ＬＡＭＰ法を用いたイネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌の検出法
【課題】環状型等温増幅反応（ＬＡＭＰ法）を用いたイネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌の検出法を提供する。
【解決手段】特定の塩基配列を持つ５種類のプライマー全種を用いるプライマーセットからなり、イネ苗立枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングし、環状型等温増幅反応（ＬＡＭＰ法）によって該特定遺伝子を増幅可能であることを特徴とするイネ苗立枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマー。特定の塩基配列を持つ５種類のプライマー全種を用いるプライマーセットからなり、イネもみ枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングし、ＬＡＭＰ法によって該特定遺伝子を増幅可能であることを特徴とするイネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマー。これらのプライマーを用いた本細菌病菌の検出方法、及び本細菌病の発病有無の判定方法。
【解決手段】特定の塩基配列を持つ５種類のプライマー全種を用いるプライマーセットからなり、イネ苗立枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングし、環状型等温増幅反応（ＬＡＭＰ法）によって該特定遺伝子を増幅可能であることを特徴とするイネ苗立枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマー。特定の塩基配列を持つ５種類のプライマー全種を用いるプライマーセットからなり、イネもみ枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングし、ＬＡＭＰ法によって該特定遺伝子を増幅可能であることを特徴とするイネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマー。これらのプライマーを用いた本細菌病菌の検出方法、及び本細菌病の発病有無の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＡＭＰ法（環状型等温増幅反応）を用いたイネ苗立枯細菌病菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｌａｎｔａｒｉｉ）及びイネもみ枯細菌病菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ）を特異的に検出できることができる方法、この方法に用いるプライマーセット、また、この方法及びプライマーセットを用いた育苗時の細菌病発病判断方法に関するものである。本発明は、育苗時において、イネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌を特異的に検出できる本細菌病の発病有無を判定できる判定技術を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
イネ苗立枯細菌病菌やイネもみ枯細菌病菌は、イネの育苗期に発生する細菌病の病原細菌の一種で、育苗時に苗を枯死させる被害を出す。現在行われている防除方法は、主にイネもみを農薬に浸漬する種子消毒法であり、育苗時の被害を予防的に防止している。
【０００３】
このような種子消毒は必須の現状であり、また、農薬を種子消毒に使用した場合、排出される農薬廃液処理も必要である。このように、育苗前に発病の有無を調査することができない現状では、防除は必須であるので、コスト面・作業時間の面からもイネ生産者には負担となっている。育苗前に防除要否を判断できる技術が求められている。
【０００４】
従来、イネ苗立枯細菌病やイネもみ枯細菌病の診断・判定法として、選択培地を用いてこれらの菌の有無を調査することがある。しかしながら、この方法は、判定までに長時間を要し、判定には熟練性を要する。そこで、生化学的性状から判断するものではなく、遺伝子レベルでの判別方法が着目されている。
【０００５】
現在報告されている遺伝子レベルでの判定方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）を利用したイネ苗立枯細菌病菌検出法及びイネもみ枯細菌病菌検出法が報告されている（非特許文献１参照）。
【０００６】
しかしながら、このＰＣＲ法を用いた細菌の検出法は、反応を行うために遺伝子増幅装置を必要とし、最終的な判定操作は電気泳動法と呼ばれる特殊な手法や紫外線を照射する装置などが必要で、開始から判定までに４〜５時間要する。
【０００７】
また、このＰＣＲ法を用いてイネ浸種時の細菌有無を調査し、防除要否を判断しようとした場合、イネもみ枯細菌病菌は、浸種液を培養し、細菌を増殖させれば判断が可能である。しかし、イネ苗立枯細菌病菌は、浸種液を培養・細菌増殖させたとしてもＰＣＲ法による菌の検出限界と発病する最低菌密度レベルがほぼ同じレベルとなり、精度不足で判断は不可能であった。そこで、ＰＣＲ法よりも迅速で簡便、そして検出感度が高い検出法が求められていた。
【０００８】
最近では、ＰＣＲ法に代わる遺伝子増幅法として環状型等温増幅反応（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＬＡＭＰ）による手法が栄研化学株式会社より開発された。この手法は、特殊な大型機器を用いる必要はなく、また反応時間も短く簡便であり、迅速に結果を得られると考えられる。しかしながら、イネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌に特異的に反応するＬＡＭＰプライマーは、未だ発見されていない。
【０００９】
【非特許文献１】日本植物病理学会報、６３巻、ｐｐ．４５５−４６２（１９９７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このような状況の中で、本発明者は、上記従来技術に鑑みて、イネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌を特異的に検出できる新しい判定技術を開発することを目標として鋭意研究を重ねた結果、イネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌に特異的に反応するＬＡＭＰプライマーを設計、完成させ、そして、これらＬＡＭＰプライマーを用いて、イネもみ浸種液中の細菌数と発病度との関係を調べることで、浸種時以降の細菌病防除要否を判断できることを見出し、本発明を完成させた。本発明は、イネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌に特異的に反応するＬＡＭＰプライマー、該プライマーを用いてイネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌を特異的に検出できる方法、該方法を用いた本細菌病の発病有無の判定方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）配列番号１〜５で示される５種類のプライマー全種を用いるプライマーセットからなり、イネ苗立枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングし、環状型等温増幅反応（ＬＡＭＰ法）によって該特定遺伝子を増幅可能であることを特徴とするイネ苗立枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマー。
（２）前記（１）に記載の５種類のプライマー全種をイネ苗立枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングさせ、更に、ＬＡＭＰ法によって特定領域遺伝子を増幅させ、この増幅による反応系の変化を光学的検査により確認することからなるイネ苗立枯細菌病菌の検出方法。
（３）光学的検査による確認が、反応液の濁度を目視判定する確認である、前記（２）に記載のイネ苗立枯細菌病菌の検出方法。
