ＭＡＧＥファミリーからの腫瘍関連抗原及びそれらをコードする核酸配列、融合タンパク質の及びワクチン接種のための組成物の調製のための使用
【課題】本発明の抗原は、所定範囲の腫瘍の治療のためのワクチンを供するよう調剤することができる。ＭＡＧＥタンパク質を精製するための新規な方法も供する。
【解決手段】本発明は、ＭＡＧＥファミリーからの新規タンパク質に、及びそれらの生産に、特に免疫学的融合パートナー、例えばリポプロテインＤに融合したＭＡＧＥタンパク質に関する。
【解決手段】本発明は、ＭＡＧＥファミリーからの新規タンパク質に、及びそれらの生産に、特に免疫学的融合パートナー、例えばリポプロテインＤに融合したＭＡＧＥタンパク質に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌ワクチン治療に利用できる腫瘍関連抗原を含むタンパク質誘導体に関する。特に、本発明の誘導体は、Ｔヘルパーエピトープを供する免疫学的融合パートナー、例えばヘモフィルス・インフルエンゼ（Haempophilus influenzae ）ＢからのプロテインＤの脂質化型に連結したＭＡＧＥ遺伝子のファミリー（例えばＭＡＧＥ−３，ＭＡＧＥ−１）によりコードされた抗原を含む融合タンパク質；抗原のジスルフィド架橋が還元されて生じたチオールがブロッキングされている化学的に改変されたＭＡＧＥタンパク質、及びアフィニティータグが供され及び／又はジスルフィド架橋形成を防ぐよう遺伝子改変された遺伝子的に改変されたＭＡＧＥタンパク質を含む。ＭＡＧＥタンパク質を精製するため及び所定範囲の癌、例えば黒色腫、乳癌、膀胱癌、肺癌、ＮＳＣＬＣ、頭部の癌及び扁平上皮癌、結腸癌及び食道癌を治療するためのワクチンを調剤するための方法も記載される。
【背景技術】
【０００２】
ＭＡＧＥ遺伝子のファミリーによりコードされる抗原は（悪性黒色腫を含む）黒色腫細胞及びＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）を含むいくつかの他の癌、頭部及び首扁平上皮癌、膀胱移行上皮癌及び食道癌で主に発現されるが、精巣及び胎盤を除く正常な組織では検出できない（Gaugler, 1994; Weyhants, 1994; Patard 1995）。ＭＡＧＥ−３は黒色腫の６９％で発現され（Gaugler, 1994 ）、ＮＳＣＬＣの４４％（Yoshimatsu 1988 ）、頭部及び首扁平上皮癌の４８％、膀胱移行上皮癌の３４％、食道癌の５７％、直腸癌の３２％、及び乳癌の２４％（Van Pel, 1995; Inoue, 1995, Fujie 1997; Nishimura 1997）においても検出されている。ＭＡＧＥタンパク質を発現する癌はＭＡＧＥ関連腫瘍として知られている。
【０００３】
ヒト黒色腫細胞の免疫原性は黒色腫細胞及び自己由来リンパ球の混合培養物を用いる実験においてエレガントに証明されている。これらの培養物は自己由来黒色腫細胞を排他的に溶解することができるが、自己由来繊維芽細胞も自己由来ＥＢＶ形質転換リンパ球も溶解することができない特定の細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）をしばしば作り出す（Knuth, 1984; Anichini, 1987 ）。これらのＣＴＬクローンにより自己由来黒色腫細胞上で認識される抗原のいくつかは、ＭＡＧＥファミリーのものを含めて現在、同定されている。
【０００４】
自己由来黒色腫細胞上の特定のＣＴＬによりその認識を介して規定され得る最初の抗原はＭＺ２−Ｅと呼ばれ（Van den Eynde, 1989 ）、遺伝子ＭＡＧＥ−１によってコードされる（Van der Bruggen, 1991 ）。ＭＺ２−Ｅに対するＣＴＬは、これらの細胞がＨＬＡ．Ａ１対立遺伝子を有することを条件に自己由来及び他の患者からのＭＺ２−Ｅ陽性黒色腫細胞を認識し、溶解する。
【０００５】
ＭＡＧＥ−１遺伝子は染色体Ｘ上に位置しそれらのコーディング配列において互いに６４〜８５％の相同性を有する１２の密接に関連した遺伝子、ＭＡＧＥ１，ＭＡＧＥ２，ＭＡＧＥ３，ＭＡＧＥ４，ＭＡＧＥ５，ＭＡＧＥ６，ＭＡＧＥ７，ＭＡＧＥ８，ＭＡＧＥ９，ＭＡＧＥ１０，ＭＡＧＥ１１，ＭＡＧＥ１２のファミリーに属する。これらは時折、ＭＡＧＥ Ａ１，ＭＡＧＥ Ａ２，ＭＡＧＥ Ａ３，ＭＡＧＥ Ａ４，ＭＡＧＥ Ａ５，ＭＡＧＥ Ａ６，ＭＡＧＥ Ａ７，ＭＡＧＥ Ａ８，ＭＡＧＥ Ａ９，ＭＡＧＥ Ａ１０，ＭＡＧＥ Ａ１１，ＭＡＧＥ Ａ１２（ＭＡＧＥ Ａファミリー）として知られる。他の２つのグループのタンパク質もＭＡＧＥファミリーの一部である。但しより遠い関係にある。これらはＭＡＧＥ Ｂ及びＭＡＧＥ Ｃグループである。ＭＡＧＥ Ｂファミリーは、（ＭＡＧＥ Ｘｐ１及びＤＡＭ１０としても知られる）ＭＡＧＥ Ｂ１，（ＭＡＧＥ Ｘｐ２及びＤＡＭ６としても知られる）ＭＡＧＥ Ｂ２，ＭＡＧＥ Ｂ３及びＭＡＧＥ Ｂ４を含む。ＭＡＧＥ Ｃファミリーは、現在、ＭＡＧＥ Ｃ１及びＭＡＧＥ Ｃ２を含む。一般的に、ＭＡＧＥタンパク質はそのタンパク質のＣ末端に対して位置したコア配列のサインを含むとして定義することができる（例えばＭＡＧＥ Ａ１の３０９アミノ酸タンパク質に関して、コアのサインはアミノ酸１９５〜２７９に相当する）。
【０００６】
従ってコアのサインの共通パターンは次の通りであり、ここでｘはいずれかのアミノ酸を指し、小文字の残基は保存され（保存性変異を許容する）、大文字の残基は完全に保存される。
コア配列のサイン
LixvL(2x)I(3x)g(2x)apEExiWexl(2x)m(3-4x)Gxe(3-4x)gxp(2x)llt(3x)VqexYLxYxqVPxsxP(2x)yeFLWGprA(2x)Et(3x)kv
保存性置換は公知であり、一般に配列アラインメントプログラムにおいてデフォルトスコアリングマトリックスとして設定される。これらのプログラムには、PAM250 (Dayhoft M.O.ら、(1978), “A model of evolutionary changes in proteins¨, In“Atlas of Protein sequence and structure¨ 5 (3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington、及びBlosum 62 (Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992),“Amino acid substitution matricies from protein blocks¨), Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919 がある。
【０００７】
一般的に、以下のグループ内の置換が保存性置換であるが、グループ間の置換は非保存性であると考えられる。グループは次の通りである：
ｉ）アスパラテート／アスパラギン／グルタメート／グルタミン
ii）セリン／トレオニン
iii) リシン／アルギニン
iv）フェニルアラニン／チロシン／トリプトファン
ｖ）ロイシン／イソロイシン／バリン／メチオニン
vi）グリシン／アラニン
一般に及び本発明の文脈において、ＭＡＧＥタンパク質はＭＡＧＥ Ａ１のアミノ酸１９５〜２７９と、そのコア領域において約５０％、同一であろう。
【０００８】
いくつかのＣＴＬエピトープがＭＡＧＥ−３タンパク質上で同定されている。１つのこのようなエピトープであるＭＡＧＥ−３．Ａ１はＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ．Ａ１と会合して提示される時にＣＴＬに特異的なエピトープを構成するＭＡＧＥ−３タンパク質のアミノ酸１６８〜１７６の間に位置したノナペプチドである。現在、２つの更なるＣＴＬエピトープが、黒色腫細胞及び自己由来リンパ球の混合培養物中でＣＴＬ応答を開始する能力によりＭＡＧＥ−３タンパク質のペプチド配列上で同定されている。これら２つのエピトープはＨＬＡ．Ａ２（Van der Bruggen, 1994 ）及びＨＬＡ．Ｂ４４（Herman, 1996）対立遺伝子の各々についての特定の結合モチーフを有する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ＭＡＧＥタンパク質誘導体を供する。このような誘導体は所定範囲の腫瘍型の治療のために適した治療用ワクチン製剤に用いるために好適である。
本発明の一実施形態において、本誘導体は異種のパートナーに連結したＭＡＧＥタンパク質ファミリーからの抗原を含む融合タンパク質である。そのタンパク質は化学的にコンジュゲートされ得るが、好ましくは非融合タンパク質と比べて増加したレベルが発現系で生産されるのを許容する組換え融合として発現される。これにより、融合パートナーは、Ｔヘルパーエピトープ（免疫学的融合パートナー）、好ましくはヒトにより認識されるＴヘルパーエピトープを供するのを補助し、又はネイティブ組換えタンパク質より高収率でタンパク質を発現するのを補助し得る（発現エンハンサー）。好ましくは融合パートナーは、免疫学的融合パートナー及び発現増強パートナーの両方であろう。
【００１０】
本発明の好ましい形態において、免疫学的融合パートナーはグラム陰性細菌ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenza ）Ｂの表面タンパク質であるプロテインＤから得られる（ＷＯ９１／１８９２６）。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、そのタンパク質のおおよそ最初の１／３、特におおよそ最初のＮ末端１００〜１１０アミノ酸を含む。好ましくは、プロテインＤ誘導体は脂質化される。好ましくは、リポプロテインＤ融合パートナーの最初の１０９残基がＮ末端上に含まれ、更なる外来Ｔ細胞エピトープと共にワクチン候補抗原を供し、大腸菌内で発現レベルを増加させる（これにより発現エンハンサーとしても機能する）。脂質のテールは、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を確実にする。
【００１１】
他の融合パートナーには、インフルエンザウイルスからの非構造タンパク質ＮＳ１（ヘマグルチニン）がある。典型的には、Ｎ末端８１アミノ酸が利用される。但しそれらがＴヘルパーエピトープを含む限り異なるフラグメントを用いることができる。
別の実施形態において、免疫学的融合パートナーはＬＹＴＡとして知られるタンパク質である。好ましくはその分子のＣ末端部分が用いられる。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格内の特定の結合を特異的に分解するオートリシンである（ｌｙｔＡ遺伝子によりコードされる（Gene, 43 (1986) ページ265 〜272 ））Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、アミダーゼＬＹＴＡを合成するストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）から得られる。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインはコリンに対する又はＤＥＡＥのような特定のコリンアナログに対するアフィニティーの原因である。この特性は融合タンパク質の発現のために役立つ大腸菌Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発のために活用されている。アミノ末端にＣ−ＬＹＴＡフラグメントを含むハイブリッドタンパク質の精製は記述されている（Biotechnolosy: 10, (1992) ページ795 〜798 ）。本明細書に用いる場合、好ましい実施形態は残基１７８で始まるＣ末端中に見い出されるＬｙｔａ分子の反復部分を利用する。特に好ましい形態は残基１８８〜３０５を組み込む。
【００１２】
上述の免疫学的融合パートナーは発現を補助するのにも有利である。特に、このような融合体はネイティブの組換えＭＡＧＥタンパク質より高収率で発現される。
臨床セッティングにおけるこのような構成物は、本発明者により黒色腫を治療することができることが示されている。１つの場合、段階IVの黒色腫はアジュバントを添加しないlipo P 1/3 MAGE 3 His タンパク質の２回の投与後に転移物を取り除いた。
【００１３】
従って、その実施形態において、本発明は、免疫学的融合パートナーに連結したＭＡＧＥファミリーからの腫瘍関連抗原を含む融合タンパク質を供する。好ましくは、その免疫学的融合パートナーはプロテインＤ又はそのフラグメント、最も好ましくはリポプロテインＤである。ＭＡＧＥタンパク質は好ましくはＭＡＧＥ Ａ１又はＭＡＧＥ Ａ３である。リポプロテインＤ部分は好ましくはリポプロテインＤの最初の１／３を含む。
【００１４】
本発明のタンパク質は好ましくは大腸菌内で発現される、好ましい実施形態において、タンパク質は、アフィニティータグ、例えば５〜９、好ましくは６のヒスチジン残基を含むヒスチジンテールと共に発現される。これらは精製を補助するのに有利である。
本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸も供する。このような配列は好適な発現ベクターに挿入してＤＮＡ／ＲＮＡワクチン接種のために用い又は好適な宿主内で発現させることができる。本核酸を発現する微生物ベクターはワクチンとして用いることができる。このようなベクターには、例えばポックスウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、リステリア及びモナルファージ（monarphage）がある。
【００１５】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は標準的なＤＮＡ合成技術を用いて、例えばD.M.Robertら（Biochemistry 1985, 24, 5090-5098）により記載される酵素連結法により、化学合成により、試験管内酵素重合により、もしくは例えば熱安定性ポリメラーゼを利用するＰＣＲ技術により、又はこれらの技術の組合せにより合成することができる。
【００１６】
ＤＮＡの酵素による重合は、必要に応じて１０°〜３７℃の温度で、一般に５０μＬ又はそれ未満の容量で、ヌクレオチドトリホスフェートｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含む好適な緩衝液中で、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）のようなＤＮＡポリメラーゼを用いて試験管内で行うことができる。ＤＮＡフラグメントの酵素による連結は、４℃〜環境温度の温度で、一般に５０ml又はそれ未満の容量で、好適な緩衝液、例えば０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ（pH７．４）、０．０１Ｍ ＭｇＣｌ2 、０．０１Ｍジチオトレイトール、１mMスペルミジン、１mM ＡＴＰ及び０．１mg／mlウシ血清アルブミン中で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼのようなＤＮＡリガーゼを用いて行うことができる。ＤＮＡポリマー又はフラグメントの化学合成は、‘Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments-A Laboratory Manual’(ed. H.G.Gassen and A.Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982) に、又は他の科学文献、例えばM.J.Gait, H.W.D.Matthes, M.Singh, B.S.Sproat、及びR.C.Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S.Sproat、及びW.Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D.Matteucci 及びM.H.Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D.Matteucci及びM.H.Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P.Adams ら、Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D.Sinha, J.Biernat, J.McMannus、及びH.Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539;並びにH.W.D.Matthes ら., EMBO Journal, 1984, 3, 801 に記載される方法のような固相技術を用いて、慣用的なホスホトリエステル、ホスファイト又はホスホルアミジト化学により行うことができる。
【００１７】
本発明の方法は、Maniatisら、Molecular Cloning-A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989に記載されるような慣用的な組換え技術により行うことができる。
特に、その方法は、
ｉ）本タンパク質又はその免疫原性誘導体をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリマーを宿主内で発現することができる複製可能又は組込み可能発現ベクターを調製し；
ii）該ベクターで宿主細胞を形質転換し；
iii) 該形質転換された宿主細胞を、前記ＤＮＡポリマーの発現が前記タンパク質を生産することができる条件下で培養し；そして
iv）該タンパク質を回収すること
を含み得る。
【００１８】
用語“形質転換”は、本明細書において、外来ＤＮＡを宿主細胞に導入することを意味する。これは、例えば、好適なプラスミド又はウイルスで、例えばGenetic Engineering: Eds. S.M.Kingsman及びA.J.Kingsman: Blackwell Scientific Publications; Oxford, England, 1988に記載されるような慣用的な技術を用いて、形質転換、トランスフェクション又は感染により達成することができる。用語“形質転換された”又は“形質転換体”は、以後、関心の外来遺伝子を含みかつそれを発現する生じた宿主細胞に適用するであろう。
【００１９】
本発現ベクターは新規であり、本発明の一部を形成する。
複製可能な発現ベクターは宿主細胞に適合したベクターを開裂して完全なレプリコンを有する直鎖ＤＮＡセグメントを供し、そしてその直鎖セグメントを、その直鎖セグメントと一緒に要求される産物をコードする１又は複数のＤＮＡ分子、例えば本発明のタンパク質をコードするＤＮＡポリマー又はその誘導体と、連結条件下で組み合わせることにより本発明に従って調製することができる。
【００２０】
これにより、ＤＮＡポリマーは、必要に応じて予め形成し、又はベクターの作製の間に形成することができる。
ベクターの選択は、部分的に宿主細胞により決定されよう。それは原核生物でも真核生物であってもよいが、好ましくは大腸菌又はＣＨＯ細胞である。適切なベクターには、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド及び組換えウイルスがある。
【００２１】
複製可能発現ベクターの調製は、例えば上述のManiatisらに記載される手順により、ＤＮＡの制限、重合及び連結のための適切な酵素で便利に行うことができる。
組換え宿主細胞は、本発明に従って、形質転換条件下で宿主細胞を本発明の複製可能発現ベクターで形質転換することにより調製される。適切な形質転換条件は慣用的であり、例えば上述のManiatisら又は“DNA Cloning¨ Vol.II, D.M.Glover ed., IRL Press Ltd, 1985に記載される。
【００２２】
形質転換条件の選択は宿主細胞により決定される。これにより、大腸菌のような細菌宿主細胞は、ＣａＣｌ2 の溶液で（Cohen ら、Proc.Nat.Acad.Sci., 1973, 69, 2110）又はＲｂＣｌ，ＭｎＣｌ2 、酢酸カリウム、及びグリセロールの混合物を含む溶液で、そして次に３−〔Ｎ−モルホリノ〕−プロパン−スルホン酸、ＲｂＣｌ及びグリセロールで処理することができる。培養中の哺乳動物細胞は、ベクターＤＮＡの細胞へのカルシウム同時沈降により形質転換することができる。本発明は、本発明の複製可能発現ベクターで形質転換された宿主細胞にも広げられる。
【００２３】
形質転換された宿主細胞をそのＤＮＡポリマーの発現を許容する条件下で培養することは、便利には、例えば上述のManiatisら及び“DNA Cloning¨に記載されるように行われる。これにより、好ましくは細胞には栄養素が補給され、５０℃未満の温度で培養される。
その産物は、宿主細胞に従って及び（細胞内又は培養培地にもしくは細胞内ペリプラズムに分泌された）発現産物の局在化に従って、慣用的な方法により回収される。これにより、宿主細胞が細菌、例えば大腸菌である場合、それは例えば物理的に、化学的に又は酵素的に溶解し、生じたライゼートからタンパク質産物を単離することができる。宿主細胞が哺乳動物細胞である場合、その産物は一般に、栄養培地から又は無細胞抽出液から単離することができる。慣用的なタンパク質単離技術には、選択的沈殿、吸着クロマトグラフィー、及びモノクローナル抗体アフィニティーカラムを含むアフィニティークロマトグラフィーがある。
【００２４】
本発明のタンパク質は、脂質に可溶性の形態で又は凍結乾燥形態で供される。
一般に、各々のヒトの投与量は、１〜１０００μｇのタンパク質、好ましくは３０〜３００μｇを含むであろうと予想される。
本発明は、医薬として許容される賦形剤中に本発明のタンパク質を含む医薬組成物も供する。好ましいワクチン組成物は、少くともリポプロテインＤ−ＭＡＧＥ−３を含む。このようなワクチンは、任意に、１又は複数の他の腫瘍関連抗原を含み得る。例えばＭＡＧＥ及びＧＡＧＥファミリーに属する他のメンバーがある。好適な他の腫瘍関連抗原には、ＭＡＧＥ−１，ＧＡＧＥ−１又はチロシナーゼタンパク質がある。
【００２５】
ワクチン調製物は、一般に、Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach¨ (eds. Powell M.F. & Newman M.J) (1995) Plenum Press New York ）に記載される。リポソームでのカプセル化は、Fullerton の米国特許４，２３５，８７７に記載される。
本発明のタンパク質は、好ましくは、本発明のワクチン調製物中にアジュバントが添加される。好適なアジュバントアルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムゲル（アルム）又はリン酸アルミニウムを含むが、カルシウム、鉄又は亜鉛の塩であってもよく、またアシル化チロシン又はアシル化糖、カチオンに又はアニオンに誘導化したポリサッカライド又はポリホスファゼンの不溶性懸濁液であってもよい。他の周知のアジュバントには、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがある。そのオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていないことを特徴とする。このようなオリゴヌクレオチドは公知であり、例えばＷＯ９６／０２５５５に記載される。
【００２６】
本発明の製剤において、アジュバント組成物はＴＨ１型に優先的に免疫応答を誘導することが好ましい。好適なアジュバントシステムには、例えばモノホスホリル脂質Ａ、好ましくは３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）の、アルミニウム塩との組合せがある。ＣｐＧオリゴヌクレオチドもＴＨ１応答を優先的に誘導する。
【００２７】
増強されたシステムはモノホスホリル脂質Ａ及びサポニン誘導体の組合せ、特にＷＯ９４／００１５３に開示されるＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬの組合せ、又はＷＯ９６／３３７３９に開示されるＱＳ２１がコレステロールでクエンチされているより少い反応原性の組成物に関する。
水中油エマルション中のＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬ及びトコフェロールに関する特に能力のあるアジュバントはＷＯ９５／１７２１０に記載され、好ましい製剤である。
【００２８】
従って、本発明の一実施形態において、モノホスホリル脂質Ａ又はその誘導体がアジュバントとして添加された。本発明のタンパク質、より好ましくはリポプロテインＤ（又はその誘導体）−ＭＡＧＥ−３を含むワクチンを供する。
好ましくは、そのワクチンは、サポニン、より好ましくはＱＳ２１を更に含む。
【００２９】
好ましくは、製剤は、水中油エマルション及びトコフェロールを更に含む。本発明は、医薬として許容される賦形剤、例えば３Ｄ−ＭＰＬを一緒に本発明のタンパク質を混合することを含むワクチン製剤を製造するための方法も供する。
本発明の一態様において、組換え生産されたＭＡＧＥ−タンパク質を精製するための方法を供する。その方法は、そのタンパク質を、例えば強カオトロピック剤（例えば尿素、塩酸グアニジウム）に、又は両性イオン界面活性剤、例えば（Empigen BB−ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン）に可溶化し、そのタンパク質の分子内及び分子間ジスルフィド結合を還元し、生じたチオールをブロッキングして酸化的再カップリングを防止し、そしてそのタンパク質を１又は複数のクロマトグラフィーステップにかけることを含む。
【００３０】
