ＴＧＦ−β情報伝達経路阻害剤
本発明の目的は、ＴＧＦ−β情報伝達経路を阻害することができる低分子化合物から成るＴＧＦ−β情報伝達経路阻害剤を提供することである。本発明によれば、下記式（１）：
（式中、Ｒ１はヒドロキシメチル基などを示し、Ｒ２はパラ−メトキシフェニル基などを示す）
で表される化合物を有効成分として含む、ＴＧＦ−β情報伝達経路阻害剤が提供される。
（式中、Ｒ１はヒドロキシメチル基などを示し、Ｒ２はパラ−メトキシフェニル基などを示す）
で表される化合物を有効成分として含む、ＴＧＦ−β情報伝達経路阻害剤が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、サイトキサゾン又はその誘導体を有効成分として含むＴＧＦ−β情報伝達経路阻害剤、並びにＴＧＦ−β関連疾患の治療及び／又は予防剤に関する。
【背景技術】
ＴＧＦ−βは、肝線維症、肝硬変、肝炎、又は肝再生不全などの肝疾患に共通する病態形成因子であることから、その活性を抑えることにより当該疾患を治療又は予防する試みがなされている。例えば、ＴＧＦ−βの中和抗体を用いた抗体療法、もしくはドミナントネガティブＴＧＦ−β受容体遺伝子や可溶性ＴＧＦ−β受容体遺伝子を用いた遺伝子治療によってＴＧＦ−βの作用を入り口で止める方法が報告されている（Ｓｃｈｕｐｐａｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ５９：３８５−３９０，１９９８；Ｑｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：２３４５−２３４９，１９９９；及びＵｅｎｏ ｅｔ ａ１．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １１：３３−４２，２０００）。
一方、本発明者らは、ＴＧＦ−βが潜在型不活性型分子として産生され、プロテアーゼによって活性型分子に変換される点（ＴＧＦ−βの活性化反応）に注目し、低分子合成プロテアーゼ阻害剤や抗体（Ａｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２３：３５２−３６４，２００２）を用いてＴＧＦ−β活性化反応を阻害することによって、病気を防ぐことができる可能性を動物モデルで示したが、活性化反応が病態、組織、アイソフォーム特異的であることが明らかとなり、適応症状が限られることがわかってきた。
一方、サイトキサゾン（ＣＸＺ）については、その精製法や免疫細胞のサイトカイン産生能の調節活性、合成法が報告されている（Ｋａｋｅｙａ Ｈ他、Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏ １９９８；５１：１１２６−１１２８；Ｋａｋｅｙａ Ｈ他、Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ １９９９；６４：１０５２−１０５３；特開平１１−２０９３５５号公報；及び特開２０００−８６６３９号公報）が、その他の生物活性については不明であった。
【発明の開示】
ＴＧＦ−βは、間葉系細胞の細胞外マトリックス産生を強力に促すとともに上皮系細胞の増殖を抑制することにより、肝線維化／肝硬変、動脈硬化、肺線維症、皮膚線維症、腎不全、子宮筋腫などの硬化性疾患の病態を形成する一方、免疫担当細胞の働きを抑制するなど、多彩な生物活性を示す分子量２５ｋＤのホモダイマー多機能サイトカインである。上記の通り、ＴＧＦ−βに対する中和抗体を用いた動物モデルでの検討から、ＴＧＦ−βの働きを抑制することによって硬化性疾患を予防・治療できることがわかってきた。さらに、変異ＴＧＦ−β受容体を用いた遺伝子治療の開発が試みられている。しかし、抗体療法や遺伝子治療では、必要量や投与法の観点で問題が残っており、すぐには臨床応用できず、ＴＧＦ−βの作用機序に基づいた低分子阻害剤の開発が望まれている。即ち、本発明は、ＴＧＦ−β情報伝達経路を阻害することができる低分子化合物から成るＴＧＦ−β情報伝達経路阻害剤を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するための鋭意検討した結果、本明細書に定義する式（１）で表されるサイトキサゾン又はその誘導体（以下、ＣＸＺとも略記する）がＴＧＦ−βの情報伝達経路を阻害することを初めて見出することにより、本発明を完成するに到った。
即ち、本発明によれば、下記式（１）：
（式中Ｒ１は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、フェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノフェニル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルキル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルコキシ基を示し、Ｒ２は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、フェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノフェニル基、ベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノベンジル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルキル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルコキシ基を示す。）
で表される化合物を有効成分として含む、ＴＧＦ−β情報伝達経路阻害剤が提供される。
好ましくは、本発明のＴＧＦ−β情報伝達経路阻害剤は、Ｓｍａｄ２のリン酸化を抑制することによりＴＧＦ−β情報伝達経路を阻害する。
本発明の別の側面によれば、下記式（１）：
（式中Ｒ１は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、フェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノフェニル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルキル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルコキシ基を示し、Ｒ２は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、フェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノフェニル基、ベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノベンジル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルキル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルコキシ基を示す。）
で表される化合物を有効成分として含む、ＴＧＦ−β関連疾患の治療及び／又は予防剤が提供される。
好ましくは、ＴＧＦ−β関連疾患は肝線維化／肝硬変、肝炎、肝再生不全、動脈硬化、肺線維症、皮膚線維症、腎不全、又は子宮筋腫である。
好ましくは、Ｒ１は、ヒドロキシメチル基であり、Ｒ２は、パラ−メトキシフェニル基である。特に好ましくは、本発明で用いる化合物は下記式（２）で表される化合物である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路を示す。
Ａ：ＴＧＦ−βの合成・分泌を高める因子、要因
ＴＧＦ−β、ビタミンＡ、抗エストロゲン、ブレオマイシン、
デキサメサゾン、ウイルス感染、リンパ球活性化、骨折、肝線維化、
心筋梗塞、肝障害
Ｂ：細胞外基質からＴＧＦ−βを放出させる因子
エラスターゼ、チマーゼ、プラスミン、トロンビン
Ｃ：ＴＧＦ−βの活性化を起こす因子
酸、アルカリ、熱、変性剤、活性酸素種（ＲＯＳ）、
エンドグリコシダーゼ、トロンボスポンジン、セリンプロテアーゼ、
インテグリン、マトリックスメタロプロテアーゼ
Ｄ：細胞にＴＧＦ−β活性化を起こす因子、要因
混合培養、ビタミンＡ、ビタミンＤ、抗エストロゲン、ブレオマイシン、
デキサメサゾン、リポ多糖、ＩｇＧ、インターフェロン、癌化
Ｅ：ＴＧＦ−β受容体の発現を高める因子、要因
ビタミンＡ、肝線維化
Ｆ：ＴＧＦ−β受容体の発現を減らす因子、要因
癌化、細胞外マトリックス
図２は、プロテアーゼインヒビターを用いたＴＧＦ−β活性化阻害による肝臓の病態形成の抑制を示す。
図３は、サイトキサゾンの構造を示す。Ｒ１はヒドロキシメチル基を示し、Ｒ２はｐ−メトキシフェニル基を示す。
図４は、サイトキサゾンによるＴＧＦ−β活性抑制を介する肝星細胞の活性化抑制を示す。Ａ）形態変化、Ｂ）標的遺伝子発現の抑制、Ｃ）ＴＧＦ−β依存転写活性の抑制
図５は、サイトキサゾン処理によるＳｍａｄ２量およびリン酸化Ｓｍａｄ２量の減少を示す。
図６は、サイトキサゾン処理によるＳｍａｄ−標的遺伝子複合体量の減少を示す。
図７は、肝星細胞とミンク肺上皮細胞におけるサイトキサゾン処理によるＴＧＦ−β依存性転写活性化活性の抑制を示す。
図８は、サイトキサゾン処理によるＴＧＦ−β受容体の下流のシグナル伝達の抑制を示す。
図９は、サイトキサゾン処理によるＳｍａｄ活性の抑制を示す。
図１０は、サイトキサゾン処理によるＳｍａｄのｍＲＮＡ発現及び蛋白質量に対する影響を示す。
図１１は、サイトキサゾン処理によるＳｍａｄ蛋白質の核局在に対する影響を示す。
図１２は、サイトキサゾン処理によるプロコラーゲン遺伝子プロモーターの転写活性化活性の抑制を示す。
図１３は、マウスにおけるサイトキサゾンによる肝再生の回復を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）−βは、硬化性疾患の病態形成を担ったり、免疫担当細胞の働きを抑制する一方、プロテアーゼの過剰産生を抑制することによって肺組織が分解され肺気腫に陥るのを防いだりしたり癌細胞の増殖を抑制するなど、多彩な生物活性を示す分子量２５ｋＤのホモダイマー多機能性サイトカインである。ＴＧＦ−βは受容体に結合できない分子量約３００ｋＤの不活性な潜在型として産生され、標的細胞表面やその周囲において活性化されて受容体に結合できる活性型となり、その作用を発揮する（図１）。