（４）前記（２）又は（３）に記載の方法で、イネもみ浸種液を集菌増殖処理した培養液中のイネ苗立枯細菌病菌を検出することにより、本細菌病の発病有無を判定する方法。
（５）配列番号６〜１０で示される５種類のプライマー全種を用いるプライマーセットからなり、イネもみ枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングし、ＬＡＭＰ法によって該特定遺伝子を増幅可能であることを特徴とするイネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマー。
（６）前記（５）に記載の５種類のプライマー全種をイネもみ枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングさせ、更に、ＬＡＭＰ法によって特定領域遺伝子を増幅させ、この増幅による反応系の変化を光学的検査により確認することからなるイネもみ枯細菌病菌の検出方法。
（７）光学的検査による確認が、反応液の濁度を目視判定する確認である、前記（６）に記載のイネもみ枯細菌病菌の検出方法。
（８）前記（６）又は（７）に記載の方法で、イネもみ浸種液中のイネもみ枯細菌病菌を検出することにより、本細菌病の発病有無を判定する方法。
【００１２】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明者は、上記した新規プライマーを得るという課題を解決するために、この発明では、配列番号１〜５に示される塩基配列５種のプライマーを全種用いるプライマーセットからなり、イネ苗立枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングし、ＬＡＭＰ法によって増幅可能なイネ苗立枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマー、そして、配列番号６〜１０に示される塩基配列５種のプライマーを全種用いるプライマーセットからなり、イネもみ枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングし、ＬＡＭＰ法によって増幅可能なイネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマーとした。
【００１３】
上記したイネ苗立枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマー及びイネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマーは、この２菌株の１６Ｓ及び２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子間に存在するスペーサー領域の塩基配列間に異なる配列が存在していることを利用しており、それぞれの細菌のスペーサー領域に特異的にアニーリングする（図１）。
【００１４】
これらの５種類のプライマーセットは、６０℃付近においてアニーリングと同時にＤＮＡ鎖の合成も起こすものである。それぞれのプライマーからなるＤＮＡ合成は、他のプライマーから合成したＤＮＡ鎖を剥がしながら進行するため、等温反応にて遺伝子の増幅が起こる。このようなＤＮＡ増幅反応が進むと、副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響で反応液が白濁するため、増幅の有無を目視により判定できる。
【００１５】
完成させたＬＡＭＰプライマーを用いて、イネ育苗時の細菌病に対する防除要否を判断する場合、イネ苗立枯細菌病菌は、浸種液をメンブレンフィルターで集菌して、フィルターを液体の選択培地に混入させて培養し、増殖させ、イネ苗立枯細菌病菌検出ＬＡＭＰプライマーを用いてＬＡＭＰ反応を行うことにより、発病限界の菌濃度まで検出することが可能となった。また、イネもみ枯細菌病菌については、浸種液を直接用いて、イネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマーを用いたＬＡＭＰ反応に使用することで、発病限界の菌濃度まで検出することが可能となった。
【００１６】
本発明において使用される試料としては、イネ苗立枯細菌病菌やイネもみ枯細菌病菌の培養液や寒天培地上に増殖させた菌体コロニーを蒸留水に懸濁した菌液を使用する。また、イネのもみ、もみ浸種時の浸種液、葉、茎などを試料として用いる場合、もみや植物体は、水や緩衝液に浸漬させるか、水や緩衝液中に浸したのち磨砕させることにより液体中に増幅に用いられる菌体・核酸を遊離させる。また、もみ浸種時における浸種液を用いる場合には、そのままかあるいは５μｍフィルターなどで夾雑物を除去して精製した菌液、また、夾雑物をフィルターで除去した液中の菌を０．２２μｍフィルターで集菌し、そのフィルターを１／５濃度の液体選択培地に混入させて培養し、増殖させた培養液を試料とする。
【００１７】
このように得られたイネ苗立枯細菌病菌やイネもみ枯細菌病菌が遊離した菌液からそれぞれの核酸を増幅するためには、ＬＡＭＰ法を行い特定遺伝子領域を増幅させる。このＬＡＭＰ法は、栄研化学株式会社が開発した核酸増幅法である。ＬＡＭＰ法は、標的遺伝子の６箇所の領域に対して４種類のプライマーを設定して、鎖置換反応を利用し、一定温度で反応させることを特徴とする。
【００１８】
反応は、サンプルとなる遺伝子、プライマー、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、基質等を同一の反応チューブに混合し、一定温度（６０℃〜６５℃付近）で保温することにより、遺伝子の増幅から検出までを１ステップの工程で行うことができる。増幅効率が高く、ＤＮＡを１時間程度で１０９〜１０１０倍に増幅することが可能である。その極めて高い特異性から、増幅産物の有無で目的とする標的遺伝子配列の有無を判定することができる。また、増幅副産物であるピロリン酸マグネシウム（白色沈殿物質）の白濁の有無によっても標的遺伝子配列の有無を判別できる。
【００１９】
本発明のイネ苗立枯細菌病菌に特異的なプライマーは、その特定領域を標的として、ループを形成する２種類の内部プライマーであるＦＩＰ（配列番号１）とＢＩＰ（配列番号２）と、２種類の外部プライマーであるＦ３（配列番号３）とＢ３（配列番号４）、そしてＤＮＡ合成の起点を増やすことが可能となるループプライマーであるＬＢ（配列番号５）、以上の５種類のＬＡＭＰプライマーを全種用いることでイネ苗立枯細菌病菌の特定遺伝子領域を増幅させることができる。このプライマーを用いたＬＡＭＰ反応を２０分〜２時間程度行い、遺伝子の増幅の有無、すなわち、イネ苗立枯細菌病菌の検出は、反応液の白濁具合により目視で確認することができる。
【００２０】
ＦＩＰ：５’−ＧＣＣＣＣＣＡＴＧＴＡＣＡＧＡＧＡＣＧＴＣＴＧＡＡＴＣＣＡＡＣＣＡＧＡＣＣＣＡＣＣ−３’（配列番号１）
ＢＩＰ：５’−ＡＧＧＧＧＧＴＣＧＴＣＧＧＴＴＣＧＡＴＣＧＣＡＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＡＡＧＣＣ−３’（配列番号２）
Ｆ３ ：５’−ＧＡＴＡＡＧＧＣＧＧＧＧＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号３）
Ｂ３ ：５’−ＣＧＣＣＡＡＴＡＡＧＧＡＡＡＣＣＴＣＧＧ−３’（配列番号４）
ＬＢ ：５’−ＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＴＣＴＴＣＡＡＴＡＡＡＧ−３’（配列番号５）
【００２１】
また、イネもみ枯細菌病菌に特異的なプライマーも同様に、その特定領域を標的として、ＬＡＭＰプライマーであるＦＩＰ（配列番号６）、ＢＩＰ（配列番号７）、Ｆ３（配列番号８）、Ｂ３（配列番号９）、ＬＢ（配列番号１０）を５種すべて用いることでイネもみ枯細菌病菌の特定遺伝子領域を増幅させることができる。このプライマーを用いたＬＡＭＰ反応を４０分〜２時間程度行い、遺伝子の増幅の有無、すなわち、イネもみ枯細菌病菌の検出は、反応液の白濁具合により目視で確認することができる。
【００２２】
ＦＩＰ：５’−ＡＴＣＧＡＡＣＣＧＡＣＧＡＣＣＣＣＣＴＧＴＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＧＣＡＴＡＧＣ−３’（配列番号６）
