ＳＥＲＰＩＮＥ２によるコラーゲンおよび平滑筋アクチンの発現を調節するための組成物および方法
本発明は、ＳＥＲＰＩＮＥ２およびＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストを使用して、肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１の発現および／またはα−平滑筋アクチンの発現を増大または減少させる方法および組成物を包含する。また、本発明は、筋線維芽細胞の形成を増大または減少させる方法および組成物を包含する。さらに、本発明は、特発性肺線維症および慢性閉塞性肺疾患といった肺疾患の治療のための方法および組成物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
特発性肺線維症（ＩＰＦ）、急性肺傷害（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）といった、肺線維症に関連する多くの様々な肺疾患が存在する（Howell et al., Am. J. Path. 159:1383-1395 (2001)、米国特許出願公開第２００９／０１３６５００号）。
【０００２】
例えば、特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、繊維芽細胞の増殖および過度のコラーゲン堆積によって特徴づけられる、間質性の肺疾患の一般的な形態である（Hardie et al., Am. J. of Respir. Cell Mol. Biol. 327:309-321 (2007)）。ＩＰＦは慢性炎症プロセスに帰着する可能性があり、これは間質における細胞外マトリックスの限局性の蓄積を発生させる。あるいは、ＩＰＦは肺の上皮の損傷によって引き起こされる可能性があり、過度の細胞外マトリックス形成を伴う異常な創傷治癒をもたらす可能性がある。現在まで、ＩＰＦに対する有効な治療法は存在しない（Hardie et al., (2007); Meltzer et al., Orphanet Journal of Rare Diseases, 3:8 (2008)）。
【０００３】
肺繊維芽細胞から筋線維芽細胞への転換は、特発性肺線維症およびその他の肺疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の病態生理学的特徴である（Dunkern et al., Eur J Pharmacol. 572(1):12-22 (2007)）。
【０００４】
ＩＰＦ患者の肺胞液では、抗繊維素溶解の活性のレベルが低下することが報告されている（Chapman et al., Am. Rev. Respir. Dis. 133:437-443 (1986)）。肺液におけるプラスミノゲン・アクチベータ・インヒビター（ＰＡＩ−１）抗原（ＳＥＲＰＩＮＥ１としても知られる）の濃度および肺細胞ライセートにおけるＰＡＩ−２抗原（ＳＥＲＰＩＮＢ２としても知られる）の濃度は、正常な被験者よりも患者のほうが高いことが報告された（同文献）。ＰＡＩ−１は肺線維症に関与する（Gharee-Kermani et al., Expert Opin. Investig. Drugs 17:905-916, 2008）。ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）は、脈管外の組織における繊維素溶解の主要な活性化剤である（同文献）。ＰＡＩ−１はｕＰＡを阻害する（同文献）。したがって、プラスミノゲンシステムのタンパク質分解特性は、肺修復の調節および繊維症に重要な役割を果たす可能性がある（同文献）。
【０００５】
ＳＥＲＰＩＮＥ２は不可逆的な細胞外セリンプロティナーゼ阻害剤である。これは、膵臓、結腸および胃の癌において過剰発現する（Neesse et al., Pancreatology 7:380-385, 2007）。ＳＥＲＰＩＮＥ２は、プロテアーゼ・ネキシンＩ（ＰＮ−１）および神経膠由来ネキシン（ＧＤＮ）としても知られる。ＳＥＲＰＩＮＥ２はさらに細胞外のウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子を阻害する（Scott et al., J. Biol. Chem. 258:4397-4403, 1983）。
【０００６】
膵臓癌細胞株にＳＥＲＰＩＮＥ２をトランスフェクションすると、侵襲性の腫瘍における細胞外マトリックス（ＥＣＭ）生産の大きな上昇と共に、異種移植片腫瘍の局所的な侵入の増強がもたらされた（Buchholz et al., Cancer Research 63:4945-4951 (2003)）。ＥＣＭ蓄積は、タイプＩコラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンについては陽性であった（同文献）。
【０００７】
ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質はマウスおよびヒトの肺において発現することがわかっている（DeMeo et al., Am. J. Hum. Gen. 78:253-264 (2006)）。この文献は、ＳＥＲＰＩＮＥ２の過剰発現は慢性閉塞性肺疾患と関連があることを示唆した。ＳＥＲＰＩＮＥ２は、トロンビン、トリプシン、プラスミンおよびウロキナーゼといったトリプシン様セリンプロテアーゼの細胞外阻害剤であることが実証された（同文献）。
【０００８】
ＳＥＲＰＩＮＥ２は繊維芽細胞によって分泌される（Farrell et al., J. Cell Physiol. 134:179-188, 1988）。ＳＥＲＰＩＮＥ２は、細胞外環境においてトロンビン、ウロキナーゼおよびプラスミンを含む特定のセリンプロテアーゼと複合体を形成し、これらはその後、細胞に取り込まれ、分解される（同文献）。ＳＥＲＰＩＮＥ２は、細胞外マトリックスに結合して、繊維芽細胞の表面に存在する（同文献）。
【０００９】
硬皮症患者の皮膚病変から単離した繊維芽細胞はコラーゲンおよびその他のマトリックス成分を過剰発現する（Strehlow et al., J. Clin. Invest. 103:1179-1190 (1999)）。ＳＥＲＰＩＮＥ２は硬皮症繊維芽細胞において過剰発現した（同文献）。マウス３Ｔ３繊維芽細胞におけるＳＥＲＰＩＮＥ２の一時的又は安定的な発現は、それぞれ、コラーゲンα−１（Ｉ）プロモーター活性または内因性コラーゲン転写物の濃度を増加させた（同文献）。活性部位に突然変異を導入したＳＥＲＰＩＮＥ２では、コラーゲンプロモーター活性の増大が生じなかった（同文献）。アンチセンス方向のＳＥＲＰＩＮＥ２の過剰発現は、マウス３Ｔ３繊維芽細胞において、コラーゲンプロモーターからの発現を阻害するようであった（同文献）。Strehlow et al., 1999の文献において、ヒトＳＥＲＰＩＮＥ２の点変異Ｒ３６４ＫおよびＳ３６５Ｔが行われており、これはトロンビンとの高い次元の複合体における形成を欠如させることが確認された。
【００１０】
低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）は、プロテアーゼ−ＳＥＲＰＩＮＥ２複合体の内部移行の原因となる受容体である（Knauer et al., J. Biol. Chem. 272: 29039-29045, 1997）。トロンビン−ＳＥＲＰＩＮＥ２のＬＲＰへの結合はアミノ酸４７−５８によって介在される（Knauer et al., J. Biol. Chem. 272:12261-12264, 1997）。ＬＲＰ結合領域におけるＳＥＲＰＩＮＥ２点変異Ｈ４８Ａ、および二重変異体Ｈ４８ＡおよびＤ４９Ａは、野生型と同様のトロンビン複合体形成速度を有するが、異化および内部移行が野生型と比較して５０％および１５％まで低下した（Knauer et al., J. Biol. Chem. 274:275-281, 1999）。
【００１１】
ＩＰＦにおける主要なエフェクター細胞は筋線維芽細胞である（Scotton and Chambers, Chest 132:1311-1321 (2007)）。筋線維芽細胞は、コラーゲンを高度に合成し、収縮性の表現型を有しており、α−平滑筋アクチンストレス・ファイバーの存在によって特徴づけられる（同文献）。筋線維芽細胞は、常在性の肺線維芽細胞の活性化／増殖、上皮−間充織の分化、循環する繊維芽幹細胞（繊維細胞）の動因に起因する可能性がある（同文献）。筋線維芽細胞は創傷治癒プロセスに関係する（Hinz et al., Am. J. Pathology 170:1807-1816 (2007)）。トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）β１は、筋線維芽細胞の発生の誘導に関与することが示された（同文献）。
【００１２】
肺線維症の患者における１つの研究において、α−平滑筋アクチン、γ−平滑筋アクチンおよびカルポニンといった筋タンパク質並びにインテグリンα７β１をコードする遺伝子の発現が著しく増大することがわかった（Zuo et al., P.N.A.S. 99:6292-6297 (2002)）。
【００１３】
肺線維症のマウスモデルにおいて、ＴＧＦ−αによる繊維症の誘導は、１−４日以内に、プロコラーゲンタイプＩ、α１（ＣＯＬ１Ａ１）、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２およびＣＯＬ１５Ａ１、およびエラスチンを含むいくつかの細胞外マトリックスタンパク質の肺ＲＮＡ濃度の上昇をもたらした（Hardie et al., 2007）。ＴＧＦ−α後に増加した防御／免疫タンパク質をコード化する多数のＲＮＡの濃度は、ＳＥＲＰＩＮＥ２を含めて、もはや発現しなかった（同文献）。ＳＥＲＰＩＮＥ２はＩＰＦと関連づけられなかったことに注目される（同文献）。
【００１４】
ＳＥＲＰＩＮＥ２とトロンビンとの反応速度は、ヘパリンが増大させる（Wallace et al., Biochem J. (1989) 257, 191-196）。ＳＥＲＰＩＮＥ２のヘパリン結合部位は、部位特異的突然変異によって局地化された（Stone et al., Biochem. 33:7731-7735, 1994）。ＳＥＲＰＩＮＥ２のヘパリン結合領域は、アミノ酸９０−１０５であることが明らかとなった。７つ全てのリジン残基のグルタミン酸残基への変異は、分解による測定と同様に、ヘパリン結合、ヘパリンが介在するトロンビン複合体形成を促進する能力、およびトロンビン−ＳＥＲＰＩＮＥ１の繊維芽細胞表面に結合する能力を失わせた（Stone et al., 1994; Knauer et al., JBC 1997, 272:29039-29045, 1997）。
【００１５】
Ｓｅｒｐｉｎｓは、３つのβ−シートおよび８−９つのヘリックスから構成される（Law et al., Genome Biology 7:216, 2006）。反応中心ループ（ＲＣＬ）は標的となるプロテアーゼと相互作用する（同文献）。ｓｅｒｐｉｎの切断は、プロテアーゼの活性部位を歪める構造変化をもたらし、これは、アシル中間体の効率的な加水分解および続くプロテアーゼの放出を妨げる（同文献）。したがって、ｓｅｒｐｉｎｓは不可逆的で自殺的な阻害剤である（同文献）。
【００１６】
ｓｅｒｐｉｎｓの多くの異なるタイプのアンタゴニストが作られた。例えば、ＳＥＲＰＩＮＥ２に対するモノクローナル抗体は、標的プロテアーゼの阻害を遮断することができる（Wagner et al., Biochemistry 27: 2173-2176, 1988; Boulaftali et al. Blood First Edition Paper, prepublished online October 23, 2009; DOI 10.1182/blood-2009-04-217240）。同様に、ＳＥＲＰＩＮＥ１（すなわちプラスミノゲンアクチベータインヒビター−１）に対するｓｃＦＶ断片を含む中和抗体が作られた（例えば、 Verbeke et al., J. Thromb. Haemost. 2:298-305, 2004, and Brooks et al., Clinical & Experimental Metastasis 18:445-453, 2001）。アンチセンスＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドが、ＳＥＲＰＩＮＥ２およびＳＥＲＰＩＮＥ１発現を阻害するために使用された（Kim and Loh, Mol. Biol. Cell. 17:789-798, 2006, and Sawa et al., J. Biol. Chem. 269:14149-14152, 1994）。
【００１７】
ＲＮＡ干渉もまた、ＳＥＲＰＩＮＥ１発現の抑制のために使用された（Kortlever et al., Nature Cell Biology 8:877-884, 2006）。さらに、ＳＥＲＰＩＮＥ１の反応中心ループに対応する１４アミノ酸ペプチドを使用して、ＳＥＲＰＩＮＥ１の不活性化が成功した（Eitzman et al., J. Cin. Invest. 95:2416-2420, 1995）。その他のｓｅｒｐｉｎｓは、反応中心ループに対応するペプチドによって同様に阻害された（Bjork et al., J. Biol. Chem. 267:1976-1982, 1992; Schulze et al., Eur. J. Biochem. 194:51-56, 1990）。低分子量分子ＸＲ５９６７（ジケトピペラジン）も、ＳＥＲＰＩＮＥ１活性を抑制することが示された（Brooks et al., Anticancer Drugs 15:37-44, 2004）。
【００１８】
肺線維芽細胞に関する多くの繊維症の肺疾患が存在する。例えば、特発性肺線維症は、慢性的で進行性の、しばしば致命的な間質性肺疾患であり、これに対して証明された薬物治療は存在しない（Gharaee-Kermani et al., 2008）。したがって、ＩＰＦおよびＣＯＰＤといった、肺線維芽細胞が関与する繊維症肺疾患を治療するための付加的な組成物および方法に対するニーズが存在する。
【発明の概要】
【００１９】
ヒト肺線維芽細胞に対して精製されたＳＥＲＰＩＮＥ２を投与すると、コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現が増大することが分かった。低密度リポ蛋白質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）に結合する能力を欠くＳＥＲＰＩＮＥ２ ＬＲＰ結合変異体の投与もまた、コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現を増大させる。その標的プロテアーゼと相互作用する能力を欠くＳＥＲＰＩＮＥ２プロテアーゼ相互作用変異体を投与した場合、コラーゲン１Ａ１の発現およびα−平滑筋アクチンの発現を増大する能力を示さなかった。標的プロテアーゼと相互作用する能力を維持するが、プロテアーゼの活性を完全には遮断しないＳＥＲＰＩＮＥ２プロテアーゼ阻害変異体(Strehlow et al., 1999)の投与は、中程度のコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現をもたらした。
【００２０】
ＳＥＲＰＩＮＥ２に対するポリクローナル抗体の投与は、用量依存的に、ＳＥＲＰＩＮＥ２−誘導型のコラーゲン１Ａ１の増大を無効にした。さらに、ＴＧＦ−βは、正常ヒト肺線維芽細胞におけるＳＥＲＰＩＮＥ２ ｍＲＮＡ発現の大きな上昇を誘導し、ブレオマイシンによるマウスの治療法は、肺ライセートにおけるＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質の発現濃度の上昇を引き起こした。
【００２１】
これらの結果は、特発性肺線維症において見られるように、ＳＥＲＰＩＮＥ２が、コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現の増大とともに、活性化された筋線維芽細胞の形成の上昇を引き起こし得ることを示す。本発明は、肺線維芽細胞において、コラーゲン１Ａ１の発現を増大するおよび／またはα−平滑筋アクチンの発現を増大するための方法および組成物を包含する。例えば、組み換え型のＳＥＲＰＩＮＥ２は、コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現および筋線維芽細胞形成を増大させるために肺線維芽細胞に添加することができる。ＳＥＲＰＩＮＥ２は、細胞外のプロテアーゼ阻害剤であるため、肺線維芽細胞自身によって製造でき、またはタンパク質の添加または近隣の細胞による生産といった別の供給源由来とできる。これらの組成物および方法は、肺線維芽細胞においてコラーゲン１Ａ１および／またはα−平滑筋アクチンの発現を増大させるのに有用であり、およびＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストのための薬剤スクリーニング検査に有用である。さらに、これらの組成物および方法は、インビボでの繊維症の活性を相殺する組成物のための薬剤アッセイに有用である。例えば、マウスを、その他の化合物と一緒に精製されたＳＥＲＰＩＮＥ２で処理し、繊維症を相殺する化合物のスクリーニングに使用することができる。さらに、本発明の組成物および方法は、創傷治癒を助ける活性化された筋線維芽細胞の形成の上昇に有用である。
【００２２】
様々な実施形態において、本発明は、ヒト肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１産生および／またはα−平滑筋アクチン産生のレベルを増大するための方法であって、細胞へＳＥＲＰＩＮＥ２を投与し、ヒト肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１および／またはα−平滑筋アクチンの発現の増大を検出することを含む方法を包含する。好ましい実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＥ２は発現ベクターにて、または精製されたタンパク質として投与される。好ましくは、コラーゲン発現の上昇は、コラーゲン１Ａ１のＲＮＡの濃度の上昇の測定により、および／またはα−平滑筋アクチンのＲＮＡ産生のレベルの上昇の測定により検出される。
【００２３】
高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２へのヒト肺線維芽細胞の曝露は、コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現の増大をもたらし、その発現の増大は、プロテアーゼ標的に結合するＳＥＲＰＩＮＥ２の能力を妨害することで遮断されるため、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露されたヒト肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現の減少を生じさせることが出来る。この方法において、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、筋線維芽細胞の発生のように、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に対するヒト肺線維芽細胞の曝露の効果を遮断することができる。したがって、本発明は、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストを使用して、肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１の発現を減少させ、および／またはα−平滑筋アクチンの発現を減少させるための方法および組成物を包含する。そのようなアンタゴニストは、肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１および／またはα−平滑筋アクチンの発現の減少に、および筋線維芽細胞の作用による場合のように肺線維芽細胞に介在される繊維症の予防に有用である。
【００２４】
様々な実施形態において、本発明は、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露されたヒト肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１および／またはα−平滑筋アクチンの発現のレベルを阻害するための方法であって、ヒト肺線維芽細胞にＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストを投与することを含む方法を包含する。１つの実施形態において、方法は、肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１および／またはα−平滑筋アクチンの発現の減少の検出を含む。様々な実施形態において、肺線維芽細胞は、アンタゴニストへの曝露の前にＴＧＦ−βに曝露される。ある実施形態において、肺線維芽細胞は、アンタゴニストへの曝露の前にＩＬ−１３に曝露される。好ましくは、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、抗体、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス核酸分子、ペプチドまたはＳＥＲＰＩＮＥ２の小分子阻害剤である。
【００２５】
ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、抗体等のような、ＳＥＲＰＩＮＥ１のアンタゴニストを含む、肺線維症のその他の阻害剤と組み合わせて使用することができる。
【００２６】
本発明はさらに、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露されたヒト肺線維芽細胞から筋線維芽細胞の形成を阻害するための方法であって、ヒト肺線維芽細胞へのＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの投与を含む方法を包含する。様々な実施形態において、肺線維芽細胞は、アンタゴニストへの曝露の前にＴＧＦ−βに曝露される。ある実施形態において、肺線維芽細胞は、アンタゴニストへの曝露の前にＩＬ−１３に曝露される。好ましくは、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、抗体、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス核酸分子、ペプチドまたはＳＥＲＰＩＮＥ２の小分子阻害剤である。
【００２７】
本発明はさらに、ＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露されたヒト肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１および／またはα−平滑筋アクチンの発現のレベルを阻害するための方法であって、ヒト肺線維芽細胞へのＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの投与を含む方法を包含する。１つの実施形態において、方法は、肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１および／またはα−平滑筋アクチンの発現の減少の検出を含む。様々な実施形態において、肺線維芽細胞は、アンタゴニストへの曝露の前にＴＧＦ−βに曝露される。ある実施形態において、肺線維芽細胞は、アンタゴニストへの曝露の前にＩＬ１３に曝露される。好ましくは、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、抗体、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス核酸分子、ペプチドまたはＳＥＲＰＩＮＥ２の小分子阻害剤である。
【００２８】
この発明の文脈において、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、ＳＥＲＰＩＮＥ２のＲＮＡ発現、タンパク質発現またはタンパク質活性を特異的に阻害することができる任意の分子を含む。したがって、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、ＳＥＲＰＩＮＥ２に特異的に結合し、その生物活動を抑制する抗体；ＳＥＲＰＩＮＥ２の発現に干渉するアンチセンス核酸ＲＮＡ；ＳＥＲＰＩＮＥ２の発現に干渉する小型干渉ＲＮＡ；ＳＥＲＰＩＮＥ２の小ペプチド阻害剤、およびＳＥＲＰＩＮＥ２の小分子阻害剤を含む。例えば、ＳＥＲＰＩＮＥ２への特異的に結合し、その生物活性を遮断するアンタゴニスト抗体を、コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現を減少させるために、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露された肺線維芽細胞に添加することができる。同様に、ＳＥＲＰＩＮＥ２に特異的に結合するアンタゴニスト抗体を、筋線維芽細胞の形成を減少させるために、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露された肺線維芽細胞に添加することができる。
【００２９】
コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現の増大に対する高いＳＥＲＰＩＮＥ２濃度の効果は、発明者らに対して、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に対するヒト肺線維芽細胞の曝露が、ＩＰＦおよびＣＯＰＤを含む様々な肺疾患に関連する主要なエフェクター細胞である筋線維芽細胞の形成を促進したことを示した。したがって、本発明は、肺線維芽細胞に対するＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの投与により、および筋線維芽細胞形成を減少させることにより、コラーゲン１Ａ１の発現および／またはα−平滑筋アクチンの過剰発現を患う患者における肺線維芽細胞においてα−平滑筋アクチンの発現を減少させるためのおよび／またはコラーゲン１Ａ１の発現を減少させるための方法および組成物を包含する。
【００３０】
本発明は、医学的状態の治療法のための医薬の製造のためのＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの使用であって、医学的状態は肺線維症、特にヒト肺線維芽細胞が高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露される肺線維症である使用を含む。好ましい実施形態において、医学的状態は特発性肺線維症（ＩＰＦ）または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。好ましくは、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは抗体、例えばモノクローナル抗体である。様々な実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス核酸分子、ペプチドまたはＳＥＲＰＩＮＥ２の小分子阻害剤である。ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストもまた、抗体等といった、ＳＥＲＰＩＮＥ１のアンタゴニストを含む肺線維症のその他の阻害剤と組み合わせて使用することができる。
【００３１】
このように、本発明は、ＩＰＦ、ＡＬＩ、ＡＲＤＳ、喘息およびＣＯＰＤのような肺疾患の治療のための方法および組成物を提供する。そのような組成物は、そのような疾病の病徴を有するまたはそのリスクのある患者に対して、予防的にまたは治療的に提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、ヒト肺線維芽細胞に対する精製されたＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質の効果のためのアッセイの結果を示す。ｂＤＮＡアッセイを、０、２．５または５μｇ／ｍｌの濃度の精製されたＳＥＲＰＩＮＥ２および０．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βで４８時間処理した正常ヒト肺線維芽細胞に対して行った。β−アクチン（ＡＣＴＢ）、α−平滑筋アクチン（ＡＣＴＡ２）およびコラーゲン１Ａ１（ＣＯＬ１Ａ１）のＲＮＡ濃度を測定した。
【図２】図２は、野生型（ＷＴ）ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＳＥＲＰＩＮＥ２ＬＲＰ結合変異体、ＳＥＲＰＩＮＥ２プロテアーゼ阻害変異体およびＳＥＲＰＩＮＥ２プロテアーゼ相互作用変異体を形質移入した細胞からのタンパク質上清の、β−アクチン（ＡＣＴＢ）、α−平滑筋アクチン（ＡＣＴＡ２）およびコラーゲン１Ａ１（ＣＯＬ１Ａ１）のＲＮＡ濃度に対する効果のためのアッセイの結果を示す。ベクターコントロール（ＶＣＭ）からの上清も使用した。ｂＤＮＡアッセイを、ＳＥＲＰＩＮＥ２含有上清またはＶＣＭ上清および０．０５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βで４８時間処理した正常ヒト肺線維芽細胞に対して行った。
【図３】図３は、野生型（ＷＴ）ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＳＥＲＰＩＮＥ２ＬＲＰ結合変異体、ＳＥＲＰＩＮＥ２プロテアーゼ阻害変異体およびＳＥＲＰＩＮＥ２プロテアーゼ相互作用変異体を形質移入した細胞からのタンパク質上清の、β−アクチン（ＡＣＴＢ）、α−平滑筋アクチン（ＡＣＴＡ２）およびコラーゲン１Ａ１（ＣＯＬ１Ａ１）のＲＮＡ濃度に対する効果のためのアッセイの結果を示す。ベクターコントロール（ＶＣＭ）からの上清も使用した。ｂＤＮＡアッセイは、ＳＥＲＰＩＮＥ２含有上清またはＶＣＭ上清および０．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βで４８時間処理した正常ヒト肺線維芽細胞に対して行った。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、２つの異なる濃度でＴＧＦ−β１が存在する状態において、ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質の濃度を増大することによるコラーゲンタンパク質生産の誘導を示す。
【図５】図５は、ＮＨＬＦ細胞におけるＴＧＦ−ｂ１によるＳＥＲＰＩＮＥ２ ＲＮＡ生産の誘導を示す。
【図６】図６は、マウスＳＥＲＰＩＮＥ２に対するポリクローナル抗体を使用した、肺線維芽細胞におけるマウスＳＥＲＰＩＮＥ２誘導性コラーゲン産生の誘導の阻害を示す。＃＃＃ｐ＜０．００１は処理なしの場合と比較、＊＊＊ｐ＜０．００１は０．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβの場合と比較、一次元配置分散分析およびＮｅｗｍａｎ Ｋｅｕｌｓ。
【図７】図７は、７または１４日間食塩水またはブレオマイシンで処理したマウスの肺ライセートにおけるＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質濃度を示す。統計的有意性は、一次元配置分散分析およびテューキーポスト試験（Tukey's Post test）を使用して決定した。ＳＥＲＰＩＮＥ２濃度（５１ＫＤバンド）は、ブレオ処理した肺ライセートにおいて著しく増加し、ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質が増大した。＊＊＊ｐ＜０．０００１は、食塩水処理したマウス肺と比較した。
【発明の詳細な説明】
【００３３】
本発明は、ＳＥＲＰＩＮＥ２を使用して、肺線維芽細胞においてコラーゲン１Ａ１の発現を増大させるためのおよび／またはα−平滑筋アクチンの発現を増大させるための方法および組成物を包含する。
【００３４】
本発明はさらに、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストを使用して、肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１の発現を減少させるためのおよび／またはα−平滑筋アクチンの発現を減少させるための方法および組成物を包含する。コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現を減少させるために、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストを高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露された肺線維芽細胞に添加することができる。同様に、筋線維芽細胞の形成を減少させるために、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストを高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露された肺線維芽細胞に添加することができる。
【００３５】
ＳＥＲＰＩＮＥ２への肺線維芽細胞の曝露は、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの投与によって阻害することができる。アンタゴニストは、ＳＥＲＰＩＮＥ２のＲＮＡ発現、タンパク質発現またはタンパク質活性を低下させるか、または遮断することができる。
【００３６】
「高い」濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２とは、細胞および／または組織について、平均値を超えるＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質の濃度を意味する。例えば、肺線維芽細胞の培養物に対するＳＥＲＰＩＮＥ２の付加は、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２をもたらす。さらに、患者の気管支洗浄におけるＳＥＲＰＩＮＥ２の濃度が、気管支洗浄サンプルについてのＳＥＲＰＩＮＥ２の平均値を超える場合、その濃度は高い。
【００３７】
高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に対する肺線維芽細胞の曝露は、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの投与によって阻害することができる。アンタゴニストは、ＳＥＲＰＩＮＥ２のＲＮＡ発現、タンパク質発現またはタンパク質活性を低下させるか、または遮断することができる。
【００３８】
本発明は、肺線維芽細胞に対するＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの投与により、および筋線維芽細胞形成を減少させることにより、ＩＰＦ患者における肺線維芽細胞においてコラーゲン１Ａ１の発現を減少させるためのおよび／またはα−平滑筋アクチンの発現を減少させるための方法および組成物を包含する。このように、本発明は特発性肺線維症の治療のための方法および組成物を提供する。
【００３９】
核酸分子
１つの実施形態において、本発明は、内因性の物質の混入がない一定の単離されたＳＥＲＰＩＮＥ２ヌクレオチド配列に関する。「ヌクレオチド配列」とは、分離した断片の形態におけるポリヌクレオチド分子またはより大きな核酸構成物の成分を意味する。核酸分子は、実質的に純粋な形態で、および、標準的な生化学的方法（概要は、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載される）による、その成分となるヌクレオチド配列の同定、操作および回収を可能とする量または濃度で、少なくとも一度単離されたＤＮＡまたはＲＮＡに由来した。そのような配列は、好ましくは、真核生物の遺伝子に典型的に存在する内在的な翻訳されない配列またはイントロンによって中断されていない、オープンリーディングフレームの形態で提供され、および／または構築される。翻訳されないＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’または３’に存在することができ、そこでは、前記配列はコード領域の操作または発現に干渉しない。
【００４０】
ＳＥＲＰＩＮＥ２核酸分子は、一本鎖および二本鎖の双方の形態のＤＮＡ並びにそのＲＮＡ相補物を含む。ＤＮＡは、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡおよびそれらの組み合わせを含む。本発明のＤＮＡ分子は、ＳＥＲＰＩＮＥ２をコードする全長遺伝子並びにポリヌクレオチドおよびその断片を含む。本発明の核酸は、通常ヒト供給源に由来するが、本発明は、その他の供給源に由来したものも含む。
【００４１】
本発明の特に好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１に記載されるＳＥＲＰＩＮＥ２のヒト配列である。配列番号１のＤＮＡによってコードされるアミノ酸の配列は配列番号２に示される。
【００４２】
１以上のコドンが同一のアミノ酸をコード化することができるという、既知の遺伝暗号の縮重により、ＤＮＡ塩基配列は、配列番号１に示される配列とは異なるものの、配列番号２のアミノ酸配列を有したポリペプチドをコードする配列にすることができる。そのような様々なＤＮＡ塩基配列は、サイレント突然変異（例えば、ＰＣＲ増幅の際に生じる）に起因する場合がありえ、または本来の配列の計画的な突然変異による生成物と成り得る。
【００４３】
したがって、本発明は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；（ｂ）配列番号２のポリペプチドをコードするＤＮＡ；（ｃ）中程度に厳密な条件の下、（ａ）または（ｂ）のＤＮＡに対してハイブリダイゼーションすることができ、且つＳＥＲＰＩＮＥ２またはその断片をコードするＤＮＡ；（ｄ）高度に厳密な条件の下、（ａ）または（ｂ）のＤＮＡに対してハイブリダイゼーションすることができ、且つＳＥＲＰＩＮＥ２またはその断片をコードするＤＮＡ；および（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）で定義されたＤＮＡに対して、遺伝暗号の結果として縮重しており、且つＳＥＲＰＩＮＥ２またはその断片をコードするＤＮＡから選択される、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ配列を包含する。当然、そのようなＤＮＡ塩基配列によってコードされたポリペプチドは、本発明に包含される。
【００４４】
本発明はしたがって、（ａ）本来の哺乳類ＳＥＲＰＩＮＥ２遺伝子のコード領域に由来したＤＮＡ；（ｂ）配列番号１のＤＮＡまたはその断片、（ｃ）中程度に厳密な条件の下、（ａ）または（ｂ）のＤＮＡに対してハイブリダイゼーションでき、且つ生物学的に活性なＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドをコードするＤＮＡ；および（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で定義されたＤＮＡに対して遺伝暗号の結果として縮重し、且つ生物学的に活性なＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドをコードするＤＮＡから選択される、生物学的に活性なＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ配列を提供する。そのようなＤＮＡの等価な配列によってコードされたＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドは、本発明に包含される。その他の哺乳類の種に由来したＤＮＡによってコードされるＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドもまた包含される。当該ＤＮＡは、配列番号１のＤＮＡの相補体にハイブリダイズすると考えられる。
【００４５】
ここで使用される「中程度に厳密な条件」とは、ニトロセルロース膜のためのプレ洗浄溶液５ｘＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の使用、約４２℃で約５０％のホルムアミド、６ｘＳＳＣのハイブリダイゼーション条件（または、約４２℃で約５０％のホルムアミドにおいて、Stark's溶液といったその他の同様のハイブリダイゼーション溶液）、約６０℃、０．５ｘＳＳＣ、０．１％のＳＤＳの洗浄条件を意味する。「高度に厳密な条件」とは、ほぼ６８℃、０．２ｘＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで洗浄することを伴う、上記のようなハイブリダイゼーション条件を意味する。
【００４６】
後述されるような、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチド断片および保存的なアミノ酸置換を含むポリペプチドをコードするＤＮＡも本発明の実施形態に含まれる。
【００４７】
その他の実施形態において、本発明の核酸分子は、さらに、本来のＳＥＲＰＩＮＥ２配列と比較して少なくとも８０％同一のヌクレオチド配列を含む。さらに、核酸分子が本来のＳＥＲＰＩＮＥ２配列と比較して、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一または少なくとも９９．９％同一である配列を含む実施形態も意図される。
【００４８】
ここに使用される、２つの核酸配列のパーセント同一性は、Devereuxらによって記述され(Nucl. Acids Res. 12:387, 1984)、ウィスコンシン遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）から利用可能な、ＧＡＰコンピュータ・プログラム・バージョン６．０を使用し、デフォルトパラメーターをＧＡＰプログラムに使用することで配列情報を比較して決定することができる。このデフォルトパラメーターは、（１）ヌクレオチドのための一成分比較マトリックス（同一の場合１および非同一の場合０の値を含む）およびGribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986の重みつき比較マトリックス（例えば、Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979に記載）、（２）それぞれの相違に対して３．０のペナルティー、およびそれぞれの相違におけるそれぞれの記号に対して付加的に０．１０のペナルティー；および（３）末端の相違に対してペナルティーはなし、ということを含む。
【００４９】
本発明はさらに、ポリペプチドの生産に有用な単離した核酸を提供する。そのようなポリペプチドは、任意の多くの従来技術によって調製することができる。ＳＥＲＰＩＮＥ２をコードするＤＮＡ塩基配列またはその所望の断片は、ポリペプチドまたは断片の生産のために発現ベクターにサブクローン化することができる。ＤＮＡ塩基配列は、有利に、適切なリーダーペプチドまたはシグナルペプチドをコードする配列に融合される。あるいは、所望の断片は、既知の技術を使用して、化学的に合成することができる。さらにＤＮＡ断片は、全長がクローン化されたＤＮＡ塩基配列の制限酵素による消化によって製造し、アガロースゲルの電気泳動によって単離してもよい。必要ならば、５’または３’末端を所望の点に再構築するオリゴヌクレオチドを、制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片に結紮することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、付加的に、所望のコード配列の上流に位置する制限酵素切断部位を含み、およびコード配列のＮ末端に開始コドン（ＡＴＧ）を有しうる。
【００５０】
さらに、周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の手法を、所望のタンパク質断片をコードするＤＮＡ塩基配列を単離および増幅するために使用することができる。ＤＮＡ断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドが、５’および３’プライマーとして使用される。オリゴヌクレオチドは、さらに、増幅されたＤＮＡ断片の発現ベクターへの挿入を容易にするために、制限酵素のための認識部位を含むことができる。ＰＣＲ技術は、Saiki et al., Science 239:487 (1988)；Recombinant DNA Methodology, Wu et al., eds., Academic Press, Inc., San Diego (1989), pp. 189-196；および PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, innis et al., eds., Academic Press, Inc. (1990)に記載されている。
【００５１】
ポリペプチドおよびその断片
本発明は、自然発生したもの、または組換えＤＮＡ技術に関する手法といった様々な技術によって製造されたものを含む、様々な形態におけるポリペプチドおよびその断片を包含する。例えば、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドをコードするＤＮＡは、部位特異的突然変異、ランダム突然変異およびインビトロの核酸合成を含むインビトロ突然変異誘発によって配列番号１から派生したものであってよい。そのような形態は、誘導体、変種およびオリゴマー並びに融合タンパク質またはその断片を含むが、これらに限定されない。
【００５２】
ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドは、上述された核酸配列によってコードされた全長タンパク質を含む。特に好ましいＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００５３】
本発明は、さらに、コラーゲン１Ａ１またはα−平滑筋アクチン生産の活性化またはヒト肺線維芽細胞からの筋線維芽細胞の発生といった、所望の生物学的活性を維持するＳＥＲＰＩＮＥ２のポリペプチドおよび断片を提供する。そのような断片は好ましくは可溶性ポリペプチドである。
【００５４】
さらに、異なる長さのポリペプチド断片も提供される。１つの実施形態において、好ましいＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチド断片は、アミノ酸配列の少なくとも６つの隣接するアミノ酸を含む。その他の実施形態において、好ましいＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチド断片は、配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、最大で少なくとも１００までの接触するアミノ酸を含む。これらのポリペプチドは可溶性形態において製造することができる。さらに、ポリペプチド断片は、抗体を生産において、免疫原として使用することができる。
【００５５】
本発明は、ＳＥＲＰＩＮＥ２およびその断片の変種を包含する。好ましくは、ＳＥＲＰＩＮＥ２の変種は、配列番号２との間で少なくとも５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を示すアミノ酸配列またはその断片を含む。そのような断片は、例えば、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または３７５のアミノ酸サイズであり得る。
【００５６】
パーセント同一性は、Devereuxらによって記述され(Nucl. Acids Res. 12:387, 1984)、ウィスコンシン遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）から利用可能であるＧＡＰコンピュータ・プログラム・バージョン６．０を使用して、配列情報を比較して決定することができる。ＧＡＰプログラムは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアライメント方法(J. Mol. Biol. 48:443, 1970)を、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎにより改定される通りに(Adv. Appl. Math 2:482, 1981)使用する。ＧＡＰプログラムのための好ましいデフォルトパラメーターは、（１）ヌクレオチドのための一成分比較マトリックス（同一の場合の値１および非同一の場合の値０を含む）およびGribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986の重みつき比較マトリックス（Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979に記載）、（２）それぞれの相違に対する３．０のペナルティー、およびそれぞれの相違におけるそれぞれの記号に対する付加的な０．１０のペナルティー；および（３）末端の相違に対してペナルティーはないことを含む。
【００５７】
ポリペプチドおよびその断片の製造
本発明のポリペプチドおよび断片の発現、単離および精製は、以下を含むがこれらに限定されない、任意の適切な技術によって達成することができる。
【００５８】
発現系
本発明は、ＳＥＲＰＩＮＥ２のＤＮＡを含む組み換えクローニングおよび発現ベクター、並びに組み換えベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。ＳＥＲＰＩＮＥ２のＤＮＡを含む発現ベクターは、当該ＤＮＡによってコードされたＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドまたは断片を調製するために使用することができる。ポリペプチドを製造する方法は、ポリペプチドをコードする組み換え発現ベクターが形質転換された宿主細胞を、ポリペプチドの発現を促進する条件の下で培養すること、その後、培養物から発現されたポリペプチドを回収することを含む。当業者は、発現されたポリペプチドを精製するための手順は、使用された宿主細胞のタイプ、ポリペプチドが膜結合型か宿主細胞から分泌されるような可溶性形態かといった因子によって変わることを理解するだろう。
【００５９】