標的細胞におけるＴＧＦ−βの作用はＳｍａｄという情報伝達を担う一連のタンパク質のリン酸化経路によって伝達される。まず、活性型ＴＧＦ−βが標的細胞表面に存在するＩＩ型ＴＧＦ−β受容体に結合すると、ＩＩ型受容体２分子とＩ型ＴＧＦ−β受容体２分子からなる受容体複合体が形成され、ＩＩ型受容体がＩ型受容体をリン酸化する。次に、リン酸化Ｉ型受容体は、Ｓｍａｄ２もしくはＳｍａｄ３をリン酸化すると、リン酸化されたＳｍａｄ２やＳｍａｄ３はＳｍａｄ４と複合体を形成して核に移行し、標的遺伝子プロモーター領域に存在するＣＡＧＡ ｂｏｘと呼ばれる標的配列に結合し、コアクチベーターとともに標的遺伝子の転写発現を誘導する（図１）。
本発明者らは、潜在型ＴＧＦ−βが肝臓においてはプロテアーゼによる切断活性化を受け、強力な線維形成誘導能や肝細胞増殖抑制能を発揮することが原因となり肝線維化／肝硬変や肝再生不全を引き起こすことを発見し、プロテアーゼインヒビターを用いてＴＧＦ−βの活性化を阻害してやると病態形成を抑制できること（図２）を報告した（Ｏｋｕｎｏ Ｍ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００１；１２０：１７８４−１８００；Ａｋｉｔａ Ｋ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００２；１２３：３５２−３６４）。これらの発見に基づき、プロテアーゼに対する抗体を用いた治療法の開発、さらには病態・組織・アイソフォーム特異的活性化反応認識抗体の作製を報告している（特願２００２−０５７２５３号、特願２００３−３１３０１４号）。
本発明者らは続いて、ＴＧＦ−βの情報伝達抑制物質とＴＧＦ−βの活性化を抑えるプロテアーゼ阻害剤を併用することによって相乗的に病態形成抑制効果が得られることを期待して、ＴＧＦ−β情報伝達抑制物質のスクリーニングを行った。その結果、オキサゾリジノン環を有するサイトキサゾン（図３；ｃｙｔｏｘａｚｏｎｅ：ＣＸＺと略）を見出だした。Ｒ１は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、フェニル基、オルトー、メターまたはパラーメトキシフェニル基、オルトー、メターまたはパラーヒドロキシフェニル基、オルトー、メターまたはパラーニトロフェニル基、オルトー、メターまたはパラーアミノフェニル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖上アルキル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルコキシ基を示し、Ｒ２は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、フェニル基、オルトー、メターまたはパラーメトキシフェニル基、オルトー、メターまたはパラーヒドロキシフェニル基、オルトー、メターまたはパラーニトロフェニル基、オルトー、メターまたはパラーアミノフェニル基、ベンジル基、オルトー、メターまたはパラーメトキシベンジル基、オルトー、メターまたはパラーヒドロキシベンジル基、オルトー、メターまたはパラーニトロベンジル基、オルトー、メターまたはパラーアミノベンジル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルキル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルコキシ基を示す。
サイトキサゾンは、ストレプトマイセス属が産生分泌する抗生物質で、免疫担当Ｔｈ２細胞からのサイトカインＩＬ４並びにＩＬ１０の産生を抑制することが知られている（Ｋａｋｅｙａ Ｈ他、Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏ １９９８；５１：１１２６−１１２８；Ｋａｋｅｙａ Ｈ他、Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ １９９９；６４：１０５２−１０５３）。サイトキサゾン又はその誘導体の発見、精製については特開平１１−２０９３５５号公報に記載されており、その有機合成は特開２０００−８６６３９号公報、及びＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ １９９９；４０：４２０３−４２０６に記載されている。上記の通り、本発明で用いる式（１）で表される化合物は公知化合物であり、上記文献の記載に準じて入手又は合成することができる。
本発明は、本明細書に定義する式（１）で表される化合物を有効成分として含む、ＴＧＦ−β情報伝達経路阻害剤、並びにＴＧＦ−β関連疾患の治療及び／又は予防剤に関するものである。以下、これらを総称して本発明の薬剤と称する場合がある。
本発明の薬剤としては、式（１）で表される化合物をそのまま単独で用いてもよいが、通常は薬学的に許容される製剤添加物を用いて医薬組成物の形態で供給することが好ましい。本発明の薬剤は経口的又は非経口的に投与することができる。本明細書で言う薬学的に許容される製剤添加物としては、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。
経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などを挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤などを挙げることができるが、本発明の薬剤の形態はこれらに限定されることはない。
非経口投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射などの種々の投与形態を例示することができる。注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、バクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合または照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することも可能である。
本発明の薬剤はヒトを含む哺乳動物に投与することができる。本発明の薬剤の投与量は患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、一般的には、成人一日あたり０．００１ｍｇ／ｋｇから１０００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲であり、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲であり、特に好ましくは１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ程度の範囲であり、例えば、２０ｍｇ／ｋｇである。上記投与量の薬剤は、毎日投与してもよいしあるいは数日間隔で投与してもよく、例えば１〜４日毎に投与される。
本発明の薬剤は、ＴＧＦ−β情報伝達経路阻害剤として使用することができ、例えば、ＴＧＦ−β関連疾患の治療及び／又は予防剤として使用することができる。ＴＧＦ−β関連疾患としては、病態形成因子がＴＧＦ−βである疾患（例えば、病態形成因子がＴＧＦ−βである肝疾患など）を挙げることができる。ＴＧＦ−β関連疾患の具体例としては、肝線維化／肝硬変、肝炎、肝再生不全、動脈硬化、肺線維症、皮膚線維症、腎不全、又は子宮筋腫などを挙げることができる。また、ＴＧＦ−β関連疾患の治療及び／又は予防剤とは、該疾患の発症及び／または進行を抑制又は阻止することを含む広い意味で解釈される。
本発明の薬剤のＴＧＦ−β関連疾患の症状に対する治療効果については、常法に従って疾患モデル動物に投与することにより試験、検討することができる。例えば、肝炎（例えば、ウイルス性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型など）など）、肝硬変あるいは薬物肝障害などの肝疾患ついても、既報のモデル動物を用いることができる（例えば、「疾患別モデル動物の作製と新薬開発のための試験・実験法」、ｐ．１１９−１２９及びｐ．３４９−３５８、１９９３、技術情報協会などを参照）。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【実施例】
［実施例１］：ＣＸＺによる肝星細胞の活性化抑制
既報の方法に従って（Ｏｋｕｎｏ Ｍ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００１；１２０：１７８４−１８００）、雄のウィスターラット（体重３５０〜４００ｇ；Ｊａｐａｎ Ｃｌｅａ）の肝臓から肝星細胞を単離し、１０ｃｍ培養プラスティックディッシュ１枚あたりに３．５×１０６個の細胞をまき、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で一晩培養した。翌日より下記構造を有する化合物（以下、ＣＸＺと略記する）を含む無血清培地に交換し、さらに６日間培養し、プラスティックディッシュ上で培養することによって誘起される肝星細胞の活性化に及ぼす薬剤の影響を顕微鏡下で観察した。
図４Ａに示すように、ＣＸＺは星細胞の活性化（ビタミンＡを含む油滴の消失を伴う形態変化）を抑制した。その効果は容量依存的であり、最適値は終濃度１５０μｇ／ｍｌであった。
次に、星細胞の活性化に伴い発現が誘導されることが知られている幾つかの遺伝子［ＴＧＦ−β１，Ｉ型プロコラゲンα２、α平滑筋アクチン］について、その発現量の変化を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法により検討した。内部標準としてはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子量の変化を測定した。顕微鏡下での観察を終了した細胞からＱＩＡＧＥＮ社のＲＮＥＡＳＹ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてＲＮＡを抽出・精製し、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、その使用説明書に従って、ＲＮＡ（１μｇ）をｃＤＮＡに逆転写し、このｃＤＮＡを鋳型として以下のセンスおよびアンチセンスプライマーを用いて各ｃＤＮＡフラグメントをＰＣＲで増幅したのちに２％アガロースゲルに流してエチジウムブロマイドで染色し、相対量をＵＶ光下で比較・観察した。
