除速度を表すモデルの係数である。
【０１６４】
カプランマイヤープロットを使用して生存率を分析した。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、米国）を使用してログランク検定で生存曲線における差の有意性を決定した。インビボの致死分析の結果は、ＡＮＯＶＡに続くダネットの多重比較検定により分析した。０．０５未満のｐ値を統計的に有意であるとみなした。
【０１６５】
実施例１
ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７融合タンパク質はインビトロで骨髄由来の樹状細胞の成熟を誘発することができる
すでに記載したように、文献ＷＯ０６１３４１９０には、フィブロネクチンからのエキストラドメインＡ（ＥＤＡ）、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）の内因性リガンドを包含する組替えタンパク質が、ＴＬＲ４シグナル伝達経路に結合して活性化することが記載されている。ＥＤＡは、ＤＣによるＩＬ−１２またはＴＮＦ−αなどの炎症誘発性サイトカインの産生も刺激して、インビトロおよびインビボにおけるそれらの成熟を誘発する。それ故、組替えタンパク質ＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７がインビトロでＢＭＤＣの成熟も誘発することができるか否かをアッセイした。ＢＭＤＣを５００ｎＭのＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７とともにインキュベーションすると成熟マーカーＩＡｂ、ＣＤ５４および、程度は低いがＣＤ８６分子の発現を上方制御し得ることを見出した（図２）。その上、ＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７は、ＢＭＤＣによるＩＬ−１２サイトカインの産生を強く刺激することができた（図３Ａ）。同様に、組替え融合タンパク質ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７は、ＴＬＲ４分子を発現するヒト単球細胞ラインＴＨＰ−１によるＴＮＦ−αサイトカインの産生も誘発することができた（図３Ｂ）。これらの結果はＥＤＡとＨＰＶＥ７タンパク質との融合タンパク質は、ＥＤＡの炎症誘発性の性質を保持することを示す。
【０１６６】
実施例２
ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７融合タンパク質は、共アジュバント不在下にインビボでＨＰＶＥ７特異的ＣＴＬを誘発する。
【０１６７】
ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７融合タンパク質で免疫したマウスが、ＨＰＶＥ７特異的Ｔ細胞応答を発生するか否かをアッセイした。融合タンパク質の能力を、Ｃ５７ＢＬ６マウスにより認識される細胞傷害性Ｔ細胞決定基を含む合成Ｅ７（４９〜５７）ペプチドと比較した。マウスは静脈注射によりＰＢＳ中２ｎｍｏｌのＥＤＡＨＰＶ−Ｅ７またはペプチドＤＴｃ／Ｅ７（４９〜５７）で免疫した。免疫７日後にマウスを屠殺して、脾臓細胞をペプチドＤＴｃの存在または不在下に５日間に培養した。ＣＴＬ活性は、ＤＴｃペプチドでパルスしたまたはしない放射性標識したＥＬ４細胞を標的細胞として使用する従来のクロム放出アッセイを使用して測定した（図４Ａ）（グラフに絶対値を示す。前記値はペプチド不在で得た細胞溶解の値をペプチド存在下で得た値から差し引いて計算した）。ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７タンパク質で免疫したマウスの方が、細胞傷害性Ｔ細胞エピトープでパルスした標的細胞に対して高いレベルのＣＴＬ活性を有することが示される。それは、ＥＬＩＳＰＯＴで、すなわち、ＥＤＡＨＰＶ−Ｅ７またはＥ７（４９〜５７）ペプチドで免疫したマウスからの脾臓細胞中における、ペプチドＥ７（４９〜５７）の存在または不在下で培養して、または放射線照射したＴＣ１腫瘍細胞（ＨＰＶＥ７タンパク質を発現する）に対して応答して、または腫瘍細胞ＥＬ−４（陰性対照）に対して応答してＩＦＮ−γを産生する細胞の数によっても測定した（図４Ｂ）。ＥＤＡ−ＨＰＶ Ｅ７で免疫したこれらのマウスは、Ｅ７（４９〜５７）またはＴＣ１細胞に対して特異的なＩＦＮ−γ産生スポットのより高い数を有することが見出され、細胞傷害性Ｔ細胞決定基単独と比較してより高いこのタンパク質の免疫源性が確認された。
【０１６８】
実施例３
ＥＤＡ−ＨＯＶＥ７融合タンパク質は共アジュバントの存在下にインビボでＨＰＶＥ７特異的ＣＴＬを誘発する。
ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７融合タンパク質で免疫したマウスが、ＴＬＲ３リガンドのポリＩ：Ｃ（ｐＩ：Ｃ）の存在下で、改善されたＨＰＶＥ７特異的Ｔ細胞応答を発生するか否かをアッセイした。マウスは静脈注射によりｐＩ：Ｃ（５０μｇ／マウス）の存在下に２ｎｍｏｌＥＤＡ−ＨＰＶＥ７またはＤＴｃ／Ｅ７（４９〜５７）ペプチドで免疫した。免疫７日後に、マウスを屠殺して脾臓細胞をＤＴｃ／Ｅ７（４９〜５７）ペプチドの存在または不在下で培養した。５日培養した後、ＣＴＬ活性を、ＤＴｃペプチドでパルスしたもしくはしない放射性標識ＥＬ４細胞（図５Ａ）または放射線照射したＴＣ−１細胞（図５Ｂ）を標的細胞として使用して、従来のクロム放出アッセイを使用して測定した（グラフは、ペプチドなしで得られた細胞溶解の値をペプチド存在下で得た値から差し引いて計算した絶対値を示す）。並行して、ＥＤＡＨＰＶ−Ｅ７またはＤＴｃ／Ｅ７（４９〜５７）ペプチドで免疫したマウスからの脾臓細胞を、Ｅ７（４９〜５７）ペプチドまたはＴＣ１細胞または放射線照射したＥＬ−４細胞の存在または不在下で２４時間インキュベートして、ＥＬＩＳＰＯＴを使用してＩＦＮ−γ産生を測定した（図５Ｃ）。
【０１６９】
実施例４
ポリＩ：Ｃおよびシクロホスファミドと組み合わせたＥＤＡ−ＨＰＶＥ７融合タンパク質の治療的有効性。
抗原送達系としておよびワクチンとしてのＥＤＡ−ＨＰＶＥ７の効力をさらによく評価するために、この融合タンパク質の治療的有効性とＥ７（４９〜５７）ペプチドの治療的有効性とを、両方ともＴＬＲリガンドｐＩ：Ｃで補完して比較した。それ故、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０５のＴＣ−１細胞を用いて皮下注射して、２５日後に、腫瘍の平均直径が約８ｍｍになったときに治療的に処置した。したがって、静脈注射で以下の組合せのＥＤＡワクチンによりマウスを処置した：（ｉ）５０μｇのｐＩ：Ｃを加えた２ｎｍｏｌのＥＤＡ−ＨＰＶＥ７；（ｉｉ）５０μｇのｐＩ：Ｃを加えた２ｎｍｏｌのペプチドＥ７（４９〜５７）；（ｉｉｉ）２ｎｍｏｌのＥＤＡおよび５０μｇのｐＩ：Ｃを加えた２ｎｍｏｌのＥ７（４９〜５７）ペプチド；（ｉｖ）５０μｇのｐＩ：Ｃを加えた２ｎｍｏｌのＥＤＡ；（ｖ）５０μｇのｐＩ：Ｃ単独；（ｖｉ）２ｎｍｏｌのＥＤＡ−ＨＰＶＥ７単独または；（ｖｉｉ）ＰＢＳ。
【０１７０】
ＰＢＳを注射したマウス（対照群）においては、腫瘍は継続的に成長して、マウスを３０日目と４０日目の間に屠殺しなければならなかった（図６Ａ）。抗原なしでアジュバントにより処置した腫瘍の大部分は、具体的にはｐＩ：ＣおよびＥＤＡ＋ｐＩ：Ｃで処置したマウスは、若干のマウスでは腫瘍成長の遅れが観察されたとはいえ、同じ腫瘍成長速度をたどった。この遅れは僅少に終わり、生存の延長は統計的に有意でない（図６Ｂ）。Ｅ７ペプチド（Ｅ７（４９〜５７））の免疫カクテルへの添加により、アジュバントにより誘発された腫瘍成長抑止は僅かに改善された（図６Ａ）。幾つかの腫瘍は、数日間腫瘍サイズの寛解を示し、さらに１匹のマウスでは腫瘍が完全に消失したが、しかしながら、腫瘍は成長し続けて、最終的にはマウスを屠殺した。融合タンパク質ＥＤＡ−ＨＰＶ Ｅ７は、単独では腫瘍を根絶することができなかったが、腫瘍成長における遅れは観察された。しかしながら、ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７とＴＬＲ３に結合する緩和なアジュバントであるｐＩ：Ｃとの組合せは、これらの大きい確立した腫瘍の根絶を６０％のマウスで達成することができた（図６Ａ）。腫瘍成長（図６Ａ）および生存（図６Ｂ）は両方とも、ｐＩ：Ｃ処置マウスとは有意に異なる（Ｅ７（４９〜５７）＋ｐＩ：Ｃで処置したマウスとＥＤＡ−ＨＰＶ Ｅ７＋ｐＩ：Ｃで処置したマウスとの間の尤度比検定を使用して決定してｐ＜０．０００４（図６Ａ）、および生存曲線の比較のためのログランク検定を使用して決定してｐ＜０．０５（図６Ｂ））。それ故、抗原とＥＤＡとの共有結合およびアジュバント共投与は両方とも、マウスにおける大きい腫瘍を根絶するために必要である。
【０１７１】
より困難な状況におけるＥＤＡ−ＨＰＶに基づくワクチン接種の治療的有効性をアッセイした。そのために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０５のＴＣ−１細胞を皮下注射して、３５日後に、腫瘍平均直径が約１２〜１５ｍｍになったときに治療的に処置した。このモデルにおいては、ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７をマウスの治療について低用量の化学療法剤シクロホスファミド（ＣＰＡ、１７５ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせた。２４時間後に、マウスをＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７（２ｎｍｏｌ／マウス）およびＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰ（３０μｇ／マウス）で免疫した。単独またはアジュバントと組み合わせたＰＢＳで免疫したマウスおよびＣＰＡ治療のみのマウス（図７Ｂ）を対照として使用した。図７Ａに示した図式に示したように、全ての動物は、対応する治療による第２の投与を検討の第５０日に受けた。
【０１７２】
ＣｐＧ／ＤＯＴＡＰを加えたＥＤＡ−ＨＰＶＥ７とＣＰＡとの組合せで２回免疫したマウスの治療は、これらの非常に大きい腫瘍を５０％のマウスにおいて拒絶することができたが、アジュバントおよびＣＰＡ投与による治療後に治癒したマウスは１２％だけであることが見出された（ＣＰＡ＋ＣｐＧ／ＤＯＴＡＰ治療マウスに対するＣＰＡ＋ＣｐＧ／ＤＯＴＡＰ＋ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７治療マウスの尤度比検定を使用して決定してｐ＝０．００６４（図７Ａ）および生存曲線の比較のためにログランク検定を使用して決定してｐ＜０．０５）（図７Ｃ）。
【０１７３】
まとめると、組替え融合タンパク質ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７は、樹状細胞の成熟を誘発し、インビボで抗腫瘍免疫応答の活性化を誘発し、且つＨＰＶＥ７タンパク質を発現している十分確立した大きい腫瘍を根絶することができることが証明された。これらのデータは、ヒト子宮頸癌に対する代替的療法の開発に対して、ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７タンパク質を考慮することができることを示唆する。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）により惹起される疾患を治療するための治療用組成物、さらに具体的には少なくとも１種のＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチドを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸癌は、全世界中の女性における最も一般的な癌の一つであり、癌全体の中で５番目に多く、患者数は１４０万例と推定される。種々のタイプの粘膜指向性のヒトパピローマウイルスに基づく慢性生殖管感染が子宮頸癌を引き起こすという一貫した証拠がある。
【０００３】
子宮癌に対して現在使用されている米国メルク社のＧａｒｄａｓｉｌと称するワクチンは、全子宮癌症例の約７０パーセントの根源にある該ウイルスの１６および１８型系統に対して９５パーセントを防御することができる。それは、生殖器官において疣贅を起こす６および１１型系統に対しても防御となる。
【０００４】
ＨＰＶの発癌性のタンパク質Ｅ６およびＥ７の発現は、悪性の形質転換、並びにＨＰＶ誘発病変の臨床的および細胞学的解決と関連してきたＥ７に対する細胞性免疫の開始および維持に必要である。
【０００５】
パピローマウイルスは、多くの様々な種に感染するＤＮＡウイルスである。これらのウイルスの幾つかは、それらの天然宿主における疾患の発生に関連している。同定されているヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のタイプは６０を超える。
【０００６】
これらのウイルスは、身体の複数の領域でヒト生体に感染して、皮膚の普通の疣贅、喉頭のパピローマ、その他の原因である。
【０００７】
ＨＰＶ生殖器感染は比較的頻度が高く、男性および女性の生殖管に最もしばしば感染するＨＰＶのタイプは６、１１、１６および１８型である。
【０００８】
女性において、ＨＰＶは、子宮頸部を含む生殖管の種々な部分に感染する。肛門と性器に関わる領域の感染は最も頻度の高い性行為感染症の一つと考えられるので、生殖器ＨＰＶは臨床的な問題である。ＨＰＶは、以下の形態において示される生殖器感染を惹起する：
ｉ）生殖器疣贅が示される臨床的感染；
ｉｉ）病変は目に見えないが、パパニコラウ細胞診などの特別の技法を使用して検出できるウイルス性病変である無症状感染；および、
ｉｉｉ）感染の単独の徴候がＨＰＶ ＤＮＡの存在である潜伏期。
【０００９】
他方、パパニコラウ細胞診の２から４％がＨＰＶの証拠を示すと見積もられるので、無症状感染は比較的一般的である。潜在的感染は、さらに高頻度であり、大部分の成人は１つまたは複数のタイプのＨＰＶを有すると推定される。
【００１０】
子宮頸癌は女性によく見られる癌である。この癌の中で、最も普通に見出される扁平上皮細胞癌（観察された症例の約９０％）と分泌細胞癌である腺癌とが区別される。子宮頸癌には数段階がある。前癌段階は前立腺上皮内新生物（ＣＩＮ）と呼ばれ、侵襲的形態（癌）に発展し得る。その前癌形態およびその侵襲的形態にある両者とも、子宮頸癌は、比較的信頼性のある費用のかからない技法、すなわちパパニコラウ検査を使用して診断することができる数少ない癌の一つである。
【００１１】
近年集められた証拠により、ＨＰＶの幾つかのタイプが子宮頸癌の発生と関連しており、これらのタイプの幾つかは癌の発生の原因となる病因性因子であることが示唆される。
【００１２】
ＨＰＶは子宮頸部発癌開始剤として作用し、悪性の形質転換は他の因子との相互作用に依存すると仮定されてきた。特にＨＰＶ−１６、一般的にはパピローマウイルスの性質は、近年研究されてきた。ＨＰＶ−１６は７９０４ｂｐの二重螺旋ＤＮＡゲノムを含む（Ｓｅｅｄｏｒｆ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，１９８５， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４５：１８１−１８５）。カプシドは直径５０ｎｍであり７２個のカプソメアを含む（Ｋｌｕｇ，Ａ．Ｊ．， １９６５， Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：４０３−４２３）。米国特許第４，７７７，２３９号は、ＨＰＶ−１６に対する抗体を発生することができて、それ故診断目的にとって有用な一連の１７個の合成ペプチドを教示している。
【００１３】
ＨＰＶは、ＨＰＶに誘発される異常な細胞増殖の病原性に関与するように思われる２種のタンパク質、Ｅ６およびＥ７をコードする（Ｓｔｏｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３７：１６８−１７９参照）。ＨＰＶ１６のＥ６およびＥ７タンパク質のアミノ酸配列はＳｅｅｄｏｒｆら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９８５、１４５： １８１−１８５）により定義された。
【００１４】
Ｅ６およびＥ７タンパク質をコードする遺伝子は、ＨＰＶ感染を伴った子宮頸癌腫瘍細胞で必ず発現しているようであることが観察されている。
【００１５】
Ｅ６およびＥ７タンパク質は腫瘍退縮に有効な免疫学的標的であると思われる。それにも拘わらず、前記タンパク質をコードするＤＮＡに基づくワクチン開発の可能性として、患者の細胞における不可逆的細胞形質転換事象の発症が生じ得る。ＥＰ０７９６２７３には、Ｅ６およびＥ７タンパク質の変異および非変異区域との融合タンパク質を使用して、望ましくない細胞形質転換を発生させずに、患者中で免疫応答を生じさせ得る組成物が記載されている。
【００１６】
Ｐｒｅｖｉｌｌｅら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００５，６５：６４１−６４９）は、百日咳菌（ボルデテラ・パータシス）のアデニレートシクラーゼ（ＣｙａＡ）と完全なＥ７タンパク質またはそれらの種々の領域とを含む種々の融合タンパク質を記載している。アデニレートシクラーゼはＣＤ１１ｂ＋樹状細胞に、αＭβ２インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）との相互作用により結合することができ、それ故融合タンパク質の幾つかは、ＨＰＶ１６ Ｅ７を発現する腫瘍細胞に対する特異的免疫応答（ヘルパーＴおよび細胞傷害性Ｔ）を引き起こすことができる。
【００１７】
Ｂｅｒｒａｏｎｄｏ Ｐら（Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００７、６７：８８４７：８８５５）は、ＣｙａＡとアミノ酸３０から４２までを欠くＨＰＶ１６の切断型（ＣｙａＡ−Ｅ７Ｌｌ３０−４２）とを含む組換えタンパク質、カチオン性脂質と関連したＣｐＧおよびシクロホスファミドにより形成される組成物を記載している。この組成物はＥ７を発現する腫瘍に対する免疫応答を生じさせることができる。
【００１８】
しかしながら、望ましくない細胞形質転換を生じさせずに、ＨＰＶタンパク質を発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を患者中に生じさせることができるさらなる免疫原性組成物並びに免疫応答の発生に相乗的に作用して前記タンパク質の投与量を減少させることができるような前記タンパク質と追加成分とを含む組成物に対する必要性が未だ存在する。
【発明の概要】
【００１９】
第１の態様において、本発明は、
（ｉ）フィブロネクチンのＥＤＡ領域またはそれらの機能的に同等な変異体、および、
（ｉｉ）少なくとも１種のＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチド
を含み、成分（ｉ）と（ｉｉ）とが共有結合してなる複合体であって、
抗原性ペプチド(peptide or peptides)に対する細胞傷害性応答を助長する複合体に関する。
【００２０】
それに加わる態様において、本発明は、本発明の複合体をコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物と、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の遺伝子構築物を含むベクターと、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物または本発明のベクターを含む細胞とに関する。
【００２１】
他の態様において、本発明は、
（ｉ）本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明による宿主細胞、および、
（ｉｉ）ＴＬＲリガンド、
を一緒にまたは別々に含む第１組成物に関する。
【００２２】
他の態様において、本発明は、
（ｉ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体、請求項７に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞、
（ｉｉ）ＴＬＲリガンドおよび、
（ｉｉｉ）化学療法剤
を一緒にまたは別々に含む第２の組成物に関する。
【００２３】
他の態様において、本発明は、医薬組成物、すなわち、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の第１のまたは第２の組成物および少なくとも１種の薬理学的に許容されるアジュバントを含む本発明の医薬組成物に関する。
【００２４】
他の態様において、本発明は、医学において使用するための、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の第１のまたは第２の組成物または本発明の医薬組成物に関する。
【００２５】
他の態様において、本発明は、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の第１のまたは第２の組成物または本発明の医薬組成物の、ワクチンを製造するための使用に関する。
【００２６】
他の態様において、本発明は、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の第１のまたは第２の組成物または本発明の医薬組成物の、ヒトパピローマウイルスにより惹起される感染および／またはＨＰＶ感染と関連する子宮頸癌の予防および治療のための医薬を製造するための使用に関する。
【００２７】
他の態様において、本発明は、少なくとも１種のＨＰＶ Ｅ７抗原を表示する成熟樹状細胞を得るためのインビトロの方法すなわち、
（ｉ）樹状細胞を、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の第１のまたは第２の組成物と、樹状細胞の成熟が起こるのに適した条件で接触させ、かつ
