ＴＬＲ９の合成アゴニスト
本発明は、ＴＬＲ９のアゴニストとしての相互作用を通して、特異な免疫反応プロファイルを個別に提供する、新規なオリゴヌクレオチドベースの化合物を提供する。本発明によるＴＬＲ９アゴニストは、特異的でユニークな化学修飾を特徴とし、これによりその特徴的な免疫反応活性化プロファイルが提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、出願日２００６年１２月１２日の米国仮出願番号第60/869,604号の利益を主張し、その内容全体を本明細書に参照として組み入れる。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、トール様受容体（ＴＬＲ）媒介性免疫反応の調整に有用な合成化学組成物に関する。特に、本発明は、ユニークなサイトカインおよびケモカインプロファイルを生成する、トール様受容体９（ＴＬＲ９）のアゴニストに関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の概要
トール様受容体（ＴＬＲ）は免疫系の多くの細胞に存在し、先天性免疫反応に関連することが示されている（Hornung, V. et al., (2002) J. Immunol. 168:4531-4537）。脊椎動物において、このファミリーはＴＬＲ１〜ＴＬＲ１１と呼ばれる１１種のタンパク質からなり、それらは、細菌、真菌、寄生虫、およびウイルスからの病原体関連分子パターンを認識することが知られている（Poltorak, a. et al. (1998) Science 282:2085-2088；Underhill, D.M., et al. (1999) Nature 401:811-815；Hayashi, F. et. al (2001) Nature 410:1099-1103；Zhang, D. et al. (2004) Science 303:1522-1526；Meier, A. et al. (2003) Cell. Microbiol. 5:561-570；Campos, M.A. et al. (2001) J. Immunol. 167: 416-423；Hoebe, K. et al. (2003) Nature 424: 743-748；Lund, J. (2003) J. Exp. Med. 198:513-520；Heil, F. et al. (2004) Science 303:1526-1529；Diebold, S.S., et al. (2004) Science 303:1529-1531；Hornung, V. et al. (2004) J. Immunol. 173:5935-5943）。
【０００４】
ＴＬＲは、哺乳類が異質分子を認識しそれに対する免疫反応を開始する鍵となる手段であり、また先天性免疫反応と適応的免疫反応を結びつける手段も提供する（Akira, S. et al. (2001) Nature Immunol. 2:675-680；Medzhitov, R. (2001) Nature Rev. Immunol. 1:135-145）。いくつかのＴＬＲは細胞表面に存在し、細胞外の病原体を検出してこれに対する反応を開始し、他のＴＬＲは細胞内に存在し、細胞内の病原体を検出してこれに対する反応を開始する。
【０００５】
ＴＬＲは、細菌ＤＮＡおよび合成オリゴヌクレオチド内の非メチル化ＣｐＧモチーフを認識することが知られている（Hemmi, H. et al. (2000) Nature 408:740-745）。ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの他の修飾も、ＴＬＲ９を介した免疫反応のモジュレーターとして作用するそれらの能力に、影響を及ぼし得る（例えば、Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182；Zhao et al. (1996) Biochem Pharmacol. 52:1537-1544；Zhao et al. (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:495-502；Zhao et al (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:3453-3458；Zhao et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:1051-1054；Yu, D. et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:2585-2588；Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2263-2267；およびKandimalla, E. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813を参照のこと）。天然に存在するＴＬＲ９のアゴニストは、抗腫瘍活性（例えば腫瘍増殖および血管形成）を産生し、効果的な抗癌反応（例えば抗白血病）をもたらすことが示されている（Smith, J.B. and Wickstrom, E. (1998) J. Natl. Cancer Inst. 90:1146-1154）。さらに、ＴＬＲ９アゴニストは、他の既知の抗腫瘍化合物（例えばセツキシマブ、イリノテカン）と相乗的に作用することが示されている（Vincenzo, D., et al. (2006) Clin. Cancer Res. 1(2):577-583）。
【０００６】
あるＴＬＲ９アゴニストは、コアＣｐＲジヌクレオチドを含有する３’−３’結合ＤＮＡ構造から構成され、ここでＲは修飾グアノシン（米国特許出願第10/279,684号）である。さらに、特定の化学修飾が、免疫反応の特異な調整をもたらす特定のオリゴヌクレオチド類似体（analogue）の調製を可能とする。特に、構造活性関連研究により、免疫反応の特異的調整を誘発する合成モチーフおよび新規なＤＮＡベースの化合物の同定が可能となり、これらの調整は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドにより引き起こされるものとは異なる。(Kandimalla, E. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102:6925-6930. Kandimalla, E. et al. (2003) Proc. Nat. Acad. Sci. U S A 100:14303-14308；Cong, Y. et al. (2003) Biochem Biophys Res. Commun.310:1133-1139；Kandimalla, E. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 306:948-953；Kandimalla, E. et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2393-2400；Yu, D. et al. (2003) Bioorg. Med. Chem.11:459-464；Bhagat, L. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun.300:853-861；Yu, D. et al. (2002) Nucleic Acids Res.30:4460-4469；Yu, D. et al. (2002) J. Med. Chem.45:4540-4548. Yu, D. et al. (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun.297:83-90；Kandimalla. E. et al. (2002) Bioconjug. Chem.13:966-974；Yu, D. et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:1613-1619；Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:2803-2808；Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2263-2267；Kandimalla, E. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813；Yu, D. et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:2585-2588；Putta, M. et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34:3231-3238)。
【０００７】
本発明者らは、驚くべきことに、コアＣｐＲジヌクレオチドに隣接する配列へのユニークな修飾が、in vitroおよびin vivoで特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを生成する、新規なＴＬＲ９アゴニストを産生することを発見した。ＣｐＲ含有オリゴヌクレオチドに対するサイトカインおよびケモカイン反応を「カスタム調整」するこの能力は、種々の疾病状態を、疾病特異的かつさらに患者特異的な様式で、予防および／または処置する能力の提供を約束する。したがって、かかるカスタム調整された反応を提供する、新規なオリゴヌクレオチド類似体化合物に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００８】
発明の概要
本発明は、ＴＬＲ９のアゴニストとしての相互作用を通して、特異な免疫反応プロファイルを個別に提供する、新規なオリゴヌクレオチドベースの化合物を提供する。本発明によるＴＬＲ９アゴニストは、特異的でユニークな化学修飾を特徴とし、これによりその特徴的な免疫反応活性化プロファイルが提供される。
本発明によるＴＬＲ９アゴニストは、種々の細胞型において、ならびに種々のin vitroおよびin vivo実験モデルにおいて免疫反応を誘発し、各アゴニストは特異な免疫反応プロファイルを提供する。そのためこれらは、免疫系の研究のため、またヒトおよびマウスなどの種々の動物種の免疫系を比較するためのツールとして有用である。本発明によるＴＬＲ９アゴニストはまた、種々の疾病の予防および／または処置において、それのみで、他の薬剤と組み合わせて、またはワクチンとして用いる抗体用のアジュバントとして、有用である。
したがって、第１の側面において、本発明は、オリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９のアゴニストを提供する。
第２の側面において、本発明は、本発明によるオリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９アゴニスト（「化合物」）および生理学的に許容し得る担体を含む、組成物を提供する。
【０００９】
第３の側面において、本発明はワクチンを提供する。この側面によるワクチンは、本発明による組成物を含み、さらに抗体を含む。
第４の側面において、本発明は、脊椎動物においてＴＬＲ９媒介性免疫反応を引き起こすための方法を提供し、かかる方法は、脊椎動物に対し、本発明による化合物、組成物またはワクチンを投与することを含む。
第５の側面において、本発明は、疾病または疾患を有する患者を治療的に処置するための方法を提供し、かかる方法は、患者に対し、本発明による化合物、組成物またはワクチンを投与することを含む。
第６の側面において、本発明は、疾病または疾患を防ぐための方法を提供し、かかる方法は、患者に対し、本発明による化合物、組成物またはワクチンを投与することを含む。
【００１０】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、ＴＬＲ９のアゴニストとしての相互作用を通して、特異な免疫反応プロファイルを個別に提供する、新規なオリゴヌクレオチドベースの化合物を提供する。本発明によるＴＬＲ９アゴニストは、ユニークな化学修飾を特徴とし、これによりその特徴的な免疫反応活性化プロファイルが提供される。本明細書に引用された全ての刊行物は、当業者のレベルを反映しており、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。これら参考文献と本明細書との間のいかなる不一致も、後者を支持するように解決されるべきである。
本発明によるＴＬＲ９アゴニストは、種々の細胞型において、ならびに種々のin vitroおよびin vivo実験モデルにおいて免疫反応を誘発し、各アゴニストは特異な免疫反応プロファイルを提供する。そのためこれらは、免疫系の研究のため、またヒトおよびマウスなどの種々の動物種の免疫系を比較するためのツールとして有用である。本発明によるＴＬＲ９アゴニストはまた、種々の疾病の予防および／または処置において、それのみで、他の薬剤と組み合わせて、またはワクチンとして用いる抗体用のアジュバントとして、有用である。
【００１１】
本発明によるいくつかのＴＬＲ９アゴニストを、下の表Ｉに示す。この表において、オリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９アゴニストは全て、別に指示のある場合を除き、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を有する。別に指示のある場合を除き、全てのヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。しかし当業者は、ホスホジエステル（ＰＯ）結合、またはＰＳ結合とＰＯ結合の組み合わせも用いることができることを、認識する。
【００１２】
【表１】
【００１３】
【表２】
【００１４】
【表３】
【００１５】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例２の記載のようにして、ＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３細胞において免疫刺激活性について試験した。下の表ＩＩ（ａ）、ＩＩ（ｂ）、ＩＩ（ｃ）およびＩＩ（ｄ）は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、投与後２４時間においてそれらのＴＬＲ９媒介性ＮＦ−κＢ活性化プロファイルを変化させることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＮＦ−κＢ活性化を増加または減少できることを示す。
【００１６】
【表４】
【００１７】
【表５】
【００１８】
【表６】
【００１９】
【表７】
【００２０】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例３の記載のようにして、Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞ＩＬ−１２アッセイにおいて免疫刺激活性について試験した。下の表ＩＩＩ（ａ）、ＩＩＩ（ｂ）およびＩＩＩ（ｃ）に示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、投与後２４時間の脾臓細胞におけるＴＬＲ９媒介性ＩＬ−１２活性化プロファイルを変化させること、および、この活性化プロファイルは、化学修飾に依存して用量依存性となり得ることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＩＬ−１２活性化を増加または減少できることを示す。
【００２１】
【表８】
【００２２】
【表９】
【００２３】
【表１０】
【００２４】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例３の記載のようにして、Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞ＩＬ−６アッセイにおいて免疫刺激活性について試験した。下の表ＩＶ（ａ）、ＩＶ（ｂ）およびＩＶ（ｃ）に示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、投与後２４時間の脾臓細胞におけるＴＬＲ９媒介性ＩＬ−６活性化プロファイルを変化させること、および、この活性化プロファイルは、化学修飾に依存して用量依存性となり得ることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＩＬ−６活性化を増加または減少できることを示す。
【００２５】
【表１１】
【００２６】
【表１２】
【００２７】
【表１３】
【００２８】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例４の記載のようにして、ヒトＢ細胞増殖アッセイにおいて免疫刺激活性について試験した。下の表Ｖ（ａ）、Ｖ（ｂ）、Ｖ（ｃ）、Ｖ（ｄ）およびＶ（ｅ）に示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、ＴＬＲ９媒介性Ｂ細胞増殖活性を変化させること、および、この活性化プロファイルは、化学修飾に依存して用量依存性となり得ることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、Ｂ細胞増殖を調節できることを示す。
【００２９】
【表１４】
【００３０】
【表１５】
【００３１】
【表１６】
【００３２】
【表１７】
【００３３】
【表１８】