ラットＴＧＦ−β１
ラットＩ型プロコラゲンα２
ラットα平滑筋アクチン
ラットグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）
図４Ｂに示すように、コントロールの細胞（溶媒である０．５％ ＤＭＳＯ処理）に比べてＣＸＺ処理細胞（ＣＸＺ）では、ＴＧＦ−β１、Ｉ型プロコラゲンα２（ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ）、α平滑筋アクチン（αＳＭＡ）遺伝子量が減少していた。このとき、内部標準のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子量には変化がみられなかった。
肝星細胞の活性化は星細胞自身が産生するＴＧＦ−βに依存していることから、ＣＸＺによる星細胞活性化抑制効果がＴＧＦ−βの活性抑制に因るものであるか否かを、ＴＧＦ−βの活性測定に最も一般的に用いられているミンク肺上皮（ＭＬＥ）細胞並びにラット肝星細胞を用いたリポーターアッセイにより検討した。
３．５ｃｍ培養プラスティックディッシュ１枚あたりに１．０×１０５個のＭＬＥ細胞をまき、１０％ ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で一晩培養した後に、ＴＧＦ−βの代表的な標的遺伝子であるｐＰＡＩ−１のプロモーターにルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）リポーターを融合させたｐＰＡＩ−１−ＬｕｃをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてディッシュ１枚あたり５００ｎｇトランスフェクションした。トランスフェクション２時間後の培地を１ｎｇ／ｍｌヒト組み換えＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ社製）や１５０μｇ／ｍｌ ＣＸＺ、並びにこれらの組み合わせを含む無血清培地に交換し、２日間前培養した後に細胞抽出液を作製し、抽出液中のルシフェラーゼ活性をＰｒｏｍｅｇａ社のＤｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いてルミノメーター（Ｐａｃｋａｒｄ社製）により測定した。トランスフェクションの効率を補正するためにウミシイタケルシフェラーゼを同時にトランスフェクションし、測定結果はウミシイタケルシフェラーゼの値と抽出液のタンパク量で補正したのちにＴＧＦ−β１のみの値を１００％とした相対値で表した（図４Ｃ、レーン１〜３）。タンパク量はＰＩＥＲＣＥ社のＢＣＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いてウシ血清アルブミンをスタンダードとして決定した。星細胞はラット肝臓から単離後３．５ｃｍプラスティックディッシュ１枚あたり４．０×１０５個の細胞をまき、一晩１０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭで培養した翌曰からＣＸＺを含む無血清培地に交換し、さらに４日間培養した後にＭＬＥ細胞と同様にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ試薬を用いてディッシュ１枚あたり５００ｎｇのｐＰＡＩ−１−Ｌｕｃをトランスフェクションし、ＣＸＺを含む無血清培地でさらに２日間培養した細胞から抽出液を調製し、抽出液中のルシフェラーゼ活性を測定した。結果はウミシイタケルシフェラーゼの値と抽出液のタンパク量で補正したのちにＣＸＺ無処理細胞（内在性ＴＧＦ−βの刺激を受けている）の値を１００％とした相対値で表した（図４Ｃ、レーン４と５）。
図４Ｃに示すようにＣＸＺはＴＧＦ−βにより誘導されるＬｕｃ活性の顕著な抑制を示した（レーン２ｖｓレーン３（ＭＬＥ細胞）；レーン４ｖｓレーン５（星細胞））。この結果は、ＣＸＺがＴＧＦ−βの活性を抑制することを示しており、ＣＸＺがＴＧＦ−βの情報伝達経路を阻害する活性を有していることが強く示唆された。
［実施例２］：ＣＸＺによるＴＧＦ−βの情報伝達経路阻害
実施例１に記載したように、ＴＧＦ−βの作用は、受容体によるＳｍａｄのリン酸化、リン酸化Ｓｍａｄ複合体の核への移行、リン酸化Ｓｍａｄ複合体の標的遺伝子プロモーターへの結合による転写の促進という経路で伝達される。そこで、ＣＸＺがＴＧＦ−βの情報伝達経路を阻害しているかどうかについて、Ｓｍａｄ２総量、リン酸化Ｓｍａｄ２量、並びにリン酸化Ｓｍａｄ複合体の標的遺伝子プロモーターへの結合量を、ウェスタンブロット解析、並びにゲルシフトアッセイの測定結果から検討した。
まず、ウェスタンブロット解析によるＳｍａｄ２総量とリン酸化Ｓｍａｄ２量の測定結果を説明する。図４Ａの実験のごとく単離、培養し、終濃度１００μｇ／ｍｌ、並びに２００μｇ／ｍｌのサイトキサゾンで処理したラット肝星細胞より１ｘＳＤＳサンプルバッファーを用いて細胞抽出液を作製し、１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけたのちにＰＶＤＦ（ポリビニデンジフルオリド）膜に電気泳動転写した。膜上のタンパク質のウェスタンブロット解析は、Ｓｍａｄ２認識マウスモノクロナル抗体（終濃度１μｇ／ｍｌ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、並びにリン酸化Ｓｍａｄ２認識ウサギポリクロナル抗体（終濃度２μｇ／ｍｌ；Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）とホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスもしくはウサギＩｇＧ抗体（最終１：７５０希釈）の組み合わせを用いて、既報の方法に従って行った（Ｏｋｕｎｏ Ｍ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００１；１２０：１７８４−１８００）。バンドはＡｍｅｒｓｈａｍ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）ＥＣＬ ｓｙｓｔｅｍで検出した。
その結果、図５に示すように、コントロールの細胞（溶媒である０．５％ ＤＭＳＯ処理した細胞：レーン１）に比べて、ＣＸＺ処理細胞（レーン２と３）では、ＣＸＺの濃度に依存してＳｍａｄ２総量とリン酸化Ｓｍａｄ２量が減少していた。このとき、内部標準のＧＡＰＤＨ量は変化していなかった。
次に、ゲルシフトアッセイによるリン酸化Ｓｍａｄ複合体の標的遺伝子プロモーターへの結合量の測定結果を説明する。図４Ａの実験のごとく単離、培養、薬剤処理したラット肝星細胞より既述の方法（Ｓｈｉｍａｄａ Ｊ他、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２００２；１５：１６７７−１６９２）に従って核抽出液を作製し、放射標識したＣＡＧＡボックス配列（ＰＡＩ−１プロモーター中に存在するリン酸化Ｓｍａｄ複合体の結合配列）含有オリゴヌレクオチドと氷上にてインキュベーションしたのちに、４％ポリアクリルアミドゲルにてリン酸化Ｓｍａｄ−ＣＡＧＡボックス複合体とフリーのＣＡＧＡボックスとを分離したのちに、オートラジオグラフィーによってリン酸化Ｓｍａｄ−ＣＡＧＡボックス複合体量を測定した。
その結果、図６に示すようにコントロールの細胞（溶媒である０．５％ ＤＭＳＯ処理した細胞：レーン２）に比べてＣＸＺ処理細胞（レーン３）では、リン酸化Ｓｍａｄ−ＣＡＧＡボックス複合体量が減少していた。レーン１は未標識ＣＡＧＡボックス配列含有オリゴヌレクオチドをコントロールの細胞由来の核抽出液に加えた時の結果であり、得られたバンドが特異的バンドであることを示している。
さらに、ＲＴ−ＰＣＲ法によってＴＧＦ−β受容体量の変化を測定したところ、ＣＸＺ処理した細胞ではＴＧＦ−β受容体量は変化していないことがわかった。また、ＣＸＺは潜在型ＴＧＦ−βの活性化反応にも影響を与えなかった。
以上の結果より、ＣＸＺはＳｍａｄ２のリン酸化を抑制することによってＴＧＦ−βの情報伝達経路を抑制することがわかった。
［実施例３］：肝星細胞とミンク肺上皮細胞におけるＣＸＺによるＴＧＦ−β依存性転写活性化活性の抑制
単離の２４時間後に、３５ｍｍ皿で培養した肝星細胞を１５０μｇ／ｍｌのＣＸＺの存在下又は非存在下で３日間処理し、ｐＲＬ−ＣＭＶ（Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ，５０ｎｇ／ｄｉｓｈ）と一緒に、ＰＡＩ−１プロモーター−ルシフェラーゼ発現ベクターであるｐＰＡＩ−１−Ｌｕｃ（５００ｎｇ／ｄｉｓｈ）又は９コピーのＣＡＧＡ配列を含むベクターである９ＣＡＧＡ−Ｌｕｃ（５００ｎｇ／ｄｉｓｈ）の何れかをトランスフェクションした（図７の左のグラフ）。トランスフェクションした細胞を同一条件下でさらに２４時間処理を続けた。３５ｍｍ皿上に２×１０５のミンク肺上皮細胞（ＭＥＬＣ）をプレーティングした２４時間後に、細胞を１５０μｇ／ｍｌのＣＸＺの存在下又は非存在下で３日間処理し、９ＣＡＧＡ−Ｌｕｃ（５００ｎｇ／ｄｉｓｈ）とｐＲＬ−ＣＭＶ（５０ｎｇ／ｄｉｓｈ）の組み合わせでトランスフェクションした（図７の右のグラフ）。トランスフェクションの翌日、細胞を１５０μｇ／ｍｌのＣＸＺの存在下又は非存在下で、５ｎｇ／ｍｌの組み換えヒトＴＧＦ−β１で１６時間処理した。両方の細胞から細胞ライセートを調製し、各ライセートにおけるルシフェラーゼ活性を測定し、ホタルルシフェラーゼ活性の変化を計算して、ＣＸＺ未処理の対照細胞のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性に標準化した後、プロットした。
結果を図７に示す。図７の結果から分かるように、ＴＧＦ−βのシグナル伝達・転写因子であるＳｍａｄ２／Ｓｍａｄ４複合体もしくはＳｍａｄ３／Ｓｍａｄ４複合体が結合する標的モチーフであるＣＡＧＡボックス９個で駆動されるルシフェラーゼリポーター遺伝子を用いて、ＣＸＺにより、ＴＧＦ−β依存性転写活性化活性が抑制されることが実証された。