任意の適切な発現システムを使用することができる。ベクターは、哺乳類、微生物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子に由来するものといった、適切な転写または翻訳の調節ヌクレオチド配列に実施可能に繋がった、本発明のＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドまたは断片をコードするＤＮＡを含む。調節配列の例は、転写プロモーター、オペレーターまたはエンハンサー、ｍＲＮＡのリボソームの結合部位、および転写および翻訳の開始および終了を制御するのに適切な配列を含む。調節配列がＤＮＡ配列に機能的に関係する場合、ヌクレオチド配列は実施可能に繋がっている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を制御する場合、プロモーターヌクレオチド配列はＤＮＡ塩基配列に実施可能に繋がっている。所望の宿主細胞において複製する能力を付与する複製起点、および形質転換体の同定のための選択遺伝子が、一般に発現ベクターに組込まれる。
【００６０】
さらに、適切なシグナルペプチド（本来または異種性）をコードする配列を発現ベクターに組込むことができる。シグナルペプチド（分泌のリーダー）のためのＤＮＡ配列を、本発明の核酸配列にインフレームで融合することができ、これにより、ＤＮＡは最初に転写され、ｍＲＮＡが翻訳され、シグナルペプチドを含む融合タンパク質が得られる。意図された宿主細胞において機能的なシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外の分泌を促進する。シグナルペプチドは、細胞からポリペプチドの分泌の際にポリペプチドから切断される。
【００６１】
ポリペプチドの発現に適している宿主細胞は、原核生物、酵母またはより高等な真核細胞を含む。哺乳類または昆虫の細胞は、宿主細胞としての使用に関して一般に好まれる。細菌、真菌、酵母および哺乳類の細胞の宿主とともに使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)に記載されている。無細胞翻訳系を使用して、ここに開示されたＤＮＡ構築物に由来したＲＮＡを使用してポリペプチドを製造することもできる。
【００６２】
原核生物系
原核生物はグラム陰性またはグラム陽性の生物を含む。形質転換に適した原核生物の宿主細胞は、例えば、Ｅ．コリ、バチルス・サブチリス、サルモネラ・ティフィムリウム、並びにシュードモナス属、ストレプトマイセス属およびスタフィロコッカス属内の様々なその他の種を含む。Ｅ．コリのような原核生物宿主細胞において、ポリペプチドは、原核生物宿主細胞における組み換えポリペプチドの発現を容易にするために、Ｎ−端末のメチオニン残基を含み得る。Ｎ−端末Ｍｅｔは、発現された組み換えポリペプチドから切断することができる。
【００６３】
原核生物宿主細胞で使用される発現ベクターは、一般に１以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を付与するか、または独立栄養要求を提供するタンパク質をコードする遺伝子である。原核生物の宿主細胞のための有用な発現ベクターの例は、クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）のような購入可能なプラスミドに由来したものを含む。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン抵抗性のための遺伝子を含んでおり、これにより、形質転換細胞を同定するための単純な手段を提供する。適切なプロモーターおよびＤＮＡ塩基配列がｐＢＲ３２２ベクターに挿入される。その他の購入可能なベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)およびｐＧＥＭ１(Promega Biotec, Madison, Wis., USA)を含む。
【００６４】
組み換え原核生物宿主の細胞発現ベクターに一般に使用されるプロモーター配列は、ベータラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモータシステム(Chang et al., Nature 275:615, 1978; and Goeddel et al., Nature 281:544, 1979)、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム(Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; and EP-A-36776)およびｔａｃプロモーター(Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982)を含む。特に有用な原核生物の宿主細胞発現システムは、ファージｌａｍｂｄａＰＬプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性リプレッサー配列を用いる。ｌａｍｂｄａＰＬプロモーターの誘導体を取り込む、アメリカンタイプカルチャーコレクションから利用可能なプラスミドベクターは、プラスミドｐＨＵＢ２（Ｅ．コリ種ＪＭＢ９、ＡＴＣＣ３７０９２中に存在）およびｐＰＬｃ２８（Ｅ．コリＲＲ１、ＡＴＣＣ５３０８２に存在）を含む。
【００６５】
ＳＥＲＰＩＮＥ２のＤＮＡは、通常の細菌の発現ベクターのマルチクローニングサイトにインフレームでクローニングされる。理想的には、ベクターはクローニング部位の上流に誘導可能なプロモーターを含み、誘導物の付加は、研究者の選択した時に、組換え型タンパク質の高いレベルの生産をもたらす。あるタンパク質について、プロモーターと関心ある遺伝子との間に、融合パートナー（例えばヘキサヒスチジン）をコードするコドンを取り込むことで、発現レベルを上昇させることができる。得られる「発現プラスミド」は、Ｅ．コリの様々な株において増幅することができる。
【００６６】
組換え型タンパク質の発現のために、細菌細胞は、予め決めた光学濃度に達するまで増殖培地中で増殖される。その後、例えば、タンパク質の発現を活性化するＩＰＴＧ（イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）の添加により、ｌａｃオペレーター／プロモーターを含むプラスミドから、組換え型タンパク質の発現が誘導される。誘導（典型的に１−４時間）の後、例えば、遠心分離機における４℃、２０分間および５，０００ＸＧによるペレッティングにより、細胞を収集する。
【００６７】
発現されたタンパク質の回収のために、ペレットにした細胞は、１０倍量の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）／１ＭのＮａＣｌで再懸濁し、その後、フレンチプレスに２または３回通すことができる。最も高度に発現した組換え型タンパク質は、封入体として知られる不溶性の凝集物を形成する。封入体は、遠心分離機において４℃、２０分および５，０００ＸＧでペレッティングすることにより可溶性タンパク質から精製することができる。封入体ペレットは、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）／１％のトリトンＸ−１００で洗浄し、その後、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）／８Ｍの尿素／０．１ＭのＤＴＴに溶解する。溶解しない任意の物質は、遠心分離（２０℃、２０分および１０，０００ＸＧ）によって除去される。関心あるタンパク質は、ほとんどの場合、得られる精製された上清中で最も豊富なタンパク質となると考えられる。このタンパク質は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）／５ｍＭのＣａＣｌ２／５ｍＭのＺｎ（ＯＡｃ）２／１ｍＭのＧＳＳＧ／０．１ｍＭのＧＳＨに対して透析することで、活性ある高次構造に「リフォールディング」することができる。リフォールディングの後に、イオン交換またはゲルろ過のような様々なクロマトグラフ法により精製を行うことができる。あるプロトコールでは、最初の精製はリフォールディングの前に実行することができる。例として、ヘキサヒスチジン標識した融合タンパク質は固定化ニッケルにて部分的に精製することができる。
【００６８】
先の精製およびリフォールディングの手順では、タンパク質は封入体から最も取り出されると考えられるものの、タンパク質精製の当業者は、多くの組換え型タンパク質は、細胞ライセートの可溶性画分から最も精製されると認識するだろう。これらの場合において、リフォールディングはしばしば必要ではなく、標準的クロマトグラフ法による精製を直接実行することができる。
【００６９】
酵母系
あるいは、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドは、酵母宿主細胞、好ましくはサッカロマイセス属（例えばＳ．セレビジエ）にて発現させることができる。ピチアまたはクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）のようなその他の酵母の種類も使用することができる。酵母ベクターは、しばしば、２μｍ酵母プラスミドからの複製起点の配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終了のための配列および選択可能マーカー遺伝子を含むだろう。酵母ベクターに適したプロモーター配列は、特に、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ(Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980)、またはその他の解糖系酵素(Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; and Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978)、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフクルトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホ−グルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのためのプロモーターを含む。酵母発現で使用されるその他の適切なベクターおよびプロモーターは、さらにHitzeman, EPA-73,657に記載されている。その他の代替は、グルコース抑制可能なＡＤＨ２プロモーターであり、これはRussellら (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982)およびBeierら(Nature 300:724, 1982)により記述されている。酵母およびＥ．コリの両方において複製可能なシャトルベクターは、Ｅ．コリにおける選択および複製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ塩基配列（Ａｍｐｒ遺伝子および複製起点）を上記の酵母ベクターに挿入することで構築することができる。
【００７０】
酵母アルファ因子リーダー配列を、ポリペプチドの分泌の誘導のために使用することができる。アルファ因子リーダー配列は、プロモーター配列と構造遺伝子配列の間にしばしば挿入される。Kurjan et al., Cell 30:933, 1982およびBitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984を参照されたい。酵母宿主からの組み換えポリペプチドの分泌を容易にするのに適したその他のリーダー配列は当業者に既知である。リーダー配列は１以上の制限部位を含むためにその３’末端付近を改変することができる。これは、構造遺伝子に対するリーダー配列の融合を容易にするだろう。
【００７１】
酵母形質転換プロトコールは当業者に既知である。そのような１つのプロトコールはHinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978に記載されている。Ｈｉｎｎｅｎらのプロトコールは、０．６７％の酵母窒素ベース、０．５％のカザミノ酸、２％のグルコース、１０ｍｇ／ｍｌのアデニンおよび２０ｍｇ／ｍｌのウラシルを含む選択培地においてＴｒｐ＋形質転換体を選択する。
【００７２】
ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクターによって形質転換された酵母宿主細胞は、「豊富な」培地における発現の誘導のために増殖することができる。豊富な培地の一例は、１％の酵母抽出物、２％のペプトン、および１％のグルコースから成り、８０ｍｇ／ｍｌのアデニンおよび８０ｍｇ／ｍｌのウラシルが添加された培地である。培地においてグルコースが枯渇すると、ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除が生じる。
【００７３】
哺乳類系または昆虫系
哺乳類または昆虫の宿主細胞培養物システムも、組み換えＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドを発現するために使用することができる。昆虫細胞の異種性タンパク質の生産のためのＢａｃｃｕｌｏｖｉｒｕｓシステムは、Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)に概説されている。哺乳類起源の樹立細胞株も使用することができる。適切な哺乳類の宿主細胞株の例は、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）(Gluzman et al., Cell 23:175, 1981)、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、およびアフリカミドリザル腎臓細胞線ＣＶ１に由来したＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）（McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991)に記載）を含む。
【００７４】
哺乳類細胞へＤＮＡを導入する確立された方法は、Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69に記載されている。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ脂質試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ脂質試薬といった購入可能な試薬を使用する付加的なプロトコールを、細胞をトランスフェクトするために使用できる(Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1987)。さらに、エレクトロポレーションは、哺乳類細胞をトランスフェクトするために、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されているように従来の手順を使用して使用することができる。安定した形質転換体の選択は、例えば細胞毒に対する抵抗性のように、当該分野において既知の方法を使用して行なうことができる。Kaufman et al., Meth. in Enzymology 185:487-511, 1990には、ジヒドロ葉還元酵素（ＤＨＦＲ）抵抗性といったいくつかの選択スキームが記載されている。ＤＨＦＲ選択に適している宿主種は、ＤＨＦＲを欠損するＣＨＯ種ＤＸ−Ｂ１１とすることができる(Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980)。ＤＨＦＲ ｃＤＮＡを発現するプラスミドは、種ＤＸ−Ｂ１１へ導入することができ、プラスミドを含む細胞のみを適切な選択培地にて増殖させることができる。発現ベクターに組込むことができる選択可能マーカーのその他の例は、Ｇ４１８およびハイグロマイシンＢといった抗生物質耐性を付与するｃＤＮＡを含む。ベクターを保持する細胞は、これらの化合物に対する抵抗性に基づいて選択することができる。
【００７５】
哺乳類宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳の制御配列は、ウィルスゲノムから切除することができる。一般に使用されるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）およびヒト・サイトメガロウイルスに由来する。ＳＶ４０ウィルスゲノムに由来したＤＮＡ塩基配列、例えば、ＳＶ４０オリジン、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位は、哺乳類の宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のためのその他の遺伝要素を提供するために使用することができる。ウイルスの初期および後期プロモーターは特に有用である。なぜならば、それらは、断片としてウィルスゲノムから容易に得ることができ、それはウイルスの複製起点を含むことができるためである(Fiers et al., Nature 273:113, 1978; Kaufman, Meth. in Enzymology, 1990)。ＳＶ４０のウイルスの複製起点部位に位置する、ＨｉｎｄＩＩＩサイトからＢｇｌＩサイトに伸びる約２５０ｂｐ配列が含まれる限り、より小さい、またはより大きなＳＶ４０断片も使用することができる。
【００７６】
哺乳類発現ベクターからの異種遺伝子の発現が改善されることが示された付加的なコントロール配列は、ＣＨＯ細胞に由来した発現増大配列因子（ＥＡＳＥ）のような因子(Morris et al., Animal Cell Technology, 1997, pp. 529-534 and PCT Application WO 97/25420)およびトリパータイトリーダー（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｌｅａｄｅｒ）（ＴＰＬ）およびアデノウイルス２由来のＶＡ遺伝子ＲＮＡ(Gingeras et al., J. Biol. Chem. 257:13475-13491, 1982)を含む。ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列は、ジシストロニック（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）なｍＲＮＡが効率的に翻訳されることを可能にする(Oh and Sarnow, Current Opinion in Genetics and Development 3:295-300, 1993; Ramesh et al., Nucleic Acids Research 24:2697-2700, 1996)。ジシストロニックなｍＲＮＡの一部としての異種起源のｃＤＮＡの発現および続く選択可能マーカー（例えばＤＨＦＲ）のための遺伝子の発現は、宿主のトランスフェクト可能性および異種起源のｃＤＮＡの発現を改善することが示された(Kaufman, Meth. in Enzymology, 1990)。ジシストロニックなｍＲＮＡを使用する典型的な発現ベクターは、ｐＴＲ−ＤＣ／ＧＦＰ（Mosser et al., Biotechniques 22:150-161, 1997）およびｐ２Ａ５Ｉ（Morris et al., Animal Cell Technology, 1997, pp. 529-534）である。
【００７７】
哺乳類宿主細胞にて使用されるその他の発現ベクターは、OkayamaおよびBergによって記述されるように構築することができる (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983)。また別の代替として、ベクターはレトロウイルスに由来するものとすることができる。付加的な有用な発現ベクターはｐＦＬＡＧ（登録商標）である。ＦＬＡＧ（登録商標）技術は、低分子量（１ｋＤ）で親水性のＦＬＡＧ（登録商標）マーカーペプチドの、ｐＦＬＡＧ（登録商標）発現ベクターによって発現された組み換えタンパク質のＮ末端への融合に集中する。
【００７８】
精製
本発明は、さらにポリペプチドおよびその断片を単離して精製する方法を含む。本発明に係る単離され且つ精製されたＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドは、上記の通り組み換え発現系によって製造でき、または天然の細胞から精製することができる。ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析において単一のタンパク質バンドが示されるように、実質的に精製することができる。ＳＥＲＰＩＮＥ２を製造する１つのプロセスは、ＳＥＲＰＩＮＥ２の発現を促進するのに十分な条件下で、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することを含む。その後、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドは、使用される発現系に依存して培地または細胞抽出液から回収される。
【００７９】
ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドの精製のための典型的な方法は当該分野において既知である。例えば、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドは、中空繊維ろ過、その後のヘパリン−セファロースカラムにおける再循環によって単離し、精製することができる（Howard et al., J. Biol. Chem. 261:684-689, 1986; Scott et al., J. Biol. Chem. 258:10439-10444, 1983; Scott et al., J. Biol. Chem. 258:4397-4403, 1983）。ＳＥＲＰＩＮＥ２に対する特定のポリクローナル抗体を使用したアフィニティークロマトグラフィー (Howard et al., 1986)を使用することもできる。
【００８０】
単離および精製
ここに使用されるような「単離され且つ精製された」という表現は、ＳＥＲＰＩＮＥ２は、例えば、組み換え宿主細胞培養物の精製物として、または非組み換えソースから精製された生成物として、その他の宿主ＤＮＡ、タンパク質またはポリペプチドと本質的に関連がないことを意味する。「単離され且つ精製された」ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質は、アルブミンのように、タンパク質のＳＥＲＰＩＮＥ２の精製を安定化させまたは支援するために、ＳＥＲＰＩＮＥ２に添加されたその他のタンパク質を含むことができる。ここに使用されるような「実質的に精製された」という用語は、ＳＥＲＰＩＮＥ２を含む混合物であって、特定の抗体を使用して除去できる既知のＤＮＡまたはタンパク質の存在を除けば、その他のＤＮＡ、タンパク質またはポリペプチドと本質的に関連がなく、実質的に精製されたＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質が生物学的活性を保つ混合物を意味する。「精製されたＳＥＲＰＩＮＥ２」という用語は、ここに記載されるように、ＳＥＲＰＩＮＥ２の「単離され且つ精製された」形態またはＳＥＲＰＩＮＥ２の「実質的に精製された」形態のいずれかを意味する。
【００８１】
ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質について「生物学的に活性」という用語は、ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質が、トロンビン、トリプシン、プラスミンおよびウロキナーゼのようなＳＥＲＰＩＮＥ２標的トリプシン様セリンプロテアーゼと関連させて、それらを不活性化することができることを意味する。
【００８２】
１つの好ましい実施形態において、組み換えポリペプチドまたは断片の精製は、ポリペプチドまたは断片の精製を助けるために、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドまたは断片の別のポリペプチドへの融合を使用して達成することができる。そのような融合パートナーは、ポリ−Ｈｉｓ、Ｆｃ成分またはその他の抗原同定ペプチドを含むことができる。
【００８３】
当業者に既知のように、任意の種の宿主細胞に関して、組み換えポリペプチドまたは断片を精製するための手順は、使用される宿主細胞の種といった因子および組み換えポリペプチドまたは断片が培地へ分泌されるかどうかによって異なるだろう。
【００８４】
一般に、組み換えＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドまたは断片は、分泌されなければ宿主細胞から単離し、または可溶性であり分泌されるならば培地もしくは上清から単離し、その後、１以上の濃縮、塩析、イオン交換、疎水的相互作用、親和性精製または体積排除クロマトグラフィーステップを行うことができる。これらのステップを達成する特定の方法に関して、培地は、最初に、購入可能なタンパク濃縮フィルター、例えばアミコンまたはミリポアＰｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮することができる。濃縮ステップに続いて、濃縮物は、ゲルろ過培地のような精製マトリックスに適用することができる。あるいは、陰イオン交換樹脂、例えばペンダント・ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは基体を使用することができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製において一般に使用されるその他の種とすることができる。あるいは、陽イオン交換ステップを使用することができる。適切な陽イオン交換体は、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスを含む。さらに、等電点電気泳動ステップを使用することができる。あるいは、疎水性相互作用クロマトグラフィーステップを使用することができる。適切なマトリックスは、樹脂に結合したフェニル基またはオクチル成分を含むことができる。さらに、選択的に組み換えタンパク質に結合するマトリックスを備えたアフィニティークロマトグラフィーを使用することができる。使用されるそのような樹脂の例は、ヘパリンカラム、レクチンカラム、色素カラムおよび金属をキレート化カラムである。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ培地（例えばペンダントメチル、オクチル、オクチルデシルまたはその他の脂肪性基を有するシリカゲルまたはポリマー樹脂）を使用する１以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ステップを、ポリペプチドをさらに精製するために使用することができる。前述の精製ステップのいくつかまたはすべては、様々な組み合わせにおいて、周知であり、単離され且つ精製された組み換えタンパク質を提供するために使用することができる。
【００８５】
細菌培養において製造された組み換えタンパク質は、宿主細胞の最初の破壊、遠心分離、不溶性ポリペプチドの場合には細胞ペレットからの抽出、または可溶性ポリペプチドの場合には上清液からの抽出、その後の１以上の濃縮、塩析、イオン交換、親和性精製または体積排除クロマトグラフィーステップにより通常単離される。最後に、ＲＰ−ＨＰＬＣを最終的な精製ステップのために使用することができる。微生物の細胞は、凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含む任意の都合のよい方法によって破壊できる。
【００８６】
さらに、発現されたポリペプチドを親和性精製するために、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドに対して得られたモノクローナル抗体といったＳＥＲＰＩＮＥ２結合タンパク質を含むアフィニティカラムを利用することが可能である。これらのポリペプチドは、従来技術を使用して、例えば高塩溶出緩衝液にてアフィニティカラムから除去し、その後、使用のためのより低塩の緩衝液に透析し、もしくは利用した親和性マトリックスに依存してｐＨまたはその他の成分を変更することにより除去し、または、本発明に由来したポリペプチドのような親和性成分の天然の基質を競合的に使用して除去することができる。
【００８７】
望ましい純度の程度は、タンパク質の意図された使用に依存する。例えば、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドがインビボで投与される場合、相対的に高い純度が望ましい。そのような場合、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析において、その他のタンパク質に対応するタンパク質バンドが検知できない程度にＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドは精製される。関係する分野の当業者は、ポリペプチドに対応する複数のバンドは、差異化糖鎖形成、差異化翻訳後修飾等によりＳＤＳ−ＰＡＧＥによって視覚化することができる。最も好ましくは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析における単一のタンパク質バンドによって示されるように、本発明のポリペプチドは本質的に均質に精製される。タンパク質バンドは、銀染色法、クマシーブルー染色または（タンパク質が放射性同位体で識別される場合）オートラジオグラフィーによって視覚化することができる。
【００８８】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の精製した製剤は、購入可能であり、本発明の方法において使用することができる。
【００８９】
ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニスト
本発明は、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストを包含する。ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、例えばＳＥＲＰＩＮＥ２のプロテアーゼ抑制機能を抑止することによりＳＥＲＰＩＮＥ２の機能を妨げる。好ましい実施形態において、アンタゴニストは、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２によって引き起こされるコラーゲン１Ａ１の発現をダウンレギュレートし、または減少させる。好ましい実施形態において、アンタゴニストは、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２によって引き起こされるα−平滑筋アクチンの発現をダウンレギュレートし、または減少させる。最も好ましくは、アンタゴニストは、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２によって引き起こされるコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現をダウンレギュレートし、または減少させる。好ましくは、ダウンレギュレーションは、肺線維芽細胞、最も好ましくはヒト肺線維芽細胞にて生じる。発現は、ＲＮＡの測定により直接測定することができ、または例えばタンパク質の測定により間接的に測定することができる。
【００９０】
そのようなアンタゴニストは、ＳＥＲＰＩＮＥ２に特異的に結合し、ＳＥＲＰＩＮＥ２を生物学的活性を阻害する抗体；ＳＥＲＰＩＮＥ２の発現を妨げるアンチセンス核酸ＲＮＡ；ＳＥＲＰＩＮＥ２の発現を妨げる小型干渉ＲＮＡ；ＳＥＲＰＩＮＥ２の反応中心ループに対応する小ペプチド；およびＳＥＲＰＩＮＥ２の小分子阻害剤を含む。
【００９１】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の候補アンタゴニストは、当該分野において既知の多数の技術および／または本願に開示される技術によって、トロンビン、トリプシン、プラスミンおよびウロキナーゼのようなトリプシン様セリンプロテアーゼのＳＥＲＰＩＮＥ２による阻害；インビトロでのコラーゲンおよび／またはα−平滑筋アクチンの発現の阻害；およびマウスモデルにおけるブレオマイシン誘導型線維症からの保護を妨げる能力といった機能についてスクリーニングすることができる。
【００９２】
抗体
１つの実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは抗体である。抗体は、合成、モノクローナルまたはポリクローナルであってよく、当該分野において周知の技術によって作ることができる。そのような抗体は、（非特異的結合とは反対に）抗体の抗原結合部位によって、特異的にＳＥＲＰＩＮＥ２に結合する。上述のような、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチド、断片、変種、融合タンパク質等は、免疫反応性の抗体の製造における免疫原として使用することができる。より特に、ポリペプチド、断片、変種、融合タンパク質等は、抗体の形成を誘発する抗原決定基またはエピトープを含む。
【００９３】
これらの抗原決定基またはエピトープは、線形または高次構造的（不連続）の何れかとすることができる。線形のエピトープはポリペプチドのアミノ酸の単一セクションからできており、高次構造的または不連続的エピトープは、タンパク質のフォールディングの際に、隣接するポリペプチド鎖の異なる領域由来のアミノ酸部分からできている(C. A. Janeway, Jr. and P. Travers, Immuno Biology 3:9 (Garland Publishing Inc., 2nd ed. 1996))。フォールディングしたタンパク質は複合の表面を有するため、利用可能なエピトープの数は非常に莫大である；しかしながら、タンパク質の立体配座および立体障害により、エピトープに実際に結合する抗体の数は利用可能なエピトープの数よりも小さい(C. A. Janeway, Jr. and P. Travers, Immuno Biology 2:14 (Garland Publishing Inc., 2nd ed. 1996))。エピトープは、当該分野において既知の任意の方法によって同定することができる。
【００９４】
したがって、本発明の１つの側面は、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドの抗原エピトープに関係がある。以下に詳細に記載されるように、そのようなエピトープは、抗体、特にモノクローナル抗体の作製に有用である。さらに、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドからのエピトープは、アッセイにおいて、研究試薬として使用することができ、培養されたハイブリドーマからのポリクローナルの血清または上清のような物質から特異的結合抗体を精製するために使用できる。そのようなエピトープまたはその変種は、固相法、ポリペプチドの化学的または酵素的分裂のような当該分野において周知の技術を使用して、または組み換えＤＮＡ技術を使用して製造することができる。
【００９５】
特異的にＳＥＲＰＩＮＥ２に結合し、標的プロテアーゼのその阻害を遮断する、ｓｃＦＶ断片を含む抗体は本発明に包含される。そのような抗体は、例えばVerbeke et al., J. Thromb. Haemost. 2:298-305, 2004およびBrooks et al., Clinical & Experimental Metastasis 18:445-453, 2001に記述される手法を使用して得ることができる。
【００９６】
本発明は、標的プロテアーゼのその阻害を遮断する、ＳＥＲＰＩＮＥ２に対するモノクローナル抗体を包含する。ＳＥＲＰＩＮＥ２に対する典型的な遮断型モノクローナル抗体は、Wagner et al., Biochemistry 27: 2173-2176, 1988およびBoulaftali et al. Blood First Edition Paper, prepublished online October 23, 2009; DOI 10.1182/blood-2009-04-217240に記載される。
【００９７】
特に、その標的プロテアーゼへのＳＥＲＰＩＮＥ２の結合を遮断するか、またはヘパリンへのＳＥＲＰＩＮＥ２の結合を遮断するモノクローナル抗体が好ましい。そのような抗体は、日常的なインビトロ結合アッセイを使用して、または例において述べられるアッセイを使用してスクリーニングすることができる。
【００９８】
１つの実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＥ２のプロテアーゼ相互作用ドメインへ結合するモノクローナル抗体が得られる。この抗体は、免疫原としてＳＥＲＰＩＮＥ２のプロテアーゼ相互作用ドメインを含む、完全なＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドまたはＳＥＲＰＩＮＥ２の断片を使用して得ることができる。抗体は、ＳＥＲＰＩＮＥ２と標的プロテアーゼとの相互作用を遮断するその能力について評価することができる。
【００９９】
抗体は、高い親和性および特異性で、標的に結合することができる。抗体結合部位がタンパク質間相互作用部位の近くに存在する場合、それらは相対的に大きな分子（〜１５０ｋＤａ）であり、立体的に２つのタンパク質（例えばＳＥＲＰＩＮＥ２およびその標的プロテアーゼ）間の相互作用を阻害することができる。したがって、１つの実施形態において、本発明は、ＳＥＲＰＩＮＥ２の「反応中心ループ」（ＲＣＬ）に結合し、同族のプロテアーゼへの結合を阻害し、ＳＥＲＰＩＮＥ２によるその不活性化を妨げることができる抗体を包含する。本発明は、直接プロテアーゼと接触するＲＣＬ残基に結合する抗体を包含する。本発明は、ＳＥＲＰＩＮＥ２−プロテアーゼ結合部位に対して近接した位置におけるエピトープに結合する抗体をさらに包含する。
【０１００】
様々な実施形態において、本発明は、ヘパリンのようなＳＥＲＰＩＮＥ２補因子と接触する残基に結合する抗体、またはＳＥＲＰＩＮＥ２抑制活性の補因子介在増強を妨げることによりＳＥＲＰＩＮＥ２抑制活性を減じる補因子結合部位の近接の残基に結合する抗体を含む。
【０１０１】
様々な実施形態において、本発明は、分子間相互作用（例えばタンパク質−タンパク質間相互作用）を妨げる抗体、並びに分子の相互作用（例えば分子内構造変化）を混乱させる抗体を包含する。したがって、ＳＥＲＰＩＮＥ２のＲＣＬ、好ましくはＳＥＲＰＩＮＥ２のアミノ酸３４８〜３６４またはアミノ酸３４８〜３７４に結合し、プロテアーゼ結合に続いて「ベータシートＡ」へのループの挿入を妨げ、および付着したプロテアーゼの歪みおよび続く分解に干渉することによりＳＥＲＰＩＮＥ２抑制活性を妨げる抗体は本発明に包含される。同様に、占有されていないＳＥＲＰＩＮＥ２のＲＣＬに「挿入された」立体配座を適応させることを強制し、プロテアーゼ結合部位をプロテアーゼ結合から隔離し、利用不可能に維持することによりｓｅｒｐｉｎ活性に干渉する抗体は、本発明に包含される。
【０１０２】
特異的標的に結合する抗体の能力は、関心ある標的に特異的に様々な種の機能的な分子を送達するために開発されている。そのような分子の例は、毒素、サイトカイン、放射性同位元素、および小分子薬剤またはプロドラッグを含む。そのような場合、これらの分子は、共有結合性化学薬品またはペプチドリンカーを介して抗体に付着してよく、またはサイトカインのようなポリペプチドの場合には、それらは、ペプチド結合によって直接付着してもよい。同様に、ＳＥＲＰＩＮＥ２を標的とする抗体は、特異的にそのプロテアーゼ阻害活性を不活性化する分子を送達するために使用することができる。１つの実施形態において、本発明は、ＳＥＲＰＩＮＥ２に変異したプロテアーゼを直接送達する抗体を包含する。この変異したプロテアーゼは、プロテアーゼ活性を保ち、ＳＥＲＰＩＮＥ２を持った共有結合のエステル結合を形成し、ＲＣＬを分断し、ベータシートへＲＣＬの挿入を誘導することができるが、それ自体の本来の基質に結合（および分断）する能力を維持しない。ＳＥＲＰＩＮＥ２がその同族のプロテアーゼに１：１のモル比で結合し、且つＳＥＲＰＩＮＥ２はプロテアーゼに結合し不活性化すると、それ自体を破壊するため、抗体によるＳＥＲＰＩＮＥ２へのこの変異したプロテアーゼの送達は有効にＳＥＲＰＩＮＥ２の供給を消費し、本来の同族プロテアーゼの活性レベルを増大することができる。変異したプロテアーゼは、同時翻訳のまたは翻訳後の手段によって抗体に付着することができる。
【０１０３】
抗体は、ＳＥＲＰＩＮＥ２の生物学的活性を遮断する能力またはリガンドへのＳＥＲＰＩＮＥ２の結合について、および／またはその他の特性についてスクリーニングすることができる。例えば、抗体は、トロンビン、トリプシン、プラスミンおよびウロキナーゼのようなトリプシン様セリンプロテアーゼをインビトロで結合し且つ遮断する能力についてスクリーニングすることができる（Wagner et al., Biochemistry 27: 2173-2176, 1988を参照されたい）。さらに、抗体は、ここに記載される手法を用いて、筋線維芽細胞形成を遮断するための、または高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露されたヒト肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１および／またはα−平滑筋アクチンの発現を阻害するための能力についてスクリーニングすることができる。さらに、Yaekashiwa et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156:1937-1944 (1997)およびDohi et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162:2302-2307 (2000)に記載されるように、マウスモデルを使用して、ブレオマイシン誘導型肺線維症に対してインビボで保護する能力についてスクリーニングすることができる。
【０１０４】
ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドのエピトープによって誘発することができる抗体に関して、エピトープが単離されている場合であっても、ポリペプチドの一部として残っている場合であっても、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方は下記に述べられるような従来技術によって作製することができる。
【０１０５】
本発明のこの側面において、ＳＥＲＰＩＮＥ２およびＳＥＲＰＩＮＥ２のアミノ酸配列に基づくペプチドを、ＳＥＲＰＩＮＥ２に特異的に結合する抗体を作製するために利用することができる。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、その断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖｓ）、単一ドメイン抗体断片（ＶＨＨまたはＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ）、二価抗体断片（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、並びに任意の組換え型のおよび合成により作製された結合パートナーを含むことを意味する。
【０１０６】
抗体は、約１０７Ｍ−１以上のＫａでＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドに結合する場合、特異的に結合していると定義される。結合パートナーまたは抗体の親和性は、例えばScatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949)に記載される従来技術を使用して、容易に決定することができる。
【０１０７】
ポリクローナル抗体は、当該分野において周知である手順を使用して、様々な供給源、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスまたはラットから容易に作製することができる。一般に、精製されたＳＥＲＰＩＮＥ２またはＳＥＲＰＩＮＥ２のアミノ酸配列に基づくペプチドは、適切に結合させて、典型的に注射によって宿主動物に投与される。ＳＥＲＰＩＮＥ２の免疫原性は、アジュバント、例えばフロインドの完全または不完全アジュバントを使用して、増強することができる。ブースター免疫化に続いて、血清の小標本を採取し、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドに対する反応性に関して試験する。そのような測定に有用な様々なアッセイの例は、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988に記載されるもの、並びに向流免疫電気泳動法（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、ラジオ免疫沈殿、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、およびサンドイッチアッセイといった手法を含む（米国特許４，３７６，１１０号および４，４８６，５３０号を参照されたい）。
【０１０８】
モノクローナル抗体は容易に周知の手順を使用して作製することができる。例えば、米国特許第３２，０１１号、第４，９０２，６１４号、第４，５４３，４３９号および第４，４１１，９９３号に記載される手法、Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKeam, and Bechtol (eds.), 1980を参照されたい。
【０１０９】
例えば、マウスのような宿主動物に対し、少なくとも１回、好ましくは少なくとも２回、約３週間の間隔で、単離されおよび精製されたＳＥＲＰＩＮＥ２または結合型ＳＥＲＰＩＮＥ２ペプチド、例えばアミノ酸３４８〜３６４またはアミノ酸３４８〜３７４を含むまたはそれから成るペプチドを、任意にアジュバントの存在下で、腹腔内に注入することができる。その後、マウス血清を従来のドットブロット技術または抗体捕獲（ＡＢＣ）によって分析し、どの動物が融合において最良か決定する。約２〜３週間後に、ＳＥＲＰＩＮＥ２または結合型ＳＥＲＰＩＮＥ２ペプチドをマウスの静脈内に注入してブーストする。その後、マウスを犠牲にし、確立したプロトコールに従って、脾臓細胞をＡｇ８．６５３（ＡＴＣＣ）といった市販される髄腫細胞と融合させる。簡潔には、ミエローマ細胞を培地で数回洗浄し、１つのミエローマ細胞に対して約３つの脾臓細胞の比率でマウス脾臓細胞と融合させる。融合剤は、当該分野において使用される任意の適した薬剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でありえる。融合物は、融合細胞の選択的な増殖を可能にする培地を含むプレートにまかれる。その後、融合した細胞を約８日間増殖させる。得られたハイブリドーマからの上清を収集し、ヤギ抗マウス一次抗体で覆われたプレートに添加する。洗浄後、標識が付されたＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドといった標識をそれぞれ十分に添加し、その後インキュベーションする。続いて、陽性ウェルを発見することができる。陽性クローンをバルクの培養液で増殖させ、上清をプロテインＡカラム（ファルマシア）で精製する。
【０１１０】
本発明のモノクローナル抗体は、例えばAlting-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990)に記載される代替技術を使用して製造することができる。当該文献は本願に援用される。同様に、結合パートナーは、組み換えＤＮＡ技術を使用して、特異的結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を組み込むよう構築することができる。そのような技術はLarrick et al., Biotechnology, 7:394 (1989)に記載される。
【０１１１】
それらは従来技術によって製造することができる、そのような抗体の抗原結合性フラグメントも本発明に包含される。そのような断片の例は、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片を含むがこれらに限定されない。遺伝子工学技術によって生産された抗体断片および誘導体も提供される。
【０１１２】
本発明のモノクローナル抗体は、キメラ抗体、例えばマウスのモノクローナル抗体のヒト化バージョンを含む。そのようなヒト化抗体は、既知の技術によって作製することができ、抗体がヒトに投与される場合、免疫原性の低下という長所を示す。１つの実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体は、マウスの抗体の可変領域（またはその単なる抗原結合部位）およびヒト抗体に由来した定常領域を含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体に由来した可変領域断片（抗原結合部位を欠く）を含み得る。キメラの、およびさらに操作された抗体の製造のための手順は、Riechmann et al. (Nature 332:323, 1988)、Liu et al. (PNAS 84:3439, 1987)、Larrick et al. (Bio/Technology 7:934, 1989)およびWinter and Harris (TIPS 14:139, May, 1993)に記載される手順を含む。抗体を遺伝子組換えにより得る手順は、英国特許第２，２７２，４４０号、米国特許第５，５６９，８２５号および第５，５４５，８０６号に見ることができる。
【０１１３】