【００３４】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例３の記載のようにして、ＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２についてのヒトＰＢＭＣおよびＢ細胞アッセイにおいて、免疫刺激活性について試験した。下の表ＶＩ（ａ）、ＶＩ（ｂ）、ＶＩ（ｃ）、ＶＩ（ｄ）、ＶＩ（ｅ）、ＶＩ（ｆ）、ＶＩ（ｇ）、およびＶＩ（ｈ）に示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、ヒトＰＢＭＣにおいてそれらのＴＬＲ９媒介性ＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−６、ＩＬ−１０および／またはＩＬ−１２活性化プロファイルを変化させることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２活性化を増加または減少できることを示す。
【００３５】
【表１９】
【００３６】
【表２０】
【００３７】
【表２１】
【００３８】
【表２２】
【００３９】
【表２３】
【００４０】
【表２４】
【００４１】
【表２５】
【００４２】
【表２６】
【００４３】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例３の記載のようにして、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−βについてのヒトＰＢＭＣアッセイにおいて、免疫刺激活性について試験した。下の表ＶＩＩ（ａ）およびＶＩＩ（ｂ）に示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、ヒトＰＢＭＣにおいてそれらのＴＬＲ９媒介性ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＭＩＰ−β活性化プロファイルを変化させることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−β活性化を増加または減少できることを示す。
【００４４】
【表２７】
【００４５】
【表２８】
【００４６】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例３の記載のようにして、ＭＣＰ−１およびＩＦＮ−αについてのヒトＰＢＭＣアッセイにおいて、免疫刺激活性について試験した。下の表ＶＩＩＩ（ａ）およびＶＩＩＩ（ｂ）に示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、ヒトＰＢＭＣにおいてそれらのＴＬＲ９媒介性ＭＣＰ−１および／またはＩＦＮ−α活性化プロファイルを変化させることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＭＣＰ−１およびＩＦＮ−α活性化を増加または減少できることを示す。
【００４７】
【表２９】
【００４８】
【表３０】
【００４９】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例３の記載のようにして、ＩＦＮ−α、ＩＬ６およびＩＬ−１２についてのヒトＰＢＭＣおよびｐＤＣアッセイにおいて、免疫刺激活性について試験した。下の表ＩＸ（ａ）、ＩＸ（ｂ）、ＩＸ（ｃ）、ＩＸ（ｄ）、ＩＸ（ｅ）、ＩＸ（ｆ）およびＩＸ（ｇ）に示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、ヒトＰＢＭＣおよびｐＤＣにおいて、それらのＴＬＲ９媒介性ＩＦＮ−α活性化プロファイルを変化させることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−１２活性化を増加または減少できることを示す。
【００５０】
【表３１】
【００５１】
【表３２】
【００５２】
【表３３】
【００５３】
【表３４】
【００５４】
【表３５】
【表３６】
【００５５】
【表３７】
【００５６】
【表３８】
【００５７】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例３の記載のようにして、マウス脾臓細胞培養物中でのそれらのＩＬ−１２およびＩＬ−６の誘発について試験した。下の表Ｘ（ａ）およびＸ（ｂ）に示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、脾臓細胞においてそれらのＴＬＲ９媒介性ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２活性化プロファイルを変化させること、およびこの活性化プロファイルは、化学修飾に依存して用量依存性となり得ることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＩＬ−６およびＩＬ−１２活性化を増加または減少できることを示す。
【００５８】
【表３９】
【００５９】
【表４０】
【００６０】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例３の記載のようにして、ヒトＰＢＭＣ培養物中でのそれらのＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ４０ｐ７０の誘発について試験した。下の表ＸＩに示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、ヒトＰＢＭＣにおいてそれらのＴＬＲ９媒介性ＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ４０ｐ７０活性化プロファイルを変化させることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ４０ｐ７０活性化を増加または減少できることを示す。
【００６１】
【表４１】
【００６２】
上記したように、本発明は、第１の側面において、オリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９合成アゴニストを提供する。塩基、糖、リンケージ、またはリンカーに対する一定の化学修飾に基づき、ＴＬＲ９のアゴニストは、接触可能５’末端を保持しつつ、他のＴＬＲ９アゴニスト分子と会合し重複した場合に、増加した安定性を有することができる。
第２の側面において、本発明は、本発明によるオリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９アゴニスト（「化合物」）および生理学的に許容し得る担体を含む、組成物を提供する。用語「生理学的に許容し得る」とは、一般に、化合物の有効性を損なうことなく、細胞、細胞培養物、組織または生物などの生体システムと適合的である物質をいう。
【００６３】
本明細書において、用語「担体」は、任意の賦形剤、希釈剤、増量剤、塩、緩衝液、安定化剤、可溶化剤、オイル、脂質、脂質含有ベシクル、ミクロスフェア、リポソームカプセル剤または生理学的に許容し得る製剤において用いるための当該分野でよく知られた他の材料を包含する。担体、賦形剤または希釈剤の特性は、特定の適用に対する投与経路に依存することが理解される。これらの材料を含む、生理学的に許容し得る製剤の調製は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に記載されている。
活性化合物は、生理学的に許容し得る担体または希釈剤中に、処置される患者に重篤な毒性効果を及ぼすことなく、予防的または治療的に有効な量で患者に送達されるのに十分な量で、含有される。用語「有効量」または「十分な量」は、一般に、有益な結果などの所望の生物学的効果を及ぼすのに十分な量をいう。したがって、「有効量」または「十分な量」は、投与される状況に依存する。生理学的に許容し得る誘導体の有効な用量範囲は、送達される親化合物の重量に基づき算出することができる。誘導体それ自体が活性を示す場合は、有効用量は誘導体の重量を用いて、または当業者に既知の他の手段により、上記のようにして推定可能である。
【００６４】
第３の側面において、本発明はワクチンを提供する。この側面によるワクチンは、本発明の組成物を含み、さらに抗体を含む。抗体とは、特異的免疫反応を誘発する分子である。かかる抗体は、限定することなく、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物および複合体またはこれらの任意のものの組合せを含む。抗体は、天然または合成であってよく、一般にその抗体に特異的な免疫反応を誘発する。任意のかかる抗体は、随意に免疫原性タンパク質に結合してもよく、その例は例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、コレラ毒素Ｂサブユニット、または任意の他の免疫原性担体タンパク質である。
本発明によるワクチンはさらに、任意の過剰な既知のアジュバントをさらに含んでよく、その例は限定なく、フロイント完全アジュバント、ＫＬＨ、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ミョウバン、およびＱＳ−２１を含むサポニン、イミキモド、Ｒ８４８、またはこれらの組合せを含む。
【００６５】
第４の側面において、本発明は、脊椎動物においてＴＬＲ９媒介性免疫反応を引き起こすための方法を提供し、かかる方法は、脊椎動物に対し、本発明による化合物、組成物またはワクチンを投与することを含む。いくつかの態様において、脊椎動物は哺乳類である。本発明の目的のために、用語「哺乳類」は、ヒトおよび動物を含むことを特に意図する。好ましい態様において、化合物、組成物またはワクチンは、免疫刺激を必要とする脊椎動物に投与される。
【００６６】
本発明のこの側面による方法において、本発明の化合物、組成物またはワクチンの投与は任意の好適な経路により行うことができ、これには、限定することなく、非経口、経口、腫瘍内、舌下、経皮、局所、経鼻、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、粘膜、膣、あるいは遺伝子銃、経皮パッチまたは点眼もしくは口腔洗浄の形態によるものを含む。化合物、組成物またはワクチンの投与は、既知の手順を用いて、疾病の症状または代理マーカーを低減するのに有効な用量と期間で、行うことができる。全身投与の場合、化合物、組成物またはワクチンは、本発明の化合物の約０．０００１マイクロモル〜約１０マイクロモルの血中レベルを達成するのに十分な用量で投与するのが好ましい。局所投与の場合、これよりはるかに低い濃度が有効であり得、またはるかに高い濃度が重篤な毒性効果なしに耐容され得る。好ましくは、本発明による化合物の総用量は１日約０．００１ｍｇ／患者〜１日約２００ｍｇ／体重１ｋｇまでの範囲である。本発明の１または２種以上の治療組成物の治療有効量を、同時に、または連続して、個体に対して１つの処置エピソードとして投与することが望ましい場合もある。
【００６７】
ある好ましい態様においては、本発明の化合物、組成物またはワクチンは他の剤と組み合わせて投与され、これらの剤は限定することなく、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＳｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、標的治療物（targeted therapies）、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、および／または免疫反応の特異性もしくは強さを増強するためのアジュバントを含む。
本発明のこの側面の目的のために、「と組み合わせて」の用語は、患者の疾病または疾患を処置する過程において、本発明の化合物、組成物またはワクチンおよび／または他の剤を、同時投与ならびに、数時間、数日間または数週間の時間的間隔をあけた順序での投与を含む任意の順序で、投与することを意味する。かかる組合せ処置はまた、本発明の化合物、組成物またはワクチンおよび／または他の剤の、単回の投与より多数の投与も含んでよい。本発明の化合物、組成物またはワクチンおよび／または他の剤の投与は、同一または異なる経路であってよい。
【００６８】
本発明のこの側面による方法は、ヒトまたは動物の疾病の予防的または治療的処置に有用である。例えば、本方法は、小児および獣医学の用途に有用である。本方法はまた、免疫系のモデル研究にも有用である。
第５の側面において、本発明は、疾病または疾患を有する患者を治療的に処置するための方法を提供し、かかる方法は、患者に対し、本発明による化合物、組成物またはワクチンを投与することを含む。種々の態様において、処置される疾病または疾患は、癌、自己免疫疾患、感染症、気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、ぜん息、または病原体もしくはアレルゲンにより引き起こされる疾患である。病原体は例えば、細菌、寄生生物、真菌、ウィルス、ウィロイド、およびプリオンを含む。投与は、本発明の第４の側面において記載されたようにして実施する。
【００６９】
用語「処置」は、一般に、症状の緩和、または疾病の進行を遅らせるかまたは改善することを含み得る、有益な、または所望の結果を得ることを意図したアプローチをいう。
本発明の目的のために、用語「アレルギー」は、一般に、炎症を特徴とする不適切な免疫反応をいい、限定はしないが、食品アレルギーおよび呼吸アレルギーを含む。用語「気道炎症」はぜん息を含むが、これに限定はされない。本明細書において用いる用語「自己免疫疾患」は、「自己」要素（例えばタンパク質）が免疫系による攻撃を受ける疾患をいう。かかる用語は、自己免疫性ぜん息を含む。用語「癌」は、限定することなく、異常または無制御的な細胞増殖および／または分裂により引き起こされる、任意の悪性の増殖または腫瘍を含む。癌は、ヒトおよび／または動物において起こり、任意のおよび全ての組織において生じ得る。本発明を用いて癌を有する患者を処置することは、本発明の化合物、組成物またはワクチンを投与して、異常または無制御的な細胞増殖および／または分裂に影響を及ぼすことを含んでよい。
【００７０】
第６の側面において、本発明は、疾病または疾患を防ぐための方法を提供し、かかる方法は、患者に対し、本発明による化合物、組成物またはワクチンを投与することを含む。種々の態様において、予防される疾病または疾患は、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、感染症、アレルギー、ぜん息、または病原体により引き起こされる疾患である。病原体は、限定することなく、細菌、寄生生物、真菌、ウィルス、ウィロイド、およびプリオンを含む。投与は、本発明の第４の側面において記載されたようにして実施する。
【００７１】
本発明の任意の方法において、本発明の化合物、組成物またはワクチンは、疾病または状態を予防または処置するのに有用であり、かつ本発明の化合物、組成物またはワクチンの免疫刺激効果を低減させないような他の剤と組み合わせて、投与することができる。本発明の任意の方法において、疾病または状態を予防または処置するのに有用な剤は、限定することなく、ワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、および／または免疫反応の特異性もしくは強さを増強するためのアジュバント、または、共刺激性分子であって、例えばサイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド、および修飾アミノ酸を含むペプチドなどを含む。例えば、癌の予防および／または処置において、本発明の化合物、組成物またはワクチンを、化学治療化合物またはモノクローナル抗体と組み合わせて投与できることが意図される。代替的に、剤は、抗原またはアレルゲンをコードするＤＮＡベクターを含むことができる。これらの態様において、本発明の化合物、組成物またはワクチンは、アジュバントとして様々に作用でき、および／または、直接免疫調節効果をもたらすことができる。
以下の例は、本発明の一定の好ましい実施例をさらに説明することを意図し、本発明の範囲を多少でも限定することを意図するものではない。
【００７２】
例１：
オリゴヌクレオチド、ペンタン−１，３，５−トリオールリンカー、ペンタン−１，５−ジオールリンカーおよびｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリオールリンカーの合成ならびにＣＰＧおよびオリゴプレップ固体支持体の機能化
対照ポアガラス誘導体化３−メチル−１，３，５−ペンタントリオールリンカー（５）を、市販の３−メチル−１，３，５−トリオール（１）からスキーム１に示すようにして実現した。初めに、ビス−ＤＭＴ保護アルコール（２）を、（１）から、ＤＭＡＰの存在下でＤＭＴＣｌで処理することにより、十分な産量で調製した。ＣＰＧ誘導体化の従来法は、おそらく立体化学的効果による、（２）の３−ヒドロキシルにおけるスクシニル化産物の低い産量のために不可能であった。しかし、ＣＰＧ誘導体化リンカー（５）は、コハク酸塩（３）（スキーム１）を作製する必要性を排除した次の代替アプローチにより調製した。この経路において、初めに、ＣＰＧビーズを室温でジクロロメタン（ＤＣＭ）中の３％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で処理することにより活性化して、ＣＰＧ表面で反応性アミノ基の最大数を遊離化した。活性化ＣＰＧビーズを次に、ＤＭＡＰの存在下で無水コハク酸で誘導体化して、ＣＰＧビーズ（４）を得た。最後に、ＣＰＧ誘導体化リンカー（５）を、ＣＰＧ（４）のカルボン酸基を用いて、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＤＥＣ）／ＤＭＡＰの存在下で（２）を縮合することにより得た。誘導体化の後、残留カルボン酸基を、ペンタクロロフェノールによるキャッピング反応により除去した。
【化１】
スキーム１．３−メチル−１，３，５−ペンタントリオールリンカーの合成およびＣＰＧの誘導体化。試薬および条件：ａ）ＤＭＴＣｌ、ＤＭＡＰ、ピリジン、０℃〜室温；ｂ）無水コハク酸、ＤＭＡＰ、ピリジン；ｃ）（ｉ）ＤＣＭ中３％ＴＣＡ；（ｉｉ）無水コハク酸、ＤＭＡＰ、ピリジン；ｄ）（ｉ）（２）、ＤＭＡＰ、ＴＥＡ、ＤＥＣ、ピリジン；（ｉｉ）ペンタクロロフェノール。