［実施例４］：ＴＧＦ−β受容体の下流のシグナル伝達の抑制
３５ｍｍ皿上に２×１０５のミンク肺上皮細胞（ＭＥＬＣ）をプレーティングした２４時間後に、細胞を１５０μｇ／ｍｌのＣＸＺの存在下又は非存在下で３日間処理し、ｐＰＡＩ−１−Ｌｕｃ（５００ｎｇ／ｄｉｓｈ）とｐＲＬ−ＣＭＶ（５０ｎｇ／ｄｉｓｈ）の組み合わせ、及び活性型ＴＧＦ−β受容体Ｉを構成的に発現するベクターでトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を同一条件下でさらに２４時間±ＣＸＺ処理を続けた。以下、実施例３と同様にルシフェラーゼ活性を測定した。
結果を図８に示す。ＴＧＦ−β受容体が存在する条件下でサイトキサゾンの効果を比較した図８の結果から、ＴＧＦ−β受容体の下流のシグナル伝達にサイトキサゾンが効果を発揮することが実証された。
［実施例５］：Ｓｍａｄ活性の抑制
単離の２４時間後に、３５ｍｍ皿の肝星細胞を１５０μｇ／ｍｌのＣＸＺの存在下又は非存在下で３日間処理し、９ＣＡＧＡ−Ｌｕｃ（５００ｎｇ／ｄｉｓｈ）とｐＲＬ−ＣＭＶ（５０ｎｇ／ｄｉｓｈ）の組み合わせ、及びＳｍａｄｓ２，３，及び４（２００ｎｇずつ／ｄｉｓｈ）の幾つかの組み合わせをトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を同一条件下でさらに２４時間処理を続けた。細胞ライセートを調製し、各ライセートにおけるルシフェラーゼ活性を測定し、ホタルルシフェラーゼ活性の変化を計算して、ＣＸＺ未処理の対照細胞のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性に標準化した後、プロットした。
結果を図９に示す。ＴＧＦ−βのシグナル伝達は、受容体が活性化（リン酸化）されると、細胞質に存在するＳｍａｄ２もしくはＳｍａｄ３がリン酸化されＳｍａｄ４と複合体を形成し、リン酸化Ｓｍａｄ２／Ｓｍａｄ４複合体もしくはリン酸化Ｓｍａｄ３／Ｓｍａｄ４複合体が核へ移行して標的配列ＣＡＧＡボックスに結合し、他の転写因子や転写仲介因子と一緒になって基本転写因子を活性化し、標的遺伝子の転写を引き起こすという機構である（図１）。図９の結果は、Ｓｍａｄ２，Ｓｍａｄ３，Ｓｍａｄ４を強制的に発現した肝星細胞におけるＣＸＺの影響を示すものである。ＣＸＺは実施例６に示すようにＳｍａｄ３の発現を抑制するが、これは、Ｓｍａｄ３の強制発現でレスキューされる。これに対して、Ｓｍａｄ２の発現は変わらないが、強制発現したＳｍａｄ２の活性がＳｍａｄ２／Ｓｍａｄ４＋Ｓｍａｄ３／Ｓｍａｄ４、並びにＳｍａｄ２／Ｓｍａｄ４の細胞において抑制を受けていることから、ＣＸＺはＳｍａｄ２の活性（含Ｓｍａｄ２のリン酸化）を抑制していることが示された。
［実施例６］：ＳｍａｄのｍＲＮＡ発現及び蛋白質量に対する影響
初代肝星細胞を１５０μｇ／ｍｌのＣＸＺの存在下又は非存在下で４日間処理した後、細胞ライセートを調製し、ｍＲＮＡを単離し、図示したＳｍａｄのｍＲＮＡ量の変化をＲＴ−ＰＣＲにより評価した（図１０の左図）。
ラットＳｍａｄ２
ラットＳｍａｄ３
ラットＳｍａｄ４
ラットＳｍａｄ７
ＨＳＣ−Ｔ６細胞を１５０μｇ／ｍｌのＣＸＺの存在下又は非存在下で４日間処理した後、細胞ライセートを調製し、Ｓｍａｄ２及び／又は３の総蛋白質量及びリン酸化蛋白質量の変化を、抗Ｓｍａｄ２／３抗体及び抗ホスホＳｍａｄ２／３抗体を用いたウエスタンブロッティングにより評価した（図１０の右図）。
図１０に示す通り、ｍＲＮＡレベルではＳｍａｄ３において有意差が見られ、蛋白質ではＳｍａｄ２／３の複合タンパク質で差が見られた。
［実施例７］：Ｓｍａｄ蛋白質の核局在に対する影響
初代肝星細胞を１５０μｇ／ｍｌのＣＸＺの存在下又は非存在下で４日間処理した後、細胞を固定化し、抗Ｓｍａｄ２／３抗体で染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。結果を図１１に示す。Ｓｍａｄ２／３は、ＣＸＺ非処理細胞（コントロール）ではより核に集まっているのに対して、ＣＸＺ処理細胞は細胞全体に広がっていることが観察された。
［実施例８］：プロコラーゲン遺伝子プロモーターの転写活性化活性の抑制
初代肝星細胞を１５０μｇ／ｍｌのＣＸＺの存在下又は非存在下で３日間処理し、ｐＣｏｌｌａｇｅｎ−Ｌｕｃ（５００ｎｇ／ｄｉｓｈ）及びｐＲＬ−ＣＭＶ（５０ｎｇ／ｄｉｓｈ）の組み合わせをトランスフェクションし、同一条件下でさらに２４時間処理を続けた。細胞ライセートを調製し、各ライセートにおけるルシフェラーゼ活性を測定し、ホタルルシフェラーゼ活性の変化を計算して、ＣＸＺ未処理の対照細胞のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性に標準化した後、プロットした。
結果を図１２に示す。図１２の結果から、ＣＸＺはプロコラーゲン遺伝子プロモーターの転写活性化活性を抑制することが示された。
［実施例９］：マウスにおけるサイトキサゾンによる肝再生の回復
ＬＰＳで前処理し、部分的に肝切除したマウスを、ＣＸＺ（１５ｍｇ／ｋｇ体重／日；ｉ．ｐ．）で処理した（対照では処理しない）。部分肝切除の開始後４８時間後に肝臓を単離し、その切片を調製し、抗ＰＣＮＡ抗体で染色し、光学顕微鏡で観察した。結果を図１３に示す。図１３において茶褐色に染まっている核が再生をした細胞核で、この核の数を測定した結果であるＰＣＮＡ標識指数は、対照では２８．５±３．７４であるのに対し、ＣＸＺ投与例では８０．８±３．８９であった。サイトキサゾンにより肝再生が回復することが示された。
（実施例のまとめ）
上記の通り、ＣＸＺはＴＧＦ−βの情報伝達を担うリン酸化Ｓｍａｄを減少させることによってＴＧＦ−β情報伝達経路を遮断し、ＴＧＦ−βの作用を阻害する作用を有しており、ＴＧＦ−βが関連する疾患、例えば肝硬変の原因である肝星細胞の活性化を有意に抑制したり、肝再生不全の原因である肝細胞の増殖抑制を回復する作用を有していることが判明した。ＣＸＺ又はその誘導体を用いることによって、従来の技術では困難であったＴＧＦ−βの情報伝達経路遮断に基づく各種硬化性疾患を始めとするＴＧＦ−β関連疾患の予防薬・治療薬の開発が可能であると期待できる。
【産業上の利用可能性】
本発明では、サイトキサゾンがＴＧＦ−β依存の肝星細胞の活性化を抑制するという知見に基づいて、サイトキサゾン又はその誘導体の新しい生物活性としてＴＧＦ−β情報伝達経路阻害を見出した。本発明によるサイトキサゾン又はその誘導体を有効成分として含むＴＧＦ−β情報伝達経路阻害剤を用いることにより、ＴＧＦ−β関連疾患の治療法・予防法を確立することが可能になる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【技術分野】
本発明は、サイトキサゾン又はその誘導体を有効成分として含むＴＧＦ−β情報伝達経路阻害剤、並びにＴＧＦ−β関連疾患の治療及び／又は予防剤に関する。
【背景技術】
ＴＧＦ−βは、肝線維症、肝硬変、肝炎、又は肝再生不全などの肝疾患に共通する病態形成因子であることから、その活性を抑えることにより当該疾患を治療又は予防する試みがなされている。例えば、ＴＧＦ−βの中和抗体を用いた抗体療法、もしくはドミナントネガティブＴＧＦ−β受容体遺伝子や可溶性ＴＧＦ−β受容体遺伝子を用いた遺伝子治療によってＴＧＦ−βの作用を入り口で止める方法が報告されている（Ｓｃｈｕｐｐａｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ５９：３８５−３９０，１９９８；Ｑｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：２３４５−２３４９，１９９９；及びＵｅｎｏ ｅｔ ａ１．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １１：３３−４２，２０００）。
一方、本発明者らは、ＴＧＦ−βが潜在型不活性型分子として産生され、プロテアーゼによって活性型分子に変換される点（ＴＧＦ−βの活性化反応）に注目し、低分子合成プロテアーゼ阻害剤や抗体（Ａｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２３：３５２−３６４，２００２）を用いてＴＧＦ−β活性化反応を阻害することによって、病気を防ぐことができる可能性を動物モデルで示したが、活性化反応が病態、組織、アイソフォーム特異的であることが明らかとなり、適応症状が限られることがわかってきた。
一方、サイトキサゾン（ＣＸＺ）については、その精製法や免疫細胞のサイトカイン産生能の調節活性、合成法が報告されている（Ｋａｋｅｙａ Ｈ他、Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏ １９９８；５１：１１２６−１１２８；Ｋａｋｅｙａ Ｈ他、Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ １９９９；６４：１０５２−１０５３；特開平１１−２０９３５５号公報；及び特開２０００−８６６３９号公報）が、その他の生物活性については不明であった。
【発明の開示】
ＴＧＦ−βは、間葉系細胞の細胞外マトリックス産生を強力に促すとともに上皮系細胞の増殖を抑制することにより、肝線維化／肝硬変、動脈硬化、肺線維症、皮膚線維症、腎不全、子宮筋腫などの硬化性疾患の病態を形成する一方、免疫担当細胞の働きを抑制するなど、多彩な生物活性を示す分子量２５ｋＤのホモダイマー多機能サイトカインである。上記の通り、ＴＧＦ−βに対する中和抗体を用いた動物モデルでの検討から、ＴＧＦ−βの働きを抑制することによって硬化性疾患を予防・治療できることがわかってきた。さらに、変異ＴＧＦ−β受容体を用いた遺伝子治療の開発が試みられている。しかし、抗体療法や遺伝子治療では、必要量や投与法の観点で問題が残っており、すぐには臨床応用できず、ＴＧＦ−βの作用機序に基づいた低分子阻害剤の開発が望まれている。即ち、本発明は、ＴＧＦ−β情報伝達経路を阻害することができる低分子化合物から成るＴＧＦ−β情報伝達経路阻害剤を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するための鋭意検討した結果、本明細書に定義する式（１）で表されるサイトキサゾン又はその誘導体（以下、ＣＸＺとも略記する）がＴＧＦ−βの情報伝達経路を阻害することを初めて見出することにより、本発明を完成するに到った。