遺伝子工学的方法によって製造された抗体、例えばヒト部分および非ヒト部分の双方を含み、標準的組み換えＤＮＡ技術を使用して作ることができるキメラのおよびヒト化されたモノクローナル抗体を使用することができる。そのようなキメラのおよびヒト化されたモノクローナル抗体は、当該分野において既知の標準的なＤＮＡ技術を用いて遺伝子工学によって製造することができ、例えばＲｏｂｉｎｓｏｎらによる国際公開番号ＷＯ８７／０２６７１；Ａｋｉｒａらによるヨーロッパ特許出願０１８４１８７；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．によるヨーロッパ特許出願０１７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎらによるヨーロッパ特許出願０１７３４９４；ＮｅｕｂｅｒｇｅｒらによるＰＣＴ国際公開ＷＯ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙらによる米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙらによるヨーロッパ特許出願０１２５０２３；BetterらによるScience 240:1041 1043, 1988；LiuらによるPNAS 84:3439 3443, 1987；LiuらによるJ. Immunol. 139:3521 3526, 1987；SunらによるPNAS 84:214 218, 1987；NishimuraらによるCanc. Res. 47:999 1005, 1987；Woodらによる Nature 314:446 449, 1985；およびShawらによるJ. Natl. Cancer Inst. 80:1553 1559, 1988；Morrison, S. Lによる Science 229:1202 1207, 1985；Oiらによる BioTechniques 4:214, 1986；Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５，２２５，５３９号；JonesらによるNature 321:552 525, 1986；VerhoeyanらによるScience 239:1534, 1988；およびBeidler らによるJ. Immunol. 141:4053 4060, 1988に記載の方法を使用することができる。
【０１１４】
合成および半合成抗体に関して、抗体断片、アイソタイプスイッチング抗体（ｉｓｏｔｙｐｅ ｓｗｉｔｃｈｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ヒト化抗体（例えばマウス−ヒト、ヒト−マウス）、ハイブリッド、複数の特異性を有する抗体、および完全に合成された抗体様分子を含むが、これらに限定されないと意図される。
【０１１５】
好ましい実施形態において、アンタゴニストは、ＳＥＲＰＩＮＥ２の活性部位（すなわち反応中心ループ）を特異的に認識する抗体である。治療の適用のために、ヒトの定常領域および可変領域を有する「ヒト」モノクローナル抗体は、抗体に対する患者の免疫反応を最小化するためにしばしば好まれる。そのような抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含む遺伝子組み換え動物を免疫することで得ることができる。Jakobovits et al. Ann NY Acad Sci 764:525-535 (1995)を参照されたい。
【０１１６】
ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドに対するヒトモノクローナル抗体は、対象のリンパ細胞に由来するｍＲＮＡから作製された免疫グロブリン軽鎖および重鎖ｃＤＮＡを使用して、ＦａｂファージディスプレーライブラリーまたはｓｃＦｖファージディスプレーライブラリーのようなコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーを構築することで作製することができる。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらによるＰＣＴ公報ＷＯ９２／０１０４７；Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581 597；およびGriffths et al. (1993) EMBO J 12:725 734を参照されたい。さらに、抗体可変領域のコンビナトリアルライブラリーは、既知のヒト化抗体を変異することで得ることができる。例えば、ＳＥＲＰＩＮＥ２に結合することが既知のヒト化抗体の可変領域は、例えば無作為に突然変異により変更されたオリゴヌクレオチドを使用して変異を導入することができ、その後ＳＥＲＰＩＮＥ２への結合についてスクリーニングすることができる変異した可変領域のライブラリーを作製できる。免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ領域内のランダムな突然変異生成を誘導する方法、重鎖および軽鎖を無作為に交叉させ、対を形成さえる方法およびスクリーニング法は、例えば、ＢａｒｂａｓらによるＰＣＴ公報ＷＯ９６／０７７５４、Barbas et al. (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4457 446に見ることができる。
【０１１７】
免疫グロブリンライブラリーは、好ましくは線状ファージに由来するディスプレイパッケージの集団によって発現させ、抗体ディスプレイライブラリーを形成することができる。抗体ディスプレイライブラリーの取得に特に使用できる方法および試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒらによる米国特許第５，２２３，４０９号；ＫａｎｇらによるＰＣＴ出願ＷＯ９２／１８６１９；ＤｏｗｅｒらによるＰＣＴ出願ＷＯ９１／１７２７１；ＷｉｎｔｅｒらによるＰＣＴ出願ＷＯ９２／２０７９１；ＭａｒｋｌａｎｄらによるＰＣＴ出願ＷＯ９２／１５６７９；ＢｒｅｉｔｌｉｎｇらによるＰＣＴ出願ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらによるＰＣＴ出願ＷＯ９２／０１０４７；ＧａｒｒａｒｄらによるＰＣＴ出願ＷＯ９２／０９６９０；ＬａｄｎｅｒらによるＰＣＴ出願ＷＯ９０／０２８０９；Fuchsらによる(1991) Bio/Technology 9:1370 1372；Hay らによる(1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81 85；Huseらによる (1989) Science 246:1275 1281；Griffthsらによる (1993)同上；Hawkinsらによる (1992) J Mol Biol 226:889 896；Clacksonらによる (1991) Nature 352:624 628；Gram らによる (1992) PNAS 89:3576 3580；Garrad らによる(1991) Bio/Technology 9:1373 1377；Hoogenboom らによる (1991) Nuc Acid Res 19:4133 4137；およびBarbas らによる (1991) PNAS 88:7978 7982に見ることができる。一旦ディスプレイパッケージ（例えば線状ファージ）の表面に表示されると、抗体ライブラリーは、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドに結合する抗体を発現するパッケージを同定し単離するためにスクリーニングされる。好ましい実施形態において、ライブラリーの主要なスクリーニングは、固定化ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドによるパニングに関与し、固定化ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドに結合する抗体を示すディスプレイパッケージが選択される。
【０１１８】
有機的およびペプチド小分子阻害剤
本発明のその他の実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＥ２の活性部位（すなわち反応中心ループ）に結合する能力の存在に基づいてＳＥＲＰＩＮＥ２のためのリガンドとして設計された、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはペプチドミメティクスであるアンタゴニストが使用される。インテグリンのためのリガンドとしてのそのような分子のデザインは、例えば、Pierschbacher et al., J. Cell. Biochem. 56:150-154 (1994)、Chorev et al. Biopolymers 37:367-375 (1995)、Pasqualini et al., J. Cell. Biol. 130:1189-1196 (1995)およびSmith et al., J. Biol, Chem, 269:32788-32795 (1994)に例証される。
【０１１９】
反応中心ループに対応するアミノ酸ペプチドを使用するＳＥＲＰＩＮＥ２の不活性化のための典型的な手順は、Eitzman et al., J. Cin. Invest. 95:2416-2420, 1995、Bjork et al., J. Biol. Chem. 267:1976-1982, 1992およびSchulze et al., Eur. J. Biochem. 194:51-56, 1990に提供される。
【０１２０】
本発明のその他の実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＥ２活性を不活性化または抑制する低分子量有機分子であるアンタゴニストが使用される。ＳＥＲＰＩＮＥ２の不活性化のための低分子量有機分子の使用のための典型的な手順は、Brooks et al., Anticancer Drugs 15:37-44, 2004および米特許第７，３６８，４７１号、第７，２５９，１８２号および第６，５９９，９２５号に提供され、これらはＳＥＲＰＩＮＥ１の不活性化のための低分子量有機分子を提供する。
【０１２１】
アンチセンス核酸分子
本発明のある実施形態において、アンチセンス核酸分子はＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストとして使用される。アンチセンス核酸分子は、標的タンパク質の産生を抑制するためのヌクレオチドの特異的な配列に結合するように設計された核酸の相補的なオリゴヌクレオチド鎖である。
【０１２２】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によれば、ＤＮＡの断片（配列番号１）を含む。そのような断片は、一般に、少なくとも約１４のヌクレオチド、好ましくは約１４から約３０のヌクレオチドを含む。所定のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを得る能力は、例えば、Stein and Cohen (Cancer Res. 48:2659, 1988)およびvan der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988)に記載される。
【０１２３】
アンチセンスＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドは、Kim and Loh, Mol. Biol. Cell. 17:789-798, 2006およびSawa et al., J. Biol. Chem. 269:14149-14152, 1994に記載されるように、ＳＥＲＰＩＮＥ２発現を阻害するために作製し使用することができる。
【０１２４】
これらの成分をコードするコード鎖配列が与えられると、アンチセンス核酸は、ワトソンおよびクリックの塩基対の規則に従って設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ｍＲＮＡの全コード領域に相補的にすることができるが、より好ましくは、ｍＲＮＡのコーディングまたは非コーディング領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドとできる。例えば、アンチセンスのオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に対して相補的にできる。アンチセンスのオリゴヌクレオチドは、例えば、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０の長さのヌクレオチドにできる。アンチセンス核酸は、当該分野において既知の手法を使用して化学合成および酵素の結紮反応を使用して構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然のヌクレオチドを使用して、または分子の生物学的安定性を増大するように若しくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成された二重鎖の物理的安定性を増大するように設計された様々に修飾されたヌクレオチドを使用して（例えば、ホスホロチオネート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる）、化学的に合成できる。アンチセンス核酸を得るために使用することができる修飾されたヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキノシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、キノシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローン化された発現ベクターを使用して（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、関心のある標的核酸に対するアンチセンス方向になるだろう）、生物学的に製造することができる。
【０１２５】
標的核酸配列へのアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合は、ＲＮＡｓｅＨによるｍＲＮＡの増強された分解、スプライシングの阻害、転写または翻訳の早期終止を含むいくつかの手段の１つにより、またはその他の手段により、タンパク質発現を遮断または阻害する二重鎖の形成をもたらす。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、したがって、ＳＥＲＰＩＮＥ２の発現を遮断するために使用することができる。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、さらに、改変された糖−リン酸ジエステル骨格を有するオリゴヌクレオチド（または、ＷＯ９１／０６６２９に記載されるようなその他の糖結合）を含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼに強い。耐性のある糖結合を有するそのようなオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であり（すなわち、酵素の分解に耐性があり）、しかし、標的ヌクレオチド配列に結合することができる配列特異性を維持する。
【０１２６】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのその他の例は、ＷＯ９０／１０４４８に記載されるような有機成分、およびポリ−（Ｌ−リジン）のような標的核酸配列のためのオリゴヌクレオチドの親和性を増大するその他の成分に共有結合するオリゴヌクレオチドを含む。またさらに、挿入剤、例えばエリプティシン（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ）およびアルキル化剤または金属複合体をセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合し、標的ヌクレオチド配列に対するアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を改変することができる。
【０１２７】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、例えばリポフェクション、ＣａＰＯ４介在ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子導入方法により、またはエプスタインバーウイルスのような遺伝子導入ベクターの使用により、標的核酸配列を含む細胞に導入することができる。
【０１２８】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、適切なレトロウイルスベクターにセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを挿入し、その後細胞をインビボまたはエクスビボのいずれかで挿入された配列を含むレトロウイルスベクターに接触させることで、標的核酸配列を含む細胞に導入される。適切なレトロウイルスベクターは、マウスレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶ由来のレトロウイルス）またはＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５ＢおよびＤＣＴ５Ｃと名付けられる二重コピーベクター（ＰＣＴ出願米国番号第９０／０２６５６号を参照されたい）を含む。
【０１２９】
さらに、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９１／０４７５３に記載されたように、リガンド結合分子との結合の形成により標的ヌクレオチド配列を含む細胞へ導入することができる。適切なリガンド結合分子は、細胞表面レセプタ、成長因子、その他のサイトカイン、または細胞表面レセプタに結合するその他のリガンドを含むが、これらに限定されない。好ましくは、リガンド結合分子の結合は、実質的に、対応する分子または受容体に結合するリガンド結合分子の能力に影響を与えず、またはセンスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその結合したバージョンの細胞への侵入を遮断しない。
【０１３０】
あるいは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９０／１０４４８に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成によって標的核酸配列を含む細胞へ導入することができる。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性リパーゼによって細胞内で分離される。
【０１３１】
アンチセンスアンタゴニストは、ＲＮＡのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドとして提供することができる（例えば、Murayama et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:109-114 (1997)参照）。アンチセンス遺伝子もまた、ウイルスベクター、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（例えばJi et al., J. Viral Hepat. 4:167-173 (1997)参照）；アデノ関連性ウイルス（例えば、Xiao et al. Brain Res. 756:76-83 (1997)参照）；またはＨＶＪ（センダイウイルス）−リポソーム遺伝子運搬システムを含むが、これらに限定されないその他のシステム（例えばKaneda et al. Ann, N.Y. Acad. Sci. 811:299-308 (1997)参照）；「ペプチドベクター」（例えばVidal et al. CR Acad. Sci III 32):279-287 (1997) 参照参照）；エピソームまたはプラスミドベクターにおける遺伝子（例えば、Cooper et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:6450-6455 (1997), Yew et al. Hum Gene Ther 8:575-584 (1997)参照）；ペプチド−ＤＮＡ凝集物における遺伝子（例えばNiidome et al. J. Biol. Chem. 272:15307-15312 (1997)参照）；「ネイキッドＤＮＡ」（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号および第５，５８９，４６６号参照）；および脂質ベクターシステム（例えばLee et al. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 14:173-206 (1997)参照）において提供することができる。
【０１３２】
小型干渉ＲＮＡ
本発明のある実施形態において、ＲＮＡｉ分子はＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストとして使用される。ＲＮＡｉは、配列特異的な方式にて標的ｍＲＮＡの分解により遍在的な機構によって遺伝子発現を調節する（McManus et al., 2002, Nat Rev Genet 3:737 747）。哺乳類細胞では、ＲＮＡの干渉（ＲＮＡｉ）は、ｓｉＲＮＡの２１〜２３のヌクレオチド二重鎖が引き金となり得る（Lee et al., 2002, Nat Biotechnol 20: 500 505; Paul et al., 2002, Nat Biotechnol. 20:505 508; Miyagishi et al., 2002, Nat Biotechnol. 20:497 500; Paddison et al., 2002, Genes Dev. 16: 948 958）。Ｕ６プロモーターによって駆動されたｓｉＲＮＡまたはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の発現は、効果的に、哺乳類細胞の標的ｍＲＮＡ分解を介在する。合成的ｓｉＲＮＡ二重鎖およびプラスミド由来ｓｉＲＮＡは、ＨＩＶゲノムＲＮＡを特異的に分解することにより、ＨＩＶ−１感染および複製を阻害することができる（McManus et al., J. Immunol. 169:5754 5760; Jacque et al., 2002, Nature 418:435 438; Novina et al., 2002, Nat Med 8:681 686）。さらに、ＨＣＶゲノムＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡはＨＣＶ複製を阻害する（Randall et al., 2003, Proc Natl Acad Sci USA 100:235 240; Wilson et al., 2003, Proc Natl Acad Sci USA 100: 2783 2788）。ｓｉＲＮＡによって標的とされたＦａｓは、劇症肝炎および繊維症から肝臓を保護する（Song et al., 2003, Nat Med 9:347 351）。
【０１３３】
好ましい実施形態において、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子はＳＥＲＰＩＮＥ２の遺伝子発現を減少させるために使用される。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用して、関連するヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現を抑えることを意味する。ＲＮＡｉはまた、転写後遺伝子抑制（またはＰＴＧＳ）とも呼ばれる。細胞の細胞質において通常見つかる唯一のＲＮＡ分子は一本鎖ｍＲＮＡの分子であるため、細胞は、ｄｓＲＮＡを認識し２１−２５の塩基対を含む断片（二重らせんの約２つのターン、小型干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡと呼ばれる）に切断する酵素を有す。断片のアンチセンス鎖は、内因性の細胞のｍＲＮＡの分子上における相補的センス配列とハイブリダイズするように、センス鎖から十分離れている。このハイブリダイゼーションは、二本鎖領域のｍＲＮＡの切断のきっかけとなり、これにより、ポリペプチドに翻訳される能力を破壊する。特定の遺伝子に対応するｄｓＲＮＡの導入は、したがって、特定の組織および／または選択された時間における、細胞自身のその遺伝子の発現をノックアウトする。
【０１３４】
ＳＥＲＰＩＮＥ２発現を抑制するＲＮＡ干渉の使用のための典型的な手順は、Kortlever et al., Nature Cell Biology 8:877-884, 2006に提供される。
【０１３５】
二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは哺乳動物における遺伝子発現に干渉するために使用することができる。ｄｓＲＮＡは、ＳＥＲＰＩＮＥ２核酸分子の無発現変異体と同様な表現型をもたらす本発明の核酸分子の機能の抑制性ＲＮＡまたはＲＮＡｉとして使用される（Wianny & Zernicka-Goetz, 2000, Nature Cell Biology 2: 70 75参照）。
【０１３６】
あるいは、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を介在するために細胞に直接導入することができる(Elbashir et al., 2001, Nature 411:494 498)。多くの方法、例えば化学合成またはインビトロの転写が、ｓｉＲＮＡの作製のために開発されている。一旦作製されると、ｓｉＲＮＡｓは一過的なトランスフェクションによって細胞へ導入される。さらに、多数の発現ベクターが、一過的および安定的にトランスフェクトされた哺乳類細胞においてｓｉＲＮＡｓを連続して発現させるために開発されている(Brummelkamp et al., 2002 Science 296:550 553; Sui et al., 2002, PNAS 99(6):5515 5520; Paul et al., 2002, Nature Biotechnol. 20:505 508)。これらのベクターのいくつかは、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現するように操作されている。ｓｈＲＮＡは、インビボでプロセスされて、遺伝子特異的なサイレンシングを行なうことができるｓｉＲＮＡ様の分子となる。他の種のｓｉＲＮＡ発現ベクターは、分離したｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御の下でセンスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖をコードする(Miyagishi and Taira, 2002, Nature Biotechnol. 20:497 500)。その他のベクターのｓｈＲＮＡｓのように、このベクター由来のｓｉＲＮＡ鎖は、３’チミジン終止コドンを有する。両種の発現ベクターによるサイレンシングの効果は、一過的なｓｉＲＮＡのトランスフェクトにより誘導される場合と比較された。
【０１３７】
ＲＮＡは、直接細胞へ導入することができ（すなわち細胞内に導入でき）；または腔、間質空間に細胞外的に導入することができ、生物の循環に、または経口的に導入することができる。核酸を導入する物理的方法、例えば細胞への直接の注入または生物への細胞外の注入も使用することができる。血管または脈管外の循環、血液またはリンパ系、および脳脊髄液は、ＲＮＡを導入することができる部位である。
【０１３８】
核酸を導入する物理的方法は、ＲＮＡを含む溶液の注射、ＲＮＡによって覆われた粒子の照射、ＲＮＡの溶液への細胞または生物の浸漬またはＲＮＡ存在下における細胞膜のエレクトロポレーションを含む。ウイルス粒子にパッケージされたウイルスの構成物は、細胞への発現構築物の効率的な導入および発現構築物によりコードされたＲＮＡの転写の両方を達成するだろう。脂質に介在されるキャリアー輸送、リン酸カルシウム等といった化学物質に介在される輸送といった、細胞に核酸を導入するための当該分野において既知のその他の方法を使用することができる。したがって、ＲＮＡは、１以上の下記の活性を達成する成分と共に導入することができる：細胞によるＲＮＡ取り込みの増強、二本鎖のアニーリングの促進、アニールされた鎖の安定化、またはそうでなければ標的遺伝子の阻害の増大。
【０１３９】
ＲＮＡは、重合されたリボヌクレオチドの１以上の鎖を含むことができる。それは、リン酸−糖骨格またはヌクレオシドのいずれかに対する修飾を含むことができる。例えば、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合は、窒素または硫黄のヘテロ原子の少なくとも１つを含むよう改変することができる。ＲＮＡ構造における修飾は、ｄｓＲＮＡによって得られるいくつかの生物における一般的なパニック応答を回避しつつ、特異的な遺伝的阻害を可能にするよう調整することができる。同様に、塩基は、アデノシンデアミナーゼの活性を遮断するよう改変することができる。ＲＮＡは、酵素的にまたは部分的／全体的に有機合成により作製することができ、任意の修飾されたリボヌクレオチドも、インビトロで酵素的にまたは有機合成により導入することができる。
【０１４０】
二本鎖構造は、単一の自己相補的ＲＮＡ鎖、または２つの相補的ＲＮＡ鎖により形成することができる。ＲＮＡ二重鎖形成は、細胞内または細胞外で発生させることができる。ＲＮＡは、１細胞当たり少なくとも１つのコピーの送達を可能にする量で導入することができる。より高用量（例えば、１細胞当たり少なくとも５、１０、１００、５００または１０００コピーの二本鎖物質）が、より有効な阻害を生じさせることができ；より低用量は、さらに特異的な用途に有用となり得る。阻害は配列特異的であり、ＲＮＡの二重鎖領域に対応するヌクレオチド配列は遺伝的阻害のための標的とされる。ＲＮＡ分子は、少なくとも１０、１２、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０の長さのヌクレオチドでありえる。
【０１４１】
標的遺伝子の一部と同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡは、阻害のために好ましい。標的配列に対して挿入、欠失および単一の点変異を有したＲＮＡ配列もまた、阻害に効果的であることがわかっている。したがって、配列同一性は、当該分野において既知の配列比較およびアラインメントアルゴリズム（ Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991参照、当該文献は本願に援用される）および、例えば、デフォルトパラメーターを使用するＢＥＳＴＦＩＴソフトウェアプログラムにおいて実行されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、University of Wisconsin Genetic Computing Group）によるヌクレオチド配列間のパーセント差の計算により最適化することができる。抑制性ＲＮＡと標的遺伝子の部分との間における９０％を越える配列同一性または１００％の配列同一性が好ましい。あるいは、ＲＮＡの二重鎖領域は、標的遺伝子転写物の一部とハイブリダイズできるヌクレオチド配列として機能的に定義できる（例えば、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃でのハイブリダイゼーション、１２−１６時間；その後洗浄）。同一のヌクレオチド配列の長さは、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００または４００塩基とすることができる。
【０１４２】
ＲＮＡと標的遺伝子との間における１００パーセントの配列同一性は、本発明の実行には必要とされない。したがって、本発明は、遺伝子変異、種多形または進化的分岐により期待されるかもしれない配列変化を許容することができることという長所を有する。
【０１４３】
ＲＮＡは、インビボでまたはインビトロで合成することができる。細胞の内因性のＲＮＡポリメラーゼは、インビボで転写を介在することができ、クローン化されたＲＮＡポリメラーゼは、インビボまたはインビトロで転写に使用することができる。インビボのトランスジーンまたは発現構築物からの転写のために、調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、スプライスドナーおよびアクセプター、ポリアデニル化）は、ＲＮＡ鎖（または複数鎖）を転写するために使用することができる。阻害は、臓器、組織または細胞種における特異的な転写；環境要因（例えば感染症、ストレス、温度、化学的誘導物）の刺激；および／または発育の段階または年齢での転写の操作による標的とすることができる。ＲＮＡ鎖はポリアデニル化されてよく；ＲＮＡ鎖は細胞の翻訳の器官によりポリペプチドに翻訳されてよい。ＲＮＡは、手動または自動の反応により、化学的にまたは酵素的に合成することができる。ＲＮＡは、細胞性ＲＮＡポリメラーゼまたはバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ３、Ｔ７、ＳＰ６）により合成することができる。発現構築物の使用および産生は当該分野において既知である（ＷＯ９７／３２０１６；米国特許第５，５９３，８７４号、第５，６９８，４２５号、第５，７１２，１３５号、第５，７８９，２１４号および第５，８０４，６９３号参照、これらは本願に援用される）。化学的またはインビトロにおける酵素的な合成により合成される場合、ＲＮＡは、細胞への導入に先立って精製することができる。例えば、ＲＮＡは、溶媒または樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィーまたはそれらの組み合わせにより混合物から取り除くことができる。あるいは、ＲＮＡは、サンプル処理による損失を回避するために、精製を行わずまたは最小限の精製を行って使用することができる。ＲＮＡは、貯蔵のために乾燥させるか、または水溶液に溶解することができる。溶液は、アニーリング、および／または二本鎖の安定化を促進するための緩衝剤または塩を含み得る。
【０１４４】
本発明は、ＩＰＦのような疾病の治療または予防のために、細胞へのＲＮＡの導入のために使用することができる。例えば、ｄｓＲＮＡは、ヒト肺線維芽細胞に導入し、それによって、ＳＥＲＰＩＮＥ２の遺伝子発現を阻害することができる。治療は、疾病に関連した任意の病徴または病理学に関連した臨床的な徴候の改善を含むだろう。
【０１４５】
製剤および投与
ＳＥＲＰＩＮＥ２アンタゴニストの多くの適切な製剤は、全ての薬剤師に既知の処方書Remington's Pharmaceutical Sciences, (15th Edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1975))、特に第８７章（Ｂｌａｕｇ、Ｓｅｙｍｏｕｒ）に見ることができる。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、無水吸収ベース、水中油型または油中水型エマルション、エマルションカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物を含む。
【０１４６】
本発明は、医学的状態、特に肺線維症、特にヒト肺線維芽細胞が高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露されるような症状の治療のための医薬の製造のためのＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの使用を含む。好ましい実施形態において、医学的状態は、ＡＬＩ、ＩＰＦ、ＣＯＰＤ、喘息またはＡＲＤＳである。好ましくは、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、ＳＥＲＰＩＮＥ２の抗体、例えばモノクローナル抗体、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス核酸分子、ペプチドまたは小分子阻害剤である。
【０１４７】
本発明は、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストを患者に投与することを含む肺線維症を患う患者を治療する方法を含む。好ましくは、肺線維症は、ヒト肺線維芽細胞が高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露されるものである。好ましい実施形態において、患者はＡＬＩ、ＩＰＦ、ＣＯＰＤ、喘息またはＡＲＤＳを有している。好ましくは、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、ＳＥＲＰＩＮＥ２の抗体、例えばモノクローナル抗体、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス核酸分子、ペプチドまたは小分子阻害剤である。
【０１４８】
様々な実施形態において、本発明の有効量の組成物が、月に一度または月に一度以上、例えば２、３、４、５または６か月に一度、対象に投与される。その他の実施形態において、本発明の有効量の組成物は、月に一度未満、例えば、２週毎または毎週投与される。本発明の有効量の組成物は、少なくとも一度対象に投与される。特定の実施形態において、有効量の組成物が、少なくとも１か月、少なくとも６か月または少なくとも１年の期間を含む、複数回投与されてよい。
【０１４９】
様々な実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも１−５日の期間毎日投与されるものの、確立している肺線維症を持った患者は、数か月から数年の期間、治療量を受けることができる。ここに使用される「治療量」とは、予防し、緩和し、減少させ、またはそうでなければ患者における症状の重症度を低減する量である。
【０１５０】
ＳＥＲＰＩＮＥ２は細胞外のプロテアーゼ阻害剤であるため、アンタゴニストのタンパク質（例えば抗体またはペプチド）または小分子の細胞外の投与は、ＳＥＲＰＩＮＥ２機能を阻害するのに十分である。ＳＥＲＰＩＮＥ２発現の阻害（例えば、アンチセンスまたはＲＮＡｉ）は、ＳＥＲＰＩＮＥ２を発現する細胞にアンタゴニストが入ることを必要とする。好ましい実施形態において、細胞はヒト肺線維芽細胞である。
【０１５１】
ＩＰＦ患者に対する薬剤の様々な送達方法は当該分野において既知である。例えば、多数の臨床研究が、ＩＰＦを治療するための分子の様々な典型的な送達方法を使用して行なわれた。抗結合組織成長因子−特異的モノクローナル抗体の単一のＩＶ注入が、臨床研究においてＩＰＦを治療するために使用された。さらに、小分子の吸入ならびにインターフェロン−ガンマの皮下注射およびエアロゾル吸入が、臨床研究において使用された。更に、エタネルセプトが、臨床研究において皮下注射で週に２度ＩＰＦを治療するために使用された（Raghu et al., Am J Respir Crit Care Med. 178:948-55, 2008）。
【０１５２】
抗体について、患者に投与される用量は、典型的に、０．１ｍｇ／ｋｇ患者体重から１００ｍｇ／ｋｇ患者体重である。好ましくは、患者に投与される用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ患者体重から２０ｍｇ／ｋｇ患者体重であり、より好ましくは患者の体重の１ｍｇ／ｋｇ患者体重から１０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。一般に、ヒト抗体およびヒト化抗体は、外来のポリペプチドに対する免疫反応に起因して、その他の種由来の抗体よりも人体において長い半減期を有する。したがって、より低い用量のヒト化抗体およびより頻度の小さい投与もしばしば可能である。
【０１５３】
有効な治療に必要な有効成分の量は、投与の手段、標的部位、患者の生理的な状態および投与されるその他の薬剤を含む様々な因子に依存するだろう。したがって、治療用量は安全性および効果を最適化するように滴定すべきである。典型的に、インビトロで使用される用量は、有効成分のインサイチュー投与に有用な量における有用なガイダンスを提供することができる。特定の疾患の治療のための有効量の動物試験は、さらに、ヒトに対する用量の予測的な示度を提供するだろう。様々な考察が、例えば、Goodman and Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Edition (1985), MacMillan Publishing Company, New York、およびRemington's Pharmaceutical Sciences 18th Edition, (1990) Mack Publishing Co, Easton Paに記載されている。そこでは、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮的、経鼻、イオン泳動的な投与等を含む投与のための方法が議論されている。好ましくは、その製剤は肺に投与される。より好ましくは、その製剤は吸入される。
【０１５４】
好ましくは、肺に対する局所的送達は、全身的送達で生じ得る潜在的な副作用を緩和するために使用される。このように、局所的に送達できる用量は、全身的（例えば、非経口的）送達様式において許容され得る量より実質的に高くなりえる。特発性肺線維症、嚢胞性繊維症、結核、肺腫瘍またはその他の炎症といった肺疾患に対しては、吸入経路による局所的送達が好ましい。静脈内投与も好ましい。
【０１５５】
肺に対する小分子の送達は当該分野において既知の技術により達成することができる。さらに、タンパク質薬剤は当該分野において既知の技術による吸入によって肺に送達することができる。例えば、肺に局所的に送達されたタンパク質薬剤は、インスリンから抗体まで、一連の分子量を示す。
【０１５６】
インスリンは吸入できるタンパク質の最もよく知られている例である一方（Ｅｘｕｂｅｒａ）、全身的送達が望ましくない肺を標的とするタンパク質の多くの例が存在する。最も古い例の１つは、肺結核を治療するためのエアロゾル化されたインターフェロンアルファまたはガンマである(Am J Respir Crit Care Med Vol 158. pp 1156-1162, 1998; Antimicrobial Agents and Chemotherapy, June 1984, p. 729-734)。今日、エアロゾルインターフェロンガンマは、目下、特発性肺線維症のためのフェーズ１臨床試験にある。皮下送達は、この示度には効果がないことを示された。インターフェロンのエアロゾル小滴は、一般に、圧縮空気によるジェット噴霧器を使用して、０．３−３．４ｕＭの範囲にある。小さな粒子サイズは肺への深い曝露を保証する。
【０１５７】
抗体のようなより大きなタンパク質も、肺に直接送達することができる。例えば、Ｔ細胞レセプタに特異的なエアロゾル化されたモノクローナル抗体は、気道炎症および超反応性についての前臨床研究において成功裡に使用された(Intl Archives of Allergy and Immunology, 134, 49-55, 2004)。他の例において、リシン毒素に対するエアロゾル化された抗体は、毒素を吸入した動物の肺を保護することが分かった(Toxicon, 34, 1037-1033, 1996)。コントロール抗体を受けた動物は、重篤な浮腫および全肺葉の炎症をともなう気道の上皮の壊死を示し、リシン後４８−９６時間に死亡した。対照的に、エアロゾル化された抗リシン抗体を与えられた動物は肺傷を作らず、動物はすべて生き残った。
【０１５８】
液体製剤のためのネビュライザーおよびアトマイザーのような肺送達を支援するために使用することができる多数の装置が存在する。乾燥粉末吸入器は固形微粒子製剤のために使用することができる。既存の装置は「能動的」または「受動的」様式に送達することができる。
【０１５９】
１つの実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＥ２に対する抗体は、肺に対する送達の１つの経路として、液体溶液から直接霧状にすることができる。その他の実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＥ２に対する抗体は、リポソームまたはポリラクチドミクロスフェア（ＧＲＡＳ材料）のような固形微粒子と混合し、またはそれらでカプセル化することができる。多孔性の粒子は非常に高い薬剤ロードを可能にし、薬剤の遅い徐放性にさらに提供することができる。粒子は均一のサイズで作ることができ、５μｍのサイズは、最も肺送達戦略のために好ましい。固形微粒子は、さらに、肺から潜在的で全身的な曝露を阻害することができる。液体および固体の肺送達様式の両方は、ブレオマイシン誘導型線維症のマウスモデルのような動物モデルにおいて容易に最適化することができる。肺組織および血流における薬剤濃度は、ＥＬＩＳＡのような標準的アッセイを使用して容易に最適化することができる。
【０１６０】
本発明の組成物は、投与の方法に依存して、様々な単位剤形において投与することができる。例えば、経口投与に適している単位剤形は、粉末、錠剤、ピル、カプセルおよびドラジェといった固体剤形、およびエリキシル、シロップおよび懸濁剤といった液体剤形を含む。有効成分は、さらに、無菌の液体剤形において非経口的に投与することができる。ゼラチンカプセルは、有効成分、および非活性成分として、粉末キャリアー、例えばグルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルク、炭酸マグネシウム等を含む。好ましい色、味、安定性、緩衝能、分散またはその他の既知の好ましい特徴を提供するために添加できる付加的な非活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白色インク等である。同様の希釈剤を圧縮錠剤を作るために使用することができる。錠剤およびカプセルの両方は、数時間の期間にわたり薬剤の連続的な放出を提供する徐放性製剤として製造することができる。圧縮錠剤は、任意の不愉快な味を覆い、大気から錠剤を保護するために、糖でコーティングまたは膜でコーティングすることができ、または、胃腸管における選択的な崩壊のために腸溶性コーティングできる。経口投与のための液体剤形は、患者の許容性を高めるために着色および着味を含むことができる。
【０１６１】
医薬製剤における本発明の組成物の濃縮は、広く異ならせることができ、すなわち、約０．１重量％未満から、通常約２重量％以上から、２０から５０重量％以上まで異ならせることができ、選択された投与の特定の様式に従って、液体体積、粘性等により第１に選択されるだろう。
【０１６２】
本発明の組成物もリポソームによって投与することができる。リポソームは、エマルション、泡、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散、層状の層等を含む。これらの製剤において、送達される本発明の組成物は、単独で、あるいは、抗体のような所望の標的と結合する分子またはその他の治療的なもしくは免疫原の組成物とともに、リポソームの一部として組込むことができる。したがって、本発明の所望の組成物が充填されたまたはそれにより装飾されたリポソームは、全身的に送達できる、または、興味のある組織に導入でき、そこでその後リポソームは、選択された治療的／免疫原ペプチド組成物を送達する。
【０１６３】
本発明で使用されるリポソームは、一般に中性および負に帯電したリン脂質およびコレステロールといったステロールを含む標準的小胞形成脂質から形成することができる。脂質の選択は一般に、例えば、リポソーム・サイズ、血流におけるリポソームの酸不安定性および安定性を考慮して導かれる。例えば、Szoka et al. Ann. Rev. Biophys. Bioeng, 9:467 (1980)、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号および第５，０１９，３６９号に記載されるように、様々な方法がリポソームを作製するために利用可能である。
【０１６４】
本発明の組成物を含むリポソーム懸濁液は、とりわけ、投与の様式、送達される本発明の組成物および治療される疾病の段階に従って変化する用量で、静脈内投与、局所的（locally）投与、局所的（topically）投与を行うことができる。
【０１６５】
固体組成物のために、例えば、製薬の等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を含む従来の無毒な固体のキャリアーを使用することができる。経口投与のために、薬学的に許容される無毒の組成物は、通常使用される任意の賦形剤、例えば以前に記録されたキャリアー、および一般に１０−９５％の有効成分を、すなわち本発明の１以上の組成物をより好ましくは２５％−７５％の濃度で取り込んで形成される。
【０１６６】
固体組成物のために、例えば、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を含む従来の無毒の固体キャリアーを使用することができる。経口投与のために、上記のキャリアーのような任意の通常使用される賦形剤と、一般に１０−９５％の、より好ましくは２５％−７５％の濃度の有効成分、すなわち本発明の１以上の組成物とを取り込むことで、薬学的に許容可能な無毒の組成物を形成することができる。
【０１６７】
エアロゾル投与のために、本発明の組成物は、好ましくは、界面活性剤および噴霧剤と共に細かく分離された形態において供給される。本発明の組成物の好ましいパーセンテージは、０．０１％−２０重量％、好ましくは１−１０重量％である。界面活性剤は、当然無毒でなくてはならず、好ましくは噴霧剤に可溶である。そのような薬剤の代表は、カプロン酸（ｃ−ａｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ）、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）およびオレイン酸といった６から２２炭素原子を含む脂肪酸と脂肪性多価アルコールまたはその環状無水物とのエステルまたは部分的エステルである。混合グリセリドまたは天然のグリセリドのような混合エステルを使用することができる。界面活性剤は、組成物中０．１−２０重量％、好ましくは０．２５−５重量％を構成することができる。組成物のバランスは通常噴霧剤である。必要であれば、キャリアーは、例えば鼻腔内送達のためのレシチンとともに含むことができる。
【０１６８】
本発明の構築物は、さらに、当該分野において周知の技術により、デポー型システム、カプセル化形態または移植において送達することができる。同様に、構築物はポンプによって興味のある組織に送達することができる。
【０１６９】
製剤における活性剤が処方により不活性化されず、製剤が生理学的に適合するかぎり、任意の前述の製剤が、本発明に関して治療法および治療に適切となり得る。