【００７３】
１，３，５−ペンタントリオールリンカー誘導体化ＣＰＧ（１０）およびオリゴプレップ（１１）を、市販の３−ヒドロキシグルタル酸ジエチル（６）から出発して調製した（スキーム２）。ＬｉＡｌＨ４による（６）の還元により、定量的産量の１，３，５−ペンタントリオール（７）を産生した。トリオール（７）を次にＤＭＡＰの存在下でＤＭＴＣｌにより選択的に保護して、ビス−ＤＭＴ保護アルコール（８）を得て、これを次にコハク酸塩に正常に変換する；これは、ＤＭＡＰの存在下で無水コハク酸で処理することにより、固体支持体上にそのまま負荷することができる。ピリジン／アセトニトリル混合物中ＤＩＣ／ＤＭＡＰの存在下で、定量的負荷産量で（９）をＣＰＧに結合することができる（１０）。一方、上記のプロトコルは、ＰＶＡ固体支持体であるオリゴプレップ２５０の機能化においては、非常に少ない負荷産量を与えた。しかし、アセトニトリル中のＴＢＴＵ／ＤＭＡＰの存在下では、定量的負荷産量が実現された（１１）。負荷はそれぞれ、ＣＰＧ（１０）上に約〜４０μｍｏｌ／ｇ、およびオリゴプレップ２５０（１１）支持体上に約〜１２５μｍｏｌ／ｇで維持され、これは、ヌクレオチド結合効率および最終収率を増加させる。
【化２】
スキーム２．１，３，５−ペンタントリオールリンカーの合成ならびにＣＰＧおよびオリゴプレップ固体支持体の誘導体化。試薬および条件：ａ）ＬｉＡｌＨ４、ＴＨＦ、０℃〜室温；ｂ）ＤＭＴＣｌ、ＤＭＡＰ、ピリジン、０℃〜室温；ｃ）無水コハク酸、ＤＭＡＰ、ピリジン；ｄ）ＬＣＡＡ−ＣＰＧ、ＤＭＡＰ、ＤＩＣ、ピリジン、アセトニトリル；ｅ）オリゴプレップ２５０、ＤＭＡＰ、ＴＢＴＵ、アセトニトリル。
【００７４】
Ｃ５リンカー機能化支持体（１０）および（１１）は、同一配列のイムノマーを作製するのに理想的である。非同一配列のイムノマーもまた、我々の研究において強力な免疫刺激活性を示した。例えば（１４）（スキーム３）などの適切に保護されたＣ５リンカーは、非同一配列のイムノマーを作製するために必要である。市販の１，５−ペンタンジオールのヒドロキシル基の１つを、ＤＭＴにより選択的に保護し、続いて２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホス−ホスホラミダイトによるリン酸化により、必要なＣ５リンカー（１４）を得た（スキーム３）。
【化３】
スキーム３．ペンタンジオールホスホラミダイトの合成。試薬および条件：ａ）ＤＭＴＣｌ、ＤＭＡＰ、ピリジン、−１０℃〜室温；ｂ）ＤＩＰＥＡ、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロ−ホスホスホラミダイト、ＮＭＩ、ＤＣＭ、０℃〜室温。
【００７５】
我々はまた、強力な合成免疫調節モチーフとしてのＣｐＧＤＮＡデンドリマーの設計および開発にも注目した。ＣｐＧＤＮＡデンドリマーを作製するためには、適切に保護されたリンカーであるホスホラミダイトは必須である。Ｃ５リンカーホスホラミダイト（１５）および（１６）を、それぞれジ−ＤＭＴアルコール（２）および（８）から、スキーム４に示すように、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホスホラミダイトによるリン酸化により調製した。
【化４】
スキーム４．ペンタントリオールホスホラミダイトの合成。試薬および条件：ａ）ＤＩＰＥＡ、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホスホラミダイト、ＮＭＩ、ＤＣＭ、０℃〜室温。
【００７６】
ＣＰＧで誘導体化したｃｉｓ−シクロヘキサントリオールリンカー（２０）を、スキーム５に示すようにして実現した。ビス−ＤＭＴ保護ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリオール（１８）を、市販のｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリオール（１７）から実現した。続く、非保護ヒドロキシル（１８）のＤＭＡＰの存在下における無水コハク酸によるスクシニル化により、所望のビス−ＤＭＴコハク酸塩（１９）を７８％の収率で得た。ＣＰＧのコハク酸塩（１９）による誘導体化を、定量的産量（（２０）、４０μｍｏｌ／ｇ）で、ピリジン／アセトニトリル混合物中のＤＩＣ／ＤＭＡＰの存在下にて実現した。
【化５】
スキーム５．ｃｉｓ−シクロヘキサン−１，３，５−トリオールリンカーの合成およびＣＰＧ固体支持体の誘導体化。試薬および条件：ａ）ＤＭＴＣｌ、ＤＭＡＰ、ピリジン、０℃〜室温；ｂ）無水コハク酸、ＤＭＡＰ、ピリジン、室温；ｃ）ＬＣＡＡ−ＣＰＧ、ＤＭＡＰ、ＤＩＣ、ピリジン、アセトニトリル。
【００７７】
３−ヒドロキシグルタル酸ジエチル、水素化アルミニウムリチウム（ＬｉＡｌＨ４）、４，４−ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴＣｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、無水コハク酸、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＤＥＣ）、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、Ｎ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）などの試薬、ならびにピリジン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）およびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの溶媒は、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)から入手し、別に言及されない限りさらなる精製なしで用いた。長鎖アルキルアミン制御ポアガラス（ＣＰＧ；１２０〜２００メッシュ、５００Å、９０〜１２０μｍｏｌ／ｇＮＨ２基）はCPG Inc (Lincoln Park, NJ)から入手し、オリゴプレップ２５０はMerck KGaA (Germany)から入手した。キャップＡ（無水酢酸／２，６−ルチジン／ＴＨＦ、１：１：８）およびキャップＢ（Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦ、１６：８４）試薬は、Applied Biosystems (Foster City, CA)から入手した。全ての反応は、使用前に少なくとも３時間１２０℃のオーブンで乾燥させたガラス容器内で行った。ＴＬＣは、アルミニウムシートを被覆しているシリカゲル６０Ｆ２５４上で実施され、ＵＶ光またはSigma-Aldrich (St. Louis, MO)からの５％リンモリブデン酸（ＰＭＡ）溶液により視覚化した。クトマトグラフィ用の、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）、ヘキサン、ＤＣＭ、メタノール、ｔ−ブチルメチルエーテルなどの溶媒は、J.T. Bakerから入手し、精製なしで用いた。フラッシュカラムクロマトグラフィは、EMD Chemicals (Gibbstown, NJ)から入手したシリカゲル６０（メッシュサイズ：０．０４０〜０．０６３ｍｍ＆２３０〜４００メッシュＡＳＴＭ）を用いて行った。ＮＭＲスペクトルは、Varian 400MHa Unity Inova装置上で行った。化学シフト（δ）はＴＭＳに対するｐｐｍで表示し、全ての結合定数（Ｊ）はＨｚで表示した。
【００７８】
１，５−ビス−ジメトキシトリチルオキシ−３−メチル−ペンタン−３−オール（２）：ピリジン（２５ｍＬ）中のＤＭＴＣｌ（３．６ｇ、１０．５ｍｍｏｌ、２．１当量）を、乾燥ピリジン（２５ｍＬ）中の３−メチル−１，３，５−ペンタンチオール（（１）、０．７ｇ、５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．２４ｇ）の氷冷（０℃）の撹拌溶液に、窒素雰囲気下で１滴ずつ加えた。反応混合物をゆっくりと室温に到達させ（〜４時間）、一晩撹拌を続けた。ＴＬＣ（０．５％ＴＥＡを含有するヘキサン／ｔ−ブチルメチルエーテル、２：１）により、反応の完了を示した。ピリジンを回転蒸発乾固し（rotoevaporate to dryness）、残留物を酢酸エチル（２５０ｍＬ）に溶解し、水（２×１００ｍＬ）、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（２×１００ｍＬ）、ブライン（２×１００ｍＬ）および水（２×１００ｍＬ）で続いて洗浄した。酢酸エチルの層を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、回転蒸発乾固した。残留物を、０．５％トリエチルアミンを含有するヘキサン／ｔ−ブチルメチルエーテル（３：１）を用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製し、ビス−ＤＭＴ産物（２）を白色の泡状物質として得た（２．９ｇ、７８％）。
【化６】
【００７９】
ビス−ＤＭＴ−３−メチル−ペンタントリオール誘導体化ＣＰＧ（５）の調製：ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（５ｇ）を３％ＴＣＡ（５０ｍＬ）に加え、ゆっくりと室温で３時間撹拌した。ＣＰＧをろ過し、ＴＥＡ／ＤＩＰＥＡの９：１混合物（５０ｍＬ）で、続いてＤＣＭ（５×１００ｍｌ）で洗浄した。活性化ＣＰＧを高真空下で１時間乾燥した。ピリジン（３０ｍＬ）中の無水コハク酸（１ｇ、１０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．２ｇ）溶液を上記ＣＰＧ（５ｇ）に加え、スラリーを室温で２４時間振盪した。溶液をろ別し、ＣＰＧをピリジン（２×２５ｍＬ）で、続いてＤＣＭ（５×２５ｍＬ）で洗浄し、高真空下で２時間乾燥して、ＣＰＧのコハク酸誘導体（４）を得た。乾燥ピリジン（１０ｍＬ）中のジ−ＤＭＴ−３−メチル−ペンタントリオール（２）（８７ｍｇ）、ＤＭＡＰ（３０ｍｇ）、ＴＥＡ（１００μＬ）およびＤＥＣ（０．４ｇ）の溶液を、ＣＰＧ（４）に加え、室温で１５時間振盪した。ペンタクロロフェノール（０．１４ｇ）を上記混合物に加え、さらに１５時間振盪した。溶液をろ別し、ＣＰＧをピリジン（２×２５ｍＬ）で、続いてＤＣＭ（５×２５ｍＬ）で完全に洗浄し、デシケータ中高真空下で一晩乾燥して、ジ−ＤＭＴ−３−メチル−ペンタントリオール誘導体化ＣＰＧ（５）を得た。負荷量は、ＣＰＧの小部分をＤＣＭ中３％ＴＣＡで処理して決定し、ＤＭＴ含量（３７μｍｏｌ／ｇ）を４９８ｍｍでの吸収の測定により定量した。
【００８０】
ペンタン−１，３，５−トリオール（７）の合成：ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の３−ヒドロキシグルタル酸ジエチル（（６）、２５ｇ、１２２．４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４００ｍＬ）中の１ＭのＬｉＡｌＨ４溶液に、０℃のアルゴン雰囲気下で、激しく撹拌しつつ１滴ずつ加えた。添加の後、反応混合物を室温に到達させ（〜４時間）、一晩撹拌した。反応混合物を−７８℃に冷却し（アセトン／乾燥氷浴）、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（５０ｍＬ）の１滴ずつの添加により急冷して、白色の沈殿物を得た。反応混合物を別の５００ｍＬのＴＨＦで希釈し、白色沈殿物をセライトを通してろ過した。沈殿物を沸騰ＴＨＦ（２５０ｍＬ）で処理してろ過した。あわせた有機相を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、溶媒を回転蒸発により除去した。残留物を、ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ／メタノール（６：３：１）を用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製して、トリオール（７）（１１．４ｇ、９５．５ｍｍｏｌ、７８％）を無色の油として得た。
【化７】
【００８１】
１，５−ビス−［（４，４、−ジメトキシフェニル）−フェニルメトキシ］−ペンタン−３−オール（８）：ピリジン（１００ｍＬ）中のＤＭＴＣｌ（１６．６ｇ、４９ｍｍｏｌ、２．１当量）を、乾燥ピリジン（５０ｍＬ）中のペンタントリオール（７）（２．８ｇ、２３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（２．８５ｇ、１当量）の氷冷（０℃）の撹拌溶液に、アルゴン雰囲気下で１滴ずつ加えた。反応混合物をゆっくりと室温に到達させ（〜４時間）、一晩撹拌を続けた。ＴＬＣ（０．５％ＴＥＡ含有のヘキサン／ＥｔＯＡｃ、３：１）により、反応の完了を示した。ピリジンを回転蒸発乾固し、残留物をＤＣＭ（５００ｍＬ）に溶解し、水（５００ｍＬ）、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）および水（２×５００ｍＬ）で続いて洗浄した。ＤＣＭ層を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、回転蒸発乾固した。残留物を、０．５％ＴＥＡ含有ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（３：１）を用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製して、ビス−ＤＭＴアルコール（８）を白色発泡体として得た（１２．１ｇ、１６．７ｍｍｏｌ、７２％）。
【化８】
【００８２】
３（１，５−Ｏ−ジメトキシトリチルペンタントリオール）コハク酸（９）：ビス−ＤＭＴアルコール（８）（１２ｇ、１６．６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（４．０４ｇ、３３．２ｍｍｏｌ）を、乾燥ピリジン（１５０ｍＬ）に溶解し、無水コハク酸（３．３１ｇ、３３．２ｍｍｏｌ）を一部ずつ室温で、激しく撹拌しつつ加えた。反応混合物を一晩撹拌し、ピリジンを回転蒸発乾固した。残留物をＤＣＭ（５００ｍＬ）に溶解し、氷冷の１０％クエン酸溶液（２×５００ｍＬ）および水（２×５００ｍＬ）で続いて洗浄した。ＤＣＭ層を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、回転蒸発装置を用いて５０ｍＬの容積に濃縮し、０．５％ＴＥＡ含有のＤＣＭ中０→２％メタノールを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製して、コハク酸塩の純粋トリエチルアンモニウム塩（９）を白色発泡体として得た（１１．４ｇ、１３．８ｍｍｏｌ、８３％）。
【化９】
【００８３】
ビス−ＤＭＴペンタントリオール負荷ＣＰＧ（１０）の調製：ピリジン／アセトニトリルの１：６混合物（１０５ｍＬ）中のコハク酸塩（９）（０．８３ｇ、１ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．４ｇ、３．３ｍｍｏｌ）およびＤＩＣ（５ｍＬ）の溶液を、ＣＰＧ（２５ｇ）に加え、スラリーを２４時間振盪した。溶液をろ別し、ＣＰＧを、５％ピリジン含有アセトニトリル（１００ｍＬ）およびアセトニトリル（２５０ｍＬ）で洗浄した。キャップＡ（ＡＢＩ、８９ｍＬ）およびキャップＢ（ＡＢＩ、１００ｍＬ）溶液を、ＣＰＧ支持体に加え、４時間振盪した。溶液をろ別し、ＣＰＧを、５％ピリジン含有アセトニトリル（２×１００ｍＬ）で、続いてアセトニトリル（２×２５０ｍＬ）で洗浄し、高真空下で３０分間乾燥した。５％ピリジン含有アセトニトリル（１５０ｍＬ）中のＴＢＤＭＳＣｌ（５．６ｇ）およびイミダゾール（１．４ｇ）の溶液をＣＰＧに加え、４時間振盪した。溶液をろ別し、ＣＰＧを、５％ピリジン含有アセトニトリル（３×１００ｍＬ）およびＤＣＭ（４×２５０ｍＬ）で続いて洗浄し、デシケータ中の高真空下で一晩乾燥して、乾燥ＣＰＧ支持体（１０）を得た。負荷量は、ＣＰＧの小部分をＤＣＭ中３％ＴＣＡで処理して決定し、ＤＭＴ含量（４０μｍｏｌ／ｇ）を４９８ｍｍでの吸収の測定により定量した。
【００８４】
ビス−ＤＭＴペンタントリオール負荷オリゴプレップ２５０（１１）の調製：オリゴプレップ２５０（アセトニトリル中で予め膨張させる）を、ペプチド合成容器に取り、無水アセトニトリル（３×１００ｍＬ）で洗浄した。コハク酸塩（９）（１．７５２ｇ、２．１２５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１．８２ｇ、１４．８７ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（３．４１ｇ、１０．６２ｍｍｏｌ）およびアセトニトリル（１００ｍＬ）をオリゴプレップ２５０に加え、スラリーを４時間振盪した。溶液をろ別し、オリゴプレップを、１％ＴＥＡ含有アセトニトリル（２×１００ｍＬ）およびアセトニトリル（５×１００ｍＬ）で洗浄した。キャップＡ（５０ｍＬ：ＮＭＩ／ピリジン／アセトニトリル＝２：３：５）およびキャップＢ（５０ｍＬ：無水酢酸／アセトニトリル＝１：４）溶液を、固体支持体に加え、６時間振盪した。溶液をろ別し、固体支持体をアセトニトリル（２×１００ｍＬ）で洗浄し、キャッピング反応をもう一度繰り返した。溶液をろ別し、固体支持体を、１％ＴＥＡ含有アセトニトリル（３×１００ｍＬ）で、続いてアセトニトリル（５×１００ｍＬ）で洗浄し、デシケータ中の高真空下で２４時間乾燥して、乾燥オリゴプレップ２５０支持体（１１）（２６．４ｇ）を得た。負荷量は、オリゴプレップの小部分をＤＣＭ中３％ＴＣＡで処理して決定し、ＤＭＴ含量（１３８μｍｏｌ／ｇ）を４９８ｍｍでの吸収の測定により定量した。
【００８５】