ＢＩＰ：５’−ＣＡＧＧＧＡＴＧＣＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＴＣＡＧＣＧＣＴＡＣＴＴＣＴＣＧＣＴＣＡＴＣ−３’（配列番号７）
Ｆ３ ：５’−ＧＧＡＡＣＡＣＣＴＧＧＧＴＡＧＴＣＴＣＴ−３’（配列番号８）
Ｂ３ ：５’−ＴＧＴＴＡＡＡＧＡＡＣＧＡＣＡＧＣＣＧＡ−３’（配列番号９）
ＬＢ ：５’−ＴＴＧＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧ−３’（配列番号１０）
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）本発明によれば、イネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌を短時間で検出ができる。ＬＡＭＰ法を用いるため、特別な機器を使用することなく、反応物の濁度を目視により判定することができる。
（２）本発明は、迅速で簡便にイネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌を検出することができる点で優れている。
（３）従来の検出法であるＰＣＲ法に比べて検出感度が高く、微量の細菌も検出することが可能となり、浸種時以降の細菌病防除要否判定にも利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【００２５】
以下の実施例では、イネ苗立枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰ反応液には、配列番号１〜５で示されるＬＡＭＰプライマーセットを用い、イネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰ反応液には、配列番号６〜１０で示されるＬＡＭＰプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により遺伝子を増幅し、反応液の濁度変化によって増幅を検出した。
【００２６】
ＬＡＭＰ反応液は、最終反応溶液２５μＬ中の各試薬濃度が、下記になるように調整した。
・２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．８）
・１０ ｍＭ ＫＣｌ
・１０ ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４
・ ８ ｍＭ ＭｇＳＯ４
・ ０．１ ％ Ｔｗｅｅｎ２０
・ １．４ｍＭ ｅａｃｈ ｄＮＴＰ
・ ０．８ Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ
・ ８ Ｕｎｉｔｓ Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ社製）
（プライマー）
・４０ｐＭ ＦＩＰ
・４０ｐＭ ＢＩＰ
・５ｐＭ Ｆ３
・５ｐＭ Ｂ３
・２０ｐＭ ＬＢ
テンプレート（菌液）１μｌ
【００２７】
ＬＡＭＰ反応条件については、６０℃で２時間保持して反応させ、その後、８０℃で５分間の酵素変性処理を行った。
【実施例１】
【００２８】
（２菌株を用いた解析）
イネ苗立枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰ反応液とイネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰ反応液を用いて、２菌株の検出を行った。使用菌株は、イネ苗立枯細菌病菌（ＭＡＦＦ３０１７２３）、イネもみ枯細菌病菌（ＭＡＦＦ１０６６６６）とし、それぞれの菌を滅菌蒸留水で懸濁した液をＬＡＭＰ反応の試料として用いた。
【００２９】
上記に記した菌液１μｌを加えた２５μｌ反応液を６０℃で反応させ、経時的に濁度を測定した。ネガティブコントロールとして蒸留水１μｌを使用した。濁度装置として栄研化学のリアルタイム濁度測定装置（ＲＴ−１６０Ｃ）を使用した。
【００３０】
図２に示す結果から、イネ苗立枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマーを用いた反応液では、イネ苗立枯細菌病菌のみで増幅反応が認められ、イネもみ枯細菌病菌とネガティブコントロールでは増幅反応が認められなかった。
【００３１】
また、図３に示す結果から、イネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマーを用いた反応液では、イネもみ枯細菌病菌のみで増幅反応が認められ、イネ苗立枯細菌病菌とネガティブコントロールでは増幅反応が認められなかった。
【実施例２】
【００３２】
（１５菌株を使用した特異性調査）
１５菌株（３属６種）を用いて実施例１と同様にＬＡＭＰ反応を行った。反応液の白濁の有無を目視により判定した。結果は表１に示ように、イネ苗立枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰ反応液はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｌａｎｔａｒｉｉ菌株のみに、イネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰ反応液はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ菌株のみで白濁がみられ、他の菌株では白濁が起こらず、特異的にそれぞれの菌を判定できた。
【００３３】
【表１】
【実施例３】
【００３４】
（ＰＣＲ法とＬＡＭＰ法による検出限界の比較）
（１）ＰＣＲ法による反応
ＰＣＲ法で使用するイネ苗立枯細菌病菌検出用ＰＣＲプライマー・イネもみ枯細菌病菌検出用ＰＣＲプライマーは、両者とも２菌株の１６Ｓ及び２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子間に存在するスペーサー領域の塩基配列からなるもので、フォワードプライマーは、それぞれ異なる遺伝子配列部分を、リバースプライマーは、共通配列部分を使用している。
【００３５】
ＰＣＲプライマーの塩基配列は、以下に示すとおりである。
ＰＣＲプライマー−１：５’−ＧＡＴＴＧＡＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＧＡＴＡＡＧＴＣ−３’
ＰＣＲプライマー−２：５’−ＴＧＴＣＴＧＡＣＡＣＧＧＡＡＣＡＣＣＴＧＧＧＴＡＧ−３’
ＰＣＲプライマー−３：５’−ＡＧＧＴＴＧＡＧＴＴＣＴＣＧＣＡＴＴＴＧＴＧＣＣＧ−３’
【００３６】
ＰＣＲプライマー−１は、イネ苗立枯細菌病菌の配列からなるフォワードプライマー、ＰＣＲプライマー−２は、イネもみ枯細菌病菌の配列からなるフォワードプライマー、そしてＰＣＲプライマー−３は、２菌株の共通配列からなるリバースプライマーである。
【００３７】
ＰＣＲ法に用いる反応液は、最終反応液２０μｌとし、以下に示す反応組成とした。
・１０×Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ社製） ２μｌ
・ｄＮＴＰｓ（ＴａＫａＲａ社製） １．６μｌ
・１０％スキムミルク ０．５μｌ
・Ｅｘ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製） ０．１μｌ
・５０μＭ ＰＣＲプライマー−１、−２、−３ 各０．２μｌ
・滅菌蒸留水 １４．２μｌ
・菌液 １μｌ
【００３８】
ＰＣＲ反応は、上記の反応液を最初に９４℃で２分間熱変性したのち、熱変性９４℃３０秒、アニーリング６０℃３０秒、ポリメラーゼ伸長反応７２℃４０秒を１サイクルとして計３０サイクル行ったのち、７２℃５分間伸長反応を行った。反応装置は、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒを使用し、反応終了後の増幅産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色したのち、紫外線を照射することで増幅産物を確認した。
【００３９】
（２）ＰＣＲ法とＬＡＭＰ法による検出限界の比較結果
イネ苗立枯細菌病菌（ＭＡＦＦ３０１７２３）を９．６×１０−２〜９．６×１０７ｃｆｕ／ｍｌの１０段階希釈、イネもみ枯細菌病菌（ＭＡＦＦ１０６６６６）を３．９×１０−２〜３．９×１０７ｃｆｕ／ｍｌの１０段階希釈した菌液を、それぞれＰＣＲ反応とＬＡＭＰ反応の試料として用いた。ネガティブコントロールは、滅菌蒸留水を使用した。ＬＡＭＰ法は、実施例１と同様にして行った。