好ましくは、ブロッキング剤はアルキル化剤である。このようなブロッキング剤には、これらに限らないが、α−ハロゲン酸（haloacids ）又はα−ハロゲンアミド（haloamides）がある。例えば、ヨード酢酸及びヨードアセトアミドはタンパク質をカルボキシメチル化又はカルボキシアミド化（カルバミドメチル化）させる。他のブロッキング剤を用いることができ、これらは文献に記載されている（例えばThe Proteins Vol II Eds H neurath, RL Hill and C-L Boeder, Academic press 1976, or Chemical Reagents for Protein modification Vol I eds. RL Lundblad and CM Noyes, CRC Press 1985 を参照のこと）。このような他のブロッキング剤の典型例には、Ｎ−エチルマレイミド、クロロアセチルホスフェート、Ｏ−メチルイソウレア及びアクリロニトリルがある。ブロッキング剤の使用は、それが産物の凝集を防ぎ、後の精製のための安定性を確実にするので有利である。
【００３１】
本発明の一実施形態において、ブロッキング剤は、安定に共有結合した不可逆的な誘導体（例えばα−ハロ酸又はα−ハロアミド）を誘導するように選択される。しかしながら、ブロッキング剤は、精製の後に、そのブロッキング剤が除去されて非誘導化タンパク質を遊離し得るように選択してもよい。
誘導化遊離チオール残基を有するＭＡＧＥタンパク質は新規であり本発明の一態様を形成する。特に、カルボキシアミド化又はカルボキシメチル化誘導体は本発明の好ましい実施形態である。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態において、本発明のタンパク質には、アフィニティータグ、例えばＣＬＹＴＡ又はポリヒスチジンテールが供される。このような場合、ブロッキングステップ後のタンパク質は、好ましくはアフィニティークロマトグラフィーにかけられる。ポリヒスチジンテールを有するこれらのタンパク質のために、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を行うことができる。金属イオンは、いずれかの適切なイオン、例えば亜鉛、ニッケル、鉄、マグネシウム又は銅であり得るが、好ましくは亜鉛又はニッケルである。好ましくは、ＩＭＡＣ緩衝液は、最終産物中に低レベルのエンドトキシンを生ずるので、Ｅｍｐｉｇｅｎ ＢＢ（以後、Ｅｍｐｉｇｅｎ）のような両性イオン界面活性剤を含む。
【００３３】
タンパク質がＣｌｙｔａ部分と共に生産されるなら、そのタンパク質は、コリン又はコリンアナログ、例えばＤＥＡＥへのアフィニティーを利用することにより精製することができる。本発明の一実施形態において、タンパク質には、ポリヒスチジンテール及びＣｌｙｔａ部分が供される。これらは簡単な２ステップのアフィニティークロマトグラフィー精製スケジュールで精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】脂質化Ｈｉｓテールを有する融合タンパク質の概略を示す。
【図２】発現ベクターｐＲＩＴ１４５８６の作製ストラテジーを示す。
【図３】プロテインＤ１／３−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓテールを発現するプラスミドｐＲＩＴ１４４７７の作製ストラテジーを示す。
【図４】Ｍａｂ３２及び５４で染色した後のｌｏｔ ９６Ｋ１９及び９６Ｊ２２について得られたバンドパターンを示す。
【図５】ＳＢＡＳ−２製剤のみ又はＰＢＳを与えたマウスのリンパ球増殖応答と比較した、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質を注入したＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞における、ＭＡＧＥ−３特異的リンパ球増殖活性の増加を示す。
【図６】ＳＢＡＳ−２製剤のみ又はＰＢＳを与えたマウスのリンパ球増殖応答と比較した、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質を注入したＣ５７ＢＬ／６マウスのリンパ節細胞における、ＭＡＧＥ−３特異的リンパ球増殖活性の増加を示す。
【図７】ＳＢＡＳ−２製剤のみ又はＰＢＳを与えたマウスのリンパ球増殖応答と比較した、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質を注入したＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞における、ＭＡＧＥ−３特異的リンパ球増殖活性の増加を示す。
【図８】ＳＢＡＳ−２製剤のみ又はＰＢＳを与えたマウスのリンパ球増殖応答と比較した、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質を注入したＢａｌｂ／ｃマウスのリンパ節細胞における、ＭＡＧＥ−３特異的リンパ球増殖活性の増加を示す。
【図９】マウスの異なるグループ（Ｎ＝５／グループ）間で、曲線の中点に達するために必要とされる平均希釈にある、血清の相対的平均中点タイターを比較する。
【図１０】Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるワクチン接種後のＩｇサブクラス特異的抗ＭＡＧＥ−３応答を示す。
【図１１】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるワクチン接種後のＩｇサブクラス特異的抗ＭＡＧＥ−３応答を示す。
【図１２】大腸菌内で発現させるべき融合タンパク質ＮＳ１，ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓのデザインを示す。
【図１３】プラスミドｐＲＩＴ１４４２６の作製ストラテジーを示す。
【図１４】ｐＲＩＴ１４４２６のプラスミドマップを示す。
【図１５】大腸菌内で発現させる融合タンパク質Ｃｌｙｔａ−Ｍａｇｅ−１−Ｈｉｓのデザインを示す。
【図１６】プラスミドｐＲＩＴ１４６１３の作製巣取れてジーを示す。
【図１７】プラスミドｐＲＩＴの作製ストラテジーを示す。
【図１８】大腸菌内で発現させる融合タンパク質Ｃｌｙｔａ−Ｍａｇｅ−３−Ｈｉｓのデザインを示す。
【図１９】プラスミドｐＲＩＴ１４６４６の作製ストラテジーを示す。
【実施例】
【００３５】
本発明は、以下の実施例を引用することにより更に記述されよう。
実施例Ｉ：
融合タンパク質リポプロテインＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ（ＬＰＤ １／３−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ又はＬｐＤ ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ）を発現する組換え大腸菌株の調製
１．大腸菌発現系：
リポプロテインＤの生産のため、プロテインＤをコードするＤＮＡを発現ベクターｐＭＧ８１にクローン化した。このプラスミドはラムダファージＤＮＡからのシグナルを利用して挿入された外来遺伝子の転写及び翻訳を駆動する。そのベクターは、ラムダＰＬプロモーターＰＬ、オペレーターＯＬ及びＮプロテインを供した時に転写極性効果を緩和するための２つの利用部位（Ｎｕ＋Ｌ及びＮｕ＋Ｒ）を含む（Gross ら、1985, Mol. & Cell.Biol. 5; 1015 ）。ＰＬプロモーターを含むベクターはプラスミドＤＮＡを安定化するため大腸菌溶原性宿主に導入される。溶原性宿主株は、ゲノム内に挿入された複製欠損ラムダファージＤＮＡを含む（Shatzmanら、1983; In Experimental Manipulation of Gene Expression. Inouya (ed) pp 1 〜14, Academic Press NY ）。ラムダファージＤＮＡはベクターのＯＬリプレッサーに結合し、ＲＮＡポリメラーゼのＰＬプロモーターへの結合を防ぎ、それにより挿入された遺伝子の転写を防ぐｃＩリプレッサータンパク質の合成を指示する。発現株ＡＲ５８のｃＩ遺伝子は、ＰＬに指示された転写が温度変化により制御され得るように、即ち培養温度の増加がリプレッサーを不活性化して外来タンパク質の合成が始まるように、温度感受性変異を含む。この発現系は、外来タンパク質、特に細胞に対して毒性であり得るものの合成を制御する（Shimataka & Rosenberg, 1981, Nature 292: 128）。
【００３６】
２．大腸菌株ＡＲ５８：
ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質の生産のために用いたＡＲ５８溶原性大腸菌株は標準的なＮＩＨ大腸菌Ｋ１２株Ｎ９９の誘導体（F-Su-galK2, lacZ-thr- ）である。それは、欠損した溶原性ラムダファージを含む（galE::TN10, 1Kil-cI857 DH1）のＫｉｌ−表現型は宿主高分子合成の遮断を防ぐ。ｃＩ８５７変異は、温度感受性障害をｃＩリプレッサーに与える。ＤＨ１欠失は、ラムダファージの右オペロン及び宿主のｂｉｏ，ｕｖｒ３、及びｃｈｌＡ座を除去する。ＡＲ５８株は、ＳＡ５００誘導体（galE::TN10, 1Kil-cI857 DH1）で先に増殖させたＰラムダファージストックでのＮ９９の導入により作り出した。Ｎ９９への欠損溶原の導入は、隣接ｇａｌＥ遺伝子中にテトラサイクリン耐性をコードするＴＮ１０トランスポゾンの存在によりテトラサイクリンで選択した。Ｎ９９及びＳＡ５００は、National Institute of HealthのDr.Martin Rosenberg's laboratoryから得た大腸菌Ｋ１２株である。
【００３７】
３．組換えタンパク質ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓを発現するようデザインしたベクターの作製
原理は、ＭＡＧＥ−３のＮ末端に連結した融合パートナーとして脂質化プロテインＤのＮ末端１／３及びＣ末端に位置したいくつかのヒスチジン残基の配列（Ｈｉｓテール）を用いて融合タンパク質としてＭＡＧＥ３を発現させることであった。
【００３８】
プロテインＤはリポタンパク質である（グラム陰性細菌ヘモフィルス・インフルエンゼの表面上に露出した４２kDa イムノグロブリンＤ結合タンパク質）。そのタンパク質は、細菌のリポタンパク質についての共通配列を含む、１８アミノ酸残基シグナル配列を有する前駆体として合成される（ＷＯ９１／１８９２６）。
【００３９】
リポタンパク質のシグナル配列が分泌の間に処理される場合、（前駆体分子中の位置１９の）Ｃｙｓがアミノ末端残基になり、同時に、エステル結合及びアミド結合脂肪酸の両方の共有結合により改変される。
次に、アミノ末端システイン残基に結合した脂肪酸は膜アンカーとして機能する。
【００４０】
融合タンパク質を発現するプラスミドは、１８アミノ酸シグナル配列及び処理されたプロテインＤの最初の１０９残基、２つの無関係なアミノ酸（Ｍｅｔ及びＡｓｐ）、ＭＡＧＥ−３のアミノ酸残基２〜３１４、後に７つのＨｉｓ残基に露出されるヒンジ領域をして機能する２つのＧｌｙ残基を含む前駆タンパク質を発現するようデザインした。
【００４１】
これにより、組換え株は、４３２アミノ酸残基長の処理された脂質化Ｈｉｓテールを有する融合タンパク質を作り出す（図１）。ここでそのアミノ酸配列は配列番号：１に記載され、コーディング配列は配列番号：２に記載される。
４．ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ融合タンパク質の形成のためのクローニングストラテジー（ベクターｐＲＩＴ１４４７７）：
（Ludwig InstituteからのDr Thierry Boon から頂いた）ＭＡＧＥ−３遺伝子（Gaugler B ら、1994）のためのコーディング配列を含むｃＤＮＡプラスミド、及び（図２に概説するように調製した）Ｌｉｐｏ−Ｄ−１／３コーディング配列のＮ末端部分を含むベクターＰＲＩＴ１４５８６を用いた。そのクローニングストラテジーは以下のステップを含む（図３）。
【００４２】
ａ）オリゴヌクレオチドセンス：５′gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct及びオリゴヌクレオチドアンチセンス：５′gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa を用いてプラスミドｃＤＮＡ ＭＡＧＥ３内に供される配列のＰＣＲ増幅；この増幅は、Ｎ末端に以下の改変を導く：最初の５つのコドンの、大腸菌コドン使用への変化、位置１におけるＰｒｏコドンのＡｓｐコドンによる置換、５′末端でのＮｃｏＩ部位の設置及び２つのＧｌｙコドン及び７つのＨｉｓコドン、その後のＸｂａＩ部位の、Ｃ末端での最後の付加。
【００４３】
ｂ）先に増幅したフラグメントのインビトロゲンのＴＡクローニングベクターへのクローニング及び中間体ベクターｐＲＩＴ１４６４７の調製。
ｃ）プラスミドｐＲＩＴ１４６４７からのＮｃｏＩ ＸｂａＩフラグメントの切り出し、及びベクターｐＲＩＴ１４５８６へのクローニング。
ｄ）宿主株ＡＲ５８の形質転換。
【００４４】
ｅ）ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ融合タンパク質を発現するプラスミドｐＲＩＴ１４４７７を含む大腸菌株形質転換体の選択及びキャラクタリゼーション
実施例II：
ＬＰＤ１／３−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ抗原の調製：
１．細菌株の増殖及び誘導−ＬＰＤ１／３−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓの発現：
プラスミドｐＲＩＴ１４４７７で形質転換したＡＲ５８の細胞を、各々イーストエキス（６．４ｇ／Ｌ）及びカナマイシンスルフェート（５０mg／Ｌ）を補給したＬＹ１２培地４００mLを含む２リッターフラスコ内で増殖させた。振とうテーブル上で、３０℃で８＋／−１時間、インキュベートした後、顕微鏡検査のため各々のフラスコから少量のサンプルを除去した。２つのフラスコの内容物をプールして２０リッター発酵槽のための接種物を供した。
【００４５】
その接種物（約８００mL）を、５０mg／Ｌのカナマイシンスルフェートを補給した７リッターの培地を含む予め滅菌した２０リッター（全量）発酵槽に加えた。そのpHを、ＮＨ4 ＯＨ（２５％ｖ／ｖ）の周期的な添加により６．８に調節し、維持して、その温度を３０℃に調節し、維持した。エレーション速度を分当り１２リッターに調節し、維持して、溶解した酸素圧を撹拌速度のフィードバック制御により５０％の飽和に維持した。発酵槽における過圧は５００ｇ／cm2 （０．５bar ）に維持した。
【００４６】
炭素供給溶液の添加量を制御することによりフェド・バッチ（fed-batch ）培養を行った。供給溶液は最初に０．０４mL／分の速度で加え、０．１ｈ-1の増殖速度を維持するように最初の４２時間の間、指数関数的に増加させた。
４２時間後に、発酵槽中の温度を３９℃に迅速に増加させ、供給速度を、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓの細胞内発現が最大レベルに達する期間である更なる２２〜２３時間、誘導期の間、０．００５mL／ｇ DCW／分の一定値に維持した。
【００４７】
その培養液のアリコート（１５mL）を増殖／誘導期全体を通して規則的な間隔で採取し、発酵の終りに微生物増殖の速度及び細胞内産物発現を追跡し、更に、微生物の同定／純度テストのためのサンブルを供した。
発酵の終りに、その培養物の光学密度は（４８〜７２ｇの DCW／Ｌの細胞濃度に相当する）８０〜１２０であり、全液体量は約１２リッターであった。その培養物を迅速に６〜１０℃に冷却し、ＥＣＫ３２の細胞を、５０００×ｇで４℃で３０分の遠心により培養液から分離した。ＥＣＫ３２の濃縮細胞を迅速にプラスチックバッグに保存し、直ちに−８０℃に凍結した。
【００４８】
２．タンパク質の抽出：
ＥＣＫ３２の凍結した濃縮細胞を４℃に解凍した後、細胞破壊緩衝液に再度懸濁して（約３６ｇの DCW／Ｌの細胞濃度に相当する）６０の最終的な光学密度にした。
その細胞を高圧ホモジナイザー（１０００bar ）に２回、通すことにより破壊した。その破壊した細胞懸濁液を遠心し（×１０，０００ｇ、４℃、３０分）、そのペレット画分をＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００（１％ｗ／ｖ）＋ＥＤＴＡ（１mM）で２回、洗い、次にリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）＋Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％ｖ／ｖ）で洗い、そして最後にＰＢＳで洗った。各々の洗浄段階の間に、懸濁液を×１０，０００ｇで３０分、４℃で遠心し、その上清を捨てて、ペレット画分を保持した。
【００４９】
実施例III ：
融合タンパク質ＬｉｐｏＤ−ＭＡＧＥ３のキャラクタリゼーション：
１．精製：
ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓを以下に記載のステップの順番を用いて細胞ホモジネートから精製した：
ａ）細胞破壊物からの洗浄したペレット画分の可溶化。
【００５０】
ｂ）タンパク質内及びタンパク質間ジスルフィド結合の化学的還元、次の酸化物再カップリングを防ぐためのチオール基のブロッキング。
ｃ）粒子の除去及びエンドトキシンの削減のための反応混合物の精密ろ過。
ｄ）ポリヒスチジンテールと亜鉛装填Chelating Sepharose との間のアフィニティー相互作用の利用によるＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓの捕獲及び最初の精製。
【００５１】
ｅ）アニオン交換クロマトグラフィーによる汚染タンパク質の除去。
その精製したＬＰＤ−ＭＡＧＥ３−Ｈｉｓはいくつかの仕上げ段階にかけた：
ｆ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによる緩衝液交換／尿素除去。
ｇ）製造過程のろ過。
【００５２】
ｈ）Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによる緩衝液交換／脱塩。
これらのステップの各々を以下により詳細に記載する。
１．１）細胞ホモジネートペレットの可溶化
（上述の）最終洗浄段階からのペレット画分を、塩酸グアニジン（６Ｍ）及びリン酸ナトリウム（０．１Ｍ、pH７．０）の溶液８００mL中で４℃で一晩、再び可溶化した。
【００５３】
１．２）還元及びカルボキシメチル化
可溶化した材料（うすい黄色、濁った懸濁液）にアルゴンを流して残った酸素を一掃し、２−メルカプトエタノールの保存溶液（１４Ｍ）を加えて４．３Ｍの最終濃度（溶液１mL当り０．４４mLの２−メルカプトエタノールに相当）を供した。
【００５４】
得られた溶液を２つのガラスフラスコに分けて移し、それら両方を水浴中で９５℃に加熱した。９５℃で１５分後に、そのフラスコを水浴から除去し、冷却して、その内容物を氷の中においたホイルでおおったビーカー（５Ｌ）にプールし、そして固体のヨードアセトアミドを激しく混合しながら加えて６Ｍの最終濃度（溶液１mL当り１．１１ｇのヨードアセトアミドに相当）を供した。その混合物を１時間、暗所で氷上に保持し、ヨードアセトアミドの完全な可溶化を確実にし、その後、約１Ｌの水酸化ナトリウム（５Ｍ）を加えることにより中和して（激しい混合を維持してpHのモニターを続けて）、７．５〜７．８の最終pHを供した。
【００５５】
得られた混合物を更に３０分、暗所で氷上に維持し、その後、pHを再びpH７．５〜７．８に調節した。
１．３）精密ろ過
その混合物を、Minikros中空繊維カートリッジ（ret. No M22M-600-01N；面積５，６００cm2 、０．２μｍ）を備えたAmicon Proflux M12接線フロー（tangenital-flow ）ユニット内で精密ろ過した。その透過液を後のクロマトグラフィー精製のために保持した。
【００５６】
１．４）金属（Ｚｎ2+）キレートクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）
金属キレートクロマトグラフィーを、ＢＰＧ １００／５００カラム（Pharmacia Biotechnology Cat No.18-1103-01 ）に充填したChelating Sepharose FF (Pharmacia Biotechnology Cat. No.17-0575-01）で行った。充填したベッドの寸法は、直径１０cm；断面積７９cm2 ；ベッドの高さ１９cm；充填容量１, ５００mLであった。空のカラムを水酸化ナトリウム（０．５Ｍ）で浄化して精製水で洗った。
【００５７】
（２０％ｖ／ｖエタノール中から出した）支持体を（真空下で）ブフナー漏斗上で精製水（８リッター）で洗い、少くとも１５リッターのＺｎＣｌ2 の溶液（０．１Ｍ）を流すことにより亜鉛で荷電させた。その支持体を、流出液のpHがＺｎＣｌ2 溶液のpH（pH５．０）に達するまで、１０Ｌの精製水で洗うことにより除去した。次にその支持体を、塩酸グアニジン（６Ｍ）及びリン酸ナトリウム（０．１Ｍ、pH７．０）を含む溶液４リッターで平衡化した。
【００５８】
ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓを含む精密ろ過からの浸透液を支持体と混合し（バッチ結合）、次にそのＢＰＧカラムに塩酸グアニジン（６Ｍ）及びリン酸ナトリウム（０．１Ｍ、pH７．０）を含む溶液をロードし、充填した。
金属キレートクロマトグラフィーの次の段階は、６０mL／分の溶出流速で行った。カラムを洗い、最初に塩酸グアニジン（６Ｍ）及びリン酸ナトリウム（０．１Ｍ、pH７．０）を含む溶液で、次に尿素（６Ｍ）及びリン酸ナトリウム（０．１Ｍ、pH７．０）を含む溶液で、カラム溶出液がＯＤ280nm で０の吸光度に達する（ベースライン）まで洗った。
【００５９】
半純粋なＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質画分を、尿素（６Ｍ）、リン酸ナトリウム（０．１Ｍ、pH７．０）及びイミダゾール（０．５Ｍ）を含む溶液２カラム容量で溶出した。この画分のコンダクタンスは約１６mS／cmであった。
１．５）アニオン交換クロマトグラフィー
アニオン交換クロマトグラフィーを続ける前に、半純粋なＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質画分のコンダクタンスを、尿素（６Ｍ）及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２０mM、pH８．０）を含む溶液で希釈することにより約４mS／cmに減少させた。
【００６０】
アニオン交換クロマトグラフィーを、ＢＰＧ ２００／５００カラム（Pharmacia Biotechnology Cat.No.18-1103-11 ）に充填したQ-Sepharose FF (Pharmacia Biotechnology, Cat No.17-0510-01）を用いた行った。充填したベッドの寸法は、直径１０cm；断面積３１４cm2 ；ベッドの高さ９cm；充填容量２，９００mLであった。
【００６１】
そのカラムに（２０％ｖ／ｖエタノール）を充填し、９リッターの精製水で７０mL／分の溶出流速で洗った。その充填したカラムを３Ｌの水酸化ナトリウム（０．５Ｍ）で浄化し、３０Ｌの精製水で洗い、次に６Ｌの尿素（６Ｍ）及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２０mM、pH８．０）を含む溶液で平衡化した。希釈した半精製したＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓをそのカラムに充填し、次に尿素（６Ｍ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０mM、pH８．０）、ＥＤＴＡ（１mM）及びＴｗｅｅｎ（０．１％）を含む９Ｌの溶液で、その溶出液の吸光度（２８０nm）が０になるまで洗った。
【００６２】
更なる洗浄ステップを、尿素（６Ｍ）及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２０mM、pH８．０）を含む６リッターの溶液で行った。
精製したＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓを、尿素（６Ｍ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０mM、pH８．０）及びＮａＣｌ（０．２５Ｍ）を含む溶液でカラムから溶出した。
【００６３】
１．６）サイズ排除クロマトグラフィー
精製したＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓからの尿素の除去及び緩衝液交換は、両方とも、サイズ排除クロマトグラフィーにより行った。これは、ＸＫ ５０／１００カラム（Pharmacia Biotechnology Cat.No.18-8753-01 ）に充填したSuperdex 75 (Pharmacia Biotechnology Cat.No.17-1044-01）を用いて行った。充填したベッドの寸法は、直径５cm；断面積１９．６cm2 ；ベッドの高さ９０cm；充填容量１，８００mLであった。
【００６４】
そのカラムはエタノール（２０％）中に充填し、５リッターの精製水で２０mL／分の溶出速度で洗浄した。そのカラムを２リッターの水酸化ナトリウム（０．５Ｍ）で浄化し、５リッターの精製水で洗い、次にＴｗｅｅｎ８０（０．１％ｖ／ｖ）を含む５リッターのリン酸緩衝塩類溶液で平衡化した。
その精製したＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ画分（脱塩ラン当り最大５００mL）を２０mL／分の溶出流速でカラムに充填した。その脱塩した精製ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓを、Ｔｗｅｅｎ８０（０．１％ｖ／ｖ）を含む３リッターのＰＢＳでカラムから溶出した。
【００６５】
ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓを含む画分はカラムのボイド容量で溶出した。
１．７）製造過程のろ過