（ｉｉ）成熟樹状細胞を回収すること
を含む本発明の方法に関する。
【００２８】
他の態様において、本発明は、本発明の方法により得られる細胞、または本発明の第２の細胞に関する。
他の態様において、本発明は、医学において使用するための本発明の第２の細胞に関する。
【００２９】
他の態様において、本発明は、ヒトパピローマウイルスにより惹起される感染および／またはＨＰＶ感染と関連する子宮頸癌を予防および治療するための医薬を製造するための本発明の第２の細胞の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】組替えＥＤＡ−ＨＰＶＥ７融合タンパク質の図式的表示である。Ｅ７タンパク質の最初の２９個のアミノ酸はＥＤＡのＮ端に位置したが、Ｅ７のアミノ酸４３〜９８はＥＤＡのＣ端に挿入されていた。融合タンパク質の配列は、アミノ酸についての単一のコードを使用して示す。Ｅ７タンパク質のアミノ酸は灰色で示すが、それに対してＥＤＡのアミノ酸は黒色で描いてある。ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７組替えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。５マイクログラムの精製タンパク質を１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離してクロマジーブルーで染色した。
【図２】ＥＤＡＨＰＶ−Ｅ７融合タンパク質による骨髄由来の樹状細胞成熟の活性化を示す図である。骨髄由来の樹状細胞を、ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７（５００ｎＭ）、ペプチドＥ７（４９−５７）（５００ｎＭ）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）（陽性対照）または培養培地（陰性対照）と共に４８時間インキュベートした。次に細胞を捕集して、フローサイトメトリーによりＨ−２ｂ分子または成熟マーカーＣＤ５４およびＣＤ８６（ＲＦＵ：相対蛍光単位）の発現について分析した。
【図３】ＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７融合タンパク質は、骨髄由来の樹状細胞によるＩＬ−１２の産生またはヒト単球細胞ラインＴＨＰ−１によるＴＮＦ−αの産生を誘発する。（Ａ）骨髄由来の樹状細胞を、ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７（５００ｎＭ）、ペプチドＥ７（４９−５７）（５００ｎＭ）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）（陽性対照）または培養培地（陰性対照）と共に４８時間インキュベートした。２４時間後に、培養上清を捕集して上清に放出されたＩＬ−１２をＥＬＩＳＡにより測定した。 （Ｂ）ＴＨＰ−１細胞を、ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７（５００ｎＭ）、ペプチドＥ７（４９−５７）（５００ｎＭ）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）または培養培地（陰性対照）と共に１５時間インキュベートした。培養後、上清を捕集して放出されたＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡにより測定した。
【図４】ＰＢＳ中におけるＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７タンパク質またはＤＴｃ／Ｅ７（４９−５７）ペプチドを用いた免疫によるＣＴＬのインビボ誘発を示す図である。（Ａ）マウスは、２ｎｍｏｌＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７またはＤＴｃ／Ｅ７（４９−５７）ペプチドを静脈注射して免疫した。免疫後７日にマウスを屠殺して、脾臓細胞をＤＴｃペプチドの存在または不在下に５日間培養した。ＣＴＬ活性は、タンパク質ＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７（黒丸印）、ペプチドＤＴｃ／Ｅ７（４９−５７）（白丸印）で免疫したマウスから得た脾臓細胞培養中で、放射性標識してＤＴｃペプチドをパルスで適用したＥＬ４細胞を標的細胞として使用する従来のクロム放出アッセイを使用して測定した（グラフでは絶対値を示し、前記の値はペプチドの存在下で得られた値からペプチド無添加で得られた細胞溶解の値を差し引くことにより計算した）。（Ｂ）ＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７またはＤＴｃ／Ｅ７（４９−５７）ペプチドで免疫したマウスからの脾臓細胞中で、ペプチドＥ７（４９−５７）に応答してＩＦＮ−γを産生する細胞または放射線照射したＴＣ１もしくはＥＬ−４細胞のＥＬＩＳＰＯＴによる測定。
【図５】ＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７タンパク質またはｐＩ：Ｃと混合したペプチドＤＴｃ／Ｅ７（４９−５７）を用いた免疫によるＣＴＬのインビボ誘発を示す図である。マウスを、ｐＩ：Ｃ（５０μｇ／マウス）の存在下で２ｎｍｏｌのＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７またはＤＴｃ／Ｅ７（４９−５７）ペプチドを静脈注射して免疫した。免疫後７日にマウスを屠殺して、脾臓細胞をＤＴｃ／Ｅ７（４９５７）ペプチドの存在または不在下で５日間培養した。ＣＴＬ活性は、ＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７＋ｐＩ：Ｃタンパク質またはＤＴｃ／Ｅ７（４９−５７）＋ｐＩ：Ｃペプチドで免疫したマウスから得た脾臓細胞培養中で、放射性標識してＤＴｃペプチドをパルスで適用したＥＬ４細胞（黒丸印）（Ａ）または放射線照射したＴＣ−１細胞（Ｂ）（白丸印を）を標的細胞として使用して、従来のクロム放出アッセイを使用して測定した。（Ｃ）ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７＋ｐＩ：ＣまたはＤＴｃ／Ｅ７（４９−５７）＋ｐＩ：Ｃで免疫したマウスからの脾臓細胞中における、Ｅ７（４９−５７）ペプチドまたは放射線照射したＴＣ１細胞もしくはＥＬ−４細胞に対して応答してＩＦＮ−γを産生する細胞の測定。
【図６Ａ】ポリＩ：Ｃ（ｐＩ：Ｃ）と組み合わせたＥＤＡ−ＨＰＶＥ７融合タンパク質の治療有効性を示す図である。マウスに５×１０５個のＴＣ−１細胞を注射して２５日後に、腫瘍の平均直径が約８ｍｍになったときに、マウスにＥＤＡを主成分とする種々のワクチンの組合せを静脈内に注射した。（Ａ）垂直な２箇所の直径の平均（ミリメートル）として表示する腫瘍サイズを、規則的な間隔で測定した。第１００日における実験に含まれたマウスの数の合計に対する腫瘍のないマウスの数、および第１００日における生存率（％）を各組の実験について示す。ＥＤＡ−Ｅ７／ｐＩ：Ｃで処置した群における腫瘍の成長とｐＩ：Ｃで処置した群における腫瘍の成長とを比較する尤度比検定により決定したｐ−値（＊ｐ＜０．０５）を示す。マウスを、腫瘍直径が２０ｍｍに達したときまたは動物の衛生状態に基づいて必要なときに屠殺した。
【図６Ｂ】（Ｂ）免疫原を示して、免疫したマウスの生存曲線を示す（ｐ値を示す（（＊ｐ＜０．０５））。２つの独立の実験をプールしたデータを示す。
【図７Ａ】大きい腫瘍モデルにおけるＥＤＡ−ＨＰＶＥ７融合タンパク質の治療的有効性を示す図である。（Ａ）ＣＳ７ＢＬ／６マウスに５×１０５個のＴＣ−１細胞を注射して３５日後に、腫瘍の平均直径が約１２〜１５ｍｍになったとき、マウスは治療せずにおくかまたは特効薬として１７５ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド（ＣＰＡ）を単回投与で与えられた。第３６日に、対照マウス群にＰＢＳまたは３０μｇのＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰを静脈注射した。ワクチン接種したマウスに５０μｇのＥＤＡ−Ｅ７および３０μｇのＣｐＧＢ／ＤＯＴＡＰを静脈注射した。ＣｐＧＢ／ＤＯＴＡＰで処置した対照群は、第５０日にシクロホスファミド、および第５１日にＣｐＧＢ／ＤＯＴＡＰの２回目の投与を受けた。治療したマウスは、第５０日にシクロホスファミドおよび第５１日にＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７／ＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰの注射により２回目のワクチン投与を受けた。
【図７Ｂ】（Ｂ）垂直な２箇所の直径の平均（ミリメートル）として表示する腫瘍サイズを、定期的間隔で測定した。第１５０日における、実験に含まれた動物の合計数に対する腫瘍のないマウスの数および第１５０日における生存率（％）を実験の各組について示す。マウスは、腫瘍直径が２２ｍｍに達したときまたは動物の衛生状態に基づいて必要なときに屠殺した。
【図７Ｃ】（Ｃ）免疫原を示して、免疫したマウスの生存曲線を示す（ｐ値を示す（（＊ｐ＜０．０５））。２つの独立の実験をプールしたデータを示す。
【発明の具体的説明】
【００３１】
本発明の複合体
本発明らは、フィブロネクチンのＥＤＡ領域とＨＰＶ−Ｅ７すなわちＥ７タンパク質の免疫原領域とを含む組替えタンパク質が、インビトロで樹状細胞の成熟を誘発し得ることに加えて、前記タンパク質を発現する腫瘍に対してＣＤ８＋Ｔ細胞により媒介される強力な抗腫瘍活性を生じ得ることを観察した。したがって、本発明の実施例１で観察されるように、前に言及した融合タンパク質と骨髄由来の樹状細胞との接触により、種々の樹状細胞成熟マーカーの発現レベルの定量から推論されるように、前記細胞の成熟が惹起される。それに加えて、本発明の実施例２で観察されるように、前記融合タンパク質の動物モデルへの投与により、Ｅ７タンパク質を発現する腫瘍細胞に対する、細胞傷害性Ｔ細胞により媒介される免疫応答を生じさせることができる。
【００３２】
したがって、第１の態様において、本発明は：
（ｉ）フィブロネクチンのＥＤＡ領域または機能的に同等なそれらの変異体、および
（ｉｉ）少なくとも１種のＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチド
を含み、
成分（ｉ）と（ｉｉ）とが共有結合してなる複合体であって、抗原性ペプチド（単数または複数）に対する細胞傷害性応答を助長する複合体（以後、本発明の複合体）に関する。
【００３３】
複合体の第１の構成要素は、フィブロネクチンのＥＤＡ領域または機能的に同等なそれらの変異体である。
【００３４】
用語「ＥＤＡ領域」または「エキストラタイプＩＩＩ」は本明細書において区別せずに使用され、フィブロネクチン遺伝子のエクソン転写／翻訳により生じて、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）に対する特異的親和性を示すフィブロネクチン分子の領域を指す。このドメインは、Ｍｕｒｏ Ａ．Ｆ．ら（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２００３，１６２：１４９−１６０）により最初に記載された。ＥＤＡ領域は、マウスフィブロネクチン（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＤ１２２５０．１）またはラットフィブロネクチン（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＢ４０８６５．１）などの異なる種から得られるフィブロネクチンから誘導することができる。
【００３５】
本明細書において使用する、「フィブロネクチン」は、血液中および組織の細胞間質中に存在する多官能性高分子量糖タンパク質として理解されている。フィブロネクチンは、Ｃ末端のジスルフィド結合により結合した２つの同一のポリペプチド鎖により形成される二量体である。各モノマーは、およその分子量が２３０〜２５０ｋＤａである。各モノマーは、３タイプの構造単位：タイプＩ、タイプＩＩおよびタイプＩＩＩを含む。これらの構造単位の各々は、２本の逆平行のβヘリックスにより形成される。
【００３６】
「機能的に同等な変異体」は、ＥＤＡ配列からの改変、１つもしくは複数のアミノ酸の挿入および／または欠失により誘導されるが、但し、ＴＬＲ４受容体への結合機能および樹状細胞を活性化する機能は実質的に保たれるこれら全てのペプチドとして理解される。機能的に同等な変異体は、フィブロネクチンＥＤＡドメインに関して、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を超える同一性を示す変異体である。２種のアミノ酸配列間の同一性の程度は、従来の方法により、例えば、例えばＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９０ Ｏｃｔ ５；２１５（３）：４０３−１０）などの当技術分野において知られた標準的配列アラインメントアルゴリズムにより決定することができる。当業者は、この記載で参照されたアミノ酸配列は、例えば、リン酸化、アセチル化などの生理学的に関連する化学的改変により、化学的に改変することができることを理解するであろう。したがって、本明細書において使用する「機能的に同等な変異体」という表現は、問題のポリペプチドまたはタンパク質が、フィブロネクチンのＥＤＡ領域の少なくとも１つの機能、好ましくは免疫応答に関する少なくとも１つの機能、特に、ＴＬＲ４と相互作用して樹状細胞の成熟を促進する能力を維持する機能を保つことを意味する。機能的に同等な変異体のＴＬＲ４と相互作用する能力は、当業者により知られた従来の方法を使用することにより決定することができる。例えば、簡単な実例として、フィブロネクチンのＥＤＡ領域の変異体がＴＬＲ４に結合する能力は、関心のあるタンパク質（例えばＥＤＡ変異体）が特異的抗体を用いて単離される共免疫沈殿実験を使用して決定することができ、該タンパク質と相互作用する分子（例えばＴＬＲ４）がそれに続いてウェスタンブロットにより同定される。自然の条件における酵母ツーハイブリッドアッセイまたは電気泳動アッセイも、使用することができる。後者の方法は、タンパク質錯体のポリアクリルアミドゲル中におけるそれらの分子量に基づく移動に基づく。移動が電
荷によっても規定されるなら、タンパク質に、変性せずにまたは他のタンパク質とそれらとの相互作用を破壊せずに正味の負の電荷を付与するクーマジーブルーを含有する溶液が陰極緩衝剤として使用される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中の第２の変性範囲により、スポットを分離して、それに続きコンプレックスを形成するサブユニットの同一性を質量分析法により同定することが可能になる。ＥＤＡの機能的と同等な変異体の樹状細胞の成熟を促進する能力を決定するアッセイは、当業者により知られており、例えば、ＩＡｂ、ＣＤ５４、ＣＤ８６およびＩＬ−１２などの種々の成熟樹状細胞マーカーの発現レベルを決定することに基づく、本出願の実施例１に記載したアッセイなどがある。
【００３７】
当業者は、ＥＤＡドメインの配列をコードするヌクレオチド配列における、タンパク質の機能性にとって決定的ではない位置においてアミノ酸の保存的置換を起こす変異は、その構造または機能性全体に影響しない進化に中性の変異であることを理解している。
【００３８】
好ましい態様において、本発明の複合体のフィブロネクチンＥＤＡ領域は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース中の受入番号ＦＩＮＣ＿ヒトで示されたヒトフィブロネクチンのアミノ酸１，６３１から１，７２１までに対応し、それは配列番号１の配列のポリペプチドに相当する。
【００３９】
本発明の複合体の成分（ｉｉ）は、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質に由来する１種または複数種の抗原性ペプチドである。Ｅ７タンパク質は、種々のＨＰＶ血清型に由来し得る。したがって、本発明の関係で使用することができるＥ７タンパク質には、ヒトＨＰＶ血清型８０（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ７５４７１．１）のタンパク質Ｅ７、ヒトＨＰＶ血清型６８（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＬ１２３５２．１）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型１１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＬ１２３４３）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型５９（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＬ１２３３５）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型３３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＬ１２３２７）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型７２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ６３８７４）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型１６（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＬ１２３１１）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型１３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＣ７９０５８）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型７３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ６３８８３）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型９６（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＱ８８２９０）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型３１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＲ１３０１５）のタンパク質Ｅ７の形質転換変異体、ヒトＨＰＶ血清型２５（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ０９１１７）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型２１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ０９１１６）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型２０（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ０９１１５）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型１４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ０９１１４）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型１２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ０９１１３）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型２７ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＥ１６２６４）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型７７（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ７５４５７）ヒトＨＰＶ血清型７６（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ７５４５７）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型７５（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ７５４５０）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿０７７１１７）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型３８（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＱ１６１１５、ＣＡＱ１６１１４、ＣＡＱ１６１１３、ＣＡＱ１６１１２、ＣＡＱ１６１１１、ＣＡＱ１６１１０、ＣＡＱ１６１０９、ＣＡＱ１６１０８、ＣＡＱ１６１０７、ＣＡＱ１６１０６、ＣＡＱ１６１０５、ＣＡＱ１６１０４、ＣＡＱ１６１０３、ＣＡＱ１６１０２、ＣＡＱ１６１０１、ＣＡＱ１６１００）の発癌性のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型９４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＦ０５７１０