即ち、本発明によれば、下記式（１）：
（式中Ｒ１は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、フェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノフェニル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルキル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルコキシ基を示し、Ｒ２は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、フェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノフェニル基、ベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノベンジル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルキル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルコキシ基を示す。）
で表される化合物を有効成分として含む、ＴＧＦ−β情報伝達経路阻害剤が提供される。
好ましくは、本発明のＴＧＦ−β情報伝達経路阻害剤は、Ｓｍａｄ２のリン酸化を抑制することによりＴＧＦ−β情報伝達経路を阻害する。
本発明の別の側面によれば、下記式（１）：
（式中Ｒ１は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、フェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノフェニル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルキル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルコキシ基を示し、Ｒ２は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、フェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノフェニル基、ベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノベンジル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルキル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルコキシ基を示す。）
で表される化合物を有効成分として含む、ＴＧＦ−β関連疾患の治療及び／又は予防剤が提供される。
好ましくは、ＴＧＦ−β関連疾患は肝線維化／肝硬変、肝炎、肝再生不全、動脈硬化、肺線維症、皮膚線維症、腎不全、又は子宮筋腫である。
好ましくは、Ｒ１は、ヒドロキシメチル基であり、Ｒ２は、パラ−メトキシフェニル基である。特に好ましくは、本発明で用いる化合物は下記式（２）で表される化合物である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路を示す。
Ａ：ＴＧＦ−βの合成・分泌を高める因子、要因
ＴＧＦ−β、ビタミンＡ、抗エストロゲン、ブレオマイシン、
デキサメサゾン、ウイルス感染、リンパ球活性化、骨折、肝線維化、
心筋梗塞、肝障害
Ｂ：細胞外基質からＴＧＦ−βを放出させる因子
エラスターゼ、チマーゼ、プラスミン、トロンビン
Ｃ：ＴＧＦ−βの活性化を起こす因子
酸、アルカリ、熱、変性剤、活性酸素種（ＲＯＳ）、
エンドグリコシダーゼ、トロンボスポンジン、セリンプロテアーゼ、
インテグリン、マトリックスメタロプロテアーゼ
Ｄ：細胞にＴＧＦ−β活性化を起こす因子、要因
混合培養、ビタミンＡ、ビタミンＤ、抗エストロゲン、ブレオマイシン、
デキサメサゾン、リポ多糖、ＩｇＧ、インターフェロン、癌化
Ｅ：ＴＧＦ−β受容体の発現を高める因子、要因
ビタミンＡ、肝線維化
Ｆ：ＴＧＦ−β受容体の発現を減らす因子、要因
癌化、細胞外マトリックス
図２は、プロテアーゼインヒビターを用いたＴＧＦ−β活性化阻害による肝臓の病態形成の抑制を示す。
図３は、サイトキサゾンの構造を示す。Ｒ１はヒドロキシメチル基を示し、Ｒ２はｐ−メトキシフェニル基を示す。
図４は、サイトキサゾンによるＴＧＦ−β活性抑制を介する肝星細胞の活性化抑制を示す。Ａ）形態変化、Ｂ）標的遺伝子発現の抑制、Ｃ）ＴＧＦ−β依存転写活性の抑制
図５は、サイトキサゾン処理によるＳｍａｄ２量およびリン酸化Ｓｍａｄ２量の減少を示す。
図６は、サイトキサゾン処理によるＳｍａｄ−標的遺伝子複合体量の減少を示す。
図７は、肝星細胞とミンク肺上皮細胞におけるサイトキサゾン処理によるＴＧＦ−β依存性転写活性化活性の抑制を示す。
図８は、サイトキサゾン処理によるＴＧＦ−β受容体の下流のシグナル伝達の抑制を示す。
図９は、サイトキサゾン処理によるＳｍａｄ活性の抑制を示す。
図１０は、サイトキサゾン処理によるＳｍａｄのｍＲＮＡ発現及び蛋白質量に対する影響を示す。
図１１は、サイトキサゾン処理によるＳｍａｄ蛋白質の核局在に対する影響を示す。
図１２は、サイトキサゾン処理によるプロコラーゲン遺伝子プロモーターの転写活性化活性の抑制を示す。
図１３は、マウスにおけるサイトキサゾンによる肝再生の回復を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）−βは、硬化性疾患の病態形成を担ったり、免疫担当細胞の働きを抑制する一方、プロテアーゼの過剰産生を抑制することによって肺組織が分解され肺気腫に陥るのを防いだりしたり癌細胞の増殖を抑制するなど、多彩な生物活性を示す分子量２５ｋＤのホモダイマー多機能性サイトカインである。ＴＧＦ−βは受容体に結合できない分子量約３００ｋＤの不活性な潜在型として産生され、標的細胞表面やその周囲において活性化されて受容体に結合できる活性型となり、その作用を発揮する（図１）。
標的細胞におけるＴＧＦ−βの作用はＳｍａｄという情報伝達を担う一連のタンパク質のリン酸化経路によって伝達される。まず、活性型ＴＧＦ−βが標的細胞表面に存在するＩＩ型ＴＧＦ−β受容体に結合すると、ＩＩ型受容体２分子とＩ型ＴＧＦ−β受容体２分子からなる受容体複合体が形成され、ＩＩ型受容体がＩ型受容体をリン酸化する。次に、リン酸化Ｉ型受容体は、Ｓｍａｄ２もしくはＳｍａｄ３をリン酸化すると、リン酸化されたＳｍａｄ２やＳｍａｄ３はＳｍａｄ４と複合体を形成して核に移行し、標的遺伝子プロモーター領域に存在するＣＡＧＡ ｂｏｘと呼ばれる標的配列に結合し、コアクチベーターとともに標的遺伝子の転写発現を誘導する（図１）。
本発明者らは、潜在型ＴＧＦ−βが肝臓においてはプロテアーゼによる切断活性化を受け、強力な線維形成誘導能や肝細胞増殖抑制能を発揮することが原因となり肝線維化／肝硬変や肝再生不全を引き起こすことを発見し、プロテアーゼインヒビターを用いてＴＧＦ−βの活性化を阻害してやると病態形成を抑制できること（図２）を報告した（Ｏｋｕｎｏ Ｍ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００１；１２０：１７８４−１８００；Ａｋｉｔａ Ｋ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００２；１２３：３５２−３６４）。これらの発見に基づき、プロテアーゼに対する抗体を用いた治療法の開発、さらには病態・組織・アイソフォーム特異的活性化反応認識抗体の作製を報告している（特願２００２−０５７２５３号、特願２００３−３１３０１４号）。
本発明者らは続いて、ＴＧＦ−βの情報伝達抑制物質とＴＧＦ−βの活性化を抑えるプロテアーゼ阻害剤を併用することによって相乗的に病態形成抑制効果が得られることを期待して、ＴＧＦ−β情報伝達抑制物質のスクリーニングを行った。その結果、オキサゾリジノン環を有するサイトキサゾン（図３；ｃｙｔｏｘａｚｏｎｅ：ＣＸＺと略）を見出だした。Ｒ１は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、フェニル基、オルトー、メターまたはパラーメトキシフェニル基、オルトー、メターまたはパラーヒドロキシフェニル基、オルトー、メターまたはパラーニトロフェニル基、オルトー、メターまたはパラーアミノフェニル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖上アルキル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルコキシ基を示し、Ｒ２は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、フェニル基、オルトー、メターまたはパラーメトキシフェニル基、オルトー、メターまたはパラーヒドロキシフェニル基、オルトー、メターまたはパラーニトロフェニル基、オルトー、メターまたはパラーアミノフェニル基、ベンジル基、オルトー、メターまたはパラーメトキシベンジル基、オルトー、メターまたはパラーヒドロキシベンジル基、オルトー、メターまたはパラーニトロベンジル基、オルトー、メターまたはパラーアミノベンジル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルキル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルコキシ基を示す。
サイトキサゾンは、ストレプトマイセス属が産生分泌する抗生物質で、免疫担当Ｔｈ２細胞からのサイトカインＩＬ４並びにＩＬ１０の産生を抑制することが知られている（Ｋａｋｅｙａ Ｈ他、Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏ １９９８；５１：１１２６−１１２８；Ｋａｋｅｙａ Ｈ他、Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ １９９９；６４：１０５２−１０５３）。サイトキサゾン又はその誘導体の発見、精製については特開平１１−２０９３５５号公報に記載されており、その有機合成は特開２０００−８６６３９号公報、及びＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ １９９９；４０：４２０３−４２０６に記載されている。上記の通り、本発明で用いる式（１）で表される化合物は公知化合物であり、上記文献の記載に準じて入手又は合成することができる。