５−ジメトキシトリチルオキシ−ペンタン−１−オール（１３）：ペンタンジオール（１２）（１２．５ｇ、１２０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１４．６ｇ、１２０ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（１００ｍＬ）に溶解し、−１０℃に冷却し、アルゴン雰囲気下に維持した。ピリジン（１５０ｍＬ）中のＤＭＴＣｌ（３７．３ｇ、１１０ｍｍｏｌ、０．９２当量）を、激しく撹拌しつつ１滴ずつ加えた。反応混合物をゆっくりと室温に到達させ（〜４時間）、一晩撹拌を続けた。ピリジンを回転蒸発乾固し、残留物をＤＣＭ（５００ｍＬ）に溶解し、水（２５０ｍＬ）、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（２×２５０ｍＬ）、ブライン（２５０ｍＬ）および水（２×２５０ｍＬ）で続いて洗浄した。ＤＣＭ層を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、回転蒸発乾固した。残留物を、０．５％ＴＥＡを含む３：１のヘキサン／ＥｔＯＡｃを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製して、モノ−ＤＭＴ保護アルコール（１３）を無色のシロップとして得た（２８．２ｇ、５８％）。
【化１０】
【００８６】
５−ジメトキシトリチルオキシ−ペンタン−１−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホラミダイト（１４）：無水ＤＣＭ（５００ｍＬ）中の氷冷した（１３）の溶液（２０．３２ｇ、５０ｍｍｏｌ）に、窒素雰囲気下で、ＤＩＰＥＡ（２６．１２ｍｌ、１５０ｍｍｏｌ）を激しく撹拌しつつ加えた。次に２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホスホラミダイト（１４．２ｇ、６０ｍｍｏｌ）を１滴ずつ加え、続いてＮＭＩ（４ｍＬ、５０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物をゆっくりと〜４時間で室温に到達させ、一晩撹拌を続けた。０．５％ＴＥＡを含む３：１のヘキサン／ＥｔＯＡｃでのＴＬＣにより、反応の完了を示した。反応混合物を追加の５００ｍＬのＤＣＭで希釈し、飽和水性ＮａＨＣＯ３（１×５００ｍＬ）、ブライン（２×５００ｍＬ）および水（１×５００ｍＬ）で続いて洗浄した。有機相を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、回転蒸発乾固した。残留物を、０．５％ＴＥＡを含む３：１のヘキサン／ＥｔＯＡｃ混合物を用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製して、（１３）を無色の粘性液体として得た（２２．３ｇ、７４％）。
【化１１】
【００８７】
ホスホラミダイト（１５）および（１６）の合成：（１４）について記載したような一般の方法を用いて合成。化合物（１５）−白色発泡体、収率６９％。
【化１２】
化合物（１６）−白色発泡体、収率７９％。
【化１３】
【００８８】
ｃｉｓ−３，５−ビス−ジメトキシトリチルオキシ−シクロヘキサン−１−オール（１８）：ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリオール無水物（５．０５ｇ、３０ｍｍｏｌ）をピリジン（１００ｍＬ）に溶解し、回転蒸発乾固し、高真空化で４８時間乾燥して、無水ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリオール（４．０５ｇ、３０．６ｍｍｏｌ）を得た。上記無水シクロヘキサントリオールおよびＤＭＡＰ（７．３３ｇ、６０ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（１００ｍＬ）に溶解し、氷浴中で冷却し、窒素雰囲気下に維持した。乾燥ピリジン（１５０ｍＬ）中のＤＭＴＣｌ（２０．４ｇ、６０ｍｍｏｌ、２当量）を、上記溶液に激しく撹拌しつつ１滴ずつ加えた。反応混合物をゆっくりと室温に到達させ（〜４時間）、２４時間撹拌を続けた。０．５％ＴＥＡを含む２：１のヘキサン／ＥｔＯＡｃ混合物中のＴＬＣは、いくつかの出発物質の存在を示した。反応混合物をさらに５時間６０℃で撹拌し、ピリジンを回転蒸発乾固した。残留物をＤＣＭ（５００ｍＬ）に溶解し、水（５００ｍＬ）、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（５００ｍＬ）、ブライン（５００ｍＬ）および水（２×５００ｍＬ）で続いて洗浄した。ＤＣＭ層を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、回転蒸発乾固した。残留物を、０．５％ＴＥＡを含む３：１のヘキサン／ＥｔＯＡｃを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製して、ビス−ＤＭＴ産物（１８）を白色固体として得た（８．４ｇ、３８％）。
【化１４】
【００８９】
１（３，５−ビス−ジメトキシトリチル−ｃｉｓ−シクロヘキサントリオール）コハク酸（１９）：ビス−ＤＭＴ−シクロヘキサントリオール（１８）（４．０５ｇ、５．５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１．３４ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（５０ｍＬ）に溶解し、無水コハク酸（１．１ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）を、室温で激しく撹拌しつつ１部ずつ加えた。反応混合物を室温で４８時間撹拌し、２％メタノールおよび０．５％ＴＥＡを含むＤＣＭ中のＴＬＣが、出発物質が完全に消えたことを示した。ピリジンを回転蒸発乾固し、残留物をＤＣＭ（２５０ｍＬ）に溶解し、氷冷の１０％クエン酸溶液（２×２５０ｍＬ）および水（２×２５０ｍＬ）で続いて洗浄した。ＤＣＭ層を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、回転蒸発装置で５０ｍＬ容積に濃縮し、０．５％ＴＥＡ含有のＤＣＭ中０→２％メタノールを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製して、コハク酸塩の純粋トリエチルアンモニウム塩（１９）を白色発泡体として得た（３．５８ｇ、７８％）。
【化１５】
【００９０】
ビス−ＤＭＴシクロヘキサントリオール誘導体化ＣＰＧ（２０）の調製：ピリジン／アセトニトリルの１：７．５混合物（８５ｍＬ）中の、コハク酸塩（１９）（０．７８ｇ、０．９３ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．３８ｇ、２．８ｍｍｏｌ）およびＤＩＣ（３ｍＬ）の溶液を、ＣＰＧ（２２．５ｇ）に加え、スラリーを２４時間撹拌した。溶液をろ別し、ＣＰＧを、５％ピリジン含有アセトニトリル（２×１００ｍＬ）およびアセトニトリル（３×１００ｍＬ）で洗浄した。キャップＡ（ＡＢＩ、８０ｍＬ）およびキャップＢ（ＡＢＩ、９０ｍＬ）溶液をＣＰＧ支持体に加え、４時間振盪した。溶液をろ別し、ＣＰＧを５％ピリジン含有アセトニトリル（２×１００ｍＬ）で洗浄し、続いてアセトニトリル（２×２５０ｍＬ）で洗浄し、高真空下で３０分間乾燥した。５％ピリジン（１００ｍＬ）を含むアセトニトリル中の、ＴＢＤＭＳＣｌ（２．５ｇ）およびイミダゾール（０．７５ｇ）の溶液をＣＰＧに加え、５時間振盪した。溶液をろ別し、ＣＰＧを、５％ピリジン含有アセトニトリル（３×１００ｍＬ）およびＤＣＭ（４×１００ｍＬ）で続いて洗浄し、デシケータ中高真空下で一晩乾燥して、乾燥ＣＰＧ支持体（２０）を得た。負荷量は、ＣＰＧの小部分をＤＣＭ中の３％ＴＣＡで処理して決定し、ＤＭＴ含量（４０μｍｏｌ／ｇ）を４９８ｍｍでの吸収の測定により定量した。
【００９１】
例２：
マウスＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３細胞中の、表Ｉからの例示のオリゴによる、細胞培養条件および試薬、サイトカイン誘発
マウスＴＬＲ９を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞（Invitrogen, San Diego, CA）を、４８ウェルプレート内、１０％熱不活性化ＦＢＳを補足したＤＭＥＭで２５０μｌ／ウェルにて、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて培養した。８０％の細胞密集度で、培養物を一時的に、４００ｎｇ／ｍｌのＳＥＡＰ（ヒト胎性アルカリホスファターゼの分泌形態）レポータープラスミド（pNifty2-Seap (Invitrogen)）を用いて、培養培地中の４μｌ／ｍｌのリポフェクタミン（Invitrogen, Carlsbad, CA）の存在下でトランスフェクトした。プラスミドＤＮＡおよびリポフェクタミンを別々に無血清培地に希釈し、室温で５分間インキュベーションした。インキュベーション後、希釈ＤＮＡおよびリポフェクタミンを混合し、混合物を室温で２０分間インキュベーションした。１００ｎｇのプラスミドＤＮＡおよび１μｌのリポフェクタミンを含む、ＤＮＡ／リポフェクタミン混合物のアリコート２５μｌを、細胞培養プレートの各ウェルに加え、培養を４時間続けた。
トランスフェクションの後、培地を新鮮な培養培地で置き換え、表Ｉからの例示のオリゴを培養物中に加え、培養を２４時間続けた。オリゴ処理の最後に、３０μｌの培養物上清を各処理から取り出し、製造業者のプロトコル（Invitrogen）に従うＳＥＡＰアッセイに用いた。簡潔に述べると、培養物上清を、リン酸ｎ−ニトロフィニイル基質でインキュベーションし、生成された黄色の物質を、プレートリーダーにより４０５ｎｍにて測定した（Putta MR et al., Nucleic Acid Res., 2006, 34: 3231-8）。
【００９２】
例３：
ヒトＰＢＭＣ、ｐＤＣ、およびマウス脾臓細胞中の、表Ｉからの例示のオリゴによるサイトカイン誘発
ヒトＰＢＭＣ単離
新しく収集した健康なボランティアの血液（CBR Laboratories, Boston, MA）からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール密度勾配遠心分離法（Histopaque-107, Sigma）により単離した。
ヒトｐＤＣ単離
ｐＤＣは、製造業者の指示書に従って、ＢＤＣＡ４細胞単離キット（Miltenyi Biotec）を用いる陽性選択により、ＰＢＭＣから単離した。
マウス脾臓細胞単離
４〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓細胞を、Zhao, Q. et al, (Biochem Pharmacol. 51:173-182(1996)およびBranda R.F., et al. (Biochem Pharmacol. 45:2037-2043(1993)による記載のように、ＲＰＭＩ完全培地中で培養した。全てのその他の培養試薬は、Mediatech (Gaithersburg, MD)から購入した。
【００９３】
サイトカインＥＬＩＳＡ
ヒトＰＢＭＣまたはマウス脾臓細胞を、４８ウェルプレートに５×１０６細胞／ｍｌでプレートした。ヒトｐＤＣを、９６ウェルディシュに１×１０６細胞／ｍｌでプレートした。ＤＰＢＳ（ｐＨ７．４；Mediatech）中に溶解した表Ｉの例示のオリゴを、細胞培養物に加えた。細胞を次に３７℃で２４時間インキュベーションし、上清をLuminex Multiplex用またはＥＬＩＳＡアッセイ用に収集した。ある実験においては、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２のレベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。サイトカイン抗体および標準を含む必要な試薬は、PharMingenから購入した。
サイトカインLuminex Multiplex
ある実験においては、培養物上清中のＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−β、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１２ｐ４０ｐ７０のレベルを、Luminex Multiplexアッセイにより測定した；これは、Luminex 100装置上でBiosource製ヒトマルチプレクスサイトカインアッセイキットを用いて実施し、データをApplied Cytometry Systems（Sacramento, CA）が供給するStarStationソフトウェアを用いて解析した。
【００９４】
例４：
表Ｉからの例示のオリゴの存在下でのヒトＢ細胞増殖アッセイ
ヒトＢ細胞を、ＰＢＭＣから、製造業者の指示に従ってCD19 Cell Isolation Kit（Mitenyi Biotec, Auburn, CA）を用いた陽性選択により単離した。
アッセイに用いた培養培地は、１．５ｍＭのグルタミンを補ったＲＰＭＩ１６４０培地、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、５０μＭの２−メルカプトエタノール、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン混合物および１０％の熱非活性化ウシ胎仔血清からなる。
全体で１ｍｌ当たり０．５×１０６のＢ細胞を、９６ウェルの平底プレートで、表Ｉからの例示のオリゴの異なる濃度で、トリプリケートで、全７２時間刺激した。６６時間後、細胞を、１ウェル当たり、２０μｌのＲＰＭＩ１６４０培地（血清なし）中の０．７５μＣｉの［Ｈ３］−チミジン（１Ｃｉ＝３７ＧＢｑ；Perkin Elmer Life Sciences）でパルスし、６〜８時間後に収穫した。次にプレートを細胞収穫器により収穫し、放射性混入物を標準の液体シンチレーション技術により決定した。いくつかのケースでは、対応する［Ｈ３］−Ｔ（ｃｐｍ）を増殖指数に変換し、これを用いて報告した。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、出願日２００６年１２月１２日の米国仮出願番号第60/869,604号の利益を主張し、その内容全体を本明細書に参照として組み入れる。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、トール様受容体（ＴＬＲ）媒介性免疫反応の調整に有用な合成化学組成物に関する。特に、本発明は、ユニークなサイトカインおよびケモカインプロファイルを生成する、トール様受容体９（ＴＬＲ９）のアゴニストに関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の概要
トール様受容体（ＴＬＲ）は免疫系の多くの細胞に存在し、先天性免疫反応に関連することが示されている（Hornung, V. et al., (2002) J. Immunol. 168:4531-4537）。脊椎動物において、このファミリーはＴＬＲ１〜ＴＬＲ１１と呼ばれる１１種のタンパク質からなり、それらは、細菌、真菌、寄生虫、およびウイルスからの病原体関連分子パターンを認識することが知られている（Poltorak, a. et al. (1998) Science 282:2085-2088；Underhill, D.M., et al. (1999) Nature 401:811-815；Hayashi, F. et. al (2001) Nature 410:1099-1103；Zhang, D. et al. (2004) Science 303:1522-1526；Meier, A. et al. (2003) Cell. Microbiol. 5:561-570；Campos, M.A. et al. (2001) J. Immunol. 167: 416-423；Hoebe, K. et al. (2003) Nature 424: 743-748；Lund, J. (2003) J. Exp. Med. 198:513-520；Heil, F. et al. (2004) Science 303:1526-1529；Diebold, S.S., et al. (2004) Science 303:1529-1531；Hornung, V. et al. (2004) J. Immunol. 173:5935-5943）。
【０００４】
ＴＬＲは、哺乳類が異質分子を認識しそれに対する免疫反応を開始する鍵となる手段であり、また先天性免疫反応と適応的免疫反応を結びつける手段も提供する（Akira, S. et al. (2001) Nature Immunol. 2:675-680；Medzhitov, R. (2001) Nature Rev. Immunol. 1:135-145）。いくつかのＴＬＲは細胞表面に存在し、細胞外の病原体を検出してこれに対する反応を開始し、他のＴＬＲは細胞内に存在し、細胞内の病原体を検出してこれに対する反応を開始する。
【０００５】
