Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド、ウアバインアンタゴニスト、それらの検定および使用
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃリガンド、それらの検定および使用を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明者：ジ・ジャン・ジー（Zi-Jian Xie），シュイ・シ（Shuyi Si），ツォンビン・ツァン（Zhongbing Zhang），ヨゼフ・Ｉ・シャピロ（Joseph I. Shapiro）
関連出願のクロス・リファレンス
[0001]本出願は、本明細書中にその開示が援用される、２００９年９月１６日出願の米国仮出願第６１／２４３，０３６号の恩典を請求する。
【０００２】
連邦政府後援による研究に関する供述
[0002]本発明は、政府援助で行われており、政府が、国立衛生研究所（National Institutes of Health）（ＮＩＨ）ＧＭ７８５６５、ＨＬ３６６５７３および２００７ＤＦＡ３１３７０の下で、本発明の権利を有する。
【０００３】
[0003]本発明は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドおよびそれらの使用に関する。本発明は、更に、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼのアゴニストおよび／またはアンタゴニスト活性について物質をスクリーニングする方法およびキット、および本明細書中に記載のスクリーニング方法によって識別された物質で疾患または障害を処置するまたは予防する方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００４】
[0004]ナトリウムポンプとしても知られるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、ＡＴＰを加水分解することによって形質膜を越えてＮａ＋およびＫ＋を輸送する偏在性膜貫通酵素である。それは、ポンピングサイクル中にＥ１とＥ２の立体配座状態の間を遷移するＰ型ＡＴＰアーゼのファミリーに属する。その機能性酵素は、主に、αおよびβサブユニットから構成されている。αサブユニットは、それが、ヌクレオチドおよび陽イオン双方の結合部位を含有するので、ホロ酵素の触媒成分である。興味深いことに、過去数年間の研究は、シグナル伝達などの、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの多くの非ポンピング機能を発見した。具体的には、シグナリングＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、カベオラ中に存在し、そしてＳｒｃ、ＩＰ３受容体およびカベオリン−１などの多数のシグナリングタンパク質と相互作用する。Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼとＩＰ３受容体との間の相互作用は、Ｃａ２＋シグナリングを促進するが、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼとＳｒｃとの間の動的会合は、細胞内Ｓｒｃ活性を調節し、そして強心ステロイドがプロテインキナーゼカスケードを刺激することを可能にする。
【０００５】
[0005]強心ステロイド（ＣＴＳ）には、ジゴキシンおよびウアバインなどの植物由来ジギタリス薬；およびブファリン（bufalin）およびマリノブファゲニン（marinobufagenin）（ＭＢＧ）などの脊椎動物由来アグリコンが含まれる。
【０００６】
[0006]ＣＴＳは、それらの発見以来、薬物としてだけ考えられてきたが、最近の研究は、ウアバインおよびＭＢＧ双方を、アンギオテンシンIIおよび副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）を含めた多様な刺激物質によってその生産および分泌が調節される内因性ステロイドとして識別した。識別され且つ特性決定された循環性ＣＴＳの内、ウアバインは、依然として最も研究されている。更に、ＣＴＳの濃度は、高食塩負荷、慢性腎不全（ＣＲＦ）およびうっ血性心不全（ＣＨＦ）の臨床状態の下で顕著に増加した。臨床的に、ジギタリス薬は、それらが、心臓への十分に証明された変力作用を有するので、うっ血性心不全を処置するのに用いることができる。
【０００７】
[0007]臨床的に、これらステロイドは、それらが、心臓への十分に証明された変力作用を有するので、うっ血性心不全を処置するのに用いることができる。Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、これらステロイドの受容体として役立つことが知られている。Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼへのＣＴＳの結合は、ポンピング機能を阻害すると同時に、それは、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼのシグナリング機能を刺激する。例えば、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ受容体複合体へのウアバインの結合は、Ｓｒｃキナーゼを刺激する。活性化したＳｒｃは、順次、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）などの受容体チロシンキナーゼをトランス活性化し、そしてチロシンキナーゼシグナルを、セリン／トレオニンキナーゼ、リピドキナーゼおよびリパーゼの刺激へ、更には、反応性酸素種（ＲＯＳ）の増加した生産へ変換する。興味深いことに、ＣＴＳによるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの阻害は、これら薬物が心臓収縮機能を増加させるのに不可欠であるが、これらステロイドによるプロテインキナーゼの刺激および引き続きのＲＯＳ生産の増加も、動物研究において心臓肥大および線維症を引き起こす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
[0008]数名の共同発明者は、ここにおいて、本明細書中にそれら出願が特に援用される、２００８年７月３１日出願の係属出願米国出願第１２／０８７，９７６号［２００７年１月３０日出願のＰＣＴ／ＵＳ０７／００２３６５号（２００７年８月９日公開ＷＯ２００７／０８９６８８号）から優先権を主張、２００６年１月３１日出願の米国出願第６０／７６３，７８３号から優先権を主張］に開示のように、「Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼリガンド」を発見した。
【０００９】
[0009]数名の共同発明者は、ここにおいて、本明細書中に特に援用される、２００９年４月２３日出願の係属出願米国出願第１２／４４６，８５６号［２００７年１０月１７日出願のＰＣＴ／ＵＳ０７／０２３０１１号（２００８年５月８日公開ＷＯ２００８／０５４７９２号）から優先権を主張、２００６年１０月１６日出願の米国出願第６０／８５５，４８２号から優先権を主張］に開示のように、「Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼ特異的ペプチド阻害剤／ＳｒｃおよびＳｒｃファミリーキナーゼのアクチベーター」を発見した。
【００１０】
[0010]更に、数名の共同発明者は、ここにおいて、本明細書中に特に援用される、２００８年１０月２８日出願の係属出願米国出願第６１／１０９，３８６号に開示のように、「Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼ発現を調節する方法および癌の療法としてのそれらの使用」を発見した。
【００１１】
[0011]更に、数名の共同発明者は、ここにおいて、本明細書中に特に援用される、２００８年１２月１２日出願の係属出願米国出願第６１／１２２，２０５号に開示のように、「ＣＴＳのアンタゴニストとしてのおよび癌の治療薬としてのＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼ由来ペプチド」を発見した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
[0012]広い側面において、本明細書中において、強心ステロイド（ＣＴＳ）とは異なる新規なクラスの化合物であって、プロテインキナーゼを活性化することなくＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを阻害するこのような化合物を提供する。
【００１３】
[0013]別の広い側面において、本明細書中において、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼのイオンポンピング機能を調節するＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを含む化合物のクラスを提供する。
【００１４】
[0014]別の広い側面において、本明細書中において、ＣＴＳで誘発されるプロテインキナーゼカスケード活性化に拮抗するＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを含む化合物のクラスを提供する。
【００１５】
[0015]別の広い側面において、本明細書中において、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを用いる一つまたはそれを超える検定を提供する。
[0016]本発明のいろいろな目的および利点は、以下の詳細な説明および好ましい態様から、添付の図面に照らして読んだ場合に、当業者に明らかになるであろう。
【００１６】
[0017]特許または出願の書類は、色彩および／または一つまたはそれを超える写真で作成された一つまたはそれを超える図面を含有してよい。一つまたは複数の色彩図面および／または一つまたは複数の写真を含む本特許または特許出願公報のコピーは、必要料金の請求・支払いで、特許庁により提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】[0018]図１Ａ：ウアバイン（図１Ａ上部）およびＭＢ７（３，４，５，６−テトラヒドロキシキサントン）（図１Ａ下部）の濃度曲線を示すグラフ。
【図１Ｂ】[0019]図１Ｂ：キサントン（左）およびクエルセチン（右）の化学構造。
【図２Ａ】[0020]図２Ａ：Ｎａ＋（図２Ａ）ＡＴＰ（図２Ｂ）依存性へのＭＢ７の作用。Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性は、「実験手順」に記載のように、Ｎａ＋またはＡＴＰ濃度の関数として測定した。ＭＢ７は、１０μＭで用いた。
【図２Ｂ】[0020]図２Ｂ：Ｎａ＋（図２Ａ）ＡＴＰ（図２Ｂ）依存性へのＭＢ７の作用。Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性は、「実験手順」に記載のように、Ｎａ＋またはＡＴＰ濃度の関数として測定した。ＭＢ７は、１０μＭで用いた。
【図３】[0021]図３：受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体へのＭＢ７およびウアバインの作用。精製Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ（２μｇ）および精製Ｓｒｃを、１０μＭウアバインかまたは１μＭおよび１０μＭのＭＢ７の存在下において１５分間インキュベートし、Ｓｒｃ活性化について「実験手順」に記載のように検定した。値は、少なくとも３回の独立した実験の平均ＳＥである。対照と比較して＊＊ｐ＜０．０１。
【図４Ａ】[0022]図４Ａ：ＳｒｃおよびＥＲＫへのＭＢ７およびウアバインの作用。Ａ５４９細胞を、ウアバインまたはＭＢ７で１０分間処理し、そして細胞溶解産物（５０μｇ／レーン）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｓｒｃ活性化について図３の場合のように分析した。値は、４回の別々の実験による平均±Ｓ．Ｅ．である。対照に対して＊，ｐ＜０．０５。
【図４Ｂ】[0023]図４Ｂ：ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、ＭＢ７またはウアバインで１０分間処理し、そしてＥＲＫ／ＭＡＰＫ（Phospho−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）リン酸化／トランスロケーション細胞基剤検定キット（Phosphorylation／Translocation Cell-Based Assay Kit）で、製造者の取扱説明書にしたがって免疫染色した。画像は、「実験手順」に記載のように集めた。スケールバーは、５０μＭである。代表的な実験による画像を示している。ｐ−ＥＲＫの定量的データは、３回の独立した実験における４０の異なった視野から集め、平均±Ｓ．Ｅ．として表した。対照に対して＊，ｐ＜０．０５。
【図５Ａ】[0024]図５Ａ：Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼポンピングサイクルの Albers-Post スキーム
【図５Ｂ】[0025]図５Ｂ：Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ相互作用のモデル化。Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼのＡドメイン（Ｎ末端およびＣＤ）を青色に、Ｐドメインを緑色に、Ｎドメインを黒色に標識した。ＳｒｃのＳＨ２ドメインを橙色に、キナーゼドメインを淡青色に標識した。
【図６Ａ】[0026]図６Ａ：受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ活性へのＮａ＋およびＫ＋濃度変化の作用。精製Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ（２ｕｇ）を、指定のイオン濃度を有する Tris／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液中に再懸濁させ、精製ｃ−Ｓｒｃと一緒に１５分間インキュベートした。次に、３ｍＭ Ｍｇ２＋／ＡＴＰを、反応混合物に加え、更に１０分間インキュベートした。試料を、ウェスタンブロットで分析した。値は、４回の別々の実験の平均±ＳＥである。
【図６Ｂ】[0027]図６Ｂ：受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ活性へのＫ＋の作用。検定は、図６Ａの場合のように、１５ｍＭ ＮａＣｌおよび指定の異なった濃度のＫＣｌの存在下で行った。３回の別々の実験の代表的なウェスタンブロットを示している。
【図７Ａ】[0028]図７Ａ〜７Ｃ：ＭＢ５によるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの用量依存性阻害。図７Ａ：低親和性および高親和性双方の二相阻害。
【図７Ｂ】[0028]図７Ａ〜７Ｃ：ＭＢ５によるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの用量依存性阻害。図７Ｂ〜７Ｃ：ＭＢ５はＭＢ７よりも効力があることが注目される、ＭＢ５（図７Ｂ）およびＭＢ７（図７Ｃ）による高親和性阻害の用量反応。
【図７Ｃ】[0028]図７Ａ〜７Ｃ：ＭＢ５によるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの用量依存性阻害。図７Ｂ〜７Ｃ：ＭＢ５はＭＢ７よりも効力があることが注目される、ＭＢ５（図７Ｂ）およびＭＢ７（図７Ｃ）による高親和性阻害の用量反応。
【図８】[0029]図８：精製Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼに結合するウアバインへのＭＢ５の作用。精製Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ（２μｇ）を、２０ｎＭ３Ｈウアバインと一緒に、異なった濃度のＭＢ５の存在下においてインキュベートした。
【図９Ａ】[0030]図９Ａ：ＥＲＫへのＭＢ５の作用。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、異なった濃度のＭＢ５（１ｎＭ、１０μＭ）に１０分間暴露後、活性なＥＲＫについて「実験手順」に記載のように検定した。代表的な組の画像を示している。同じ実験を３回繰り返した。
【図９Ｂ】[0031]図９Ｂ：ウアバインで誘発されるＥＲＫ活性化へのＭＢ５の作用。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、異なった濃度のＭＢ５（１ｎＭ、１０μＭ）で１５分間前処理し、１ｎＭウアバインに１０分間暴露し、そして活性なＥＲＫについて図９Ａの場合のように検定した。代表的な組の画像を示している。
【図９Ｃ】[0032]図９Ｃ：ウアバインで誘発されるＥＲＫ活性化へのＭＢ５の作用。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、異なった濃度のＭＢ５（１ｎＭ、１０μＭ）で１５分間前処理し、１００ｎＭウアバインに１０分間暴露し、そして活性なＥＲＫについて図９Ａの場合のように検定した。代表的な組の画像を示している。
【図９Ｄ】[0033]図９Ｄ：ウアバインで誘発されるＥＲＫ活性化へのＭＢ５の作用。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、異なった濃度のＭＢ５（１ｎＭ、１０μＭ）で１５分間前処理し、１ｎＭウアバインに１時間暴露し、そして活性なＥＲＫについて図９Ａの場合のように検定した。代表的な組の画像を示している。
【図９Ｅ】[0034]図９Ｅ：刺激物質で誘発されるＥＲＫ活性化へのＭＢ５の作用。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、異なった濃度のＭＢ５（１ｎＭ、１０μＭ）で１５分間前処理し、上皮増殖因子（ＥＧＦ）またはドーパミン刺激物質に１０分間かまたは３分間暴露し、そして活性なＥＲＫについて図９Ａの場合のように検定した。代表的な組の画像を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
[0035]本開示を通して、いろいろな公報、特許および公開特許明細書を、確認引用によって論及している。これら公報、特許および公開特許明細書の開示は、本発明が関する当該技術分野の状態をより十分に記載するために、本開示に援用される。
【００１９】
[0036]本発明は、少なくとも一部分は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼで媒介されるＳｒｃ調節の新規な分子機構についての本発明者の発見と、（ｉ）Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼへのＮａ＋およびＡＴＰ双方の親和性を減少させる、および（ii）ウアバインで誘発されるキナーゼカスケード活性化を無効にしうるアンタゴニストとして作用するヒドロキシルキサントン誘導体の識別とに基づく。
【００２０】
[0037]本発明を、次の実施例において更に定義するが、ここにおいて、部および百分率は全て、重量により、そして度は、特に断らない限り、摂氏である。これら実施例は、本発明の好ましい態様を示しているが、単に例示するものとして与えられているということは理解されるべきである。上の考察およびこれら実施例により、当業者は、本発明の本質的な特徴を確かめることができるし、そしてその精神および範囲から逸脱することなく、いろいろな使用および条件に適合するように、本発明のいろいろな変更および修飾を行うことができる。本明細書中に論及される特許および非特許文献を含めた公報は全て、特に援用される。次の実施例は、本発明の特定の好ましい態様を詳しく説明するためのものであり、明記されない限り、請求の範囲に定義の発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００２１】
[0038]実施例Ｉ
[0039]材料：ＡＴＰおよびウアバインは、Sigma（St. Louis, MO）から入手した。Biomol Green は、ＢＩＯＭＯＬ（Plymouth Meeting, PA）から購入した。ＥＲＫ／ＭＡＰＫ（Phospho−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）リン酸化／トランスロケーション細胞基剤検定キットは、Cayman Chemical Company（Ann Arbor, MI）から購入した。精製リコンビナントＳｒｃは、Upstate Biotechnology（Lake Placid, NY）から入手した。多クローン性抗Ｔｙｒ（Ｐ）４１８−Ｓｒｃは、Invitrogen（Camarillo, CA）から入手した。抗ｃ−Ｓｒｃ（Ｂ−１２）単クローン性抗体は、Santa Cruz Biotechnology Inc.（Santa Cruz, CA）製であった。一般的な化学物質は、入手可能な最高純度のものであった。新鮮ブタ腎臓は、近くの畜殺場から購入し、そして酵素製造に用いるまで−８０℃で貯蔵した。
【００２２】
[0040]高処理スクリーニング検定：本研究でスクリーニングに用いた化学物質ライブラリーは、２６００種類の構造的に異なる、薬物様の天然に存在する有機化合物またはそれらの半合成誘導体を含有した。原料化合物は、９６ウェルプレート中においてＤＭＳＯ中に１０ｍｇ／ｍｌで調製した。