【００４０】
その結果、イネ苗立枯細菌病菌の検出では、ＰＣＲ法では９．６×１０５ｃｆｕ／ｍｌまで増幅断片が確実に検出できたが、９．６×１０４ｃｆｕ／ｍｌでは薄いバンドとして観察された。これに対して、ＬＡＭＰ法では９．６×１０４ｃｆｕ／ｍｌまで反応液の濁度が上昇し菌を検出することができた（図４）。よって、同等の検出感度、あるいは１０倍程度ＰＣＲ法よりもＬＡＭＰ法の方が検出感度が高かった。
【００４１】
一方、イネもみ枯細菌病菌の検出では、ＰＣＲ法では３．９×１０５ｃｆｕ／ｍｌまで増幅断片が検出できた。ＬＡＭＰ法では３．９×１０４ｃｆｕ／ｍｌまで反応液の濁度が上昇し、菌を検出することができた（図５）。よって、ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲ法よりも１０倍程度検出感度が高いことが明らかとなった。
【実施例４】
【００４２】
（浸種液中の菌検出結果と発病の関連（イネ苗立枯細菌病菌））
イネ苗立枯細菌病菌の浸種液中の増殖実態をＬＡＭＰ法により調査し、催芽時以降の防除要否を判断できるか否かを検討した。
【００４３】
・汚染種子作製法：（１）１／２アンチホルミンで一時間表面殺菌し、イネ苗立枯細菌病菌を１．９×１０２〜１．９×１０8ｃｆｕ／ｍｌの７濃度段階でコシヒカリ種子に減圧接種して汚染種子を作製した。また、（２）３．５×１０６ｃｆｕ／ｍｌで減圧接種したコシヒカリ種子を、混入割合０．０２５％（１粒）、０．２５％（１０粒）、１％（１ｇ）、１０％（１０ｇ）、１００％（１００ｇ）の５段階で健全種子に混和、１００ｇの汚染種子を作製した。
【００４４】
・浸種液中の菌検出法：浸種前の試験種子を６０分間振とうし、被検液を採取、更に、浸種３日後、浸種５日後及び催芽直後に採種した浸種液を被検液とした。また、それぞれ採種した浸種液５０ｍｌを５μｍフィルターで夾雑物を除去後、０．２２μｍフィルターで集菌、集菌フィルターを１／５ＡＤＦＴ液体培地（２０ｍｌ）に混入し、振とう培養（３０℃，２４ｈ）後に検出した（表２〜５にはＭＦと示す）。
【００４５】
検出は、ＰＣＲ法（実施例３と同様の方法）及びＬＡＭＰ法（実施例１と同様の方法）により菌検出した。
・菌密度調査：被検液の菌密度を調べるために、選択培地（ＡＤＦＴ培地）を用い、段階希釈平板法により菌密度調査した。
【００４６】
・浸種・育苗管理：汚染種子を水道水中で浸種（１５℃，６日間、浴比１：２）し、催芽（３０℃，２４ｈ、浴比１：２）させた。イチゴパック（１５０ｃｍ２，５×１０ｃｍ）に１２．５ｇ／パックで播種後、３０℃定温（照明：１４Ｌ−１０Ｄ）で１０日間育苗し、発病程度を観察した。
【００４７】
・発病調査：各イチゴパックから２００苗ランダムに抽出し、発病を調査した。無発病は、全苗調査した。発病度の算出：発病度＝１００×（５×枯死苗数＋３×葉の黄白化等発病苗数）／５×調査苗数
【００４８】
上記の方法で調査した結果、イネ苗立枯細菌病の発病は、接種濃度が１．９×１０４以上又は汚染もみ（３．５×１０６ｃｆｕ／ｍｌ）の混入割合が０．２５％以上で認められた。浸種水を直接ＬＡＭＰ反応に用いるだけでは、発病限界の菌濃度まで検出することは不可能であった。しかし、メンブランフィルターで集菌して増殖させた被検液をＬＡＭＰ反応に用いることで、検出可能であった。
【００４９】
よって、本病の発病限界の菌濃度をイネ苗立枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰ反応液により集菌・増殖させた浸種液から検出することが可能であった（表２、表３）。
【００５０】
【表２】
【００５１】
【表３】
【実施例５】
【００５２】
（浸種液中の菌検出結果と発病の関連（イネもみ枯細菌病菌））
イネもみ枯細菌病菌の浸種液中の増殖実態をＬＡＭＰ法により調査し、催芽時以降の防除要否を判断できるか否かを検討した。
【００５３】
実施例４で示した方法と同様であるが、イネもみ枯細菌病菌を２．９×１０３〜２．９×１０8ｃｆｕ／ｍｌの６濃度段階でコシヒカリ種子に減圧接種した。また、５．９×１０７ｃｆｕ／ｍｌの菌液をコシヒカリに減圧接種した汚染もみを５段階の混入割合にして汚染種子を作製した。また、集菌後の増殖用培地には１／５ＣＣＮＴ液体培地を、菌密度調査には選択培地としてＳ−ＰＧ培地を用いた。
【００５４】
調査した結果、イネもみ枯細菌病の発病は、接種濃度が２．９×１０６以上又は汚染もみ（５．９×１０７ｃｆｕ／ｍｌ）の混入割合が１％以上で認められ、浸種５日後までの浸種液では、発病する菌濃度である浸種水を用いたＬＡＭＰ反応ではすべて菌が検出できた。よって、本病の発病限界の菌濃度をイネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰ反応液により浸種液から直接検出することが可能であった（表４、表５）。
【００５５】
【表４】
【００５６】
【表５】
【産業上の利用可能性】
【００５７】
以上詳述したように、本発明は、ＬＡＭＰ法を用いたイネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌の検出法に係るものであり、本発明により、イネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌を短時間で検出ができる。ＬＡＭＰ法を用いるため、特別な機器を使用することなく、反応物の濁度を目視により判定することができる。本発明は、迅速で簡便にイネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌を検出することができる点で優れている。従来の検出法であるＰＣＲ法に比べて検出感度が高く、微量の細菌も検出することが可能となり、浸種時以降の細菌病防除要否判定にも利用できる。本発明は、育苗時において、イネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌を特異的に検出できる本細菌病の発病有無を判定できる判定技術を提供するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】イネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌の１６Ｓ及び２３リボソームＲＮＡ遺伝子間の塩基配列を示す。
【図２】イネ苗立枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰ反応液の濁度と経時的変化を示す。
【図３】イネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰ反応液の濁度と経時的変化を示す。
【図４】ＰＣＲ反応ＬＡＭＰ反応によるイネ苗立枯細菌病菌の検出限界の比較を示す。
【図５】ＰＣＲ反応ＬＡＭＰ反応によるイネもみ枯細菌病菌の検出限界の比較を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＡＭＰ法（環状型等温増幅反応）を用いたイネ苗立枯細菌病菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｌａｎｔａｒｉｉ）及びイネもみ枯細菌病菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ）を特異的に検出できることができる方法、この方法に用いるプライマーセット、また、この方法及びプライマーセットを用いた育苗時の細菌病発病判断方法に関するものである。本発明は、育苗時において、イネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌を特異的に検出できる本細菌病の発病有無を判定できる判定技術を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
イネ苗立枯細菌病菌やイネもみ枯細菌病菌は、イネの育苗期に発生する細菌病の病原細菌の一種で、育苗時に苗を枯死させる被害を出す。現在行われている防除方法は、主にイネもみを農薬に浸漬する種子消毒法であり、育苗時の被害を予防的に防止している。
【０００３】
このような種子消毒は必須の現状であり、また、農薬を種子消毒に使用した場合、排出される農薬廃液処理も必要である。このように、育苗前に発病の有無を調査することができない現状では、防除は必須であるので、コスト面・作業時間の面からもイネ生産者には負担となっている。育苗前に防除要否を判断できる技術が求められている。