）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型９５（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＦ０５７０３）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型４３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＦ０５７８４）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型５ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ４２８１８）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型１０３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＹＰ＿６５６４９３）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型１０１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＺ３９５０７）のＥ７、ヒトＨＰＶ血清型１０３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＺ３９４８５）のＥ７が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
本明細書において使用する表現「抗原性ペプチド」は、生体の免疫系を刺激して抗原特異的細胞または液性応答を発生させることができる１つまたは複数のエピトープを含むペプチド分子を指す。抗原性ペプチドと被験者の適当な細胞とを接触させた結果として、抗原は前記被験者に免疫応答の感度または能力を生じさせ、その結果、前記被験者から得られる抗体および免疫細胞は両方とも抗原と特異的に反応することができる。
【００４１】
本明細書において使用する表現「ＨＰＶ Ｅ７タンパク質由来の抗原性ペプチド」は、Ｅ７の発現により惹起される腫瘍の成長を阻害またはＨＰＶの増殖を阻害することができる、前記タンパク質に対する免疫応答が生ずるように哺乳動物の免疫系を刺激することができるＨＰＶ Ｅ７タンパク質フラグメントを意味する。
【００４２】
抗原（単数または複数）は、完全なＥ７タンパク質だけでなく、前記タンパク質の単離されたドメイン、Ｅ７タンパク質のペプチド断片または複数のエピトープ（例えば５から１００の異なったエピトープ）を含むポリエピトープ融合タンパク質であってよいことが観察されるであろう。該ポリペプチドは、場合により追加の区域を含むことができ、例えば、少なくとも４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、９０またはさらに１００以上の区域を含むことができて、各々は病原性物質の天然に生ずるＥ７タンパク質および／または他の区域が由来するタンパク質（単数または複数）と同じであっても異なっていてもよい天然に生ずる腫瘍抗原の一部分である。これらの区域の各々は、少なくとも８アミノ酸の長さを有することができて、各々、他の区域のエピトープと異なる少なくとも１つのエピトープ（好ましくは２つ以上）を含む。ハイブリッドポリペプチド中の少なくとも１つの（好ましくは少なくとも２または３）区域は、例えば、３、４、５、６、７またはさらに１０以上のエピトープ、特にＭＢＣクラスＩまたはクラスＩＩに結合するエピトープを含むことができる。２または３以上の区域は、ハイブリッドポリペプチドに近接することができる；すなわち、それらは、それらの間にスペーサなしで端末間で結合することができる。あるいは、任意の２つの隣接する区域は、アミノ酸のスペーサまたはペプチドのスペーサにより結合することができる。
【００４３】
表ＩはＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチドの例である。
【００４４】
【表１】
【００４５】
当業者は、ＨＰＶ Ｅ７ペプチドが抗原性であるかどうかを決定する種々の方法、例えば、実施例２で使用する方法（ＥＬＩＳＰＯＴ）またはＴリンパ球により媒介される標的抗原性ペプチドの活性を検出するインビトロのプロセスを記載する特許ＥＰ１３３４１７７−Ｂ１に記載された方法について知っている。
【００４６】
好ましい態様において、本発明の複合体の一部を形成する抗原性ペプチドは、ＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質から誘導される。
【００４７】
本発明の複合体の特定の態様において、後者は、Ｅ７のアミノ酸の第１〜２９番まで（配列番号５１）に対応するまたはそれを含むＨＰＶ Ｅ７タンパク質由来の抗原性ペプチド、Ｅ７のアミノ酸第４３〜９８番まで（配列番号５２）に対応するまたはそれを含む抗原性ペプチドまたはそれら両方を含む。
【００４８】
本発明の複合体の特定の態様において、ＥＤＡ領域には、２つのＨＰＶ Ｅ７抗原性ペプチドが並んで配置されている。さらにより好ましい態様において、融合タンパク質の配列は配列番号５３または配列番号７２である。
【００４９】
特定の態様において、成分ｉｉ）は、単独のポリペプチド鎖をまたは成分ｉ）とともに融合タンパク質を形成する。
【００５０】
本発明の融合タンパク質の単離および精製を容易にする目的で、前記融合タンパク質は、所望であれば、融合タンパク質を単離または精製する目的のために使用することができるタグペプチドなどの追加のペプチドを含有することができる。前記タグペプチドは、ポリペプチド（ｉ）および（ｉｉ）のいずれの機能性も変化させない、融合タンパク質の任意の位置に所在することができる。限定するものではない例示として、前記タグペプチドは、タグペプチドのＣ末端が本発明の複合体のＮ末端に結合するように、本発明の複合体のＮ末端位に所在することができる。あるいは、タグペプチドは、タグペプチドのＮ末端が本発明の複合体のＣ末端に結合するように、本発明の複合体のＣ末端位に所在することができる。実質的には、融合タンパク質の単離または精製を可能にする任意のペプチドまたはペプチド配列を使用することができる、例えば、ポリヒスチジン配列、生じた融合タンパク質を免疫アフィニティクロマトグラフィーにより精製するのに役立ち得る抗体により認識され得るペプチド配列、例えばタグペプチドなど、例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＲＡ）由来のエピトープ（Ｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． ＢｉｏＩ．，８：２１５９−２１６５）、Ｃ−ｍｙｃおよびそれに対する抗体８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０（Ｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５：３６１０−３６１６）；単純ヘルペスウイルスＤ（ｇＤ）タグタンパク質およびそれらの抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ３：５４７−５５３）などである。他のタグペプチドには、フラッグペプチド（Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．， １９８８， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６：１２０４−１２１０）およびＫＴ３エピトープ（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５５： １９２−１９４）が含まれる。タグペプチドは、一般的に、アミノまたはカルボキシ末端に配列される。
【００５１】
当業者は、フィブロネクチンのＥＤＡ領域がその樹状細胞を活性化する性質を保ち、且つＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチドの領域（単数または複数）が抗原性の性質を保つ限り、本発明の複合体の異なった構成要素は任意の順で置かれてよいことを認識するであろう。
【００５２】
したがって、常にＮ末端からＣ末端方向へと構成要素の配置を示す、本発明の複合体の構成要素の配列の例は、とりわけ：
・ＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチド−フィブロネクチンＥＤＡ、
・フィブロネクチンＥＤＡ−ＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチド、
・フィブロネクチンＥＤＡ−ＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチド−フィブロネクチンＥＤＡ、
・ＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチド−フィブロネクチンＥＤＡ−ＨＰＶ３５Ｅ７由来の抗原性ペプチド、
・最後の２つの反復
である。
【００５３】
当業者は、本発明の複合体を形成する構成要素、すなわち、ＥＤＡペプチドと少なくとも１種のＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチドとが、直接複合体化し得るかまたは、あるいは、それらが前記成分間のリンカーとしてはたらく追加のアミノ酸配列を含有し得ることを理解するであろう。本発明により、前記中間アミノ酸配列は、前記ドメイン間の蝶番部としてはたらき、それらが個々のドメインの３次元形態を保ちながら互いに独立に動くことを可能にする。
この意味で、本発明による好ましい中間アミノ酸配列は、この運動を可能にする構造的延性により特徴づけられる蝶番部であろう。特定の態様において、前記中間アミノ酸配列は柔軟性リンカーである。好ましい態様において、前記柔軟性リンカーは、２０アミノ酸以下の長さの柔軟性リンカーペプチドである。
【００５４】
リンカー領域の効果は、ＥＤＡペプチドと成分（ｉｉ）との間にスペースを提供することである。したがって、ＥＤＡペプチドの二次構造は成分（ｉｉ）の存在により影響されずおよび逆も成り立つことが保証される。スペーサは、好ましくはポリペプチドの性質のものである。リンカーペプチドは、好ましくは、少なくとも２アミノ酸、少なくとも３アミノ酸、少なくとも５アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも７０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも９０アミノ酸または約１００アミノ酸を含む。
【００５５】
より好ましい態様において、リンカーペプチドは、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群から選択される２つ以上のアミノ酸を含む。本発明の好ましい態様において、前記柔軟性リンカーは、ポリグリシンリンカーである。リンカー／スペーサの可能な例には、ＡＧＳＳＴＧＳＳＴＧＰＧＳＴＴ（配列番号：５５）またはＧＧＳＧＧＡＰ（配列番号５６）が含まれる。これらの配列は、設計して巻いたコイルを他のタンパク質ドメインに結合するために使用されてきた（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｋ．Ｍ．，Ａｒｎｄｔ，Ｋ．Ｍ．ａｎｄ Ａｌｂｅｒ，Ｔ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｉｍｏｌｏｇｙ， ２０００， ３２８：２６１−２８１）。好ましくは、前記リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＶＥＧＧＧ（配列番号５７）を含むかまたはそれからなる。
【００５６】
リンカーは、本発明の複合体の２つの成分の上下流に隣接する成分に共有結合により結合することができる。スペーサは、本質的に非免疫原性であり、および／またはタンパク分解されやすくなく、および／またはシステイン残基を全く含まないことが好ましい。同様に、スペーサの３次元構造は、好ましくは線状または実質的に線状である。
【００５７】
スペーサまたはリンカーペプチドの好ましい例として、結合したタンパク質の機能を実質的に損なわずにまたは結合したタンパク質の少なくとも一方の機能を実質的に損なわずに、タンパク質を結合するために使用されてきたものが挙げられる。スペーサまたはリンカーは巻かれたコイル構造を含むタンパク質を結合するためにより好ましく使用されてきた。
【００５８】
リンカーは、テトラネクチン中でβ−シートを形成するテトラネクチン残基５３〜５６、およびテトラネクチン中で折り返しを形成する残基５７〜５９を含むことができる（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｂ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１２：３８８−３９６，１９９７）。セグメントの配列はＧＴＫＶＨＭＫ（配列番号５８）である。このリンカーは、天然テトラネクチン中に存在するとき、３量化ドメインがＣＲＤドメインと結合しており、それ故それは、一般的に３量化ドメインを他のドメインに接続するのに適するという利点を有する。さらに、生じる構築物は、リンカーのない構築物より免疫原性が強くないと期待される。
【００５９】
あるいは、適当なリンカーペプチドは、マウスＩｇＧ３の上方蝶番部の１０アミノ酸残基の配列を基礎に形成することができる。このペプチド（ＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳ、配列番号５９）は、巻かれたコイルによる２量化した抗体の産生のために使用されたことがあり（Ｐａｃｋ Ｐ． ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．， １９９２， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：１５７９−１５８４）、本発明によるスペーサペプチドとして有用であり得る。さらにより好ましくは、それは、ヒトＩｇＧ３の上方蝶番部の対応する配列であり得る。ヒトＩｇＧ３の配列は、ヒトにおいて免疫原性ではないと期待される。本発明の複合体で使用することができるさらなるリンカーペプチドには、配列ＡＰＡＥＴＫＡＥＰＭＴ（配列番号６０）のペプチドおよび配列ＧＡＰのペプチドが含まれる。
【００６０】
あるいは、本発明の複合体の２つの成分は、配列がプロテアーゼの切断標的を含むペプチドにより接続することができ、したがって成分（ｉｉ）のＥＤＡペプチドの分離が可能になる。本発明のポリペプチドに組み込むのに適したプロテアーゼ切断部位には、エンテロキナーゼ標的部位（配列ＤＤＤＤＫ配列番号６１）、Ｘａ因子標的部位（切断部位ＩＥＤＧＲ、配列番号６２）、トロンビン標的部位（切断部位ＬＶＰＲＧＳ、配列番号６３）、プロテアーゼＴＥＶ標的部位（切断部位ＥＮＬＹＦＱＧ、配列番号６４）、切断用プロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ）標的部位（切断部位ＬＥＶＬＦＱＧＰ、配列番号６５）およびインテイン標的部位等が含まれる。
【００６１】
本発明の複合体を得る方法
本発明の複合体は、当業者に知られた任意の方法を使用して得ることができる。したがって、ＥＤＡペプチドまたは前記タンパク質の変異体を任意の標準的方法により得ることは可能である。例えば、ＥＤＡペプチドは、ｃＤＮＡから、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、出芽酵母（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、メタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの異種生体中における発現により得ることができる。
【００６２】
十分な量の精製されたＥＤＡペプチドが利用可能になれば、後者をＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチド（単数または複数）と複合体化しなければならない。成分（ｉｉ）とＥＤＡ分子との複合体化は、種々の方法で実施することができる。一つの可能性は、官能基を治療的有効成分に、前記成分の活性を妨げない位置で直接結合することである。本発明において理解される官能基とは、前記分子の特徴的化学的反応に寄与する、分子中の特別の原子団のことである。官能基の例として、ヒドロキシ、アルデヒド、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、カルボキサミド、第一級、第二級、第三級および第四級アミン、アミノキシ、アジド、アゾ（ジイミド）ベンジル、カーボネート、エステル、エーテル、グルオキシリル、ハロアルキル、ハロホルミル、イミン、イミド、ケトン、マレイミド、イソシアニド、イソシアネート、カルボニル、ナイトレート、ナイトライト、ニトロ、ニトロソ、ペルオキシド、フェニル、ホスフィン、ホスフェート、ホスホノ、ピリジル、スルフィド、スルホニル、スルフィニル、チオエステル、チオールおよび酸化された３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）基が挙げられるが、これらに限定されない。前記基の例は、ＡｐｏＡ分子中でチオール基と特異的に反応するマレイミドまたはグリオキシリル基、およびＥＤＡ分子および成分（ｉｉ）中の第一級アミノ基と反応する、酸化された３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）基である。
【００６３】
もう一つの可能性は、成分（ｉｉ）とＥＤＡ分子とを、ホモまたはヘテロの二官能性基により複合体化することである。二官能性基は、最初に治療的有効化合物に結合し、次に、ＥＤＡペプチドと複合化することができ、または、別の方法で、二官能性基をＥＤＡペプチドに結合させて、次に、後者を成分（ｉｉ）と複合体化することが可能である。このタイプの複合体の実例には、ケトン−オキシムとして知られる複合体が含まれ（ＵＳ２００５０２５５０４２中に記載されている）、その場合、複合体の第１成分は、ヘテロの二官能性基中に存在するケトン基に結合しているアミノキシ基を含み、ヘテロの二官能性基は、順送りで複合体の第２成分中のアミノ基と結合している。
【００６４】
他の態様において、本発明の複合体の成分（ｉ）と（ｉｉ）とを複合体化するために使用される作用剤は、光分解で、化学的に、熱的にまたは酵素的に処理することができる。特に、治療的に有効な化合物だけが細胞中に放出されるように、標的細胞中にある酵素により加水分解され得る連結剤の使用は、興味がある。細胞内で処理され得る連結剤のタイプの例は、ＷＯ０４０５４６２２、ＷＯ０６１０７６１７、ＷＯ０７０４６８９３およびＷＯ０７１１２１９３に記載されている。
【００６５】
好ましい態様において、本発明の複合体の成分（ｉｉ）は、オリゴペプチドおよびペプチドの両方を含むペプチド性の化合物であるから、当業者にとって周知であり、システイン部分に存在するチオール基による複合化に基づく方法、リシン部分に存在する第一級アミノ基による複合化に基づく方法（ＵＳ６８０９１８６）、Ｎ−末端部分とＣ末端部分とによる複合化に基づく方法を含む、ポリペプチド鎖を化学的に改質する方法を使用することができる。ポリペプチドを改質してそれらの他の化合物とのカップリングを可能にするために適した試薬には：グルタルアルデヒド（ポリペプチドのＮ末端に化合物を結合することを可能にする）、カルボジイミド（ポリペプチドのＣ末端に化合物を結合することを可能にする）、Ｎ末端およびシステイン部分の活性化を可能にするスクシンイミドエステル（例えばＭＢＳ、ＳＭＣＣ）、チロシン部分の活性化を可能にするベンジジン（ＢＤＢ）、これらのグリコシル化されたタンパク質中の炭水化物部分の活性化を可能にする過ヨウ素酸塩が含まれる。
【００６６】
本発明のポリヌクレオチド、遺伝子構築物、ベクターおよび宿主細胞
ＥＤＡ成分およびＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチド（単数または複数）が単一のペプチド鎖を形成する特定の事象において、前記複合体をコードするポリヌクレオチドを使用する単一ステップでの複合体の発現は可能である。したがって、他の態様において、本発明は、本発明の複合体をコードするポリヌクレオチドに関する。当業者は、本発明のポリヌクレオチドが、成分（ｉｉ）とＥＤＡポリペプチドまたはその機能的に同等な変異体とが単一のペプチド鎖を形成するこれらの複合体だけを、相対的位置関係とは独立に且つ両成分が直接連結しているかまたはスペーサ領域により分離しているかという事実とは独立にコードすることを理解するであろう。
【００６７】
本発明において使用する用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さで、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドにより形成されたヌクレオチドのポリマー形態を指す。該用語は、一本鎖および二重螺旋ポリヌクレオチド、並びに改変ポリヌクレオチド（メチル化された、保護された等）を含む。
【００６８】