【０１７０】
ＳＥＲＰＩＮＥ２活性のアッセイおよびＳＥＲＰＩＮＥ２アンタゴニスト
肺線維芽細胞に対するＳＥＲＰＩＮＥ２の効果は、ＳＥＲＰＩＮＥ２の存在下でヒト肺線維芽細胞をインキュベートし、コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンにおける影響をここに記載されるように評価することで、評価することができる。例えば、正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）Ｌｏｎｚａ製品番号ＣＣ−２５１２をインスリン、ｒｈＦＧＦ−Ｂ、ゲンタマイシン硫酸アンフォテリシン−Ｂおよびウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む繊維芽細胞増殖培地で増殖させることができる。
【０１７１】
ＮＨＬＦ細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅによってフラスコから採集することができ、酵素は、トリプシン中和溶液中で中和され、細胞はペレットにされ、完全増殖培地に再懸濁され、数を計測され、Ｆａｌｃｏｎ９６ウェルプレートに、１ウェル当り８０００細胞、１ウェル当り２００ｕｌで播種され、３７℃、５％のＣＯ２下で６時間インキュベートされる。プレーティングから６時間後、完全増殖培地を除去し、細胞に２００ｕｌの飢餓培地を添加し、３７℃、５％のＣＯ２で１６−２４時間をインキュベートすることで、細胞が血清を枯渇した状態とする。
【０１７２】
飢餓培地を細胞から除去し、７５ｕｌのタンパク質処理の直後に、７５ｕｌの共処理を添加する。共処理は、ＴＧＦ−β１またはＩＬ−１３を次の３つの用量のうち１つで添加した飢餓培地である：ＴＧＦ低処理は０．１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１（実験における終末濃度は０．０５ｎｇ／ｍｌ）；ＴＧＦ高処理は１．０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１（実験における終末濃度は０．５ｎｇ／ｍｌ）；ＩＬ−１３処理は１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３（実験における終末濃度は５ｎｇ／ｍｌ）。ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質処理は、組み換えＳＥＲＰＩＮＥ２が添加された７５ｕｌの飢餓培地である。ＳＥＲＰＩＮＥ２の濃度は０ｎｇ／ｍｌから１０，０００ｎｇ／ｍｌまでとできる。タンパク質処理の添加の後、細胞は、３７℃、５％のＣＯ２で４８時間培養される。
【０１７３】
４８時間の処理の後、培地を除去し、細胞を溶解する。コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンのＲＮＡのレベルを決定する。ＲＮＡ発現のレベルは、Ｓ１ヌクレアーゼ／ＲＮａｓｅプロテクション、ＰＣＲ、ｂＤＮＡ、ノーザンブロットなどのような当該分野において既知の多数の技術による決定することができる。β−アクチンのようなコントロールを使用することができる。
【０１７４】
高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２にさらされる肺線維芽細胞は、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストを投与して、これらの細胞に対する高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２の効果を転換することができる。例えば、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニスト（例えばモノクローナル抗体）を肺線維芽細胞に投与し、４８時間のインキュベーションの後に、コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンのＲＮＡのレベルを決定することができる。ＳＥＲＰＩＮＥ２アンタゴニストのレベルは１ｎｇ／ｍｌから１０，０００ｎｇ／ｍｌまでとすることができる。ＲＮＡレベルは、並列のサンプルを実行することで、またはアンタゴニスト添加前の一定分量のサンプルと、アンタゴニストの投与後のある時間（例えば２４、４８および７２時間）の一定分量のサンプルとを比較することで、アンタゴニストの存在下および非存在下で比較することができる。
【０１７５】
さらに、ＳＥＲＰＩＮＥ２とともにアンタゴニストをインキュベートし、トリプシン様セリンプロテアーゼ、例えばトロンビン、トリプシン、プラスミンおよびウロキナーゼと複合体を形成し、それらを阻害するＳＥＲＰＩＮＥ２の能力が変更されたかどうかを決定することで、アンタゴニストの効果を評価することができる。例えばWagner et al., 1988を参照されたい。
【０１７６】
コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの合成に対するＳＥＲＰＩＮＥ２アンタゴニストの効果は、肺線維症のマウスモデルにて試験することができる。このモデルにおいて、繊維症は抗癌剤硫酸ブレオマイシンの気管内注射によるマウスの肺において誘導される。この疾病を有するマウスおよびヒトの両方における形態、生化学およびｍＲＮＡの変化の研究により裏付けられるように、ブレオマイシン誘導型線維症はヒト特発性肺線維症に非常に類似する(Phan, S. H. Fibrotic mechanisms in lung disease. In: Immunology of Inflammation, edited by P. A. Ward, New York: Elsevier, 1983, pp121 162; Zhang et. al. (1994) Lab. Invest. 70: 192 202; Phan and Kunkel (1992) Exper. Lung Res. 18:29 43)。
【０１７７】
マウスは、ブレオマイシンを投与し、好ましくは、その後、例えば１０日後、ＳＥＲＰＩＮＥ２アンタゴニストを投与することで治療することができる。Moeller et al, 2008を参照されたい。アンタゴニストの投与後１０−２１日目において、マウスの肺を採取し、食塩水で洗浄して血液を除去し、ｍＲＮＡを抽出し、コラーゲンおよびα−平滑筋アクチンの発現を評価することができる。ＳＥＲＰＩＮＥ２アンタゴニストの投与は、マウス肺における繊維症の症状を改善することができる。
【実施例】
【０１７８】
例１．ＲＮＡ発現に対する精製されたＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質の効果
肺線維芽細胞に対するＳＥＲＰＩＮＥ２の効果を、繊維芽細胞増殖培地において、正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）をインキュベートすることで評価した。ＮＨＬＦ細胞を採取した。その後、細胞をペレット化し、増殖培地に再懸濁し、１ウェルあたり８０００細胞で２００ｕｌでプレーティングし、３７℃、５％のＣＯ２で６時間インキュベートした。６時間のプレーティング後、完全増殖培地を除去し、２００ｕｌの飢餓培地(Clonetics Fibroblast Basal Medium (FBM) from Lonza Cat. # CC-3131 + 0.5% BSA fraction V) を細胞に添加し、３７℃、５％のＣＯ２で１６−２４時間インキュベートすることで、細胞を、血清が枯渇した状態にした。
【０１７９】
飢餓培地を細胞から除去し、７５ｕｌのタンパク質処理の直後に、７５ｕｌの共処理を添加した。共処理は、以下の３つの用量のうち１つでＴＧＦ−β１またはＩＬ−１３を添加した飢餓培地とした：ＴＧＦ低処理は０．１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１（実験における終末濃度は０．０５ｎｇ／ｍｌ）；ＴＧＦ高処理は１．０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１（実験における終末濃度は０．５ｎｇ／ｍｌ）；ＩＬ−１３処理は１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３（実験における終末濃度は５ｎｇ／ｍｌ）。ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質処理法は、組み換えＳＥＲＰＩＮＥ２を添加した７５ｕｌの飢餓培地であった。ＳＥＲＰＩＮＥ２のレベルは約０−５０００ｎｇ／ｍｌであった。タンパク質処理の添加の後、細胞を３７℃、５％のＣＯ２で４８時間培養した。ヒトＴＧＦベータ１（２４０−Ｂ−０１０）、組み換えヒトＩＬ−１３（２１３−ＩＬ−０２５）および組み換えヒトＳＥＲＰＩＮＥ２（２９８０−ＰＩ）は、Ｒ＆Ｄシステムズから入手した。
【０１８０】
処理の４８時間後、１５０ｕｌの培地を除去し、細胞はプロテイナーゼＫを含む１００ｕｌの１ｘ溶解緩衝液に溶解した。コラーゲン１Ａ１、β−アクチンおよびα−平滑筋アクチンのレベルを、ｂＤＮＡアッセイ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を使用して決定した。オーバーナイトハイブリダイゼーションおよびフィルタプレートにおけるサンプル処理のためのＰａｎｏｍｉｃｓキット説明書に従った。最終ステップにおいて、ビーズを８０ｕｌで再懸濁し、Ｌｕｍｉｎｅｘプレートリーダー上でランさせた。
【０１８１】
精製されたＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質および０．０５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βによるアッセイの結果を図１に示す。コントロールＲＮＡ、β−アクチンは、ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質添加による上昇を示さなかった。しかしながら、全３つの実験条件下において、コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンのレベルは、用量依存的に上昇し、ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質が増加した。これらの結果は、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に対するヒト肺線維芽細胞の曝露が、コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの両方の発現の上昇をもたらしたことを示す。
【０１８２】
例２．野生型ＳＥＲＰＩＮＥ２を発現する構築物の作製
野生型ＳＥＲＰＩＮＥ２のＤＮＡのヌクレオチド配列を含み、野生型ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質を発現する構築物を作製した。
【０１８３】
野生型ＳＥＲＰＩＮＥ２のＤＮＡのヌクレオチド配列は、
atgaactggcatctccccctcttcctcttggcctctgtgacgctgccttccatctgctcccacttcaatcctctgtctctcgaggaactaggctccaacacggggatccaggttttcaatcagattgtgaagtcgaggcctcatgacaacatcgtgatctctccccatgggattgcgtcggtcctggggatgcttcagctgggggcggacggcaggaccaagaagcagctcgccatggtgatgagatacggcgtaaatggagttggtaaaatattaaagaagatcaacaaggccatcgtctccaagaagaataaagacattgtgacagtggctaacgccgtgtttgttaagaatgcctctgaaattgaagtgccttttgttacaaggaacaaagatgtgttccagtgtgaggtccggaatgtgaactttgaggatccagcctctgcctgtgattccatcaatgcatgggttaaaaacgaaaccagggatatgattgacaatctgctgtccccagatcttattgatggtgtgctcaccagactggtcctcgtcaacgcagtgtatttcaagggtctgtggaaatcacggttccaacccgagaacacaaagaaacgcactttcgtggcagccgacgggaaatcctatcaagtgccaatgctggcccagctctccgtgttccggtgtgggtcgacaagtgcccccaatgatttatggtacaacttcattgaactgccctaccacggggaaagcatcagcatgctgattgcactgccgactgagagctccactccgctgtctgccatcatcccacacatcagcaccaagaccatagacagctggatgagcatcatggtccccaagagggtgcaggtgatcctgcccaagttcacagctgtagcacaaacagatttgaaggagccgctgaaagttcttggcattactgacatgtttgattcatcaaaggcaaattttgcaaaaataacaaggtcagaaaacctccatgtttctcatatcttgcaaaaagcaaaaattgaagtcagtgaagatggaaccaaagcttcagcagcaacaactgcaattctcattgcaagatcatcgcctccctggtttatagtagacagaccttttctgtttttcatccgacataatcctacaggtgctgtgttattcatggggcagataaacaaaccc (配列番号１)である。
【０１８４】
野生型ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質のアミノ酸配列は、
MNWHLPLFLLASVTLPSICSHFNPLSLEELGSNTGIQVFNQIVKSRPHDNIVISPHGIASVLGMLQLGADGRTKKQLAMVMRYGVNGVGKILKKINKAIVSKKNKDIVTVANAVFVKNASEIEVPFVTRNKDVFQCEVRNVNFEDPASACDSINAWVKNETRDMIDNLLSPDLIDGVLTRLVLVNAVYFKGLWKSRFQPENTKKRTFVAADGKSYQVPMLAQLSVFRCGSTSAPNDLWYNFIELPYHGESISMLIALPTESSTPLSAIIPHISTKTIDSWMSIMVPKRVQVILPKFTAVAQTDLKEPLKVLGITDMFDSSKANFAKITRSENLHVSHILQKAKIEVSEDGTKASAATTAILIARSSPPWFIVDRPFLFFIRHNPTGAVLFMGQINKP (配列番号２)である。
【０１８５】
例３．ＬＲＰに結合しないＳＥＲＰＩＮＥ２ムテインの作製
低密度リポ蛋白質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）に結合できないＳＥＲＰＩＮＥ２ムテインのヌクレオチド配列を含む構築物を作製した。このムテインは、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアミノ酸位置４８および４９に次の変異を含んだ：Ｈ４８ＡおよびＤ４９Ｅ。
【０１８６】
ＳＥＲＰＩＮＥ２のＤＮＡのＬＲＰ結合ムテインのヌクレオチド配列は、
atgaactggcatctccccctcttcctcttggcctctgtgacgctgccttccatctgctcccacttcaatcctctgtctctcgaggaactaggctccaacacggggatccaggttttcaatcagattgtgaagtcgaggcctgcagaaaacatcgtgatctctccccatgggattgcgtcggtcctggggatgcttcagctgggggcggacggcaggaccaagaagcagctcgccatggtgatgagatacggcgtaaatggagttggtaaaatattaaagaagatcaacaaggccatcgtctccaagaagaataaagacattgtgacagtggctaacgccgtgtttgttaagaatgcctctgaaattgaagtgccttttgttacaaggaacaaagatgtgttccagtgtgaggtccggaatgtgaactttgaggatccagcctctgcctgtgattccatcaatgcatgggttaaaaacgaaaccagggatatgattgacaatctgctgtccccagatcttattgatggtgtgctcaccagactggtcctcgtcaacgcagtgtatttcaagggtctgtggaaatcacggttccaacccgagaacacaaagaaacgcactttcgtggcagccgacgggaaatcctatcaagtgccaatgctggcccagctctccgtgttccggtgtgggtcgacaagtgcccccaatgatttatggtacaacttcattgaactgccctaccacggggaaagcatcagcatgctgattgcactgccgactgagagctccactccgctgtctgccatcatcccacacatcagcaccaagaccatagacagctggatgagcatcatggtccccaagagggtgcaggtgatcctgcccaagttcacagctgtagcacaaacagatttgaaggagccgctgaaagttcttggcattactgacatgtttgattcatcaaaggcaaattttgcaaaaataacaaggtcagaaaacctccatgtttctcatatcttgcaaaaagcaaaaattgaagtcagtgaagatggaaccaaagcttcagcagcaacaactgcaattctcattgcaagatcatcgcctccctggtttatagtagacagaccttttctgtttttcatccgacataatcctacaggtgctgtgttattcatggggcagataaacaaaccc (配列番号３)である。
【０１８７】
ＳＥＲＰＩＮＥ２のＬＲＰ結合ムテインのアミノ酸配列は、
MNWHLPLFLLASVTLPSICSHFNPLSLEELGSNTGIQVFNQIVKSRPAENIVISPHGIASVLGMLQLGADGRTKKQLAMVMRYGVNGVGKILKKINKAIVSKKNKDIVTVANAVFVKNASEIEVPFVTRNKDVFQCEVRNVNFEDPASACDSINAWVKNETRDMIDNLLSPDLIDGVLTRLVLVNAVYFKGLWKSRFQPENTKKRTFVAADGKSYQVPMLAQLSVFRCGSTSAPNDLWYNFIELPYHGESISMLIALPTESSTPLSAIIPHISTKTIDSWMSIMVPKRVQVILPKFTAVAQTDLKEPLKVLGITDMFDSSKANFAKITRSENLHVSHILQKAKIEVSEDGTKASAATTAILIARSSPPWFIVDRPFLFFIRHNPTGAVLFMGQINKP (配列番号４)である。
【０１８８】
例４．標的プロテアーゼに結合できるがプロテアーゼを不可逆的に阻害しないＳＥＲＰＩＮＥ２ムテインの作製
標的プロテアーゼに結合できるが、プロテアーゼを不可逆的に阻害しないＳＥＲＰＩＮＥ２ムテインのヌクレオチド配列を含む構築物を作製した。このムテイン（阻害ムテイン）は、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアミノ酸位置３６４および３６５に次のような変異を含む：Ｒ３６４ＫおよびＳ３６５Ｔ。
【０１８９】
ＳＥＲＰＩＮＥ２阻害ムテインＤＮＡのヌクレオチド配列は、
atgaactggcatctccccctcttcctcttggcctctgtgacgctgccttccatctgctcccacttcaatcctctgtctctcgaggaactaggctccaacacggggatccaggttttcaatcagattgtgaagtcgaggcctcatgacaacatcgtgatctctccccatgggattgcgtcggtcctggggatgcttcagctgggggcggacggcaggaccaagaagcagctcgccatggtgatgagatacggcgtaaatggagttggtaaaatattaaagaagatcaacaaggccatcgtctccaagaagaataaagacattgtgacagtggctaacgccgtgtttgttaagaatgcctctgaaattgaagtgccttttgttacaaggaacaaagatgtgttccagtgtgaggtccggaatgtgaactttgaggatccagcctctgcctgtgattccatcaatgcatgggttaaaaacgaaaccagggatatgattgacaatctgctgtccccagatcttattgatggtgtgctcaccagactggtcctcgtcaacgcagtgtatttcaagggtctgtggaaatcacggttccaacccgagaacacaaagaaacgcactttcgtggcagccgacgggaaatcctatcaagtgccaatgctggcccagctctccgtgttccggtgtgggtcgacaagtgcccccaatgatttatggtacaacttcattgaactgccctaccacggggaaagcatcagcatgctgattgcactgccgactgagagctccactccgctgtctgccatcatcccacacatcagcaccaagaccatagacagctggatgagcatcatggtccccaagagggtgcaggtgatcctgcccaagttcacagctgtagcacaaacagatttgaaggagccgctgaaagttcttggcattactgacatgtttgattcatcaaaggcaaattttgcaaaaataacaaggtcagaaaacctccatgtttctcatatcttgcaaaaagcaaaaattgaagtcagtgaagatggaaccaaagcttcagcagcaacaactgcaattctcattgcaaaaacatcgcctccctggtttatagtagacagaccttttctgtttttcatccgacataatcctacaggtgctgtgttattcatggggcagataaacaaaccc (配列番号５)である。
【０１９０】
ＳＥＲＰＩＮＥ２阻害ムテインのアミノ酸配列は、
MNWHLPLFLLASVTLPSICSHFNPLSLEELGSNTGIQVFNQIVKSRPHDNIVISPHGIASVLGMLQLGADGRTKKQLAMVMRYGVNGVGKILKKINKAIVSKKNKDIVTVANAVFVKNASEIEVPFVTRNKDVFQCEVRNVNFEDPASACDSINAWVKNETRDMIDNLLSPDLIDGVLTRLVLVNAVYFKGLWKSRFQPENTKKRTFVAADGKSYQVPMLAQLSVFRCGSTSAPNDLWYNFIELPYHGESISMLIALPTESSTPLSAIIPHISTKTIDSWMSIMVPKRVQVILPKFTAVAQTDLKEPLKVLGITDMFDSSKANFAKITRSENLHVSHILQKAKIEVSEDGTKASAATTAILIAKTSPPWFIVDRPFLFFIRHNPTGAVLFMGQINKP (配列番号６)である。
【０１９１】
例５．標的プロテアーゼに結合できないＳＥＲＰＩＮＥ２ムテインの作製
標的プロテアーゼに結合できないＳＥＲＰＩＮＥ２ムテインのヌクレオチド配列を含む構築物（相互作用ムテイン）を作製した。このムテインは、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアミノ酸位置３６４および３６５に次の変異を含んだ：Ｒ３６４ＰおよびＳ３６５Ｐ。
【０１９２】
ＳＥＲＰＩＮＥ２のＤＮＡの相互作用ムテインのヌクレオチド配列は、
atgaactggcatctccccctcttcctcttggcctctgtgacgctgccttccatctgctcccacttcaatcctctgtctctcgaggaactaggctccaacacggggatccaggttttcaatcagattgtgaagtcgaggcctcatgacaacatcgtgatctctccccatgggattgcgtcggtcctggggatgcttcagctgggggcggacggcaggaccaagaagcagctcgccatggtgatgagatacggcgtaaatggagttggtaaaatattaaagaagatcaacaaggccatcgtctccaagaagaataaagacattgtgacagtggctaacgccgtgtttgttaagaatgcctctgaaattgaagtgccttttgttacaaggaacaaagatgtgttccagtgtgaggtccggaatgtgaactttgaggatccagcctctgcctgtgattccatcaatgcatgggttaaaaacgaaaccagggatatgattgacaatctgctgtccccagatcttattgatggtgtgctcaccagactggtcctcgtcaacgcagtgtatttcaagggtctgtggaaatcacggttccaacccgagaacacaaagaaacgcactttcgtggcagccgacgggaaatcctatcaagtgccaatgctggcccagctctccgtgttccggtgtgggtcgacaagtgcccccaatgatttatggtacaacttcattgaactgccctaccacggggaaagcatcagcatgctgattgcactgccgactgagagctccactccgctgtctgccatcatcccacacatcagcaccaagaccatagacagctggatgagcatcatggtccccaagagggtgcaggtgatcctgcccaagttcacagctgtagcacaaacagatttgaaggagccgctgaaagttcttggcattactgacatgtttgattcatcaaaggcaaattttgcaaaaataacaaggtcagaaaacctccatgtttctcatatcttgcaaaaagcaaaaattgaagtcagtgaagatggaaccaaagcttcagcagcaacaactgcaattctcattgcaccaccatcgcctccctggtttatagtagacagaccttttctgtttttcatccgacataatcctacaggtgctgtgttattcatggggcagataaacaaaccc (配列番号７)である。
【０１９３】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の相互作用ムテインのアミノ酸配列は、
MNWHLPLFLLASVTLPSICSHFNPLSLEELGSNTGIQVFNQIVKSRPHDNIVISPHGIASVLGMLQLGADGRTKKQLAMVMRYGVNGVGKILKKINKAIVSKKNKDIVTVANAVFVKNASEIEVPFVTRNKDVFQCEVRNVNFEDPASACDSINAWVKNETRDMIDNLLSPDLIDGVLTRLVLVNAVYFKGLWKSRFQPENTKKRTFVAADGKSYQVPMLAQLSVFRCGSTSAPNDLWYNFIELPYHGESISMLIALPTESSTPLSAIIPHISTKTIDSWMSIMVPKRVQVILPKFTAVAQTDLKEPLKVLGITDMFDSSKANFAKITRSENLHVSHILQKAKIEVSEDGTKASAATTAILIAPPSPPWFIVDRPFLFFIRHNPTGAVLFMGQINKP (配列番号８)である。
【０１９４】
例６．コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現に対するＳＥＲＰＩＮＥ２ムテインの効果
コントロールベクター構築物および野生型ＳＥＲＰＩＮＥ２またはＳＥＲＰＩＮＥ２ムテインを発現する構築物を細胞にトランスフェクトし、細胞上清を採取した。
【０１９５】
ＳＥＲＰＩＮＥ２およびムテインをコードするｃＤＮＡ発現のためのＣＭＶプロモーターを含むプラスミドにクローン化した。プラスミドと脂質試薬Ｆｕｇｅｎｅ６との複合体を形成し、１０％のＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地にまいたヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、３７℃で５％のＣＯ２のもとでインキュベートした。４０時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、培地を５％のＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地で交換し、さらに４８時間、３７℃、５％のＣＯ２のもとでインキュベートした。発現されたタンパク質を含む細胞上清を、２９３Ｔ細胞から除去し、細胞に基づくアッセイにおけるＮＨＬＦ細胞を治療するために使用した。
【０１９６】
正常ヒト肺線維芽細胞を、０．０５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βを有する細胞上清で４８時間処理した。例１に示されるように、ｂＤＮＡアッセイを行なった。結果を図２および３に示す。ハウスキーピングコントロールＲＮＡ、β−アクチンは、野生型ＳＥＲＰＩＮＥ２またはＳＥＲＰＩＮＥ２ムテイン添加による上昇を示さなかった。しかしながら、コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンのレベルは野生型ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質の添加にともない増加した。ＳＥＲＰＩＮＥ２のＬＲＰ結合領域の変異を有するＳＥＲＰＩＮＥ２ムテインは、野生型ＳＥＲＰＩＮＥ２と判別不能だった。ＳＥＲＰＩＮＥ２のプロテアーゼ相互作用領域の変異は効果を打ち消した。標的プロテアーゼに結合できるが、それらを不可逆的に阻害できない変異体は中間的効果を示した。これらの結果は、ＳＥＲＰＩＮＥ２の標的プロテアーゼを阻害する能力は、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露されたヒト肺線維芽細胞によるコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現の上昇に関与することを示している。
【０１９７】
例７．ＳＥＲＰＩＮＥ２は、ヒト肺線維芽細胞においてコラーゲンタンパク質を誘導する
正常ヒト肺線維芽細胞は、３７℃で一晩、１５０ｕｌの繊維芽細胞増殖培地（ＦＧＭ、Ｌｏｎｚａ）中で、９６ウェルプレートに８０００細胞／ウェルで播種した。１５０ｕｌのＦＧＭ中の処理（０．０５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β、０．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βおよびｒｈＳｅｒｐｉｎＥ２用量曲線）を、翌日（０時間）、培地を吸引した後に添加した。２５ｕｇ／ｍｌアスコルビン酸を含む１５０ｕｌのＦＧＭ中の処理を、２４時間において、培地を吸引した後に添加した。７２時間において、細胞をＰＢＳで洗浄し、９５％のエタノールを使用して固定した。その後、細胞を１％のＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングし、１次抗体として３ｕｇ／ｍｌのマウス抗ヒトコラーゲン１抗体#AB6308 (Abcam)および２次抗体として１：５０００のヤギ抗マウス cat# 115-035-071 (Jackson Labs)を用いて標識した。ＨＲＰ−ＴＭＢを検出に使用し、吸光度を４５０ｎＭで読みとった。結果を図４に示す。ＳＥＲＰＩＮＥ２は、両方のＴＧＦ−β用量でＮＨＬＦ細胞のコラーゲンタンパク質の発現を誘導する際に、強力な活性を有することが示された。
【０１９８】
例８．ヒト肺線維芽細胞におけるＳＥＲＰＩＮＥ２発現
ＮＨＬＦ細胞（Ｌｏｎｚａ）を９６ウェルプレートに１ウェル当たり８０００細胞で播種し、一晩血清枯渇状態とし（０．５％のＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＦＢＭ（Ｌｏｎｚａ））、その後、新鮮な飢餓培地にて４８時間ＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄシステムズ）で処理した。ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。それぞれの治療条件の３つの独立した治療ウェルからの細胞ライセートをＲＮＡ単離のためにプールした。
【０１９９】
ＲＮＡは、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を使用して逆転写し、ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、ヒトＳＥＲＰＩＮＥ２（Ｑｉａｇｅｎ ＱＴ００００８０７８）およびＧｕｓＢ（ＱＴ０００４６０４６）に特異的なプライマーにより、説明書に従ってＡＢＩ７０００機器にて行った。ＳＥＲＰＩＮＥ２データはデルタ−デルタＣＴ法(Applied Biosystems, Foster City, CA) を使用して、ＧｕｓＢハウスキーピング遺伝子に対して標準化し、未処理の細胞コントロールに対して標準化したｍＲＮＡとして表示した。結果を図５に示す。ＮＨＬＦ細胞のＳＥＲＰＩＮＥ２のｍＲＮＡレベルは、用量依存的にＴＧＦ−β処理で増大した。
【０２００】
例９．マウスＳＥＲＰＩＮＥ２に対するポリクローナル抗体を使用した、肺線維芽細胞におけるマウスＳＥＲＰＩＮＥ２誘導型コラーゲン産生の阻害
正常ヒト肺線維芽細胞を９６ウェル組織培養プレートに１ウェル当り８０００細胞で播種し、一晩付着させた。細胞は、ＴＧＦ−β（ポジティブコントロール）またはＴＧＦ−β＋マウスＳＥＲＰＩＮＥ２の用量を増大させて刺激した。抗体処理のために、ＳＥＲＰＩＮＥ２は、ポリクローナル抗マウスＳＥＲＰＩＮＥ２抗体またはアイソタイプコントロール抗体とともに、３０分間室温でプレインキュベートし、その後細胞に添加した。２４時間後、培地を吸引し、細胞は、２５ｇ／ｍｌのＬ−アスコルビン酸の存在下、上記試薬とともにさらに２４時間刺激した。刺激後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、室温で１０分間９５％のエタノールにて固定し、ＰＢＳで再び洗浄し、室温で２時間１％のＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングした。その後、細胞を０．１％のｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、マウス抗ヒトコラーゲンＩ抗体（ブロッキング緩衝液中、Ａｂｃａｍ Ａｂ６３０８ １：２０００）とともに２時間インキュベートした。プレートを前述のように洗浄し、２次抗体（抗マウスＩｇＧＨＲＰ、１：５０００、ブロッキング緩衝液中）を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを前述のように洗浄し、ＴＭＢ ＯＮＥ溶液にて、暗所で２０分間現像した。２Ｎ硫酸の添加によりアッセイを停止し、光学濃度（ＯＤ）を４５０ｎｍで読みとった。結果を図６に示す。
【０２０１】
ＴＧＦ−βによる肺線維芽細胞の処理は、製造されたコラーゲンの量の用量依存的な増大をもたらした。ＴＧＦ−βを伴うマウスＳＥＲＰＩＮＥ２の添加は、ＴＧＦ−β単独と比較して、コラーゲンタンパク質の著しい上昇をもたらした。図に示されるように、ポリクローナル抗マウスＳＥＲＰＩＮＥ２抗体によるマウスＳＥＲＰＩＮＥ２のプレインキュベーションは、用量依存的にコラーゲンＩのＳＥＲＰＩＮＥ２誘導型増加を完全に打ち消し、一方で、アイソタイプコントロール抗体は効果を示さなかった。
【０２０２】
例１０．ブレオマイシン治療マウスにおけるＳＥＲＰＩＮＥ２誘導
約６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６のメスのマウス（ACE laboratories）を、麻酔（イソフルラン）をかける群、および０日目に４０ｌの無菌リン酸緩衝生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ１４１９０）を投与（Ｉ．Ｔ．）する群または０日目に４０ｌの硫酸ブレオマイシン（Ｓｉｇｍａ Ｂ５７７０５：０．９％無菌食塩水中１Ｕ／ｍｌ）を投与（Ｉ．Ｔ．）する群に分けた。
【０２０３】
マウスを７日目または１４日目にｉ．ｐ．ケタミン注射で安楽死させ、肺組織採取に使用した。動物に対して、心臓を通る潅流を行い、肺から血液を除去した。一旦潅流されると、マウス由来の肺葉を切除し、氷冷し、さらなる処理までファストプレップチューブ中に保持した。
【０２０４】
肺ライセートを、ＦａｓｔＰｒｅｐマトリックスＤチューブを用いて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃ＦＮＮ００２１リシス緩衝液＋プロテアーゼ阻害剤カクテルおよびホスファターゼ阻害剤カクテル１および２（Ｓｉｇｍａ）中で作製した。ライセートは、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡアッセイを用いて定量し、Ｂｉｏｒａｄローディングバッファー（Ｃａｔ＃ １６１−０７９１）＋ＢＭＥを用いて９５℃で５分間煮沸した。全２ｕｇのタンパク質を４−１２％のビス−トリスゲルのそれぞれのレーンにロードし、ＭＯＰＳ緩衝液中、２００Ｖで５０分間泳動させた。トランスファーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＩＢｌｏｔシステムを使用して行なった。０．１ｕｇ／ｍｌのＲ＆Ｄ ＡＦ２１７５により４℃で一晩標識することでブロットした。ＰＢＳ／０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０による３回の洗浄に続いて、ペルオキシダーゼ融合ウシ抗ヤギ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｃａｔ＃８０５−０３５−１８０）を１：１０，０００で、室温で１時間使用した。その後、ＰＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ２０とで６回ブロットを洗浄し、ＧＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＥＣＬＰｌｕｓを検出試薬として使用した。３０秒、２分および４分の露出により膜を現像した。
【０２０５】
ＩｍａｇｅＪソフトウェア（http://rsb.info.nih.gov/ij/）を平均ピクセル強度の定量するために使用した。特に、画像を反転させ、固定した次元の長方形の領域をそれぞれのバンド内に配置し、平均ピクセル強度を測定した。Ｒａｗ ＡＰＩ値はＧｒａｐｈＰａｄプリズムを使用して、プロットし、統計的有意性をテューキーポスト試験により一次元配置分散分析を使用して決定した。結果を図７に示す。ＳＥＲＰＩＮＥ２レベル（５１ＫＤバンド）は、食塩水処理と比較して、ｂｌｅ処理した肺ライセートにて著しく増大した。
【０２０６】
例１１．ヒト肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現に対するＳＥＲＰＩＮＥ２の効果の阻害
ＳＥＲＰＩＮＥ２に結合し、それとトロンビンのような標的プロテアーゼとの相互作用を遮断するモノクローナル抗体を構築することができる（Wagner et al., Biochemistry 27: 2173-2176, 1988）。ＳＥＲＰＩＮＥ２と標的プロテアーゼとの相互作用を遮断するこの抗体の能力は、精製された抗体および精製されたタンパク質によるインビトロ結合アッセイを使用して決定することができる。
【０２０７】
例１に記載されるアッセイにおいて、抗体は量を増大させて、固定量のＳＥＲＰＩＮＥ２とともにインキュベートすることができる。ヒト肺線維芽細胞によるコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現レベルはｂＤＮＡアッセイを使用して決定することができる。抗体の量の増大は、ヒト肺線維芽細胞によるコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現のレベルにおける減少をもたらし得る。
【０２０８】
例１２．ブレオマイシンマウスモデルにおけるコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現に対するＳＥＲＰＩＮＥ２の効果の阻害
例１１の抗体は、エアロゾルによって、量を増大させて、ブレオマイシン処理後の様々な時間、例えば１２日目に開始して、肺に送達することができる。抗体処理後の様々な時間に、例えばブレオマイシン処理後１５日目に、マウスの肺を採取して、食塩水を流して血液を除去し、ｍＲＮＡを抽出し、コラーゲンおよびα−平滑筋アクチンの発現を評価した。抗体の量の増大は、ヒト肺線維芽細胞によるコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現のレベルにおける減少を引き起こし得る。抗体の投与は、マウス肺における繊維症の症状を改善することができる。ヒトにおける肺線維症を治療するのに必要な抗体の送達の量およびタイミングは、これらの研究から決定することができる。
【背景技術】
【０００１】
特発性肺線維症（ＩＰＦ）、急性肺傷害（ＡＬＩ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）といった、肺線維症に関連する多くの様々な肺疾患が存在する（Howell et al., Am. J. Path. 159:1383-1395 (2001)、米国特許出願公開第２００９／０１３６５００号）。
【０００２】
例えば、特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、繊維芽細胞の増殖および過度のコラーゲン堆積によって特徴づけられる、間質性の肺疾患の一般的な形態である（Hardie et al., Am. J. of Respir. Cell Mol. Biol. 327:309-321 (2007)）。ＩＰＦは慢性炎症プロセスに帰着する可能性があり、これは間質における細胞外マトリックスの限局性の蓄積を発生させる。あるいは、ＩＰＦは肺の上皮の損傷によって引き起こされる可能性があり、過度の細胞外マトリックス形成を伴う異常な創傷治癒をもたらす可能性がある。現在まで、ＩＰＦに対する有効な治療法は存在しない（Hardie et al., (2007); Meltzer et al., Orphanet Journal of Rare Diseases, 3:8 (2008)）。
【０００３】
肺繊維芽細胞から筋線維芽細胞への転換は、特発性肺線維症およびその他の肺疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の病態生理学的特徴である（Dunkern et al., Eur J Pharmacol. 572(1):12-22 (2007)）。
【０００４】
ＩＰＦ患者の肺胞液では、抗繊維素溶解の活性のレベルが低下することが報告されている（Chapman et al., Am. Rev. Respir. Dis. 133:437-443 (1986)）。肺液におけるプラスミノゲン・アクチベータ・インヒビター（ＰＡＩ−１）抗原（ＳＥＲＰＩＮＥ１としても知られる）の濃度および肺細胞ライセートにおけるＰＡＩ−２抗原（ＳＥＲＰＩＮＢ２としても知られる）の濃度は、正常な被験者よりも患者のほうが高いことが報告された（同文献）。ＰＡＩ−１は肺線維症に関与する（Gharee-Kermani et al., Expert Opin. Investig. Drugs 17:905-916, 2008）。ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）は、脈管外の組織における繊維素溶解の主要な活性化剤である（同文献）。ＰＡＩ−１はｕＰＡを阻害する（同文献）。したがって、プラスミノゲンシステムのタンパク質分解特性は、肺修復の調節および繊維症に重要な役割を果たす可能性がある（同文献）。
【０００５】
ＳＥＲＰＩＮＥ２は不可逆的な細胞外セリンプロティナーゼ阻害剤である。これは、膵臓、結腸および胃の癌において過剰発現する（Neesse et al., Pancreatology 7:380-385, 2007）。ＳＥＲＰＩＮＥ２は、プロテアーゼ・ネキシンＩ（ＰＮ−１）および神経膠由来ネキシン（ＧＤＮ）としても知られる。ＳＥＲＰＩＮＥ２はさらに細胞外のウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子を阻害する（Scott et al., J. Biol. Chem. 258:4397-4403, 1983）。
【０００６】
膵臓癌細胞株にＳＥＲＰＩＮＥ２をトランスフェクションすると、侵襲性の腫瘍における細胞外マトリックス（ＥＣＭ）生産の大きな上昇と共に、異種移植片腫瘍の局所的な侵入の増強がもたらされた（Buchholz et al., Cancer Research 63:4945-4951 (2003)）。ＥＣＭ蓄積は、タイプＩコラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンについては陽性であった（同文献）。
【０００７】
ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質はマウスおよびヒトの肺において発現することがわかっている（DeMeo et al., Am. J. Hum. Gen. 78:253-264 (2006)）。この文献は、ＳＥＲＰＩＮＥ２の過剰発現は慢性閉塞性肺疾患と関連があることを示唆した。ＳＥＲＰＩＮＥ２は、トロンビン、トリプシン、プラスミンおよびウロキナーゼといったトリプシン様セリンプロテアーゼの細胞外阻害剤であることが実証された（同文献）。
【０００８】
ＳＥＲＰＩＮＥ２は繊維芽細胞によって分泌される（Farrell et al., J. Cell Physiol. 134:179-188, 1988）。ＳＥＲＰＩＮＥ２は、細胞外環境においてトロンビン、ウロキナーゼおよびプラスミンを含む特定のセリンプロテアーゼと複合体を形成し、これらはその後、細胞に取り込まれ、分解される（同文献）。ＳＥＲＰＩＮＥ２は、細胞外マトリックスに結合して、繊維芽細胞の表面に存在する（同文献）。
【０００９】
硬皮症患者の皮膚病変から単離した繊維芽細胞はコラーゲンおよびその他のマトリックス成分を過剰発現する（Strehlow et al., J. Clin. Invest. 103:1179-1190 (1999)）。ＳＥＲＰＩＮＥ２は硬皮症繊維芽細胞において過剰発現した（同文献）。マウス３Ｔ３繊維芽細胞におけるＳＥＲＰＩＮＥ２の一時的又は安定的な発現は、それぞれ、コラーゲンα−１（Ｉ）プロモーター活性または内因性コラーゲン転写物の濃度を増加させた（同文献）。活性部位に突然変異を導入したＳＥＲＰＩＮＥ２では、コラーゲンプロモーター活性の増大が生じなかった（同文献）。アンチセンス方向のＳＥＲＰＩＮＥ２の過剰発現は、マウス３Ｔ３繊維芽細胞において、コラーゲンプロモーターからの発現を阻害するようであった（同文献）。Strehlow et al., 1999の文献において、ヒトＳＥＲＰＩＮＥ２の点変異Ｒ３６４ＫおよびＳ３６５Ｔが行われており、これはトロンビンとの高い次元の複合体における形成を欠如させることが確認された。
【００１０】
低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）は、プロテアーゼ−ＳＥＲＰＩＮＥ２複合体の内部移行の原因となる受容体である（Knauer et al., J. Biol. Chem. 272: 29039-29045, 1997）。トロンビン−ＳＥＲＰＩＮＥ２のＬＲＰへの結合はアミノ酸４７−５８によって介在される（Knauer et al., J. Biol. Chem. 272:12261-12264, 1997）。ＬＲＰ結合領域におけるＳＥＲＰＩＮＥ２点変異Ｈ４８Ａ、および二重変異体Ｈ４８ＡおよびＤ４９Ａは、野生型と同様のトロンビン複合体形成速度を有するが、異化および内部移行が野生型と比較して５０％および１５％まで低下した（Knauer et al., J. Biol. Chem. 274:275-281, 1999）。
【００１１】
ＩＰＦにおける主要なエフェクター細胞は筋線維芽細胞である（Scotton and Chambers, Chest 132:1311-1321 (2007)）。筋線維芽細胞は、コラーゲンを高度に合成し、収縮性の表現型を有しており、α−平滑筋アクチンストレス・ファイバーの存在によって特徴づけられる（同文献）。筋線維芽細胞は、常在性の肺線維芽細胞の活性化／増殖、上皮−間充織の分化、循環する繊維芽幹細胞（繊維細胞）の動因に起因する可能性がある（同文献）。筋線維芽細胞は創傷治癒プロセスに関係する（Hinz et al., Am. J. Pathology 170:1807-1816 (2007)）。トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）β１は、筋線維芽細胞の発生の誘導に関与することが示された（同文献）。
【００１２】
肺線維症の患者における１つの研究において、α−平滑筋アクチン、γ−平滑筋アクチンおよびカルポニンといった筋タンパク質並びにインテグリンα７β１をコードする遺伝子の発現が著しく増大することがわかった（Zuo et al., P.N.A.S. 99:6292-6297 (2002)）。
【００１３】
肺線維症のマウスモデルにおいて、ＴＧＦ−αによる繊維症の誘導は、１−４日以内に、プロコラーゲンタイプＩ、α１（ＣＯＬ１Ａ１）、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２およびＣＯＬ１５Ａ１、およびエラスチンを含むいくつかの細胞外マトリックスタンパク質の肺ＲＮＡ濃度の上昇をもたらした（Hardie et al., 2007）。ＴＧＦ−α後に増加した防御／免疫タンパク質をコード化する多数のＲＮＡの濃度は、ＳＥＲＰＩＮＥ２を含めて、もはや発現しなかった（同文献）。ＳＥＲＰＩＮＥ２はＩＰＦと関連づけられなかったことに注目される（同文献）。
【００１４】