【０００４】
従来、イネ苗立枯細菌病やイネもみ枯細菌病の診断・判定法として、選択培地を用いてこれらの菌の有無を調査することがある。しかしながら、この方法は、判定までに長時間を要し、判定には熟練性を要する。そこで、生化学的性状から判断するものではなく、遺伝子レベルでの判別方法が着目されている。
【０００５】
現在報告されている遺伝子レベルでの判定方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）を利用したイネ苗立枯細菌病菌検出法及びイネもみ枯細菌病菌検出法が報告されている（非特許文献１参照）。
【０００６】
しかしながら、このＰＣＲ法を用いた細菌の検出法は、反応を行うために遺伝子増幅装置を必要とし、最終的な判定操作は電気泳動法と呼ばれる特殊な手法や紫外線を照射する装置などが必要で、開始から判定までに４〜５時間要する。
【０００７】
また、このＰＣＲ法を用いてイネ浸種時の細菌有無を調査し、防除要否を判断しようとした場合、イネもみ枯細菌病菌は、浸種液を培養し、細菌を増殖させれば判断が可能である。しかし、イネ苗立枯細菌病菌は、浸種液を培養・細菌増殖させたとしてもＰＣＲ法による菌の検出限界と発病する最低菌密度レベルがほぼ同じレベルとなり、精度不足で判断は不可能であった。そこで、ＰＣＲ法よりも迅速で簡便、そして検出感度が高い検出法が求められていた。
【０００８】
最近では、ＰＣＲ法に代わる遺伝子増幅法として環状型等温増幅反応（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＬＡＭＰ）による手法が栄研化学株式会社より開発された。この手法は、特殊な大型機器を用いる必要はなく、また反応時間も短く簡便であり、迅速に結果を得られると考えられる。しかしながら、イネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌に特異的に反応するＬＡＭＰプライマーは、未だ発見されていない。
【０００９】
【非特許文献１】日本植物病理学会報、６３巻、ｐｐ．４５５−４６２（１９９７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このような状況の中で、本発明者は、上記従来技術に鑑みて、イネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌を特異的に検出できる新しい判定技術を開発することを目標として鋭意研究を重ねた結果、イネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌に特異的に反応するＬＡＭＰプライマーを設計、完成させ、そして、これらＬＡＭＰプライマーを用いて、イネもみ浸種液中の細菌数と発病度との関係を調べることで、浸種時以降の細菌病防除要否を判断できることを見出し、本発明を完成させた。本発明は、イネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌に特異的に反応するＬＡＭＰプライマー、該プライマーを用いてイネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌を特異的に検出できる方法、該方法を用いた本細菌病の発病有無の判定方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）配列番号１〜５で示される５種類のプライマー全種を用いるプライマーセットからなり、イネ苗立枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングし、環状型等温増幅反応（ＬＡＭＰ法）によって該特定遺伝子を増幅可能であることを特徴とするイネ苗立枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマー。
（２）前記（１）に記載の５種類のプライマー全種をイネ苗立枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングさせ、更に、ＬＡＭＰ法によって特定領域遺伝子を増幅させ、この増幅による反応系の変化を光学的検査により確認することからなるイネ苗立枯細菌病菌の検出方法。
（３）光学的検査による確認が、反応液の濁度を目視判定する確認である、前記（２）に記載のイネ苗立枯細菌病菌の検出方法。
（４）前記（２）又は（３）に記載の方法で、イネもみ浸種液を集菌増殖処理した培養液中のイネ苗立枯細菌病菌を検出することにより、本細菌病の発病有無を判定する方法。
（５）配列番号６〜１０で示される５種類のプライマー全種を用いるプライマーセットからなり、イネもみ枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングし、ＬＡＭＰ法によって該特定遺伝子を増幅可能であることを特徴とするイネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマー。
（６）前記（５）に記載の５種類のプライマー全種をイネもみ枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングさせ、更に、ＬＡＭＰ法によって特定領域遺伝子を増幅させ、この増幅による反応系の変化を光学的検査により確認することからなるイネもみ枯細菌病菌の検出方法。
（７）光学的検査による確認が、反応液の濁度を目視判定する確認である、前記（６）に記載のイネもみ枯細菌病菌の検出方法。
（８）前記（６）又は（７）に記載の方法で、イネもみ浸種液中のイネもみ枯細菌病菌を検出することにより、本細菌病の発病有無を判定する方法。
【００１２】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明者は、上記した新規プライマーを得るという課題を解決するために、この発明では、配列番号１〜５に示される塩基配列５種のプライマーを全種用いるプライマーセットからなり、イネ苗立枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングし、ＬＡＭＰ法によって増幅可能なイネ苗立枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマー、そして、配列番号６〜１０に示される塩基配列５種のプライマーを全種用いるプライマーセットからなり、イネもみ枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングし、ＬＡＭＰ法によって増幅可能なイネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマーとした。
【００１３】
上記したイネ苗立枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマー及びイネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマーは、この２菌株の１６Ｓ及び２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子間に存在するスペーサー領域の塩基配列間に異なる配列が存在していることを利用しており、それぞれの細菌のスペーサー領域に特異的にアニーリングする（図１）。
【００１４】
これらの５種類のプライマーセットは、６０℃付近においてアニーリングと同時にＤＮＡ鎖の合成も起こすものである。それぞれのプライマーからなるＤＮＡ合成は、他のプライマーから合成したＤＮＡ鎖を剥がしながら進行するため、等温反応にて遺伝子の増幅が起こる。このようなＤＮＡ増幅反応が進むと、副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響で反応液が白濁するため、増幅の有無を目視により判定できる。
【００１５】
完成させたＬＡＭＰプライマーを用いて、イネ育苗時の細菌病に対する防除要否を判断する場合、イネ苗立枯細菌病菌は、浸種液をメンブレンフィルターで集菌して、フィルターを液体の選択培地に混入させて培養し、増殖させ、イネ苗立枯細菌病菌検出ＬＡＭＰプライマーを用いてＬＡＭＰ反応を行うことにより、発病限界の菌濃度まで検出することが可能となった。また、イネもみ枯細菌病菌については、浸種液を直接用いて、イネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマーを用いたＬＡＭＰ反応に使用することで、発病限界の菌濃度まで検出することが可能となった。