他の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物（本明細書においては今後本発明の遺伝子構築物と称する）に関する。構築物は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する配列に機能的に結合した本発明のポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドが発現する細胞と適合性であれば、原則として、任意のプロモーターを本発明の遺伝子構築物のために使用することができる。したがって、本発明を実施するのに適したプロモーターには、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ＣＭＶ、トリ肉腫ウイルス、肝炎Ｂウイルスなど真核生物のウイルスのゲノムに由来するものなどの構成型プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、レトロウイルスＬＴＲ領域、免疫グロブリン遺伝子プロモーター、アクチン遺伝子プロモーター、ＥＦ−１α遺伝子プロモーター、並びにタンパク質発現が分子またはテトラサイクリン系、ＮＦＫＢ／ＵＶ光系、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系などの外因性シグナルの添加に依存する誘発性プロモーターおよびヒートショック遺伝子プロモーター、ＷＯ／２００６／１３５４３６に記載された調節性ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター並びに組織特異的プロモーターが含まれるが、これらに必ずしも限定されない。
【００６９】
組織特異的なプロモーターの他の例として、アルブミン遺伝子プロモーター（Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ， ７１：５１２４−３２）、肝炎ウイルスコアプロモーター（Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ３：１００２−９）；α−フェトプロテイン遺伝子プロモーター（Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３−１４）およびチロキシン結合グロブリン結合タンパク質遺伝子プロモーター（Ｗａｎｇ，Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１１５６３−１１５６６）が挙げられる。本発明の構築物は、好ましくは、ＣＤ１１ｃプロモーター（Ｍａｓｏｏｄ，Ｒ．， ｅｔ ａｌ． ２００１． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ８：３３５−３４３； Ｓｏｍｉａ，Ｎ．Ｖ．， ｅｔ ａｌ． １９９５． Ｐｒｏｃ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：７５７０−７５７４）、ファシンプロモーター （Ｓｕｄｏｗｅ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， ２００６． Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：１９６−２０３）、ＣＤ８３遺伝子プロモーター、ＣＤ３６遺伝子プロモーターまたはデクチン−２プロモーター（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ２００１， ８：１７２９−１７３７）などの樹状細胞特異的プロモーターを含有する。
【００７０】
本発明のポリヌクレオチドまたはそれを形成する遺伝子構築物は、ベクターの一部を形成することができる。したがって、他の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物を含むベクターに関する。当業者は、前記ベクターは、適当なポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築物を増殖して得るのに適したクローニングベクターまたは複合体の精製に適した種々の異種の生物体における発現ベクターであることができるので、使用することができるベクターのタイプに関して限定はないことを理解するであろう。したがって、本発明による適当なベクターには、ＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏＩＥＩ、ｐＣＲＩ、ＲＰ４、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのファージおよびシャトルベクターなどの原核細胞における発現ベクター、２−ミクロンプラスミドタイプベクター、統合プラスミド、ＹＥＰベクター、セントロメアプラスミドなどの酵母における発現ベクター、ｐＡＣシリーズおよびｐＶＬシリーズのベクターなどの昆虫細胞における発現ベクター、ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥシリーズのベクターなどの植物における発現ベクター、およびウイルスベクター（アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス並びにレトロウイルスおよびレンチウイルス）並びにｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦＩ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅ０２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸＩ、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴＩなどの非ウイルスベクターのいずれかに基づく上位真核細胞（ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌ）における発現ベクターが含まれる。
【００７１】
本発明のベクターは、前記ベクターにより形質転換、形質移入または感染され得る細胞に、形質転換、形質移入または感染するために使用することができる。前記細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。例として、前記ＤＮＡ配列を導入することができるベクターは、プラスミドまたはＤＮＡ配列が宿主細胞中に導入されたとき、それが前記細胞のゲノム中に組み込まれて染色体（またはクロモソ−ム）と一緒に複製されるベクターであってよい。前記ベクターは、当業者により知られた従来の方法により得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ２００１， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， ｔｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． Ｖｏｌ １−３ａ）。
【００７２】
それ故、他の態様において、本発明は、本発明により提供される構築物またはベクターにより形質転換、形質移入または感染することができた、本発明のポリヌクレオチド、遺伝子構築物またはベクターを含む細胞に関する。形質転換、形質移入または感染した細胞は、当業者により知られた従来の方法により得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１、前出）。特定の態様において、前記宿主細胞は、適当なベクターで形質移入または感染した動物細胞である。
【００７３】
本発明の複合体の発現に適した宿主細胞には、哺乳動物、植物、昆虫、真菌および細菌の細胞が含まれるが、これらに限定されない。細菌の細胞には、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の種などのグラム陽性細菌の細胞、並びにエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属などのグラム陰性細菌の細胞が含まれるが、これらに限定されない。真菌細胞は、好ましくはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）などの酵母細胞を含む。昆虫細胞には、ショウジョウバエ細胞およびＳｆ９細胞が含まれるが、これらに限定されない。植物細胞には、とりわけ、穀類、薬用、観賞用または球根状植物などの作物植物細胞が含まれる。本発明に適した哺乳動物細胞には、上皮細胞ライン（ブタその他）、骨肉腫細胞ライン（ヒトその他）神経芽細胞腫の細胞ライン（ヒトその他）、上皮癌（ヒトその他）、グリア細胞（マウスその他）、肝細胞ライン（サルその他）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１細胞、ＡＴ１０８０細胞、Ａ５４９細胞、２９３細胞またはＰＥＲ．Ｃ６細胞、ヒトＥＣＣ ＮＴＥＲＡ−２細胞、ｍＥＳＣラインのＤ３細胞、ＨＳ２９３およびＢＧＶ０１、ＳＨＥＦ１、ＳＨＥＦ２およびＨＳ１８１などのヒト胚幹細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、２９３Ｔ細胞、ＲＥＨ細胞およびＭＣＦ−７細胞およびｈＭＳＣ細胞が含まれる。
【００７４】
本発明の免疫原性組成物
本発明者らは、本発明の複合体とＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストとの組合せにより、前記成分の各々が別々に投与されたときに得られるよりも大きい免疫応答が生ずることが可能になることを観察した。したがって、実施例３で観察されるように、ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７融合タンパク質およびポリＩ：Ｃにより形成した組成物は、融合タンパク質だけが投与されるときには治療可能ではない腫瘍を根絶することができる。
【００７５】
したがって、他の態様において、本発明は：
（ｉ）本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明による宿主細胞、および
（ｉｉ）ＴＬＲリガンド
を一緒にまたは別々に含む組成物（本明細書において以後、本発明の組成物１または本発明の第１組成物と称する）に関する。
【００７６】
本発明の第１組成物の一部を形成する成分のモル濃度は変えることができるが、２成分のモル濃度の比は、好ましくは、５０：１と１：５０との間、より好ましくは２０：１と１：２０との間、１：１０と１０：１との間、５：１と１：５との間に含まれる。
【００７７】
組成物の第１成分ｉ）は、本発明のペプチドに関連して詳細に記載した。好ましい特定の態様において、前記第１成分は、ヒト由来のフィブロネクチンのＥＤＡ領域を含む。他の態様において、本発明の組成物の第１成分は、Ｅ７タンパク質のアミノ酸１から２９までおよび／またはＥ７タンパク質のアミノ酸４３から９８までを含む。さらにより好ましい態様において、本発明の組成物を形成する複合体の第１成分は、配列番号５３または配列番号７２で記載される２種のＨＰＶ Ｅ７抗原性ペプチドが側面に接するＥＤＡ領域を含む（それに加えて６ヒスチジンタグを含む）。
【００７８】
本発明において、「ＴＬＲ受容体リガンド」は、少なくとも１種のＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）受容体に特異的に結合して、結合すると前記受容体とその天然リガンドとの結合に特徴的な副刺激シグナルまたは前記受容体とＴＬＲアゴニストとの結合の結果生ずる他のシグナルのあるものを刺激することができる分子と理解される。
【００７９】
Ｔｏｌｌ様受容体（またはＴＬＲ）は、生来の免疫系の一部を形成するＩ型膜貫通タンパク質のファミリーである。脊椎動物において、それらは免疫系の適応も可能にする。ＴＬＲはインターロイキン受容体と一緒になって、インターロイキン−１／Ｔｏｌｌ様受容体スーパーファミリーとして知られるスーパーファミリーを形成する。このファミリーの全ての構成員は、Ｔｏｌｌ−ＩＬ−１受容体（ＴＩＬ）ドメインと呼ばれるドメインを共通して有する。
【００８０】
大部分の哺乳動物は、１０ないし１５タイプのＴＬＲを有すると見積もられている。今までに１３タイプのＴＬＲが、ヒトおよびマウスにおいて同定された（Ｄｕ Ｘ， ｅｔ ａｌ． ２０００， Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ． １１：３６２−７１； Ｃｈｕａｎｇ ＴＨ． ｅｔ ａｌ．， ２０００． Ｅｕｒ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．１１：３７２−３７８； Ｔａｂｅｔａ Ｋ， ｅｔ ａｌ．； ２００４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １０１：３５１６−３５２１）。
【００８１】
ＴＬＲリガンドは、ＴＬＲが発現した細胞に依存して、並びにＴＬＲリガンドの起源に依存して幾つかの免疫応答を誘発する。例えば、微生物のリガンドの場合に、免疫細胞は、炎症を惹起するサイトカインを産生し得る。ウイルス因子の場合には、細胞はアポトーシスを起こし得る。
【００８２】
特定の態様において、リガンドは、アゴニストリガンドである。ＴＬＲ受容体のアゴニストリガンドは、（ｉ）実際のＴＬＲ受容体の天然リガンド、もしくはＴＬＲ受容体に結合してそれらで副刺激シグナルを誘発する能力を保存する機能的に同等なそれらの変異体、または（ｉｉ）ＴＬＲ受容体に対するアゴニスト抗体、またはＴＬＲ受容体に、より特定すれば、前記受容体の細胞外ドメインに特異的に結合して、この受容体により制御される免疫シグナルのあるものおよび関連するタンパク質を誘発することができる機能的に同等なそれらの変異体である。結合特異性は、ヒトＴＬＲ受容体またはヒトに相同の異種のＴＬＲ受容体に対するものであってよい。
【００８３】
種々のＴＬＲのリガンドの例を表２に体系的に示す。
【００８４】
【表２】
【００８５】
当業者が理解するように、ＴＬＲ受容体のアゴニストリガンドおよび一般的にはリガンドの活性を検出するのに利用できる、樹状細胞のインビトロ同時刺激などの非常に種々の免疫アッセイがある。簡単に説明すると、前記アッセイは、培養した樹状細胞とＴＬＲアゴニストリガンドとを接触させて、前記細胞の活性化を測定することからなる。前記活性化は、受容体がＴＬＲ３である場合に、何らかのマーカー、例えばポリ（Ｉ：Ｃ）の検出により決定することができる。活性化された樹状細胞は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）およびＣＤ４０などの種々のタンパク質を発現する。したがって、例えばＣｈｅｎ Ｘ．Ｚ．ら（Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ． ２００９ Ｊｕｌ ４、印刷前の電子出版）により記載されているように、前記リガンドに曝した後の樹状細胞における前記タンパク質の発現レベルの変化を検出することにより、ＴＬＲアゴニストリガンドのアゴニスト活性を検出することが可能である。
【００８６】
他の好ましい特定の態様において、ＴＬＲリガンドは、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ９リガンドおよび両者の組合せの群から選択される。より好ましい方法において、ＴＬＲ３リガンドはポリ（Ｉ：Ｃ）（ポリイノシン酸−ポリシチジル酸またはポリイノシン酸−ポリシチジル酸ナトリウム塩）である。
【００８７】
他の好ましい態様において、ＴＬＲ９リガンドは、少なくとも１種のＣｐＧモチーフ、より好ましくはタイプＢＣｐＧ−ホスホロチオエート（ＣｐＧ１８２６：５’ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’配列番号６６）を含むオリゴヌクレオチドである。
【００８８】
本発明者らは、本発明の複合体が、ＴＬＲリガンドおよび化学療法剤の使用により得られる抗腫瘍応答を改善し得ることを観察した。具体的に、本発明の図７は、ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７融合タンパク質、ＴＬＲ９リガンドＣｐＧおよびシクロホスファミドを含む組成物の投与が、如何にシクロホスファミドおよびＴＬＲ９リガンドの投与を超える腫瘍サイズ縮小を生ずるかを示す。
【００８９】
したがって、他の態様において、本発明は：
（ｉ）本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明による宿主細胞、
（ｉｉ）ＴＬＲリガンド、および
（ｉｉｉ）化学療法剤
を含む、本発明の組成物（本明細書において以後、本発明の組成物２または本発明の第２組成物と称する）に関する。
【００９０】
本発明の第２組成物の成分（ｉ）（本発明の複合体）および（ｉｉ）（ＴＬＲリガンド）は、前節で詳細に説明した。
【００９１】
「化学療法剤」は、細胞を必ずしも殺さずに細胞増殖を阻害し得る任意の物質または細胞死を誘発し得る任意の物質と理解される。細胞死を惹起せずに細胞増殖を阻害することができる作用剤は、細胞分裂抑制剤と総称され、それに対してアポトーシスを活性化することにより細胞死を正常に誘発することができるものは、細胞傷害性薬物と総称される。本発明の組成物における使用に適した化学療法剤の例として、（ｉ）タキサン、パクリタキセルム、ドセタキセル、エポチロンおよびラウリマリドなどの微小管安定剤、（ｉｉ）イレッサ（登録商標）、グリベック、Ｔａｒｃｅｖａ（商標）、（エルロチニブＨＣＩ）、ＢＡＹ−４３−９００６などのキナーゼ阻害剤、（ｉｉｉ）トラツツマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎｍ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｓａｎ（登録商標））、ペルツツマブ（Ｏｍｎｉｔａｒｇ（商標）を含むが、これらに限定されないキナーゼ活性を有する受容体特異的抗体；（ｉｖ）ラパマイシンおよびＣＣＩ−７７８などのｍＴＯＲ経路阻害剤；（ｖ）Ａｐｏ２Ｌ／Ｔｒａｉｌ、（ｖｉ）エンドスタチン、コンブレタスタチン、アンジオスタチン、トロンボスポンジンなどの抗血管形成剤および血管内皮成長阻害剤（ＶＥＧＩ）；（ｖｉｉ）活性化Ｔ細胞、非特異的免疫刺激剤（例えばインターフェロン、インターロイキン）を含む抗新生物ワクチン；（ｖｉｉｉ）ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ミトマイシンおよびミトザントロンなどの抗生物質細胞傷害性薬物；（ｉｘ）メルファラン、カルムスチン、ロムスチン、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、ホテムスチン、ブスルファン、テモゾロミドおよびチオテパなどのアルキル化剤；（ｘ）ニルタミド、酢酸シプロテロン、アナストロゾール、エキセメスタン、タモキシフェン、ラロキシフェン、ビカルタミド、アミノグルテチミド、酢酸リュープロレリン、クエン酸トレミフェン、レトロゾール、フルタミド、酢酸メゲストロールおよび酢酸ゴセレリンなどの抗新生物ホルモン剤；（ｘｉ）酢酸シプロテロンおよび酢酸メドロキシプロゲステロンなどの生殖腺ホルモン；（ｘｉｉ）シタラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、トポテカン、ヒドロキシウレア、チオグア
ニン、メトトレキセート、コラスパーゼ（Ｃｏｌａｓｐａｓｅ）、ラルチトレキセドおよびカペシタビンなどの抗代謝物；（ｘｉｉｉ）ナンドロロンなどのタンパク質同化剤；（ｘｉｖ）酢酸メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ヒドロコーチゾン、プレドニゾロンおよびプレドニゾンなどの副腎ステロイドホルモン；（ｘｖ）カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、エトポシドおよびデカルバジンなどの抗新生物薬、および（ｘｖｉ）トポテカンおよびイリノテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
如何なる理論にも拘束されることは望まず、化学療法剤は、適当な用量で投与されるとき、調節性Ｔ細胞の不活性化により間接的に免疫刺激剤として作用することができると思われる。
【００９３】
好ましい態様において、化学療法剤は、細胞分裂抑制剤であり、より好ましくは、それは、シクロホスファミドまたはシクロホスファミドアナログである。シクロホスファミドアナログは、文献で周知である（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ， Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，１１ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ ４２９−４３０；文書ＵＳ５１９０９２９）。
【００９４】
本明細書において今後、用語「本発明の組成物」は、場合により、本発明の第１組成物および本発明の第２組成物の両方を指す。当業者が理解するように、本発明の組成物は、単一成分として剤形化するか、あるいは組み合わせてそれらを続けて投与できる別々の剤形として提供することができる。本発明の組成物は、キットの一部として提供することもでき、キット中の成分は個別に剤形化されるが、単一の容れ物の中に梱包される。
【００９５】
本発明の複合体および組成物の医学的使用
本研究者達は、本発明の複合体が、樹状細胞の成熟を誘発し、ペプチドに対するインビボの抗腫瘍免疫応答の活性化を誘発して、ＨＰＶＥ７タンパク質を発現している十分発育した大きい腫瘍を根絶することができることを観察した（本発明の実施例１から３を参照されたい）。
【００９６】
それ故、他の態様において、本発明は、医学において使用するための本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクターまたは本発明の組成物に関する。
【００９７】
他の態様において、本発明は、医薬組成物、すなわち、本発明の融合タンパク質、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の組成物および少なくとも１種の薬学的に許容し得る担体またはアジュバントを含む本発明の医薬組成物に関する。
【００９８】
「アジュバント」は、本発明の医薬組成物の効能を強化する任意の物質と理解される。
