Ｐ４５０による難化学合成化合物の製造方法及び新規セスキテルペン
【課題】 P450を用いて、機能性セスキテルペン、及びナフタレン誘導体に水酸基を効率的に導入し、難化学合成化合物を製造する手段を提供する。
【解決手段】 CYP110に属するタンパク質などを、セスキテルペン又はナフタレン誘導体に作用させ、水酸化されたセスキテルペン又は水酸化されたナフタレン誘導体を得る工程を含むことを特徴とする水酸化化合物の製造方法。
【解決手段】 CYP110に属するタンパク質などを、セスキテルペン又はナフタレン誘導体に作用させ、水酸化されたセスキテルペン又は水酸化されたナフタレン誘導体を得る工程を含むことを特徴とする水酸化化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を用いる水酸化化合物の製造方法及び新規なセスキテルペンに関する。本発明の方法により、化学合成が困難な水酸化化合物の製造が可能になる。
【背景技術】
【０００２】
シトクロムP450 (以下、単に「P450」という場合がある。)は、全ての真核生物と、大腸菌などの一部の原核生物を除くすべての生物種に広く存在している酵素最大のファミリー群である(Nelson博士のホームページhttp://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html 参照のこと)。P450は、真核生物では500前後、原核生物では400前後のアミノ酸残基から構成されるヘムタンパク質であり、真核生物の場合、膜タンパク質、細菌の場合は、可溶性タンパク質として存在している。しかし、すべてのP450において、立体構造は類似しており、一辺が約60Å、厚さは約30Åのプリズム型をしている。一次構造の特徴に数カ所の共通した領域があり、中でも、カルボキシル末端から約50〜60アミノ酸残基手前に存在するPhe-X-X-Gly-X-Arg/His-X-Cys-X-Glyというヘム結合領域のアミノ酸配列は、高度に保存されたP450特有の配列であり、ゲノム情報からP450遺伝子を同定する場合に利用される。また、これらの共通性から、P450は、アミノ酸配列の類似度に基づいて分類される。分類は、シトクロムP450を示すCYPを接頭辞に付け、その後にファミリー番号、サブファミリー番号、遺伝子番号と分類する。原則的に、アミノ酸配列が40%以上一致する場合、同一ファミリーに分類し、55%以上一致する場合、同一サブファミリーに分類される。
【０００３】
P450は、炭化水素や芳香族化合物のように、化学的に安定な化合物の水酸化反応を触媒できる。しかし、P450の触媒反応は水酸化反応だけではない。現在判明しているP450の触媒反応は、水酸化のほかに、エポキシ化、O-脱メチル化、スルホキシド化、酸化的アリール転移、アリール結合反応等の様々な反応を触媒する (非特許文献１)。P450がモノオキシゲナーゼとして機能するには通常、NAD(P)HからP450に電子を伝達するタンパク質［電子伝達タンパク質、又はレドックス（redox；酸化還元）パートナータンパク質と呼ばれている。］の介在を必要とする。シアノバクテリアや放線菌を含む細菌（原核生物）由来のP450はほとんどclass Iに属するP450であり、電子伝達するタンパク質として、フェレドキシンレダクターゼ（ferredoxin reductase；FADを補酵素とする）とフェレドキシン（ferredoxin；鉄-硫黄小タンパク質）の２つのタンパク質の介在を必要とするという性質により特徴づけられる(非特許文献２）。しかしながら、細菌由来のP450には、これらの電子伝達タンパク質との相性があり、しかもP450自体が失活しやすい不安定酵素であるので、細菌ゲノム解析の結果、続々と新しいP450遺伝子配列が明らかになっている（http://drnelson.utmem.edu/BLAST/bacteria.dbs.html 参照）にもかかわらず、その機能解析がなされた例は少なく、P450の触媒機能の同定は困難となる場合が多かった(非特許文献２)。
【０００４】
シアノバクテリアは原核生物でありながら、光合成能を有し、高等植物の葉緑体の起源となった微細藻である。現在、シアノバクテリアは３４種のゲノムの解読が終了しており、その情報が開示されている(CyanoBaseホームページhttp://bacteria.kazusa.or.jp/cyanobase/index.html 参照)。ゲノム解析が終了しているシアノバクテリアの内、P450遺伝子を保有しているのは、２０種類である。公開されたゲノム情報から14ファミリー、60分子種のP450遺伝子配列が確認された。例えば、CYP110ファミリーは、アナベナ属[Anabaena sp.；ノストック属（Nostoc sp.）とも呼ばれる。] PCC7120株、ノストック・パンクチホルメ（Nostoc punctiforme）、アナベナ・バリアビリス（Anabaena variabilis）ATCC 29413株等のシアノバクテリアが保有するP450の最大のファミリーである。最近、アナベナ属PCC7120株由来のP450(CYP110C1)遺伝子を、同株由来のフェレドキシンレダクターゼとフェレドキシン遺伝子とともに大腸菌で共発現させることにより、シアノバクテリアが保有するセスキテルペンであるゲルマクレン（germacrene）Ａに水酸基を導入できると発表された（非特許文献３）。ただし、反応産物の構造は未同定である。これ以外のシアノバクテリア由来のP450の触媒機能が解析された例はない。
【０００５】
メルシャン株式会社は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のプチダレドキシン（フェレドキシン）レダクターゼとプチダレドキシン遺伝子を利用し、細菌由来のP450遺伝子と共発現させるためのベクターpT7NS-camABを開発した（非特許文献４）。上松らはこのベクターを用い、213個の放線菌等細菌由来のP450遺伝子を大腸菌で発現させ、テストステロンに水酸基を導入できるかどうかを調べた（非特許文献５）。その結果、24種類の立体特異的な水酸基導入反応が可能であることが示された（非特許文献５）。しかしながら、pT7NS-camABが、細菌由来のすべてのP450に対して必ずしも効率的な電子伝達を行うことができるわけではなく（非特許文献６）、細菌由来のP450遺伝子の効率的機能発現系として、他のオプション系が望まれていた。
【０００６】
ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌NCIMB9784株が有するP450RhF（CYP116）が、フェレドキシンレダクターゼ部分（FMNを補酵素とする）とフェレドキシン部分（鉄-硫黄小タンパク質）からなる還元酵素ドメイン（reductase domain、レドックスパートナータンパク質部分；C末側）がリンカー配列を介してP450本体タンパク質部分（N末側）と一本に繋がった１つのポリペプチド鎖という、一般的なP450とは異なる珍しい構造を持つことが、エジンバラ大学のグループによって示された（非特許文献７）。野舘らは、このP450RhFのリンカー配列（アミノ酸残基445-460；DDBJ accession no. AAM67416）を含む還元酵素ドメイン（アミノ酸残基461-773；DDBJ accession no. AAM67416）を利用し、機能解析を行いたいP450遺伝子のクローニング部位としてNdeI部位及びEcoRI部位を付与した大腸菌用機能発現ベクターpREDを作製した（特許文献１及び非特許文献８）。なお、大腸菌用ベースベクターとしては、T7プロモーターにより制御を受けるpET21a（Novagen社製）が用いられている。pREDベクターの構造を図１に示す。このpREDベクターを用いると、細菌由来のいくつかのP450遺伝子[P450cam(CYP101A1)、P450Bzo(CYP203A)、P450balk(CYP153A13a)]が大腸菌で機能発現されることが示された（特許文献１及び非特許文献８）。このpREDベクター系の最大の利点は、異種細菌由来のP450遺伝子を還元酵素ドメインとの融合タンパク質になるように大腸菌で発現させることにより、大腸菌内に合成されたP450の触媒機能の解析を効率良く実施できることである。
【０００７】
細菌バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）BM-3株が有するP450BM-3（P450BM3、CYP102A1とも呼ぶ）も、P450本体タンパク質部分（N末側）がレドックスパートナータンパク質部分（C末側）と一本に繋がった１つのポリペプチド鎖という珍しい構造をしている（本酵素のアミノ酸配列はDDBJ accession no. J04832参照）。しかし、P450BM-3のレドックスパートナータンパク質部分はP450RhF還元酵素ドメインとは違って、肝ミクロソーム等に存在するNADPH-P450レダクターゼと相同性を有していた。NADPH-P450レダクターゼを電子伝達タンパク質とするP450はclass IIであり、その意味でもP450BM-3は変わったP450であるが、この発見が1989年と古いので（非特許文献９）、現在までに広く研究に用いられてきた。本酵素は元々、炭素数12〜20の飽和脂肪酸のω末端メチル基から1位、2位または3位を水酸化する酵素として発見されたが、P450BM-3 における87番目のフェニルアラニン（F）をバリン（V）に変換させた酵素P450BM-3(F87V) ［CYP102A1(F87V)；以後、単にF87Vと呼ぶことがある］は、ナフタレンやベンゾチオフェンといった芳香族化合物に水酸基を導入できることがわかった（反応特異性は緩い；非特許文献１０）。さらにF87Vは、フェノール及びo-クレゾール、2,6-ジクロロフェノール、2-(ベンジロキシ)フェノール［2-(benzyloxy)phenol］等のフェノール類縁体をヒドロキノン及びヒドロキノン類縁体に変換できることが示されれ、広く芳香族化合物を変換できることが示された（非特許文献１０）。
【０００８】
免疫抑制剤のFK506に感受性のFK506結合タンパク質（FKBP）ファミリーは、ペプチジルプロリルcis-transイソメラーゼ（PPIase；peptidyl-prolyl cis-trans ismerase）ファミリー（３ファミリーからなる）の１つである。古細菌由来のFKBPはPPIase活性を持つだけでなく、本来の立体構造を取っていないタンパク質の再折りたたみ（refolding）を助け、タンパク質の凝集（aggregation）を抑制するという分子シャペロン活性をもつことが知られている（非特許文献１１）。古細菌由来のFKBPとして、たとえば、高度好熱性の古細菌であるサーモコッカス（Thermococcus）属KS-1株由来のPPIase（TcFKBP18と呼ばれている；そのアミノ酸・塩基配列はaccession no. AB012209参照）が挙げられる（非特許文献１１）。野舘らは、このFKBP（PPIase）（N末側）がF87Vタンパク質（C末側）と14アミノ酸からなるリンカー配列［TSLVPRGSHMEFEL；トロンビン切断部位（下線）を含む］を介して融合タンパク質として合成されるようにデザインしたプラスミドpFusionF87V（特許文献２ではpFusionP450と記載されている）を作製した（特許文献２）。プラスミドpFusionF87Vの構造を図２に示す。このプラスミドを作製する際、大腸菌用発現用ベクターとしてpET21d（Novagen社製）を使用した。またコントロールとして、PPIaseと融合形ではなく、F87V遺伝子のみをpET21dに挿入したプラスミドpETF87V（特許文献２ではpETP450と記載されている）を作製した。pFusionF87VまたはpETF87Vで形質転換した大腸菌BL21(DE3)から調製した無細胞酵素抽出液を用いて、60℃、20分の処理をした後P450の残存活性を測定したところ、pFusionF87Vを持つ大腸菌から調製された酵素抽出液の方が、pETF87Vを持つ大腸菌から調製された酵素抽出液より残存活性が2倍近く高かった（特許文献２）。したがって、PPIaseと融合したF87Vタンパク質の方がF87Vタンパク質だけより安定であることが示唆された。
【０００９】
以上述べてきたように、細菌由来のP450の中には有機化学合成では合成が困難な化合物への変換反応を担うP450の分子種が存在することが明らかになりつつあり、新規の触媒機能を有するP450の探索や、P450を用いた有機低分子化合物への酸素添加反応の産業利用が望まれている。そのなかでも特に、ゼルンボン（zerumbone）やβ-オイデスモール（β-eudesmol）等の機能性セスキテルペン、及び、1-メトキシナフタレンや1-エトキシナフタレンなどのナフタレン誘導体を変換できるP450の探索に関心がもたれている。
【００１０】
ゼルンボンやβ-オイデスモール等の機能性セスキテルペンは、ショウガ属の作物であるハナショウガ（Zingiber zerumbet Smith）（日本ではほとんど栽培されていない）の根茎に作られる。ゼルンボンについては抗炎症効果等が報告されているが、それ自身が分子内に共役カルボニル基や孤立二重結合等を有する11環化合物であり、多様な化学反応性が期待できることから、医薬品・農薬・香料等を作る際の化学合成の初発物質として注目されている。β-オイデスモールは、胃酸分泌抑制などの健胃作用や抗菌作用が報告されている機能性セスキテルペンである。
【００１１】
本発明者らは以前に、pFusionF87Vを持つ組換え大腸菌により、1-メトキシナフタレンからバイオコンバージョンにより作られた4-メトキシ-1-ナフトール（4-methoxy-1-naphthol；D897と呼ぶ）が 、枯草菌のレスポンスレギュレータ（Response Regulator）である YycF（細胞の分裂・増殖を司る）の二量体形成を阻害すると言うユニークなタイプの細菌二成分制御系（TCS；two component system）阻害剤であること見出し、日本農芸化学会2007年度大会で発表した（近畿大学・内海龍太郎教授との共同発表；講演要旨集 p. 35）。YycF阻害剤は、細菌TCSを解析するケミカルバイオロジー研究を行う上で重要なだけでなく、MRSA等の多剤薬剤耐性細菌の新ジャンル抗菌剤として開発できる可能性を有するという点でもきわめて重要である。ただし、このD897は安定性に問題があり、溶液中で次第に褐色を呈するようになる。したがって、D897の類縁体を作製して、さらに高品質のYycFの二量体形成の阻害剤を探索することが望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００６／０５１７２９号パンフレット
【特許文献２】特開２００５−２７８６３７号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】E. M. Isin and F. P. Guengerich, Biochim. Biophys, Acta. 1770: 314-329 (2007)
【非特許文献２】F. Hannemann et al, Biochim. Biophys. Acta, 1770: 330-344 (2007)
【非特許文献３】S. A. Agger et al, J. Bacteriol., 190: 6084-6096 (2008)
【非特許文献４】A. Arisawa and H. Agematu, A modular approach to biotransformation using microbial cytochrome P450 monooxygenases. In “Modern biooxidation: enzymes, reactions, and applications,” eds. Schmid, D. R., and Urlacher, V. B., Wiley-VCH, Weinheim (2007)
【非特許文献５】H. Agematu et al, Biosci. Biotechnol. Biochem., 70, 307-311 (2006)
【非特許文献６】R. Bernhardt, and I. C. Gunsalus, Biochem. Biophys. Res. Commun. 187, 310-317 (1992)
【非特許文献７】G. A. Roberts et al, J. Bacteriol. 184: 3898-3908 (2002)
【非特許文献８】M. Nodate et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 71: 455-462 (2006)
【非特許文献９】R. T. Ruettinger et al, J. Biol. Chem. 264, 10987-10995 (1989)
【非特許文献１０】W. T. Sulistyaningdyah et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 67: 556-562 (2005)
【非特許文献１１】A. Ideno et al, Appl.Microbiol. Biotechnol., 64: 99-105 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、P450を用いて、機能性セスキテルペン、及びナフタレン誘導体に水酸基を効率的に導入し、難化学合成化合物を製造する手段を提供することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、課題とする基質化合物に対して、新規の触媒機能を有するP450の探索を行った。研究を行う対象として、すでにゲノム情報が公開されている、放線菌 ストレプトミセス・グリセウス(Streptomyces griseus)由来の27個のP450遺伝子、シアノバクテリア ［Anabaena (Nostocとも言う) sp. strain PCC 7120、Anabaena variabilis strain ATCC 29413］由来の10個のP450遺伝子を単離した。そして、これらのP450遺伝子を、触媒機能の解析を行うため、pREDベクター（図１、特許文献１、非特許文献８）に導入した。pREDベクターは、前述したように、ロドコッカス属NCIMB 9784株が保有するP450RhF（非特許文献７）が、一般的なP450とは異なる構造［フェレドキシン（鉄-硫黄小タンパク質）レダクターゼ（還元酵素)領域とフェレドキシン領域とからなるP450還元酵素ドメイン (C末端側)が、リンカー配列を介してP450本体タンパク質と一本のポリペプチド鎖として融合している構造）を有することに着目して作製されたベクターであり、T7プロモーターにより制御を受けるpET21a (Novagen社製)を元に、P450RhFのリンカー配列を含む還元酵素ドメインとP450遺伝子のクローニング部位としてNdeIとEcoRI部位を付与した異種由来P450の大腸菌用機能発現ベクター（図１）である。このpREDベクターに異種細菌由来のいくつかのP450遺伝子を連結し、大腸菌で機能解析することにより、既に該ベクターの汎用性が確認されている(特許文献１、非特許文献８)。
【００１６】
本発明者等は、新規触媒機能の探索を行う過程において、アナベナ（Anabaena）属［ノストック属（Nostoc）とも言う］PCC 7120株由来のCYP110ファミリーに属するCYP110C1（アクセッション番号NP_488726）またはCYP110E1（アクセッション番号NP_488873）［CyanoBase（http://bacteria.kazusa.or.jp/cyanobase/index.html）におけるalr4686及びalr4833がそれぞれCYP110C1及びCYP110E1に対応する］が新規の触媒機能を有することを見出した。なお、CYP110C1とCYP110E1のアミノ酸配列レベルでの同一性（identity）は49％であった。すなわち、CYP110C1またはCYP110E1遺伝子を発現した組換え大腸菌の細胞を用いてバイオコンバージョン実験を行うと、ハナショウガが作る機能性セスキテルペンであるゼルンボン（zerumbone）が変換されて、水酸基が導入された2種類の新規の難化学合成性誘導体２種類（S-2及びS-3）を作ることができることを見出した。これらの新規化合物の構造は図３に示されている。CYP110C1及びCYP110E1遺伝子（終止コドンは除かれている）がpREDベクターに挿入されたプラスミドをそれぞれ、pCYP110C1-Red及びpCYP110E1-Redと命名した。なお、ゼルンボンは、大腸菌が保有する内在性酵素により、１つの二重結合が飽和されたS-1に変換された後、S-2及びS-3に変換されたと考えられる。
【００１７】
さらに、前述のPPIase（TcFKBP18）とP450BM-3 F87Vの融合タンパク質を合成する組換え大腸菌（プラスミドpFusionF87Vを含む）の細胞を用いバイオコンバージョン実験を行うと、ハナショウガが作る機能性セスキテルペンであるβ-オイデスモール（β-eudesmol）が変換されて、水酸基が導入された難化学合成性誘導体（S-4；図３）を作ることができることを見出した。さらに、プラスミドpFusionF87Vを含む組換え大腸菌は、前述の新規のゼルンボン誘導体のうちの１つ（S-2）を合成することができた。なお、ゼルンボンやβ-オイデスモールは有用な機能性セスキテルペンでありながら、それらのバイオコンバージョンの報告はこれまでになく、今回、初めて行ったものである。
【００１８】
また前述したように、pFusionF87Vをもつ組換え大腸菌により1-メトキシナフタレンから変換された4-メトキシ-1-ナフトール（4-methoxy-1-naphthol；D897と呼ぶ）が 、枯草菌のレスポンスレギュレータ（Response Regulator）である YycF（細胞の分裂・増殖を司る）の二量体形成を阻害すると言うユニークなタイプの細菌二成分制御系（TCS；two component system）阻害剤であることが見出されている。ただ、前述したよに、D897はそれ自身が分解しやすい不安定な化合物なので、化学合成では作るのが困難な構造をもつD897の類縁体を作ることを目的とし、1-メトキシナフタレン（1-methoxynaphthalene）及び1-エトキシナフタレン（1-ethoxynaphthalene）を基質として用い、これらに水酸基を導入できるかどうかという触媒機能の探索を行った。その過程において、CYP110E1遺伝子を発現した組換え大腸菌の細胞を用いてバイオコンバージョン実験を行うと、1-メトキシナフタレンが水酸化されて３つの難化学合成性のD897類縁体（D-1、D-2及びD-3）が生成すること、さらには1-エトキシナフタレンが水酸化されて３つの難化学合成性のD897類縁体（D-4とD-5）が生成することを見出した。これらの化合物の構造は図４に示されている。一方、pFusionF87Vをもつ組換え大腸菌により1-エトキシナフタレンのバイオコンバージョン実験を行うと、１つの難化学合成性の類縁体（D-6）が合成されることを見出し（図４）、一連のD897の難化学合成性の類縁体の製造研究を完成するに至った。なお、D-1及びD-6は基質の水酸化反応だけでなく、アリール結合反応が共に行われることにより生成されたものである。
【００１９】
すなわち本発明者らは、以下の知見を得た。
(i) CYP110に属するタンパク質をセスキテルペンのゼルンボンに作用させることにより、このセスキテルペンに水酸基を導入して新規化合物を製造できる。
(ii) CYP110に属するタンパク質を1-メトキシナフタレンまたは1-エトキシナフタレンに作用させることにより、このナフタレン誘導体に水酸基を導入でき、場合によりさらにアリール結合反応を行わせることができる。
(iii) CYP102A1(F87V)タンパク質をセスキテルペンのゼルンボンまたはβ-オイデスモールに作用させることにより、このセスキテルペンに水酸基を導入して新規または難化学合成性の化合物を製造できる。
(iv) CYP102A1(F87V)タンパク質を1-エトキシナフタレンに作用させることにより、1-エトキシナフタレンに水酸基を効率的に導入でき、さらにアリール結合反応を行わせることができる。
(v) 上記(i)〜(ii)の反応は、CYP110に属するタンパク質遺伝子をCYP110に属するタンパク質に電子を伝達するタンパク質の遺伝子と共に発現する組換えプラスミドを導入した形質転換体を、ゼルンボンまたは1-メトキシナフタレンまたは1-エトキシナフタレンに作用させることにより行うことができるが、従来のpREDベクターにCYP110に属するタンパク質遺伝子を挿入したプラスミドで形質転換した組換え大腸菌を用いれば、水酸基導入反応が進行しやすい。
(vi) 上記(iii)〜(iv)の反応は、CYP102A1(F87V)タンパク質を発現する組換えプラスミドを導入した形質転換体を、ゼルンボンまたはβ-オイデスモールまたは1-エトキシナフタレンに作用させることにより行うことができるが、従来の古細菌由来のFKBP（PPIase）遺伝子にCYP102A1(F87V)遺伝子を融合したプラスミドで形質転換した組換え大腸菌を用いれば、水酸基導入反応、また1-エトキシナフタレンの場合さらにアリール結合反応が進行しやすい。
(vii)上記(i)〜(vi)の反応は、CYP110に属するタンパク質またはCYP102A1(F87V)タンパク質を発現する大腸菌等の生きた細胞を用いて行うことができるので、反応の際に酵素を精製して使用する必要がなく、しかも反応後は遠心分離等により菌体を容易に除去することができることから、生成物の精製も容易である。このため、目的化合物を酵素法で簡便に、しかも大量に製造することができる。
【００２０】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の（１）〜（１６）を提供するものである。
（１）CYP110に属するタンパク質を、セスキテルペン又はナフタレン誘導体に作用させ、水酸化されたセスキテルペン又は水酸化されたナフタレン誘導体を得る工程を含むことを特徴とする水酸化化合物の製造方法。
（２）CYP110に属するタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体と、セスキテルペン又はナフタレン誘導体を共存させることにより、CYP110に属するタンパク質をセスキテルペン又はナフタレン誘導体に作用させることを特徴とする（１）に記載の水酸化化合物の製造方法。