【００２３】
[0041]精製Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを、ブタ腎臓から製造した。いろいろな腎臓標品のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの比活性は、９００〜１，２００μｍｏｌ／ｍｇ／時の範囲内であり、全ＡＴＰアーゼ活性の９５％より大であった。高処理スクリーニングは、９６ウェルフォーマットにおいて、次の成分：１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２０ｍＭ Tris−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および０．２μｇの精製Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを含有する１００μｌの最終反応容量で行う。化合物を加えた後、混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、そして反応を、２ｍＭ ＡＴＰ．Ｍｇ混合物を加えることによって開始した。
【００２４】
[0042]反応を、１５分間行った後、１００μｌの氷冷トリクロロ酢酸の添加によって止めた。反応混合物を、遠心分離によって透明にし、そして放出されたホスフェートについて、ＢＩＯＭＯＬ ＧＲＥＥＮＴＭ試薬を製造者の取扱説明書にしたがって用いて検定した。更に、対照Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性を、１ｍＭウアバインの存在下および不存在下で測定し、１００％とした。更に、５μＭウアバインおよび０．１％のＤＭＳＯを、各々のプレート中に、それぞれ、陽性対照およびビヒクル対照として包含した。対照実験は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼによって触媒されたＡＴＰ加水分解が、上の実験条件下の３０分のインキュベーション中に直線範囲内であったということを示した。
【００２５】
[0043]細胞培養：ブタ腎臓上皮細胞（ＬＬＣ−ＰＫ１細胞）およびヒト肺癌細胞（Ａ５４９細胞）を、ＡＴＣＣから入手し、そしてダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンの存在下において、５％ＣＯ２給湿インキュベーター中で維持した。血清中の増殖因子の混同作用を排除するために、特に断らない限り、細胞を２４時間血清欠乏状態とした後、実験を行った。
【００２６】
[0044]ウェスタンブロット分析：細胞を、ＰＢＳで洗浄し、そして前に記載のように（１３）、１％ Nonidet Ｐ−４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭ ＮａＦ、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチンおよび５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を含有する氷冷ＲＩＰＡ緩衝液中に溶解させた。次に、細胞溶解産物を、１４，０００ｒｐｍでの遠心分離によって透明にし、上澄みを、タンパク質検定用に用い、ウェスタンブロット分析を行った。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５０μｇ／レーン）で分離し、セルロースメンブランへ移した。メンブランは、全ＳｒｃおよびＥＲＫについて、ＴＢＳＴ（Tris−ＨＣｌ １０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、Tween ２０、０．１％；ｐＨ８．０）中の３％脱脂粉乳で、またはリン酸化ＳｒｃおよびＥＲＫについて、１％ＢＳＡ＋１％脱脂粉乳で、室温において１時間ブロック後、特異的抗体でプローブした。タンパク質シグナルは、ＥＣＬキットを用いて検出し、Bio-Rad ＧＳ−６７０イメージングデンシトメーターを用いて定量した。
【００２７】
[0045]受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体の活性化についての検定：受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体の活性を検定した。簡単にいうと、精製Ｓｒｃ（４．５Ｕ）を、２μｇの精製Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼと一緒に、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中において３７℃で３０分間インキュベートした。その後、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体を、ウアバインまたはＭＢ７に１０分間暴露した。反応は、２ｍＭ ＡＴＰ／Ｍｇ２＋の添加によって開始し、３７℃で５分間続け、そしてＳＤＳ試料緩衝液の添加によって止めた。Ｓｒｃの活性化は、ウェスタンブロットにより、抗ｐＹ４１８抗体を用いて測定した。全Ｓｒｃを、負荷対照について更にプローブした。
【００２８】
[0046]共焦点画像化および免疫細胞化学：カバーガラス上で増殖したＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、２４時間血清欠乏状態にし、そしてＭＢ７またはウアバインで異なった時間処理した。ｐ−ＥＲＫの免疫染色は、商業的に入手可能なＥＲＫ／ＭＡＰＫ（Phospho−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）Phosphorylation／Translocation Cell-Based Assay Kit を製造者の取扱説明書にしたがって用いて行った。シグナルは、Leica 共焦点顕微鏡によって検出した。Leica 共焦点ソフトウェアを、データ分析に用いた。
【００２９】
[0047]データ分析：データは、平均±Ｓ．Ｅ．として与えている。統計的分析は、スチューデントｔ検定を用いて行い、有意性をｐ＜０．０５で認めた。
[0048]実施例Ｉの結果
[0049]Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤の高処理スクリーニング：Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤について化学物質ライブラリーをスクリーニングするために、本発明者は、９６ウェルフォーマット検定を開発した。
【００３０】
[0050]図１Ａに示されるように、陽性対照としてのウアバインは、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの用量依存性阻害を生じた。もう一方において、ビヒクルであるＤＭＳＯは、反応容量の１％未満の濃度で用いた場合、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性への作用を示さなかった（データは示されていない）。ウアバインの見掛けＩＣ５０は、報告されたものに匹敵する約５μＭであった。同検定を用いて、全２６００種類の化合物を１０μｇ／ｍｌの最終濃度で調べた。この濃度は、大部分の化合物が、約２００の分子質量を有し、したがって、ウアバインのＩＣ５０の１０倍である約５０μＭで調べられているという理由で適応した。各々の９６ウェルプレートにおいて、ウアバイン（５μＭ）を陽性対照として用い、０．１％ＤＭＳＯを陰性対照として用いた。検定は、二重反復試験で行い、そしてＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの少なくとも２５％阻害を生じた化合物を、正ヒットとして識別した。これら実験条件下において、本発明者は、数種類の周知のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤（ミリセチン、オリゴマイシン、レシブホゲニン（resibufogenin）およびシノブファジン（cinobufagin））を包含する全１５種類の正の化合物を発見した（下の表Ｉ）。
【００３１】
【表１】
【００３２】
[0051]新クラスのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドとしてのヒドロキシキサントンの識別：１５種類の正ヒットの内の多くは、６種類のヒドロキシルキサントン誘導体（ＭＢ１〜ＭＢ７）を含めたポリフェノール性化合物である（表Ｉ）。構造的に、それらは、クエルセチン（図１Ｂ）などの十分に特性決定されたポリフェノール性化合物に似ている。次に、本発明者は、これらヒドロキシキサントンの阻害性を決定した。ＭＢ７は、この群で最も効力のある阻害剤であったので（下の表II）、それを、次の研究に用いた。
【００３３】
【表２】
【００３４】
[0052]図１Ａに示される実験において、ＭＢ７の用量反応曲線を、ウアバインと比較した。ウアバインのように、ＭＢ７は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの用量依存性阻害を示した。その見掛けＩＣ５０（５μＭ）は、ウアバインのそれに匹敵する。しかしながら、基質依存性へのＭＢ７の作用を決定した場合、ＭＢ７は、ウアバインとは異なり、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼのＮａ＋およびＡＴＰ双方の親和性を減少させた（図２Ａおよび図２Ｂ）。もう一方において、Ｋ＋濃度の変化は、ＭＢ７で誘発されるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害への作用を示さなかったが（データは示されていない）、ウアバインで誘発される阻害に拮抗した。更に、１０μＭ ＭＢ７は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼへの場合のように、Ｎａ−ＡＴＰアーゼの５８±６％阻害を生じた。総合すると、そのデータは、ヒドロキシキサントンが、ウアバインの場合とは異なった機構によってＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを阻害するということを示している。
【００３５】
[0053]構造・活性関係を決定するために、キサントン、６種類のヒドロキシキサントンおよび数種類のメチル化ヒドロキシキサントン誘導体の用量反応を比較した。表IIに示されるように、キサントンは、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性を阻害できなかったが、フェノール性基の数の増加は、ヒドロキシキサントンの有効性および効力を増加させた（例えば、ＭＢ２とＭＢ５とを比較、表II）。一貫して、完全または部分メチル化は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼへのヒドロキシキサントンの阻害作用を減少させることができた（例えば、ＭＢ５とＭＢ８とを比較）。更に、フェノール性基が、ピロン環中の酸素の近くに（すなわち、４位および５位に）位置した場合、それらは、これら化合物の効力へのより大きい作用を有した（例えば、ＭＢ３とＭＢ５とを比較）。
【００３６】
[0054]ＭＢ７は、受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体を活性化できない：Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、Ｓｒｃキナーゼと相互作用して、プロテインキナーゼカスケードを活性化するウアバインについて機能性受容体複合体を形成する。
【００３７】
[0055]ＭＢ７が、プロテインキナーゼを活性化することが可能なウアバインのように作用するか否か決定するために、本発明者は、最初に、Ｓｒｃ活性へのＭＢ７の作用を、再構成したＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体を用いて測定した。ウアバイン（１０μＭ）を、陽性対照として用いた。図３に示されるように、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、Ｓｒｃを阻害した。しかしながら、驚くべきことに、ＭＢ７ではなくウアバインの添加が、試験管中のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼに会合したＳｒｃを刺激した。この発見は、現在、ＭＢ７が、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの受容体機能を刺激することなく、ＡＴＰアーゼ活性を阻害しうるということを示している。
【００３８】
[0056]上の結果を立証するために、培養細胞中のＳｒｃおよびＥＲＫへのＭＢ７の作用を測定した。再度、ウアバインを陽性対照として用いた。図４Ａに示されるように、１００ｎＭウアバインは、Ａ５４９細胞中においてＳｒｃを刺激したが、１０μＭまでのＭＢ７は、それができなかった。
【００３９】
[0057]更に確かめるために、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、１００ｎＭウアバインかまたは異なった濃度のＭＢ７で処理した。ウアバインは、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞中において、Ｓｒｃを刺激し、引き続き、ＥＲＫカスケードを刺激した。ここにおいて、現在、ウアバインは、免疫染色によって検出される細胞内の活性ＥＲＫ量を増加させたということが分かっている（図４Ｂ）。しかしながら、同じ実験条件下において、ＭＢ７（１００ｎＭ〜１０μＭ）は、細胞内ＥＲＫ活性に影響を与えることができなかった。
【００４０】
[0058]実施例Ｉの考察
[0059]有効な高処理スクリーニング検定を用いて、数種類の構造的に異なるクラスの化合物である１５種類のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤を識別した。更に、新たに識別された阻害剤を、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの基質依存性へのそれらの作用を評価することによって、ウアバインおよびオリゴマイシンなどの他の既知の阻害剤と区別した。新たに識別されたキサントン誘導体は、ウアバインとは異なり、ＡＴＰアーゼ活性を阻害するだけであるが、受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体を活性化することはない。
【００４１】
[0060]新クラスのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤としてのキサントン誘導体：Albers-Post 反応スキームによれば、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、多様な立体配座変化によってＥ１〜Ｅ２状態へ遷移する。Ｎａ＋は、Ｅ１状態に好都合であるが、Ｋ＋は、Ｅ２状態を促進する。何年にもわたって、数種類のクラスの有機Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤が識別されてきた。それらは、異なった立体配座状態で酵素を安定化させることによってＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを阻害する。例えば、ＣＴＳは、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼをＥ２Ｐで結合し且つ安定化するが、オリゴマイシンは、Ｅ１Ｐ〜Ｅ２Ｐ遷移を妨げる。
【００４２】
[0061]比較すると、本発明者は、ここで、新規なリガンドＭＢ７は、それが、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼのＫ＋感受性に影響を与えることなく、Ｎａ＋およびＡＴＰ双方の見掛けの親和性を減少させるので、Ｅ１ＮａＡＴＰの形成を減少させると考えられるということを示している。興味深いことに、キサントンは、それらが双方とも、構造が同じベンゾピロンを共有することから、フラボノイドのような類似の構造を共有する（図１Ｂ）。更に、クエルセチンおよびミリセチンは、周知の効力のあるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤である。しかしながら、ＭＢ７とは異なり、それらは、Ｎａ＋かまたはＡＴＰに対するＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの親和性を減少させない。
【００４３】
[0062]ベンゾピロンへのベンゼン環の縮合は、キサントンとＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼとの相互作用特性を完全に変化させ、それは、キサントン誘導体で誘発されるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害の特異性を強調している。
【００４４】
[0063]更に、表IIに示されるデータは、キサントン誘導体で誘発されるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害におけるフェノール性基の重要性を示している。親化合物キサントンは、ベンゼン環に結合したフェノール性基を有していないし、そしてそれは、検出可能なＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害を示さなかった。テトラヒドロキシキサントンは、最も効力のある阻害剤であるが、ジヒドロキシキサントンは、ＡＴＰアーゼ活性にほとんど影響を与えない。
【００４５】
[0064]理論によって拘束されたくはないが、本発明者は、ここで、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼが、他のＰ型ＡＴＰアーゼと共通の多くの特徴を共有していることから、本明細書中に記載の新たに識別されたキサントン誘導体も、他のイオンポンプに影響を与えるかもしれないと考えている。本発明者は、ここで、マイトマイシンおよび４−エピテトラサイクリンなどの他の正ヒットも、別のクラスの新リガンドである可能性があると考えている。
【００４６】
[0065]キサントン誘導体化合物は、既知のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤とは異なった化学構造を有するので、ここで、本発明者は、異なった機構によって作用する新クラスのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤であると考えている。
【００４７】
[0066]ＭＢ７は、受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体を活性化しない：Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、in vitro でも in vivo でもＳｒｃを結合する。この会合は、Ｓｒｃを不活性状態で保持することによって細胞内Ｓｒｃ活性を調節する（１１）。更に、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体の形成は、ウアバインがポンプに会合したＳｒｃを刺激する機能性受容体を生じ、それが、引き続き、図４に示されるように、ＥＲＫを含めた多様な下流プロテインキナーゼカスケードを組み立て且つ活性化する。
【００４８】
[0067]ウアバインとは対照的に、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体へのＭＢ７の結合は、in vitro でＳｒｃを活性化できなかった（図３）。一貫して、それは、培養細胞にＭＢ７を加えた場合に、細胞内ＳｒｃおよびＥＲＫ活性への作用を有していなかった。この発見は、ＭＢ７が、ウアバインとは異なり、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼからＳｒｃキナーゼドメインを放出させることができるような方法でＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの立体配座を変えることはできないということを示している。ＭＢ７は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを、ウアバインの場合とは異なった方法で阻害する。
【００４９】
[0068]展望：キサントンという名称は、植物、真菌および地衣類の限られた集合において通常見出される二次代謝産物の群を称する。植物由来のキサントンは、主に、ヒメハギ科（Polygalaceae）、オトギリソウ科（Guttiferae）、クワ科（Moraceae）およびリンドウ科（Gentianaceae）という科に関連していると考えられる。これら植物は、伝統的漢方薬に広く用いられてきた。例えば、ポリガラ・テヌイホリア・ウィルド（Polygala tenuifolia Willd.）またはポリガラ・シビリカ・エル（Polygala sibirica L.）の根である Yuanzhi は、いろいろな医学的状態に広範囲に用いられている。フェノール性化合物として、キサントンは、それらの抗酸化性について記載されてきた。これら性質は、それらの抗炎症作用および化学的予防作用に関連していた。キサントンの一つであるジメチルキサンテノン−４−酢酸は、現在、抗腫瘍薬として臨床試験中である。
【００５０】