【００９９】
アジュバントの例として、水酸化アルミニウム、アルミニウムホスフェート、アルミニウム硫酸塩などのアルミニウム塩（ミョウバン）により形成されるアジュバント、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）並びに不完全なフロイントアジュバント（ＩＦＡ）などの水中油または油中水エマルションの剤形；鉱物ゲル；ブロックコポリマー、アブリジン（商標）、ＳＥＡＭ６２；細菌細胞壁の成分により形成されたアジュバント、例えば、リポ多糖（例えば、リピドＡもしくはモノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ））、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）の成分などを含むアジュバントなど、熱ショックタンパク質もしくはそれらの誘導体をを含むアジュバント；ジフテリア毒素（ＤＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、コレラ毒素（ＣＴ）大腸菌の熱に不安定な毒素（ＬＴ１およびＬＴ２）、シュードモナス・内毒素Ａおよび外毒素、Ｂ．セレウス（ｃｅｒｅｕｓ）細胞外酵素Ｂ、Ｂ．スファエリクス（ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）毒素、Ｃ．ボツリヌス毒素Ｃ２およびＣ３、Ｃ．リモスム（ｌｉｍｏｓｕｍ）、Ｃ．ペルフリンゲンス（ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、Ｃ．スピリフォルマ（ｓｐｉｒｉｆｏｒｍａ）およびＣ．ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細胞外酵素並びに毒素、ＥＤＩＭおよび、ジフテリア毒素の無毒性変異体であるＣＲＭ−１９７変異体などの変異体毒素を含む細菌毒素のＡＤＰ−リボシル化から誘導されたアジュバント；ＩＳＣＯＭ（免疫刺激錯体）などサポニン；ケモカイン、キモカインおよびサイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ−ＩＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、その他）、インターフェロン（インターフェロンγなど）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；デフェンシン（ｄｅｆｅｎｓｉｎ）１または２、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、ＭＩＰ１−α、およびＭＥＰ−２、ムラミルペプチド、例えば、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓ−ｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）など；ＣｐＧ分子、ＣｐＧジヌクレオチドおよびＣｐＧモチーフを含む合成オリゴヌクレオチドのファミリーから誘導されるアジュバント；Ｃ．リモスム（Ｃ．ｌｉｍｏｓｕｍ）細胞外酵素および合成アジュバント例えばＰＣＰＰなど、コレラ毒素、サルモネラ毒素、ミョウバン等、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、ＭＴＰ−ＰＥおよび；細菌から抽出された３成分、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％／ツイーン８０添加スクワレンエマルション中に含むＲＩＢＩが挙げられるが、これらに限定されない。アジュバントの他の例として、ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物）、完全および不完全フロイントアジュバントおよびクイル（Ｑｕｉｌ）Ａが挙げられる。
【０１００】
用語「担体」は、有効成分がそれとともに投与される希釈剤または賦形剤を指す。そのような薬学的担体は、滅菌液体、例えば、水および石油、動物、植物または合成起源の油を含む油、例えば、ピーナツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など油であってよい。水または食塩の水溶液並びにデキストロ−スおよびグリセリンの水溶液は、特に注射用溶液のために担体として好ましく使用される。適当な薬学的担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（１９９５）に記載されている。本発明の担体は、連邦または州政府の規制当局により承認されたかまたは米国薬局方または動物、より特定すればヒトで使用するために一般的に認められた他の薬局方にリストされていることが好ましい。
【０１０１】
本発明の医薬組成物の所望の薬学的投与形態を製造するために必要な担体および補助物質は、とりわけ、選択された薬学的投与形態に依存するであろう。医薬組成物の前記薬学的投与形態は、当業者により知られた従来の方法にしたがって製造される。有効成分の種々の投与方法、使用すべき賦形剤およびそれらを製造するための工程の総説は、「Ｔｒａｔａｄｏ ｄｅ Ｆａｒｍａｃｉａ Ｇａｌｅｎｉｃａ」、Ｃ．Ｆａｕｌｉ ｉ Ｔｒｉｌｌｏ、Ｌｕｚａｎ ５、Ｓ．Ａ．ｄｅ Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ、１９９３に見出すことができる。医薬組成物の例として、経口、局所または非経口的投与のための任意の固体（錠剤、ピル、カプセル、顆粒、その他）または液体（溶液、懸濁液またはエマルション）組成物が挙げられる。さらに、医薬組成物は、適当な安定剤、懸濁液、防腐剤、界面活性剤等を含有することができる。
【０１０２】
医薬中で使用するために、本発明の複合体は、プロドラッグ、塩、溶媒和物またはクラスレートの、単離されているかまたは追加の活性な作用剤との組合せのいずれかの形態で見出すことができる。本発明による化合物の組合せは、薬学的観点から許容される賦形剤と一緒に剤形化することができる。本発明において使用するために好ましい賦形剤には、糖類、デンプン、セルロース、ガムおよびタンパク質が含まれる。特定の態様において、本発明の医薬組成物は、固体（例えば錠剤、カプセル、コートされた錠剤、顆粒、坐剤、再構成して液体形態を提供することができる滅菌された結晶性または非晶質の固体、その他）、液体（例えば溶液、懸濁液、エマルション、エリキシル、ローション、軟膏その他）または半固体（ゲル、ポマード、クリーム剤等）の薬学的投与形態に剤形化することができる。本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸経路を含むが、これらに限定されない任意の経路により投与することができる。有効成分、使用すべき賦形剤の投与およびそれらを製造するための工程の種々の形態の総説は、Ｔｒａｔａｄｏ ｄｅ Ｆａｒｍａｃｉａ ＧａｌＥｍｉｃａ， Ｃ． Ｆａｕｌｉ ｉ Ｔｒｉｌｌｏ， Ｌｕｚａｎ ５， Ｓ．Ａ． ｄｅ Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ， １９９３ ａｎｄ ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．），２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ＰＡ，ＵＳＡ（２０００）に見出すことができる。薬学的に許容し得る担体の例は、当技術分野において知られており、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水エマルションなどのエマルション、種々のタイプの湿潤剤、滅菌溶液、その他が挙げられる。前記担体を含む組成物は、当技術分野において知られた従来の方法により剤形化することができる。
【０１０３】
核酸（本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは遺伝子構築物）が投与される事象において、本発明は、特に前記核酸の投与のために調製された医薬組成物を想定する。医薬組成物は、前記核酸を無防備の形態で、すなわち、核酸を生体のヌクレアーゼによるそれらの分解から保護する化合物の不在で含むことができ、形質移入のために使用した試薬に関連する毒性を排除する利点を含む。無防備の化合物に適した投与経路には、静脈内、腫瘍内部、脳内、腹腔内、脾臓内、筋肉内、網膜下、皮下、粘膜、局所および経口経路が含まれる（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，２００２，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２１：８５７−８６７）。あるいは、核酸は、リポソームの一部を形成し、コレステロールに複合体化して、または細胞膜を通る転座を促進することができる化合物、例えば、ＨＩＶ １ ＴＡＴタンパク質から誘導されるＴａｔペプチドなど、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質のホメオドメインの第３ヘリックス、単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２タンパク質、アルギニンオリゴマーおよびペプチド、例えば、ＷＯ０７０６９０９０（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ，２１：９９−１０３，Ｓｃｈｗａｒｚｅ，Ｓ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２１：４５−４８，Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１４３−１５０およびＳｎｙｄｅｒ，Ｅ．Ｌ．ａｎｄ Ｄｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．，２００４，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１：３８９−３９３）に記載されたペプチドなどのペプチドと複合体化して投与することができる。あるいは、ポリヌクレオチドは、プラスミドベクターまたはウイルスベクター、好ましくは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスまたはマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）もしくはレンチウイルス（ＨＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶ）などのレトロウイルスに基づくベクターの一部を形成して、投与することができる。
【０１０４】
本発明の組成物は、体重１キログラム当たり１０ｍｇ未満、好ましくは体重１ｋｇ当たり５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５または０．００００１ｍｇ未満の用量で投与することができる。単位用量は、注射、吸入または局所投与により投与することができる。
【０１０５】
用量は、治療すべき状態の重症度および応答に依存し、数日と数ヶ月または状態が寛解したことを観察するまでの間で変えることができる。最適用量は、患者の生体中の薬剤濃度の定期的測定を実施して決定することができる。最適用量は、前もってインビトロまたは動物モデルにおけるインビボアッセイにより得られたＥＣ５０値により決定することができる。単位用量は、１日１回または１日１回未満、好ましくは、２、４、８または３０日毎に１日１回未満で投与することができる。あるいは、初期用量を投与し、続いて１回または数回の、一般的に初期用量より少ない量の維持量を投与することが可能である。維持投与計画は、１日当たり０．０１μｇと１．４ｍｇ／ｋｇ体重との間で変化する用量、例えば１日に体重１ｋｇ当たり１０、１、０．１、０．０１、０．００１、または０．００００１ｍｇを用いて患者を治療することを含むことができる。維持量は、５、１０または３０日毎に最大１日１回で投与することが好ましい。治療継続期間は、患者が罹患する障害のタイプ、その重症度および患者の状態により変えなければならない。治療後は、患者の展開を監視して、疾患が治療に応答しない事象においては用量を増加べきかどうか、疾患の改善が観察されればまたは望ましくない副作用が観察されれば、用量を減少すべきかどうかを決定しなければならない。
【０１０６】
特定の態様において、本発明の組成物の成分は、同時に、逐次にまたは別々に投与することができる。好ましい態様において、化学療法剤（好ましくはシクロホスファミド）を最初に投与して、それに続いて、可変時間の後、本発明の組成物の残余の成分、すなわち、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、本発明のベクターまたは本発明による宿主細胞およびＴＬＲリガンドを投与する。本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、本発明のベクターまたは本発明による宿主細胞およびＴＬＲの投与は、同時に、別々にまたは逐次に行うことができる。好ましい態様においては、ＴＬＲリガンド（好ましくはｐＩ：ＣまたはＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰ）および複合体化したポリヌクレオチド、遺伝子構築物、ベクターまたは本発明による宿主細胞（好ましくは融合タンパク質）を、同時に投与する。本発明の組成物が、化学療法剤、好ましい態様においては具体的にシクロホスファミド（ＣＰＡ）を含む場合には、ＣＰＡは、制御性Ｔ細胞を選択的に殺すことができる「少量を頻繁に連続投与する用量（ｍｅｔｒｏｎｏｍｉｃ ｄｏｓｅ）」と呼ばれる最適未満の濃度で使用される（Ｇｈｉｒｉｎｇｈｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００７，５６：６４１−８）。
【０１０７】
本発明の組成物は、一体の用量として、あるいは、最初の用量および１回または複数回のブースター投与量として投与することができる。したがって、好ましい態様において、本発明の組成物は、第１の用量および第２のブースター用量として投与される。本発明の組成物が別々の時間に投与されるときは、本発明の第１成分の第１の用量、本発明の第２成分の第２の用量、本発明の第１成分からの第２のブースター用量、本発明の第２成分からの第２のブースター用量と期間中そのように次々に投与されると理解される。より好ましい態様において、療法には、化学療法剤（好ましくはシクロホスファミド）が投与される第１の投与、本発明による複合体、ポリヌクレオチド、遺伝的構築物、ベクターまたは宿主細胞およびＴＬＲリガンドが投与される第２の投与；化学療法剤（好ましくはシクロホスファミド）を含む第３の投与および本発明による複合体、ポリヌクレオチド、遺伝的構築物、ベクターまたは宿主細胞が、ＴＬＲリガンド（好ましくはｐＩ：ＣまたはＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰ）と一緒に再度投与される第４の投与が含まれる。第２のおよび第４の投与においては、ＴＬＲリガンド（好ましくは、ｐＩ：ＣまたはＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰ）および本発明による複合体、ポリヌクレオチド、遺伝的構築物、ベクターまたは宿主細胞、（好ましくは融合タンパク質）が、同時に、別々にまたは逐次に投与される。
【０１０８】
好ましい態様においては、ＴＲＬリガンド（好ましくはｐＩ：ＣまたはＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰ）および本発明による複合体、ポリヌクレオチド、遺伝的構築物、ベクターまたは宿主細胞（好ましくは融合タンパク質）が、同時に投与される。
【０１０９】
毎日の用量は、単一の用量でまたは特定の状況によっては２回以上の用量で投与することができる。繰り返し投与または頻回投与が所望であれば、ポンプ、半永続性カテーテル（静脈内、腹腔内、クモ膜下槽内または嚢内）またはリザーバーなどの投与デバイスの埋め込みが薦められる。
【０１１０】
他の態様において、本発明は、ワクチン製造のための、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の組成物または本発明の医薬組成物の使用に関する。換言すれば、本発明は、ワクチンとして使用するための、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の組成物または本発明の医薬組成物に関する。あるいは、本発明は、対象者への本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の組成物または本発明の医薬組成物の投与を含む、対象者にワクチン接種する方法に関する。
【０１１１】
「ワクチン」は、一旦生体内に入ると、抗体と呼ばれる攻撃に対する応答を生じさせる抗原製剤として理解される。この応答は、大部分の症例において、永続的免疫の原因となる免疫学的記憶を生じさせる。
【０１１２】
ワクチンは、全身的または局所的に投与される。ワクチンは、単回投与により、または本発明の組成物の投与について以前記載したような複数回の投与によるブーストを用いて、投与することができる。
【０１１３】
他の態様において、本発明は、ヒトパピローマウイルスにより惹起される感染および／またはＨＰＶ感染と関連する子宮頸癌の予防および治療のための医薬を製造するための、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の組成物または本発明の医薬組成物の使用に関する。あるいは、本発明は、ヒトパピローマウイルスにより惹起される感染および／またはＨＰＶ感染と関連する子宮頸癌の予防および治療において使用するための、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の組成物または本発明の医薬組成物に関する。あるいは、本発明は、対象者におけるヒトパピローマウイルスにより惹起される感染および／またはＨＰＶ感染と関連する子宮頸癌予防および治療のための、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の組成物または本発明の医薬組成物の前記対象者への投与を含む方法に関する。
【０１１４】
ヒトパピローマウイルスにより惹起される感染および疾患には、疣贅（足の疣贅など）、生殖器疣贅、反復性呼吸器乳頭腫（喉頭のパピローマなど）およびパピローマ感染と関連する癌が含まれる。パピローマウイルスと関連した癌には、肛門生殖器癌（例えば子宮頸部、肛門周囲、外陰部、膣内、陰茎癌、その他）、頭部および頸部癌（例えば口腔咽頭腔癌、食道癌、その他）および皮膚癌（例えば、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌）が含まれる。
【０１１５】
本発明の樹状細胞を用いるワクチン接種方法
他の癌療法の取り組みは、免疫教育者としての正常樹状細胞の役割の利点を利用することである。前に言及したように、樹状細胞は数ある中でウイルス抗原を捉えてそれらをＴ細胞に提示し、初期のＴ細胞性免疫応答におけるそれらの助勢を募ることである。これは身体に侵入した外来細胞に対してよく機能するが、癌細胞は、しばしば「自己」／「外来」物質検出系を逃れる。研究者達は、樹状細胞を改変することにより、癌細胞に対するＴ細胞の攻撃を含む特別なタイプの自己免疫応答を活性化することができる。腫瘍作用剤は単独では免疫応答を生じさせるには十分でないという事実に基づき、未成熟樹状細胞と本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の細胞、本発明の組成物または本発明の医薬組成物とを接触させることが可能であり、その結果、樹状細胞の活性化、ＨＰＶ Ｅ７由来の抗原（単数または複数）の捕捉、および主要組織適合抗原に関連する表面におけるそれらの提示が生ずる。したがって、これらの活性化した細胞を患者に投与することができ、それで腫瘍抗原が患者の免疫系に提示され、その結果最終的に、Ｔ細胞により媒介された、患者の癌細胞に対する免疫応答が生ずる。
【０１１６】
したがって、他の態様において、本発明は、少なくとも１種のＨＰＶ Ｅ７抗原を提示する成熟樹状細胞を得るインビトロの方法であって：
（ｉ）樹状細胞と、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の遺伝子構築物、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の組成物または本発明の医薬組成物とを、樹状細胞の成熟が起こるのに適した条件で接触させるステップ、および
（ｉｉ）成熟樹状細胞を回収するステップ
を含む方法に関する。
【０１１７】
樹状細胞（ＤＣ）は、最も強力な抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、活性化されていないＴリンパ球（ナイーブＴリンパ球）と相互作用する独特の能力を有し、最初の免疫応答を開始して、ＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化する。
【０１１８】
炎症および免疫応答が不在であると、樹状細胞は、血液、末梢組織、リンパ液および二次リンパ器官を通って巡視する。末梢組織において、樹状細胞は自己および外来抗原を捕捉する。捕捉された抗原は処理されてそれらの断片を生じ、それらはクラスＩおよびＩＩＭＨＣ分子に渡される（それぞれＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔリンパ球を活性化するために）。抗原捕捉、分解および負荷のこの過程は抗原提示と称される。
しかしながら、刺激がないと、末梢樹状細胞の抗原提示は効果的でない。外因性シグナルすなわち病原体から来るシグナル（単数または複数）または内因性シグナル（単数または複数）は、樹状細胞を、それらが成熟と称される過程を開始するように誘導し、それにより樹状細胞はＡＰＣおよびＴリンパ球活性化因子に形質転換する。