（３）CYP110に属するタンパク質が、還元酵素ドメインと融合したタンパク質であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の水酸化化合物の製造方法。
（４）CYP110に属するタンパク質が、以下の(a)、(b)、又は(c)であることを特徴とする（１）乃至（３）のいずれかに記載の水酸化化合物の製造方法、
(a)CYP110E1、
(b)CYP110E1のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、
(c)CYP110E1遺伝子と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（５）セスキテルペンがゼルンボンであり、水酸化されたセスキテルペンが下記の式（II）又は式（III）：
【００２１】
【化１】
【００２２】
【化２】
で表される化合物であることを特徴とする（４）に記載の水酸化化合物の製造方法。
（６）ナフタレン誘導体が1-メトキシナフタレンであり、水酸化されたナフタレン誘導体が下記の式（V）、式（VI）、又は式（VII）：
【００２３】
【化３】
【００２４】
【化４】
【００２５】
【化５】
で表される化合物であることを特徴とする（４）に記載の水酸化化合物の製造方法。
（７）ナフタレン誘導体が1-エトキシナフタレンであり、水酸化されたナフタレン誘導体が下記の式（VIII）又は式（IX）：
【００２６】
【化６】
【００２７】
【化７】
で表される化合物であることを特徴とする（４）に記載の水酸化化合物の製造方法。
（８）CYP110に属するタンパク質が、以下の(d)、(e)、又は(f)であることを特徴とする（１）乃至（３）のいずれかに記載の水酸化化合物の製造方法、
(d)CYP110C1、
(e)CYP110C1のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、
(f)CYP110C1遺伝子と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（９）セスキテルペンがゼルンボンであり、水酸化されたセスキテルペンが下記の式（II）又は式（III）：
【００２８】
【化８】
【００２９】
【化９】
で表される化合物であることを特徴とする（８）に記載の水酸化化合物の製造方法。
（１０）以下の(g)、(h)、又は(i)のタンパク質を、セスキテルペン又はナフタレン誘導体に作用させ、水酸化されたセスキテルペン又は水酸化されたナフタレン誘導体を得る工程を含むことを特徴とする水酸化化合物の製造方法、
(g)CYP102A1(F87V)、
(h)CYP102A1(F87V)のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、
(i)CYP102A1(F87V)遺伝子と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（１１）(g)、(h)、又は(i)のタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体と、セスキテルペン又はナフタレン誘導体を共存させることにより、(g)、(h)、又は(i)のタンパク質をセスキテルペン又はナフタレン誘導体に作用させることを特徴とする（１０）に記載の水酸化化合物の製造方法。
（１２）(g)、(h)、又は(i)のタンパク質が、古細菌由来のFK506結合タンパク質と融合したタンパク質であることを特徴とする（１０）又は（１１）に記載の水酸化化合物の製造方法。
（１３）セスキテルペンがゼルンボンであり、水酸化されたセスキテルペンが下記の式（II）：
【００３０】
【化１０】
で表される化合物であることを特徴とする（１０）乃至（１２）のいずれかに記載の水酸化化合物の製造方法。
（１４）セスキテルペンがβ−オイデスモールであり、水酸化されたセスキテルペンが下記の式（IV）：
【００３１】
【化１１】
で表される化合物であることを特徴とする（１０）乃至（１２）のいずれかに記載の水酸化化合物の製造方法。
（１５）ナフタレン誘導体が1-エトキシナフタレンであり、水酸化されたナフタレン誘導体が下記の式（Ｘ）：
【００３２】
【化１２】
で表される化合物であることを特徴とする（１０）乃至（１２）のいずれかに記載の水酸化化合物の製造方法。
（１６）下記の式（II）、又は式（III）：
【００３３】
【化１３】
【００３４】
【化１４】
で表される水酸化されたセスキテルペン。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によれば、ゼルンボン（zerumbone）やβ-オイデスモール（β-eudesmol）等の機能性セスキテルペン、及び、1-メトキシナフタレンまたは1-エトキシナフタレンを基質として用いることにより、難化学合成性の水酸化化合物を得ることができる。すなわち、本発明により、医薬品、健康食品、農薬、香料及びこれらの合成中間体等として有用であるセスキテルペンまたはナフタレン誘導体を、温和な条件下で簡便に、しかも効率よく大量に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】pREDベクターの構造を示す図である。
【図２】PPIase-P450BM-3 F87Vの融合タンパク質生産用プラスミドpFusionF87V（別名 pFusionP450）の構造を示す図である。
【図３】組換え大腸菌によるゼルンボンまたはβ-オイデスモールから水酸化された難化学合成性誘導体の製造経路を示す図である。
【図４】組換え大腸菌による1-メトキシナフトールまたは1-エトキシナフトールから水酸化された難化学合成性誘導体の製造経路を示す図である。
【図５】CYP110E1-Redタンパク質のCO差スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３８】
本発明の水酸化化合物の製造方法は、シトクロムP450を、セスキテルペン又はナフタレン誘導体に作用させ、水酸化されたセスキテルペン又は水酸化されたナフタレン誘導体を得る工程を含むことを特徴とするものである。
【００３９】
（Ａ）シトクロムP450
本発明において使用するシトクロムP450としては、CYP110に属するタンパク質やCYP102A1のF87V変異体（CYP102A1(F87V)）などを例示できる。
【００４０】
（Ａ−１）CYP110に属するタンパク質
CYP110に属するタンパク質としては、例えば、CYP110E1やCYP110C1を使用することができる。CYP110E1やCYP110C1は公知のタンパク質であり、そのアミノ酸配列やそれをコードする遺伝子の塩基配列はデータベース上に登録されている。例えば、CYP110E1及びCYP110C1のアミノ酸配列は、それぞれDDBJにaccession no NP_488873及びaccession no. NP_488726として登録されており、また、CYP110E1遺伝子及びCYP110C1遺伝子の塩基配列は、DDBJのaccession no NC_003272内にそれぞれ、alr4833及びalr4686として登録されている。
【００４１】
また、CYP110E1の代わりにCYP110E1と同機能のタンパク質、CYP110C1の代わりにCYP110C1と同機能のタンパク質を使用してもよい。CYP110E1と同機能のタンパク質としては、以下の(b)及び(c)のタンパク質を例示でき、CYP110C1と同機能のタンパク質としては、以下の(e)及び(f)のタンパク質を例示できる。
(b)CYP110E1のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質
(c)CYP110E1遺伝子と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質
(e)CYP110C1のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質
(f)CYP110C1遺伝子と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質
【００４２】
(b)及び(e)のタンパク質は、それぞれCYP110E1及びCYP110C1に、CYP110E1及びCYP110C1の有するモノオキシゲナーゼ活性を失わせない程度の変異が導入されたタンパク質である。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、通常は、30アミノ酸以内であり、好ましくは20アミノ酸以内であり、更に好ましくは10アミノ酸以内であり、最も好ましくは5アミノ酸以内である。変異を導入したタンパク質がモノオキシゲナーゼ活性を保持しているかどうかは、タンパク質に還元状態で一酸化炭素を通気し、吸収スペクトルが変化し、450nmに極大をもつ差スペクトル（ＣＯ差スペクトル）が現れるかどうかで確認することができる。なお、ここでいう「モノオキシゲナーゼ活性」とは、酸素分子を還元して１分子の水を作るとともに、残りの酸素原子を様々な低分子有機化合物に導入して、酸化生成物に変換する反応を触媒する活性を意味する。
【００４３】
(c)及び(f)のタンパク質は、DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られるモノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質である。これらのタンパク質における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、5×SSC、1％SDSを含む緩衝液中の37℃でのハイブリダイゼーション及び1×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による37℃での洗浄処理といった条件であり、好ましくは、5×SSC、1％SDSを含む緩衝液中の42℃でのハイブリダイゼーション及び0.5×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による42℃での洗浄処理といった条件であり、更に好ましくは、5×SSC、1％SDSを含む緩衝液中の65℃でのハイブリダイゼーション及び0.2×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による65℃での洗浄処理といった条件である。ハイブリダイゼーションにより得られるDNAは、CYP110E1遺伝子又はCYP110C1遺伝子と通常、高い相同性を有する。高い相同性とは、80％以上の相同性、好ましくは90％以上の相同性、更に好ましくは95％以上の相同性を指す。
【００４４】
CYP110に属するタンパク質は、他のタンパク質と融合した融合タンパク質であってもよい。CYP110に属するタンパク質と融合する他のタンパク質は特に限定されないが、還元酵素ドメインが好ましく、ロドコッカス属NCIMB9784株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼP450RhFに含まれる還元酵素ドメインがより好ましい。シトクロムP450モノオキシゲナーゼP450RhFのアミノ酸配列は、DDBJにaccession no.AAM67416として登録されており、このアミノ酸配列の461-773が還元酵素ドメインである。
【００４５】
シトクロムP450モノオキシゲナーゼP450RhFに含まれる還元酵素ドメインの代わりに、この還元酵素ドメインと同機能のタンパク質を使用してもよい。このようなタンパク質としては、以下の(j)及び(k)を例示できる。
【００４６】
（j）シトクロムP450モノオキシゲナーゼP450RhFに含まれる還元酵素ドメインのアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、還元酵素活性を有するタンパク質
（k）シトクロムP450モノオキシゲナーゼP450RhFに含まれる還元酵素ドメインをコードするDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、還元酵素活性を有するタンパク質
「付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列」及び「ストリンジェントな条件」の意味は、上述した(b)、(c)、(e)、及び(f)のタンパク質と同様である。変異を導入したタンパク質が還元酵素活性を保持しているかどうかは、そのタンパク質と既知のシトクロムP450との融合タンパク質を作り、実際に反応生成物が生じるかどうかを確かめることで確認することができる。
【００４７】
CYP110に属するタンパク質と還元酵素ドメインとの間には、リンカーペプチドを介在させることができる。リンカーペプチドの長さは、CYP110に属するタンパク質と還元酵素ペプチドとで効率良く反応を進める上で、約６〜２６アミノ酸残基、好ましくは１６残基前後とすることができる。
【００４８】
（Ａ−２）CYP102A1(F87V)
CYP102A1(F87V)は公知のタンパク質であり、このタンパク質の元となったタンパク質であるCYP102A1のアミノ酸配列やそれをコードする遺伝子の塩基配列はデータベース上に登録されている。例えば、CYP102A1のアミノ酸配列は、DDBJにaccession no. AAA87602として登録されており、また、CYP102A1遺伝子の塩基配列は、DDBJにaccession no.J04832として登録されている。
【００４９】
また、CYP102A1(F87V)の代わりにCYP102A1(F87V)と同機能のタンパク質を使用してもよい。CYP110E1と同機能のタンパク質としては、以下の(h)及び(i)のタンパク質を例示できる。
【００５０】
(h)CYP102A1(F87V)のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質
(i)CYP102A1(F87V)遺伝子と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質
「付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列」及び「ストリンジェントな条件」の意味は、上述した(b)、(c)、(e)、及び(f)のタンパク質と同様である。
【００５１】
CYP102A1(F87V)も、CYP110に属するタンパク質と同様に他のタンパク質と融合した融合タンパク質であってもよい。CYP102A1(F87V)と融合する他のタンパク質は特に限定されないが、FK506結合タンパク質（FKBP）が好ましく、古細菌由来のFKBPがより好ましく、サーモスコッカス属KS-1株由来のFKBP（TcFKBP18）が更に好ましい。TcFKBP18のアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列は、GenBankにaccession no.AB012209として登録されている。
【００５２】
TcFKBP18の代わりにTcFKBP18と同機能のタンパク質を使用してもよい。TcFKBP18と同機能のタンパク質としては、以下の(l)及び(m)のタンパク質を例示できる。
【００５３】
(l)TcFKBP18のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、PPIase活性を有するタンパク質
(m)TcFKBP18遺伝子と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、PPIase活性を有するタンパク質
「付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列」及び「ストリンジェントな条件」の意味は、上述した(b)、(c)、(e)、及び(f)のタンパク質と同様である。変異を導入したタンパク質がPPIase活性を保持しているかどうかは、フィッシャーらが提案したキモトリプシンカップルドアッセイによって確認することができる(Fischer et al., 1984, Biomed.Biochim.Acta 43,1101-1111)。
【００５４】
CYP102A1(F87V)とFKBPとの間には、リンカーペプチドを介在させることができる。リンカーペプチドの長さは、約4〜24アミノ酸残基、好ましくは14残基前後とすることができる。
【００５５】
（Ｂ）反応
（Ｂ−１）反応条件
本発明の水酸化化合物の製造方法では、適当な溶液又は溶媒中で、基質とシトクロムP450とを反応させる。シトクロムP450がモノオキシダーゼとして機能するためには、通常、電子伝達タンパク質が必要なので、このタンパク質も反応系に加える。但し、シトクロムP450が還元酵素ドメインとの融合タンパク質になっている場合には、電子伝達タンパク質の添加は不要である。シトクロムP450は必ずしも精製されている必要はなく、菌体の破砕物や抽出物などであってもよい。また、シトクロムP450は適当な担体に固定化されたものであってもよい。
【００５６】
反応に用いるシトクロムP450は、上記のようにシトクロムP450自体でもよいが、シトクロムP450をコードする遺伝子を導入した形質転換体が好ましい。以下、このような形質転換体を用いた方法について説明する。反応は、回分反応や流加（半回分）反応などのバッチ方式や灌流反応などの連続反応方式で行い得る。基質は一括、又は連続的に添加し得る。
【００５７】
反応条件は用いる微生物、及び基質の種類によって異なるが、例えば、回分反応の場合は、反応液中の基質濃度は約0.1〜10 ｍＭが好ましく、約0.5〜2 ｍＭがより好ましい。また、非水溶性かつ液体の基質の場合は、重層することができる。反応液のｐＨは約6〜8が好ましく、約7.0〜7.5がより好ましい。また、反応は、通常、約20〜30℃で約12〜48時間行えばよい。流加（半回分）反応や連続反応の場合は、回分反応の条件に準じて条件を設定すればよい。上記範囲であれば、原料化合物の変換率が高く、かつ精製が容易となる。
【００５８】
（Ｂ−２）基質
基質とするセスキテルペンとしては、ゼルンボン、β-オイデスモールなどを例示でき、基質とするナフタレン誘導体としては、1-メトキシナフタレン、1-エトキシナフタレンなどを例示できる。これらの化合物は市販のものを利用してもよく、また、公知の方法によって合成したものであってもよい。
【００５９】
（Ｂ−３）生成物
反応による生成物は、下記の式（II）で表される化合物（S-2）、下記の式（III）で表される化合物（S-3）、下記の式（IV）で表される化合物（S-4）、下記の式（Ｖ）で表される化合物（D-1）、下記の式（VI）で表される化合物（D-2）、下記の式（VII）で表される化合物（D-3）、下記の式（VIII）で表される化合物（D-4）、下記の式（IX）で表される化合物（D-5）、下記の式（Ｘ）で表される化合物（D-6）である。
【００６０】
【化１５】
【００６１】
【化１６】
【００６２】
【化１７】
【００６３】
【化１８】
【００６４】
【化１９】
【００６５】
【化２０】
【００６６】
【化２１】
【００６７】
【化２２】
【００６８】
【化２３】
S-2は、基質としてゼルンボンを用い、シトクロムP450としてCYP110E1若しくはこれと同機能のタンパク質、CYP110C1若しくはこれと同機能のタンパク質、又はCYP102A1(F87V)若しくはこれと同機能のタンパク質を用いた場合に生成し、S-3は、基質としてゼルンボンを用い、シトクロムP450としてCYP110E1若しくはこれと同機能のタンパク質、又はCYP110C1若しくはこれと同機能のタンパク質を用いた場合に生成し、S-4は、基質としてβ-オイデスモールを用い、シトクロムP450としてCYP102A1(F87V)若しくはこれと同機能のタンパク質を用いた場合に生成し、D-1、D-2、及びD-3は、基質として1-メトキシナフタレンを用い、シトクロムP450としてCYP110E1若しくはこれと同機能のタンパク質を用いた場合に生成し、D-4及びD-5は、基質として1-エトキシナフタレンを用い、シトクロムP450としてCYP110E1若しくはこれと同機能のタンパク質を用いた場合に生成し、D-6は、基質として1-エトキシナフタレンを用い、シトクロムP450としてCYP102A1(F87V)若しくはこれと同機能のタンパク質を用いた場合に生成する。
【００６９】
各生成物は、常法により精製され得る。例えば、必要に応じ遠心分離、濾過等の処理を施して菌体等の懸濁物を除去し、次いで一般的な抽出溶剤、例えば酢酸エチル、クロロホルム、メタノール等の有機溶剤で抽出し、有機溶剤を減圧下で除去し、そして減圧蒸留、クロマトグラフィー、イオン交換樹脂、又は吸着性樹脂等の処理を行うことにより精製され得る。
【００７０】
（Ｃ）形質転換体
シトクロムP450をコードする遺伝子を導入した形質転換体の作製は、常法に従って行うことができる。即ち、シトクロムP450をコードする遺伝子を常法に従って取得し、これを適当なベクターに挿入し、それを適当な宿主に導入し、形質転換すればよい。
【００７１】
シトクロムP450をコードする遺伝子は、例えば、シトクロムP450をコードする公知の遺伝子の配列に基づきプローブやプライマーを設計し、これを利用してゲノムDNAライブラリーやcDNAライブラリーから取得することができる。この際、取得した遺伝子の塩基配列の一部を改変してもよい。また、シトクロムP450をコードする公知の遺伝子の配列を基に化学的に合成してもよい。
【００７２】
遺伝子を挿入するベクターは特に限定されず、例えば、ファージ、ファージミドベクター、プラスミドベクター等が挙げられる。プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルス、トガウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。細菌細胞は生育が容易で反応を行い易いため、本発明に用いるベクターとしては、細菌由来のベクターが好ましく、大腸菌由来のベクターがより好ましい。大腸菌由来のベクターとしては、pUC系ベクターやpETベクターが好ましい。
【００７３】
シトクロムP450を高発現させるためには、プロモーター及び翻訳シグナルの選択が重要である。プロモーターは、宿主中で機能できるものであればよいが、例えば、lacプロモーター、lacUV5プロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、T7プロモーターなどが挙げられる。中でも、lacプロモーターやT7プロモーターを用いることにより、シトクロムP450を高発現させることができる。翻訳シグナルも宿主中で機能できるものであればいずれを用いてもよいが、例えば、LacZの翻訳シグナル、Lppの翻訳シグナルなどが挙げられる。中でも、シトクロムP450を高発現させることができる点で、LacZの翻訳シグナルが好ましい。
【００７４】
CYP110に属するタンパク質をコードする遺伝子を発現する最も好ましいベクターとしては、CYP110に属するタンパク質をコードする遺伝子の３’末端に、リンカーを介して、ロドコッカス属NCIMB9784株由来のシトクロムP450RhFの還元酵素ドメイン又はこれと同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を連結した融合タンパク質発現カセットを含むベクターである。
【００７５】
CYP102A1(F87V)をコードする遺伝子を発現する最も好ましいベクターとしては、CYP102A1(F87V)をコードする遺伝子の５’末端に、リンカーを介して、TcFKBP18又はこれと同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を連結した融合タンパク質発現カセットを含むベクターである。
【００７６】
ベクターの宿主への導入方法は、特に限定されないが、細菌に導入する方法であれば、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Cohen et a1.: Proc. Nat1. Acad. Sci., USA, 69, 2110, 1972]やエレクトロポレーション法等が挙げられ、また、酵母へ導入する方法であれば、例えば、エレクトロポレーション法[Becker,D.M. et a1.: Methods Enzymo1., 194,182, 1990]、スフェロプラスト法[Hinnen, A. et a1.: Proc. Nat1. Acad. Sci., USA, 75, 1929, 1978]、酢酸リチウム法[Itoh, H.: J .Bacterio1.,153, 163, 983]等が、また、動物細胞へ導入する方法であれば、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が、また、昆虫細胞へ導入する方法であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００７７】
宿主はベクターに合わせて選択すればよいが、ゼルンボンを基質とする場合は、ゼルボンをS-1に変換する内在性酵素を持つ宿主を選択することが好ましい。このような宿主としては大腸菌を挙げることができる。ゼルンボン以外を基質とする場合は、宿主は特に限定されず、動物、酵母等の真核細胞でも、放線菌や真正細菌（eubacteria）等の原核細胞でもよいが、生育が簡単で早く変換反応を行い易い点で、真正細菌細胞が好ましい。真正細菌細胞としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）などのエシェリキア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属に属する細菌などが挙げられるが、中でも、大腸菌が好ましい。
【実施例】
【００７８】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７９】
[実施例１]
アナベナ属PCC 7120株由来CYP110E1及びCYP110C1遺伝子の大腸菌での機能発現用プラスミドの作製
アナベナ属PCC 7120株が有するCYP110E1の機能解析用プラスミドCYP110E1-Red及びCYP110C1の機能発現用プラスミドpCYP110C1-Redの作製を行った。
【００８０】