[0069]新クラスのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤として、キサントンは、心臓収縮機能を増加させることもありうる。このようなキサントンは、それらが、受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体を刺激しないので、大きな価値がある。これは、内因性かまたは外因性のＣＴＳによるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼで媒介されるシグナル伝達の刺激が、心臓成長を変化させ且つ心臓線維症を誘発することから、重要になっている。
【００５１】
[0070]したがって、ＭＢ７およびその類似体は、現在、うっ血性心不全の臨床状態の下でしばしば認められる心臓肥大および／または線維症を引き起こすことなく、収縮機能を改善するのに特に有用であると考えられる。
【００５２】
[0071]実施例II
[0072]材料：ＡＴＰおよびウアバインは、Sigma（St. Louis, MO）から入手した。Biomol Green は、ＢＩＯＭＯＬ（Plymouth Meeting, PA）から購入した。ＥＲＫ／ＭＡＰＫ（Phospho−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）リン酸化／トランスロケーション細胞基剤検定キットは、Cayman Chemical Company（Ann Arbor, MI）から購入した。多クローン性抗Ｔｙｒ（Ｐ）４１８−Ｓｒｃは、Invitrogen（Camarillo, CA）から入手した。抗ｃ−Ｓｒｃ（Ｂ−１２）単クローン性抗体は、Santa Cruz Biotechnology Inc.（Santa Cruz, CA）製であった。一般的な化学物質は、入手可能な最高純度のものであった。新鮮ブタ腎臓は、近くの畜殺場から購入し、そして酵素製造に用いるまで−８０℃で貯蔵した。
【００５３】
[0073]Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ精製および活性検定：精製Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを、ブタ腎臓から製造した。いろいろな腎臓標品のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの比活性は、９００〜１，２００μｍｏｌ／ｍｇ／時の範囲内であり、全ＡＴＰアーゼ活性の９５％より大であった。Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ検定は、５００μｌの最終容量を有する次の反応緩衝液中で行った。１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２０ｍＭ Tris−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および１μｇの精製Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ。化合物を加えた後、混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、そして反応を、２ｍＭ ＡＴＰ．Ｍｇ混合物を加えることによって開始した。反応を、１５分間行った後、３００μｌの氷冷トリクロロ酢酸の添加によって止めた。反応混合物を、遠心分離によって透明にし、そして放出されたホスフェートについて、ＢＩＯＭＯＬ ＧＲＥＥＮＴＭ試薬を製造者の取扱説明書にしたがって用いて検定した。対照実験は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼによって触媒されたＡＴＰ加水分解が、上の実験条件下の３０分のインキュベーション中に直線範囲内であったということを示した。
【００５４】
[0074]細胞培養：ブタ腎臓上皮細胞（ＬＬＣ−ＰＫ１細胞）およびヒト肺癌細胞（Ａ５４９細胞）を、ＡＴＣＣから入手し、そしてダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンの存在下において、５％ＣＯ２給湿インキュベーター中で維持した。血清中の増殖因子の混同作用を排除するために、特に断らない限り、細胞を２４時間血清欠乏状態とした後、実験を行った。
【００５５】
[0075]Ｓｒｃ活性検定およびウェスタンブロット分析：Ｓｒｃ活性へのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼおよびそのリガンドの作用を、ウェスタンブロット法Ｓｒｃ ｐＹ４１８リン酸化によって測定するプロトコルを続けた。ウェスタン分析用の細胞溶解産物を調製するために、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、そして１％ Nonidet Ｐ−４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭ ＮａＦ、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチンおよび５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を含有する氷冷ＲＩＰＡ緩衝液中に溶解させた。次に、細胞溶解産物を、１４，０００ｒｐｍでの遠心分離によって透明にし、上澄みを、タンパク質検定用に用い、ウェスタンブロット分析を行った。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５０μｇ／レーン）で分離し、セルロースメンブランへ移した。メンブランは、全ＳｒｃおよびＥＲＫについて、ＴＢＳＴ（Tris−ＨＣｌ １０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、Tween ２０、０．１％；ｐＨ８．０）中の３％脱脂粉乳で、またはリン酸化ＳｒｃおよびＥＲＫについて、１％ＢＳＡ＋１％脱脂粉乳で、室温において１時間ブロック後、特異的抗体でプローブした。タンパク質シグナルは、ＥＣＬキットを用いて検出し、Bio-Rad ＧＳ−６７０イメージングデンシトメーターを用いて定量した。
【００５６】
[0076]共焦点画像化および免疫細胞化学：カバーガラス上で増殖したＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、２４時間血清欠乏状態にし、そしてＭＢ５またはウアバインで異なった時間処理した。ｐ−ＥＲＫの免疫染色は、商業的に入手可能なＥＲＫ／ＭＡＰＫ（Phospho−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）Phosphorylation／Translocation Cell-Based Assay Kit を製造者の取扱説明書にしたがって用いて行った。シグナルは、Leica 共焦点顕微鏡によって検出した。Leica 共焦点ソフトウェアを、データ分析に用いた。
【００５７】
[0077]データ分析：データは、平均±Ｓ．Ｅ．として与えている。統計的分析は、スチューデントｔ検定を用いて行い、有意性をｐ＜０．０５で認めた。
[0078]実施例IIの結果
[0079]Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、立体配座依存性方式でＳｒｃを調節する：大多数のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、生細胞中においてＳｒｃキナーゼと直接的に相互作用する。その相互作用は、少なくとも２対のタンパク質ドメインを必要とする。具体的には、μ１サブユニットの第二サイトゾルドメインは、ＳｒｃＳＨ２と相互作用し、そしてヌクレオチド結合（Ｎ）ドメインは、Ｓｒｃキナーゼドメインと会合する。ポンピングサイクル中に、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、Ｅ１〜Ｅ２立体配座遷移を行い（図５Ａ）、そこで、Ｎドメインは閉じ、そしてＡドメインは、回転してＮドメイン上に連結する（図５Ｂ）。
【００５８】
[0080]構造モデル化は、ＡドメインとＮドメインの場所およびその間の空間が、Ｅ１状態でのみ、μ１サブユニットがＳＨ２およびキナーゼ双方のドメインに同時に結合するのに適しているということを示している（図５Ｂ）。したがって、本発明者は、ここで、Ｅ１ Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、Ｓｒｃを阻害するが、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼに会合したＳｒｃは、その酵素がＥ２立体配座である時に活性であるべきであると考えている。
【００５９】
[0081]実際上、大多数のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼが、Ｎａ＋不含で且つ５ｍＭ Ｋ＋の緩衝液（４７）中で酵素をインキュベートすることによってＥ２立体配座で安定化している場合に、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼに会合したＳｒｃは、十分に活性になる（図６Ａ）。一貫して、この反応緩衝液への１５０ｍＭ Ｎａ＋の添加は、Ｅ２ Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを不安定にし、それが、Ｓｒｃの失活を引き起こした（図６Ａ）。更に、５ｍＭ〜０へのＫ＋の減少は、緩やかなＳｒｃ活性化を引き起こした（図６Ｂ）。これら結果は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼとＳｒｃとの間の相互作用が、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの立体配座状態の変化によって調節しうるということを示している。更に、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼのＥ１〜Ｅ２立体配座遷移の阻害は、ウアバインで誘発されるＳｒｃ活性化に拮抗するのに用いることができる。
【００６０】
[0082]キサントン誘導体は、効力のあるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤であり、ウアバインがＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼに結合するのを妨げる：Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼをＥ１立体配座で安定化する新Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドのクラスとしての新キサントン誘導体は、実施例Ｉに記載している。
【００６１】
[0083]図１および図７Ａ〜Ｃに示されるように、ヒドロキシキサントンは、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性の二相阻害を示した。ＭＢ５による高親和性阻害は、ｎＭ下濃度で起こって（４０ｐＭのＩＣ５０）、ＡＴＰアーゼ活性の約２５％阻害を生じるが、低親和性結合は、約５０μＭで１００％阻害を生じる。ＭＢ５は、高親和性部位においてＭＢ７より効力があるが、それは、低親和性部位ではより少ない効力を有するということに注目することは興味深い。ウアバインは、Ｅ２ Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを結合することを選択するので、ＭＢ５によるＥ１状態でのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの安定化は、ウアバイン結合に拮抗するのに用いることができる。実際上、図８に示されるように、ＭＢ５は、精製Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼへのウアバイン結合の用量依存性阻害を生じた。有意の阻害は、０．１ｎＭで検出し、そしてＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを１０μＭ ＭＢ５に暴露した場合に、３０％の最大阻害に達した。
【００６２】
[0084]ＭＢ５は、ウアバインで誘発されるプロテインキナーゼ活性化に拮抗するが、ＥＧＦおよびドーパミンで誘発されるプロテインキナーゼ活性化には拮抗しない：ウアバインは、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞中においてＳｒｃ依存性経路によってプロテインキナーゼカスケードを刺激する。ＭＢ５が、ウアバインで誘発されるシグナル伝達に拮抗しうるか否かを決定するために、処理済みＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、異なった濃度のＭＢ５で１５分間前処理後、ウアバインまたは他の刺激物質に暴露した。
【００６３】
[0085]図９Ａ〜９Ｄに示されるように、ウアバイン（１ｎＭおよび１００ｎＭ）は、ＥＲＫを時間・濃度依存性方式で刺激したが、１ｎＭでのＭＢ５は、ウアバインで誘発されるＥＲＫ活性化を有意に減少させることができた。更に、ＭＢ５を１０μＭで用いた場合、それは、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞中においてＥＲＫへのウアバインの作用を完全にブロックした。
【００６４】
[0086]対照的に、同じ実験を、ＥＧＦかまたはドーパミンの存在下で行った場合、ＭＢ５は、これら二つの刺激物質で誘発されるＥＲＫ活性化に影響を与えることができなかった（図９Ｅ）。
【００６５】
[0086]総合すると、これらデータは、ＭＢ５が、プロテインキナーゼカスケードの活性化に対する特異的ウアバインアンタゴニストとして機能しうるということを示している。
[0088]実施例IIの考察
[0089]受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼがＥ２立体配座で安定化している場合に活性化することができるが、Ｅ１ Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、Ｓｒｃを不活性状態で保持する。
【００６６】
[0090]本明細書中に記載しているのは、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼのポンピングおよびシグナリング双方の機能を調節しうる化学物質について有効な高処理スクリーニング検定である。
【００６７】
[0091]高処理検定（実施例Ｉに記載の）は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの阻害によって反映されるように、Ｅ１／Ｅ２立体配座遷移に影響を与える化学物質／組成物を識別するのに有用である。次に、識別された化学物質／組成物を、次のようなＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ受容体複合体のアゴニストとしてかまたはアンタゴニストとして調べることができる。アゴニストとしては、このような化学物質／組成物は、ウアバインのように機能すると考えられ、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼへのそれらの阻害作用は、Ｋ＋濃度を増加させることによって拮抗しうると考えられる。もう一方において、アンタゴニストとしてのそれらは、ＭＢ５のように作用すると考えられ、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼへのウアバイン結合を妨げる。更に、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼへのそれらの阻害作用は、Ｎａ＋濃度を増加させることによって減少しうると考えられる。
【００６８】
[0092]更に、本明細書中に記載しているのは、ウアバインがＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ受容体複合体を活性化させるのを妨げる新規な且つ効力のあるウアバインアンタゴニストのクラスの識別である。続いて、それらウアバインアンタゴニストは、更に、ウアバインで誘発されるＥＲＫ活性化を無効にした。
【００６９】
[0093]これら結果は、少なくとも次の考察について有意である。（１）Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ複合体および／またはＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体は、新しいアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングするのに有用である；（２）本明細書中に記載のキサントン誘導体は、例えば、心臓血管および腎臓のリモデリング、更には、心臓および腎臓の線維症を包含する、内因性ＣＴＳ上昇で誘発される病理学的変化に拮抗する薬剤として有用である；（３）本明細書中に記載のキサントン誘導体は、それらが、収縮機能を改善しうるのみならず、心筋層における構造的リモデリングを妨げることもありうるので、うっ血性心不全を処置する薬剤として有用である；（４）本明細書中に記載のキサントン誘導体は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナリングが、前立腺癌および他の癌の細胞増殖に重要であるので、これら癌を処置する薬剤として有用である；および（５）キサントン誘導体は、現在利用可能な組成物よりも効力があり、毒性が少なく、そしてより良い薬物動態学的性質を有するであろう受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼアンタゴニストの新しい生成に有用である。
【００７０】
[0094]本発明を、いろいろな且つ好ましい態様に関して記載してきたが、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、いろいろな変更を行うことができるし、しかもそれらの要素に均等物を置き換えることができるということは、当業者に理解されるはずである。更に、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、発明の内容に特定の状況または材料を適応させるように多くの修飾を行うことができる。したがって、本発明は、本発明を実施するのに考えられた本明細書中に開示の具体的な態様に制限されるものではなく、本発明は、請求の範囲の範囲内にある全ての態様を包含するであろうということである。
【技術分野】
【０００１】
発明者：ジ・ジャン・ジー（Zi-Jian Xie），シュイ・シ（Shuyi Si），ツォンビン・ツァン（Zhongbing Zhang），ヨゼフ・Ｉ・シャピロ（Joseph I. Shapiro）
関連出願のクロス・リファレンス
[0001]本出願は、本明細書中にその開示が援用される、２００９年９月１６日出願の米国仮出願第６１／２４３，０３６号の恩典を請求する。
【０００２】
連邦政府後援による研究に関する供述
[0002]本発明は、政府援助で行われており、政府が、国立衛生研究所（National Institutes of Health）（ＮＩＨ）ＧＭ７８５６５、ＨＬ３６６５７３および２００７ＤＦＡ３１３７０の下で、本発明の権利を有する。
【０００３】
[0003]本発明は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドおよびそれらの使用に関する。本発明は、更に、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼのアゴニストおよび／またはアンタゴニスト活性について物質をスクリーニングする方法およびキット、および本明細書中に記載のスクリーニング方法によって識別された物質で疾患または障害を処置するまたは予防する方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００４】
[0004]ナトリウムポンプとしても知られるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、ＡＴＰを加水分解することによって形質膜を越えてＮａ＋およびＫ＋を輸送する偏在性膜貫通酵素である。それは、ポンピングサイクル中にＥ１とＥ２の立体配座状態の間を遷移するＰ型ＡＴＰアーゼのファミリーに属する。その機能性酵素は、主に、αおよびβサブユニットから構成されている。αサブユニットは、それが、ヌクレオチドおよび陽イオン双方の結合部位を含有するので、ホロ酵素の触媒成分である。興味深いことに、過去数年間の研究は、シグナル伝達などの、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの多くの非ポンピング機能を発見した。具体的には、シグナリングＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、カベオラ中に存在し、そしてＳｒｃ、ＩＰ３受容体およびカベオリン−１などの多数のシグナリングタンパク質と相互作用する。Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼとＩＰ３受容体との間の相互作用は、Ｃａ２＋シグナリングを促進するが、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼとＳｒｃとの間の動的会合は、細胞内Ｓｒｃ活性を調節し、そして強心ステロイドがプロテインキナーゼカスケードを刺激することを可能にする。
【０００５】