ＳＥＲＰＩＮＥ２とトロンビンとの反応速度は、ヘパリンが増大させる（Wallace et al., Biochem J. (1989) 257, 191-196）。ＳＥＲＰＩＮＥ２のヘパリン結合部位は、部位特異的突然変異によって局地化された（Stone et al., Biochem. 33:7731-7735, 1994）。ＳＥＲＰＩＮＥ２のヘパリン結合領域は、アミノ酸９０−１０５であることが明らかとなった。７つ全てのリジン残基のグルタミン酸残基への変異は、分解による測定と同様に、ヘパリン結合、ヘパリンが介在するトロンビン複合体形成を促進する能力、およびトロンビン−ＳＥＲＰＩＮＥ１の繊維芽細胞表面に結合する能力を失わせた（Stone et al., 1994; Knauer et al., JBC 1997, 272:29039-29045, 1997）。
【００１５】
Ｓｅｒｐｉｎｓは、３つのβ−シートおよび８−９つのヘリックスから構成される（Law et al., Genome Biology 7:216, 2006）。反応中心ループ（ＲＣＬ）は標的となるプロテアーゼと相互作用する（同文献）。ｓｅｒｐｉｎの切断は、プロテアーゼの活性部位を歪める構造変化をもたらし、これは、アシル中間体の効率的な加水分解および続くプロテアーゼの放出を妨げる（同文献）。したがって、ｓｅｒｐｉｎｓは不可逆的で自殺的な阻害剤である（同文献）。
【００１６】
ｓｅｒｐｉｎｓの多くの異なるタイプのアンタゴニストが作られた。例えば、ＳＥＲＰＩＮＥ２に対するモノクローナル抗体は、標的プロテアーゼの阻害を遮断することができる（Wagner et al., Biochemistry 27: 2173-2176, 1988; Boulaftali et al. Blood First Edition Paper, prepublished online October 23, 2009; DOI 10.1182/blood-2009-04-217240）。同様に、ＳＥＲＰＩＮＥ１（すなわちプラスミノゲンアクチベータインヒビター−１）に対するｓｃＦＶ断片を含む中和抗体が作られた（例えば、 Verbeke et al., J. Thromb. Haemost. 2:298-305, 2004, and Brooks et al., Clinical & Experimental Metastasis 18:445-453, 2001）。アンチセンスＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドが、ＳＥＲＰＩＮＥ２およびＳＥＲＰＩＮＥ１発現を阻害するために使用された（Kim and Loh, Mol. Biol. Cell. 17:789-798, 2006, and Sawa et al., J. Biol. Chem. 269:14149-14152, 1994）。
【００１７】
ＲＮＡ干渉もまた、ＳＥＲＰＩＮＥ１発現の抑制のために使用された（Kortlever et al., Nature Cell Biology 8:877-884, 2006）。さらに、ＳＥＲＰＩＮＥ１の反応中心ループに対応する１４アミノ酸ペプチドを使用して、ＳＥＲＰＩＮＥ１の不活性化が成功した（Eitzman et al., J. Cin. Invest. 95:2416-2420, 1995）。その他のｓｅｒｐｉｎｓは、反応中心ループに対応するペプチドによって同様に阻害された（Bjork et al., J. Biol. Chem. 267:1976-1982, 1992; Schulze et al., Eur. J. Biochem. 194:51-56, 1990）。低分子量分子ＸＲ５９６７（ジケトピペラジン）も、ＳＥＲＰＩＮＥ１活性を抑制することが示された（Brooks et al., Anticancer Drugs 15:37-44, 2004）。
【００１８】
肺線維芽細胞に関する多くの繊維症の肺疾患が存在する。例えば、特発性肺線維症は、慢性的で進行性の、しばしば致命的な間質性肺疾患であり、これに対して証明された薬物治療は存在しない（Gharaee-Kermani et al., 2008）。したがって、ＩＰＦおよびＣＯＰＤといった、肺線維芽細胞が関与する繊維症肺疾患を治療するための付加的な組成物および方法に対するニーズが存在する。
【発明の概要】
【００１９】
ヒト肺線維芽細胞に対して精製されたＳＥＲＰＩＮＥ２を投与すると、コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現が増大することが分かった。低密度リポ蛋白質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）に結合する能力を欠くＳＥＲＰＩＮＥ２ ＬＲＰ結合変異体の投与もまた、コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現を増大させる。その標的プロテアーゼと相互作用する能力を欠くＳＥＲＰＩＮＥ２プロテアーゼ相互作用変異体を投与した場合、コラーゲン１Ａ１の発現およびα−平滑筋アクチンの発現を増大する能力を示さなかった。標的プロテアーゼと相互作用する能力を維持するが、プロテアーゼの活性を完全には遮断しないＳＥＲＰＩＮＥ２プロテアーゼ阻害変異体(Strehlow et al., 1999)の投与は、中程度のコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現をもたらした。
【００２０】
ＳＥＲＰＩＮＥ２に対するポリクローナル抗体の投与は、用量依存的に、ＳＥＲＰＩＮＥ２−誘導型のコラーゲン１Ａ１の増大を無効にした。さらに、ＴＧＦ−βは、正常ヒト肺線維芽細胞におけるＳＥＲＰＩＮＥ２ ｍＲＮＡ発現の大きな上昇を誘導し、ブレオマイシンによるマウスの治療法は、肺ライセートにおけるＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質の発現濃度の上昇を引き起こした。
【００２１】
これらの結果は、特発性肺線維症において見られるように、ＳＥＲＰＩＮＥ２が、コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現の増大とともに、活性化された筋線維芽細胞の形成の上昇を引き起こし得ることを示す。本発明は、肺線維芽細胞において、コラーゲン１Ａ１の発現を増大するおよび／またはα−平滑筋アクチンの発現を増大するための方法および組成物を包含する。例えば、組み換え型のＳＥＲＰＩＮＥ２は、コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現および筋線維芽細胞形成を増大させるために肺線維芽細胞に添加することができる。ＳＥＲＰＩＮＥ２は、細胞外のプロテアーゼ阻害剤であるため、肺線維芽細胞自身によって製造でき、またはタンパク質の添加または近隣の細胞による生産といった別の供給源由来とできる。これらの組成物および方法は、肺線維芽細胞においてコラーゲン１Ａ１および／またはα−平滑筋アクチンの発現を増大させるのに有用であり、およびＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストのための薬剤スクリーニング検査に有用である。さらに、これらの組成物および方法は、インビボでの繊維症の活性を相殺する組成物のための薬剤アッセイに有用である。例えば、マウスを、その他の化合物と一緒に精製されたＳＥＲＰＩＮＥ２で処理し、繊維症を相殺する化合物のスクリーニングに使用することができる。さらに、本発明の組成物および方法は、創傷治癒を助ける活性化された筋線維芽細胞の形成の上昇に有用である。
【００２２】
様々な実施形態において、本発明は、ヒト肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１産生および／またはα−平滑筋アクチン産生のレベルを増大するための方法であって、細胞へＳＥＲＰＩＮＥ２を投与し、ヒト肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１および／またはα−平滑筋アクチンの発現の増大を検出することを含む方法を包含する。好ましい実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＥ２は発現ベクターにて、または精製されたタンパク質として投与される。好ましくは、コラーゲン発現の上昇は、コラーゲン１Ａ１のＲＮＡの濃度の上昇の測定により、および／またはα−平滑筋アクチンのＲＮＡ産生のレベルの上昇の測定により検出される。
【００２３】
高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２へのヒト肺線維芽細胞の曝露は、コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現の増大をもたらし、その発現の増大は、プロテアーゼ標的に結合するＳＥＲＰＩＮＥ２の能力を妨害することで遮断されるため、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露されたヒト肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現の減少を生じさせることが出来る。この方法において、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、筋線維芽細胞の発生のように、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に対するヒト肺線維芽細胞の曝露の効果を遮断することができる。したがって、本発明は、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストを使用して、肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１の発現を減少させ、および／またはα−平滑筋アクチンの発現を減少させるための方法および組成物を包含する。そのようなアンタゴニストは、肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１および／またはα−平滑筋アクチンの発現の減少に、および筋線維芽細胞の作用による場合のように肺線維芽細胞に介在される繊維症の予防に有用である。
【００２４】
様々な実施形態において、本発明は、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露されたヒト肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１および／またはα−平滑筋アクチンの発現のレベルを阻害するための方法であって、ヒト肺線維芽細胞にＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストを投与することを含む方法を包含する。１つの実施形態において、方法は、肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１および／またはα−平滑筋アクチンの発現の減少の検出を含む。様々な実施形態において、肺線維芽細胞は、アンタゴニストへの曝露の前にＴＧＦ−βに曝露される。ある実施形態において、肺線維芽細胞は、アンタゴニストへの曝露の前にＩＬ−１３に曝露される。好ましくは、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、抗体、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス核酸分子、ペプチドまたはＳＥＲＰＩＮＥ２の小分子阻害剤である。
【００２５】
ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、抗体等のような、ＳＥＲＰＩＮＥ１のアンタゴニストを含む、肺線維症のその他の阻害剤と組み合わせて使用することができる。
【００２６】
本発明はさらに、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露されたヒト肺線維芽細胞から筋線維芽細胞の形成を阻害するための方法であって、ヒト肺線維芽細胞へのＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの投与を含む方法を包含する。様々な実施形態において、肺線維芽細胞は、アンタゴニストへの曝露の前にＴＧＦ−βに曝露される。ある実施形態において、肺線維芽細胞は、アンタゴニストへの曝露の前にＩＬ−１３に曝露される。好ましくは、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、抗体、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス核酸分子、ペプチドまたはＳＥＲＰＩＮＥ２の小分子阻害剤である。
【００２７】
本発明はさらに、ＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露されたヒト肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１および／またはα−平滑筋アクチンの発現のレベルを阻害するための方法であって、ヒト肺線維芽細胞へのＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの投与を含む方法を包含する。１つの実施形態において、方法は、肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１および／またはα−平滑筋アクチンの発現の減少の検出を含む。様々な実施形態において、肺線維芽細胞は、アンタゴニストへの曝露の前にＴＧＦ−βに曝露される。ある実施形態において、肺線維芽細胞は、アンタゴニストへの曝露の前にＩＬ１３に曝露される。好ましくは、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、抗体、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス核酸分子、ペプチドまたはＳＥＲＰＩＮＥ２の小分子阻害剤である。
【００２８】
この発明の文脈において、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、ＳＥＲＰＩＮＥ２のＲＮＡ発現、タンパク質発現またはタンパク質活性を特異的に阻害することができる任意の分子を含む。したがって、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、ＳＥＲＰＩＮＥ２に特異的に結合し、その生物活動を抑制する抗体；ＳＥＲＰＩＮＥ２の発現に干渉するアンチセンス核酸ＲＮＡ；ＳＥＲＰＩＮＥ２の発現に干渉する小型干渉ＲＮＡ；ＳＥＲＰＩＮＥ２の小ペプチド阻害剤、およびＳＥＲＰＩＮＥ２の小分子阻害剤を含む。例えば、ＳＥＲＰＩＮＥ２への特異的に結合し、その生物活性を遮断するアンタゴニスト抗体を、コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現を減少させるために、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露された肺線維芽細胞に添加することができる。同様に、ＳＥＲＰＩＮＥ２に特異的に結合するアンタゴニスト抗体を、筋線維芽細胞の形成を減少させるために、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露された肺線維芽細胞に添加することができる。
【００２９】
コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現の増大に対する高いＳＥＲＰＩＮＥ２濃度の効果は、発明者らに対して、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に対するヒト肺線維芽細胞の曝露が、ＩＰＦおよびＣＯＰＤを含む様々な肺疾患に関連する主要なエフェクター細胞である筋線維芽細胞の形成を促進したことを示した。したがって、本発明は、肺線維芽細胞に対するＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの投与により、および筋線維芽細胞形成を減少させることにより、コラーゲン１Ａ１の発現および／またはα−平滑筋アクチンの過剰発現を患う患者における肺線維芽細胞においてα−平滑筋アクチンの発現を減少させるためのおよび／またはコラーゲン１Ａ１の発現を減少させるための方法および組成物を包含する。
【００３０】
本発明は、医学的状態の治療法のための医薬の製造のためのＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの使用であって、医学的状態は肺線維症、特にヒト肺線維芽細胞が高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露される肺線維症である使用を含む。好ましい実施形態において、医学的状態は特発性肺線維症（ＩＰＦ）または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。好ましくは、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは抗体、例えばモノクローナル抗体である。様々な実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス核酸分子、ペプチドまたはＳＥＲＰＩＮＥ２の小分子阻害剤である。ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストもまた、抗体等といった、ＳＥＲＰＩＮＥ１のアンタゴニストを含む肺線維症のその他の阻害剤と組み合わせて使用することができる。
【００３１】
このように、本発明は、ＩＰＦ、ＡＬＩ、ＡＲＤＳ、喘息およびＣＯＰＤのような肺疾患の治療のための方法および組成物を提供する。そのような組成物は、そのような疾病の病徴を有するまたはそのリスクのある患者に対して、予防的にまたは治療的に提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、ヒト肺線維芽細胞に対する精製されたＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質の効果のためのアッセイの結果を示す。ｂＤＮＡアッセイを、０、２．５または５μｇ／ｍｌの濃度の精製されたＳＥＲＰＩＮＥ２および０．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βで４８時間処理した正常ヒト肺線維芽細胞に対して行った。β−アクチン（ＡＣＴＢ）、α−平滑筋アクチン（ＡＣＴＡ２）およびコラーゲン１Ａ１（ＣＯＬ１Ａ１）のＲＮＡ濃度を測定した。
【図２】図２は、野生型（ＷＴ）ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＳＥＲＰＩＮＥ２ＬＲＰ結合変異体、ＳＥＲＰＩＮＥ２プロテアーゼ阻害変異体およびＳＥＲＰＩＮＥ２プロテアーゼ相互作用変異体を形質移入した細胞からのタンパク質上清の、β−アクチン（ＡＣＴＢ）、α−平滑筋アクチン（ＡＣＴＡ２）およびコラーゲン１Ａ１（ＣＯＬ１Ａ１）のＲＮＡ濃度に対する効果のためのアッセイの結果を示す。ベクターコントロール（ＶＣＭ）からの上清も使用した。ｂＤＮＡアッセイを、ＳＥＲＰＩＮＥ２含有上清またはＶＣＭ上清および０．０５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βで４８時間処理した正常ヒト肺線維芽細胞に対して行った。
【図３】図３は、野生型（ＷＴ）ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＳＥＲＰＩＮＥ２ＬＲＰ結合変異体、ＳＥＲＰＩＮＥ２プロテアーゼ阻害変異体およびＳＥＲＰＩＮＥ２プロテアーゼ相互作用変異体を形質移入した細胞からのタンパク質上清の、β−アクチン（ＡＣＴＢ）、α−平滑筋アクチン（ＡＣＴＡ２）およびコラーゲン１Ａ１（ＣＯＬ１Ａ１）のＲＮＡ濃度に対する効果のためのアッセイの結果を示す。ベクターコントロール（ＶＣＭ）からの上清も使用した。ｂＤＮＡアッセイは、ＳＥＲＰＩＮＥ２含有上清またはＶＣＭ上清および０．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βで４８時間処理した正常ヒト肺線維芽細胞に対して行った。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、２つの異なる濃度でＴＧＦ−β１が存在する状態において、ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質の濃度を増大することによるコラーゲンタンパク質生産の誘導を示す。
【図５】図５は、ＮＨＬＦ細胞におけるＴＧＦ−ｂ１によるＳＥＲＰＩＮＥ２ ＲＮＡ生産の誘導を示す。
【図６】図６は、マウスＳＥＲＰＩＮＥ２に対するポリクローナル抗体を使用した、肺線維芽細胞におけるマウスＳＥＲＰＩＮＥ２誘導性コラーゲン産生の誘導の阻害を示す。＃＃＃ｐ＜０．００１は処理なしの場合と比較、＊＊＊ｐ＜０．００１は０．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβの場合と比較、一次元配置分散分析およびＮｅｗｍａｎ Ｋｅｕｌｓ。
【図７】図７は、７または１４日間食塩水またはブレオマイシンで処理したマウスの肺ライセートにおけるＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質濃度を示す。統計的有意性は、一次元配置分散分析およびテューキーポスト試験（Tukey's Post test）を使用して決定した。ＳＥＲＰＩＮＥ２濃度（５１ＫＤバンド）は、ブレオ処理した肺ライセートにおいて著しく増加し、ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質が増大した。＊＊＊ｐ＜０．０００１は、食塩水処理したマウス肺と比較した。
【発明の詳細な説明】
【００３３】
本発明は、ＳＥＲＰＩＮＥ２を使用して、肺線維芽細胞においてコラーゲン１Ａ１の発現を増大させるためのおよび／またはα−平滑筋アクチンの発現を増大させるための方法および組成物を包含する。
【００３４】
本発明はさらに、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストを使用して、肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１の発現を減少させるためのおよび／またはα−平滑筋アクチンの発現を減少させるための方法および組成物を包含する。コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現を減少させるために、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストを高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露された肺線維芽細胞に添加することができる。同様に、筋線維芽細胞の形成を減少させるために、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストを高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露された肺線維芽細胞に添加することができる。
【００３５】
ＳＥＲＰＩＮＥ２への肺線維芽細胞の曝露は、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの投与によって阻害することができる。アンタゴニストは、ＳＥＲＰＩＮＥ２のＲＮＡ発現、タンパク質発現またはタンパク質活性を低下させるか、または遮断することができる。
【００３６】
「高い」濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２とは、細胞および／または組織について、平均値を超えるＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質の濃度を意味する。例えば、肺線維芽細胞の培養物に対するＳＥＲＰＩＮＥ２の付加は、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２をもたらす。さらに、患者の気管支洗浄におけるＳＥＲＰＩＮＥ２の濃度が、気管支洗浄サンプルについてのＳＥＲＰＩＮＥ２の平均値を超える場合、その濃度は高い。
【００３７】
高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に対する肺線維芽細胞の曝露は、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの投与によって阻害することができる。アンタゴニストは、ＳＥＲＰＩＮＥ２のＲＮＡ発現、タンパク質発現またはタンパク質活性を低下させるか、または遮断することができる。
【００３８】
本発明は、肺線維芽細胞に対するＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの投与により、および筋線維芽細胞形成を減少させることにより、ＩＰＦ患者における肺線維芽細胞においてコラーゲン１Ａ１の発現を減少させるためのおよび／またはα−平滑筋アクチンの発現を減少させるための方法および組成物を包含する。このように、本発明は特発性肺線維症の治療のための方法および組成物を提供する。
【００３９】
核酸分子
１つの実施形態において、本発明は、内因性の物質の混入がない一定の単離されたＳＥＲＰＩＮＥ２ヌクレオチド配列に関する。「ヌクレオチド配列」とは、分離した断片の形態におけるポリヌクレオチド分子またはより大きな核酸構成物の成分を意味する。核酸分子は、実質的に純粋な形態で、および、標準的な生化学的方法（概要は、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載される）による、その成分となるヌクレオチド配列の同定、操作および回収を可能とする量または濃度で、少なくとも一度単離されたＤＮＡまたはＲＮＡに由来した。そのような配列は、好ましくは、真核生物の遺伝子に典型的に存在する内在的な翻訳されない配列またはイントロンによって中断されていない、オープンリーディングフレームの形態で提供され、および／または構築される。翻訳されないＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’または３’に存在することができ、そこでは、前記配列はコード領域の操作または発現に干渉しない。
【００４０】
ＳＥＲＰＩＮＥ２核酸分子は、一本鎖および二本鎖の双方の形態のＤＮＡ並びにそのＲＮＡ相補物を含む。ＤＮＡは、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡおよびそれらの組み合わせを含む。本発明のＤＮＡ分子は、ＳＥＲＰＩＮＥ２をコードする全長遺伝子並びにポリヌクレオチドおよびその断片を含む。本発明の核酸は、通常ヒト供給源に由来するが、本発明は、その他の供給源に由来したものも含む。
【００４１】
本発明の特に好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１に記載されるＳＥＲＰＩＮＥ２のヒト配列である。配列番号１のＤＮＡによってコードされるアミノ酸の配列は配列番号２に示される。
【００４２】
１以上のコドンが同一のアミノ酸をコード化することができるという、既知の遺伝暗号の縮重により、ＤＮＡ塩基配列は、配列番号１に示される配列とは異なるものの、配列番号２のアミノ酸配列を有したポリペプチドをコードする配列にすることができる。そのような様々なＤＮＡ塩基配列は、サイレント突然変異（例えば、ＰＣＲ増幅の際に生じる）に起因する場合がありえ、または本来の配列の計画的な突然変異による生成物と成り得る。
【００４３】
したがって、本発明は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；（ｂ）配列番号２のポリペプチドをコードするＤＮＡ；（ｃ）中程度に厳密な条件の下、（ａ）または（ｂ）のＤＮＡに対してハイブリダイゼーションすることができ、且つＳＥＲＰＩＮＥ２またはその断片をコードするＤＮＡ；（ｄ）高度に厳密な条件の下、（ａ）または（ｂ）のＤＮＡに対してハイブリダイゼーションすることができ、且つＳＥＲＰＩＮＥ２またはその断片をコードするＤＮＡ；および（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）で定義されたＤＮＡに対して、遺伝暗号の結果として縮重しており、且つＳＥＲＰＩＮＥ２またはその断片をコードするＤＮＡから選択される、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ配列を包含する。当然、そのようなＤＮＡ塩基配列によってコードされたポリペプチドは、本発明に包含される。
【００４４】
本発明はしたがって、（ａ）本来の哺乳類ＳＥＲＰＩＮＥ２遺伝子のコード領域に由来したＤＮＡ；（ｂ）配列番号１のＤＮＡまたはその断片、（ｃ）中程度に厳密な条件の下、（ａ）または（ｂ）のＤＮＡに対してハイブリダイゼーションでき、且つ生物学的に活性なＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドをコードするＤＮＡ；および（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で定義されたＤＮＡに対して遺伝暗号の結果として縮重し、且つ生物学的に活性なＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドをコードするＤＮＡから選択される、生物学的に活性なＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ配列を提供する。そのようなＤＮＡの等価な配列によってコードされたＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドは、本発明に包含される。その他の哺乳類の種に由来したＤＮＡによってコードされるＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドもまた包含される。当該ＤＮＡは、配列番号１のＤＮＡの相補体にハイブリダイズすると考えられる。
【００４５】
ここで使用される「中程度に厳密な条件」とは、ニトロセルロース膜のためのプレ洗浄溶液５ｘＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の使用、約４２℃で約５０％のホルムアミド、６ｘＳＳＣのハイブリダイゼーション条件（または、約４２℃で約５０％のホルムアミドにおいて、Stark's溶液といったその他の同様のハイブリダイゼーション溶液）、約６０℃、０．５ｘＳＳＣ、０．１％のＳＤＳの洗浄条件を意味する。「高度に厳密な条件」とは、ほぼ６８℃、０．２ｘＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで洗浄することを伴う、上記のようなハイブリダイゼーション条件を意味する。
【００４６】
後述されるような、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチド断片および保存的なアミノ酸置換を含むポリペプチドをコードするＤＮＡも本発明の実施形態に含まれる。
【００４７】
その他の実施形態において、本発明の核酸分子は、さらに、本来のＳＥＲＰＩＮＥ２配列と比較して少なくとも８０％同一のヌクレオチド配列を含む。さらに、核酸分子が本来のＳＥＲＰＩＮＥ２配列と比較して、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一または少なくとも９９．９％同一である配列を含む実施形態も意図される。
【００４８】
ここに使用される、２つの核酸配列のパーセント同一性は、Devereuxらによって記述され(Nucl. Acids Res. 12:387, 1984)、ウィスコンシン遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）から利用可能な、ＧＡＰコンピュータ・プログラム・バージョン６．０を使用し、デフォルトパラメーターをＧＡＰプログラムに使用することで配列情報を比較して決定することができる。このデフォルトパラメーターは、（１）ヌクレオチドのための一成分比較マトリックス（同一の場合１および非同一の場合０の値を含む）およびGribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986の重みつき比較マトリックス（例えば、Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979に記載）、（２）それぞれの相違に対して３．０のペナルティー、およびそれぞれの相違におけるそれぞれの記号に対して付加的に０．１０のペナルティー；および（３）末端の相違に対してペナルティーはなし、ということを含む。
【００４９】
本発明はさらに、ポリペプチドの生産に有用な単離した核酸を提供する。そのようなポリペプチドは、任意の多くの従来技術によって調製することができる。ＳＥＲＰＩＮＥ２をコードするＤＮＡ塩基配列またはその所望の断片は、ポリペプチドまたは断片の生産のために発現ベクターにサブクローン化することができる。ＤＮＡ塩基配列は、有利に、適切なリーダーペプチドまたはシグナルペプチドをコードする配列に融合される。あるいは、所望の断片は、既知の技術を使用して、化学的に合成することができる。さらにＤＮＡ断片は、全長がクローン化されたＤＮＡ塩基配列の制限酵素による消化によって製造し、アガロースゲルの電気泳動によって単離してもよい。必要ならば、５’または３’末端を所望の点に再構築するオリゴヌクレオチドを、制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片に結紮することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、付加的に、所望のコード配列の上流に位置する制限酵素切断部位を含み、およびコード配列のＮ末端に開始コドン（ＡＴＧ）を有しうる。
【００５０】
さらに、周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の手法を、所望のタンパク質断片をコードするＤＮＡ塩基配列を単離および増幅するために使用することができる。ＤＮＡ断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドが、５’および３’プライマーとして使用される。オリゴヌクレオチドは、さらに、増幅されたＤＮＡ断片の発現ベクターへの挿入を容易にするために、制限酵素のための認識部位を含むことができる。ＰＣＲ技術は、Saiki et al., Science 239:487 (1988)；Recombinant DNA Methodology, Wu et al., eds., Academic Press, Inc., San Diego (1989), pp. 189-196；および PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, innis et al., eds., Academic Press, Inc. (1990)に記載されている。
【００５１】
ポリペプチドおよびその断片
本発明は、自然発生したもの、または組換えＤＮＡ技術に関する手法といった様々な技術によって製造されたものを含む、様々な形態におけるポリペプチドおよびその断片を包含する。例えば、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドをコードするＤＮＡは、部位特異的突然変異、ランダム突然変異およびインビトロの核酸合成を含むインビトロ突然変異誘発によって配列番号１から派生したものであってよい。そのような形態は、誘導体、変種およびオリゴマー並びに融合タンパク質またはその断片を含むが、これらに限定されない。
【００５２】
ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドは、上述された核酸配列によってコードされた全長タンパク質を含む。特に好ましいＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００５３】
本発明は、さらに、コラーゲン１Ａ１またはα−平滑筋アクチン生産の活性化またはヒト肺線維芽細胞からの筋線維芽細胞の発生といった、所望の生物学的活性を維持するＳＥＲＰＩＮＥ２のポリペプチドおよび断片を提供する。そのような断片は好ましくは可溶性ポリペプチドである。
【００５４】
さらに、異なる長さのポリペプチド断片も提供される。１つの実施形態において、好ましいＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチド断片は、アミノ酸配列の少なくとも６つの隣接するアミノ酸を含む。その他の実施形態において、好ましいＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチド断片は、配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、最大で少なくとも１００までの接触するアミノ酸を含む。これらのポリペプチドは可溶性形態において製造することができる。さらに、ポリペプチド断片は、抗体を生産において、免疫原として使用することができる。
【００５５】
本発明は、ＳＥＲＰＩＮＥ２およびその断片の変種を包含する。好ましくは、ＳＥＲＰＩＮＥ２の変種は、配列番号２との間で少なくとも５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を示すアミノ酸配列またはその断片を含む。そのような断片は、例えば、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または３７５のアミノ酸サイズであり得る。
【００５６】
パーセント同一性は、Devereuxらによって記述され(Nucl. Acids Res. 12:387, 1984)、ウィスコンシン遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）から利用可能であるＧＡＰコンピュータ・プログラム・バージョン６．０を使用して、配列情報を比較して決定することができる。ＧＡＰプログラムは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアライメント方法(J. Mol. Biol. 48:443, 1970)を、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎにより改定される通りに(Adv. Appl. Math 2:482, 1981)使用する。ＧＡＰプログラムのための好ましいデフォルトパラメーターは、（１）ヌクレオチドのための一成分比較マトリックス（同一の場合の値１および非同一の場合の値０を含む）およびGribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986の重みつき比較マトリックス（Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979に記載）、（２）それぞれの相違に対する３．０のペナルティー、およびそれぞれの相違におけるそれぞれの記号に対する付加的な０．１０のペナルティー；および（３）末端の相違に対してペナルティーはないことを含む。
【００５７】
ポリペプチドおよびその断片の製造
本発明のポリペプチドおよび断片の発現、単離および精製は、以下を含むがこれらに限定されない、任意の適切な技術によって達成することができる。
【００５８】
発現系
本発明は、ＳＥＲＰＩＮＥ２のＤＮＡを含む組み換えクローニングおよび発現ベクター、並びに組み換えベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。ＳＥＲＰＩＮＥ２のＤＮＡを含む発現ベクターは、当該ＤＮＡによってコードされたＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドまたは断片を調製するために使用することができる。ポリペプチドを製造する方法は、ポリペプチドをコードする組み換え発現ベクターが形質転換された宿主細胞を、ポリペプチドの発現を促進する条件の下で培養すること、その後、培養物から発現されたポリペプチドを回収することを含む。当業者は、発現されたポリペプチドを精製するための手順は、使用された宿主細胞のタイプ、ポリペプチドが膜結合型か宿主細胞から分泌されるような可溶性形態かといった因子によって変わることを理解するだろう。
【００５９】
任意の適切な発現システムを使用することができる。ベクターは、哺乳類、微生物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子に由来するものといった、適切な転写または翻訳の調節ヌクレオチド配列に実施可能に繋がった、本発明のＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドまたは断片をコードするＤＮＡを含む。調節配列の例は、転写プロモーター、オペレーターまたはエンハンサー、ｍＲＮＡのリボソームの結合部位、および転写および翻訳の開始および終了を制御するのに適切な配列を含む。調節配列がＤＮＡ配列に機能的に関係する場合、ヌクレオチド配列は実施可能に繋がっている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を制御する場合、プロモーターヌクレオチド配列はＤＮＡ塩基配列に実施可能に繋がっている。所望の宿主細胞において複製する能力を付与する複製起点、および形質転換体の同定のための選択遺伝子が、一般に発現ベクターに組込まれる。
【００６０】
さらに、適切なシグナルペプチド（本来または異種性）をコードする配列を発現ベクターに組込むことができる。シグナルペプチド（分泌のリーダー）のためのＤＮＡ配列を、本発明の核酸配列にインフレームで融合することができ、これにより、ＤＮＡは最初に転写され、ｍＲＮＡが翻訳され、シグナルペプチドを含む融合タンパク質が得られる。意図された宿主細胞において機能的なシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外の分泌を促進する。シグナルペプチドは、細胞からポリペプチドの分泌の際にポリペプチドから切断される。
【００６１】
ポリペプチドの発現に適している宿主細胞は、原核生物、酵母またはより高等な真核細胞を含む。哺乳類または昆虫の細胞は、宿主細胞としての使用に関して一般に好まれる。細菌、真菌、酵母および哺乳類の細胞の宿主とともに使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)に記載されている。無細胞翻訳系を使用して、ここに開示されたＤＮＡ構築物に由来したＲＮＡを使用してポリペプチドを製造することもできる。
【００６２】
原核生物系
原核生物はグラム陰性またはグラム陽性の生物を含む。形質転換に適した原核生物の宿主細胞は、例えば、Ｅ．コリ、バチルス・サブチリス、サルモネラ・ティフィムリウム、並びにシュードモナス属、ストレプトマイセス属およびスタフィロコッカス属内の様々なその他の種を含む。Ｅ．コリのような原核生物宿主細胞において、ポリペプチドは、原核生物宿主細胞における組み換えポリペプチドの発現を容易にするために、Ｎ−端末のメチオニン残基を含み得る。Ｎ−端末Ｍｅｔは、発現された組み換えポリペプチドから切断することができる。
【００６３】
原核生物宿主細胞で使用される発現ベクターは、一般に１以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を付与するか、または独立栄養要求を提供するタンパク質をコードする遺伝子である。原核生物の宿主細胞のための有用な発現ベクターの例は、クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）のような購入可能なプラスミドに由来したものを含む。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン抵抗性のための遺伝子を含んでおり、これにより、形質転換細胞を同定するための単純な手段を提供する。適切なプロモーターおよびＤＮＡ塩基配列がｐＢＲ３２２ベクターに挿入される。その他の購入可能なベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)およびｐＧＥＭ１(Promega Biotec, Madison, Wis., USA)を含む。
【００６４】
組み換え原核生物宿主の細胞発現ベクターに一般に使用されるプロモーター配列は、ベータラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモータシステム(Chang et al., Nature 275:615, 1978; and Goeddel et al., Nature 281:544, 1979)、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム(Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; and EP-A-36776)およびｔａｃプロモーター(Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982)を含む。特に有用な原核生物の宿主細胞発現システムは、ファージｌａｍｂｄａＰＬプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性リプレッサー配列を用いる。ｌａｍｂｄａＰＬプロモーターの誘導体を取り込む、アメリカンタイプカルチャーコレクションから利用可能なプラスミドベクターは、プラスミドｐＨＵＢ２（Ｅ．コリ種ＪＭＢ９、ＡＴＣＣ３７０９２中に存在）およびｐＰＬｃ２８（Ｅ．コリＲＲ１、ＡＴＣＣ５３０８２に存在）を含む。
【００６５】
ＳＥＲＰＩＮＥ２のＤＮＡは、通常の細菌の発現ベクターのマルチクローニングサイトにインフレームでクローニングされる。理想的には、ベクターはクローニング部位の上流に誘導可能なプロモーターを含み、誘導物の付加は、研究者の選択した時に、組換え型タンパク質の高いレベルの生産をもたらす。あるタンパク質について、プロモーターと関心ある遺伝子との間に、融合パートナー（例えばヘキサヒスチジン）をコードするコドンを取り込むことで、発現レベルを上昇させることができる。得られる「発現プラスミド」は、Ｅ．コリの様々な株において増幅することができる。
【００６６】
組換え型タンパク質の発現のために、細菌細胞は、予め決めた光学濃度に達するまで増殖培地中で増殖される。その後、例えば、タンパク質の発現を活性化するＩＰＴＧ（イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）の添加により、ｌａｃオペレーター／プロモーターを含むプラスミドから、組換え型タンパク質の発現が誘導される。誘導（典型的に１−４時間）の後、例えば、遠心分離機における４℃、２０分間および５，０００ＸＧによるペレッティングにより、細胞を収集する。
【００６７】
発現されたタンパク質の回収のために、ペレットにした細胞は、１０倍量の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）／１ＭのＮａＣｌで再懸濁し、その後、フレンチプレスに２または３回通すことができる。最も高度に発現した組換え型タンパク質は、封入体として知られる不溶性の凝集物を形成する。封入体は、遠心分離機において４℃、２０分および５，０００ＸＧでペレッティングすることにより可溶性タンパク質から精製することができる。封入体ペレットは、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）／１％のトリトンＸ−１００で洗浄し、その後、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）／８Ｍの尿素／０．１ＭのＤＴＴに溶解する。溶解しない任意の物質は、遠心分離（２０℃、２０分および１０，０００ＸＧ）によって除去される。関心あるタンパク質は、ほとんどの場合、得られる精製された上清中で最も豊富なタンパク質となると考えられる。このタンパク質は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）／５ｍＭのＣａＣｌ２／５ｍＭのＺｎ（ＯＡｃ）２／１ｍＭのＧＳＳＧ／０．１ｍＭのＧＳＨに対して透析することで、活性ある高次構造に「リフォールディング」することができる。リフォールディングの後に、イオン交換またはゲルろ過のような様々なクロマトグラフ法により精製を行うことができる。あるプロトコールでは、最初の精製はリフォールディングの前に実行することができる。例として、ヘキサヒスチジン標識した融合タンパク質は固定化ニッケルにて部分的に精製することができる。
【００６８】
先の精製およびリフォールディングの手順では、タンパク質は封入体から最も取り出されると考えられるものの、タンパク質精製の当業者は、多くの組換え型タンパク質は、細胞ライセートの可溶性画分から最も精製されると認識するだろう。これらの場合において、リフォールディングはしばしば必要ではなく、標準的クロマトグラフ法による精製を直接実行することができる。
【００６９】
酵母系
あるいは、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドは、酵母宿主細胞、好ましくはサッカロマイセス属（例えばＳ．セレビジエ）にて発現させることができる。ピチアまたはクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）のようなその他の酵母の種類も使用することができる。酵母ベクターは、しばしば、２μｍ酵母プラスミドからの複製起点の配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終了のための配列および選択可能マーカー遺伝子を含むだろう。酵母ベクターに適したプロモーター配列は、特に、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ(Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980)、またはその他の解糖系酵素(Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; and Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978)、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフクルトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホ−グルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのためのプロモーターを含む。酵母発現で使用されるその他の適切なベクターおよびプロモーターは、さらにHitzeman, EPA-73,657に記載されている。その他の代替は、グルコース抑制可能なＡＤＨ２プロモーターであり、これはRussellら (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982)およびBeierら(Nature 300:724, 1982)により記述されている。酵母およびＥ．コリの両方において複製可能なシャトルベクターは、Ｅ．コリにおける選択および複製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ塩基配列（Ａｍｐｒ遺伝子および複製起点）を上記の酵母ベクターに挿入することで構築することができる。