本発明者らは、上記でも述べたように大腸菌でのP450遺伝子の機能発現系を構築した（特許文献１、非特許文献８）。本研究で機能解析を実施するシアノバクテリア (アナベナ属PCC 7120株)由来のCYP110E1及びCYP110C1の機能発現解析に、このpREDベクターを利用した。機能解析用プラスミドCYP110E1-Red及びpCYP110C1-Redの作り方はほぼ同じなので、ここではCYP110E1-Redの作製の実施例について述べる。
【００８１】
(1) Anabaena属PCC 7120株由来CYP110E1遺伝子の塩基配列確認用プラスドの作製とPCR増幅したCYP110E1遺伝子の塩基配列の確認
塩基配列の確認の為に、α相補性を利用した青白選抜が可能である大腸菌用プラスミドベクターpHSG396 (クロラムフェニコール耐性；TaKaRa Bio 社製)を材料として用いた。その後のP450遺伝子のサブクローニング操作が容易となるように、マルチクローニング部位を新たに付与し、汎用性を高めたpHSG396NMSベクターを構築した。その後、このpHSG396NMSに、Anabaena属PCC 7120株のゲノムからPCR法により増幅したCYP110E1遺伝子（終止コドンは除いている）を挿入し、pHSG396NMS-CYP110E1プラスミドを作製し、CYP110E1遺伝子の塩基配列の確認を行った。pHSG396NMSに連結（挿入）したCYP110E1遺伝子の塩基配列は、DDBJ accession no. NP_488873で示される塩基配列から終始コドン（TAG）を除去したもの(1,365 bp)である。
【００８２】
1) P450遺伝子の塩基配列確認用プラスミドpHSG396NMSプラスミドベクターの作製
pHSG396プラスミドベクターをHindIIIとHincIIとで二重消化した後、アガロース電気泳動をかけてDNA断片をゲルから切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製)を用いてゲル抽出を行った(2,218 bp)。次にHindIII-NdeI-NotI-MfeI(MunI)-SpeI-HincII部位を持つようにデザインした合成DNAを二重鎖になるようにアニーリングしたもの（0.5μg）をHindIII-HincII切断したpHSG396ベクター（0.2μg）と混合し、Ligation high溶液 (東洋紡社製)と1:1の量比で混合し、16℃、45分間のライゲーション反応を行い、合成二本鎖DNAをpHSG396ベクターに連結した。その後、氷水中で大腸菌コンピテントセル［ECOS Competent E. coli DH5α (ニッポンジーン社製)］にライゲーション反応液を1/10量混合し、5分間氷水中で放置した後、42℃、45秒間処理することで形質転換した。次に、SOC培地 (2% トリプトン、0.5% yeast extract、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4、20 mM グルコース)を菌体溶液の２倍量加え、37℃、30分間インキュベートした。その後、30μg/mlのクロラムフェニコールを含み、30μlの100 mM IPTG （イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）と30μlの20%のX-Gal （５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）-DMSO (Dimethyl sulfoxide)溶液を塗布したLB培地プレート (1% Bacto-tryptone、0.5% Bacto-yeast extract、1% NaCl、0.02% 5 N NaOH、1.5%アガロース)にインキュベートした菌体溶液を塗布し、37℃で16時間培養した。16時間の培養後、プラスミドを抽出するために、白色コロニーを採り、クロラムフェニコールを30μg/ml含むLB培地 (1% Bacto-tryptone、0.5% Bacto-yeast extract、1% NaCl、0.02% 5 N NaOH)へ移植し、37℃で16時間、170 rpmの条件下、振盪培養器で振盪培養した。培養した形質転換大腸菌から、QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN社製)を用いてプラスミドの抽出を行った。抽出したプラスミドを、マルチクローニングサイトの外側の塩基配列から設計したプライマーを使用し、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems 社製)を用いてシークエンス反応に供した。シークエンス反応条件は、1μlのReady reaction premix、3.5μlの5×BigDye sequencing Buffer、プライマー {3.5μlのフォワードプライマー：pHSG396NMS-Fo (1μmol/μl)もしくは、3.5μlのリバースプライマー：pHSG396NMS-Rv (1μmol/μl)}、200 ngのプラスミドDNA、及び滅菌水蒸留水を20μlとなるように混合し、シークエンス反応として96℃で1分間加熱した後、96℃で10秒間、50℃で5 秒間、及び60℃で4分間を30サイクル行った。その後、model 3730 DNA analyzer (Applied Biosystems 社製)を使用して、インサートの塩基配列を確認し、P450遺伝子の塩基配列確認用プラスミドをpHSG396NMS (2,347 bp)とした。
【００８３】
＜シークエンス用プライマーの塩基配列＞
シークエンス確認に使用したプライマーの塩基配列は以下の通りである。
【００８４】
pHSG396NMS-Fo : 5’- AGTCACGACGTTGTA -3’（配列番号１）
pHSG396NMS-Rv : 5’- CAGGAAACAGCTATGAC -3’ （配列番号２）
2) Anabaena属PCC 7120株由来CYP110E1遺伝子の塩基配列確認用プラスミドpHSG396NMS-CYP110E1の作製
＜Anabaena属PCC 7120株のゲノムDNAの抽出＞
Anabaena属PCC 7120株凍結菌体（約1 g）を氷水中で溶解後、300μlのSTE Buffer {100 mM NaCl、10 mM Tris・HCl (pH8.0)、1 mM EDTA (pH8.0)}を加え、懸濁後、4℃、15分間、8000 rpm遠心分離し、上清を除いた。菌体を300μlのSTE Bufferに再懸濁し、68℃、15分間のインキュベートにより、DNaseを失活させた。4℃、15分間、8000 rpm遠心分離し、上清を除いた。菌体にリゾチームを終濃度5 mg/ml、及び60μlのRNase A (10mg/ml)を加えた600μlの溶菌 Buffer {50 mM グルコース、25 mM Tris・HCl (pH8.0)、10 mM EDTA (pH8.0)}を加え、再懸濁し、37℃、30分間保温した。12μlのProteinase K (20 mg/ml) (TaKaRa Bio 社製)を加え、混和後、さらに37℃で10分間保温した。6 mgのN-Lauroylsarcosine・Naを加え、混和後、37℃、16時間保温し、菌体を溶菌させた。600μlのフェノール/クロロホルム {TE Buffer {10 mM Tris・HCl (pH8.0)、1 mM EDTA (pH8.0)}飽和フェノール：(クロロホルム：イソアミルアルコール=24:1)=1:1}を加え、5分間混和後、10℃、15分間、9000 rpm遠心分離した。上層を回収し、400μlのフェノール/クロロホルムを加え、5分間混和後、10℃、15 分間、9000 rpm遠心分離した。再度、上層を回収し、400μlのフェノール/クロロホルムを加え、5分間混和後、10℃、15 分間、9000 rpm遠心分離した。上層を回収し、1/10量の3 M酢酸ナトリウム、1/10量の125 mM EDTA、及び3倍量の100%エタノールを加え、4℃、20分間、10000 rpm遠心分離し、上清を除いた。70%エタノールを500μl加え、4℃、10分間、10000 rpm遠心分離し、上清をよく除いた。200μlのTE Bufferを加え、沈殿したゲノムDNAを4℃で24時間溶解させた。
【００８５】
＜pHSG396NMS-CYP110E1の作製＞
pHSG396NMSプラスミドベクターを、制限酵素NdeIとEcoRIとで37℃、4時間、2重消化した。その後、1.5%アガロース電気泳動を行い、NdeIとEcoRIとで切断されたpHSG396NMSを切り出し、QIAquick Gel Extraction Kitを用いてゲル抽出を行った。このDNAをベクターDNAとした。
【００８６】
次に、PCR法を用いて、Anabaena属PCC 7120株のCYP110E1遺伝子を増幅した。PCR増幅には、pHSG396NMSプラスミドベクターへの連結を行うためにCYP110E1遺伝子のN末端側にNde I配列、C末端側にEcoR I配列を付与するように設計したプライマーを使用した。また、後に述べるP450還元酵素とのキメラタンパク質としての発現のために、C末端側のプライマーは、終止コドンを除くように設計した。PCR増幅反応は、25μｌの2×PrimeSTAR MaxPremix (TaKaRa Bio 社製)、1μlのフォワードプライマー：Ana4833F (10μmol/μl)、1μlのリバースプライマー：Ana4833R (10μmol/μl)、0.5μlのAnabaena属PCC 7120株ゲノムDNA (25 ng)、2.5μlのDMSO (ジメチルスルホキシド)、及び20μlの滅菌水蒸留水を混合し、PCR反応として98℃で2分間加熱した後、98℃で10秒間、55℃で10秒間、及び72℃で15秒間を5サイクル行った。その後、98℃で10秒間、62℃で5秒間、及び72℃で15秒間を30サイクル行い、CYP110E1遺伝子を増幅した。PCR増幅反応の終了後、反応液2μlを用いて1.5%アガロース電気泳動を行い、CYP110E1遺伝子(1,365 bp)の大きさのPCR増幅産物が得られたことを確認した。CYP110E1遺伝子の増幅を確認後、MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN社製)を用いてPCR増幅産物を精製した。精製したPCR増幅産物は、1.5%アガロース電気泳動を行い、CYP110E1遺伝子の大きさのバンドを切り出し、QIAquick Gel Extraction Kitを用いてゲル抽出を行った。抽出したPCR増幅産物を、制限酵素NdeIとEcoRIとで37℃、4時間、2重消化した。その後、1.5%アガロース電気泳動を行い、QIAquick Gel Extraction Kitを用いてゲル抽出を行った。このPCR増幅産物をインサートDNAとした。
【００８７】
次いで、ベクターDNAとインサートDNAとをモル比で3:1の割合で混合し、Ligation Convenience Kit (ニッポンジーン社製)を等量加えて混合後、16℃、15分間ライゲーションした。氷水中で2.5μlのライゲーション反応液を25μlの大腸菌コンピテントセル (ECOS Competent E.coli DH5α)へ混合した。これを5分間氷水中で放置した後、42℃、45秒間処理することでコンピテントセルを形質転換した。その後、得られた形質転換体に25μlのSOC培地を加え、37℃で、30分間放置した後、30μg/mlのクロラムフェニコールを含み、30μlの100 mM IPTGと30μlの20%のX-Gal-DMSO溶液とを塗布したLBプレートに塗り広げた。その後、37℃、16時間培養し、コロニーを形成させた。次に、生じた白色コロニーを採り、コロニーダイレクトPCR法を用いて、プラスミドのインサートを確認した。コロニーダイレクトPCRは、0.125μlのSpeedSTAR HS DNA polymelase (TaKaRa Bio 社製)、2.5μlの10×Fast Buffer I (TaKaRa Bio 社製)、0.7μlのフォワードプライマー：Ana4833F (10 pmol/μl)、0.7μlのリバースプライマー：Ana4833R (10 pmol/μl)、1.25μlのDMSO、2μlのdNTP Mixture (2.5 mM each)、及び17.725μlの滅菌水蒸留水のPCR反応溶液へコロニーを少量混合し、98℃で5秒間、64℃で10秒間、及び72℃で10秒間のPCR反応を30サイクル繰り返した。反応後、PCR反応液の内、3μlを1.5%アガロース電気泳動することで、インサートDNAが挿入されているコロニーを選び出した。インサートを確認したコロニーを、次に、30μg/mlのクロラムフェニコールを含む10 mlのLB培地に植菌し、37℃で16時間、170 rpmの条件下、振盪培養器で振盪培養した。培養した形質転換大腸菌から、QIAprep Spin Miniprep Kitを用いてプラスミドの抽出を行った。抽出したプラスミドは、マルチクローニングサイトの外側の塩基配列から設計したプライマーを使用し、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitを用いてシークエンス反応を行い、インサートDNAの塩基配列を確認した。シークエンス条件は、CYP110E1遺伝子のGC含有量が高いことから、DMSOを反応液に5%添加し、pHSG396NMSの作製と同様にシークエンス反応を行った。なお、CYP110E1遺伝子の挿入が確認されたプラスミドをpHSG396NMS-CYP110E1とした。
【００８８】
＜CYP110E1のPCR増幅に使用したプライマーの塩基配列＞
前述のプライマーの塩基配列は以下の通りである。
【００８９】
Ana4833F: 5’-TACCATATGATGAAACTTCCAGATAGTC-3’（配列番号３）
Ana4833R: 5’-TACGAATTCTACTTCTACAGGGTTTTTG-3’（配列番号４）
(2) Anabaena属PCC 7120株由来CYP110E1遺伝子の機能発現用プラスミドpCYP110E1-Redの作製
pREDベクターを制限酵素NdeIとEcoRIとで37℃、3時間、2重消化した。処理後は、0.8%アガロース電気泳動を行い、バンドを切り出し、QIAquick Gel Extraction Kitを用いてゲル抽出を行った。これを酵素機能発現用ベクターDNAとした。プラスミドpHSG396NMS-CYP110E1を制限酵素NdeIとEcoRIとで37℃、3時間、2重消化した。制限酵素処理後、0.8% アガロース電気泳動に供し、QIAquick Gel Extraction Kitを用いてゲル抽出を行った。これをインサートDNAとした。次いで、ベクターDNAとインサートDNAとをモル比で3:1の割合で混合し、Ligation Convenience Kitを等量加えて混合後、16℃、15分間ライゲーションした。氷水中で2.5μlのライゲーション反応液を25μlの大腸菌コンピテントセル ［ECOS Competent E. coli DH5α］へ加え、5分間氷水中で放置した後、42℃、45秒間処理することで形質転換した。その後、SOC培地を25μl加え、100μg/mlのアンピシリンを含むLBプレートへ塗り広げた。これを、37℃、16時間培養し、コロニーを形成させた。次に、生じたコロニーを採り、コロニーダイレクトPCR法を用いて、プラスミドへのインサート配列の挿入を確認した。コロニーダイレクトPCRの条件は、生じたコロニーを0.125μlのSpeedSTAR HS DNA polymelase、2.5μlの10×Fast Buffer I、0.7μlのフォワードプライマー：Ana4833F (10 pmol/μl)、0.7μlのリバースプライマー：Ana4833R (10 pmol/μl)、1.25μlのDMSO、2μlのdNTP Mixture (2.5 mM each)、及び17.725μlの滅菌水蒸留水に少量混合し、PCR反応として98℃で5秒間、64℃で10秒間、及び72℃で10秒間を30サイクル行った。反応後、PCR反応液を3μl、1.5%アガロース電気泳動することで、インサート配列の挿入を確認した。その後、プラスミドを抽出するために、インサートを確認したコロニーを100μg/mlのアンピシリンを含む10 mlのLB培地に植菌し、37℃で16時間振盪培養した。培養した形質転換大腸菌は、QIAprep Spin Miniprep Kitを用いてプラスミドを抽出した。目的とするCYP110E1機能発現用プラスミド（pCYP110E1-Redと命名）は、7,745 bpの大きさであり、インサートチェックの結果、挿入したCYP110E1遺伝子の1,365 bpの増幅を確認し、pCYP110E1-Redの作製を確認した。
【００９０】
[実施例２]
基質スクリーニング
実施例１で作製したpCYP110E1-RedまたはpCYP110C1-Red、または「背景技術」で説明したpFusionF87V（図3）で形質転換した組換え大腸菌を用いて、以下のようにして基質スクリーニング実験をおこなった。スクリーニング用有機低分子化合物として種々の基質候補物質を含む96穴プレートを作製した。その中から変換される化合物を探索し、さらに、変換した基質化合物についてはその類似体の変換試験を実施することで、これらの組換え大腸菌が触媒する反応、触媒可能な基質の同定を行った。
【００９１】
(1) BL21(DE3)株の大腸菌へのCYP110E1またはCYP110C1の導入と導入遺伝子の機能発現の確認
基質スクリーニングの前に、実施例１で作製したpCYP110E1-RedまたはpCYP110C1-Redプラスミドを大腸菌BL21(DE3)で発現させ、これにコードされるCYP110E1またはCYP110C1とP450RhF還元酵素末端（reductase domain）との融合型タンパク質(以後CYP110E1-REDまたはCYP110C1-REDと呼ぶ)の活性型が作られるかどうかを確認した。以下にpCYP110E1-Redを例としてその詳細を示す。
【００９２】
0.5μlのpCYP110E1-Redのプラスミド (約120 ng/μl)を5μlのBL21(DE3)大腸菌コンピテントセル ［ECOS Competent E. coli BL21(DE3) (ニッポンジーン社製)］に加え、氷水中で10分間放置した。その後、42℃、45 秒間加熱し、氷水中で5秒間冷却し、25μl のSOC培地を形質転換溶液に加えた。得られた形質転換体を含む培地を、100μg/mlのアンピシリンを含むLBプレートへ塗り広げた後、37℃、16 時間培養した。生じたコロニー各3個を100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地3 mlへ移植し、25℃、15.5時間、170 rpmの条件下、振盪培養し、前培養液とした(ロータリー)。続いて、アンピシリン (終濃度100μg/ml) を含むLB培地 100 mlを2本の300 mlバッフル付三角フラスコに分注し、前培養液をそれぞれ0.5 ml移植し、OD600が約0.8になるまで20℃、120 rpmの条件で培養した。その後5-ALA (終濃度80μg/ml)、Fe(NH4)2(SO4)2 (終濃度0.1 mM)、及びIPTG (終濃度0.5 mM)を加えて同条件で24時間培養を続け、導入遺伝子を発現させ、本培養液とした。
【００９３】
培養終了後、OD600を測定し、50 ml遠沈管に培養液を移し、8000 rpm、4℃、15分間遠心分離した。上清を除去後、菌体湿重量を測定し、本培養液の1/10量のCV-3 Buffer {50 mMリン酸ナトリウム、グリセロール (終濃度5%)、pH7.2}を菌体に加え、vortexで完全に菌体を再懸濁した。2本の培養液を合併した後、3本の15 mlファルコンチューブに再懸濁液を各2 ml分注し、100μlのBug Buster 10×Protein Extraction Reagent (Novagen 社製)、1μlのBenzonase Nuclease (Novagen 社製)、DTT (終濃度2 mM)、及びLysozyme (終濃度200μg/ml)を加え、室温で15℃、20分間、緩やかに回転式振器を用いて菌体を破砕した。15000 rpm、4℃、20分間遠心分離し、上清を回収した。回収したタンパク質抽出物をCOバブリングし、分光光度計(JASCO 社製 V630型)を用いて吸収波長400 nmから550 nmまで0.5 nm間隔で3本の試料(S1、S2及びS3)のCO差スペクトルを測定した。
【００９４】
２本の本培養液のOD600と菌体湿重量は、1本目がOD600=3.09、菌体湿重量=0.47 gであり、2本目がOD600=3.03、菌体湿重量=0.47 gであった。CO差スペクトルの測定結果は、図５に示した。CO差スペクトルの測定の結果、3サンプル(S1、S2及びS3)共にヘムドメインにCOが結合すると確認されるP450に特有の約450 nmのソーレー帯が検出されたことから、活性型のCYP110E1-REDが発現していることが確認された。また、Omura とSatoの方法（T. Omura and R. Sato, The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. Ｉ. Evidence for its hemoprotein nature. J. Biol. Chem. 239: 2370-2378, 1964）に基づいてCO差スペクトルから算出した本培養液中のP450の濃度は、図５に示したS1は311 nM、S2は229 nM、S3は279 nMであり、本培養液100 ml中に約270 nMのCYP110E1-REDが発現していることが判明した。
【００９５】
(2) pCYP110E1-Red、pCYP110C1-RedまたはpFusionF87Vを保持する大腸菌BL21(DE3)によるバイオコンバージョンの方法
基質スクリーニングにおいては、プラスミドpCYP110E1-Red、pCYP110C1-RedまたはpFusionF87Vを導入した大腸菌BL21(DE3)株の懸濁液を、独自のスクリーニング用化合物基質が入ったプレートに加えて反応させ、その後、反応液から変換産物を抽出し、HPLC(高速液体クロマトグラフィー；High Performance Liquid Chromatography)-PDA（PhotoDiode Array Detector）分析を行うことにより基質全体のバイオコンバージョンのプロフィールを調べた。以下にその詳細を示す。
【００９６】
(a) BL21(DE3)株の大腸菌へのpCYP110E1-Red、pCYP110C1-RedまたはpFusionF87Vの導入とグリセロールストックの作製
0.5μlのpCYP110E1-Red、pCYP110C1-RedまたはpFusionF87Vのプラスミド (約120 ng/μl)を5μlの大腸菌BL21(DE3) 株コンピテントセルに加え、氷水中で10分間放置した。その後、42℃、45秒間加熱し、氷水中で5秒間冷却し、25μlのSOC培地を形質転換溶液に加えた。100μg/mlのアンピシリンを含むLBプレートへ塗り広げた後、37℃、16時間培養した。生じたコロニー各3個を100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地15 mlへ移植し、37℃、16時間、170 rpmの条件下、振盪培養した。培養後、培養液1.5 mlに対して80%グリセロールを700μl加え、-80℃でグリセロールストックとして各4本保存した。
【００９７】
(b) 基質変換試験
プラスミドpCYP110E1-Red、pCYP110C1-RedまたはpFusionF87Vを保持した組換え大腸菌BL21(DE3)株のグリセロールストックをディスポーサブルスパーテルで少量掻き取り、100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地5 mlを加えたガラス試験管に懸濁した。培養液は、培養液のOD600が約0.8になるまで37℃、3時間、150 rpmの条件で振盪培養した (Kuhner SHAKER X、Lab Therm LT-X キューナー社製)。
【００９８】
続いて、アンピシリン(終濃度100μg/ml)を含むLB培地 125 mlを加えた500 mlバッフル付三角フラスコを2本調製し、前培養液をそれぞれ1.5 ml移植し、OD600が約0.8になるまで20℃、140 rpmの条件で培養 (Kuhner SHAKER X、Lab Therm LT-X、キューナー社製)した。その後5-ALA (終濃度80μg/ml)、Fe(NH4)2(SO4)2(終濃度0.1 mM)、及びIPTG (終濃度0.5 mM)を加えて同条件で20時間培養を続け、導入遺伝子を発現させ、本培養液とした。
【００９９】
培養終了後、250 ml遠沈管に培養液を移し、8000 rpm、4℃、15分間遠心分離した。上清を除去後、25 mlのCV-3 Buffer［50 mMリン酸ナトリウム、グリセロール (終濃度5%)、pH7.2］を菌体に加え、vortexで完全に菌体を再懸濁した。次に、96穴ディープウェルプレート(PP-MASTER BLOCK 2ML、128,0/85 MM 96WELL STERIL、Greiner bio-one社製)の各ウェルに5μlの100 mMの基質候補物質-DMSO溶液をそれぞれ加え、細胞懸濁液を各500μl分注した。その後、シーリングマット(Flexible Sealing Mat for 2.2 ml Deep Well Plate、IWAKI社製)でウェルを密閉し、25℃、24時間、300 rpmの条件で(Kuhner SHAKER X、Lab Therm LT-X)変換試験を実施した。
【０１００】
(c) 変換産物のHPLC-PDA分析
変換試験終了後、各ウェルに飽和食塩水を100μlと、カルボン酸などの酸性化合物を基質とした場合には、さらに25μlの1N HCl加えた後、酢酸エチルを500μl加えた1.5 mlエッペンチューブへ全量ピペットアウトした。5分間vortexした後、15000 rpm、25℃、15分間遠心分離を行い、酢酸エチル層を1 mlシリンジで回収した。回収した酢酸エチル層は、シリンジフィルター(0.2μm、φ 4 mm、Millex-LG、 日本ミリポア社製)でろ過した後、HPLC分析試料とした。HPLC分析条件は以下の通りに実施した。
【０１０１】