[0005]強心ステロイド（ＣＴＳ）には、ジゴキシンおよびウアバインなどの植物由来ジギタリス薬；およびブファリン（bufalin）およびマリノブファゲニン（marinobufagenin）（ＭＢＧ）などの脊椎動物由来アグリコンが含まれる。
【０００６】
[0006]ＣＴＳは、それらの発見以来、薬物としてだけ考えられてきたが、最近の研究は、ウアバインおよびＭＢＧ双方を、アンギオテンシンIIおよび副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）を含めた多様な刺激物質によってその生産および分泌が調節される内因性ステロイドとして識別した。識別され且つ特性決定された循環性ＣＴＳの内、ウアバインは、依然として最も研究されている。更に、ＣＴＳの濃度は、高食塩負荷、慢性腎不全（ＣＲＦ）およびうっ血性心不全（ＣＨＦ）の臨床状態の下で顕著に増加した。臨床的に、ジギタリス薬は、それらが、心臓への十分に証明された変力作用を有するので、うっ血性心不全を処置するのに用いることができる。
【０００７】
[0007]臨床的に、これらステロイドは、それらが、心臓への十分に証明された変力作用を有するので、うっ血性心不全を処置するのに用いることができる。Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、これらステロイドの受容体として役立つことが知られている。Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼへのＣＴＳの結合は、ポンピング機能を阻害すると同時に、それは、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼのシグナリング機能を刺激する。例えば、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ受容体複合体へのウアバインの結合は、Ｓｒｃキナーゼを刺激する。活性化したＳｒｃは、順次、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）などの受容体チロシンキナーゼをトランス活性化し、そしてチロシンキナーゼシグナルを、セリン／トレオニンキナーゼ、リピドキナーゼおよびリパーゼの刺激へ、更には、反応性酸素種（ＲＯＳ）の増加した生産へ変換する。興味深いことに、ＣＴＳによるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの阻害は、これら薬物が心臓収縮機能を増加させるのに不可欠であるが、これらステロイドによるプロテインキナーゼの刺激および引き続きのＲＯＳ生産の増加も、動物研究において心臓肥大および線維症を引き起こす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
[0008]数名の共同発明者は、ここにおいて、本明細書中にそれら出願が特に援用される、２００８年７月３１日出願の係属出願米国出願第１２／０８７，９７６号［２００７年１月３０日出願のＰＣＴ／ＵＳ０７／００２３６５号（２００７年８月９日公開ＷＯ２００７／０８９６８８号）から優先権を主張、２００６年１月３１日出願の米国出願第６０／７６３，７８３号から優先権を主張］に開示のように、「Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼリガンド」を発見した。
【０００９】
[0009]数名の共同発明者は、ここにおいて、本明細書中に特に援用される、２００９年４月２３日出願の係属出願米国出願第１２／４４６，８５６号［２００７年１０月１７日出願のＰＣＴ／ＵＳ０７／０２３０１１号（２００８年５月８日公開ＷＯ２００８／０５４７９２号）から優先権を主張、２００６年１０月１６日出願の米国出願第６０／８５５，４８２号から優先権を主張］に開示のように、「Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼ特異的ペプチド阻害剤／ＳｒｃおよびＳｒｃファミリーキナーゼのアクチベーター」を発見した。
【００１０】
[0010]更に、数名の共同発明者は、ここにおいて、本明細書中に特に援用される、２００８年１０月２８日出願の係属出願米国出願第６１／１０９，３８６号に開示のように、「Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼ発現を調節する方法および癌の療法としてのそれらの使用」を発見した。
【００１１】
[0011]更に、数名の共同発明者は、ここにおいて、本明細書中に特に援用される、２００８年１２月１２日出願の係属出願米国出願第６１／１２２，２０５号に開示のように、「ＣＴＳのアンタゴニストとしてのおよび癌の治療薬としてのＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼ由来ペプチド」を発見した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
[0012]広い側面において、本明細書中において、強心ステロイド（ＣＴＳ）とは異なる新規なクラスの化合物であって、プロテインキナーゼを活性化することなくＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを阻害するこのような化合物を提供する。
【００１３】
[0013]別の広い側面において、本明細書中において、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼのイオンポンピング機能を調節するＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを含む化合物のクラスを提供する。
【００１４】
[0014]別の広い側面において、本明細書中において、ＣＴＳで誘発されるプロテインキナーゼカスケード活性化に拮抗するＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを含む化合物のクラスを提供する。
【００１５】
[0015]別の広い側面において、本明細書中において、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを用いる一つまたはそれを超える検定を提供する。
[0016]本発明のいろいろな目的および利点は、以下の詳細な説明および好ましい態様から、添付の図面に照らして読んだ場合に、当業者に明らかになるであろう。
【００１６】
[0017]特許または出願の書類は、色彩および／または一つまたはそれを超える写真で作成された一つまたはそれを超える図面を含有してよい。一つまたは複数の色彩図面および／または一つまたは複数の写真を含む本特許または特許出願公報のコピーは、必要料金の請求・支払いで、特許庁により提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】[0018]図１Ａ：ウアバイン（図１Ａ上部）およびＭＢ７（３，４，５，６−テトラヒドロキシキサントン）（図１Ａ下部）の濃度曲線を示すグラフ。
【図１Ｂ】[0019]図１Ｂ：キサントン（左）およびクエルセチン（右）の化学構造。
【図２Ａ】[0020]図２Ａ：Ｎａ＋（図２Ａ）ＡＴＰ（図２Ｂ）依存性へのＭＢ７の作用。Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性は、「実験手順」に記載のように、Ｎａ＋またはＡＴＰ濃度の関数として測定した。ＭＢ７は、１０μＭで用いた。
【図２Ｂ】[0020]図２Ｂ：Ｎａ＋（図２Ａ）ＡＴＰ（図２Ｂ）依存性へのＭＢ７の作用。Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性は、「実験手順」に記載のように、Ｎａ＋またはＡＴＰ濃度の関数として測定した。ＭＢ７は、１０μＭで用いた。
【図３】[0021]図３：受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体へのＭＢ７およびウアバインの作用。精製Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ（２μｇ）および精製Ｓｒｃを、１０μＭウアバインかまたは１μＭおよび１０μＭのＭＢ７の存在下において１５分間インキュベートし、Ｓｒｃ活性化について「実験手順」に記載のように検定した。値は、少なくとも３回の独立した実験の平均ＳＥである。対照と比較して＊＊ｐ＜０．０１。
【図４Ａ】[0022]図４Ａ：ＳｒｃおよびＥＲＫへのＭＢ７およびウアバインの作用。Ａ５４９細胞を、ウアバインまたはＭＢ７で１０分間処理し、そして細胞溶解産物（５０μｇ／レーン）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｓｒｃ活性化について図３の場合のように分析した。値は、４回の別々の実験による平均±Ｓ．Ｅ．である。対照に対して＊，ｐ＜０．０５。
【図４Ｂ】[0023]図４Ｂ：ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、ＭＢ７またはウアバインで１０分間処理し、そしてＥＲＫ／ＭＡＰＫ（Phospho−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）リン酸化／トランスロケーション細胞基剤検定キット（Phosphorylation／Translocation Cell-Based Assay Kit）で、製造者の取扱説明書にしたがって免疫染色した。画像は、「実験手順」に記載のように集めた。スケールバーは、５０μＭである。代表的な実験による画像を示している。ｐ−ＥＲＫの定量的データは、３回の独立した実験における４０の異なった視野から集め、平均±Ｓ．Ｅ．として表した。対照に対して＊，ｐ＜０．０５。
【図５Ａ】[0024]図５Ａ：Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼポンピングサイクルの Albers-Post スキーム
【図５Ｂ】[0025]図５Ｂ：Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ相互作用のモデル化。Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼのＡドメイン（Ｎ末端およびＣＤ）を青色に、Ｐドメインを緑色に、Ｎドメインを黒色に標識した。ＳｒｃのＳＨ２ドメインを橙色に、キナーゼドメインを淡青色に標識した。
【図６Ａ】[0026]図６Ａ：受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ活性へのＮａ＋およびＫ＋濃度変化の作用。精製Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ（２ｕｇ）を、指定のイオン濃度を有する Tris／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液中に再懸濁させ、精製ｃ−Ｓｒｃと一緒に１５分間インキュベートした。次に、３ｍＭ Ｍｇ２＋／ＡＴＰを、反応混合物に加え、更に１０分間インキュベートした。試料を、ウェスタンブロットで分析した。値は、４回の別々の実験の平均±ＳＥである。
【図６Ｂ】[0027]図６Ｂ：受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ活性へのＫ＋の作用。検定は、図６Ａの場合のように、１５ｍＭ ＮａＣｌおよび指定の異なった濃度のＫＣｌの存在下で行った。３回の別々の実験の代表的なウェスタンブロットを示している。
【図７Ａ】[0028]図７Ａ〜７Ｃ：ＭＢ５によるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの用量依存性阻害。図７Ａ：低親和性および高親和性双方の二相阻害。
【図７Ｂ】[0028]図７Ａ〜７Ｃ：ＭＢ５によるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの用量依存性阻害。図７Ｂ〜７Ｃ：ＭＢ５はＭＢ７よりも効力があることが注目される、ＭＢ５（図７Ｂ）およびＭＢ７（図７Ｃ）による高親和性阻害の用量反応。
【図７Ｃ】[0028]図７Ａ〜７Ｃ：ＭＢ５によるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの用量依存性阻害。図７Ｂ〜７Ｃ：ＭＢ５はＭＢ７よりも効力があることが注目される、ＭＢ５（図７Ｂ）およびＭＢ７（図７Ｃ）による高親和性阻害の用量反応。
【図８】[0029]図８：精製Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼに結合するウアバインへのＭＢ５の作用。精製Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ（２μｇ）を、２０ｎＭ３Ｈウアバインと一緒に、異なった濃度のＭＢ５の存在下においてインキュベートした。
【図９Ａ】[0030]図９Ａ：ＥＲＫへのＭＢ５の作用。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、異なった濃度のＭＢ５（１ｎＭ、１０μＭ）に１０分間暴露後、活性なＥＲＫについて「実験手順」に記載のように検定した。代表的な組の画像を示している。同じ実験を３回繰り返した。
【図９Ｂ】[0031]図９Ｂ：ウアバインで誘発されるＥＲＫ活性化へのＭＢ５の作用。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、異なった濃度のＭＢ５（１ｎＭ、１０μＭ）で１５分間前処理し、１ｎＭウアバインに１０分間暴露し、そして活性なＥＲＫについて図９Ａの場合のように検定した。代表的な組の画像を示している。
【図９Ｃ】[0032]図９Ｃ：ウアバインで誘発されるＥＲＫ活性化へのＭＢ５の作用。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、異なった濃度のＭＢ５（１ｎＭ、１０μＭ）で１５分間前処理し、１００ｎＭウアバインに１０分間暴露し、そして活性なＥＲＫについて図９Ａの場合のように検定した。代表的な組の画像を示している。
【図９Ｄ】[0033]図９Ｄ：ウアバインで誘発されるＥＲＫ活性化へのＭＢ５の作用。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、異なった濃度のＭＢ５（１ｎＭ、１０μＭ）で１５分間前処理し、１ｎＭウアバインに１時間暴露し、そして活性なＥＲＫについて図９Ａの場合のように検定した。代表的な組の画像を示している。
【図９Ｅ】[0034]図９Ｅ：刺激物質で誘発されるＥＲＫ活性化へのＭＢ５の作用。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、異なった濃度のＭＢ５（１ｎＭ、１０μＭ）で１５分間前処理し、上皮増殖因子（ＥＧＦ）またはドーパミン刺激物質に１０分間かまたは３分間暴露し、そして活性なＥＲＫについて図９Ａの場合のように検定した。代表的な組の画像を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
[0035]本開示を通して、いろいろな公報、特許および公開特許明細書を、確認引用によって論及している。これら公報、特許および公開特許明細書の開示は、本発明が関する当該技術分野の状態をより十分に記載するために、本開示に援用される。
【００１９】
[0036]本発明は、少なくとも一部分は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼで媒介されるＳｒｃ調節の新規な分子機構についての本発明者の発見と、（ｉ）Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼへのＮａ＋およびＡＴＰ双方の親和性を減少させる、および（ii）ウアバインで誘発されるキナーゼカスケード活性化を無効にしうるアンタゴニストとして作用するヒドロキシルキサントン誘導体の識別とに基づく。
【００２０】
[0037]本発明を、次の実施例において更に定義するが、ここにおいて、部および百分率は全て、重量により、そして度は、特に断らない限り、摂氏である。これら実施例は、本発明の好ましい態様を示しているが、単に例示するものとして与えられているということは理解されるべきである。上の考察およびこれら実施例により、当業者は、本発明の本質的な特徴を確かめることができるし、そしてその精神および範囲から逸脱することなく、いろいろな使用および条件に適合するように、本発明のいろいろな変更および修飾を行うことができる。本明細書中に論及される特許および非特許文献を含めた公報は全て、特に援用される。次の実施例は、本発明の特定の好ましい態様を詳しく説明するためのものであり、明記されない限り、請求の範囲に定義の発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００２１】
[0038]実施例Ｉ
[0039]材料：ＡＴＰおよびウアバインは、Sigma（St. Louis, MO）から入手した。Biomol Green は、ＢＩＯＭＯＬ（Plymouth Meeting, PA）から購入した。ＥＲＫ／ＭＡＰＫ（Phospho−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）リン酸化／トランスロケーション細胞基剤検定キットは、Cayman Chemical Company（Ann Arbor, MI）から購入した。精製リコンビナントＳｒｃは、Upstate Biotechnology（Lake Placid, NY）から入手した。多クローン性抗Ｔｙｒ（Ｐ）４１８−Ｓｒｃは、Invitrogen（Camarillo, CA）から入手した。抗ｃ−Ｓｒｃ（Ｂ−１２）単クローン性抗体は、Santa Cruz Biotechnology Inc.（Santa Cruz, CA）製であった。一般的な化学物質は、入手可能な最高純度のものであった。新鮮ブタ腎臓は、近くの畜殺場から購入し、そして酵素製造に用いるまで−８０℃で貯蔵した。
【００２２】
[0040]高処理スクリーニング検定：本研究でスクリーニングに用いた化学物質ライブラリーは、２６００種類の構造的に異なる、薬物様の天然に存在する有機化合物またはそれらの半合成誘導体を含有した。原料化合物は、９６ウェルプレート中においてＤＭＳＯ中に１０ｍｇ／ｍｌで調製した。
【００２３】
[0041]精製Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを、ブタ腎臓から製造した。いろいろな腎臓標品のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの比活性は、９００〜１，２００μｍｏｌ／ｍｇ／時の範囲内であり、全ＡＴＰアーゼ活性の９５％より大であった。高処理スクリーニングは、９６ウェルフォーマットにおいて、次の成分：１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２０ｍＭ Tris−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および０．２μｇの精製Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを含有する１００μｌの最終反応容量で行う。化合物を加えた後、混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、そして反応を、２ｍＭ ＡＴＰ．Ｍｇ混合物を加えることによって開始した。
【００２４】
[0042]反応を、１５分間行った後、１００μｌの氷冷トリクロロ酢酸の添加によって止めた。反応混合物を、遠心分離によって透明にし、そして放出されたホスフェートについて、ＢＩＯＭＯＬ ＧＲＥＥＮＴＭ試薬を製造者の取扱説明書にしたがって用いて検定した。更に、対照Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性を、１ｍＭウアバインの存在下および不存在下で測定し、１００％とした。更に、５μＭウアバインおよび０．１％のＤＭＳＯを、各々のプレート中に、それぞれ、陽性対照およびビヒクル対照として包含した。対照実験は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼによって触媒されたＡＴＰ加水分解が、上の実験条件下の３０分のインキュベーション中に直線範囲内であったということを示した。
【００２５】
[0043]細胞培養：ブタ腎臓上皮細胞（ＬＬＣ−ＰＫ１細胞）およびヒト肺癌細胞（Ａ５４９細胞）を、ＡＴＣＣから入手し、そしてダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンの存在下において、５％ＣＯ２給湿インキュベーター中で維持した。血清中の増殖因子の混同作用を排除するために、特に断らない限り、細胞を２４時間血清欠乏状態とした後、実験を行った。
【００２６】
[0044]ウェスタンブロット分析：細胞を、ＰＢＳで洗浄し、そして前に記載のように（１３）、１％ Nonidet Ｐ−４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭ ＮａＦ、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチンおよび５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を含有する氷冷ＲＩＰＡ緩衝液中に溶解させた。次に、細胞溶解産物を、１４，０００ｒｐｍでの遠心分離によって透明にし、上澄みを、タンパク質検定用に用い、ウェスタンブロット分析を行った。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５０μｇ／レーン）で分離し、セルロースメンブランへ移した。メンブランは、全ＳｒｃおよびＥＲＫについて、ＴＢＳＴ（Tris−ＨＣｌ １０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、Tween ２０、０．１％；ｐＨ８．０）中の３％脱脂粉乳で、またはリン酸化ＳｒｃおよびＥＲＫについて、１％ＢＳＡ＋１％脱脂粉乳で、室温において１時間ブロック後、特異的抗体でプローブした。タンパク質シグナルは、ＥＣＬキットを用いて検出し、Bio-Rad ＧＳ−６７０イメージングデンシトメーターを用いて定量した。