【００１６】
本発明において使用される試料としては、イネ苗立枯細菌病菌やイネもみ枯細菌病菌の培養液や寒天培地上に増殖させた菌体コロニーを蒸留水に懸濁した菌液を使用する。また、イネのもみ、もみ浸種時の浸種液、葉、茎などを試料として用いる場合、もみや植物体は、水や緩衝液に浸漬させるか、水や緩衝液中に浸したのち磨砕させることにより液体中に増幅に用いられる菌体・核酸を遊離させる。また、もみ浸種時における浸種液を用いる場合には、そのままかあるいは５μｍフィルターなどで夾雑物を除去して精製した菌液、また、夾雑物をフィルターで除去した液中の菌を０．２２μｍフィルターで集菌し、そのフィルターを１／５濃度の液体選択培地に混入させて培養し、増殖させた培養液を試料とする。
【００１７】
このように得られたイネ苗立枯細菌病菌やイネもみ枯細菌病菌が遊離した菌液からそれぞれの核酸を増幅するためには、ＬＡＭＰ法を行い特定遺伝子領域を増幅させる。このＬＡＭＰ法は、栄研化学株式会社が開発した核酸増幅法である。ＬＡＭＰ法は、標的遺伝子の６箇所の領域に対して４種類のプライマーを設定して、鎖置換反応を利用し、一定温度で反応させることを特徴とする。
【００１８】
反応は、サンプルとなる遺伝子、プライマー、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、基質等を同一の反応チューブに混合し、一定温度（６０℃〜６５℃付近）で保温することにより、遺伝子の増幅から検出までを１ステップの工程で行うことができる。増幅効率が高く、ＤＮＡを１時間程度で１０９〜１０１０倍に増幅することが可能である。その極めて高い特異性から、増幅産物の有無で目的とする標的遺伝子配列の有無を判定することができる。また、増幅副産物であるピロリン酸マグネシウム（白色沈殿物質）の白濁の有無によっても標的遺伝子配列の有無を判別できる。
【００１９】
本発明のイネ苗立枯細菌病菌に特異的なプライマーは、その特定領域を標的として、ループを形成する２種類の内部プライマーであるＦＩＰ（配列番号１）とＢＩＰ（配列番号２）と、２種類の外部プライマーであるＦ３（配列番号３）とＢ３（配列番号４）、そしてＤＮＡ合成の起点を増やすことが可能となるループプライマーであるＬＢ（配列番号５）、以上の５種類のＬＡＭＰプライマーを全種用いることでイネ苗立枯細菌病菌の特定遺伝子領域を増幅させることができる。このプライマーを用いたＬＡＭＰ反応を２０分〜２時間程度行い、遺伝子の増幅の有無、すなわち、イネ苗立枯細菌病菌の検出は、反応液の白濁具合により目視で確認することができる。
【００２０】
ＦＩＰ：５’−ＧＣＣＣＣＣＡＴＧＴＡＣＡＧＡＧＡＣＧＴＣＴＧＡＡＴＣＣＡＡＣＣＡＧＡＣＣＣＡＣＣ−３’（配列番号１）
ＢＩＰ：５’−ＡＧＧＧＧＧＴＣＧＴＣＧＧＴＴＣＧＡＴＣＧＣＡＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＡＡＧＣＣ−３’（配列番号２）
Ｆ３ ：５’−ＧＡＴＡＡＧＧＣＧＧＧＧＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号３）
Ｂ３ ：５’−ＣＧＣＣＡＡＴＡＡＧＧＡＡＡＣＣＴＣＧＧ−３’（配列番号４）
ＬＢ ：５’−ＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＴＣＴＴＣＡＡＴＡＡＡＧ−３’（配列番号５）
【００２１】
また、イネもみ枯細菌病菌に特異的なプライマーも同様に、その特定領域を標的として、ＬＡＭＰプライマーであるＦＩＰ（配列番号６）、ＢＩＰ（配列番号７）、Ｆ３（配列番号８）、Ｂ３（配列番号９）、ＬＢ（配列番号１０）を５種すべて用いることでイネもみ枯細菌病菌の特定遺伝子領域を増幅させることができる。このプライマーを用いたＬＡＭＰ反応を４０分〜２時間程度行い、遺伝子の増幅の有無、すなわち、イネもみ枯細菌病菌の検出は、反応液の白濁具合により目視で確認することができる。
【００２２】
ＦＩＰ：５’−ＡＴＣＧＡＡＣＣＧＡＣＧＡＣＣＣＣＣＴＧＴＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＧＣＡＴＡＧＣ−３’（配列番号６）
ＢＩＰ：５’−ＣＡＧＧＧＡＴＧＣＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＴＣＡＧＣＧＣＴＡＣＴＴＣＴＣＧＣＴＣＡＴＣ−３’（配列番号７）
Ｆ３ ：５’−ＧＧＡＡＣＡＣＣＴＧＧＧＴＡＧＴＣＴＣＴ−３’（配列番号８）
Ｂ３ ：５’−ＴＧＴＴＡＡＡＧＡＡＣＧＡＣＡＧＣＣＧＡ−３’（配列番号９）
ＬＢ ：５’−ＴＴＧＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧ−３’（配列番号１０）
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）本発明によれば、イネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌を短時間で検出ができる。ＬＡＭＰ法を用いるため、特別な機器を使用することなく、反応物の濁度を目視により判定することができる。
（２）本発明は、迅速で簡便にイネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌を検出することができる点で優れている。
（３）従来の検出法であるＰＣＲ法に比べて検出感度が高く、微量の細菌も検出することが可能となり、浸種時以降の細菌病防除要否判定にも利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【００２５】
以下の実施例では、イネ苗立枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰ反応液には、配列番号１〜５で示されるＬＡＭＰプライマーセットを用い、イネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰ反応液には、配列番号６〜１０で示されるＬＡＭＰプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により遺伝子を増幅し、反応液の濁度変化によって増幅を検出した。
【００２６】
ＬＡＭＰ反応液は、最終反応溶液２５μＬ中の各試薬濃度が、下記になるように調整した。
・２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．８）
・１０ ｍＭ ＫＣｌ
・１０ ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４
・ ８ ｍＭ ＭｇＳＯ４
・ ０．１ ％ Ｔｗｅｅｎ２０
・ １．４ｍＭ ｅａｃｈ ｄＮＴＰ
・ ０．８ Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ
・ ８ Ｕｎｉｔｓ Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ社製）
（プライマー）
・４０ｐＭ ＦＩＰ
・４０ｐＭ ＢＩＰ
・５ｐＭ Ｆ３
・５ｐＭ Ｂ３
・２０ｐＭ ＬＢ
テンプレート（菌液）１μｌ
【００２７】
ＬＡＭＰ反応条件については、６０℃で２時間保持して反応させ、その後、８０℃で５分間の酵素変性処理を行った。
【実施例１】
【００２８】
（２菌株を用いた解析）
イネ苗立枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰ反応液とイネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰ反応液を用いて、２菌株の検出を行った。使用菌株は、イネ苗立枯細菌病菌（ＭＡＦＦ３０１７２３）、イネもみ枯細菌病菌（ＭＡＦＦ１０６６６６）とし、それぞれの菌を滅菌蒸留水で懸濁した液をＬＡＭＰ反応の試料として用いた。
【００２９】
上記に記した菌液１μｌを加えた２５μｌ反応液を６０℃で反応させ、経時的に濁度を測定した。ネガティブコントロールとして蒸留水１μｌを使用した。濁度装置として栄研化学のリアルタイム濁度測定装置（ＲＴ−１６０Ｃ）を使用した。