HPLCシステム：Waters 2695 Separation Module (waters社製)
検出器：Waters2996 Photodiode array detector (PDA) 検出器 (waters社製)
カラム：Waters Xterra MS C18 5μm I.D.4.6 mm×100 mm (waters社製)
移動相：0-3 min: 5% CH3CN/H2O (20 mM リン酸)
3-28 min: 5% CH3CN/H2O (20 mM リン酸)
→95% CH3CN/H2O (20 mM リン酸) (リニアグラジエント)
28-33 min: 95% CH3CN/H2O (20 mM リン酸)
33-38 min: 5% CH3CN/H2O (20 mM リン酸)
カラム温度：30℃
流速：1 ml/min
検出波長域：PDA (200-500 nm)
分析試料：20μl
変換率は、λmaxで抽出した基質、及び変換産物各々のピーク面積値から、生成物と基質との合計面積に占める生成物の面積の割合として算出した。
【０１０２】
[実施例３]
変換産物の構造解析
基質スクリーニングの結果、変換が進行したと考えれた基質について、スケールアップした基質変換試験を行い、得られた変換産物について、標品が存在する場合には、HPLCで標品との重ね打ちによる化合物の同定を実施し、標品が存在しない場合には、MS (Mass Spectrometry、質量分析法)及びNMR (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy、核磁気共鳴分光法)による構造解析を実施した。
【０１０３】
(1) スケールアップした基質変換試験
pCYP110E1-Red、pCYP110C1-RedまたはpFusionF87Vを導入した大腸菌BL21(DE3)株のグリセロールストックをディスポーサブルスパーテルで少量掻き取り、アンピシリン (100μg/ml)を含むLB培地12 mlを加えた50 mlガラス試験管に懸濁した。培養液は、培養液のOD600が約0.8になるまで37℃、170 rpm、4 時間振盪培養 (レシプロ恒温水槽)し、前培養液とした。続いて、アンピシリン (終濃度100μg/ml)を含むLB培地 500 mlを加えた2 Lバッフル付三角フラスコを2本調製し、前培養液をそれぞれ5 ml移植し、OD600が約0.8になるまで20℃、140 rpmの条件で培養 (Kuhner SHAKER X、Lab Therm LT-X、キューナー社製)した。その後5-ALA (終濃度80μg/ml)、Fe(NH4)2(SO4)2(終濃度0.1 mM)、及びIPTG (終濃度0.5 mM)を加えて同条件で20時間培養を続け、導入遺伝子を発現させ、本培養液とした。培養終了後、250 ml遠沈管に培養液を移し、8000 rpm、4℃、15分間遠心分離した。上清を除去後、200 mlのCV-3 Buffer ［50 mMリン酸ナトリウム、グリセロール (終濃度5%)、pH7.2］を菌体に加え、vortexにより再懸濁した。次に、菌体懸濁液を2 Lバッフル付三角フラスコ2本に各100 ml移植し、100 mMのDMSO溶解基質をそれぞれ1 ml加えた後、軽く混和し、CO2透過シート(BREATHseal、Greiner bio-one社製)でフラスコの口をシールして25℃、48時間、180 rpmの条件下、変換試験を実施した。
【０１０４】
変換試験終了後、1.5 mlエッペンチューブに変換試験液を500μl回収し、飽和食塩水100μl、及び酢酸エチルを500μl加えた。5分間vortexした後、15000 rpm、25℃、15分間遠心分離を行い、上層の酢酸エチル層を1 mlシリンジで回収した。回収した酢酸エチル層は、0.2μmシリンジフィルターでろ過した後、HPLC分析試料とした。
【０１０５】
(2) 変換産物の構造解析法
プラスミドpRED-CYP110E1を保持する大腸菌BL21(DE3)と基質との変換試験液200 mlに等量の酢酸エチルを添加し、分液する操作を2回繰り返して酢酸エチル層を回収した。
【０１０６】
得られた酢酸エチル層を減圧下濃縮して粗体を得た。粗体をシリカゲル［Slicagel 60F-254 0.25 mm silica gel plate (Merck社製)］を用いた薄層クロマトグラフ (TLC)に供し、変換産物の確認を行った後、シリカゲルカラムクロマトグラフ［I.D. 10×200 mm、Silica Gel 60 (Merck 社製)］に供して精製品を得た。
【０１０７】
なお、各基質におけるTLCの展開溶媒は以下の通りである。
【０１０８】
・ゼルンボン（zerumbone） ヘキサン：酢酸エチル＝3：1
・β-オイデスモール（β-eudesmol） ヘキサン：酢酸エチル＝1：1
・1-メトキシナフタレン（1-methoxynaphthalene） ヘキサン：酢酸エチル＝6：1
・1-エトキシナフタレン（1-ethoxynaphthalene） ヘキサン：酢酸エチル＝6：1
カラムクロマトグラフによる変換産物の精製後、MS(EI: JEOL DX505W, ESI: JEOL JMS-T100LP)及びNMR(400 MHz、Bruker AMX400)スペクトルデータを分析した。
【０１０９】
(3) 変換産物の同定結果
(a) ゼルンボン（zerumbone）
【０１１０】
【化２４】
ゼルンボン（zerumbone）を基質とした場合、大腸菌内在酵素により、下記の化合物に変換された。
【０１１１】
【化２５】
化合物S-１の1H、13C化学シフト (Table 1)、及び同定の根拠を以下に示す。
【０１１２】
【表１】
S-1のHREI-MSを測定したところ、m/z 220.1822に分子イオンピーク（M+）が観測された。この結果、S-1の分子式はC15H24O (calcd for 220.1827)と決定された。
【０１１３】
S-１の1H NMRでは二重結合に由来するシグナルは3H分しか観測されず（δ 5.09, δ 6.05, δ 6.24）、その分子式がzerumbone + 2Hであることを考えると、S-1はzerumboneの二重結合のΔ2,3、Δ6,7のいずれかの二重結合が還元された化合物であることが強く示唆された。次にS-１の1H-1H DQF, HMQC, HMBCスペクトルを測定、解析した結果、HMBCスペクトルにおいてδ 1.05に観測されるダブレットメチル基（H-2）からδ 205.3のケトン基（C-1）に1H-13C遠隔スピン結合が観測され、この結果還元された二重結合はΔ2,3であることが明らかとなった。以上の結果より、S-1の構造は式（I）に示すように決定された。
【０１１４】
pCYP110E1-Red、pCYP110C1-RedまたはpFusionF87Vを導入した大腸菌BL21(DE3)株によりゼルンボンは下記の化合物に変換された。なお、本化合物はCASデータベースにおける新規化合物であった。
【０１１５】
【化２６】
化合物S-2の1H、13C化学シフト、及び同定の根拠を以下に示す。
【０１１６】
【表２】
S-2のHREI-MSを測定したところ、m/z 236.1769に分子イオンピーク（M+）が観測された。この結果、S-2の分子式はC15H24O2 (calcd for 236.1776)と決定された。
【０１１７】
S-2の1H NMRはS-1と非常に類似したものであったが、S-1でδ 1.45に観測されたシングレットメチルは消失し、代わりにδ 3.92及びδ 4.02に孤立した1級アルコール由来のシグナルが観測される点が異なっていた。S-2の分子式はS-1 + Oであることから、S-2はS-1のC-13メチル基がアルコールとなったものであることが強く示唆された。次にS-2の1H-1H DQF, HMQC, HMBCスペクトルを測定、解析した結果、HMBCスペクトルにおいてδ 3.92 (H-13)からδ 35.0 (C-5), δ 140.1 (C-6), δ 126.0 (C-7)に1H-13C遠隔スピン結合が観測され、C-13が1級アルコールであることが確認された。以上の結果より、S-2の構造は式（II）に示すように決定された。
【０１１８】
pCYP110E1-RedまたはpCYP110C1-Redを導入した大腸菌BL21(DE3)株によりゼルンボンはまた下記の化合物に変換された。なお、本化合物はCASデータベースにおける新規化合物であった。
【０１１９】
【化２７】
化合物S-3の1H、13C化学シフト、及び同定の根拠を以下に示す。
【０１２０】
【表３】
S-3のHREI-MSを測定したところ、m/z 236.1773に分子イオンピーク（M+）が観測された。この結果、S-3の分子式はC15H24O2 (calcd for 236.1776)と決定された。
【０１２１】
S-3の1H NMRはS-1と非常に類似したものであったが、S-1でδ 2.06に観測されたダブレットメチレン（H-8）シグナルが消失し、d 4.24に新たなダブレットメチンが観測される点が異なっていた。S-3の分子式はS-1 + Oであることを考え合わせると、S-3はS-1のC-8メチレン基に水酸基が導入されたものであることが強く示唆された。次にS-2の1H-1H DQF, HMQC, HMBCスペクトルを測定、解析した結果、HMBCスペクトルにおいてδ 1.12 (H-14)及びδ 1.26 (H-15)からδ 75.5 (C-8)に1H-13C遠隔スピン結合が観測され、C-8に水酸基が導入されたことが確認された。以上の結果から、S-3の構造は式（III）に示すように決定された。
【０１２２】
(b) β-オイデスモール（β-eudesmol）
【０１２３】
【化２８】
pFusionF87Vを導入した大腸菌BL21(DE3)株によりβ-オイデスモールは下記の化合物に変換された。
【０１２４】
【化２９】
化合物Ｓ-4の1H、13C化学シフト、及び同定の根拠を以下に示す。
【０１２５】
【表４】
S-4のHREI-MSを測定したところ、m/z 238.1929に分子イオンピーク（M+）が観測された。この結果、S-4の分子式はC15H24O2 (calcd for 238.1933)と決定された。
【０１２６】
S-4の1H NMRではシングレットメチルが3本観測され（δ 0.68, δ 1.21, δ 1.21）、S-4の分子式がβ-eudesmol + Oであることを考え合わせると、S-4はβ-eudesmolのC-11に水酸基が導入されたものであることが強く示唆された。次にS-4の1H-1H DQF, HMQC, HMBCスペクトルを測定、解析した結果、HMBCスペクトルにおいてδ 1.21 (H-12及びH-13)からδ 72.8 (C-11)に1H-13C遠隔スピン結合が観測され、C-11に水酸基が導入されたことが確認された。以上の結果、S-4の構造は式（IV）に示すように決定された。
【０１２７】
(c) 1-メトキシナフタレン（1-methoxynaphthalene）
【０１２８】
【化３０】
pCYP110E1-Redを導入した大腸菌BL21(DE3)株により1-メトキシナフタレンは下記の化合物D-1、D-2、D-3に変換された。
【０１２９】
【化３１】
化合物D-1の1H、13C化学シフト、及び同定の根拠を以下に示す。
【０１３０】
【表５】
D-1のHRESI-MSを測定したところ、m/z 345.1116に分子イオンピーク（（M-H）-）が観測された。この結果、D-1の分子式はC22H18O4 (((M-H)-:C22H17O4, calcd for 345.1127)と決定された。D-1の炭素数は基質である1-methoxynaphthalene構成炭素数の倍であることから、本化合物はdimer構造を取っていることが推定された。
【０１３１】
D-1の1H NMRでは8H分のシグナルのみ観測されたことから、本化合物がhomo dimer構造であることが確認された。次にD-1の1H-1H DQFスペクトルを測定した結果、δ 8.30 - δ 7.54 - δ 7.49 - δ 8.20のvicinal spin networkが観測され、H-5 〜 H-8の部分は1-methoxynaphthaleneと変化ないことが確認された。さらにD-1のHMBCスペクトルでδ 8.30 (H-5)からδ 142.1 (C-4)へ1H-13C遠隔スピン結合が観測されることから、C-4, 4’に水酸基が存在することが明らかとなった。以上の結果及びD-1の分子式を考慮すると、D-1は1-methoxy-4-hydroxynaphthaleneがC-2 - C-2’あるいはC-3 - C-3’間でC-C結合を形成した化合物であることが明らかとなった。ここでD-1は1-methoxy-4-hydroxynaphthalene 2分子がphenol oxidation coupling反応により生じた化合物であると判断されるため、一義的にC-3 - C-3’結合であると結論することができ、D-1の構造は式（Ｖ）に示すように決定された。
【０１３２】
【化３２】
化合物D-2の1H、13C化学シフト、及び同定の根拠を以下に示す。
【０１３３】
【表６】
D-2のHRESI-MSを測定したところ、m/z 173.0600に分子イオンピーク（（M-H）-）が観測された。この結果、D-2の分子式はC11H10O2 ((M-H)-:C11H9O2, calcd for 173.0603)と決定された。従ってD-2は基質である1-methoxynaphthaleneに1分子のOが導入された化合物であることが明らかとなった。
【０１３４】
次にD-2の1H NMR, 1H-1H COSYスペクトルを測定、解析した結果、H-5 〜 H-8のvicinal spin networkは保存されていることが明らかとなった。またこのvicinal spin networkの他に、δ 7.23 - δ 7.57間にvicinal spin coupling (J= 8.5 Hz)が観測されることから、Oが導入された位置は一義的にC-2と決定され、D-2の構造は式（VI）に示すように決定された。
【０１３５】
【化３３】
化合物D-3の1H、13C化学シフト、及び同定の根拠を以下に示す。
【０１３６】
【表７】
D-3のHRESI-MSを測定したところ、m/z 173.0611に分子イオンピーク（（M-H）-）が観測された。この結果、D-3の分子式はC11H10O2 ((M-H)-:C11H9O2, calcd for 173.0603)と決定された。従ってD-3は基質である1-methoxynaphthaleneに1分子のOが導入された化合物であることが明らかとなった。
【０１３７】
次にD-3の1H NMR, 1H-1H COSYスペクトルを測定、解析した結果、δ 6.85 - δ 7.40 - δ 7.73及びδ 6.85 - δ 7.30 - δ 7.85の2つのvicinal spin networksが観測され、Oが導入された位置はC-5或いはC-8と決定された。さらにD-3のHMBCスペクトルにおいて、δ 7.40 (H-3)及びδ 4.00 (H-9)からδ 155.2 (C-1)へ1H-13C遠隔スピン結合が観測され、さらにδ 7.40(H-3)とvicinal spin couplingしたδ 7.73 (H-4)からδ151.5 (C-5)へ1H-13C遠隔スピン結合が観測されることから、Oの導入はC-5と確定された。以上の結果から、D-3の構造は式（VII）に示すように決定された。
【０１３８】
(d) 1-エトキシナフタレン（1-methoxynaphthalene）
【０１３９】
【化３４】
pCYP110E1-Redを導入した大腸菌BL21(DE3)株により1-エトキシナフタレンは下記の化合物D-4、D-5に変換された。
【０１４０】
【化３５】
化合物D-4の1H、13C化学シフト、及び同定の根拠を以下に示す。
【０１４１】
【表８】
D-4のHRESI-MSを測定したところ、m/z 187.0750に分子イオンピーク（（M-H）-）が観測された。この結果、D-4の分子式はC12H12O2 ((M-H)-:C12H11O2, calcd for 187.0759)と決定された。従ってD-4は基質である1-ethoxynaphthaleneに1分子のOが導入された化合物であることが明らかとなった。
【０１４２】
次にD-4の1H NMR, 1H-1H COSYスペクトルを測定、解析した結果、δ 7.78 - δ 7.33 - δ 7.47 - δ 7.92 のvicinal spin network が観測され、これはH-5 〜 H-8のspin networkと判断された。これ以外にD-4には δ 7.55 - δ 7.23のvicinal spin couplingが観測されることから、これはH-2 - H-3のvicinal spin couplingと一義的に判定され、Oが導入された位置はC-4と決定された。以上の結果から、D-4の構造は式（VIII）に示すように決定された。
【０１４３】
【化３６】
化合物D-5の1H、13C化学シフト、及び同定の根拠を以下に示す。
【０１４４】
【表９】
D-5のHRESI-MSを測定したところ、m/z 187.0756に分子イオンピーク（（M-H）-）が観測された。この結果、D-5の分子式はC12H12O2 ((M-H)-:C12H11O2, calcd for 187.0759)と決定された。従ってD-5は基質である1-ethoxynaphthaleneに1分子のOが導入された化合物であることが明らかとなった。
【０１４５】
次にD-5の1H NMR, 1H-1H COSYスペクトルを測定、解析した結果、δ 6.83 - δ 7.37 - δ 7.71及びδ 6.85 - δ 7.29 - δ 7.89の2つのvicinal spin networksが観測され、Oが導入された位置はC-5或いはC-8と決定された。さらにD-5のHMBCスペクトルにおいて、δ 7.37 (H-3)及びδ 4.20 (H-9)からδ 154.8 (C-1)へ1H-13C遠隔スピン結合が観測され、さらにδ 7.37(H-3)とvicinal spin couplingしたδ 7.71 (H-4)からδ151.2 (C-5)へ1H-13C遠隔スピン結合が観測されることから、Oの導入はC-5と確定された。以上の結果から、D-5の構造は式（IX）に示すように決定された。
【０１４６】
pFusionF87Vを導入した大腸菌BL21(DE3)株により1-エトキシナフタレンは下記の化合物D-6に変換された。
【０１４７】
【化３７】
化合物D-6の1H、13C化学シフト、及び同定の根拠を以下に示す。
【０１４８】
【表１０】
D-6のHRESI-MSを測定したところ、m/z 373.1433に分子イオンピーク（（M-H）-）が観測された。この結果、D-6の分子式はC24H22O4 (((M-H)-:C24H21O4, calcd for 373.1440)と決定された。D-6の炭素数は基質である1-methoxynaphthalene構成炭素数の倍であることから、本化合物はdimer構造を取っていることが推定された。
【０１４９】
D-6の1H NMRでは10H分のシグナルのみ観測されたことから、本化合物がhomo dimer構造であることが確認された。次にD-6の1H-1H DQFスペクトルを測定した結果、δ 8.26 - δ 7.52 - δ 7.52 - δ 8.15のvicinal spin networkが観測され、H-5 〜 H-8の部分は1-ethoxynaphthaleneと変化ないことが確認された。さらにD-6のHMBCスペクトルでδ 8.26 (H-5)からδ 142.6 (C-4)へ1H-13C遠隔スピン結合が観測されることから、C-4, 4’に水酸基が存在することが明らかとなった。以上の結果及びD-6の分子式を考慮すると、D-6は1-ethoxy-4-hydroxynaphthaleneがC-2 - C-2’あるいはC-3 - C-3’間でC-C結合を形成した化合物であることが明らかとなった。ここでD-6は1-ethoxy-4-hydroxynaphthalene 2分子がphenol oxidation coupling反応により生じた化合物であると判断されるため、一義的にC-3 - C-3’結合であると結論することができ、D-6の構造は式（Ｘ）に示すように決定された。
【産業上の利用可能性】
【０１５０】
本発明の製造方法は、ゼルンボンまたはβ-オイデスモール等のセスキテルペン誘導体の製造、及び1-メトキシ基または２-メトキシ基をもつナフタレンの水酸化誘導体の製造、創薬段階における新規化合物の創製、代謝物の調製、長い工程を要する製造プロセスの短縮、化学合成では合成が困難な化合物の合成などにおいて有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を用いる水酸化化合物の製造方法及び新規なセスキテルペンに関する。本発明の方法により、化学合成が困難な水酸化化合物の製造が可能になる。
【背景技術】
【０００２】
シトクロムP450 (以下、単に「P450」という場合がある。)は、全ての真核生物と、大腸菌などの一部の原核生物を除くすべての生物種に広く存在している酵素最大のファミリー群である(Nelson博士のホームページhttp://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html 参照のこと)。P450は、真核生物では500前後、原核生物では400前後のアミノ酸残基から構成されるヘムタンパク質であり、真核生物の場合、膜タンパク質、細菌の場合は、可溶性タンパク質として存在している。しかし、すべてのP450において、立体構造は類似しており、一辺が約60Å、厚さは約30Åのプリズム型をしている。一次構造の特徴に数カ所の共通した領域があり、中でも、カルボキシル末端から約50〜60アミノ酸残基手前に存在するPhe-X-X-Gly-X-Arg/His-X-Cys-X-Glyというヘム結合領域のアミノ酸配列は、高度に保存されたP450特有の配列であり、ゲノム情報からP450遺伝子を同定する場合に利用される。また、これらの共通性から、P450は、アミノ酸配列の類似度に基づいて分類される。分類は、シトクロムP450を示すCYPを接頭辞に付け、その後にファミリー番号、サブファミリー番号、遺伝子番号と分類する。原則的に、アミノ酸配列が40%以上一致する場合、同一ファミリーに分類し、55%以上一致する場合、同一サブファミリーに分類される。
【０００３】
P450は、炭化水素や芳香族化合物のように、化学的に安定な化合物の水酸化反応を触媒できる。しかし、P450の触媒反応は水酸化反応だけではない。現在判明しているP450の触媒反応は、水酸化のほかに、エポキシ化、O-脱メチル化、スルホキシド化、酸化的アリール転移、アリール結合反応等の様々な反応を触媒する (非特許文献１)。P450がモノオキシゲナーゼとして機能するには通常、NAD(P)HからP450に電子を伝達するタンパク質［電子伝達タンパク質、又はレドックス（redox；酸化還元）パートナータンパク質と呼ばれている。］の介在を必要とする。シアノバクテリアや放線菌を含む細菌（原核生物）由来のP450はほとんどclass Iに属するP450であり、電子伝達するタンパク質として、フェレドキシンレダクターゼ（ferredoxin reductase；FADを補酵素とする）とフェレドキシン（ferredoxin；鉄-硫黄小タンパク質）の２つのタンパク質の介在を必要とするという性質により特徴づけられる(非特許文献２）。しかしながら、細菌由来のP450には、これらの電子伝達タンパク質との相性があり、しかもP450自体が失活しやすい不安定酵素であるので、細菌ゲノム解析の結果、続々と新しいP450遺伝子配列が明らかになっている（http://drnelson.utmem.edu/BLAST/bacteria.dbs.html 参照）にもかかわらず、その機能解析がなされた例は少なく、P450の触媒機能の同定は困難となる場合が多かった(非特許文献２)。
【０００４】
シアノバクテリアは原核生物でありながら、光合成能を有し、高等植物の葉緑体の起源となった微細藻である。現在、シアノバクテリアは３４種のゲノムの解読が終了しており、その情報が開示されている(CyanoBaseホームページhttp://bacteria.kazusa.or.jp/cyanobase/index.html 参照)。ゲノム解析が終了しているシアノバクテリアの内、P450遺伝子を保有しているのは、２０種類である。公開されたゲノム情報から14ファミリー、60分子種のP450遺伝子配列が確認された。例えば、CYP110ファミリーは、アナベナ属[Anabaena sp.；ノストック属（Nostoc sp.）とも呼ばれる。] PCC7120株、ノストック・パンクチホルメ（Nostoc punctiforme）、アナベナ・バリアビリス（Anabaena variabilis）ATCC 29413株等のシアノバクテリアが保有するP450の最大のファミリーである。最近、アナベナ属PCC7120株由来のP450(CYP110C1)遺伝子を、同株由来のフェレドキシンレダクターゼとフェレドキシン遺伝子とともに大腸菌で共発現させることにより、シアノバクテリアが保有するセスキテルペンであるゲルマクレン（germacrene）Ａに水酸基を導入できると発表された（非特許文献３）。ただし、反応産物の構造は未同定である。これ以外のシアノバクテリア由来のP450の触媒機能が解析された例はない。
【０００５】
メルシャン株式会社は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のプチダレドキシン（フェレドキシン）レダクターゼとプチダレドキシン遺伝子を利用し、細菌由来のP450遺伝子と共発現させるためのベクターpT7NS-camABを開発した（非特許文献４）。上松らはこのベクターを用い、213個の放線菌等細菌由来のP450遺伝子を大腸菌で発現させ、テストステロンに水酸基を導入できるかどうかを調べた（非特許文献５）。その結果、24種類の立体特異的な水酸基導入反応が可能であることが示された（非特許文献５）。しかしながら、pT7NS-camABが、細菌由来のすべてのP450に対して必ずしも効率的な電子伝達を行うことができるわけではなく（非特許文献６）、細菌由来のP450遺伝子の効率的機能発現系として、他のオプション系が望まれていた。
【０００６】
ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌NCIMB9784株が有するP450RhF（CYP116）が、フェレドキシンレダクターゼ部分（FMNを補酵素とする）とフェレドキシン部分（鉄-硫黄小タンパク質）からなる還元酵素ドメイン（reductase domain、レドックスパートナータンパク質部分；C末側）がリンカー配列を介してP450本体タンパク質部分（N末側）と一本に繋がった１つのポリペプチド鎖という、一般的なP450とは異なる珍しい構造を持つことが、エジンバラ大学のグループによって示された（非特許文献７）。野舘らは、このP450RhFのリンカー配列（アミノ酸残基445-460；DDBJ accession no. AAM67416）を含む還元酵素ドメイン（アミノ酸残基461-773；DDBJ accession no. AAM67416）を利用し、機能解析を行いたいP450遺伝子のクローニング部位としてNdeI部位及びEcoRI部位を付与した大腸菌用機能発現ベクターpREDを作製した（特許文献１及び非特許文献８）。なお、大腸菌用ベースベクターとしては、T7プロモーターにより制御を受けるpET21a（Novagen社製）が用いられている。pREDベクターの構造を図１に示す。このpREDベクターを用いると、細菌由来のいくつかのP450遺伝子[P450cam(CYP101A1)、P450Bzo(CYP203A)、P450balk(CYP153A13a)]が大腸菌で機能発現されることが示された（特許文献１及び非特許文献８）。このpREDベクター系の最大の利点は、異種細菌由来のP450遺伝子を還元酵素ドメインとの融合タンパク質になるように大腸菌で発現させることにより、大腸菌内に合成されたP450の触媒機能の解析を効率良く実施できることである。
【０００７】
細菌バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）BM-3株が有するP450BM-3（P450BM3、CYP102A1とも呼ぶ）も、P450本体タンパク質部分（N末側）がレドックスパートナータンパク質部分（C末側）と一本に繋がった１つのポリペプチド鎖という珍しい構造をしている（本酵素のアミノ酸配列はDDBJ accession no. J04832参照）。しかし、P450BM-3のレドックスパートナータンパク質部分はP450RhF還元酵素ドメインとは違って、肝ミクロソーム等に存在するNADPH-P450レダクターゼと相同性を有していた。NADPH-P450レダクターゼを電子伝達タンパク質とするP450はclass IIであり、その意味でもP450BM-3は変わったP450であるが、この発見が1989年と古いので（非特許文献９）、現在までに広く研究に用いられてきた。本酵素は元々、炭素数12〜20の飽和脂肪酸のω末端メチル基から1位、2位または3位を水酸化する酵素として発見されたが、P450BM-3 における87番目のフェニルアラニン（F）をバリン（V）に変換させた酵素P450BM-3(F87V) ［CYP102A1(F87V)；以後、単にF87Vと呼ぶことがある］は、ナフタレンやベンゾチオフェンといった芳香族化合物に水酸基を導入できることがわかった（反応特異性は緩い；非特許文献１０）。さらにF87Vは、フェノール及びo-クレゾール、2,6-ジクロロフェノール、2-(ベンジロキシ)フェノール［2-(benzyloxy)phenol］等のフェノール類縁体をヒドロキノン及びヒドロキノン類縁体に変換できることが示されれ、広く芳香族化合物を変換できることが示された（非特許文献１０）。
【０００８】
免疫抑制剤のFK506に感受性のFK506結合タンパク質（FKBP）ファミリーは、ペプチジルプロリルcis-transイソメラーゼ（PPIase；peptidyl-prolyl cis-trans ismerase）ファミリー（３ファミリーからなる）の１つである。古細菌由来のFKBPはPPIase活性を持つだけでなく、本来の立体構造を取っていないタンパク質の再折りたたみ（refolding）を助け、タンパク質の凝集（aggregation）を抑制するという分子シャペロン活性をもつことが知られている（非特許文献１１）。古細菌由来のFKBPとして、たとえば、高度好熱性の古細菌であるサーモコッカス（Thermococcus）属KS-1株由来のPPIase（TcFKBP18と呼ばれている；そのアミノ酸・塩基配列はaccession no. AB012209参照）が挙げられる（非特許文献１１）。野舘らは、このFKBP（PPIase）（N末側）がF87Vタンパク質（C末側）と14アミノ酸からなるリンカー配列［TSLVPRGSHMEFEL；トロンビン切断部位（下線）を含む］を介して融合タンパク質として合成されるようにデザインしたプラスミドpFusionF87V（特許文献２ではpFusionP450と記載されている）を作製した（特許文献２）。プラスミドpFusionF87Vの構造を図２に示す。このプラスミドを作製する際、大腸菌用発現用ベクターとしてpET21d（Novagen社製）を使用した。またコントロールとして、PPIaseと融合形ではなく、F87V遺伝子のみをpET21dに挿入したプラスミドpETF87V（特許文献２ではpETP450と記載されている）を作製した。pFusionF87VまたはpETF87Vで形質転換した大腸菌BL21(DE3)から調製した無細胞酵素抽出液を用いて、60℃、20分の処理をした後P450の残存活性を測定したところ、pFusionF87Vを持つ大腸菌から調製された酵素抽出液の方が、pETF87Vを持つ大腸菌から調製された酵素抽出液より残存活性が2倍近く高かった（特許文献２）。したがって、PPIaseと融合したF87Vタンパク質の方がF87Vタンパク質だけより安定であることが示唆された。
【０００９】
以上述べてきたように、細菌由来のP450の中には有機化学合成では合成が困難な化合物への変換反応を担うP450の分子種が存在することが明らかになりつつあり、新規の触媒機能を有するP450の探索や、P450を用いた有機低分子化合物への酸素添加反応の産業利用が望まれている。そのなかでも特に、ゼルンボン（zerumbone）やβ-オイデスモール（β-eudesmol）等の機能性セスキテルペン、及び、1-メトキシナフタレンや1-エトキシナフタレンなどのナフタレン誘導体を変換できるP450の探索に関心がもたれている。
【００１０】
ゼルンボンやβ-オイデスモール等の機能性セスキテルペンは、ショウガ属の作物であるハナショウガ（Zingiber zerumbet Smith）（日本ではほとんど栽培されていない）の根茎に作られる。ゼルンボンについては抗炎症効果等が報告されているが、それ自身が分子内に共役カルボニル基や孤立二重結合等を有する11環化合物であり、多様な化学反応性が期待できることから、医薬品・農薬・香料等を作る際の化学合成の初発物質として注目されている。β-オイデスモールは、胃酸分泌抑制などの健胃作用や抗菌作用が報告されている機能性セスキテルペンである。
【００１１】
本発明者らは以前に、pFusionF87Vを持つ組換え大腸菌により、1-メトキシナフタレンからバイオコンバージョンにより作られた4-メトキシ-1-ナフトール（4-methoxy-1-naphthol；D897と呼ぶ）が 、枯草菌のレスポンスレギュレータ（Response Regulator）である YycF（細胞の分裂・増殖を司る）の二量体形成を阻害すると言うユニークなタイプの細菌二成分制御系（TCS；two component system）阻害剤であること見出し、日本農芸化学会2007年度大会で発表した（近畿大学・内海龍太郎教授との共同発表；講演要旨集 p. 35）。YycF阻害剤は、細菌TCSを解析するケミカルバイオロジー研究を行う上で重要なだけでなく、MRSA等の多剤薬剤耐性細菌の新ジャンル抗菌剤として開発できる可能性を有するという点でもきわめて重要である。ただし、このD897は安定性に問題があり、溶液中で次第に褐色を呈するようになる。したがって、D897の類縁体を作製して、さらに高品質のYycFの二量体形成の阻害剤を探索することが望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００６／０５１７２９号パンフレット
【特許文献２】特開２００５−２７８６３７号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】E. M. Isin and F. P. Guengerich, Biochim. Biophys, Acta. 1770: 314-329 (2007)
【非特許文献２】F. Hannemann et al, Biochim. Biophys. Acta, 1770: 330-344 (2007)
【非特許文献３】S. A. Agger et al, J. Bacteriol., 190: 6084-6096 (2008)
【非特許文献４】A. Arisawa and H. Agematu, A modular approach to biotransformation using microbial cytochrome P450 monooxygenases. In “Modern biooxidation: enzymes, reactions, and applications,” eds. Schmid, D. R., and Urlacher, V. B., Wiley-VCH, Weinheim (2007)
【非特許文献５】H. Agematu et al, Biosci. Biotechnol. Biochem., 70, 307-311 (2006)
【非特許文献６】R. Bernhardt, and I. C. Gunsalus, Biochem. Biophys. Res. Commun. 187, 310-317 (1992)
【非特許文献７】G. A. Roberts et al, J. Bacteriol. 184: 3898-3908 (2002)
【非特許文献８】M. Nodate et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 71: 455-462 (2006)
【非特許文献９】R. T. Ruettinger et al, J. Biol. Chem. 264, 10987-10995 (1989)
【非特許文献１０】W. T. Sulistyaningdyah et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 67: 556-562 (2005)
【非特許文献１１】A. Ideno et al, Appl.Microbiol. Biotechnol., 64: 99-105 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、P450を用いて、機能性セスキテルペン、及びナフタレン誘導体に水酸基を効率的に導入し、難化学合成化合物を製造する手段を提供することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、課題とする基質化合物に対して、新規の触媒機能を有するP450の探索を行った。研究を行う対象として、すでにゲノム情報が公開されている、放線菌 ストレプトミセス・グリセウス(Streptomyces griseus)由来の27個のP450遺伝子、シアノバクテリア ［Anabaena (Nostocとも言う) sp. strain PCC 7120、Anabaena variabilis strain ATCC 29413］由来の10個のP450遺伝子を単離した。そして、これらのP450遺伝子を、触媒機能の解析を行うため、pREDベクター（図１、特許文献１、非特許文献８）に導入した。pREDベクターは、前述したように、ロドコッカス属NCIMB 9784株が保有するP450RhF（非特許文献７）が、一般的なP450とは異なる構造［フェレドキシン（鉄-硫黄小タンパク質）レダクターゼ（還元酵素)領域とフェレドキシン領域とからなるP450還元酵素ドメイン (C末端側)が、リンカー配列を介してP450本体タンパク質と一本のポリペプチド鎖として融合している構造）を有することに着目して作製されたベクターであり、T7プロモーターにより制御を受けるpET21a (Novagen社製)を元に、P450RhFのリンカー配列を含む還元酵素ドメインとP450遺伝子のクローニング部位としてNdeIとEcoRI部位を付与した異種由来P450の大腸菌用機能発現ベクター（図１）である。このpREDベクターに異種細菌由来のいくつかのP450遺伝子を連結し、大腸菌で機能解析することにより、既に該ベクターの汎用性が確認されている(特許文献１、非特許文献８)。
【００１６】
本発明者等は、新規触媒機能の探索を行う過程において、アナベナ（Anabaena）属［ノストック属（Nostoc）とも言う］PCC 7120株由来のCYP110ファミリーに属するCYP110C1（アクセッション番号NP_488726）またはCYP110E1（アクセッション番号NP_488873）［CyanoBase（http://bacteria.kazusa.or.jp/cyanobase/index.html）におけるalr4686及びalr4833がそれぞれCYP110C1及びCYP110E1に対応する］が新規の触媒機能を有することを見出した。なお、CYP110C1とCYP110E1のアミノ酸配列レベルでの同一性（identity）は49％であった。すなわち、CYP110C1またはCYP110E1遺伝子を発現した組換え大腸菌の細胞を用いてバイオコンバージョン実験を行うと、ハナショウガが作る機能性セスキテルペンであるゼルンボン（zerumbone）が変換されて、水酸基が導入された2種類の新規の難化学合成性誘導体２種類（S-2及びS-3）を作ることができることを見出した。これらの新規化合物の構造は図３に示されている。CYP110C1及びCYP110E1遺伝子（終止コドンは除かれている）がpREDベクターに挿入されたプラスミドをそれぞれ、pCYP110C1-Red及びpCYP110E1-Redと命名した。なお、ゼルンボンは、大腸菌が保有する内在性酵素により、１つの二重結合が飽和されたS-1に変換された後、S-2及びS-3に変換されたと考えられる。
【００１７】
さらに、前述のPPIase（TcFKBP18）とP450BM-3 F87Vの融合タンパク質を合成する組換え大腸菌（プラスミドpFusionF87Vを含む）の細胞を用いバイオコンバージョン実験を行うと、ハナショウガが作る機能性セスキテルペンであるβ-オイデスモール（β-eudesmol）が変換されて、水酸基が導入された難化学合成性誘導体（S-4；図３）を作ることができることを見出した。さらに、プラスミドpFusionF87Vを含む組換え大腸菌は、前述の新規のゼルンボン誘導体のうちの１つ（S-2）を合成することができた。なお、ゼルンボンやβ-オイデスモールは有用な機能性セスキテルペンでありながら、それらのバイオコンバージョンの報告はこれまでになく、今回、初めて行ったものである。
【００１８】
また前述したように、pFusionF87Vをもつ組換え大腸菌により1-メトキシナフタレンから変換された4-メトキシ-1-ナフトール（4-methoxy-1-naphthol；D897と呼ぶ）が 、枯草菌のレスポンスレギュレータ（Response Regulator）である YycF（細胞の分裂・増殖を司る）の二量体形成を阻害すると言うユニークなタイプの細菌二成分制御系（TCS；two component system）阻害剤であることが見出されている。ただ、前述したよに、D897はそれ自身が分解しやすい不安定な化合物なので、化学合成では作るのが困難な構造をもつD897の類縁体を作ることを目的とし、1-メトキシナフタレン（1-methoxynaphthalene）及び1-エトキシナフタレン（1-ethoxynaphthalene）を基質として用い、これらに水酸基を導入できるかどうかという触媒機能の探索を行った。その過程において、CYP110E1遺伝子を発現した組換え大腸菌の細胞を用いてバイオコンバージョン実験を行うと、1-メトキシナフタレンが水酸化されて３つの難化学合成性のD897類縁体（D-1、D-2及びD-3）が生成すること、さらには1-エトキシナフタレンが水酸化されて３つの難化学合成性のD897類縁体（D-4とD-5）が生成することを見出した。これらの化合物の構造は図４に示されている。一方、pFusionF87Vをもつ組換え大腸菌により1-エトキシナフタレンのバイオコンバージョン実験を行うと、１つの難化学合成性の類縁体（D-6）が合成されることを見出し（図４）、一連のD897の難化学合成性の類縁体の製造研究を完成するに至った。なお、D-1及びD-6は基質の水酸化反応だけでなく、アリール結合反応が共に行われることにより生成されたものである。
【００１９】
すなわち本発明者らは、以下の知見を得た。
(i) CYP110に属するタンパク質をセスキテルペンのゼルンボンに作用させることにより、このセスキテルペンに水酸基を導入して新規化合物を製造できる。
(ii) CYP110に属するタンパク質を1-メトキシナフタレンまたは1-エトキシナフタレンに作用させることにより、このナフタレン誘導体に水酸基を導入でき、場合によりさらにアリール結合反応を行わせることができる。
(iii) CYP102A1(F87V)タンパク質をセスキテルペンのゼルンボンまたはβ-オイデスモールに作用させることにより、このセスキテルペンに水酸基を導入して新規または難化学合成性の化合物を製造できる。
(iv) CYP102A1(F87V)タンパク質を1-エトキシナフタレンに作用させることにより、1-エトキシナフタレンに水酸基を効率的に導入でき、さらにアリール結合反応を行わせることができる。
(v) 上記(i)〜(ii)の反応は、CYP110に属するタンパク質遺伝子をCYP110に属するタンパク質に電子を伝達するタンパク質の遺伝子と共に発現する組換えプラスミドを導入した形質転換体を、ゼルンボンまたは1-メトキシナフタレンまたは1-エトキシナフタレンに作用させることにより行うことができるが、従来のpREDベクターにCYP110に属するタンパク質遺伝子を挿入したプラスミドで形質転換した組換え大腸菌を用いれば、水酸基導入反応が進行しやすい。
(vi) 上記(iii)〜(iv)の反応は、CYP102A1(F87V)タンパク質を発現する組換えプラスミドを導入した形質転換体を、ゼルンボンまたはβ-オイデスモールまたは1-エトキシナフタレンに作用させることにより行うことができるが、従来の古細菌由来のFKBP（PPIase）遺伝子にCYP102A1(F87V)遺伝子を融合したプラスミドで形質転換した組換え大腸菌を用いれば、水酸基導入反応、また1-エトキシナフタレンの場合さらにアリール結合反応が進行しやすい。
(vii)上記(i)〜(vi)の反応は、CYP110に属するタンパク質またはCYP102A1(F87V)タンパク質を発現する大腸菌等の生きた細胞を用いて行うことができるので、反応の際に酵素を精製して使用する必要がなく、しかも反応後は遠心分離等により菌体を容易に除去することができることから、生成物の精製も容易である。このため、目的化合物を酵素法で簡便に、しかも大量に製造することができる。
【００２０】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の（１）〜（１６）を提供するものである。
（１）CYP110に属するタンパク質を、セスキテルペン又はナフタレン誘導体に作用させ、水酸化されたセスキテルペン又は水酸化されたナフタレン誘導体を得る工程を含むことを特徴とする水酸化化合物の製造方法。
（２）CYP110に属するタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体と、セスキテルペン又はナフタレン誘導体を共存させることにより、CYP110に属するタンパク質をセスキテルペン又はナフタレン誘導体に作用させることを特徴とする（１）に記載の水酸化化合物の製造方法。
（３）CYP110に属するタンパク質が、還元酵素ドメインと融合したタンパク質であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の水酸化化合物の製造方法。
（４）CYP110に属するタンパク質が、以下の(a)、(b)、又は(c)であることを特徴とする（１）乃至（３）のいずれかに記載の水酸化化合物の製造方法、
(a)CYP110E1、
(b)CYP110E1のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、
(c)CYP110E1遺伝子と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（５）セスキテルペンがゼルンボンであり、水酸化されたセスキテルペンが下記の式（II）又は式（III）：
【００２１】
【化１】
【００２２】
【化２】
で表される化合物であることを特徴とする（４）に記載の水酸化化合物の製造方法。
（６）ナフタレン誘導体が1-メトキシナフタレンであり、水酸化されたナフタレン誘導体が下記の式（V）、式（VI）、又は式（VII）：
【００２３】
【化３】
【００２４】
【化４】
【００２５】
【化５】
で表される化合物であることを特徴とする（４）に記載の水酸化化合物の製造方法。
（７）ナフタレン誘導体が1-エトキシナフタレンであり、水酸化されたナフタレン誘導体が下記の式（VIII）又は式（IX）：
【００２６】
【化６】
【００２７】
【化７】
で表される化合物であることを特徴とする（４）に記載の水酸化化合物の製造方法。
（８）CYP110に属するタンパク質が、以下の(d)、(e)、又は(f)であることを特徴とする（１）乃至（３）のいずれかに記載の水酸化化合物の製造方法、
(d)CYP110C1、
(e)CYP110C1のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、
(f)CYP110C1遺伝子と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（９）セスキテルペンがゼルンボンであり、水酸化されたセスキテルペンが下記の式（II）又は式（III）：
【００２８】
【化８】
【００２９】
【化９】
で表される化合物であることを特徴とする（８）に記載の水酸化化合物の製造方法。
（１０）以下の(g)、(h)、又は(i)のタンパク質を、セスキテルペン又はナフタレン誘導体に作用させ、水酸化されたセスキテルペン又は水酸化されたナフタレン誘導体を得る工程を含むことを特徴とする水酸化化合物の製造方法、
(g)CYP102A1(F87V)、
(h)CYP102A1(F87V)のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、
(i)CYP102A1(F87V)遺伝子と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（１１）(g)、(h)、又は(i)のタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体と、セスキテルペン又はナフタレン誘導体を共存させることにより、(g)、(h)、又は(i)のタンパク質をセスキテルペン又はナフタレン誘導体に作用させることを特徴とする（１０）に記載の水酸化化合物の製造方法。
（１２）(g)、(h)、又は(i)のタンパク質が、古細菌由来のFK506結合タンパク質と融合したタンパク質であることを特徴とする（１０）又は（１１）に記載の水酸化化合物の製造方法。
（１３）セスキテルペンがゼルンボンであり、水酸化されたセスキテルペンが下記の式（II）：
【００３０】
【化１０】
で表される化合物であることを特徴とする（１０）乃至（１２）のいずれかに記載の水酸化化合物の製造方法。
（１４）セスキテルペンがβ−オイデスモールであり、水酸化されたセスキテルペンが下記の式（IV）：
【００３１】
【化１１】
で表される化合物であることを特徴とする（１０）乃至（１２）のいずれかに記載の水酸化化合物の製造方法。
（１５）ナフタレン誘導体が1-エトキシナフタレンであり、水酸化されたナフタレン誘導体が下記の式（Ｘ）：
【００３２】
【化１２】
で表される化合物であることを特徴とする（１０）乃至（１２）のいずれかに記載の水酸化化合物の製造方法。
（１６）下記の式（II）、又は式（III）：
【００３３】
【化１３】
【００３４】
【化１４】
で表される水酸化されたセスキテルペン。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によれば、ゼルンボン（zerumbone）やβ-オイデスモール（β-eudesmol）等の機能性セスキテルペン、及び、1-メトキシナフタレンまたは1-エトキシナフタレンを基質として用いることにより、難化学合成性の水酸化化合物を得ることができる。すなわち、本発明により、医薬品、健康食品、農薬、香料及びこれらの合成中間体等として有用であるセスキテルペンまたはナフタレン誘導体を、温和な条件下で簡便に、しかも効率よく大量に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】pREDベクターの構造を示す図である。
【図２】PPIase-P450BM-3 F87Vの融合タンパク質生産用プラスミドpFusionF87V（別名 pFusionP450）の構造を示す図である。
【図３】組換え大腸菌によるゼルンボンまたはβ-オイデスモールから水酸化された難化学合成性誘導体の製造経路を示す図である。
【図４】組換え大腸菌による1-メトキシナフトールまたは1-エトキシナフトールから水酸化された難化学合成性誘導体の製造経路を示す図である。
【図５】CYP110E1-Redタンパク質のCO差スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３８】
本発明の水酸化化合物の製造方法は、シトクロムP450を、セスキテルペン又はナフタレン誘導体に作用させ、水酸化されたセスキテルペン又は水酸化されたナフタレン誘導体を得る工程を含むことを特徴とするものである。
【００３９】
（Ａ）シトクロムP450
本発明において使用するシトクロムP450としては、CYP110に属するタンパク質やCYP102A1のF87V変異体（CYP102A1(F87V)）などを例示できる。
【００４０】
（Ａ−１）CYP110に属するタンパク質