ＴＬＲは、細菌ＤＮＡおよび合成オリゴヌクレオチド内の非メチル化ＣｐＧモチーフを認識することが知られている（Hemmi, H. et al. (2000) Nature 408:740-745）。ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの他の修飾も、ＴＬＲ９を介した免疫反応のモジュレーターとして作用するそれらの能力に、影響を及ぼし得る（例えば、Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182；Zhao et al. (1996) Biochem Pharmacol. 52:1537-1544；Zhao et al. (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:495-502；Zhao et al (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:3453-3458；Zhao et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:1051-1054；Yu, D. et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:2585-2588；Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2263-2267；およびKandimalla, E. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813を参照のこと）。天然に存在するＴＬＲ９のアゴニストは、抗腫瘍活性（例えば腫瘍増殖および血管形成）を産生し、効果的な抗癌反応（例えば抗白血病）をもたらすことが示されている（Smith, J.B. and Wickstrom, E. (1998) J. Natl. Cancer Inst. 90:1146-1154）。さらに、ＴＬＲ９アゴニストは、他の既知の抗腫瘍化合物（例えばセツキシマブ、イリノテカン）と相乗的に作用することが示されている（Vincenzo, D., et al. (2006) Clin. Cancer Res. 1(2):577-583）。
【０００６】
あるＴＬＲ９アゴニストは、コアＣｐＲジヌクレオチドを含有する３’−３’結合ＤＮＡ構造から構成され、ここでＲは修飾グアノシン（米国特許出願第10/279,684号）である。さらに、特定の化学修飾が、免疫反応の特異な調整をもたらす特定のオリゴヌクレオチド類似体（analogue）の調製を可能とする。特に、構造活性関連研究により、免疫反応の特異的調整を誘発する合成モチーフおよび新規なＤＮＡベースの化合物の同定が可能となり、これらの調整は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドにより引き起こされるものとは異なる。(Kandimalla, E. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102:6925-6930. Kandimalla, E. et al. (2003) Proc. Nat. Acad. Sci. U S A 100:14303-14308；Cong, Y. et al. (2003) Biochem Biophys Res. Commun.310:1133-1139；Kandimalla, E. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 306:948-953；Kandimalla, E. et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2393-2400；Yu, D. et al. (2003) Bioorg. Med. Chem.11:459-464；Bhagat, L. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun.300:853-861；Yu, D. et al. (2002) Nucleic Acids Res.30:4460-4469；Yu, D. et al. (2002) J. Med. Chem.45:4540-4548. Yu, D. et al. (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun.297:83-90；Kandimalla. E. et al. (2002) Bioconjug. Chem.13:966-974；Yu, D. et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:1613-1619；Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:2803-2808；Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2263-2267；Kandimalla, E. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813；Yu, D. et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:2585-2588；Putta, M. et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34:3231-3238)。
【０００７】
本発明者らは、驚くべきことに、コアＣｐＲジヌクレオチドに隣接する配列へのユニークな修飾が、in vitroおよびin vivoで特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを生成する、新規なＴＬＲ９アゴニストを産生することを発見した。ＣｐＲ含有オリゴヌクレオチドに対するサイトカインおよびケモカイン反応を「カスタム調整」するこの能力は、種々の疾病状態を、疾病特異的かつさらに患者特異的な様式で、予防および／または処置する能力の提供を約束する。したがって、かかるカスタム調整された反応を提供する、新規なオリゴヌクレオチド類似体化合物に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００８】
発明の概要
本発明は、ＴＬＲ９のアゴニストとしての相互作用を通して、特異な免疫反応プロファイルを個別に提供する、新規なオリゴヌクレオチドベースの化合物を提供する。本発明によるＴＬＲ９アゴニストは、特異的でユニークな化学修飾を特徴とし、これによりその特徴的な免疫反応活性化プロファイルが提供される。
本発明によるＴＬＲ９アゴニストは、種々の細胞型において、ならびに種々のin vitroおよびin vivo実験モデルにおいて免疫反応を誘発し、各アゴニストは特異な免疫反応プロファイルを提供する。そのためこれらは、免疫系の研究のため、またヒトおよびマウスなどの種々の動物種の免疫系を比較するためのツールとして有用である。本発明によるＴＬＲ９アゴニストはまた、種々の疾病の予防および／または処置において、それのみで、他の薬剤と組み合わせて、またはワクチンとして用いる抗体用のアジュバントとして、有用である。
したがって、第１の側面において、本発明は、オリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９のアゴニストを提供する。
第２の側面において、本発明は、本発明によるオリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９アゴニスト（「化合物」）および生理学的に許容し得る担体を含む、組成物を提供する。
【０００９】
第３の側面において、本発明はワクチンを提供する。この側面によるワクチンは、本発明による組成物を含み、さらに抗体を含む。
第４の側面において、本発明は、脊椎動物においてＴＬＲ９媒介性免疫反応を引き起こすための方法を提供し、かかる方法は、脊椎動物に対し、本発明による化合物、組成物またはワクチンを投与することを含む。
第５の側面において、本発明は、疾病または疾患を有する患者を治療的に処置するための方法を提供し、かかる方法は、患者に対し、本発明による化合物、組成物またはワクチンを投与することを含む。
第６の側面において、本発明は、疾病または疾患を防ぐための方法を提供し、かかる方法は、患者に対し、本発明による化合物、組成物またはワクチンを投与することを含む。
【００１０】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、ＴＬＲ９のアゴニストとしての相互作用を通して、特異な免疫反応プロファイルを個別に提供する、新規なオリゴヌクレオチドベースの化合物を提供する。本発明によるＴＬＲ９アゴニストは、ユニークな化学修飾を特徴とし、これによりその特徴的な免疫反応活性化プロファイルが提供される。本明細書に引用された全ての刊行物は、当業者のレベルを反映しており、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。これら参考文献と本明細書との間のいかなる不一致も、後者を支持するように解決されるべきである。
本発明によるＴＬＲ９アゴニストは、種々の細胞型において、ならびに種々のin vitroおよびin vivo実験モデルにおいて免疫反応を誘発し、各アゴニストは特異な免疫反応プロファイルを提供する。そのためこれらは、免疫系の研究のため、またヒトおよびマウスなどの種々の動物種の免疫系を比較するためのツールとして有用である。本発明によるＴＬＲ９アゴニストはまた、種々の疾病の予防および／または処置において、それのみで、他の薬剤と組み合わせて、またはワクチンとして用いる抗体用のアジュバントとして、有用である。
【００１１】
本発明によるいくつかのＴＬＲ９アゴニストを、下の表Ｉに示す。この表において、オリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９アゴニストは全て、別に指示のある場合を除き、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を有する。別に指示のある場合を除き、全てのヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。しかし当業者は、ホスホジエステル（ＰＯ）結合、またはＰＳ結合とＰＯ結合の組み合わせも用いることができることを、認識する。
【００１２】
【表１】
【００１３】
【表２】
【００１４】
【表３】
【００１５】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例２の記載のようにして、ＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３細胞において免疫刺激活性について試験した。下の表ＩＩ（ａ）、ＩＩ（ｂ）、ＩＩ（ｃ）およびＩＩ（ｄ）は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、投与後２４時間においてそれらのＴＬＲ９媒介性ＮＦ−κＢ活性化プロファイルを変化させることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＮＦ−κＢ活性化を増加または減少できることを示す。
【００１６】
【表４】
【００１７】
【表５】
【００１８】
【表６】
【００１９】
【表７】
【００２０】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例３の記載のようにして、Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞ＩＬ−１２アッセイにおいて免疫刺激活性について試験した。下の表ＩＩＩ（ａ）、ＩＩＩ（ｂ）およびＩＩＩ（ｃ）に示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、投与後２４時間の脾臓細胞におけるＴＬＲ９媒介性ＩＬ−１２活性化プロファイルを変化させること、および、この活性化プロファイルは、化学修飾に依存して用量依存性となり得ることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＩＬ−１２活性化を増加または減少できることを示す。
【００２１】
【表８】
【００２２】
【表９】
【００２３】
【表１０】
【００２４】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例３の記載のようにして、Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞ＩＬ−６アッセイにおいて免疫刺激活性について試験した。下の表ＩＶ（ａ）、ＩＶ（ｂ）およびＩＶ（ｃ）に示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、投与後２４時間の脾臓細胞におけるＴＬＲ９媒介性ＩＬ−６活性化プロファイルを変化させること、および、この活性化プロファイルは、化学修飾に依存して用量依存性となり得ることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＩＬ−６活性化を増加または減少できることを示す。
【００２５】
【表１１】
【００２６】
【表１２】
【００２７】
【表１３】
【００２８】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例４の記載のようにして、ヒトＢ細胞増殖アッセイにおいて免疫刺激活性について試験した。下の表Ｖ（ａ）、Ｖ（ｂ）、Ｖ（ｃ）、Ｖ（ｄ）およびＶ（ｅ）に示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、ＴＬＲ９媒介性Ｂ細胞増殖活性を変化させること、および、この活性化プロファイルは、化学修飾に依存して用量依存性となり得ることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、Ｂ細胞増殖を調節できることを示す。
【００２９】
【表１４】
【００３０】
【表１５】
【００３１】
【表１６】
【００３２】
【表１７】
【００３３】
【表１８】
【００３４】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例３の記載のようにして、ＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２についてのヒトＰＢＭＣおよびＢ細胞アッセイにおいて、免疫刺激活性について試験した。下の表ＶＩ（ａ）、ＶＩ（ｂ）、ＶＩ（ｃ）、ＶＩ（ｄ）、ＶＩ（ｅ）、ＶＩ（ｆ）、ＶＩ（ｇ）、およびＶＩ（ｈ）に示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、ヒトＰＢＭＣにおいてそれらのＴＬＲ９媒介性ＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−６、ＩＬ−１０および／またはＩＬ−１２活性化プロファイルを変化させることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２活性化を増加または減少できることを示す。
【００３５】
【表１９】
【００３６】
【表２０】
【００３７】
【表２１】
【００３８】
【表２２】
【００３９】
【表２３】
【００４０】
【表２４】
【００４１】
【表２５】
【００４２】
【表２６】
【００４３】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例３の記載のようにして、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−βについてのヒトＰＢＭＣアッセイにおいて、免疫刺激活性について試験した。下の表ＶＩＩ（ａ）およびＶＩＩ（ｂ）に示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、ヒトＰＢＭＣにおいてそれらのＴＬＲ９媒介性ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＭＩＰ−β活性化プロファイルを変化させることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−β活性化を増加または減少できることを示す。
【００４４】
【表２７】
【００４５】
【表２８】
【００４６】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例３の記載のようにして、ＭＣＰ−１およびＩＦＮ−αについてのヒトＰＢＭＣアッセイにおいて、免疫刺激活性について試験した。下の表ＶＩＩＩ（ａ）およびＶＩＩＩ（ｂ）に示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、ヒトＰＢＭＣにおいてそれらのＴＬＲ９媒介性ＭＣＰ−１および／またはＩＦＮ−α活性化プロファイルを変化させることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＭＣＰ−１およびＩＦＮ−α活性化を増加または減少できることを示す。
【００４７】
【表２９】
【００４８】
【表３０】
【００４９】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例３の記載のようにして、ＩＦＮ−α、ＩＬ６およびＩＬ−１２についてのヒトＰＢＭＣおよびｐＤＣアッセイにおいて、免疫刺激活性について試験した。下の表ＩＸ（ａ）、ＩＸ（ｂ）、ＩＸ（ｃ）、ＩＸ（ｄ）、ＩＸ（ｅ）、ＩＸ（ｆ）およびＩＸ（ｇ）に示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、ヒトＰＢＭＣおよびｐＤＣにおいて、それらのＴＬＲ９媒介性ＩＦＮ−α活性化プロファイルを変化させることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−１２活性化を増加または減少できることを示す。
【００５０】
【表３１】
【００５１】
【表３２】
【００５２】
【表３３】
【００５３】
【表３４】
【００５４】
【表３５】
【表３６】
【００５５】
【表３７】
【００５６】
【表３８】