本発明は、本明細書に定義する式（１）で表される化合物を有効成分として含む、ＴＧＦ−β情報伝達経路阻害剤、並びにＴＧＦ−β関連疾患の治療及び／又は予防剤に関するものである。以下、これらを総称して本発明の薬剤と称する場合がある。
本発明の薬剤としては、式（１）で表される化合物をそのまま単独で用いてもよいが、通常は薬学的に許容される製剤添加物を用いて医薬組成物の形態で供給することが好ましい。本発明の薬剤は経口的又は非経口的に投与することができる。本明細書で言う薬学的に許容される製剤添加物としては、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。
経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などを挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤などを挙げることができるが、本発明の薬剤の形態はこれらに限定されることはない。
非経口投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射などの種々の投与形態を例示することができる。注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、バクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合または照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することも可能である。
本発明の薬剤はヒトを含む哺乳動物に投与することができる。本発明の薬剤の投与量は患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、一般的には、成人一日あたり０．００１ｍｇ／ｋｇから１０００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲であり、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲であり、特に好ましくは１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ程度の範囲であり、例えば、２０ｍｇ／ｋｇである。上記投与量の薬剤は、毎日投与してもよいしあるいは数日間隔で投与してもよく、例えば１〜４日毎に投与される。
本発明の薬剤は、ＴＧＦ−β情報伝達経路阻害剤として使用することができ、例えば、ＴＧＦ−β関連疾患の治療及び／又は予防剤として使用することができる。ＴＧＦ−β関連疾患としては、病態形成因子がＴＧＦ−βである疾患（例えば、病態形成因子がＴＧＦ−βである肝疾患など）を挙げることができる。ＴＧＦ−β関連疾患の具体例としては、肝線維化／肝硬変、肝炎、肝再生不全、動脈硬化、肺線維症、皮膚線維症、腎不全、又は子宮筋腫などを挙げることができる。また、ＴＧＦ−β関連疾患の治療及び／又は予防剤とは、該疾患の発症及び／または進行を抑制又は阻止することを含む広い意味で解釈される。
本発明の薬剤のＴＧＦ−β関連疾患の症状に対する治療効果については、常法に従って疾患モデル動物に投与することにより試験、検討することができる。例えば、肝炎（例えば、ウイルス性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型など）など）、肝硬変あるいは薬物肝障害などの肝疾患ついても、既報のモデル動物を用いることができる（例えば、「疾患別モデル動物の作製と新薬開発のための試験・実験法」、ｐ．１１９−１２９及びｐ．３４９−３５８、１９９３、技術情報協会などを参照）。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【実施例】
［実施例１］：ＣＸＺによる肝星細胞の活性化抑制
既報の方法に従って（Ｏｋｕｎｏ Ｍ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００１；１２０：１７８４−１８００）、雄のウィスターラット（体重３５０〜４００ｇ；Ｊａｐａｎ Ｃｌｅａ）の肝臓から肝星細胞を単離し、１０ｃｍ培養プラスティックディッシュ１枚あたりに３．５×１０６個の細胞をまき、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で一晩培養した。翌日より下記構造を有する化合物（以下、ＣＸＺと略記する）を含む無血清培地に交換し、さらに６日間培養し、プラスティックディッシュ上で培養することによって誘起される肝星細胞の活性化に及ぼす薬剤の影響を顕微鏡下で観察した。
図４Ａに示すように、ＣＸＺは星細胞の活性化（ビタミンＡを含む油滴の消失を伴う形態変化）を抑制した。その効果は容量依存的であり、最適値は終濃度１５０μｇ／ｍｌであった。
次に、星細胞の活性化に伴い発現が誘導されることが知られている幾つかの遺伝子［ＴＧＦ−β１，Ｉ型プロコラゲンα２、α平滑筋アクチン］について、その発現量の変化を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法により検討した。内部標準としてはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子量の変化を測定した。顕微鏡下での観察を終了した細胞からＱＩＡＧＥＮ社のＲＮＥＡＳＹ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてＲＮＡを抽出・精製し、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、その使用説明書に従って、ＲＮＡ（１μｇ）をｃＤＮＡに逆転写し、このｃＤＮＡを鋳型として以下のセンスおよびアンチセンスプライマーを用いて各ｃＤＮＡフラグメントをＰＣＲで増幅したのちに２％アガロースゲルに流してエチジウムブロマイドで染色し、相対量をＵＶ光下で比較・観察した。
ラットＴＧＦ−β１
ラットＩ型プロコラゲンα２
ラットα平滑筋アクチン
ラットグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）
図４Ｂに示すように、コントロールの細胞（溶媒である０．５％ ＤＭＳＯ処理）に比べてＣＸＺ処理細胞（ＣＸＺ）では、ＴＧＦ−β１、Ｉ型プロコラゲンα２（ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ）、α平滑筋アクチン（αＳＭＡ）遺伝子量が減少していた。このとき、内部標準のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子量には変化がみられなかった。
肝星細胞の活性化は星細胞自身が産生するＴＧＦ−βに依存していることから、ＣＸＺによる星細胞活性化抑制効果がＴＧＦ−βの活性抑制に因るものであるか否かを、ＴＧＦ−βの活性測定に最も一般的に用いられているミンク肺上皮（ＭＬＥ）細胞並びにラット肝星細胞を用いたリポーターアッセイにより検討した。
３．５ｃｍ培養プラスティックディッシュ１枚あたりに１．０×１０５個のＭＬＥ細胞をまき、１０％ ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で一晩培養した後に、ＴＧＦ−βの代表的な標的遺伝子であるｐＰＡＩ−１のプロモーターにルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）リポーターを融合させたｐＰＡＩ−１−ＬｕｃをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてディッシュ１枚あたり５００ｎｇトランスフェクションした。トランスフェクション２時間後の培地を１ｎｇ／ｍｌヒト組み換えＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ社製）や１５０μｇ／ｍｌ ＣＸＺ、並びにこれらの組み合わせを含む無血清培地に交換し、２日間前培養した後に細胞抽出液を作製し、抽出液中のルシフェラーゼ活性をＰｒｏｍｅｇａ社のＤｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いてルミノメーター（Ｐａｃｋａｒｄ社製）により測定した。トランスフェクションの効率を補正するためにウミシイタケルシフェラーゼを同時にトランスフェクションし、測定結果はウミシイタケルシフェラーゼの値と抽出液のタンパク量で補正したのちにＴＧＦ−β１のみの値を１００％とした相対値で表した（図４Ｃ、レーン１〜３）。タンパク量はＰＩＥＲＣＥ社のＢＣＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いてウシ血清アルブミンをスタンダードとして決定した。星細胞はラット肝臓から単離後３．５ｃｍプラスティックディッシュ１枚あたり４．０×１０５個の細胞をまき、一晩１０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭで培養した翌曰からＣＸＺを含む無血清培地に交換し、さらに４日間培養した後にＭＬＥ細胞と同様にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ試薬を用いてディッシュ１枚あたり５００ｎｇのｐＰＡＩ−１−Ｌｕｃをトランスフェクションし、ＣＸＺを含む無血清培地でさらに２日間培養した細胞から抽出液を調製し、抽出液中のルシフェラーゼ活性を測定した。結果はウミシイタケルシフェラーゼの値と抽出液のタンパク量で補正したのちにＣＸＺ無処理細胞（内在性ＴＧＦ−βの刺激を受けている）の値を１００％とした相対値で表した（図４Ｃ、レーン４と５）。
図４Ｃに示すようにＣＸＺはＴＧＦ−βにより誘導されるＬｕｃ活性の顕著な抑制を示した（レーン２ｖｓレーン３（ＭＬＥ細胞）；レーン４ｖｓレーン５（星細胞））。この結果は、ＣＸＺがＴＧＦ−βの活性を抑制することを示しており、ＣＸＺがＴＧＦ−βの情報伝達経路を阻害する活性を有していることが強く示唆された。