【００３０】
図２に示す結果から、イネ苗立枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマーを用いた反応液では、イネ苗立枯細菌病菌のみで増幅反応が認められ、イネもみ枯細菌病菌とネガティブコントロールでは増幅反応が認められなかった。
【００３１】
また、図３に示す結果から、イネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマーを用いた反応液では、イネもみ枯細菌病菌のみで増幅反応が認められ、イネ苗立枯細菌病菌とネガティブコントロールでは増幅反応が認められなかった。
【実施例２】
【００３２】
（１５菌株を使用した特異性調査）
１５菌株（３属６種）を用いて実施例１と同様にＬＡＭＰ反応を行った。反応液の白濁の有無を目視により判定した。結果は表１に示ように、イネ苗立枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰ反応液はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｌａｎｔａｒｉｉ菌株のみに、イネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰ反応液はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ菌株のみで白濁がみられ、他の菌株では白濁が起こらず、特異的にそれぞれの菌を判定できた。
【００３３】
【表１】
【実施例３】
【００３４】
（ＰＣＲ法とＬＡＭＰ法による検出限界の比較）
（１）ＰＣＲ法による反応
ＰＣＲ法で使用するイネ苗立枯細菌病菌検出用ＰＣＲプライマー・イネもみ枯細菌病菌検出用ＰＣＲプライマーは、両者とも２菌株の１６Ｓ及び２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子間に存在するスペーサー領域の塩基配列からなるもので、フォワードプライマーは、それぞれ異なる遺伝子配列部分を、リバースプライマーは、共通配列部分を使用している。
【００３５】
ＰＣＲプライマーの塩基配列は、以下に示すとおりである。
ＰＣＲプライマー−１：５’−ＧＡＴＴＧＡＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＧＡＴＡＡＧＴＣ−３’
ＰＣＲプライマー−２：５’−ＴＧＴＣＴＧＡＣＡＣＧＧＡＡＣＡＣＣＴＧＧＧＴＡＧ−３’
ＰＣＲプライマー−３：５’−ＡＧＧＴＴＧＡＧＴＴＣＴＣＧＣＡＴＴＴＧＴＧＣＣＧ−３’
【００３６】
ＰＣＲプライマー−１は、イネ苗立枯細菌病菌の配列からなるフォワードプライマー、ＰＣＲプライマー−２は、イネもみ枯細菌病菌の配列からなるフォワードプライマー、そしてＰＣＲプライマー−３は、２菌株の共通配列からなるリバースプライマーである。
【００３７】
ＰＣＲ法に用いる反応液は、最終反応液２０μｌとし、以下に示す反応組成とした。
・１０×Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ社製） ２μｌ
・ｄＮＴＰｓ（ＴａＫａＲａ社製） １．６μｌ
・１０％スキムミルク ０．５μｌ
・Ｅｘ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製） ０．１μｌ
・５０μＭ ＰＣＲプライマー−１、−２、−３ 各０．２μｌ
・滅菌蒸留水 １４．２μｌ
・菌液 １μｌ
【００３８】
ＰＣＲ反応は、上記の反応液を最初に９４℃で２分間熱変性したのち、熱変性９４℃３０秒、アニーリング６０℃３０秒、ポリメラーゼ伸長反応７２℃４０秒を１サイクルとして計３０サイクル行ったのち、７２℃５分間伸長反応を行った。反応装置は、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒを使用し、反応終了後の増幅産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色したのち、紫外線を照射することで増幅産物を確認した。
【００３９】
（２）ＰＣＲ法とＬＡＭＰ法による検出限界の比較結果
イネ苗立枯細菌病菌（ＭＡＦＦ３０１７２３）を９．６×１０−２〜９．６×１０７ｃｆｕ／ｍｌの１０段階希釈、イネもみ枯細菌病菌（ＭＡＦＦ１０６６６６）を３．９×１０−２〜３．９×１０７ｃｆｕ／ｍｌの１０段階希釈した菌液を、それぞれＰＣＲ反応とＬＡＭＰ反応の試料として用いた。ネガティブコントロールは、滅菌蒸留水を使用した。ＬＡＭＰ法は、実施例１と同様にして行った。
【００４０】
その結果、イネ苗立枯細菌病菌の検出では、ＰＣＲ法では９．６×１０５ｃｆｕ／ｍｌまで増幅断片が確実に検出できたが、９．６×１０４ｃｆｕ／ｍｌでは薄いバンドとして観察された。これに対して、ＬＡＭＰ法では９．６×１０４ｃｆｕ／ｍｌまで反応液の濁度が上昇し菌を検出することができた（図４）。よって、同等の検出感度、あるいは１０倍程度ＰＣＲ法よりもＬＡＭＰ法の方が検出感度が高かった。
【００４１】
一方、イネもみ枯細菌病菌の検出では、ＰＣＲ法では３．９×１０５ｃｆｕ／ｍｌまで増幅断片が検出できた。ＬＡＭＰ法では３．９×１０４ｃｆｕ／ｍｌまで反応液の濁度が上昇し、菌を検出することができた（図５）。よって、ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲ法よりも１０倍程度検出感度が高いことが明らかとなった。
【実施例４】
【００４２】
（浸種液中の菌検出結果と発病の関連（イネ苗立枯細菌病菌））
イネ苗立枯細菌病菌の浸種液中の増殖実態をＬＡＭＰ法により調査し、催芽時以降の防除要否を判断できるか否かを検討した。
【００４３】
・汚染種子作製法：（１）１／２アンチホルミンで一時間表面殺菌し、イネ苗立枯細菌病菌を１．９×１０２〜１．９×１０8ｃｆｕ／ｍｌの７濃度段階でコシヒカリ種子に減圧接種して汚染種子を作製した。また、（２）３．５×１０６ｃｆｕ／ｍｌで減圧接種したコシヒカリ種子を、混入割合０．０２５％（１粒）、０．２５％（１０粒）、１％（１ｇ）、１０％（１０ｇ）、１００％（１００ｇ）の５段階で健全種子に混和、１００ｇの汚染種子を作製した。
【００４４】
・浸種液中の菌検出法：浸種前の試験種子を６０分間振とうし、被検液を採取、更に、浸種３日後、浸種５日後及び催芽直後に採種した浸種液を被検液とした。また、それぞれ採種した浸種液５０ｍｌを５μｍフィルターで夾雑物を除去後、０．２２μｍフィルターで集菌、集菌フィルターを１／５ＡＤＦＴ液体培地（２０ｍｌ）に混入し、振とう培養（３０℃，２４ｈ）後に検出した（表２〜５にはＭＦと示す）。
【００４５】
検出は、ＰＣＲ法（実施例３と同様の方法）及びＬＡＭＰ法（実施例１と同様の方法）により菌検出した。
・菌密度調査：被検液の菌密度を調べるために、選択培地（ＡＤＦＴ培地）を用い、段階希釈平板法により菌密度調査した。
【００４６】
・浸種・育苗管理：汚染種子を水道水中で浸種（１５℃，６日間、浴比１：２）し、催芽（３０℃，２４ｈ、浴比１：２）させた。イチゴパック（１５０ｃｍ２，５×１０ｃｍ）に１２．５ｇ／パックで播種後、３０℃定温（照明：１４Ｌ−１０Ｄ）で１０日間育苗し、発病程度を観察した。
【００４７】
・発病調査：各イチゴパックから２００苗ランダムに抽出し、発病を調査した。無発病は、全苗調査した。発病度の算出：発病度＝１００×（５×枯死苗数＋３×葉の黄白化等発病苗数）／５×調査苗数
【００４８】
上記の方法で調査した結果、イネ苗立枯細菌病の発病は、接種濃度が１．９×１０４以上又は汚染もみ（３．５×１０６ｃｆｕ／ｍｌ）の混入割合が０．２５％以上で認められた。浸種水を直接ＬＡＭＰ反応に用いるだけでは、発病限界の菌濃度まで検出することは不可能であった。しかし、メンブランフィルターで集菌して増殖させた被検液をＬＡＭＰ反応に用いることで、検出可能であった。
【００４９】
よって、本病の発病限界の菌濃度をイネ苗立枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰ反応液により集菌・増殖させた浸種液から検出することが可能であった（表２、表３）。
【００５０】
【表２】
【００５１】
【表３】
【実施例５】
【００５２】
（浸種液中の菌検出結果と発病の関連（イネもみ枯細菌病菌））