【００５７】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例３の記載のようにして、マウス脾臓細胞培養物中でのそれらのＩＬ−１２およびＩＬ−６の誘発について試験した。下の表Ｘ（ａ）およびＸ（ｂ）に示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、脾臓細胞においてそれらのＴＬＲ９媒介性ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２活性化プロファイルを変化させること、およびこの活性化プロファイルは、化学修飾に依存して用量依存性となり得ることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＩＬ−６およびＩＬ−１２活性化を増加または減少できることを示す。
【００５８】
【表３９】
【００５９】
【表４０】
【００６０】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例３の記載のようにして、ヒトＰＢＭＣ培養物中でのそれらのＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ４０ｐ７０の誘発について試験した。下の表ＸＩに示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、ヒトＰＢＭＣにおいてそれらのＴＬＲ９媒介性ＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ４０ｐ７０活性化プロファイルを変化させることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ４０ｐ７０活性化を増加または減少できることを示す。
【００６１】
【表４１】
【００６２】
上記したように、本発明は、第１の側面において、オリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９合成アゴニストを提供する。塩基、糖、リンケージ、またはリンカーに対する一定の化学修飾に基づき、ＴＬＲ９のアゴニストは、接触可能５’末端を保持しつつ、他のＴＬＲ９アゴニスト分子と会合し重複した場合に、増加した安定性を有することができる。
第２の側面において、本発明は、本発明によるオリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９アゴニスト（「化合物」）および生理学的に許容し得る担体を含む、組成物を提供する。用語「生理学的に許容し得る」とは、一般に、化合物の有効性を損なうことなく、細胞、細胞培養物、組織または生物などの生体システムと適合的である物質をいう。
【００６３】
本明細書において、用語「担体」は、任意の賦形剤、希釈剤、増量剤、塩、緩衝液、安定化剤、可溶化剤、オイル、脂質、脂質含有ベシクル、ミクロスフェア、リポソームカプセル剤または生理学的に許容し得る製剤において用いるための当該分野でよく知られた他の材料を包含する。担体、賦形剤または希釈剤の特性は、特定の適用に対する投与経路に依存することが理解される。これらの材料を含む、生理学的に許容し得る製剤の調製は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に記載されている。
活性化合物は、生理学的に許容し得る担体または希釈剤中に、処置される患者に重篤な毒性効果を及ぼすことなく、予防的または治療的に有効な量で患者に送達されるのに十分な量で、含有される。用語「有効量」または「十分な量」は、一般に、有益な結果などの所望の生物学的効果を及ぼすのに十分な量をいう。したがって、「有効量」または「十分な量」は、投与される状況に依存する。生理学的に許容し得る誘導体の有効な用量範囲は、送達される親化合物の重量に基づき算出することができる。誘導体それ自体が活性を示す場合は、有効用量は誘導体の重量を用いて、または当業者に既知の他の手段により、上記のようにして推定可能である。
【００６４】
第３の側面において、本発明はワクチンを提供する。この側面によるワクチンは、本発明の組成物を含み、さらに抗体を含む。抗体とは、特異的免疫反応を誘発する分子である。かかる抗体は、限定することなく、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物および複合体またはこれらの任意のものの組合せを含む。抗体は、天然または合成であってよく、一般にその抗体に特異的な免疫反応を誘発する。任意のかかる抗体は、随意に免疫原性タンパク質に結合してもよく、その例は例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、コレラ毒素Ｂサブユニット、または任意の他の免疫原性担体タンパク質である。
本発明によるワクチンはさらに、任意の過剰な既知のアジュバントをさらに含んでよく、その例は限定なく、フロイント完全アジュバント、ＫＬＨ、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ミョウバン、およびＱＳ−２１を含むサポニン、イミキモド、Ｒ８４８、またはこれらの組合せを含む。
【００６５】
第４の側面において、本発明は、脊椎動物においてＴＬＲ９媒介性免疫反応を引き起こすための方法を提供し、かかる方法は、脊椎動物に対し、本発明による化合物、組成物またはワクチンを投与することを含む。いくつかの態様において、脊椎動物は哺乳類である。本発明の目的のために、用語「哺乳類」は、ヒトおよび動物を含むことを特に意図する。好ましい態様において、化合物、組成物またはワクチンは、免疫刺激を必要とする脊椎動物に投与される。
【００６６】
本発明のこの側面による方法において、本発明の化合物、組成物またはワクチンの投与は任意の好適な経路により行うことができ、これには、限定することなく、非経口、経口、腫瘍内、舌下、経皮、局所、経鼻、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、粘膜、膣、あるいは遺伝子銃、経皮パッチまたは点眼もしくは口腔洗浄の形態によるものを含む。化合物、組成物またはワクチンの投与は、既知の手順を用いて、疾病の症状または代理マーカーを低減するのに有効な用量と期間で、行うことができる。全身投与の場合、化合物、組成物またはワクチンは、本発明の化合物の約０．０００１マイクロモル〜約１０マイクロモルの血中レベルを達成するのに十分な用量で投与するのが好ましい。局所投与の場合、これよりはるかに低い濃度が有効であり得、またはるかに高い濃度が重篤な毒性効果なしに耐容され得る。好ましくは、本発明による化合物の総用量は１日約０．００１ｍｇ／患者〜１日約２００ｍｇ／体重１ｋｇまでの範囲である。本発明の１または２種以上の治療組成物の治療有効量を、同時に、または連続して、個体に対して１つの処置エピソードとして投与することが望ましい場合もある。
【００６７】
ある好ましい態様においては、本発明の化合物、組成物またはワクチンは他の剤と組み合わせて投与され、これらの剤は限定することなく、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＳｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、標的治療物（targeted therapies）、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、および／または免疫反応の特異性もしくは強さを増強するためのアジュバントを含む。
本発明のこの側面の目的のために、「と組み合わせて」の用語は、患者の疾病または疾患を処置する過程において、本発明の化合物、組成物またはワクチンおよび／または他の剤を、同時投与ならびに、数時間、数日間または数週間の時間的間隔をあけた順序での投与を含む任意の順序で、投与することを意味する。かかる組合せ処置はまた、本発明の化合物、組成物またはワクチンおよび／または他の剤の、単回の投与より多数の投与も含んでよい。本発明の化合物、組成物またはワクチンおよび／または他の剤の投与は、同一または異なる経路であってよい。
【００６８】
本発明のこの側面による方法は、ヒトまたは動物の疾病の予防的または治療的処置に有用である。例えば、本方法は、小児および獣医学の用途に有用である。本方法はまた、免疫系のモデル研究にも有用である。
第５の側面において、本発明は、疾病または疾患を有する患者を治療的に処置するための方法を提供し、かかる方法は、患者に対し、本発明による化合物、組成物またはワクチンを投与することを含む。種々の態様において、処置される疾病または疾患は、癌、自己免疫疾患、感染症、気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、ぜん息、または病原体もしくはアレルゲンにより引き起こされる疾患である。病原体は例えば、細菌、寄生生物、真菌、ウィルス、ウィロイド、およびプリオンを含む。投与は、本発明の第４の側面において記載されたようにして実施する。
【００６９】
用語「処置」は、一般に、症状の緩和、または疾病の進行を遅らせるかまたは改善することを含み得る、有益な、または所望の結果を得ることを意図したアプローチをいう。
本発明の目的のために、用語「アレルギー」は、一般に、炎症を特徴とする不適切な免疫反応をいい、限定はしないが、食品アレルギーおよび呼吸アレルギーを含む。用語「気道炎症」はぜん息を含むが、これに限定はされない。本明細書において用いる用語「自己免疫疾患」は、「自己」要素（例えばタンパク質）が免疫系による攻撃を受ける疾患をいう。かかる用語は、自己免疫性ぜん息を含む。用語「癌」は、限定することなく、異常または無制御的な細胞増殖および／または分裂により引き起こされる、任意の悪性の増殖または腫瘍を含む。癌は、ヒトおよび／または動物において起こり、任意のおよび全ての組織において生じ得る。本発明を用いて癌を有する患者を処置することは、本発明の化合物、組成物またはワクチンを投与して、異常または無制御的な細胞増殖および／または分裂に影響を及ぼすことを含んでよい。
【００７０】
第６の側面において、本発明は、疾病または疾患を防ぐための方法を提供し、かかる方法は、患者に対し、本発明による化合物、組成物またはワクチンを投与することを含む。種々の態様において、予防される疾病または疾患は、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、感染症、アレルギー、ぜん息、または病原体により引き起こされる疾患である。病原体は、限定することなく、細菌、寄生生物、真菌、ウィルス、ウィロイド、およびプリオンを含む。投与は、本発明の第４の側面において記載されたようにして実施する。
【００７１】
本発明の任意の方法において、本発明の化合物、組成物またはワクチンは、疾病または状態を予防または処置するのに有用であり、かつ本発明の化合物、組成物またはワクチンの免疫刺激効果を低減させないような他の剤と組み合わせて、投与することができる。本発明の任意の方法において、疾病または状態を予防または処置するのに有用な剤は、限定することなく、ワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、および／または免疫反応の特異性もしくは強さを増強するためのアジュバント、または、共刺激性分子であって、例えばサイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド、および修飾アミノ酸を含むペプチドなどを含む。例えば、癌の予防および／または処置において、本発明の化合物、組成物またはワクチンを、化学治療化合物またはモノクローナル抗体と組み合わせて投与できることが意図される。代替的に、剤は、抗原またはアレルゲンをコードするＤＮＡベクターを含むことができる。これらの態様において、本発明の化合物、組成物またはワクチンは、アジュバントとして様々に作用でき、および／または、直接免疫調節効果をもたらすことができる。
以下の例は、本発明の一定の好ましい実施例をさらに説明することを意図し、本発明の範囲を多少でも限定することを意図するものではない。
【００７２】
例１：
オリゴヌクレオチド、ペンタン−１，３，５−トリオールリンカー、ペンタン−１，５−ジオールリンカーおよびｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリオールリンカーの合成ならびにＣＰＧおよびオリゴプレップ固体支持体の機能化
対照ポアガラス誘導体化３−メチル−１，３，５−ペンタントリオールリンカー（５）を、市販の３−メチル−１，３，５−トリオール（１）からスキーム１に示すようにして実現した。初めに、ビス−ＤＭＴ保護アルコール（２）を、（１）から、ＤＭＡＰの存在下でＤＭＴＣｌで処理することにより、十分な産量で調製した。ＣＰＧ誘導体化の従来法は、おそらく立体化学的効果による、（２）の３−ヒドロキシルにおけるスクシニル化産物の低い産量のために不可能であった。しかし、ＣＰＧ誘導体化リンカー（５）は、コハク酸塩（３）（スキーム１）を作製する必要性を排除した次の代替アプローチにより調製した。この経路において、初めに、ＣＰＧビーズを室温でジクロロメタン（ＤＣＭ）中の３％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で処理することにより活性化して、ＣＰＧ表面で反応性アミノ基の最大数を遊離化した。活性化ＣＰＧビーズを次に、ＤＭＡＰの存在下で無水コハク酸で誘導体化して、ＣＰＧビーズ（４）を得た。最後に、ＣＰＧ誘導体化リンカー（５）を、ＣＰＧ（４）のカルボン酸基を用いて、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＤＥＣ）／ＤＭＡＰの存在下で（２）を縮合することにより得た。誘導体化の後、残留カルボン酸基を、ペンタクロロフェノールによるキャッピング反応により除去した。
【化１】
スキーム１．３−メチル−１，３，５−ペンタントリオールリンカーの合成およびＣＰＧの誘導体化。試薬および条件：ａ）ＤＭＴＣｌ、ＤＭＡＰ、ピリジン、０℃〜室温；ｂ）無水コハク酸、ＤＭＡＰ、ピリジン；ｃ）（ｉ）ＤＣＭ中３％ＴＣＡ；（ｉｉ）無水コハク酸、ＤＭＡＰ、ピリジン；ｄ）（ｉ）（２）、ＤＭＡＰ、ＴＥＡ、ＤＥＣ、ピリジン；（ｉｉ）ペンタクロロフェノール。
【００７３】
１，３，５−ペンタントリオールリンカー誘導体化ＣＰＧ（１０）およびオリゴプレップ（１１）を、市販の３−ヒドロキシグルタル酸ジエチル（６）から出発して調製した（スキーム２）。ＬｉＡｌＨ４による（６）の還元により、定量的産量の１，３，５−ペンタントリオール（７）を産生した。トリオール（７）を次にＤＭＡＰの存在下でＤＭＴＣｌにより選択的に保護して、ビス−ＤＭＴ保護アルコール（８）を得て、これを次にコハク酸塩に正常に変換する；これは、ＤＭＡＰの存在下で無水コハク酸で処理することにより、固体支持体上にそのまま負荷することができる。ピリジン／アセトニトリル混合物中ＤＩＣ／ＤＭＡＰの存在下で、定量的負荷産量で（９）をＣＰＧに結合することができる（１０）。一方、上記のプロトコルは、ＰＶＡ固体支持体であるオリゴプレップ２５０の機能化においては、非常に少ない負荷産量を与えた。しかし、アセトニトリル中のＴＢＴＵ／ＤＭＡＰの存在下では、定量的負荷産量が実現された（１１）。負荷はそれぞれ、ＣＰＧ（１０）上に約〜４０μｍｏｌ／ｇ、およびオリゴプレップ２５０（１１）支持体上に約〜１２５μｍｏｌ／ｇで維持され、これは、ヌクレオチド結合効率および最終収率を増加させる。
【化２】
スキーム２．１，３，５−ペンタントリオールリンカーの合成ならびにＣＰＧおよびオリゴプレップ固体支持体の誘導体化。試薬および条件：ａ）ＬｉＡｌＨ４、ＴＨＦ、０℃〜室温；ｂ）ＤＭＴＣｌ、ＤＭＡＰ、ピリジン、０℃〜室温；ｃ）無水コハク酸、ＤＭＡＰ、ピリジン；ｄ）ＬＣＡＡ−ＣＰＧ、ＤＭＡＰ、ＤＩＣ、ピリジン、アセトニトリル；ｅ）オリゴプレップ２５０、ＤＭＡＰ、ＴＢＴＵ、アセトニトリル。
【００７４】
Ｃ５リンカー機能化支持体（１０）および（１１）は、同一配列のイムノマーを作製するのに理想的である。非同一配列のイムノマーもまた、我々の研究において強力な免疫刺激活性を示した。例えば（１４）（スキーム３）などの適切に保護されたＣ５リンカーは、非同一配列のイムノマーを作製するために必要である。市販の１，５−ペンタンジオールのヒドロキシル基の１つを、ＤＭＴにより選択的に保護し、続いて２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホス−ホスホラミダイトによるリン酸化により、必要なＣ５リンカー（１４）を得た（スキーム３）。
【化３】
スキーム３．ペンタンジオールホスホラミダイトの合成。試薬および条件：ａ）ＤＭＴＣｌ、ＤＭＡＰ、ピリジン、−１０℃〜室温；ｂ）ＤＩＰＥＡ、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロ−ホスホスホラミダイト、ＮＭＩ、ＤＣＭ、０℃〜室温。
【００７５】
我々はまた、強力な合成免疫調節モチーフとしてのＣｐＧＤＮＡデンドリマーの設計および開発にも注目した。ＣｐＧＤＮＡデンドリマーを作製するためには、適切に保護されたリンカーであるホスホラミダイトは必須である。Ｃ５リンカーホスホラミダイト（１５）および（１６）を、それぞれジ−ＤＭＴアルコール（２）および（８）から、スキーム４に示すように、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホスホラミダイトによるリン酸化により調製した。
【化４】
スキーム４．ペンタントリオールホスホラミダイトの合成。試薬および条件：ａ）ＤＩＰＥＡ、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホスホラミダイト、ＮＭＩ、ＤＣＭ、０℃〜室温。
【００７６】
ＣＰＧで誘導体化したｃｉｓ−シクロヘキサントリオールリンカー（２０）を、スキーム５に示すようにして実現した。ビス−ＤＭＴ保護ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリオール（１８）を、市販のｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリオール（１７）から実現した。続く、非保護ヒドロキシル（１８）のＤＭＡＰの存在下における無水コハク酸によるスクシニル化により、所望のビス−ＤＭＴコハク酸塩（１９）を７８％の収率で得た。ＣＰＧのコハク酸塩（１９）による誘導体化を、定量的産量（（２０）、４０μｍｏｌ／ｇ）で、ピリジン／アセトニトリル混合物中のＤＩＣ／ＤＭＡＰの存在下にて実現した。