サイズ排除クロマトグラフィーからのバルクＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓを、層流フード中０．２２μｍ膜（クラス１０．０００）を介してろ過した。そのろ過したバルクは−８０℃に凍結し、脱塩ステップまで保存した。
【００６６】
１．８）脱塩クロマトグラフィー
最終的なバルクのオスモル濃度は４００mOsM未満であるべきであるので、塩濃度を減少させるために更なる緩衝液交換が必要とされた。これは、ＢＰＧ １００／９５０カラム（Pharmacia Biotechnology Cat.No.18-1103-03 ）に充填したSephadex G25 (Pharmacia Biotechnology Cat.No.17-0033-02 ）を用いて脱塩クロマトグラフィーにより行った。充填したベッドの寸法は直径１０cm；断面積７８．６cm2 ；ベッドの高さ８５cm；充填容量６，５００mLであった。
【００６７】
Sephadex G25を７リッターの精製水で水和し、４℃で一晩、膨潤させた。次にそのゲルを純水で１００mL／分の溶出流速でカラムにつめた。
そのカラムを６リッターの水酸化ナトリウム（０．５Ｍ）で浄化し、次にリン酸ナトリウム（１０mM、pH６．８）、ＮａＣｌ（２０mM）及びＴｗｅｅｎ８０（０．１％ｖ／ｖ）を含む１０リッターの溶液で平衡化した。
【００６８】
その精製したＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ画分（脱塩ラン当り最大１５００mL）を１００mL／分の溶出流速でカラムに流した。カラムのボイド容量で溶出した脱塩精製したＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ画分を０．２２μｍ膜を介して滅菌ろ過し、−８０℃で保存した。
最終的なバルクタンパク質を＋４℃に解凍した後、容器に分取してラクトース賦形剤中に凍結乾燥した。
【００６９】
２．クーマシー染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでの分析：
ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ精製抗原を、１２．５％アクリルアミドゲル上で還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
タンパク質充填量はクーマシーブルー染色について５０μｇ及び硝酸銀染色について５μｇであった。臨床用ｌｏｔ ９６Ｋ１９及びパイロットｌｏｔ ９６Ｊ２２を分析した。６０kDa の分子量に相当する１つの主要バンドを可視化した。約４５kDa 及び３５kDa の２つのマイナーな更なるバンドも見られた。
【００７０】
３．ウェスタンブロット分析：
ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により表されるペプチドを、マウスモノクローナル抗体を用いてウェスタン・ブロットにより同定した。これらの抗体は、ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質（このタンパク質はＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−ＨｉｓのＬＰＤ部分を含まない）の精製した調製物を用いて企業内で開発した。
【００７１】
２つのモノクローナル抗体調製物（Ｍａｂ２２及びＭａｂ５４）は、ウェスタンブロット分析のための適合性に基づいて選択し、ｌｏｔリリースのための同一性テストに用いた。図４は、Ｍａｂ３２及び５４で染色した後のｌｏｔ ９６Ｋ１９及び９６Ｊ２２について得られたバンドパターンを示す。６００ngのタンパク質が１２．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、それをナイロン膜に移し、Ｍａｂ３２及び５４（６０μｇ／ml）と反応させ、ペルオキシダーゼに連結させた抗マウス抗体で表した。
【００７２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出された６０kDa 及び３０kDa ペプチドは両方のＭａｂにより表した。
実施例IV：
１．ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質を用いるワクチン調製物：
これらの実験に用いたワクチンは、アジュバントを加えた又は加えなかった、株ＡＲ５８からの大腸菌で発現されたリポプロテインＤ１／３−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓをコードする組換えＤＮＡから作り出す。アジュバントとして、その製剤は、油／水エマルション中、３ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）及びＱＳ２１の混合物を含む。アジュバントシステムＳＢＡＳ２は、先にＷＯ９５／１７２１０に記載されている。
【００７３】
３Ｄ−ＭＰＬは、グラム陰性細菌サルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnesota）のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）由来の免疫刺激剤である。ＭＰＬは脱アシル化されており、脂質Ａ成分上のホスフェート基を欠く。この化学的処理は、免疫刺激特性を保存しながら、毒性を劇的に減少させる（Ribi, 1986）。Ribi ImmunochemistryはＭＰＬを製造し、それをSB-Biologicalsに供給する。Smith Kline Beecham Biologicals で行った実験は、種々のビヒクルと組合わせた３Ｄ−ＭＰＬは、体液性免疫及び細胞性免疫のＴＨ１型の両方を強力に増強することを示した。
【００７４】
ＱＳ２１は、南アメリカの樹木Quillaja saponaria Molina の樹皮から抽出された天然のサポニン分子である。樹皮の粗抽出液から個々のサポニンを分離するために開発した精製技術は、親構成物と比べて強いアジュバント活性及び低い毒性を示すトリテルペングリコシドである特定のサポニンＱＳ２１の単離を許容した。ＱＳ２１はＭＨＣクラスＩ制限ＣＴＬをいくつかのサブユニットＡｇｓに活性化し、及びＡｇ特異的リンパ球増殖を刺激することが示されている（Kensil, 1992）。Ａｑｕｉｌａ（正式にはCambridge Biotech Corporation ）はＱＳ２１を製造し、それをSB-Biologicalsに供給する。
【００７５】
Smith Kline Beecham Biologicals で行った実験は、体液性及びＴＨ１型細胞性免疫応答の両方の誘導におけるＭＰＬ及びＱＳ２１の組合せの明らかな相乗効果を証明した。
油／水エマルションは、２種の油（トコフェロール及びスクアレン）から構成される有機相、及び乳化剤としてＴｗｅｅｎ８０を含むＰＢＳの水性相から構成される。そのエマルションは、５％のスクアレン、５％のトコフェロール、０．４％のＴｗｅｅｎ８０を含み、１８０nmの平均粒径を有し、ＳＢ６２として知られる（ＷＯ９５／１７２１０を参照のこと）。
【００７６】
Smith Kline Beecham Biologicals で行った実験は、３Ｄ−ＭＰＬ／ＱＳ２１（ＳＢＡＳ２）へのＯ／Ｗエマルションの添加が種々のサブユニット抗原に対する後者の免疫刺激特性を更に増加させる。
２．エマルションＳＢ６２（２倍濃縮物）の調製：
Ｔｗｅｅｎ８０をリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）に溶かしてＰＢＳ中２％溶液を供する。１００mLの２倍濃縮エマルションを供するために、５ｇのＤＬ−α−トコフェロール及び５mLのスクアレンをボルテキシングして完全に混合する。９０mLのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液を加え、完全に混合する。次に生じたエマルションをシリンジに通して、Ｍ１１０Ｓマイクロフルーディクスマシンを用いることにより最終的にミクロな液体にする。得られた油滴は約１８０nmの大きさを有する。
【００７７】
３．リポプロテインＤ１／３−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ ＱＳ２１／３Ｄ ＭＰＬ水中油（ＳＢＡＳ２）製剤の調製
アジュバントを油／水エマルション中で、ＭＰＬ及びＱＳ２１の組合せとして調剤する。この調製物を０．７mlの容器に入れて、凍結乾燥した抗原（容器は３０〜３００μｇの抗原を含む）と混合する。
【００７８】
凍結乾燥したワクチンのためのアジュバント希釈物の組成は次の通りである：
【００７９】
【表１】
【００８０】
最終的なワクチンは、凍結乾燥されたＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ調製物をアジュバントで又はＰＢＳのみで再構成した後に得られる。
抗原を含まないアジュバント対照は、タンパク質をＰＢＳで置換することにより調製した。
４．ワクチン抗原：融合タンパク質リポプロテインＤ１／３−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ：
リポプロテインＤはグラム陰性細菌ヘモフィルス・インフルエンゼの表面上に露出したリポタンパク質である。
【００８１】
融合パートナーとしての処理したプロテインＤの最初の１０９残基の包含は、Ｔ細胞エピトープを有するワクチン抗原を供する。ＬＰＤ成分の他に、タンパク質は、２つの無関係なアミノ酸（Ｍｅｔ及びＡｓｐ）、Ｍａｇｅ−３のアミノ酸残基２〜３１４、次の７つのヒスチジン残基を露出するためのヒンジ領域として機能する２つのＧｌｙ残基を含む。
【００８２】
実施例Ｖ：
１：マウス及びサルにおけるＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓの免疫原性：
ヒトＭＡＧＥ−３タンパク質の抗原性及び免疫原性をテストするため、候補ワクチンを、遺伝的バックグラウンド及びＭＨＣ対立遺伝子が異なる２つの異なるマウス株（Ｃ５７ＢＬ／６及びＢａｌｂ／ｃ）に注入した。両方のマウス株について、潜在的なＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスIIペプチドモチーフは、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ融合タンパク質のＭＡＧＥ部分のためのものであると理論的に予測された。
【００８３】
ａ）免疫化プロトコル：
各々の株の５匹のマウスに、ヒトに用いた濃度の１０分の１でＳＢＡＳ２中に調剤した５μｇのＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ又はそれのないものを、足のひらに、２週間間隔で２回、注入した。
ｂ）増殖アッセイ：
リンパ球を、最後の注入後２週間に、マウスからの脾臓又は膝窩リンパ節を破壊することにより調製した。２×１０5 細胞を９６ウェルプレートに３回重複して入れ、細胞を試験管内で７２時間、それ自体で又はラテックスマイクロビーズ上にコートした異なる濃度（１〜０．１μｇ／ml）のＨｉｓ−Ｍａｇｅ３で再刺激した。
【００８４】
ＳＢＡＳ−２製剤のみ又はＰＢＳを与えたマウスのリンパ球増殖応答と比べて、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質を注入したＣ５７ＢＬ／６又はＢａｌｂ／ｃマウスのいずれかからの脾臓細胞（図５及び７を参照のこと）及びリンパ節細胞（図６及び８を参照のこと）の両方で、ＭＡＧＥ−３特異的リンパ球増殖活性の増加が観察された。
【００８５】
更に、アジュバントＳＢＡＳ２中のＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓで免疫化したマウスからのリンパ球で、かなり高い増殖応答が得られた（図６及び８を参照のこと）。
ｃ）結論
ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓはマウスにおいて免疫原性であり、この免疫原性は、ＳＢＡＳ２アジュバント製剤の使用により増加させることができる。
【００８６】
２．抗体応答：
ａ）免疫化プロトコル
Ｂａｌｂ／ｃ又はＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＰＢＳ、又はＳＢＡＳ２、又は５μＧのＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ、又は５μＧのＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ＋ＳＢＡＳ２のいずれかで、２週間間隔で足のひら内注入により２回、免疫化した。
【００８７】
対照グループ及びテストグループの各々に３及び５の動物を用いた。
ｂ）間接ＥＬＩＳＡ：
２回目の注入後２週に、個々の血清を採取し、間接ＥＬＩＳＡにかけた。
２μＧ／mlの精製Ｈｉｓ ＭＡＧＥ−３をコートした抗原として用いた。ＰＢＳ＋１％新生ウシ血清中で、３７℃で１時間の飽和の後、その血清を飽和緩衝液中で逐次的に希釈（１／１０００で開始）し、４℃で一晩、又は３７℃で９０分、インキュベートした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％で洗った後、ビオチニル化ヤギ抗マウス全ＩｇＧ（１／１０００）又はヤギ抗マウスＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ２ｂ抗血清（１／５０００）を二次抗体として用いた。３７℃で９０分のインキュベーションの後、ペルオキシダーゼに連結したストレプトアビジンを加え、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジンペルオキシド）を基質として用いた。１０分後、その反応をＨ2 ＳＯ4 ０．５Ｍを加えることによりブロックし、そのＯ．Ｄ．を測定した。
【００８８】
ｃ）結果：
図９は、マウスの異なるグループ（Ｎ＝５／グループ）間で、曲線の中点に達するために必要とされる平均希釈にある、血清の相対的平均中点タイターを比較する。
これらの結果は、テストした両方のマウス株においてＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓのみの２回の注入の後に弱いＡｂ応答がマウントされるが、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−ＨｉｓをＳＢＡＳ２の存在下で注入した時にはより高い抗ＭＡＧＥ−３ Ａｂ濃度が形成されることを示す。これにより、２週間隔でのＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓの２回の注入のみで観察される高いＡｂ応答を作り出すのに十分である。
【００８９】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスで得られる応答と比べてＢａｌｂ／ｃマウスで観察されるより優れたＡｂ応答は、たとえＣ５７ＢＬ／６マウスで達成されるＡｂタイターが、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓのみの注入後よりＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ＋ＳＢＡＳ２の注入後でより高いとしても、ハプロタイプの差又はこれら２つの株の間のバックグラウンドの差によって説明することができる。
【００９０】
マウスの異なるグループにおけるワクチン接種後のＩｇサブクラス特異的抗ＭＡＧＥ−３応答は、図１０及び１１で見ることができ、これらは、血清の平均中点希釈の比較を供する。
アジュバントＳＢＡＳ２中のＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓをワクチン接種したマウスからでさえ、血清サンプルのいずれにおいてもＩｇＡもＩｇＭも検出されなかった。
【００９１】
対照的に、全ＩｇＧレベルは、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓのみをワクチン接種したマウスからの血清中で少し高く、ＳＢＡＳ２中のＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓを注入した動物の血清においてかなり増加した。
異なるＩｇＧサブクラス濃度の分析は、テストした全てのＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ２ｂ）のレベルが、Ａｇ又はアジュバントのみを注入したマウスにおいてのものよりアジュバントを加えたＡｇをワクチン接種したマウスにおいて高かったので、混合されたＡｂ応答がマウスにおいて誘導されたことを示す。
【００９２】
しかしながら、ＳＢＡＳ２の存在下でのＬｉｐｏＤ−ＭＡＧＥ−３でのワクチン接種後のこの混合されたＡｂ応答の性質は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｂがＢａｌｂ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウス各々の血清中に主に見い出されるので、マウス株に依存するようである。
３．アカゲザルにおけるリポプロテインＤ１／３ ＭＡＧＥ３−Ｈｉｓ＋ＳＢＡＳ２アジュバントの免疫原性
５匹のアカゲザル（Macaca Mulatta）の３つのグループを選択した。ＲＴＳ，Ｓ及びｇｐ１２０を陽性対照として用いた。
【００９３】
グループ：
グループ１ 右足：ＲＴＳ，Ｓ／ＳＢＡＳ２
左足：ＧＰ１２０／ＳＢＡＳ２
グループ２ 右足：ＲＴＳ，Ｓ／ＳＢ２６Ｔ
左足：ＧＰ１２０／ＳＢ２６Ｔ
グループ３ 右足：ＬｉｐｏＤ１／３ Ｍａｇｅ３ Ｈｉｓ／ＳＢＡＳ２
０日目に動物にワクチンを与え、２８日目にブーストし、８４日目にＭＡＧＥ３及びプロテインＤ成分の両方に対する抗体応答を決定するために採血した。ワクチンを、右足の後部にボーラス注入（０．５ml）で筋内に投与した。
【００９４】
少量の血液サンプルを１４日毎に採取した。３mlの非ヘパリン添加血液サンプルを大腿静脈から収集し、少くとも１時間、凝固させ、室温で１０分、２５００rpm で遠心した。
血清を除去して−２０℃で凍結し、特異的ＥＬＩＳＡによる抗体レベルの測定のために用いた。
【００９５】
９６ウェルマイクロプレート（maxisorb Nunc ）を、４℃で５μｇのＨｉｓ Ｍａｇｅ ３又はプロテインＤでコートした。ＰＢＳ ＮＣＳ １％での３７℃での１時間の飽和の後、ウサギ血清の連続希釈物を３７℃で１時間３０分、（１／１０で始めて）加え、ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎで３回、洗った後、抗ビオチニル化血清（Amersham ref RPN 1004. lot 88 ）を加えた（１／５０００）。プレートを洗い、ペルオキシダーゼ連結ストレプトアビジン（１／５０００）を３７℃で３０分、加えた。洗浄後、５０μｌのＴＭＢ（BioRad）を７分、加え、その反応をＨ2 ＳＯ4 で停止させ、ＯＤを４５０nmで測定した。中点希釈をSoftmaxProにより計算した。
【００９６】
抗体応答：
ＥＬＩＳＡによりＭＡＧＥ３に対する抗体応答の速度を追跡するために、１４日毎に少量の血液サンプルを採取した。結果は、ＬＰＤ１／３ Ｍａｇｅ３ Ｈｉｓ＋ＳＢＡＳ２の１回の注入後に、Ｍａｇｅ３特異的全Ｉｇタイターが低くなることを示し、同じサルでのＬｉｐｏＤ１／３ Ｍａｇｅ３＋アジュバントの２回目及び３回目の注入後に、５の動物のうち３つで見られた。少い応答のものは、３回の注入後でさえ陰性であり続けた。II後２８日又はIII 後に、抗体タイターは基底レベルに戻った。抗体のサブクラスはＩｇＭでなく主要なＩｇＧとして決定した。ＩｇＧへのスイッチは、Ｔヘルパー応答が誘発されていることを示唆する。プロテインＤ特異的抗体応答は、弱いか、Ｍａｇｅ３抗体応答と正確に平行している。
【００９７】
実施例VI：
１．ＬＰＤ−ＭＡＧＥ１ Ｈｉｓ
同様に、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−１−Ｈｉｓを調製した。そのアミノ酸及びＤＮＡ配列を配列番号：３及び４に示す。得られたタンパク質は、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質と同様に精製した。要約すると、細胞培養物をホモジナイズし、０．５％ Ｅｍｐｉｇｅｎ界面活性剤の存在下で４ＭグアニジンＨＣｌ及び０．５Ｍ β−メルカプトエタノールで処理した。その産物をろ過し、浸透物を０．６Ｍヨードアセトアミドで処理した。そのカルボキシアミド化画分をＩＭＡＣ（亜鉛キレート−セファロースＦＦ）クロマトグラフィーにかけた。そのカラムを平衡化し、４Ｍグアニジン、ＨＣｌ及びリン酸ナトリウム（２０mM、pH７．５）及び０．５％ Ｅｍｐｉｇｅｎを含む溶液で洗い、次にそのカラムをリン酸ナトリウム（２０mM、pH７．５）０．５％ Ｅｍｐｉｇｅｎ緩衝液中４Ｍ尿素を含む溶液で洗った。タンパク質を同じ緩衝液であるが、イミダゾールの濃度を増加させて（２０mM，４００mM及び５００mM）溶出した。
【００９８】
溶出液を４Ｍ尿素で希釈した。Ｑ−セファロースカラムを平衡化し、０．５％ Ｅｍｐｉｇｅｎの存在下で２０mMリン酸緩衝液（pH７．５）中４Ｍ尿素で洗った。界面活性剤を含まない同じ緩衝液で２回目の洗浄を行った。同じ緩衝液であるがイミダゾールの濃度を増加させて（１５０mM，４００mM，１Ｍ）タンパク質を溶出した。その溶出液を限外ろ過した。
【００９９】
実施例VII ：
発現プラスミドｐＲＩＴ１４４２６の作製及びＮＳ１−ＭＡＧＥ−３ Ｈｉｓを生産するための宿主株ＡＲ５８の形質転換：
タンパク質デザイン：
大腸菌内で発現させるべき融合タンパク質ＮＳ１，ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓのデザインを図１２に示す。
【０１００】
生じたタンパク質の一次構造は配列番号：５に記載の配列を有する。
上述のタンパク質デザインに対応するコーディング配列（配列番号：６）を大腸菌発現プラスミド中のλｐＬプロモーターの制御下においた。
ＮＳ1 −ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ融合タンパク質の形成のためのクローニングストラテジー
出発材料は、ＭＡＧＥ−３遺伝子のためのコーディング配列を含む、Ludwig InstituteからのDr.Tierry Boonから受け取ったｃＤＮＡプラスミド、及びインフルエンザからのＮＳ1 （非構造タンパク質）コーディング領域の８１ａａを含むベクターＰＭＧ８１であった。
【０１０１】
図１３に概説するクローニングストラテジーは以下のステップを含む：
ａ）オリゴヌクレオチドセンス：５′gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct、及びオリゴヌクレオチドアンチセンス：５′gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa を用いて、プラスミドｃＤＮＡ ＭＡＧＥ−３内に供される配列のＰＣＲ増幅。
【０１０２】
この増幅はＮ末端において以下の改変を導く：最初の５つのコドンの大腸菌コドン使用への変化、位置１におけるＰｒｏコドンのＡｓｐコドンでの置換、５′末端でのＮｃｏＩ部位の導入及び２つのＧｌｙコドン及び７つのＨｉｓコドン、次のＸｂａＩ部位のＣ末端での最後の付加。
ｂ）先に増幅したフラグメントのインビトロゲンのＴＡクローニングベクターへのクローニング及び中間体ベクターｐＲＩＴ１４６４７の調製。
【０１０３】
ｃ）プラスミドｐＲＩＴ１４６４７からのＮｃｏＩ−ＸｂａＩフラグメントの切り出し及びベクターｐＲＩＴ ＰＭＧ８１へのクローニング。
ｄ）宿主株ＡＲ５８の形質転換。
ｅ）ＮＳ１−ＭＡＧＥ３−Ｈｉｓ融合タンパク質を発現するプラスミドｐＲＩＴ１４４２６（図１４を参照）を含む大腸菌株形質転換体の選択及びキャラクタリゼーション。
【０１０４】
組換えＮＳ1 −ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ（ｐＲＩＴ１４４２６）のキャラクタリゼーション
細菌を、５０μｇ／mlのカナマイシンを補給したＬＢ培地で、３０℃で増殖させた。その培養がＯＤ＝０．３（６２０nm）に達した時に、温度を４２℃に上げることにより熱誘導を行った。
【０１０５】
４時間の誘導後、細胞を収集し、ＰＢＳに再度懸濁し、フレンチプレスに３回、通すことにより（分解により）溶解した。遠心（１００，０００ｇで６０分）の後、ペレット上清及び全抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質をクーマシーＢ１染色したゲルにおいて可視化し、ここでその融合タンパク質は全大腸菌タンパク質の約１％を表した。組換えタンパク質は、４４．９Ｋの見掛けＭＷで単一バンドとして現れた。その融合タンパク質は、抗ＮＳ１モノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット分析により同定した。
【０１０６】
実施例VIII：
ウサギ／マウス免疫化のためのＮＳ１−ＭＡＧＥ３−Ｈｉｓ（大腸菌）の精製。
精製スキーム：
抗原を精製するために以下の精製スキームを用いた：
細胞の溶解＋遠心
↓
抗原可溶化＋遠心
↓
Ｎｉ2 ＋ＮＴＡアガロース
↓
濃縮
↓
Prep cell
↓
ＴＣＡ沈殿及びＰＢＳ可溶化
ａ．溶解
細菌細胞（２３ｇ）をＲａｎｎｉｅ（ホモジナイザー）により２０３mLの５０mM ＰＯ4 pH７緩衝液に溶かし、そのライゼートを３０分、１５，０００rpm でＪＡ２０ローターで遠心した。
【０１０７】
その上清を捨てた。
ｂ．抗原可溶化
ペレットの１／３を３４mlの１００mM ＰＯ4 −６Ｍ ＧｕＨＣｌ pH７中４℃でＯ／Ｎに再び可溶化した。ＪＡ２０ローターで１５，０００rpm で３０分の遠心の後、ペレットを捨てて、上清をＩＭＡＣにより更に精製した。
【０１０８】
ｃ．アフィニティークロマトグラフィー：Ｎｉ2 ＋ＮＴＡアガロース（Qiagen）
カラム容量：１５mL（１６mm×７．５cm）