【００２７】
[0045]受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体の活性化についての検定：受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体の活性を検定した。簡単にいうと、精製Ｓｒｃ（４．５Ｕ）を、２μｇの精製Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼと一緒に、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中において３７℃で３０分間インキュベートした。その後、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体を、ウアバインまたはＭＢ７に１０分間暴露した。反応は、２ｍＭ ＡＴＰ／Ｍｇ２＋の添加によって開始し、３７℃で５分間続け、そしてＳＤＳ試料緩衝液の添加によって止めた。Ｓｒｃの活性化は、ウェスタンブロットにより、抗ｐＹ４１８抗体を用いて測定した。全Ｓｒｃを、負荷対照について更にプローブした。
【００２８】
[0046]共焦点画像化および免疫細胞化学：カバーガラス上で増殖したＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、２４時間血清欠乏状態にし、そしてＭＢ７またはウアバインで異なった時間処理した。ｐ−ＥＲＫの免疫染色は、商業的に入手可能なＥＲＫ／ＭＡＰＫ（Phospho−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）Phosphorylation／Translocation Cell-Based Assay Kit を製造者の取扱説明書にしたがって用いて行った。シグナルは、Leica 共焦点顕微鏡によって検出した。Leica 共焦点ソフトウェアを、データ分析に用いた。
【００２９】
[0047]データ分析：データは、平均±Ｓ．Ｅ．として与えている。統計的分析は、スチューデントｔ検定を用いて行い、有意性をｐ＜０．０５で認めた。
[0048]実施例Ｉの結果
[0049]Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤の高処理スクリーニング：Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤について化学物質ライブラリーをスクリーニングするために、本発明者は、９６ウェルフォーマット検定を開発した。
【００３０】
[0050]図１Ａに示されるように、陽性対照としてのウアバインは、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの用量依存性阻害を生じた。もう一方において、ビヒクルであるＤＭＳＯは、反応容量の１％未満の濃度で用いた場合、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性への作用を示さなかった（データは示されていない）。ウアバインの見掛けＩＣ５０は、報告されたものに匹敵する約５μＭであった。同検定を用いて、全２６００種類の化合物を１０μｇ／ｍｌの最終濃度で調べた。この濃度は、大部分の化合物が、約２００の分子質量を有し、したがって、ウアバインのＩＣ５０の１０倍である約５０μＭで調べられているという理由で適応した。各々の９６ウェルプレートにおいて、ウアバイン（５μＭ）を陽性対照として用い、０．１％ＤＭＳＯを陰性対照として用いた。検定は、二重反復試験で行い、そしてＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの少なくとも２５％阻害を生じた化合物を、正ヒットとして識別した。これら実験条件下において、本発明者は、数種類の周知のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤（ミリセチン、オリゴマイシン、レシブホゲニン（resibufogenin）およびシノブファジン（cinobufagin））を包含する全１５種類の正の化合物を発見した（下の表Ｉ）。
【００３１】
【表１】
【００３２】
[0051]新クラスのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドとしてのヒドロキシキサントンの識別：１５種類の正ヒットの内の多くは、６種類のヒドロキシルキサントン誘導体（ＭＢ１〜ＭＢ７）を含めたポリフェノール性化合物である（表Ｉ）。構造的に、それらは、クエルセチン（図１Ｂ）などの十分に特性決定されたポリフェノール性化合物に似ている。次に、本発明者は、これらヒドロキシキサントンの阻害性を決定した。ＭＢ７は、この群で最も効力のある阻害剤であったので（下の表II）、それを、次の研究に用いた。
【００３３】
【表２】
【００３４】
[0052]図１Ａに示される実験において、ＭＢ７の用量反応曲線を、ウアバインと比較した。ウアバインのように、ＭＢ７は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの用量依存性阻害を示した。その見掛けＩＣ５０（５μＭ）は、ウアバインのそれに匹敵する。しかしながら、基質依存性へのＭＢ７の作用を決定した場合、ＭＢ７は、ウアバインとは異なり、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼのＮａ＋およびＡＴＰ双方の親和性を減少させた（図２Ａおよび図２Ｂ）。もう一方において、Ｋ＋濃度の変化は、ＭＢ７で誘発されるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害への作用を示さなかったが（データは示されていない）、ウアバインで誘発される阻害に拮抗した。更に、１０μＭ ＭＢ７は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼへの場合のように、Ｎａ−ＡＴＰアーゼの５８±６％阻害を生じた。総合すると、そのデータは、ヒドロキシキサントンが、ウアバインの場合とは異なった機構によってＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを阻害するということを示している。
【００３５】
[0053]構造・活性関係を決定するために、キサントン、６種類のヒドロキシキサントンおよび数種類のメチル化ヒドロキシキサントン誘導体の用量反応を比較した。表IIに示されるように、キサントンは、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性を阻害できなかったが、フェノール性基の数の増加は、ヒドロキシキサントンの有効性および効力を増加させた（例えば、ＭＢ２とＭＢ５とを比較、表II）。一貫して、完全または部分メチル化は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼへのヒドロキシキサントンの阻害作用を減少させることができた（例えば、ＭＢ５とＭＢ８とを比較）。更に、フェノール性基が、ピロン環中の酸素の近くに（すなわち、４位および５位に）位置した場合、それらは、これら化合物の効力へのより大きい作用を有した（例えば、ＭＢ３とＭＢ５とを比較）。
【００３６】
[0054]ＭＢ７は、受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体を活性化できない：Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、Ｓｒｃキナーゼと相互作用して、プロテインキナーゼカスケードを活性化するウアバインについて機能性受容体複合体を形成する。
【００３７】
[0055]ＭＢ７が、プロテインキナーゼを活性化することが可能なウアバインのように作用するか否か決定するために、本発明者は、最初に、Ｓｒｃ活性へのＭＢ７の作用を、再構成したＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体を用いて測定した。ウアバイン（１０μＭ）を、陽性対照として用いた。図３に示されるように、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、Ｓｒｃを阻害した。しかしながら、驚くべきことに、ＭＢ７ではなくウアバインの添加が、試験管中のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼに会合したＳｒｃを刺激した。この発見は、現在、ＭＢ７が、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの受容体機能を刺激することなく、ＡＴＰアーゼ活性を阻害しうるということを示している。
【００３８】
[0056]上の結果を立証するために、培養細胞中のＳｒｃおよびＥＲＫへのＭＢ７の作用を測定した。再度、ウアバインを陽性対照として用いた。図４Ａに示されるように、１００ｎＭウアバインは、Ａ５４９細胞中においてＳｒｃを刺激したが、１０μＭまでのＭＢ７は、それができなかった。
【００３９】
[0057]更に確かめるために、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、１００ｎＭウアバインかまたは異なった濃度のＭＢ７で処理した。ウアバインは、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞中において、Ｓｒｃを刺激し、引き続き、ＥＲＫカスケードを刺激した。ここにおいて、現在、ウアバインは、免疫染色によって検出される細胞内の活性ＥＲＫ量を増加させたということが分かっている（図４Ｂ）。しかしながら、同じ実験条件下において、ＭＢ７（１００ｎＭ〜１０μＭ）は、細胞内ＥＲＫ活性に影響を与えることができなかった。
【００４０】
[0058]実施例Ｉの考察
[0059]有効な高処理スクリーニング検定を用いて、数種類の構造的に異なるクラスの化合物である１５種類のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤を識別した。更に、新たに識別された阻害剤を、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの基質依存性へのそれらの作用を評価することによって、ウアバインおよびオリゴマイシンなどの他の既知の阻害剤と区別した。新たに識別されたキサントン誘導体は、ウアバインとは異なり、ＡＴＰアーゼ活性を阻害するだけであるが、受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体を活性化することはない。
【００４１】
[0060]新クラスのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤としてのキサントン誘導体：Albers-Post 反応スキームによれば、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、多様な立体配座変化によってＥ１〜Ｅ２状態へ遷移する。Ｎａ＋は、Ｅ１状態に好都合であるが、Ｋ＋は、Ｅ２状態を促進する。何年にもわたって、数種類のクラスの有機Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤が識別されてきた。それらは、異なった立体配座状態で酵素を安定化させることによってＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを阻害する。例えば、ＣＴＳは、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼをＥ２Ｐで結合し且つ安定化するが、オリゴマイシンは、Ｅ１Ｐ〜Ｅ２Ｐ遷移を妨げる。
【００４２】
[0061]比較すると、本発明者は、ここで、新規なリガンドＭＢ７は、それが、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼのＫ＋感受性に影響を与えることなく、Ｎａ＋およびＡＴＰ双方の見掛けの親和性を減少させるので、Ｅ１ＮａＡＴＰの形成を減少させると考えられるということを示している。興味深いことに、キサントンは、それらが双方とも、構造が同じベンゾピロンを共有することから、フラボノイドのような類似の構造を共有する（図１Ｂ）。更に、クエルセチンおよびミリセチンは、周知の効力のあるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤である。しかしながら、ＭＢ７とは異なり、それらは、Ｎａ＋かまたはＡＴＰに対するＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの親和性を減少させない。
【００４３】
[0062]ベンゾピロンへのベンゼン環の縮合は、キサントンとＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼとの相互作用特性を完全に変化させ、それは、キサントン誘導体で誘発されるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害の特異性を強調している。
【００４４】
[0063]更に、表IIに示されるデータは、キサントン誘導体で誘発されるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害におけるフェノール性基の重要性を示している。親化合物キサントンは、ベンゼン環に結合したフェノール性基を有していないし、そしてそれは、検出可能なＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害を示さなかった。テトラヒドロキシキサントンは、最も効力のある阻害剤であるが、ジヒドロキシキサントンは、ＡＴＰアーゼ活性にほとんど影響を与えない。
【００４５】
[0064]理論によって拘束されたくはないが、本発明者は、ここで、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼが、他のＰ型ＡＴＰアーゼと共通の多くの特徴を共有していることから、本明細書中に記載の新たに識別されたキサントン誘導体も、他のイオンポンプに影響を与えるかもしれないと考えている。本発明者は、ここで、マイトマイシンおよび４−エピテトラサイクリンなどの他の正ヒットも、別のクラスの新リガンドである可能性があると考えている。
【００４６】
[0065]キサントン誘導体化合物は、既知のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤とは異なった化学構造を有するので、ここで、本発明者は、異なった機構によって作用する新クラスのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤であると考えている。
【００４７】
[0066]ＭＢ７は、受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体を活性化しない：Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、in vitro でも in vivo でもＳｒｃを結合する。この会合は、Ｓｒｃを不活性状態で保持することによって細胞内Ｓｒｃ活性を調節する（１１）。更に、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体の形成は、ウアバインがポンプに会合したＳｒｃを刺激する機能性受容体を生じ、それが、引き続き、図４に示されるように、ＥＲＫを含めた多様な下流プロテインキナーゼカスケードを組み立て且つ活性化する。
【００４８】
[0067]ウアバインとは対照的に、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体へのＭＢ７の結合は、in vitro でＳｒｃを活性化できなかった（図３）。一貫して、それは、培養細胞にＭＢ７を加えた場合に、細胞内ＳｒｃおよびＥＲＫ活性への作用を有していなかった。この発見は、ＭＢ７が、ウアバインとは異なり、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼからＳｒｃキナーゼドメインを放出させることができるような方法でＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの立体配座を変えることはできないということを示している。ＭＢ７は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを、ウアバインの場合とは異なった方法で阻害する。
【００４９】
[0068]展望：キサントンという名称は、植物、真菌および地衣類の限られた集合において通常見出される二次代謝産物の群を称する。植物由来のキサントンは、主に、ヒメハギ科（Polygalaceae）、オトギリソウ科（Guttiferae）、クワ科（Moraceae）およびリンドウ科（Gentianaceae）という科に関連していると考えられる。これら植物は、伝統的漢方薬に広く用いられてきた。例えば、ポリガラ・テヌイホリア・ウィルド（Polygala tenuifolia Willd.）またはポリガラ・シビリカ・エル（Polygala sibirica L.）の根である Yuanzhi は、いろいろな医学的状態に広範囲に用いられている。フェノール性化合物として、キサントンは、それらの抗酸化性について記載されてきた。これら性質は、それらの抗炎症作用および化学的予防作用に関連していた。キサントンの一つであるジメチルキサンテノン−４−酢酸は、現在、抗腫瘍薬として臨床試験中である。
【００５０】
[0069]新クラスのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤として、キサントンは、心臓収縮機能を増加させることもありうる。このようなキサントンは、それらが、受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体を刺激しないので、大きな価値がある。これは、内因性かまたは外因性のＣＴＳによるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼで媒介されるシグナル伝達の刺激が、心臓成長を変化させ且つ心臓線維症を誘発することから、重要になっている。
【００５１】
[0070]したがって、ＭＢ７およびその類似体は、現在、うっ血性心不全の臨床状態の下でしばしば認められる心臓肥大および／または線維症を引き起こすことなく、収縮機能を改善するのに特に有用であると考えられる。
【００５２】
[0071]実施例II
[0072]材料：ＡＴＰおよびウアバインは、Sigma（St. Louis, MO）から入手した。Biomol Green は、ＢＩＯＭＯＬ（Plymouth Meeting, PA）から購入した。ＥＲＫ／ＭＡＰＫ（Phospho−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）リン酸化／トランスロケーション細胞基剤検定キットは、Cayman Chemical Company（Ann Arbor, MI）から購入した。多クローン性抗Ｔｙｒ（Ｐ）４１８−Ｓｒｃは、Invitrogen（Camarillo, CA）から入手した。抗ｃ−Ｓｒｃ（Ｂ−１２）単クローン性抗体は、Santa Cruz Biotechnology Inc.（Santa Cruz, CA）製であった。一般的な化学物質は、入手可能な最高純度のものであった。新鮮ブタ腎臓は、近くの畜殺場から購入し、そして酵素製造に用いるまで−８０℃で貯蔵した。
【００５３】
[0073]Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ精製および活性検定：精製Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを、ブタ腎臓から製造した。いろいろな腎臓標品のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの比活性は、９００〜１，２００μｍｏｌ／ｍｇ／時の範囲内であり、全ＡＴＰアーゼ活性の９５％より大であった。Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ検定は、５００μｌの最終容量を有する次の反応緩衝液中で行った。１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２０ｍＭ Tris−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および１μｇの精製Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ。化合物を加えた後、混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、そして反応を、２ｍＭ ＡＴＰ．Ｍｇ混合物を加えることによって開始した。反応を、１５分間行った後、３００μｌの氷冷トリクロロ酢酸の添加によって止めた。反応混合物を、遠心分離によって透明にし、そして放出されたホスフェートについて、ＢＩＯＭＯＬ ＧＲＥＥＮＴＭ試薬を製造者の取扱説明書にしたがって用いて検定した。対照実験は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼによって触媒されたＡＴＰ加水分解が、上の実験条件下の３０分のインキュベーション中に直線範囲内であったということを示した。