［実施例２］：ＣＸＺによるＴＧＦ−βの情報伝達経路阻害
実施例１に記載したように、ＴＧＦ−βの作用は、受容体によるＳｍａｄのリン酸化、リン酸化Ｓｍａｄ複合体の核への移行、リン酸化Ｓｍａｄ複合体の標的遺伝子プロモーターへの結合による転写の促進という経路で伝達される。そこで、ＣＸＺがＴＧＦ−βの情報伝達経路を阻害しているかどうかについて、Ｓｍａｄ２総量、リン酸化Ｓｍａｄ２量、並びにリン酸化Ｓｍａｄ複合体の標的遺伝子プロモーターへの結合量を、ウェスタンブロット解析、並びにゲルシフトアッセイの測定結果から検討した。
まず、ウェスタンブロット解析によるＳｍａｄ２総量とリン酸化Ｓｍａｄ２量の測定結果を説明する。図４Ａの実験のごとく単離、培養し、終濃度１００μｇ／ｍｌ、並びに２００μｇ／ｍｌのサイトキサゾンで処理したラット肝星細胞より１ｘＳＤＳサンプルバッファーを用いて細胞抽出液を作製し、１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけたのちにＰＶＤＦ（ポリビニデンジフルオリド）膜に電気泳動転写した。膜上のタンパク質のウェスタンブロット解析は、Ｓｍａｄ２認識マウスモノクロナル抗体（終濃度１μｇ／ｍｌ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、並びにリン酸化Ｓｍａｄ２認識ウサギポリクロナル抗体（終濃度２μｇ／ｍｌ；Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）とホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスもしくはウサギＩｇＧ抗体（最終１：７５０希釈）の組み合わせを用いて、既報の方法に従って行った（Ｏｋｕｎｏ Ｍ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００１；１２０：１７８４−１８００）。バンドはＡｍｅｒｓｈａｍ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）ＥＣＬ ｓｙｓｔｅｍで検出した。
その結果、図５に示すように、コントロールの細胞（溶媒である０．５％ ＤＭＳＯ処理した細胞：レーン１）に比べて、ＣＸＺ処理細胞（レーン２と３）では、ＣＸＺの濃度に依存してＳｍａｄ２総量とリン酸化Ｓｍａｄ２量が減少していた。このとき、内部標準のＧＡＰＤＨ量は変化していなかった。
次に、ゲルシフトアッセイによるリン酸化Ｓｍａｄ複合体の標的遺伝子プロモーターへの結合量の測定結果を説明する。図４Ａの実験のごとく単離、培養、薬剤処理したラット肝星細胞より既述の方法（Ｓｈｉｍａｄａ Ｊ他、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２００２；１５：１６７７−１６９２）に従って核抽出液を作製し、放射標識したＣＡＧＡボックス配列（ＰＡＩ−１プロモーター中に存在するリン酸化Ｓｍａｄ複合体の結合配列）含有オリゴヌレクオチドと氷上にてインキュベーションしたのちに、４％ポリアクリルアミドゲルにてリン酸化Ｓｍａｄ−ＣＡＧＡボックス複合体とフリーのＣＡＧＡボックスとを分離したのちに、オートラジオグラフィーによってリン酸化Ｓｍａｄ−ＣＡＧＡボックス複合体量を測定した。
その結果、図６に示すようにコントロールの細胞（溶媒である０．５％ ＤＭＳＯ処理した細胞：レーン２）に比べてＣＸＺ処理細胞（レーン３）では、リン酸化Ｓｍａｄ−ＣＡＧＡボックス複合体量が減少していた。レーン１は未標識ＣＡＧＡボックス配列含有オリゴヌレクオチドをコントロールの細胞由来の核抽出液に加えた時の結果であり、得られたバンドが特異的バンドであることを示している。
さらに、ＲＴ−ＰＣＲ法によってＴＧＦ−β受容体量の変化を測定したところ、ＣＸＺ処理した細胞ではＴＧＦ−β受容体量は変化していないことがわかった。また、ＣＸＺは潜在型ＴＧＦ−βの活性化反応にも影響を与えなかった。
以上の結果より、ＣＸＺはＳｍａｄ２のリン酸化を抑制することによってＴＧＦ−βの情報伝達経路を抑制することがわかった。
［実施例３］：肝星細胞とミンク肺上皮細胞におけるＣＸＺによるＴＧＦ−β依存性転写活性化活性の抑制
単離の２４時間後に、３５ｍｍ皿で培養した肝星細胞を１５０μｇ／ｍｌのＣＸＺの存在下又は非存在下で３日間処理し、ｐＲＬ−ＣＭＶ（Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ，５０ｎｇ／ｄｉｓｈ）と一緒に、ＰＡＩ−１プロモーター−ルシフェラーゼ発現ベクターであるｐＰＡＩ−１−Ｌｕｃ（５００ｎｇ／ｄｉｓｈ）又は９コピーのＣＡＧＡ配列を含むベクターである９ＣＡＧＡ−Ｌｕｃ（５００ｎｇ／ｄｉｓｈ）の何れかをトランスフェクションした（図７の左のグラフ）。トランスフェクションした細胞を同一条件下でさらに２４時間処理を続けた。３５ｍｍ皿上に２×１０５のミンク肺上皮細胞（ＭＥＬＣ）をプレーティングした２４時間後に、細胞を１５０μｇ／ｍｌのＣＸＺの存在下又は非存在下で３日間処理し、９ＣＡＧＡ−Ｌｕｃ（５００ｎｇ／ｄｉｓｈ）とｐＲＬ−ＣＭＶ（５０ｎｇ／ｄｉｓｈ）の組み合わせでトランスフェクションした（図７の右のグラフ）。トランスフェクションの翌日、細胞を１５０μｇ／ｍｌのＣＸＺの存在下又は非存在下で、５ｎｇ／ｍｌの組み換えヒトＴＧＦ−β１で１６時間処理した。両方の細胞から細胞ライセートを調製し、各ライセートにおけるルシフェラーゼ活性を測定し、ホタルルシフェラーゼ活性の変化を計算して、ＣＸＺ未処理の対照細胞のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性に標準化した後、プロットした。
結果を図７に示す。図７の結果から分かるように、ＴＧＦ−βのシグナル伝達・転写因子であるＳｍａｄ２／Ｓｍａｄ４複合体もしくはＳｍａｄ３／Ｓｍａｄ４複合体が結合する標的モチーフであるＣＡＧＡボックス９個で駆動されるルシフェラーゼリポーター遺伝子を用いて、ＣＸＺにより、ＴＧＦ−β依存性転写活性化活性が抑制されることが実証された。
［実施例４］：ＴＧＦ−β受容体の下流のシグナル伝達の抑制
３５ｍｍ皿上に２×１０５のミンク肺上皮細胞（ＭＥＬＣ）をプレーティングした２４時間後に、細胞を１５０μｇ／ｍｌのＣＸＺの存在下又は非存在下で３日間処理し、ｐＰＡＩ−１−Ｌｕｃ（５００ｎｇ／ｄｉｓｈ）とｐＲＬ−ＣＭＶ（５０ｎｇ／ｄｉｓｈ）の組み合わせ、及び活性型ＴＧＦ−β受容体Ｉを構成的に発現するベクターでトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を同一条件下でさらに２４時間±ＣＸＺ処理を続けた。以下、実施例３と同様にルシフェラーゼ活性を測定した。
結果を図８に示す。ＴＧＦ−β受容体が存在する条件下でサイトキサゾンの効果を比較した図８の結果から、ＴＧＦ−β受容体の下流のシグナル伝達にサイトキサゾンが効果を発揮することが実証された。
［実施例５］：Ｓｍａｄ活性の抑制
単離の２４時間後に、３５ｍｍ皿の肝星細胞を１５０μｇ／ｍｌのＣＸＺの存在下又は非存在下で３日間処理し、９ＣＡＧＡ−Ｌｕｃ（５００ｎｇ／ｄｉｓｈ）とｐＲＬ−ＣＭＶ（５０ｎｇ／ｄｉｓｈ）の組み合わせ、及びＳｍａｄｓ２，３，及び４（２００ｎｇずつ／ｄｉｓｈ）の幾つかの組み合わせをトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を同一条件下でさらに２４時間処理を続けた。細胞ライセートを調製し、各ライセートにおけるルシフェラーゼ活性を測定し、ホタルルシフェラーゼ活性の変化を計算して、ＣＸＺ未処理の対照細胞のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性に標準化した後、プロットした。
結果を図９に示す。ＴＧＦ−βのシグナル伝達は、受容体が活性化（リン酸化）されると、細胞質に存在するＳｍａｄ２もしくはＳｍａｄ３がリン酸化されＳｍａｄ４と複合体を形成し、リン酸化Ｓｍａｄ２／Ｓｍａｄ４複合体もしくはリン酸化Ｓｍａｄ３／Ｓｍａｄ４複合体が核へ移行して標的配列ＣＡＧＡボックスに結合し、他の転写因子や転写仲介因子と一緒になって基本転写因子を活性化し、標的遺伝子の転写を引き起こすという機構である（図１）。図９の結果は、Ｓｍａｄ２，Ｓｍａｄ３，Ｓｍａｄ４を強制的に発現した肝星細胞におけるＣＸＺの影響を示すものである。ＣＸＺは実施例６に示すようにＳｍａｄ３の発現を抑制するが、これは、Ｓｍａｄ３の強制発現でレスキューされる。これに対して、Ｓｍａｄ２の発現は変わらないが、強制発現したＳｍａｄ２の活性がＳｍａｄ２／Ｓｍａｄ４＋Ｓｍａｄ３／Ｓｍａｄ４、並びにＳｍａｄ２／Ｓｍａｄ４の細胞において抑制を受けていることから、ＣＸＺはＳｍａｄ２の活性（含Ｓｍａｄ２のリン酸化）を抑制していることが示された。
［実施例６］：ＳｍａｄのｍＲＮＡ発現及び蛋白質量に対する影響
初代肝星細胞を１５０μｇ／ｍｌのＣＸＺの存在下又は非存在下で４日間処理した後、細胞ライセートを調製し、ｍＲＮＡを単離し、図示したＳｍａｄのｍＲＮＡ量の変化をＲＴ−ＰＣＲにより評価した（図１０の左図）。
ラットＳｍａｄ２
ラットＳｍａｄ３
ラットＳｍａｄ４
ラットＳｍａｄ７
ＨＳＣ−Ｔ６細胞を１５０μｇ／ｍｌのＣＸＺの存在下又は非存在下で４日間処理した後、細胞ライセートを調製し、Ｓｍａｄ２及び／又は３の総蛋白質量及びリン酸化蛋白質量の変化を、抗Ｓｍａｄ２／３抗体及び抗ホスホＳｍａｄ２／３抗体を用いたウエスタンブロッティングにより評価した（図１０の右図）。
図１０に示す通り、ｍＲＮＡレベルではＳｍａｄ３において有意差が見られ、蛋白質ではＳｍａｄ２／３の複合タンパク質で差が見られた。
［実施例７］：Ｓｍａｄ蛋白質の核局在に対する影響
初代肝星細胞を１５０μｇ／ｍｌのＣＸＺの存在下又は非存在下で４日間処理した後、細胞を固定化し、抗Ｓｍａｄ２／３抗体で染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。結果を図１１に示す。Ｓｍａｄ２／３は、ＣＸＺ非処理細胞（コントロール）ではより核に集まっているのに対して、ＣＸＺ処理細胞は細胞全体に広がっていることが観察された。
［実施例８］：プロコラーゲン遺伝子プロモーターの転写活性化活性の抑制