【００７０】
酵母アルファ因子リーダー配列を、ポリペプチドの分泌の誘導のために使用することができる。アルファ因子リーダー配列は、プロモーター配列と構造遺伝子配列の間にしばしば挿入される。Kurjan et al., Cell 30:933, 1982およびBitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984を参照されたい。酵母宿主からの組み換えポリペプチドの分泌を容易にするのに適したその他のリーダー配列は当業者に既知である。リーダー配列は１以上の制限部位を含むためにその３’末端付近を改変することができる。これは、構造遺伝子に対するリーダー配列の融合を容易にするだろう。
【００７１】
酵母形質転換プロトコールは当業者に既知である。そのような１つのプロトコールはHinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978に記載されている。Ｈｉｎｎｅｎらのプロトコールは、０．６７％の酵母窒素ベース、０．５％のカザミノ酸、２％のグルコース、１０ｍｇ／ｍｌのアデニンおよび２０ｍｇ／ｍｌのウラシルを含む選択培地においてＴｒｐ＋形質転換体を選択する。
【００７２】
ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクターによって形質転換された酵母宿主細胞は、「豊富な」培地における発現の誘導のために増殖することができる。豊富な培地の一例は、１％の酵母抽出物、２％のペプトン、および１％のグルコースから成り、８０ｍｇ／ｍｌのアデニンおよび８０ｍｇ／ｍｌのウラシルが添加された培地である。培地においてグルコースが枯渇すると、ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除が生じる。
【００７３】
哺乳類系または昆虫系
哺乳類または昆虫の宿主細胞培養物システムも、組み換えＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドを発現するために使用することができる。昆虫細胞の異種性タンパク質の生産のためのＢａｃｃｕｌｏｖｉｒｕｓシステムは、Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)に概説されている。哺乳類起源の樹立細胞株も使用することができる。適切な哺乳類の宿主細胞株の例は、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）(Gluzman et al., Cell 23:175, 1981)、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、およびアフリカミドリザル腎臓細胞線ＣＶ１に由来したＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）（McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991)に記載）を含む。
【００７４】
哺乳類細胞へＤＮＡを導入する確立された方法は、Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69に記載されている。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ脂質試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ脂質試薬といった購入可能な試薬を使用する付加的なプロトコールを、細胞をトランスフェクトするために使用できる(Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1987)。さらに、エレクトロポレーションは、哺乳類細胞をトランスフェクトするために、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されているように従来の手順を使用して使用することができる。安定した形質転換体の選択は、例えば細胞毒に対する抵抗性のように、当該分野において既知の方法を使用して行なうことができる。Kaufman et al., Meth. in Enzymology 185:487-511, 1990には、ジヒドロ葉還元酵素（ＤＨＦＲ）抵抗性といったいくつかの選択スキームが記載されている。ＤＨＦＲ選択に適している宿主種は、ＤＨＦＲを欠損するＣＨＯ種ＤＸ−Ｂ１１とすることができる(Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980)。ＤＨＦＲ ｃＤＮＡを発現するプラスミドは、種ＤＸ−Ｂ１１へ導入することができ、プラスミドを含む細胞のみを適切な選択培地にて増殖させることができる。発現ベクターに組込むことができる選択可能マーカーのその他の例は、Ｇ４１８およびハイグロマイシンＢといった抗生物質耐性を付与するｃＤＮＡを含む。ベクターを保持する細胞は、これらの化合物に対する抵抗性に基づいて選択することができる。
【００７５】
哺乳類宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳の制御配列は、ウィルスゲノムから切除することができる。一般に使用されるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）およびヒト・サイトメガロウイルスに由来する。ＳＶ４０ウィルスゲノムに由来したＤＮＡ塩基配列、例えば、ＳＶ４０オリジン、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位は、哺乳類の宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のためのその他の遺伝要素を提供するために使用することができる。ウイルスの初期および後期プロモーターは特に有用である。なぜならば、それらは、断片としてウィルスゲノムから容易に得ることができ、それはウイルスの複製起点を含むことができるためである(Fiers et al., Nature 273:113, 1978; Kaufman, Meth. in Enzymology, 1990)。ＳＶ４０のウイルスの複製起点部位に位置する、ＨｉｎｄＩＩＩサイトからＢｇｌＩサイトに伸びる約２５０ｂｐ配列が含まれる限り、より小さい、またはより大きなＳＶ４０断片も使用することができる。
【００７６】
哺乳類発現ベクターからの異種遺伝子の発現が改善されることが示された付加的なコントロール配列は、ＣＨＯ細胞に由来した発現増大配列因子（ＥＡＳＥ）のような因子(Morris et al., Animal Cell Technology, 1997, pp. 529-534 and PCT Application WO 97/25420)およびトリパータイトリーダー（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｌｅａｄｅｒ）（ＴＰＬ）およびアデノウイルス２由来のＶＡ遺伝子ＲＮＡ(Gingeras et al., J. Biol. Chem. 257:13475-13491, 1982)を含む。ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列は、ジシストロニック（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）なｍＲＮＡが効率的に翻訳されることを可能にする(Oh and Sarnow, Current Opinion in Genetics and Development 3:295-300, 1993; Ramesh et al., Nucleic Acids Research 24:2697-2700, 1996)。ジシストロニックなｍＲＮＡの一部としての異種起源のｃＤＮＡの発現および続く選択可能マーカー（例えばＤＨＦＲ）のための遺伝子の発現は、宿主のトランスフェクト可能性および異種起源のｃＤＮＡの発現を改善することが示された(Kaufman, Meth. in Enzymology, 1990)。ジシストロニックなｍＲＮＡを使用する典型的な発現ベクターは、ｐＴＲ−ＤＣ／ＧＦＰ（Mosser et al., Biotechniques 22:150-161, 1997）およびｐ２Ａ５Ｉ（Morris et al., Animal Cell Technology, 1997, pp. 529-534）である。
【００７７】
哺乳類宿主細胞にて使用されるその他の発現ベクターは、OkayamaおよびBergによって記述されるように構築することができる (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983)。また別の代替として、ベクターはレトロウイルスに由来するものとすることができる。付加的な有用な発現ベクターはｐＦＬＡＧ（登録商標）である。ＦＬＡＧ（登録商標）技術は、低分子量（１ｋＤ）で親水性のＦＬＡＧ（登録商標）マーカーペプチドの、ｐＦＬＡＧ（登録商標）発現ベクターによって発現された組み換えタンパク質のＮ末端への融合に集中する。
【００７８】
精製
本発明は、さらにポリペプチドおよびその断片を単離して精製する方法を含む。本発明に係る単離され且つ精製されたＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドは、上記の通り組み換え発現系によって製造でき、または天然の細胞から精製することができる。ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析において単一のタンパク質バンドが示されるように、実質的に精製することができる。ＳＥＲＰＩＮＥ２を製造する１つのプロセスは、ＳＥＲＰＩＮＥ２の発現を促進するのに十分な条件下で、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することを含む。その後、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドは、使用される発現系に依存して培地または細胞抽出液から回収される。
【００７９】
ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドの精製のための典型的な方法は当該分野において既知である。例えば、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドは、中空繊維ろ過、その後のヘパリン−セファロースカラムにおける再循環によって単離し、精製することができる（Howard et al., J. Biol. Chem. 261:684-689, 1986; Scott et al., J. Biol. Chem. 258:10439-10444, 1983; Scott et al., J. Biol. Chem. 258:4397-4403, 1983）。ＳＥＲＰＩＮＥ２に対する特定のポリクローナル抗体を使用したアフィニティークロマトグラフィー (Howard et al., 1986)を使用することもできる。
【００８０】
単離および精製
ここに使用されるような「単離され且つ精製された」という表現は、ＳＥＲＰＩＮＥ２は、例えば、組み換え宿主細胞培養物の精製物として、または非組み換えソースから精製された生成物として、その他の宿主ＤＮＡ、タンパク質またはポリペプチドと本質的に関連がないことを意味する。「単離され且つ精製された」ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質は、アルブミンのように、タンパク質のＳＥＲＰＩＮＥ２の精製を安定化させまたは支援するために、ＳＥＲＰＩＮＥ２に添加されたその他のタンパク質を含むことができる。ここに使用されるような「実質的に精製された」という用語は、ＳＥＲＰＩＮＥ２を含む混合物であって、特定の抗体を使用して除去できる既知のＤＮＡまたはタンパク質の存在を除けば、その他のＤＮＡ、タンパク質またはポリペプチドと本質的に関連がなく、実質的に精製されたＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質が生物学的活性を保つ混合物を意味する。「精製されたＳＥＲＰＩＮＥ２」という用語は、ここに記載されるように、ＳＥＲＰＩＮＥ２の「単離され且つ精製された」形態またはＳＥＲＰＩＮＥ２の「実質的に精製された」形態のいずれかを意味する。
【００８１】
ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質について「生物学的に活性」という用語は、ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質が、トロンビン、トリプシン、プラスミンおよびウロキナーゼのようなＳＥＲＰＩＮＥ２標的トリプシン様セリンプロテアーゼと関連させて、それらを不活性化することができることを意味する。
【００８２】
１つの好ましい実施形態において、組み換えポリペプチドまたは断片の精製は、ポリペプチドまたは断片の精製を助けるために、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドまたは断片の別のポリペプチドへの融合を使用して達成することができる。そのような融合パートナーは、ポリ−Ｈｉｓ、Ｆｃ成分またはその他の抗原同定ペプチドを含むことができる。
【００８３】
当業者に既知のように、任意の種の宿主細胞に関して、組み換えポリペプチドまたは断片を精製するための手順は、使用される宿主細胞の種といった因子および組み換えポリペプチドまたは断片が培地へ分泌されるかどうかによって異なるだろう。
【００８４】
一般に、組み換えＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドまたは断片は、分泌されなければ宿主細胞から単離し、または可溶性であり分泌されるならば培地もしくは上清から単離し、その後、１以上の濃縮、塩析、イオン交換、疎水的相互作用、親和性精製または体積排除クロマトグラフィーステップを行うことができる。これらのステップを達成する特定の方法に関して、培地は、最初に、購入可能なタンパク濃縮フィルター、例えばアミコンまたはミリポアＰｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮することができる。濃縮ステップに続いて、濃縮物は、ゲルろ過培地のような精製マトリックスに適用することができる。あるいは、陰イオン交換樹脂、例えばペンダント・ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは基体を使用することができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製において一般に使用されるその他の種とすることができる。あるいは、陽イオン交換ステップを使用することができる。適切な陽イオン交換体は、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスを含む。さらに、等電点電気泳動ステップを使用することができる。あるいは、疎水性相互作用クロマトグラフィーステップを使用することができる。適切なマトリックスは、樹脂に結合したフェニル基またはオクチル成分を含むことができる。さらに、選択的に組み換えタンパク質に結合するマトリックスを備えたアフィニティークロマトグラフィーを使用することができる。使用されるそのような樹脂の例は、ヘパリンカラム、レクチンカラム、色素カラムおよび金属をキレート化カラムである。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ培地（例えばペンダントメチル、オクチル、オクチルデシルまたはその他の脂肪性基を有するシリカゲルまたはポリマー樹脂）を使用する１以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ステップを、ポリペプチドをさらに精製するために使用することができる。前述の精製ステップのいくつかまたはすべては、様々な組み合わせにおいて、周知であり、単離され且つ精製された組み換えタンパク質を提供するために使用することができる。
【００８５】
細菌培養において製造された組み換えタンパク質は、宿主細胞の最初の破壊、遠心分離、不溶性ポリペプチドの場合には細胞ペレットからの抽出、または可溶性ポリペプチドの場合には上清液からの抽出、その後の１以上の濃縮、塩析、イオン交換、親和性精製または体積排除クロマトグラフィーステップにより通常単離される。最後に、ＲＰ−ＨＰＬＣを最終的な精製ステップのために使用することができる。微生物の細胞は、凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含む任意の都合のよい方法によって破壊できる。
【００８６】
さらに、発現されたポリペプチドを親和性精製するために、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドに対して得られたモノクローナル抗体といったＳＥＲＰＩＮＥ２結合タンパク質を含むアフィニティカラムを利用することが可能である。これらのポリペプチドは、従来技術を使用して、例えば高塩溶出緩衝液にてアフィニティカラムから除去し、その後、使用のためのより低塩の緩衝液に透析し、もしくは利用した親和性マトリックスに依存してｐＨまたはその他の成分を変更することにより除去し、または、本発明に由来したポリペプチドのような親和性成分の天然の基質を競合的に使用して除去することができる。
【００８７】
望ましい純度の程度は、タンパク質の意図された使用に依存する。例えば、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドがインビボで投与される場合、相対的に高い純度が望ましい。そのような場合、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析において、その他のタンパク質に対応するタンパク質バンドが検知できない程度にＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドは精製される。関係する分野の当業者は、ポリペプチドに対応する複数のバンドは、差異化糖鎖形成、差異化翻訳後修飾等によりＳＤＳ−ＰＡＧＥによって視覚化することができる。最も好ましくは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析における単一のタンパク質バンドによって示されるように、本発明のポリペプチドは本質的に均質に精製される。タンパク質バンドは、銀染色法、クマシーブルー染色または（タンパク質が放射性同位体で識別される場合）オートラジオグラフィーによって視覚化することができる。
【００８８】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の精製した製剤は、購入可能であり、本発明の方法において使用することができる。
【００８９】
ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニスト
本発明は、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストを包含する。ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、例えばＳＥＲＰＩＮＥ２のプロテアーゼ抑制機能を抑止することによりＳＥＲＰＩＮＥ２の機能を妨げる。好ましい実施形態において、アンタゴニストは、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２によって引き起こされるコラーゲン１Ａ１の発現をダウンレギュレートし、または減少させる。好ましい実施形態において、アンタゴニストは、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２によって引き起こされるα−平滑筋アクチンの発現をダウンレギュレートし、または減少させる。最も好ましくは、アンタゴニストは、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２によって引き起こされるコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現をダウンレギュレートし、または減少させる。好ましくは、ダウンレギュレーションは、肺線維芽細胞、最も好ましくはヒト肺線維芽細胞にて生じる。発現は、ＲＮＡの測定により直接測定することができ、または例えばタンパク質の測定により間接的に測定することができる。
【００９０】
そのようなアンタゴニストは、ＳＥＲＰＩＮＥ２に特異的に結合し、ＳＥＲＰＩＮＥ２を生物学的活性を阻害する抗体；ＳＥＲＰＩＮＥ２の発現を妨げるアンチセンス核酸ＲＮＡ；ＳＥＲＰＩＮＥ２の発現を妨げる小型干渉ＲＮＡ；ＳＥＲＰＩＮＥ２の反応中心ループに対応する小ペプチド；およびＳＥＲＰＩＮＥ２の小分子阻害剤を含む。
【００９１】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の候補アンタゴニストは、当該分野において既知の多数の技術および／または本願に開示される技術によって、トロンビン、トリプシン、プラスミンおよびウロキナーゼのようなトリプシン様セリンプロテアーゼのＳＥＲＰＩＮＥ２による阻害；インビトロでのコラーゲンおよび／またはα−平滑筋アクチンの発現の阻害；およびマウスモデルにおけるブレオマイシン誘導型線維症からの保護を妨げる能力といった機能についてスクリーニングすることができる。
【００９２】
抗体
１つの実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは抗体である。抗体は、合成、モノクローナルまたはポリクローナルであってよく、当該分野において周知の技術によって作ることができる。そのような抗体は、（非特異的結合とは反対に）抗体の抗原結合部位によって、特異的にＳＥＲＰＩＮＥ２に結合する。上述のような、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチド、断片、変種、融合タンパク質等は、免疫反応性の抗体の製造における免疫原として使用することができる。より特に、ポリペプチド、断片、変種、融合タンパク質等は、抗体の形成を誘発する抗原決定基またはエピトープを含む。
【００９３】
これらの抗原決定基またはエピトープは、線形または高次構造的（不連続）の何れかとすることができる。線形のエピトープはポリペプチドのアミノ酸の単一セクションからできており、高次構造的または不連続的エピトープは、タンパク質のフォールディングの際に、隣接するポリペプチド鎖の異なる領域由来のアミノ酸部分からできている(C. A. Janeway, Jr. and P. Travers, Immuno Biology 3:9 (Garland Publishing Inc., 2nd ed. 1996))。フォールディングしたタンパク質は複合の表面を有するため、利用可能なエピトープの数は非常に莫大である；しかしながら、タンパク質の立体配座および立体障害により、エピトープに実際に結合する抗体の数は利用可能なエピトープの数よりも小さい(C. A. Janeway, Jr. and P. Travers, Immuno Biology 2:14 (Garland Publishing Inc., 2nd ed. 1996))。エピトープは、当該分野において既知の任意の方法によって同定することができる。
【００９４】
したがって、本発明の１つの側面は、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドの抗原エピトープに関係がある。以下に詳細に記載されるように、そのようなエピトープは、抗体、特にモノクローナル抗体の作製に有用である。さらに、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドからのエピトープは、アッセイにおいて、研究試薬として使用することができ、培養されたハイブリドーマからのポリクローナルの血清または上清のような物質から特異的結合抗体を精製するために使用できる。そのようなエピトープまたはその変種は、固相法、ポリペプチドの化学的または酵素的分裂のような当該分野において周知の技術を使用して、または組み換えＤＮＡ技術を使用して製造することができる。
【００９５】
特異的にＳＥＲＰＩＮＥ２に結合し、標的プロテアーゼのその阻害を遮断する、ｓｃＦＶ断片を含む抗体は本発明に包含される。そのような抗体は、例えばVerbeke et al., J. Thromb. Haemost. 2:298-305, 2004およびBrooks et al., Clinical & Experimental Metastasis 18:445-453, 2001に記述される手法を使用して得ることができる。
【００９６】
本発明は、標的プロテアーゼのその阻害を遮断する、ＳＥＲＰＩＮＥ２に対するモノクローナル抗体を包含する。ＳＥＲＰＩＮＥ２に対する典型的な遮断型モノクローナル抗体は、Wagner et al., Biochemistry 27: 2173-2176, 1988およびBoulaftali et al. Blood First Edition Paper, prepublished online October 23, 2009; DOI 10.1182/blood-2009-04-217240に記載される。
【００９７】
特に、その標的プロテアーゼへのＳＥＲＰＩＮＥ２の結合を遮断するか、またはヘパリンへのＳＥＲＰＩＮＥ２の結合を遮断するモノクローナル抗体が好ましい。そのような抗体は、日常的なインビトロ結合アッセイを使用して、または例において述べられるアッセイを使用してスクリーニングすることができる。
【００９８】
１つの実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＥ２のプロテアーゼ相互作用ドメインへ結合するモノクローナル抗体が得られる。この抗体は、免疫原としてＳＥＲＰＩＮＥ２のプロテアーゼ相互作用ドメインを含む、完全なＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドまたはＳＥＲＰＩＮＥ２の断片を使用して得ることができる。抗体は、ＳＥＲＰＩＮＥ２と標的プロテアーゼとの相互作用を遮断するその能力について評価することができる。
【００９９】
抗体は、高い親和性および特異性で、標的に結合することができる。抗体結合部位がタンパク質間相互作用部位の近くに存在する場合、それらは相対的に大きな分子（〜１５０ｋＤａ）であり、立体的に２つのタンパク質（例えばＳＥＲＰＩＮＥ２およびその標的プロテアーゼ）間の相互作用を阻害することができる。したがって、１つの実施形態において、本発明は、ＳＥＲＰＩＮＥ２の「反応中心ループ」（ＲＣＬ）に結合し、同族のプロテアーゼへの結合を阻害し、ＳＥＲＰＩＮＥ２によるその不活性化を妨げることができる抗体を包含する。本発明は、直接プロテアーゼと接触するＲＣＬ残基に結合する抗体を包含する。本発明は、ＳＥＲＰＩＮＥ２−プロテアーゼ結合部位に対して近接した位置におけるエピトープに結合する抗体をさらに包含する。
【０１００】
様々な実施形態において、本発明は、ヘパリンのようなＳＥＲＰＩＮＥ２補因子と接触する残基に結合する抗体、またはＳＥＲＰＩＮＥ２抑制活性の補因子介在増強を妨げることによりＳＥＲＰＩＮＥ２抑制活性を減じる補因子結合部位の近接の残基に結合する抗体を含む。
【０１０１】
様々な実施形態において、本発明は、分子間相互作用（例えばタンパク質−タンパク質間相互作用）を妨げる抗体、並びに分子の相互作用（例えば分子内構造変化）を混乱させる抗体を包含する。したがって、ＳＥＲＰＩＮＥ２のＲＣＬ、好ましくはＳＥＲＰＩＮＥ２のアミノ酸３４８〜３６４またはアミノ酸３４８〜３７４に結合し、プロテアーゼ結合に続いて「ベータシートＡ」へのループの挿入を妨げ、および付着したプロテアーゼの歪みおよび続く分解に干渉することによりＳＥＲＰＩＮＥ２抑制活性を妨げる抗体は本発明に包含される。同様に、占有されていないＳＥＲＰＩＮＥ２のＲＣＬに「挿入された」立体配座を適応させることを強制し、プロテアーゼ結合部位をプロテアーゼ結合から隔離し、利用不可能に維持することによりｓｅｒｐｉｎ活性に干渉する抗体は、本発明に包含される。
【０１０２】
特異的標的に結合する抗体の能力は、関心ある標的に特異的に様々な種の機能的な分子を送達するために開発されている。そのような分子の例は、毒素、サイトカイン、放射性同位元素、および小分子薬剤またはプロドラッグを含む。そのような場合、これらの分子は、共有結合性化学薬品またはペプチドリンカーを介して抗体に付着してよく、またはサイトカインのようなポリペプチドの場合には、それらは、ペプチド結合によって直接付着してもよい。同様に、ＳＥＲＰＩＮＥ２を標的とする抗体は、特異的にそのプロテアーゼ阻害活性を不活性化する分子を送達するために使用することができる。１つの実施形態において、本発明は、ＳＥＲＰＩＮＥ２に変異したプロテアーゼを直接送達する抗体を包含する。この変異したプロテアーゼは、プロテアーゼ活性を保ち、ＳＥＲＰＩＮＥ２を持った共有結合のエステル結合を形成し、ＲＣＬを分断し、ベータシートへＲＣＬの挿入を誘導することができるが、それ自体の本来の基質に結合（および分断）する能力を維持しない。ＳＥＲＰＩＮＥ２がその同族のプロテアーゼに１：１のモル比で結合し、且つＳＥＲＰＩＮＥ２はプロテアーゼに結合し不活性化すると、それ自体を破壊するため、抗体によるＳＥＲＰＩＮＥ２へのこの変異したプロテアーゼの送達は有効にＳＥＲＰＩＮＥ２の供給を消費し、本来の同族プロテアーゼの活性レベルを増大することができる。変異したプロテアーゼは、同時翻訳のまたは翻訳後の手段によって抗体に付着することができる。
【０１０３】
抗体は、ＳＥＲＰＩＮＥ２の生物学的活性を遮断する能力またはリガンドへのＳＥＲＰＩＮＥ２の結合について、および／またはその他の特性についてスクリーニングすることができる。例えば、抗体は、トロンビン、トリプシン、プラスミンおよびウロキナーゼのようなトリプシン様セリンプロテアーゼをインビトロで結合し且つ遮断する能力についてスクリーニングすることができる（Wagner et al., Biochemistry 27: 2173-2176, 1988を参照されたい）。さらに、抗体は、ここに記載される手法を用いて、筋線維芽細胞形成を遮断するための、または高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露されたヒト肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１および／またはα−平滑筋アクチンの発現を阻害するための能力についてスクリーニングすることができる。さらに、Yaekashiwa et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156:1937-1944 (1997)およびDohi et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162:2302-2307 (2000)に記載されるように、マウスモデルを使用して、ブレオマイシン誘導型肺線維症に対してインビボで保護する能力についてスクリーニングすることができる。
【０１０４】
ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドのエピトープによって誘発することができる抗体に関して、エピトープが単離されている場合であっても、ポリペプチドの一部として残っている場合であっても、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方は下記に述べられるような従来技術によって作製することができる。
【０１０５】
本発明のこの側面において、ＳＥＲＰＩＮＥ２およびＳＥＲＰＩＮＥ２のアミノ酸配列に基づくペプチドを、ＳＥＲＰＩＮＥ２に特異的に結合する抗体を作製するために利用することができる。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、その断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖｓ）、単一ドメイン抗体断片（ＶＨＨまたはＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ）、二価抗体断片（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、並びに任意の組換え型のおよび合成により作製された結合パートナーを含むことを意味する。
【０１０６】
抗体は、約１０７Ｍ−１以上のＫａでＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドに結合する場合、特異的に結合していると定義される。結合パートナーまたは抗体の親和性は、例えばScatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949)に記載される従来技術を使用して、容易に決定することができる。
【０１０７】
ポリクローナル抗体は、当該分野において周知である手順を使用して、様々な供給源、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスまたはラットから容易に作製することができる。一般に、精製されたＳＥＲＰＩＮＥ２またはＳＥＲＰＩＮＥ２のアミノ酸配列に基づくペプチドは、適切に結合させて、典型的に注射によって宿主動物に投与される。ＳＥＲＰＩＮＥ２の免疫原性は、アジュバント、例えばフロインドの完全または不完全アジュバントを使用して、増強することができる。ブースター免疫化に続いて、血清の小標本を採取し、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドに対する反応性に関して試験する。そのような測定に有用な様々なアッセイの例は、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988に記載されるもの、並びに向流免疫電気泳動法（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、ラジオ免疫沈殿、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、およびサンドイッチアッセイといった手法を含む（米国特許４，３７６，１１０号および４，４８６，５３０号を参照されたい）。
【０１０８】
モノクローナル抗体は容易に周知の手順を使用して作製することができる。例えば、米国特許第３２，０１１号、第４，９０２，６１４号、第４，５４３，４３９号および第４，４１１，９９３号に記載される手法、Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKeam, and Bechtol (eds.), 1980を参照されたい。
【０１０９】
例えば、マウスのような宿主動物に対し、少なくとも１回、好ましくは少なくとも２回、約３週間の間隔で、単離されおよび精製されたＳＥＲＰＩＮＥ２または結合型ＳＥＲＰＩＮＥ２ペプチド、例えばアミノ酸３４８〜３６４またはアミノ酸３４８〜３７４を含むまたはそれから成るペプチドを、任意にアジュバントの存在下で、腹腔内に注入することができる。その後、マウス血清を従来のドットブロット技術または抗体捕獲（ＡＢＣ）によって分析し、どの動物が融合において最良か決定する。約２〜３週間後に、ＳＥＲＰＩＮＥ２または結合型ＳＥＲＰＩＮＥ２ペプチドをマウスの静脈内に注入してブーストする。その後、マウスを犠牲にし、確立したプロトコールに従って、脾臓細胞をＡｇ８．６５３（ＡＴＣＣ）といった市販される髄腫細胞と融合させる。簡潔には、ミエローマ細胞を培地で数回洗浄し、１つのミエローマ細胞に対して約３つの脾臓細胞の比率でマウス脾臓細胞と融合させる。融合剤は、当該分野において使用される任意の適した薬剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でありえる。融合物は、融合細胞の選択的な増殖を可能にする培地を含むプレートにまかれる。その後、融合した細胞を約８日間増殖させる。得られたハイブリドーマからの上清を収集し、ヤギ抗マウス一次抗体で覆われたプレートに添加する。洗浄後、標識が付されたＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドといった標識をそれぞれ十分に添加し、その後インキュベーションする。続いて、陽性ウェルを発見することができる。陽性クローンをバルクの培養液で増殖させ、上清をプロテインＡカラム（ファルマシア）で精製する。
【０１１０】
本発明のモノクローナル抗体は、例えばAlting-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990)に記載される代替技術を使用して製造することができる。当該文献は本願に援用される。同様に、結合パートナーは、組み換えＤＮＡ技術を使用して、特異的結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を組み込むよう構築することができる。そのような技術はLarrick et al., Biotechnology, 7:394 (1989)に記載される。
【０１１１】
それらは従来技術によって製造することができる、そのような抗体の抗原結合性フラグメントも本発明に包含される。そのような断片の例は、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片を含むがこれらに限定されない。遺伝子工学技術によって生産された抗体断片および誘導体も提供される。
【０１１２】
本発明のモノクローナル抗体は、キメラ抗体、例えばマウスのモノクローナル抗体のヒト化バージョンを含む。そのようなヒト化抗体は、既知の技術によって作製することができ、抗体がヒトに投与される場合、免疫原性の低下という長所を示す。１つの実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体は、マウスの抗体の可変領域（またはその単なる抗原結合部位）およびヒト抗体に由来した定常領域を含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体に由来した可変領域断片（抗原結合部位を欠く）を含み得る。キメラの、およびさらに操作された抗体の製造のための手順は、Riechmann et al. (Nature 332:323, 1988)、Liu et al. (PNAS 84:3439, 1987)、Larrick et al. (Bio/Technology 7:934, 1989)およびWinter and Harris (TIPS 14:139, May, 1993)に記載される手順を含む。抗体を遺伝子組換えにより得る手順は、英国特許第２，２７２，４４０号、米国特許第５，５６９，８２５号および第５，５４５，８０６号に見ることができる。
【０１１３】
遺伝子工学的方法によって製造された抗体、例えばヒト部分および非ヒト部分の双方を含み、標準的組み換えＤＮＡ技術を使用して作ることができるキメラのおよびヒト化されたモノクローナル抗体を使用することができる。そのようなキメラのおよびヒト化されたモノクローナル抗体は、当該分野において既知の標準的なＤＮＡ技術を用いて遺伝子工学によって製造することができ、例えばＲｏｂｉｎｓｏｎらによる国際公開番号ＷＯ８７／０２６７１；Ａｋｉｒａらによるヨーロッパ特許出願０１８４１８７；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．によるヨーロッパ特許出願０１７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎらによるヨーロッパ特許出願０１７３４９４；ＮｅｕｂｅｒｇｅｒらによるＰＣＴ国際公開ＷＯ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙらによる米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙらによるヨーロッパ特許出願０１２５０２３；BetterらによるScience 240:1041 1043, 1988；LiuらによるPNAS 84:3439 3443, 1987；LiuらによるJ. Immunol. 139:3521 3526, 1987；SunらによるPNAS 84:214 218, 1987；NishimuraらによるCanc. Res. 47:999 1005, 1987；Woodらによる Nature 314:446 449, 1985；およびShawらによるJ. Natl. Cancer Inst. 80:1553 1559, 1988；Morrison, S. Lによる Science 229:1202 1207, 1985；Oiらによる BioTechniques 4:214, 1986；Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５，２２５，５３９号；JonesらによるNature 321:552 525, 1986；VerhoeyanらによるScience 239:1534, 1988；およびBeidler らによるJ. Immunol. 141:4053 4060, 1988に記載の方法を使用することができる。
【０１１４】
合成および半合成抗体に関して、抗体断片、アイソタイプスイッチング抗体（ｉｓｏｔｙｐｅ ｓｗｉｔｃｈｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ヒト化抗体（例えばマウス−ヒト、ヒト−マウス）、ハイブリッド、複数の特異性を有する抗体、および完全に合成された抗体様分子を含むが、これらに限定されないと意図される。
【０１１５】
好ましい実施形態において、アンタゴニストは、ＳＥＲＰＩＮＥ２の活性部位（すなわち反応中心ループ）を特異的に認識する抗体である。治療の適用のために、ヒトの定常領域および可変領域を有する「ヒト」モノクローナル抗体は、抗体に対する患者の免疫反応を最小化するためにしばしば好まれる。そのような抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含む遺伝子組み換え動物を免疫することで得ることができる。Jakobovits et al. Ann NY Acad Sci 764:525-535 (1995)を参照されたい。
【０１１６】
ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドに対するヒトモノクローナル抗体は、対象のリンパ細胞に由来するｍＲＮＡから作製された免疫グロブリン軽鎖および重鎖ｃＤＮＡを使用して、ＦａｂファージディスプレーライブラリーまたはｓｃＦｖファージディスプレーライブラリーのようなコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーを構築することで作製することができる。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらによるＰＣＴ公報ＷＯ９２／０１０４７；Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581 597；およびGriffths et al. (1993) EMBO J 12:725 734を参照されたい。さらに、抗体可変領域のコンビナトリアルライブラリーは、既知のヒト化抗体を変異することで得ることができる。例えば、ＳＥＲＰＩＮＥ２に結合することが既知のヒト化抗体の可変領域は、例えば無作為に突然変異により変更されたオリゴヌクレオチドを使用して変異を導入することができ、その後ＳＥＲＰＩＮＥ２への結合についてスクリーニングすることができる変異した可変領域のライブラリーを作製できる。免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ領域内のランダムな突然変異生成を誘導する方法、重鎖および軽鎖を無作為に交叉させ、対を形成さえる方法およびスクリーニング法は、例えば、ＢａｒｂａｓらによるＰＣＴ公報ＷＯ９６／０７７５４、Barbas et al. (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4457 446に見ることができる。
【０１１７】
免疫グロブリンライブラリーは、好ましくは線状ファージに由来するディスプレイパッケージの集団によって発現させ、抗体ディスプレイライブラリーを形成することができる。抗体ディスプレイライブラリーの取得に特に使用できる方法および試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒらによる米国特許第５，２２３，４０９号；ＫａｎｇらによるＰＣＴ出願ＷＯ９２／１８６１９；ＤｏｗｅｒらによるＰＣＴ出願ＷＯ９１／１７２７１；ＷｉｎｔｅｒらによるＰＣＴ出願ＷＯ９２／２０７９１；ＭａｒｋｌａｎｄらによるＰＣＴ出願ＷＯ９２／１５６７９；ＢｒｅｉｔｌｉｎｇらによるＰＣＴ出願ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらによるＰＣＴ出願ＷＯ９２／０１０４７；ＧａｒｒａｒｄらによるＰＣＴ出願ＷＯ９２／０９６９０；ＬａｄｎｅｒらによるＰＣＴ出願ＷＯ９０／０２８０９；Fuchsらによる(1991) Bio/Technology 9:1370 1372；Hay らによる(1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81 85；Huseらによる (1989) Science 246:1275 1281；Griffthsらによる (1993)同上；Hawkinsらによる (1992) J Mol Biol 226:889 896；Clacksonらによる (1991) Nature 352:624 628；Gram らによる (1992) PNAS 89:3576 3580；Garrad らによる(1991) Bio/Technology 9:1373 1377；Hoogenboom らによる (1991) Nuc Acid Res 19:4133 4137；およびBarbas らによる (1991) PNAS 88:7978 7982に見ることができる。一旦ディスプレイパッケージ（例えば線状ファージ）の表面に表示されると、抗体ライブラリーは、ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドに結合する抗体を発現するパッケージを同定し単離するためにスクリーニングされる。好ましい実施形態において、ライブラリーの主要なスクリーニングは、固定化ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドによるパニングに関与し、固定化ＳＥＲＰＩＮＥ２ポリペプチドに結合する抗体を示すディスプレイパッケージが選択される。
【０１１８】
有機的およびペプチド小分子阻害剤
本発明のその他の実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＥ２の活性部位（すなわち反応中心ループ）に結合する能力の存在に基づいてＳＥＲＰＩＮＥ２のためのリガンドとして設計された、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはペプチドミメティクスであるアンタゴニストが使用される。インテグリンのためのリガンドとしてのそのような分子のデザインは、例えば、Pierschbacher et al., J. Cell. Biochem. 56:150-154 (1994)、Chorev et al. Biopolymers 37:367-375 (1995)、Pasqualini et al., J. Cell. Biol. 130:1189-1196 (1995)およびSmith et al., J. Biol, Chem, 269:32788-32795 (1994)に例証される。
【０１１９】
反応中心ループに対応するアミノ酸ペプチドを使用するＳＥＲＰＩＮＥ２の不活性化のための典型的な手順は、Eitzman et al., J. Cin. Invest. 95:2416-2420, 1995、Bjork et al., J. Biol. Chem. 267:1976-1982, 1992およびSchulze et al., Eur. J. Biochem. 194:51-56, 1990に提供される。
【０１２０】
本発明のその他の実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＥ２活性を不活性化または抑制する低分子量有機分子であるアンタゴニストが使用される。ＳＥＲＰＩＮＥ２の不活性化のための低分子量有機分子の使用のための典型的な手順は、Brooks et al., Anticancer Drugs 15:37-44, 2004および米特許第７，３６８，４７１号、第７，２５９，１８２号および第６，５９９，９２５号に提供され、これらはＳＥＲＰＩＮＥ１の不活性化のための低分子量有機分子を提供する。
【０１２１】
アンチセンス核酸分子
本発明のある実施形態において、アンチセンス核酸分子はＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストとして使用される。アンチセンス核酸分子は、標的タンパク質の産生を抑制するためのヌクレオチドの特異的な配列に結合するように設計された核酸の相補的なオリゴヌクレオチド鎖である。