CYP110に属するタンパク質としては、例えば、CYP110E1やCYP110C1を使用することができる。CYP110E1やCYP110C1は公知のタンパク質であり、そのアミノ酸配列やそれをコードする遺伝子の塩基配列はデータベース上に登録されている。例えば、CYP110E1及びCYP110C1のアミノ酸配列は、それぞれDDBJにaccession no NP_488873及びaccession no. NP_488726として登録されており、また、CYP110E1遺伝子及びCYP110C1遺伝子の塩基配列は、DDBJのaccession no NC_003272内にそれぞれ、alr4833及びalr4686として登録されている。
【００４１】
また、CYP110E1の代わりにCYP110E1と同機能のタンパク質、CYP110C1の代わりにCYP110C1と同機能のタンパク質を使用してもよい。CYP110E1と同機能のタンパク質としては、以下の(b)及び(c)のタンパク質を例示でき、CYP110C1と同機能のタンパク質としては、以下の(e)及び(f)のタンパク質を例示できる。
(b)CYP110E1のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質
(c)CYP110E1遺伝子と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質
(e)CYP110C1のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質
(f)CYP110C1遺伝子と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質
【００４２】
(b)及び(e)のタンパク質は、それぞれCYP110E1及びCYP110C1に、CYP110E1及びCYP110C1の有するモノオキシゲナーゼ活性を失わせない程度の変異が導入されたタンパク質である。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、通常は、30アミノ酸以内であり、好ましくは20アミノ酸以内であり、更に好ましくは10アミノ酸以内であり、最も好ましくは5アミノ酸以内である。変異を導入したタンパク質がモノオキシゲナーゼ活性を保持しているかどうかは、タンパク質に還元状態で一酸化炭素を通気し、吸収スペクトルが変化し、450nmに極大をもつ差スペクトル（ＣＯ差スペクトル）が現れるかどうかで確認することができる。なお、ここでいう「モノオキシゲナーゼ活性」とは、酸素分子を還元して１分子の水を作るとともに、残りの酸素原子を様々な低分子有機化合物に導入して、酸化生成物に変換する反応を触媒する活性を意味する。
【００４３】
(c)及び(f)のタンパク質は、DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られるモノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質である。これらのタンパク質における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、5×SSC、1％SDSを含む緩衝液中の37℃でのハイブリダイゼーション及び1×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による37℃での洗浄処理といった条件であり、好ましくは、5×SSC、1％SDSを含む緩衝液中の42℃でのハイブリダイゼーション及び0.5×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による42℃での洗浄処理といった条件であり、更に好ましくは、5×SSC、1％SDSを含む緩衝液中の65℃でのハイブリダイゼーション及び0.2×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による65℃での洗浄処理といった条件である。ハイブリダイゼーションにより得られるDNAは、CYP110E1遺伝子又はCYP110C1遺伝子と通常、高い相同性を有する。高い相同性とは、80％以上の相同性、好ましくは90％以上の相同性、更に好ましくは95％以上の相同性を指す。
【００４４】
CYP110に属するタンパク質は、他のタンパク質と融合した融合タンパク質であってもよい。CYP110に属するタンパク質と融合する他のタンパク質は特に限定されないが、還元酵素ドメインが好ましく、ロドコッカス属NCIMB9784株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼP450RhFに含まれる還元酵素ドメインがより好ましい。シトクロムP450モノオキシゲナーゼP450RhFのアミノ酸配列は、DDBJにaccession no.AAM67416として登録されており、このアミノ酸配列の461-773が還元酵素ドメインである。
【００４５】
シトクロムP450モノオキシゲナーゼP450RhFに含まれる還元酵素ドメインの代わりに、この還元酵素ドメインと同機能のタンパク質を使用してもよい。このようなタンパク質としては、以下の(j)及び(k)を例示できる。
【００４６】
（j）シトクロムP450モノオキシゲナーゼP450RhFに含まれる還元酵素ドメインのアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、還元酵素活性を有するタンパク質
（k）シトクロムP450モノオキシゲナーゼP450RhFに含まれる還元酵素ドメインをコードするDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、還元酵素活性を有するタンパク質
「付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列」及び「ストリンジェントな条件」の意味は、上述した(b)、(c)、(e)、及び(f)のタンパク質と同様である。変異を導入したタンパク質が還元酵素活性を保持しているかどうかは、そのタンパク質と既知のシトクロムP450との融合タンパク質を作り、実際に反応生成物が生じるかどうかを確かめることで確認することができる。
【００４７】
CYP110に属するタンパク質と還元酵素ドメインとの間には、リンカーペプチドを介在させることができる。リンカーペプチドの長さは、CYP110に属するタンパク質と還元酵素ペプチドとで効率良く反応を進める上で、約６〜２６アミノ酸残基、好ましくは１６残基前後とすることができる。
【００４８】
（Ａ−２）CYP102A1(F87V)
CYP102A1(F87V)は公知のタンパク質であり、このタンパク質の元となったタンパク質であるCYP102A1のアミノ酸配列やそれをコードする遺伝子の塩基配列はデータベース上に登録されている。例えば、CYP102A1のアミノ酸配列は、DDBJにaccession no. AAA87602として登録されており、また、CYP102A1遺伝子の塩基配列は、DDBJにaccession no.J04832として登録されている。
【００４９】
また、CYP102A1(F87V)の代わりにCYP102A1(F87V)と同機能のタンパク質を使用してもよい。CYP110E1と同機能のタンパク質としては、以下の(h)及び(i)のタンパク質を例示できる。
【００５０】
(h)CYP102A1(F87V)のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質
(i)CYP102A1(F87V)遺伝子と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質
「付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列」及び「ストリンジェントな条件」の意味は、上述した(b)、(c)、(e)、及び(f)のタンパク質と同様である。
【００５１】
CYP102A1(F87V)も、CYP110に属するタンパク質と同様に他のタンパク質と融合した融合タンパク質であってもよい。CYP102A1(F87V)と融合する他のタンパク質は特に限定されないが、FK506結合タンパク質（FKBP）が好ましく、古細菌由来のFKBPがより好ましく、サーモスコッカス属KS-1株由来のFKBP（TcFKBP18）が更に好ましい。TcFKBP18のアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列は、GenBankにaccession no.AB012209として登録されている。
【００５２】
TcFKBP18の代わりにTcFKBP18と同機能のタンパク質を使用してもよい。TcFKBP18と同機能のタンパク質としては、以下の(l)及び(m)のタンパク質を例示できる。
【００５３】
(l)TcFKBP18のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、PPIase活性を有するタンパク質
(m)TcFKBP18遺伝子と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、PPIase活性を有するタンパク質
「付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列」及び「ストリンジェントな条件」の意味は、上述した(b)、(c)、(e)、及び(f)のタンパク質と同様である。変異を導入したタンパク質がPPIase活性を保持しているかどうかは、フィッシャーらが提案したキモトリプシンカップルドアッセイによって確認することができる(Fischer et al., 1984, Biomed.Biochim.Acta 43,1101-1111)。
【００５４】
CYP102A1(F87V)とFKBPとの間には、リンカーペプチドを介在させることができる。リンカーペプチドの長さは、約4〜24アミノ酸残基、好ましくは14残基前後とすることができる。
【００５５】
（Ｂ）反応
（Ｂ−１）反応条件
本発明の水酸化化合物の製造方法では、適当な溶液又は溶媒中で、基質とシトクロムP450とを反応させる。シトクロムP450がモノオキシダーゼとして機能するためには、通常、電子伝達タンパク質が必要なので、このタンパク質も反応系に加える。但し、シトクロムP450が還元酵素ドメインとの融合タンパク質になっている場合には、電子伝達タンパク質の添加は不要である。シトクロムP450は必ずしも精製されている必要はなく、菌体の破砕物や抽出物などであってもよい。また、シトクロムP450は適当な担体に固定化されたものであってもよい。
【００５６】
反応に用いるシトクロムP450は、上記のようにシトクロムP450自体でもよいが、シトクロムP450をコードする遺伝子を導入した形質転換体が好ましい。以下、このような形質転換体を用いた方法について説明する。反応は、回分反応や流加（半回分）反応などのバッチ方式や灌流反応などの連続反応方式で行い得る。基質は一括、又は連続的に添加し得る。
【００５７】
反応条件は用いる微生物、及び基質の種類によって異なるが、例えば、回分反応の場合は、反応液中の基質濃度は約0.1〜10 ｍＭが好ましく、約0.5〜2 ｍＭがより好ましい。また、非水溶性かつ液体の基質の場合は、重層することができる。反応液のｐＨは約6〜8が好ましく、約7.0〜7.5がより好ましい。また、反応は、通常、約20〜30℃で約12〜48時間行えばよい。流加（半回分）反応や連続反応の場合は、回分反応の条件に準じて条件を設定すればよい。上記範囲であれば、原料化合物の変換率が高く、かつ精製が容易となる。
【００５８】
（Ｂ−２）基質
基質とするセスキテルペンとしては、ゼルンボン、β-オイデスモールなどを例示でき、基質とするナフタレン誘導体としては、1-メトキシナフタレン、1-エトキシナフタレンなどを例示できる。これらの化合物は市販のものを利用してもよく、また、公知の方法によって合成したものであってもよい。
【００５９】
（Ｂ−３）生成物
反応による生成物は、下記の式（II）で表される化合物（S-2）、下記の式（III）で表される化合物（S-3）、下記の式（IV）で表される化合物（S-4）、下記の式（Ｖ）で表される化合物（D-1）、下記の式（VI）で表される化合物（D-2）、下記の式（VII）で表される化合物（D-3）、下記の式（VIII）で表される化合物（D-4）、下記の式（IX）で表される化合物（D-5）、下記の式（Ｘ）で表される化合物（D-6）である。
【００６０】
【化１５】
【００６１】
【化１６】
【００６２】
【化１７】
【００６３】
【化１８】
【００６４】
【化１９】
【００６５】
【化２０】
【００６６】
【化２１】
【００６７】
【化２２】
【００６８】
【化２３】
S-2は、基質としてゼルンボンを用い、シトクロムP450としてCYP110E1若しくはこれと同機能のタンパク質、CYP110C1若しくはこれと同機能のタンパク質、又はCYP102A1(F87V)若しくはこれと同機能のタンパク質を用いた場合に生成し、S-3は、基質としてゼルンボンを用い、シトクロムP450としてCYP110E1若しくはこれと同機能のタンパク質、又はCYP110C1若しくはこれと同機能のタンパク質を用いた場合に生成し、S-4は、基質としてβ-オイデスモールを用い、シトクロムP450としてCYP102A1(F87V)若しくはこれと同機能のタンパク質を用いた場合に生成し、D-1、D-2、及びD-3は、基質として1-メトキシナフタレンを用い、シトクロムP450としてCYP110E1若しくはこれと同機能のタンパク質を用いた場合に生成し、D-4及びD-5は、基質として1-エトキシナフタレンを用い、シトクロムP450としてCYP110E1若しくはこれと同機能のタンパク質を用いた場合に生成し、D-6は、基質として1-エトキシナフタレンを用い、シトクロムP450としてCYP102A1(F87V)若しくはこれと同機能のタンパク質を用いた場合に生成する。
【００６９】
各生成物は、常法により精製され得る。例えば、必要に応じ遠心分離、濾過等の処理を施して菌体等の懸濁物を除去し、次いで一般的な抽出溶剤、例えば酢酸エチル、クロロホルム、メタノール等の有機溶剤で抽出し、有機溶剤を減圧下で除去し、そして減圧蒸留、クロマトグラフィー、イオン交換樹脂、又は吸着性樹脂等の処理を行うことにより精製され得る。
【００７０】
（Ｃ）形質転換体
シトクロムP450をコードする遺伝子を導入した形質転換体の作製は、常法に従って行うことができる。即ち、シトクロムP450をコードする遺伝子を常法に従って取得し、これを適当なベクターに挿入し、それを適当な宿主に導入し、形質転換すればよい。
【００７１】
シトクロムP450をコードする遺伝子は、例えば、シトクロムP450をコードする公知の遺伝子の配列に基づきプローブやプライマーを設計し、これを利用してゲノムDNAライブラリーやcDNAライブラリーから取得することができる。この際、取得した遺伝子の塩基配列の一部を改変してもよい。また、シトクロムP450をコードする公知の遺伝子の配列を基に化学的に合成してもよい。
【００７２】
遺伝子を挿入するベクターは特に限定されず、例えば、ファージ、ファージミドベクター、プラスミドベクター等が挙げられる。プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルス、トガウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。細菌細胞は生育が容易で反応を行い易いため、本発明に用いるベクターとしては、細菌由来のベクターが好ましく、大腸菌由来のベクターがより好ましい。大腸菌由来のベクターとしては、pUC系ベクターやpETベクターが好ましい。
【００７３】
シトクロムP450を高発現させるためには、プロモーター及び翻訳シグナルの選択が重要である。プロモーターは、宿主中で機能できるものであればよいが、例えば、lacプロモーター、lacUV5プロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、T7プロモーターなどが挙げられる。中でも、lacプロモーターやT7プロモーターを用いることにより、シトクロムP450を高発現させることができる。翻訳シグナルも宿主中で機能できるものであればいずれを用いてもよいが、例えば、LacZの翻訳シグナル、Lppの翻訳シグナルなどが挙げられる。中でも、シトクロムP450を高発現させることができる点で、LacZの翻訳シグナルが好ましい。
【００７４】
CYP110に属するタンパク質をコードする遺伝子を発現する最も好ましいベクターとしては、CYP110に属するタンパク質をコードする遺伝子の３’末端に、リンカーを介して、ロドコッカス属NCIMB9784株由来のシトクロムP450RhFの還元酵素ドメイン又はこれと同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を連結した融合タンパク質発現カセットを含むベクターである。
【００７５】
CYP102A1(F87V)をコードする遺伝子を発現する最も好ましいベクターとしては、CYP102A1(F87V)をコードする遺伝子の５’末端に、リンカーを介して、TcFKBP18又はこれと同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を連結した融合タンパク質発現カセットを含むベクターである。
【００７６】
ベクターの宿主への導入方法は、特に限定されないが、細菌に導入する方法であれば、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Cohen et a1.: Proc. Nat1. Acad. Sci., USA, 69, 2110, 1972]やエレクトロポレーション法等が挙げられ、また、酵母へ導入する方法であれば、例えば、エレクトロポレーション法[Becker,D.M. et a1.: Methods Enzymo1., 194,182, 1990]、スフェロプラスト法[Hinnen, A. et a1.: Proc. Nat1. Acad. Sci., USA, 75, 1929, 1978]、酢酸リチウム法[Itoh, H.: J .Bacterio1.,153, 163, 983]等が、また、動物細胞へ導入する方法であれば、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が、また、昆虫細胞へ導入する方法であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００７７】
宿主はベクターに合わせて選択すればよいが、ゼルンボンを基質とする場合は、ゼルボンをS-1に変換する内在性酵素を持つ宿主を選択することが好ましい。このような宿主としては大腸菌を挙げることができる。ゼルンボン以外を基質とする場合は、宿主は特に限定されず、動物、酵母等の真核細胞でも、放線菌や真正細菌（eubacteria）等の原核細胞でもよいが、生育が簡単で早く変換反応を行い易い点で、真正細菌細胞が好ましい。真正細菌細胞としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）などのエシェリキア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属に属する細菌などが挙げられるが、中でも、大腸菌が好ましい。
【実施例】
【００７８】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７９】
[実施例１]
アナベナ属PCC 7120株由来CYP110E1及びCYP110C1遺伝子の大腸菌での機能発現用プラスミドの作製
アナベナ属PCC 7120株が有するCYP110E1の機能解析用プラスミドCYP110E1-Red及びCYP110C1の機能発現用プラスミドpCYP110C1-Redの作製を行った。
【００８０】
本発明者らは、上記でも述べたように大腸菌でのP450遺伝子の機能発現系を構築した（特許文献１、非特許文献８）。本研究で機能解析を実施するシアノバクテリア (アナベナ属PCC 7120株)由来のCYP110E1及びCYP110C1の機能発現解析に、このpREDベクターを利用した。機能解析用プラスミドCYP110E1-Red及びpCYP110C1-Redの作り方はほぼ同じなので、ここではCYP110E1-Redの作製の実施例について述べる。
【００８１】
(1) Anabaena属PCC 7120株由来CYP110E1遺伝子の塩基配列確認用プラスドの作製とPCR増幅したCYP110E1遺伝子の塩基配列の確認
塩基配列の確認の為に、α相補性を利用した青白選抜が可能である大腸菌用プラスミドベクターpHSG396 (クロラムフェニコール耐性；TaKaRa Bio 社製)を材料として用いた。その後のP450遺伝子のサブクローニング操作が容易となるように、マルチクローニング部位を新たに付与し、汎用性を高めたpHSG396NMSベクターを構築した。その後、このpHSG396NMSに、Anabaena属PCC 7120株のゲノムからPCR法により増幅したCYP110E1遺伝子（終止コドンは除いている）を挿入し、pHSG396NMS-CYP110E1プラスミドを作製し、CYP110E1遺伝子の塩基配列の確認を行った。pHSG396NMSに連結（挿入）したCYP110E1遺伝子の塩基配列は、DDBJ accession no. NP_488873で示される塩基配列から終始コドン（TAG）を除去したもの(1,365 bp)である。
【００８２】
1) P450遺伝子の塩基配列確認用プラスミドpHSG396NMSプラスミドベクターの作製
pHSG396プラスミドベクターをHindIIIとHincIIとで二重消化した後、アガロース電気泳動をかけてDNA断片をゲルから切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製)を用いてゲル抽出を行った(2,218 bp)。次にHindIII-NdeI-NotI-MfeI(MunI)-SpeI-HincII部位を持つようにデザインした合成DNAを二重鎖になるようにアニーリングしたもの（0.5μg）をHindIII-HincII切断したpHSG396ベクター（0.2μg）と混合し、Ligation high溶液 (東洋紡社製)と1:1の量比で混合し、16℃、45分間のライゲーション反応を行い、合成二本鎖DNAをpHSG396ベクターに連結した。その後、氷水中で大腸菌コンピテントセル［ECOS Competent E. coli DH5α (ニッポンジーン社製)］にライゲーション反応液を1/10量混合し、5分間氷水中で放置した後、42℃、45秒間処理することで形質転換した。次に、SOC培地 (2% トリプトン、0.5% yeast extract、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4、20 mM グルコース)を菌体溶液の２倍量加え、37℃、30分間インキュベートした。その後、30μg/mlのクロラムフェニコールを含み、30μlの100 mM IPTG （イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）と30μlの20%のX-Gal （５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）-DMSO (Dimethyl sulfoxide)溶液を塗布したLB培地プレート (1% Bacto-tryptone、0.5% Bacto-yeast extract、1% NaCl、0.02% 5 N NaOH、1.5%アガロース)にインキュベートした菌体溶液を塗布し、37℃で16時間培養した。16時間の培養後、プラスミドを抽出するために、白色コロニーを採り、クロラムフェニコールを30μg/ml含むLB培地 (1% Bacto-tryptone、0.5% Bacto-yeast extract、1% NaCl、0.02% 5 N NaOH)へ移植し、37℃で16時間、170 rpmの条件下、振盪培養器で振盪培養した。培養した形質転換大腸菌から、QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN社製)を用いてプラスミドの抽出を行った。抽出したプラスミドを、マルチクローニングサイトの外側の塩基配列から設計したプライマーを使用し、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems 社製)を用いてシークエンス反応に供した。シークエンス反応条件は、1μlのReady reaction premix、3.5μlの5×BigDye sequencing Buffer、プライマー {3.5μlのフォワードプライマー：pHSG396NMS-Fo (1μmol/μl)もしくは、3.5μlのリバースプライマー：pHSG396NMS-Rv (1μmol/μl)}、200 ngのプラスミドDNA、及び滅菌水蒸留水を20μlとなるように混合し、シークエンス反応として96℃で1分間加熱した後、96℃で10秒間、50℃で5 秒間、及び60℃で4分間を30サイクル行った。その後、model 3730 DNA analyzer (Applied Biosystems 社製)を使用して、インサートの塩基配列を確認し、P450遺伝子の塩基配列確認用プラスミドをpHSG396NMS (2,347 bp)とした。
【００８３】
＜シークエンス用プライマーの塩基配列＞
シークエンス確認に使用したプライマーの塩基配列は以下の通りである。
【００８４】
pHSG396NMS-Fo : 5’- AGTCACGACGTTGTA -3’（配列番号１）
pHSG396NMS-Rv : 5’- CAGGAAACAGCTATGAC -3’ （配列番号２）
2) Anabaena属PCC 7120株由来CYP110E1遺伝子の塩基配列確認用プラスミドpHSG396NMS-CYP110E1の作製
＜Anabaena属PCC 7120株のゲノムDNAの抽出＞