【０１１９】
本発明において使用することができる種々のタイプの樹状細胞がある。それに対して、単球に類似の骨髄腫樹状細胞（ｍＤＣ）があり、それはさらに２つのサブタイプ：最も普通でＴ細胞の主要な刺激因子であるｍＤＣ−１、およびそれより少なくて主な機能は創傷感染と戦うことであるｍＤＣ−２に分かれる。
【０１２０】
一方、プラズマ細胞に類似しているが、骨髄腫樹状細胞に典型的なある特徴を有する形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）がある。
【０１２１】
未成熟樹状細胞は、骨髄造血性幹細胞から誘導される。これらの幹細胞は、エンドサイトーシス能力が高くＴ細胞活性化能力は低い未成熟細胞に分化する。これらの細胞は、それらの膜中にＴＬＲなどの種々の膜受容体を有する。
【０１２２】
細菌およびウイルスの産生物、並びに炎症性サイトカインおよび他の典型的な分子は、樹状細胞の成熟を生来の樹状細胞の表面受容体との直接相互作用により誘導する。Ｔリンパ球はＣＤ４０依存性および独立の経路により、内皮細胞は細胞と細胞との直接接触およびサイトカイン分泌により、樹状細胞の最終的成熟に寄与する。危険シグナルが発生すると直後に、抗原捕捉、細胞内輸送および分解、および細胞内ＭＨＣ分子の往来の効率が改善される。ペプチド負荷、並びに分子ＭＨＣの半減期および細胞表面への移動は増大する。Ｔ細胞副刺激分子の表面における発現も増大する。このようにして樹状細胞は、最も強力なＡＰＣ、および活性化されていないＴリンパ球を活性化して免疫応答を開始することができる唯一のものになる。抗原提示におけるそれらの能力の改善と一緒に、成熟は樹状細胞の末梢組織からの大量移動も誘発する。ケモカイン受容体および接着分子の発現における改変、並びに細胞骨格構成における重要な変化が、樹状細胞のリンパ液を通る二次リンパ器官への移動に寄与する。
【０１２３】
樹状細胞は、２タイプのシグナル、すなわち：病原体の直接認識（特異的認識パターンを有する受容体により）、および感染の間接的認識（炎症性サイトカイン、内部細胞化合物（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｅｌｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）および特異的免疫応答による）に応答する。これらのシグナルに応答して、樹状細胞は活性化されてそれらの成熟過程を開始し、それにより有効なＴ細胞刺激因子に形質転換する。ＤＣの成熟にとって最も有効なシグナルの一つは、ｔｏｌｌ様受容体ＴＬＲ、（ＴＬＲｌ〜９）とそれらのそれぞれのリガンドとの相互作用により媒介される（ＫａｉｓｈｏおよびＡｋｉｒａによる総説 Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，２００２，１５８９：１−１３）。
【０１２４】
本発明において使用する未成熟樹状細胞は、初代培養細胞であってよい。したがって、本発明の方法において使用する樹状細胞は、自家細胞でも異種細胞でもよい。
【０１２５】
本明細書において使用する、用語「自家」は、細胞が同一個体からのものであることを意味する。
【０１２６】
本明細書において使用する、用語「異種」は、細胞が異なった個体からのものであることを意味する。
【０１２７】
樹状細胞は、基本的には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、前記細胞の接着が可能になるように培養瓶中に蒔くことからなるプロトコルを使用して、インビトロでＰＢＭＣから発生させることができる。その後、細胞をインターロイキン４（ＩＬ４）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）で処理すると、約１週間で細胞は未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）へと分化するに至る。場合により、細胞は、それらを腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）で処理して成熟させることができる。
【０１２８】
樹状細胞は、標準的方法を使用して適当な供給源から得ることができる。樹状細胞の単離に適したこれらの組織には、末梢血、脊髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周囲の組織に浸潤している細胞、リンパ節の生検、胸腺、脾臓、皮膚、臍帯血液、末梢血から得た単球、末梢血から得たＣＤ３４−またはＣＤ１４陽性細胞、並びに任意の他の適当な組織または体液が含まれる。
【０１２９】
場合により、安定な細胞培養を使用することができる。文書ＷＯ９６３００３０には、樹状細胞様細胞／腫瘍細胞ハイブリドーマおよび複数種の樹状細胞様細胞／腫瘍細胞ハイブリッドを得る方法が記載されている。これらのハイブリッドおよびハイブリドーマは、腫瘍細胞と樹状細胞様細胞との融合により生成する。例えば、自家腫瘍細胞ラインからの不死の腫瘍細胞と自家ＨＬＡに適合した同種の樹状細胞様細胞とを融合することができる。自家腫瘍細胞ラインは、原発腫瘍およびそれらの転移から得ることができる。あるいは、自家のまたは同種のＨＬＡに適合した樹状細胞様細胞ラインの不死の樹状細胞様細胞を、自家腫瘍細胞と融合することができる。文書ＷＯ／２００２／０４８１６７には、安定な樹状細胞ラインを発生させる方法も記載されている。使用することができる他の細胞ラインは、ＣＢＩである（Ｐａｇｌｉａ Ｐ． ｅｔ ａｌ．１９９３．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ １７８，１８９３−１９０１）。
【０１３０】
本発明の方法の第１のステップは、樹状細胞と、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の遺伝子構築物、本発明の細胞、本発明の組成物または本発明の医薬組成物とを、樹状細胞の成熟が起こるのに適した条件で接触させることからなる。
【０１３１】
本発明は、樹状細胞と本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の遺伝子構築物、本発明の細胞、本発明の組成物または本発明の医薬組成物とを接触させる任意の可能な方法を考慮している。当業者は、化合物のタイプに応じて、接触の実施が異なることを理解するであろう。したがって、それが、本発明の複合体または本発明のペプチドである場合、これらは、樹状細胞が触れるプラスチック、ガラス、その他の表面に、細胞が位置しまたは結合することができる培養培地に直接添加することができる。本発明の複合体並びに本発明のペプチドの成分を固体表面に結合する形態は、当業者により知られている。
【０１３２】
それが本発明の遺伝子構築物または本発明のベクターである場合、前記成分を細胞（本発明の細胞）に導入するために使用する技法は、本発明の遺伝子構築物の節で前に記載した。特定の態様において、本発明の細胞は、それらの膜中に本発明の複合体の成分を有するので、それらは樹状細胞に接触可能である。
【０１３３】
「成熟が起こるのに適した条件」は、本発明の複合体、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の組成物または本発明の医薬組成物が接触して、その結果少なくとも１種のＨＰＶ Ｅ７由来の抗原が提示された後、樹状細胞の活性化が可能になるこれら全ての培養条件（酸素、温度、湿度、栄養分その他）と理解される。この活性化は、未成熟樹状細胞が何らかの提示された抗原を貪食して、前記抗原を小片に分解し、組織適合系分子（ＭＣＨ）を使用することにより前記部分をそれらの表面に提示したときに起こる。成熟樹状細胞は、同時に、Ｔ細胞の活性化において共受容体として作用するＣＤ８０（Ｂ７．１）ＣＤ８６（Ｂ７．２）およびＣＤ４０などの膜受容体を上方制御して、したがってその結果、それらの前記Ｔ細胞を活性化する能力は増大する。成熟樹状細胞は、樹状細胞の血流全体を通って脾臓に至る移動、およびそこからリンパ系へのそれらの移動を誘発する受容体ＣＣＲ７の発現も上方制御する。成熟樹状細胞は、それらが処理した抗原を提示するヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞およびＢリンパ球を活性化することができる。
【０１３４】
したがって、少なくとも１種のＨＰＶ Ｅ７抗原を提示する成熟樹状細胞は、ＨＰＶ Ｅ７抗原を捕捉した後、前記抗原を処理した後、それを主要組織適合性複合体（ＭＢＣ）に結合した膜の表面に提示することができる樹状細胞として理解される。
それに加えて、成熟樹状細胞は、上で示した上方発現した膜受容体を提示することができる。
【０１３５】
他のステップにおいて、細胞は、本発明の複合体の誘導体の１種または複数種のペプチドの内部移行、処理および提示に適した条件下で維持される。本発明の複合体から誘導された少なくとも１種の抗原性ペプチドの内部移行、処理および提示に適した条件は、樹状細胞の活性化を定量するための標準的アッセイを使用して決定することができる。
【０１３６】
ＤＣの成熟は、細胞表面の多数の分子マーカーおよび表現型の変化を使用して追跡することができる。これらの変化は、例えば、フローサイトメトリー技法を使用して分析することができる。成熟マーカーは、典型的には特異的抗体を使用してマークされ、マーカーまたは一群のマーカーを発現するＤＣは、例えば、ＦＡＣＳによる細胞選別を使用してＤＣ全体から分離することができる。ＤＣ成熟マーカーは、未成熟ＤＣに比較して成熟ＤＣにおいて高レベルで発現されて出現する遺伝子を含む。これらのマーカーには、細胞表面のＭＢＣクラスＩＩ抗原（特にＨＬＡ−ＤＲ）、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３などの副刺激分子、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１８などの細胞輸送分子が含まれるが、これらに限定されない。さらに、ＤＣの成熟は、ある種のＮｏｔｃｈリガンド例えばデルタ様リガンド（ＤＬＬ４）など、Ｔｈ１応答の誘発と関連するＪａｇｇｅｄ１およびＪａｇｇｅｄ２の発現を測定して決定することができる。一方、成熟樹状細胞は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で同種のＴ細胞の増殖を刺激するそれらの能力を使用して確認することができる。さらに、未成熟ＤＣは抗原の内部移行に非常に有効であるが抗原提示が低いのに対して、成熟ＤＣ細胞は抗原の内部移行は低いが抗原提示に非常に有効であることが一般的に見られている。
【０１３７】
樹状細胞の抗原提示機能は、ＭＨＣ限定、抗原依存性のＴ細胞活性化アッセイ並びに当業者にとって周知の他のアッセイ、例えば末梢血液リンパ球におけるインビトロ刺激の能力など、例えば、ＤＣの存在におけるＣＤ８＋リンパ球によるＩＦＮ−γ産生量の定量などを使用して、測定することができる。この定量は、ＥＬＩＳＰＯＴと称する技法を使用して実施することができる。Ｔ細胞の活性化は、それに加えて、例えば刺激された樹状細胞によるサイトカイン産生の誘発を測定して定量することができる。サイトカイン産生の刺激は、ＥＬＩＳＡなどの、当業者により周知の非常に種々の標準的技法を使用して定量することができる。
【０１３８】
標的細胞にトリチル化チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）を結合するなどの他の細胞傷害性アッセイも使用することができる。３Ｈ−ＴｄＲは、細胞核に組み込まれる。・Ｈ−ＴｄＲの遊離は、ＤＮＡ断片化に基づく細胞死の尺度である。
【０１３９】
本発明の方法の第２のステップにおいて、ステップ（ａ）で得られた成熟樹状細胞が回収される。
【０１４０】
本発明の方法のステップａ）で得た成熟細胞を回収するために種々の戦略を使用することができる。例えば、成熟細胞により発現された、および前に記載した、例えばＣＤ８０などの膜マーカーを使用することができる。
【０１４１】
細胞表面マーカーの発現は、従来の方法および装置を使用して例えば、フローサイトメトリーにより定量することができる。例えば、市販の抗体および当技術分野において知られた通常のプロトコルを使用して、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＣａｌｉｂｕｒのＦＡＣＳ（蛍光性活性化細胞選別）システムを使用することができる。したがって、フローサイトメトリーにおいて、特異的な細胞表面マーカーについてバックグラウンドシグナルより上のシグナルを提示する細胞を選択することができる。バックグラウンドシグナルは、従来のＦＡＣＳ分析において各表面マーカーを検出するために使用した特異的抗体と同じイソタイプの非特異的抗体により生ずるシグナル強度として定義される。マーカーが陽性とみなされるためには、観察された特異的シグナルが、従来の方法および装置（例えば、市販の抗体および当技術分野において知られた通常のプロトコルを用いて使用したＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃａｌｉｂｕｒ ＦＡＣＳシステム）を使用したバックグラウンドシグナルの強度に対して、２０％を超え、好ましくは、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、５００％、１０００％、５０００％、１００００％またはそれを超えて強くなければならない。
【０１４２】
本発明による方法により得た樹状細胞は、Ｅ７抗原に対する免疫応答の発生に応答する疾患の治療に有用であることが証明された。前記方法を使用して、本発明の複合体からの少なくとも１種の抗原を提示する成熟細胞が得られる。したがって、他の態様において、本発明は、本発明の方法または本発明の樹状細胞により得られる、本発明の複合体からの少なくとも１種の抗原を提示し且つＣＤ４０陽性である抗原提示樹状細胞に関する。
【０１４３】
他の態様において、本発明は、医学においてそれらを使用するための本発明の樹状細胞に関する。前記本発明の樹状細胞は、それをＤＣワクチン接種として使用して、すなわち前記患者に対する前記細胞の投与により、患者における免疫応答を惹起するために使用することができる。したがって他の態様において、本発明は、患者における免疫応答の発生にための本発明の樹状細胞に関する。換言すれば、本発明は、対象者に対する抗原提示細胞の投与を含む、対象者における免疫反応を惹起する方法に関する。
【０１４４】
ＤＣを用いるワクチン接種は、抗原提示ＤＣを対象者（例えば、ヒト患者）に投与することにより実施され、対象者に免疫応答が誘発される。免疫応答は、典型的には、抗原性ペプチド（例えば、本発明の複合体の成分）でマークされた標的細胞に対するＣＴＬ応答を含む。これらの標的細胞は、典型的には癌細胞である。改変されたＤＣを患者に投与すべきとき、これらの細胞は、同じ患者の幹細胞から単離することが好ましい（すなわち、ＤＣは自家患者に投与される）。しかしながら、ＨＬＡに関して適合性の同種の患者または一致がない同種の患者に、細胞を投与することができる。この後者の場合は、細胞を受ける患者に免疫抑制薬を投与しなければならない。
【０１４５】
細胞は、任意の適当な形態で、好ましくは担体（例えば食塩水溶液）とともに投与することができる。投与は、通常は静脈内であるが、動脈内、筋肉内、皮内、腹腔内または皮下投与も許容される。投与または免疫は種々の時間間隔で繰り返すことができる。
【０１４６】
ＤＣ注射は、サイトカインの投与と組合せることができ、それはＤＣの数およびそれらの活性が、ＧＭ、ＣＳＦ、ＩＬ−１２と同じように維持されるように作用する。
【０１４７】
患者に投与する用量は、免疫応答を誘発するために有効でなければならなず、免疫応答は、Ｔ細胞の増殖、Ｔリンパ球の細胞傷害性および／または患者の応答の経時的に有益な治療効果を測定するアッセイを使用して検出することができる。利用できる場合には、通常１０６から１０９個のＤＣ細胞が注射される。ワクチンは、１回または複数回患者に投与して、有益な結果を達成することができる。ワクチンの１回目の投与と続く投与（単数または複数）との間の時間は、患者の健康、年齢、体重その他を含むがそれらに限定されない種々の要因に依存する。ワクチンは、例えば、週に１回、２週間毎に１日１回、３週間毎に１日１回、１ヵ月に１回を含むが、これらに限定されない任意の適当な時間間隔で投与することができる。特定の態様において、ワクチンは、無期限で投与することができる。他の特定の態様において、ワクチンは、２週間間隔で３回投与される。ワクチンの用量は、患者の健康、安定性、年齢、体重、その他を含むが、これらに限定されない種々の要因にも依存する。臨床的利益を含む十分な免疫レベルが一旦達成されたら、一般的に頻度を落として投与する（例えば、毎月または半年毎の投与）ブースター用量を使用することができる。
【０１４８】
免疫応答を惹起する方法で使用するＤＣは、それらを在庫品の薬剤として使用することができるようにまたは製剤の細胞と治療される患者の細胞との間に組織適合性がある場合に、それらを使用する用意があるように製剤化することが好ましい。治療目的の対象者と樹状細胞との間の適合性が欠如すると、細胞の早発排除（特に複数回の投与後）があるのでまたは意図された標的の免疫系を混乱させる強い抗異種応答の発生に基づくかのいずれかにより、ワクチンの効果の減少が生じ得る。この関係で、本発明の樹状細胞中のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子の少なくとも幾つか（特に遺伝子座Ａおよびさらに特定すればＡ２対立遺伝子における）が患者と共有されるワクチンの使用が有利である。したがって腫瘍抗原の少なくとも幾つかが自家のクラスＩの分子中に提示され、それにより抗腫瘍応答が増大すれば、抗アロタイプ応答が減少するであろう。
【０１４９】
部分的一致は、最もありふれたＨＬＡ−Ａアロタイプ（ＨＬＡ−Ａ２、Ａ１、Ａ１９、Ａ３、Ａ９、およびＡ２４）の２つ以上を有する細胞を用いて作製されたＤＣによるワクチンを使用して得ることができる。大部分の患者に対する全体的一致は、遺伝子座ＨＬＡ−Ａにただ１つのアロタイプを有する種々の可能性を選択することができる一連の種々のＤＣを医師に提供するとこにより達成することができる。
治療は、標準的組織適合試験方法を使用する患者における１種または複数種のＨＬＡアロタイプ同定、およびＨＬＡアロタイプ（単数または複数）が患者と一致するＤＣによる患者の治療を含むであろう。例えば、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ１９の患者は、ＨＬＡ−Ａ２もしくはＨＬＡ−Ａ１９についてホモ接合体の細胞のいずれかまたは両者の混合物を用いて治療することができる。
【０１５０】
ＨＬＡの一致の欠如の潜在的な負の効果は、外来性アロタイプに対する免疫寛容を生じさせて治療することができる。ワクチンの調製中にＤＣ細胞は、２群：免疫寛容を生じる未成熟細胞を生ずる群、および抗原提示のための成熟ＤＣを生ずる他の群に分割される。免疫寛容を生じる細胞は、それらが成熟細胞の受容を生ずるように設計される。免疫寛容を生じる細胞は、十分な程度の免疫応答不在（例えば、混合リンパ球反応で測定される）が生ずるように、患者に１回または複数回投与されるであろう。患者が免疫寛容になれば（１週間または１ヵ月後に）、標的腫瘍抗原に対する免疫応答に必要な量および頻度で、成熟抗原提示細胞を対象者に投与する。
【０１５１】
特定の態様において、本発明の抗原提示樹状細胞は、治療すべき象者にとって自己である。ワクチンの組成物はアジュバントを含むことができる。アジュバントは、任意の利用可能なアジュバントまたはそれらの組合せであってよい。アジュバントの例は、本発明の複合体および組成物に医学的使用の節で挙げた。
【０１５２】
他の態様において、本発明は、ヒトパピローマウイルスにより惹起される感染および／またはＨＰＶ感染と関連する子宮頸癌の予防および治療のための医薬を製造するための本発明の樹状細胞の使用に関する。あるいは、本発明は、ヒトパピローマウイルスにより惹起される感染および／またはＨＰＶ感染と関連する子宮頸癌の予防および治療のための本発明の樹状細胞に関する。最後に、本発明は、前記対象者に対する本発明による樹状細胞の投与を含む、対象者におけるヒトパピローマウイルスにより惹起される感染および／またはＨＰＶ感染と関連する子宮頸癌の治療方法に関する。
【０１５３】
本発明を、以下の例により説明するが、それらは単に例示であり、発明の限定とみなしてはならない。
【実施例】
【０１５４】
材料および方法
マウスおよび細胞ライン
特定の病原体のいない５週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、スペイン）から購入し、ＣＩＭＡ動物施設で無菌条件下に水および食物が自由な状態に保った。動物を使用する実験は動物管理のための指示指針にしたがって実施した。
【０１５５】
ＴＨＰ１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、ＥＤＡから誘導した融合タンパク質による単球活性化のインビトロアッセイのために使用した。ＴＣ−１、ＨＰＶ１６−Ｅ６を発現する腫瘍細胞および始原マウス肺上皮細胞由来のＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＬＧＣ Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ，Ｍｏｌｓｈｅｉｍ，Ｆｒａｎｃｅ）から得た。細胞は、１０％熱不活化胎児仔牛血清、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．４ｍｇ／ｍｌゲネチシンおよび５×１０−５ｍｏｌ／ｌの２−メルカプトエタノールで補完したＧｌｕｔａＭＡＸ添加ＲＰＭＩ １６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）中で維持した。５×１０５のＴＣ−１細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの剃毛した背中（左側）に２００μＬ ＰＢＳ中で注射した。２方向に垂直の直径（ミリメートル）の平均として表した腫瘍サイズを、一定間隔で測定した。ＥＬ−４（マウス胸腺腫）腫瘍細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＬＧＣ Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ、Ｍｏｌｓｈｅｉｍ、フランス）から得て細胞傷害性検討のための標的細胞として使用し（ＤＴｃペプチド添加または無添加で培養した）、それらが如何なるＨＰＶタンパク質も発現しないので腫瘍の陰性対照として使用した。