パッキング緩衝液：０．１Ｍ ＰＯ4 −６Ｍ ＧｕＨＣｌ pH７
サンプル緩衝液：同上
洗浄緩衝液：０．１Ｍ ＰＯ4 −６Ｍ ＧｕＨＣｌ pH７
０．１Ｍ ＰＯ4 −６Ｍ尿素 pH７
溶出：６Ｍ尿素を補給した０．１Ｍ ＰＯ4 緩衝液 pH７中のイミダゾール勾配（０→２５０mM）。
【０１０９】
流速：２mL／分
ａ．濃縮：
ＩＭＡＣ溶出物の抗原陽性画分（１６０mL）をプールし、Ｆｉｌｔｒｏｎ膜（Ｏｍｅｇａ型カットオフ１０，０００）でＡｍｉｃｏｎ撹拌セル内で５mLに濃縮した。この段階の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価して約７０％である。
【０１１０】
ｂ．調製用電気泳動（Prep Cell Biorad）
２．４mLの濃縮サンプルを０．８mLの還元サンプル緩衝液中で煮沸し、１０％アクリルアミドゲルに充填した。その抗原を、４％ ＳＤＳを補給したＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液 pH８．３中に溶出し、Ｎｓ1 −ＭＡＧＥ３ Ｈｉｓ陽性画分をプールした。
【０１１１】
ａ．ＴＣＡ沈殿：
抗原をＴＣＡで沈殿させ、ＪＡ２０ローターで１５，０００rpm で２０℃、遠心した後、上清を捨てた。そのペレットをＰＢＳ緩衝液 pH７．４に再び溶かした。
そのタンパク質は、凍結／解凍後にＰＢＳに可溶性であり、３７℃で３時間、保存した後にいずれの分解も示さず、そしてＳＤＳ（１２．５％ ＰＡＧＥ）により測定して約５０，０００ダルトンの見掛け分子量を有する。
【０１１２】
実施例IX：
融合タンパク質ＣＬＹＴＡ−ＭＡＧＥ−１−Ｈｉｓテールを発現する大腸菌株の調製
１．発現プラスミドｐＲＩＴ１４６１３の作製及び宿主株ＡＲ５８の形質転換：
タンパク質デザイン：
大腸菌内で発現させる融合タンパク質Ｃｌｙｔａ−Ｍａｇｅ−１−Ｈｉｓのデザインを図１５に示す。
【０１１３】
生じたタンパク質の一次構造は配列番号：７に示す配列を有する。
上述のタンパク質デザインに相当するコーディング配列（配列番号：８を参照のこと）を大腸菌発現プラスミド中のλｐＬプロモーターの制御下においた。
クローニング：
出発材料は、ストレプトコッカス・ニューモニエからのＬｙｔＡコーディング領域の１１７Ｃ末端コドンを含むベクターＰＣＵＺ１、及び我々が、Ludwig InstituteからDr.Thierry Boon から頂いたプラスミドからの先にサブクローニングしたＭＡＧＥ−１遺伝子ｃＤＮＡを有するベクターｐＲＩＴ１４５１８であった。
【０１１４】
ＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−１−Ｈｉｓタンパク質の発現のためのクローニングストラテジー（図１６の概説を参照のこと）は以下のステップを含む：
２．ＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−１−Ｈｉｓコーディング配列モジュールの調製：
ａ）最初のステップは、ＣＬＹＴＡ配列をＮｄｅＩ−ＡｆｌIII 制限部位に隣接させることを予定したＰＣＲ増幅であった。そのＰＣＲ増幅は、プラスミドＰＣＵＺ１テンプレート及びプライマーとしてオリゴヌクレオチドセンス：５′tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac 、及びオリゴヌクレオチドアンチセンス：５′GCC AGA CAT GTC CAA TTC TGG CCT GTC TGC CAG を用いて行った。これは、３７８ヌクレオチド長のＣＬＹＴＡ配列の増幅を導く。
【０１１５】
ｂ）第２のステップは、ＣＬＹＴＡ配列をＭＡＧＥ−１−Ｈｉｓ配列に連結して融合タンパク質のためのコーディング配列を作ることであった。このステップはＮｄｅＩ−ＡｆｌIII 制限フラグメントの切り出し及びＮｄｅＩ及びＮｃｏＩにより先に開裂したベクターｐＲＩＴ１４５１８（ＮｃｏＩ及びＡｆｌIII に適合）への挿入を含み、プラスミドｐＲＩＴ１４６１３を作り出す。
【０１１６】
ｃ）宿主細胞ＡＲ５８の形質転換
ｄ）プラスミドｐＲＩＴ１４６１３を含む大腸菌形質転換体（ＫＡＮ耐性）の選択及びキャラクタリゼーション（図１６を参照）。
１．組換えタンパク質ＣＬＹＴＡ−ＭＡＧＥ−１−Ｈｉｓ（ｐＲＩＴ１４６１３）のキャラクタリゼーション：
細菌を、３０℃で５０μｇ／mlカナマイシンを補給したＬＢ培地で増殖させた。その培養物がＯＤ＝０．３（６２０nm）に達した時に、温度を３８℃に上げることにより熱誘導を行った。
【０１１７】
４時間の誘導の後、細胞を収集し、ＰＢＳ中に懸濁し、そしてワンショット（one shot）により（分解により）溶解した。遠心の後、ペレット上清及び全抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質をクーマシーＢ１染色したゲルで可視化し、ここでその融合タンパク質は全大腸菌タンパク質の約１％を示した。組換えタンパク質は約４９kDの見掛けＭＷの単一バンドとして現れた。融合タンパク質を、抗Ｍａｇｅ−１ポリクローナル抗体を用いたウェスタン・ブロットにより同定した。
【０１１８】
（ナリジクス酸誘導のために役立つ）長λｐＬプロモーター及びＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−１コーディング配列ｐＲＩＴ１４６１４により構成される発現ユニットの再構成：
長いＰＬプロモーター及びＣＬＹＴＡ配列の一部を含むＥｃｏＲＩ−ＮＣＯ1 制限フラグメントをプラスミドｐＲＩＴ ＤＶＡ６から調製し、プラスミドｐＲＩＴ１４６１３のＥｃｏＲＩ−ＮＣＯ1 部位の間に挿入した。
【０１１９】
組換えプラスミドｐＲＩＴ１４６１４を得た。
融合タンパク質ＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−１−Ｈｉｓをコードする組換えプラスミドｐＲＩＴ１４６１４（図１７を参照）を用いて大腸菌ＡＲ１２０を形質転換した。Ｋａｎ耐性候補株を選択し、キャラクタライズした。
組換えタンパク質のキャラクタリゼーション：
細菌を５０mg／mlのカナマイシンを補給したＬＢ培地で３０℃で増殖させた。その培養物がＯＤ＝４００（６２０nm）に達した時に、ナリジクス酸を６０mg／mlの最終濃度まで加えた。
【０１２０】
４時間の誘導の後、細胞を収集し、ＰＢＳに再び懸濁して、分解（disintegration）（分解ＣＬＳ“ワン・ショット”型）により溶解した。遠心後、ペレット上清及び全抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質をクーマシーブルー染色したゲルで可視化した。ここで、その融合タンパク質は全大腸菌タンパク質の約１％を示した。その融合タンパク質をウサギ抗Ｍａｇｅ−１ポリクローナル抗体を用いてウェスタンブロット分析により同定した。組換えタンパク質は約４９kDの見掛けＭＷの単一バンドとして現れた。
【０１２１】
実施例Ｘ：
ＣＬＹＴＡ−ＭＡＧＥ−３−ＨＩＳ
Ａ：腫瘍拒絶組換え抗原：Ｃ−ｌｙｔＡ融合パートナーが可溶性タンパク質の発現を導く融合タンパク質ＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−３−Ｈｉｓはアフィニティータグとして機能し、有用なＴ−ヘルパーを供する。
【０１２２】
融合タンパク質ＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−３−Ｈｉｓテールを発現する大腸菌の調製
発現プラスミドｐＲＩＴ１４６４６の作製及び宿主株ＡＲ１２０の形質転換：
タンパク質デザイン：
大腸菌内で発現させる融合タンパク質Ｃｌｙｔａ−Ｍａｇｅ−３−Ｈｉｓのデザインを図１８に示す。
【０１２３】
得られたタンパク質の一次構造は配列番号：９に記載の配列及び配列番号：１０に記載のコーディング配列を有する。
上述のタンパク質デザインに相当するコーディング配列を大腸菌発現プラスミド内のλｐＬプロモーターの制御下においた。
クローニング：
出発材料は、Gene 43 (1986) p 265-272に記載されるストレプトコッカス・ニューモニエからのＬｙｔＡコーディング領域の１１７Ｃ末端コドンを含むベクターＰＣＵＺ１、及び我々が、Ludwig InstituteからDr.Tierry Boonから頂いたプラスミドからのＭＡＧＥ−３遺伝子ｃＤＮＡを先にサブクローニングしたベクターｐＲＩＴ１４４２６であった。
【０１２４】
ＣＬＹＴＡ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質の発現のためのクローニングストラテジー（図１９の概説を参照のこと）は以下のステップを含む。
１．ＣＬＹＴＡ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓコーディング配列モジュールの調製：
１．１．最初のステップはＡｆｌII及びＡｆｌIII 制限部位にＣＬＹＴＡを隣接させることを予定したＰＣＲ増幅であった。ＰＣＲ増幅は、テンプレートとしてプラスミドＰＣＵＺ１及びプライマーとしてオリゴヌクレオチドセンス：５′tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac 、及びオリゴヌクレオチドアンチセンス：５′ccc aca tgt cca gac tgc tgg cca att ctg gcc tgt ctg cca gtg を用いて行った。これは、４２７ヌクレオチド長ＣＬＹＴＡ配列の増幅を導く。先に増幅したフラグメントをInvitrogenのＴＡクローニングベクターにクローン化して、中間体ベクターｐＲＩＴ１４６６１を得た。
【０１２５】
１．２．第２のステップは、ＣＬＹＴＡ配列をＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ配列に連結して融合タンパク質のためのコーディング配列を作り出すことであった。このステップは、ＡｆｌII−ＡｆｌIII フラグメントの切り出し及びＡｆｌII及びＮｃｏＩ（ＮｃｏＩ及びＡｆｌII適合）制限酵素により先に開裂したベクターｐＲＩＴ１４４２６に挿入することを含み、プラスミドｐＲＩＴ１４６６２を作り出した。
【０１２６】
２．（ナリジクス酸誘導のために役立つ）長いλｐＬプロモーター及びＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−３コーディング配列により構成される発現ユニットの再構成
短いｐＬプロモーター及びＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−３−Ｈｉｓコーディング配列を含むＢｇｌII−ＸｂａＩ制限フラグメントをプラスミドｐＲＩＴ１４６６２から調製し、プラスミドＴＣＭ６７（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ９２／０１８２７に記載される、アンピシリンに対する耐性、及び長いλｐＬプロモーターを含むｒＢＲ３２２誘導体）のＢｇｌII−ＸｂａＩ部位の間に挿入した。プラスミドｐＲＩＴ１４６０７を得た。
【０１２７】
融合タンパク質Ｃｌｙｔａ−Ｍａｇｅ−３ Ｈｉｓをコードする組換えプラスミドｐＲＩＴ１４６０７を用いて大腸菌ＡＲ１２０（Mottら、1985, Proc.Natl.Acad.Sci, 82: 88）を形質転換した。アンピシリン耐性候補株を選択し、キャラクタライズした。
３．プラスミドｐＲＩＴ１４６４６の調製：
最後に、ｐＲＩＴ１４６０7 に類似するがカナマイシン選択を有するプラスミドを作製した（ｐＲＩＴ１４６４６）。
【０１２８】
組換えタンパク質のキャラクタリゼーション：
細菌を５０mg／mlのカナマイシンを補給したＬＢ培地で３０℃で増殖させた。その培養物がＯＤ＝４００（６００nm）に達した時に、ナリジクス酸を６０ｇ／mlの最終濃度まで加えた。
４時間の誘導の後、細胞を収集し、ＰＢＳに懸濁し、分解（分解ＣＬＳ“ワン・ショット”型）により溶解した。遠心の後、ペレット上清及び全抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質をクーマシーブルーで染色したゲルで可視化し、ここでその融合タンパク質は全大腸菌タンパク質の約１％を示した。その融合タンパク質は、ウサギ抗Ｍａｇｅ−３ポリクローナル抗体を用いてウェスタンブロット分析により同定した。組換えタンパク質は約５８kDの見掛けＭＷの単一バンドとして表れた。
【０１２９】
実施例XI：
組換えタンパク質ＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−３ Ｈｉｓの精製：
組換え細菌ＡＲ１２０（ｐＲＩＴ１４６４６）を３０℃で、フェド・バッチ条件下で２０リッター発酵槽中で増殖させた。組換えタンパク質の発現は、ナリジクス酸を６０ｇ／mlの最終濃度まで加えることにより誘導した。発酵の終りに細胞を収集し、フレンチプレス破砕機（２０，０００psi ）に２回、通すことにより６０ ＯＤ／６００に溶解した。溶解した細胞を４℃で１５，０００ｇで２０分、ペレット化した。組換えタンパク質を含む上清を、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ pH７．６（緩衝液Ａ）で予め平衡化した交換DEAE Sepharose CL6B 樹脂（Pharmacia ）に充填した。緩衝液Ａでのカラム洗浄の後、融合タンパク質を緩衝液Ａ中２％コリンにより溶出した。抗Ｍａｇｅ−３抗体を用いてウェスタン・ブロット分析により表した陽性抗原画分をプールした。ＤＥＡＥで溶出した抗原を０．５％ Ｅｍｐｉｇｅｎ ＢＢ（両性イオン界面活性剤）に及び０．５Ｍ ＮａＣｌにし、次に０．５％ Ｅｍｐｉｇｅｎ ＢＢ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０mMリン酸緩衝液 pH７．６（緩衝液Ｂ）で予め平衡化したIon Metal Affinityクロマトグラフィーカラムに充填した。
【０１３０】
ＩＭＡＣカラムを２８０nmの吸光度がベースラインに達するまで緩衝液Ｂで洗った。界面活性剤を除去するためのＥｍｐｉｇｅｎ ＢＢを含まない緩衝液Ｂ（緩衝液Ｃ）での第２の洗浄を行い、次に抗原を緩衝液Ｃ中のイミダゾール勾配０〜２５０mMにより溶出した。
０．０９０〜０．２５０Ｍイミダゾール画分をプールし、１０kDa Ｆｉｌｔｒｏｎオメガ膜で濃縮し、次にＰＢＳ緩衝液に対して透析した。
【０１３１】
結論：
我々は、融合タンパク質ＬＰＤ−ＭＡＧＥ３−Ｈｉｓがマウスにおいて免疫原性であること、及びこの免疫原性（増殖性応答及び抗体応答）は、上述のアジュバントの使用により更に増加させることができることを証明した。精製は、ジスルフィド結合を形成するチオールを誘導化することにより増強することができる。
【０１３２】
我々は、アジュバントの存在下でのＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓでのワクチン接種によりより優れた抗体応答が誘発されることも証明した。Ｃ５７ＢＬ／６の血清中に見い出される主要なアイソタイプがＩｇＧ２ｂであることは、ＴＨ１型免疫応答が生じたことを示唆する。
ヒトにおいてアジュバントを加えない製剤中のＬＰＤ−ＭＡＧＥ３−Ｈｉｓで患者を臨床的に処置すると、黒色腫を除去した。
【０１３３】
【表２】
【０１３４】
【表３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌ワクチン治療に利用できる腫瘍関連抗原を含むタンパク質誘導体に関する。特に、本発明の誘導体は、Ｔヘルパーエピトープを供する免疫学的融合パートナー、例えばヘモフィルス・インフルエンゼ（Haempophilus influenzae ）ＢからのプロテインＤの脂質化型に連結したＭＡＧＥ遺伝子のファミリー（例えばＭＡＧＥ−３，ＭＡＧＥ−１）によりコードされた抗原を含む融合タンパク質；抗原のジスルフィド架橋が還元されて生じたチオールがブロッキングされている化学的に改変されたＭＡＧＥタンパク質、及びアフィニティータグが供され及び／又はジスルフィド架橋形成を防ぐよう遺伝子改変された遺伝子的に改変されたＭＡＧＥタンパク質を含む。ＭＡＧＥタンパク質を精製するため及び所定範囲の癌、例えば黒色腫、乳癌、膀胱癌、肺癌、ＮＳＣＬＣ、頭部の癌及び扁平上皮癌、結腸癌及び食道癌を治療するためのワクチンを調剤するための方法も記載される。
【背景技術】
【０００２】
ＭＡＧＥ遺伝子のファミリーによりコードされる抗原は（悪性黒色腫を含む）黒色腫細胞及びＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）を含むいくつかの他の癌、頭部及び首扁平上皮癌、膀胱移行上皮癌及び食道癌で主に発現されるが、精巣及び胎盤を除く正常な組織では検出できない（Gaugler, 1994; Weyhants, 1994; Patard 1995）。ＭＡＧＥ−３は黒色腫の６９％で発現され（Gaugler, 1994 ）、ＮＳＣＬＣの４４％（Yoshimatsu 1988 ）、頭部及び首扁平上皮癌の４８％、膀胱移行上皮癌の３４％、食道癌の５７％、直腸癌の３２％、及び乳癌の２４％（Van Pel, 1995; Inoue, 1995, Fujie 1997; Nishimura 1997）においても検出されている。ＭＡＧＥタンパク質を発現する癌はＭＡＧＥ関連腫瘍として知られている。
【０００３】
ヒト黒色腫細胞の免疫原性は黒色腫細胞及び自己由来リンパ球の混合培養物を用いる実験においてエレガントに証明されている。これらの培養物は自己由来黒色腫細胞を排他的に溶解することができるが、自己由来繊維芽細胞も自己由来ＥＢＶ形質転換リンパ球も溶解することができない特定の細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）をしばしば作り出す（Knuth, 1984; Anichini, 1987 ）。これらのＣＴＬクローンにより自己由来黒色腫細胞上で認識される抗原のいくつかは、ＭＡＧＥファミリーのものを含めて現在、同定されている。
【０００４】
自己由来黒色腫細胞上の特定のＣＴＬによりその認識を介して規定され得る最初の抗原はＭＺ２−Ｅと呼ばれ（Van den Eynde, 1989 ）、遺伝子ＭＡＧＥ−１によってコードされる（Van der Bruggen, 1991 ）。ＭＺ２−Ｅに対するＣＴＬは、これらの細胞がＨＬＡ．Ａ１対立遺伝子を有することを条件に自己由来及び他の患者からのＭＺ２−Ｅ陽性黒色腫細胞を認識し、溶解する。
【０００５】
ＭＡＧＥ−１遺伝子は染色体Ｘ上に位置しそれらのコーディング配列において互いに６４〜８５％の相同性を有する１２の密接に関連した遺伝子、ＭＡＧＥ１，ＭＡＧＥ２，ＭＡＧＥ３，ＭＡＧＥ４，ＭＡＧＥ５，ＭＡＧＥ６，ＭＡＧＥ７，ＭＡＧＥ８，ＭＡＧＥ９，ＭＡＧＥ１０，ＭＡＧＥ１１，ＭＡＧＥ１２のファミリーに属する。これらは時折、ＭＡＧＥ Ａ１，ＭＡＧＥ Ａ２，ＭＡＧＥ Ａ３，ＭＡＧＥ Ａ４，ＭＡＧＥ Ａ５，ＭＡＧＥ Ａ６，ＭＡＧＥ Ａ７，ＭＡＧＥ Ａ８，ＭＡＧＥ Ａ９，ＭＡＧＥ Ａ１０，ＭＡＧＥ Ａ１１，ＭＡＧＥ Ａ１２（ＭＡＧＥ Ａファミリー）として知られる。他の２つのグループのタンパク質もＭＡＧＥファミリーの一部である。但しより遠い関係にある。これらはＭＡＧＥ Ｂ及びＭＡＧＥ Ｃグループである。ＭＡＧＥ Ｂファミリーは、（ＭＡＧＥ Ｘｐ１及びＤＡＭ１０としても知られる）ＭＡＧＥ Ｂ１，（ＭＡＧＥ Ｘｐ２及びＤＡＭ６としても知られる）ＭＡＧＥ Ｂ２，ＭＡＧＥ Ｂ３及びＭＡＧＥ Ｂ４を含む。ＭＡＧＥ Ｃファミリーは、現在、ＭＡＧＥ Ｃ１及びＭＡＧＥ Ｃ２を含む。一般的に、ＭＡＧＥタンパク質はそのタンパク質のＣ末端に対して位置したコア配列のサインを含むとして定義することができる（例えばＭＡＧＥ Ａ１の３０９アミノ酸タンパク質に関して、コアのサインはアミノ酸１９５〜２７９に相当する）。
【０００６】
従ってコアのサインの共通パターンは次の通りであり、ここでｘはいずれかのアミノ酸を指し、小文字の残基は保存され（保存性変異を許容する）、大文字の残基は完全に保存される。
コア配列のサイン
LixvL(2x)I(3x)g(2x)apEExiWexl(2x)m(3-4x)Gxe(3-4x)gxp(2x)llt(3x)VqexYLxYxqVPxsxP(2x)yeFLWGprA(2x)Et(3x)kv
保存性置換は公知であり、一般に配列アラインメントプログラムにおいてデフォルトスコアリングマトリックスとして設定される。これらのプログラムには、PAM250 (Dayhoft M.O.ら、(1978), “A model of evolutionary changes in proteins¨, In“Atlas of Protein sequence and structure¨ 5 (3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington、及びBlosum 62 (Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992),“Amino acid substitution matricies from protein blocks¨), Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919 がある。
【０００７】
一般的に、以下のグループ内の置換が保存性置換であるが、グループ間の置換は非保存性であると考えられる。グループは次の通りである：
ｉ）アスパラテート／アスパラギン／グルタメート／グルタミン
ii）セリン／トレオニン
iii) リシン／アルギニン
iv）フェニルアラニン／チロシン／トリプトファン
ｖ）ロイシン／イソロイシン／バリン／メチオニン
vi）グリシン／アラニン
一般に及び本発明の文脈において、ＭＡＧＥタンパク質はＭＡＧＥ Ａ１のアミノ酸１９５〜２７９と、そのコア領域において約５０％、同一であろう。
【０００８】
いくつかのＣＴＬエピトープがＭＡＧＥ−３タンパク質上で同定されている。１つのこのようなエピトープであるＭＡＧＥ−３．Ａ１はＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ．Ａ１と会合して提示される時にＣＴＬに特異的なエピトープを構成するＭＡＧＥ−３タンパク質のアミノ酸１６８〜１７６の間に位置したノナペプチドである。現在、２つの更なるＣＴＬエピトープが、黒色腫細胞及び自己由来リンパ球の混合培養物中でＣＴＬ応答を開始する能力によりＭＡＧＥ−３タンパク質のペプチド配列上で同定されている。これら２つのエピトープはＨＬＡ．Ａ２（Van der Bruggen, 1994 ）及びＨＬＡ．Ｂ４４（Herman, 1996）対立遺伝子の各々についての特定の結合モチーフを有する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ＭＡＧＥタンパク質誘導体を供する。このような誘導体は所定範囲の腫瘍型の治療のために適した治療用ワクチン製剤に用いるために好適である。
本発明の一実施形態において、本誘導体は異種のパートナーに連結したＭＡＧＥタンパク質ファミリーからの抗原を含む融合タンパク質である。そのタンパク質は化学的にコンジュゲートされ得るが、好ましくは非融合タンパク質と比べて増加したレベルが発現系で生産されるのを許容する組換え融合として発現される。これにより、融合パートナーは、Ｔヘルパーエピトープ（免疫学的融合パートナー）、好ましくはヒトにより認識されるＴヘルパーエピトープを供するのを補助し、又はネイティブ組換えタンパク質より高収率でタンパク質を発現するのを補助し得る（発現エンハンサー）。好ましくは融合パートナーは、免疫学的融合パートナー及び発現増強パートナーの両方であろう。
【００１０】
本発明の好ましい形態において、免疫学的融合パートナーはグラム陰性細菌ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenza ）Ｂの表面タンパク質であるプロテインＤから得られる（ＷＯ９１／１８９２６）。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、そのタンパク質のおおよそ最初の１／３、特におおよそ最初のＮ末端１００〜１１０アミノ酸を含む。好ましくは、プロテインＤ誘導体は脂質化される。好ましくは、リポプロテインＤ融合パートナーの最初の１０９残基がＮ末端上に含まれ、更なる外来Ｔ細胞エピトープと共にワクチン候補抗原を供し、大腸菌内で発現レベルを増加させる（これにより発現エンハンサーとしても機能する）。脂質のテールは、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を確実にする。
【００１１】
他の融合パートナーには、インフルエンザウイルスからの非構造タンパク質ＮＳ１（ヘマグルチニン）がある。典型的には、Ｎ末端８１アミノ酸が利用される。但しそれらがＴヘルパーエピトープを含む限り異なるフラグメントを用いることができる。
別の実施形態において、免疫学的融合パートナーはＬＹＴＡとして知られるタンパク質である。好ましくはその分子のＣ末端部分が用いられる。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格内の特定の結合を特異的に分解するオートリシンである（ｌｙｔＡ遺伝子によりコードされる（Gene, 43 (1986) ページ265 〜272 ））Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、アミダーゼＬＹＴＡを合成するストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）から得られる。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインはコリンに対する又はＤＥＡＥのような特定のコリンアナログに対するアフィニティーの原因である。この特性は融合タンパク質の発現のために役立つ大腸菌Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発のために活用されている。アミノ末端にＣ−ＬＹＴＡフラグメントを含むハイブリッドタンパク質の精製は記述されている（Biotechnolosy: 10, (1992) ページ795 〜798 ）。本明細書に用いる場合、好ましい実施形態は残基１７８で始まるＣ末端中に見い出されるＬｙｔａ分子の反復部分を利用する。特に好ましい形態は残基１８８〜３０５を組み込む。