【０１２２】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によれば、ＤＮＡの断片（配列番号１）を含む。そのような断片は、一般に、少なくとも約１４のヌクレオチド、好ましくは約１４から約３０のヌクレオチドを含む。所定のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを得る能力は、例えば、Stein and Cohen (Cancer Res. 48:2659, 1988)およびvan der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988)に記載される。
【０１２３】
アンチセンスＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドは、Kim and Loh, Mol. Biol. Cell. 17:789-798, 2006およびSawa et al., J. Biol. Chem. 269:14149-14152, 1994に記載されるように、ＳＥＲＰＩＮＥ２発現を阻害するために作製し使用することができる。
【０１２４】
これらの成分をコードするコード鎖配列が与えられると、アンチセンス核酸は、ワトソンおよびクリックの塩基対の規則に従って設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ｍＲＮＡの全コード領域に相補的にすることができるが、より好ましくは、ｍＲＮＡのコーディングまたは非コーディング領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドとできる。例えば、アンチセンスのオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に対して相補的にできる。アンチセンスのオリゴヌクレオチドは、例えば、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０の長さのヌクレオチドにできる。アンチセンス核酸は、当該分野において既知の手法を使用して化学合成および酵素の結紮反応を使用して構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然のヌクレオチドを使用して、または分子の生物学的安定性を増大するように若しくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成された二重鎖の物理的安定性を増大するように設計された様々に修飾されたヌクレオチドを使用して（例えば、ホスホロチオネート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる）、化学的に合成できる。アンチセンス核酸を得るために使用することができる修飾されたヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキノシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、キノシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローン化された発現ベクターを使用して（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、関心のある標的核酸に対するアンチセンス方向になるだろう）、生物学的に製造することができる。
【０１２５】
標的核酸配列へのアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合は、ＲＮＡｓｅＨによるｍＲＮＡの増強された分解、スプライシングの阻害、転写または翻訳の早期終止を含むいくつかの手段の１つにより、またはその他の手段により、タンパク質発現を遮断または阻害する二重鎖の形成をもたらす。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、したがって、ＳＥＲＰＩＮＥ２の発現を遮断するために使用することができる。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、さらに、改変された糖−リン酸ジエステル骨格を有するオリゴヌクレオチド（または、ＷＯ９１／０６６２９に記載されるようなその他の糖結合）を含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼに強い。耐性のある糖結合を有するそのようなオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であり（すなわち、酵素の分解に耐性があり）、しかし、標的ヌクレオチド配列に結合することができる配列特異性を維持する。
【０１２６】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのその他の例は、ＷＯ９０／１０４４８に記載されるような有機成分、およびポリ−（Ｌ−リジン）のような標的核酸配列のためのオリゴヌクレオチドの親和性を増大するその他の成分に共有結合するオリゴヌクレオチドを含む。またさらに、挿入剤、例えばエリプティシン（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ）およびアルキル化剤または金属複合体をセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合し、標的ヌクレオチド配列に対するアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を改変することができる。
【０１２７】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、例えばリポフェクション、ＣａＰＯ４介在ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子導入方法により、またはエプスタインバーウイルスのような遺伝子導入ベクターの使用により、標的核酸配列を含む細胞に導入することができる。
【０１２８】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、適切なレトロウイルスベクターにセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを挿入し、その後細胞をインビボまたはエクスビボのいずれかで挿入された配列を含むレトロウイルスベクターに接触させることで、標的核酸配列を含む細胞に導入される。適切なレトロウイルスベクターは、マウスレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶ由来のレトロウイルス）またはＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５ＢおよびＤＣＴ５Ｃと名付けられる二重コピーベクター（ＰＣＴ出願米国番号第９０／０２６５６号を参照されたい）を含む。
【０１２９】
さらに、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９１／０４７５３に記載されたように、リガンド結合分子との結合の形成により標的ヌクレオチド配列を含む細胞へ導入することができる。適切なリガンド結合分子は、細胞表面レセプタ、成長因子、その他のサイトカイン、または細胞表面レセプタに結合するその他のリガンドを含むが、これらに限定されない。好ましくは、リガンド結合分子の結合は、実質的に、対応する分子または受容体に結合するリガンド結合分子の能力に影響を与えず、またはセンスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその結合したバージョンの細胞への侵入を遮断しない。
【０１３０】
あるいは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９０／１０４４８に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成によって標的核酸配列を含む細胞へ導入することができる。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性リパーゼによって細胞内で分離される。
【０１３１】
アンチセンスアンタゴニストは、ＲＮＡのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドとして提供することができる（例えば、Murayama et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:109-114 (1997)参照）。アンチセンス遺伝子もまた、ウイルスベクター、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（例えばJi et al., J. Viral Hepat. 4:167-173 (1997)参照）；アデノ関連性ウイルス（例えば、Xiao et al. Brain Res. 756:76-83 (1997)参照）；またはＨＶＪ（センダイウイルス）−リポソーム遺伝子運搬システムを含むが、これらに限定されないその他のシステム（例えばKaneda et al. Ann, N.Y. Acad. Sci. 811:299-308 (1997)参照）；「ペプチドベクター」（例えばVidal et al. CR Acad. Sci III 32):279-287 (1997) 参照参照）；エピソームまたはプラスミドベクターにおける遺伝子（例えば、Cooper et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:6450-6455 (1997), Yew et al. Hum Gene Ther 8:575-584 (1997)参照）；ペプチド−ＤＮＡ凝集物における遺伝子（例えばNiidome et al. J. Biol. Chem. 272:15307-15312 (1997)参照）；「ネイキッドＤＮＡ」（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号および第５，５８９，４６６号参照）；および脂質ベクターシステム（例えばLee et al. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 14:173-206 (1997)参照）において提供することができる。
【０１３２】
小型干渉ＲＮＡ
本発明のある実施形態において、ＲＮＡｉ分子はＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストとして使用される。ＲＮＡｉは、配列特異的な方式にて標的ｍＲＮＡの分解により遍在的な機構によって遺伝子発現を調節する（McManus et al., 2002, Nat Rev Genet 3:737 747）。哺乳類細胞では、ＲＮＡの干渉（ＲＮＡｉ）は、ｓｉＲＮＡの２１〜２３のヌクレオチド二重鎖が引き金となり得る（Lee et al., 2002, Nat Biotechnol 20: 500 505; Paul et al., 2002, Nat Biotechnol. 20:505 508; Miyagishi et al., 2002, Nat Biotechnol. 20:497 500; Paddison et al., 2002, Genes Dev. 16: 948 958）。Ｕ６プロモーターによって駆動されたｓｉＲＮＡまたはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の発現は、効果的に、哺乳類細胞の標的ｍＲＮＡ分解を介在する。合成的ｓｉＲＮＡ二重鎖およびプラスミド由来ｓｉＲＮＡは、ＨＩＶゲノムＲＮＡを特異的に分解することにより、ＨＩＶ−１感染および複製を阻害することができる（McManus et al., J. Immunol. 169:5754 5760; Jacque et al., 2002, Nature 418:435 438; Novina et al., 2002, Nat Med 8:681 686）。さらに、ＨＣＶゲノムＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡはＨＣＶ複製を阻害する（Randall et al., 2003, Proc Natl Acad Sci USA 100:235 240; Wilson et al., 2003, Proc Natl Acad Sci USA 100: 2783 2788）。ｓｉＲＮＡによって標的とされたＦａｓは、劇症肝炎および繊維症から肝臓を保護する（Song et al., 2003, Nat Med 9:347 351）。
【０１３３】
好ましい実施形態において、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子はＳＥＲＰＩＮＥ２の遺伝子発現を減少させるために使用される。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用して、関連するヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現を抑えることを意味する。ＲＮＡｉはまた、転写後遺伝子抑制（またはＰＴＧＳ）とも呼ばれる。細胞の細胞質において通常見つかる唯一のＲＮＡ分子は一本鎖ｍＲＮＡの分子であるため、細胞は、ｄｓＲＮＡを認識し２１−２５の塩基対を含む断片（二重らせんの約２つのターン、小型干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡと呼ばれる）に切断する酵素を有す。断片のアンチセンス鎖は、内因性の細胞のｍＲＮＡの分子上における相補的センス配列とハイブリダイズするように、センス鎖から十分離れている。このハイブリダイゼーションは、二本鎖領域のｍＲＮＡの切断のきっかけとなり、これにより、ポリペプチドに翻訳される能力を破壊する。特定の遺伝子に対応するｄｓＲＮＡの導入は、したがって、特定の組織および／または選択された時間における、細胞自身のその遺伝子の発現をノックアウトする。
【０１３４】
ＳＥＲＰＩＮＥ２発現を抑制するＲＮＡ干渉の使用のための典型的な手順は、Kortlever et al., Nature Cell Biology 8:877-884, 2006に提供される。
【０１３５】
二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは哺乳動物における遺伝子発現に干渉するために使用することができる。ｄｓＲＮＡは、ＳＥＲＰＩＮＥ２核酸分子の無発現変異体と同様な表現型をもたらす本発明の核酸分子の機能の抑制性ＲＮＡまたはＲＮＡｉとして使用される（Wianny & Zernicka-Goetz, 2000, Nature Cell Biology 2: 70 75参照）。
【０１３６】
あるいは、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を介在するために細胞に直接導入することができる(Elbashir et al., 2001, Nature 411:494 498)。多くの方法、例えば化学合成またはインビトロの転写が、ｓｉＲＮＡの作製のために開発されている。一旦作製されると、ｓｉＲＮＡｓは一過的なトランスフェクションによって細胞へ導入される。さらに、多数の発現ベクターが、一過的および安定的にトランスフェクトされた哺乳類細胞においてｓｉＲＮＡｓを連続して発現させるために開発されている(Brummelkamp et al., 2002 Science 296:550 553; Sui et al., 2002, PNAS 99(6):5515 5520; Paul et al., 2002, Nature Biotechnol. 20:505 508)。これらのベクターのいくつかは、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現するように操作されている。ｓｈＲＮＡは、インビボでプロセスされて、遺伝子特異的なサイレンシングを行なうことができるｓｉＲＮＡ様の分子となる。他の種のｓｉＲＮＡ発現ベクターは、分離したｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御の下でセンスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖をコードする(Miyagishi and Taira, 2002, Nature Biotechnol. 20:497 500)。その他のベクターのｓｈＲＮＡｓのように、このベクター由来のｓｉＲＮＡ鎖は、３’チミジン終止コドンを有する。両種の発現ベクターによるサイレンシングの効果は、一過的なｓｉＲＮＡのトランスフェクトにより誘導される場合と比較された。
【０１３７】
ＲＮＡは、直接細胞へ導入することができ（すなわち細胞内に導入でき）；または腔、間質空間に細胞外的に導入することができ、生物の循環に、または経口的に導入することができる。核酸を導入する物理的方法、例えば細胞への直接の注入または生物への細胞外の注入も使用することができる。血管または脈管外の循環、血液またはリンパ系、および脳脊髄液は、ＲＮＡを導入することができる部位である。
【０１３８】
核酸を導入する物理的方法は、ＲＮＡを含む溶液の注射、ＲＮＡによって覆われた粒子の照射、ＲＮＡの溶液への細胞または生物の浸漬またはＲＮＡ存在下における細胞膜のエレクトロポレーションを含む。ウイルス粒子にパッケージされたウイルスの構成物は、細胞への発現構築物の効率的な導入および発現構築物によりコードされたＲＮＡの転写の両方を達成するだろう。脂質に介在されるキャリアー輸送、リン酸カルシウム等といった化学物質に介在される輸送といった、細胞に核酸を導入するための当該分野において既知のその他の方法を使用することができる。したがって、ＲＮＡは、１以上の下記の活性を達成する成分と共に導入することができる：細胞によるＲＮＡ取り込みの増強、二本鎖のアニーリングの促進、アニールされた鎖の安定化、またはそうでなければ標的遺伝子の阻害の増大。
【０１３９】
ＲＮＡは、重合されたリボヌクレオチドの１以上の鎖を含むことができる。それは、リン酸−糖骨格またはヌクレオシドのいずれかに対する修飾を含むことができる。例えば、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合は、窒素または硫黄のヘテロ原子の少なくとも１つを含むよう改変することができる。ＲＮＡ構造における修飾は、ｄｓＲＮＡによって得られるいくつかの生物における一般的なパニック応答を回避しつつ、特異的な遺伝的阻害を可能にするよう調整することができる。同様に、塩基は、アデノシンデアミナーゼの活性を遮断するよう改変することができる。ＲＮＡは、酵素的にまたは部分的／全体的に有機合成により作製することができ、任意の修飾されたリボヌクレオチドも、インビトロで酵素的にまたは有機合成により導入することができる。
【０１４０】
二本鎖構造は、単一の自己相補的ＲＮＡ鎖、または２つの相補的ＲＮＡ鎖により形成することができる。ＲＮＡ二重鎖形成は、細胞内または細胞外で発生させることができる。ＲＮＡは、１細胞当たり少なくとも１つのコピーの送達を可能にする量で導入することができる。より高用量（例えば、１細胞当たり少なくとも５、１０、１００、５００または１０００コピーの二本鎖物質）が、より有効な阻害を生じさせることができ；より低用量は、さらに特異的な用途に有用となり得る。阻害は配列特異的であり、ＲＮＡの二重鎖領域に対応するヌクレオチド配列は遺伝的阻害のための標的とされる。ＲＮＡ分子は、少なくとも１０、１２、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０の長さのヌクレオチドでありえる。
【０１４１】
標的遺伝子の一部と同一のヌクレオチド配列を含むＲＮＡは、阻害のために好ましい。標的配列に対して挿入、欠失および単一の点変異を有したＲＮＡ配列もまた、阻害に効果的であることがわかっている。したがって、配列同一性は、当該分野において既知の配列比較およびアラインメントアルゴリズム（ Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991参照、当該文献は本願に援用される）および、例えば、デフォルトパラメーターを使用するＢＥＳＴＦＩＴソフトウェアプログラムにおいて実行されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、University of Wisconsin Genetic Computing Group）によるヌクレオチド配列間のパーセント差の計算により最適化することができる。抑制性ＲＮＡと標的遺伝子の部分との間における９０％を越える配列同一性または１００％の配列同一性が好ましい。あるいは、ＲＮＡの二重鎖領域は、標的遺伝子転写物の一部とハイブリダイズできるヌクレオチド配列として機能的に定義できる（例えば、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃でのハイブリダイゼーション、１２−１６時間；その後洗浄）。同一のヌクレオチド配列の長さは、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００または４００塩基とすることができる。
【０１４２】
ＲＮＡと標的遺伝子との間における１００パーセントの配列同一性は、本発明の実行には必要とされない。したがって、本発明は、遺伝子変異、種多形または進化的分岐により期待されるかもしれない配列変化を許容することができることという長所を有する。
【０１４３】
ＲＮＡは、インビボでまたはインビトロで合成することができる。細胞の内因性のＲＮＡポリメラーゼは、インビボで転写を介在することができ、クローン化されたＲＮＡポリメラーゼは、インビボまたはインビトロで転写に使用することができる。インビボのトランスジーンまたは発現構築物からの転写のために、調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、スプライスドナーおよびアクセプター、ポリアデニル化）は、ＲＮＡ鎖（または複数鎖）を転写するために使用することができる。阻害は、臓器、組織または細胞種における特異的な転写；環境要因（例えば感染症、ストレス、温度、化学的誘導物）の刺激；および／または発育の段階または年齢での転写の操作による標的とすることができる。ＲＮＡ鎖はポリアデニル化されてよく；ＲＮＡ鎖は細胞の翻訳の器官によりポリペプチドに翻訳されてよい。ＲＮＡは、手動または自動の反応により、化学的にまたは酵素的に合成することができる。ＲＮＡは、細胞性ＲＮＡポリメラーゼまたはバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ３、Ｔ７、ＳＰ６）により合成することができる。発現構築物の使用および産生は当該分野において既知である（ＷＯ９７／３２０１６；米国特許第５，５９３，８７４号、第５，６９８，４２５号、第５，７１２，１３５号、第５，７８９，２１４号および第５，８０４，６９３号参照、これらは本願に援用される）。化学的またはインビトロにおける酵素的な合成により合成される場合、ＲＮＡは、細胞への導入に先立って精製することができる。例えば、ＲＮＡは、溶媒または樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィーまたはそれらの組み合わせにより混合物から取り除くことができる。あるいは、ＲＮＡは、サンプル処理による損失を回避するために、精製を行わずまたは最小限の精製を行って使用することができる。ＲＮＡは、貯蔵のために乾燥させるか、または水溶液に溶解することができる。溶液は、アニーリング、および／または二本鎖の安定化を促進するための緩衝剤または塩を含み得る。
【０１４４】
本発明は、ＩＰＦのような疾病の治療または予防のために、細胞へのＲＮＡの導入のために使用することができる。例えば、ｄｓＲＮＡは、ヒト肺線維芽細胞に導入し、それによって、ＳＥＲＰＩＮＥ２の遺伝子発現を阻害することができる。治療は、疾病に関連した任意の病徴または病理学に関連した臨床的な徴候の改善を含むだろう。
【０１４５】
製剤および投与
ＳＥＲＰＩＮＥ２アンタゴニストの多くの適切な製剤は、全ての薬剤師に既知の処方書Remington's Pharmaceutical Sciences, (15th Edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1975))、特に第８７章（Ｂｌａｕｇ、Ｓｅｙｍｏｕｒ）に見ることができる。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、無水吸収ベース、水中油型または油中水型エマルション、エマルションカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物を含む。
【０１４６】
本発明は、医学的状態、特に肺線維症、特にヒト肺線維芽細胞が高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露されるような症状の治療のための医薬の製造のためのＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの使用を含む。好ましい実施形態において、医学的状態は、ＡＬＩ、ＩＰＦ、ＣＯＰＤ、喘息またはＡＲＤＳである。好ましくは、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、ＳＥＲＰＩＮＥ２の抗体、例えばモノクローナル抗体、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス核酸分子、ペプチドまたは小分子阻害剤である。
【０１４７】
本発明は、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストを患者に投与することを含む肺線維症を患う患者を治療する方法を含む。好ましくは、肺線維症は、ヒト肺線維芽細胞が高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露されるものである。好ましい実施形態において、患者はＡＬＩ、ＩＰＦ、ＣＯＰＤ、喘息またはＡＲＤＳを有している。好ましくは、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストは、ＳＥＲＰＩＮＥ２の抗体、例えばモノクローナル抗体、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス核酸分子、ペプチドまたは小分子阻害剤である。
【０１４８】
様々な実施形態において、本発明の有効量の組成物が、月に一度または月に一度以上、例えば２、３、４、５または６か月に一度、対象に投与される。その他の実施形態において、本発明の有効量の組成物は、月に一度未満、例えば、２週毎または毎週投与される。本発明の有効量の組成物は、少なくとも一度対象に投与される。特定の実施形態において、有効量の組成物が、少なくとも１か月、少なくとも６か月または少なくとも１年の期間を含む、複数回投与されてよい。
【０１４９】
様々な実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも１−５日の期間毎日投与されるものの、確立している肺線維症を持った患者は、数か月から数年の期間、治療量を受けることができる。ここに使用される「治療量」とは、予防し、緩和し、減少させ、またはそうでなければ患者における症状の重症度を低減する量である。
【０１５０】
ＳＥＲＰＩＮＥ２は細胞外のプロテアーゼ阻害剤であるため、アンタゴニストのタンパク質（例えば抗体またはペプチド）または小分子の細胞外の投与は、ＳＥＲＰＩＮＥ２機能を阻害するのに十分である。ＳＥＲＰＩＮＥ２発現の阻害（例えば、アンチセンスまたはＲＮＡｉ）は、ＳＥＲＰＩＮＥ２を発現する細胞にアンタゴニストが入ることを必要とする。好ましい実施形態において、細胞はヒト肺線維芽細胞である。
【０１５１】
ＩＰＦ患者に対する薬剤の様々な送達方法は当該分野において既知である。例えば、多数の臨床研究が、ＩＰＦを治療するための分子の様々な典型的な送達方法を使用して行なわれた。抗結合組織成長因子−特異的モノクローナル抗体の単一のＩＶ注入が、臨床研究においてＩＰＦを治療するために使用された。さらに、小分子の吸入ならびにインターフェロン−ガンマの皮下注射およびエアロゾル吸入が、臨床研究において使用された。更に、エタネルセプトが、臨床研究において皮下注射で週に２度ＩＰＦを治療するために使用された（Raghu et al., Am J Respir Crit Care Med. 178:948-55, 2008）。
【０１５２】
抗体について、患者に投与される用量は、典型的に、０．１ｍｇ／ｋｇ患者体重から１００ｍｇ／ｋｇ患者体重である。好ましくは、患者に投与される用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ患者体重から２０ｍｇ／ｋｇ患者体重であり、より好ましくは患者の体重の１ｍｇ／ｋｇ患者体重から１０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。一般に、ヒト抗体およびヒト化抗体は、外来のポリペプチドに対する免疫反応に起因して、その他の種由来の抗体よりも人体において長い半減期を有する。したがって、より低い用量のヒト化抗体およびより頻度の小さい投与もしばしば可能である。
【０１５３】
有効な治療に必要な有効成分の量は、投与の手段、標的部位、患者の生理的な状態および投与されるその他の薬剤を含む様々な因子に依存するだろう。したがって、治療用量は安全性および効果を最適化するように滴定すべきである。典型的に、インビトロで使用される用量は、有効成分のインサイチュー投与に有用な量における有用なガイダンスを提供することができる。特定の疾患の治療のための有効量の動物試験は、さらに、ヒトに対する用量の予測的な示度を提供するだろう。様々な考察が、例えば、Goodman and Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Edition (1985), MacMillan Publishing Company, New York、およびRemington's Pharmaceutical Sciences 18th Edition, (1990) Mack Publishing Co, Easton Paに記載されている。そこでは、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮的、経鼻、イオン泳動的な投与等を含む投与のための方法が議論されている。好ましくは、その製剤は肺に投与される。より好ましくは、その製剤は吸入される。
【０１５４】
好ましくは、肺に対する局所的送達は、全身的送達で生じ得る潜在的な副作用を緩和するために使用される。このように、局所的に送達できる用量は、全身的（例えば、非経口的）送達様式において許容され得る量より実質的に高くなりえる。特発性肺線維症、嚢胞性繊維症、結核、肺腫瘍またはその他の炎症といった肺疾患に対しては、吸入経路による局所的送達が好ましい。静脈内投与も好ましい。
【０１５５】
肺に対する小分子の送達は当該分野において既知の技術により達成することができる。さらに、タンパク質薬剤は当該分野において既知の技術による吸入によって肺に送達することができる。例えば、肺に局所的に送達されたタンパク質薬剤は、インスリンから抗体まで、一連の分子量を示す。
【０１５６】
インスリンは吸入できるタンパク質の最もよく知られている例である一方（Ｅｘｕｂｅｒａ）、全身的送達が望ましくない肺を標的とするタンパク質の多くの例が存在する。最も古い例の１つは、肺結核を治療するためのエアロゾル化されたインターフェロンアルファまたはガンマである(Am J Respir Crit Care Med Vol 158. pp 1156-1162, 1998; Antimicrobial Agents and Chemotherapy, June 1984, p. 729-734)。今日、エアロゾルインターフェロンガンマは、目下、特発性肺線維症のためのフェーズ１臨床試験にある。皮下送達は、この示度には効果がないことを示された。インターフェロンのエアロゾル小滴は、一般に、圧縮空気によるジェット噴霧器を使用して、０．３−３．４ｕＭの範囲にある。小さな粒子サイズは肺への深い曝露を保証する。
【０１５７】
抗体のようなより大きなタンパク質も、肺に直接送達することができる。例えば、Ｔ細胞レセプタに特異的なエアロゾル化されたモノクローナル抗体は、気道炎症および超反応性についての前臨床研究において成功裡に使用された(Intl Archives of Allergy and Immunology, 134, 49-55, 2004)。他の例において、リシン毒素に対するエアロゾル化された抗体は、毒素を吸入した動物の肺を保護することが分かった(Toxicon, 34, 1037-1033, 1996)。コントロール抗体を受けた動物は、重篤な浮腫および全肺葉の炎症をともなう気道の上皮の壊死を示し、リシン後４８−９６時間に死亡した。対照的に、エアロゾル化された抗リシン抗体を与えられた動物は肺傷を作らず、動物はすべて生き残った。
【０１５８】
液体製剤のためのネビュライザーおよびアトマイザーのような肺送達を支援するために使用することができる多数の装置が存在する。乾燥粉末吸入器は固形微粒子製剤のために使用することができる。既存の装置は「能動的」または「受動的」様式に送達することができる。
【０１５９】
１つの実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＥ２に対する抗体は、肺に対する送達の１つの経路として、液体溶液から直接霧状にすることができる。その他の実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＥ２に対する抗体は、リポソームまたはポリラクチドミクロスフェア（ＧＲＡＳ材料）のような固形微粒子と混合し、またはそれらでカプセル化することができる。多孔性の粒子は非常に高い薬剤ロードを可能にし、薬剤の遅い徐放性にさらに提供することができる。粒子は均一のサイズで作ることができ、５μｍのサイズは、最も肺送達戦略のために好ましい。固形微粒子は、さらに、肺から潜在的で全身的な曝露を阻害することができる。液体および固体の肺送達様式の両方は、ブレオマイシン誘導型線維症のマウスモデルのような動物モデルにおいて容易に最適化することができる。肺組織および血流における薬剤濃度は、ＥＬＩＳＡのような標準的アッセイを使用して容易に最適化することができる。
【０１６０】
本発明の組成物は、投与の方法に依存して、様々な単位剤形において投与することができる。例えば、経口投与に適している単位剤形は、粉末、錠剤、ピル、カプセルおよびドラジェといった固体剤形、およびエリキシル、シロップおよび懸濁剤といった液体剤形を含む。有効成分は、さらに、無菌の液体剤形において非経口的に投与することができる。ゼラチンカプセルは、有効成分、および非活性成分として、粉末キャリアー、例えばグルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルク、炭酸マグネシウム等を含む。好ましい色、味、安定性、緩衝能、分散またはその他の既知の好ましい特徴を提供するために添加できる付加的な非活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白色インク等である。同様の希釈剤を圧縮錠剤を作るために使用することができる。錠剤およびカプセルの両方は、数時間の期間にわたり薬剤の連続的な放出を提供する徐放性製剤として製造することができる。圧縮錠剤は、任意の不愉快な味を覆い、大気から錠剤を保護するために、糖でコーティングまたは膜でコーティングすることができ、または、胃腸管における選択的な崩壊のために腸溶性コーティングできる。経口投与のための液体剤形は、患者の許容性を高めるために着色および着味を含むことができる。
【０１６１】
医薬製剤における本発明の組成物の濃縮は、広く異ならせることができ、すなわち、約０．１重量％未満から、通常約２重量％以上から、２０から５０重量％以上まで異ならせることができ、選択された投与の特定の様式に従って、液体体積、粘性等により第１に選択されるだろう。
【０１６２】
本発明の組成物もリポソームによって投与することができる。リポソームは、エマルション、泡、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散、層状の層等を含む。これらの製剤において、送達される本発明の組成物は、単独で、あるいは、抗体のような所望の標的と結合する分子またはその他の治療的なもしくは免疫原の組成物とともに、リポソームの一部として組込むことができる。したがって、本発明の所望の組成物が充填されたまたはそれにより装飾されたリポソームは、全身的に送達できる、または、興味のある組織に導入でき、そこでその後リポソームは、選択された治療的／免疫原ペプチド組成物を送達する。
【０１６３】
本発明で使用されるリポソームは、一般に中性および負に帯電したリン脂質およびコレステロールといったステロールを含む標準的小胞形成脂質から形成することができる。脂質の選択は一般に、例えば、リポソーム・サイズ、血流におけるリポソームの酸不安定性および安定性を考慮して導かれる。例えば、Szoka et al. Ann. Rev. Biophys. Bioeng, 9:467 (1980)、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号および第５，０１９，３６９号に記載されるように、様々な方法がリポソームを作製するために利用可能である。
【０１６４】
本発明の組成物を含むリポソーム懸濁液は、とりわけ、投与の様式、送達される本発明の組成物および治療される疾病の段階に従って変化する用量で、静脈内投与、局所的（locally）投与、局所的（topically）投与を行うことができる。
【０１６５】
固体組成物のために、例えば、製薬の等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を含む従来の無毒な固体のキャリアーを使用することができる。経口投与のために、薬学的に許容される無毒の組成物は、通常使用される任意の賦形剤、例えば以前に記録されたキャリアー、および一般に１０−９５％の有効成分を、すなわち本発明の１以上の組成物をより好ましくは２５％−７５％の濃度で取り込んで形成される。
【０１６６】
固体組成物のために、例えば、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を含む従来の無毒の固体キャリアーを使用することができる。経口投与のために、上記のキャリアーのような任意の通常使用される賦形剤と、一般に１０−９５％の、より好ましくは２５％−７５％の濃度の有効成分、すなわち本発明の１以上の組成物とを取り込むことで、薬学的に許容可能な無毒の組成物を形成することができる。
【０１６７】
エアロゾル投与のために、本発明の組成物は、好ましくは、界面活性剤および噴霧剤と共に細かく分離された形態において供給される。本発明の組成物の好ましいパーセンテージは、０．０１％−２０重量％、好ましくは１−１０重量％である。界面活性剤は、当然無毒でなくてはならず、好ましくは噴霧剤に可溶である。そのような薬剤の代表は、カプロン酸（ｃ−ａｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ）、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）およびオレイン酸といった６から２２炭素原子を含む脂肪酸と脂肪性多価アルコールまたはその環状無水物とのエステルまたは部分的エステルである。混合グリセリドまたは天然のグリセリドのような混合エステルを使用することができる。界面活性剤は、組成物中０．１−２０重量％、好ましくは０．２５−５重量％を構成することができる。組成物のバランスは通常噴霧剤である。必要であれば、キャリアーは、例えば鼻腔内送達のためのレシチンとともに含むことができる。
【０１６８】
本発明の構築物は、さらに、当該分野において周知の技術により、デポー型システム、カプセル化形態または移植において送達することができる。同様に、構築物はポンプによって興味のある組織に送達することができる。
【０１６９】
製剤における活性剤が処方により不活性化されず、製剤が生理学的に適合するかぎり、任意の前述の製剤が、本発明に関して治療法および治療に適切となり得る。
【０１７０】
ＳＥＲＰＩＮＥ２活性のアッセイおよびＳＥＲＰＩＮＥ２アンタゴニスト
肺線維芽細胞に対するＳＥＲＰＩＮＥ２の効果は、ＳＥＲＰＩＮＥ２の存在下でヒト肺線維芽細胞をインキュベートし、コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンにおける影響をここに記載されるように評価することで、評価することができる。例えば、正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）Ｌｏｎｚａ製品番号ＣＣ−２５１２をインスリン、ｒｈＦＧＦ−Ｂ、ゲンタマイシン硫酸アンフォテリシン−Ｂおよびウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む繊維芽細胞増殖培地で増殖させることができる。
【０１７１】
ＮＨＬＦ細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅによってフラスコから採集することができ、酵素は、トリプシン中和溶液中で中和され、細胞はペレットにされ、完全増殖培地に再懸濁され、数を計測され、Ｆａｌｃｏｎ９６ウェルプレートに、１ウェル当り８０００細胞、１ウェル当り２００ｕｌで播種され、３７℃、５％のＣＯ２下で６時間インキュベートされる。プレーティングから６時間後、完全増殖培地を除去し、細胞に２００ｕｌの飢餓培地を添加し、３７℃、５％のＣＯ２で１６−２４時間をインキュベートすることで、細胞が血清を枯渇した状態とする。
【０１７２】
飢餓培地を細胞から除去し、７５ｕｌのタンパク質処理の直後に、７５ｕｌの共処理を添加する。共処理は、ＴＧＦ−β１またはＩＬ−１３を次の３つの用量のうち１つで添加した飢餓培地である：ＴＧＦ低処理は０．１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１（実験における終末濃度は０．０５ｎｇ／ｍｌ）；ＴＧＦ高処理は１．０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１（実験における終末濃度は０．５ｎｇ／ｍｌ）；ＩＬ−１３処理は１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３（実験における終末濃度は５ｎｇ／ｍｌ）。ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質処理は、組み換えＳＥＲＰＩＮＥ２が添加された７５ｕｌの飢餓培地である。ＳＥＲＰＩＮＥ２の濃度は０ｎｇ／ｍｌから１０，０００ｎｇ／ｍｌまでとできる。タンパク質処理の添加の後、細胞は、３７℃、５％のＣＯ２で４８時間培養される。
【０１７３】
４８時間の処理の後、培地を除去し、細胞を溶解する。コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンのＲＮＡのレベルを決定する。ＲＮＡ発現のレベルは、Ｓ１ヌクレアーゼ／ＲＮａｓｅプロテクション、ＰＣＲ、ｂＤＮＡ、ノーザンブロットなどのような当該分野において既知の多数の技術による決定することができる。β−アクチンのようなコントロールを使用することができる。
【０１７４】
高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２にさらされる肺線維芽細胞は、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストを投与して、これらの細胞に対する高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２の効果を転換することができる。例えば、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニスト（例えばモノクローナル抗体）を肺線維芽細胞に投与し、４８時間のインキュベーションの後に、コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンのＲＮＡのレベルを決定することができる。ＳＥＲＰＩＮＥ２アンタゴニストのレベルは１ｎｇ／ｍｌから１０，０００ｎｇ／ｍｌまでとすることができる。ＲＮＡレベルは、並列のサンプルを実行することで、またはアンタゴニスト添加前の一定分量のサンプルと、アンタゴニストの投与後のある時間（例えば２４、４８および７２時間）の一定分量のサンプルとを比較することで、アンタゴニストの存在下および非存在下で比較することができる。
【０１７５】
さらに、ＳＥＲＰＩＮＥ２とともにアンタゴニストをインキュベートし、トリプシン様セリンプロテアーゼ、例えばトロンビン、トリプシン、プラスミンおよびウロキナーゼと複合体を形成し、それらを阻害するＳＥＲＰＩＮＥ２の能力が変更されたかどうかを決定することで、アンタゴニストの効果を評価することができる。例えばWagner et al., 1988を参照されたい。
【０１７６】
コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの合成に対するＳＥＲＰＩＮＥ２アンタゴニストの効果は、肺線維症のマウスモデルにて試験することができる。このモデルにおいて、繊維症は抗癌剤硫酸ブレオマイシンの気管内注射によるマウスの肺において誘導される。この疾病を有するマウスおよびヒトの両方における形態、生化学およびｍＲＮＡの変化の研究により裏付けられるように、ブレオマイシン誘導型線維症はヒト特発性肺線維症に非常に類似する(Phan, S. H. Fibrotic mechanisms in lung disease. In: Immunology of Inflammation, edited by P. A. Ward, New York: Elsevier, 1983, pp121 162; Zhang et. al. (1994) Lab. Invest. 70: 192 202; Phan and Kunkel (1992) Exper. Lung Res. 18:29 43)。
【０１７７】
マウスは、ブレオマイシンを投与し、好ましくは、その後、例えば１０日後、ＳＥＲＰＩＮＥ２アンタゴニストを投与することで治療することができる。Moeller et al, 2008を参照されたい。アンタゴニストの投与後１０−２１日目において、マウスの肺を採取し、食塩水で洗浄して血液を除去し、ｍＲＮＡを抽出し、コラーゲンおよびα−平滑筋アクチンの発現を評価することができる。ＳＥＲＰＩＮＥ２アンタゴニストの投与は、マウス肺における繊維症の症状を改善することができる。
【実施例】
【０１７８】
例１．ＲＮＡ発現に対する精製されたＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質の効果
肺線維芽細胞に対するＳＥＲＰＩＮＥ２の効果を、繊維芽細胞増殖培地において、正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）をインキュベートすることで評価した。ＮＨＬＦ細胞を採取した。その後、細胞をペレット化し、増殖培地に再懸濁し、１ウェルあたり８０００細胞で２００ｕｌでプレーティングし、３７℃、５％のＣＯ２で６時間インキュベートした。６時間のプレーティング後、完全増殖培地を除去し、２００ｕｌの飢餓培地(Clonetics Fibroblast Basal Medium (FBM) from Lonza Cat. # CC-3131 + 0.5% BSA fraction V) を細胞に添加し、３７℃、５％のＣＯ２で１６−２４時間インキュベートすることで、細胞を、血清が枯渇した状態にした。
【０１７９】
飢餓培地を細胞から除去し、７５ｕｌのタンパク質処理の直後に、７５ｕｌの共処理を添加した。共処理は、以下の３つの用量のうち１つでＴＧＦ−β１またはＩＬ−１３を添加した飢餓培地とした：ＴＧＦ低処理は０．１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１（実験における終末濃度は０．０５ｎｇ／ｍｌ）；ＴＧＦ高処理は１．０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１（実験における終末濃度は０．５ｎｇ／ｍｌ）；ＩＬ−１３処理は１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３（実験における終末濃度は５ｎｇ／ｍｌ）。ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質処理法は、組み換えＳＥＲＰＩＮＥ２を添加した７５ｕｌの飢餓培地であった。ＳＥＲＰＩＮＥ２のレベルは約０−５０００ｎｇ／ｍｌであった。タンパク質処理の添加の後、細胞を３７℃、５％のＣＯ２で４８時間培養した。ヒトＴＧＦベータ１（２４０−Ｂ−０１０）、組み換えヒトＩＬ−１３（２１３−ＩＬ−０２５）および組み換えヒトＳＥＲＰＩＮＥ２（２９８０−ＰＩ）は、Ｒ＆Ｄシステムズから入手した。
【０１８０】
処理の４８時間後、１５０ｕｌの培地を除去し、細胞はプロテイナーゼＫを含む１００ｕｌの１ｘ溶解緩衝液に溶解した。コラーゲン１Ａ１、β−アクチンおよびα−平滑筋アクチンのレベルを、ｂＤＮＡアッセイ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を使用して決定した。オーバーナイトハイブリダイゼーションおよびフィルタプレートにおけるサンプル処理のためのＰａｎｏｍｉｃｓキット説明書に従った。最終ステップにおいて、ビーズを８０ｕｌで再懸濁し、Ｌｕｍｉｎｅｘプレートリーダー上でランさせた。
【０１８１】