【化５】
スキーム５．ｃｉｓ−シクロヘキサン−１，３，５−トリオールリンカーの合成およびＣＰＧ固体支持体の誘導体化。試薬および条件：ａ）ＤＭＴＣｌ、ＤＭＡＰ、ピリジン、０℃〜室温；ｂ）無水コハク酸、ＤＭＡＰ、ピリジン、室温；ｃ）ＬＣＡＡ−ＣＰＧ、ＤＭＡＰ、ＤＩＣ、ピリジン、アセトニトリル。
【００７７】
３−ヒドロキシグルタル酸ジエチル、水素化アルミニウムリチウム（ＬｉＡｌＨ４）、４，４−ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴＣｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、無水コハク酸、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＤＥＣ）、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、Ｎ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）などの試薬、ならびにピリジン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）およびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの溶媒は、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)から入手し、別に言及されない限りさらなる精製なしで用いた。長鎖アルキルアミン制御ポアガラス（ＣＰＧ；１２０〜２００メッシュ、５００Å、９０〜１２０μｍｏｌ／ｇＮＨ２基）はCPG Inc (Lincoln Park, NJ)から入手し、オリゴプレップ２５０はMerck KGaA (Germany)から入手した。キャップＡ（無水酢酸／２，６−ルチジン／ＴＨＦ、１：１：８）およびキャップＢ（Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦ、１６：８４）試薬は、Applied Biosystems (Foster City, CA)から入手した。全ての反応は、使用前に少なくとも３時間１２０℃のオーブンで乾燥させたガラス容器内で行った。ＴＬＣは、アルミニウムシートを被覆しているシリカゲル６０Ｆ２５４上で実施され、ＵＶ光またはSigma-Aldrich (St. Louis, MO)からの５％リンモリブデン酸（ＰＭＡ）溶液により視覚化した。クトマトグラフィ用の、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）、ヘキサン、ＤＣＭ、メタノール、ｔ−ブチルメチルエーテルなどの溶媒は、J.T. Bakerから入手し、精製なしで用いた。フラッシュカラムクロマトグラフィは、EMD Chemicals (Gibbstown, NJ)から入手したシリカゲル６０（メッシュサイズ：０．０４０〜０．０６３ｍｍ＆２３０〜４００メッシュＡＳＴＭ）を用いて行った。ＮＭＲスペクトルは、Varian 400MHa Unity Inova装置上で行った。化学シフト（δ）はＴＭＳに対するｐｐｍで表示し、全ての結合定数（Ｊ）はＨｚで表示した。
【００７８】
１，５−ビス−ジメトキシトリチルオキシ−３−メチル−ペンタン−３−オール（２）：ピリジン（２５ｍＬ）中のＤＭＴＣｌ（３．６ｇ、１０．５ｍｍｏｌ、２．１当量）を、乾燥ピリジン（２５ｍＬ）中の３−メチル−１，３，５−ペンタンチオール（（１）、０．７ｇ、５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．２４ｇ）の氷冷（０℃）の撹拌溶液に、窒素雰囲気下で１滴ずつ加えた。反応混合物をゆっくりと室温に到達させ（〜４時間）、一晩撹拌を続けた。ＴＬＣ（０．５％ＴＥＡを含有するヘキサン／ｔ−ブチルメチルエーテル、２：１）により、反応の完了を示した。ピリジンを回転蒸発乾固し（rotoevaporate to dryness）、残留物を酢酸エチル（２５０ｍＬ）に溶解し、水（２×１００ｍＬ）、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（２×１００ｍＬ）、ブライン（２×１００ｍＬ）および水（２×１００ｍＬ）で続いて洗浄した。酢酸エチルの層を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、回転蒸発乾固した。残留物を、０．５％トリエチルアミンを含有するヘキサン／ｔ−ブチルメチルエーテル（３：１）を用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製し、ビス−ＤＭＴ産物（２）を白色の泡状物質として得た（２．９ｇ、７８％）。
【化６】
【００７９】
ビス−ＤＭＴ−３−メチル−ペンタントリオール誘導体化ＣＰＧ（５）の調製：ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（５ｇ）を３％ＴＣＡ（５０ｍＬ）に加え、ゆっくりと室温で３時間撹拌した。ＣＰＧをろ過し、ＴＥＡ／ＤＩＰＥＡの９：１混合物（５０ｍＬ）で、続いてＤＣＭ（５×１００ｍｌ）で洗浄した。活性化ＣＰＧを高真空下で１時間乾燥した。ピリジン（３０ｍＬ）中の無水コハク酸（１ｇ、１０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．２ｇ）溶液を上記ＣＰＧ（５ｇ）に加え、スラリーを室温で２４時間振盪した。溶液をろ別し、ＣＰＧをピリジン（２×２５ｍＬ）で、続いてＤＣＭ（５×２５ｍＬ）で洗浄し、高真空下で２時間乾燥して、ＣＰＧのコハク酸誘導体（４）を得た。乾燥ピリジン（１０ｍＬ）中のジ−ＤＭＴ−３−メチル−ペンタントリオール（２）（８７ｍｇ）、ＤＭＡＰ（３０ｍｇ）、ＴＥＡ（１００μＬ）およびＤＥＣ（０．４ｇ）の溶液を、ＣＰＧ（４）に加え、室温で１５時間振盪した。ペンタクロロフェノール（０．１４ｇ）を上記混合物に加え、さらに１５時間振盪した。溶液をろ別し、ＣＰＧをピリジン（２×２５ｍＬ）で、続いてＤＣＭ（５×２５ｍＬ）で完全に洗浄し、デシケータ中高真空下で一晩乾燥して、ジ−ＤＭＴ−３−メチル−ペンタントリオール誘導体化ＣＰＧ（５）を得た。負荷量は、ＣＰＧの小部分をＤＣＭ中３％ＴＣＡで処理して決定し、ＤＭＴ含量（３７μｍｏｌ／ｇ）を４９８ｍｍでの吸収の測定により定量した。
【００８０】
ペンタン−１，３，５−トリオール（７）の合成：ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の３−ヒドロキシグルタル酸ジエチル（（６）、２５ｇ、１２２．４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４００ｍＬ）中の１ＭのＬｉＡｌＨ４溶液に、０℃のアルゴン雰囲気下で、激しく撹拌しつつ１滴ずつ加えた。添加の後、反応混合物を室温に到達させ（〜４時間）、一晩撹拌した。反応混合物を−７８℃に冷却し（アセトン／乾燥氷浴）、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（５０ｍＬ）の１滴ずつの添加により急冷して、白色の沈殿物を得た。反応混合物を別の５００ｍＬのＴＨＦで希釈し、白色沈殿物をセライトを通してろ過した。沈殿物を沸騰ＴＨＦ（２５０ｍＬ）で処理してろ過した。あわせた有機相を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、溶媒を回転蒸発により除去した。残留物を、ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ／メタノール（６：３：１）を用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製して、トリオール（７）（１１．４ｇ、９５．５ｍｍｏｌ、７８％）を無色の油として得た。
【化７】
【００８１】
１，５−ビス−［（４，４、−ジメトキシフェニル）−フェニルメトキシ］−ペンタン−３−オール（８）：ピリジン（１００ｍＬ）中のＤＭＴＣｌ（１６．６ｇ、４９ｍｍｏｌ、２．１当量）を、乾燥ピリジン（５０ｍＬ）中のペンタントリオール（７）（２．８ｇ、２３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（２．８５ｇ、１当量）の氷冷（０℃）の撹拌溶液に、アルゴン雰囲気下で１滴ずつ加えた。反応混合物をゆっくりと室温に到達させ（〜４時間）、一晩撹拌を続けた。ＴＬＣ（０．５％ＴＥＡ含有のヘキサン／ＥｔＯＡｃ、３：１）により、反応の完了を示した。ピリジンを回転蒸発乾固し、残留物をＤＣＭ（５００ｍＬ）に溶解し、水（５００ｍＬ）、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）および水（２×５００ｍＬ）で続いて洗浄した。ＤＣＭ層を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、回転蒸発乾固した。残留物を、０．５％ＴＥＡ含有ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（３：１）を用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製して、ビス−ＤＭＴアルコール（８）を白色発泡体として得た（１２．１ｇ、１６．７ｍｍｏｌ、７２％）。
【化８】
【００８２】
３（１，５−Ｏ−ジメトキシトリチルペンタントリオール）コハク酸（９）：ビス−ＤＭＴアルコール（８）（１２ｇ、１６．６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（４．０４ｇ、３３．２ｍｍｏｌ）を、乾燥ピリジン（１５０ｍＬ）に溶解し、無水コハク酸（３．３１ｇ、３３．２ｍｍｏｌ）を一部ずつ室温で、激しく撹拌しつつ加えた。反応混合物を一晩撹拌し、ピリジンを回転蒸発乾固した。残留物をＤＣＭ（５００ｍＬ）に溶解し、氷冷の１０％クエン酸溶液（２×５００ｍＬ）および水（２×５００ｍＬ）で続いて洗浄した。ＤＣＭ層を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、回転蒸発装置を用いて５０ｍＬの容積に濃縮し、０．５％ＴＥＡ含有のＤＣＭ中０→２％メタノールを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製して、コハク酸塩の純粋トリエチルアンモニウム塩（９）を白色発泡体として得た（１１．４ｇ、１３．８ｍｍｏｌ、８３％）。
【化９】
【００８３】
ビス−ＤＭＴペンタントリオール負荷ＣＰＧ（１０）の調製：ピリジン／アセトニトリルの１：６混合物（１０５ｍＬ）中のコハク酸塩（９）（０．８３ｇ、１ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．４ｇ、３．３ｍｍｏｌ）およびＤＩＣ（５ｍＬ）の溶液を、ＣＰＧ（２５ｇ）に加え、スラリーを２４時間振盪した。溶液をろ別し、ＣＰＧを、５％ピリジン含有アセトニトリル（１００ｍＬ）およびアセトニトリル（２５０ｍＬ）で洗浄した。キャップＡ（ＡＢＩ、８９ｍＬ）およびキャップＢ（ＡＢＩ、１００ｍＬ）溶液を、ＣＰＧ支持体に加え、４時間振盪した。溶液をろ別し、ＣＰＧを、５％ピリジン含有アセトニトリル（２×１００ｍＬ）で、続いてアセトニトリル（２×２５０ｍＬ）で洗浄し、高真空下で３０分間乾燥した。５％ピリジン含有アセトニトリル（１５０ｍＬ）中のＴＢＤＭＳＣｌ（５．６ｇ）およびイミダゾール（１．４ｇ）の溶液をＣＰＧに加え、４時間振盪した。溶液をろ別し、ＣＰＧを、５％ピリジン含有アセトニトリル（３×１００ｍＬ）およびＤＣＭ（４×２５０ｍＬ）で続いて洗浄し、デシケータ中の高真空下で一晩乾燥して、乾燥ＣＰＧ支持体（１０）を得た。負荷量は、ＣＰＧの小部分をＤＣＭ中３％ＴＣＡで処理して決定し、ＤＭＴ含量（４０μｍｏｌ／ｇ）を４９８ｍｍでの吸収の測定により定量した。
【００８４】
ビス−ＤＭＴペンタントリオール負荷オリゴプレップ２５０（１１）の調製：オリゴプレップ２５０（アセトニトリル中で予め膨張させる）を、ペプチド合成容器に取り、無水アセトニトリル（３×１００ｍＬ）で洗浄した。コハク酸塩（９）（１．７５２ｇ、２．１２５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１．８２ｇ、１４．８７ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（３．４１ｇ、１０．６２ｍｍｏｌ）およびアセトニトリル（１００ｍＬ）をオリゴプレップ２５０に加え、スラリーを４時間振盪した。溶液をろ別し、オリゴプレップを、１％ＴＥＡ含有アセトニトリル（２×１００ｍＬ）およびアセトニトリル（５×１００ｍＬ）で洗浄した。キャップＡ（５０ｍＬ：ＮＭＩ／ピリジン／アセトニトリル＝２：３：５）およびキャップＢ（５０ｍＬ：無水酢酸／アセトニトリル＝１：４）溶液を、固体支持体に加え、６時間振盪した。溶液をろ別し、固体支持体をアセトニトリル（２×１００ｍＬ）で洗浄し、キャッピング反応をもう一度繰り返した。溶液をろ別し、固体支持体を、１％ＴＥＡ含有アセトニトリル（３×１００ｍＬ）で、続いてアセトニトリル（５×１００ｍＬ）で洗浄し、デシケータ中の高真空下で２４時間乾燥して、乾燥オリゴプレップ２５０支持体（１１）（２６．４ｇ）を得た。負荷量は、オリゴプレップの小部分をＤＣＭ中３％ＴＣＡで処理して決定し、ＤＭＴ含量（１３８μｍｏｌ／ｇ）を４９８ｍｍでの吸収の測定により定量した。
【００８５】
５−ジメトキシトリチルオキシ−ペンタン−１−オール（１３）：ペンタンジオール（１２）（１２．５ｇ、１２０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１４．６ｇ、１２０ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（１００ｍＬ）に溶解し、−１０℃に冷却し、アルゴン雰囲気下に維持した。ピリジン（１５０ｍＬ）中のＤＭＴＣｌ（３７．３ｇ、１１０ｍｍｏｌ、０．９２当量）を、激しく撹拌しつつ１滴ずつ加えた。反応混合物をゆっくりと室温に到達させ（〜４時間）、一晩撹拌を続けた。ピリジンを回転蒸発乾固し、残留物をＤＣＭ（５００ｍＬ）に溶解し、水（２５０ｍＬ）、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（２×２５０ｍＬ）、ブライン（２５０ｍＬ）および水（２×２５０ｍＬ）で続いて洗浄した。ＤＣＭ層を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、回転蒸発乾固した。残留物を、０．５％ＴＥＡを含む３：１のヘキサン／ＥｔＯＡｃを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製して、モノ−ＤＭＴ保護アルコール（１３）を無色のシロップとして得た（２８．２ｇ、５８％）。
【化１０】
【００８６】
５−ジメトキシトリチルオキシ−ペンタン−１−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホラミダイト（１４）：無水ＤＣＭ（５００ｍＬ）中の氷冷した（１３）の溶液（２０．３２ｇ、５０ｍｍｏｌ）に、窒素雰囲気下で、ＤＩＰＥＡ（２６．１２ｍｌ、１５０ｍｍｏｌ）を激しく撹拌しつつ加えた。次に２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホスホラミダイト（１４．２ｇ、６０ｍｍｏｌ）を１滴ずつ加え、続いてＮＭＩ（４ｍＬ、５０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物をゆっくりと〜４時間で室温に到達させ、一晩撹拌を続けた。０．５％ＴＥＡを含む３：１のヘキサン／ＥｔＯＡｃでのＴＬＣにより、反応の完了を示した。反応混合物を追加の５００ｍＬのＤＣＭで希釈し、飽和水性ＮａＨＣＯ３（１×５００ｍＬ）、ブライン（２×５００ｍＬ）および水（１×５００ｍＬ）で続いて洗浄した。有機相を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、回転蒸発乾固した。残留物を、０．５％ＴＥＡを含む３：１のヘキサン／ＥｔＯＡｃ混合物を用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製して、（１３）を無色の粘性液体として得た（２２．３ｇ、７４％）。
【化１１】
【００８７】
ホスホラミダイト（１５）および（１６）の合成：（１４）について記載したような一般の方法を用いて合成。化合物（１５）−白色発泡体、収率６９％。
【化１２】
化合物（１６）−白色発泡体、収率７９％。
【化１３】
【００８８】