【００１２】
上述の免疫学的融合パートナーは発現を補助するのにも有利である。特に、このような融合体はネイティブの組換えＭＡＧＥタンパク質より高収率で発現される。
臨床セッティングにおけるこのような構成物は、本発明者により黒色腫を治療することができることが示されている。１つの場合、段階IVの黒色腫はアジュバントを添加しないlipo P 1/3 MAGE 3 His タンパク質の２回の投与後に転移物を取り除いた。
【００１３】
従って、その実施形態において、本発明は、免疫学的融合パートナーに連結したＭＡＧＥファミリーからの腫瘍関連抗原を含む融合タンパク質を供する。好ましくは、その免疫学的融合パートナーはプロテインＤ又はそのフラグメント、最も好ましくはリポプロテインＤである。ＭＡＧＥタンパク質は好ましくはＭＡＧＥ Ａ１又はＭＡＧＥ Ａ３である。リポプロテインＤ部分は好ましくはリポプロテインＤの最初の１／３を含む。
【００１４】
本発明のタンパク質は好ましくは大腸菌内で発現される、好ましい実施形態において、タンパク質は、アフィニティータグ、例えば５〜９、好ましくは６のヒスチジン残基を含むヒスチジンテールと共に発現される。これらは精製を補助するのに有利である。
本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸も供する。このような配列は好適な発現ベクターに挿入してＤＮＡ／ＲＮＡワクチン接種のために用い又は好適な宿主内で発現させることができる。本核酸を発現する微生物ベクターはワクチンとして用いることができる。このようなベクターには、例えばポックスウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、リステリア及びモナルファージ（monarphage）がある。
【００１５】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は標準的なＤＮＡ合成技術を用いて、例えばD.M.Robertら（Biochemistry 1985, 24, 5090-5098）により記載される酵素連結法により、化学合成により、試験管内酵素重合により、もしくは例えば熱安定性ポリメラーゼを利用するＰＣＲ技術により、又はこれらの技術の組合せにより合成することができる。
【００１６】
ＤＮＡの酵素による重合は、必要に応じて１０°〜３７℃の温度で、一般に５０μＬ又はそれ未満の容量で、ヌクレオチドトリホスフェートｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含む好適な緩衝液中で、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）のようなＤＮＡポリメラーゼを用いて試験管内で行うことができる。ＤＮＡフラグメントの酵素による連結は、４℃〜環境温度の温度で、一般に５０ml又はそれ未満の容量で、好適な緩衝液、例えば０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ（pH７．４）、０．０１Ｍ ＭｇＣｌ2 、０．０１Ｍジチオトレイトール、１mMスペルミジン、１mM ＡＴＰ及び０．１mg／mlウシ血清アルブミン中で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼのようなＤＮＡリガーゼを用いて行うことができる。ＤＮＡポリマー又はフラグメントの化学合成は、‘Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments-A Laboratory Manual’(ed. H.G.Gassen and A.Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982) に、又は他の科学文献、例えばM.J.Gait, H.W.D.Matthes, M.Singh, B.S.Sproat、及びR.C.Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S.Sproat、及びW.Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D.Matteucci 及びM.H.Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D.Matteucci及びM.H.Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P.Adams ら、Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D.Sinha, J.Biernat, J.McMannus、及びH.Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539;並びにH.W.D.Matthes ら., EMBO Journal, 1984, 3, 801 に記載される方法のような固相技術を用いて、慣用的なホスホトリエステル、ホスファイト又はホスホルアミジト化学により行うことができる。
【００１７】
本発明の方法は、Maniatisら、Molecular Cloning-A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989に記載されるような慣用的な組換え技術により行うことができる。
特に、その方法は、
ｉ）本タンパク質又はその免疫原性誘導体をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリマーを宿主内で発現することができる複製可能又は組込み可能発現ベクターを調製し；
ii）該ベクターで宿主細胞を形質転換し；
iii) 該形質転換された宿主細胞を、前記ＤＮＡポリマーの発現が前記タンパク質を生産することができる条件下で培養し；そして
iv）該タンパク質を回収すること
を含み得る。
【００１８】
用語“形質転換”は、本明細書において、外来ＤＮＡを宿主細胞に導入することを意味する。これは、例えば、好適なプラスミド又はウイルスで、例えばGenetic Engineering: Eds. S.M.Kingsman及びA.J.Kingsman: Blackwell Scientific Publications; Oxford, England, 1988に記載されるような慣用的な技術を用いて、形質転換、トランスフェクション又は感染により達成することができる。用語“形質転換された”又は“形質転換体”は、以後、関心の外来遺伝子を含みかつそれを発現する生じた宿主細胞に適用するであろう。
【００１９】
本発現ベクターは新規であり、本発明の一部を形成する。
複製可能な発現ベクターは宿主細胞に適合したベクターを開裂して完全なレプリコンを有する直鎖ＤＮＡセグメントを供し、そしてその直鎖セグメントを、その直鎖セグメントと一緒に要求される産物をコードする１又は複数のＤＮＡ分子、例えば本発明のタンパク質をコードするＤＮＡポリマー又はその誘導体と、連結条件下で組み合わせることにより本発明に従って調製することができる。
【００２０】
これにより、ＤＮＡポリマーは、必要に応じて予め形成し、又はベクターの作製の間に形成することができる。
ベクターの選択は、部分的に宿主細胞により決定されよう。それは原核生物でも真核生物であってもよいが、好ましくは大腸菌又はＣＨＯ細胞である。適切なベクターには、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド及び組換えウイルスがある。
【００２１】
複製可能発現ベクターの調製は、例えば上述のManiatisらに記載される手順により、ＤＮＡの制限、重合及び連結のための適切な酵素で便利に行うことができる。
組換え宿主細胞は、本発明に従って、形質転換条件下で宿主細胞を本発明の複製可能発現ベクターで形質転換することにより調製される。適切な形質転換条件は慣用的であり、例えば上述のManiatisら又は“DNA Cloning¨ Vol.II, D.M.Glover ed., IRL Press Ltd, 1985に記載される。
【００２２】
形質転換条件の選択は宿主細胞により決定される。これにより、大腸菌のような細菌宿主細胞は、ＣａＣｌ2 の溶液で（Cohen ら、Proc.Nat.Acad.Sci., 1973, 69, 2110）又はＲｂＣｌ，ＭｎＣｌ2 、酢酸カリウム、及びグリセロールの混合物を含む溶液で、そして次に３−〔Ｎ−モルホリノ〕−プロパン−スルホン酸、ＲｂＣｌ及びグリセロールで処理することができる。培養中の哺乳動物細胞は、ベクターＤＮＡの細胞へのカルシウム同時沈降により形質転換することができる。本発明は、本発明の複製可能発現ベクターで形質転換された宿主細胞にも広げられる。
【００２３】
形質転換された宿主細胞をそのＤＮＡポリマーの発現を許容する条件下で培養することは、便利には、例えば上述のManiatisら及び“DNA Cloning¨に記載されるように行われる。これにより、好ましくは細胞には栄養素が補給され、５０℃未満の温度で培養される。
その産物は、宿主細胞に従って及び（細胞内又は培養培地にもしくは細胞内ペリプラズムに分泌された）発現産物の局在化に従って、慣用的な方法により回収される。これにより、宿主細胞が細菌、例えば大腸菌である場合、それは例えば物理的に、化学的に又は酵素的に溶解し、生じたライゼートからタンパク質産物を単離することができる。宿主細胞が哺乳動物細胞である場合、その産物は一般に、栄養培地から又は無細胞抽出液から単離することができる。慣用的なタンパク質単離技術には、選択的沈殿、吸着クロマトグラフィー、及びモノクローナル抗体アフィニティーカラムを含むアフィニティークロマトグラフィーがある。
【００２４】
本発明のタンパク質は、脂質に可溶性の形態で又は凍結乾燥形態で供される。
一般に、各々のヒトの投与量は、１〜１０００μｇのタンパク質、好ましくは３０〜３００μｇを含むであろうと予想される。
本発明は、医薬として許容される賦形剤中に本発明のタンパク質を含む医薬組成物も供する。好ましいワクチン組成物は、少くともリポプロテインＤ−ＭＡＧＥ−３を含む。このようなワクチンは、任意に、１又は複数の他の腫瘍関連抗原を含み得る。例えばＭＡＧＥ及びＧＡＧＥファミリーに属する他のメンバーがある。好適な他の腫瘍関連抗原には、ＭＡＧＥ−１，ＧＡＧＥ−１又はチロシナーゼタンパク質がある。
【００２５】
ワクチン調製物は、一般に、Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach¨ (eds. Powell M.F. & Newman M.J) (1995) Plenum Press New York ）に記載される。リポソームでのカプセル化は、Fullerton の米国特許４，２３５，８７７に記載される。
本発明のタンパク質は、好ましくは、本発明のワクチン調製物中にアジュバントが添加される。好適なアジュバントアルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムゲル（アルム）又はリン酸アルミニウムを含むが、カルシウム、鉄又は亜鉛の塩であってもよく、またアシル化チロシン又はアシル化糖、カチオンに又はアニオンに誘導化したポリサッカライド又はポリホスファゼンの不溶性懸濁液であってもよい。他の周知のアジュバントには、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがある。そのオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていないことを特徴とする。このようなオリゴヌクレオチドは公知であり、例えばＷＯ９６／０２５５５に記載される。
【００２６】
本発明の製剤において、アジュバント組成物はＴＨ１型に優先的に免疫応答を誘導することが好ましい。好適なアジュバントシステムには、例えばモノホスホリル脂質Ａ、好ましくは３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）の、アルミニウム塩との組合せがある。ＣｐＧオリゴヌクレオチドもＴＨ１応答を優先的に誘導する。
【００２７】
増強されたシステムはモノホスホリル脂質Ａ及びサポニン誘導体の組合せ、特にＷＯ９４／００１５３に開示されるＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬの組合せ、又はＷＯ９６／３３７３９に開示されるＱＳ２１がコレステロールでクエンチされているより少い反応原性の組成物に関する。
水中油エマルション中のＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬ及びトコフェロールに関する特に能力のあるアジュバントはＷＯ９５／１７２１０に記載され、好ましい製剤である。
【００２８】
従って、本発明の一実施形態において、モノホスホリル脂質Ａ又はその誘導体がアジュバントとして添加された。本発明のタンパク質、より好ましくはリポプロテインＤ（又はその誘導体）−ＭＡＧＥ−３を含むワクチンを供する。
好ましくは、そのワクチンは、サポニン、より好ましくはＱＳ２１を更に含む。
【００２９】
好ましくは、製剤は、水中油エマルション及びトコフェロールを更に含む。本発明は、医薬として許容される賦形剤、例えば３Ｄ−ＭＰＬを一緒に本発明のタンパク質を混合することを含むワクチン製剤を製造するための方法も供する。
本発明の一態様において、組換え生産されたＭＡＧＥ−タンパク質を精製するための方法を供する。その方法は、そのタンパク質を、例えば強カオトロピック剤（例えば尿素、塩酸グアニジウム）に、又は両性イオン界面活性剤、例えば（Empigen BB−ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン）に可溶化し、そのタンパク質の分子内及び分子間ジスルフィド結合を還元し、生じたチオールをブロッキングして酸化的再カップリングを防止し、そしてそのタンパク質を１又は複数のクロマトグラフィーステップにかけることを含む。
【００３０】
好ましくは、ブロッキング剤はアルキル化剤である。このようなブロッキング剤には、これらに限らないが、α−ハロゲン酸（haloacids ）又はα−ハロゲンアミド（haloamides）がある。例えば、ヨード酢酸及びヨードアセトアミドはタンパク質をカルボキシメチル化又はカルボキシアミド化（カルバミドメチル化）させる。他のブロッキング剤を用いることができ、これらは文献に記載されている（例えばThe Proteins Vol II Eds H neurath, RL Hill and C-L Boeder, Academic press 1976, or Chemical Reagents for Protein modification Vol I eds. RL Lundblad and CM Noyes, CRC Press 1985 を参照のこと）。このような他のブロッキング剤の典型例には、Ｎ−エチルマレイミド、クロロアセチルホスフェート、Ｏ−メチルイソウレア及びアクリロニトリルがある。ブロッキング剤の使用は、それが産物の凝集を防ぎ、後の精製のための安定性を確実にするので有利である。
【００３１】
本発明の一実施形態において、ブロッキング剤は、安定に共有結合した不可逆的な誘導体（例えばα−ハロ酸又はα−ハロアミド）を誘導するように選択される。しかしながら、ブロッキング剤は、精製の後に、そのブロッキング剤が除去されて非誘導化タンパク質を遊離し得るように選択してもよい。
誘導化遊離チオール残基を有するＭＡＧＥタンパク質は新規であり本発明の一態様を形成する。特に、カルボキシアミド化又はカルボキシメチル化誘導体は本発明の好ましい実施形態である。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態において、本発明のタンパク質には、アフィニティータグ、例えばＣＬＹＴＡ又はポリヒスチジンテールが供される。このような場合、ブロッキングステップ後のタンパク質は、好ましくはアフィニティークロマトグラフィーにかけられる。ポリヒスチジンテールを有するこれらのタンパク質のために、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を行うことができる。金属イオンは、いずれかの適切なイオン、例えば亜鉛、ニッケル、鉄、マグネシウム又は銅であり得るが、好ましくは亜鉛又はニッケルである。好ましくは、ＩＭＡＣ緩衝液は、最終産物中に低レベルのエンドトキシンを生ずるので、Ｅｍｐｉｇｅｎ ＢＢ（以後、Ｅｍｐｉｇｅｎ）のような両性イオン界面活性剤を含む。
【００３３】
タンパク質がＣｌｙｔａ部分と共に生産されるなら、そのタンパク質は、コリン又はコリンアナログ、例えばＤＥＡＥへのアフィニティーを利用することにより精製することができる。本発明の一実施形態において、タンパク質には、ポリヒスチジンテール及びＣｌｙｔａ部分が供される。これらは簡単な２ステップのアフィニティークロマトグラフィー精製スケジュールで精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】脂質化Ｈｉｓテールを有する融合タンパク質の概略を示す。
【図２】発現ベクターｐＲＩＴ１４５８６の作製ストラテジーを示す。
【図３】プロテインＤ１／３−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓテールを発現するプラスミドｐＲＩＴ１４４７７の作製ストラテジーを示す。
【図４】Ｍａｂ３２及び５４で染色した後のｌｏｔ ９６Ｋ１９及び９６Ｊ２２について得られたバンドパターンを示す。
【図５】ＳＢＡＳ−２製剤のみ又はＰＢＳを与えたマウスのリンパ球増殖応答と比較した、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質を注入したＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞における、ＭＡＧＥ−３特異的リンパ球増殖活性の増加を示す。
【図６】ＳＢＡＳ−２製剤のみ又はＰＢＳを与えたマウスのリンパ球増殖応答と比較した、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質を注入したＣ５７ＢＬ／６マウスのリンパ節細胞における、ＭＡＧＥ−３特異的リンパ球増殖活性の増加を示す。
【図７】ＳＢＡＳ−２製剤のみ又はＰＢＳを与えたマウスのリンパ球増殖応答と比較した、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質を注入したＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞における、ＭＡＧＥ−３特異的リンパ球増殖活性の増加を示す。
【図８】ＳＢＡＳ−２製剤のみ又はＰＢＳを与えたマウスのリンパ球増殖応答と比較した、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質を注入したＢａｌｂ／ｃマウスのリンパ節細胞における、ＭＡＧＥ−３特異的リンパ球増殖活性の増加を示す。
【図９】マウスの異なるグループ（Ｎ＝５／グループ）間で、曲線の中点に達するために必要とされる平均希釈にある、血清の相対的平均中点タイターを比較する。
【図１０】Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるワクチン接種後のＩｇサブクラス特異的抗ＭＡＧＥ−３応答を示す。
【図１１】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるワクチン接種後のＩｇサブクラス特異的抗ＭＡＧＥ−３応答を示す。
【図１２】大腸菌内で発現させるべき融合タンパク質ＮＳ１，ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓのデザインを示す。
【図１３】プラスミドｐＲＩＴ１４４２６の作製ストラテジーを示す。
【図１４】ｐＲＩＴ１４４２６のプラスミドマップを示す。
【図１５】大腸菌内で発現させる融合タンパク質Ｃｌｙｔａ−Ｍａｇｅ−１−Ｈｉｓのデザインを示す。
【図１６】プラスミドｐＲＩＴ１４６１３の作製巣取れてジーを示す。
【図１７】プラスミドｐＲＩＴの作製ストラテジーを示す。
【図１８】大腸菌内で発現させる融合タンパク質Ｃｌｙｔａ−Ｍａｇｅ−３−Ｈｉｓのデザインを示す。
【図１９】プラスミドｐＲＩＴ１４６４６の作製ストラテジーを示す。
【実施例】
【００３５】
本発明は、以下の実施例を引用することにより更に記述されよう。
実施例Ｉ：
融合タンパク質リポプロテインＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ（ＬＰＤ １／３−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ又はＬｐＤ ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ）を発現する組換え大腸菌株の調製
１．大腸菌発現系：
リポプロテインＤの生産のため、プロテインＤをコードするＤＮＡを発現ベクターｐＭＧ８１にクローン化した。このプラスミドはラムダファージＤＮＡからのシグナルを利用して挿入された外来遺伝子の転写及び翻訳を駆動する。そのベクターは、ラムダＰＬプロモーターＰＬ、オペレーターＯＬ及びＮプロテインを供した時に転写極性効果を緩和するための２つの利用部位（Ｎｕ＋Ｌ及びＮｕ＋Ｒ）を含む（Gross ら、1985, Mol. & Cell.Biol. 5; 1015 ）。ＰＬプロモーターを含むベクターはプラスミドＤＮＡを安定化するため大腸菌溶原性宿主に導入される。溶原性宿主株は、ゲノム内に挿入された複製欠損ラムダファージＤＮＡを含む（Shatzmanら、1983; In Experimental Manipulation of Gene Expression. Inouya (ed) pp 1 〜14, Academic Press NY ）。ラムダファージＤＮＡはベクターのＯＬリプレッサーに結合し、ＲＮＡポリメラーゼのＰＬプロモーターへの結合を防ぎ、それにより挿入された遺伝子の転写を防ぐｃＩリプレッサータンパク質の合成を指示する。発現株ＡＲ５８のｃＩ遺伝子は、ＰＬに指示された転写が温度変化により制御され得るように、即ち培養温度の増加がリプレッサーを不活性化して外来タンパク質の合成が始まるように、温度感受性変異を含む。この発現系は、外来タンパク質、特に細胞に対して毒性であり得るものの合成を制御する（Shimataka & Rosenberg, 1981, Nature 292: 128）。
【００３６】
２．大腸菌株ＡＲ５８：
ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質の生産のために用いたＡＲ５８溶原性大腸菌株は標準的なＮＩＨ大腸菌Ｋ１２株Ｎ９９の誘導体（F-Su-galK2, lacZ-thr- ）である。それは、欠損した溶原性ラムダファージを含む（galE::TN10, 1Kil-cI857 DH1）のＫｉｌ−表現型は宿主高分子合成の遮断を防ぐ。ｃＩ８５７変異は、温度感受性障害をｃＩリプレッサーに与える。ＤＨ１欠失は、ラムダファージの右オペロン及び宿主のｂｉｏ，ｕｖｒ３、及びｃｈｌＡ座を除去する。ＡＲ５８株は、ＳＡ５００誘導体（galE::TN10, 1Kil-cI857 DH1）で先に増殖させたＰラムダファージストックでのＮ９９の導入により作り出した。Ｎ９９への欠損溶原の導入は、隣接ｇａｌＥ遺伝子中にテトラサイクリン耐性をコードするＴＮ１０トランスポゾンの存在によりテトラサイクリンで選択した。Ｎ９９及びＳＡ５００は、National Institute of HealthのDr.Martin Rosenberg's laboratoryから得た大腸菌Ｋ１２株である。
【００３７】
３．組換えタンパク質ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓを発現するようデザインしたベクターの作製
原理は、ＭＡＧＥ−３のＮ末端に連結した融合パートナーとして脂質化プロテインＤのＮ末端１／３及びＣ末端に位置したいくつかのヒスチジン残基の配列（Ｈｉｓテール）を用いて融合タンパク質としてＭＡＧＥ３を発現させることであった。
【００３８】
プロテインＤはリポタンパク質である（グラム陰性細菌ヘモフィルス・インフルエンゼの表面上に露出した４２kDa イムノグロブリンＤ結合タンパク質）。そのタンパク質は、細菌のリポタンパク質についての共通配列を含む、１８アミノ酸残基シグナル配列を有する前駆体として合成される（ＷＯ９１／１８９２６）。
【００３９】
リポタンパク質のシグナル配列が分泌の間に処理される場合、（前駆体分子中の位置１９の）Ｃｙｓがアミノ末端残基になり、同時に、エステル結合及びアミド結合脂肪酸の両方の共有結合により改変される。
次に、アミノ末端システイン残基に結合した脂肪酸は膜アンカーとして機能する。
【００４０】
融合タンパク質を発現するプラスミドは、１８アミノ酸シグナル配列及び処理されたプロテインＤの最初の１０９残基、２つの無関係なアミノ酸（Ｍｅｔ及びＡｓｐ）、ＭＡＧＥ−３のアミノ酸残基２〜３１４、後に７つのＨｉｓ残基に露出されるヒンジ領域をして機能する２つのＧｌｙ残基を含む前駆タンパク質を発現するようデザインした。
【００４１】
これにより、組換え株は、４３２アミノ酸残基長の処理された脂質化Ｈｉｓテールを有する融合タンパク質を作り出す（図１）。ここでそのアミノ酸配列は配列番号：１に記載され、コーディング配列は配列番号：２に記載される。
４．ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ融合タンパク質の形成のためのクローニングストラテジー（ベクターｐＲＩＴ１４４７７）：
（Ludwig InstituteからのDr Thierry Boon から頂いた）ＭＡＧＥ−３遺伝子（Gaugler B ら、1994）のためのコーディング配列を含むｃＤＮＡプラスミド、及び（図２に概説するように調製した）Ｌｉｐｏ−Ｄ−１／３コーディング配列のＮ末端部分を含むベクターＰＲＩＴ１４５８６を用いた。そのクローニングストラテジーは以下のステップを含む（図３）。