初代肝星細胞を１５０μｇ／ｍｌのＣＸＺの存在下又は非存在下で３日間処理し、ｐＣｏｌｌａｇｅｎ−Ｌｕｃ（５００ｎｇ／ｄｉｓｈ）及びｐＲＬ−ＣＭＶ（５０ｎｇ／ｄｉｓｈ）の組み合わせをトランスフェクションし、同一条件下でさらに２４時間処理を続けた。細胞ライセートを調製し、各ライセートにおけるルシフェラーゼ活性を測定し、ホタルルシフェラーゼ活性の変化を計算して、ＣＸＺ未処理の対照細胞のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性に標準化した後、プロットした。
結果を図１２に示す。図１２の結果から、ＣＸＺはプロコラーゲン遺伝子プロモーターの転写活性化活性を抑制することが示された。
［実施例９］：マウスにおけるサイトキサゾンによる肝再生の回復
ＬＰＳで前処理し、部分的に肝切除したマウスを、ＣＸＺ（１５ｍｇ／ｋｇ体重／日；ｉ．ｐ．）で処理した（対照では処理しない）。部分肝切除の開始後４８時間後に肝臓を単離し、その切片を調製し、抗ＰＣＮＡ抗体で染色し、光学顕微鏡で観察した。結果を図１３に示す。図１３において茶褐色に染まっている核が再生をした細胞核で、この核の数を測定した結果であるＰＣＮＡ標識指数は、対照では２８．５±３．７４であるのに対し、ＣＸＺ投与例では８０．８±３．８９であった。サイトキサゾンにより肝再生が回復することが示された。
（実施例のまとめ）
上記の通り、ＣＸＺはＴＧＦ−βの情報伝達を担うリン酸化Ｓｍａｄを減少させることによってＴＧＦ−β情報伝達経路を遮断し、ＴＧＦ−βの作用を阻害する作用を有しており、ＴＧＦ−βが関連する疾患、例えば肝硬変の原因である肝星細胞の活性化を有意に抑制したり、肝再生不全の原因である肝細胞の増殖抑制を回復する作用を有していることが判明した。ＣＸＺ又はその誘導体を用いることによって、従来の技術では困難であったＴＧＦ−βの情報伝達経路遮断に基づく各種硬化性疾患を始めとするＴＧＦ−β関連疾患の予防薬・治療薬の開発が可能であると期待できる。
【産業上の利用可能性】
本発明では、サイトキサゾンがＴＧＦ−β依存の肝星細胞の活性化を抑制するという知見に基づいて、サイトキサゾン又はその誘導体の新しい生物活性としてＴＧＦ−β情報伝達経路阻害を見出した。本発明によるサイトキサゾン又はその誘導体を有効成分として含むＴＧＦ−β情報伝達経路阻害剤を用いることにより、ＴＧＦ−β関連疾患の治療法・予防法を確立することが可能になる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）：
（式中Ｒ１は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、フェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノフェニル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルキル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルコキシ基を示し、Ｒ２は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、フェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノフェニル基、ベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノベンジル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルキル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルコキシ基を示す。）
で表される化合物を有効成分として含む、ＴＧＦ−β情報伝達経路阻害剤。
【請求項２】
Ｓｍａｄ２のリン酸化を抑制することによりＴＧＦ−β情報伝達経路を阻害する、請求項１に記載のＴＧＦ−β情報伝達経路阻害剤。
【請求項３】
下記式（１）：
（式中Ｒ１は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、フェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノフェニル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルキル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルコキシ基を示し、Ｒ２は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、フェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノフェニル基、ベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノベンジル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルキル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルコキシ基を示す。）
で表される化合物を有効成分として含む、ＴＧＦ−β関連疾患の治療及び／又は予防剤。
【請求項４】
ＴＧＦ−β関連疾患が肝線維化／肝硬変、肝炎、肝再生不全、動脈硬化、肺線維症、皮膚線維症、腎不全、又は子宮筋腫である、請求項３に記載の薬剤。
【請求項５】
Ｒ１が、ヒドロキシメチル基であり、Ｒ２が、パラ−メトキシフェニル基である、請求項１から４の何れかに記載の薬剤。
【請求項６】
式（１）で表される化合物が下記式（２）で表される化合物である、請求項１から５の何れかに記載の薬剤。
【請求項１】
下記式（１）：
（式中Ｒ１は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、フェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノフェニル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルキル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルコキシ基を示し、Ｒ２は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、フェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノフェニル基、ベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノベンジル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルキル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルコキシ基を示す。）
で表される化合物を有効成分として含む、ＴＧＦ−β情報伝達経路阻害剤。
【請求項２】
Ｓｍａｄ２のリン酸化を抑制することによりＴＧＦ−β情報伝達経路を阻害する、請求項１に記載のＴＧＦ−β情報伝達経路阻害剤。
【請求項３】
下記式（１）：
（式中Ｒ１は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、フェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノフェニル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルキル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルコキシ基を示し、Ｒ２は、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、フェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロフェニル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノフェニル基、ベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−メトキシベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−ヒドロキシベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−ニトロベンジル基、オルト−、メタ−またはパラ−アミノベンジル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルキル基、炭素数１〜２０の直鎖状または分岐鎖状アルコキシ基を示す。）
で表される化合物を有効成分として含む、ＴＧＦ−β関連疾患の治療及び／又は予防剤。
【請求項４】
ＴＧＦ−β関連疾患が肝線維化／肝硬変、肝炎、肝再生不全、動脈硬化、肺線維症、皮膚線維症、腎不全、又は子宮筋腫である、請求項３に記載の薬剤。
【請求項５】
Ｒ１が、ヒドロキシメチル基であり、Ｒ２が、パラ−メトキシフェニル基である、請求項１から４の何れかに記載の薬剤。
【請求項６】
式（１）で表される化合物が下記式（２）で表される化合物である、請求項１から５の何れかに記載の薬剤。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３９５７０
【国際公開日】平成１７年５月６日（２００５．５．６）
【発行日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１５０６５（Ｐ２００５−５１５０６５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１６３７０
【国際出願日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年５月６日（２００５．５．６）
【発行日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１６３７０
【国際出願日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
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