ｃｉｓ−３，５−ビス−ジメトキシトリチルオキシ−シクロヘキサン−１−オール（１８）：ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリオール無水物（５．０５ｇ、３０ｍｍｏｌ）をピリジン（１００ｍＬ）に溶解し、回転蒸発乾固し、高真空化で４８時間乾燥して、無水ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリオール（４．０５ｇ、３０．６ｍｍｏｌ）を得た。上記無水シクロヘキサントリオールおよびＤＭＡＰ（７．３３ｇ、６０ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（１００ｍＬ）に溶解し、氷浴中で冷却し、窒素雰囲気下に維持した。乾燥ピリジン（１５０ｍＬ）中のＤＭＴＣｌ（２０．４ｇ、６０ｍｍｏｌ、２当量）を、上記溶液に激しく撹拌しつつ１滴ずつ加えた。反応混合物をゆっくりと室温に到達させ（〜４時間）、２４時間撹拌を続けた。０．５％ＴＥＡを含む２：１のヘキサン／ＥｔＯＡｃ混合物中のＴＬＣは、いくつかの出発物質の存在を示した。反応混合物をさらに５時間６０℃で撹拌し、ピリジンを回転蒸発乾固した。残留物をＤＣＭ（５００ｍＬ）に溶解し、水（５００ｍＬ）、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（５００ｍＬ）、ブライン（５００ｍＬ）および水（２×５００ｍＬ）で続いて洗浄した。ＤＣＭ層を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、回転蒸発乾固した。残留物を、０．５％ＴＥＡを含む３：１のヘキサン／ＥｔＯＡｃを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製して、ビス−ＤＭＴ産物（１８）を白色固体として得た（８．４ｇ、３８％）。
【化１４】
【００８９】
１（３，５−ビス−ジメトキシトリチル−ｃｉｓ−シクロヘキサントリオール）コハク酸（１９）：ビス−ＤＭＴ−シクロヘキサントリオール（１８）（４．０５ｇ、５．５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１．３４ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（５０ｍＬ）に溶解し、無水コハク酸（１．１ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）を、室温で激しく撹拌しつつ１部ずつ加えた。反応混合物を室温で４８時間撹拌し、２％メタノールおよび０．５％ＴＥＡを含むＤＣＭ中のＴＬＣが、出発物質が完全に消えたことを示した。ピリジンを回転蒸発乾固し、残留物をＤＣＭ（２５０ｍＬ）に溶解し、氷冷の１０％クエン酸溶液（２×２５０ｍＬ）および水（２×２５０ｍＬ）で続いて洗浄した。ＤＣＭ層を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥し、回転蒸発装置で５０ｍＬ容積に濃縮し、０．５％ＴＥＡ含有のＤＣＭ中０→２％メタノールを用いたシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製して、コハク酸塩の純粋トリエチルアンモニウム塩（１９）を白色発泡体として得た（３．５８ｇ、７８％）。
【化１５】
【００９０】
ビス−ＤＭＴシクロヘキサントリオール誘導体化ＣＰＧ（２０）の調製：ピリジン／アセトニトリルの１：７．５混合物（８５ｍＬ）中の、コハク酸塩（１９）（０．７８ｇ、０．９３ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．３８ｇ、２．８ｍｍｏｌ）およびＤＩＣ（３ｍＬ）の溶液を、ＣＰＧ（２２．５ｇ）に加え、スラリーを２４時間撹拌した。溶液をろ別し、ＣＰＧを、５％ピリジン含有アセトニトリル（２×１００ｍＬ）およびアセトニトリル（３×１００ｍＬ）で洗浄した。キャップＡ（ＡＢＩ、８０ｍＬ）およびキャップＢ（ＡＢＩ、９０ｍＬ）溶液をＣＰＧ支持体に加え、４時間振盪した。溶液をろ別し、ＣＰＧを５％ピリジン含有アセトニトリル（２×１００ｍＬ）で洗浄し、続いてアセトニトリル（２×２５０ｍＬ）で洗浄し、高真空下で３０分間乾燥した。５％ピリジン（１００ｍＬ）を含むアセトニトリル中の、ＴＢＤＭＳＣｌ（２．５ｇ）およびイミダゾール（０．７５ｇ）の溶液をＣＰＧに加え、５時間振盪した。溶液をろ別し、ＣＰＧを、５％ピリジン含有アセトニトリル（３×１００ｍＬ）およびＤＣＭ（４×１００ｍＬ）で続いて洗浄し、デシケータ中高真空下で一晩乾燥して、乾燥ＣＰＧ支持体（２０）を得た。負荷量は、ＣＰＧの小部分をＤＣＭ中の３％ＴＣＡで処理して決定し、ＤＭＴ含量（４０μｍｏｌ／ｇ）を４９８ｍｍでの吸収の測定により定量した。
【００９１】
例２：
マウスＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３細胞中の、表Ｉからの例示のオリゴによる、細胞培養条件および試薬、サイトカイン誘発
マウスＴＬＲ９を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞（Invitrogen, San Diego, CA）を、４８ウェルプレート内、１０％熱不活性化ＦＢＳを補足したＤＭＥＭで２５０μｌ／ウェルにて、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて培養した。８０％の細胞密集度で、培養物を一時的に、４００ｎｇ／ｍｌのＳＥＡＰ（ヒト胎性アルカリホスファターゼの分泌形態）レポータープラスミド（pNifty2-Seap (Invitrogen)）を用いて、培養培地中の４μｌ／ｍｌのリポフェクタミン（Invitrogen, Carlsbad, CA）の存在下でトランスフェクトした。プラスミドＤＮＡおよびリポフェクタミンを別々に無血清培地に希釈し、室温で５分間インキュベーションした。インキュベーション後、希釈ＤＮＡおよびリポフェクタミンを混合し、混合物を室温で２０分間インキュベーションした。１００ｎｇのプラスミドＤＮＡおよび１μｌのリポフェクタミンを含む、ＤＮＡ／リポフェクタミン混合物のアリコート２５μｌを、細胞培養プレートの各ウェルに加え、培養を４時間続けた。
トランスフェクションの後、培地を新鮮な培養培地で置き換え、表Ｉからの例示のオリゴを培養物中に加え、培養を２４時間続けた。オリゴ処理の最後に、３０μｌの培養物上清を各処理から取り出し、製造業者のプロトコル（Invitrogen）に従うＳＥＡＰアッセイに用いた。簡潔に述べると、培養物上清を、リン酸ｎ−ニトロフィニイル基質でインキュベーションし、生成された黄色の物質を、プレートリーダーにより４０５ｎｍにて測定した（Putta MR et al., Nucleic Acid Res., 2006, 34: 3231-8）。
【００９２】
例３：
ヒトＰＢＭＣ、ｐＤＣ、およびマウス脾臓細胞中の、表Ｉからの例示のオリゴによるサイトカイン誘発
ヒトＰＢＭＣ単離
新しく収集した健康なボランティアの血液（CBR Laboratories, Boston, MA）からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール密度勾配遠心分離法（Histopaque-107, Sigma）により単離した。
ヒトｐＤＣ単離
ｐＤＣは、製造業者の指示書に従って、ＢＤＣＡ４細胞単離キット（Miltenyi Biotec）を用いる陽性選択により、ＰＢＭＣから単離した。
マウス脾臓細胞単離
４〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓細胞を、Zhao, Q. et al, (Biochem Pharmacol. 51:173-182(1996)およびBranda R.F., et al. (Biochem Pharmacol. 45:2037-2043(1993)による記載のように、ＲＰＭＩ完全培地中で培養した。全てのその他の培養試薬は、Mediatech (Gaithersburg, MD)から購入した。
【００９３】
サイトカインＥＬＩＳＡ
ヒトＰＢＭＣまたはマウス脾臓細胞を、４８ウェルプレートに５×１０６細胞／ｍｌでプレートした。ヒトｐＤＣを、９６ウェルディシュに１×１０６細胞／ｍｌでプレートした。ＤＰＢＳ（ｐＨ７．４；Mediatech）中に溶解した表Ｉの例示のオリゴを、細胞培養物に加えた。細胞を次に３７℃で２４時間インキュベーションし、上清をLuminex Multiplex用またはＥＬＩＳＡアッセイ用に収集した。ある実験においては、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２のレベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。サイトカイン抗体および標準を含む必要な試薬は、PharMingenから購入した。
サイトカインLuminex Multiplex
ある実験においては、培養物上清中のＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−β、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１２ｐ４０ｐ７０のレベルを、Luminex Multiplexアッセイにより測定した；これは、Luminex 100装置上でBiosource製ヒトマルチプレクスサイトカインアッセイキットを用いて実施し、データをApplied Cytometry Systems（Sacramento, CA）が供給するStarStationソフトウェアを用いて解析した。
【００９４】
例４：
表Ｉからの例示のオリゴの存在下でのヒトＢ細胞増殖アッセイ
ヒトＢ細胞を、ＰＢＭＣから、製造業者の指示に従ってCD19 Cell Isolation Kit（Mitenyi Biotec, Auburn, CA）を用いた陽性選択により単離した。
アッセイに用いた培養培地は、１．５ｍＭのグルタミンを補ったＲＰＭＩ１６４０培地、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、５０μＭの２−メルカプトエタノール、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン混合物および１０％の熱非活性化ウシ胎仔血清からなる。
全体で１ｍｌ当たり０．５×１０６のＢ細胞を、９６ウェルの平底プレートで、表Ｉからの例示のオリゴの異なる濃度で、トリプリケートで、全７２時間刺激した。６６時間後、細胞を、１ウェル当たり、２０μｌのＲＰＭＩ１６４０培地（血清なし）中の０．７５μＣｉの［Ｈ３］−チミジン（１Ｃｉ＝３７ＧＢｑ；Perkin Elmer Life Sciences）でパルスし、６〜８時間後に収穫した。次にプレートを細胞収穫器により収穫し、放射性混入物を標準の液体シンチレーション技術により決定した。いくつかのケースでは、対応する［Ｈ３］−Ｔ（ｃｐｍ）を増殖指数に変換し、これを用いて報告した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜９２として表Ｉに示されるオリゴヌクレオチドを有するＴＬＲ９アゴニストであって、ヌクレオシド間結合が、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、前記ＴＬＲ９アゴニスト。
【請求項２】
請求項１に記載のＴＬＲ９アゴニストを含み、さらに生理学的に許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物を含み、さらに抗体を含む、ワクチン。
【請求項４】
脊椎動物においてＴＬＲ９媒介性免疫反応を引き起こすための方法であって、脊椎動物に対し、請求項１に記載のＴＬＲ９アゴニストの有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項５】
脊椎動物においてＴＬＲ９媒介性免疫反応を引き起こすための方法であって、脊椎動物に対し、請求項２に記載の組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項６】
疾病または疾患を有する患者を治療的に処置するための方法であって、患者に対し、請求項１に記載のＴＬＲ９アゴニストの治療有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項７】
疾病または疾患を有する患者を治療的に処置するための方法であって、患者に対し、請求項２に記載の組成物の治療有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項８】
疾病または疾患を有する患者を治療的に処置するための方法であって、患者に対し、請求項３に記載のワクチンの治療有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項９】
疾病または疾患にかかりやすい患者において該疾病または疾患を予防するための方法であって、患者に対し、請求項１に記載のＴＬＲ９アゴニストの予防有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１０】
疾病または疾患にかかりやすい患者において該疾病または疾患を予防するための方法であって、患者に対し、請求項２に記載の組成物の予防有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１１】
疾病または疾患にかかりやすい患者において該疾病または疾患を予防するための方法であって、患者に対し、請求項３に記載のワクチンの予防有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１２】
疾病または疾患が、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、感染症、アレルギー、ぜん息、および病原体により引き起こされる疾患からなる群から選択される、請求項４〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
配列番号１〜９２として表Ｉに示されるオリゴヌクレオチドを有するＴＬＲ９アゴニストであって、ヌクレオシド間結合が、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、前記ＴＬＲ９アゴニスト。
【請求項２】
請求項１に記載のＴＬＲ９アゴニストを含み、さらに生理学的に許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物を含み、さらに抗体を含む、ワクチン。
【請求項４】
脊椎動物においてＴＬＲ９媒介性免疫反応を引き起こすための方法であって、脊椎動物に対し、請求項１に記載のＴＬＲ９アゴニストの有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項５】
脊椎動物においてＴＬＲ９媒介性免疫反応を引き起こすための方法であって、脊椎動物に対し、請求項２に記載の組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項６】
疾病または疾患を有する患者を治療的に処置するための方法であって、患者に対し、請求項１に記載のＴＬＲ９アゴニストの治療有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項７】
疾病または疾患を有する患者を治療的に処置するための方法であって、患者に対し、請求項２に記載の組成物の治療有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項８】
疾病または疾患を有する患者を治療的に処置するための方法であって、患者に対し、請求項３に記載のワクチンの治療有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項９】
疾病または疾患にかかりやすい患者において該疾病または疾患を予防するための方法であって、患者に対し、請求項１に記載のＴＬＲ９アゴニストの予防有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１０】
疾病または疾患にかかりやすい患者において該疾病または疾患を予防するための方法であって、患者に対し、請求項２に記載の組成物の予防有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１１】
疾病または疾患にかかりやすい患者において該疾病または疾患を予防するための方法であって、患者に対し、請求項３に記載のワクチンの予防有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１２】
疾病または疾患が、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、感染症、アレルギー、ぜん息、および病原体により引き起こされる疾患からなる群から選択される、請求項４〜１１のいずれかに記載の方法。
【公表番号】特表２０１０−５１２４２１（Ｐ２０１０−５１２４２１Ａ）
【公表日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４１５４５（Ｐ２００９−５４１５４５）
【出願日】平成１９年１２月１２日（２００７．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８７１８２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７３９５９
【国際公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【出願人】（３９８０３２７１７）イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (38)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１２日（２００７．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８７１８２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７３９５９
【国際公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【出願人】（３９８０３２７１７）イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (38)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
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