【００４２】
ａ）オリゴヌクレオチドセンス：５′gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct及びオリゴヌクレオチドアンチセンス：５′gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa を用いてプラスミドｃＤＮＡ ＭＡＧＥ３内に供される配列のＰＣＲ増幅；この増幅は、Ｎ末端に以下の改変を導く：最初の５つのコドンの、大腸菌コドン使用への変化、位置１におけるＰｒｏコドンのＡｓｐコドンによる置換、５′末端でのＮｃｏＩ部位の設置及び２つのＧｌｙコドン及び７つのＨｉｓコドン、その後のＸｂａＩ部位の、Ｃ末端での最後の付加。
【００４３】
ｂ）先に増幅したフラグメントのインビトロゲンのＴＡクローニングベクターへのクローニング及び中間体ベクターｐＲＩＴ１４６４７の調製。
ｃ）プラスミドｐＲＩＴ１４６４７からのＮｃｏＩ ＸｂａＩフラグメントの切り出し、及びベクターｐＲＩＴ１４５８６へのクローニング。
ｄ）宿主株ＡＲ５８の形質転換。
【００４４】
ｅ）ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ融合タンパク質を発現するプラスミドｐＲＩＴ１４４７７を含む大腸菌株形質転換体の選択及びキャラクタリゼーション
実施例II：
ＬＰＤ１／３−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ抗原の調製：
１．細菌株の増殖及び誘導−ＬＰＤ１／３−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓの発現：
プラスミドｐＲＩＴ１４４７７で形質転換したＡＲ５８の細胞を、各々イーストエキス（６．４ｇ／Ｌ）及びカナマイシンスルフェート（５０mg／Ｌ）を補給したＬＹ１２培地４００mLを含む２リッターフラスコ内で増殖させた。振とうテーブル上で、３０℃で８＋／−１時間、インキュベートした後、顕微鏡検査のため各々のフラスコから少量のサンプルを除去した。２つのフラスコの内容物をプールして２０リッター発酵槽のための接種物を供した。
【００４５】
その接種物（約８００mL）を、５０mg／Ｌのカナマイシンスルフェートを補給した７リッターの培地を含む予め滅菌した２０リッター（全量）発酵槽に加えた。そのpHを、ＮＨ4 ＯＨ（２５％ｖ／ｖ）の周期的な添加により６．８に調節し、維持して、その温度を３０℃に調節し、維持した。エレーション速度を分当り１２リッターに調節し、維持して、溶解した酸素圧を撹拌速度のフィードバック制御により５０％の飽和に維持した。発酵槽における過圧は５００ｇ／cm2 （０．５bar ）に維持した。
【００４６】
炭素供給溶液の添加量を制御することによりフェド・バッチ（fed-batch ）培養を行った。供給溶液は最初に０．０４mL／分の速度で加え、０．１ｈ-1の増殖速度を維持するように最初の４２時間の間、指数関数的に増加させた。
４２時間後に、発酵槽中の温度を３９℃に迅速に増加させ、供給速度を、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓの細胞内発現が最大レベルに達する期間である更なる２２〜２３時間、誘導期の間、０．００５mL／ｇ DCW／分の一定値に維持した。
【００４７】
その培養液のアリコート（１５mL）を増殖／誘導期全体を通して規則的な間隔で採取し、発酵の終りに微生物増殖の速度及び細胞内産物発現を追跡し、更に、微生物の同定／純度テストのためのサンブルを供した。
発酵の終りに、その培養物の光学密度は（４８〜７２ｇの DCW／Ｌの細胞濃度に相当する）８０〜１２０であり、全液体量は約１２リッターであった。その培養物を迅速に６〜１０℃に冷却し、ＥＣＫ３２の細胞を、５０００×ｇで４℃で３０分の遠心により培養液から分離した。ＥＣＫ３２の濃縮細胞を迅速にプラスチックバッグに保存し、直ちに−８０℃に凍結した。
【００４８】
２．タンパク質の抽出：
ＥＣＫ３２の凍結した濃縮細胞を４℃に解凍した後、細胞破壊緩衝液に再度懸濁して（約３６ｇの DCW／Ｌの細胞濃度に相当する）６０の最終的な光学密度にした。
その細胞を高圧ホモジナイザー（１０００bar ）に２回、通すことにより破壊した。その破壊した細胞懸濁液を遠心し（×１０，０００ｇ、４℃、３０分）、そのペレット画分をＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００（１％ｗ／ｖ）＋ＥＤＴＡ（１mM）で２回、洗い、次にリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）＋Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％ｖ／ｖ）で洗い、そして最後にＰＢＳで洗った。各々の洗浄段階の間に、懸濁液を×１０，０００ｇで３０分、４℃で遠心し、その上清を捨てて、ペレット画分を保持した。
【００４９】
実施例III ：
融合タンパク質ＬｉｐｏＤ−ＭＡＧＥ３のキャラクタリゼーション：
１．精製：
ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓを以下に記載のステップの順番を用いて細胞ホモジネートから精製した：
ａ）細胞破壊物からの洗浄したペレット画分の可溶化。
【００５０】
ｂ）タンパク質内及びタンパク質間ジスルフィド結合の化学的還元、次の酸化物再カップリングを防ぐためのチオール基のブロッキング。
ｃ）粒子の除去及びエンドトキシンの削減のための反応混合物の精密ろ過。
ｄ）ポリヒスチジンテールと亜鉛装填Chelating Sepharose との間のアフィニティー相互作用の利用によるＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓの捕獲及び最初の精製。
【００５１】
ｅ）アニオン交換クロマトグラフィーによる汚染タンパク質の除去。
その精製したＬＰＤ−ＭＡＧＥ３−Ｈｉｓはいくつかの仕上げ段階にかけた：
ｆ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによる緩衝液交換／尿素除去。
ｇ）製造過程のろ過。
【００５２】
ｈ）Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによる緩衝液交換／脱塩。
これらのステップの各々を以下により詳細に記載する。
１．１）細胞ホモジネートペレットの可溶化
（上述の）最終洗浄段階からのペレット画分を、塩酸グアニジン（６Ｍ）及びリン酸ナトリウム（０．１Ｍ、pH７．０）の溶液８００mL中で４℃で一晩、再び可溶化した。
【００５３】
１．２）還元及びカルボキシメチル化
可溶化した材料（うすい黄色、濁った懸濁液）にアルゴンを流して残った酸素を一掃し、２−メルカプトエタノールの保存溶液（１４Ｍ）を加えて４．３Ｍの最終濃度（溶液１mL当り０．４４mLの２−メルカプトエタノールに相当）を供した。
【００５４】
得られた溶液を２つのガラスフラスコに分けて移し、それら両方を水浴中で９５℃に加熱した。９５℃で１５分後に、そのフラスコを水浴から除去し、冷却して、その内容物を氷の中においたホイルでおおったビーカー（５Ｌ）にプールし、そして固体のヨードアセトアミドを激しく混合しながら加えて６Ｍの最終濃度（溶液１mL当り１．１１ｇのヨードアセトアミドに相当）を供した。その混合物を１時間、暗所で氷上に保持し、ヨードアセトアミドの完全な可溶化を確実にし、その後、約１Ｌの水酸化ナトリウム（５Ｍ）を加えることにより中和して（激しい混合を維持してpHのモニターを続けて）、７．５〜７．８の最終pHを供した。
【００５５】
得られた混合物を更に３０分、暗所で氷上に維持し、その後、pHを再びpH７．５〜７．８に調節した。
１．３）精密ろ過
その混合物を、Minikros中空繊維カートリッジ（ret. No M22M-600-01N；面積５，６００cm2 、０．２μｍ）を備えたAmicon Proflux M12接線フロー（tangenital-flow ）ユニット内で精密ろ過した。その透過液を後のクロマトグラフィー精製のために保持した。
【００５６】
１．４）金属（Ｚｎ2+）キレートクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）
金属キレートクロマトグラフィーを、ＢＰＧ １００／５００カラム（Pharmacia Biotechnology Cat No.18-1103-01 ）に充填したChelating Sepharose FF (Pharmacia Biotechnology Cat. No.17-0575-01）で行った。充填したベッドの寸法は、直径１０cm；断面積７９cm2 ；ベッドの高さ１９cm；充填容量１, ５００mLであった。空のカラムを水酸化ナトリウム（０．５Ｍ）で浄化して精製水で洗った。
【００５７】
（２０％ｖ／ｖエタノール中から出した）支持体を（真空下で）ブフナー漏斗上で精製水（８リッター）で洗い、少くとも１５リッターのＺｎＣｌ2 の溶液（０．１Ｍ）を流すことにより亜鉛で荷電させた。その支持体を、流出液のpHがＺｎＣｌ2 溶液のpH（pH５．０）に達するまで、１０Ｌの精製水で洗うことにより除去した。次にその支持体を、塩酸グアニジン（６Ｍ）及びリン酸ナトリウム（０．１Ｍ、pH７．０）を含む溶液４リッターで平衡化した。
【００５８】
ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓを含む精密ろ過からの浸透液を支持体と混合し（バッチ結合）、次にそのＢＰＧカラムに塩酸グアニジン（６Ｍ）及びリン酸ナトリウム（０．１Ｍ、pH７．０）を含む溶液をロードし、充填した。
金属キレートクロマトグラフィーの次の段階は、６０mL／分の溶出流速で行った。カラムを洗い、最初に塩酸グアニジン（６Ｍ）及びリン酸ナトリウム（０．１Ｍ、pH７．０）を含む溶液で、次に尿素（６Ｍ）及びリン酸ナトリウム（０．１Ｍ、pH７．０）を含む溶液で、カラム溶出液がＯＤ280nm で０の吸光度に達する（ベースライン）まで洗った。
【００５９】
半純粋なＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質画分を、尿素（６Ｍ）、リン酸ナトリウム（０．１Ｍ、pH７．０）及びイミダゾール（０．５Ｍ）を含む溶液２カラム容量で溶出した。この画分のコンダクタンスは約１６mS／cmであった。
１．５）アニオン交換クロマトグラフィー
アニオン交換クロマトグラフィーを続ける前に、半純粋なＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質画分のコンダクタンスを、尿素（６Ｍ）及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２０mM、pH８．０）を含む溶液で希釈することにより約４mS／cmに減少させた。
【００６０】
アニオン交換クロマトグラフィーを、ＢＰＧ ２００／５００カラム（Pharmacia Biotechnology Cat.No.18-1103-11 ）に充填したQ-Sepharose FF (Pharmacia Biotechnology, Cat No.17-0510-01）を用いた行った。充填したベッドの寸法は、直径１０cm；断面積３１４cm2 ；ベッドの高さ９cm；充填容量２，９００mLであった。
【００６１】
そのカラムに（２０％ｖ／ｖエタノール）を充填し、９リッターの精製水で７０mL／分の溶出流速で洗った。その充填したカラムを３Ｌの水酸化ナトリウム（０．５Ｍ）で浄化し、３０Ｌの精製水で洗い、次に６Ｌの尿素（６Ｍ）及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２０mM、pH８．０）を含む溶液で平衡化した。希釈した半精製したＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓをそのカラムに充填し、次に尿素（６Ｍ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０mM、pH８．０）、ＥＤＴＡ（１mM）及びＴｗｅｅｎ（０．１％）を含む９Ｌの溶液で、その溶出液の吸光度（２８０nm）が０になるまで洗った。
【００６２】
更なる洗浄ステップを、尿素（６Ｍ）及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２０mM、pH８．０）を含む６リッターの溶液で行った。
精製したＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓを、尿素（６Ｍ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０mM、pH８．０）及びＮａＣｌ（０．２５Ｍ）を含む溶液でカラムから溶出した。
【００６３】
１．６）サイズ排除クロマトグラフィー
精製したＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓからの尿素の除去及び緩衝液交換は、両方とも、サイズ排除クロマトグラフィーにより行った。これは、ＸＫ ５０／１００カラム（Pharmacia Biotechnology Cat.No.18-8753-01 ）に充填したSuperdex 75 (Pharmacia Biotechnology Cat.No.17-1044-01）を用いて行った。充填したベッドの寸法は、直径５cm；断面積１９．６cm2 ；ベッドの高さ９０cm；充填容量１，８００mLであった。
【００６４】
そのカラムはエタノール（２０％）中に充填し、５リッターの精製水で２０mL／分の溶出速度で洗浄した。そのカラムを２リッターの水酸化ナトリウム（０．５Ｍ）で浄化し、５リッターの精製水で洗い、次にＴｗｅｅｎ８０（０．１％ｖ／ｖ）を含む５リッターのリン酸緩衝塩類溶液で平衡化した。
その精製したＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ画分（脱塩ラン当り最大５００mL）を２０mL／分の溶出流速でカラムに充填した。その脱塩した精製ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓを、Ｔｗｅｅｎ８０（０．１％ｖ／ｖ）を含む３リッターのＰＢＳでカラムから溶出した。
【００６５】
ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓを含む画分はカラムのボイド容量で溶出した。
１．７）製造過程のろ過
サイズ排除クロマトグラフィーからのバルクＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓを、層流フード中０．２２μｍ膜（クラス１０．０００）を介してろ過した。そのろ過したバルクは−８０℃に凍結し、脱塩ステップまで保存した。
【００６６】
１．８）脱塩クロマトグラフィー
最終的なバルクのオスモル濃度は４００mOsM未満であるべきであるので、塩濃度を減少させるために更なる緩衝液交換が必要とされた。これは、ＢＰＧ １００／９５０カラム（Pharmacia Biotechnology Cat.No.18-1103-03 ）に充填したSephadex G25 (Pharmacia Biotechnology Cat.No.17-0033-02 ）を用いて脱塩クロマトグラフィーにより行った。充填したベッドの寸法は直径１０cm；断面積７８．６cm2 ；ベッドの高さ８５cm；充填容量６，５００mLであった。
【００６７】
Sephadex G25を７リッターの精製水で水和し、４℃で一晩、膨潤させた。次にそのゲルを純水で１００mL／分の溶出流速でカラムにつめた。
そのカラムを６リッターの水酸化ナトリウム（０．５Ｍ）で浄化し、次にリン酸ナトリウム（１０mM、pH６．８）、ＮａＣｌ（２０mM）及びＴｗｅｅｎ８０（０．１％ｖ／ｖ）を含む１０リッターの溶液で平衡化した。
【００６８】
その精製したＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ画分（脱塩ラン当り最大１５００mL）を１００mL／分の溶出流速でカラムに流した。カラムのボイド容量で溶出した脱塩精製したＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ画分を０．２２μｍ膜を介して滅菌ろ過し、−８０℃で保存した。
最終的なバルクタンパク質を＋４℃に解凍した後、容器に分取してラクトース賦形剤中に凍結乾燥した。
【００６９】
２．クーマシー染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでの分析：
ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ精製抗原を、１２．５％アクリルアミドゲル上で還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
タンパク質充填量はクーマシーブルー染色について５０μｇ及び硝酸銀染色について５μｇであった。臨床用ｌｏｔ ９６Ｋ１９及びパイロットｌｏｔ ９６Ｊ２２を分析した。６０kDa の分子量に相当する１つの主要バンドを可視化した。約４５kDa 及び３５kDa の２つのマイナーな更なるバンドも見られた。
【００７０】
３．ウェスタンブロット分析：
ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により表されるペプチドを、マウスモノクローナル抗体を用いてウェスタン・ブロットにより同定した。これらの抗体は、ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質（このタンパク質はＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−ＨｉｓのＬＰＤ部分を含まない）の精製した調製物を用いて企業内で開発した。
【００７１】
２つのモノクローナル抗体調製物（Ｍａｂ２２及びＭａｂ５４）は、ウェスタンブロット分析のための適合性に基づいて選択し、ｌｏｔリリースのための同一性テストに用いた。図４は、Ｍａｂ３２及び５４で染色した後のｌｏｔ ９６Ｋ１９及び９６Ｊ２２について得られたバンドパターンを示す。６００ngのタンパク質が１２．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、それをナイロン膜に移し、Ｍａｂ３２及び５４（６０μｇ／ml）と反応させ、ペルオキシダーゼに連結させた抗マウス抗体で表した。
【００７２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出された６０kDa 及び３０kDa ペプチドは両方のＭａｂにより表した。
実施例IV：
１．ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質を用いるワクチン調製物：
これらの実験に用いたワクチンは、アジュバントを加えた又は加えなかった、株ＡＲ５８からの大腸菌で発現されたリポプロテインＤ１／３−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓをコードする組換えＤＮＡから作り出す。アジュバントとして、その製剤は、油／水エマルション中、３ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）及びＱＳ２１の混合物を含む。アジュバントシステムＳＢＡＳ２は、先にＷＯ９５／１７２１０に記載されている。
【００７３】
３Ｄ−ＭＰＬは、グラム陰性細菌サルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnesota）のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）由来の免疫刺激剤である。ＭＰＬは脱アシル化されており、脂質Ａ成分上のホスフェート基を欠く。この化学的処理は、免疫刺激特性を保存しながら、毒性を劇的に減少させる（Ribi, 1986）。Ribi ImmunochemistryはＭＰＬを製造し、それをSB-Biologicalsに供給する。Smith Kline Beecham Biologicals で行った実験は、種々のビヒクルと組合わせた３Ｄ−ＭＰＬは、体液性免疫及び細胞性免疫のＴＨ１型の両方を強力に増強することを示した。
【００７４】
ＱＳ２１は、南アメリカの樹木Quillaja saponaria Molina の樹皮から抽出された天然のサポニン分子である。樹皮の粗抽出液から個々のサポニンを分離するために開発した精製技術は、親構成物と比べて強いアジュバント活性及び低い毒性を示すトリテルペングリコシドである特定のサポニンＱＳ２１の単離を許容した。ＱＳ２１はＭＨＣクラスＩ制限ＣＴＬをいくつかのサブユニットＡｇｓに活性化し、及びＡｇ特異的リンパ球増殖を刺激することが示されている（Kensil, 1992）。Ａｑｕｉｌａ（正式にはCambridge Biotech Corporation ）はＱＳ２１を製造し、それをSB-Biologicalsに供給する。
【００７５】
Smith Kline Beecham Biologicals で行った実験は、体液性及びＴＨ１型細胞性免疫応答の両方の誘導におけるＭＰＬ及びＱＳ２１の組合せの明らかな相乗効果を証明した。
油／水エマルションは、２種の油（トコフェロール及びスクアレン）から構成される有機相、及び乳化剤としてＴｗｅｅｎ８０を含むＰＢＳの水性相から構成される。そのエマルションは、５％のスクアレン、５％のトコフェロール、０．４％のＴｗｅｅｎ８０を含み、１８０nmの平均粒径を有し、ＳＢ６２として知られる（ＷＯ９５／１７２１０を参照のこと）。
【００７６】
Smith Kline Beecham Biologicals で行った実験は、３Ｄ−ＭＰＬ／ＱＳ２１（ＳＢＡＳ２）へのＯ／Ｗエマルションの添加が種々のサブユニット抗原に対する後者の免疫刺激特性を更に増加させる。
２．エマルションＳＢ６２（２倍濃縮物）の調製：
Ｔｗｅｅｎ８０をリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）に溶かしてＰＢＳ中２％溶液を供する。１００mLの２倍濃縮エマルションを供するために、５ｇのＤＬ−α−トコフェロール及び５mLのスクアレンをボルテキシングして完全に混合する。９０mLのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液を加え、完全に混合する。次に生じたエマルションをシリンジに通して、Ｍ１１０Ｓマイクロフルーディクスマシンを用いることにより最終的にミクロな液体にする。得られた油滴は約１８０nmの大きさを有する。
【００７７】
３．リポプロテインＤ１／３−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ ＱＳ２１／３Ｄ ＭＰＬ水中油（ＳＢＡＳ２）製剤の調製
アジュバントを油／水エマルション中で、ＭＰＬ及びＱＳ２１の組合せとして調剤する。この調製物を０．７mlの容器に入れて、凍結乾燥した抗原（容器は３０〜３００μｇの抗原を含む）と混合する。
【００７８】
凍結乾燥したワクチンのためのアジュバント希釈物の組成は次の通りである：
【００７９】
【表１】
【００８０】
最終的なワクチンは、凍結乾燥されたＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ調製物をアジュバントで又はＰＢＳのみで再構成した後に得られる。
抗原を含まないアジュバント対照は、タンパク質をＰＢＳで置換することにより調製した。
４．ワクチン抗原：融合タンパク質リポプロテインＤ１／３−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ：
リポプロテインＤはグラム陰性細菌ヘモフィルス・インフルエンゼの表面上に露出したリポタンパク質である。
【００８１】
融合パートナーとしての処理したプロテインＤの最初の１０９残基の包含は、Ｔ細胞エピトープを有するワクチン抗原を供する。ＬＰＤ成分の他に、タンパク質は、２つの無関係なアミノ酸（Ｍｅｔ及びＡｓｐ）、Ｍａｇｅ−３のアミノ酸残基２〜３１４、次の７つのヒスチジン残基を露出するためのヒンジ領域として機能する２つのＧｌｙ残基を含む。
【００８２】
実施例Ｖ：
１：マウス及びサルにおけるＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓの免疫原性：
ヒトＭＡＧＥ−３タンパク質の抗原性及び免疫原性をテストするため、候補ワクチンを、遺伝的バックグラウンド及びＭＨＣ対立遺伝子が異なる２つの異なるマウス株（Ｃ５７ＢＬ／６及びＢａｌｂ／ｃ）に注入した。両方のマウス株について、潜在的なＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスIIペプチドモチーフは、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ融合タンパク質のＭＡＧＥ部分のためのものであると理論的に予測された。
【００８３】
ａ）免疫化プロトコル：
各々の株の５匹のマウスに、ヒトに用いた濃度の１０分の１でＳＢＡＳ２中に調剤した５μｇのＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ又はそれのないものを、足のひらに、２週間間隔で２回、注入した。
ｂ）増殖アッセイ：
リンパ球を、最後の注入後２週間に、マウスからの脾臓又は膝窩リンパ節を破壊することにより調製した。２×１０5 細胞を９６ウェルプレートに３回重複して入れ、細胞を試験管内で７２時間、それ自体で又はラテックスマイクロビーズ上にコートした異なる濃度（１〜０．１μｇ／ml）のＨｉｓ−Ｍａｇｅ３で再刺激した。
【００８４】
ＳＢＡＳ−２製剤のみ又はＰＢＳを与えたマウスのリンパ球増殖応答と比べて、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質を注入したＣ５７ＢＬ／６又はＢａｌｂ／ｃマウスのいずれかからの脾臓細胞（図５及び７を参照のこと）及びリンパ節細胞（図６及び８を参照のこと）の両方で、ＭＡＧＥ−３特異的リンパ球増殖活性の増加が観察された。