【００５４】
[0074]細胞培養：ブタ腎臓上皮細胞（ＬＬＣ−ＰＫ１細胞）およびヒト肺癌細胞（Ａ５４９細胞）を、ＡＴＣＣから入手し、そしてダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンの存在下において、５％ＣＯ２給湿インキュベーター中で維持した。血清中の増殖因子の混同作用を排除するために、特に断らない限り、細胞を２４時間血清欠乏状態とした後、実験を行った。
【００５５】
[0075]Ｓｒｃ活性検定およびウェスタンブロット分析：Ｓｒｃ活性へのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼおよびそのリガンドの作用を、ウェスタンブロット法Ｓｒｃ ｐＹ４１８リン酸化によって測定するプロトコルを続けた。ウェスタン分析用の細胞溶解産物を調製するために、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、そして１％ Nonidet Ｐ−４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭ ＮａＦ、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチンおよび５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を含有する氷冷ＲＩＰＡ緩衝液中に溶解させた。次に、細胞溶解産物を、１４，０００ｒｐｍでの遠心分離によって透明にし、上澄みを、タンパク質検定用に用い、ウェスタンブロット分析を行った。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５０μｇ／レーン）で分離し、セルロースメンブランへ移した。メンブランは、全ＳｒｃおよびＥＲＫについて、ＴＢＳＴ（Tris−ＨＣｌ １０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、Tween ２０、０．１％；ｐＨ８．０）中の３％脱脂粉乳で、またはリン酸化ＳｒｃおよびＥＲＫについて、１％ＢＳＡ＋１％脱脂粉乳で、室温において１時間ブロック後、特異的抗体でプローブした。タンパク質シグナルは、ＥＣＬキットを用いて検出し、Bio-Rad ＧＳ−６７０イメージングデンシトメーターを用いて定量した。
【００５６】
[0076]共焦点画像化および免疫細胞化学：カバーガラス上で増殖したＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、２４時間血清欠乏状態にし、そしてＭＢ５またはウアバインで異なった時間処理した。ｐ−ＥＲＫの免疫染色は、商業的に入手可能なＥＲＫ／ＭＡＰＫ（Phospho−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）Phosphorylation／Translocation Cell-Based Assay Kit を製造者の取扱説明書にしたがって用いて行った。シグナルは、Leica 共焦点顕微鏡によって検出した。Leica 共焦点ソフトウェアを、データ分析に用いた。
【００５７】
[0077]データ分析：データは、平均±Ｓ．Ｅ．として与えている。統計的分析は、スチューデントｔ検定を用いて行い、有意性をｐ＜０．０５で認めた。
[0078]実施例IIの結果
[0079]Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、立体配座依存性方式でＳｒｃを調節する：大多数のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、生細胞中においてＳｒｃキナーゼと直接的に相互作用する。その相互作用は、少なくとも２対のタンパク質ドメインを必要とする。具体的には、μ１サブユニットの第二サイトゾルドメインは、ＳｒｃＳＨ２と相互作用し、そしてヌクレオチド結合（Ｎ）ドメインは、Ｓｒｃキナーゼドメインと会合する。ポンピングサイクル中に、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、Ｅ１〜Ｅ２立体配座遷移を行い（図５Ａ）、そこで、Ｎドメインは閉じ、そしてＡドメインは、回転してＮドメイン上に連結する（図５Ｂ）。
【００５８】
[0080]構造モデル化は、ＡドメインとＮドメインの場所およびその間の空間が、Ｅ１状態でのみ、μ１サブユニットがＳＨ２およびキナーゼ双方のドメインに同時に結合するのに適しているということを示している（図５Ｂ）。したがって、本発明者は、ここで、Ｅ１ Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、Ｓｒｃを阻害するが、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼに会合したＳｒｃは、その酵素がＥ２立体配座である時に活性であるべきであると考えている。
【００５９】
[0081]実際上、大多数のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼが、Ｎａ＋不含で且つ５ｍＭ Ｋ＋の緩衝液（４７）中で酵素をインキュベートすることによってＥ２立体配座で安定化している場合に、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼに会合したＳｒｃは、十分に活性になる（図６Ａ）。一貫して、この反応緩衝液への１５０ｍＭ Ｎａ＋の添加は、Ｅ２ Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを不安定にし、それが、Ｓｒｃの失活を引き起こした（図６Ａ）。更に、５ｍＭ〜０へのＫ＋の減少は、緩やかなＳｒｃ活性化を引き起こした（図６Ｂ）。これら結果は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼとＳｒｃとの間の相互作用が、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの立体配座状態の変化によって調節しうるということを示している。更に、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼのＥ１〜Ｅ２立体配座遷移の阻害は、ウアバインで誘発されるＳｒｃ活性化に拮抗するのに用いることができる。
【００６０】
[0082]キサントン誘導体は、効力のあるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤であり、ウアバインがＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼに結合するのを妨げる：Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼをＥ１立体配座で安定化する新Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドのクラスとしての新キサントン誘導体は、実施例Ｉに記載している。
【００６１】
[0083]図１および図７Ａ〜Ｃに示されるように、ヒドロキシキサントンは、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性の二相阻害を示した。ＭＢ５による高親和性阻害は、ｎＭ下濃度で起こって（４０ｐＭのＩＣ５０）、ＡＴＰアーゼ活性の約２５％阻害を生じるが、低親和性結合は、約５０μＭで１００％阻害を生じる。ＭＢ５は、高親和性部位においてＭＢ７より効力があるが、それは、低親和性部位ではより少ない効力を有するということに注目することは興味深い。ウアバインは、Ｅ２ Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを結合することを選択するので、ＭＢ５によるＥ１状態でのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの安定化は、ウアバイン結合に拮抗するのに用いることができる。実際上、図８に示されるように、ＭＢ５は、精製Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼへのウアバイン結合の用量依存性阻害を生じた。有意の阻害は、０．１ｎＭで検出し、そしてＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを１０μＭ ＭＢ５に暴露した場合に、３０％の最大阻害に達した。
【００６２】
[0084]ＭＢ５は、ウアバインで誘発されるプロテインキナーゼ活性化に拮抗するが、ＥＧＦおよびドーパミンで誘発されるプロテインキナーゼ活性化には拮抗しない：ウアバインは、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞中においてＳｒｃ依存性経路によってプロテインキナーゼカスケードを刺激する。ＭＢ５が、ウアバインで誘発されるシグナル伝達に拮抗しうるか否かを決定するために、処理済みＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、異なった濃度のＭＢ５で１５分間前処理後、ウアバインまたは他の刺激物質に暴露した。
【００６３】
[0085]図９Ａ〜９Ｄに示されるように、ウアバイン（１ｎＭおよび１００ｎＭ）は、ＥＲＫを時間・濃度依存性方式で刺激したが、１ｎＭでのＭＢ５は、ウアバインで誘発されるＥＲＫ活性化を有意に減少させることができた。更に、ＭＢ５を１０μＭで用いた場合、それは、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞中においてＥＲＫへのウアバインの作用を完全にブロックした。
【００６４】
[0086]対照的に、同じ実験を、ＥＧＦかまたはドーパミンの存在下で行った場合、ＭＢ５は、これら二つの刺激物質で誘発されるＥＲＫ活性化に影響を与えることができなかった（図９Ｅ）。
【００６５】
[0086]総合すると、これらデータは、ＭＢ５が、プロテインキナーゼカスケードの活性化に対する特異的ウアバインアンタゴニストとして機能しうるということを示している。
[0088]実施例IIの考察
[0089]受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼがＥ２立体配座で安定化している場合に活性化することができるが、Ｅ１ Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、Ｓｒｃを不活性状態で保持する。
【００６６】
[0090]本明細書中に記載しているのは、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼのポンピングおよびシグナリング双方の機能を調節しうる化学物質について有効な高処理スクリーニング検定である。
【００６７】
[0091]高処理検定（実施例Ｉに記載の）は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの阻害によって反映されるように、Ｅ１／Ｅ２立体配座遷移に影響を与える化学物質／組成物を識別するのに有用である。次に、識別された化学物質／組成物を、次のようなＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ受容体複合体のアゴニストとしてかまたはアンタゴニストとして調べることができる。アゴニストとしては、このような化学物質／組成物は、ウアバインのように機能すると考えられ、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼへのそれらの阻害作用は、Ｋ＋濃度を増加させることによって拮抗しうると考えられる。もう一方において、アンタゴニストとしてのそれらは、ＭＢ５のように作用すると考えられ、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼへのウアバイン結合を妨げる。更に、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼへのそれらの阻害作用は、Ｎａ＋濃度を増加させることによって減少しうると考えられる。
【００６８】
[0092]更に、本明細書中に記載しているのは、ウアバインがＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ受容体複合体を活性化させるのを妨げる新規な且つ効力のあるウアバインアンタゴニストのクラスの識別である。続いて、それらウアバインアンタゴニストは、更に、ウアバインで誘発されるＥＲＫ活性化を無効にした。
【００６９】
[0093]これら結果は、少なくとも次の考察について有意である。（１）Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ複合体および／またはＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体は、新しいアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングするのに有用である；（２）本明細書中に記載のキサントン誘導体は、例えば、心臓血管および腎臓のリモデリング、更には、心臓および腎臓の線維症を包含する、内因性ＣＴＳ上昇で誘発される病理学的変化に拮抗する薬剤として有用である；（３）本明細書中に記載のキサントン誘導体は、それらが、収縮機能を改善しうるのみならず、心筋層における構造的リモデリングを妨げることもありうるので、うっ血性心不全を処置する薬剤として有用である；（４）本明細書中に記載のキサントン誘導体は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナリングが、前立腺癌および他の癌の細胞増殖に重要であるので、これら癌を処置する薬剤として有用である；および（５）キサントン誘導体は、現在利用可能な組成物よりも効力があり、毒性が少なく、そしてより良い薬物動態学的性質を有するであろう受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼアンタゴニストの新しい生成に有用である。
【００７０】
[0094]本発明を、いろいろな且つ好ましい態様に関して記載してきたが、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、いろいろな変更を行うことができるし、しかもそれらの要素に均等物を置き換えることができるということは、当業者に理解されるはずである。更に、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、発明の内容に特定の状況または材料を適応させるように多くの修飾を行うことができる。したがって、本発明は、本発明を実施するのに考えられた本明細書中に開示の具体的な態様に制限されるものではなく、本発明は、請求の範囲の範囲内にある全ての態様を包含するであろうということである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドであって、構造：
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の内の一つまたはそれを超えるものは、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、カルボン酸エステルまたはその類似体より選択される）
を有する少なくとも一つのヒドロキシルキサントン誘導体を含むＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド。
【請求項２】
プロテインキナーゼを活性化することなく、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを阻害するのに有用な、請求項１に記載のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド。
【請求項３】
ＭＢ３を含み、ここにおいて、Ｒ１＝ＯＨ、Ｒ３＝ＯＨおよびＲ５＝ＯＨである、請求項１に記載のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド。
【請求項４】
ＭＢ５を含み、ここにおいて、Ｒ３＝ＯＨ、Ｒ４＝ＯＨおよびＲ５＝ＯＨである、請求項１に記載のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド。
【請求項５】
ＭＢ６を含み、ここにおいて、Ｒ１＝ＯＨ、Ｒ３＝ＯＨ、Ｒ５＝ＯＨおよびＲ６＝ＯＨである、請求項１に記載のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド。
【請求項６】
ＭＢ７を含み、ここにおいて、Ｒ３＝ＯＨ、Ｒ４＝ＯＨ、Ｒ５＝ＯＨおよびＲ６＝ＯＨである、請求項１に記載のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド。
【請求項７】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを阻害するためのヒドロキシキサントン組成物であって、請求項１に記載のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを含み、ここにおいて、
フェノール性基の数の増加が、ヒドロキシキサントンの有効性および効力を増加させる、ヒドロキシキサントン組成物。
【請求項８】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを阻害するためのヒドロキシキサントン組成物であって、請求項１に記載のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを含み、ここにおいて、
完全または部分メチル化が、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼへのヒドロキシキサントンの阻害作用を実質的にブロックする、ヒドロキシキサントン組成物。
【請求項９】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを阻害するためのヒドロキシキサントン組成物であって、請求項１に記載のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを含み、ここにおいて、
フェノール性基が、ピロン環中の酸素の近くに位置した場合に、それらが、化合物の効力へのより大きい作用を有していた、ヒドロキシキサントン組成物。
【請求項１０】
ＡＴＰアーゼ活性を阻害することを必要としている細胞中において、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの受容体機能を刺激することなく、ＡＴＰアーゼ活性を阻害するための方法であって、
請求項１に記載の少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドの有効量を投与することを含む方法。
【請求項１１】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドが、ＭＢ７を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１２】
受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体を実質的に活性化することなく、ＡＴＰアーゼ活性を阻害するための方法であって、
請求項１に記載の少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを投与することを含む方法。
【請求項１３】
テトラヒドロキシキサントンを含む、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの阻害剤。
【請求項１４】
少なくともＭＢ５またはその誘導体を含む、ＣＴＳアンタゴニスト。
【請求項１５】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤のスクリーニング用の高処理検定であって、ウアバイン（５μＭ）を陽性対照として含み、そして０．１％ＤＭＳＯを陰性対照として用い、ここにおいて、
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの少なくとも２５％の阻害を生じる化合物を識別する、高処理検定。
【請求項１６】
新しいアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングするのに有用な、精製Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼおよび／または再構成したＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体。
【請求項１７】
キサントン誘導体であって、心臓血管および腎臓のリモデリング、更には、心臓および腎臓の線維症を包含する、内因性ＣＴＳ上昇で誘発される病理学的変化に拮抗する薬剤として有用なキサントン誘導体。
【請求項１８】
キサントン誘導体であって、現在利用可能な組成物よりも効力があり、毒性が少なく、そしてより良い薬物動態学的性質を有する受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼアンタゴニストの新しい生成に有用なキサントン誘導体。