Anabaena属PCC 7120株凍結菌体（約1 g）を氷水中で溶解後、300μlのSTE Buffer {100 mM NaCl、10 mM Tris・HCl (pH8.0)、1 mM EDTA (pH8.0)}を加え、懸濁後、4℃、15分間、8000 rpm遠心分離し、上清を除いた。菌体を300μlのSTE Bufferに再懸濁し、68℃、15分間のインキュベートにより、DNaseを失活させた。4℃、15分間、8000 rpm遠心分離し、上清を除いた。菌体にリゾチームを終濃度5 mg/ml、及び60μlのRNase A (10mg/ml)を加えた600μlの溶菌 Buffer {50 mM グルコース、25 mM Tris・HCl (pH8.0)、10 mM EDTA (pH8.0)}を加え、再懸濁し、37℃、30分間保温した。12μlのProteinase K (20 mg/ml) (TaKaRa Bio 社製)を加え、混和後、さらに37℃で10分間保温した。6 mgのN-Lauroylsarcosine・Naを加え、混和後、37℃、16時間保温し、菌体を溶菌させた。600μlのフェノール/クロロホルム {TE Buffer {10 mM Tris・HCl (pH8.0)、1 mM EDTA (pH8.0)}飽和フェノール：(クロロホルム：イソアミルアルコール=24:1)=1:1}を加え、5分間混和後、10℃、15分間、9000 rpm遠心分離した。上層を回収し、400μlのフェノール/クロロホルムを加え、5分間混和後、10℃、15 分間、9000 rpm遠心分離した。再度、上層を回収し、400μlのフェノール/クロロホルムを加え、5分間混和後、10℃、15 分間、9000 rpm遠心分離した。上層を回収し、1/10量の3 M酢酸ナトリウム、1/10量の125 mM EDTA、及び3倍量の100%エタノールを加え、4℃、20分間、10000 rpm遠心分離し、上清を除いた。70%エタノールを500μl加え、4℃、10分間、10000 rpm遠心分離し、上清をよく除いた。200μlのTE Bufferを加え、沈殿したゲノムDNAを4℃で24時間溶解させた。
【００８５】
＜pHSG396NMS-CYP110E1の作製＞
pHSG396NMSプラスミドベクターを、制限酵素NdeIとEcoRIとで37℃、4時間、2重消化した。その後、1.5%アガロース電気泳動を行い、NdeIとEcoRIとで切断されたpHSG396NMSを切り出し、QIAquick Gel Extraction Kitを用いてゲル抽出を行った。このDNAをベクターDNAとした。
【００８６】
次に、PCR法を用いて、Anabaena属PCC 7120株のCYP110E1遺伝子を増幅した。PCR増幅には、pHSG396NMSプラスミドベクターへの連結を行うためにCYP110E1遺伝子のN末端側にNde I配列、C末端側にEcoR I配列を付与するように設計したプライマーを使用した。また、後に述べるP450還元酵素とのキメラタンパク質としての発現のために、C末端側のプライマーは、終止コドンを除くように設計した。PCR増幅反応は、25μｌの2×PrimeSTAR MaxPremix (TaKaRa Bio 社製)、1μlのフォワードプライマー：Ana4833F (10μmol/μl)、1μlのリバースプライマー：Ana4833R (10μmol/μl)、0.5μlのAnabaena属PCC 7120株ゲノムDNA (25 ng)、2.5μlのDMSO (ジメチルスルホキシド)、及び20μlの滅菌水蒸留水を混合し、PCR反応として98℃で2分間加熱した後、98℃で10秒間、55℃で10秒間、及び72℃で15秒間を5サイクル行った。その後、98℃で10秒間、62℃で5秒間、及び72℃で15秒間を30サイクル行い、CYP110E1遺伝子を増幅した。PCR増幅反応の終了後、反応液2μlを用いて1.5%アガロース電気泳動を行い、CYP110E1遺伝子(1,365 bp)の大きさのPCR増幅産物が得られたことを確認した。CYP110E1遺伝子の増幅を確認後、MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN社製)を用いてPCR増幅産物を精製した。精製したPCR増幅産物は、1.5%アガロース電気泳動を行い、CYP110E1遺伝子の大きさのバンドを切り出し、QIAquick Gel Extraction Kitを用いてゲル抽出を行った。抽出したPCR増幅産物を、制限酵素NdeIとEcoRIとで37℃、4時間、2重消化した。その後、1.5%アガロース電気泳動を行い、QIAquick Gel Extraction Kitを用いてゲル抽出を行った。このPCR増幅産物をインサートDNAとした。
【００８７】
次いで、ベクターDNAとインサートDNAとをモル比で3:1の割合で混合し、Ligation Convenience Kit (ニッポンジーン社製)を等量加えて混合後、16℃、15分間ライゲーションした。氷水中で2.5μlのライゲーション反応液を25μlの大腸菌コンピテントセル (ECOS Competent E.coli DH5α)へ混合した。これを5分間氷水中で放置した後、42℃、45秒間処理することでコンピテントセルを形質転換した。その後、得られた形質転換体に25μlのSOC培地を加え、37℃で、30分間放置した後、30μg/mlのクロラムフェニコールを含み、30μlの100 mM IPTGと30μlの20%のX-Gal-DMSO溶液とを塗布したLBプレートに塗り広げた。その後、37℃、16時間培養し、コロニーを形成させた。次に、生じた白色コロニーを採り、コロニーダイレクトPCR法を用いて、プラスミドのインサートを確認した。コロニーダイレクトPCRは、0.125μlのSpeedSTAR HS DNA polymelase (TaKaRa Bio 社製)、2.5μlの10×Fast Buffer I (TaKaRa Bio 社製)、0.7μlのフォワードプライマー：Ana4833F (10 pmol/μl)、0.7μlのリバースプライマー：Ana4833R (10 pmol/μl)、1.25μlのDMSO、2μlのdNTP Mixture (2.5 mM each)、及び17.725μlの滅菌水蒸留水のPCR反応溶液へコロニーを少量混合し、98℃で5秒間、64℃で10秒間、及び72℃で10秒間のPCR反応を30サイクル繰り返した。反応後、PCR反応液の内、3μlを1.5%アガロース電気泳動することで、インサートDNAが挿入されているコロニーを選び出した。インサートを確認したコロニーを、次に、30μg/mlのクロラムフェニコールを含む10 mlのLB培地に植菌し、37℃で16時間、170 rpmの条件下、振盪培養器で振盪培養した。培養した形質転換大腸菌から、QIAprep Spin Miniprep Kitを用いてプラスミドの抽出を行った。抽出したプラスミドは、マルチクローニングサイトの外側の塩基配列から設計したプライマーを使用し、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitを用いてシークエンス反応を行い、インサートDNAの塩基配列を確認した。シークエンス条件は、CYP110E1遺伝子のGC含有量が高いことから、DMSOを反応液に5%添加し、pHSG396NMSの作製と同様にシークエンス反応を行った。なお、CYP110E1遺伝子の挿入が確認されたプラスミドをpHSG396NMS-CYP110E1とした。
【００８８】
＜CYP110E1のPCR増幅に使用したプライマーの塩基配列＞
前述のプライマーの塩基配列は以下の通りである。
【００８９】
Ana4833F: 5’-TACCATATGATGAAACTTCCAGATAGTC-3’（配列番号３）
Ana4833R: 5’-TACGAATTCTACTTCTACAGGGTTTTTG-3’（配列番号４）
(2) Anabaena属PCC 7120株由来CYP110E1遺伝子の機能発現用プラスミドpCYP110E1-Redの作製
pREDベクターを制限酵素NdeIとEcoRIとで37℃、3時間、2重消化した。処理後は、0.8%アガロース電気泳動を行い、バンドを切り出し、QIAquick Gel Extraction Kitを用いてゲル抽出を行った。これを酵素機能発現用ベクターDNAとした。プラスミドpHSG396NMS-CYP110E1を制限酵素NdeIとEcoRIとで37℃、3時間、2重消化した。制限酵素処理後、0.8% アガロース電気泳動に供し、QIAquick Gel Extraction Kitを用いてゲル抽出を行った。これをインサートDNAとした。次いで、ベクターDNAとインサートDNAとをモル比で3:1の割合で混合し、Ligation Convenience Kitを等量加えて混合後、16℃、15分間ライゲーションした。氷水中で2.5μlのライゲーション反応液を25μlの大腸菌コンピテントセル ［ECOS Competent E. coli DH5α］へ加え、5分間氷水中で放置した後、42℃、45秒間処理することで形質転換した。その後、SOC培地を25μl加え、100μg/mlのアンピシリンを含むLBプレートへ塗り広げた。これを、37℃、16時間培養し、コロニーを形成させた。次に、生じたコロニーを採り、コロニーダイレクトPCR法を用いて、プラスミドへのインサート配列の挿入を確認した。コロニーダイレクトPCRの条件は、生じたコロニーを0.125μlのSpeedSTAR HS DNA polymelase、2.5μlの10×Fast Buffer I、0.7μlのフォワードプライマー：Ana4833F (10 pmol/μl)、0.7μlのリバースプライマー：Ana4833R (10 pmol/μl)、1.25μlのDMSO、2μlのdNTP Mixture (2.5 mM each)、及び17.725μlの滅菌水蒸留水に少量混合し、PCR反応として98℃で5秒間、64℃で10秒間、及び72℃で10秒間を30サイクル行った。反応後、PCR反応液を3μl、1.5%アガロース電気泳動することで、インサート配列の挿入を確認した。その後、プラスミドを抽出するために、インサートを確認したコロニーを100μg/mlのアンピシリンを含む10 mlのLB培地に植菌し、37℃で16時間振盪培養した。培養した形質転換大腸菌は、QIAprep Spin Miniprep Kitを用いてプラスミドを抽出した。目的とするCYP110E1機能発現用プラスミド（pCYP110E1-Redと命名）は、7,745 bpの大きさであり、インサートチェックの結果、挿入したCYP110E1遺伝子の1,365 bpの増幅を確認し、pCYP110E1-Redの作製を確認した。
【００９０】
[実施例２]
基質スクリーニング
実施例１で作製したpCYP110E1-RedまたはpCYP110C1-Red、または「背景技術」で説明したpFusionF87V（図3）で形質転換した組換え大腸菌を用いて、以下のようにして基質スクリーニング実験をおこなった。スクリーニング用有機低分子化合物として種々の基質候補物質を含む96穴プレートを作製した。その中から変換される化合物を探索し、さらに、変換した基質化合物についてはその類似体の変換試験を実施することで、これらの組換え大腸菌が触媒する反応、触媒可能な基質の同定を行った。
【００９１】
(1) BL21(DE3)株の大腸菌へのCYP110E1またはCYP110C1の導入と導入遺伝子の機能発現の確認
基質スクリーニングの前に、実施例１で作製したpCYP110E1-RedまたはpCYP110C1-Redプラスミドを大腸菌BL21(DE3)で発現させ、これにコードされるCYP110E1またはCYP110C1とP450RhF還元酵素末端（reductase domain）との融合型タンパク質(以後CYP110E1-REDまたはCYP110C1-REDと呼ぶ)の活性型が作られるかどうかを確認した。以下にpCYP110E1-Redを例としてその詳細を示す。
【００９２】
0.5μlのpCYP110E1-Redのプラスミド (約120 ng/μl)を5μlのBL21(DE3)大腸菌コンピテントセル ［ECOS Competent E. coli BL21(DE3) (ニッポンジーン社製)］に加え、氷水中で10分間放置した。その後、42℃、45 秒間加熱し、氷水中で5秒間冷却し、25μl のSOC培地を形質転換溶液に加えた。得られた形質転換体を含む培地を、100μg/mlのアンピシリンを含むLBプレートへ塗り広げた後、37℃、16 時間培養した。生じたコロニー各3個を100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地3 mlへ移植し、25℃、15.5時間、170 rpmの条件下、振盪培養し、前培養液とした(ロータリー)。続いて、アンピシリン (終濃度100μg/ml) を含むLB培地 100 mlを2本の300 mlバッフル付三角フラスコに分注し、前培養液をそれぞれ0.5 ml移植し、OD600が約0.8になるまで20℃、120 rpmの条件で培養した。その後5-ALA (終濃度80μg/ml)、Fe(NH4)2(SO4)2 (終濃度0.1 mM)、及びIPTG (終濃度0.5 mM)を加えて同条件で24時間培養を続け、導入遺伝子を発現させ、本培養液とした。
【００９３】
培養終了後、OD600を測定し、50 ml遠沈管に培養液を移し、8000 rpm、4℃、15分間遠心分離した。上清を除去後、菌体湿重量を測定し、本培養液の1/10量のCV-3 Buffer {50 mMリン酸ナトリウム、グリセロール (終濃度5%)、pH7.2}を菌体に加え、vortexで完全に菌体を再懸濁した。2本の培養液を合併した後、3本の15 mlファルコンチューブに再懸濁液を各2 ml分注し、100μlのBug Buster 10×Protein Extraction Reagent (Novagen 社製)、1μlのBenzonase Nuclease (Novagen 社製)、DTT (終濃度2 mM)、及びLysozyme (終濃度200μg/ml)を加え、室温で15℃、20分間、緩やかに回転式振器を用いて菌体を破砕した。15000 rpm、4℃、20分間遠心分離し、上清を回収した。回収したタンパク質抽出物をCOバブリングし、分光光度計(JASCO 社製 V630型)を用いて吸収波長400 nmから550 nmまで0.5 nm間隔で3本の試料(S1、S2及びS3)のCO差スペクトルを測定した。
【００９４】
２本の本培養液のOD600と菌体湿重量は、1本目がOD600=3.09、菌体湿重量=0.47 gであり、2本目がOD600=3.03、菌体湿重量=0.47 gであった。CO差スペクトルの測定結果は、図５に示した。CO差スペクトルの測定の結果、3サンプル(S1、S2及びS3)共にヘムドメインにCOが結合すると確認されるP450に特有の約450 nmのソーレー帯が検出されたことから、活性型のCYP110E1-REDが発現していることが確認された。また、Omura とSatoの方法（T. Omura and R. Sato, The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. Ｉ. Evidence for its hemoprotein nature. J. Biol. Chem. 239: 2370-2378, 1964）に基づいてCO差スペクトルから算出した本培養液中のP450の濃度は、図５に示したS1は311 nM、S2は229 nM、S3は279 nMであり、本培養液100 ml中に約270 nMのCYP110E1-REDが発現していることが判明した。
【００９５】
(2) pCYP110E1-Red、pCYP110C1-RedまたはpFusionF87Vを保持する大腸菌BL21(DE3)によるバイオコンバージョンの方法
基質スクリーニングにおいては、プラスミドpCYP110E1-Red、pCYP110C1-RedまたはpFusionF87Vを導入した大腸菌BL21(DE3)株の懸濁液を、独自のスクリーニング用化合物基質が入ったプレートに加えて反応させ、その後、反応液から変換産物を抽出し、HPLC(高速液体クロマトグラフィー；High Performance Liquid Chromatography)-PDA（PhotoDiode Array Detector）分析を行うことにより基質全体のバイオコンバージョンのプロフィールを調べた。以下にその詳細を示す。
【００９６】
(a) BL21(DE3)株の大腸菌へのpCYP110E1-Red、pCYP110C1-RedまたはpFusionF87Vの導入とグリセロールストックの作製
0.5μlのpCYP110E1-Red、pCYP110C1-RedまたはpFusionF87Vのプラスミド (約120 ng/μl)を5μlの大腸菌BL21(DE3) 株コンピテントセルに加え、氷水中で10分間放置した。その後、42℃、45秒間加熱し、氷水中で5秒間冷却し、25μlのSOC培地を形質転換溶液に加えた。100μg/mlのアンピシリンを含むLBプレートへ塗り広げた後、37℃、16時間培養した。生じたコロニー各3個を100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地15 mlへ移植し、37℃、16時間、170 rpmの条件下、振盪培養した。培養後、培養液1.5 mlに対して80%グリセロールを700μl加え、-80℃でグリセロールストックとして各4本保存した。
【００９７】
(b) 基質変換試験
プラスミドpCYP110E1-Red、pCYP110C1-RedまたはpFusionF87Vを保持した組換え大腸菌BL21(DE3)株のグリセロールストックをディスポーサブルスパーテルで少量掻き取り、100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地5 mlを加えたガラス試験管に懸濁した。培養液は、培養液のOD600が約0.8になるまで37℃、3時間、150 rpmの条件で振盪培養した (Kuhner SHAKER X、Lab Therm LT-X キューナー社製)。
【００９８】
続いて、アンピシリン(終濃度100μg/ml)を含むLB培地 125 mlを加えた500 mlバッフル付三角フラスコを2本調製し、前培養液をそれぞれ1.5 ml移植し、OD600が約0.8になるまで20℃、140 rpmの条件で培養 (Kuhner SHAKER X、Lab Therm LT-X、キューナー社製)した。その後5-ALA (終濃度80μg/ml)、Fe(NH4)2(SO4)2(終濃度0.1 mM)、及びIPTG (終濃度0.5 mM)を加えて同条件で20時間培養を続け、導入遺伝子を発現させ、本培養液とした。
【００９９】
培養終了後、250 ml遠沈管に培養液を移し、8000 rpm、4℃、15分間遠心分離した。上清を除去後、25 mlのCV-3 Buffer［50 mMリン酸ナトリウム、グリセロール (終濃度5%)、pH7.2］を菌体に加え、vortexで完全に菌体を再懸濁した。次に、96穴ディープウェルプレート(PP-MASTER BLOCK 2ML、128,0/85 MM 96WELL STERIL、Greiner bio-one社製)の各ウェルに5μlの100 mMの基質候補物質-DMSO溶液をそれぞれ加え、細胞懸濁液を各500μl分注した。その後、シーリングマット(Flexible Sealing Mat for 2.2 ml Deep Well Plate、IWAKI社製)でウェルを密閉し、25℃、24時間、300 rpmの条件で(Kuhner SHAKER X、Lab Therm LT-X)変換試験を実施した。
【０１００】
(c) 変換産物のHPLC-PDA分析
変換試験終了後、各ウェルに飽和食塩水を100μlと、カルボン酸などの酸性化合物を基質とした場合には、さらに25μlの1N HCl加えた後、酢酸エチルを500μl加えた1.5 mlエッペンチューブへ全量ピペットアウトした。5分間vortexした後、15000 rpm、25℃、15分間遠心分離を行い、酢酸エチル層を1 mlシリンジで回収した。回収した酢酸エチル層は、シリンジフィルター(0.2μm、φ 4 mm、Millex-LG、 日本ミリポア社製)でろ過した後、HPLC分析試料とした。HPLC分析条件は以下の通りに実施した。
【０１０１】
HPLCシステム：Waters 2695 Separation Module (waters社製)
検出器：Waters2996 Photodiode array detector (PDA) 検出器 (waters社製)
カラム：Waters Xterra MS C18 5μm I.D.4.6 mm×100 mm (waters社製)
移動相：0-3 min: 5% CH3CN/H2O (20 mM リン酸)
3-28 min: 5% CH3CN/H2O (20 mM リン酸)
→95% CH3CN/H2O (20 mM リン酸) (リニアグラジエント)
28-33 min: 95% CH3CN/H2O (20 mM リン酸)
33-38 min: 5% CH3CN/H2O (20 mM リン酸)
カラム温度：30℃
流速：1 ml/min
検出波長域：PDA (200-500 nm)
分析試料：20μl
変換率は、λmaxで抽出した基質、及び変換産物各々のピーク面積値から、生成物と基質との合計面積に占める生成物の面積の割合として算出した。
【０１０２】
[実施例３]
変換産物の構造解析
基質スクリーニングの結果、変換が進行したと考えれた基質について、スケールアップした基質変換試験を行い、得られた変換産物について、標品が存在する場合には、HPLCで標品との重ね打ちによる化合物の同定を実施し、標品が存在しない場合には、MS (Mass Spectrometry、質量分析法)及びNMR (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy、核磁気共鳴分光法)による構造解析を実施した。
【０１０３】
(1) スケールアップした基質変換試験
pCYP110E1-Red、pCYP110C1-RedまたはpFusionF87Vを導入した大腸菌BL21(DE3)株のグリセロールストックをディスポーサブルスパーテルで少量掻き取り、アンピシリン (100μg/ml)を含むLB培地12 mlを加えた50 mlガラス試験管に懸濁した。培養液は、培養液のOD600が約0.8になるまで37℃、170 rpm、4 時間振盪培養 (レシプロ恒温水槽)し、前培養液とした。続いて、アンピシリン (終濃度100μg/ml)を含むLB培地 500 mlを加えた2 Lバッフル付三角フラスコを2本調製し、前培養液をそれぞれ5 ml移植し、OD600が約0.8になるまで20℃、140 rpmの条件で培養 (Kuhner SHAKER X、Lab Therm LT-X、キューナー社製)した。その後5-ALA (終濃度80μg/ml)、Fe(NH4)2(SO4)2(終濃度0.1 mM)、及びIPTG (終濃度0.5 mM)を加えて同条件で20時間培養を続け、導入遺伝子を発現させ、本培養液とした。培養終了後、250 ml遠沈管に培養液を移し、8000 rpm、4℃、15分間遠心分離した。上清を除去後、200 mlのCV-3 Buffer ［50 mMリン酸ナトリウム、グリセロール (終濃度5%)、pH7.2］を菌体に加え、vortexにより再懸濁した。次に、菌体懸濁液を2 Lバッフル付三角フラスコ2本に各100 ml移植し、100 mMのDMSO溶解基質をそれぞれ1 ml加えた後、軽く混和し、CO2透過シート(BREATHseal、Greiner bio-one社製)でフラスコの口をシールして25℃、48時間、180 rpmの条件下、変換試験を実施した。
【０１０４】
変換試験終了後、1.5 mlエッペンチューブに変換試験液を500μl回収し、飽和食塩水100μl、及び酢酸エチルを500μl加えた。5分間vortexした後、15000 rpm、25℃、15分間遠心分離を行い、上層の酢酸エチル層を1 mlシリンジで回収した。回収した酢酸エチル層は、0.2μmシリンジフィルターでろ過した後、HPLC分析試料とした。
【０１０５】
(2) 変換産物の構造解析法
プラスミドpRED-CYP110E1を保持する大腸菌BL21(DE3)と基質との変換試験液200 mlに等量の酢酸エチルを添加し、分液する操作を2回繰り返して酢酸エチル層を回収した。
【０１０６】
得られた酢酸エチル層を減圧下濃縮して粗体を得た。粗体をシリカゲル［Slicagel 60F-254 0.25 mm silica gel plate (Merck社製)］を用いた薄層クロマトグラフ (TLC)に供し、変換産物の確認を行った後、シリカゲルカラムクロマトグラフ［I.D. 10×200 mm、Silica Gel 60 (Merck 社製)］に供して精製品を得た。
【０１０７】
なお、各基質におけるTLCの展開溶媒は以下の通りである。
【０１０８】
・ゼルンボン（zerumbone） ヘキサン：酢酸エチル＝3：1
・β-オイデスモール（β-eudesmol） ヘキサン：酢酸エチル＝1：1
・1-メトキシナフタレン（1-methoxynaphthalene） ヘキサン：酢酸エチル＝6：1
・1-エトキシナフタレン（1-ethoxynaphthalene） ヘキサン：酢酸エチル＝6：1
カラムクロマトグラフによる変換産物の精製後、MS(EI: JEOL DX505W, ESI: JEOL JMS-T100LP)及びNMR(400 MHz、Bruker AMX400)スペクトルデータを分析した。
【０１０９】
(3) 変換産物の同定結果
(a) ゼルンボン（zerumbone）
【０１１０】
【化２４】
ゼルンボン（zerumbone）を基質とした場合、大腸菌内在酵素により、下記の化合物に変換された。
【０１１１】
【化２５】
化合物S-１の1H、13C化学シフト (Table 1)、及び同定の根拠を以下に示す。
【０１１２】
【表１】
S-1のHREI-MSを測定したところ、m/z 220.1822に分子イオンピーク（M+）が観測された。この結果、S-1の分子式はC15H24O (calcd for 220.1827)と決定された。
【０１１３】
S-１の1H NMRでは二重結合に由来するシグナルは3H分しか観測されず（δ 5.09, δ 6.05, δ 6.24）、その分子式がzerumbone + 2Hであることを考えると、S-1はzerumboneの二重結合のΔ2,3、Δ6,7のいずれかの二重結合が還元された化合物であることが強く示唆された。次にS-１の1H-1H DQF, HMQC, HMBCスペクトルを測定、解析した結果、HMBCスペクトルにおいてδ 1.05に観測されるダブレットメチル基（H-2）からδ 205.3のケトン基（C-1）に1H-13C遠隔スピン結合が観測され、この結果還元された二重結合はΔ2,3であることが明らかとなった。以上の結果より、S-1の構造は式（I）に示すように決定された。