【００８５】
更に、アジュバントＳＢＡＳ２中のＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓで免疫化したマウスからのリンパ球で、かなり高い増殖応答が得られた（図６及び８を参照のこと）。
ｃ）結論
ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓはマウスにおいて免疫原性であり、この免疫原性は、ＳＢＡＳ２アジュバント製剤の使用により増加させることができる。
【００８６】
２．抗体応答：
ａ）免疫化プロトコル
Ｂａｌｂ／ｃ又はＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＰＢＳ、又はＳＢＡＳ２、又は５μＧのＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ、又は５μＧのＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ＋ＳＢＡＳ２のいずれかで、２週間間隔で足のひら内注入により２回、免疫化した。
【００８７】
対照グループ及びテストグループの各々に３及び５の動物を用いた。
ｂ）間接ＥＬＩＳＡ：
２回目の注入後２週に、個々の血清を採取し、間接ＥＬＩＳＡにかけた。
２μＧ／mlの精製Ｈｉｓ ＭＡＧＥ−３をコートした抗原として用いた。ＰＢＳ＋１％新生ウシ血清中で、３７℃で１時間の飽和の後、その血清を飽和緩衝液中で逐次的に希釈（１／１０００で開始）し、４℃で一晩、又は３７℃で９０分、インキュベートした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％で洗った後、ビオチニル化ヤギ抗マウス全ＩｇＧ（１／１０００）又はヤギ抗マウスＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ２ｂ抗血清（１／５０００）を二次抗体として用いた。３７℃で９０分のインキュベーションの後、ペルオキシダーゼに連結したストレプトアビジンを加え、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジンペルオキシド）を基質として用いた。１０分後、その反応をＨ2 ＳＯ4 ０．５Ｍを加えることによりブロックし、そのＯ．Ｄ．を測定した。
【００８８】
ｃ）結果：
図９は、マウスの異なるグループ（Ｎ＝５／グループ）間で、曲線の中点に達するために必要とされる平均希釈にある、血清の相対的平均中点タイターを比較する。
これらの結果は、テストした両方のマウス株においてＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓのみの２回の注入の後に弱いＡｂ応答がマウントされるが、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−ＨｉｓをＳＢＡＳ２の存在下で注入した時にはより高い抗ＭＡＧＥ−３ Ａｂ濃度が形成されることを示す。これにより、２週間隔でのＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓの２回の注入のみで観察される高いＡｂ応答を作り出すのに十分である。
【００８９】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスで得られる応答と比べてＢａｌｂ／ｃマウスで観察されるより優れたＡｂ応答は、たとえＣ５７ＢＬ／６マウスで達成されるＡｂタイターが、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓのみの注入後よりＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ＋ＳＢＡＳ２の注入後でより高いとしても、ハプロタイプの差又はこれら２つの株の間のバックグラウンドの差によって説明することができる。
【００９０】
マウスの異なるグループにおけるワクチン接種後のＩｇサブクラス特異的抗ＭＡＧＥ−３応答は、図１０及び１１で見ることができ、これらは、血清の平均中点希釈の比較を供する。
アジュバントＳＢＡＳ２中のＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓをワクチン接種したマウスからでさえ、血清サンプルのいずれにおいてもＩｇＡもＩｇＭも検出されなかった。
【００９１】
対照的に、全ＩｇＧレベルは、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓのみをワクチン接種したマウスからの血清中で少し高く、ＳＢＡＳ２中のＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓを注入した動物の血清においてかなり増加した。
異なるＩｇＧサブクラス濃度の分析は、テストした全てのＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ２ｂ）のレベルが、Ａｇ又はアジュバントのみを注入したマウスにおいてのものよりアジュバントを加えたＡｇをワクチン接種したマウスにおいて高かったので、混合されたＡｂ応答がマウスにおいて誘導されたことを示す。
【００９２】
しかしながら、ＳＢＡＳ２の存在下でのＬｉｐｏＤ−ＭＡＧＥ−３でのワクチン接種後のこの混合されたＡｂ応答の性質は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｂがＢａｌｂ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウス各々の血清中に主に見い出されるので、マウス株に依存するようである。
３．アカゲザルにおけるリポプロテインＤ１／３ ＭＡＧＥ３−Ｈｉｓ＋ＳＢＡＳ２アジュバントの免疫原性
５匹のアカゲザル（Macaca Mulatta）の３つのグループを選択した。ＲＴＳ，Ｓ及びｇｐ１２０を陽性対照として用いた。
【００９３】
グループ：
グループ１ 右足：ＲＴＳ，Ｓ／ＳＢＡＳ２
左足：ＧＰ１２０／ＳＢＡＳ２
グループ２ 右足：ＲＴＳ，Ｓ／ＳＢ２６Ｔ
左足：ＧＰ１２０／ＳＢ２６Ｔ
グループ３ 右足：ＬｉｐｏＤ１／３ Ｍａｇｅ３ Ｈｉｓ／ＳＢＡＳ２
０日目に動物にワクチンを与え、２８日目にブーストし、８４日目にＭＡＧＥ３及びプロテインＤ成分の両方に対する抗体応答を決定するために採血した。ワクチンを、右足の後部にボーラス注入（０．５ml）で筋内に投与した。
【００９４】
少量の血液サンプルを１４日毎に採取した。３mlの非ヘパリン添加血液サンプルを大腿静脈から収集し、少くとも１時間、凝固させ、室温で１０分、２５００rpm で遠心した。
血清を除去して−２０℃で凍結し、特異的ＥＬＩＳＡによる抗体レベルの測定のために用いた。
【００９５】
９６ウェルマイクロプレート（maxisorb Nunc ）を、４℃で５μｇのＨｉｓ Ｍａｇｅ ３又はプロテインＤでコートした。ＰＢＳ ＮＣＳ １％での３７℃での１時間の飽和の後、ウサギ血清の連続希釈物を３７℃で１時間３０分、（１／１０で始めて）加え、ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎで３回、洗った後、抗ビオチニル化血清（Amersham ref RPN 1004. lot 88 ）を加えた（１／５０００）。プレートを洗い、ペルオキシダーゼ連結ストレプトアビジン（１／５０００）を３７℃で３０分、加えた。洗浄後、５０μｌのＴＭＢ（BioRad）を７分、加え、その反応をＨ2 ＳＯ4 で停止させ、ＯＤを４５０nmで測定した。中点希釈をSoftmaxProにより計算した。
【００９６】
抗体応答：
ＥＬＩＳＡによりＭＡＧＥ３に対する抗体応答の速度を追跡するために、１４日毎に少量の血液サンプルを採取した。結果は、ＬＰＤ１／３ Ｍａｇｅ３ Ｈｉｓ＋ＳＢＡＳ２の１回の注入後に、Ｍａｇｅ３特異的全Ｉｇタイターが低くなることを示し、同じサルでのＬｉｐｏＤ１／３ Ｍａｇｅ３＋アジュバントの２回目及び３回目の注入後に、５の動物のうち３つで見られた。少い応答のものは、３回の注入後でさえ陰性であり続けた。II後２８日又はIII 後に、抗体タイターは基底レベルに戻った。抗体のサブクラスはＩｇＭでなく主要なＩｇＧとして決定した。ＩｇＧへのスイッチは、Ｔヘルパー応答が誘発されていることを示唆する。プロテインＤ特異的抗体応答は、弱いか、Ｍａｇｅ３抗体応答と正確に平行している。
【００９７】
実施例VI：
１．ＬＰＤ−ＭＡＧＥ１ Ｈｉｓ
同様に、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−１−Ｈｉｓを調製した。そのアミノ酸及びＤＮＡ配列を配列番号：３及び４に示す。得られたタンパク質は、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質と同様に精製した。要約すると、細胞培養物をホモジナイズし、０．５％ Ｅｍｐｉｇｅｎ界面活性剤の存在下で４ＭグアニジンＨＣｌ及び０．５Ｍ β−メルカプトエタノールで処理した。その産物をろ過し、浸透物を０．６Ｍヨードアセトアミドで処理した。そのカルボキシアミド化画分をＩＭＡＣ（亜鉛キレート−セファロースＦＦ）クロマトグラフィーにかけた。そのカラムを平衡化し、４Ｍグアニジン、ＨＣｌ及びリン酸ナトリウム（２０mM、pH７．５）及び０．５％ Ｅｍｐｉｇｅｎを含む溶液で洗い、次にそのカラムをリン酸ナトリウム（２０mM、pH７．５）０．５％ Ｅｍｐｉｇｅｎ緩衝液中４Ｍ尿素を含む溶液で洗った。タンパク質を同じ緩衝液であるが、イミダゾールの濃度を増加させて（２０mM，４００mM及び５００mM）溶出した。
【００９８】
溶出液を４Ｍ尿素で希釈した。Ｑ−セファロースカラムを平衡化し、０．５％ Ｅｍｐｉｇｅｎの存在下で２０mMリン酸緩衝液（pH７．５）中４Ｍ尿素で洗った。界面活性剤を含まない同じ緩衝液で２回目の洗浄を行った。同じ緩衝液であるがイミダゾールの濃度を増加させて（１５０mM，４００mM，１Ｍ）タンパク質を溶出した。その溶出液を限外ろ過した。
【００９９】
実施例VII ：
発現プラスミドｐＲＩＴ１４４２６の作製及びＮＳ１−ＭＡＧＥ−３ Ｈｉｓを生産するための宿主株ＡＲ５８の形質転換：
タンパク質デザイン：
大腸菌内で発現させるべき融合タンパク質ＮＳ１，ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓのデザインを図１２に示す。
【０１００】
生じたタンパク質の一次構造は配列番号：５に記載の配列を有する。
上述のタンパク質デザインに対応するコーディング配列（配列番号：６）を大腸菌発現プラスミド中のλｐＬプロモーターの制御下においた。
ＮＳ1 −ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ融合タンパク質の形成のためのクローニングストラテジー
出発材料は、ＭＡＧＥ−３遺伝子のためのコーディング配列を含む、Ludwig InstituteからのDr.Tierry Boonから受け取ったｃＤＮＡプラスミド、及びインフルエンザからのＮＳ1 （非構造タンパク質）コーディング領域の８１ａａを含むベクターＰＭＧ８１であった。
【０１０１】
図１３に概説するクローニングストラテジーは以下のステップを含む：
ａ）オリゴヌクレオチドセンス：５′gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct、及びオリゴヌクレオチドアンチセンス：５′gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa を用いて、プラスミドｃＤＮＡ ＭＡＧＥ−３内に供される配列のＰＣＲ増幅。
【０１０２】
この増幅はＮ末端において以下の改変を導く：最初の５つのコドンの大腸菌コドン使用への変化、位置１におけるＰｒｏコドンのＡｓｐコドンでの置換、５′末端でのＮｃｏＩ部位の導入及び２つのＧｌｙコドン及び７つのＨｉｓコドン、次のＸｂａＩ部位のＣ末端での最後の付加。
ｂ）先に増幅したフラグメントのインビトロゲンのＴＡクローニングベクターへのクローニング及び中間体ベクターｐＲＩＴ１４６４７の調製。
【０１０３】
ｃ）プラスミドｐＲＩＴ１４６４７からのＮｃｏＩ−ＸｂａＩフラグメントの切り出し及びベクターｐＲＩＴ ＰＭＧ８１へのクローニング。
ｄ）宿主株ＡＲ５８の形質転換。
ｅ）ＮＳ１−ＭＡＧＥ３−Ｈｉｓ融合タンパク質を発現するプラスミドｐＲＩＴ１４４２６（図１４を参照）を含む大腸菌株形質転換体の選択及びキャラクタリゼーション。
【０１０４】
組換えＮＳ1 −ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ（ｐＲＩＴ１４４２６）のキャラクタリゼーション
細菌を、５０μｇ／mlのカナマイシンを補給したＬＢ培地で、３０℃で増殖させた。その培養がＯＤ＝０．３（６２０nm）に達した時に、温度を４２℃に上げることにより熱誘導を行った。
【０１０５】
４時間の誘導後、細胞を収集し、ＰＢＳに再度懸濁し、フレンチプレスに３回、通すことにより（分解により）溶解した。遠心（１００，０００ｇで６０分）の後、ペレット上清及び全抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質をクーマシーＢ１染色したゲルにおいて可視化し、ここでその融合タンパク質は全大腸菌タンパク質の約１％を表した。組換えタンパク質は、４４．９Ｋの見掛けＭＷで単一バンドとして現れた。その融合タンパク質は、抗ＮＳ１モノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット分析により同定した。
【０１０６】
実施例VIII：
ウサギ／マウス免疫化のためのＮＳ１−ＭＡＧＥ３−Ｈｉｓ（大腸菌）の精製。
精製スキーム：
抗原を精製するために以下の精製スキームを用いた：
細胞の溶解＋遠心
↓
抗原可溶化＋遠心
↓
Ｎｉ2 ＋ＮＴＡアガロース
↓
濃縮
↓
Prep cell
↓
ＴＣＡ沈殿及びＰＢＳ可溶化
ａ．溶解
細菌細胞（２３ｇ）をＲａｎｎｉｅ（ホモジナイザー）により２０３mLの５０mM ＰＯ4 pH７緩衝液に溶かし、そのライゼートを３０分、１５，０００rpm でＪＡ２０ローターで遠心した。
【０１０７】
その上清を捨てた。
ｂ．抗原可溶化
ペレットの１／３を３４mlの１００mM ＰＯ4 −６Ｍ ＧｕＨＣｌ pH７中４℃でＯ／Ｎに再び可溶化した。ＪＡ２０ローターで１５，０００rpm で３０分の遠心の後、ペレットを捨てて、上清をＩＭＡＣにより更に精製した。
【０１０８】
ｃ．アフィニティークロマトグラフィー：Ｎｉ2 ＋ＮＴＡアガロース（Qiagen）
カラム容量：１５mL（１６mm×７．５cm）
パッキング緩衝液：０．１Ｍ ＰＯ4 −６Ｍ ＧｕＨＣｌ pH７
サンプル緩衝液：同上
洗浄緩衝液：０．１Ｍ ＰＯ4 −６Ｍ ＧｕＨＣｌ pH７
０．１Ｍ ＰＯ4 −６Ｍ尿素 pH７
溶出：６Ｍ尿素を補給した０．１Ｍ ＰＯ4 緩衝液 pH７中のイミダゾール勾配（０→２５０mM）。
【０１０９】
流速：２mL／分
ａ．濃縮：
ＩＭＡＣ溶出物の抗原陽性画分（１６０mL）をプールし、Ｆｉｌｔｒｏｎ膜（Ｏｍｅｇａ型カットオフ１０，０００）でＡｍｉｃｏｎ撹拌セル内で５mLに濃縮した。この段階の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価して約７０％である。
【０１１０】
ｂ．調製用電気泳動（Prep Cell Biorad）
２．４mLの濃縮サンプルを０．８mLの還元サンプル緩衝液中で煮沸し、１０％アクリルアミドゲルに充填した。その抗原を、４％ ＳＤＳを補給したＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液 pH８．３中に溶出し、Ｎｓ1 −ＭＡＧＥ３ Ｈｉｓ陽性画分をプールした。
【０１１１】
ａ．ＴＣＡ沈殿：
抗原をＴＣＡで沈殿させ、ＪＡ２０ローターで１５，０００rpm で２０℃、遠心した後、上清を捨てた。そのペレットをＰＢＳ緩衝液 pH７．４に再び溶かした。
そのタンパク質は、凍結／解凍後にＰＢＳに可溶性であり、３７℃で３時間、保存した後にいずれの分解も示さず、そしてＳＤＳ（１２．５％ ＰＡＧＥ）により測定して約５０，０００ダルトンの見掛け分子量を有する。
【０１１２】
実施例IX：
融合タンパク質ＣＬＹＴＡ−ＭＡＧＥ−１−Ｈｉｓテールを発現する大腸菌株の調製
１．発現プラスミドｐＲＩＴ１４６１３の作製及び宿主株ＡＲ５８の形質転換：
タンパク質デザイン：
大腸菌内で発現させる融合タンパク質Ｃｌｙｔａ−Ｍａｇｅ−１−Ｈｉｓのデザインを図１５に示す。
【０１１３】
生じたタンパク質の一次構造は配列番号：７に示す配列を有する。
上述のタンパク質デザインに相当するコーディング配列（配列番号：８を参照のこと）を大腸菌発現プラスミド中のλｐＬプロモーターの制御下においた。
クローニング：
出発材料は、ストレプトコッカス・ニューモニエからのＬｙｔＡコーディング領域の１１７Ｃ末端コドンを含むベクターＰＣＵＺ１、及び我々が、Ludwig InstituteからDr.Thierry Boon から頂いたプラスミドからの先にサブクローニングしたＭＡＧＥ−１遺伝子ｃＤＮＡを有するベクターｐＲＩＴ１４５１８であった。
【０１１４】
ＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−１−Ｈｉｓタンパク質の発現のためのクローニングストラテジー（図１６の概説を参照のこと）は以下のステップを含む：
２．ＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−１−Ｈｉｓコーディング配列モジュールの調製：
ａ）最初のステップは、ＣＬＹＴＡ配列をＮｄｅＩ−ＡｆｌIII 制限部位に隣接させることを予定したＰＣＲ増幅であった。そのＰＣＲ増幅は、プラスミドＰＣＵＺ１テンプレート及びプライマーとしてオリゴヌクレオチドセンス：５′tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac 、及びオリゴヌクレオチドアンチセンス：５′GCC AGA CAT GTC CAA TTC TGG CCT GTC TGC CAG を用いて行った。これは、３７８ヌクレオチド長のＣＬＹＴＡ配列の増幅を導く。
【０１１５】
ｂ）第２のステップは、ＣＬＹＴＡ配列をＭＡＧＥ−１−Ｈｉｓ配列に連結して融合タンパク質のためのコーディング配列を作ることであった。このステップはＮｄｅＩ−ＡｆｌIII 制限フラグメントの切り出し及びＮｄｅＩ及びＮｃｏＩにより先に開裂したベクターｐＲＩＴ１４５１８（ＮｃｏＩ及びＡｆｌIII に適合）への挿入を含み、プラスミドｐＲＩＴ１４６１３を作り出す。
【０１１６】
ｃ）宿主細胞ＡＲ５８の形質転換
ｄ）プラスミドｐＲＩＴ１４６１３を含む大腸菌形質転換体（ＫＡＮ耐性）の選択及びキャラクタリゼーション（図１６を参照）。
１．組換えタンパク質ＣＬＹＴＡ−ＭＡＧＥ−１−Ｈｉｓ（ｐＲＩＴ１４６１３）のキャラクタリゼーション：
細菌を、３０℃で５０μｇ／mlカナマイシンを補給したＬＢ培地で増殖させた。その培養物がＯＤ＝０．３（６２０nm）に達した時に、温度を３８℃に上げることにより熱誘導を行った。
【０１１７】
４時間の誘導の後、細胞を収集し、ＰＢＳ中に懸濁し、そしてワンショット（one shot）により（分解により）溶解した。遠心の後、ペレット上清及び全抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質をクーマシーＢ１染色したゲルで可視化し、ここでその融合タンパク質は全大腸菌タンパク質の約１％を示した。組換えタンパク質は約４９kDの見掛けＭＷの単一バンドとして現れた。融合タンパク質を、抗Ｍａｇｅ−１ポリクローナル抗体を用いたウェスタン・ブロットにより同定した。
【０１１８】
（ナリジクス酸誘導のために役立つ）長λｐＬプロモーター及びＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−１コーディング配列ｐＲＩＴ１４６１４により構成される発現ユニットの再構成：
長いＰＬプロモーター及びＣＬＹＴＡ配列の一部を含むＥｃｏＲＩ−ＮＣＯ1 制限フラグメントをプラスミドｐＲＩＴ ＤＶＡ６から調製し、プラスミドｐＲＩＴ１４６１３のＥｃｏＲＩ−ＮＣＯ1 部位の間に挿入した。
【０１１９】
組換えプラスミドｐＲＩＴ１４６１４を得た。
融合タンパク質ＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−１−Ｈｉｓをコードする組換えプラスミドｐＲＩＴ１４６１４（図１７を参照）を用いて大腸菌ＡＲ１２０を形質転換した。Ｋａｎ耐性候補株を選択し、キャラクタライズした。
組換えタンパク質のキャラクタリゼーション：
細菌を５０mg／mlのカナマイシンを補給したＬＢ培地で３０℃で増殖させた。その培養物がＯＤ＝４００（６２０nm）に達した時に、ナリジクス酸を６０mg／mlの最終濃度まで加えた。
【０１２０】
４時間の誘導の後、細胞を収集し、ＰＢＳに再び懸濁して、分解（disintegration）（分解ＣＬＳ“ワン・ショット”型）により溶解した。遠心後、ペレット上清及び全抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質をクーマシーブルー染色したゲルで可視化した。ここで、その融合タンパク質は全大腸菌タンパク質の約１％を示した。その融合タンパク質をウサギ抗Ｍａｇｅ−１ポリクローナル抗体を用いてウェスタンブロット分析により同定した。組換えタンパク質は約４９kDの見掛けＭＷの単一バンドとして現れた。
【０１２１】
実施例Ｘ：
ＣＬＹＴＡ−ＭＡＧＥ−３−ＨＩＳ
Ａ：腫瘍拒絶組換え抗原：Ｃ−ｌｙｔＡ融合パートナーが可溶性タンパク質の発現を導く融合タンパク質ＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−３−Ｈｉｓはアフィニティータグとして機能し、有用なＴ−ヘルパーを供する。
【０１２２】
融合タンパク質ＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−３−Ｈｉｓテールを発現する大腸菌の調製
発現プラスミドｐＲＩＴ１４６４６の作製及び宿主株ＡＲ１２０の形質転換：
タンパク質デザイン：
大腸菌内で発現させる融合タンパク質Ｃｌｙｔａ−Ｍａｇｅ−３−Ｈｉｓのデザインを図１８に示す。
【０１２３】
得られたタンパク質の一次構造は配列番号：９に記載の配列及び配列番号：１０に記載のコーディング配列を有する。
上述のタンパク質デザインに相当するコーディング配列を大腸菌発現プラスミド内のλｐＬプロモーターの制御下においた。
クローニング：
出発材料は、Gene 43 (1986) p 265-272に記載されるストレプトコッカス・ニューモニエからのＬｙｔＡコーディング領域の１１７Ｃ末端コドンを含むベクターＰＣＵＺ１、及び我々が、Ludwig InstituteからDr.Tierry Boonから頂いたプラスミドからのＭＡＧＥ−３遺伝子ｃＤＮＡを先にサブクローニングしたベクターｐＲＩＴ１４４２６であった。
【０１２４】
ＣＬＹＴＡ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質の発現のためのクローニングストラテジー（図１９の概説を参照のこと）は以下のステップを含む。
１．ＣＬＹＴＡ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓコーディング配列モジュールの調製：
１．１．最初のステップはＡｆｌII及びＡｆｌIII 制限部位にＣＬＹＴＡを隣接させることを予定したＰＣＲ増幅であった。ＰＣＲ増幅は、テンプレートとしてプラスミドＰＣＵＺ１及びプライマーとしてオリゴヌクレオチドセンス：５′tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac 、及びオリゴヌクレオチドアンチセンス：５′ccc aca tgt cca gac tgc tgg cca att ctg gcc tgt ctg cca gtg を用いて行った。これは、４２７ヌクレオチド長ＣＬＹＴＡ配列の増幅を導く。先に増幅したフラグメントをInvitrogenのＴＡクローニングベクターにクローン化して、中間体ベクターｐＲＩＴ１４６６１を得た。
【０１２５】
１．２．第２のステップは、ＣＬＹＴＡ配列をＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ配列に連結して融合タンパク質のためのコーディング配列を作り出すことであった。このステップは、ＡｆｌII−ＡｆｌIII フラグメントの切り出し及びＡｆｌII及びＮｃｏＩ（ＮｃｏＩ及びＡｆｌII適合）制限酵素により先に開裂したベクターｐＲＩＴ１４４２６に挿入することを含み、プラスミドｐＲＩＴ１４６６２を作り出した。
【０１２６】
２．（ナリジクス酸誘導のために役立つ）長いλｐＬプロモーター及びＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−３コーディング配列により構成される発現ユニットの再構成
短いｐＬプロモーター及びＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−３−Ｈｉｓコーディング配列を含むＢｇｌII−ＸｂａＩ制限フラグメントをプラスミドｐＲＩＴ１４６６２から調製し、プラスミドＴＣＭ６７（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ９２／０１８２７に記載される、アンピシリンに対する耐性、及び長いλｐＬプロモーターを含むｒＢＲ３２２誘導体）のＢｇｌII−ＸｂａＩ部位の間に挿入した。プラスミドｐＲＩＴ１４６０７を得た。
【０１２７】
融合タンパク質Ｃｌｙｔａ−Ｍａｇｅ−３ Ｈｉｓをコードする組換えプラスミドｐＲＩＴ１４６０７を用いて大腸菌ＡＲ１２０（Mottら、1985, Proc.Natl.Acad.Sci, 82: 88）を形質転換した。アンピシリン耐性候補株を選択し、キャラクタライズした。
３．プラスミドｐＲＩＴ１４６４６の調製：
最後に、ｐＲＩＴ１４６０7 に類似するがカナマイシン選択を有するプラスミドを作製した（ｐＲＩＴ１４６４６）。
【０１２８】
組換えタンパク質のキャラクタリゼーション：