【請求項１９】
細胞中においてＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼで媒介されるＳｒｃ調節を引き起こす方法であって、それを必要としている対象に、細胞中においてウアバインなどの強心ステロイドで誘発されるキナーゼカスケード活性化を無効にしうるアンタゴニストとして作用することが可能な少なくとも一つのヒドロキシルキサントン誘導体を投与することを含む方法。
【請求項２０】
ＳｒｃキナーゼドメインをＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼから放出させることができるような方法でのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの立体配座への変更を妨げる方法であって、
少なくとも一つのキサントン誘導体を投与することを含む方法。
【請求項２１】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤のクラスであって、心臓収縮機能を増加させることを必要としている対象の心臓収縮機能を増加させるのに有用であるが、受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体を刺激しない、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤のクラス。
【請求項２２】
心臓の肥大および／または線維症を引き起こすことなく、心臓収縮機能を改善するのに有用な組成物であって、
少なくとも一つのキサントン誘導体を含む組成物。
【請求項２３】
うっ血性心不全の一つまたはそれを超える臨床状態を処置するのに有用な組成物であって、
少なくとも一つのキサントン誘導体を含む組成物。
【請求項２４】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ受容体複合体をターゲッティング（targeting）し且つＣＴＳで誘発されるプロテインキナーゼカスケードに拮抗することを必要としている一つまたはそれを超える細胞中において、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ受容体複合体にターゲッティングし且つＣＴＳで誘発されるプロテインキナーゼカスケードに拮抗するための組成物であって、
請求項１に記載の少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを含む組成物。
【請求項２５】
Ｓｒｃ活性を阻害するまたはＣＴＳで誘発されるシグナル伝達に拮抗することを必要としている対象において、Ｓｒｃ活性を阻害するまたはＣＴＳで誘発されるシグナル伝達に拮抗するための方法であって、
キサントン誘導体から構成される一つまたはそれを超えるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドの有効量を投与することを含む方法。
【請求項２６】
ＳｒｃのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ相互作用性プールをターゲッティングし且つ効力のあるウアバインアンタゴニストとして作用することを必要としている一つまたはそれを超える細胞中においてＳｒｃのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ相互作用性プールをターゲッティングし且つ効力のあるウアバインアンタゴニストとして作用するための方法であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドの有効量を投与することを含む方法。
【請求項２７】
ウアバインで誘発されるＳｒｃ活性化およびＥＲＫ１／２などの下流シグナリング経路をブロックすることを必要としている対象においてウアバインで誘発されるＳｒｃ活性化およびＥＲＫ１／２などの下流シグナリング経路をブロックするための方法であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドの有効量を投与することを含む方法。
【請求項２８】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼおよびＣＴＳのシグナリング機能の生理学的および病理学的有意性を決定するための方法であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドをプローブとして用いることを含む方法。
【請求項２９】
ＳｒｃのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ相互作用性プールを選択的にターゲッティングし且つ有効なウアバインアンタゴニストとして機能することを必要としている一つまたはそれを超える細胞中においてＳｒｃのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ相互作用性プールを選択的にターゲッティングし且つ有効なウアバインアンタゴニストとして機能することが可能な組成物であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを含む組成物。
【請求項３０】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ受容体が過剰刺激されている場合の心臓血管疾患および癌のための治療的組成物であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを含む治療的組成物。
【請求項３１】
細胞増殖阻害および／または細胞死を誘発することを必要としている対象において細胞増殖阻害および／または細胞死を誘発する方法であって、
対象に、キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドの治療的有効量を投与することを含む方法。
【請求項３２】
ＣＴＳで引き起こされるシグナリング経路を妨げることを必要としている対象においてＣＴＳで引き起こされるシグナリング経路を妨げるための組成物であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを含む組成物。
【請求項３３】
ウアバインで引き起こされる心臓のシグナリング伝達を実質的に無効にすることを必要としている対象においてウアバインで引き起こされる心臓のシグナリング伝達を実質的に無効にするための方法であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドの有効量を投与することを含む方法。
【請求項３４】
癌関連障害または心臓疾患関連障害の処置用の薬剤の製造における、キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドの使用。
【請求項３５】
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド、および生理学的に許容しうる担体を含む、医薬組成物。
【請求項３６】
組成物が、心臓肥大、組織線維症および／またはうっ血性心不全の処置として用いるのに適合されている、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
対象におけるウアバインステロイド受容体によって媒介される状態を予防するまたは処置する方法であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドおよび／またはそのアゴニストまたはアンタゴニストを投与することを含む方法。
【請求項３８】
状態が、癌、心臓肥大、組織線維症またはうっ血性心不全の内の一つまたはそれを超えるものである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ステロイド受容体によって媒介される状態の予防または処置用の、対象への投与に適合された医薬組成物であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド、又はそのアゴニスト若しくはアンタゴニストの有効量、及び薬学的に許容しうる担体、希釈剤又は賦形剤、を含む医薬組成物。
【請求項４０】
心臓障害に苦しむ患者の処置に適合された医薬組成物であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド、またはその薬学的に許容しうる塩の治療的有効量を含む、医薬組成物。
【請求項４１】
医薬組成物であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド、またはそのアゴニストまたはアンタゴニストの有効量、および適当な担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項４２】
ステロイド受容体によって媒介される状態およびウアバイン受容体によって媒介される状態の予防または処置用の、対象への投与に適合された医薬組成物であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド、および適当な担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項４３】
ヒト対象においてＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性を推定的に引き出すまたはモジュレーションする化合物を、化合物の特異的結合および／またはＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害または活性化への作用に基づいて識別する in vitro 方法であって、
（ｉ）特異的に結合する、および／または受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体の活性化を活性化またはモジュレーションする（増強するまたは阻害する）、または別の化合物による受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体の特異的結合および／または活性化をモジュレーションする少なくとも一つの化合物を検出する、結合検定または機能検定において、一つまたはそれを超える化合物をスクリーニングし；そして
（ii）受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性を推定的に引き出すまたはモジュレーションする少なくとも一つのこのような化合物を、（ｉ）化合物の特異的結合および／または活性化またはモジュレーション（阻害または増強）に基づいて；または（ii）化合物の、機能検定における別の化合物による特異的結合または活性化のモジュレーションに基づいて、識別することを含む方法。
【請求項４４】
分子、物質、タンパク質、ペプチドおよび／または化学物質のライブラリーをスクリーニングして、受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体に結合可能な分子、物質、タンパク質、ペプチドおよび／または化学物質を識別するための、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ライブラリーが、化学物質ライブラリー、抗体ライブラリー、ファージ提示ライブラリー、ペプチドライブラリーまたは天然化合物のライブラリーである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
分子、物質、タンパク質、ペプチドおよび／または化学物質が、ウアバインのアンタゴニストまたはアゴニストである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
対象においてＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性を潜在的に引き出すまたはモジュレーションする化合物を識別する方法であって、
受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体を活性化する、または別の化合物による受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体の活性化をモジュレーションする（増強するまたは阻害する）化合物を検出する機能検定において、一つまたはそれを超える化合物をスクリーニングし；そして
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性を潜在的に引き出すまたはモジュレーションする化合物を、化合物の（ｉ）受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体の活性化、および／または（ii）別の化合物による受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体の活性化のモジュレーション（増強または阻害）に基づいて、識別することを含む方法。
【請求項４８】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを、細胞中において発現させる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
細胞が、無傷のままであるまたは透過性化されている、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体を、細胞の表面上で発現させる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
真核細胞が、哺乳動物細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
機能検定が、受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体のインターナリゼーション（internalization）への化合物の作用を検出する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
一つまたはそれを超える化合物が、組み合わせ化学物質ライブラリー中に含まれている、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
一つまたはそれを超える化合物が、低分子量分子、薬草薬剤および細菌代謝産物の無作為ライブラリー中で配合されている、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
方法が、高処理スクリーニング法である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
機能検定が、受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体の活性化を増強するまたは阻害する化合物について、ウアバインによってスクリーニングする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
機能検定が、受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体へのウアバインまたはその類似体の結合を増強するまたは阻害する化合物についてスクリーニングする、請求項４７に記載の方法。
【請求項５８】
機能検定が、シグナル伝達への化合物の作用を検出する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５９】
機能検定が、受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体とウアバインとのリガンド特異的カップリングへの化合物の作用を検出する、請求項４７に記載の方法。
【請求項６０】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼのアゴニストまたはアンタゴニスト活性について試験物質をスクリーニングするための検定であって、
（ｉ）ウアバインでモジュレーションされたＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを発現するまたは含有する一つまたはそれを超える細胞と、試験物質とを、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ受容体複合体の存在下において接触させ；
（ii）細胞中に存在するＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ受容体複合体の量を測定しまたは検出し；そして
（iii）工程（ii）において測定されたまたは検出された細胞中に存在するＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体受容体と、ウアバインでモジュレーションされたＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを含有するまたは発現する細胞を化合物の存在下で比較可能な条件下で接触させることによって得られる測定されたまたは検出されたＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体受容体とを比較し、それによって、試験物質が、アゴニストまたはアンタゴニスト活性を示すか否かを決定する工程を含む検定。
【請求項６１】
細胞が、心筋細胞または腎臓上皮細胞である、請求項６０に記載の方法。
【請求項１】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドであって、構造：
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の内の一つまたはそれを超えるものは、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、カルボン酸エステルまたはその類似体より選択される）
を有する少なくとも一つのヒドロキシルキサントン誘導体を含むＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド。
【請求項２】
プロテインキナーゼを活性化することなく、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを阻害するのに有用な、請求項１に記載のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド。
【請求項３】
ＭＢ３を含み、ここにおいて、Ｒ１＝ＯＨ、Ｒ３＝ＯＨおよびＲ５＝ＯＨである、請求項１に記載のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド。
【請求項４】
ＭＢ５を含み、ここにおいて、Ｒ３＝ＯＨ、Ｒ４＝ＯＨおよびＲ５＝ＯＨである、請求項１に記載のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド。
【請求項５】
ＭＢ６を含み、ここにおいて、Ｒ１＝ＯＨ、Ｒ３＝ＯＨ、Ｒ５＝ＯＨおよびＲ６＝ＯＨである、請求項１に記載のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド。
【請求項６】
ＭＢ７を含み、ここにおいて、Ｒ３＝ＯＨ、Ｒ４＝ＯＨ、Ｒ５＝ＯＨおよびＲ６＝ＯＨである、請求項１に記載のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド。
【請求項７】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを阻害するためのヒドロキシキサントン組成物であって、請求項１に記載のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを含み、ここにおいて、
フェノール性基の数の増加が、ヒドロキシキサントンの有効性および効力を増加させる、ヒドロキシキサントン組成物。
【請求項８】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを阻害するためのヒドロキシキサントン組成物であって、請求項１に記載のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを含み、ここにおいて、
完全または部分メチル化が、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼへのヒドロキシキサントンの阻害作用を実質的にブロックする、ヒドロキシキサントン組成物。
【請求項９】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを阻害するためのヒドロキシキサントン組成物であって、請求項１に記載のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを含み、ここにおいて、
フェノール性基が、ピロン環中の酸素の近くに位置した場合に、それらが、化合物の効力へのより大きい作用を有していた、ヒドロキシキサントン組成物。
【請求項１０】
ＡＴＰアーゼ活性を阻害することを必要としている細胞中において、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの受容体機能を刺激することなく、ＡＴＰアーゼ活性を阻害するための方法であって、
請求項１に記載の少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドの有効量を投与することを含む方法。