【０１５６】
試薬
ＨＰＶ１６−Ｅ７Ｈ２−Ｄｂ制限エピトープに対応する合成Ｅ７４９−５７ペプチド［ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号６７）：アミノ酸に対する一字コード］は、Ｐｒｏｉｒｎｒｎｕｎｅ（Ｏｘｆｏｒｄ、英国）から購入した。ポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ＰｌＣ、ポリＩ：Ｃ、ｐｌＣまたはｐＩ：Ｃ）はＩｎｖｉｖｏｇｅｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入して、注射前にＰＢＳ中に希釈した。ＣｐＧホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドタイプＢ（ＣｐＧ１８２６：５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’）はＰｒｏｌｉｇｏ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）により合成された。３０μｇのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを、５０μＬのＯｐｔｉｍｅｎ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，米国）中に希釈して、６０μｇのＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）と混合し、１００μＬのＯｐｔｉｍｅｎで希釈した。シクロホスファミド（ＣＰＡ）（Ｓｉｇｒｎａ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，ドイツ）を注射前にＰＢＳで希釈してワクチン接種の２４時間前に投与した。種々の抗原性剤形およびアジュバントを同時に注射した。静脈内投与は眼窩後部注射により２００μＬの体積で実施した。
【０１５７】
組替えＥＤＡ−ＨＰＶＥ７融合タンパク質の調製
フィブロネクチンからのエキストラドメインＡを発現するプラスミドｐＥＴ２０ｂ−ＥＤＡを、前に記載したようにして調製して（Ｌａｓａｒｔｅ，Ｃａｓａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．２００７）、ＥＤＡタンパク質のＮ端に連結したＨＰＶ−Ｅ７タンパク質の最初の１〜２９アミノ酸およびＥＤＡのＣ末端に連結したＨＰＶ−Ｅ７の４３〜９８アミノ酸を含有する融合タンパク質を発現するための発現プラスミドｐＥＴ２０ｂ−ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７を構築するために使用した。この発現プラスミドは、下記のように２ステップで構築した。ＴＣ−１細胞からのＲＮＡは、１×１０７個の細胞からＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ １９８７）の方法により、Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ（Ｂｉｏｔｅｃｘ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、米国）をメーカーの指示にしたがって使用して単離した。全ＲＮＡを逆転写して、ＨＰＶ−Ｅ７タンパク質をコードする遺伝子を、前に記載したように（Ｌａｓａｒｔｅ，Ｃａｓａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．２００７）上流で最初のＵＰ−１ ＣＡＴＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣ［配列番号６８］（下線を引いたＮｄｅＩ制限部位を含む）および下流で最初のＤＷ−１ ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴ［配列番号６９］（ＮｏｔＩ制限部位を含有する）を使用して、ＰＣＲにより増幅した。生ずるＰＣＲ生成物は、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，米国）を使用して、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローニングし、プラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＨＰＶ−Ｅ７に導いた。発現プラスミドｐＥＴ２０ｂ−ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７の構築についての最初のステップについては、プラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯＨＰＶ−Ｅ７テンプレートとして、プライマーＵＰ−１（配列番号６８）およびＤＷ−２（ＣＡＴＡＴＧＡＴＴＴＡＡＴＴＧＣＴＣＡＴＡＡＣＡ、配列番号７０）を使用するＰＣＲ反応。生じたフラグメントをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯでサブクローニングするとプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−（１〜２９）Ｅ７が生ずる。このプラスミドをＮｄｅＩ制限酵素で消化して、生じたフラグメントをＮｄｅＩで消化したｐＥＴ２０ｂ−ＥＤＡプラスミドでサブクローニングするとプラスミドｐＥＴ２０ｂ−ＥＤＡ−（１〜２９）Ｅ７が生ず
る。第２のステップにおいては、プラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＨＰＶ−Ｅ７テンプレートとしてプラスミドＵＰ−２（ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＣＣＧＧＡ、配列番号７１）およびＤＷ−１（配列番号６９）を使用するＰＣＲ反応を実施した。生じたＰＣＲ生成物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯでサブクローニングするとプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（４３〜９８）Ｅ７が生じ、それをＮｏｔＩで消化してＥ７タンパク質のこの部分をコードするフラグメントを精製した。この生成物を前にＮｏｔＩで消化したプラスミドｐＥＴ２０ｂＥＤＡ−（１〜２９）Ｅ７でサブクローニングした。この過程の後、本発明者らは、プラスミドｐＥＴ２０ｂ−ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７を得てその配列を決定し、カルボキシ端に６つのヒスチジン残基（６×Ｈｉｓタグ）を担持する融合タンパク質（１〜２９）Ｅ７−ＥＤＡ−（４３〜９８）Ｅ７の正しい発現を確認した。このプラスミドｐＥＴ２０ｂ２−２６をＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中に形質移入して、組替えタンパク質を発現し、それを、細胞抽出物の可溶性分画から、ＦＰＬＣプラットホーム（ＡＫＴＡ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して親和性クロマトグラフィー（Ｈｉｓｔｒａｐ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により精製した。溶出したタンパク質を、Ｈｉｔｒａｐ脱塩カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して脱塩し、ＡｍｉｃｏｎのＵｌｔｒａ４−５０００ＭＷＣＯ遠心濾過デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃａｒｒｉｇｈｗａｈｉｌｌ、アイルランド）を使用して濃縮した。この組替えタンパク質を、Ｅｎｄｏｔｒａｐカラム（Ｐｒｏｆｏｓ Ａｇ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）を使用することにより、内毒素レベルが、リムルス試験法の定量的発色（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国）により試験して０．２ＥＵ／μｇタンパク質未満になるまで内毒素を除いて精製した。精製した組替えタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用し、メーカーの指示にしたがってクーマジーブルーで染色した（図１）。
【０１５８】
ウェスタンブロットおよび質量分析法によるタンパク質のキャラクタリゼーション
【０１５９】
ウェスタンブロット分析：精製したタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷し、続いてニトロセルロース膜に電気泳動で移した。ヒスチジンタグ付タンパク質を抗Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）および抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して検出した。タンパク質のバンドは、増強化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）により検出した。トリプシン消化物から、ＷａｔｅｒｓのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＧＬ−ＲＥＦ質量分光計を使用して、ペプチドのマスフィンガープリント（ＰＭＦ）を得た。簡単に説明すると、１．２μＬのトリプシン消化物を０．１％ＴＦＡ添加５０％アセトニトリル中の等量のα−シアノ−４−ヒドロキシ−トランス−ケイヒ酸と混合して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的プレート上にスポットした。データ処理は、Ｍａｓｓｌｙｎｘ ４．０（Ｗａｔｅｒｓ）でＡＣＴＨを内部ロック質量標準として使用して実施した。
【０１６０】
微細毛細管逆相ＬＣをＣａｐＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）毛細管系で実施した。トリプシン消化物の逆相分離は、５％アセトニトリル、０．２％ギ酸で平衡化したＡｔｌａｎｔｉｓ、Ｃ１８、３μｍ、７５μｍ×１０ｃｍのＮａｎｏ Ｅａｓｅ溶融シリカ毛細管カラム（Ｗａｔｅｒｓ）で実施した。６μＬの試料を注入した後、カラムを５分間同じ緩衝液で洗浄し、ペプチドを、３０分で５〜５０％のアセトニトリルの線形グラジエントを使用して、一定の流速０．２μＬ／分で溶出した。カラムを、Ｐｉｃｏ Ｔｉｐナノスプレーイオン化供給源（Ｗａｔｅｒｓ）を使用するＱ−ＴＯＦ Ｍｉｃｒｏ（Ｗａｔｅｒｓ）に連結した。加熱した毛細管温度は８０°Ｃであり、スプレー電圧は１．８〜２．２ｋＶであった。ＭＳ／ＭＳデータは自動化されたデータ依存様式で収集した。各概略走査における３つの非常に強いイオンを２．５の単離幅および３５％の相対衝突エネルギーを使用して衝突誘起解離（ＣＩＤ）により順次に断片化した。データ処理は、Ｍａｓｓｌｙｎｘ ４．０を用いて実施した。ＰＭＦに基づくタンパク質同定は、Ｍａｓｓｌｙｎｘスコアが少なくとも７であり、且つ合致したペプチドが指名したタンパク質配列の少なくとも３０％を提示するときにのみ受け入れた。ＭＳ／ＭＳデータによるタンパク質同定は、７を超えるスコア値について、および少なくとも３つの独立のペプチドの配列に基づくときのみ考慮した。
【０１６１】
単球活性化のインビトロ分析。ＴＨＰ−１
ＴＨＰ−１細胞を１×１０６細胞／ウェルで入れて、培養の安定化のための完全培地中で、３７°Ｃおよび５％ＣＯ２で終夜培養した。種々の濃度の指示した抗原を培養液に加えて、１５時間のインキュベーション後に、培養上清を収穫した。ＴＨＰ−１細胞ラインにより培地に放出されたヒトＴＮＦ−αの濃度を、市販のＥＬＩＳＡアッセイ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してメーカーの指示にしたがって定量した。
【０１６２】
ＤＣ成熟のインビトロ分析
骨髄（ＢＭ）由来の樹状細胞を、マウス大腿骨骨髄細胞の培養により発生させた。赤血球をＡＣＫ細胞溶解緩衝液で溶解した後、骨髄細胞を洗浄し、続いてＣＤ４（ＧＫ１；ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）、ＣＤ８（５３．６．７２；ＡＴＣＣ）Ｌｙ−６Ｇ／Ｇｒ１（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）およびＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に対する抗体の混合物と続いてウサギ補体とのインキュベーションによりリンパ球をおよび顆粒球完全に除去した。残存する細胞を、１２ウェルのプレート中１０６細胞／ｍｌで、２０ｎｇ／ｍｌのｍＧＭ−ＣＳＦおよび２０ｎｇ／ｍｌのｍＩＬ−４（両方ともＰｅｐｒｏｔｅｃｈ；Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫから）で補完したＣＭ（１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノールで補完したＲＰＭＩ１６４０）中で増殖させた。２日毎に、培地の３分の２をサイトカインを含有する新鮮培地で置換した。付着しない樹状細胞を第７日に収穫して、種々の刺激剤の存在または不在下に３７°Ｃおよび５％ＣＯ２で培養した、２４時間の培養後、上清を収穫してＩＬ−１２（ｐ７０）、ＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡ（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）によりメーカーの指示にしたがって測定した。ＤＣ成熟マーカーの発現はフローサイトメトリーにより測定した。細胞をラット抗ＣＤ１６／３２ｍＡｂ（２．４Ｇ２クローン、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とともに１５分間、前培養して、一次抗体の非特異的結合を阻止した。この初期インキュベーションの後、細胞を一次抗体により４°Ｃで１５分間染色して洗浄し、ＦＡＣＳ走査サイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で捕捉して、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。使用した抗体は：抗ＩＡβｂ（２５−９−１７クローン）、抗Ｈ−２Ｋｂ（ＡＦ６−８８．５クローン）、抗ＣＤ４０（３／２３クローン）、抗ＣＤ５４（３Ｅ２クローン）、抗ＣＤ８０（１６−１０Ａ１クローン）、抗ＣＤ８６（ＧＬ１クローン）、抗ＣＤ１１ｃ（ＨＬ−３クローン）であり、全てＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎからのものである。
【０１６３】
統計分析
非線形混合効果モデルで腫瘍成長データを分析するために、Ｍｏｎｏｌｉｘソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｎｏｌｉｘ．ｏｒｇ／）を使用した。経時的な腫瘍の平均直径を、方程式１．１で記述されるモデルを使用して適合させ、治療を尤度比検定を使用して比較した。
【数１】
式中、Ｙｉｊはマウスｉの時間ｔｉｊにおける腫瘍直径であり、Ｙｏ、ｋｃ、ｋａおよびｋｅは、それぞれ、初期腫瘍直径、腫瘍成長速度、エフェクター細胞固有の致死活性およびエフェクター細胞の排除速度を表すモデルの係数である。
【０１６４】
カプランマイヤープロットを使用して生存率を分析した。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、米国）を使用してログランク検定で生存曲線における差の有意性を決定した。インビボの致死分析の結果は、ＡＮＯＶＡに続くダネットの多重比較検定により分析した。０．０５未満のｐ値を統計的に有意であるとみなした。
【０１６５】
実施例１
ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７融合タンパク質はインビトロで骨髄由来の樹状細胞の成熟を誘発することができる
すでに記載したように、文献ＷＯ０６１３４１９０には、フィブロネクチンからのエキストラドメインＡ（ＥＤＡ）、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）の内因性リガンドを包含する組替えタンパク質が、ＴＬＲ４シグナル伝達経路に結合して活性化することが記載されている。ＥＤＡは、ＤＣによるＩＬ−１２またはＴＮＦ−αなどの炎症誘発性サイトカインの産生も刺激して、インビトロおよびインビボにおけるそれらの成熟を誘発する。それ故、組替えタンパク質ＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７がインビトロでＢＭＤＣの成熟も誘発することができるか否かをアッセイした。ＢＭＤＣを５００ｎＭのＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７とともにインキュベーションすると成熟マーカーＩＡｂ、ＣＤ５４および、程度は低いがＣＤ８６分子の発現を上方制御し得ることを見出した（図２）。その上、ＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７は、ＢＭＤＣによるＩＬ−１２サイトカインの産生を強く刺激することができた（図３Ａ）。同様に、組替え融合タンパク質ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７は、ＴＬＲ４分子を発現するヒト単球細胞ラインＴＨＰ−１によるＴＮＦ−αサイトカインの産生も誘発することができた（図３Ｂ）。これらの結果はＥＤＡとＨＰＶＥ７タンパク質との融合タンパク質は、ＥＤＡの炎症誘発性の性質を保持することを示す。
【０１６６】
実施例２
ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７融合タンパク質は、共アジュバント不在下にインビボでＨＰＶＥ７特異的ＣＴＬを誘発する。
【０１６７】
ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７融合タンパク質で免疫したマウスが、ＨＰＶＥ７特異的Ｔ細胞応答を発生するか否かをアッセイした。融合タンパク質の能力を、Ｃ５７ＢＬ６マウスにより認識される細胞傷害性Ｔ細胞決定基を含む合成Ｅ７（４９〜５７）ペプチドと比較した。マウスは静脈注射によりＰＢＳ中２ｎｍｏｌのＥＤＡＨＰＶ−Ｅ７またはペプチドＤＴｃ／Ｅ７（４９〜５７）で免疫した。免疫７日後にマウスを屠殺して、脾臓細胞をペプチドＤＴｃの存在または不在下に５日間に培養した。ＣＴＬ活性は、ＤＴｃペプチドでパルスしたまたはしない放射性標識したＥＬ４細胞を標的細胞として使用する従来のクロム放出アッセイを使用して測定した（図４Ａ）（グラフに絶対値を示す。前記値はペプチド不在で得た細胞溶解の値をペプチド存在下で得た値から差し引いて計算した）。ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７タンパク質で免疫したマウスの方が、細胞傷害性Ｔ細胞エピトープでパルスした標的細胞に対して高いレベルのＣＴＬ活性を有することが示される。それは、ＥＬＩＳＰＯＴで、すなわち、ＥＤＡＨＰＶ−Ｅ７またはＥ７（４９〜５７）ペプチドで免疫したマウスからの脾臓細胞中における、ペプチドＥ７（４９〜５７）の存在または不在下で培養して、または放射線照射したＴＣ１腫瘍細胞（ＨＰＶＥ７タンパク質を発現する）に対して応答して、または腫瘍細胞ＥＬ−４（陰性対照）に対して応答してＩＦＮ−γを産生する細胞の数によっても測定した（図４Ｂ）。ＥＤＡ−ＨＰＶ Ｅ７で免疫したこれらのマウスは、Ｅ７（４９〜５７）またはＴＣ１細胞に対して特異的なＩＦＮ−γ産生スポットのより高い数を有することが見出され、細胞傷害性Ｔ細胞決定基単独と比較してより高いこのタンパク質の免疫源性が確認された。
【０１６８】
実施例３
ＥＤＡ−ＨＯＶＥ７融合タンパク質は共アジュバントの存在下にインビボでＨＰＶＥ７特異的ＣＴＬを誘発する。
ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７融合タンパク質で免疫したマウスが、ＴＬＲ３リガンドのポリＩ：Ｃ（ｐＩ：Ｃ）の存在下で、改善されたＨＰＶＥ７特異的Ｔ細胞応答を発生するか否かをアッセイした。マウスは静脈注射によりｐＩ：Ｃ（５０μｇ／マウス）の存在下に２ｎｍｏｌＥＤＡ−ＨＰＶＥ７またはＤＴｃ／Ｅ７（４９〜５７）ペプチドで免疫した。免疫７日後に、マウスを屠殺して脾臓細胞をＤＴｃ／Ｅ７（４９〜５７）ペプチドの存在または不在下で培養した。５日培養した後、ＣＴＬ活性を、ＤＴｃペプチドでパルスしたもしくはしない放射性標識ＥＬ４細胞（図５Ａ）または放射線照射したＴＣ−１細胞（図５Ｂ）を標的細胞として使用して、従来のクロム放出アッセイを使用して測定した（グラフは、ペプチドなしで得られた細胞溶解の値をペプチド存在下で得た値から差し引いて計算した絶対値を示す）。並行して、ＥＤＡＨＰＶ−Ｅ７またはＤＴｃ／Ｅ７（４９〜５７）ペプチドで免疫したマウスからの脾臓細胞を、Ｅ７（４９〜５７）ペプチドまたはＴＣ１細胞または放射線照射したＥＬ−４細胞の存在または不在下で２４時間インキュベートして、ＥＬＩＳＰＯＴを使用してＩＦＮ−γ産生を測定した（図５Ｃ）。