【０１１４】
pCYP110E1-Red、pCYP110C1-RedまたはpFusionF87Vを導入した大腸菌BL21(DE3)株によりゼルンボンは下記の化合物に変換された。なお、本化合物はCASデータベースにおける新規化合物であった。
【０１１５】
【化２６】
化合物S-2の1H、13C化学シフト、及び同定の根拠を以下に示す。
【０１１６】
【表２】
S-2のHREI-MSを測定したところ、m/z 236.1769に分子イオンピーク（M+）が観測された。この結果、S-2の分子式はC15H24O2 (calcd for 236.1776)と決定された。
【０１１７】
S-2の1H NMRはS-1と非常に類似したものであったが、S-1でδ 1.45に観測されたシングレットメチルは消失し、代わりにδ 3.92及びδ 4.02に孤立した1級アルコール由来のシグナルが観測される点が異なっていた。S-2の分子式はS-1 + Oであることから、S-2はS-1のC-13メチル基がアルコールとなったものであることが強く示唆された。次にS-2の1H-1H DQF, HMQC, HMBCスペクトルを測定、解析した結果、HMBCスペクトルにおいてδ 3.92 (H-13)からδ 35.0 (C-5), δ 140.1 (C-6), δ 126.0 (C-7)に1H-13C遠隔スピン結合が観測され、C-13が1級アルコールであることが確認された。以上の結果より、S-2の構造は式（II）に示すように決定された。
【０１１８】
pCYP110E1-RedまたはpCYP110C1-Redを導入した大腸菌BL21(DE3)株によりゼルンボンはまた下記の化合物に変換された。なお、本化合物はCASデータベースにおける新規化合物であった。
【０１１９】
【化２７】
化合物S-3の1H、13C化学シフト、及び同定の根拠を以下に示す。
【０１２０】
【表３】
S-3のHREI-MSを測定したところ、m/z 236.1773に分子イオンピーク（M+）が観測された。この結果、S-3の分子式はC15H24O2 (calcd for 236.1776)と決定された。
【０１２１】
S-3の1H NMRはS-1と非常に類似したものであったが、S-1でδ 2.06に観測されたダブレットメチレン（H-8）シグナルが消失し、d 4.24に新たなダブレットメチンが観測される点が異なっていた。S-3の分子式はS-1 + Oであることを考え合わせると、S-3はS-1のC-8メチレン基に水酸基が導入されたものであることが強く示唆された。次にS-2の1H-1H DQF, HMQC, HMBCスペクトルを測定、解析した結果、HMBCスペクトルにおいてδ 1.12 (H-14)及びδ 1.26 (H-15)からδ 75.5 (C-8)に1H-13C遠隔スピン結合が観測され、C-8に水酸基が導入されたことが確認された。以上の結果から、S-3の構造は式（III）に示すように決定された。
【０１２２】
(b) β-オイデスモール（β-eudesmol）
【０１２３】
【化２８】
pFusionF87Vを導入した大腸菌BL21(DE3)株によりβ-オイデスモールは下記の化合物に変換された。
【０１２４】
【化２９】
化合物Ｓ-4の1H、13C化学シフト、及び同定の根拠を以下に示す。
【０１２５】
【表４】
S-4のHREI-MSを測定したところ、m/z 238.1929に分子イオンピーク（M+）が観測された。この結果、S-4の分子式はC15H24O2 (calcd for 238.1933)と決定された。
【０１２６】
S-4の1H NMRではシングレットメチルが3本観測され（δ 0.68, δ 1.21, δ 1.21）、S-4の分子式がβ-eudesmol + Oであることを考え合わせると、S-4はβ-eudesmolのC-11に水酸基が導入されたものであることが強く示唆された。次にS-4の1H-1H DQF, HMQC, HMBCスペクトルを測定、解析した結果、HMBCスペクトルにおいてδ 1.21 (H-12及びH-13)からδ 72.8 (C-11)に1H-13C遠隔スピン結合が観測され、C-11に水酸基が導入されたことが確認された。以上の結果、S-4の構造は式（IV）に示すように決定された。
【０１２７】
(c) 1-メトキシナフタレン（1-methoxynaphthalene）
【０１２８】
【化３０】
pCYP110E1-Redを導入した大腸菌BL21(DE3)株により1-メトキシナフタレンは下記の化合物D-1、D-2、D-3に変換された。
【０１２９】
【化３１】
化合物D-1の1H、13C化学シフト、及び同定の根拠を以下に示す。
【０１３０】
【表５】
D-1のHRESI-MSを測定したところ、m/z 345.1116に分子イオンピーク（（M-H）-）が観測された。この結果、D-1の分子式はC22H18O4 (((M-H)-:C22H17O4, calcd for 345.1127)と決定された。D-1の炭素数は基質である1-methoxynaphthalene構成炭素数の倍であることから、本化合物はdimer構造を取っていることが推定された。
【０１３１】
D-1の1H NMRでは8H分のシグナルのみ観測されたことから、本化合物がhomo dimer構造であることが確認された。次にD-1の1H-1H DQFスペクトルを測定した結果、δ 8.30 - δ 7.54 - δ 7.49 - δ 8.20のvicinal spin networkが観測され、H-5 〜 H-8の部分は1-methoxynaphthaleneと変化ないことが確認された。さらにD-1のHMBCスペクトルでδ 8.30 (H-5)からδ 142.1 (C-4)へ1H-13C遠隔スピン結合が観測されることから、C-4, 4’に水酸基が存在することが明らかとなった。以上の結果及びD-1の分子式を考慮すると、D-1は1-methoxy-4-hydroxynaphthaleneがC-2 - C-2’あるいはC-3 - C-3’間でC-C結合を形成した化合物であることが明らかとなった。ここでD-1は1-methoxy-4-hydroxynaphthalene 2分子がphenol oxidation coupling反応により生じた化合物であると判断されるため、一義的にC-3 - C-3’結合であると結論することができ、D-1の構造は式（Ｖ）に示すように決定された。
【０１３２】
【化３２】
化合物D-2の1H、13C化学シフト、及び同定の根拠を以下に示す。
【０１３３】
【表６】
D-2のHRESI-MSを測定したところ、m/z 173.0600に分子イオンピーク（（M-H）-）が観測された。この結果、D-2の分子式はC11H10O2 ((M-H)-:C11H9O2, calcd for 173.0603)と決定された。従ってD-2は基質である1-methoxynaphthaleneに1分子のOが導入された化合物であることが明らかとなった。
【０１３４】
次にD-2の1H NMR, 1H-1H COSYスペクトルを測定、解析した結果、H-5 〜 H-8のvicinal spin networkは保存されていることが明らかとなった。またこのvicinal spin networkの他に、δ 7.23 - δ 7.57間にvicinal spin coupling (J= 8.5 Hz)が観測されることから、Oが導入された位置は一義的にC-2と決定され、D-2の構造は式（VI）に示すように決定された。
【０１３５】
【化３３】
化合物D-3の1H、13C化学シフト、及び同定の根拠を以下に示す。
【０１３６】
【表７】
D-3のHRESI-MSを測定したところ、m/z 173.0611に分子イオンピーク（（M-H）-）が観測された。この結果、D-3の分子式はC11H10O2 ((M-H)-:C11H9O2, calcd for 173.0603)と決定された。従ってD-3は基質である1-methoxynaphthaleneに1分子のOが導入された化合物であることが明らかとなった。
【０１３７】
次にD-3の1H NMR, 1H-1H COSYスペクトルを測定、解析した結果、δ 6.85 - δ 7.40 - δ 7.73及びδ 6.85 - δ 7.30 - δ 7.85の2つのvicinal spin networksが観測され、Oが導入された位置はC-5或いはC-8と決定された。さらにD-3のHMBCスペクトルにおいて、δ 7.40 (H-3)及びδ 4.00 (H-9)からδ 155.2 (C-1)へ1H-13C遠隔スピン結合が観測され、さらにδ 7.40(H-3)とvicinal spin couplingしたδ 7.73 (H-4)からδ151.5 (C-5)へ1H-13C遠隔スピン結合が観測されることから、Oの導入はC-5と確定された。以上の結果から、D-3の構造は式（VII）に示すように決定された。
【０１３８】
(d) 1-エトキシナフタレン（1-methoxynaphthalene）
【０１３９】
【化３４】
pCYP110E1-Redを導入した大腸菌BL21(DE3)株により1-エトキシナフタレンは下記の化合物D-4、D-5に変換された。
【０１４０】
【化３５】
化合物D-4の1H、13C化学シフト、及び同定の根拠を以下に示す。
【０１４１】
【表８】
D-4のHRESI-MSを測定したところ、m/z 187.0750に分子イオンピーク（（M-H）-）が観測された。この結果、D-4の分子式はC12H12O2 ((M-H)-:C12H11O2, calcd for 187.0759)と決定された。従ってD-4は基質である1-ethoxynaphthaleneに1分子のOが導入された化合物であることが明らかとなった。
【０１４２】
次にD-4の1H NMR, 1H-1H COSYスペクトルを測定、解析した結果、δ 7.78 - δ 7.33 - δ 7.47 - δ 7.92 のvicinal spin network が観測され、これはH-5 〜 H-8のspin networkと判断された。これ以外にD-4には δ 7.55 - δ 7.23のvicinal spin couplingが観測されることから、これはH-2 - H-3のvicinal spin couplingと一義的に判定され、Oが導入された位置はC-4と決定された。以上の結果から、D-4の構造は式（VIII）に示すように決定された。
【０１４３】
【化３６】
化合物D-5の1H、13C化学シフト、及び同定の根拠を以下に示す。
【０１４４】
【表９】
D-5のHRESI-MSを測定したところ、m/z 187.0756に分子イオンピーク（（M-H）-）が観測された。この結果、D-5の分子式はC12H12O2 ((M-H)-:C12H11O2, calcd for 187.0759)と決定された。従ってD-5は基質である1-ethoxynaphthaleneに1分子のOが導入された化合物であることが明らかとなった。
【０１４５】
次にD-5の1H NMR, 1H-1H COSYスペクトルを測定、解析した結果、δ 6.83 - δ 7.37 - δ 7.71及びδ 6.85 - δ 7.29 - δ 7.89の2つのvicinal spin networksが観測され、Oが導入された位置はC-5或いはC-8と決定された。さらにD-5のHMBCスペクトルにおいて、δ 7.37 (H-3)及びδ 4.20 (H-9)からδ 154.8 (C-1)へ1H-13C遠隔スピン結合が観測され、さらにδ 7.37(H-3)とvicinal spin couplingしたδ 7.71 (H-4)からδ151.2 (C-5)へ1H-13C遠隔スピン結合が観測されることから、Oの導入はC-5と確定された。以上の結果から、D-5の構造は式（IX）に示すように決定された。
【０１４６】
pFusionF87Vを導入した大腸菌BL21(DE3)株により1-エトキシナフタレンは下記の化合物D-6に変換された。
【０１４７】
【化３７】
化合物D-6の1H、13C化学シフト、及び同定の根拠を以下に示す。
【０１４８】
【表１０】
D-6のHRESI-MSを測定したところ、m/z 373.1433に分子イオンピーク（（M-H）-）が観測された。この結果、D-6の分子式はC24H22O4 (((M-H)-:C24H21O4, calcd for 373.1440)と決定された。D-6の炭素数は基質である1-methoxynaphthalene構成炭素数の倍であることから、本化合物はdimer構造を取っていることが推定された。
【０１４９】
D-6の1H NMRでは10H分のシグナルのみ観測されたことから、本化合物がhomo dimer構造であることが確認された。次にD-6の1H-1H DQFスペクトルを測定した結果、δ 8.26 - δ 7.52 - δ 7.52 - δ 8.15のvicinal spin networkが観測され、H-5 〜 H-8の部分は1-ethoxynaphthaleneと変化ないことが確認された。さらにD-6のHMBCスペクトルでδ 8.26 (H-5)からδ 142.6 (C-4)へ1H-13C遠隔スピン結合が観測されることから、C-4, 4’に水酸基が存在することが明らかとなった。以上の結果及びD-6の分子式を考慮すると、D-6は1-ethoxy-4-hydroxynaphthaleneがC-2 - C-2’あるいはC-3 - C-3’間でC-C結合を形成した化合物であることが明らかとなった。ここでD-6は1-ethoxy-4-hydroxynaphthalene 2分子がphenol oxidation coupling反応により生じた化合物であると判断されるため、一義的にC-3 - C-3’結合であると結論することができ、D-6の構造は式（Ｘ）に示すように決定された。
【産業上の利用可能性】
【０１５０】
本発明の製造方法は、ゼルンボンまたはβ-オイデスモール等のセスキテルペン誘導体の製造、及び1-メトキシ基または２-メトキシ基をもつナフタレンの水酸化誘導体の製造、創薬段階における新規化合物の創製、代謝物の調製、長い工程を要する製造プロセスの短縮、化学合成では合成が困難な化合物の合成などにおいて有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CYP110に属するタンパク質を、セスキテルペン又はナフタレン誘導体に作用させ、水酸化されたセスキテルペン又は水酸化されたナフタレン誘導体を得る工程を含むことを特徴とする水酸化化合物の製造方法。
【請求項２】
CYP110に属するタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体と、セスキテルペン又はナフタレン誘導体を共存させることにより、CYP110に属するタンパク質をセスキテルペン又はナフタレン誘導体に作用させることを特徴とする請求項１に記載の水酸化化合物の製造方法。
【請求項３】
CYP110に属するタンパク質が、還元酵素ドメインと融合したタンパク質であることを特徴とする請求項１又は２に記載の水酸化化合物の製造方法。
【請求項４】
CYP110に属するタンパク質が、以下の(a)、(b)、又は(c)であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の水酸化化合物の製造方法、
(a)CYP110E1、
(b)CYP110E1のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、
(c)CYP110E1遺伝子と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項５】
セスキテルペンがゼルンボンであり、水酸化されたセスキテルペンが下記の式（II）又は式（III）：
【化１】
【化２】
で表される化合物であることを特徴とする請求項４に記載の水酸化化合物の製造方法。
【請求項６】
ナフタレン誘導体が1-メトキシナフタレンであり、水酸化されたナフタレン誘導体が下記の式（V）、式（VI）、又は式（VII）：
【化３】
【化４】
【化５】
で表される化合物であることを特徴とする請求項４に記載の水酸化化合物の製造方法。
【請求項７】
ナフタレン誘導体が1-エトキシナフタレンであり、水酸化されたナフタレン誘導体が下記の式（VIII）又は式（IX）：
【化６】
【化７】
で表される化合物であることを特徴とする請求項４に記載の水酸化化合物の製造方法。
【請求項８】
CYP110に属するタンパク質が、以下の(d)、(e)、又は(f)であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の水酸化化合物の製造方法、
(d)CYP110C1、
(e)CYP110C1のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、
(f)CYP110C1遺伝子と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項９】
セスキテルペンがゼルンボンであり、水酸化されたセスキテルペンが下記の式（II）又は式（III）：
【化８】
【化９】
で表される化合物であることを特徴とする請求項８に記載の水酸化化合物の製造方法。
【請求項１０】
以下の(g)、(h)、又は(i)のタンパク質を、セスキテルペン又はナフタレン誘導体に作用させ、水酸化されたセスキテルペン又は水酸化されたナフタレン誘導体を得る工程を含むことを特徴とする水酸化化合物の製造方法、
(g)CYP102A1(F87V)、
(h)CYP102A1(F87V)のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、
(i)CYP102A1(F87V)遺伝子と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
(g)、(h)、又は(i)のタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体と、セスキテルペン又はナフタレン誘導体を共存させることにより、(g)、(h)、又は(i)のタンパク質をセスキテルペン又はナフタレン誘導体に作用させることを特徴とする請求項１０に記載の水酸化化合物の製造方法。
【請求項１２】
(g)、(h)、又は(i)のタンパク質が、古細菌由来のFK506結合タンパク質と融合したタンパク質であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の水酸化化合物の製造方法。
【請求項１３】
セスキテルペンがゼルンボンであり、水酸化されたセスキテルペンが下記の式（II）：
【化１０】
で表される化合物であることを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれか一項に記載の水酸化化合物の製造方法。
【請求項１４】
セスキテルペンがβ−オイデスモールであり、水酸化されたセスキテルペンが下記の式（IV）：
【化１１】
で表される化合物であることを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれか一項に記載の水酸化化合物の製造方法。
【請求項１５】
ナフタレン誘導体が1-エトキシナフタレンであり、水酸化されたナフタレン誘導体が下記の式（Ｘ）：
【化１２】
で表される化合物であることを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれか一項に記載の水酸化化合物の製造方法。
【請求項１６】
下記の式（II）、又は式（III）：
【化１３】
【化１４】
で表される水酸化されたセスキテルペン。
【請求項１】
CYP110に属するタンパク質を、セスキテルペン又はナフタレン誘導体に作用させ、水酸化されたセスキテルペン又は水酸化されたナフタレン誘導体を得る工程を含むことを特徴とする水酸化化合物の製造方法。
【請求項２】
CYP110に属するタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体と、セスキテルペン又はナフタレン誘導体を共存させることにより、CYP110に属するタンパク質をセスキテルペン又はナフタレン誘導体に作用させることを特徴とする請求項１に記載の水酸化化合物の製造方法。
【請求項３】
CYP110に属するタンパク質が、還元酵素ドメインと融合したタンパク質であることを特徴とする請求項１又は２に記載の水酸化化合物の製造方法。
【請求項４】
CYP110に属するタンパク質が、以下の(a)、(b)、又は(c)であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の水酸化化合物の製造方法、
(a)CYP110E1、
(b)CYP110E1のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、
(c)CYP110E1遺伝子と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項５】
セスキテルペンがゼルンボンであり、水酸化されたセスキテルペンが下記の式（II）又は式（III）：
【化１】
【化２】
で表される化合物であることを特徴とする請求項４に記載の水酸化化合物の製造方法。
【請求項６】
ナフタレン誘導体が1-メトキシナフタレンであり、水酸化されたナフタレン誘導体が下記の式（V）、式（VI）、又は式（VII）：
【化３】
【化４】
【化５】
で表される化合物であることを特徴とする請求項４に記載の水酸化化合物の製造方法。
【請求項７】
ナフタレン誘導体が1-エトキシナフタレンであり、水酸化されたナフタレン誘導体が下記の式（VIII）又は式（IX）：
【化６】
【化７】
で表される化合物であることを特徴とする請求項４に記載の水酸化化合物の製造方法。
【請求項８】
CYP110に属するタンパク質が、以下の(d)、(e)、又は(f)であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の水酸化化合物の製造方法、
(d)CYP110C1、
(e)CYP110C1のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、
(f)CYP110C1遺伝子と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項９】
セスキテルペンがゼルンボンであり、水酸化されたセスキテルペンが下記の式（II）又は式（III）：
【化８】
【化９】
で表される化合物であることを特徴とする請求項８に記載の水酸化化合物の製造方法。
【請求項１０】
以下の(g)、(h)、又は(i)のタンパク質を、セスキテルペン又はナフタレン誘導体に作用させ、水酸化されたセスキテルペン又は水酸化されたナフタレン誘導体を得る工程を含むことを特徴とする水酸化化合物の製造方法、
(g)CYP102A1(F87V)、
(h)CYP102A1(F87V)のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、
(i)CYP102A1(F87V)遺伝子と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
(g)、(h)、又は(i)のタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体と、セスキテルペン又はナフタレン誘導体を共存させることにより、(g)、(h)、又は(i)のタンパク質をセスキテルペン又はナフタレン誘導体に作用させることを特徴とする請求項１０に記載の水酸化化合物の製造方法。
【請求項１２】
(g)、(h)、又は(i)のタンパク質が、古細菌由来のFK506結合タンパク質と融合したタンパク質であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の水酸化化合物の製造方法。
【請求項１３】
セスキテルペンがゼルンボンであり、水酸化されたセスキテルペンが下記の式（II）：
【化１０】
で表される化合物であることを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれか一項に記載の水酸化化合物の製造方法。
【請求項１４】
セスキテルペンがβ−オイデスモールであり、水酸化されたセスキテルペンが下記の式（IV）：
【化１１】
で表される化合物であることを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれか一項に記載の水酸化化合物の製造方法。
【請求項１５】
ナフタレン誘導体が1-エトキシナフタレンであり、水酸化されたナフタレン誘導体が下記の式（Ｘ）：
【化１２】
で表される化合物であることを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれか一項に記載の水酸化化合物の製造方法。
【請求項１６】
下記の式（II）、又は式（III）：
【化１３】
【化１４】
で表される水酸化されたセスキテルペン。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図１】
【公開番号】特開２０１０−２７９３２４（Ｐ２０１０−２７９３２４Ａ）
【公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１３７２１１（Ｐ２００９−１３７２１１）
【出願日】平成２１年６月８日（２００９．６．８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度生物系特定産業技術研究支援センター「生物系産業創出のための異分野融合研究支援事業」産業技術力強化法第１９条（旧：産業活力再生特別措置法第３０条）の適用を受けるもの
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月８日（２００９．６．８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度生物系特定産業技術研究支援センター「生物系産業創出のための異分野融合研究支援事業」産業技術力強化法第１９条（旧：産業活力再生特別措置法第３０条）の適用を受けるもの
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
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