【請求項１１】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドが、ＭＢ７を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１２】
受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体を実質的に活性化することなく、ＡＴＰアーゼ活性を阻害するための方法であって、
請求項１に記載の少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを投与することを含む方法。
【請求項１３】
テトラヒドロキシキサントンを含む、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの阻害剤。
【請求項１４】
少なくともＭＢ５またはその誘導体を含む、ＣＴＳアンタゴニスト。
【請求項１５】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤のスクリーニング用の高処理検定であって、ウアバイン（５μＭ）を陽性対照として含み、そして０．１％ＤＭＳＯを陰性対照として用い、ここにおいて、
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの少なくとも２５％の阻害を生じる化合物を識別する、高処理検定。
【請求項１６】
新しいアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングするのに有用な、精製Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼおよび／または再構成したＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体。
【請求項１７】
キサントン誘導体であって、心臓血管および腎臓のリモデリング、更には、心臓および腎臓の線維症を包含する、内因性ＣＴＳ上昇で誘発される病理学的変化に拮抗する薬剤として有用なキサントン誘導体。
【請求項１８】
キサントン誘導体であって、現在利用可能な組成物よりも効力があり、毒性が少なく、そしてより良い薬物動態学的性質を有する受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼアンタゴニストの新しい生成に有用なキサントン誘導体。
【請求項１９】
細胞中においてＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼで媒介されるＳｒｃ調節を引き起こす方法であって、それを必要としている対象に、細胞中においてウアバインなどの強心ステロイドで誘発されるキナーゼカスケード活性化を無効にしうるアンタゴニストとして作用することが可能な少なくとも一つのヒドロキシルキサントン誘導体を投与することを含む方法。
【請求項２０】
ＳｒｃキナーゼドメインをＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼから放出させることができるような方法でのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの立体配座への変更を妨げる方法であって、
少なくとも一つのキサントン誘導体を投与することを含む方法。
【請求項２１】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤のクラスであって、心臓収縮機能を増加させることを必要としている対象の心臓収縮機能を増加させるのに有用であるが、受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体を刺激しない、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害剤のクラス。
【請求項２２】
心臓の肥大および／または線維症を引き起こすことなく、心臓収縮機能を改善するのに有用な組成物であって、
少なくとも一つのキサントン誘導体を含む組成物。
【請求項２３】
うっ血性心不全の一つまたはそれを超える臨床状態を処置するのに有用な組成物であって、
少なくとも一つのキサントン誘導体を含む組成物。
【請求項２４】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ受容体複合体をターゲッティング（targeting）し且つＣＴＳで誘発されるプロテインキナーゼカスケードに拮抗することを必要としている一つまたはそれを超える細胞中において、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ受容体複合体にターゲッティングし且つＣＴＳで誘発されるプロテインキナーゼカスケードに拮抗するための組成物であって、
請求項１に記載の少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを含む組成物。
【請求項２５】
Ｓｒｃ活性を阻害するまたはＣＴＳで誘発されるシグナル伝達に拮抗することを必要としている対象において、Ｓｒｃ活性を阻害するまたはＣＴＳで誘発されるシグナル伝達に拮抗するための方法であって、
キサントン誘導体から構成される一つまたはそれを超えるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドの有効量を投与することを含む方法。
【請求項２６】
ＳｒｃのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ相互作用性プールをターゲッティングし且つ効力のあるウアバインアンタゴニストとして作用することを必要としている一つまたはそれを超える細胞中においてＳｒｃのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ相互作用性プールをターゲッティングし且つ効力のあるウアバインアンタゴニストとして作用するための方法であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドの有効量を投与することを含む方法。
【請求項２７】
ウアバインで誘発されるＳｒｃ活性化およびＥＲＫ１／２などの下流シグナリング経路をブロックすることを必要としている対象においてウアバインで誘発されるＳｒｃ活性化およびＥＲＫ１／２などの下流シグナリング経路をブロックするための方法であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドの有効量を投与することを含む方法。
【請求項２８】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼおよびＣＴＳのシグナリング機能の生理学的および病理学的有意性を決定するための方法であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドをプローブとして用いることを含む方法。
【請求項２９】
ＳｒｃのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ相互作用性プールを選択的にターゲッティングし且つ有効なウアバインアンタゴニストとして機能することを必要としている一つまたはそれを超える細胞中においてＳｒｃのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ相互作用性プールを選択的にターゲッティングし且つ有効なウアバインアンタゴニストとして機能することが可能な組成物であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを含む組成物。
【請求項３０】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ受容体が過剰刺激されている場合の心臓血管疾患および癌のための治療的組成物であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを含む治療的組成物。
【請求項３１】
細胞増殖阻害および／または細胞死を誘発することを必要としている対象において細胞増殖阻害および／または細胞死を誘発する方法であって、
対象に、キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドの治療的有効量を投与することを含む方法。
【請求項３２】
ＣＴＳで引き起こされるシグナリング経路を妨げることを必要としている対象においてＣＴＳで引き起こされるシグナリング経路を妨げるための組成物であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを含む組成物。
【請求項３３】
ウアバインで引き起こされる心臓のシグナリング伝達を実質的に無効にすることを必要としている対象においてウアバインで引き起こされる心臓のシグナリング伝達を実質的に無効にするための方法であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドの有効量を投与することを含む方法。
【請求項３４】
癌関連障害または心臓疾患関連障害の処置用の薬剤の製造における、キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドの使用。
【請求項３５】
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド、および生理学的に許容しうる担体を含む、医薬組成物。
【請求項３６】
組成物が、心臓肥大、組織線維症および／またはうっ血性心不全の処置として用いるのに適合されている、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
対象におけるウアバインステロイド受容体によって媒介される状態を予防するまたは処置する方法であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドおよび／またはそのアゴニストまたはアンタゴニストを投与することを含む方法。
【請求項３８】
状態が、癌、心臓肥大、組織線維症またはうっ血性心不全の内の一つまたはそれを超えるものである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ステロイド受容体によって媒介される状態の予防または処置用の、対象への投与に適合された医薬組成物であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド、又はそのアゴニスト若しくはアンタゴニストの有効量、及び薬学的に許容しうる担体、希釈剤又は賦形剤、を含む医薬組成物。
【請求項４０】
心臓障害に苦しむ患者の処置に適合された医薬組成物であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド、またはその薬学的に許容しうる塩の治療的有効量を含む、医薬組成物。
【請求項４１】
医薬組成物であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド、またはそのアゴニストまたはアンタゴニストの有効量、および適当な担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項４２】
ステロイド受容体によって媒介される状態およびウアバイン受容体によって媒介される状態の予防または処置用の、対象への投与に適合された医薬組成物であって、
キサントン誘導体から構成される少なくとも一つのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド、および適当な担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項４３】
ヒト対象においてＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性を推定的に引き出すまたはモジュレーションする化合物を、化合物の特異的結合および／またはＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害または活性化への作用に基づいて識別する in vitro 方法であって、
（ｉ）特異的に結合する、および／または受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体の活性化を活性化またはモジュレーションする（増強するまたは阻害する）、または別の化合物による受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体の特異的結合および／または活性化をモジュレーションする少なくとも一つの化合物を検出する、結合検定または機能検定において、一つまたはそれを超える化合物をスクリーニングし；そして
（ii）受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性を推定的に引き出すまたはモジュレーションする少なくとも一つのこのような化合物を、（ｉ）化合物の特異的結合および／または活性化またはモジュレーション（阻害または増強）に基づいて；または（ii）化合物の、機能検定における別の化合物による特異的結合または活性化のモジュレーションに基づいて、識別することを含む方法。
【請求項４４】
分子、物質、タンパク質、ペプチドおよび／または化学物質のライブラリーをスクリーニングして、受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体に結合可能な分子、物質、タンパク質、ペプチドおよび／または化学物質を識別するための、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ライブラリーが、化学物質ライブラリー、抗体ライブラリー、ファージ提示ライブラリー、ペプチドライブラリーまたは天然化合物のライブラリーである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
分子、物質、タンパク質、ペプチドおよび／または化学物質が、ウアバインのアンタゴニストまたはアゴニストである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
対象においてＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性を潜在的に引き出すまたはモジュレーションする化合物を識別する方法であって、
受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体を活性化する、または別の化合物による受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体の活性化をモジュレーションする（増強するまたは阻害する）化合物を検出する機能検定において、一つまたはそれを超える化合物をスクリーニングし；そして
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性を潜在的に引き出すまたはモジュレーションする化合物を、化合物の（ｉ）受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体の活性化、および／または（ii）別の化合物による受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体の活性化のモジュレーション（増強または阻害）に基づいて、識別することを含む方法。
【請求項４８】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを、細胞中において発現させる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
細胞が、無傷のままであるまたは透過性化されている、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体を、細胞の表面上で発現させる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
真核細胞が、哺乳動物細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
機能検定が、受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体のインターナリゼーション（internalization）への化合物の作用を検出する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
一つまたはそれを超える化合物が、組み合わせ化学物質ライブラリー中に含まれている、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
一つまたはそれを超える化合物が、低分子量分子、薬草薬剤および細菌代謝産物の無作為ライブラリー中で配合されている、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
方法が、高処理スクリーニング法である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
機能検定が、受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体の活性化を増強するまたは阻害する化合物について、ウアバインによってスクリーニングする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
機能検定が、受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体へのウアバインまたはその類似体の結合を増強するまたは阻害する化合物についてスクリーニングする、請求項４７に記載の方法。
【請求項５８】
機能検定が、シグナル伝達への化合物の作用を検出する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５９】
機能検定が、受容体Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体とウアバインとのリガンド特異的カップリングへの化合物の作用を検出する、請求項４７に記載の方法。
【請求項６０】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼのアゴニストまたはアンタゴニスト活性について試験物質をスクリーニングするための検定であって、
（ｉ）ウアバインでモジュレーションされたＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを発現するまたは含有する一つまたはそれを超える細胞と、試験物質とを、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ受容体複合体の存在下において接触させ；
（ii）細胞中に存在するＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ受容体複合体の量を測定しまたは検出し；そして
（iii）工程（ii）において測定されたまたは検出された細胞中に存在するＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体受容体と、ウアバインでモジュレーションされたＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを含有するまたは発現する細胞を化合物の存在下で比較可能な条件下で接触させることによって得られる測定されたまたは検出されたＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体受容体とを比較し、それによって、試験物質が、アゴニストまたはアンタゴニスト活性を示すか否かを決定する工程を含む検定。
【請求項６１】
細胞が、心筋細胞または腎臓上皮細胞である、請求項６０に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図５Ａ】
【図６Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図１Ｂ】
【図５Ａ】
【図６Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【公表番号】特表２０１３−５０５２４１（Ｐ２０１３−５０５２４１Ａ）
【公表日】平成２５年２月１４日（２０１３．２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２９８０２（Ｐ２０１２−５２９８０２）
【出願日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４８２２７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３４７７２
【国際公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【出願人】（５０２４０９７２１）ザ・ユニバーシティ・オブ・トレド (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月１４日（２０１３．２．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４８２２７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３４７７２
【国際公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【出願人】（５０２４０９７２１）ザ・ユニバーシティ・オブ・トレド (13)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]