精製されたＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質および０．０５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βによるアッセイの結果を図１に示す。コントロールＲＮＡ、β−アクチンは、ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質添加による上昇を示さなかった。しかしながら、全３つの実験条件下において、コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンのレベルは、用量依存的に上昇し、ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質が増加した。これらの結果は、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に対するヒト肺線維芽細胞の曝露が、コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの両方の発現の上昇をもたらしたことを示す。
【０１８２】
例２．野生型ＳＥＲＰＩＮＥ２を発現する構築物の作製
野生型ＳＥＲＰＩＮＥ２のＤＮＡのヌクレオチド配列を含み、野生型ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質を発現する構築物を作製した。
【０１８３】
野生型ＳＥＲＰＩＮＥ２のＤＮＡのヌクレオチド配列は、
atgaactggcatctccccctcttcctcttggcctctgtgacgctgccttccatctgctcccacttcaatcctctgtctctcgaggaactaggctccaacacggggatccaggttttcaatcagattgtgaagtcgaggcctcatgacaacatcgtgatctctccccatgggattgcgtcggtcctggggatgcttcagctgggggcggacggcaggaccaagaagcagctcgccatggtgatgagatacggcgtaaatggagttggtaaaatattaaagaagatcaacaaggccatcgtctccaagaagaataaagacattgtgacagtggctaacgccgtgtttgttaagaatgcctctgaaattgaagtgccttttgttacaaggaacaaagatgtgttccagtgtgaggtccggaatgtgaactttgaggatccagcctctgcctgtgattccatcaatgcatgggttaaaaacgaaaccagggatatgattgacaatctgctgtccccagatcttattgatggtgtgctcaccagactggtcctcgtcaacgcagtgtatttcaagggtctgtggaaatcacggttccaacccgagaacacaaagaaacgcactttcgtggcagccgacgggaaatcctatcaagtgccaatgctggcccagctctccgtgttccggtgtgggtcgacaagtgcccccaatgatttatggtacaacttcattgaactgccctaccacggggaaagcatcagcatgctgattgcactgccgactgagagctccactccgctgtctgccatcatcccacacatcagcaccaagaccatagacagctggatgagcatcatggtccccaagagggtgcaggtgatcctgcccaagttcacagctgtagcacaaacagatttgaaggagccgctgaaagttcttggcattactgacatgtttgattcatcaaaggcaaattttgcaaaaataacaaggtcagaaaacctccatgtttctcatatcttgcaaaaagcaaaaattgaagtcagtgaagatggaaccaaagcttcagcagcaacaactgcaattctcattgcaagatcatcgcctccctggtttatagtagacagaccttttctgtttttcatccgacataatcctacaggtgctgtgttattcatggggcagataaacaaaccc (配列番号１)である。
【０１８４】
野生型ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質のアミノ酸配列は、
MNWHLPLFLLASVTLPSICSHFNPLSLEELGSNTGIQVFNQIVKSRPHDNIVISPHGIASVLGMLQLGADGRTKKQLAMVMRYGVNGVGKILKKINKAIVSKKNKDIVTVANAVFVKNASEIEVPFVTRNKDVFQCEVRNVNFEDPASACDSINAWVKNETRDMIDNLLSPDLIDGVLTRLVLVNAVYFKGLWKSRFQPENTKKRTFVAADGKSYQVPMLAQLSVFRCGSTSAPNDLWYNFIELPYHGESISMLIALPTESSTPLSAIIPHISTKTIDSWMSIMVPKRVQVILPKFTAVAQTDLKEPLKVLGITDMFDSSKANFAKITRSENLHVSHILQKAKIEVSEDGTKASAATTAILIARSSPPWFIVDRPFLFFIRHNPTGAVLFMGQINKP (配列番号２)である。
【０１８５】
例３．ＬＲＰに結合しないＳＥＲＰＩＮＥ２ムテインの作製
低密度リポ蛋白質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）に結合できないＳＥＲＰＩＮＥ２ムテインのヌクレオチド配列を含む構築物を作製した。このムテインは、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアミノ酸位置４８および４９に次の変異を含んだ：Ｈ４８ＡおよびＤ４９Ｅ。
【０１８６】
ＳＥＲＰＩＮＥ２のＤＮＡのＬＲＰ結合ムテインのヌクレオチド配列は、
atgaactggcatctccccctcttcctcttggcctctgtgacgctgccttccatctgctcccacttcaatcctctgtctctcgaggaactaggctccaacacggggatccaggttttcaatcagattgtgaagtcgaggcctgcagaaaacatcgtgatctctccccatgggattgcgtcggtcctggggatgcttcagctgggggcggacggcaggaccaagaagcagctcgccatggtgatgagatacggcgtaaatggagttggtaaaatattaaagaagatcaacaaggccatcgtctccaagaagaataaagacattgtgacagtggctaacgccgtgtttgttaagaatgcctctgaaattgaagtgccttttgttacaaggaacaaagatgtgttccagtgtgaggtccggaatgtgaactttgaggatccagcctctgcctgtgattccatcaatgcatgggttaaaaacgaaaccagggatatgattgacaatctgctgtccccagatcttattgatggtgtgctcaccagactggtcctcgtcaacgcagtgtatttcaagggtctgtggaaatcacggttccaacccgagaacacaaagaaacgcactttcgtggcagccgacgggaaatcctatcaagtgccaatgctggcccagctctccgtgttccggtgtgggtcgacaagtgcccccaatgatttatggtacaacttcattgaactgccctaccacggggaaagcatcagcatgctgattgcactgccgactgagagctccactccgctgtctgccatcatcccacacatcagcaccaagaccatagacagctggatgagcatcatggtccccaagagggtgcaggtgatcctgcccaagttcacagctgtagcacaaacagatttgaaggagccgctgaaagttcttggcattactgacatgtttgattcatcaaaggcaaattttgcaaaaataacaaggtcagaaaacctccatgtttctcatatcttgcaaaaagcaaaaattgaagtcagtgaagatggaaccaaagcttcagcagcaacaactgcaattctcattgcaagatcatcgcctccctggtttatagtagacagaccttttctgtttttcatccgacataatcctacaggtgctgtgttattcatggggcagataaacaaaccc (配列番号３)である。
【０１８７】
ＳＥＲＰＩＮＥ２のＬＲＰ結合ムテインのアミノ酸配列は、
MNWHLPLFLLASVTLPSICSHFNPLSLEELGSNTGIQVFNQIVKSRPAENIVISPHGIASVLGMLQLGADGRTKKQLAMVMRYGVNGVGKILKKINKAIVSKKNKDIVTVANAVFVKNASEIEVPFVTRNKDVFQCEVRNVNFEDPASACDSINAWVKNETRDMIDNLLSPDLIDGVLTRLVLVNAVYFKGLWKSRFQPENTKKRTFVAADGKSYQVPMLAQLSVFRCGSTSAPNDLWYNFIELPYHGESISMLIALPTESSTPLSAIIPHISTKTIDSWMSIMVPKRVQVILPKFTAVAQTDLKEPLKVLGITDMFDSSKANFAKITRSENLHVSHILQKAKIEVSEDGTKASAATTAILIARSSPPWFIVDRPFLFFIRHNPTGAVLFMGQINKP (配列番号４)である。
【０１８８】
例４．標的プロテアーゼに結合できるがプロテアーゼを不可逆的に阻害しないＳＥＲＰＩＮＥ２ムテインの作製
標的プロテアーゼに結合できるが、プロテアーゼを不可逆的に阻害しないＳＥＲＰＩＮＥ２ムテインのヌクレオチド配列を含む構築物を作製した。このムテイン（阻害ムテイン）は、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアミノ酸位置３６４および３６５に次のような変異を含む：Ｒ３６４ＫおよびＳ３６５Ｔ。
【０１８９】
ＳＥＲＰＩＮＥ２阻害ムテインＤＮＡのヌクレオチド配列は、
atgaactggcatctccccctcttcctcttggcctctgtgacgctgccttccatctgctcccacttcaatcctctgtctctcgaggaactaggctccaacacggggatccaggttttcaatcagattgtgaagtcgaggcctcatgacaacatcgtgatctctccccatgggattgcgtcggtcctggggatgcttcagctgggggcggacggcaggaccaagaagcagctcgccatggtgatgagatacggcgtaaatggagttggtaaaatattaaagaagatcaacaaggccatcgtctccaagaagaataaagacattgtgacagtggctaacgccgtgtttgttaagaatgcctctgaaattgaagtgccttttgttacaaggaacaaagatgtgttccagtgtgaggtccggaatgtgaactttgaggatccagcctctgcctgtgattccatcaatgcatgggttaaaaacgaaaccagggatatgattgacaatctgctgtccccagatcttattgatggtgtgctcaccagactggtcctcgtcaacgcagtgtatttcaagggtctgtggaaatcacggttccaacccgagaacacaaagaaacgcactttcgtggcagccgacgggaaatcctatcaagtgccaatgctggcccagctctccgtgttccggtgtgggtcgacaagtgcccccaatgatttatggtacaacttcattgaactgccctaccacggggaaagcatcagcatgctgattgcactgccgactgagagctccactccgctgtctgccatcatcccacacatcagcaccaagaccatagacagctggatgagcatcatggtccccaagagggtgcaggtgatcctgcccaagttcacagctgtagcacaaacagatttgaaggagccgctgaaagttcttggcattactgacatgtttgattcatcaaaggcaaattttgcaaaaataacaaggtcagaaaacctccatgtttctcatatcttgcaaaaagcaaaaattgaagtcagtgaagatggaaccaaagcttcagcagcaacaactgcaattctcattgcaaaaacatcgcctccctggtttatagtagacagaccttttctgtttttcatccgacataatcctacaggtgctgtgttattcatggggcagataaacaaaccc (配列番号５)である。
【０１９０】
ＳＥＲＰＩＮＥ２阻害ムテインのアミノ酸配列は、
MNWHLPLFLLASVTLPSICSHFNPLSLEELGSNTGIQVFNQIVKSRPHDNIVISPHGIASVLGMLQLGADGRTKKQLAMVMRYGVNGVGKILKKINKAIVSKKNKDIVTVANAVFVKNASEIEVPFVTRNKDVFQCEVRNVNFEDPASACDSINAWVKNETRDMIDNLLSPDLIDGVLTRLVLVNAVYFKGLWKSRFQPENTKKRTFVAADGKSYQVPMLAQLSVFRCGSTSAPNDLWYNFIELPYHGESISMLIALPTESSTPLSAIIPHISTKTIDSWMSIMVPKRVQVILPKFTAVAQTDLKEPLKVLGITDMFDSSKANFAKITRSENLHVSHILQKAKIEVSEDGTKASAATTAILIAKTSPPWFIVDRPFLFFIRHNPTGAVLFMGQINKP (配列番号６)である。
【０１９１】
例５．標的プロテアーゼに結合できないＳＥＲＰＩＮＥ２ムテインの作製
標的プロテアーゼに結合できないＳＥＲＰＩＮＥ２ムテインのヌクレオチド配列を含む構築物（相互作用ムテイン）を作製した。このムテインは、ＳＥＲＰＩＮＥ２のアミノ酸位置３６４および３６５に次の変異を含んだ：Ｒ３６４ＰおよびＳ３６５Ｐ。
【０１９２】
ＳＥＲＰＩＮＥ２のＤＮＡの相互作用ムテインのヌクレオチド配列は、
atgaactggcatctccccctcttcctcttggcctctgtgacgctgccttccatctgctcccacttcaatcctctgtctctcgaggaactaggctccaacacggggatccaggttttcaatcagattgtgaagtcgaggcctcatgacaacatcgtgatctctccccatgggattgcgtcggtcctggggatgcttcagctgggggcggacggcaggaccaagaagcagctcgccatggtgatgagatacggcgtaaatggagttggtaaaatattaaagaagatcaacaaggccatcgtctccaagaagaataaagacattgtgacagtggctaacgccgtgtttgttaagaatgcctctgaaattgaagtgccttttgttacaaggaacaaagatgtgttccagtgtgaggtccggaatgtgaactttgaggatccagcctctgcctgtgattccatcaatgcatgggttaaaaacgaaaccagggatatgattgacaatctgctgtccccagatcttattgatggtgtgctcaccagactggtcctcgtcaacgcagtgtatttcaagggtctgtggaaatcacggttccaacccgagaacacaaagaaacgcactttcgtggcagccgacgggaaatcctatcaagtgccaatgctggcccagctctccgtgttccggtgtgggtcgacaagtgcccccaatgatttatggtacaacttcattgaactgccctaccacggggaaagcatcagcatgctgattgcactgccgactgagagctccactccgctgtctgccatcatcccacacatcagcaccaagaccatagacagctggatgagcatcatggtccccaagagggtgcaggtgatcctgcccaagttcacagctgtagcacaaacagatttgaaggagccgctgaaagttcttggcattactgacatgtttgattcatcaaaggcaaattttgcaaaaataacaaggtcagaaaacctccatgtttctcatatcttgcaaaaagcaaaaattgaagtcagtgaagatggaaccaaagcttcagcagcaacaactgcaattctcattgcaccaccatcgcctccctggtttatagtagacagaccttttctgtttttcatccgacataatcctacaggtgctgtgttattcatggggcagataaacaaaccc (配列番号７)である。
【０１９３】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の相互作用ムテインのアミノ酸配列は、
MNWHLPLFLLASVTLPSICSHFNPLSLEELGSNTGIQVFNQIVKSRPHDNIVISPHGIASVLGMLQLGADGRTKKQLAMVMRYGVNGVGKILKKINKAIVSKKNKDIVTVANAVFVKNASEIEVPFVTRNKDVFQCEVRNVNFEDPASACDSINAWVKNETRDMIDNLLSPDLIDGVLTRLVLVNAVYFKGLWKSRFQPENTKKRTFVAADGKSYQVPMLAQLSVFRCGSTSAPNDLWYNFIELPYHGESISMLIALPTESSTPLSAIIPHISTKTIDSWMSIMVPKRVQVILPKFTAVAQTDLKEPLKVLGITDMFDSSKANFAKITRSENLHVSHILQKAKIEVSEDGTKASAATTAILIAPPSPPWFIVDRPFLFFIRHNPTGAVLFMGQINKP (配列番号８)である。
【０１９４】
例６．コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現に対するＳＥＲＰＩＮＥ２ムテインの効果
コントロールベクター構築物および野生型ＳＥＲＰＩＮＥ２またはＳＥＲＰＩＮＥ２ムテインを発現する構築物を細胞にトランスフェクトし、細胞上清を採取した。
【０１９５】
ＳＥＲＰＩＮＥ２およびムテインをコードするｃＤＮＡ発現のためのＣＭＶプロモーターを含むプラスミドにクローン化した。プラスミドと脂質試薬Ｆｕｇｅｎｅ６との複合体を形成し、１０％のＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地にまいたヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、３７℃で５％のＣＯ２のもとでインキュベートした。４０時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、培地を５％のＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地で交換し、さらに４８時間、３７℃、５％のＣＯ２のもとでインキュベートした。発現されたタンパク質を含む細胞上清を、２９３Ｔ細胞から除去し、細胞に基づくアッセイにおけるＮＨＬＦ細胞を治療するために使用した。
【０１９６】
正常ヒト肺線維芽細胞を、０．０５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βを有する細胞上清で４８時間処理した。例１に示されるように、ｂＤＮＡアッセイを行なった。結果を図２および３に示す。ハウスキーピングコントロールＲＮＡ、β−アクチンは、野生型ＳＥＲＰＩＮＥ２またはＳＥＲＰＩＮＥ２ムテイン添加による上昇を示さなかった。しかしながら、コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンのレベルは野生型ＳＥＲＰＩＮＥ２タンパク質の添加にともない増加した。ＳＥＲＰＩＮＥ２のＬＲＰ結合領域の変異を有するＳＥＲＰＩＮＥ２ムテインは、野生型ＳＥＲＰＩＮＥ２と判別不能だった。ＳＥＲＰＩＮＥ２のプロテアーゼ相互作用領域の変異は効果を打ち消した。標的プロテアーゼに結合できるが、それらを不可逆的に阻害できない変異体は中間的効果を示した。これらの結果は、ＳＥＲＰＩＮＥ２の標的プロテアーゼを阻害する能力は、高い濃度のＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露されたヒト肺線維芽細胞によるコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現の上昇に関与することを示している。
【０１９７】
例７．ＳＥＲＰＩＮＥ２は、ヒト肺線維芽細胞においてコラーゲンタンパク質を誘導する
正常ヒト肺線維芽細胞は、３７℃で一晩、１５０ｕｌの繊維芽細胞増殖培地（ＦＧＭ、Ｌｏｎｚａ）中で、９６ウェルプレートに８０００細胞／ウェルで播種した。１５０ｕｌのＦＧＭ中の処理（０．０５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β、０．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βおよびｒｈＳｅｒｐｉｎＥ２用量曲線）を、翌日（０時間）、培地を吸引した後に添加した。２５ｕｇ／ｍｌアスコルビン酸を含む１５０ｕｌのＦＧＭ中の処理を、２４時間において、培地を吸引した後に添加した。７２時間において、細胞をＰＢＳで洗浄し、９５％のエタノールを使用して固定した。その後、細胞を１％のＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングし、１次抗体として３ｕｇ／ｍｌのマウス抗ヒトコラーゲン１抗体#AB6308 (Abcam)および２次抗体として１：５０００のヤギ抗マウス cat# 115-035-071 (Jackson Labs)を用いて標識した。ＨＲＰ−ＴＭＢを検出に使用し、吸光度を４５０ｎＭで読みとった。結果を図４に示す。ＳＥＲＰＩＮＥ２は、両方のＴＧＦ−β用量でＮＨＬＦ細胞のコラーゲンタンパク質の発現を誘導する際に、強力な活性を有することが示された。
【０１９８】
例８．ヒト肺線維芽細胞におけるＳＥＲＰＩＮＥ２発現
ＮＨＬＦ細胞（Ｌｏｎｚａ）を９６ウェルプレートに１ウェル当たり８０００細胞で播種し、一晩血清枯渇状態とし（０．５％のＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＦＢＭ（Ｌｏｎｚａ））、その後、新鮮な飢餓培地にて４８時間ＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄシステムズ）で処理した。ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。それぞれの治療条件の３つの独立した治療ウェルからの細胞ライセートをＲＮＡ単離のためにプールした。
【０１９９】
ＲＮＡは、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を使用して逆転写し、ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、ヒトＳＥＲＰＩＮＥ２（Ｑｉａｇｅｎ ＱＴ００００８０７８）およびＧｕｓＢ（ＱＴ０００４６０４６）に特異的なプライマーにより、説明書に従ってＡＢＩ７０００機器にて行った。ＳＥＲＰＩＮＥ２データはデルタ−デルタＣＴ法(Applied Biosystems, Foster City, CA) を使用して、ＧｕｓＢハウスキーピング遺伝子に対して標準化し、未処理の細胞コントロールに対して標準化したｍＲＮＡとして表示した。結果を図５に示す。ＮＨＬＦ細胞のＳＥＲＰＩＮＥ２のｍＲＮＡレベルは、用量依存的にＴＧＦ−β処理で増大した。
【０２００】
例９．マウスＳＥＲＰＩＮＥ２に対するポリクローナル抗体を使用した、肺線維芽細胞におけるマウスＳＥＲＰＩＮＥ２誘導型コラーゲン産生の阻害
正常ヒト肺線維芽細胞を９６ウェル組織培養プレートに１ウェル当り８０００細胞で播種し、一晩付着させた。細胞は、ＴＧＦ−β（ポジティブコントロール）またはＴＧＦ−β＋マウスＳＥＲＰＩＮＥ２の用量を増大させて刺激した。抗体処理のために、ＳＥＲＰＩＮＥ２は、ポリクローナル抗マウスＳＥＲＰＩＮＥ２抗体またはアイソタイプコントロール抗体とともに、３０分間室温でプレインキュベートし、その後細胞に添加した。２４時間後、培地を吸引し、細胞は、２５ｇ／ｍｌのＬ−アスコルビン酸の存在下、上記試薬とともにさらに２４時間刺激した。刺激後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、室温で１０分間９５％のエタノールにて固定し、ＰＢＳで再び洗浄し、室温で２時間１％のＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングした。その後、細胞を０．１％のｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、マウス抗ヒトコラーゲンＩ抗体（ブロッキング緩衝液中、Ａｂｃａｍ Ａｂ６３０８ １：２０００）とともに２時間インキュベートした。プレートを前述のように洗浄し、２次抗体（抗マウスＩｇＧＨＲＰ、１：５０００、ブロッキング緩衝液中）を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを前述のように洗浄し、ＴＭＢ ＯＮＥ溶液にて、暗所で２０分間現像した。２Ｎ硫酸の添加によりアッセイを停止し、光学濃度（ＯＤ）を４５０ｎｍで読みとった。結果を図６に示す。
【０２０１】
ＴＧＦ−βによる肺線維芽細胞の処理は、製造されたコラーゲンの量の用量依存的な増大をもたらした。ＴＧＦ−βを伴うマウスＳＥＲＰＩＮＥ２の添加は、ＴＧＦ−β単独と比較して、コラーゲンタンパク質の著しい上昇をもたらした。図に示されるように、ポリクローナル抗マウスＳＥＲＰＩＮＥ２抗体によるマウスＳＥＲＰＩＮＥ２のプレインキュベーションは、用量依存的にコラーゲンＩのＳＥＲＰＩＮＥ２誘導型増加を完全に打ち消し、一方で、アイソタイプコントロール抗体は効果を示さなかった。
【０２０２】
例１０．ブレオマイシン治療マウスにおけるＳＥＲＰＩＮＥ２誘導
約６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６のメスのマウス（ACE laboratories）を、麻酔（イソフルラン）をかける群、および０日目に４０ｌの無菌リン酸緩衝生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ１４１９０）を投与（Ｉ．Ｔ．）する群または０日目に４０ｌの硫酸ブレオマイシン（Ｓｉｇｍａ Ｂ５７７０５：０．９％無菌食塩水中１Ｕ／ｍｌ）を投与（Ｉ．Ｔ．）する群に分けた。
【０２０３】
マウスを７日目または１４日目にｉ．ｐ．ケタミン注射で安楽死させ、肺組織採取に使用した。動物に対して、心臓を通る潅流を行い、肺から血液を除去した。一旦潅流されると、マウス由来の肺葉を切除し、氷冷し、さらなる処理までファストプレップチューブ中に保持した。
【０２０４】
肺ライセートを、ＦａｓｔＰｒｅｐマトリックスＤチューブを用いて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃ＦＮＮ００２１リシス緩衝液＋プロテアーゼ阻害剤カクテルおよびホスファターゼ阻害剤カクテル１および２（Ｓｉｇｍａ）中で作製した。ライセートは、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡアッセイを用いて定量し、Ｂｉｏｒａｄローディングバッファー（Ｃａｔ＃ １６１−０７９１）＋ＢＭＥを用いて９５℃で５分間煮沸した。全２ｕｇのタンパク質を４−１２％のビス−トリスゲルのそれぞれのレーンにロードし、ＭＯＰＳ緩衝液中、２００Ｖで５０分間泳動させた。トランスファーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＩＢｌｏｔシステムを使用して行なった。０．１ｕｇ／ｍｌのＲ＆Ｄ ＡＦ２１７５により４℃で一晩標識することでブロットした。ＰＢＳ／０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０による３回の洗浄に続いて、ペルオキシダーゼ融合ウシ抗ヤギ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｃａｔ＃８０５−０３５−１８０）を１：１０，０００で、室温で１時間使用した。その後、ＰＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ２０とで６回ブロットを洗浄し、ＧＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＥＣＬＰｌｕｓを検出試薬として使用した。３０秒、２分および４分の露出により膜を現像した。
【０２０５】
ＩｍａｇｅＪソフトウェア（http://rsb.info.nih.gov/ij/）を平均ピクセル強度の定量するために使用した。特に、画像を反転させ、固定した次元の長方形の領域をそれぞれのバンド内に配置し、平均ピクセル強度を測定した。Ｒａｗ ＡＰＩ値はＧｒａｐｈＰａｄプリズムを使用して、プロットし、統計的有意性をテューキーポスト試験により一次元配置分散分析を使用して決定した。結果を図７に示す。ＳＥＲＰＩＮＥ２レベル（５１ＫＤバンド）は、食塩水処理と比較して、ｂｌｅ処理した肺ライセートにて著しく増大した。
【０２０６】
例１１．ヒト肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現に対するＳＥＲＰＩＮＥ２の効果の阻害
ＳＥＲＰＩＮＥ２に結合し、それとトロンビンのような標的プロテアーゼとの相互作用を遮断するモノクローナル抗体を構築することができる（Wagner et al., Biochemistry 27: 2173-2176, 1988）。ＳＥＲＰＩＮＥ２と標的プロテアーゼとの相互作用を遮断するこの抗体の能力は、精製された抗体および精製されたタンパク質によるインビトロ結合アッセイを使用して決定することができる。
【０２０７】
例１に記載されるアッセイにおいて、抗体は量を増大させて、固定量のＳＥＲＰＩＮＥ２とともにインキュベートすることができる。ヒト肺線維芽細胞によるコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現レベルはｂＤＮＡアッセイを使用して決定することができる。抗体の量の増大は、ヒト肺線維芽細胞によるコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現のレベルにおける減少をもたらし得る。
【０２０８】
例１２．ブレオマイシンマウスモデルにおけるコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現に対するＳＥＲＰＩＮＥ２の効果の阻害
例１１の抗体は、エアロゾルによって、量を増大させて、ブレオマイシン処理後の様々な時間、例えば１２日目に開始して、肺に送達することができる。抗体処理後の様々な時間に、例えばブレオマイシン処理後１５日目に、マウスの肺を採取して、食塩水を流して血液を除去し、ｍＲＮＡを抽出し、コラーゲンおよびα−平滑筋アクチンの発現を評価した。抗体の量の増大は、ヒト肺線維芽細胞によるコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現のレベルにおける減少を引き起こし得る。抗体の投与は、マウス肺における繊維症の症状を改善することができる。ヒトにおける肺線維症を治療するのに必要な抗体の送達の量およびタイミングは、これらの研究から決定することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露されたヒト肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１および／またはα−平滑筋アクチンの発現のレベルを阻害するための方法であって、前記ヒト肺線維芽細胞へのＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの投与を含む方法。
【請求項２】
前記肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現の減少の検出をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記肺線維芽細胞は、前記アンタゴニストへの曝露の前にＴＧＦ−βに曝露される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記肺線維芽細胞は、前記アンタゴニストへの曝露の前にＩＬ−１３に曝露される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストが抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体はモノクローナル抗体である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがＲＮＡｉ分子である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがアンチセンス核酸分子である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがペプチドである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがＳＥＲＰＩＮＥ２の小分子阻害剤である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現のレベルが阻害される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
コラーゲン１Ａ１の前記レベルが阻害される請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
α−平滑筋アクチンの発現のレベルが阻害される請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
高いレベルのＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露されたヒト肺線維芽細胞からの筋線維芽細胞の形成を阻害するための方法であって、前記ヒト肺線維芽細胞へのＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの投与を含む方法。
【請求項１５】
前記肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現の減少の検出をさらに含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記肺線維芽細胞は、前記アンタゴニストへの曝露の前にＴＧＦ−βに曝露される請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記肺線維芽細胞は、前記アンタゴニストへの曝露の前にＩＬ−１３に曝露される請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストが抗体である請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体はモノクローナル抗体である請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがＲＮＡｉ分子である請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがアンチセンス核酸分子である請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがペプチドである請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがＳＥＲＰＩＮＥ２の小分子阻害剤である請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
ヒト肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１生産のレベルを増大するための方法であって、細胞へＳＥＲＰＩＮＥ２を投与し、前記ヒト肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現の増大を検出することを含む方法。
【請求項２５】
前記ＳＥＲＰＩＮＥ２が発現ベクターにて投与される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＳＥＲＰＩＮＥ２が精製されたタンパク質として投与される請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
コラーゲン発現の前記増大が、コラーゲン１Ａ１のＲＮＡのレベルの増大を測定することで検出される請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
α−平滑筋アクチンの発現の前記増大が、α−平滑筋アクチンのＲＮＡ産生のレベルの増大を測定することで検出される請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
医学的状態の治療のための医薬の製造のためのＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの使用であって、前記医学的状態は肺線維症である使用。
【請求項３０】
医学的状態の治療のための医薬の製造のためのＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの使用であって、前記医学的状態は特発性肺線維症（ＩＰＦ）である使用。
【請求項３１】
医学的状態の治療のための医薬の製造のためのＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの使用であって、前記医学的状態は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である使用。
【請求項３２】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストが抗体である請求項２９に記載の使用。
【請求項３３】
前記抗体はモノクローナル抗体である請求項２９に記載の使用。
【請求項３４】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがＲＮＡｉ分子である請求項２９に記載の使用。
【請求項３５】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがアンチセンス核酸分子である請求項２９に記載の使用。
【請求項３６】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがペプチドである請求項２９に記載の使用。
【請求項３７】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがＳＥＲＰＩＮＥ２の小分子阻害剤である請求項２９に記載の使用。
【請求項３８】
前記ヒト肺線維芽細胞が高いレベルのＳＥＲＰＩＮ２に曝露される請求項１に記載の方法。
【請求項１】
ＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露されたヒト肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１および／またはα−平滑筋アクチンの発現のレベルを阻害するための方法であって、前記ヒト肺線維芽細胞へのＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの投与を含む方法。
【請求項２】
前記肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現の減少の検出をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記肺線維芽細胞は、前記アンタゴニストへの曝露の前にＴＧＦ−βに曝露される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記肺線維芽細胞は、前記アンタゴニストへの曝露の前にＩＬ−１３に曝露される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストが抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体はモノクローナル抗体である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがＲＮＡｉ分子である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがアンチセンス核酸分子である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがペプチドである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがＳＥＲＰＩＮＥ２の小分子阻害剤である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
コラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現のレベルが阻害される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
コラーゲン１Ａ１の前記レベルが阻害される請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
α−平滑筋アクチンの発現のレベルが阻害される請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
高いレベルのＳＥＲＰＩＮＥ２に曝露されたヒト肺線維芽細胞からの筋線維芽細胞の形成を阻害するための方法であって、前記ヒト肺線維芽細胞へのＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの投与を含む方法。
【請求項１５】
前記肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現の減少の検出をさらに含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記肺線維芽細胞は、前記アンタゴニストへの曝露の前にＴＧＦ−βに曝露される請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記肺線維芽細胞は、前記アンタゴニストへの曝露の前にＩＬ−１３に曝露される請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストが抗体である請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体はモノクローナル抗体である請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがＲＮＡｉ分子である請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがアンチセンス核酸分子である請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがペプチドである請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがＳＥＲＰＩＮＥ２の小分子阻害剤である請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
ヒト肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１生産のレベルを増大するための方法であって、細胞へＳＥＲＰＩＮＥ２を投与し、前記ヒト肺線維芽細胞におけるコラーゲン１Ａ１およびα−平滑筋アクチンの発現の増大を検出することを含む方法。
【請求項２５】
前記ＳＥＲＰＩＮＥ２が発現ベクターにて投与される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＳＥＲＰＩＮＥ２が精製されたタンパク質として投与される請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
コラーゲン発現の前記増大が、コラーゲン１Ａ１のＲＮＡのレベルの増大を測定することで検出される請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
α−平滑筋アクチンの発現の前記増大が、α−平滑筋アクチンのＲＮＡ産生のレベルの増大を測定することで検出される請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
医学的状態の治療のための医薬の製造のためのＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの使用であって、前記医学的状態は肺線維症である使用。
【請求項３０】
医学的状態の治療のための医薬の製造のためのＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの使用であって、前記医学的状態は特発性肺線維症（ＩＰＦ）である使用。
【請求項３１】
医学的状態の治療のための医薬の製造のためのＳＥＲＰＩＮＥ２のアンタゴニストの使用であって、前記医学的状態は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である使用。
【請求項３２】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストが抗体である請求項２９に記載の使用。
【請求項３３】
前記抗体はモノクローナル抗体である請求項２９に記載の使用。
【請求項３４】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがＲＮＡｉ分子である請求項２９に記載の使用。
【請求項３５】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがアンチセンス核酸分子である請求項２９に記載の使用。
【請求項３６】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがペプチドである請求項２９に記載の使用。
【請求項３７】
ＳＥＲＰＩＮＥ２の前記アンタゴニストがＳＥＲＰＩＮＥ２の小分子阻害剤である請求項２９に記載の使用。
【請求項３８】
前記ヒト肺線維芽細胞が高いレベルのＳＥＲＰＩＮ２に曝露される請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５０９９４１（Ｐ２０１２−５０９９４１Ａ）
【公表日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３８７０２（Ｐ２０１１−５３８７０２）
【出願日】平成２１年１１月２５日（２００９．１１．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６５９９１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６２９９５
【国際公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【出願人】（５１１１２８２５１）ファイブ・プライム・セラピューティクス，インコーポレイテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＦＩＶＥ ＰＲＩＭＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】Ｔｗｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ ９４０８０， ｔｈｅ ＵＳＡ
【出願人】（５１１１２８２６２）セントコア・リサーチ・アンド・ディベロプメント，インコーポレイテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＯＣＯＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＆ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ， ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】１４５ Ｋｉｎｇ Ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ Ｒｏａｄ， Ｒａｄｎｏｒ， ＰＡ １９０８７， ｔｈｅ ＵＳＡ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月２５日（２００９．１１．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６５９９１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６２９９５
【国際公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【出願人】（５１１１２８２５１）ファイブ・プライム・セラピューティクス，インコーポレイテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＦＩＶＥ ＰＲＩＭＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】Ｔｗｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ ９４０８０， ｔｈｅ ＵＳＡ
【出願人】（５１１１２８２６２）セントコア・リサーチ・アンド・ディベロプメント，インコーポレイテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＯＣＯＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＆ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ， ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】１４５ Ｋｉｎｇ Ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ Ｒｏａｄ， Ｒａｄｎｏｒ， ＰＡ １９０８７， ｔｈｅ ＵＳＡ
【Ｆターム（参考）】
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