イネもみ枯細菌病菌の浸種液中の増殖実態をＬＡＭＰ法により調査し、催芽時以降の防除要否を判断できるか否かを検討した。
【００５３】
実施例４で示した方法と同様であるが、イネもみ枯細菌病菌を２．９×１０３〜２．９×１０8ｃｆｕ／ｍｌの６濃度段階でコシヒカリ種子に減圧接種した。また、５．９×１０７ｃｆｕ／ｍｌの菌液をコシヒカリに減圧接種した汚染もみを５段階の混入割合にして汚染種子を作製した。また、集菌後の増殖用培地には１／５ＣＣＮＴ液体培地を、菌密度調査には選択培地としてＳ−ＰＧ培地を用いた。
【００５４】
調査した結果、イネもみ枯細菌病の発病は、接種濃度が２．９×１０６以上又は汚染もみ（５．９×１０７ｃｆｕ／ｍｌ）の混入割合が１％以上で認められ、浸種５日後までの浸種液では、発病する菌濃度である浸種水を用いたＬＡＭＰ反応ではすべて菌が検出できた。よって、本病の発病限界の菌濃度をイネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰ反応液により浸種液から直接検出することが可能であった（表４、表５）。
【００５５】
【表４】
【００５６】
【表５】
【産業上の利用可能性】
【００５７】
以上詳述したように、本発明は、ＬＡＭＰ法を用いたイネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌の検出法に係るものであり、本発明により、イネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌を短時間で検出ができる。ＬＡＭＰ法を用いるため、特別な機器を使用することなく、反応物の濁度を目視により判定することができる。本発明は、迅速で簡便にイネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌を検出することができる点で優れている。従来の検出法であるＰＣＲ法に比べて検出感度が高く、微量の細菌も検出することが可能となり、浸種時以降の細菌病防除要否判定にも利用できる。本発明は、育苗時において、イネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌を特異的に検出できる本細菌病の発病有無を判定できる判定技術を提供するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】イネ苗立枯細菌病菌及びイネもみ枯細菌病菌の１６Ｓ及び２３リボソームＲＮＡ遺伝子間の塩基配列を示す。
【図２】イネ苗立枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰ反応液の濁度と経時的変化を示す。
【図３】イネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰ反応液の濁度と経時的変化を示す。
【図４】ＰＣＲ反応ＬＡＭＰ反応によるイネ苗立枯細菌病菌の検出限界の比較を示す。
【図５】ＰＣＲ反応ＬＡＭＰ反応によるイネもみ枯細菌病菌の検出限界の比較を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜５で示される５種類のプライマー全種を用いるプライマーセットからなり、イネ苗立枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングし、環状型等温増幅反応（ＬＡＭＰ法）によって該特定遺伝子を増幅可能であることを特徴とするイネ苗立枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマー。
【請求項２】
請求項１に記載の５種類のプライマー全種をイネ苗立枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングさせ、更に、ＬＡＭＰ法によって特定領域遺伝子を増幅させ、この増幅による反応系の変化を光学的検査により確認することからなるイネ苗立枯細菌病菌の検出方法。
【請求項３】
光学的検査による確認が、反応液の濁度を目視判定する確認である、請求項２に記載のイネ苗立枯細菌病菌の検出方法。
【請求項４】
請求項２又は請求項３に記載の方法で、イネもみ浸種液を集菌増殖処理した培養液中のイネ苗立枯細菌病菌を検出することにより、本細菌病の発病有無を判定する方法。
【請求項５】
配列番号６〜１０で示される５種類のプライマー全種を用いるプライマーセットからなり、イネもみ枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングし、ＬＡＭＰ法によって該特定遺伝子を増幅可能であることを特徴とするイネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマー。
【請求項６】
請求項５に記載の５種類のプライマー全種をイネもみ枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングさせ、更に、ＬＡＭＰ法によって特定領域遺伝子を増幅させ、この増幅による反応系の変化を光学的検査により確認することからなるイネもみ枯細菌病菌の検出方法。
【請求項７】
光学的検査による確認が、反応液の濁度を目視判定する確認である、請求項６に記載のイネもみ枯細菌病菌の検出方法。
【請求項８】
請求項６又は請求項７に記載の方法で、イネもみ浸種液中のイネもみ枯細菌病菌を検出することにより、本細菌病の発病有無を判定する方法。
【請求項１】
配列番号１〜５で示される５種類のプライマー全種を用いるプライマーセットからなり、イネ苗立枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングし、環状型等温増幅反応（ＬＡＭＰ法）によって該特定遺伝子を増幅可能であることを特徴とするイネ苗立枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマー。
【請求項２】
請求項１に記載の５種類のプライマー全種をイネ苗立枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングさせ、更に、ＬＡＭＰ法によって特定領域遺伝子を増幅させ、この増幅による反応系の変化を光学的検査により確認することからなるイネ苗立枯細菌病菌の検出方法。
【請求項３】
光学的検査による確認が、反応液の濁度を目視判定する確認である、請求項２に記載のイネ苗立枯細菌病菌の検出方法。
【請求項４】
請求項２又は請求項３に記載の方法で、イネもみ浸種液を集菌増殖処理した培養液中のイネ苗立枯細菌病菌を検出することにより、本細菌病の発病有無を判定する方法。
【請求項５】
配列番号６〜１０で示される５種類のプライマー全種を用いるプライマーセットからなり、イネもみ枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングし、ＬＡＭＰ法によって該特定遺伝子を増幅可能であることを特徴とするイネもみ枯細菌病菌検出用ＬＡＭＰプライマー。
【請求項６】
請求項５に記載の５種類のプライマー全種をイネもみ枯細菌病菌の特定遺伝子領域にアニーリングさせ、更に、ＬＡＭＰ法によって特定領域遺伝子を増幅させ、この増幅による反応系の変化を光学的検査により確認することからなるイネもみ枯細菌病菌の検出方法。
【請求項７】
光学的検査による確認が、反応液の濁度を目視判定する確認である、請求項６に記載のイネもみ枯細菌病菌の検出方法。
【請求項８】
請求項６又は請求項７に記載の方法で、イネもみ浸種液中のイネもみ枯細菌病菌を検出することにより、本細菌病の発病有無を判定する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−２２０２２８（Ｐ２００８−２２０２２８Ａ）
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−６１１３１（Ｐ２００７−６１１３１）
【出願日】平成１９年３月１０日（２００７．３．１０）
【出願人】（５９１０４０２３６）石川県 (70)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１０日（２００７．３．１０）
【出願人】（５９１０４０２３６）石川県 (70)
【Ｆターム（参考）】
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