【０１６９】
実施例４
ポリＩ：Ｃおよびシクロホスファミドと組み合わせたＥＤＡ−ＨＰＶＥ７融合タンパク質の治療的有効性。
抗原送達系としておよびワクチンとしてのＥＤＡ−ＨＰＶＥ７の効力をさらによく評価するために、この融合タンパク質の治療的有効性とＥ７（４９〜５７）ペプチドの治療的有効性とを、両方ともＴＬＲリガンドｐＩ：Ｃで補完して比較した。それ故、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０５のＴＣ−１細胞を用いて皮下注射して、２５日後に、腫瘍の平均直径が約８ｍｍになったときに治療的に処置した。したがって、静脈注射で以下の組合せのＥＤＡワクチンによりマウスを処置した：（ｉ）５０μｇのｐＩ：Ｃを加えた２ｎｍｏｌのＥＤＡ−ＨＰＶＥ７；（ｉｉ）５０μｇのｐＩ：Ｃを加えた２ｎｍｏｌのペプチドＥ７（４９〜５７）；（ｉｉｉ）２ｎｍｏｌのＥＤＡおよび５０μｇのｐＩ：Ｃを加えた２ｎｍｏｌのＥ７（４９〜５７）ペプチド；（ｉｖ）５０μｇのｐＩ：Ｃを加えた２ｎｍｏｌのＥＤＡ；（ｖ）５０μｇのｐＩ：Ｃ単独；（ｖｉ）２ｎｍｏｌのＥＤＡ−ＨＰＶＥ７単独または；（ｖｉｉ）ＰＢＳ。
【０１７０】
ＰＢＳを注射したマウス（対照群）においては、腫瘍は継続的に成長して、マウスを３０日目と４０日目の間に屠殺しなければならなかった（図６Ａ）。抗原なしでアジュバントにより処置した腫瘍の大部分は、具体的にはｐＩ：ＣおよびＥＤＡ＋ｐＩ：Ｃで処置したマウスは、若干のマウスでは腫瘍成長の遅れが観察されたとはいえ、同じ腫瘍成長速度をたどった。この遅れは僅少に終わり、生存の延長は統計的に有意でない（図６Ｂ）。Ｅ７ペプチド（Ｅ７（４９〜５７））の免疫カクテルへの添加により、アジュバントにより誘発された腫瘍成長抑止は僅かに改善された（図６Ａ）。幾つかの腫瘍は、数日間腫瘍サイズの寛解を示し、さらに１匹のマウスでは腫瘍が完全に消失したが、しかしながら、腫瘍は成長し続けて、最終的にはマウスを屠殺した。融合タンパク質ＥＤＡ−ＨＰＶ Ｅ７は、単独では腫瘍を根絶することができなかったが、腫瘍成長における遅れは観察された。しかしながら、ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７とＴＬＲ３に結合する緩和なアジュバントであるｐＩ：Ｃとの組合せは、これらの大きい確立した腫瘍の根絶を６０％のマウスで達成することができた（図６Ａ）。腫瘍成長（図６Ａ）および生存（図６Ｂ）は両方とも、ｐＩ：Ｃ処置マウスとは有意に異なる（Ｅ７（４９〜５７）＋ｐＩ：Ｃで処置したマウスとＥＤＡ−ＨＰＶ Ｅ７＋ｐＩ：Ｃで処置したマウスとの間の尤度比検定を使用して決定してｐ＜０．０００４（図６Ａ）、および生存曲線の比較のためのログランク検定を使用して決定してｐ＜０．０５（図６Ｂ））。それ故、抗原とＥＤＡとの共有結合およびアジュバント共投与は両方とも、マウスにおける大きい腫瘍を根絶するために必要である。
【０１７１】
より困難な状況におけるＥＤＡ−ＨＰＶに基づくワクチン接種の治療的有効性をアッセイした。そのために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０５のＴＣ−１細胞を皮下注射して、３５日後に、腫瘍平均直径が約１２〜１５ｍｍになったときに治療的に処置した。このモデルにおいては、ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７をマウスの治療について低用量の化学療法剤シクロホスファミド（ＣＰＡ、１７５ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせた。２４時間後に、マウスをＥＤＡ−ＨＰＶ−Ｅ７（２ｎｍｏｌ／マウス）およびＣｐＧ−Ｂ／ＤＯＴＡＰ（３０μｇ／マウス）で免疫した。単独またはアジュバントと組み合わせたＰＢＳで免疫したマウスおよびＣＰＡ治療のみのマウス（図７Ｂ）を対照として使用した。図７Ａに示した図式に示したように、全ての動物は、対応する治療による第２の投与を検討の第５０日に受けた。
【０１７２】
ＣｐＧ／ＤＯＴＡＰを加えたＥＤＡ−ＨＰＶＥ７とＣＰＡとの組合せで２回免疫したマウスの治療は、これらの非常に大きい腫瘍を５０％のマウスにおいて拒絶することができたが、アジュバントおよびＣＰＡ投与による治療後に治癒したマウスは１２％だけであることが見出された（ＣＰＡ＋ＣｐＧ／ＤＯＴＡＰ治療マウスに対するＣＰＡ＋ＣｐＧ／ＤＯＴＡＰ＋ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７治療マウスの尤度比検定を使用して決定してｐ＝０．００６４（図７Ａ）および生存曲線の比較のためにログランク検定を使用して決定してｐ＜０．０５）（図７Ｃ）。
【０１７３】
まとめると、組替え融合タンパク質ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７は、樹状細胞の成熟を誘発し、インビボで抗腫瘍免疫応答の活性化を誘発し、且つＨＰＶＥ７タンパク質を発現している十分確立した大きい腫瘍を根絶することができることが証明された。これらのデータは、ヒト子宮頸癌に対する代替的療法の開発に対して、ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７タンパク質を考慮することができることを示唆する。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）フィブロネクチンのＥＤＡ領域またはそれらの機能的に同等な変異体、および
ｉｉ）少なくとも１種のＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチド
を含み、成分（ｉ）と（ｉｉ）とが共有結合してなる、複合体であって、
前記抗原性ペプチドに対する細胞傷害性応答を助長する、複合体。
【請求項２】
フィブロネクチンのＥＤＡ領域がヒト由来である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
成分（ｉｉ）が、配列番号５１のアミノ酸の１〜２９番を含有する抗原性ペプチド、配列番号５２のアミノ酸の４３〜９８番を含有する抗原性ペプチドまたは両方を含む、請求項１または２に記載の複合体。
【請求項４】
成分（ｉｉ）が成分（ｉ）とともに単一ポリペプチド鎖を形成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項５】
前記ＥＤＡ領域が、２つのＨＰＶ Ｅ７抗原性ペプチドと並んで配置されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項６】
配列番号５３または配列番号７２の配列を含む、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか一項に記載の複合体をコードする、ポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物を含む、ベクター。
【請求項９】
請求項７に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、または請求項８に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１０】
（ｉ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体、請求項７に記載のポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築物、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞、および
（ｉｉ）ＴＬＲリガンド
を一緒にまたは別々に含む、組成物。
【請求項１１】
（ｉ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体、請求項７に記載のポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築物、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞、
（ｉｉ）ＴＬＲリガンド、および
（ｉｉｉ）化学療法剤
を一緒にまたは別々に含む、組成物。
【請求項１２】
ＴＬＲリガンドが、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ９リガンドおよび両者の組合せからなる群から選択される、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＴＬＲ３リガンドがポリ（Ｉ：Ｃ）である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ＴＬＲ９リガンドが、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
化学療法剤（ｉｉｉ）がシクロホスファミドである、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体、請求項７に記載のポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築物、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の細胞、または請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の組成物、および少なくとも１種の薬学的に許容し得る担体もしくはアジュバントを含む、医薬組成物。
【請求項１７】
医薬に使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体、請求項７に記載のポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築物、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の細胞または請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
ワクチンを製造するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体、請求項７に記載のポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築物、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の細胞または請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１９】
ヒトパピローマウイルスにより惹起される感染および／またはＨＰＶ感染と関連する子宮頸癌の予防および治療のための医薬を製造するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体、請求項７に記載のポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築物、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の細胞または請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２０】
少なくとも１種のＨＰＶ Ｅ７抗原を提示する成熟樹状細胞を得るためのインビトロ方法であって、
ｉ）樹状細胞と、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体、請求項７に記載のポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築物、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の細胞または請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の組成物とを、樹状細胞の成熟が起こるために適した条件で接触させ、かつ
ｉｉ）成熟樹状細胞を回収すること
を含む、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法により得られる、樹状細胞。
【請求項２２】
医薬に使用するための、請求項２１に記載の樹状細胞。
【請求項２３】
ヒトパピローマウイルスにより惹起される感染および／またはＨＰＶ感染と関連する子宮頸癌の予防および治療のための医薬を製造するための、請求項２２に記載の細胞の使用。
【請求項１】
ｉ）フィブロネクチンのＥＤＡ領域またはそれらの機能的に同等な変異体、および
ｉｉ）少なくとも１種のＨＰＶ Ｅ７由来の抗原性ペプチド
を含み、成分（ｉ）と（ｉｉ）とが共有結合してなる、複合体であって、
前記抗原性ペプチドに対する細胞傷害性応答を助長する、複合体。
【請求項２】
フィブロネクチンのＥＤＡ領域がヒト由来である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
成分（ｉｉ）が、配列番号５１のアミノ酸の１〜２９番を含有する抗原性ペプチド、配列番号５２のアミノ酸の４３〜９８番を含有する抗原性ペプチドまたは両方を含む、請求項１または２に記載の複合体。
【請求項４】
成分（ｉｉ）が成分（ｉ）とともに単一ポリペプチド鎖を形成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項５】
前記ＥＤＡ領域が、２つのＨＰＶ Ｅ７抗原性ペプチドと並んで配置されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項６】
配列番号５３または配列番号７２の配列を含む、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか一項に記載の複合体をコードする、ポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物を含む、ベクター。
【請求項９】
請求項７に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物、または請求項８に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１０】
（ｉ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体、請求項７に記載のポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築物、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞、および
（ｉｉ）ＴＬＲリガンド
を一緒にまたは別々に含む、組成物。
【請求項１１】
（ｉ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体、請求項７に記載のポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築物、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞、
（ｉｉ）ＴＬＲリガンド、および
（ｉｉｉ）化学療法剤
を一緒にまたは別々に含む、組成物。
【請求項１２】
ＴＬＲリガンドが、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ９リガンドおよび両者の組合せからなる群から選択される、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＴＬＲ３リガンドがポリ（Ｉ：Ｃ）である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ＴＬＲ９リガンドが、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
化学療法剤（ｉｉｉ）がシクロホスファミドである、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体、請求項７に記載のポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築物、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の細胞、または請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の組成物、および少なくとも１種の薬学的に許容し得る担体もしくはアジュバントを含む、医薬組成物。
【請求項１７】
医薬に使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体、請求項７に記載のポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築物、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の細胞または請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
ワクチンを製造するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体、請求項７に記載のポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築物、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の細胞または請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１９】
ヒトパピローマウイルスにより惹起される感染および／またはＨＰＶ感染と関連する子宮頸癌の予防および治療のための医薬を製造するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体、請求項７に記載のポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築物、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の細胞または請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２０】
少なくとも１種のＨＰＶ Ｅ７抗原を提示する成熟樹状細胞を得るためのインビトロ方法であって、
ｉ）樹状細胞と、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体、請求項７に記載のポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築物、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の細胞または請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の組成物とを、樹状細胞の成熟が起こるために適した条件で接触させ、かつ
ｉｉ）成熟樹状細胞を回収すること
を含む、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法により得られる、樹状細胞。
【請求項２２】
医薬に使用するための、請求項２１に記載の樹状細胞。
【請求項２３】
ヒトパピローマウイルスにより惹起される感染および／またはＨＰＶ感染と関連する子宮頸癌の予防および治療のための医薬を製造するための、請求項２２に記載の細胞の使用。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【公表番号】特表２０１３−５０４３１４（Ｐ２０１３−５０４３１４Ａ）
【公表日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２８３９７（Ｐ２０１２−５２８３９７）
【出願日】平成２２年９月１０日（２０１０．９．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２０１０／０７０５９０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２９９８０
【国際公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【出願人】（５０６０６１７１６）プロイェクト、デ、ビオメディシナ、シーマ、ソシエダッド、リミターダ (34)
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＹＥＣＴＯ ＤＥ ＢＩＯＭＥＤＩＣＩＮＡ ＣＩＭＡ， Ｓ．Ｌ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１０日（２０１０．９．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２０１０／０７０５９０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２９９８０
【国際公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【出願人】（５０６０６１７１６）プロイェクト、デ、ビオメディシナ、シーマ、ソシエダッド、リミターダ (34)
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＹＥＣＴＯ ＤＥ ＢＩＯＭＥＤＩＣＩＮＡ ＣＩＭＡ， Ｓ．Ｌ．
【Ｆターム（参考）】
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