細菌を５０mg／mlのカナマイシンを補給したＬＢ培地で３０℃で増殖させた。その培養物がＯＤ＝４００（６００nm）に達した時に、ナリジクス酸を６０ｇ／mlの最終濃度まで加えた。
４時間の誘導の後、細胞を収集し、ＰＢＳに懸濁し、分解（分解ＣＬＳ“ワン・ショット”型）により溶解した。遠心の後、ペレット上清及び全抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質をクーマシーブルーで染色したゲルで可視化し、ここでその融合タンパク質は全大腸菌タンパク質の約１％を示した。その融合タンパク質は、ウサギ抗Ｍａｇｅ−３ポリクローナル抗体を用いてウェスタンブロット分析により同定した。組換えタンパク質は約５８kDの見掛けＭＷの単一バンドとして表れた。
【０１２９】
実施例XI：
組換えタンパク質ＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−３ Ｈｉｓの精製：
組換え細菌ＡＲ１２０（ｐＲＩＴ１４６４６）を３０℃で、フェド・バッチ条件下で２０リッター発酵槽中で増殖させた。組換えタンパク質の発現は、ナリジクス酸を６０ｇ／mlの最終濃度まで加えることにより誘導した。発酵の終りに細胞を収集し、フレンチプレス破砕機（２０，０００psi ）に２回、通すことにより６０ ＯＤ／６００に溶解した。溶解した細胞を４℃で１５，０００ｇで２０分、ペレット化した。組換えタンパク質を含む上清を、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ pH７．６（緩衝液Ａ）で予め平衡化した交換DEAE Sepharose CL6B 樹脂（Pharmacia ）に充填した。緩衝液Ａでのカラム洗浄の後、融合タンパク質を緩衝液Ａ中２％コリンにより溶出した。抗Ｍａｇｅ−３抗体を用いてウェスタン・ブロット分析により表した陽性抗原画分をプールした。ＤＥＡＥで溶出した抗原を０．５％ Ｅｍｐｉｇｅｎ ＢＢ（両性イオン界面活性剤）に及び０．５Ｍ ＮａＣｌにし、次に０．５％ Ｅｍｐｉｇｅｎ ＢＢ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０mMリン酸緩衝液 pH７．６（緩衝液Ｂ）で予め平衡化したIon Metal Affinityクロマトグラフィーカラムに充填した。
【０１３０】
ＩＭＡＣカラムを２８０nmの吸光度がベースラインに達するまで緩衝液Ｂで洗った。界面活性剤を除去するためのＥｍｐｉｇｅｎ ＢＢを含まない緩衝液Ｂ（緩衝液Ｃ）での第２の洗浄を行い、次に抗原を緩衝液Ｃ中のイミダゾール勾配０〜２５０mMにより溶出した。
０．０９０〜０．２５０Ｍイミダゾール画分をプールし、１０kDa Ｆｉｌｔｒｏｎオメガ膜で濃縮し、次にＰＢＳ緩衝液に対して透析した。
【０１３１】
結論：
我々は、融合タンパク質ＬＰＤ−ＭＡＧＥ３−Ｈｉｓがマウスにおいて免疫原性であること、及びこの免疫原性（増殖性応答及び抗体応答）は、上述のアジュバントの使用により更に増加させることができることを証明した。精製は、ジスルフィド結合を形成するチオールを誘導化することにより増強することができる。
【０１３２】
我々は、アジュバントの存在下でのＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓでのワクチン接種によりより優れた抗体応答が誘発されることも証明した。Ｃ５７ＢＬ／６の血清中に見い出される主要なアイソタイプがＩｇＧ２ｂであることは、ＴＨ１型免疫応答が生じたことを示唆する。
ヒトにおいてアジュバントを加えない製剤中のＬＰＤ−ＭＡＧＥ３−Ｈｉｓで患者を臨床的に処置すると、黒色腫を除去した。
【０１３３】
【表２】
【０１３４】
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ） ヘモフィルス・インフルエンゼＢ（Heamophilus influenzae B）由来のプロテインＤ、又はプロテインＤの最初の約１／３もしくはプロテインＤのＮ末端１０９もしくは１００〜１１０アミノ酸を含むそのフラグメント；
（ｉｉ） インフルエンザ由来のＮＳ１プロテイン、又はＮＳ１プロテインのＮ末端８１アミノ酸を含むそのフラグメント；あるいは
（ｉｉｉ） ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）由来のＬｙｔＡ、又は（ａ）Ｌｙｔ−ＡのＣ末端部分；（ｂ）残基１７８で始まるＣ末端中に発見されるＬｙｔＡ分子の反復部分；及び／又は（ｃ）ＬｙｔＡのアミノ酸残基１８８〜３０５を含むそのフラグメント、から選択される融合パートナーに連結したＭＡＧＥ遺伝子のファミリーによりコードされる抗原を含む融合タンパク質。
【請求項２】
アフィニティータグを更に含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記プロテインＤが、プロテインＤの脂質化形態である、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記抗原が、ＭＡＧＥ Ａ１，ＭＡＧＥ Ａ２，ＭＡＧＥ Ａ３，ＭＡＧＥ Ａ４，ＭＡＧＥ Ａ５，ＭＡＧＥ Ａ６，ＭＡＧＥ Ａ７，ＭＡＧＥ Ａ８，ＭＡＧＥ Ａ９，ＭＡＧＥ Ａ１０，ＭＡＧＥ Ａ１１，ＭＡＧＥ Ａ１２，ＭＡＧＥ Ｂ１，ＭＡＧＥ Ｂ２，ＭＡＧＥ Ｂ３，ＭＡＧＥ Ｂ４，ＭＡＧＥ Ｃ１及びＭＡＧＥ Ｃ２から選択されるＭＡＧＥ遺伝子によりコードされる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項６】
請求項５の核酸を含むベクター。
【請求項７】
請求項６のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質又は請求項５に記載の核酸を含有するワクチン。
【請求項９】
アジュバント、及び／又は免疫刺激性サイトカインもしくはケモカインを更に含む請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記タンパク質が、水中油又は油中水エマルションビヒクルに供される、請求項８又は９に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記アジュバントが、３Ｄ−ＭＰＬ，ＱＳ２１又はＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む、請求項９又は１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
１又は複数の他の抗原を更に含む、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１３】
医薬に用いるための請求項８〜１２のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１４】
黒色腫、又は乳癌、膀胱癌、肺癌、ＮＳＣＬＣ、頭部の癌及び扁平上皮癌、結腸癌及び食道癌を含む他のＭＡＧＥ関連腫瘍を患う患者を免疫療法的に治療するためのワクチンにおける使用のための請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質又は請求項５に記載の核酸。
【請求項１５】
ＭＡＧＥ関連腫瘍を患う患者を免疫療法的に治療するためのワクチンにおける使用のための誘導化チオール残基を含むＭＡＧＥファミリー由来の腫瘍関連抗原誘導体であるタンパク質であって、ここで該ＭＡＧＥ関連腫瘍が乳癌、膀胱癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭部の癌及び扁平上皮癌、結腸癌及び食道癌から選択される、タンパク質。
【請求項１６】
前記誘導化遊離チオールが、カルボキシアミド化又はカルボキシメチル化される、請求項１５に記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記抗原が、プロテインＤもしくはプロテインＤの最初の約１／３を含むプロテインＤの誘導体から選択される融合パートナーを含む、請求項１５又は１６に記載のタンパク質。
【請求項１８】
前記抗原がアフィニティータグを含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１９】
前記プロテインＤ又はそのフラグメントが脂質化される、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２０】
前記ＭＡＧＥタンパク質が、ＭＡＧＥ Ａ１，ＭＡＧＥ Ａ２，ＭＡＧＥ Ａ３，ＭＡＧＥ Ａ４，ＭＡＧＥ Ａ５，ＭＡＧＥ Ａ６，ＭＡＧＥ Ａ７，ＭＡＧＥ Ａ８，ＭＡＧＥ Ａ９，ＭＡＧＥ Ａ１０，ＭＡＧＥ Ａ１１，ＭＡＧＥ Ａ１２，ＭＡＧＥ Ｂ１，ＭＡＧＥ Ｂ２，ＭＡＧＥ Ｂ３，ＭＡＧＥ Ｂ４，ＭＡＧＥ Ｃ１及びＭＡＧＥ Ｃ２から選択される、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２１】
前記ワクチンが、アジュバント、及び／又は免疫刺激性サイトカインもしくはケモカインを更に含む、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２２】
前記タンパク質が、水中油又は油中水エマルションビヒクルに供される、請求項２１に記載のタンパク質。
【請求項２３】
前記アジュバントが、３Ｄ−ＭＰＬ，ＱＳ２１又はＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む、請求項２１又は２２に記載のタンパク質。
【請求項２４】
１又は複数の他の抗原を更に含む、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２５】
ＭＡＧＥタンパク質の精製又は製造方法であって、該タンパク質のジスルフィド結合を還元すること、及び得られた遊離チオール基をブロッキング基でブロッキングすることを含み、そして１又は複数のクロマトグラフィーステップを更に含み、ここで該タンパク質は強カオトロピック剤又は両性イオン界面活性剤を使用して可溶化される、方法。
【請求項２６】
前記カオトロピック剤が、尿素又は塩酸グアニジウムである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記両性イオン界面活性剤が、エンピゲンＢＢ−ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ブロッキング剤がアルキル化剤である、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ブロッキング剤がα−ハロ酸及び／又はα−ハロアミドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ブロッキング剤が、１又は複数の以下の群：ヨード酢酸；ヨードアセトアミド；Ｎ−エチルマレイミド；クロロアセチルホスフェート；Ｏ−メチルイソウレア；及びアクリロニトリルである、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記タンパク質がアフィニティータグを含む、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記アフィニティータグが、ＣＬｙｔＡ又はポリヒスチジンテールである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記アフィニティータグを含むタンパク質が、ブロッキングステップ後にアフィニティークロマトグラフィーにかけられる、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記アフィニティークロマトグラフィーが、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記金属イオンが、亜鉛、ニッケル、鉄、マグネシウム又は銅から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記アフィニティークロマトグラフィーが、両性イオン界面活性剤エンピゲンＢＢを含有する緩衝液を使用して行われる、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記タンパク質が、ＭＡＧＥ抗原及び融合パートナーを含む融合タンパク質である、請求項２５〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記融合パートナーが、ヘモフィルス・インフルエンゼＢ（Heamophilus influenzae B）由来のプロテインＤもしくはプロテインＤの最初の１／３を含むそのフラグメント、インフルエンザ由来のＮＳ１プロテインもしくはＮＳ１のＮ末端８１アミノ酸を含むそのフラグメント、又はストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）由来のＬｙｔＡもしくはＬｙｔＡの残基１８８〜３０５を含むそのフラグメントである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記融合パートナーがプロテインＤの脂質化形態である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記タンパク質が、ＬｙｔＡもしくは残基１８８〜３０５を含むそのフラグメントを含み、そしてここで該タンパク質がコリン又はコリンアナログ、例えばＤＥＡＥに対するアフィニティークロマトグラフィーにより精製される、請求項３２〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＭＡＧＥ抗原が、ＭＡＧＥ Ａ１，ＭＡＧＥ Ａ２，ＭＡＧＥ Ａ３，ＭＡＧＥ Ａ４，ＭＡＧＥ Ａ５，ＭＡＧＥ Ａ６，ＭＡＧＥ Ａ７，ＭＡＧＥ Ａ８，ＭＡＧＥ Ａ９，ＭＡＧＥ Ａ１０，ＭＡＧＥ Ａ１１，ＭＡＧＥ Ａ１２，ＭＡＧＥ Ｂ１，ＭＡＧＥ Ｂ２，ＭＡＧＥ Ｂ３，ＭＡＧＥ Ｂ４，ＭＡＧＥ Ｃ１及びＭＡＧＥ Ｃ２から選択される、請求項２５〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
ワクチンの製造方法であって、請求項２５〜４１のいずれか１項に記載の方法によりＭＡＧＥタンパク質を産生又は精製する工程、及び得られたタンパク質をワクチンとして調剤する工程を含む方法。
【請求項１】
（ｉ） ヘモフィルス・インフルエンゼＢ（Heamophilus influenzae B）由来のプロテインＤ、又はプロテインＤの最初の約１／３もしくはプロテインＤのＮ末端１０９もしくは１００〜１１０アミノ酸を含むそのフラグメント；
（ｉｉ） インフルエンザ由来のＮＳ１プロテイン、又はＮＳ１プロテインのＮ末端８１アミノ酸を含むそのフラグメント；あるいは
（ｉｉｉ） ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）由来のＬｙｔＡ、又は（ａ）Ｌｙｔ−ＡのＣ末端部分；（ｂ）残基１７８で始まるＣ末端中に発見されるＬｙｔＡ分子の反復部分；及び／又は（ｃ）ＬｙｔＡのアミノ酸残基１８８〜３０５を含むそのフラグメント、から選択される融合パートナーに連結したＭＡＧＥ遺伝子のファミリーによりコードされる抗原を含む融合タンパク質。
【請求項２】
アフィニティータグを更に含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記プロテインＤが、プロテインＤの脂質化形態である、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記抗原が、ＭＡＧＥ Ａ１，ＭＡＧＥ Ａ２，ＭＡＧＥ Ａ３，ＭＡＧＥ Ａ４，ＭＡＧＥ Ａ５，ＭＡＧＥ Ａ６，ＭＡＧＥ Ａ７，ＭＡＧＥ Ａ８，ＭＡＧＥ Ａ９，ＭＡＧＥ Ａ１０，ＭＡＧＥ Ａ１１，ＭＡＧＥ Ａ１２，ＭＡＧＥ Ｂ１，ＭＡＧＥ Ｂ２，ＭＡＧＥ Ｂ３，ＭＡＧＥ Ｂ４，ＭＡＧＥ Ｃ１及びＭＡＧＥ Ｃ２から選択されるＭＡＧＥ遺伝子によりコードされる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項６】
請求項５の核酸を含むベクター。
【請求項７】
請求項６のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質又は請求項５に記載の核酸を含有するワクチン。
【請求項９】
アジュバント、及び／又は免疫刺激性サイトカインもしくはケモカインを更に含む請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記タンパク質が、水中油又は油中水エマルションビヒクルに供される、請求項８又は９に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記アジュバントが、３Ｄ−ＭＰＬ，ＱＳ２１又はＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む、請求項９又は１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
１又は複数の他の抗原を更に含む、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１３】
医薬に用いるための請求項８〜１２のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１４】
黒色腫、又は乳癌、膀胱癌、肺癌、ＮＳＣＬＣ、頭部の癌及び扁平上皮癌、結腸癌及び食道癌を含む他のＭＡＧＥ関連腫瘍を患う患者を免疫療法的に治療するためのワクチンにおける使用のための請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質又は請求項５に記載の核酸。
【請求項１５】
ＭＡＧＥ関連腫瘍を患う患者を免疫療法的に治療するためのワクチンにおける使用のための誘導化チオール残基を含むＭＡＧＥファミリー由来の腫瘍関連抗原誘導体であるタンパク質であって、ここで該ＭＡＧＥ関連腫瘍が乳癌、膀胱癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭部の癌及び扁平上皮癌、結腸癌及び食道癌から選択される、タンパク質。
【請求項１６】
前記誘導化遊離チオールが、カルボキシアミド化又はカルボキシメチル化される、請求項１５に記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記抗原が、プロテインＤもしくはプロテインＤの最初の約１／３を含むプロテインＤの誘導体から選択される融合パートナーを含む、請求項１５又は１６に記載のタンパク質。
【請求項１８】
前記抗原がアフィニティータグを含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１９】
前記プロテインＤ又はそのフラグメントが脂質化される、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２０】
前記ＭＡＧＥタンパク質が、ＭＡＧＥ Ａ１，ＭＡＧＥ Ａ２，ＭＡＧＥ Ａ３，ＭＡＧＥ Ａ４，ＭＡＧＥ Ａ５，ＭＡＧＥ Ａ６，ＭＡＧＥ Ａ７，ＭＡＧＥ Ａ８，ＭＡＧＥ Ａ９，ＭＡＧＥ Ａ１０，ＭＡＧＥ Ａ１１，ＭＡＧＥ Ａ１２，ＭＡＧＥ Ｂ１，ＭＡＧＥ Ｂ２，ＭＡＧＥ Ｂ３，ＭＡＧＥ Ｂ４，ＭＡＧＥ Ｃ１及びＭＡＧＥ Ｃ２から選択される、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２１】
前記ワクチンが、アジュバント、及び／又は免疫刺激性サイトカインもしくはケモカインを更に含む、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２２】
前記タンパク質が、水中油又は油中水エマルションビヒクルに供される、請求項２１に記載のタンパク質。
【請求項２３】
前記アジュバントが、３Ｄ−ＭＰＬ，ＱＳ２１又はＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む、請求項２１又は２２に記載のタンパク質。
【請求項２４】
１又は複数の他の抗原を更に含む、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２５】
ＭＡＧＥタンパク質の精製又は製造方法であって、該タンパク質のジスルフィド結合を還元すること、及び得られた遊離チオール基をブロッキング基でブロッキングすることを含み、そして１又は複数のクロマトグラフィーステップを更に含み、ここで該タンパク質は強カオトロピック剤又は両性イオン界面活性剤を使用して可溶化される、方法。
【請求項２６】
前記カオトロピック剤が、尿素又は塩酸グアニジウムである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記両性イオン界面活性剤が、エンピゲンＢＢ−ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ブロッキング剤がアルキル化剤である、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ブロッキング剤がα−ハロ酸及び／又はα−ハロアミドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ブロッキング剤が、１又は複数の以下の群：ヨード酢酸；ヨードアセトアミド；Ｎ−エチルマレイミド；クロロアセチルホスフェート；Ｏ−メチルイソウレア；及びアクリロニトリルである、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記タンパク質がアフィニティータグを含む、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記アフィニティータグが、ＣＬｙｔＡ又はポリヒスチジンテールである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記アフィニティータグを含むタンパク質が、ブロッキングステップ後にアフィニティークロマトグラフィーにかけられる、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記アフィニティークロマトグラフィーが、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記金属イオンが、亜鉛、ニッケル、鉄、マグネシウム又は銅から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記アフィニティークロマトグラフィーが、両性イオン界面活性剤エンピゲンＢＢを含有する緩衝液を使用して行われる、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記タンパク質が、ＭＡＧＥ抗原及び融合パートナーを含む融合タンパク質である、請求項２５〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記融合パートナーが、ヘモフィルス・インフルエンゼＢ（Heamophilus influenzae B）由来のプロテインＤもしくはプロテインＤの最初の１／３を含むそのフラグメント、インフルエンザ由来のＮＳ１プロテインもしくはＮＳ１のＮ末端８１アミノ酸を含むそのフラグメント、又はストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）由来のＬｙｔＡもしくはＬｙｔＡの残基１８８〜３０５を含むそのフラグメントである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記融合パートナーがプロテインＤの脂質化形態である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記タンパク質が、ＬｙｔＡもしくは残基１８８〜３０５を含むそのフラグメントを含み、そしてここで該タンパク質がコリン又はコリンアナログ、例えばＤＥＡＥに対するアフィニティークロマトグラフィーにより精製される、請求項３２〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＭＡＧＥ抗原が、ＭＡＧＥ Ａ１，ＭＡＧＥ Ａ２，ＭＡＧＥ Ａ３，ＭＡＧＥ Ａ４，ＭＡＧＥ Ａ５，ＭＡＧＥ Ａ６，ＭＡＧＥ Ａ７，ＭＡＧＥ Ａ８，ＭＡＧＥ Ａ９，ＭＡＧＥ Ａ１０，ＭＡＧＥ Ａ１１，ＭＡＧＥ Ａ１２，ＭＡＧＥ Ｂ１，ＭＡＧＥ Ｂ２，ＭＡＧＥ Ｂ３，ＭＡＧＥ Ｂ４，ＭＡＧＥ Ｃ１及びＭＡＧＥ Ｃ２から選択される、請求項２５〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
ワクチンの製造方法であって、請求項２５〜４１のいずれか１項に記載の方法によりＭＡＧＥタンパク質を産生又は精製する工程、及び得られたタンパク質をワクチンとして調剤する工程を含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公開番号】特開２００９−２０１５１０（Ｐ２００９−２０１５１０Ａ）
【公開日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００９−１２０４０９（Ｐ２００９−１２０４０９）
【出願日】平成２１年５月１８日（２００９．５．１８）
【分割の表示】特願２０００−５３０６０２（Ｐ２０００−５３０６０２）の分割
【原出願日】平成１１年２月２日（１９９９．２．２）
【出願人】（３０５０６０２７９）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (169)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１２０４０９（Ｐ２００９−１２０４０９）
【出願日】平成２１年５月１８日（２００９．５．１８）
【分割の表示】特願２０００−５３０６０２（Ｐ２０００−５３０６０２）の分割
【原出願日】平成１１年２月２日（１９９９．２．２）
【出願人】（３０５０６０２７９）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (169)
【Ｆターム（参考）】
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